KR20100059560A - 감태 추출물을 이용하여 천식 반응을 완화 또는 방지하는 방법과 그 조성물 - Google Patents

Abstract

동물에서의 천식을 완화 또는 방지하는 방법이 제공된다. 구체적으로는, 상기 방법은 동물에서의 SOCS-3 발현을 억제하는데 효과적인 양의 감태 추출물을 포함하는 조성물을 상기 동물에 투여하여 상기 동물에서의 천식을 완화 또는 방지하는 단계를 포함한다.

천식, 감태 추출물, SOCS-3

Description

감태 추출물을 이용하여 천식 반응을 완화 또는 방지하는 방법과 그 조성물{METHOD FOR ALLEVIATING OR PREVENTING ASTHMATIC REACTIONS BY USING ECKLONIA CAVA EXTRACTS AND COMPOSITION THEREOF}

본 발명은 천식 반응을 감소시키기 위한 감태(Ecklonia cava; EC) 추출물의 이용에 관한 것으로서, 특히, 기도 과민성(AHR), 기도 염증 등과 같은 천식 반응을 완화 또는 방지하는 방법과 감태 추출물의 조성물에 관한 것이다.

천식이란, 기관지의 과민성에 의해 특징지어지는 염증성 질병으로서, 생명을 위협할 정도의 기도 장애로 이어질 수 있고, 숨을 색색거리거나 숨을 쉴 때(특히 숨을 내쉴 때) 어려움을 느끼거나 가슴이 답답한 것과 같은 증상의 원인이 될 수 있다. 천식 발작을 유발시키는 것으로는 온도나 습도의 갑작스러운 변화, 알레르기, 상부 호흡기 감염, 격렬한 운동, 스트레스, 및 심한 흡연이 있다.

상기 유발 요인들 가운데, 면역 반응을 야기하는 흡입된 알레르기 항원은 가장 흔한 요인 중 하나이다. 천식 환자에 있어서, 내부 기도로 들어온 흡입된 알레르기 항원은 항원 전달 세포로 알려진 일종의 세포에 의해 섭취된다. 항원 전달 세포는 다른 면역 세포에, 예를 들면 인체가 어떠한 감염에 대항해 싸우도록 돕는 일종의 백혈구 세포인 T 조력 세포에, 알레르기 항원의 조각을 전달한다. 건강한 사람에서는, 그러한 면역 세포가 알레르기 항원 분자를 확인하지만, 종종 무시하기도 한다. 그러나 천식 환자에서는, 이러한 세포는 T helper 2(Th2)와 같은 다른 종류의 세포로 전달된다. 결과적으로 Th2 세포는 면역 체계(예를 들면, 체액 면역 체계)에서 중요한 부문이다. 체액 면역 체계는 흡입된 알레르기 항원에 대항하기 위한 항체를 생성한다. 이후에, 천식 환자가 동일한 알레르기 항원을 흡입할 때, 이 항체가 그것을 인식해서 체액 반응을 활성화시킨다. 그 결과로, 화학 물질이 생성되어, 기도가 수축되고 더 많은 가래가 배출되며 면역 체계의 세포 매개 부문이 활성화된다.

천식 발현 중에, 염증이 생긴 기도는 매연, 먼지, 또는 꽃가루와 같은 환경적 유발 인자에 반응한다. 기도는 축소되고, 과도한 가래가 생성되며, 호흡하기 어렵게 된다. 본질적으로, 천식은 기관지 기도에서의 면역 반응의 결과이다.

보다 상세하게는, Th2형 시토카인 인터루킨4(IL-4), IL-5, 및 활성 CD4⁺ T 세포에 의해서 생성된 IL-13은 면역 글로블린 E(IgE) 생성, 비만 세포 성장, 및 비만 세포와 호산구의 분화 및 활성화의 주요 프로세스를 조절함으로써 천식 발병 기전에 중요한 역할을 하며, 여기서 CD4⁺ T 세포는 B 세포가 감염(challenge)에 응답하여 항체를 만들도록 돕는다. 유전적 환경적 요인들이 Th1 또는 Th2 세포의 발달에 영향을 미친다. Th 세포들의 분화 방향은 초기 항원 활성화 부위의 시토카인 환경에 의해 결정된다. 유도기 동안 IL-4가 존재한다는 것은 Th2 세포가 우세하도 록 하고 이것은 결과적으로 상기 기술한 바와 같이 알레르기 염증 반응을 결정한다는 것은 잘 알려진 사실이다. Th2 세포는 천식 환자의 기도에 침투하는 우세한 림프구 집단이다. 또한, Th2 세포의 시토카인 생성물은 기도 호산구 증가증, 기도 과민성 및 혈청 IgE 생성에 필수적인 역할을 수행한다.

호산구는 골수에서 생성되며, 쥐와 인간 모두에서 최근 관찰된 바에 따르면, 폐의 항원 노출은 조혈 조직에서의 호산구 증가뿐만 아니라, 폐로의 Th2 세포의 이동 증가도 야기하는 것으로 나타났다. 궁극적으로 진행성인 염증성 조직 손상을 유도하는 것은 항원 노출에 대한 후기 반응 동안 축적된 활성화 호산구이다. 따라서, Th1 시토카인 생성을 확대하여 Th2 시토카인을 억제하는 것이 알레르기성 천식 치료에 유용하다는 것이 증명될 수 있다.

반면에, 시토카인 신호 전달 억제 인자(SOCS)는 시토카인 신호 전달의 네거티브 조절 인자로서 기능하는 분자이다. SOCS는 염증성 질환을 앓는 숙주(예컨대, 동물 또는 인간)의 발병 기전에 관련되어 있는 것으로 알려져 있다. SOCS 단백질의 발견은 Th1 및 Th2 면역 반응의 시토카인 통제에 새로운 영감을 제공해 주었다. SOCS 단백질 군의 8가지 구성요소는 다음과 같이 인식된다: 시토카인 유도 src 상동성 2(SH2) 영역 포함 단백질 및 SOCS-1 내지 SOCS-7.

SOCS 단백질 중에서, SOCS-3는 Th2 세포에서 선택적으로 발현되며, Th2 매개성 알레르기 질병의 발병과 유지를 통제하는데 중대한 역할을 한다. 또한, 혈청 IgE의 농도는 천식 환자에서 증가되며, 이것은 높은 SOCS-3 발현의 증거로서 해석될 수 있다. 반면에, SOCS-5는 Th1 세포에서 선택적으로 발현되며, 이 발현의 결 과로서, IL-4 신호 전달의 억제에 기인하여 Th2 분화가 감소한다.

따라서, SOCS-3 발현을 억제하는 것은, 알레르기 천식을 포함하여, Th2-우세 질병의 치료에 유용한 치료 방법이 될 수 있다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 감태 추출물을 이용하여, SOCS-3 발현을 억제하고 천식의 발병 기전 과정을 억제함으로써, 기도 과민성, 기도 염증 등과 같은 천식 반응을 완화하거나 방지하는 것이다.

본 발명의 일 태양에 따르면, 동물에서의 천식을 완화 또는 방지하는 방법으로서, 동물에서의 SOCS-3 발현을 억제하는데 효과적인 양의 감태 추출물을 포함하는 조성물을 상기 동물에 투여하여 상기 동물에서의 천식을 완화 또는 방지하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법이 제공된다.

본 발명의 다른 태양에 따르면, 동물에서의 SOCS-3 발현을 억제하여, 상기 동물에서 천식을 완화 또는 방지하는데 효과적인 양의 감태 추출물을 포함하는 조성물이 제공된다.

본 발명에 의하면, 감태 추출물을 이용하여, SOCS-3 발현을 억제하고 천식의 발병 기전 과정을 억제함으로써, 기도 과민성, 기도 염증 등과 같은 천식 반응이 완화되거나 방지된다.

후술하는 본 발명에 대한 상세한 설명은, 본 발명이 실시될 수 있는 특정 실시예를 예시로서 도시하는 첨부 도면을 참조한다. 이들 실시예는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있기에 충분하도록 상세히 설명된다. 본 발명의 다양한 실시예는 서로 다르지만 상호 배타적일 필요는 없음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 여기에 기재되어 있는 특정 형상, 구조 및 특성은 일 실시예와 관련하여 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 다른 실시예로 구현될 수 있다. 또한, 각각의 개시된 실시예 내의 개별 구성요소의 위치 또는 배치는 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 변경될 수 있음이 이해되어야 한다. 따라서, 후술하는 상세한 설명은 한정적인 의미로서 취하려는 것이 아니며, 본 발명의 범위는, 적절하게 설명된다면, 그 청구항들이 주장하는 것과 균등한 모든 범위와 더불어 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다. 도면에서 유사한 참조부호는 여러 측면에 걸쳐서 동일 또는 유사한 기능을 지칭한다.

또한, 본 발명을 위하여 수행된 실험들이 이하에서 상세히 설명되지만, 이들 실험은 예시적으로 기술되는 것일 뿐 본 발명을 제한하는 것으로 해석되지는 않아야 할 것이다.

발명의 실시를 위한 물질과 방법

첫째, 본 발명을 실시하기 위해 필수적인 감태 추출물 준비 과정을 이하에서 상세히 기술한다.

감태는 갈조류(Laminariaceae)로서, 대한민국 제주도의 조하대 지역에서 풍 부하게 발견된다. 최근, 감태의 자유기 소거능, 바탕질 금속 단백 분해 효소 억제능, 항균 작용, 단백 분해 효소 억제능, 항산화 작용, 항염증 작용 등을 보여주는 더 많은 증거들이 발견되고 있다.

본 발명에 따르면, 천식 반응을 완화 또는 방지하기 위한 재료는 아래와 같이 추출되고 정제된다.

감태는 2004년 10월에서 2005년 3월까지의 기간 동안, 대한민국 제주도 해안을 따라 수집되었다. 감태는 감태 표면에 붙어있는 소금, 착생 식물, 모래 등과 같은 이물질을 제거하기 위해 수도물에 세 번 세척되었다. 그런 다음, 영하 20℃에서 저장되었다. 이 동결된 감태 표본은 추출되기 전에, 분쇄기를 이용해서, 감압 하에 동결 건조되고 균질화되었다. 마지막으로, 감태 분말은 감태 추출물을 얻기 위해 유기 용제에 침지되었다. 이 추출을 위해 유기 용제는, 바람직하게는, 메탄올, 에탄올, 에틸 아세테이트, 아세토니트릴, 아세톤, 물 및 그 혼합 용액, 및 물/에탄올 혼합 용액으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것이 유용하다. 선택 사항으로서, 상기 추출 과정은, 각각의 반복 단계에 사용되는 용제를 달리하여, 그 수율을 증가시키기 위해 최소 2번 반복될 수 있다.

본 발명에서는, 말린 감태 분말 1 kg이, 예를 들면, 95% EtOH(1:10 w/v)으로 추출되고 진공 증착된다. 불필요한 물질과 남아 있는 용제를 추출물에서 제거하기 위해, 원심 분리기와 회전 증발 농축기와 같은 분리 및 농축 기구가 사용될 수 있다.

둘째, 본 발명에 따른 실험에 사용되는 동물을 설명한다.

암컷 BALB/c 쥐들은 Charles River Laboratories(요코하마, 일본)에서 획득한 것으로, 여기서 BALB/c는 실험실 쥐의 백색 균주이며, 사용 전 최소 1주일 동안 동물 시설에서 유지된 것이다. 본 발명에 사용된 모든 실험용 동물은 인제대 의대(Inje University Medical School)의 동물 실험 윤리 위원회에 의해 승인된 프로토콜에 따라 유지되었다. 모든 쥐들의 연령은 6-8주이며, 평균 몸무게는 20g이었다.

이하에서는, 전술한 쥐에 대한 예방 접종과 시험 감염에 대해 기술한다.

쥐들은 복강 내에 20μg의 OVA에 1.0mg 수산화 알루미늄 항원 보강제를 더하여 첫째날과 15일째날에 면역시켰다. 쥐들은 식염수에 50mg/ml의 OVA로 기도를 통해 22일째날부터 24일째날까지 매일 감염되었다. 대조군 쥐들은 식염수 분무에 노출되었다. 분무는 초음파 분무기(NE-U12, Omron, 동경, 일본)에 연결된 세로 15cm, 가로 25cm, 높이 15cm의 규격을 가진 챔버에 쥐를 배치해서 20분 동안 수행되었다. 쥐들은 감태 추출물 20μl에 20mg/kg/일의 OVA로 16일째부터 20일째까지 매일 복강 내 주사를 맞았다.

그 다음, 기관지 폐포 세척과 세포수 측정을 아래와 같이 수행하였다.

쥐들을 마취시키고, 가슴을 부드럽게 마사지하면서, 기관에 캐뉼러를 꽂았다. 폐는 인산염 완충 식염수(PBS) 0.7ml로 세척되었다. 기관지 폐포 세척액 표본이 수집되어, 50μl 부분 표본에 있는 세포의 수를 혈구 계산기를 사용하여 결정하였다. 이 혈구 계산기는 주어진 용량에서 혈구를 계산하기 위한 챔버를 가진 유리 슬라이드이다. 남은 표본은 원심 분리시켜, 그 상청액을 시토카인 분석 때까지 -70°C에서 보관하였다. 침전물은 PBS로 현탁시켰다. 기관지 폐포 세척 세포의 Cytospin 준비물은 Diff-Quik(International Reagents Corp., 고베, 일본)으로 염색되었다. 이것은 조직학 염색(즉, 여러 가지 표본을 재빨리 염색하여 분화시키는 것)에 공통적으로 사용되는 상업용 염색제이다. 본 발명과 관련이 없는 두 명의 익명의 시험자가 현미경을 사용해서 세포 수를 카운트하였다. 약 400개의 세포가 4개의 서로 다른 무작위 위치 각각에서 카운트되었다.

다음으로, 본 발명에서 수행한 시토카인 분석에 대해 설명한다.

기관지 폐포 세척액 속의 시토카인 수준은 효소 결합 면역 흡수법(ELISA)에 의해 결정되는데, 여기서 ELISA는 표본에서 항체 또는 항원의 존재를 검출하기 위해 주로 면역학에서 사용되는 생화학 기술이다. R&D Systems(미네아폴리스, 미네소타)에서 입수한 ELISA 키트를 IL-4, IL-5, IFN-γ 및 TNF-α의 측정에 사용하였으며, 여기서 IFN과 TNF는 각각 인터페론과 종양 괴사 인자를 의미한다.

이어서, 기도 과민성을 결정하는 방법을 상세히 설명한다.

기도 과민성은, Hamelmann 등의 방법에 따라, 제약이 없는 의식 상태에 있는 쥐들에 대해 마지막 OVA 감염된지 3일 이후에 측정되었다. 대기압식 혈량 측정 챔버(All Medicus Co., 서울, 대한민국)에 쥐들을 배치하여, 3분 동안 기저선 판독을 실시하여 평균을 내었다. 이후, 농도를 증가시키며(예를 들면, 2.5 내지 50 mg/ml) 분무 메타콜린(Mch)을 3분 동안 주 챔버의 주입구를 통해 분무하여, 각 분무 이후 3분 동안 판독하여 평균을 내었다. 기관지 폐 저항은 enhanced pause(Penh)로 표현되었고, 이것은 제조업자의 프로토콜에 따라, 공식[expiratory time(Te)/relaxation time(RT)-1] x [peak expiratory flow(PEF)/peak inspiratory flow(PIF)]으로 계산되었다. 다음으로, 메타콜린의 여러 가지 농도에 따라, 감염에 따른 Penh의 증가 비율이 제공될 것이며, 여기서 (식염수 감염 이후) Penh 기저선은 100%로 표현된다.

이하에서는, 본 발명에 따른 조직학 연구에 대해 설명한다.

마지막 감염 48시간 이후, 사용하였던 쥐에서 폐를 제거하였다. 폐 제거에 앞서, 기관 주변에서 묶음실을 사용하여, 4% 파라포름알데히드 고정액으로 폐와 기관의 복강 내를 채웠다. 폐 조직은 10%(v/v) 파라포름알데히드로 고정되었다. 표본은 탈수하여 파라핀에 침지하였다. 조직학 조사를 위해, 고정 침지된 조직 중 4μm 부분을 Leica model 2165 회전형 박절기(Leica, Nussloch, 독일)에서 절단하고, 유리 슬라이드에 배치시켜 파라핀을 제거하였으며, 이어서 헤마톡실린 2와 에오신 Y(Richard-Allan Seientific, Kalamazoo, 미시간)로 착색하였다. 본 발명과 관련이 없는 3명의 독립된 조사자들에 의해 염증 점수를 매겼다.

또한, 본 발명에서 수행한 웨스턴 블롯(western blot) 분석에 대해 기술한다.

웨스턴 블롯(또는, 면역 블롯)은 주어진 조직 균등질 또는 추출물 표본에서 특정 단백질을 검출하는 것이다. 이것은 겔 전기영동을 사용하여, 폴리펩타이드 길이 단위 또는 단백질 3-D 구조 단위로 천연 또는 변성 단백질을 분리한다. 그 다음, 단백질은 막(전형적으로는, 니트로셀룰로오스 또는 PVDF)으로 전달되므로, 타겟 단백질 특이 항체를 사용하여 탐침으로 조사, 검출할 수 있다.

폐 조직은 균질화되었고, PBS로 세척된 후, 폐 단백질 추출물을 얻기 위해, 단백질 분해 효소 저해제 칵테일(Sigma, 세인트루이스, 미주리)을 추가한 라이시스 버퍼에서 배양되었다. 표본에 10% 도데실 황산 나트륨-폴리 아크릴 아미드겔 전기 영동(SDS-PAGE) 겔을 가하여, 니트로셀룰로오스에 전기 전달시켰다. 여기서, SDS-PAGE는 전기장에서 변성 단백질을 분리하는 기술이다. 블롯은 적절한 농도의 특이 항체로 배양되었다. 세척 후에, 이 블롯은 양고추냉이 과산화효소 접합된 2차 항체로 배양되었다. 각 레인에서 단백질의 균등 부하를 보증하기 위해, 이 막은 탈피되어 anti-actin 항체(Sigma)로 다시 블롯팅되었다.

다음으로, OVA 특이 혈청 IgE 수준의 측정을 설명한다.

OVA 특이 혈청 IgE의 수준은 전술한 바와 같이, 마지막 OVA 감염 12시간 이후 수집된 표본을 사용하여, ELISA에 의해 결정되었다. 요약하면, 96웰 미량 역가판을 OVA 10mg/ml로 코팅한 후, 바이오틴 접합 쥐(pharamingen, 샌디에이고, 캘리포니아)의 anti-mouse IgE에 따른 쥐 혈청으로 처리하였다. 그리고 나서, 아비딘-양고추냉이 과산화효소 용액을 각 웰에 추가하였다. 광학 밀도 눈금은 405nm 파장에서의 단위이다.

이하에서는 본 발명에서 수행한 자이모그래피를 예시한다.

젤라틴 자이모그래피는 바탕질 금속 단백 분해 효소-9의 활성도를 평가하는데 사용되었다. 맑은 웃물을 비환원 로딩 버퍼(400mmol/L Tris-HCL, 5% 도데실 황산 나트륨, 20% 글리세롤, 0.006% 브로모 페놀 블루)로 세 번 희석하였다. 각 표본의 15μl를 로딩 버퍼로 혼합하고, 단백질을, 20mA의 일정한 전류를 흐르게 하여 0.75mm의 거리를 두고 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의해 분리시켰다. 여기서, 1% 젤라틴(Bio-Rad)을 포함한 8% 도데실 황산나트륨 용액을 사용하였다. 겔은 도데실 황산나트륨을 제거하기 위해 재생 버퍼(renaturing buffer)(즉, 2.5% Triton X-100 버퍼)에서 30분 동안 배양되었다. 세척 후에, 겔은 효소 활성 버퍼(50mmol/L Tris-HCL[pH 7.3], 200mmol/L 염화나트륨, 및 0.02% Tween 20)에서 37℃, 20분 동안 배양되었다. 그런 다음, 겔은 쿠마시 브릴리언트 블루 R250으로 염색되었고, PBS 용액에서 5% 메탄올, 7% 아세트산으로 탈염되었고, 이후, 젤라틴 융해성 활성도가 선명한 띠로 검출되었다.

이어서, EPO 측정을 설명한다.

기관지 폐포 세척 세포의 현탁액과 폐 균등질은 EPO를 얻기 위해, 37℃에서 액체 질소와 수조를 사용하여 세 번 냉동 및 해동되었다. 기관지 폐포액은 4℃에서 10분 동안 원심 분리되었고, 96웰 배양판(75μl/well)에서 순차적으로 희석되었으며, 이어서 150μl의 기질(0.05M Tris-HCL, pH 8.0의 1.5mM o-페닐렌디아민, 및 6.6mM H₂O₂)을 추가하였다. 실온에서 30분 후, 30% H₂SO₄ 75μl를 추가함으로써 반응을 중단시켰고, 표본의 흡광도를 ELISA 판독기에서 492nm로 결정하였다.

마지막으로, 본 발명에서 수행된 밀도 계측 분석 및 통계를 설명한다.

모든 면역 반응 신호는 밀도 계측 스캐닝(Gel Doc XR; Bio-Rad, Hercules, 캘리포니아) 방법으로 분석되었다. 자료는 평균 ± SEM으로 표시되었다. 통계적 비교는 일원 변량 분석(ANOVA)을 사용하여 수행되었고, 이어서 피셔의 검증, 즉 통 계적 독립성 검증 방법으로 잘 알려져 있고, 종종 의학 연구에서 사용되고 있는 검증이 수행되었다. 2개 군 사이의 유의차는 정규 편차의 계산과 유사한 통계적 방법을 적용한 일측 스튜던트의 t 검증을 사용하여 결정되었다. 통계적 유의도는 P < 0.05 로 설정되었다.

전술한 실험에 기초하여, 감태 추출물을 구성하는 조성물은, 천식 반응을 완화 또는 방지하기 위해, 식품, 식품 보조제 또는 영양 보조 식품에 포함될 수 있다. 당업자는 실험의 결과를, 인간을 포함한 다른 동물에의 유효 투여량을 결정하기 위해, 전술한 세포와 동물에 사용할 수 있다. "유효량"이란, 세포에서의 생체 외 또는 동물에서의 생체 내 알레르기 천식을 억제하기 위한 농도를 말한다. 예를 들면, 인체 시험 투여량은, 몸무게 또는 표면적 단위로, 세포 연구에서의 유효 투여량 또는 생체 내 유효 투여량으로부터 추정될 수 있다. 이러한 추정은 종래기술에서는 관례적이다. 감태 추출물을 구성하는 조성물은, 하나 이상의 충진제를 사용하여, 식품 보조제로 투여되도록 제제될 수 있다. 대체 방법으로, 이러한 추출물을 구성하는 조성물은, 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 운반체 또는 부형제를 사용하여, 통상의 제약으로 투여될 수 있다. 기능성 식품 조성물은, 이것으로 제한하는 것은 아니지만, (입이나 코를 통한) 흡입 또는 통기, 경구, 구강, 비경구적, 질 내 또는 직장 내 투여를 포함한 경로에 의해 투여되도록 제제될 수 있다. 일 실시예인 경구 투여에서, 조성물은 음식에 직접 추가하여, 통상의 식사의 일부로서 섭취될 수 있다. 제약을 식품에 추가 또는 통합시키는 여러 가지 방법들은 당업자에게 알려져 있다.

또한, 본 발명에서 사용되는 조성물은 결합제, 충진제, 윤활제, 붕괴제 또는 침윤제와 같은 약학적으로 허용된 부형제로 종래 수단에 의해 정제 또는 캡슐의 형태로 투여될 수 있다. 정제 또는 캡슐을 형성하는데 사용된 특정 화합물의 예는 U.S. Pharmacopeia에 상세히 기술되어 있다. 감태 추출물을 구성하는 정제는 또한, 종래 기술에 잘 알려진 방법에 의해, 코팅될 수 있다. 또한, 경구 투여를 위해, 용제가 사용될 수 있다. 용제는 용액, 시럽 또는 현탁액, 또는 사용 전 물 또는 적절한 매개체로 재생되는 건조 산물의 형태가 될 수 있다. 이러한 용제는, 현탁화제, 유화제, 비수 매개체, 및 보존제와 같은 약학적으로 허용된 첨가제로 종래 수단에 의해 조제될 수 있다. 다시 말하면, 특정 첨가제는 당업자에 잘 알려져 있고, U.S. Pharmacopeia와 같은 곳에 목록화되어 있다. 일 실시예로, 경구용 약물은 지효성 활성 건강 식품 조성물을 제공하도록 제제될 수 있다. 경구 투여를 위해, 감태 추출물은 정제 또는 로젠지로 제제될 수 있다.

흡입 투여를 위해, 본 발명에서 사용되는 조성물은, 가압 포장 또는 적절한 분사제를 사용하는 분무기에서의 에어로졸 분무 형태로 전달될 수 있다. 가압 에어로졸의 경우에, 투약 단위는 측정된 투여량을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다.

비경구적으로 투여하기 위한 조성물은 덩어리로 혹은 지속적으로 주입할 수 있도록 주사 제제로 될 수 있다. 주사 제제는, 앰플과 같은 단위 투여 형태 또는 보존제를 첨가하여 멀티 투여 단위로 조제될 수 있다. 주사를 위한 조성물은, 유성 또는 수성 매개체로 현탁액, 수용액, 또는 에멀젼의 형태가 될 수 있다. 또한, 이 조성물은 현탁화제, 안정제, 및/또는 분산제와 같은 제제 물질을 포함할 수 있다. 또한, 주요 재료는 사용 전 적절한 매개체로 재생할 수 있는 분말 형태로 제시될 수 있다. 비경구 주사를 위한 제제를 만드는 특정한 예들은 U.S. Pharmacopeia에서 찾아볼 수 있다.

직장 내 또는 질 내 투여를 위해, 본 발명에서 사용되는 조성물은 좌약, 크림, 겔, 또는 정체 관장으로 제제될 수 있다.

식이 보충제를 위해, 감태 추출물은 종래 기술의 방법에 따라, 중량 기준 최대 5%까지 농도를 증가시켜 혼합될 수 있다. 동물을 위한 식이 보충제는, 이것으로 제한하는 것은 아니지만, 수용액, 분말, 또는 고형 알약 형태를 포함한 다양한 형태로 조제될 수 있다. 본 발명에서, 감태 추출물은 단독으로 또는 천식 반응에 영향을 미치는 것으로 알려진 다른 항산화 물질과 결합하여 투여될 수 있고, 여기서 결합 화합물 또는 추출물은 시너지 효과를 낼 수 있다.

따라서, 감태 추출물과 적어도 하나의 다른 항산화 물질로 구성되는 식이 보충제를 결합하는 식이요법은 인간을 포함한 동물에서 천식 반응을 완화하고 방지하는데 유용하다.

상기 물질 및 방법을 사용함에 따른 검증

다음으로, 상기 물질 및 방법을 사용함에 따른 검증 결과를 첨부 도면을 참조하여 보다 상세히 설명한다.

도 1은 본 발명에 따라, OVA 유도성 알레르기 천식을 앓는 쥐에 대해, 기관지 폐포 세척액 속의 염증 세포의 점증에 관한 감태 추출물의 영향을 예시하는 실 험 결과를 도시한 그래프이다.

도 1을 참조하면, 쥐들은 식염수로 처리되었고, OVA 흡입 쥐들에는 식염수가 투여되었고, 다른 OVA 흡입 쥐들에는 40mg/kg의(즉, OVA+EC 추출물의) 감태 추출물이 각각 투여되었다. 기관지 폐포 세척 세포는 원심 분리기를 사용하여 분리하였고, 그 다음 전술한 바와 같이, Diff-Quik으로 염색되었다. 표준 형태 기준을 사용하여, 상이 세포 카운팅을 수행하였다. 기관지 폐포 세척 세포는 마지막 OVA 감염 2일 후 수집되었다. 실험 결과는 수행한 5번의 실험 중 한 번의 대표 실험에서 획득된 것이다. 이 실험에서, 5마리의 쥐가 사용되었다(n=5). 통계적 유의수준은 식염수 처리된 쥐에 대해 *p < 0.05, 그리고 OVA 처리된 쥐에 대해 #p < 0.05로 설정되었다.

쥐 천식에서 마지막으로 OVA 감염된 2일 후, 기관지 폐포 세척액에서 총 세포의 수가 급격히 증가하여, 도 1에서 보는 바와 같이, 식염수 노출된 대조군 쥐의 총 세포수와 비교해 볼 때, 약 5배가 되었다. 또한, OVA 감작 및 감염은 기관지 폐포 세척액 내에서 정상 호산구의 현저한 증가를 유도하였다. OVA 노출된 쥐에서 기관지 폐포 세척액의 호산구의 수는 급격히 증가한 반면, 감태 추출물로 처리된 쥐에서 호산구의 수는 눈에 띄게 감소하였다. 따라서, 감태 추출물은 OVA에 감작되고 OVA에 감염된 쥐의 기관지 폐포 세척액에서 증가한 염증 세포의 수를 감소시킨다고 인정할 수 있다. 또한, 이 결과는 폐 호산구가 어느 정도 억제되는 것과 관련이 있다고 볼 수 있다.

도 2는 본 발명에 따라, OVA에 감작되고 OVA에 감염된 쥐의 폐 조직에서의 병리학적 변화를 도시한다.

쥐들은, 도 1에서 보는 바와 같이, 감작되고 감염되었다. 도 2를 참조하면, 식염수(A)로 처리한 쥐의 폐에서 일부를, 식염수(B)가 투여된 OVA 흡입된 쥐에서 일부를, 40mg/kg의 감태 추출물(OVA+EC 추출물)(C)이 투여된 OVA 흡입된 쥐에서 일부를 각각 획득하였다. 폐는 마지막 기도 감염 2일 후에 제거되었다. 각 일부 조직은 헤마톡실린과 에오신 염색(x 200)으로 염색되었다. 6 마리의 동물을 각 쥐의 군에 할당하였다.

폐 조직의 조직학 검사의 결과는 기관지 폐포액의 세포의 수와 일치하였다. 도 2에서 보는 바와 같이, 식염수 처리된 대조군(A)이 아닌, OVA에 감작되고 OVA에 감염된 쥐들에서 기도로 그리고 혈관 주위에서 염증 세포가 현저히 유입되는 것이 검출되었다. 도 2에서, 감태 추출물(C)로 처리된 쥐들에서는, 세기관지 내 및 혈관 주위 영역의 염증 세포의 침윤이 상당히 감소하는 것을 볼 수 있다. 점액 과다 분비 및 기도 폐쇄는 생쥐 천식 폐의 두드러진 조직 병리학적 특색이다. 분비된 가래가 원인이 되어, 가래 세포 비대와 기도관 축소가, OVA에 감작되고 OVA에 감염된 쥐들(B)에서 발견되었다. 또한, 감태 추출물의 투입으로, 도 2에서 보는 바와 같이, 감태 추출물로 처리된 쥐들(C)에서, 기도관 축소가 현저히 개선될 수 있다는 것을 발견하였다. 이 결과들은, 감태 추출물은, OVA 유도된 천식의 병리학적 변화, 즉 OVA 유도된 천식이 원인이 된 알레르기 상태의 진전을 억제할 수 있다는 것을 나타낸다.

도 3은 본 발명에 따라, 감태 추출물의 IL-4, IL-5 및 TNF-α에 대한 영향을 보여주는 실험 결과를 도시한 그래프이다.

OVA에 감작된 쥐들은 앞에서 언급한 바와 같이 처리되었다. 기관지 폐포 세척은 마지막 기도 감염 2시간 이후에 수행되었다. 자료는 5-7 동물에서의 응답으로, 5번의 독립된 실험에서 평균 ± SEM으로 표현되었다. 통계적 유의수준은 식염수 처리된 쥐에 대해 *p < 0.05, 그리고 OVA 처리된 쥐에 대해 #p < 0.05로 설정되었다.

전술한 바와 같이, Th2 시토카인, IL-4, 및 IL-5는 알레르기 염증 반응의 시작과 진전에 중요한 역할을 담당한다. 또한, 몇몇 연구 결과는, TNF-α가 천식 발병 기전 규명에 중요한 기능을 수행함을 제시하였다. TNF-α는 폐 호중구 침윤을 유도할 수 있고, 몇몇 천식에서는 혈청 TNF-α가 증가함을 보여준다. 감태 추출물로 선처리하는 것이 기관지 폐포 세척액에 있는 시토카인 분비에 영향을 미치는지의 여부를 결정하기 위해, IL-4, IL-5, 및 TNF-α의 수준을 ELISA에 의해 결정하였다. 기관지 폐포액은 마지막 기도 감염 4시간 후에 획득되었다. 기관지 폐포액에 있는 IL-4, IL-5, 및 TNF-α의 수준은, 식염수 처리된 대조군 쥐의 수준과 비교할 때, OVA에 감염된 쥐들에서 상당히 증가되었다. 감태 추출물의 투여로 각각 IL-4 66%, IL-5 84%의 농도가 감소되었고, 결과적으로, 도 3에서 보는 바와 같이, TNF-α의 분비가 73% 감소되었다. 감태 추출물은 IFN-γ 생산을 촉진시켰지만, 유의할 수준은 아니었다.

도 4는 본 발명에 따라, OVA에 감작되고 OVA에 감염된 쥐에 대해, 감태 추출물의 기도 반응에 대한 영향을 보여주는 실험 결과를 도시한 그래프이다.

기도 반응성은 마지막 기도 감염 72시간 후에 측정되었다. 감태 추출물을 마지막 감작 후부터 첫번째 기도 감염 1일 전까지 복강 내에 투여하였다. 분무된 메타콜린에 대한 기도 반응성은 구속되지 않고 의식이 있는 상태의 쥐들에서 측정되었다. 쥐들을 주 챔버에 배치하였고, 식염수로 먼저 분무한 다음에, 분무당 3분간 메타콜린의 투여량을 증가(2.5 내지 50 mg/ml)시켰다. 호흡 요인의 판독은 각 분무 이후 3분 동안 행해졌고, 이 동안 Penh 값을 결정하였다. 자료는 6번의 독립 실험에서 평균 ± SEM으로 표현되었다. 통계적 유의수준은 식염수 처리된 쥐에 대해 *p < 0.05, 그리고 OVA 처리된 쥐에 대해 #p < 0.05로 설정되었다.

보다 상세하게는, 기도 반응성은 메타콜린의 투여량 증가에 대해 Penh의 증가 비율로 평가되었다. 도 4에서 보는 바와 같이, OVA에 감작되고 OVA에 감염된 쥐에 대해 Penh 비율의 투여량-반응 곡선이 이동하였다. 즉, 메타콜린 투여(투여량 2.5 내지 50mg/ml)로 발생된 Penh 비율은, 대조군 쥐와 비교해 볼 때, OVA에 감작되고 OVA에 감염된 쥐에 대해 상당히 증가하였다. 그러나, 감태 추출물로 처리한, OVA에 감작되고 OVA에 감염된 쥐에 대해서는, Penh 비율의 투여량-반응 곡선은, 감태 추출물로 처리하지 않은 OVA에 감작되고 OVA에 감염된 쥐의 비율과 비교해 볼 때, 오른쪽으로 이동하였다(명백히, 이 이동은 투여량에 의존적이었다). 이 결과는 감태 추출물 처리가 메타콜린에 대한 OVA 유도 기도 반응성을 감소시킨다는 것을 보여준다.

도 5는 본 발명에 따라, 감태 추출물의 혈청 OVA 특이 IgE 항체에 대한 영향을 보여주는 실험 결과를 도시한 그래프이다.

쥐들은 전술한 바와 같이, 감작되고 감염되었다. OVA 특이 IgE의 수준은 마지막 기도 흡입 12시간 후에 측정되었다. 혈액은 ELISA에 의해, OVA 특이 IgE의 측정을 위해, 심장 천자 방법으로 채취하였다. 감태 추출물은 마지막 감작으로 부터 첫 번째 기도 감염 1일 전까지 복강 내에 투여되었다. 통계적 유의수준은 식염수 처리된 쥐에 대해 *p < 0.05, 그리고 OVA 처리된 쥐에 대해 #p < 0.05로 설정되었다.

알레르겐 감염에서 비만 세포 표면의 알레르겐 특이 IgE의 가교 결합은 초기 천식 반응의 시작과 관련이 있다. OVA 특이 IgE의 혈청 수준은 마지막 기도 감염 12시간 후에 측정되었다. OVA 감작 및 감염은 결과적으로, OVA 특이 IgE의 혈청 수준을 증가시킨 반면에, 식염수 처리된 대조군 쥐에 대한 혈청 수준은 낮은 것으로 결정되었다. 감태 추출물로 쥐를 감작시킨 것은, 도 5에 도시된 바와 같이, OVA 특이 IgE를 67% 감소시켰다. 이 결과는, 감태 추출물이 생쥐 천식에서 Th2형 면역 반응의 생성을 억제한다는 결론을 뒷받침할 수 있다.

도 6A 및 도 6B는 본 발명에 따라, OVA에 감염된 쥐의 폐 속에서, 바탕질 금속 단백 분해 효소-9(MMP-9)의 발현에 대한 감태 추출물의 영향을 보여주는 실험 결과를 예시한다.

바탕질 금속 단백 분해 효소는 세포 외 바탕질의 많은 구성요소들을 단백질 분해할 수 있는 아연-의존형 및 칼슘-의존형 엔도펩티디아제의 군에 속한다. 바탕질 금속 단백 분해 효소는, 섬유모세포, 내피 세포, 및 상피 세포와 같은 구조 세포에 의해서 뿐만 아니라, 대식 세포, 림프구, 호중구, 및 호산구를 포함하는 염증 세포에 의해서도 발생될 수 있다. 금속 단백 분해 효소-9은, 지적막을 통해, 호산구, 림프구, 및 호중구의 이동을 유도해서, 천식 환자에서의 만성 염증 과정의 리모델링과 같은, 만성 기도 염증에 중요한 역할을 할 수 있다.

OVA에 감작된 쥐들은 OVA 감염 전에 감태 추출물로 전처리되거나, 전처리되지 않을 수 있다. 세포 추출물은 감염 48시간 이후 OVA 처리된 쥐의 폐에서 채취되었고, 또한, 식염수 처리된 쥐의 폐 조직에서도 채취되었다. 도 6A 및 도 6B를 참조하면, 추출물은, 금속 단백 분해 효소-9(A)의 각 레인에서 동일한 양의 단백질 로딩을 확인하기 위해, anti-actin 항체(Beta)로 면역 블롯 분석되었다. 표본 추출은, 식염수, OVA, 또는 OVA 및 감태 추출물로 감염된지 48시간 이후에 수행되어, 자이모그래피(B)로 분석되었다. 자료는 6번의 독립 실험에서 평균 ± SEM으로 표현되었다.

도 6A 및 도 6B를 참조하면, OVA 감염은 기관지 폐포 세척액에서 금속 단백 분해 효소-9 활성을 눈에 띄게 유도하는 반면, 대조군 쥐에서는 이러한 것을 관찰할 수 없음을 주목할 수 있었다. 마지막 기도 OVA 감염에 앞서 감태 추출물의 투여는, 도 6B에 도시된 바와 같이, 기관지 폐포 세척액에서 금속 단백 분해 효소-9의 젤라틴 융해성 활성 수준을 감소시킬 뿐만 아니라, 도 6A에 도시된 바와 같이, 금속 단백 분해 효소-9의 발현을 상당히 억제하는 결과로 나타났다. 이 결과는 감태 추출물이 금속 단백 분해 효소-9의 발현을 조절하는 것을 의미한다.

도 7은 본 발명에 따라, OVA에 감작되고 OVA에 감염된 쥐에 대해, 기관지 폐포 세척액의 EPO 함량 수준에 대한 감태 추출물의 영향을 보여주는 실험 결과를 도 시한 그래프이다.

쥐들은 전술한 바와 같이, 감작되고 감염되었다. EPO 활성은 마지막 기도 감염 48시간 이후 기관지 폐포 세척액에서 측정되었다. 감태는 마지막 감작으로부터 첫번째 기도 감염 1일 전까지 복강 내에 투여되었다. 자료는 6번의 독립 실험에서 평균 ± SEM으로 표현되었다. 통계적 유의수준은 식염수 처리된 쥐에 대해 *p < 0.05, 그리고 OVA 처리된 쥐에 대해 #p < 0.05로 설정되었다.

EPO의 조직 수준은 염증 부위에서의 호산구의 수와 밀접하게 관련이 있다. 도 7에 도시된 바와 같이, OVA에 감염된 쥐의 기관지 폐포 세척액에서 측정된 호산구의 수에 따르면, 기관지 폐포 세척액에서 EPO 수준은, 식염수 흡입된 EPO 수준과 비교해 볼 때, OVA 흡입 24시간 이후 상당히 증가되었다. 이 증가된 EPO의 수준은 감태 추출물을 투여해서 약 42%까지 상당히 감소시켰다.

도 8A 및 도 8B는 본 발명에 따라, OVA에 감작되고 OVA에 감염된 쥐의 폐 조직에서, SOCS-3 및 SOCS-5의 발현에 대한 감태 추출물의 영향을 보여주는 실험 결과를 예시한다.

도 8A에는 SOCS-3 및 SOCS-5에 대한 웨스턴 블롯팅의 실험 결과가 제공된다. 표본 추출은, 식염수 투여된 쥐, 식염수 투여된 OVA 흡입된 쥐(OVA), 40mg/kg의 감태 추출물을 투여한 OVA 흡입된 쥐(OVA+EC)에 대해, 마지막 흡입 72시간 이후에 수행하였다. 도 8B에 도시된 바와 같이, 밀도 계측 분석이 actin에 대한 각 분자들의 상대적 비율로 제시되었다. 식염수 처리된 쥐들의 폐 조직에 있는 각 분자들의 상대적 비율은 임의로 1로 설정되었다. 자료는 6번의 독립 시행에서 평균 ± SEM 으로 표현되었다. 통계적 유의수준은 식염수 처리된 쥐에 대해 *p < 0.05, 그리고 OVA 처리된 쥐에 대해 #p < 0.05로 설정되었다.

도 8A 및 도 8B를 보면, SOCS-3 및 SOCS-5는 알레르기 면역 질병의 주 조정자인 것으로 예측되며, 이들은 Th1 및 Th2 분화 과정을 상호적으로 억제한다. 따라서, 폐 조직에서 SOCS-3 및 SOCS-5의 발현은, 웨스턴 블롯 분석법으로 평가되었다. 웨스턴 블롯 분석법은 폐 조직에서 SOCS-3 단백질의 수준이, 도 8A 및 도 8B에 도시된 바와 같이, 식염수 흡입된 후의 SOCS-3 단백질의 수준과 비교해 볼 때, OVA 흡입 48시간 후에 급격히 증가하는 것을 보여준다. 증가한 SOCS-3 단백질의 수준은, 감태 추출물을 투여함으로써 감소되었다. 그러나, 감태 추출물 처리는 SOCS-5 발현을 증가시키지 못했다. 이 발견은, 감태 추출물은 Th1 반응을 촉진시키기 보다는, 기도 속으로의 Th2 세포의 점증을 억제함으로써 알레르기 기도 반응을 억제할 수 있음을 의미한다.

본 발명이 바람직한 실세예를 참조하여 설명되었지만, 본 기술 분야에서 통상의 지식을 가진자라면 다음의 청구항에 규정된 본 발명의 정신 및 범주로부터 일탈함이 없이 다양한 변경 및 변형이 있을 수 있음을 인식할 것이다.

전술한 바와 같이, 감태 추출물은, 본 발명에 따라, 생쥐 천식에서 OVA 유도된 기도 염증을 억제한다. 마지막 기도 OVA 감염에 앞서, 감태 추출물을 투여함으로써, 모든 천식 반응을 상당히 억제하였다. 또한, 감태 추출 매개된 천식 반응의 억제는 알레르겐 특이 IgE 반응의 초기 억제에 기여하는 것으로 보인다. 또한, 감 태 추출물은, Th2 매개성 I형 알레르기 질병의 위험을 증가시키는 SOCS-3 발현을 감소시킨다. 감태 추출물 처리는, 높은 SOCS-3 발현을 보이는 천식에서, 혈청 IgE 농도 증가에 영향을 주는 것으로 증명되었다.

도 1은 본 발명에 따라, OVA 유도성 알레르기 천식을 앓는 쥐에 대해, 기관지 폐포 세척액 속의 염증 세포의 점증에 대한 감태 추출물의 영향을 보여주는 실험 결과를 도시한 그래프이다.

도 2는 본 발명에 따라, OVA에 감작되고 OVA에 감염된 쥐의 폐 조직에서의 병리학적 변화를 도시한다.

도 3은 본 발명에 따라, 감태 추출물의 IL-4, IL-5 및 TNF-α에 대한 영향을 보여주는 실험 결과를 도시한 그래프이다.

도 4는 본 발명에 따라, OVA에 감작되고 OVA에 감염된 쥐에 대해, 감태 추출물의 기도 반응성에 대한 영향을 보여주는 실험 결과를 도시한 그래프이다.

도 5는 본 발명에 따라, 감태 추출물의 혈청 OVA 특이 IgE 항체에 대한 영향을 보여주는 실험 결과를 도시한 그래프이다.

도 6A 및 도 6B는 본 발명에 따라, OVA에 감염된 쥐의 폐 속에서, 바탕질 금속 단백 분해 효소-9(MMP-9)의 발현에 대한 감태 추출물의 영향을 보여주는 실험 결과를 예시한다.

도 7은 본 발명에 따라, OVA에 감작되고 OVA에 감염된 쥐에 대해, 기관지 폐포 세척액의 EPO 함량 수준에 대한 감태 추출물의 영향을 보여주는 실험 결과를 도시한 그래프이다.

도 8A 및 도 8B는 본 발명에 따라, OVA에 감작되고 OVA에 감염된 쥐의 폐 조직에서, SOCS-3 및 SOCS-5의 발현에 대한 감태 추출물의 영향을 보여주는 실험 결 과를 예시한다.

Claims (10)

1. 동물에서의 천식을 완화 또는 방지하는 방법으로서,

   동물에서의 SOCS-3 발현을 억제하는데 효과적인 양의 감태 추출물을 포함하는 조성물을 상기 동물에 투여하여 상기 동물에서의 천식을 완화 또는 방지하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 생리학적으로 허용되는 운반체 또는 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 경구용 조성물인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 음식을 통해 상기 동물에게 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 기능성 식품인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 식이 보충물인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 캡슐, 정제, 로렌지, 또는 코팅된 정제의 형 태인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 용액, 시럽, 또는 현탁액의 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 감태 추출물은, 감압 하에 동결 건조하여 균질화하고, 에탄올을 포함한 유기 용제에 침지하며, 진공 증착함으로써, 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 동물에서의 SOCS-3 발현을 억제하여, 상기 동물에서 천식을 완화 또는 방지하는데 효과적인 양의 감태 추출물을 포함하는 조성물.

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