WO2020008083A1 - Diana terapéutica en receptores de quimiocinas para la selección de compuestos útiles para el tratamiento de procesos patológicos que implican la señalización de quimiocinas - Google Patents

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chemokine
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cells
receptor
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Mario MELLADO GARCÍA
José Miguel RODRÍGUEZ FRADE
Laura MARTÍNEZ MUÑOZ
César Augusto SANTIAGO HERNÁNDEZ
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Consejo Superior De Investigaciones Científicas
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7158—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for chemokines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the invention relates to the identification of molecular targets in chemokine / chemokine receptor complexes whose modulation is useful for intervening in cellular responses mediated by chemokines. Exogenous modulation of these therapeutic targets specifically blocks the events triggered by the binding of the chemokine ligand to its receptor, such events include, among others, cell migration. Therefore, the invention belongs to the fields of medicine and pharmacology, in particular to the field of therapeutic targets for the detection of compounds useful in the treatment of diseases or clinical conditions whose symptoms or pathologies are a consequence of the events triggered by signaling. of chemokines, such as inflammatory and autoimmune diseases, as well as cancer.
  • chemokines are now known to be involved in a wide variety of cell types and functions; They have been linked to lymphocyte trafficking, regulation of T lymphocyte differentiation, macrophage polarization, HIV-1 infection, angiogenesis, organogenesis and tumor metastasis. Therefore, deregulation of its expression is implicated in many human diseases, including autoimmune and chronic inflammatory diseases, immunodeficiency and cancer (Charo IF and Ransohoff RM (2006) N Engl J Med 354 (6): 610-621; Gerard CaR BJ (2001) Nal Immunol. 2: 108-1 15). Chemokines are, therefore, an important focus of interest as potential therapeutic targets.
  • chemokines There are almost 50 known and classified human chemokines. Constitutive chemokines are usually regulated during development and participate in homeostasis, while inducible chemokine expression is regulated primarily during inflammatory processes. In addition, several viruses encode highly selective chemokines that act as agonists or antagonists and may participate in viral propagation and / or evasion of the host immune response (Aicami A (2003) Nal Rev. Immunol. 3: 36-50).
  • Chemokines act by binding to GPCR (G protein-coupled receptors) of ciase A. This interaction involves amino acid residues in the N-terminal domain of! receptor and the third extracellular loop, among others.
  • the 20 receptors characterized to date are classified as CGR, CXCR, CX3CR and XCR, based on their ligands;
  • the family also includes several decoy receptors (DARC, D6, CCXCKR), which participate in the elimination of chemokines at sites of inflammation.
  • DARC, D6, CCXCKR decoy receptors
  • chemokines and their receptors are precisely regulated by several factors that include cytokines, growth factors and the state of the cell cycle, indicating that the cellular context influences these responses.
  • chemokines are expressed simultaneously and the cells coexpress more than one receptor.
  • the complexity of this scenario is completed by the remarkable redundancy between chemokines and their receptors (Rossi DaZ A (2000) Annu. Rev. Immunol. 18: 217-242) and with the glycosaminoglycans (GAG) that chemokines present to cells (Hamel DJ et al. (2009) Methods in enzymology 461: 71-102).
  • interactions between these mediators, between their receptors and between the complexes they form are likely to be crucial to integrate the spacetime organization of the immune system and to understand their physiological function.
  • CXCR4 is one of the most conserved chemokine receptors in vertebrates and, in mice, is essential for life (Sierro F et al. (2007) Proc Nati Acad Sci USA 104 (37): 14759-14764). It binds to the key homeostatic ligand CXCL12, also called stromal cell derived factor 1 (SDF-1), which is constitutively secreted by bone marrow stromal cells (MO) and by many other cell types in various tissues.
  • SDF-1 stromal cell derived factor 1
  • CXCR4 is a classic GPCR that signals in a G-protein dependent manner.
  • CXCL12 The binding of CXCL12 to CXCR4 activates all signal transduction pathways typical of chemokine receptors, including those that trigger adhesion, chemotaxis, survival and proliferation. .
  • CXCR4 also binds to non-chemokine ligands, such as the gp12G envelope protein of HIV CXCR4 (X4) -tropic. Therefore, CXCR4 is considered one of the main HIV co-receptors (Moore JP et al. (1997) Current Opinion in immmunoiogy 9: 551-562).
  • CXCR4 is widely expressed in undifferentiated and differentiated tissues. It is found on almost all hematopoietic cells, vascular endothelial cells, in neurons of the central and peripheral nervous system, microglia and astrocytes. Therefore, its activity is related to cell migration and positioning, neovascularization, survival and growth. It is also functionally expressed by many cancer cells of hematopoietic and non-hematopoietic origin (Baikwii! F (2004) Nat Rev Cancer 4 (7): 540-550).
  • CXCR4 conserves hematopoietic precursors in the MO, mediates the segregation of B cells in lymphoid organs, as well as the outflow of neutrophils from the MO and the return to the MO of senescent neutrophils (Ma Q et al. (1999) -471).
  • CXCR4 can also play an important role in the trafficking of virgin and memory B cells to germ centers. Mice harboring a function gain promoted by CXCL12 for CXCR4 show an abnormal compartmentalization of B cells in the periphery, with a reduction of the primary follicles in the spleen and their absence in the lymph nodes.
  • CD4 + T lymphocytes express elevated levels of CXCR4 and the concentration of CXCL12 is also elevated in synovial fluid of RA patients (Nanki T et al. (2000) J Immunol 185 (1 1): 6590-6598), indicating that CXCR4 is important for the retention of T lymphocytes in synovial tissues affected by RA.
  • CXCR4 antagonists including the competitor of the AMD3I00 binding site, have anti-AR activity (Mattbys P et al. (2001) J Immunol 167 (8): 4886-4692).
  • chemokine-mediated cell activation would involve the binding of a monomeric chemokine to its monomeric receptor.
  • chemokine monomers bound to nanomolar concentrations retain full activity to trigger cellular responses mediated by in vitro receptors, several series of indications indicate that the situation in vivo is much more complex.
  • Chemokines are found as monomers or as oiigomers, as soluble or GAG-associated factors and are capable of binding and activating a monomeric receptor or receptor oiigomers on the cell surface (Proud ⁇ oot A et al. (2003) Proc Nati. Acad. Sci USA 100: 1885-1890).
  • Non-functional CCR2 and CXCR2 mules block ligand-mediated cell migration by dimerization with corresponding wild-type receptors (Rodriguez-Frade JM et ai. (1999) Proc Nati Acad Sci USA 96 (7): 3628-3633; Trettel F et al. (2003) The Journal heard biological! Chemistry 278 (42): 40980-40988).
  • CCR2 / CCR5 heterodimers trigger specific signaling events such as Gn activation, which in turn promotes specific cellular functions that include increased cell adhesion (Mellado M et al., (2001) Embo J 20 (10) : 2497-2507).
  • the CCR5 / CXCR4 heterodimers are recruited into the immune synapse, where they are coupled to the G q and / or Gn protein; T lymphocytes become insensitive to chemotactic gradients, form more stable conjugates and respond with proliferation and production of enhanced cytokines (Molon B et ai. (2005) Nat lmmunoi Q (5): 465-471).
  • CXCR7 / CXCR4 heterodimers are reported in transfectants and in primary cells, where CXCR7 modulates responses mediated by CXCR4 (Sierro F et ai. (2007) Proc Nati Acad Sci USA 104 (37): 14759-14764). Allosteric modulation between chemokine receptor dimers is also reported and appears to depend on the relative expression of each receptor. In transfected and primary cells expressing CCR2 alone, CCR5 specific ligands are unable to compete for binding of CCR2 specific ligands; however, avoid this Binding efficiently when CCR2 and CCR5 are coexpressed.
  • chemokine receptor oligomerization Although there is much evidence of the functional relevance of chemokine receptor oligomerization, it is still far from well understood. Homodimerization and heterodimerization have far-reaching implications with respect to agonist-induced activation mechanisms and antagonist-induced inhibition mechanisms, G-protein coupling and signaling and internation and GPCR desensitization. Therefore, it is essential to define the complexities of these signaling modules, since GPCR is a target of great importance in the development and pharmaceutical intervention and the effectiveness of the drugs directed to these receptors could depend largely on the state of interaction of the receiver.
  • chemokine / chemokine receptor complexes it is necessary to identify the regions involved in the adoption of the active conformational state (oligomerization) of chemokine / chemokine receptor complexes. These regions would be therapeutic targets whose exogenous modulation can be interesting from a clinical point of view for the treatment and / or prevention of clinical conditions, pathological processes or diseases that involve chemokine signaling, such as inflammatory or autoimmune diseases. Similarly, it is necessary to develop molecules or compounds capable of interfering with these new therapeutic targets thereby avoiding the adoption of the active conformational state (oligomerization) in the chemokine / chemokine receptor complex and thus blocking chemokine-mediated signaling in the cell. These developed molecules could be used to improve pathological processes, such as cancer or inflammation, in which chemokine signaling pathways are crucial.
  • the invention relates to a peptide comprising the amino acid sequence X I X2TX 4 ILIX 8 A (SEO ID NO: 1) or its inverted sequence, wherein
  • X 2 is T or P
  • X 4 is V or A
  • X 8 is L or A
  • said peptide is capable of inhibiting CXCL12 signaling.
  • the invention in another aspect, relates to a fusion protein that It comprises the peptide of the invention and at least one heterologous polypeptide.
  • the invention relates to a nanoparticle comprising the peptide or fusion protein of the invention.
  • the invention relates to a virus-like particle comprising the peptide or fusion protein of the invention.
  • the invention in another aspect, relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of the peptide, fusion protein, nanoparticle or virus-like particle of the invention and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • the invention relates to an in vitro method for the detection of compounds, molecules and / or compositions that inhibit the chemokine-mediated cellular response or are useful for the treatment and / or prevention of chronic inflammatory diseases, autoimmune diseases. , immunodeficiencies or cancer, where said method comprises:
  • c) classify the compound, molecule and / or composition as useful for inhibiting chemokine-mediated cellular response or useful for the treatment and / or prevention of chronic inflammatory diseases, autoimmune diseases, immunodeficiencies or cancer, when a binding has been detected in stage b).
  • the invention relates to the peptide, fusion protein, nanoparticle, virus-like particle according to the invention or pharmaceutical composition of the invention for use in medicine.
  • the invention relates to a peptide, fusion protein, nanoparticle, virus-like particle or pharmaceutical composition of the invention for use in the treatment and / or prevention of chronic inflammatory diseases, autoimmune diseases, immunodeficiencies or cancer. .
  • the present invention provides a molecular target within chemokine receptors, specifically within the transmembrane region VI of the CXCR4 chemokine receptor, which allows the detection and / or design of molecules whose binding selectively inhibits chemokine-mediated receptor oligomerization, preferably CXCR12 chemokine-mediated CXCR4 receptor oligomerization. Since this oligomerization is the active conformational state of these chemokine / chemokine receptor complexes, inhibition of chemokine receptor oligomerization blocks the events triggered by chemokine signaling, including pathological processes such as inflammation or cell migration in cancer.
  • the inventors have identified, within the chemokine receptors, preferably within the CXCR4 receptor, the residues involved in the oligomerization of the chemokine-mediated receptor. These residues represent a new therapeutic target to intervene in cellular responses associated with chemokine signaling.
  • chemokine receptor oligomerization oligomerization and cell surface receptor dynamics.
  • the inventors have evaluated the biological relevance of these oligomers and, using peptides designed to mimic the transmembrane regions of this receptor, have identified as a target the region consisting of amino acid residues 239 KTTVILiLA 247 , SEQ ID NO: 2, located in ei Transmembrane domain VI (TMVI) of the CXCR4 receptor, whose exogenous modulation specifically blocks cell migration mediated by CXCL12. Therefore, this chemokine receptor region is proposed in the present invention as a molecular target for the detection of compounds capable of inhibiting the oligomerization of! chemokine receptor, affecting chemokine signaling involved in several pathological processes.
  • TIRF total internal reflection fluorescent microscopy
  • STED stimulated emission depletion microscopy
  • CXCR4 the inventors studied these residues in CXCR4 and generated a triple mutant CXCR4 consisting of the amino acid sequence of CXCR4 (SEQ ID NQ: 3) where in the region comprising ios residues 239 KTTVILILA 24 / substitutions K239E, V242A and L246A ( 239 ETTAILIAA 247 , SEQ ID NO: 4) were included.
  • This triple mutant receptor was normally expressed in the cell membrane, dimerized as demonstrated by FRET, bound to CXCL12 but was not able to trigger cell migration or phosphorylation of ERK and AKT.
  • the present invention also provides a molecule (the peptide comprising SEQ ID NO: 4) that prevents oligomerization of the receptor from chemokines and that can be used for the treatment of pathological processes that involve chemokine signaling.
  • this peptide consisting of SEQ ID NO: 2 is also proposed in the present invention as an agonist for blocking chemokine receptor oligomerization and for treating pathological processes that involve chemokine signaling.
  • the results of the inventors shown in the examples below indicate that: i) the residues responsible for chemokine-mediated receptor oligomerization are a therapeutic target that can be exogenously modulated in order to treat inflammatory and autoimmune diseases or, in general , all pathological processes in which chemokine signaling pathways are involved and ii) the specific sequence SEQ ID NO: 2 within the amino acid sequence of CXCR4 is responsible for said oligomerization, thus being a promising therapeutic target to intervene in chemokine-mediated responses within cells.
  • the invention relates to a peptide, hereinafter peptide of the invention, comprising the amino acid sequence X 1 X 2 TX 4 ILIX 8 A (SEQ ID NQ: 1) or its sequence inverted where
  • Xi K or E
  • X 2 is T or P
  • X 4 is V or A
  • Xg is L or A
  • peptide or "polypeptide”, as used herein, is generally removed from a linear chain of about 2 to 50 amino acid residues linked together with peptide bonds. It will be understood that the expressions “peptide bond”, “peptide”, “polypeptide” and protein are known to those skilled in the art. Hereinafter, “peptide” and “polypeptide” will be used interchangeably.
  • amino acid residue refers to any naturally occurring amino acid, any amino acid derivative or any amino acid mimetic known in the art.
  • amino acid residue encompasses amino acid residues L and D.
  • the peptide of the invention does not comprise the full length sequence of CXCR4 (SEQ ID NO: 3).
  • GXGR4 refers to a type 4 CXC chemokine receptor (CXCR-4) also known as fusin or CD184 (differentiation group 184) and is a protein that, in beings human, is encoded by the GXGR4 gene.
  • CXCR-4 is a specific alpha-chemokine receptor for stromal-derived factor 1 (SDF-1 also called CXGL12), a molecule endowed with potent chemotactic activity for lymphocytes.
  • SDF-1 stromal-derived factor 1
  • CXCR4 is also one of several chemokine receptors that HIV can use to infect CD4 + T cells.
  • the CXCR4 can be of any origin, for example, human, bovine, murine, equine, canine, etc.
  • CXCR4 is a human protein with the Uniprot accession number P61073 (CXCR4JHUMAN) (SEG ID NO: 3).
  • CXCL12 refers to the G-X-C chemokine 12 motif, also known as stromal cell derived factor 1 (SDF1).
  • SDF1 stromal cell derived factor 1
  • CXCL12 is a chemokine protein that in humans is encoded by the CXCL12 gene on chromosome 10.
  • CXGL12 is strongly chemotactic for lymphocytes and its signaling has been observed in several types of cancer.
  • CXGR4 is the exclusive receiver for CXCL12; therefore, by blocking its receptor, CXCL12 acts as an endogenous inhibitor of CXCR4-tropic HIV-1 strains.
  • the peptide of the invention consists of less than 50, less than 40, less than 30, less than 20 or less than 10 amino acid residues.
  • the peptide of the invention is between 9 and 50 amino acids in length, preferably between 9 and 40, more preferably between 9 and 30, even more preferably between 9 and 20. In a particular embodiment, the peptide is between 9 and 15 amino acids in length.
  • the peptide of the invention has a length of 9 amino acids.
  • the peptide of the invention has the amino acid sequence KTTVILILA (SEQ ID NO: 2).
  • the peptide of the invention comprises the reverse sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the peptide of the invention comprises the amino acid sequence ETTAILIAA (SEQ ID NO: 4). In a more particular embodiment, the peptide of the invention comprises the reverse sequence of SEQ ID NQ: 4.
  • the peptide of the invention comprises the amino acid sequence KPTVILILA (SEQ ID NO: 5). In a more particular embodiment, the peptide of the invention comprises the reverse sequence of SEQ ID NO: 5.
  • the peptide of the invention comprises the inverted sequence of the peptide of the invention.
  • inverted sequence refers to a peptide in which the direction of the amino acid sequence is reversed, that is, the amino acid sequence of a peptide read from its C-terminus to its N-terminus, so that the positions of the carbonite and amino groups in each amide bond are exchanged.
  • This peptide is also known as "retropypeptide.”
  • the reverse sequence, or retropypeptide, of the sequence of SEQ ID NQ: 1 is AX 2 iLIX 6 TXsX9 (SEQ ID NO: 6) where X 2 is L or A, X 6 is V or A, X 8 is T or P and X 9 is K or E.
  • the reverse sequence of the SEQ ID NO: 2 peptide is ALIUVTTK (SEQ ID NQ: 7).
  • the reverse sequence of the SEQ ID NO: 4 peptide is AAILIATTE (SEQ ID NO: 8).
  • the reverse sequence of the SEQ ID NQ: 5 peptide is ALILIVTPK (SEQ ID NQ: 9).
  • the peptide of the invention comprises a sequence that is a variant of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 that has at least 50%, at least 55%, at least 58%, at minus 60%, at least 65%, at least 67%, at least 70%, at least 75%, at least 78%, at least 80%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95% , at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99% sequence identity with SEQ ID NO: 1.
  • the degree of identity between the variants and SEQ ID NO: 1 is determined by the use of algorithms and computer methods that are widely known to those skilled in the art.
  • sequence identity is preferably determined by using the BLASTP algorithm (BLAST Manual, Aitschui, S. et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894). In a preferred embodiment, the sequence identity is determined along the entire length of the sequence of SEQ ID NO: 1 or across the entire length of the variant or both
  • X is K or E. In a more particular embodiment, Xi is K.
  • X 2 is T or P. In a more particular embodiment, X 2 is T.
  • X 4 is V or A. In a more particular embodiment, X 4 is V.
  • X 8 is L or A. In a more particular embodiment, X 8 is L.
  • the vacancy of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is capable of inhibiting CXCL12 / CXCR4 signaling, that is, CXCR12-mediated CXCR4 receptor signaling.
  • the ability of a peptide to inhibit CXCL12 / CXCR4 signaling can be determined by measuring the ability of the peptide to block the activation of CXCL4-mediated CXCL4 targets, namely JAK / Stat, GRK / b-arrestine, Rho / Rac pathways , P! 3K / Akt, Grb2 / Ras / RAf / ERK PKC or NFKkb, ERK and / or Akt, which results in events such as migration, polarization, adhesion, growth, cell compartmentalization and the like.
  • CXCL4-mediated CXCL4 targets namely JAK / Stat, GRK / b-arrestine, Rho / Rac pathways , P! 3K / Akt, Grb2 / Ras / RAf / ERK PKC or NFKkb, ERK and / or Akt, which results in events such as migration, polarization, adhesion, growth, cell
  • the inhibition of the chemoein-mediated cellular response referred to in the present invention comprises a reduced calcium flow, lack of activation of AKT and ERK, difficulties in polarizing and / or adhering to the substrate and / or the absence of cell migration, lack of activation of neutrophils, reduction of cell proliferation, lymphopoiesis, cell survival and / or angiogenesis, blocking the metastasis of tumor cells in cells in response to CXCL12 chemokine.
  • the modification in the function of CXCR4 referred to in the present invention also It comprises the inhibition of HIV infection.
  • a peptide is considered to be able to inhibit CXCL12 / CXCR4 signaling if it reduces CXCL12-induced phosphorylation of any of JAK / STAT, ERK1 / 2 and AKT by at least 5%, at least 10%. %, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90% or 100%
  • the peptide of the invention comprises at least one amino acid D.
  • amino acid D refers to the enantiomer D of an amino acid, which is the mirror image of amino acid L.
  • the peptide of the invention comprises 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or more D. amino acids.
  • the peptide of the invention consists entirely of amino acids D, that is, it is a whole D enantiomer.
  • glycine is the only amino acid that does not have an enantiomer, so in this particular embodiment excludes that the peptide comprises glycine.
  • the peptide of the invention comprises the fully D enantiomer of the sequence X I X 2 TX4IX 8 A (SEQ ID NO: 1) where Xi is K or E, X 2 is T or P, X 4 is V or A and X 8 is L or A.
  • the peptide of the invention comprises the whole D enantiomer of the sequence KTTVIL1LA (SEQ ID NO: 2) or the reverse peptide thereof.
  • the peptide of the invention comprises the whole D enantiomer of the sequence ETTA1LIAA (SEQ ID NO: 4) or the reverse peptide thereof.
  • the peptide of the invention comprises the whole D enantiomer of the sequence KPTViLILA (SEQ ID NO: 5) or the reverse peptide thereof.
  • the reverse peptide of the whole D enantiomer is also called retroinverse or retroinverted peptide.
  • the retroinverse peptide constitutes linear peptide isomers in which the direction of the amino acid sequence is reversed (retro) and the chirality, D or L, of one or more amino acids thereof is inverted. (reverse), for example, using D amino acids instead of L amino acids, for example, Jameson et al., Nature, 368, 744-746 (1994); Brady et al., Nature, 368, 692-693 (1994).
  • the peptide of the invention can be obtained by any suitable method known in the art, for example, but not limited to, an in vifro method such as, for example, by chemical synthesis or by recombinant protein techniques. For example, through solid phase peptide synthesis or by recombinant DNA approaches.
  • the peptides and polypeptides of the invention can be produced recombinantly, not only directly but also as fusion peptides and polypeptides together with one or more heterologous peptides or polypeptides that may contain, for example, but not limited to, a signal sequence, a sequence marker or other peptide having a protease cleavage site, for example, but not limited to, at the N-terminal end of the mature peptide or polypeptide.
  • the peptides or polypeptides of the invention may also comprise one or more chemical groups attached to the N-termini and / or C-terminal ends, such as biotin groups or other fluorescent groups that allow visualization and control of the peptide or polypeptide.
  • the recombinant production of the peptides or polypeptides of the invention comprises the design and optionally amplification of a polynucleotide encoding said peptide or polypeptide, cloning of the polynucleotide in a gene construct, preferably in an expression vector, transformation or transfection of a cell competent with said construction, the cultivation of said cell under conditions that promote the expression of the peptide or polypeptide of the invention and the isolation and purification of the peptide or polypeptide of the invention produced or expressed by the cell.
  • the invention in another aspect, relates to a fusion protein, hereinafter referred to as "fusion protein of the invention", which comprises the peptide of the invention and at least one heterologous polypeptide.
  • fusion protein refers to a single artificially designed polypeptide chain comprising two or more sequences of different origins, natural and / or artificial. Fusion protein, by definition, is never found in nature as such.
  • heterologous polypeptide means that the polypeptide is not naturally fused to the peptide of the invention.
  • the heterologous polypeptide is a peptide that is capable of crossing the blood brain barrier.
  • the conjugation of the peptide of the invention with this type of peptide will facilitate the peptide crossing the blood brain barrier and is especially useful for delivering the peptide in the central nervous system by systemic administration.
  • Peptides capable of crossing the blood brain barrier are known in the art.
  • W0200979790 discloses a series of peptides known collectively as Angiopeps that are capable of crossing the blood-brain barrier by receptor-mediated transcytosis using low density lipoprotein receptor-related protein 1 (LRP-1) and that allows delivery to the CNS of systemically administered conjugates comprising said peptides.
  • LRP-1 low density lipoprotein receptor-related protein 1
  • WO201 1087804 describes a peptide derived from the glycoprotein G of rabies virus, which allows the conjugate comprising said peptide to cross the blood brain barrier.
  • Prades et al. (Padres R et ai. (2015) Angew Chem nt. Ed. Eng! 54 (13): 3967-3972) describes a 12 amino acid peptide derived from the human transferrin peptide that is capable of overcoming the barrier blood brain
  • the fusion protein of the invention can be obtained by any suitable technique that allows two peptides (the peptide of the invention and the heterologous polypeptide) to be obtained in a single polynucleotide chain.
  • suitable techniques include recombinant techniques, where a gene construct encoding the fusion protein is introduced into a suitable vector for expression in a suitable expression system, and protein binding techniques that involve the formation of a peptide bond between two polypeptides. , such as native chemical ligation or expressed protein ligation.
  • nanoparticle of the invention which comprises the peptide or fusion protein of the invention.
  • peptide and fusion protein have been defined above. All Particular and preferred embodiments of the peptide and fusion protein of the invention are fully applicable to the nanoparticle of the invention.
  • nanoparticle refers to any material that has dimensions in the range of 1 -1,000 nm. In some embodiments, the nanoparticles have dimensions in the range of 2-200nm, preferably in the range of 2 ⁇ 150nm, and even more preferably in the range of 2-100nm.
  • the nanoparticles can contribute to preserve the integrity of the peptide or fusion protein in biological fluids until they reach the target organ.
  • encapsulation of the composition may decrease the side effects caused by the modulator.
  • the nanoparticles can also be modified to include residues that allow the nanoparticle to be directed to an organ of interest.
  • Suitable nanoparticles that can be used in the context of the present invention include nanometric-scale materials such as a lipid-based nanoparticle (such as liposus ace), a superparamagnetic nanoparticle, a nanocoat, a semiconductor nanocrystal, a quantum dot, a nanoparticle polymer-based, a silicon-based nanoparticle, a silica-based nanoparticle, a metal-based nanoparticle, a fullerene and a nanotube.
  • nanometric-scale materials such as a lipid-based nanoparticle (such as liposus ace), a superparamagnetic nanoparticle, a nanocoat, a semiconductor nanocrystal, a quantum dot, a nanoparticle polymer-based, a silicon-based nanoparticle, a silica-based nanoparticle, a metal-based nanoparticle, a fullerene and a nanotube.
  • Targeted delivery can be achieved by adding igands without compromising the ability of the nanoparticles to deliver their peptide payloads. It is contemplated that this will allow delivery to specific cells, tissues and organs.
  • the address specificity of the delivery systems based on ligands is based on the distribution of ligand receptors in different cell types.
  • the direction ligand can be non-covalently or covalently associated with a nanoparticle and can be conjugated to the nanoparticles by a variety of methods as described herein.
  • the formulation of the product of the invention in a nanoparticle is not intended or not only intended to facilitate access of the product to the interior of the cell, but to protect the product from degradation and / or facilitate orientation of the nanoparticle to the organ of interest
  • the invention refers to a virus-like particle (in English, virus-Uke particie or VLP), hereinafter referred to as "virus-like particle of the invention", which comprises the peptide or the fusion protein of the invention.
  • peptide and fusion protein of the invention have been defined above. All particular and preferred embodiments of the peptide and fusion protein of the invention are fully applicable to virus-like particles of the invention.
  • virus-like particle also called “VLP” refers to non-infectious particles that resemble viruses that do not contain any viral genetic material. VLPs are the result of the expression of viral structural proteins, such as capsule proteins, and their self-sensing blage.
  • the VLP may comprise or, alternatively, consist of structural proteins of Parvovirus, Rotavirus; structural proteins of Norwalk virus; structural proteins of Alfavirus; structural proteins of the Foot and Mouth Disease virus; measles virus structural proteins, Sindbis virus structural proteins, Retrovirus structural proteins, Hepatitis B virus structural proteins (for example, an HBcAg); structural proteins of the tobacco mosaic virus; structural proteins of the Flock House Virus; structural proteins of the human papillomavirus; structural proteins of the Polyoma virus; bacteriophage structural proteins, structural phage RNA proteins.
  • the fusion peptide or protein of the invention is coupled or bound to the capsid of the virus-like particle. Binding of the peptide or fusion protein to the capsid can be accomplished by a covalent or non-covalent bond.
  • the peptide of the invention can be used as a pharmacological target for the detection / selection / search of compounds, molecules and / or compositions useful for the treatment and / or prevention of chronic inflammatory diseases, auto-unit diseases, immunodeficiencies or cancer. Therefore, in another aspect of the invention, the peptide of the invention is a pharmacological target for the detection of compounds, molecules and / or compositions useful for the treatment and / or prevention of chronic inflammatory diseases, diseases autoimmune, immunodeficiencies or cancer.
  • the peptide of SEQ ID NO: 1 has been identified in the present invention as the region within the GXGR4 receptor responsible for oligomerization of the CXCL12 chemokine-induced receptor. Therefore, this peptide can be used in vitro, by itself or as part of the CXCR4 receptor, as a molecular target for the detection of compounds or molecules useful for the inhibition of oligomerization of the receptor and, therefore, to block mediated signaling. by chemokines inside the cell.
  • target refers to the peptide of the invention that is useful for studying the biochemical effect of molecules, compounds or compositions capable of joining this sequence, interfering with the activity of this sequence or blocking this sequence or its activity.
  • the molecules, compounds or compositions of interest are those that, through their binding to this sequence or interference with the activity of this sequence, prevent the oligomerization of the chemokine receptor, preferably the GXGR4 receptor, which comprises the peptide of the invention .
  • the "compounds, molecules or compositions” referred to in the present invention may be, without limitation, blocking agents, interference agents, inhibitors, stimulus bias inducing ligands, allosteric and bifunctional modulators, or the like, of any nature (biological or chemical agents) and may include, for example, antibodies, antibody fragments capable of binding to the antigen, aptamers, interfering RNA, peptides, nucleic acids, metabolites or chemical agents.
  • the GXGR4 receptor mediated by chemokines, more preferably mediated by the chemokine GXCL12. Therefore, these compounds, molecules and / or compositions inhibit the oligomerization of the chemokine receptor, thereby affecting the chemokine signaling pathways.
  • inhibitor refers to an inhibition, reduction, modulation, interference, cancellation or the like, total or partial, so that the oligomerization of the chemokine receptor and, therefore, the Chemokine-mediated signaling does not occur in the way it would occur in a normal, healthy or wild type cell (not manipulated).
  • inhibitor chemokine-mediated cellular response refers to inhibiting any pathway. downstream activated or triggered by the binding of chemokine (ligand) to its receptor.
  • the downstream pathways activated by chemokines comprise activation of the JAK / Stat, GRK / p-arrestine, Rho / Rac, PI3K / Akt, Grb2 / Ras / RAf / ERK, PKC or NRkb, ERK and / or Akt, which results in events such as migration, polarization, adhesion, growth, cell compartmentalization and the like.
  • the inhibition of the chemokine-mediated cellular response referred to in the present invention comprises a reduced calcium flow, lack of activation of AKT and ERK, difficulties in polarizing and / or adhering to the substrate and / or the absence of cell migration, the lack of activation of kaurophiles, the reduction of cell proliferation, lymphopoiesis, cell survival and / or angiogenesis, blocking the metastasis of tumor cells in cells in response to CXCL12 chemokine.
  • the modification in the function of CXCR4 referred to in the present invention also includes the inhibition of HIV-1 infection.
  • the peptide of the invention is used to design new binding or interference molecules, preferably by peptidomimetics.
  • a peptidomimetic drug in its broadest sense, is a term used to designate organic molecules that mimic some properties of peptide ligands: they are usually compounds derived from peptides and proteins and obtained by structural modification using unnatural amino acids, conformational restrictions.
  • compositions, combinations and methods of the present invention also include those characterized by peptidomimetic analogs of the peptides described herein.
  • Peptidomimetic analogs mimic the three-dimensional structure of the active site contained in the original peptide.
  • the peptide analogs of the invention may be semi-peptide or non-peptide in nature.
  • These peptidomimetic analogs advantageously have a longer shelf life and biostability compared to the original compound.
  • the The bioavailability of these peptidomimetic analogs may be greater than that of the corresponding peptides when administered orally or topically.
  • these analogs may exhibit increased immunomodulatory activity for chemokine-mediated cellular response.
  • the peptidomimetic analogs of the present invention are characterized by biological activities that are similar to those of the hirudin peptides described herein. Accordingly, these analogs can be used in compositions, combinations and methods of the present invention in the same manner as the peptide of the invention. It is to be understood that the peptidomimetic and covalent analogs of the present invention are characterized by biological activities that are similar to those of the peptides described herein. Consequently, these analogs can be used in compositions, combinations and methods for diagnosis, therapy and prophylaxis in the same manner as the peptides of the present invention.
  • the peptide of the invention is used in a method of detection / search / selection of compounds, molecules and / or compositions that inhibit the cellular response mediated by chemokines, preferably chemokine is CXCL12.
  • the invention refers to the use of the peptide of the invention as a pharmacological target for the detection of compounds, molecules and / or compositions useful for the treatment and / or prevention of chronic inflammatory diseases, autoimmune diseases, immunodeficiencies or cancer.
  • the invention relates to an in vitro detection method, hereinafter "the method of detection of the invention", for the detection, design or identification of compounds, molecules and / or compositions that inhibit the chemokine-mediated cellular response, preferably where the chemokine is CXCL12 or is useful for the treatment and / or prevention of clinical conditions, pathological processes or diseases that involve chemokine signaling, preferably signaling of CXCL12, for the development of symptoms, where said method comprises:
  • Contacting the peptide of the invention or a chemokine receptor, preferably the CXCR4 receptor, with a compound, molecule and / or composition means the incubation of the compound, molecule and / or composition to be studied with the peptide of the invention or a chemokine receptor, preferably the CXCR4 receptor, under conditions that allow the binding of the molecule, compound or composition to the target, where the peptide of the invention is the target. If the molecule to be studied is an antibody or a fragment thereof, the incubation is carried out under conditions that allow the formation and control of the antigen-antibody complexes.
  • the target and / or the compound, molecule or composition to be tested are labeled, more preferably with a bioiuminiscent or fluorescent label.
  • union refers to a total or partial physical union or a union that exerts a steric hindrance.
  • interference refers to the ability of the compound, molecule or composition to block or totally or partially block the activity of the target, preferably the oligomerization activity that the target exerts on the chemokine receptor.
  • chemokine receptor oligomerization preferably chemokine-mediated CXCR4 receptor, preferably CXCL12 chemokine.
  • the analysis of the binding or interference in step (b) can be performed, for example, but without limitations, by FRET ("energy transfer” by fluorescent resonance "), BRET (bioluminescence resonance energy transfer), TiRF ⁇ total internal reflection microscopy), high resolution STED microscopy ⁇ stimulated emission depletion), Biacore (SPR, surface plasmon resonance), cytometry of flow, Western blot, electrophoresis gels, immunoprecipitation, protein matrices, immunofluorescence, immunohistochemistry, ELISA or any other enzymatic method: by incubation using a specific ligand, preferably CXCL12; by MRI or any other diagnostic imaging technique; or, for example, using chromatographic techniques combined with mass spectrometry.
  • FRET energy transfer
  • BRET bioluminescence resonance energy transfer
  • TiRF ⁇ total internal reflection microscopy high resolution STED microscopy ⁇ stimulated emission depletion
  • Biacore surface plasmon resonance
  • cytometry of flow Western blo
  • the clinical condition, the pathological process or the disease is selected from chronic inflammatory diseases, autoimmune diseases, immunodeficiencies or cancer. Definitions of these diseases and examples thereof can be found below.
  • the peptide of the invention refers to the use of the peptide of the invention as an antigen to generate an antibody that binds or interferes with the chemokine-mediated cellular response.
  • the invention refers to an antibody or fragment thereof wherein said antibody binds to the peptide of the invention, hereinafter referred to as the "antibody of the invention".
  • Said antibody or fragment thereof can be identified by the method of detection of the invention and thus is able to inhibit the chemokine-mediated cellular response or be useful for the treatment and / or prevention of clinical conditions, pathological processes or diseases. which involve chemokine signaling for the development of symptoms.
  • an “antibody” (used interchangeably in the plural form) is an immunogiobulin molecule capable of specifically binding to a target, such as a carbohydrate, polynucleotide, lipid, polypeptide, etc., through at least one recognition site of antigen, located in the variable region of the immunogiobulin molecule.
  • antibody encompasses not only intact polyclonal or monoclonal antibodies (eg, full length), but also antigen-binding fragments thereof (such as Fab, Fab ', F ( ab ') 2, Fv), single stranded (scFv), mutants thereof, fusion proteins comprising a portion of antibody, humanized antibodies, chimeric antibodies, diabody, linear antibodies, single stranded antibodies, multispecific antibodies (eg, bispecific antibodies ) and any other modified configuration of the immunogiobulin molecule comprising an antigen recognition site of the required specificity, including antibody glycosylation variants, amino acid sequence variants of antibodies and covalently modified antibodies.
  • antigen-binding fragments thereof such as Fab, Fab ', F ( ab ') 2, Fv), single stranded (scFv), mutants thereof, fusion proteins comprising a portion of antibody, humanized antibodies, chimeric antibodies, diabody, linear antibodies, single stranded antibodies, multispecific antibodies (eg, bispecific antibodies
  • An antibody includes an antibody of any kind, such as IgD, IgE, IgG, IgA or IgM (or subclass thereof) and it is not necessary for the antibody to be of any particular nature.
  • immunoglobulins can be assigned to different classes. There are five main immunoglobulin classes: IgA, IgD, IgE, IgG and IgM and several of them can be divided into subclasses (isotypes), for example, igG1,! GG2,! GG3, igG4,! GA1 and igA2.
  • the constant heavy chain domains that correspond to the different classes of immunoglobulins are called alpha, delta, epsilon, gamma and mu, respectively.
  • the subunit structures and three-dimensional configurations of different immunoglobulin classes are well known.
  • antibody fragment refers to one or more fragments of an antibody that retain the ability to specifically bind an antigen. (for example, CXGR4). It has been shown that the antigen binding function of an antibody can be performed by fragments of a full length antibody. Such antibody embodiments may also be of bispecific, dual specific or multispecific formats; that specifically bind to two or more different antigens. Multi-specific, double-specific and bispecific antibody constructs are well known in the art and are described and characterized in Kontermann (ed.), Bispecific Antibodies, Springer, NY (201 1) and Sp ⁇ ess C et al. (2015) Mol Immunol 67 (2 Part A): 95-106.
  • binding fragments included within the expression "antigen binding portion" of an antibody include (i) a Fab fragment, a monovalent fragment consisting of the VL, VH, CL and CH1 domains; (I) an F (ab ') 2 fragment, a bivalent fragment comprising two Fab fragments linked by a disulfide bridge in the hinge region; (iii) an Fd fragment consisting of the VH and CH1 domains; ( ⁇ V) an Fv fragment consisting of the single-arm VL and VH domains of an antibody, (v) a dAb fragment (Ward ES et al.
  • single chain antibodies are included within the expression "antigen binding portion" of an antibody.
  • Diabodies are bispecific bivalent antibodies in which the VH and VL domains are expressed in a single polypeptide chain, but using a linker that is too short to allow pairing between the two domains in the same chain, thereby forcing the domains to mate with complementary domains of another chain and c rear two antigen binding sites (see, for example, Holüger P et al. (1993) Proc Nati Acad Sci USA 90 (14): 6444-6448; Poljak RJ et al.
  • antibodies can be produced using recombinant DNA methods.
  • Monoclonal antibodies can also be produced by hybridoma generation (see, for example, Kohler G & Miistein C (1975) Nature 256 (5517): 495-497) according to known methods. Then, hybridomas formed in this manner are detected using conventional methods, such as enzyme-linked immunosorbent analysis (ELISA) and surface plasma resonance analysis (eg, OCTET or BIACORE), to identify one or more hybridomas that produce an antibody that specifically binds to a specific antigen.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent analysis
  • OCTET surface plasma resonance analysis
  • any form of the specified antigen can be used as an immunogen, for example, recombinant antigen, naturally occurring forms, any variant or fragment thereof, as well as antigenic peptide thereof (for example, any of the epitopes described in this document as a linear epitope or within a framework as a conformational epitope).
  • An example method for producing antibodies includes exploring protein expression libraries that express antibodies or fragments thereof (eg, scFv), for example, phage display libraries or ribosomes. The presentation in phages are described, for example, in: US Pat. N. and 5223 409; Smith GP (1985) Science 228 (4705): 1315-1317; Ciackson T et ai.
  • the specified antigen for example, the peptide of the invention
  • a non-human animal for example, a rodent, for example, a mouse, hamster or rat.
  • the non-human animal is a mouse.
  • a monoclonal antibody of the non-human animal is obtained and then modified, for example, chimeric, using suitable recombinant DNA techniques.
  • suitable recombinant DNA techniques A variety of approaches to producing chimeric antibodies have been described. See, for example, Morrison SL et al. (1984) Proc Nati Acad Sci USA 81 (21): 6851-6855; Takeda S et al. (1985) Nature 314 (6010): 452-454; U.S. Patent No. 4,816,567; US Patent N. 4,816,397 q; EP171496; EP0173494; GB 2177Q96B.
  • the invention relates to a nucleic acid encoding the peptide, a fusion protein or the antibody of the invention, hereinafter referred to as "nucleic acid of the invention” and a gene construct comprising said nucleic acid, hereinafter referred to as “gene construct of the invention”.
  • peptide fusion protein
  • antibody of the invention has been defined above. All particular and preferred embodiments of the peptide, a fusion protein and the antibody of the invention are fully applicable to the nucleic acid and gene construct of the invention.
  • polynucleotide refers to polymeric forms of nucleotides of any length.
  • the polynucleotides may contain deoxyribonucleotides, 28 ribonucleotides and / or their analogues.
  • Nucleotides can have any three-dimensional structure and can perform any function, known or unknown.
  • polynucleotide includes, for example, single-stranded, double-stranded and triple helical molecules, a gene or gene fragment, exons, introns, mRNA, tRNA, rRNA, ribozymes, cDNA, recombinant polynucieotides, branched polynucleotides, plasmids, vectors, isolated DNA of any sequence, RNA isolated from any sequence, nucleic acid probes and primers.
  • a nucleic acid molecule of the present invention may also comprise modified nucleic acid molecules.
  • mRNA refers to an RNA that can be translated into a cell.
  • the polynucleotide of the invention is an mRNA.
  • the mRNA can be chemically synthesized, can be obtained by in vitro transcription or can be synthesized in vivo in the target cell.
  • the nucleotide sequences that form the nucleic acid encoding the conjugate or fusion protein of the invention are in the same correct reading frame for expression.
  • the nucleic acid sequences of the invention may encode mature peptides or polypeptides or preproteins that consist of a signal peptide linked to the mature peptide or polypeptide that must subsequently be processed.
  • the nucleotide sequences of the present invention may also comprise, in addition to the coding sequence, other elements, such as introns, non-coding sequences at the 3 'ends and / or 5 ⁇ ribosome binding sites, restriction sites, etc. These nucleotide sequences may also include coding sequences for additional amino acids that are useful for the purification or stability of the encoded peptides or polypeptides.
  • gene construct refers to the nucleic acid of the invention together with regions suitable for regulating the expression of said nucleic acid, including promoters, transcription terminators, 5 'and 3' regions. untranslated, polyadenylation signals and the like.
  • gene construct refers to a functional unit necessary to transfer, and preferably express, a nucleic acid sequence of interest, herein. document the nucleotide sequences of the invention as described, in a host cell.
  • gene constructs also preferably comprise regulatory or control sequences that include, for example, a promoter, enhancer, terminator, etc., linked operatively to the sequence encoding the peptide or polypeptide.
  • gene constructs refer to a single or double stranded nucleic acid molecule, which is isolated from a natural gene or modified to contain nucleic acid segments so that they would not otherwise exist in nature.
  • the expression "nucleic acid construct” is synonymous with the expression "expression cassette", when the nucleic acid construct contains the control sequences necessary for the expression of the coding sequence.
  • the gene constructs of the invention further comprise a promoter operably linked to the nucleic acid sequences of the invention.
  • the promoter can be, but without imitations, a constitutive or inducible promoter.
  • the gene constructs of the invention further comprise a terminator.
  • the invention in another aspect, relates to a vector, hereinafter referred to as "vector of the invention", which comprises a polynucleotide of the invention.
  • vector refers to a nucleic acid sequence comprising the necessary sequences so that after transcribing and translating said sequences into a cell a polypeptide encoded by the nucleic acid of To the invention. Said sequence is operatively linked to additional segments that provide autonomous replication in a host cell of interest.
  • the vector is an expression vector, which is defined as a vector that, in addition to regions of autonomous replication in a host cell, contains regions operably linked to the nucleic acid of the invention and which are capable of enhancing the expression of the nucleic acid products according to the invention.
  • the vectors of the invention can be obtained by means of techniques widely known in the art.
  • vectors include, but are not limited to viral vectors, naked DNA or RNA expression vectors, plasmids, cosmids or phage vectors, DNA or RNA expression vectors associated with cationic condensing agents, DNA expression vectors. or RNA encapsulated in liposomes and certain eukaryotic cells, such as producing cells.
  • the vector of the invention can be used to transform, transfect or infect cells that can be transformed, transfected or infected by said vector.
  • Such cells can be prokaryotic or eukaryotic.
  • the vector preferably comprises the nucleic acid of the invention operably linked to sequences that regulate the expression of the nucleic acid of the invention.
  • the regulatory sequences of use in the present invention may be nuclear promoters or, alternatively, enhancer sequences and / or other regulatory sequences that increase the expression of the heterologous nucleic acid sequence.
  • any promoter can be used in the present invention provided that said promoter is compatible with the cells where the nucleic acid is to be expressed.
  • the expression vector of the invention is introduced into a host cell so that the vector remains as a chromosomal constituent or as an extrachromosomal self-replicating vector.
  • expression vectors are, but not limited to, phages, cosmids, phagemids, artificial yeast chromosomes (YAC), bacterial artificial chromosomes (BAC), human artificial chromosomes (HAC) or viral vectors, such as adenovirus, retrovirus or lentivirus.
  • Examples of appropriate expression vectors for insertion of the polynucleotides of the invention preferably but not limited to, pUG18, pUC19, Bluescript and their derivatives, mp18, mp19, pBR322, pMB9, Co1 E1, pGR1, RP4, pET plasmids, phages and "initiator" vectors, such as pSA3 and pAT28; yeast expression vectors such as the 2 micrometer plasmid of Saccharomyces cerevisiae, integration plasmids, YEP vectors, centromere plasmids and the like; insect cell expression vectors such as pAG and pVL series vectors; plant cell expression vectors such as piBi, pEarleyGate, PAVA, pGAMBIA, PGSA, PGWB, PMDC, PMY, pore series and the like, and other protein expression plasmids used in eukaryotic cells , including baculovirus
  • the gene constructs of the invention preferably comprise a marker, such as a gene resistant to ampicillin.
  • a marker such as a gene resistant to ampicillin.
  • plasmids are commercially available (pUC series (Takara S diver), pPROK series (Glontech), pKK233-2 (Glontech), etc.).
  • the marker can be another drug resistant gene such as a kanamycin, neomycin or chloramphenic! Gene, or a fluorescence gene, such as iuciferase, GFP, mGherry and the like.
  • the marker can be an auxotrophic genetic marker.
  • cell of the invention refers to an isolated cell, preferably a eukaryotic cell, more preferably a mammalian cell, even more preferably a human cell, hereinafter "cell of the invention” document, comprising the peptide, fusion protein, antibody, nucleic acid, gene construct or vector of the invention.
  • isolated means that the element has been separated and extracted from its natural environment or has been synthesized in viral and that it is outside a living organism (ex vivo).
  • the peptide, the fusion protein, the antibody, the nucleic acid, the gene construct and the vector of the invention have been defined above. All particular and preferred embodiments of the peptide, the fusion protein, the antibody, the nucleic acid, the gene construct and the vector of the invention are fully applicable to the nucleic acid and the gene construct of the invention.
  • Suitable cells in the present invention include, but are not limited to, mammalian, yeast, plant, insect, fungal and bacterial cells.
  • the invention in another aspect, relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of the peptide, fusion protein, nanoparticle, virus-like particle, antibody, nucleic acid, gene construct, vector or cell of the invention and a pharmaceutically excipient. acceptable.
  • the peptide, the fusion protein, the nanoparticle, the virus-like particle, the antibody, the nucleic acid, the gene construct, the vector and the cell of the invention have been defined above. All particular and preferred embodiments of the peptide, the fusion protein, the nanoparticle, the virus-like particle, the antibody, the nucleic acid, the gene construct, the vector and the cell of the invention are fully applicable to the nucleic acid and to the Gene construction of the invention.
  • the term "pharmaceutical composition” refers to a formulation that has been adapted to deliver a predetermined dose of one or more useful therapeutic agents to a cell, a group of cells, an organ, a tissue or an animal in which the cell division is uncontrolled, such as cancer.
  • terapéuticaally effective amount is understood as an amount capable of providing a therapeutic effect and which can be determined by the person skilled in the art by commonly used means.
  • the amount of the peptide, the fusion protein, the nanoparticle, the antibody, the nucleic acid, the gene construct, the vector, the virus or the viral particle or cell of the invention that may be included in the pharmaceutical compositions according to the invention will vary depending on the subject and the particular mode of administration.
  • dosages can also be determined with the guidance of Goodman and Goldman's The Pharmacogy / Basis o ⁇ Therapeutics, ninth edition (1996), appendix II, pages 1707-171 1 and Goodman and Goldman's The Pharmacological Basis o ⁇ Therapeutics , tenth edition (2001), Appendix ⁇ I, pages 475-493.
  • the appropriate dosage of the active principle or principles within the pharmaceutical composition will depend on the type of disease to be treated, the severity and the course of the disease, on whether the composition is administered for preventive or therapeutic purposes, on prior therapy. , of the clinical history and of the patient's response to the composition and of the discretion of the medical specialist.
  • the amount of the peptide, to the fusion protein, the nanoparticle, the antibody, the nucleic acid, the gene construct, the vector, the virus or the viral particle or the cell of the Invention is suitably administered to the patient at once. or during a series of treatments.
  • an appropriate dosage level will generally be from about 0.1 to about 10 mg / kg; more preferably from about 0.5 to about 5 mg / kg, even more preferably from about 0.75 to about 2.5 mg / kg, even more preferably about 1 mg / kg, which can be administered in single or multiple doses.
  • the compounds may be administered on a schedule of 1 to several times per day or for two, three, four, five, six or seven days, preferably once every two days.
  • the pharmaceutical composition may be administered for at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21, 28 or more days, preferably for 14 days.
  • the pharmaceutical composition can preferably be administered once every two days for 14 days.
  • compositions of the invention also contain one or more additional pharmaceutically acceptable excipients.
  • pharmaceutically acceptable excipient is meant a therapeutically inactive substance that is said to be used to incorporate the active ingredient and that is acceptable to the patient from a pharmacobiological / toxicological point of view and to the pharmaceutical chemist who manufactures it from a point of view. physical / chemical view regarding the composition, formulation, stability, patient acceptance and bioavailability.
  • the excipient or vehicle also includes any substance that serves to improve the delivery and efficacy of the active ingredient within the pharmaceutical composition.
  • pharmaceutically acceptable carriers include one or more of water, saline, phosphate buffered saline, dextrose, glycerol, ethanol and the like, as well as combinations thereof. In many cases, it will be preferable to include isotonic agents, for example, sugars, polyalcohols such as mannitol, sorbitol or sodium chloride in the composition. Pharmaceutically acceptable carriers may additionally comprise minor amounts of auxiliary substances such as wetting or emulsifying agents, preservatives or buffers, which enhance the shelf life or efficacy of the fusion protein or of the compositions that are part of the pharmaceutical compositions.
  • vehicles without limitation are a series of saccharides such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol and maltitol; a series of starches such as corn starch, wheat starch, rice starch and potato starch; a series of tai cellulose such as cellulose, methyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose and hydroxy propylmethyl cellulose; and a series of fillers such as gelatin and polyvinyl pyrrolidone.
  • a tai disintegrant such as cross-linked polyvinyl pyrroiidone, agar, aiginic acid or sodium aiginate may be added.
  • compositions can be prepared by means of conventional methods known in the art. state of the art ⁇ “Remington: the Science and Practice of Pharmacy", 20 'edition (2003) Genaro AR, ed, Lippincott Williams & Wilkins, Filadeifia, USA)..
  • compositions of the invention can be administered by any type of suitable route, such as oral, nasal, ocular, topical, infradermal, intracranial or intravenous.
  • suitable route such as oral, nasal, ocular, topical, infradermal, intracranial or intravenous.
  • the preferred route of administration of said pharmaceutical compositions is the oral, nasal, ocular, topical, intracranial or infradermal route.
  • oral route is understood as the pharmaceutical composition incorporated into the body after swallowing.
  • nasal route is understood as the administration of the pharmaceutical composition insufflated through the nose.
  • the "ocular route” is understood as the topical administration of the composition Pharmaceutical by instillation directly in the eye.
  • the “topical route” is understood as the application on the outside of the body, as well as, without limitation, the skin, scalp and nails; and also the application to mucous membranes such as, without limitation, the oral, nasal or oral mucosa. rectal.
  • the "intradermal route” is understood as the administration of the pharmaceutical composition by injection into the dermis.
  • the "intracranial route” is understood as the administration of the pharmaceutical composition within the skull.
  • the "intravenous route” is understood as the administration of the pharmaceutical composition by injection into the bloodstream.
  • the invention relates to the peptide, the fusion protein, the nanoparticle, the virus-like particle, the antibody, the nucleic acid, the gene construct, the vector, the cell or the pharmaceutical composition of the invention for its Use in medicine.
  • the invention relates to the use of the peptide, the fusion protein, the nanoparticle, the virus-like particle, the antibody, the nucleic acid, the gene construct, the vector, the cell or the pharmaceutical composition of the invention for The manufacture of a medicine.
  • the invention relates to the peptide, the fusion protein, the nanoparticle, the virus-like particle, the antibody, the nucleic acid, the gene construct, the vector, the cell or the pharmaceutical composition of the invention for use in the treatment and / or prevention of chronic inflammatory diseases, autoimmune diseases, immunodeficiencies or cancer.
  • the invention relates to a method for the treatment and / or prevention of chronic inflammatory diseases, autoimmune diseases, immunodeficiencies or cancer comprising administering to a patient a therapeutically effective amount of the peptide, fusion protein, nanoparticle, similar particle. to virus, antibody, nucleic acid, gene construct, vector, cell or pharmaceutical composition of the invention.
  • Chemokine-mediated cellular response immunomodulation has been reported to be useful in several diseases, including chronic inflammatory diseases, autoimmune diseases, immunodeficiencies or cancer (Charo IF and Ransohoff RM (2006) N Eng ⁇ J Med 354 (6): 610 -621; Ba ⁇ kwili F (2004) Nat Rev Cancer 4 (7): 540-550; Bacheierie F et al. (2014) Pharmacoiogicai reviews 66 (1): 1 - 79).
  • the invention relates to the peptide, the fusion protein, the nanoparticle, the virus-like particle, the antibody, the nucleic acid, the gene construct, the vector, the cell or the pharmaceutical composition of the invention for use in the treatment of chronic inflammatory diseases, autoimmune diseases, immunodeficiencies or cancer.
  • the invention relates to the use of the peptide, the fusion protein, the nanoparticle, the virus-like particle, the antibody, the nucleic acid, the gene construct, the vector, the cell or the pharmaceutical composition of the invention for the manufacture of a drug for the treatment of chronic inflammatory diseases, autoimmune diseases, immunodeficiencies or cancer.
  • the invention relates to a method for the treatment of chronic inflammatory diseases, autoimmune diseases, immunodeficiencies or cancer comprising administering to a patient a therapeutically effective amount of the peptide, the fusion protein, the nanoparticle, the virus-like particle. , the antibody, the nucleic acid, the gene construct, the vector, the cell or the pharmaceutical composition of the invention.
  • the peptide, the fusion protein, the nanoparticle, the virus-like particle, the antibody, the nucleic acid, the gene construct, the vector, the cell and the pharmaceutical composition of the invention have been defined above. All particular and preferred embodiments of the peptide, fusion protein, nanoparticle, antibody, nucleic acid, gene construct, vector, cell and pharmaceutical composition of the invention are fully applicable to the medical uses of the invention. .
  • treatment refers to any process, action, application, therapy or the like, where a subject (or patient), including a human being, is provided medical assistance with the in order to improve the condition of the subject, directly or indirectly, or slow the progression of a condition or disorder in the subject, or improve at least one symptom of the disease or disorder in treatment.
  • prevention refers to the capacity of the peptide, the fusion protein, the nanoparticle, the antibody, the nucleic acid, the gene construct, the vector, the cell and the pharmaceutical composition. of the invention, to prevent, minimize or hinder the progression of a disease.
  • patient refers to any animal, preferably a mammal, and includes, among others, domestic and farm animals, primates and humans, for example, humans , nonhuman primates, cows, horses, pigs, sheep, goats, dogs, cats or rodents such as rats and mice.
  • the subject is a human being of any age or race.
  • the medicament of the invention is used as a tai therapy as, for example, administration together with radiation, surgery or other chemotherapeutic products.
  • the medicament is administered in combination with an additional anticancer agent.
  • anticancer agents i.e. antineoplastic agents
  • antineoplastic agents include, for example, alkylating agents, antimetabolites, natural antineoplastic agents, hormonal antineoplastic agents, angiogenesis inhibitors, differentiation reagents, RNA inhibitors, antibodies or immunotherapeutic agents, gene therapy agents, small molecule enzyme inhibitors, biological response modifiers and antimetastatic agents.
  • the medicament of the invention can be used as an adjuvant therapy (ie, additional treatment).
  • Some embodiments relate to the administration of the medicament of the invention as neoadjuvant therapy, which is administered before a primary treatment.
  • chronic inflammatory disease also known as EIC, as used herein, refers to a disease characterized by prolonged inflammation due to non-degrading pathogens, viral infection, persistent foreign bodies or autoimmune reactions that persist for many months. or years, and where the results are destruction, fibrosis and / or tissue necrosis.
  • chronic inflammatory disease are: rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus (lupus), multiple sclerosis, atherosclerosis, psoriatic arthritis (APs), inflammatory bowel disease (Eli) that includes ulcerative colitis (UC) and Crohn's disease (CD), chronic obstructive pulmonary disease (COPD), etc.
  • autoimmune disease refers to a condition that arises from an abnormal immune response to a normal part of the body.
  • Non-limiting examples of autoimmune diseases include: rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus (lupus), inflammatory bowel disease (Eli) that includes ulcerative colitis (UC) and Crohn's disease (CD), multiple sclerosis (MS), diabetes mellitus type 1, Guillain-Barre syndrome, chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy, psoriasis, Graves' disease, Hashimoto's thyroiditis, myasthenia gravis, vasculitis, etc.
  • immunodeficiency refers to a condition in which the ability of the immune system to fight infectious diseases and cancer is compromised or completely absent. Most cases of Immunodeficiency are acquired (“secondary") due to extrinsic factors that affect the patient's immune system, examples of these extrinsic factors include HIV infection, age extremes and environmental factors, such as nutrition. Sometimes it can be achieved by immunosuppression by some drugs, such as the spheroids, either as an adverse effect or the intended purpose of treatment. This definition includes intrinsic defects in your immune system or primary immunodeficiencies. An immunocompromised person may be particularly vulnerable to opportunistic infections.
  • Immunodeficiency also lowers immunosupervision against cancer, in which the immune system detects body cells and destroys neoplastic cells.
  • primary immunodeficiency disorders include, but are not limited to: X-linked agammagiobulinemia (XLA), Common variable immunodeficiency (IDCV), Severe combined immunodeficiency (IDCG) in English), etc.
  • secondary immunodeficiency disorders include: severe burns, chemotherapy, radiation, diabetes, malnutrition, metal poisoning, etc.
  • Non-limiting examples of secondary immunodeficiency diseases include: AIDS, immune system cancers (leukemia), immune complex diseases (viral hepatitis), multiple myeloma, etc.
  • cancer refers to a disease characterized by inconsolable cell division (or by an increase in survival or resistance to apoptosis) and by the capacity of said cells. 38 to invade other neighboring tissues (invasion) and spread to other areas of the body where cells are not normally located (metastases) through the lymphatic and blood vessels, circulate through the bloodstream and then invade normal tissues in other parts of the body. Body. Depending on whether they can spread or not by invasion and metastasis, tumors are classified as benign or malignant: benign tumors are tumors that cannot spread by invasion or metastasis, that is, they only grow locally; while malignant tumors are tumors that are capable of spreading by invasion and metastasis.
  • cancer includes, but is not limited to, the following types of cancer: breast cancer; bile duct cancer; bladder cancer; brain cancer that includes glioblastomas and meduioblastomas; cervical cancer; choriocarcinoma; colon cancer; endometrial cancer; esophagus cancer; gastric cancer; hematologic malignancies that include acute and myelogenous lymphocytic leukemia; acute lymphocytic T lymphocytic leukemia / lymphoma; hair cell leukemia; chronic myelogenous leukemia, multiple myeloma; AIDS-associated leukemia and adult T-cell leukemia / lymphoma; intraepithelial neoplasms that include Bowen's disease and Paget's disease; Liver cancer; lung cancer; lymphomas, which include Hodgkin'
  • the peptide, fusion protein, nanoparticle, antibody, nucleic acid, gene construct, vector, cell and pharmaceutical composition of the invention can be administered by any suitable route, for example, oral, nasal, ocular, topical, intradermal, intracranial or intravenous.
  • the route of administration Preferred is the oral, nasal, ocular or intradermal route.
  • CXCR4 forms nanoaggregates and shows various types of movement on the surface of the T inlociios (AB) STED images representative of CXCR4 in stationary state cells, T lymphocytes (A) and CD4 ⁇ Jurkat (B) cells together with enlargements in specific membrane regions (square boxes).
  • the pseudo-color code scale indicates the intensity of individual spots marked with CXCR4 / AF488, from the dimer (dark gray) to the lightest (gray to white).
  • the intensity distribution (upper representation) of individual CXCR4 spots on the cell membrane (solid line) and individual antibodies not specifically bound to glass (broken line) is obtained from STED images.
  • Probability histograms (lower representation) of the distribution of the CXCR4 receptor are obtained from the analysis of the intensity distribution data. 2076 spots for CD4 + Jurkat cells and 2575 spots for 30-cell T lymphocytes in 2-3 independent STED experiments.
  • C Representative paths (i-confined, N-Brownian / free, III-direct fransporfe) of CXCR4-AcGFP particles that diffuse in the membrane at indicated times, detected by SPT-TIRF in resting JKCD4 cells. The centroid position of the spot (circle) was traced (black line).
  • D Percentage of CXCR4-AcGFP trajectories classified as stationary or mobile. 593 trajectories of 22 JKCD4 cells in three independent experiments.
  • E Representative DCM graphs of individual CXCR4 ⁇ AcGFP paths showing Different types of movement.
  • F Percentage of individual trajectories that present different types of movement, classified by EEM. 192 trajectories of 22 cells in three independent experiments.
  • G Diffusion coefficients of short time lapses (D1 -4) of the individual paths analyzed in F) with the indicated median.
  • H Distribution of individual CXCR4-AcGFP trajectory intensity, averaged over the first 20 frames and subtracted from the background. 595 trajectories in 5 independent experiments, the average is indicated in the figure. (!) Percentage of!
  • FIG. 2 The binding to CXCL12 modulates the dynamics of CXCR4 and puts the nanogrouping of the receptor.
  • AF SPT analysis of CXCR4-AcGFP in JKCD4 cells on coverslips coated with FN or FN + CXCL12.
  • B Percentage of mobile and immobile trajectories in the cell membrane.
  • D Percentage of mobile and immobile particles analyzed as in B), depending on the particle size (monomer: 1; dimer: 2, nano-aggregated: 3 receptors / particle)
  • E Percentage of single-particle trajectories of stimulated cells with CXCL12, classified by type of movement using EEM analysis (254 trajectories in 24 cells of 3 independent experiments).
  • F D1 -4 of individual paths that show a confined (left) or free (right) movement associated with their size. ( * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.001).
  • GH Representative images of STED of GXGR4 in Jurkat GD4 ⁇ (G) cells and T (H) lymphocytes activated with CXCL12, with enlargements in specific membrane regions (square). Scale bar: 1 pm. Probability distribution of the number of receptors / spot (lower plots) for the two different cell types, in steady state conditions (gray bar) and after stimulation with GXGL12 (white bar). 1446 individual spots for CD4 + Jurkat cells and 1849 for T lymphocytes, 30 cells in 2-3 independent STED experiments. Figure 3. The transmembrane region CXCR4 VI has a role! key in the grouping of receivers.
  • D Intensity distribution (arbitrary units; ua) of individual CXCR4 trajectories in JKCD4 cells not stimulated and stimulated with CXCL12, pretreated with 221 TMV, 239TMVI or DMSO peptides (control) (221TMV based!
  • JKCD4 wt JKCD4 wt
  • CXCR4wt 669 paths of 24 cells
  • GXGR4mut 420 paths of 22 cells
  • Fig. 2C JKCD4 wt, FN + CXCL12
  • FIG. 4 The CXCR4 mutant receptor with poor oligomerization and the 239T1VIVI peptide reduce the cellular responses mediated by CXCL12.
  • D Immunoblot analysis of pERK1 / 2 and -pAkt in response to CXCL12 in cells as in A. Total Akt is used as load control.
  • Example 1 CXCR4 shows different types of trajectories on the surface of T lymphocytes.
  • the inventors used stimulated emission depletion microscopy (STED) to visualize the oligomerization of CXCR4 in virgin or naphve T lymphocytes (T lymphocytes) and in GD4 + Jurkat T lymphocyte strain (JKCD4 + ).
  • STED stimulated emission depletion microscopy
  • Example 2 The union of CXCL12 triggers the clustering of CXCR4 and modulates particle dynamics.
  • CXCL12 promoted a significant reduction in the total diffusivity of CXCR4 (baseline, D I -4 : Q, 0Q47pm 2 s 1 ; CXCL12, 0.0042 pm 2 s 1 ) and increased the percentage of stationary particles from -27% (baseline) at -35% (GXCL12) ( Figures 2A, B). These data coincide with those published for other GPGRs after agonist activation (Baker A et al. (2007) Eur B ⁇ ophys J 36 (8): 849-860).
  • CXCL12 stimulation of receptor clustering in JKCD4 cells and in T lymphocytes was validated; CXCL12 promoted the grouping of CXCR4 up to a maximum of 10 to 18 receptors / particle ( Figures 2G-H).
  • the ligand thus reduced the percentage of monomers and dimers at the expense of increasing the number of large nanogroups and promoting their immobilization.
  • the crystalline structure of CXCR4 shows a homodimer whose interface is located in the transmembrane regions (Wu B et al. (2010) Science 330 (8007): 1066-1071).
  • the inventors thus predicted oiigomers as complexes formed by dimeric entities and performing a computer analysis to determine the residues in the TM regions of CXCR4 involved in the oiigomerization of the receptor without altering the homodimers of the receptor.
  • the analyzes revealed several transmembrane peptides in TMIV, TMV, TMVI and TMVII ( Figure 3A), which were explored to determine their ability to antagonize CXCL12-mediated cell migration.
  • CXCL12 also promoted the flow of intracellular Ca 2+ in cells expressing X4wt or X4mut, although the responses through X4mut were significantly lower (Figure 4C). It was also observed that the activation mediated by CXCL12 of MAPK (ERK1, 2) and PI3K (Akt) was remarkably compromised in cells expressing X4mut (Figure 4D) and that cell migration to CXCL12, thus, was altered ( Figure 4E). Using the lipid bilayer system with 1CAM-1 included plus CXCL12, it was found that JKCD4 + cells that expressed X4mut did not migrate, poorly adhered to the substrate and had a smaller contact area.
  • MAPK ERK1, 2
  • Akt PI3K
  • JKCD4 + cells expressing X4mut were polarized, with a flattened leading edge extension and migrated along the lipid bilayer ( Figures 4F-G). These data indicated that ungrouped receptors are capable of promoting intracellular ligand-mediated Ca 2+ flow, although receptor clustering is necessary for complete activation of the CXCR4 function.

Abstract

La invención proporciona una diana molecular (SEQ ID NO: 1) dentro de receptores de quimiocinas, localizada específicamente dentro de la región transmembrana VI del receptor de quimiocinas CXCR4, que permite la detección y/o el diseño de moléculas cuya unión inhibe selectivamente la oligomerización del receptor mediada por quimiocinas, preferentemente la oligomerización del receptor CXCR4 mediada por quimiocina CXCL12. Puesto que esta oligomerización es el estado conformacional activo de estos complejos de quimiocina/receptor de quimiocinas, la inhibición de esta diana molecular representa un nuevo enfoque terapéutico para intervenir en respuestas celulares asociadas a la señalización de quimiocinas, incluyendo procesos patológicos tales como la inflamación o la migración celular en el cáncer.

Description

DIANA TERAPÉUTICA EN RECEPTORES DE QUIMIOCINAS PARA LA SELECCIÓN DE COMPUESTOS ÚTILES PARA EL TRATAMIENTO DE PROCESOS
PATOLÓGICOS QUE IMPLICAN LA SEÑALIZACIÓN DE QUIMIOCINAS
La invención se refiere a la identificación de dianas moleculares en complejos de receptores de quimiocinas/quimiocina cuya modulación es útil para intervenir en respuestas celulares mediadas por quimiocinas. La modulación exógena de estas dianas terapéuticas bloquea específicamente los acontecimientos desencadenados por la unión de la quimiocina ligando a su receptor, dichos acontecimientos incluyen, entre otros, la migración celular. Por tanto, la invención pertenece a los campos de la medicina y la farmacología, en particular al campo de dianas terapéuticas para la detección de compuestos útiles en el tratamiento de enfermedades o afecciones clínicas cuyos síntomas o patologías son consecuencia de los acontecimientos desencadenados por la señalización de quimiocinas, tales como enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias, así como el cáncer.
ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA
Varias pruebas muestran la importancia de las quimiocinas y sus receptores en muchos procesos fisiológicos y patológicos; su expresión desregulada se relaciona con enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias crónicas, inmunodeficiencias y cáncer. Sin embargo, a pesar de los estudios exhaustivos, no se han aprobado todavía fármacos para bloquear la unión de las quimiocinas a sus receptores en pacientes con enfermedades inflamatorias o autoinmunitarias.
Mediante el uso de técnicas convencionales de inmunoprecipitación y Western blot y, más recientemente, metodologías biofísicas basadas en la transferencia de energía de resonancia fluorescente, se ha demostrado claramente que el sistema quimiocina/receptor es considerablemente más complejo de lo que se esperaba inicialmente. Los ligandos y los receptores forman homodímeros y heterodímeros, e incluso entidades oligoméricas en la superficie celular; estas estructuras muy dinámicas están reguladas por la expresión del receptor y los niveles de ligando. Aunque estudios previos demostraron que ios complejos receptores regulan la señalización desencadenada por quimiocinas e incluso modulan la capacidad de unión de las quimiocinas, poco se sabe acerca de los factores que contribuyen a la oligomerización del receptor, de la dinámica de estos complejos receptores en la superficie celular o de los residuos implicados en la formación de oligómeros. Descritas originariamente como mediadores específicos del movimiento direccional de leucocitos, hoy en día se sabe que las quimiocinas están implicadas en una amplia diversidad de tipos y funciones celulares; se han relacionado con el tráfico de linfocitos, la regulación de la diferenciación de linfocitos T, la polarización de macrófagos, ¡a infección por VIH-1 , la angiogénesis, la organogénesis y ¡a metástasis tumoral. Por tanto, ia desregulación de su expresión está implicada en muchas enfermedades humanas, incluyendo enfermedades inflamatorias autoin unitarias y crónicas, inmunodeficiencia y cáncer (Charo IF y Ransohoff RM (2006) N Engl J Med 354 (6): 610-621 ; Gerard CaR BJ (2001 ) Nal Immunol. 2: 108-1 15). Las quimiocinas son, por tanto, un importante foco de interés como dianas terapéuticas potenciales.
Existen casi 50 quimiocinas humanas conocidas y clasificadas. Las quimiocinas constitutivas generalmente se regulan durante el desarrollo y participan en la homeostasis, mientras que ia expresión de quimiocinas inducibles se regula principalmente durante procesos inflamatorios. Además, varios virus codifican quimiocinas altamente selectivas que actúan como agonistas o antagonistas y pueden participar en la propagación vírica y/o la evasión de la respuesta inmunitaria del hospedador (Aicami A (2003) Nal Rev. Immunol. 3:36-50).
Las quimiocinas actúan mediante la unión a GPCR (receptores acoplados a proteína G, por sus siglas en inglés) de ciase A. Esta interacción implica restos de aminoácidos en el dominio N-terminal de! receptor y el tercer bucle extracelular, entre otros. Los 20 receptores caracterizados hasta la fecha se clasifican como CGR, CXCR, CX3CR y XCR, basándose en sus ligandos; la familia también incluye varios receptores señuelo (DARC, D6, CCXCKR), que participan en la eliminación de quimiocinas en sitios de inflamación. Aunque existen ejemplos de pares específicos quimiocina- receptor (receptores específicos), la mayoría son capaces de interactuar con más de una quimiocina (receptores compartidos), lo que explica la gran redundancia que caracteriza a este sistema. La expresión de quimiocinas y sus receptores se regula de forma precisa por varios factores que incluyen las citocinas, los factores de crecimiento y el estado del ciclo celular, lo que indica que el contexto celular influye en estas respuestas. Para facilitar el tráfico orquestado de distintas poblaciones celulares, generalmente varias quimiocinas se expresan simultáneamente y las células coexpresan más de un receptor. La complejidad de este escenario se completa con la notable redundancia entre las quimiocinas y sus receptores (Rossi DaZ A (2000) Annu. Rev . Immunol. 18: 217-242) y con los glucosaminoglicanos (GAG) que presentan las quimiocinas a las células (Hamel DJ et al. (2009) Methods in enzymology 461 : 71 -102). En este escenario, es probable que las interacciones entre estos mediadores, entre sus receptores y entre los complejos que forman resulten cruciales para integrar la organización espaciotemporal del sistema inmunitario y para comprender su función fisiológica.
CXCR4 es uno de los receptores de quimiocinas más conservados en vertebrados y, en ratones, es esencial para la vida (Sierro F et al. (2007) Proc Nati Acad Sci USA 104 (37): 14759-14764). Se une al ligando homeostático clave CXCL12, también denominado factor 1 derivado de células estromales (SDF-1 ), que es secretado constitutivamente por células del estroma de la médula ósea (MO) y por muchos otros tipos celulares en varios tejidos. CXCR4 es un GPCR clásico que señala de una manera dependiente de proteína G. La unión de CXCL12 a CXCR4 activa todas las vías de fransducción de señales típicas de receptores de quimiocinas, incluyendo las que desencadenan la adhesión, la quimiotaxis, la supervivencia y la proliferación. CXCR4 también se une a iigandos que no son quimiocinas, tales como la proteína de envuelta gp12G del VIH CXCR4 (X4)-trópico. Por tanto, CXCR4 es considerado uno de ios principales correceptores del VIH (Moore JP et ai. (1997) Current Opinión in ímmunoiogy 9: 551 -562).
CXCR4 se expresa ampliamente en tejidos indiferenciados y diferenciados. Se encuentra sobre casi todas las células hematopoyéticas, las células endoteliaies vasculares, en neuronas del sistema nervioso central y periférico, microglía y astrocitos. Por tanto, su actividad se relaciona con la migración celular y el posicionamiento, la neovascularización, la supervivencia y el crecimiento. También se expresa funcionalmente por muchas células cancerosas de origen hematopoyético y no hematopoyético (Baikwii! F (2004) Nat Rev Cáncer 4 (7): 540-550). CXCR4 conserva precursores hematopoyéticos en la MO, media la segregación de células B en órganos linfoides, así como la salida de neutrófiios de la MO y el retorno a la MO de neutrófilos senescentes (Ma Q et al. (1999) ¡mmunity 10: 463-471 ).
CXCR4 también puede desempeñar un papel importante en el tráfico de células B vírgenes y de memoria a ios centros germinales. Los ratones que albergan una ganancia de función promovida por CXCL12 para CXCR4 muestran una compartimentalización anormal de células B en la periferia, con una reducción de ios folículos primarios en el bazo y su ausencia en ios ganglios linfáticos. El truncamiento del extremo C de CXCR4, que conduce a una ganancia de función estimulada por agonista para el receptor, se asocia en el hombre con el síndrome VHIM (verrugas provocadas por infección por virus del papiloma humano, bipogammagíobulinemia, infecciones y mielotetraxia), un trastorno de inmunodeficiencia raro que promueve la retención anormal de leucocitos maduros en la MQ y, posiblemente, en otros órganos inmunitarios (Balabanian K et al. (2005) Blood 105 (6): 2449-2457). Las pruebas crecientes indican la implicación de CXCR4/CXCL12 en la autoinmunidad, como, por ejemplo, en la patogenia de la artritis reumatoide (AR). Los linfocitos T CD4+ expresan niveles elevados de CXCR4 y la concentración de CXCL12 también es elevada en el líquido sinovial de enfermos de AR (Nanki T et al. (2000) J Immunol 185 (1 1 ): 6590- 6598), lo que indica que CXCR4 es importante para la retención de linfocitos T en tejidos sinoviales afectados por AR. Varios antagonistas de CXCR4, incluyendo el competidor del sitio de unión AMD3I00, tienen actividad anti-AR (Mattbys P et al. (2001 ) J Immunol 167 (8): 4886-4692).
Un modelo explicativo simple de la activación celular mediada por quimiocinas implicaría la unión de una quimiocina monomérica a su receptor monomérico. Aunque ios monómeros de quimiocinas obligados a concentraciones nanomolares conservan la actividad completa para desencadenar respuestas celulares mediadas por receptores in vitro, varias series de indicios indican que ia situación in vivo es mucho más compleja. Las quimiocinas se encuentran como monómeros o como oiigómeros, como factores solubles o asociadas a GAG y son capaces de unirse y activar un receptor monomérico u oiigómeros receptores en la superficie celular (Proudíoot A et al. (2003) Proc Nati. Acad. Sci USA 100: 1885-1890). Varios estudios informan que algunos GPGR pueden actuar como monómeros in viíro; sin embargo, análisis bioinformátlcos, estructurales y funcionales han avanzado la idea de que ios receptores de quimiocinas probablemente se expresan en la superficie celular como dímeros/oligómeros (Hamatake M et ai. (2009) Cáncer Sci 100 (1 ): 95-102). La estructura cristalina de CXGR4 en presencia de antagonistas (una molécula pequeña o un péptido cíclico) demostró una conformación homodimérica con la interfaz localizada en las regiones transmembrana V y VI (Wu B et al. (2010) Science 330 (8007): 1066- 1071 ).
Los estudios de dimerización en células vivas se desarrollan actualmente usando técnicas basadas en ia transferencia de energía de resonancia. La transferencia de energía de resonancia de fluorescencia y bioluminiscencia (FRET, BRET, por sus siglas en inglés), ambas basadas en la defección de fluoróforos acopiados a receptor, permiten la medición indirecta de la asociación del receptor. Las variaciones en ios valores de eficiencia FRET7BRET dependen de ia posición relativa, ia distancia y la orientación de los fluoróforos utilizados; aunque los datos positivos indican claramente la asociación del receptor, ios resultados negativos no pueden considerarse una falta de dimerización. El uso de estas técnicas confirmó que la di erización es una regia general para la mayoría de los receptores de quimiocinas estudiados hasta la fecha y que los bomodímeros y heterodímeros se regulan dinámicamente tanto por la expresión del receptor como por la unión del ligando. Algunos de estos métodos también permiten la evaluación de la ubicación subcelular de estos complejos. Los datos de FRET mediante fotobianqueo aceptar demostraron que se encuentran bomodímeros y heterodímeros receptores de quimiocinas en la superficie celular incluso en ausencia de ligandos, asi como en vesículas intracelulares formadas supuestamente durante la síntesis y maduración del receptor (Martínez- Muñoz L. et al. (2016) Methods Mol Biol 1407: 341 -359).
La dimerización puede afectar a la afinidad de unión a ligando y modula la transducción de señal. Los informes sugieren un papel para las conformaciones diméricas en la modulación de señales mediadas por quimiocinas. Los mulantes CCR2 y CXCR2 no funcionales bloquean la migración celular mediada por ligando mediante la dimerización con los receptores de tipo silvestre correspondientes (Rodriguez-Frade JM et ai. (1999) Proc Nati Acad Sci USA 96 (7): 3628-3633; Trettel F et al. (2003) The Journal oí biológica! chemistry 278 (42): 40980-40988). También se observó que heterodímeros CCR2/CCR5 desencadenan acontecimientos de señalización específicos tales como la activación de Gn , que a su vez promueve funciones celulares específicas que incluyen una mayor adhesión celular (Mellado M et al., (2001 ) Embo J 20 (10): 2497-2507). Los heterodímeros CCR5/CXCR4 se reclutan en la sínapsis ¡nmunitaria, donde se acoplan a la proteína Gq y/o Gn ; los linfocitos T se vuelven insensibles a ios gradientes quimiotácticos, forman conjugados más estables y responden con una proliferación y una producción de citocinas potenciadas (Molon B et ai. (2005) Nat lmmunoi Q (5): 465-471 ).
La estabilización de una conformación podría no solo desencadenar acontecimientos de señalización específicos, sino que también podría modular el comportamiento del receptor individual. Se notifican heterodímeros CXCR7/CXCR4 en transfectantes y en células primarias, donde CXCR7 modula respuestas mediadas por CXCR4 (Sierro F et ai. (2007) Proc Nati Acad Sci USA 104 (37): 14759-14764). También se notifica modulación alostérica entre dímeros de receptor de quimiocinas y parece depender de la expresión relativa de cada receptor. En células transfectadas y primarias que expresan CCR2 solo, los ligandos específicos de CCR5 son incapaces de competir por la unión de ligandos específicos de CCR2; no obstante, evitan esta unión eficientemente cuando CCR2 y CCR5 se coexpresan.
Aunque existe mucha evidencia de ¡a relevancia funcional de la oligomerización del receptor de quimiocinas, aún está lejos de comprenderse bien. La homodimerización y la heterodimerización tienen implicaciones de gran alcance con respecto a mecanismos de activación inducidos por agonista y mecanismos de inhibición inducidos por antagonista, acoplamiento de proteína G y señalización e ínternaiízacíón y desensibilización de GPCR. Por tanto, es fundamental definir las complejidades de estos módulos de señalización, puesto que GPCR constituye una diana de gran importancia en el desarrollo y la intervención farmacéutica y la eficacia de los fármacos dirigidos a estos receptores podría depender en gran medida del estado de interacción del receptor.
Por tanto, es necesario identificar las regiones implicadas en la adopción del estado conformacionai activo (oligomerización) de complejos de receptores de quimiocinas/quimiocinas. Estas regiones serían dianas terapéuticas cuya modulación exógena puede ser interesante desde un punto de vista clínico para el tratamiento y/o la prevención de afecciones clínicas, procesos patológicos o enfermedades que implican señalización de quimiocinas, tales como enfermedades inflamatorias o autoinmunitarias. Análogamente, es necesario desarrollar moléculas o compuestos capaces de interferir con estas nuevas dianas terapéuticas evitando de este modo la adopción del estado conformacionai activo (oligomerización) en el complejo quimiocina/receptor de quimiocinas y bloqueando, por tanto, la señalización mediada por quimiocinas en la célula. Estas moléculas desarrolladas podrían usarse para mejorar procesos patológicos, tales como el cáncer o la inflamación, en los que las vías de señalización de quimiocinas son cruciales.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Por tanto, en un primer aspecto, la invención se refiere a un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos XIX2TX4ILIX8A (SEO ID NO: 1 ) o su secuencia invertida, donde
X! es K o E,
X2 es T o P,
X4 es V o A,
X8 es L o A, y
donde dicho péptido es capaz de inhibir la señalización de CXCL12.
En otro aspecto, la invención se refiere a una proteína de fusión que comprende el péptido de la invención y ai menos un poiipéptido heterólogo.
En otro aspecto, la invención se refiere a una nanopartícula que comprende el péptido o la proteína de fusión de la invención.
En otro aspecto, la invención se refiere a una partícula similar a virus que comprende el péptido o la proteína de fusión de la invención.
En otro aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del péptido, proteína de fusión, nanopartícula o partícula similar a virus de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para la detección de compuestos, moléculas y/o composiciones que inhiben la respuesta celular mediada por quimiocinas o son útiles para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades inflamatorias crónicas, enfermedades autoinmunitarias, inmunodeficiencias o cáncer, donde dicho método comprende:
a) poner en contacto un receptor de quimiocinas con un compuesto, molécula y/o composición que se ha de someter a ensayo,
b) analizar la unión entre el compuesto, molécula y/o composición que se ha de someter a ensayo y la región que consiste en el péptido de la invención dentro de la secuencia de aminoácidos del receptor de quimiocinas, y
c) clasificar el compuesto, molécula y/o composición como útil para inhibir la respuesta celular mediada por quimiocinas o útil para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades inflamatorias crónicas, enfermedades autoinmunitarias, inmunodeficiencias o cáncer, cuando se ha detectado una unión en la etapa b).
En otro aspecto, la invención se refiere al péptido, proteína de fusión, nanopartícula, partícula similar a virus de acuerdo con la invención o composición farmacéutica de la invención para su uso en medicina.
En otro aspecto, la invención se refiere a un péptido, proteína de fusión, nanopartícula, partícula similar a virus o composición farmacéutica de la invención para su uso en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades inflamatorias crónicas, enfermedades autoinmunitarias, inmunodeficiencias o cáncer.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona una diana molecular dentro de los receptores de quimiocinas, específicamente dentro de ¡a región VI transmembrana del receptor de quimiocinas CXCR4, que permite la detección y/o el diseño de moléculas cuya unión inhibe selectivamente la oligomerización del receptor mediada por quimiocinas, preferentemente la oligomerización del receptor CXCR4 mediada por quimiocinas CXCL12. Puesto que esta oligomerización es el estado conformacional activo de estos complejos de quimiocina/receptor de quimiocinas, la inhibición de la oligomerización de receptores de quimiocinas bloquea ios acontecimientos desencadenados por la señalización de quimiocinas, incluyendo procesos patológicos tales como la inflamación o la migración celular en el cáncer.
Por tanto, los inventores han identificado, dentro de los receptores de quimiocinas, preferentemente dentro del receptor CXCR4, los restos implicados en la oligomerización del receptor mediada por quimiocinas. Estos restos representan una nueva diana terapéutica para intervenir en respuestas celulares asociadas a la señalización de quimiocinas.
Usando el modelo de receptor/ligando CXCR4/CXCL12, los inventores han aplicado microscopía fluorescente de reflexión interna total (TIRF, por sus siglas en inglés) y microscopía de agotamiento de emisión estimulada (STED, por sus siglas en inglés) para estudiar, en condiciones básales y después de la estimulación por ligando, la oligomerización del receptor de quimiocinas y la dinámica del receptor en la superficie de la célula. Los inventores han evaluado la relevancia biológica de estos oligómeros y, usando péptidos diseñados para imitar las regiones transmembrana de este receptor, han identificado como diana la región que consistía en los restos de aminoácidos 239KTTVILiLA247, SEQ ID NO: 2, ubicados en ei dominio VI transmembrana (TMVI, por sus siglas en inglés) del receptor CXCR4, cuya modulación exógena bloquea específicamente la migración celular mediada por CXCL12. Por tanto, esta región del receptor de quimiocinas se propone en la presente invención como una diana molecular para ¡a detección de compuestos capaces de inhibir la oligomerización de! receptor de quimiocinas, afectando a la señalización de quimiocinas implicada en varios procesos patológicos.
Aunque los restos de aminoácidos no se conservan, esta región está conservada estructuralmente en otros miembros de ia familia de receptores de quimiocinas (Figura 5) y, por tanto, es una diana potencia! para inhibir la oligomerización de otros receptores de quimiocinas.
Además, basándose en un análisis informático, ios inventores estudiaron estos restos en CXCR4 y generaron un triple muíante CXCR4 que consistía en la secuencia de aminoácidos de CXCR4 (SEQ ID NQ: 3) donde en la región que comprende ios restos 239KTTVILILA24/ se incluyeron las sustituciones K239E, V242A y L246A (239ETTAILIAA247, SEQ ID NO: 4). Este receptor muíante triple se expresó normalmente en la membrana celular, se dimerizó como se demostró mediante FRET, se unió a CXCL12 pero no fue capaz de desencadenar la migración celular ni la fosforilación de ERK y AKT. Los datos TIRF usando células JK transfectadas con este mutante CXCR4 mostraron una falta de oligomerizaclón del receptor mediada por CXCL12 Por tanto, la presente invención también proporciona una molécula (el péptido que comprende la SEQ ID NO: 4) que evita la oligomerizaclón del receptor de quimiocinas y que puede usarse para el tratamiento de procesos patológicos que implican la señalización de quimiocinas.
Además, en experimentos in vivo, el tratamiento con el péptido 239KTTVILILA247, SEQ ID NQ: 2, bloqueó específicamente el retorno de neutrófiios a la médula ósea. Por tanto, este péptido que consiste en la SEQ ID NO: 2 también se propone en la presente invención como agonista para el bloqueo de la oligomerización del receptor de quimiocinas y para el tratamiento de procesos patológicos que implican la señalización de quimiocinas.
Resumiendo, los resultados de los inventores mostrados en los ejemplos a continuación indican que: i) los restos responsables de la oligomerización del receptor mediada por quimiocinas son una diana terapéutica que puede modularse exógenamente con el fin de tratar enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias o, en general, todos los procesos patológicos en los que hay implicadas vías de señalización de quimiocinas y ii) la secuencia específica SEQ ID NO: 2 dentro de la secuencia de aminoácidos del CXCR4 es responsable de dicha oligomerización, siendo de este modo una diana terapéutica prometedora para intervenir en respuestas mediadas por quimiocinas dentro de las células.
Péptido de la invención
En un primer aspecto, la invención se refiere a un péptido, en lo sucesivo en el presente documento péptido de la invención, que comprende la secuencia de aminoácidos X1X2TX4ILIX8A (SEQ ID NQ: 1 ) o su secuencia invertida, donde
Xi es K o E,
X2 es T o P,
X4 es V o A,
Xg es L o A, y
donde dicho péptido es capaz de inhibir la señalización de CXCL12. El término "péptido" o "polipéptido", como se usa en el presente documento, generalmente se retiere a una cadena lineal de aproximadamente 2 a 50 restos de aminoácidos unidos entre sí con enlaces peptídicos. Se entenderá que ¡as expresiones "enlace peptídico", "péptido", "polipéptido" y proteína son conocidos para ¡os expertos en la materia. En lo sucesivo en el presente documento, "péptido" y "polipéptido" se usarán indistintamente.
Como se usa en el presente documento, un "resto de aminoácido" se refiere a cualquier aminoácido de origen natural, cualquier derivado de aminoácido o cualquier mimético de aminoácido conocido en la técnica. La expresión "resto de aminoácido" abarca restos de aminoácidos L y D.
En una realización particular, el péptido de la invención no comprende la secuencia de longitud completa de CXCR4 (SEQ ID NO: 3).
El término "GXGR4", como se usa en el presente documento, se refiere a un receptor de quimiocinas C-X-C de tipo 4 (CXCR-4) también conocido como fusina o CD184 (grupo de diferenciación 184) y es una proteína que, en seres humanos, está codificada por el gen GXGR4. CXCR-4 es un receptor de alfa-quimiocinas específico para el factor 1 derivado del estroma (SDF-1 también denominado CXGL12), una molécula dotada de una potente actividad quimiotáctica para los linfocitos. CXCR4 es también uno de varios receptores de quimiocinas que el VIH puede usar para infectar linfocitos T CD4+. El CXCR4 puede ser de cualquier origen, por ejemplo, humano, bovino, murino, equino, canino, etc. En una realización particular, el CXCR4 es ¡a proteína humana con el número de acceso de Uniprot P61073 (CXCR4JHUMAN) (SEG ID NO: 3).
El término "CXCL12", como se usa en el presente documento, se refiere al motivo G-X-C quimiocina 12, también conocida como factor 1 derivado de células estromales (SDF1 ). CXCL12 es una proteína quimiocina que en humanos está codificada por el gen CXCL12 en el cromosoma 10. CXGL12 es fuertemente quimiotáctico para linfocitos y su señalización se ha observado en varios tipos de cáncer. CXGR4 es el receptor exclusivo para CXCL12; por tanto, mediante el bloqueo de su receptor, CXCL12 actúa como un inhibidor endógeno de cepas de VIH-1 CXCR4-trópicas.
En una realización particular, el péptido de ¡a invención consiste en menos de 50, menos de 40, menos de 30, menos de 20 o menos de 10 restos de aminoácidos.
En una realización particular, el péptido de la invención tiene entre 9 y 50 aminoácidos de longitud, preferentemente entre 9 y 40, más preferentemente entre 9 y 30, incluso más preferentemente entre 9 y 20. En una realización particular, el péptido tiene entre 9 y 15 aminoácidos de longitud.
En una realización particular, el péptido de la invención tiene una longitud de 9 aminoácidos. En una realización más particular, el péptido de la invención tiene la secuencia de aminoácidos KTTVILILA (SEQ ID NO: 2). En una realización más particular, el péptido de la invención comprende la secuencia inversa de la SEQ ID NO: 2.
En una realización particular, el péptido de la invención comprende la secuencia de aminoácidos ETTAILIAA (SEQ ID NO: 4). En una realización más particular, el péptido de la invención comprende la secuencia inversa de la SEQ ID NQ: 4.
En una realización particular, el péptido de la invención comprende la secuencia de aminoácidos KPTVILILA (SEQ ID NO: 5). En una realización más particular, el péptido de la invención comprende la secuencia inversa de la SEQ ID NO: 5.
En una realización particular, el péptido de la invención comprende la secuencia invertida del péptido de la invención. La expresión "secuencia invertida", como se usa en el presente documento, se refiere a un péptido en el que se invierte la dirección de la secuencia de aminoácidos, es decir, la secuencia de aminoácidos de un péptido leído desde su extremo C hasta su extremo N, de modo que las posiciones de ios grupos carbonita y amino en cada enlace amida se intercambian. Este péptido también se conoce como "retropéptido”. Como el experto en la materia sabrá, la secuencia invertida, o retropéptido, de la secuencia de la SEQ ID NQ: 1 es AX2iLIX6TXsX9 (SEQ ID NO: 6) donde X2 es L o A, X6 es V o A, X8 es T o P y X9 es K o E.
En una realización particular, la secuencia inversa del péptido SEQ ID NO: 2 es ALIUVTTK (SEQ ID NQ: 7).
En otra realización particular, la secuencia inversa del péptido SEQ ID NO: 4 es AAILIATTE (SEQ ID NO: 8).
En otra realización particular, la secuencia inversa del péptido SEQ ID NQ: 5 es ALILIVTPK (SEQ ID NQ: 9).
En una realización particular, el péptido de la invención comprende una secuencia que es una variante de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 que tiene al menos el 50 %, ai menos el 55 %, al menos el 58 %, al menos el 60 %, ai menos el 65 %, ai menos el 67 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, ai menos el 78 %, al menos el 80 %, al menos el 89 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 . El grado de identidad entre las variantes y la SEQ ID NO: 1 se determina mediante el uso de algoritmos y métodos informáticos que son ampliamente conocidos por los expertos en la materia. La identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina preferentemente mediante el uso del algoritmo BLASTP ( BLAST Manual, Aitschui, S. et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894). En una realización preferida, la identidad de secuencia se determina a lo largo de toda la longitud de la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o a través de toda la longitud de la variante o ambos
En una realización particular, X, es K o E. En una realización más particular, Xi es K.
En una realización particular, X2 es T o P. En una realización más particular, X2 es T.
En otra realización particular, X4 es V o A. En una realización más particular, X4 es V.
En otra realización particular, X8 es L o A. En una realización más particular, X8 es L.
De acuerdo con la presente invención, la vanante de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 es capaz de inhibir la señalización de CXCL12/CXCR4, es decir, la señalización del receptor CXCR4 mediada por CXCL12.
La capacidad de un péptido para inhibir la señalización de CXCL12/CXCR4 puede determinarse midiendo la capacidad del péptido para bloquear la activación de las dianas CXCL12 mediada por CXCR4, a saber, las vías JAK/Stat, GRK/b-arrestina, Rho/Rac, P!3K/Akt, Grb2/Ras/RAf/ERK PKC o NFKkb, ERK y/o Akt, que da como resultado acontecimientos tales como la migración, la polarización, la adhesión, el crecimiento, la compartimentación celulares y similares. Más preferentemente, la inhibición de la respuesta celular mediada por quimioeinas a la que se hace referencia en la presente invención comprende un flujo de calcio reducido, la falta de activación de AKT y ERK, dificultades para polarizar y/o adherirse al sustrato y/o la ausencia de migración celular, la falta de activación de neutróflios, la reducción de la proliferación celular, la linfopoyesis, la supervivencia celular y/o la angiogénesis, bloqueando la metástasis de células tumorales en células en respuesta a la quimiocina CXCL12. La modificación en la función de CXCR4 referida en la presente invención también comprende la inhibición de la infección por ViH-1 . En una realización particular, se considera que un péptido es capaz de inhibir la señalización de CXCL12/CXCR4 si reduce ia fosforilación inducida por CXCL12 de cualquiera de JAK/STAT, ERK1/2 y AKT en ai menos un 5%, al menos un 10%, ai menos un 20%, ai menos un 30%, ai menos un 40%, al menos un 50%, ai menos un 60%, ai menos un 70%, ai menos un 80%, al menos un 90% o un 100%.
En una realización particular, el péptido de la invención comprende ai menos un aminoácido D. La expresión "aminoácido D", como se usa en el presente documento, se refiere al enantiómero D de un aminoácido, que es ia imagen especular del aminoácido L.
En una realización particular, el péptido de la invención comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o más aminoácidos D.
En una realización particular, el péptido de ia invención consiste completamente en aminoácidos D, es decir, es un enantiómero todo D. Como sabe el experto, la glicina es el único aminoácido que no tiene enantiómero, por lo que en esta realización particular no se excluye que ei péptido comprenda glicina.
En otra realización particular, el péptido de la invención comprende ei enantiómero totalmente D de la secuencia XIX2TX4ÍLIX8A (SEQ ID NO: 1 ) donde Xi es K o E, X2 es T o P, X4 es V o A y X8 es L o A.
En una realización particular, el péptido de la invención comprende el enantiómero todo D de ia secuencia KTTVIL1LA (SEQ ID NO: 2} o el péptido inverso de ia misma.
En una realización particular, el péptido de la invención comprende ei enantiómero todo D de la secuencia ETTA1LIAA (SEQ ID NO: 4) o el péptido inverso de ia misma.
En una realización particular, el péptido de la invención comprende ei enantiómero todo D de la secuencia KPTViLILA (SEQ ID NO: 5) o el péptido inverso de la misma.
Como sabe el experto, el péptido inverso del enantiómero todo D también se denomina péptido retroinverso o retroinvertido. El péptido retroinverso, como se usa en el presente documento, constituye isómeros de péptidos lineales en los que la dirección de la secuencia de aminoácidos se invierte (retro) y ia quiralidad, D o L, de uno o más aminoácidos de los mismos está invertida (inverso), por ejemplo, usando aminoácidos D en lugar de aminoácidos L, por ejemplo, Jameson et al., Nature, 368, 744-746 (1994); Brady et al., Nature, 368, 692-693 (1994). El resultado neto de la combinación de enantiómeros D y la síntesis inversa es que las posiciones de ios grupos carboniio y amino en cada enlace amida se intercambian, mientras que la posición de los grupos de cadena lateral en cada carbono alfa se conserva. Una ventaja de los péptidos retroinversos es su actividad potenciada in vivo debido a la resistencia mejorada a la degradación proteolítica, es decir, el péptido tiene una estabilidad mejorada.
El péptido de ¡a invención puede obtenerse mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica, por ejemplo, pero no limitado a, un método in vifro como, por ejemplo, mediante síntesis química o mediante técnicas de proteínas recombinantes. Por ejemplo, a través de la síntesis de péptidos en fase sólida o mediante aproximaciones de ADN recombinante. Los péptidos y polipéptidos de la invención pueden producirse de forma recombinante, no solo directamente sino también como péptidos y polipéptidos de fusión junto con uno o más péptidos o polipéptidos heterólogos que pueden contener, por ejemplo, pero sin limitación, una secuencia señal, una secuencia marcadora u otro péptido que tenga un sitio de escisión de proteasa, por ejemplo, pero no limitado a, en el extremo N-terminal del péptido o poiipéptido maduro. Los péptidos o polipéptidos de la invención también pueden comprender uno o más grupos químicos unidos a los extremos N-terminai y/o C-terminal, tales como grupos biotina u otros grupos fluorescentes que permitan la visualización y el control del péptido o poiipéptido. La producción recombinante de los péptidos o polipéptidos de la invención comprende el diseño y opcionalmente la amplificación, de un poiinucleótido que codifica dicho péptido o poiipéptido, la clonación del poiinucleótido en una construcción génica, preferentemente en un vector de expresión, la transformación o transfección de una célula competente con dicha construcción, el cultivo de dicha célula en condiciones que promuevan la expresión del péptido o poiipéptido de la invención y el aislamiento y la purificación del péptido o poiipéptido de la invención producido o expresado por la célula.
Proteína de fusión, nanopartícula y partícula similar a virus de la invención
En otro aspecto, la invención se refiere a una proteína de fusión, en lo sucesivo en el presente documento "proteína de fusión de la invención", que comprende el péptido de la invención y al menos un poiipéptido heferólogo.
El péptido de la invención se ha definido anteriormente. Todas las realizaciones particulares y preferidas del péptido de la invención son completamente aplicables a la proteína de fusión de la invención. La expresión "proteína de fusión", como se usa en el presente documento, se refiere a una única cadena polipeptídica diseñada artificialmente que comprende dos o más secuencias de diferentes orígenes, natural y/o artificial. La proteína de fusión, por definición, nunca se encuentra en la naturaleza como tal.
La expresión "polipépíido heterólogo", como se usa en el presente documento, significa que el polipépíido no se encuentra naturalmente fusionado al pépíído de la invención.
En una realización particular, el poiipéptido heterólogo es un péptido que es capaz de atravesar ¡a barrera hematoencefálica. La conjugación del péptido de la invención con este tipo de péptido facilitará que el péptido atraviese la barrera hematoencefálica y es especialmente útil para entregar el péptido en el sistema nervioso central mediante administración sistémica. Se conocen en la técnica péptidos capaces de atravesar la barrera hematoencefálica. Por ejemplo, el documento W0200979790 divulga una serie de péptidos conocidos colectivamente como Angiopeps que son capaces de atravesar la barrera hematoencefálica por transcitosis mediada por receptor usando la proteína 1 relacionada con receptor de lipoproteína de baja densidad (LRP-1 ) y que permite la entrega al SNC de conjugados administrados por vía sistémica que comprendan dichos péptidos. El documento WO201 1087804 describe un péptido derivado de la gllcoproteína G del virus de la rabia, que permite que el conjugado que comprenda dicho péptido atraviese la barrera hematoencefálica. Prades et al., (Padres R et ai. (2015) Angew Chem ¡nt. Ed. Eng! 54 (13): 3967-3972) describe un péptido de 12 aminoácidos derivado del péptido transferrina humana que es capaz de superar la barrera hematoencefálica.
La proteína de fusión de la invención puede obtenerse mediante cualquier técnica adecuada que permita obtener dos péptidos (el péptido de la invención y el poiipéptido heterólogo) en una única cadena de polinucleóíidos. Dichas técnicas incluyen técnicas recombinantes, donde una construcción génica que codifica la proteína de fusión se introduce en un vector adecuado para la expresión en un sistema de expresión adecuado, y técnicas de ligadura de proteínas que implican ¡a formación de un enlace peptídico entre dos polipéptidos, como la ligadura química nativa o la ligadura de proteínas expresadas.
En otro aspecto, la invención se refiere a una nanopartícula, en lo sucesivo en el presente documento "nanopartícula de la invención", que comprende el péptido o la proteína de fusión de la invención.
El péptido y ¡a proteína de fusión se han definido anteriormente. Todas las 18 realizaciones particulares y preferidas del péptido y la proteína de fusión de la invención son completamente aplicables a la nanopartícula de la invención.
El término "nanopartícula", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier material que tenga dimensiones en el intervalo de 1 -1.000nm. En algunas realizaciones, las nanopartículas tienen dimensiones en el intervalo de 2-200nm, preferentemente en el intervalo de 2~150nm, e incluso más preferentemente en el intervalo de 2-100nm.
Las nanopartículas pueden contribuir a preservar la integridad del péptido o de la proteína de fusión en los fluidos biológicos hasta que alcanzar el órgano diana. Además, en el caso de la fusión que comprende un inmunomodulador, la encapsulación de la composición puede disminuir ios efectos secundarios provocados por el modulador. Por último, las nanopartículas también pueden modificarse para incluir restos que permitan dirigir la nanopartícula a un órgano de interés.
Las nanopartículas adecuadas que pueden usarse en el contexto de la presente invención incluyen materiales a escala nanométrica tales como una nanopartícula a base de lípidos (tales como liposo as), una nanopartícula superparamagnética, una nanocubierta, un nanocristal semiconductor, un punto cuántico, una nanopartícula a base de polímero, una nanopartícula a base de silicio, una nanopartícula a base de sílice, una nanopartícula a base de metal, un fullereno y un nanotubo.
La entrega dirigida puede conseguirse mediante la adición de iigandos sin comprometer la capacidad de las nanopartículas para entregar sus cargas útiles de péptidos. Se contempla que esto permitirá la entrega a células, tejidos y órganos específicos. La especificidad de dirección de los sistemas de entrega a base de iigandos se basa en la distribución de ios receptores de ligando en diferentes tipos celulares. El ligando de dirección puede asociarse de forma no covalente o covaiente con una nanopartícula y puede conjugarse con las nanopartículas mediante una diversidad de métodos como se describe en el presente documento.
Los ejemplos de proteínas o péptidos que pueden usarse para dirigir nanopartículas incluyen transferrina, lactoferrina, TGF-b, factor de crecimiento nervioso, albúmina, péptido Tat del VIH, péptido RGD e insulina, así como otros.
Se entenderá que la formulación del producto de la invención en una nanopartícula no tiene por objeto o no solo tiene por objeto facilitar el acceso del producto al interior de la célula, sino proteger el producto de la degradación y/o facilitar a orientación de la nanopartícula al órgano de interés. En otro aspecto, ¡a invención se reíiere a una partícula similar a virus (en inglés, virus-Uke particie o VLP), en lo sucesivo en el presente documento "partícula similar a virus de la invención", que comprende el péptido o la proteína de fusión de la invención.
El péptido y la proteína de fusión de la invención se han definido anteriormente. Todas las realizaciones particulares y preferidas del péptido y la proteína de fusión de la invención son totalmente aplicables a partículas similares a virus de la invención.
La expresión "partícula similar a virus", también denominada "VLP", por sus siglas en inglés, se refiere a partículas no infecciosas que se asemejan a virus que no contienen ningún material genético vírico. Las VLPs son el resultado de la expresión de proteínas estructurales víricas, tales como las proteínas de la cápslde, y su autoensa blaje.
En una realización particular, la VLP puede comprender o, como alternativa, consistir en proteínas estructurales de Parvovirus, Rotavirus; proteínas estructurales del virus de Norwalk; proteínas estructurales de Alfavirus; proteínas estructurales del virus de la Fiebre Aftosa; proteínas estructurales del virus del sarampión, proteínas estructurales del virus Sindbis, proteínas estructurales del Retrovirus, proteínas estructurales del virus de la Hepatitis B (por ejemplo, un HBcAg); proteínas estructurales del virus del mosaico del tabaco; proteínas estructurales del Virus Flock House; proteínas estructurales del virus del papiloma humano; proteínas estructurales del virus de Polioma; proteínas estructurales de bacteriófagos, proteínas estructurales de fagos de ARN.
En una realización particular, el péptido o proteína de fusión de la invención se acopla o se une a la cápside de la partícula similar a virus. La unión dei péptido o proteína de fusión a la cápside puede realizarse mediante un enlace covalente o no covaiente.
Diana farmacológica
El péptido de la invención puede usarse como diana farmacológica para la detección/selección/búsqueda de compuestos, moléculas y/o composiciones útiles para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades inflamatorias crónicas, enfermedades autoin unitarias, inmunodeficiencias o cáncer. Por tanto, en otro aspecto de la invención, el péptido de la invención es una diana farmacológica para la detección de compuestos, moléculas y/o composiciones útiles para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades inflamatorias crónicas, enfermedades autoinmunitarias, ¡nmunodeficiencias o cáncer.
Como se ha mencionado anteriormente, el péptido de la SEQ ID NO: 1 se ha identificado en la presente invención corno la región dentro del receptor GXGR4 responsable de ¡a oligomerización del receptor inducida por la quimiocina CXCL12. Por tanto, este péptido puede usarse in vitro, por sí mismo o formando parte del receptor CXCR4, como diana molecular para la detección de compuestos o moléculas útiles para la inhibición de ¡a oligomerización del receptor y, por tanto, para bloquear la señalización mediada por quimiocinas dentro de la célula.
La expresión "diana", "diana molecular", "diana farmacológica" o "diana terapéutica", como se usa en la presente invención, se refiere ai péptido de la invención que es útil para estudiar el efecto bioquímico de moléculas, compuestos o composiciones capaces de unirse a esta secuencia, interfiriendo con la actividad de esta secuencia o bloqueando esta secuencia o su actividad. Las moléculas, compuestos o composiciones de interés son ios que, a través de su unión a esta secuencia o la interferencia con la actividad de esta secuencia, evitan la oligomerización del receptor de quimiocina, preferentemente el receptor GXGR4, que comprende el péptido de la invención.
Los "compuestos, moléculas o composiciones" a ios que se hace referencia en la presente invención pueden ser, sin limitación, agentes bloqueantes, agentes de interferencia, inhibidores, ligandos que inducen sesgo de estímulo, moduladores alostéricos y bifuncionaies, o similares, de cualquier naturaleza (biológica o agentes químicos) y pueden incluir, por ejemplo, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos capaces de unirse al antígeno, aptámeros, ARN de interferencia, péptidos, ácidos nucleicos, mefabolitos o agentes químicos.
Los compuestos, moléculas y/o composiciones que interfieren con, se asocian a o se unen ai péptido de la invención, son capaces de bloquear la actividad de esta diana afectando de este modo a su implicación en la oligomerización del receptor de quimiocinas, preferentemente la oligomerización del receptor GXGR4, mediada por quimiocinas, más preferentemente mediada por la quimiocina GXCL12. Por tanto, estos compuestos, moléculas y/o composiciones inhiben la oligomerización del receptor de quimiocinas afectando, por tanto, a las vías de señalización de quimiocinas.
El término "inhibición", como se usa en la presente invención, se refiere a una inhibición, reducción, modulación, interferencia, cancelación o similar, total o parcial, de modo que la oligomerización del receptor de quimiocinas y, por tanto, la señalización mediada por quimiocinas no se produzca de la forma en que ocurriría en una célula de tipo normal, sana o silvestre (no manipulada).
La expresión "inhibir la respuesta celular mediada por quimiocinas", "inhibir la señalización mediada por quimiocinas", "inhibir las vías de señalización de quimiocinas", "inhibir ios acontecimientos desencadenados por la señalización de quimiocinas" o similares se refieren a inhibir cualquier vía corriente abajo activada o desencadenada mediante la unión de la quimiocina (ligando) a su receptor. Preferentemente, pero sin limitación, las vías corriente abajo ( downstream ) activadas por quimiocinas comprenden la activación de las vías JAK/Stat, GRK /p-arrestina, Rho/Rac, PI3K/Akt, Grb2/Ras/RAf/ERK, PKC o NRkb, ERK y/o Akt, lo que da como resultado acontecimientos tales como la migración, la polarización, la adhesión, el crecimiento, la compartimentación celulares y similares. Más preferentemente, la inhibición de la respuesta celular mediada por quimiocinas a la que se hace referencia en la presente invención comprende un flujo de calcio reducido, la falta de activación de AKT y ERK, dificultades para polarizar y/o adherirse al sustrato y/o la ausencia de migración celular, la falta de activación de neufrófilos, la reducción de la proliferación celular, la linfopoyesis, la supervivencia celular y/o ia angiogénesis, bloqueando la metástasis de células tumorales en células en respuesta a la quimiocina CXCL12. La modificación en ia función de CXCR4 referida en la presente invención también comprende la inhibición de la infección por VIH-1 .
En una realización particular, el péptido de la invención se usa para diseñar nuevas moléculas de unión o de interferencia, preferentemente mediante peptidomiméticos.
Un fármaco peptidomimético, en su sentido más amplio, es un término utilizado para designar moléculas orgánicas que imitan algunas propiedades de iigandos peptídicos: por lo general son compuestos derivados de péptidos y proteínas y obtenidos mediante modificación estructural usando aminoácidos no naturales, restricciones conformacionales.
Las composiciones, combinaciones y métodos de la presente invención también incluyen los caracterizados por análogos peptidomiméticos de los péptidos descritos en el presente documento. Los análogos peptidomiméticos imitan la estructura tridimensional del sitio activo contenido en el péptido original. Por ejemplo, ios análogos del péptido de la invención pueden ser de naturaleza semipeptídica o no peptídica. Estos análogos peptidomiméticos presentan ventajosamente una mayor vida útil y bioestabilidad en comparación con el compuesto original. Además, la biodisponibllidad de estos análogos peptidomiméticos puede ser mayor que la de ¡os péptidos correspondientes cuando se administran por vía oral o tópica. Además, estos análogos pueden presentar una actividad inmunomoduladora aumentada para la respuesta celular mediada por quimiocinas. Ha de entenderse que los análogos peptidomiméticos de la presente invención se caracterizan por actividades biológicas que son similares a las de los péptidos de hirudina que se describen en el presente documento. En consecuencia, estos análogos pueden emplearse en composiciones, combinaciones y métodos de ¡a presente invención de la misma manera que el péptido de la invención. Ha de entenderse que el peptidomimético y análogos covalentes de la presente invención se caracterizan por actividades biológicas que son similares a ¡as de ¡os péptidos que se describen en el presente documento. En consecuencia, estos análogos pueden emplearse en composiciones, combinaciones y métodos para el diagnóstico, la terapia y ¡a profilaxis de ¡a misma manera que los péptidos de la presente invención.
Método de detección de ¡a invención
En otro aspecto de ¡a invención, el péptido de ¡a invención se usa en un método de detección/búsqueda/selección de compuestos, moléculas y/o composiciones que inhiben la respuesta celular mediada por quimiocinas, preferentemente la quimiocina es CXCL12. En una realización específica, ¡a invención se refiere al uso del péptido de ¡a invención como diana farmacológica para la detección de compuestos, moléculas y/o composiciones útiles para el tratamiento y/o ¡a prevención de enfermedades inflamatorias crónicas, enfermedades autoinmunitarias, ínmunodeficiencias o cáncer.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a un método de detección in vitro, en ¡o sucesivo en el presente documento "el método de detección de la invención", para la detección, el diseño o la identificación de compuestos, moléculas y/o composiciones que inhiben ¡a respuesta celular mediada por quimiocinas, preferentemente donde la quimiocina es CXCL12 o es útil para el tratamiento y/o ¡a prevención de afecciones clínicas, procesos patológicos o enfermedades que implican ¡a señalización de quimiocinas, preferentemente señalización de CXCL12, para el desarrollo de síntomas, donde dicho método comprende:
a. poner en contacto el péptido de ¡a invención o un receptor de quimiocinas, preferentemente el receptor CXCR4, con un compuesto, molécula y/o composición que se ha de someter a ensayo,
b. analizar ¡a unión o la interferencia entre el compuesto, molécula y/o composición que se ha de someter a ensayo y la región que consiste en el péptido de la invención dentro de la secuencia de aminoácidos del receptor de quimiocinas y
c. clasificar el compuesto, molécula y/o composición como útil para inhibir la respuesta celular mediada por quimiocinas o útil para el tratamiento y/o la prevención de afecciones clínicas, procesos patológicos o enfermedades que implican señalización de quimiocinas para el desarrollo de síntomas, cuando se ha detectado unión o interferencia en la etapa ib)
"Poner en contacto ei péptido de la invención o un receptor de quimiocinas, preferentemente el receptor CXCR4, con un compuesto, molécula y/o composición" significa la incubación del compuesto, molécula y/o composición que se ha de estudiar con el péptido de la invención o un receptor de quimiocinas, preferentemente ei receptor CXCR4, en condiciones que permitan la unión de la molécula, compuesto o composición a la diana, donde el péptido de la invención es la diana. Si la molécula que se ha de estudiar es un anticuerpo o un fragmento del mismo, la incubación se realiza en condiciones que permitan la formación y el control de ios complejos antígeno-anticuerpo. Preferentemente, la diana y/o ei compuesto, molécula o composición que se ha de someter a ensayo se marcan, más preferentemente con un marcador bioiuminiscente o fluorescente.
El término "unión" se refiere a una unión física total o parcial o una unión que ejerce un impedimento estérico. El término "interferencia" se refiere a la capacidad del compuesto, molécula o composición para bloquear o inhibir total o parcialmente la actividad de la diana, preferentemente la actividad de oligomerización que la diana ejerce sobre ei receptor de quimiocinas. Por tanto, un buen compuesto, molécula o composición candidato será capaz de inhibir la oligomerización del receptor de quimiocinas, preferentemente ei receptor CXCR4, mediada por quimiocinas, preferentemente por la quimiocina CXCL12.
Dependiendo de la naturaleza del compuesto, molécula y/o composición que se ha de someter a ensayo, el análisis de la unión o interferencia en la etapa (b) puede realizarse, por ejemplo, pero sin limitaciones, mediante FRET ("transferencia de energía por resonancia fluorescente"), BRET (transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia), TiRF {microscopía de reflexión interna total), microscopía STED de alta resolución {agotamiento de emisión estimulada), Biacore (SPR, resonancia de plasmón superficial), citometría de flujo, Western blot, geles de electroforesis, inmunoprecipitación, matrices de proteínas, inmunofluorescencia, inmunohistoquímica, ELISA o cualquier otro método enzimático: por medio de incubación usando un ligando específico, preferentemente CXCL12; por medio de RM o cualquier otra técnica de formación de imágenes de diagnóstico; o, por ejemplo, usando técnicas cromatográficas combinadas con espectrometría de masas.
En una realización preferida del método de la invención, la afección clínica, el proceso patológico o la enfermedad se selecciona entre enfermedades inflamatorias crónicas, enfermedades autoinmunitarias, inmunodeficiencias o cáncer. Las definiciones de estas enfermedades y ejemplos de las mismas pueden encontrarse a continuación.
Anticuerpo de ia invención
En otro aspecto de la invención se refiere al uso del péptido de la invención como antígeno para generar un anticuerpo que se une o interfiere con la respuesta celular mediada por quimiocinas.
Por tanto, en otro aspecto, ia invención se refiere a un anticuerpo o fragmento del mismo donde dicho anticuerpo se une al péptido de ia invención, en lo sucesivo en el presente documento el "anticuerpo de la invención". Dicho anticuerpo o fragmento del mismo puede identificarse mediante el método de detección de la invención y de este modo es capaz de inhibir ia respuesta celular mediada por quimiocinas o de ser útil para el tratamiento y/o la prevención de afecciones clínicas, procesos patológicos o enfermedades que implican señalización de quimiocinas para el desarrollo de síntomas.
Un "anticuerpo" (utilizado indistintamente en forma plural) es una molécula de inmunogiobulina capaz de unirse específicamente a una diana, tal como un hidrato de carbono, polinucleótido, lípido, polipéptido, etc., a través de ai menos un sitio de reconocimiento de antígeno, localizado en ia región variable de la molécula de inmunogiobulina. Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" abarca no solo anticuerpos policlonales o monoclonales intactos (por ejemplo, de longitud completa), sino también fragmentos de unión a antígeno de los mismos (tales como Fab, Fab', F(ab’)2, Fv), monocatenarios (scFv), mutantes de los mismos, proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, diacuerpos, anticuerpos lineales, anticuerpos monocatenarios, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunogiobulina que comprende un sitio de reconocimiento de antígeno de la especificidad requerida, incluyendo variantes de glicosilación de anticuerpos, variantes de secuencias de aminoácidos de anticuerpos y anticuerpos modificados covaíentemente. Un anticuerpo incluye un anticuerpo de cualquier clase, tal como IgD, IgE, IgG, ígA o igM (o subclase del mismo) y no es necesario que el anticuerpo sea de ninguna dase particular. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases. Existen cinco ciases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM y varias de ellas pueden dividirse en subclases (isotipos), por ejemplo, igG1 , !gG2, !gG3, igG4, !gA1 e igA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan alfa, delta, épsiion, gamma y mu, respectivamente. Las estructuras de subunidades y configuraciones tridimensionales de diferentes ciases de inmunoglobulinas son bien conocidas.
La expresión "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "fragmento de anticuerpo"), como se usa en el presente documento, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, CXGR4). Se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede realizarse mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Dichas realizaciones de anticuerpos también pueden ser de formatos biespecíficos, específicos duales o multiespecíficos; que se unen de forma específica a dos o más antígenos diferentes. Las construcciones de anticuerpos multiespecíficas, de doble especificidad y biespecíficas son bien conocidas en la técnica y se describen y caracterizan en Kontermann (ed.), Bispecífic Antibodies, Springer, NY (201 1 ) y Spíess C et al. (2015) Mol Immunol 67 (2 Parte A): 95-106.
Los ejemplos de fragmentos de unión incluidos dentro de la expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en ios dominios VL, VH, CL y CH1 ; (¡i) un fragmento F(ab’)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en ios dominios VH y CH1 ; (¡v) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward ES et al. (1989) Nature 341 (6242): 544-546; documento WO 90/05144 A1 incorporado en el presente documento por referencia), que comprende un solo dominio variable; y (vi) una región determinante de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) aislada. Además, aunque ios dos dominios del fragmento Fv, VL y VH están codificados por genes separados, pueden unirse, usando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que ¡es permite formarse como una única cadena de proteína en la que ¡as regiones VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv monocatenario (scFv); véase, por ejemplo, Bird RE et al. (1988) Science 242 (4877): 423-426; Huston JS et al. (1988) Proc Nati Acad. Sci USA 85 (16): 5879-5883. Se pretende que dichos anticuerpos monocatenarios estén incluidos dentro de la expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo. También se incluyen otras formas de anticuerpos monocatenarios, tales como diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes biespecíficos en los que ¡os dominios VH y VL se expresan en una única cadena polipeptídica, pero usando un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, obligando de este modo a ¡os dominios a aparearse con dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antigeno (véase, por ejemplo, Holüger P et al. (1993) Proc Nati Acad Sci USA 90 (14): 6444-6448; Poljak RJ et al. (1994) Sfructure 2: 1 121 -1 123). Dichas porciones de unión a anticuerpo son conocidas en la técnica (Kontermann y Dubel eds., Antibody Engineeríng (2001 ) Springer-Verlag. Nueva York. 790 págs. (ISBN 3 540 41354 5
Se conocen numerosos métodos que pueden usarse para la obtención de anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la invención. Por ejemplo, pueden producirse anticuerpos usando métodos de ADN recombinante. También pueden producirse anticuerpos monoclonales mediante generación de hibridomas (véase, por ejemplo, Kohler G & Miistein C (1975) Nature 256 (5517): 495- 497) de acuerdo con métodos conocidos. Después, los hibridomas formados de esta manera se detectan usando métodos convencionales, tales como el análisis por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) y el análisis por resonancia de plasmen superficial (por ejemplo, OCTET o BIACORE), para identificar uno o más hibridomas que producen un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno específico. Puede usarse cualquier forma del antígeno especificado como inmunógeno, por ejemplo, antígeno recombinante, formas de origen natural, cualquier variante o fragmento de ¡os mismos, así como péptido antigénico de los mismos (por ejemplo, cualquiera de ¡os epítopos que se describen en el presente documento como un epífopo lineal o dentro de un armazón como un epítopo conformacional). Un método de ejemplo para producir anticuerpos incluye explorar bibliotecas de expresión de proteínas que expresan anticuerpos o fragmentos de los mismos (por ejemplo, scFv), por ejemplo, bibliotecas de presentación de fagos o ribosomas. La presentación en fagos se describe, por ejemplo, en: ¡a Patente de ¡os EE.UU. N.e 5.223 409; Smith GP (1985) Science 228 (4705): 1315-1317; Ciackson T et ai. (1991 ) Nature 352 (8336): 624-628; Marks JD et al. (1991 ) Journal of molecular bioíogy 222 (3): 581 -597); documento W092/18619; documento WO 91 /17271 ; documento WO 92/20791 ; documento WO 92/15679; documento WO 93/01288; documento WO 92/01047; documento WO 92/09690; y documento WO 90/02809.
Además del uso de bibliotecas de presentación, el antígeno especificado (por ejemplo, el péptido de la invención) puede usarse para inmunizar un animal no humano, por ejemplo, un roedor, por ejemplo, un ratón, hámster o rata. En una realización particular, el animal no humano es un ratón.
En otra realización particular, se obtiene un anticuerpo monoclonal del animal no humano y después se modifica, por ejemplo, quimérico, usando técnicas de ADN recombinante adecuadas. Se ha descrito una diversidad de enfoques para producir anticuerpos quiméricos. Véase, por ejemplo, Morrison SL et al. (1984) Proc Nati Acad Sci USA 81 (21 ): 6851 -6855; Takeda S et al. (1985) Nature 314 (6010): 452-454; Patente de los EE.UU. N. ° 4.816.567; Patente de los EE.UU N.q 4 816 397; documento EP171496; documento EP0173494; documento GB 2177Q96B.
Para técnicas de producción de anticuerpos adicionales, véase Antibodies: A Laboratory Manual, eds. Harlow et al., Coid Spring Harbor Laboratory, 1988 La presente divulgación no se limita necesariamente a ninguna fuente particular, método de producción u otras características especiales de un anticuerpo.
Ácido nucleico , construcción génica, vector y célula de la invención
En otro aspecto, la invención se refiere a un ácido nucleico que codifica el péptido, ¡a proteica de fusión o el anticuerpo de la invención, en lo sucesivo en el presente documento "ácido nucleico de la invención" y a una construcción génica que comprende dicho ácido nucleico, en lo sucesivo en el presente documento "construcción génica de la invención".
Los términos“péptido”,“proteína de fusión” y“anticuerpo de ¡a invención” se han definido anteriormente. Todas las realizaciones particulares y preferidas del péptido, ¡a proteína de fusión y el anticuerpo de ¡a invención son completamente aplicables al ácido nucleico y construcción génica de la invención.
Las expresiones "polinucleótido", "ácido nucleico" y "molécula de ácido nucleico" se usan indistintamente para referirse a formas poiiméricas de nucleótidos de cualquier longitud. Los polinucleótidos pueden contener desoxirribonucleótidos, 28 ribonucleótidos y/o sus análogos. Los nucleótidos pueden tener cualquier estructura tridimensional y pueden realizar cualquier función, conocida o desconocida. El término "polinucleótido" incluye, por ejemplo, moléculas monocatenarias, bicatenarias y triple helicoidales, un gen o fragmento génico, exones, intrones, ARNm, ARNt, ARNr, ribozimas, ADNc, polinucieótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico y cebadores. Además de una molécula de ácido nucleico nativa, una molécula de ácido nucleico de la presente invención también puede comprender moléculas de ácido nucleico modificadas. Como se usa en el presente documento, ARNm se refiere a un ARN que puede traducirse en una célula.
En una realización preferida, el polinucleótido de la invención es un ARNm. Ei ARNm puede sintetizarse químicamente, puede obtenerse mediante transcripción in vitro o puede sintetizarse in vivo en la célula diana. Las secuencias de nucleótidos que forman el ácido nucleico que codifica el conjugado o proteína de fusión de la invención están en el mismo marco de lectura correcto para su expresión.
Las secuencias de ácido nucleico de la invención pueden codificar los péptidos o polipéptidos maduros o preproteínas que consisten en un péptido señal unido ai péptido o polipéptido maduro que posteriormente debe procesarse. Las secuencias de nucleótidos de la presente invención también pueden comprender, además de la secuencia codificante, otros elementos, tales como intrones, secuencias no codificantes en ios extremos 3' y/o 5\ sitios de unión a ribosomas, sitios de restricción, etc. Estas secuencias de nucleótidos también pueden incluir secuencias codificantes para aminoácidos adicionales que son útiles para la purificación o estabilidad de ios péptidos o polipéptidos codificados.
La expresión "construcción géniea", como se usa en el presente documento, se refiere al ácido nucleico de la invención junto con regiones adecuadas para regular la expresión de dicho ácido nucleico, incluyendo promotores, terminadores de la transcripción, regiones 5' y 3’ no traducidas, señales de poliadenilación y similares. La expresión "construcción géniea", "construcción genética" o "construcción de ácido nucleico" como se usa en el presente documento se refiere a una unidad funcional necesaria para transferir, y preferentemente expresar, una secuencia de ácido nucleico de interés, en el presente documento las secuencias de nucleótidos de la invención como se describen, en una célula hospedadora. Estas construcciones génicas también comprenden preferentemente secuencias reguladoras o de control que incluyen, por ejemplo, un promotor, un potenciador, un terminador, etc., unidas operativamente a la secuencia que codifica el péptido o poiipéptido. Estas construcciones génicas se refieren a una molécula de ácido nucleico, mono o bicatenaria, que se aísla de un gen natural o que se modifica para contener segmentos de ácido nucleico de manera que de otro modo no existirían en la naturaleza. La expresión "construcción de ácido nucleico" es sinónimo de la expresión "casete de expresión", cuando la construcción de ácido nucleico contiene las secuencias de control necesarias para la expresión de la secuencia de codificación.
Preferentemente, las construcciones génicas de la invención comprenden adicionalmente un promotor unido operativamente a ¡as secuencias de ácido nucleico de la invención. El promotor puede ser, pero sin ¡imitaciones, un promotor constitutivo o inducible. Preferentemente, ¡as construcciones génicas de la invención comprenden adicionalmente un terminador.
En otro aspecto, la invención se refiere a un vector, en ¡o sucesivo en el presente documento "vector de la invención", que comprende un poiinucleótido de la invención.
El término "vector", como se usa en ei presente documento, se refiere a una secuencia de ácido nucleico que comprende las secuencias necesarias de manera que después de transcribir y traducir dichas secuencias en una célula se genere un poiipéptido codificado por el ácido nucleico de ¡a invención. Dicha secuencia está unida operativamente a segmentos adicionales que proporcionan su replicación autónoma en una célula hospedador de interés. Preferentemente, ei vector es un vector de expresión, que se define como un vector que, además de ¡as regiones de la replicación autónoma en una célula hospedadora, contiene regiones unidas operativamente al ácido nucleico de la invención y que son capaces de potenciar ¡a expresión de los productos del ácido nucleico de acuerdo con la invención. Los vectores de la invención pueden obtenerse por medio de técnicas ampliamente conocidas en la técnica.
Los ejemplos de vectores incluyen, pero no se limitan a vectores víricos, vectores de expresión de ADN o ARN desnudos, plásmidos, cósmidos o vectores de fagos, vectores de expresión de ADN o ARN asociados a agentes de condensación catiónicos, vectores de expresión de ADN o ARN encapsulados en liposomas y ciertas células eucariotas, tales como células productoras.
El vector de la invención puede usarse para transformar, transfectar o infectar células que pueden transformarse, transfectarse o infectarse mediante dicho vector. Dichas células pueden ser procarióticas o eucarióticas. El vector preferentemente comprende el ácido nucleico de ia invención unido operativamente a secuencias que regulan la expresión del ácido nucleico de la invención. Las secuencias reguladoras de uso en la presente invención pueden ser promotores nucleares o, como alternativa, secuencias potenciadoras y/u otras secuencias reguladoras que aumenten la expresión de la secuencia de ácido nucleico heteróloga. En principio, puede usarse cualquier promotor en ia presente invención a condición de que dicho promotor sea compatible con las células donde se ha de expresar el ácido nucleico.
El vector de expresión de ia invención se introduce en una célula hospedadora de manera que el vector permanezca como un constituyente cromosómico o como un vector autorreplicante extracromosómico. Son ejemplos de vectores de expresión, pero sin limitaciones, fagos, cósmidos, fagémidos, cromosomas artificiales de levadura (YAC), cromosomas artificiales bacterianos (BAC), cromosomas artificiales humanos (HAC) o vectores víricos, tales como adenovirus, retrovirus o lentivirus. Son ejemplos de vectores de expresión apropiados para la inserción de los poiinucleótidos de la invención, preferentemente pero sin limitaciones, pUG18, pUC19, Bluescript y sus derivados, mp18, mp19, pBR322, pMB9, Co1 E1 , pGR1 , RP4, plásmidos pET, fagos y vectores "iniciadores”, tales como pSA3 y pAT28; vectores de expresión de levadura tales como el plásmido de 2 micrómetros de Saccharomyces cerevisiae, plásmidos de integración, vectores YEP, plásmidos de centrómero y similares; vectores de expresión en células de insecto tales como los vectores de las series pAG y pVL; vectores de expresión en células vegetales tales como piBi, pEarleyGate, PAVA, pGAMBIA, PGSA, PGWB, PMDC, PMY, series de poros y similares, y otros plásmidos de expresión de proteínas utilizados en células eucariofas, incluyendo baculovirus adecuados para la transfección celular.
Además, las construcciones génicas de ia invención comprenden preferentemente un marcador, tal como un gen resistente a ia ampicilina. Dichos plásmidos están disponibles en el mercado (serie pUC (Takara S buzo), serie pPROK (Glontech), pKK233-2 (Glontech), etc.). Como alternativa, el marcador puede ser otro gen resistente a fármacos tal como un gen resistente a kanamicina, neomicina o cloranfenico!, o un gen de fluorescencia, tal como iuciferasa, GFP, mGherry y similares. O el marcador puede ser un marcador genético auxótrofo.
En otro aspecto de ia invención, se refiere a una célula aislada, preferentemente una célula eucariótica, más preferentemente una célula de mamífero, incluso más preferentemente una célula humana, en lo sucesivo en el presente documento "célula de la invención", que comprende el péptido, proteína de fusión, anticuerpo, ácido nucleico, construcción génica o vector de la invención.
El término "aislado" significa que el elemento se ha separado y extraído de su entorno natural o se ha sintetizado in vííro y que está fuera de un organismo vivo (ex vivo).
El péptido, la proteína de fusión, el anticuerpo, el ácido nucleico, la construcción génica y el vector de la invención se han definido anteriormente. Todas las realizaciones particulares y preferidas del péptido, la proteína de fusión, el anticuerpo, el ácido nucleico, la construcción génica y el vector de la invención son completamente aplicables al ácido nucleico y la construcción génica de la invención.
Las células adecuadas en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, células de mamífero, de levadura, vegetales, de insecto, fúngicas y bacterianas.
Composición farmacéutica de ia invención
En otro aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del péptido, protefna de fusión, nanopartícula, partícula similar a virus, anticuerpo, ácido nucleico, construcción génica, vector o célula de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
El péptido, la protefna de fusión, la nanopartícula, ia partícula similar a virus, el anticuerpo, el ácido nucleico, ia construcción génica, el vector y la célula de la invención se han definido anteriormente. Todas las realizaciones particulares y preferidas del péptido, ia proteína de fusión, ia nanopartícula, ia partícula similar a virus, el anticuerpo, el ácido nucleico, ia construcción génica, el vector y la célula de la invención son completamente aplicables ai ácido nucleico y a la construcción génica de ia invención.
Como se usa en la presente Invención, ia expresión "composición farmacéutica" se refiere a una formulación que se ha adaptado para administrar una dosis predeterminada de uno o varios agentes terapéuticos útiles a una célula, un grupo de células, un órgano, un tejido o un animal en el que ia división celular está descontrolada, tai como el cáncer.
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz", como se usa en el presente documento, se entiende como una cantidad capaz de proporcionar un efecto terapéutico y que puede ser determinada por el experto en ia materia por medios utilizados habitualmente. La cantidad del péptido, la proteína de fusión, la nanopartícula, el anticuerpo, el ácido nucleico, la construcción génica, el vector, el virus o la partícula vírica o la célula de la invención que puede incluirse en ¡as composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención variará dependiendo del sujeto y el modo particular de administración. Los expertos en la materia apreciarán que las dosificaciones también pueden determinarse con la orientación de Goodman and Goldman's The Pharmacoíogica / Basis oí Therapeutics, novena edición (1996), apéndice II, páginas 1707-171 1 y de Goodman and Goldman's The Pharmacological Basis oí Therapeutics, décima edición (2001 ), Apéndice ¡I, páginas 475-493.
La dosificación apropiada del principio o principios activos dentro de la composición farmacéutica dependerá del tipo de enfermedad que se ha de tratar, de la gravedad y del curso de la enfermedad, de si la composición se administra con fines preventivos o terapéuticos, de la terapia previa, de la historia clínica y de la respuesta del paciente a la composición y de la discreción dei médico especialista. La cantidad del péptido, ¡a proteína de fusión, la nanopartícula, el anticuerpo, el ácido nucleico, la construcción génica, el vector, el virus o la partícula vírica o la célula de ¡a Invención se administra adecuadamente ai paciente de una sola vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y ¡a gravedad de la enfermedad, un nivel de dosificación apropiado generalmente será de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg/kg; más preferentemente de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5 mg/kg, incluso más preferentemente de aproximadamente 0,75 a aproximadamente 2,5 mg/kg, aún más preferentemente aproximadamente 1 mg/kg, que puede administrarse en dosis únicas o múltiples. Los compuestos pueden administrarse en una pauta de 1 a varias veces por día o por dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete días, preferentemente una vez cada dos días. La composición farmacéutica puede administrarse durante ai menos 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21 , 28 o más días, preferentemente durante 14 días. La composición farmacéutica puede administrarse preferentemente una vez cada dos días durante 14 días.
Las composiciones farmacéuticas de ¡a invención también contienen uno o varios excipientes farmacéuticamente aceptables adicionales. Se entiende por "excipiente farmacéuticamente aceptable" una sustancia terapéuticamente inactiva que se dice que se usa para incorporar el principio activo y que es aceptable para el paciente desde un punto de vista farmacoíógíco/toxicológico y para el químico farmacéutico que lo fabrica desde un punto de vista físico/químico con respecto a la composición, formulación, estabilidad, aceptación del paciente y biodisponibilidad. El excipiente o vehículo también incluye cualquier sustancia que sirva para mejorar la entrega y la eficacia dei principio activo dentro de la composición farmacéutica. Los ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables Incluyen uno o más de entre agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden comprender adicionalmente cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que potencian la vida útil o la eficacia de la proteína de fusión o de las composiciones que forman parte de las composiciones farmacéuticas. Se conocen bien en la bibliografía ejemplos de vehículos apropiados (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 19s ed., Mack Pubiishing Company, Bastón, PA, 1995). Son ejemplos de vehículos sin limitación una serie de sacáridos tales como lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol y maltitol; una serie de almidones tales como almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz y almidón de patata; una serie de celulosa tai como celulosa, metil celulosa, carboximetil celulosa de sodio e hidroxi propilmetil celulosa; y una serie de cargas tales como gelatina y polivinii pirrolidona. En algunos casos, puede añadirse un disgregante tai como polivinii pirroiidona reticulada, agar, ácido aigínico o aiginato de sodio.
El número y la naturaleza de ios excipientes farmacéuticamente aceptables dependen de la forma de dosificación deseada. Los excipientes farmacéuticamente aceptables son conocidos por el experto en la materia (Faulí y Trillo C. (1993) "Tratado de Farmacia Galénica”, Luzán 5, S.A. Ediciones, Madrid). Dichas composiciones pueden prepararse por medio de los métodos convencionales conocidos en el estado de la técnica {" Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20 ' edición (2003) Genaro A.R., ed., Lippincott Williams & Wilkins, Filadeifia, EE.UU.).
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse por cualquier tipo de vía adecuada, tal como por vía oral, nasal, ocular, tópica, infradérmica, intracraneal o intravenosa. La vía de administración preferida de dichas composiciones farmacéuticas es la vía oral, nasal, ocular, tópica, intracraneal o infradérmica.
La "vía oral" se entiende como la composición farmacéutica incorporada dentro del organismo después de la deglución.
La "vía nasal" se entiende como la administración de la composición farmacéutica insuflada a través de la nariz.
La "vía ocular" se entiende como la administración tópica de la composición farmacéutica por instilación directamente en el ojo.
La "vía tópica” se entiende como la aplicación en el exterior del cuerpo, tai como, sin limitación, la piel, el cuero cabelludo y las uñas; y también la aplicación a mucosas tales como, sin limitación, la mucosa bucal, nasal o rectal.
La "vía intradérmica" se entiende como la administración de la composición farmacéutica mediante la inyección en la dermis.
La "vía intracraneal" se entiende como la administración de la composición farmacéutica dentro del cráneo.
La "vía intravenosa" se entiende como la administración de la composición farmacéutica mediante la inyección en el flujo sanguíneo.
Usos médicos de la invención
En otro aspecto, la invención se refiere ai péptido, la proteína de fusión, la nanopartícula, la partícula similar a virus, el anticuerpo, el ácido nucleico, la construcción génica, el vector, la célula o la composición farmacéutica de la invención para su uso en medicina.
Como alternativa, la invención se refiere ai uso del péptido, la proteína de fusión, la nanopartícula, la partícula similar a virus, el anticuerpo, el ácido nucleico, la construcción génica, el vector, la célula o la composición farmacéutica de la invención para la fabricación de un medicamento.
Los autores de la presente invención han demostrado que el péptido de 9 aminoácidos de longitud que contiene una secuencia conservada de 9 restos del dominio transmembrana VI (TMVI) fue eficaz corno ¡nmunomodulador para la respuesta celular mediada por quimiocinas, en particular para CXCL12, y también es una diana para diseñar nuevas moléculas que interfieren con la multimerización del receptor, en particular anticuerpos. Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere ai péptido, la proteína de fusión, la nanopartícula, la partícula similar a virus, el anticuerpo, el ácido nucleico, la construcción génica, el vector, la célula o la composición farmacéutica de la invención para su uso en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades inflamatorias crónicas, enfermedades autoinmunitarias, inmunodeficiencias o cáncer.
Como alternativa, la invención se refiere a un método para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades inflamatorias crónicas, enfermedades autoinmunitarias, inmunodeficiencias o cáncer que comprende administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz del péptido, proteína de fusión, nanopartícula, partícula similar a virus, anticuerpo, nucleico ácido, construcción génica, vector, célula o composición farmacéutica de la invención.
Se ha notificado que la ¡nmunomodulación de la respuesta celular mediada por quimiocinas es útil en varias enfermedades, incluyendo enfermedades inflamatorias crónicas, enfermedades autoinmunitarias, inmunodeficiencias o cáncer (Charo IF y Ransohoff RM (2006) N Engí J Med 354 (6): 610-621 ; Baíkwili F (2004) Nat Rev Cáncer 4 (7): 540-550; Bacheierie F et al. (2014) Pharmacoiogicai reviews 66 (1 ): 1 - 79). Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere al péptido, la proteína de fusión, la nanopartícula, la partícula similar a virus, el anticuerpo, el ácido nucleico, la construcción génica, el vector, la célula o la composición farmacéutica de la invención para su uso en el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas, enfermedades autoinmunitarias, inmunodeficiencias o cáncer.
Como alternativa, la invención se refiere ai uso del péptido, la proteína de fusión, la nanopartícula, la partícula similar a virus, el anticuerpo, el ácido nucleico, la construcción génica, el vector, la célula o la composición farmacéutica de la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades crónicas inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias, inmunodeficiencias o cáncer.
Como alternativa, la invención se refiere a un método para el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas, enfermedades autoinmunitarias, inmunodeficiencias o cáncer que comprende administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz del péptido, la proteína de fusión, la nanopartícula, la partícula similar a virus, el anticuerpo, el ácido nucleico, la construcción génica, el vector, la célula o la composición farmacéutica de la invención.
El péptido, la proteína de fusión, la nanopartícula, la partícula similar a virus, el anticuerpo, el ácido nucleico, la construcción génica, el vector, la célula y la composición farmacéutica de la invención se han definido anteriormente. Todas las realizaciones particulares y preferidas del péptido, la proteína de fusión, la nanopartícula, el anticuerpo, el ácido nucleico, la construcción génica, el vector, la célula y la composición farmacéutica de la invención son completamente aplicables a ios usos médicos de la invención.
El término "tratamiento’', como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier proceso, acción, aplicación, terapia o similar, donde a un sujeto (o paciente), incluyendo un ser humano, se le proporciona asistencia médica con el fin de mejorar la afección del sujeto, directa o indirectamente, o ralentizar la progresión de una afección o trastorno en el sujeto, o mejorar al menos un síntoma de la enfermedad o trastorno en tratamiento.
El término "prevención", como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad del péptido, la proteína de fusión, la nanopartícula, el anticuerpo, el ácido nucleico, la construcción génica, el vector, la célula y la composición farmacéutica de la invención, para prevenir, minimizar o dificultar la progresión de una enfermedad.
El término "paciente" o "sujeto", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier animal, preferentemente un mamífero, e incluye, entre otros, animales domésticos y de granja, primates y seres humanos, por ejemplo, seres humanos, primates no humanos, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, perros, gatos o roedores como ratas y ratones. En una realización preferida, el sujeto es un ser humano de cualquier edad o raza.
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se ha definido anteriormente.
En algunas realizaciones, el medicamento de la invención se usa como una coterapia tai como, por ejemplo, la administración junto con radiación, cirugía u otros productos quimioterápicos. En algunas realizaciones, el medicamento se administra en combinación con un agente anticancerosos adicional. En la técnica se conoce una amplia diversidad de agentes anticancerosos {es decir, antineoplásicos) e incluyen, por ejemplo, agentes alquilantes, antimetabolitos, agentes antineoplásicos naturales, agentes antineoplásicos hormonales, inhibidores de angiogénesis, reactivos de diferenciación, inhibidores de ARN, anticuerpos o agentes inmunoterápicos, agentes de terapia génica, inhibidores enzimáticos de molécula pequeña, modificadores de respuesta biológica y agentes antimetastásicos.
En algunas realizaciones, el medicamento de la invención puede usarse corno una terapia adyuvante (es decir, tratamiento adicional).
Algunas realizaciones se refieren a la administración del medicamento de la invención como terapia neoadyuvante, que se administra antes de un tratamiento primario.
La expresión "enfermedad inflamatoria crónica" también conocida como EIC, como se usa en el presente documento, se refiere a una enfermedad caracterizada por la inflamación prolongada debida a patógenos no degradadles, infección vírica, cuerpos extraños persistentes o reacciones autoinmunitarias que persisten hasta muchos meses o años, y donde ios resultados son la destrucción, la fibrosis y/o la necrosis del tejido. Son ejemplos no limitantes de enfermedad inflamatoria crónica: artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (lupus), esclerosis múltiple, aterosclerosis, artritis psoriásica (APs), enfermedad inflamatoria intestinal (Eli) que incluye colitis ulcerosa (CU) y enfermedad de Crohn (EC), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), etc.
La expresión "enfermedad autoinmunitaria" como se usa en el presente documento, se refiere a una afección que surge de una respuesta inmunitaria anormal a una parte normal del cuerpo. Los ejemplos no limitantes de enfermedades autoinmunitarias incluyen: artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (lupus), enfermedad inflamatoria intestinal (Eli) que incluye colitis ulcerosa (CU) y enfermedad de Crohn (EC), esclerosis múltiple (EM), diabetes mellitus de tipo 1 , síndrome de Guillain-Barre, poiineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, psoriasis, enfermedad de Graves, tiroiditls de Hashimoto, miastenia grave, vasculitis, etc.
El término "ínmunodeficiencia", como se usa en el presente documento, se refiere a una afección en la que la capacidad del sistema inmunitario para combatir las enfermedades infecciosas y el cáncer está comprometida o completamente ausente. La mayoría de los casos de Ínmunodeficiencia se adquieren ("secundarios") debido a factores extrínsecos que afectan al sistema inmunitario del paciente, los ejemplos de estos factores extrínsecos incluyen la infección por VIH, los extremos de edad y los factores ambientales, tales como la nutrición. A veces puede conseguirse mediante la inmunosupresión por algunos fármacos, tales como ios esferoides, ya sea como un efecto adverso o el objetivo previsto del tratamiento. En esta definición se incluyen los defectos intrínsecos en su sistema inmunitario o inmunodeficiencias primarias. Una persona inmunocomprometida puede ser particularmente vulnerable a las infecciones oportunistas. La Ínmunodeficiencia también disminuye la inmunosupervisión contra el cáncer, en la que el sistema inmunitario detecta las células corporales y destruye las neoplásicas. Los ejemplos de trastornos de ínmunodeficiencia primaria incluyen, de manera no limitante: agammagíobulinemia ligada a X (XLA, por sus siglas en inglés), Inmunodeficiencia variable común (IDCV, por sus siglas en inglés), Inmunodeficiencia combinada grave (IDCG, por sus siglas en inglés), etc. Los ejemplos no limitantes de trastornos de inmunodeficiencia secundaria incluyen: quemaduras graves, quimioterapia, radiación, diabetes, desnutrición, intoxicación por metales, etc. Los ejemplos no limitantes de enfermedades de inmunodeficiencia secundaria incluyen: SIDA, cánceres del sistema inmunitario (leucemia), enfermedades del inmunocomplejo (hepatitis vírica), mieloma múltiple, etc.
El término "cáncer", como se usa en el presente documento, se refiere a una enfermedad caracterizada por la división celular desconsolada (o por un aumento de la supervivencia o la resistencia a la apoptosis) y por la capacidad de dichas células 38 para invadir otros tejidos vecinos (invasión) y diseminarse a otras áreas dei cuerpo donde las células no se localizan normalmente (metástasis) a través de los vasos linfáticos y sanguíneos, circular a través dei torrente sanguíneo y después invadir tejidos normales en otras partes del cuerpo. Dependiendo de si pueden diseminarse o no por invasión y metástasis, los tumores se clasifican como benignos o malignos: ios tumores benignos son tumores que no pueden diseminarse por invasión o metástasis, es decir, que solo crecen localmente; mientras que los tumores malignos son tumores que son capaces de diseminarse por invasión y metástasis. Los procesos biológicos que se sabe que están relacionados con el cáncer incluyen la angiogénesis, la infiltración de células inmunitarias, la migración celular y la metástasis. Como se usa en el presente documento, el término cáncer incluye, pero no se limita a, los siguientes tipos de cáncer: cáncer de mama; cáncer de vías biliares; cáncer de vejiga; cáncer de cerebro que incluye glioblastomas y meduioblastomas; cáncer de cuello uterino; coriocarcinoma; cáncer de colon; cáncer endometrial; cáncer de esófago; cáncer gástrico; neoplasias hematológicas que incluyen leucemia linfocítica aguda y mielógena; leucemia/linfoma linfobiástico agudo de linfocitos T; leucemia de células pilosas; leucemia mielógena crónica, mieloma múltiple; leucemias asociadas al SIDA y leucemia/linfoma de linfocitos T adultos; neoplasias intraepiteliales que incluyen la enfermedad de Bowen y la enfermedad de Paget; cáncer de hígado; cáncer de pulmón; linfomas, que incluyen la enfermedad de Hodgkin y linfomas linfocíticos; neuroblastomas; cáncer oral que incluye carcinoma de células escamosas; cáncer de ovario, que incluye ios que surgen de células epiteliales, células dei estroma, células germinales y células mesenquimales; cáncer de páncreas; cáncer de próstata; cáncer de recto; sarcomas que incluyen ieiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, liposarcoma, fibrosarcoma y osteosarcoma; cáncer de piel que incluye melanoma, carcinoma de células de Merkel, sarcoma de Kaposi, carcinoma de células básales y cáncer de células escamosas; cáncer de testículo que incluye tumores germinales tales como seminoma, no seminoma (teratomas, coriocarcinomas), tumores del estroma y tumores de células germinales; cáncer de tiroides que incluye adenocarcinoma de tiroides y carcinoma medular: y cáncer renal que incluye adenocarcinoma y tumor de Wilms.
El péptido, la proteína de fusión, la nanopartícula, el anticuerpo, el ácido nucleico, la construcción génica, el vector, la célula y la composición farmacéutica de la invención pueden administrarse por cualquier vía adecuada, por ejemplo, la vía oral, nasal, ocular, tópica, intradérmica, intracraneal o intravenosa. La vía de administración preferida es la vía oral, nasal, ocular o intradérmica.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido habitualmente por un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención. Los métodos y materiales similares o equivalentes a ios que se describen en el presente documento pueden usarse en la práctica de la presente invención. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, la palabra "comprender" y sus variaciones no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o etapas. Serán evidentes para los expertos en la materia objetos, ventajas y características adicionales de la invención tras el examen de la descripción o pueden aprenderse mediante la práctica de ¡a invención. La invención se describe en el presente documento con más detalle por medio de los siguientes ejemplos que han de considerarse meramente ilustrativos y no limitantes del alcance de la invención.
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Figura 1. CXCR4 forma nanoagregados y muestra diversos tipos de movimiento en la superficie de los iínlociíos T. (A-B) Imágenes de STED representativas de CXCR4 en células de estado estacionario, linfocitos T (A) y células CD4÷ Jurkat (B) junto con ampliaciones en regiones de la membrana específicas (recuadros cuadrados). La escala del pseudo-código de color indica la intensidad de manchas individuales marcadas con CXCR4/AF488, desde el dímero (color gris oscuro) hasta el más claro (de color gris a color blanco). La distribución de intensidad (representación superior) de manchas de CXCR4 individuales en la membrana celular (línea continua) y de anticuerpos individuales unidos no específicamente a vidrio (línea discontinua), se obtiene a partir de imágenes de STED. Se obtienen histogramas de probabilidad (representación inferior) de la distribución del receptor CXCR4 a partir del análisis de los datos de distribución de intensidad. 2076 manchas para células CD4+ Jurkat y 2575 manchas para linfocitos T de 30 células en 2-3 experimentos de STED independientes. (C) Trayectorias representativas (i-confinada, N-Browniano/libre, III- fransporfe directo) de partículas de CXCR4-AcGFP que difunden en la membrana en momentos indicados, detectadas por SPT-TIRF en células JKCD4 en reposo. La posición centroide de la mancha (círculo) se rastreó (línea negra). (D) Porcentaje de trayectorias de CXCR4-AcGFP clasificadas como inmóviles o móviles. 593 trayectorias de 22 células JKCD4 en tres experimentos independientes. (E) Gráficos de DCM representativos de trayectorias individuales de CXCR4~AcGFP que muestran diferentes tipos de movimiento. (F) Porcentaje de trayectorias individuales que presentan diferentes tipos de movimiento, clasificadas por EEM. 192 trayectorias de 22 células en tres experimentos independientes. (G) Coeficientes de difusión de lapsos de tiempo cortos (D1 -4) de las trayectorias individuales analizadas en F) con la mediana indicada. (H) Distribución de intensidad de trayectorias de CXCR4-AcGFP individuales, promediada en los primeros 20 marcos y restada del fondo. 595 trayectorias en 5 experimentos independientes, la media se indica en la figura. (!) Porcentaje de! número de receptores/partículas extraídos de la distribución de la intensidad de trayectorias de CXCR4-AcGFP individuales (H) (véanse los métodos). (J) Porcentaje de etapas discretas de fotoblanqueo de trayectorias de CXCR4-AcGFP individuales. 151 trayectorias de 8 células diferentes en dos experimentos independientes.
Figura 2, La unión a CXCL12 modula la dinámica de CXCR4 y pontencía el nanoagrupa iento del receptor. (A-F) Análisis por SPT de CXCR4-AcGFP en células JKCD4 en cubreobjetos recubiertos con FN o FN+CXCL12. (A) Coeficiente de difusión (DI -4) de trayectorias individuales, con la mediana indicada. 427 trayectorias en 23 células en condiciones de equilibrio (FN) y 424 trayectorias en 24 células cultivadas en placas en FN+CXGL12 (n = 3; * p < 0,05). (B) Porcentaje de trayectorias móviles e inmóviles en la membrana celular. 593 trayectorias en 23 células (FN); 851 trayectorias en 24 células (FN÷GXGL12) (n = 3, ** p < 0,001 ). (G) Porcentaje de la cantidad de receptores/partículas. 595 trayectorias a partir de 23 células (FN) y 673 trayectorias a partir de 24 células (FN+GXGL12), en 5 experimentos independientes). (D) Porcentaje de partículas móviles e inmóviles analizadas como en B), en función del tamaño de partícula (monómero: 1 ; dímero: 2, nanoagregado: ³ 3 receptores/partícula) (E) Porcentaje de trayectorias de partícula única de células estimuladas con CXCL12, clasificadas por el tipo de movimiento usando análisis por EEM (254 trayectorias en 24 células de 3 experimentos independientes). (F) D1 -4 de trayectorias individuales que muestran un movimiento confinado (izquierda) o libre (derecha) asociado a su tamaño. (* p < 0,05, ** p < 0,001 ). (G-H) imágenes representativas de STED de GXGR4 en células Jurkat GD4÷ (G) y iinfocitos T (H) activados con CXCL12, con ampliaciones en regiones de membrana específicas (cuadrado). Barra de escala: 1 pm. Distribución de probabilidad del número de receptores/mancha (parcelas inferiores) para ios dos tipos celulares diferentes, en condiciones de estado estacionario (barra gris) y tras la estimulación con GXGL12 (barra blanca). 1446 manchas individuales para células CD4+ Jurkat y 1849 para iinfocitos T, 30 células en 2-3 experimentos de STED independientes. Figura 3. La región íransmembrana CXCR4 VI tiene un pape! clave en el agrupamiento de receptores. (A) Esquema de un homodímero de CXCR4 modelado en la estructura cristalina de CXCR4 resuelta (PDBi 30E8), generado en el servidor SWISS-MODEL (https: //swissmode!. expasy.org/). Las regiones transmembrana que se prevén implicadas en la oiigomerización de CXCR4 se representan en color oscuro. (B) Se preincubaron células CD4+ Jurkat con péptidos indicados o con el péptido diiuyente (DMSO, control) y se les permitió migrar (CXCL12). Los datos se muestran como la media ± DT (n = 5; *** p <0,0001 ). (C) Se preincubaron células 293T, cotransfectadas transitoriamente a una relación fija de CXGR4-YFP:CXCR4-CFP 1 :1 , con DMSO (control) o con los péptidos 221 TMV o 239TMVI y se evaluó la eficacia de FREI. Los datos se muestran corno media ± DT (n = 3, *** p <0,0001 ). (D) Distribución de intensidades (unidades arbitrarias; u.a.) de trayectorias de CXCR4 individuales en células JKCD4 no estimuladas y estimuladas con CXCL12, pretratadas con 221 TMV, péptidos 239TMVI o DMSO (control) (221TMV basa! 1750 trayectorias a partir de 71 células; 239TMVI basa! 916 a partir de 62 células; control basal 1031 a partir de 56 células; 221 TMV estimulado por CXCL12 1 157 a partir de 58 células; 239TMVI estimulado por CXCL12 1 104 a partir de 59 células; control estimulado por CXCL12 1200 trayectorias a partir de 48 células). Media indicada con barra horizontal (n = 3; no significativo, p > 0,05, *** p < 0,0001 ). (E) A la izquierda, restos en la región TMVi (representación de barra, color oscuro) que se prevé que están implicados en la interfaz de nanoagrupamiento de CXCR4 (TMViwt). Derecha, restos mutados (TMVImut). (F) Curvas de saturación de FRET usando células 293T transfectadas transitoriamente con una cantidad constante de CXCR4wt-GFP o CXCR4mut~CFP y cantidades crecientes de CXGR4wt-YFP o GXGR4mut-YFP Datos ajustados a la ecuación de regresión no lineal asumiendo un sitio de unión. Los valores de FRETmáx y FRET50 se compararon mediante un ensayo F de suma de cuadrados extra (n = 4-6, * p < 0,05). (G) Porcentaje de receptor/partícula de JKCD4 wt no estimulado (595 trayectorias de 22 células n = 3) y células JKGD4 mut (996 trayectorias de 24 células, n = 3). Para facilitar la comparación, la Fig.1 1 (JKCD4 wt) también se reproduce en la figura. (H) Células como en G) o J células K-CD4 mut (barras sombreadas). Porcentaje de receptores/partículas a partir de células estimuladas por CXCL12 (CXCR4wt: 669 trayectorias de 24 células; GXGR4mut, 420 trayectorias de 22 células; JK-GD4 mut, 392 trayectorias de 22 células, n = 3). Para facilitar el análisis comparativo, la Fig. 2C (JKCD4 wt, FN+CXCL12) se reproduce aquí. (I) Se muestra la distribución Di -4 de partículas de CXCR4 de estado estacionario o estimuladas con CXCL12 con ¡a mediana indicada (horizontal ¡ine), usando células JK-CD4 muí o CD4+ Jurkat electroporadas con un ARNip no diana (control) y con CXCR4mut-AcGFP (células JKcCD4 mut; JKcCD4 mut en estado estacionario 792 trayectorias de 26 células; JK-CD4 1 13 en estado estacionario a partir de 14 células; JKcCD4 mut estimuladas con CXCL12 281 a partir de 22 células; JK-CD4 mut estimuladas con CXCL12 272 trayectorias a partir de 22 células; n = 3). (J) Porcentaje de trayectorias móviles e inmóviles de CXCR4 (como en la Figura 2B) en células JK-CD4 mut no estimuladas (336 trayectorias a partir de 22 células, n = 3).
Figura 4. El receptor muíante CXCR4 de oligomerlzación deficiente y el péptido 239T1VIVI reducen las respuestas celulares mediadas por CXCL12. (A) Análisis por inmunotransferencia de la asociación de la proteína de Gai a células KG1 a transfectadas con CXCR4wt-AcGFP o GXGR4mut-AcGFP en respuesta a GXGL12. Parte inferior, datos de densitometría con media ± DT (n = 3). (B) Células 293T no estimuladas y estimuladas con CXCL12 cotransfectadas transitoriamente a una relación Gaí-R!uc:GXCR4mut-YFP fija. El gráfico muestra cambios en la eficiencia de la relación de BRET (n = 3; no significativo, p > 0,05). (G) Respuesta de flujo de Ca2÷ a GXGL12 en células 2931 transfectadas con GXGR4wt-CFP o CXCR4mut-CFP (n = 3; * p < 0,05) (D) Análisis de inmunotransferencia de pERK1 /2 y -pAkt en respuesta a CXCL12 en células como en A. Se usa Akt total como control de carga. (E) Quimiotaxis inducida por GXCL12 de células JK-GD4 wt y JK-GD4 mut (n = 3; * p < 0,05). (F) DIC de lapsos de tiempo fusionados (indicados en s) e imágenes de fluorescencia de células representativas JK-CD4 wt y JK-CD4 mut como en E, en bicapas iipídicas que contienen ICAM1 recubiertas con CXCL12. Puntas de flecha, células controladas en cada condición. Perfiles de área de contacto celular
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estimados por IRM. (G) Frecuencia de adherencia de las células como en F) a bicapas iipídicas recubiertas con CXCL12 que contienen IGAM-1 (n = 3; *** p < 0,0001 ). (H) Migración inducida por CXGL12 de neutrófilos de ratón pretratados con 221 TMV, péptidos 239TMVI, el diluyente (DMSO) o PTx (n = 3; ** p < 0,001 , *** p £ 0,0001 ). (!) Guantificación de neutrófilos marcados con CMFDA transferidos adoptivamente obtenidos de médula ósea de ratones C57BL/6 receptores 1 hora después de la transferencia celular. Antes de la transferencia, los neutrófilos se preincubaron corno en H (n = 3; ** p < 0,001 , *** p < 0,0001 ).
Figura 5. Homología de secuencia en la región TSVfVI KTTVILfLA de la familia de receptores de quimiocinas. Alineación de secuencias múltiples de la región correspondiente a KTTVILILA (SEQ ID NO: 2) en todos los receptores de quimiocinas, realizada con la prestación https://weblogo.berkeley.edu/1ogo.cgi. Aunque ¡os restos de aminoácidos no se conservan, esta región se conserva estructuraimente en otros miembros de la familia de receptores de quimiocinas.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. CXCR4 muestra diferentes tipos de trayectorias en la superficie de ios linfocitos T.
Los inventores utilizaron microscopía de agotamiento de emisión estimulada (STED, stimulated emission depletion) para visualizar la oligomerización de CXCR4 en linfocitos T vírgenes o nafve (linfocitos T) y en ¡a estirpe de linfocitos T GD4+ Jurkat (JKCD4+). La mayoría de ¡os receptores se encontraron en forma de monómeros y dímeros (~80% en linfocitos T y -35% en células JKCD4+), pero también se detectaron nanoagrupamientos ( nanoclusters ), complejos formados por más de tres receptores (-20% y 65%, respectivamente) (Figura 1A-B) Para evaluar la dinámica de GXGR4, ios inventores usaron el seguimiento de partículas individuales (SPT, por sus siglas en inglés) en el modo de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) y transfectaron células JKCD4+ con CXCR4 fusionadas con la proteína monomérica AcGFP (JKCD4+- X4). Primero se estimaron ¡as densidades de partículas apropiadas para ¡a obtención de imágenes TIRF usando AcGFP purificado inmovilizado en vidrio. Solo ¡as películas con densidades de partículas < 4,5 partículas/pm2 se usaron para detectar y rastrear CXCR4. Se reconstruyeron trayectorias de ¡os receptores usando un algoritmo de rastreo de partículas para seguir partículas individuales y capturar su fusión y separación de otras partículas (Figuras 1 G, D). En estado estacionario, el -28% de ¡as partículas de GXGR4 eran inmóviles (Figuras 1 E); los receptores restantes mostraron perfiles de difusión distintos (Figuras 1 F), como se demostró mediante diagramas de desplazamiento cuadrado medio (DGM) (Manzo G y García-Parajo MF (2015) Rep Prog Phys 78 (12): 124601 ) y se clasificaron usando el espectro de escalado de momento (EEM) (Ewers H et al. (2005) Proc Nati Acad Sci USA 102 (42): 151 10-151 15). La mayoría de estas partículas móviles (-78%) mostraron una movilidad restringida dentro de regiones de -200 nm; el -15% exhibieron difusión sin movimiento Browniano y el -7% eran partículas con movimiento dirigido (Figuras 1 G). La mediana del coeficiente de difusión (DI-4) para las partículas de GXCR4 varió de 0,0037 pm2s 1 para receptores confinados a 0,0094 pm2s 1 para CXCR4 con movimiento de transporte directo (Figura 1 H). Para estimar ¡a estequiometría puntual, se midió la intensidad de fluorescencia promedio para los primeros 50 marcos de cada trayectoria (Figura 1 1} y se usó como referencia la intensidad de la proteína monomérica CD86-AcGFP (Caiebiro D et al. (2013) Proc Nat / Acad Sci USA 1 10 (2): 743-748). La mayoría de ias partículas CXCR4 eran monómeros (-23 %), dímeros (-47 %) y trímeros (-19 %), aunque también se identificaron complejos de 4 a 6 receptores (-1 % eran hexámeros) (Figura 1 J).
Se descartó la influencia de CXCR4 expresado endógenamente en el sistema celular, ya que el tamaño de agrupamiento y los parámetros dinámicos fueron similares cuando se analizaron las células JKCD4+ en las que CXCR4 endógeno esfaba regulado negativamente por ARNip antes de la transfección con CXCR4- AcGFP (JKCD4+s¡). Los datos indican que los monómeros GXCR4, los dímeros y los nanoagrupamientos pequeños dinámicos coexisten en la membrana de ios linfocitos T.
Ejemplo 2. La unión de CXCL12 desencadena el agrupamiento de CXCR4 y modula la dinámica de las partículas.
Gomo la unión de CXCL12 al receptor promueve cambios conformacionales en complejos de CXGR4 y aumenta el número de dímeros de CXCR4 (Schiraidi M et ai. (2012) J Exp Med 209 (3): 551 -5639), se usó SPT-TIRFM para evaluar el efecto del ligando sobre la dinámica de CXCR4. Se cultivaron en placas células JKCD4+-X4 en placas recubiertas con fibronectina o fibronectina/CXCL12 y se siguió la movilidad lateral de ias partículas individuales a lo largo del tiempo. CXCL12 promovió una reducción significativa en la difusividad total de CXCR4 (basal, DI -4: Q,0Q47pm2s 1 ; CXCL12, 0,0042 pm2s 1) y aumentó el porcentaje de partículas inmóviles del -27 % (basal) al -35 % (GXCL12) (Figuras 2A, B). Estos datos coinciden con los publicados para otros GPGR después de la activación del agonista (Baker A et al. (2007) Eur Bíophys J 36 (8): 849-860). También se detectó un mayor número de nanoagrupamientos más grandes en la membrana de células activadas con CXCL12 (un -70 % de nanoagrupamientos con > 3 receptores, en comparación con el -30 % de nanoagrupamientos similares en condiciones básales (Figura 2G); un -22 % de partículas inmóviles eran nanoagrupamientos formados por > 3 receptores/parfícula en comparación con el -7 % en estado estacionario (Figura 2D). Estas diferencias fueron incluso mayores cuando solo se tuvieron en cuenta nanoagrupamientos más grandes (4-7 receptores/partícula). Estos resultados indican un nanoagrupamiento de receptor desencadenado por CXCL12, que afecta a la dinámica de CXCR4 en la membrana celular. Usando STED, se validó la estimulación por CXCL12 del agrupamiento de receptores en células JKCD4 y en liníocltos T; CXCL12 promovió el agrupamiento de CXCR4 hasta un máximo de 10 a 18 receptores/partícula (Figuras 2G-H). El ligando redujo de este modo el porcentaje de monómeros y dímeros a expensas de aumentar el número de nanoagrupamientos grandes y promover su inmovilización.
Sin embargo, el agrupamiento mediado por CXCL12 no se alteró cuando las células se pretrataron con PitStop2 o brefeldina A, fármacos que bloquean ios pocilios recubiertos de clatrina y el tráfico de vesículas, respectivamente (Figuras 2I-J), lo que indica que el agrupamiento de receptores mediado por ligando no se asociaba a procesos de internalización.
Ejemplo 3. K239E, V2424 y L248A en CXCR4 TIVI VI son restos esenciales para el agrupamiento de! receptor y las funciones inducidas por CXCL12.
La estructura cristalina de CXCR4 muestra un homodímero cuya interfaz está localizada en las regiones transmembrana (Wu B et al. (2010) Science 330 (8007): 1066-1071 ). Los inventores predijeron de este modo oiigómeros como complejos formados por entidades diméricas y realizando un análisis informático para determinar ios restos en las regiones TM de CXCR4 implicadas en la oiigomerizacíón del receptor sin alterar los homodímeros del receptor. Los análisis revelaron varios péptidos transmembrana en TMIV, TMV, TMVI y TMVII (Figura 3A), que se exploraron para determinar su capacidad para antagonizar la migración celular mediada por CXCL12. El péptido basado en CXCR4 TMVI 239KPTVILILA247 (SEQ ID NO: 5) (239TMVI), que bloqueó la migración de la célula JKCD4 + mediada por CXCL12 (Figura 3B), se seleccionó para estudios adicionales. Los péptidos restantes no alteraron las funciones mediadas por CXCR4, lo que confirma la especificidad del efecto. El péptido sintético TMV 221 !IISKLSH228 (SEQ ID NO: 10) (221TMV) se eligió como control para experimentos posteriores (Figura 3B). El tratamiento con 239TMVI promovió específicamente un aumento significativo en la eficacia de FRET de homodímeros de CXCR4, lo que confirmó su interacción con CXCR4 sin alterar ios complejos homodiméricos. El tratamiento con control 221TMV no modificó la eficiencia de FREI basa! (Figura 3C) Ambos péptidos se incorporaron a la membrana celular, como se muestra mediante citomeíría de flujo usando péptidos marcados con biofina.
Sobre la base de los efectos in vitro del péptido TMVI, los inventores exploraron informáticamente los restos de aminoácidos de 239TMV! que tenían sus cadenas laterales en el lado externo del complejo receptor (Figura 3D). Los inventores generaron un muíante puntual triple (sustituciones K239E, V242A y L246A; X4mut), en la región de contacto teórico de oiigómeros de CXCR4 (Figura 3D), que se evaluó en detalle. En células JKCD4+si transfectadas transitoriamente con CXCR4mut (X4mut) y CXCR4 de tipo silvestre (X4wt), la tinción anti-CXCR4 demostró que los dos receptores se expresaban por igual en las membranas celulares (Figura 3E), CXCL12 unido (KD de X4wt: 0,60 nM, KD de X4mut: 0,62 nM) y se internalizaban de manera similar en respuesta ai ligando (Figura 3F). También formaron homodímeros y heterodímeros, como se muestra mediante el análisis por FRET (Figura 3G). Sin embargo, sus valores de FRETmáx y FRET50 indicaron que los homodímeros X4wt y X4mut adoptaban conformaciones distintas (Figura 3G y Tabla 1 ).
El análisis por SPT-TÍRF de las células JKCD4+ transfectadas indicó que en el estado estacionario el tamaño de partícula de X4mut era similar ai de X4wt (Figura 3H). Por el contrario, mientras que CXCL12 promovió el agrupamiento de X4wt (~70 % de nanoagrupamientos), el efecto sobre X4mut fue más pequeño (-30 % de nanoagrupamientos) (Figura 3i). Guando se analizaron las células JKGD4+si-X4 ut, la reducción en el tamaño del agrupamiento fue incluso mayor a pesar de la activación de GXGL12; el agrupamiento se abolió en gran medida, y el >94 % de las partículas eran monómeros/dímeros (Figura 3i). La capacidad de X4mut y X4wt para heterodimerizarse podría explicar las diferencias más grandes detectadas en función de las células utilizadas. No se encontraron cambios en los perfiles de trayectoria entre ios dos receptores ni variación en el coeficiente de difusión X4mut entre células con o sin expresión de X4wt endógena (Figura 3J). En ausencia de CXCR4 endógeno, también se encontró el >90 % de partículas de X4mut móviles (Figura 3K). Estos datos indican fuertemente que K239, V242 y L246 participan en la oligomerización de CXCR4 y, por tanto, influyen en su movilidad lateral.
Para determinar los efectos funcionales del agrupamiento de CXCR4, se evaluó la activación de la proteína Gc¡¡ por X4mut. La ínmunoprecipitación y el análisis por inmunotransferencia mostraron que X4wt y X4mut asociaron Ga en respuesta a GXGL12 (Figura 4A). Sin embargo, las mediciones de BRET demostraron que tanto el CXCR4 de tipo silvestre como ei muíante se asociaron constitutivamente a Gal (Figura 4B). Aunque la unión de CXCL12 a X4wt promovió un cambio conformacional en ei complejo CXCR4/Ga¡ compatible con ia activación de cascada de señalización, no se observaron cambios marcados cuando CXCL12 se unió a X4mut (Figura 4B).
CXCL12 también promovió ei flujo de Ca2+ iníracelular en células que expresan X4wt o X4mut, aunque las respuestas a través de X4mut fueron significativamente más bajas (Figura 4C). También se observó que la activación mediada por CXCL12 de MAPK (ERK1 , 2) y PI3K (Akt) se vio notablemente comprometida en células que expresaban X4mut (Figura 4D) y que la migración celular hacia CXCL12, de este modo, se alteraba (Figura 4E). Usando el sistema de bicapa lipídica con 1CAM-1 incluido más CXCL12, se encontró que las células JKCD4+si que expresaban X4mut no migraron, se adhirieron deficientemente al sustrato y tenían un área de contacto más pequeña. Por el contrario, las células JKCD4+si que expresaban X4mut estaban polarizadas, con una extensión de borde de ataque aplanada y migraron a lo largo de la bicapa lipídica (Figuras 4F-G). Estos datos indicaron que los receptores no agrupados son capaces de promover el flujo de Ca2+ intracelular mediado por ligando, aunque el agrupamiento de receptores es necesario para la activación completa de la función de CXCR4.
Para determinar la relevancia in vivo del agrupamiento de CXCR4 mediado por CXCL12, se usó un modelo de eliminación de neutrófilos senescentes a la médula ósea. Algunos informes demostraron que este proceso depende del eje CXCR4/CXCL12 (Furze RC y Rankin SM (2008) Immunology 125 (3): 281 -288). Los neutrófilos de médula ósea murina se tiñeron con verde CelITracker (CMFDA) y se incubaron con el péptldo 239TMVI, 221TMV (control) o PTx como control positivo del bloqueo de la función de CXCR4. Primero se confirmó el antagonismo de 239TMV! en un ensayo de quimiotaxis in vitro de neutrófilos frente a gradientes de CXCL12 (Figura 4H). Los neutrófilos tratados se inyectaron después por vía intravenosa en ratones y se analizó la acumulación de células en la médula ósea después de 60 minutos mediante citometría de flujo. El tratamiento con 239TMV! inhibió la eliminación de neutrófilos en un ~62 %, mientras que los neutrófilos tratados con el péptido de control 22!TMV retornaron a la médula ósea, al igual que los controles (neutrófilos tratados con PBS o DMSO). Como control positivo de la inhibición, el tratamiento con PTx inhibió la eliminación en el ~48 % (Figura 4I).

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos X X2TX4ILIX8A (SEQ ID NO: 1) o su secuencia invertida, en el que
X! es K o E,
X2 es T o P,
X4 es V o A,
Xs es L o A, y
en el que dicho péptido es capaz de inhibir la señalización de CXCL12.
2. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1 , en el que el péptido tiene una longitud de entre 9 y 50 aminoácidos.
3. El péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el péptido tiene una longitud de 9 aminoácidos y en el que la secuencia de aminoácidos es KTTVILILA (SEQ ID NO: 2) o su secuencia invertida.
4. El péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el péptido tiene una longitud de 9 aminoácidos y en el que la secuencia de aminoácidos es KPTVILILA (SEQ ID NO: 5) o su secuencia invertida.
5. El péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el péptido tiene una longitud de 9 aminoácidos y en el que la secuencia de aminoácidos es ETTAILIAA (SEQ ID NO: 4) o su secuencia invertida.
6. El péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el péptido comprende al menos un aminoácido D.
7. Una proteína de fusión que comprende un péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y al menos un polipéptido heterólogo.
8. Una nanopartícula que comprende un péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 7.
9. Una partícula similar a virus que comprende un péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 7.
10. Uso del péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en un método de selección de compuestos, moléculas y/o composiciones que inhiben la respuesta celular mediada por quimiocinas.
11. Uso del péptido de acuerdo con la reivindicación 1 a 5 para el diseño de un peptidomimético que inhibe la respuesta celular mediada por quimiocinas.
12. Un método in vitro para la selección de compuestos, moléculas y/o composiciones que inhiben la respuesta celular mediada por quimiocinas o son útiles para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades inflamatorias crónicas, enfermedades autoinmunitarias, inmunodeficiencias o cáncer, en el que dicho método comprende:
a) poner en contacto un receptor de quimiocinas con un compuesto, molécula y/o composición que se ha de someter a ensayo,
b) analizar la unión entre el compuesto, molécula y/o composición que se ha de someter a ensayo y la región que consiste en el péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 dentro de la secuencia de aminoácidos del receptor de quimiocinas, y
c) clasificar el compuesto, molécula y/o composición como útil para inhibir la respuesta celular mediada por quimiocinas o útil para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades inflamatorias crónicas, enfermedades autoinmunitarias, inmunodeficiencias o cáncer, cuando se ha detectado una unión en la etapa b).
13. Uso de acuerdo con la reivindicación 11 , en el que la quimiocina es CXCL12.
14. Uso del péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 como diana farmacológica para la detección de compuestos, moléculas y/o composiciones útiles para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades inflamatorias crónicas, enfermedades autoinmunitarias, inmunodeficiencias o cáncer.
15. Anticuerpo que reconoce el péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 como antígeno.
16. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 7, o una nanopartícula de acuerdo con la reivindicación 8, o una partícula similar a virus de acuerdo con la reivindicación 9, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
17. Un péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 7, o una nanopartícula de acuerdo con la reivindicación 8, o una partícula similar a virus de acuerdo con la reivindicación 9, o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 10 para su uso en medicina.
18. Un péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 7, o una nanopartícula de acuerdo con la reivindicación 8, o una partícula similar a virus de acuerdo con la reivindicación 9, o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 10 para su uso en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades inflamatorias crónicas, enfermedades autoinmunitarias, inmunodeficiencias o cáncer.
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