KR20110044946A

KR20110044946A - 면역장애로부터 유발된 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물 및 복령 추출물

Info

Publication number: KR20110044946A
Application number: KR1020107028975A
Authority: KR
Inventors: 항칭 린; 원메인 우
Original assignee: 신파 티엔리 파머슈티컬 컴퍼니 리미티드 (항저우)
Priority date: 2008-06-24
Filing date: 2008-06-24
Publication date: 2011-05-03
Also published as: EP2305268A4; CA2728112A1; CA2728112C; JP2011525481A; WO2009155730A1; EP2305268A1; CN102056612B; CN102056612A; KR101544804B1; EP2305268B1; MY158979A

Abstract

본 발명은 면역장애로부터 유발된 질환을 치료하는데 다음 화학식(I) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 가진 라노스테인의 새로운 용도에 관한 것이다:

(I)
여기서, R₁은 H 또는 CH₃이고; R₂는 OCOCH₃, =O, 또는 OH이고; R₃는 H 또는 OH이고; R₄는 -C(=CH₂)-C(CH₃)₂R_a(여기서 R_a는 H 또는 OH), 또는 -CH=C(CH₃)R_b(여기서 R_b는 CH₃ 또는 CH₂OH)이고; R₅는 H 또는 OH이고, R₆는 CH₃ 또는 CH₂OH이다.

Description

면역장애로부터 유발된 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물 및 복령 추출물{A pharmaceutical composition for treating disease caused by immune disturbance and the extract from tuckahoe}

본 발명은 알레르기와 같은 면역장애로부터 유발된 질환을 치료하는데 라노스테인 화합물들의 신규한 용도에 관한 것이다.

면역글로불린 E(IgE)는 면역글로불린(또는 "항체") 분자의 한 종류이다. IgE는 다른 면역글로불린: IgG, IgM, IgA, 및 IgD보다 더 낮은 농도로 인간 혈청에 존재한다. IgE는 기생충들을 방어하는 역할을 하는 것으로 생각되나, 기생충 감염이 심각한 문제가 아닌 적어도 선진국들에서 필수적이거나 유효한 역할을 하는 것으로 명확하게 증명되지 않았다. IgE는 알레르기 비염("고초열성"), 천식, 두드러기 및 식품과 약물 알레르기를 포함하는 급성 과민 알레르기 반응의 매개체로서 주지되어 있다.

IgE-매개 알레르기 반응에서, B 세포들에 의해 분비된 후, IgE는 이의 Fc 부분을 통해 호염기성구, 비만세포 및 랑게르한스 세포의 표면상에 존재하는 FcεRI 수용체들에 결합한다. 이런 세포들의 표면에 결합된 IgE가 알레르기 항원과 접촉하고 결합하는 경우, 이것이 결합된 IgE 분자들과 기본 수용체들의 교차연결을 일으키고 히스타민, 세로토닌, 류코트리엔 및 과민증의 느린 반응 물질과 같은 약리학적 매개체들을 방출한다. 이런 매개체들이 알레르기 반응의 병적 이상을 일으킨다.

IgE-매개 알레르기 질환의 일부 또는 전부를 가진 일부 환자들은 아토피 피부염으로 불리는 통증성 피부 질환을 앓고 있다.

알레르기 질환 중에서 천식을 예로 들면, 면역반응시간은 즉시 천식 반응과 지연 천식 반응으로 나뉠 수 있다. 즉시 천식 반응은 비만세포들로부터 배출된 염증 매개체들에 의해 유발된 반응이며, 알레르기 항원의 접촉 후 15 내지 30분 내에 일어난다. 알레르기 항원은 비만세포들과 결합된 IgE를 확인하고 결합하며, 환자가 동일한 알레르기 항원에 다시 노출될 때, 비만세포들 및 탈과립화가 진행하는 세포들에서 과립들을 활성화하여, 히스타민, 류코트리엔, IL-2, IL-4, IL-5 및 GM-CSF과 같은 사이토카인 및 화학유인물질 등과 같은 더 많은 염증 물질들이 배출되어 혈관들의 투과성이 증가하여 기도의 평활근이 수축한다. 이런 염증 물질들, 사이토카인 및 화학유인물질은 즉시 천식 반응에 영향을 줄 뿐만 아니라 지연 염증 반응에 영향을 준다.

호산구와 호중구에 의해 유발된 반응은 지연 반응에 관한 것이다. 즉시 반응 4 내지 6 시간 후 비만세포들로부터 배출된 사이토카인 및 화학유인물질은 호산구와 호중구와 같은 염증 세포들을 끌어당겨서, 침투를 일으킬 것이다. 또한, 상피세포, 내피세포 및 섬유아세포로부터 분비된 에오탁신과 같은 사이토카인은 화학유인물질의 중요 부분이고, 호산구 또는 Th2 면역세포가 폐의 기관지에 있는 염증 부위로 이동하게 한다. MBP(주요 염기성 단백질), ECP(호산구 양이온 단백질), 호산구 유도 신경독, EPO(호산구 퍼옥시다아제) 및 류코트리엔 등과 같은 많은 염증 단백질은 활성화될 때 호산구로부터 분비될 것이다. 이런 염증 단백질은 기도의 평활근을 자극하여 수축시켜, 혈관의 투과성을 증가시키고 기도 부종을 일으켜, 기도의 내피 조직들이 직접 손상되고 따라서 내피 세포들은 완전한 상태를 잃는다. 기도는 너무 많은 점액을 분비하여, 기도를 폐쇄하거나 좁힐 뿐만 아니라 호중구의 침투와 비만세포의 탈과립화를 일으켜, 호산구의 침투를 증가시킨다. 그 결과, 천식의 정도는 더욱 심각하다.

대만 발명 특허 출원 제 92113393(공개번호 제 200425900, 2004년 12월 1일 발행)의 특허출원의 출원인은 신체의 면역성을 강화시키는데 효과적인 약학적 조성물을 개시한다. 이 조성물은 라노스테인 화합물들의 특허 성분들을 함유한다. 신체의 면역성을 증가시키기 위한 복령 추출물이 제공되며, 추출물의 라노스테인 화합물의 5-60중량%를 함유하며 실질적으로 세코라노스테인이 없다. 추출물은 복령의 대사산물, 균핵 또는 발효 생성물로부터 얻는다.

알레르기를 치료할 수 있는 물질 또는 방법은 연구자들뿐만 아니라 일반인들에게도 중요한 문제이다. 지금까지 라노스테인 화합물이 알레르기를 치료하는데 효과가 있다는 것은 보고되지 않았다.

본 발명의 주요 목적은 알레르기와 같은 면역장애로부터 유발된 질환을 치료하는데 라노스테인 화합물들의 신규한 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 유효 성분으로서 라노스테인 화합물을 포함하는 면역장애(예를 들어 알레르기)로부터 유발된 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 라노스테인 화합물을 사용함으로써 면역장애(예를 들어 알레르기)로부터 유발된 질환을 치료하기 위한 방법을 제공하는 것이다.

포유류(예를 들어, 인간)의 면역장애(예를 들어 알레르기)로부터 유발된 질환을 치료할 수 있는 약학적 조성물은 활성 성분으로서 다음 화학식(I)을 가진 라노스테인 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 상기 질환을 치료하기 위한 유효량을 포함한다:

(I)

여기서, R₁은 H 또는 CH₃이고; R₂는 OCOCH₃, =O, 또는 OH이고; R₃는 H 또는 OH이고; R₄는 -C(=CH₂)-C(CH₃)₂R_a(여기서 R_a는 H 또는 OH), 또는 -CH=C(CH₃)R_b(여기서 R_b는 CH₃ 또는 CH₂OH)이고; R₅는 H 또는 OH이고, R₆는 CH₃ 또는 CH₂OH이다.

본 발명은 또한 포유류의 면역장애로부터 유발된 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에서 상기 화학식(I)을 가진 라노스테인의 용도를 제공한다.

바람직하게는, 알레르기는 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염, 알레르기성 천식, 아토피 피부염, 식도 알레르기, 아토피 습진 또는 류마티스 관절염이다. 가장 바람직하게는, 상기 알레르기는 알레르기성 천식이다.

바람직하게는, 라노스테인 화합물(I)은 다음 화학식을 가진다:

또는

.

바람직하게는, 상기 약학적 조성물은 조성물의 0.1-60중량%의 라노스테인 화합물(I) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다.

일반적으로 본 발명의 알레르기를 치료하기 위한 약학적 조성물은 정제, 알약, 연질 캡슐, 경질 캡슐, 미세 캡슐, 분말 또는 펠렛 등과 같은 형태로 환자에게 경구로 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 수용액으로서 경구 또는 비경구로 투여될 수 있는 액체 형태일 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 에탄올, 물 또는 기타 혼합 용매에 분산될 수 있고 스프레이, 로션, 연고, 팅크제, 에멀젼 또는 앰풀의 형태로 비경구로 투여될 수 있다.

바람직하게는, 상기 약학적 조성물은 경구로 투여된다.

본 발명의 다른 목적은 라노스테인 화합물(I)의 원료로서 복령 추출물을 사용하는 것이다. 상기 복령 추출물은, 추출물의 1-60중량%의 라노스테인 화합물(I)을 포함하며 세코라노스테인(secolanostane)이 실질적으로 없다.

바람직하게는, 상기 복령 추출물은 다음 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다:

a) 물, 메탄올, 에탄올 또는 이의 혼합 용매에 의해 복령(Poria cocos (Schw) Wolf)의 대사 산물들, 발효 생성물들 또는 균핵(sclerotium)을 추출하는 단계;

b) 단계 a)로부터의 얻은 액체 추출물을 농축하는 단계;

c) 단계 b)로부터 얻은 농축된 물질을 실리카겔 컬럼에 주입하는 단계;

d) 낮은 극성을 가진 용출액으로 실리카겔 컬럼을 용출하고 결과로 얻은 용출물을 수집하는 단계; 및

e) 단계 d)로부터의 용출물을 농축하는 단계.

바람직하게는, 단계 e)로부터의 농축 용출물은 다이클로로메테인 : 메탄올 = 96 : 4의 혼합 용매에 의해 전개되고 자외선 램프 및 요오드 증기에 의해 탐지되는 박층 크로마토그래피와 일치하는 적어도 0.1의 크로마토그래피 값, Rf를 가진다.

바람직하게는, 단계 a)의 추출하는 단계는 95% 에탄올을 사용하여 수행된다.

바람직하게는, 단계 a)의 추출하는 단계는 물을 끓임으로써 복령(Poria cocos (Schw) Wolf)의 대사산물들, 발효 생성물들 또는 균핵을 추출하는 단계; 염기를 pH 값이 9-11일 때까지 얻은 추출 수용액에 첨가하는 단계; 염기성 수용액을 회수하는 단계; 침전물을 형성하기 위해 산을 pH 값이 4-6이 될 때까지 염기성 수용액에 첨가하는 단계; 침전물을 회수하는 단계; 침전물을 에탄올로 추출하는 단계; 및 액체 추출물을 회수하는 단계를 포함한다.

바람직하게는, 단계 b)로부터 얻은 농축 물질은 1:1의 부피 비로 메탄올 수용액과 n-헥세인을 함유하는 2상 용매로 추가로 추출되고, 메탄올 층은 2상 용매 추출 혼합물로부터 분리하고 메탄올 층은 농축되어 농축물을 형성하며, 이 농축물은 단계 c)에서 실리카겔 컬럼에 대한 원료로 사용된다.

바람직하게는, 단계 d)의 낮은 극성의 용출물은 96.5:3.5의 부피 비로 다이클로로메테인 및 메탄올을 함유하는 혼합 용매이다.

바람직하게는, 상기 복령 추출물은 5-35중량%의 라노스테인 화합물(I)을 포함한다.

바람직하게는, 본 발명의 조성물은 희석제, 부형제 또는 운반체를 더 포함한다.

본 발명의 내용 중에 포함되어 있음

본 발명에서 수행된 다음 실험들에서 알레르기 항원으로써 난백 알부민(OVA)을 사용하여 생쥐들이 알레르기를 일으키게 하였고 생쥐들에서 OVE-특이적 IgE 항체의 출현으로부터 유발된 천식을 생쥐들이 앓고 있는 것을 확인하였다. 다른 그룹에 있는 생쥐들은 실험기간 동안 복령 추출물 또는 순수한 라노스테인 화합물을 먹였고 한 달을 먹인 후 각 생쥐에게 기도 과민성 검사를 하였고, 이로부터 생쥐의 천식의 심각함을 나타내는 중요한 지수를 측정하였다. 본 발명자들은 또한 특히 호산구와 호중구가 영향을 받았는지에 대해 생쥐들의 기관지폐세척액(BALF)에서 다른 면역세포들을 관찰하였다. 또한, 화학유인물질, 에오탁신은 사이토카인의 분비가 급격하게 변했는지를 관찰하기 위한 본 발명의 중요한 관찰 요소이었다. 상기 세 약리학적 또는 염증성 물질, 기도 과민성, 염증 세포들 및 화학유인물질(에오탁신)의 관찰은 복령 추출물과 라노스테인 화합물은 천식의 예방과 치료에 우수한 의약이라는 것을 나타낸다.

본 발명에 개시된 포유류들(예를 들어, 인간)에 의한 영양분 흡수를 향상시키는 복령의 추출물은 미정제 추출물을 얻기 위한 종래의 추출 방법에 의해 복령(Poria cocos (Schw) Wolf)을 추출하는 단계, 크로마토그래피에 의해 미정제 추출물을 낮은 극성 부분의 라노스테인(96:4의 다이클로로메테인:메탄올의 용출액으로) 및 높은 극성 부분의 세코라노세테인(90:10 및 0:100의 다이클로로메테인:메탄올의 용출액으로)으로 분리하는 단계를 포함하는, 상기 대만 특허 공개공보 No. 200425900에 개시된 것과 유사한 방법에 의해 제조될 수 있고, 라노스테인 부분은, 다이클로로메테인:메탄올 = 96:4의 혼합 용매에 의해 전개될 때, 적어도 0.1의 크로마토그래피 값, Rf를 가진 박층 크로마토그래피에 의해 탐지되며, Rf는 세코라노스테인 부분의 경우 0.1 미만이다. 여러 라노스테인은 라노스테인 부분을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 용출시킴으로써 라노스테인 부분과 분리되며, 사용된 용출액은 97:3 내지 95:5이다.

다음 실시예들은 본 발명을 더욱 상세하게 기술하기 위해 제공되며 본 발명의 범위를 제한하는데 사용되지 않아야 한다.

본 명세서에서 언급된 백분율과 다른 양은 달리 나타내지 않는 한 중량%이다. 백분율은 사용된 임의의 범위로부터 전체 100%까지 선택된다.

실시예 1:

복령 분말은 30kg의 중국산 복령(Poria cocos (Schw) Wolf)으로 제조하였다. 복령 분말을 24시간 동안 120L 95% 알콜로 추출하였다. 혼합물을 여과하여 여과물을 얻었다. 잔류물을 추가 3 사이클 동안 추출하고 여과하였다. 여과물들을 혼합하고 농축하여 265.2g의 건조 분말을 얻었다. 건조 추출물을 2상 추출제(n-헥세인: 95% 메탄올 = 1:1)로 분배 추출하였고 메탄올 층을 제거하고, 농축하여 246.9g의 건조 고체를 얻었다. 건조 고체의 분리는 건조 고체의 중량의 10-40배 실리카겔을 채운 실리카겔 컬럼에 의해 수행하였다. 70-230 메쉬의 지름을 가진 실리카겔은 머크사에 의해 제조되었고 실리카겔 60의 기호를 가진다. 컬럼은 다음 용출액: 다이클로로메테인:메탄올 = 96:4의 혼합 용액; 다이클로로메테인:메탄올 = 90:10의 혼합 용액 및 순수 메탄올로 용출되었다. 용출액들은 박층 크로마토그래피(TLC)로 검사하였고, 자외선 램프와 요오드 증기가 탐지를 위해 사용되었고 다이클로로메테인:메탄올 = 96:4의 혼합 용액은 전개액으로 사용되었다. TLC에서 유사한 구성물질을 가진 용출액들을 혼합하였다.

용출은 다이클로로메테인:메탄올 = 96:4의 혼합 용액으로 수행하여 78g의 양으로 PCM 부분을 얻었다. PCM은 박층 크로마토그래피에서 6개 추적점(trace points)을 나타내었다. 다이클로로메테인:메탄올 = 90:10 및 순수 에탄올의 용출액으로 수행된 용출로부터 얻은 용출액들을 혼합하여 168g의 PCW 부분을 얻었다.

PCM 부분은 다이클로로메테인:메탄올 = 96.5:3.5의 용출액과 동일한 실리카겔 컬럼에 의해 추가로 분리되어 K1(K1-1 및 K1-2), K2(K2-1 및 K2-2), K3, K4, K4a, K4b, K5, K6a 및 K6b의 정제된 라노스테인 성분들을 얻었다. 분리 단계와 확인 분석 데이터의 추가 상세내용은 상기 대만 특허 공개공보 No. 200425900에서 볼 수 있다.

상기 K1 내지 K6b 화합물은 다음 구조를 가진다:

K1-1:R₂ = OCOCH₃(파침산) K1-2:R₂ = OCOCH₃(소량)

K2-1:R₂ = OH(투물로스산) (디하이드로파침산)

K2-2:R₂ = OH(소량)

(디하이드로투물로스산)

K3:R₆ = CH₃, R₅ = H K4:R₂ = α-OH, R₅ = H

(폴리포렌산 C) (3-에피디하이드로투물로스산)

K4a:R₆ = CH₂OH, R₅ = H K4b:R₂ = β-OCOCH₃, R₅ = OH

K6a: R₆ = CH₃, R₅ = OH

K6b K5

PCM 부분으로부터 분리된 라노스테인 화합물 K1 내지 K6b의 양은 아래 표에 나열된다. PCM 부분은 대략 15중량%의 라노스테인 화합물 K1 내지 K6b를 함유한다.

K1	K2	K3	K4	K4a	K4b	K5	K6a	K6b
3.0g	6.2g	1.93g	0.55g	66mg	86.8mg	47.6mg	21.4mg	90.7mg

실시예 2:

100kg의 복령을 3시간 동안 800kg의 물로 끓인 후 50℃로 냉각시키기 위해 방치하고 이의 pH 값을 5N NaOH 용액을 사용하여 pH 11로 조절하고 결과로 얻은 용액을 3시간 동안 교반하였다. 원심분리기를 사용하여 액체를 고체로부터 분리하고 800kg의 물을 분리된 고체에 첨가하였다. 상기 절차를 반복하였고, 절차는 pH 값을 NaOH로 pH 11로 조절하는 단계, 교반하는 단계 및 원심분리로 고체를 제거하는 단계를 포함하였다. 두 개의 결과로 얻은 액체를 혼합하고 50℃에서 100kg의 용액으로 진공 농축하였고 pH 값을 3N HCl를 사용하여 pH 6.5로 조절하여 침전물을 생성하였다. 상기 침전물을 용액으로부터 분리하고, 뒤이어 40L H₂O로 세척하고 원심분리하여 침전물을 얻었다; 침전물을 8L의 물로 분사 건조하여 380g의 분말을 얻었다. 그 후, 분말을 4L의 알콜을 사용하여 3회 추출하였고 추출 용액들을 혼합하고 농축하여 238.9g의 알콜 추출물을 얻었다. 그런 후에 추출물을 HPLC 분리하여, 추출물의 그램당 185.93mg의 K2, 20.34mg의 K3, 4.52mg의 K1을 나타내었다. 다시 말하면, 추출물의 각 그램은 대략 226.07mg의 라노스테인 화합물을 가진다.

실시예 3:

복령 추출물 또는 순수 라노스테인 화합물로 천식에 걸린 생쥐들을 치료하는 실험

이 실시예에서 알레르기 항원으로써 난백 알부민(OVA)을 사용하여 생쥐들이 알레르기를 일으키게 하였고 생쥐들에서 OVE-특이적 IgE 항체의 출현으로부터 유발된 천식을 생쥐들이 앓고 있는 것을 확인하였다. 다른 그룹에 있는 생쥐들은 실험기간 동안 복령 추출물 또는 순수한 라노스테인 화합물을 먹였고 한 달을 먹인 후 각 생쥐에게 기도 과민성 검사를 하였고, 이로부터 생쥐의 천식의 심각함을 나타내는 중요한 지수를 측정하였다. 본 발명자들은 또한 특히 호산구와 호중구가 영향을 받았는지에 대해 생쥐들의 기관지폐세척액(BALF)에서 다른 면역세포들을 관찰하였다. 또한, 화학유인물질, 에오탁신은 사이토카인의 분비가 급격하게 변했는지를 관찰하기 위한 본 발명의 중요한 관찰 요소이었다.

실험 방법:

(1) 실험 동물: 근친 교배 BALB/c 암컷 생쥐들을 임의적인 표준 실험실 식사로 키웠다. 실온을 19-24℃에서 유지하고 상대 습도 50-70%에서 유지하였다. 동물 실험들을 대만 푸-젠 대학, 실험 동물의 보호와 사용에 대한 가이드라인에 따라 수행하였다. BALB/c 생쥐들을 각 8 마리인 10개 그룹으로 나누었다.

(2) 동물들의 실험용 천식 모델의 설정: 면역 프로토콜은 유사하고 (Sy, L. B, et al. Propolis extracts exhibit an immunoregulatory activity is an ova-sensitized airway inflammatory animal model. Int Immunopharm 6:1053-1060. (2006)에 이미 기술된 것에 따라 변형하였다. 간단하게, 각각 8주 및 10주의 나이의 BALB/c 생쥐들을 10㎍/ml와 30㎍/ml OVA(알부민, 닭 난자, A-5503, 시그마)의 복강 주사와 2mg 항원보강제 수산화알루미늄(Al(OH)₃, 77161, 피어스)으로 면역화하였다. 모든 생쥐를 2차 복강 주사를 받은 후, 초음파 분무기(DeVilbiss Pulmo-Aide, 5650D, USA)를 사용하여 챔버에 생쥐들을 놓음으로써 20분의 시간 동안 2% OVA 에어로졸의 8ml에 흡입 노출을 받게 하였다.

(3) 실험 동물의 그룹화: OVA-민감 천식에 걸린 생쥐들의 10개 그룹을 비 치료 그룹(As); 실시예 2에서 제조된 복령 추출물과 순수 화합물 K1, K2 및 K3(1PCE, 1K1, 1K2, 1K3, 2PCE, 2K1, 2K2, 및 2K3)에 의한 치료 그룹; 및 대조군 약물 그룹(Pred)으로 나누었다. 1PCE 그룹의 치료 그룹에서 각각의 생쥐는 실시예 2(1PCE)에서 제조된 에탄올 추출물 PCE의 0.0372mg을 매일 투여받았다. 2PCE 평균 생쥐들에게 1PCE 그룹의 PCE(0.0744mg)의 복용량의 2배를 제공하였다. 2K1, 2K2 및 2K3 평균 생쥐들에게 1K1, 1K2 및 1K3 그룹과 비교하여 K1, K2 및 K3(0.0174mg)의 복용량의 2배를 제공하였다. Pred 그룹의 각 생쥐에게 생쥐를 희생시키기 전에 5일 연속으로 하루당 0.1mg의 프레드니솔론을 투여하였다. 상기 PCE, K1, K2, K3 및 프레드니솔론 화합물들을 먼저 95% 에탄올로 용해하고, 마지막으로 인산염 버퍼 용액(PBS)에 용해하였다. 각 생쥐에게 위관영양법으로 매 회 0.4ml의 전체 부피로 투여하였다.

(4) 기도 과민성 검사:

기도 과민성(AHR) 값은 천식의 심각도에 따라 비례적으로 증가하고 AHR의 감소는 천식이 완화되는 지에 대한 중요한 징후이다. 모든 그룹에 있는 각 생쥐에게 최종 흡입 노출이 수행된 치료 그룹에 투여 29일 후 다음날에 AHR 검사를 하였다. AHR은 북시코 시스템(Biosystem XA; Buxco Electronics Inc. Sharon, CT, USA)으로 검사하였고, 생쥐를 챔버에 놓고 PBS의 에어로졸 또는 다른 농도(25mg/ml 및 50mg/ml)의 메타콜린을 초음파 분무기를 사용하여 챔버 속에 주입하였다. 주입 3분 후 분당 AHR의 평균값을 기록하였다. 메타콜린에 의해 유발된 기도의 수축은 메타콜린의 농도가 증가할 때 더욱 현저하였다. Penh(증가의 중단)의 값은 시스템 내의 압력 센서(차압 변환기; 북시코) 및 전치 증폭기(MAX Ⅱ, 북시코)로부터 유발된 데이터를 수집함으로써 계산하였다. Penh의 상대 증가 비율은 Penh% = Penh_methacholine/Penh_PBS으로 계산하였고, Penh_methacholine은 생쥐들이 3분의 메타코린 에어로졸을 흡입한 후 Penh의 평균값이고 Penh_PBS은 생쥐들이 3분의 PBS 에어로졸을 흡입한 후 Penh의 평균값이다.

(5) 기관지폐세척액(BALF) 및 폐 미세구조:

생쥐들의 모든 그룹들이 AHR 분석을 마침에 따라, 생쥐들을 다음날 희생시켰다. 폐를 3회 동안 2% 태아 소 혈청(FBS) 및 2mM 2Na-EDTA를 함유한 1ml의 생리식염수(HBSS, SH30016.01, Hyclone, USA)으로 기관 삽입관(18 GA, angiocath, B.D.)을 통해 즉시 세척하였다. 약 3ml의 BALF를 수집하였다. 먼저 수집된 BALF를 4℃에서 5분 동안 1500rpm에서 원심분리하였다. BALF의 수집된 상청액을 사이토카인의 수준을 측정하기 위해 -20℃로 저장하였다. 둘째 및 셋째로 수집된 BALF를 혼합하고 먼저 수집된 BALF와 같은 조건하에서 원심분리하였다. 상청액을 제거하여 얻은 세포들을 약하게 때려 이들을 분리하였고, 여기에 첫 번째 원심분리에 의해 얻은 세포들을 첨가하였다. 전체 세포 숫자를 0.5ml CM-10으로 측정하였고, 세포들의 밀도를 3x10⁵ cells/ml로 조절하였다. 사이토스핀 원심분리 장치(Cytospin 4 Cytocentrifuge, Thermo Shandon, USA)를 사용하여 그 후 수행된 실험들을 위해 세포들을 고정하는데 사용하였다. 생쥐 당 200㎕의 세포 현탁액을 4분 동안 500rpm에서 원심분리하였고 슬라이드를 제조하였고, 이 위에서 세포 현탁액을 공기 중에서 건조하였다. 세포들을 리우 염색 용액(Liu's stain solution)(Liu A and Liu B, Delta, 232, Japan)으로 염색하였다. 세포들을 1000배 확대하에서 오일 침지 렌즈가 장착된 현미경(Olympus, BX41TF, Japan)으로 관찰하였다. 200개 백혈구를 4개 다른 세포들, 호산구, 호중구, 림프구 및 단핵구를 포함하는 각 슬라이드 상에서 계수하였다. 실험 결과들을 전체 BALF 세포들을 기초로 한 림프구의 특정-소집단의 백분율로 제공하였다.

(6) 에오탁신 수준 측정:

기관지폐세척액에서 에오탁신 수준을 R&D의 상표로 판매되는 키트로 샌드위치-ELISA로 측정하였다. 간단하게, ELISA 판들을 특정 Abs로 먼저 덮고 4℃에서 밤새 방치하였다. 판들을 1% PBS-BSA로 처리하였고 실험들을 수행하기 전에 세척하였다. 그런 후에 상청액을 ELISA 판에 첨가하였고 2시간 동안 실온에서 유지시켰고, 바이오틴-접합 Abs를 첨가하였다. 실온에서 2시간 후, 아비딘-접합 HRP를 첨가하고 2시간 동안 방치하였다. 그런 후에 기질 테트라메틸벤지딘(TMB)을 착색을 위해 첨가하고 흡수된 파장을 OD450 파장에서 측정하였다. 농도를 표준 값들을 기초로 내삽법으로 계산하였다.

(7) 생물학적 통계 분석:

모든 데이터를 평균 ± SD로 제공하였다. 통계적으로 유의한 차이들에 대한 모든 분석은 As 그룹에 대한 치료와 비교하여 스튜던트 t-검정(Student's t test)으로 수행하였다. P 값 < 0.05는 유의한 것으로 생각하였다.

OVA로 민감해진 생쥐들에서 기도 과민성(AHR)에 대한 복령의 추출물과 구성물질들의 효과

(Penh%)
메타콜린(mg/mL)	25	50
그룹
As	14.2±8.4	18.4±8.5
Pred	10.4±5.1	13.0±5.4
1PCE	12.5±5.5	17.6±6.6
2PCE	13.6±10.2	21.1±14.8
1K1	6.9±3.3	9.3±4.2^*
2K1	13.5±5.7	20.1±14.4
1K2	12.4±12.0	14.7±12.5
2K2	6.1±3.7^*	9.0±5.2^*
1K3	6.6±6.0	8.8±7.7^*
2K3	9.9±8.2	14.9±11.3

^*p<0.05

OVA-민감 생쥐들의 BALF에서 면역 세포들의 소집단의 백분율에 대한 복령의 추출물과 구성물질들의 효과

그룹	단핵구	림프구	호중구	호산구
그룹	%
As	19.1±7.9	64.7±12.2	0.6±0.6	15.7±8.3
Pred	13.3±7.8	76.4±9.3^*	0.8±0.8	9.4±2.5
1PCE	16.5±6.5	69.4±12.9	0.1±0.2^*	15.1±8.0
2PCE	14.2±7.7	74.7±12.5	0.1±0.2^*	11.0±5.8
1K1	15.1±6.6	72.1±10.5	0±0^*	12.9±6.3
2K1	18.5±10.7	67.6±18.8	1.0±0.4^*	13.9±9.0
1K2	31.0±6.6	57.9±7.2	0.4±0.8	10.6±3.2
2K2	35.7±7.5	50.4±8.2	0.6±0.5	13.4±3.8
1K3	38.2±8.7	49.8±12.8	0.8±0.9	11.3±7.0
2K3	37.1±5.7	52.1±8.1	1.1±1.1	9.7±3.6

^*p<0.05

OVA-민감 생쥐들의 BALF에서 에오탁신의 수준에 대한 복령의 추출물과 구성물질들의 효과

그룹	에오탁신(pg/mL)
As	34.1±9.3
Pred	31.1±6.8
1PCE	20.9±6.4^*
2PCE	27.1±11.1
1K1	19.6±8.8^*
2K2	21.5±5.8^*
1K2	22.1±13.1
2K2	19.3±6.5^*
1K3	21.1±10.4^*
2K3	25.1±12.0

^*p<0.05

결과:

1. 메타콜린의 농도가 증가함에 따라, AHR의 값은 그룹들 중에서 증가한다는 것을 표 2로부터 볼 수 있다. 2K2 그룹은 As 그룹가 비교하여 최저 AHR 값들을 나타내며 1K1, 2K2 및 1K3 그룹은 메타콜린의 더 높은 자극(50mg/mL)에 대해 As 그룹과 비교하여 AHR의 현저하게 적은 값을 가진다. AHR의 더 큰 값은 생쥐들은 기도 과민성 반응의 더욱 심각함을 앓고 있다는 것을 나타낸다. 결과로 얻은 데이터는 본 발명의 복령 추출물과 구성물질들은 천식에 대한 예방/치료 효과를 가진다는 것을 나타낸다. Pred 그룹은 더 적은 값의 AHR를 나타내나 As 그룹에 대해서는 통계적으로 유의하지 않다. 따라서, 본 발명의 복령의 추출물 및 구성물질들은 천식 치료를 위한 인기있는 임상 치료 스테로이드와 비교해서, 천식에 의해 유발된 기도의 수축의 면에서 천식에 대한 예방/치료 효과에 더욱 유익하다.

2. As 그룹은 OVA-민감 생쥐들의 BALF에서 호산구의 최고의 백분율을 가지며 Pred 그룹은 최저 백분율을 가지나 통계적 유의성은 없다는 것을 표 3에 도시된 결과로부터 볼 수 있다. 그러나, Pred 그룹에서 림프구의 백분율은 As 그룹의 백분율보다 현저하게 더 높다. 이것에도 불구하고, 1PCE, 2PCE, 1K1 및 2K1이 투여된 생쥐들은 As 그룹과 비교하여 BALF에서 호중구의 현저하게 더 적은 백분율을 보여준다. 결과들은 복령의 구성물질들은 폐 조직에 유지된 감염 세포들의 침투를 완화시킬 수 있다.

3. 천식의 개시 단계의 활성 국면에서, 국소 염증과 관련된 여러 종류의 염증 단백질들이 있다. 이 실시예에서, BALF에서 에오탁신의 수준을 분석하였고 결과들은 표 4에 나타내었다. 기도기관지 위의 상피세포, 내피세포 및 섬유아세포와 같은 에오탁신을 분비할 수 있는 여러 종류의 세포들이 있다. 분비된 에오탁신은 호산구 또는 Th2 세포들을 기도기관지에 모을 수 있다(Rankin et al., Eotaxin and eosinophil recruitment: implication for human disease. Mol Med Today 6:20-27.(2000)). 1PCE, 1K1, 2K1 및 1K3가 투여된 생쥐들은 As 그룹과 비교하여 BALF에서 에오탁신의 현저하게 낮은 수준을 가진다는 것이 표 3에 있는 데이터로부터 볼 수 있다. Pred 그룹에서 생쥐들은 As 그룹과 비교해서 에오탁신의 수준들에 대해 현저한 차이를 보여주지 않는다. 결과들은 본 발명에 개시된 복령의 구성물질들은 염증 단백질 에오탁신의 분비를 억제함으로써 기도에 염증 세포들의 침투하는 것을 막을 수 있다는 것을 입증한다. 따라서, 본 발명의 복령의 구성물질들은 천식 치료를 위한 인기있는 임상 치료 스테로이드(Pred)와 비교해서, 폐 조직에 유지된 염증 세포들(호산구 또는 Th2 림프구)의 침투를 완화하는 면에서 천식에 대한 예방/치료 효과에 더욱 유익하다.

Claims

포유류의 면역장애로부터 유발된 질환을 치료하기 위한 약물의 제조에서 활성 성분으로서 다음 화학식(I) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 가진 라노스테인의 용도:

(I)
(여기서, R₁은 H 또는 CH₃이고; R₂는 OCOCH₃, =O, 또는 OH이고; R₃는 H 또는 OH이고; R₄는 -C(=CH₂)-C(CH₃)₂R_a(여기서 R_a는 H 또는 OH), 또는 -CH=C(CH₃)R_b(여기서 R_b는 CH₃ 또는 CH₂OH)이고; R₅는 H 또는 OH이고, R₆는 CH₃ 또는 CH₂OH이다.).
제 1 항에 있어서,
면역장애로 유발된 상기 질환은 알레르기인 용도.
제 2 항에 있어서,
상기 알레르기는 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염, 알레르기성 천식, 아토피 피부염, 식도 알레르기, 아토피 습진 또는 류마티스 관절염인 용도.
제 3 항에 있어서,
상기 알레르기는 알레르기 천식인 용도.
제 1 항에 있어서,
라노스테인(I)은

또는

인 용도.
제 1 항에 있어서,
상기 의약은 0.1-60중량%의 라노스테인(I) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 용도.
제 1 항에 있어서,
상기 의약은 경구로 투여되는 용도.
제 1 항에 있어서,
포유류는 인간인 용도.
제 1 항에 있어서,
복령 추출물은 활성 성분으로 사용되고, 추출물의 1-60중량%의 라노스테인(I)을 포함하며 세코라노스테인의 실질적으로 없는 용도.
제 9 항에 있어서,
상기 복령 추출물은 다음 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 용도:
a) 물, 메탄올, 에탄올 또는 이의 혼합 용매에 의해 복령(Poria cocos (Schw) Wolf)의 대사 산물들, 발효 생성물들 또는 균핵(sclerotium)을 추출하는 단계;
b) 단계 a)로부터의 얻은 액체 추출물을 농축하는 단계;
c) 단계 b)로부터 얻은 농축된 물질을 실리카겔 컬럼에 주입하는 단계;
d) 낮은 극성을 가진 용출액으로 실리카겔 컬럼을 용출하고 결과로 얻은 용출물을 수집하는 단계; 및
e) 단계 d)로부터의 용출물을 농축하는 단계.
제 10 항에 있어서,
단계 e)로부터의 농축 용출물은 다이클로로메테인 : 메탄올 = 96 : 4의 혼합 용매에 의해 전개되고 자외선 램프 및 요오드 증기에 의해 탐지되는 실리카 박층 크로마토그래피와 일치하는 적어도 0.1의 크로마토그래피 값, Rf를 갖는 용도.
제 10 항에 있어서,
단계 a)의 추출은 95% 에탄올을 사용하여 수행되는 용도.
제 10 항에 있어서,
단계 a)의 추출하는 단계는 물을 끓임으로써 복령(Poria cocos (Schw) Wolf)의 대사산물들, 발효 생성물들 또는 균핵을 추출하는 단계; 염기를 pH 값이 9-11일 때까지 얻은 추출 수용액에 첨가하는 단계; 염기성 수용액을 회수하는 단계; 침전물을 형성하기 위해 산을 pH 값이 4-6이 될 때까지 염기성 수용액에 첨가하는 단계; 침전물을 회수하는 단계; 침전물을 에탄올로 추출하는 단계; 및 액체 추출물을 회수하는 단계를 포함하는 용도.
제 12 항 또는 제 13 항에 있어서,
단계 b)로부터 얻은 농축 물질은 1:1의 부피 비로 메탄올 수용액과 n-헥세인을 함유하는 2상 용매로 추가로 추출되고, 메탄올 층은 2상 용매 추출 혼합물로부터 분리하고 메탄올 층은 농축되어 농축물을 형성하며, 이 농축물은 단계 c)에서 실리카겔 컬럼에 대한 원료로 사용되는 용도.
제 10 항에 있어서,
단계 d)의 낮은 극성의 용출물은 96.5:3.5의 부피 비로 다이클로로메테인 및 메탄올을 함유하는 혼합 용매인 용도.
제 9 항에 있어서,
상기 복령 추출물은 5-35중량%의 라노스테인 화합물(I)을 포함하는 용도.
제 9 항에 있어서,
라노스테인(I)은:

또는

인 용도.