JP2005225853A - アレルギー性疾患又は呼吸器系疾患の予防ないし治療剤 - Google Patents

Abstract

【課題】
本発明は、肥満細胞の脱顆粒、気道過敏性の亢進及び／又は好酸球の増加を伴うアレルギー性疾患又は呼吸器系疾患の予防ないし治療剤の提供を目的とする。
【解決手段】肥満細胞の脱顆粒抑制作用、気道過敏性の抑制作用及び好酸球の増加抑制作用を有するＴＲＸタンパク質を用いたアレルギー性疾患、アレルギー性疾患又は呼吸器系疾患の予防および治療剤を提供する。
【選択図】図４

Description

本発明は、アレルギー性疾患又は呼吸器系疾患の予防ないし治療剤に関し、詳しくは、チオレドキシンスーパーファミリーに属するポリペプチド類（以下、「ＴＲＸｓ」と略記する場合がある）を有効成分とするアレルギー性疾患又は呼吸器系疾患の予防ないし治療剤に関する。

チオレドキシン（Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ；ＴＲＸ）はその活性部位配列の−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−内にレドックス活性なジスルフィド／ジチオールを有する１２ｋＤａの多機能ポリペプチドである（非特許文献１）。チオレドキシンはリボヌクレオチドリダクターゼに対するハイドロゲン供与体、デオキシリボヌクレオチドの合成に重要な酵素として大腸菌から単離されて以来、多くの原核生物，真核生物から単離同定されてきた。

成人Ｔ細胞白血病誘導因子（ＡＤＦ）は，本発明者らがＨＴＬＶ−Ｉに感染したＴリンパ球によって産生されるＩＬ−２受容体誘導因子として最初に同定したもので、ヒトチオレドキシンである。細胞内チオレドキシンはラジカル消去や、ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ−１や ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ−κＢ などのレドックスに関する転写因子の制御に重要な役割を果たしている（非特許文献２）。

さらに、 ヒトチオレドキシンはｐ３８ ｍｉｔｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ（ＭＡＰＫ）やａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｓｉｇｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ−１（ＡＳＫ−１）のシグナル伝達を制御する。

また、チオレドキシンが細胞外に放出され、サイトカインまたはケモカイン作用を示すこと（非特許文献３）、さらには細胞外ＴＲＸが細胞内へ移行すること（非特許文献４）が、本発明者らによって報告されてきた。しかし、ＴＲＸｓの肥満細胞の脱顆粒制御機能、及び好酸球の増加抑制作用については、未だ解明されていない。

肥満細胞は、その細胞表面のＦｃεレセプターに結合したＩｇＥ抗体に、抗原が結合（架橋）することにより脱顆粒を起こし、結果として放出される細胞内のケミカルメディエーター（ヒスタミン、ＩＬ−２，ＩＬ−６など）が、炎症反応（Ｉ型アレルギー反応）を引き起こすことが知られている。肥満細胞とアレルギー性疾患の直接的な関係については多くの報告がなされており、アレルギー性鼻炎、花粉症の原因であるとされている。

したがって、ＩＬ−２およびＩＬ−６の肥満細胞からの分泌を抑制することによって、間接的に免疫抑制効果または炎症抑制効果を得ることができると考えられる。

一方、気管支喘息においては、ＩｇＥ抗体が肥満細胞に大きく影響していることが知られており、特に成人よりも小児に多いアトピー型気管支喘息の直接原因になっていると考えられている。また、アトピー型気管支喘息モデルマウスを用いた実験系においても、肥満細胞が主要原因であることが証明されている（非特許文献５）。

また、気管支喘息の主症状である気道狭窄は、肥満細胞の脱顆粒によって引き起こされる。すなわち、抗原刺激に対してＩｇＥ抗体が気管支粘膜上の肥満細胞に結合し、肥満細胞の脱顆粒がおこると、ケミカルメディエーターが放出され、種々の炎症反応が引き起こされる。その６〜８時間後、新たな抗原の侵入が無いにもかかわらず、Ｔｈ２細胞からＩＬ−５等が放出され、好酸球の浸潤がおこる。好酸球は、細胞内顆粒からロイコトリエン、細胞傷害性タンパク質を放出し、気道粘膜を傷害する。これにより、気道の過敏性が亢進され、気道の狭窄を生じ、それが原因となって気道抵抗が上昇する。この、気道炎症疾患又は気道過敏症に代表される疾患を、呼吸器炎症疾患又は呼吸器過敏症と呼ぶ。

好酸球は、顆粒球の一種であり、寄生虫感染、アレルギー疾患、炎症反応等において重要な生体防御機能を担っていることが知られている。

従来、呼吸器炎症疾患又は呼吸器過敏症の治療剤としては、キサンチン誘導体の一種であるテオフィリン等が知られているが、副作用等の問題がある。また、他の治療剤としては、β２受容体刺激剤，抗コリン剤，抗アレルギー用剤，副腎皮質ホルモン剤，吸入ステロイド等のステロイド剤等が一般的に用いられている。しかしながら、難治性喘息患者において上記の従来型の治療剤は、いずれも満足な効果は得られていない。
"Ｒｅｄｏｘ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ" Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９７； １５：３５１−３６９． "ＡＰ−１ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ａ ｄｉｒｅｃｔ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ ａｎｄ Ｒｅｆ−１" ＰＮＡＳ．１９９７； ９４： ３６３３−３６３８． "Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ" ＰＮＡＳ． ２００１； ９８： １５１４３−１５１４８ "Ｒｅｄｏｘ−ｓｅｎｓｉｎｇ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ ｆｒｏｍ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｗｉｔｈ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｆｅｅｄｂａｃｋ ｌｏｏｐｓ" Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００４； １７２： ４４２−４４８． "Ａｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｍａｓｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｉｒｗａｙ ｈｙｐｅｒｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ｉｎ ａ ｍｕｒｉｎｅ ａｓｔｈｍａ ｍｏｄｅｌ．" Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０００； １６４：３８５５−３８６１．

本発明は、肥満細胞の脱顆粒抑制作用、気道過敏性の抑制及び炎症部位における好酸球の増加抑制作用に基づいたチオレドキシンを有効成分とするアレルギー性疾患又は呼吸器系疾患の予防ないし治療剤の提供を目的とする。

本発明者らは、ＴＲＸｓが肥満細胞の脱顆粒抑制作用、気道過敏性の抑制作用及び炎症部位における好酸球の増加抑制作用を有し、アレルギー性疾患もしくは呼吸器炎症疾患又は呼吸器過敏症の予防ないし治療剤として有効であることを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明は、以下のアレルギー性疾患もしくは呼吸器炎症疾患又は呼吸器過敏症予防ないし治療剤を提供するものである：
項１．チオレドキシンスーパーファミリーのポリペプチドを有効成分とする肥満細胞の脱顆粒を伴うアレルギー性疾患の予防ないし治療剤。
項２．チオレドキシンスーパーファミリーのポリペプチドを有効成分とする気道過敏性の亢進及び／又は炎症部位における好酸球の増加を伴う呼吸器系疾患の予防ないし治療剤。
項３．該アレルギー性疾患が、アトピー型気管支喘息、アレルギー性鼻炎又は花粉症である項１に記載の予防ないし治療剤。
項４．該呼吸器系疾患が呼吸器炎症疾患又は呼吸器過敏症である項２に記載の予防ないし治療剤。
項５．該呼吸器炎症疾患又は呼吸器過敏症が、気道炎症疾患、気道過敏症又は好酸球性肺疾患である項２に記載の予防ないし治療剤。
項６．該気道炎症疾患が気管支喘息である項２に記載の予防ないし治療剤。
項７．該呼吸器炎症疾患又は呼吸器過敏症が、アスピリン誘導性のものである項２に記載の予防ないし治療剤。
項８．該好酸球性肺疾患が、単純性好酸球増加症、急性好酸球性肺炎、慢性好酸球性肺炎、好酸球増多症候群、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、アレルギー性肉芽腫性血管炎、寄生虫感染及び過敏性肺炎からなる群より選択される、いずれか１つである項２に記載の予防ないし治療剤。
項９．以下の疾患：
アトピー型気管支喘息、アレルギー性鼻炎、花粉症、気管支喘息、アスピリン誘導性の呼吸器炎症疾患又は呼吸器過敏症、単純性好酸球増加症、急性好酸球性肺炎、慢性好酸球性肺炎、好酸球増多症候群、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、アレルギー性肉芽腫性血管炎、寄生虫感染及び過敏性肺炎のチオレドキシンスーパーファミリーのポリペプチドを有効成分とする予防ないし治療剤。
項１０．呼吸器系疾患が気道過敏症である項２に記載の予防ないし治療剤。
項１１．チオレドキシンスーパーファミリーのポリペプチドがヒトチオレドキシンである項１〜１０に記載の予防ないし治療剤。

本発明の予防ないし治療剤は、肥満細胞の脱顆粒抑制作用を有することから、肥満細胞が深く関与するＩ型アレルギー反応によるアレルギー性疾患、特にアトピー型気管支喘息、および花粉症等アレルギー性鼻炎の予防ないし治療剤として有用である。

また、本発明の予防ないし治療剤は、気道過敏性及び炎症部位における好酸球の増加を強く抑制することから、呼吸器炎症疾患、呼吸器過敏症、又は好酸球性肺疾患にも有効である。

本発明によれば、体内でも発現する内因性のチオールタンパクであるチオレドキシンを有効成分とするため、副作用の心配がない。

本明細書において呼吸器系又は呼吸器とは、肺胞におけるガス交換に関係する全ての器官を指し、鼻腔、副鼻腔、咽頭、喉頭、気管、気管支、肺等が含まれる。

本明細書において、ヒトチオレドキシン（ｈＴＲＸ）とは、配列番号１に示される１０５個のアミノ酸からなるポリペプチドを指す。

本発明のＴＲＸｓは、ヒトチオレドキシン以外に「チオレドキシンスーパーファミリー」に属するものであればよく、その活性中心に−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−、−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−、−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−、−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−有するポリペプチド類を有するものが例示される。これらの中でも、活性中心に配列−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−を有するチオレドキシン又はチオレドキシン２（ミトコンドリア特異的チオレドキシン）が好ましい。

本発明のチオレドキシン誘導体は、配列番号１のヒトチオレドキシンをもとにして公知の遺伝子工学的手法により誘導体を製造することができる。該誘導体は、配列番号１の３２位と３５位以外、好ましくは３２位〜３５位以外のアミノ酸の１又は複数個、好ましくは１又は数個が置換、欠失、付加、挿入され、且つ、肥満細胞の脱顆粒抑制活性、気道過敏性抑制活性、及び好酸球増加抑制活性を有するものである。なお、配列番号２は、配列番号１の核酸配列を表す。

ＴＲＸｓは、肥満細胞の脱顆粒抑制作用、及び肥満細胞から放出されるサイトカインの産生（分泌）抑制作用を有し、これらのサイトカインに起因するアレルギー性疾患の予防ないし治療剤として有効である。

肥満細胞から放出されるサイトカインとしては、ヒスタミン、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α等が挙げられ、ヒスタミン、ＩＬ−２及びＩＬ−６は特にアレルギー性疾患との関連が深く、これらの産生（分泌）を抑制することにより、アレルギー性疾患の予防ないし治療効果を得ることができる。

ヒスタミン、ＩＬ−２、ＩＬ−６と関連するアレルギー性疾患としては、アトピー型気管支喘息、花粉症等のアレルギー性鼻炎があげられる。

ＴＲＸｓは、肥満細胞の脱顆粒抑制作用に加え、気道過敏性の抑制作用も有する。この作用を利用し、本発明の予防ないし治療剤は、呼吸器炎症疾患又は呼吸器過敏症の予防又は治療を目的として用いることができる。ここで、呼吸器炎症疾患とは、気管支喘息等の気道炎症疾患を指す。また、本発明の予防ないし治療剤は、抗原又は化学物質が誘導する呼吸器炎症疾患又は呼吸器過敏症に有効であり、特にアスピリン誘導性の呼吸器炎症疾患又は呼吸器過敏症に高い効果を有する。

また、本発明者らは、ＴＲＸｓが、炎症部位における好酸球の増加抑制作用を有することを見出した。この作用を利用し、単純性好酸球増加症、急性好酸球性肺炎、慢性好酸球性肺炎、好酸球増多症候群、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、アレルギー性肉芽種性血管炎、寄生虫感染、過敏性肺炎等の好酸球性肺疾患の予防又は治療剤としても好ましく使用できる。

さらに、本発明者らは、チオレドキシントランスジェニックマウスにおいてＤＥＰ（Ｄｉｅｓｅｌ ｅｘｈａｕｓｔ Ｐａｒｔｉｃｌｅ：ディーゼル排気微粒子）肺傷害モデルを作製したところ、ワイルドタイプのマウスに比べ、肺傷害が極めて軽度であることを見出した。

ＤＥＰは、ディーゼルの燃焼によって生成した化学物質が炭素粒子核の周りに付着した微粒子である。この微粒子は、大気汚染の原因の１つとされ、容易にヒト呼吸器内に吸入されることが知られている。ＤＥＰの吸入は、肺、気管支等の呼吸器組織及び細胞の炎症、線維化、壊死等の原因となり、気管支喘息、肺気腫、慢性気管支炎等の大気汚染系疾病を引き起こすと考えられている。

ＤＥＰ肺障害モデルの予防ないし治療に有用な化合物は、大気の汚染物質（排ガス、喫煙ガス、粉塵、煤煙等）による肺障害に広く有効であると考えられる。

したがって、本発明の予防ないし治療剤は、喫煙、又は排ガス、粉塵、煤煙等の大気汚染によって引き起こされる呼吸器系疾患の予防ないし治療に有効である事が示唆される。

本発明に係るアレルギー性疾患の予防ないし治療剤の投与経路としては、経口および非経口のいずれでも投与することができ、臨床医によって適宜選択される。また有効成分であるチオレドキシンを単独または通常使用される担体と共に投与することができる。

本発明の予防ないし治療剤を経口投与する場合は、薬剤の形態として、錠剤、丸剤、散剤、被覆錠剤、顆粒剤、カプセル剤等の固形製剤、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等の液状製剤、エアゾール剤、アトマイザー、ネブライザー等の吸入剤、およびリポソーム封入剤等があげられる。

本発明に係る予防ないし治療剤は、上記の有効成分と共に薬学的に許容される製剤担体を用いて、医薬製剤の形態として実用される。該製剤担体としては、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、吸収促進剤、保湿剤、吸着剤、滑沢剤、充填剤、増量剤、付湿剤、防腐剤、安定剤、乳化剤、可溶化剤、浸透圧を調節する塩、緩衝剤等の希釈剤又は賦形剤を例示でき、これらは得られる製剤の投与単位形態に応じて適宜選択使用される。

錠剤の形態に成形するに際しては、上記製剤担体として例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、リン酸カリウム等の賦形剤、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム等の崩壊剤、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド等の界面活性剤、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤、第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤、グリセリン、デンプン等の保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等を使用できる。

さらに錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠とすることができる。この剤皮の層の数によって二重錠、多層錠とすることができる。

丸剤の形態に成形するに際しては、製剤担体として例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤、アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等の結合剤、ラミナラン、カンテン等の崩壊剤等を使用できる。

本発明の予防ないし治療剤を非経口投与する場合は、薬剤の形態として静脈注射、皮下注射、皮内注射、筋肉注射および腹腔内注射などに使用される注射剤（液剤、乳剤、懸濁剤等）、液剤（例えば、点眼剤、点鼻薬等）、懸濁剤、乳剤、点滴剤等があげられる。

本発明薬剤が液剤、乳剤、懸濁剤等の注射剤として調製される場合、これらは殺菌され且つ血液と等張であるのが好ましく、これらの形態に成形するに際しては、希釈剤として例えば水、エチルアルコール、マクロゴール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を使用できる。なお、この場合、等張性の溶液を調整するに充分な量の食塩、ブドウ糖あるいはグリセリンを本発明薬剤中に含有させてもよい。また、通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤等を添加してもよい。

本発明の予防ないし治療剤が液状製剤である場合は、凍結保存または凍結乾燥等により水分を除去して保存してもよい。凍結乾燥製剤は、使用時に注射用蒸留水等を加え、再度溶解して使用される。

さらに、本発明に係る予防ないし治療剤中には、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を含有させて調製することもできる。

ＴＲＸファミリーに属するポリペプチドの有効量は、当業者が従来の技術を参考に容易に決定することができるが、例えば、体重１ｋｇあたり０．１ｍｇ−１０ｇ程度、好ましくは１−１０ｍｇ程度、より好ましくは１−５００ｍｇ程度である。

これを１日あたり１回又は数回に分けて投与することができるが、各種製剤の形態、患者の性別、年齢、疾患の程度に合わせて適宜調節することが好ましい。

以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明は、これらの実施例により何ら限定されるものではなく、本発明の技術分野における通常の変更ができることは言うまでもない。

チオレドキシンによる肥満細胞のサイトカイン産生抑制効果
１．細胞の調製
Ｃ５７ＢＬ／６マウスとＴＲＸトランスジェニックマウス（味の素株式会社）を解剖して、大腿骨をとり、２７Ｇ針を付けた注射筒（１０ｍｌの培地（非働化した牛胎児血清１５％、Ｌ−グルタミン２００ｍＭ、β−メルカプトエタノール５０ｍＭ、ｒｍＩＬ−３１００ｐＭ含有ＲＰＭＩ）を内部に有する）に該大腿骨由来の骨髄（５ｍｌ）を採取し、２５ｃｍ^２Ｔフラスコに骨髄を流し入れて培養した。１週間目に中フラスコに移し３０ｍｌの培地を添加した後、さらに２週間目に１７５ｃｍ^２Ｔ大フラスコに移し１００ｍｌの培地で培養を継続した。培養開始から４−５週間目で肥満細胞を得た（図１）。
２．肥満細胞のサイトカイン産生能
１ｘ１０^７個の肥満細胞を１０ｍｌの１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ培地に懸濁後、ａｎｔｉ−ＤＮＰ（抗ジニトロフェニル）ＩｇＥ抗体を最終濃度１−２μｇ／ｍｌで添加し、１８時間培養した。細胞を回収しＰＢＳで洗浄後、培地に最終濃度１×１０^６個／ｍｌで懸濁し、９６穴プレートに２００μｌずつ添加し培養した。２−３時間後、ＤＮＰ−ＢＳＡを最終濃度３０ｎｇ／ｍｌになるように加え、１８時間培養した（図１）。培養上清中のサイトカイン（ＩＬ−２，ＩＬ−６）をＥＬＩＳＡ法で測定した結果、ＴＲＸ高発現肥満細胞からのＩＬ−２とＩＬ−６の産生量が、コントロールマウス由来肥満細胞に比べて有意に低かった（図２−ａおよび図２−ｂ）。

チオレドキシンによる肥満細胞の脱顆粒抑制効果
１．肥満細胞の調製と抗原感作
１×１０^７個の肥満細胞を１０ｍｌの１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ培地に懸濁後、ａｎｔｉ−ＤＮＰ ＩｇＥ抗体を最終濃度１〜２μｇ／ｍｌで添加し、１８時間培養した。この細胞を回収してＰＢＳで洗浄後、ＰＢＳに最終濃度１×１０^７個／ｍｌで懸濁し、９６穴プレートに２５０μｌずつ添加し培養した。１０分後、ＤＮＰ−ＢＳＡを最終濃度３０ｎｇ／ｍｌになるように加え、２０分培養した。次に、１０μｌの反応停止緩衝液（４ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１％グルコース、１％ゼラチン）を添加し、氷上に置いた後、培養上清を回収した（図３）。
２．ヒスタミンの定量
ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ９．５）で平衡化したＳｈｏｄｅｘ−Ａｓａｈｉｐａｋ ＯＤＰ−５０ ４Ｄ（東ソー）に肥満細胞の培養上清を注入後、流速０．５ｍｌ／分で緩衝液を流し、ヒスタミン量を検出（励起波長３３０ｎｍ、発光波長４４０ｎｍ）するクロマトグラフィーを行った。その結果、ＴＲＸ高発現肥満細胞からのヒスタミン産生量が、コントロールマウス由来肥満細胞に比較して低値であった（図４）。

呼吸器炎症疾患又は呼吸器過敏症の予防又は治療効果確認試験
本実施例で用いた動物、試薬及び試験方法は以下の通りである。
１．使用動物
動物は７週齢のＢａｌｂ／ｃ雌マウス（日本チャールス・リバー）を使用した。
２．試薬
感作用の卵白アルブミンはＡｌｂｕｍｉｎ； Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ （ＳＩＧＭＡ社製； 以下、ＯＶＡと略す） を必要量秤量した後ＰＢＳで希釈し、これをアルミニウムゲル：Ａｌ（ＯＨ）_３（Ａｌｕ−Ｇｅｌ−Ｓ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ， ｒｅｓｅａｒｃｈ ｇｒａｄｅ， ｓｔｅｒｉｌｅ； ＳＥＲＶＡ社製）を用いて、５０μｇ ／ ｍｌとなるように用時調製して使用した。誘発用の卵白アルブミンは、ＯＶＡを必要量秤量し、ＰＢＳを用いて５％溶液となるように調製して使用した。マウスへの麻酔は、塩酸ケタミンを使用した。気道過敏性測定用のアセチルコリンはＡＣＥＴＹＬＣＨＯＬＩＮＥＣＨＬＯＲＩＤＥ（ＳＩＧＭＡ社製； 以下、Ａｃｈと略す）を用い、ＰＢＳで希釈し使用した。Ｈｕｍａｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎは味の素より供与、 ｍｕｔａｎｔ ｈｕｍａｎ Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ（Ｃ３２Ｓ／Ｃ３５Ｓ）は中村らの方法（Ｎａｋａｍｕｒａ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， ２００１． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９８（２６）：１５１４３−８．）で作成した。
３．気道過敏性の測定
気道過敏性は、Ｗｈｏｌｅ Ｂｏｄｙ Ｐｌｅｔｈｙｓｍｏｇｒａｐｈｙを用いて覚醒・自発呼吸下のマウスでＰｅｎｈを気道収縮の指標として測定した。最初にＰＢＳを吸入させＰｅｎｈのｂａｓｅ ｌｉｎｅの値を測定し、次いでＡｃｈ ０．７５ ｍｇ／ｍｌから順次高濃度のものを吸入させＰｅｎｈの変化を観察する。そして、Ｐｅｎｈがｂａｓｅ ｌｉｎｅの２倍になったところのＡｃｈ濃度をＥＣ_２Ｐｅｎｈと表現した。
４． 気管支肺胞洗浄
気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）は、マウスを麻酔し気管内挿管をした状態でＰＢＳを２．５ｃｍＨ_２Ｏで気管内へ注ぎ、洗浄液を回収した。回収した気管支肺胞洗浄液は、細胞数のｃｏｕｎｔをし、Ｍａｙ−Ｇｉｍｓａ染色したあと細胞分画のｃｏｕｎｔを行った。

本実施例は、被験動物（Ｂａｌｂ／ｃ）を下記の４群に分けて行った。
（第１群）ｎｏｎ−ｔｒｅａｔ群（ｃｏｎｔｒｏｌ）
（第２群）代表的な抗原刺激物質・卵白アルブミン（ＯＶＡ）の腹腔内投与を行い感作した群。
（第３群）ＯＶＡによる感作の後、ＯＶＡ吸入、すなわちｃｈａｌｌｅｎｇｅを行った群。
（第４群）ＯＶＡ感作を行い、ｃｈａｌｌｅｎｇｅを行う前に、ＴＲＸ：４０μｇ／ｈｅａｄを腹腔内投与をした群。
投与スケジュール：
（第２群）
初日と５日後にＯＶＡ：８μｇ／ｈｅａｄを腹腔内投与し、１７日目に気道過敏症の測定とＢＡＬを行った。
（第３群）
第２群と同様、初日と５日目にＯＶＡの腹腔内投与を行い、１８日目にＯＶＡの吸入によるｃｈａｌｌｅｎｇｅをし、そして１９日後に気道過敏症の測定とＢＡＬを行った。
（第４群）
第３群と同様、ＯＶＡ感作し、ｃｈａｌｌｅｎｇｅ前の１６日目，１７日目，１８日目、ＴＲＸ ４０μｇの腹腔内投与を行った。その後ｃｈａｌｌｅｎｇｅを行い、１９日目に気道過敏症の測定とＢＡＬを行った。

気道過敏症の変化
図５は、気道過敏症の変化を示したものである。

Ｐｅｎｈとは、ｂｏｄｙ ｐｌｅｔｈｉｓｍｏｇｒａｐｈｙを用いて測定したもので、気道抵抗の測定と気流の変化から求めた、気道過敏症の指標である。値が高いほど、気道性過敏症が亢進していることを示す。

ＯＶＡ感作、ｃｈａｌｌｅｎｇｅを行った群ではＰｅｎｈの上昇を認め、また、ＴＲＸを投与すると気道過敏症が抑制されていることが分かった。

図６は、ＰＢＳ吸入時のＰｅｎｈをｂａｓｅとして、Ｐｅｎｈが２倍となったところのアセチルコリン（Ａｃｈ）濃度をＥＣ２Ｐｅｎｈと表現し、ｌｏｇ計算してグラフにしたものである。ＥＣ２Ｐｅｎｈの値が低いほど、気道過敏症は亢進していることを表す。

Ｎｏｎ−ｔｒｅａｔ 群とＯＶＡ感作、ｃｈａｌｌｅｎｇｅ群との比較により、感作、ｃｈａｌｌｅｎｇｅ群で有意に気道過敏症が亢進しているのが分かった。また、ＴＲＸ投与群では、感作、ｃｈａｌｌｅｎｇｅ群に比べ気道過敏症が有意に抑制されていた。

ＢＡＬの結果
図７は、マウスを麻酔し、ＢＡＬを行い、回収したＢＡＬ液中の細胞数をｃｏｕｎｔしたものである。図の左から、Ｔｏｔａｌ ｃｅｌｌ、単球、好中球、好酸球の数を示している。

図８は、図７から、好酸球だけをピックアップしたものである。
ＯＶＡ感作、ｃｈａｌｌｅｎｇｅ群では有意に好酸球の上昇がみられ、ＴＲＸ投与群ではそれが抑制されていることがわかった。

結果より、ｃｈａｌｌｅｎｇｅ前のＴＲＸ投与によって、ＯＶＡ感作及びｃｈａｌｌｅｎｇｅによる気道過敏症の亢進、及びＢＡＬ液中の好酸球増加が抑制されることがわかった。

実施例３と同様の方法で、ｈｕｍａｎ ＴＲＸ（Ｗｉｌｄ ＴＲＸ）及びｍｕｔａｎｔ ｈｕｍａｎ Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ （Ｃ３２Ｓ／Ｃ３５Ｓ）を用いて、試験を行った。

その結果、ｍｕｔａｎｔ ｈｕｍａｎ Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎでは、気道過敏の抑制及びＢＡＬ液中の好酸球数の抑制が見られなかった（図９−ａ、９−ｂ、１０−ａ、１０−ｂ）。

Ｃ５７ＢＬ／６マウス及びＴＲＸトランスジェニックマウス（味の素株式会社）を用いてＤＥＰ肺障害モデルを作製した。麻酔したマウスの気管から、ＤＥＰ気管内注入（ｉｎｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ）した。その後、肺を摘出し、パラフィン包埋して切片を作製した後、ヘマトキシリン・エオシン染色を行った。

その結果、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの肺組織は、好中球およびリンパ球の肺細胞への浸潤が見られるのに対し、ＴＲＸトランスジェニックマウスでは、これらの細胞の肺細胞への浸潤が極めて軽度であった（図１１）。

実施例１の実験方法を示す。 ＴＲＸ高発現肥満細胞およびコントロール細胞におけるＩＬ−２の産生量の比較を表す。図中、Ｂ６はコントロール細胞、ＴＲＸｔｇは、ＴＲＸ高発現肥満細胞を表す。 ＴＲＸ高発現肥満細胞およびコントロール細胞におけるＩＬ−６の産生量の比較を表す。図中、Ｂ６はコントロール細胞、ＴＲＸｔｇは、ＴＲＸ高発現肥満細胞を表す。 実施例２の実験方法を示す。 ＴＲＸ高発現肥満細胞およびコントロール細胞におけるヒスタミン放出量を表す。図中、Ｂ６はコントロール細胞、ＴＲＸｔｇは、ＴＲＸ高発現肥満細胞を表す。 Ｐｅｎｈによって、ＴＲＸ−Ｐの投与による、気道過敏症の抑制効果を示した図である。 ＥＣ２Ｐｅｎｈによって、ＴＲＸの投与による、気道過敏症の抑制効果を示した図である。 回収したＢＡＬ液中の細胞数（Ｔｏｔａｌ ｃｅｌｌ、単球、好中球、好酸球）を示す図である。 図７から、好酸球だけをピックアップした図である。 ＥＣ２Ｐｅｎｈによる、ｗｉｌｄ ＴＲＸの投与による、気道過敏症の抑制効果を示した図である。 ＥＣ２Ｐｅｎｈによる、ｍｕｔａｎｔ ｈｕｍａｎ ＴＲＸの投与による、気道過敏症の抑制効果を示した図である。 ｗｉｌｄ ＴＲＸの投与を行ったマウスから回収したＢＡＬ液中の好酸球数を示す図である。 ｍｕｔａｎｔ ｈｕｍａｎＴＲＸの投与を行ったマウスから回収したＢＡＬ液中の好酸球数を示す図である。 ＤＥＰを気管内注入した、ＴＲＸトランスジェニックマウス（ＴＲＸ Ｔｇ）及びＣ５７ＢＬ／６マウスにおける肺組織切片（×１２、×１００）を示す。

Claims (11)

1. チオレドキシンスーパーファミリーのポリペプチドを有効成分とする肥満細胞の脱顆粒を伴うアレルギー性疾患の予防ないし治療剤。
2. チオレドキシンスーパーファミリーのポリペプチドを有効成分とする気道過敏性の亢進及び／又は炎症部位における好酸球の増加を伴う呼吸器系疾患の予防ないし治療剤。
3. 該アレルギー性疾患が、アトピー型気管支喘息、アレルギー性鼻炎又は花粉症である請求項１に記載の予防ないし治療剤。
4. 該呼吸器系疾患が呼吸器炎症疾患又は呼吸器過敏症である請求項２に記載の予防ないし治療剤。
5. 該呼吸器炎症疾患又は呼吸器過敏症が、気道炎症疾患、気道過敏症又は好酸球性肺疾患である請求項２に記載の予防ないし治療剤。
6. 該気道炎症疾患が気管支喘息である請求項２に記載の予防ないし治療剤。
7. 該呼吸器炎症疾患又は呼吸器過敏症が、アスピリン誘導性のものである請求項２に記載の予防ないし治療剤。
8. 該好酸球性肺疾患が、単純性好酸球増加症、急性好酸球性肺炎、慢性好酸球性肺炎、好酸球増多症候群、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、アレルギー性肉芽腫性血管炎、寄生虫感染及び過敏性肺炎からなる群より選択される、いずれか１つである請求項２に記載の予防ないし治療剤。
9. 以下の疾患：
   アトピー型気管支喘息、アレルギー性鼻炎、花粉症、気管支喘息、アスピリン誘導性の呼吸器炎症疾患又は呼吸器過敏症、単純性好酸球増加症、急性好酸球性肺炎、慢性好酸球性肺炎、好酸球増多症候群、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、アレルギー性肉芽腫性血管炎、寄生虫感染及び過敏性肺炎のチオレドキシンスーパーファミリーのポリペプチドを有効成分とする予防ないし治療剤。
10. 呼吸器系疾患が気道過敏症である請求項２に記載の予防ないし治療剤。
11. チオレドキシンスーパーファミリーのポリペプチドがヒトチオレドキシンである請求項１〜１０に記載の予防ないし治療剤。

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