ES2345040T3 - Receptores de la citoquina de clase ii y usos de los mismos. - Google Patents

Receptores de la citoquina de clase ii y usos de los mismos. Download PDF

Info

Publication number
ES2345040T3
ES2345040T3 ES02756665T ES02756665T ES2345040T3 ES 2345040 T3 ES2345040 T3 ES 2345040T3 ES 02756665 T ES02756665 T ES 02756665T ES 02756665 T ES02756665 T ES 02756665T ES 2345040 T3 ES2345040 T3 ES 2345040T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
modulator
baselineskip
receptor
cells
complex
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES02756665T
Other languages
English (en)
Inventor
Laure Dumoutier
Jean-Christophe Renauld
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wyeth LLC
Original Assignee
Wyeth LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=25436193&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2345040(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Wyeth LLC filed Critical Wyeth LLC
Application granted granted Critical
Publication of ES2345040T3 publication Critical patent/ES2345040T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/08—Antiseborrheics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/10—Anti-acne agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/715—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/20—Screening for compounds of potential therapeutic value cell-free systems

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Uso de un modulador de un complejo de IL-22R e IL-20Rβ, para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de un sujeto que padece un neoplasma o un queratoderma, en el que el modulador del complejo de IL-22R e IL-20 es una forma soluble de IL-22R o un anticuerpo contra IL-22R.

Description

Receptores de citoquina de clase II y usos de los mismos.
Campo de la invención
Esta invención se refiere a citocinas y al fenómeno del "intercambio de receptores". Más particularmente, se refiere a homólogos de IL-10 y a diversos receptores para estos homólogos, así como a su uso
Antecedentes y técnica anterior
La interleucina-10 ("IL-10" en lo sucesivo en este documento) es una citocina principal, antiinflamatoria, originalmente identificada por Moore, et al., Annu. Reverendo Immunol 19:683 (2001), como un factor que inhibe la producción de citocinas por linfocitos TH1 activados. Tras la identificación de IL-10, se identificaron varias citocinas adicionales, con diversos grados de homología con IL-10. La primera de estas se denominó "mda-7", un acrónimo de "gen 7 asociado con la diferenciación de melanocitos", porque su expresión se reguló positivamente durante la diferenciación in vitro de una línea celular de melanoma. Véase Jiang, et al., Oncogene 11:2477 (1995). Esta proteína presenta una identidad de secuencia del 22% con IL-10, pero originalmente no se reconoció como una proteína secretada. Se indica que la expresión de mda-7 provoca la detección del crecimiento irreversible de los tumores mediante la inducción de la apoptosis o diferenciación; sin embargo no está claro si este efecto es el resultado de un bucle paracrino que implica una ruta clásica de receptores de citocinas o de una forma citoplásmica de la molécula mda-7. Recientemente, Schaefer, et al., J. Immunol 166: 5859 (2001), identificaron el ortólogo murino de mda-7, como una citocina específica de TH2 y recibió el nombre de "proteína secretada inducida por IL-4" o "FISP". El homólogo de rata, identificado por Zhang, et al., J. Biol. Chem 275:24436 (2000), se conoce como "mob5" y se expresa por las células epiteliales intestinales al realizar la activación de ras. Zhang et al. han sugerido que mob5 desempeña un papel en la neoplasia mediada por el oncogén ras, a través de un bucle autocrino que implica un supuesto receptor de la superficie celular inducible por ras. Soo, et al., J. Cell Biochem. 74:1 (1999), han clonado el gen como un gen que se sobreexpresa en la piel durante la cicatrización de las heridas.
Los dos genes IL10 y mda7 se han asignado al mapa del cromosoma 1q31-32, que es una región donde se encuentran otros dos genes relacionados con IL-10, es decir, "IL19" e "IL20". IL-19 se expresa por las células mononucleares de sangre periférica activadas por LPS, según lo informado por Gallagher, et al., 1:442 de Immun de los genes (2000). En lo que respecta a IL-20, se han estudiado sus actividades biológicas usando ratones transgénicos que sobreexpresan la citocina, donde el gen está bajo el control de diversos promotores. Esos ratones, según lo informado por Blumberg, et al., Cell 104:9 (2001), se caracterizan por letalidad neonatal y anomalías en la piel, incluida la diferenciación epidérmica aberrante, que es una reminiscencia de lesiones de psoriasis en seres humanos. Blumberg, et al., han descrito el complejo del receptor de IL-20 como un heterodímero de dos subunidades del receptor huérfano de la citocina de clase II.
Específicamente, "CRF2-8," para la cual se ha sugerido el nombre "IL-20R\alpha" y "DIRS1", para la que se ha sugerido el nombre "IL-20R\beta".
La solicitud PCT WO 01/46261 revela antagonistas de IL-20 que son formas solubles de IL-de IL-20R\alpha y/o \beta o anticuerpos contra IL-20R\alpha o \beta y su uso en el tratamiento de enfermedades en las que IL-20 desempeña un papel como dermatitis atópica y psoriasis.
Otras dos citocinas IL-10, es decir, "AK155" e "IL-22" se localizan en el cromosoma humano 12q15, cerca del gen IFN-\gamma. Se sabe que AK155 se regula positivamente mediante infección por Herpes saimiri de los linfocitos T. Véase Knappe, et al., Virol J 74:3381 (2000). La molécula IL-22 se describió originalmente como un gen inducible por IL-9 y se denominó "IL-TIF," por "factor inducible derivado de células T relacionado con IL-10". Véase Dumoutier, et al., J. Immunol 164: 1814 (2000), así como la solicitud PCT WO 00/24758 y las solicitudes de prioridad de Estados Unidos contempladas en su interior. Las actividades de IL-22 incluyen la inducción de la respuesta de fase aguda, especialmente en hepatocitos y se median a través de un receptor heterodimérico que consiste en la subunidad CRF2-9/IL-22R y la cadena \beta del receptor de IL-20. Véase, por ejemplo, Dumoutier, et al., Proc. Natl Acad. Sci USA 97:10144 (2000); Kotenko, et al., J. Biol. Chem 276:2725 (2000); Xie, et al., J. Biol. Chem 275:31335 (2000). La inducción de la respuesta de fase aguda se asocia con inflamación, respuestas alérgicas y cáncer, sugiriendo así que la modulación de la interacción entre IL-9 e IL-22 está asociada con estas afecciones. Además de a su receptor celular, IL-22 se une a un miembro secretado de la familia de receptores de citocinas de clase II, denominado "IL-22BP", o "proteína de unión a IL-22" que actúa como un antagonista natural de IL-22. Véase Dumoutier, et al., J. Immunol 166:7090 (2001), Kotenko, et al., J. Immunol 166:7096 (2001).
De lo anterior deberá entenderse, que hay dos clases de receptores de citocinas, es decir, clase I y clase II. Dentro de los receptores de citocinas de clase I, el uso compartido de subunidades receptoras es un fenómeno bien reconocido. Como resultado de este fenómeno se han definido subfamilias, incluyendo las familias \betac, gp130 e IL-2R\gamma. Sin embargo, en el caso de los receptores de la clase II, el único ejemplo de un receptor compartido hasta ahora ha sido la cadena de IL-10R\beta, implicada en la señalización de IL-10 e IL-22. Véase Dumoutier, et al., Proc. Natl Acad. Sci USA 97:10144 (2000); Kotenko, et al., J. Biol. Chem 276: 2725 (2000); Xie, et al., J. Biol. Chem 275:31335 (2000). Es de interés para determinar qué clase de receptores de citocinas de clase II pueden y funcionan en relación con la unión a citocinas particulares. Se trata de una característica de la invención, que se describirá junto con otras características de la invención, a continuación en la divulgación.
En la solicitud WO 02/072607 publicada el 19 de septiembre de 2002 y que reivindica una fecha de prioridad de 9 de marzo de 2001 se describe, entre otras cosas, un polipéptido heterodimérico IL-22R/IL-20Rbeta soluble que comprende los dominios extracelulares de IL-22R e IL-20R unidos entre sí. El documento también describe el uso de este polipéptido heterodimérico en el tratamiento de la psoriasis, eczema, dermatitis atópica y por contacto.
Descripción detallada de realizaciones preferidas
Ejemplo 1
Para caracterizar las interacciones entre diversos homólogos y receptores de IL-10 que pertenecen a la familia de los receptores de citocinas de clase II, se llevaron a cabo una serie de experimentos.
Para hacer esto, se amplificaron las secuencias que codifican los homólogos de IL-10, mda-7, IL-19, IL-20 e IL-22 mediante RT-PCR, usando RNA procedente de células T que se habían estimulado con anticuerpos anti-CD3, usando técnicas convencionales y reconocidas en la técnica. La secuencia que codifica a IL-20 se amplificó a partir de ARN de la piel.
Las moléculas de ADNc resultantes se clonaron después en un plásmido disponible en el mercado, es decir, pCEP4, bajo el control de un promotor de CMV. Se produjeron las proteínas de fusión, denominadas "mda-7-flag," "IL-19-flag" e "IL-22-flag". Para dar más detalles, se prepararon construcciones de ADN colocando un cebador sentido en pCEP4 antes del sitio de clonación, así como un cebador antisentido, en el que se mutó el codón de TERMINACIÓN del ADN, junto con una secuencia de nucleótidos que codifica la primera parte de la molécula flag. Las secuencias utilizadas fueron:
gtccttgtag tcacctcccc cgagcttgta gaatttctg (SEC ID Nº: 1; usada con mda-7);
gtccttgtag tcacctcccc cagctgagga catacttc (SEC ID Nº: 2; usada con IL-19);
gtccttgtag tcacctcccc cttctgtctc ctccatcca (SEC ID Nº: 3; para IL-20); y
gtccttgtag tcacctcccc cgacgcaagc atttctcag (SEC ID Nº: 4; usada con IL-22).
Se preparó un primer producto PCR y después se realizó una segunda ampliación por PCR, usando el mismo cebador sentido, así como un oligonucleótido que contenía toda la secuencia flag, así como un sitio de restricción NheI, es decir,
actgctagct cacttgtcgt catcgtcctt gtagtcacct (SEC ID Nº: 5).
Esto permitió la clonación directa en el plásmido pCEP4.
Se secuenciaron los clones que contenían el ADNc de fusión a citocinas-flag, usando técnicas convencionales y un sistema basado en fluorescencia automatizado disponible en el mercado.
Las proteínas de fusión se produjeron después por expresión transitoria en células HEK293-EBNA. Para hacer esto, las células se sembraron en placas de 6 pocillos, a 8 x 10^{5} células/pocillo, un día antes de la transfección. Después, la transfección se llevó a cabo usando un método de lipofectamina convencional, siguiendo las instrucciones del fabricante, usando 2 \mug de ADN plasmidial.
Después de esto, las células se incubaron en 2 ml de medio, durante cuatro días, para maximizar la producción de proteínas.
La proteína recombinante se midió, mediante transferencia de Western, usando un anticuerpo específico para el péptido flag, combinando 10 \mul de sobrenadante celular con tampón de muestra de Laemmli, seguido de ebullición durante 5 minutos. Las proteínas se separaron en un gel de poliacrilamida al 14% prefabricado. Después de la transferencia, la membrana PVDF se bloqueó en leche descremada seca al 5%, se lavó y sondeó con anticuerpos anti-flag (25 mg/ml) biotinilados, seguido de incubación con estreptavidina peroxidasa (1/5000). La electroquimioluminiscencia se midió usando un sistema disponible en el mercado.
Las proteínas de fusión, mda-7-flag, IL-19-flag e IL-22-flag con un peso molecular heterogéneo, secretadas por las células HEK-293, varían de 23-30 kilodaltons. La heterogeneidad es muy probablemente resultado de una glicosilación. La proteína de fusión IL-20-flag se secretó como una sola banda, con un peso molecular de aproximadamente 18 kilodaltons. Esto sugiere que la proteína no estaba glicosilada.
Cuando se cuantificaron las señales de quimioluminiscencia, se observó que IL-19 e IL-22 se producían a niveles similares. Por el contrario, IL-20 y mda-7 se produjeron a niveles 7 veces menores.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2
Los sobrenadantes de los transfectantes de HEK-293, descritos anteriormente, se usaron para ensayar la interacción de las citocinas con los receptores de citocinas de clase II.
La línea celular HT-29 expresa endógenamente IL-22R e IL-10R\beta. Muestras de estas células se transfectaron con la construcción "pGRR5". Esta construcción, que contiene 5 copias del sitio de unión a STAT del gen FcyRI, insertada aguas arriba de un gen de luciferasa controlado por el promotor de TK, puede usarse para controlar la activación de STAT por IL-22. Se supuso que, si el mecanismo de acción de los otros homólogos de IL-22 era el mismo, podía usarse un ensayo similar para detectarlo.
Se realizó la electroporación de muestras de HT-29 (10^{7} células en 400 \mul, 250 V, 192 \Omega, 1.200 \muF) con 15 \mug de ofp-GRRS. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos, a 10^{5} células/pocillo, se incubaron durante 5 horas a 37ºC y después se preincubaron, o no, durante 1 hora con cualquier antisuero anti-IL22R (1/500) o anticuerpos anti-IL-10R\beta (6 \mug/ml). Las células se estimularon después, durante dos horas, con los diferentes sobrenadantes. La actividad luciferasa se midió usando materiales comercialmente disponibles.
\vskip1.000000\baselineskip
Los anticuerpos anti-hIL22R se prepararon mediante transfección de células de mastocitoma P815 con ADNc que codifica la IL-22R humana que se había incorporado en el plásmido puro pEF-BOS. Para dar más detalles, se amplificó ADNc de IL-22R procedente de una línea celular de hepatoma, es decir "Hep G2", usando un cebador sentido:
ggaggactag ttgccagccc cgatgagga (SEC ID Nº: 6). Este cebador sentido contiene un sitio de restricción para SpeI. También se uso un cebador antisentido que contenía un sitio de restricción para NotI, es decir:
gtgtggcggc cgcaggcatg ggattgacag c (SEC ID Nº: 7). Estos cebadores facilitan la clonación directa en el vector de expresión puro pEF-BOS. Véase Demoulin, et al., Mol. Cell Biol. 16: 4710 (1996).
\vskip1.000000\baselineskip
Los transfectantes se inyectaron en ratones DBA/2. Después del rechazo de los tumores por parte de los ratones, los sueros resultantes contenían titulaciones altas de anticuerpos anti-hIL-22 neutralizantes. Este es el antisuero indicado anteriormente.
Las células HT-29 eran sensibles a IL-22, pero no a otras citocinas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3
El trabajo del ejemplo 2 se amplió, cotransfectando las células HT-29 con pGRR5 y ADNc (15 \mug), para cada IL-20R\beta o IL-20R\alpha. En las otras formas, el experimento fue exactamente igual al del ejemplo 2.
Cuando las células HT-29 se transfectaron con ADNc de IL-20R\beta, tanto mda-7 como IL-20 indujeron la producción de luciferasa; sin embargo, este efecto se bloqueó completamente por el antisuero anti-IL-22R, indicando la formación de una IL-20R no observada anteriormente, que contenía IL-22R e IL-20R\beta.
Cuando las células HT-29 se transfectaron con ADNc tanto de IL-20R\alpha como de IL-20R\beta, se volvieron receptivas a todas las mda-7, IL-20 e IL-19. Además, la producción de luciferasa no se vio afectada por los anticuerpos anti-IL-22R, indicando que la actividad era independiente de la cadena.
La transfección solo con ADNc de IL-20R\alpha no provocó ninguna respuesta.
Estos resultados demuestran que IL-20R\beta es necesaria para el proceso descrito.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 4
Posteriormente se llevaron a cabo una serie de experimentos, para caracterizar los diferentes tipos de otros complejos receptores.
Las células HEK-293 expresan endogénamente IL-10R\beta, pero no expresan IL-22R. Las células no transfectadas se mezclaron con los sobrenadantes, como se ha descrito anteriormente y no respondieron a ninguno de los homólogos. Las muestras de las células HEK-29 se sembraron en placas de 24 pocillos a 2x10^{5} células/pocillo un día antes de la transfección y después se transfectaron usando 100 ng de pGRR5 y 500 ng de plásmido que codifica IL-20R\alpha, IL-20R\beta o IL-22R, usando el método de lipofectamina indicado en el ejemplo 1 y se ensayó con sobrenadantes, como se ha descrito anteriormente. El ADNc para IL-20R\alpha se obtuvo amplificando una biblioteca de placenta. Se amplificó un fragmento de ADNc que codifica el dominio extracelular usando:
gccggatcca tgcggccgct gccgctgccg (SEC ID Nº: 8), y
atcgctagcc atttagcctt gaactctgat g (SEC ID Nº: 9),
se digirió con la endonucleasa de restricción BamHI y se clonó en los sitios BamHI y EcoRV del vector pcDEF3, disponible en el mercado.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido resultante se denomina "pEF2-CRF2-8EC". Se generó el producto PCR que codifica los dominios transmembrana a intracelulares usando:
gtggctagcc tggtatgttt tgcccat (SEC ID Nº: 10), y
gcgaattcgt ctggcaaaca tttattga (SEC ID Nº: 11), que contienen los sitios NheI y EcoRI, respectivamente para facilitar la clonación en pEF2-CRF2-8EC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se amplificó el ADNc para IL-20R\beta procedente de células K562 de leucemia usando:
ttggctagca acaatgttct aggtc (SEC ID Nº: 12), y
tgggcgcggc cgcaaaccta tgagat (SEC ID Nº: 13), que contiene sitios NheI y NotI, para la clonación en pCEP4.
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando el ADNc de IL-22R se transfectó en las células, IL-22 indujo la producción de luciferasa y la fosforilación de STAT-3, pero no lo hizo ninguno de los homólogos. Las células transfectadas tanto con IL-22R como con IL-20R\beta respondían a IL-22, IL-20 y mda-7. La transfección sólo con IL-20R\beta no confirió ninguna sensibilidad. Cuando se transfirieron tanto IL-20R\alpha como IL-20R\beta, todas las mda-7, IL-19 e IL-20 provocaron respuestas, pero no lo hizo IL-22. No hubo respuesta cuando se usó solo IL-20R\alpha.
En cada uno de estos experimentos, la inducción de luciferasa se correlaciona con la fosforilación de STAT-3.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 5
Los experimentos indicados anteriormente, demostraron que a IL-20 y a mda-7 se unían dos complejos diferentes. Esto plantea la cuestión de si un complejo podría responder más favorablemente a una de las citocinas.
Para examinar esta cuestión, se transfectaron células HT-29, solo con IL-20R\beta o con IL-20R\beta e IL-20R\alpha, del mismo modo descrito anteriormente. Se usaron diversas diluciones de sobrenadantes (10%, 1% y 0,1%). La actividad luciferasa se midió dos horas después de la estimulación.
Cuando tanto IL-20R\alpha como IL-20R\beta se transfectaron en las células, las diluciones tanto de mda-7 como de IL-20 mostraron una curva de respuesta a la dosis similar, indicando sensibilidad similar para las dos citocinas. Cuando se transfectó solo IL-20R\beta, las células HT-29 mostraron mejor sensibilidad a mda-7 a diluciones no saturantes (sobrenadante al 1% y 0,1%), indicando que este tipo de complejo es más sensible a mda-7.
Cuando se repitieron los experimentos, usando células HEK-293, se obtuvieron resultados paralelos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 6
Los experimentos expuestos, anteriormente, demuestran que IL-22R puede asociarse tanto con IL-10R\beta como con IL-20R\beta, lo que sugiere que los complejos de IL-20R\beta e IL-22R podrían mediar una respuesta de IL-22. Los experimentos para ensayar esta posibilidad tuvieron en cuenta el hecho de que IL-10R\beta se expresa de manera ubicua. Por lo tanto, la función de IL-10R\beta se ensayó con un anticuerpo anti-IL-10R\beta. Se transfectaron células HT-29 con pGRR5 y ADNc de IL-20R\beta como se describe anteriormente. Los transfectantes se cultivaron, como también se describe anteriormente y después se incubaron con sobrenadante al 10% procedente de células HEK-293 que o bien se habían transfectado con ADNc de IL-22 o se habían transfectado de manera simulada. La actividad luciferasa se controló 2 horas después.
Los resultados demuestran que el anticuerpo anti-IL-10R\beta bloquea la actividad de IL-22 tanto en las células de control como en las células transfectadas con ADNc de IL-20R\beta. Esto indica que IL-20R\beta no puede sustituir a IL-10R\beta, cuando esto no es accesible para IL-22.
En experimentos relacionados, el anticuerpo no influyó en la actividad de mda-7 o IL-22, en las mismas células.
\newpage
Ejemplo 7
El trabajo de Dumoutier, et al., J. Immunol 166: 7090 (2001) y Kotenko, et al., J. Immunol 166: 7096(2001), demostró que IL-22BP se une a IL-22. No ha habido ningún otro informe sobre si esta molécula se une a otras citocinas. Como expone el mismo grado de homología con los dominios extracelulares de IL-22R e IL-R\alpha, se sugirió que IL-22BP también podría unirse a IL-20, o a otras moléculas.
Para ensayar esto, se recubrieron placas de poliestireno, activadas primero con anhídrido maleico, con anticuerpo anti-flag biotinilado incubando las placas, durante una noche, a 4ºC, con 12,5 \mug/ml del anticuerpo en PBS. Las placas se lavaron en tampón PBS que contenía Tween 20 (0,01%) y después se bloquearon con albúmina de suero bovina (en PBS al 1%) durante 2 horas, seguido de incubación durante 2 horas con 50 \mul de proteínas de fusión a citosinas flan, por medio de sobrenadantes HEK-293, producidos como se ha descrito anteriormente. Tras el lavado, se añadieron sobrenadantes de células al 10% que se habían transfectado con vectores que produjeron IL-22BP-Ig. Véase Dumoutier, et al., anteriormente, incorporado por referencia, para obtener información sobre la producción de esta proteína de fusión. El sobrenadante se retiró después de 2 horas, y se detectó cualquier IL-22BP-Ig unida añadiendo anticuerpos policlonales anti IgG3 de ratón, acoplados a peroxidasa. La actividad enzimática se determinó a continuación añadiendo 3, 3', 5, 5' tetrametilbencidina. La reacción se detuvo añadiendo 20 \mul de H_{2}SO_{4} (2 M). La reactividad se determinó mediante la lectura de los valores de absorbancia, a 450 nm.
Sólo IL-22 pudo unirse a IL-22BP-Ig. Ningún homólogo mostró actividad.
En experimentos relacionados, se determinó el efecto inhibitorio de homólogos de IL-10 en la unión de IL-22BP a IL-22. Para hacer esto, se recubrieron placas, como se ha descrito anteriormente, con IL-22 humana recombinante, según lo descrito por Dumoutier, et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 97: 10144 (2000). Después las placas se pusieron en contacto con IL-22BP-Ig (sobrenadante al 10%) que se había preincubado con diversos homólogos de IL-10, 2 horas antes del contacto con las placas. Se determinó cualquier unión a IL-22BP-Ig de la misma manera que se describe en el primer conjunto de experimentos. La interacción entre IL-22 e IL-22BP era detectable con el anticuerpo anti-Ig y sólo el sobrenadante de IL-22 pudo bloquear la unión a IL-22BP.
Los ejemplos anteriores describen, entre otras cosas, un nuevo complejo receptor de citocinas, que comprende una molécula IL-22R y una molécula IL-20R\beta. Como se muestra, anteriormente, este complejo receptor facilita la unión de citocinas tales como mda-7 e IL-20. Los ejemplos también muestran que los complejos que contienen IL-20R\alpha e IL-20R\beta se unen a estas citocinas, así como a IL-19. Ambos complejos pueden servir, entre otras cosas, como agentes para determinar si sus compañeros de unión respectivos están presentes o no en una muestra. Por ejemplo, la presente solicitud muestra que IL-20R\alpha e IL-20R\beta forman un receptor para mda-7, IL-19 e IL-20. Los complejos de IL-R22 e IL-R\beta forman un receptor para mda-7 e IL-20 pero no para IL-19. Por lo tanto, usando diversas combinaciones de estos receptores, puede determinarse que citocinas relacionadas con IL-10 están presentes o no en una muestra. Receptores tales como el complejo de IL-22R e IL-20R\beta o las variantes descritas a más adelante, pueden usarse en ensayos para determinar agentes y sustancias que, influyendo en la asociación o interacción entre IL-22R e IL-20R\beta, modulan in vivo la función de IL-20 y/o mda-7. De manera similar, pueden determinarse sustancias que, influyendo en la asociación o interacción entre IL-20R\alpha e IL-20R\beta o sus variantes, modulan in vivo la función de IL-19, IL-20 y mda-7. A continuación se describen con detalle formatos que pueden usarse en estos ensayos, pero en resumen pueden incluir la determinación de unión entre cadenas polipeptídicas componentes en presencia o ausencia de una sustancia de ensayo, y/o la determinación de la capacidad de un receptor de la invención para unirse al ligando, tal como una citocina, en presencia o ausencia de una sustancia del ensayo y/o la determinación de la capacidad de una sustancia de ensayo para modular una función o actividad biológica o celular en la que el receptor desempeña una función, cuya función o actividad puede estar influida por un compañero de unión como se describe anteriormente, seleccionado de los muestran unirse al receptor o puede implicar una actividad aguas abajo del receptor en una ruta biológica. Los métodos de ensayo que implican la determinación de la unión entre los componentes de un complejo receptor y el efecto de una sustancia de ensayo sobre dicha unión no necesitan necesariamente utilizar cadenas polipeptídicas de longitud completa. Por ejemplo, pueden emplearse fragmentos que conservan la capacidad de unirse al componente de la cadena polipeptídica acompañante del receptor. De hecho, como se describe más adelante, fragmentos de los propios polipéptidos representan una categoría de supuestos inhibidores, que pueden usarse para interferir con la unión entre los componentes del polipéptido receptor.
Adicionalmente, puede usarse un receptor o un fragmento aislado de este tipo que conserva la capacidad de unirse a citocinas, para determinar, en una muestra o material de ensayo, la presencia de una citosina a la cual se une, por ejemplo, IL-20 o mda-7 para un receptor que comprende IL-22R e IL-20R\beta e IL-19 o mda-7 para un receptor que comprende IL-20R\alpha/IL-20R\beta. Esto también se describe más adelante.
Para los métodos o usos en este documento puede proporcionarse un complejo receptor en una forma aislada mediante un método de purificación a partir de células que producen endógenamente las cadenas polipeptídicas del componente de interés. Sin embargo, más habitual y preferiblemente, el complejo receptor se proporciona por medio de la producción recombinante por expresión de moléculas de ácido nucleico que codifican en un sistema de expresión adecuado, seguido de purificación, por ejemplo, usando moléculas de anticuerpos de unión adecuadas o los propios ligandos así como mediante el uso de proteínas de fusión, tales como proteínas de fusión que comprenden una parte de los ligandos suficiente para unirse al receptor.
Las moléculas de ácido nucleico aislado que codifican las cadenas polipeptídicas del receptor utilizadas en este documento se encuentran disponibles en la técnica.
Dichas moléculas de ácido nucleico pueden usarse para proporcionar construcciones de vectores que codifican las cadenas polipeptídicas de los receptores identificados en este documento.
Los receptores que comprenden combinaciones de cadenas polipeptídicas como se identifica en este documento pueden producirse por co-expresión de moléculas de ácido nucleico que codifican las dos cadenas o pueden producirse por combinación de cadenas polipeptídicas producidas por separado y después dejando que se asocien. Las moléculas receptoras pueden estar glicosiladas o no glicosiladas, sulfatadas o no sulfatadas, así como en formas que implican otras modificaciones pos-traduccionales tales como, pero sin limitación, acetilación, acilación, fosforilación, palmitoilación, ubiquitinación, ADP-ribosilación, hidroxilación, adición de glucosilfosfatidilinositida, oxidación, reducción y así sucesivamente.
El experto en la materia puede emplear cualquier técnica disponible para la manipulación de las secuencias codificantes y la producción recombinante de polipéptidos y péptidos codificados para preparar las moléculas deseadas.
Generalmente, las moléculas de ácido nucleico empleadas para producir receptores y cadenas o fragmentos polipeptídicos de los mismos descritos en este documento, por ejemplo moléculas de ácido nucleico con distintas secuencias que codifican una nueva combinación de cadenas polipeptídicas receptoras como se identifica en este documento, se proporcionan como aislados, en forma aislada y/o purificada o sin material o sustancialmente sin material con el que se encuentran naturalmente asociadas, tales como moléculas que carecen o carecen sustancialmente de ácidos nucleicos que flanquean el gen en el genoma (por ejemplo humano), excepto posiblemente una o más secuencias reguladoras para la expresión. Las moléculas de ácido nucleico pueden ser total o parcialmente sintéticas e incluir ADN genómino, ADNc y ARN.
Un experto puede preparar fácilmente las moléculas de ácido nucleico que codifican los péptidos o polipéptidos descritos en este documento usando la información y las referencias contenidas en este documento y las técnicas conocidas en la técnica (por ejemplo, véase Sambrook y Russell "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001, y Ausubel et al, Current Protocols en Molecular Biology, John Wiley and Sons, 1992 o la última edición del mismo). Las moléculas de ácido nucleico que codifican fragmentos peptídicos pueden generarse y usarse en cualquier modo adecuado conocido por los expertos en la materia, incluyendo la extracción de las moléculas codificantes, la identificación de los sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción adecuados a ambos lados de la región a expresar, y la escisión de dicha región de las moléculas. La región puede estar unida operativamente a un promotor adecuado en un sistema de expresión convencional disponible en el mercado. Otra estrategia recombinante es amplificar la región del ADN de interés con cebadores de PCR adecuados.
Las modificaciones de las moléculas de ácido nucleico pueden realizarse, por ejemplo, usando mutagénesis dirigida, para conducir a la producción de polipéptidos modificados, ejemplo un alelo o una forma mutante de un polipéptido o para tener en cuenta el codón de preferencia en las células hospedadoras usadas para expresar el ácido nucleico.
En los métodos descritos en este documento, puede emplearse un polipéptido que sea una variante de la secuencia de aminoácidos, una isoforma alélica, un derivado o un mutante de una secuencia de aminoácidos de tipo silvestre definida, siempre que pueda unirse a una cadena polipeptídica y/o a un ligando compañero. Una variante, isoforma alélica, derivado o mutante puede comprender una secuencia de aminoácidos que comparte más del 60% de identidad de secuencia con las secuencias conocidas, más de aproximadamente el 70%, más de aproximadamente el 80%, más de aproximadamente el 90% o más de aproximadamente el 95%. La secuencia puede compartir más de aproximadamente el 70% de similitud, más del aproximadamente el 80% de similitud, más de aproximadamente el 90% de similitud o superior a aproximadamente el 95% de similitud con la secuencia de aminoácidos descrita en este documento. La comparación de secuencias puede realizarse a lo largo de la longitud completa de la secuencia de interés que se muestra en este documento o puede realizarse preferiblemente a lo largo de la longitud de un dominio de la proteína específico.
La "identidad" y "similitud" de aminoácidos en relación con las secuencias son términos familiares para los expertos en la materia de acuerdo con los principios establecidos y pueden determinarse por ejemplo usando el algoritmo GAP (Genetics Computer Group, Madison, WI). GAP usa el algoritmo de Needleman y Wunsch para alinear dos secuencias completas que maximiza el número de coincidencias y minimiza la cantidad de huecos. Generalmente se usan parámetros por defecto, con una penalización por creación de huecos = 12 y una penalización de extensión de huecos = 4. Puede preferirse el uso de GAP pero también pueden usarse otros algoritmos, por ejemplo BLAST (que usa el método de Altschul et al. (199) J. Mol. Biol. 215: 405-410), FASTA (que usa el método de Pearson y Lipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448), o el algoritmo de Smith-Waterman (Smith y Waterman (1981) J. Mol Biol. 147: 195-197), empleando generalmente parámetros por defecto.
Al nivel de ácido nucleico, la relación de la secuencia puede determinarse por medio de hibridación selectiva entre moléculas en condiciones rigurosas.
Por ejemplo, pueden realizarse hibridaciones, de acuerdo con el método de Sambrook usando una solución de hibridación que comprende: SSC 5X (en la que "SSC" = cloruro de sodio 0,15 M; citrato de sodio 0,15 M; pH 7), reactivo de Denhardt 5X, SDS al 0,5-1,0%, 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado, pirofosfato de sodio al 0,05% y hasta un 50% de formamida. La hibridación se realiza a 37-42ºC durante al menos seis horas. Después de la hibridación, los filtros se lavan de la siguiente manera: (1) 5 minutos a temperatura ambiente en SSC 2X y SDS al 1%; (2) 15 minutos a temperatura ambiente en SSC 2X y SDS al 0,1%; (3) 30 minutos-1 hora a 37ºC en SSC 1X y SDS al 1%; (4) 2 horas a 42-65ºC en SSC 1X y SDS al 1%, cambiando la solución cada 30 minutos.
Una fórmula común para calcular las condiciones rigurosas necesarias para conseguir la hibridación entre las moléculas de ácido nucleico de una homología de secuencia especifica es (Sambrook): T_{m} = 81,5ºC + 16,6 Log [Na+] + 0,41 (% G+C) - 0,63 (formamida %) - 600/Nº pb en el dúplex de ADN. Como ilustración de esta fórmula, usando [Na+] = [0,368] y formamida al 50%, con un contenido CG de un 42% y un tamaño promedio de sonda de 200 bases, la T_{m} es de 57ºC. Por cada 1% de disminución en la homología, la T_{m} de un dúplex de ADN disminuye 1-1,5ºC. Por tanto, usando una temperatura de hibridación de 42ºC se observarían dianas con una identidad de secuencia superior a aproximadamente el 75%.
Otras condiciones adecuadas incluyen, por ejemplo, para la detección de secuencias con una identidad de aproximadamente 80-90%, la hibridación durante una noche a 42ºC en Na_{2}BPO_{4} 0,25 M, pH 7,2, SDS 6,5%, sulfato de dextrano al 10% y un lavado final a 55ºC en SSC 0,1X, SDS al 0,1%. Para la detección de secuencias con una identidad superior a aproximadamente el 90%, las condiciones adecuadas incluyen la hibridación durante una noche a 65ºC en Na_{2}HPO_{4} 0,25 M, pH 7,2, SDS al 6,5%, sulfato de dextrano al 10% y un lavado final a 60ºC en SSC 0,1X, SDS al 0,1%.
Para obtener la expresión de las moléculas de ácido nucleico para los usos de la invención, las secuencias pueden incorporarse en un vector que tiene uno o más secuencias de control unidas operativamente al ácido nucleico para controlar su expresión. Los vectores pueden seleccionarse o construirse. Pueden contener secuencias reguladoras apropiadas, que incluyen secuencias promotoras, fragmentos de terminación, secuencias de poliadenilación, secuencias potenciadoras, genes marcadores, y otras secuencias según sea apropiado, por ejemplo, secuencias de ácido nucleico de manera que el polipéptido o el péptido se produce como una fusión y/o un ácido nucleico que codifica señales de secreción de manera las células hospedadoras secretan el péptido producido en las células. Los vectores pueden ser plásmidos, por ejemplo fagos virales o fagémidos según sea apropiado. El producto codificado puede obtenerse entonces transformando los vectores en el interior de las células hospedadoras en las que el vector es funcional, cultivando las células hospedadoras para producir el producto y recuperando el producto procedente de las células hospedadoras del medio circundante. El método incluye introducir una molécula de ácido nucleico que codifica la combinación de las cadenas polipeptídicas receptoras como se ha descrito, en el interior de una célula hospedadora. La introducción, que generalmente puede denominarse (particularmente para la introducción in vitro), sin limitación, "transformación" o "transfección", puede emplear cualquier técnica disponible. Para las células eucariotas, las técnicas adecuadas pueden incluir transfección mediante fosfato de calcio, DEAE-Dextrano, electroporación, transfección mediada por liposomas y transducción usando retrovirus u otros virus, por ejemplo vacunas o, para células de insectos, baculovirus. Para las células bacterianas, las técnicas adecuadas pueden incluir transformación mediante cloruro de calcio, electroporación y transfección usando bacteriófagos. Como alternativa, puede emplearse la inyección directa del ácido nucleico. Pueden usarse genes marcadores tales como genes con sensibilidad o resistencia a antibióticos en la identificación de clones que contienen el ácido nucleico de interés, como se conoce bien en la técnica.
Después de la introducción puede producirse o permitirse la expresión de la molécula de ácido nucleico, por ejemplo cultivando células hospedadoras (que pueden incluir células realmente transformadas aunque más probablemente las células serán descendientes de las células transformadas) en condiciones para la expresión de la molécula de ácido nucleico, de manera que se produzca el producto codificado. Si el producto se expresa acoplado a un péptido de señal apropiado, tal como un péptido líder, este puede secretarse procedente de la célula en el medio de cultivo. Después de la producción por la expresión, puede aislarse y/o purificarse un producto procedente de la célula hospedadora y/o del medio de cultivo, como puede ser el caso, y posteriormente usarse según se desee, por ejemplo en un ensayo o prueba como se describe en este documento.
En vista de lo anterior, también se describe un método para preparar un complejo receptor como se ha descrito, comprendiendo el método ocasionar o permitir la expresión de moléculas de ácido nucleico que codifican las cadenas polipeptídicas receptoras, combinar las cadenas para formar el complejo receptor y purificar el complejo. La expresión de las dos cadenas del complejo puede implicar la coexpresión dentro de un sistema único de expresión, por ejemplo célula hospedadora o las dos cadenas pueden producirse por separado, someterse a una etapa de purificación intermedia opcional, después combinarse para formar el receptor, el cual puede después purificarse.
La expresión puede conseguirse convenientemente cultivando una célula hospedadora que contiene la molécula de ácido nucleico en un cultivo en condiciones apropiadas que ocasionan o permitirán la expresión del péptido. Se observa sin embargo que la expresión también puede llevarse a cabo en sistemas in vitro, por ejemplo lisado de recticulocitos.
Después de la producción de los complejos receptores, por ejemplo, que comprenden una combinación de cadenas polipeptídicas como se ha identificado en este documento, puede ensayarse para determinar la capacidad de unirse a citocina. Por tanto, puede ensayarse, por ejemplo, un receptor que comprende IL-22R e IL-20R\beta para detectar la unión a una o más de IL-20 y mda-7; y puede ensayarse un receptor que comprende IL-20R\beta e IL-20R\alpha para detectar la unión a uno o más de IL-20, IL-19 y mda-7.
También se describe una célula hospedadora que contiene moléculas heterológas de ácido nucleico que codifican cadenas polipeptídicas receptoras como se describe en este documento. Las moléculas de ácido nucleico pueden integrarse en el genoma (por ejemplo cromosoma) de la célula hospedadora. La integración puede promoverse por inclusión de secuencias que promueven la recombinación con el genoma, de acuerdo con técnicas convencionales. El ácido nucleico puede estar un vector extracromosomal dentro de la célula o de otra manera heterólogo identificable o ajeno a la célula.
Por tanto, una célula hospedadora que contiene una molécula de ácido nucleico, por ejemplo como resultado de la introducción del ácido nucleico en la célula o en el interior de un ancestro de la célula, puede expesar un receptor descrito en este documento, que haga que la célula sea sensible a una o más citocinas como se describe.
Los ensayos que emplean receptores, cadenas polipeptídicas y fragmentos de los mismos, como se describe en este documento, adoptan diversos formatos.
En la siguiente descripción, se hace referencia por comodidad a una "primera cadena polipeptídica" y a "una segunda cadena polipeptídica" de receptores de la invención. En diferentes realizaciones deberá entenderse que esto se refiere a las cadenas polipeptídicas respectivas del receptor de combinación identificado en este documento, es decir IL-22R/IL-20R\beta y así sucesivamente.
Un método de ensayo para un agente que modula la interacción entre la primera y la segunda cadena polipeptídica de un receptor de la invención puede comprender:
(a)
poner en contacto una primera cadena polipeptídica del receptor o un fragmento de la primera cadena polipeptídica, cuya cadena o fragmento se une a la segunda cadena polipeptídica del receptor; una segunda cadena polipeptídica del receptor o un fragmento de la segunda cadena polipeptídica, cuya cadena o fragmento se une a la primera cadena polipeptídica; y un compuesto de ensayo; y
(b)
determinar la interacción o unión entre la primera y segunda cadenas polipeptídicas o fragmentos en presencia del compuesto del ensayo, en comparación con la interacción o unión entre la primera y segunda cadenas polipeptídicas o fragmentos en ausencia del compuesto del ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
Un compuesto o agente de ensayo que reduce o inhibe la interacción o unión entre la primera y segunda cadena polipeptídica del receptor puede identificarse y/o obtenerse en condiciones en las que, en ausencia del compuesto de ensayo siendo un inhibidor, la primera y segunda sustancias interaccionan o se unen.
Un compuesto o agente de ensayo que aumenta o potencia la interacción entre la primera y segunda cadena polipeptídica del receptor puede identificarse usando condiciones, que, en ausencia de un agente de ensayo positivo, impide o perjudica la interacción o unión de las cadenas polipeptídicas.
También se describe un método de ensayo para una sustancia que puede interaccionar con la región de interés de una primera cadena polipeptídica de un receptor de la invención que se une a una segunda cadena polipeptídica del receptor o la región relevante de una segunda cadena polipeptídica de un receptor de la invención que se une a una primera cadena polipeptídica del receptor, como puede ser el caso, comprendiendo el método:
(a)
poner en contacto una primera cadena polipeptídica de un receptor de la invención o fragmento del mismo que se une a una segunda cadena polipeptídica del receptor; o dicha segunda cadena polipeptídica o fragmento de la misma que se une a dicha primera cadena polipeptídica y un compuesto de ensayo; y
(b)
determinar la interacción o unión entre dicha primera o segunda cadena polipeptídica o fragmento de la misma y el compuesto del ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
Un compuesto de ensayo que se observa que interacciona con o se une a la región de interés de la primera o segunda cadena polipeptídica puede ensayarse para su capacidad de modular, por ejemplo modificar o interferir con, uniéndose entre la primera y segunda cadena polipeptídica o para modular una actividad mediada por el receptor descrito en este documento.
En un aspecto adicional la presente invención proporciona un método de ensayo para un agente que modula la unión de un receptor descrito en este documento con un ligando, por ejemplo citocina, comprendiendo el método:
poner en contacto un receptor descrito en este documento con un ligando y una sustancia de ensayo, en condiciones en las que la ausencia de la sustancia de ensayo que es un inhibidor de unión al ligando para el receptor el ligando se une al receptor y
determinar la unión de ligando al receptor.
La modulación de la unión identifica la sustancia de ensayo como un agente que modula la unión de receptor al ligando.
El ligando puede ser una citocina seleccionada de las identificadas en este documento que es un modulador del receptor descrito en este documento.
También se describe un método de ensayo para un agente que modula la actividad biológica de un receptor descrito en este documento, comprendiendo el método proporcionar el receptor en una células hospedadora y determinar la actividad del receptor en presencia y ausencia de una sustancia de ensayo.
La actividad del receptor puede determinarse por medio de sensibilidades de las células al tratamiento con una molécula que es agonista o antagonista para el receptor. Por ejemplo, una célula que expresa un receptor de la invención puede tratarse con una citocina (por ejemplo IL-20 para un receptor que comprende IL-22R e IL-20R\beta).
En diferentes ensayos descritos en este documento, la interacción y/o unión y/o actividad de los componentes en presencia de un compuesto o sustancia de ensayo puede compararse con la interacción y/o unión y/o actividad en un medio de reacción y condiciones comparables en ausencia de un compuesto del ensayo. Puede identificarse un compuesto del ensayo capaz de modular la interacción y/o actividad. El experto es muy consciente de los controles experimentales apropiados cuando se llevan a cabo métodos de ensayo.
Los compuestos que pueden explorarse pueden ser compuestos químicos naturales o sintéticos usados en los programas de exploración de fármacos. También pueden utilizarse extractos de plantas, microbios y otros organismos que contienen varios componentes caracterizados o no caracterizados.
La tecnología de bibliotecas combinatorias también proporciona un modo eficaz para ensayar un número potencialmente alto de diferentes sustratos para detectar su capacidad de modular una interacción. Dichas librerías y su uso se conocen en la técnica, para todo tipo de productos naturales, pequeñas moléculas y péptido entre otros.
En determinadas circunstancias puede preferirse el uso de bibliotecas peptídicas. Ya se ha mencionado la posible unión entre las cadenas polipeptídicas de los receptores descritos en este documento para inhibirse por medio de fragmentos peptídicos de las cadenas polipeptídicas. Dichos fragmentos peptídicos pueden consistir, por ejemplo, en 10-40 aminoácidos, por ejemplo aproximadamente 10, aproximadamente 20, aproximadamente 30 o aproximadamente 40 aminoácidos o aproximadamente 10-20, 20-30 ó 30-40 aminoácidos. Estos pueden sintetizarse recombinante, química o sintéticamente usando técnicas disponibles.
Otra clase de inhibidores de unión de un receptor de la invención a un ligando de la invención incluye receptores modificados para anular la función efectora conservando al mismo tiempo la capacidad de unirse al ligando, por ejemplo una citocina. Los receptores de citocina habitualmente contienen 4 dominios: el primero de estos es el péptido de señal, una región de 15-30 aminoácidos (habitualmente aproximadamente 20), principalmente hidrófobos, que se escinde después de la transferencia de la proteína al retículo endoplásmico (y por tanto no está presente en la proteína madura en la superficie celular). El segundo dominio es el domino extracelular. Para los receptores de la invención, este dominio tiene una longitud de aproximadamente 200 aminoácidos y presenta cierta homología entre los receptores (aprox. 20-30% de identidad de aminoácidos). El tercer dominio es el dominio transmembrana, un tramo de aproximadamente 20 aminoácidos hidrófobos. Finalmente, el domino intracelular tiene un tamaño variable en los receptores de citocina (20-3000AA) y muestra escasa homología entre los receptores de la misma familia. En Internet existen programas disponibles para predecir péptidos de señal y dominios transmembrana (véase por ejemplo www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/: para referencias véase S. Moller, M. D. R. Croning, R. Apweiler. Evaluation of methods for the prediction of membrana spanning, regions, Bioinformatics, 17(7): 646-653, julio 2001, o A. Krogh, B. Larsson, G. von Heijne, y E. L. L. Sonnhammer. Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: Application to complete genomes. Journal of Molecular Biology, 305(3): 567-580, enero 2001.). Esto ayuda a definir los dominios extracelulares que podrían usarse como inhibidores. Los modos para generar dichos receptores solubles podrían ser insertando un codón de terminación antes del dominio transmembrana. Como alternativa, el dominio extracelular puede producirse en fusión con otras proteínas tales como péptidos usados para hacer una purificación más fácil (por ejemplo péptidos poli-his que se unen a iones metálicos, tales como Ni^{2+}), fragmentos Fc de inmunoglobulina, que permiten la dimerización del receptor (esto aumenta la avidez para el ligando). También, la co-expresión en una célula de construcciones de fusión con Ig para las 2 cadenas del receptor conduce a la producción de heterodímeros, reconstituyendo complejos IL-20R de tipo 1 o tipo 2, unidos mediante el fragmento Fc de inmunoglobulina. También pueden producirse dos dominios extracelulares como una sola cadena incluyendo un "péptido espacial" entre las secuencias de la primera y la segunda cadena. Dicha proteína podría plegarse como el complejo de las proteínas originales separadas.
En cualquier método de ensayo de acuerdo con la invención, la cantidad de sustancia o compuesto de ensayo que puede añadirse a un ensayo de la invención se determinará normalmente por prueba y error dependiendo del tipo de compuesto usado. Típicamente, pueden usarse de aproximadamente de 0,01 nM a 1 mM o más concentraciones del compuesto inhibidor supuesto, por ejemplo de 0,01 nM a 10 mM, por ejemplo de 0,1 a 50 \muM, tal como aproximadamente 10 \muM. Incluso una molécula que tiene un efecto débil puede ser un compuesto líder útil para la investigación y desarrollo adicional.
Un método de exploración o ensayo puede incluir la purificación y/o aislamiento de un compuesto y/o sustancia de ensayo de interés a partir de una mezcla o extracto, es decir la reducción del contenido de al menos un componente de la mezcla o extracto, por ejemplo un componente con el que la sustancia de ensayo se asocia naturalmente. La exploración o el método de ensayo puede incluir determinar la capacidad de una o más fracciones de una mezcla o extracto de ensayo para unirse a una cadena polipeptídica o receptor de una invención o determinar la capacidad de una o más fracciones de una mezcla o extracto de ensayo para unirse a o influir en la actividad de un receptor.
La purificación y/o aislamiento de las moléculas pueden emplear cualquier método conocido por los expertos en la materia, por ejemplo usando una molécula de anticuerpo.
Además de su uso en la purificación de las cadenas polipépticas y receptores descritos en este documento, las moléculas de anticuerpo representan por sí mismas una clase adicional de posibles moduladores de la función receptora.
Los anticuerpos dirigidos al sitio de unión en una cadena polipeptídica de un receptor para otra cadena polipeptídica del receptor o dirigidos a un sitio de unión del receptor para el ligando, forman otra clase de supuestos moduladores de actividad receptora. El inhibidor y/o anticuerpos agonistas candidatos pueden caracterizarse y sus regiones de unión determinarse para proporcionar anticuerpos y fragmentos monocatenarios de las misma responsables de alterar la unión.
Pueden obtenerse anticuerpos usando técnicas convencionales en la técnica. Los métodos para producir anticuerpos incluyen inmunizar un mamífero (por ejemplo, ratón, rata, conejo, caballo, cabra, oveja o mono) con el receptor, cadena polipeptídica o un fragmento peptídico de la misma, de interés. Los anticuerpos pueden obtenerse a partir de animales inmunizados usando cualquiera de una diversidad de técnicas conocidas en la técnica y explorarse, preferiblemente usando la unión del anticuerpo al antígeno de interés. Por ejemplo, pueden usarse técnicas de transferencia de Western o inmunoprecipitación (Armitage et al., 1992, Nature 357: 80-82). El aislamiento de anticuerpos y/o de células productoras de anticuerpos procedentes de un animal puede acompañarse de una etapa de sacrificio del
animal.
Como alternativa o complemento para inmunizar un mamífero con un péptido, puede obtenerse un anticuerpo a partir de una biblioteca producida recombinantemente de dominios variables expresados de inmunoglobulina, por ejemplo usando bacteriófagos lambda o bacteriófagos filamentosos que presentan dominios de unión a inmunoglobulina funcionales sobre su superficie, por ejemplo véase la Solicitud PCT W092/0147 incorporada por referencia. Estas metodologías se prefieren especialmente para preparar anticuerpos de fragmentos humanizados, quimerizados u otras formas de anticuerpos híbridos o fragmentos de todos los anticuerpos que son híbridos de, por ejemplo, formas humanas y murinas, formas humanas y de ratas, formas humanas y de conejos u otros animales que no son roedores, incluyendo pero sin limitación cabras, ovejas, chimpancé, mono y otros animales.
Las moléculas de anticuerpos útiles de acuerdo con la presente invención pueden modificarse de diversas maneras. De hecho la expresión "molécula de anticuerpo" debe interpretarse como que abarca fragmentos de anticuerpos y derivados que pueden unirse al antígeno. Fragmentos de anticuerpo ejemplo que pueden unirse a un antígeno o a otro compañero de unión son el fragmento Fab que consiste en los dominios VL, VH, C1 y CH1; el fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; el fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo anticuerpo; el fragmento dAd que consiste en el dominio VH; las regiones CDR aisladas y los fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que incluye dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra. También se incluyen los fragmentos Fv de cadena única.
Hibridomas que pueden producir anticuerpos con las características de unión deseadas que se encuentran dentro del alcance de la presente invención, son las células hospedadoras, eucariotas o procariotas, que contienen el ácido nucleico que codifica anticuerpos (incluyendo fragmentos de anticuerpos) y que pueden realizar su expresión. La invención también proporciona métodos de producción de los anticuerpos que incluyen cultivar una célula que puede producir el anticuerpo en las condiciones en las que se produce y preferiblemente se secreta el anticuerpo.
Las reactividades de los anticuerpos en una muestra pueden determinarse por cualquier medio apropiado. El etiquetado con moléculas indicadoras individuales es una posibilidad. Las moléculas indicadoras pueden generar directa o indirectamente señales detectables y preferiblemente cuantificables. El enlace de las moléculas indicadoras puede realizarse directa o indirectamente, de manera covalente, por ejemplo mediante un enlace peptídico o de manera no covalente. El enlace mediante un enlace peptídico puede ser como resultado de la expresión recombinante de una fusión de genes que codifican anticuerpos y moléculas indicadoras. El modo de determinar la unión no es una característica de la presente invención y los expertos en la técnica pueden elegir un modo adecuado de acuerdo con sus preferencias y conocimientos generales.
Los anticuerpos también pueden usarse para purificar y/o aislar una cadena polipeptídica o receptor de la invención, o un fragmento peptídico, por ejemplo después de la producción de un péptido por expresión de la codificación del ácido nucleico. Los anticuerpos pueden ser útiles en un contexto terapéutico (que puede incluir profilaxis) para interrumpir la unión de las cadenas polipeptídicas de un receptor o la unión del receptor al ligando con el fin de inhibir la función o actividad biológica pertinente. Los anticuerpos pueden, por ejemplo, micro-inyectarse en el interior de las células, por ejemplo donde existe un tumor.
Independientemente de la naturaleza de los compuestos de ensayo a ensayar en un método de análisis de la invención, la interacción o la unión entre sustancias, por ejemplo cadenas polipeptídicas de un receptor de este documento, puede determinarse por cualquiera de las diversas técnicas cualitativas o cuantitativas disponibles en la técnica. Esto incluye técnicas tales como radioinmunoensayo, co-inmunoprecipitación, ensayo de centelleo por proximidad y métodos ELISA.
La unión de un componente a otro puede estudiarse marcando cualquiera de los dos con un marcador detectable y ponerle en contacto con el otro que se puede haber inmovilizado en un soporte sólido. Los marcadores detectables adecuados, especialmente para sustancias peptidílicas, incluyen ^{35}S-metionina que puede incorporarse en los péptidos y polipéptidos producidos de manera recombinante. Los péptidos y polipéptidos producidos de manera recombinante también pueden expresarse como proteínas de fusión que contienen un epítope que puede marcarse con un anticuerpo.
El polipéptido o péptido que se inmoviliza en un soporte sólido puede inmovilizarse usando un anticuerpo contra ese polipéptido unido a un soporte sólido o mediante otras tecnologías en sí conocidas. Un interacción in vitro preferida puede utilizar un péptido de fusión que incluye glutatión-S-transferasa (GST). Esta puede movilizarse en perlas de glutatión agarosa. En un formato de ensayo in vitro del tipo descrito anteriormente un modulador de ensayo puede ensayarse determinando su capacidad para disminuir la cantidad de péptido o polipéptido marcado (por ejemplo IL-20R\beta marcado que se une al péptido de fusión GST inmovilizado (por ejemplo péptido de fusión de GST inmovilizado e IL-22R o IL-20R\alpha). Esto puede determinarse fraccionando las perlas de glutatión agarosa por electrofóresis en gel de poliacrilamida-SDS. Como alternativa, las perlas pueden aclararse para eliminar el péptido o polipéptido no unido y la cantidad de péptido o polipéptido que se ha unido se determina contando la cantidad de marcador presente, por ejemplo, en un contador de centelleo adecuado.
La unión o interacción de dos componentes también puede determinarse usando un ensayo de doble híbrido.
Por ejemplo, una primera cadena polipeptídica de un receptor descrito en este documento puede fusionarse con un dominio de unión a ADN tal como el factor de transcripción de levadura GAL4. El factor de transcripción GAL4 incluye dos dominios funcionales. Estos dominios son el dominio de unión a ADN (GAL4DBD) y el dominio de activación transcripcional GAL4 (GAL4TAD). Fusionando una primera cadena polipeptídica de un receptor a uno de estos dominios y una segunda cadena polipeptídica del receptor al equivalente respectivo, un factor de transcripción funcional GAL4 se restablece sólo cuando los dos polipéptidos interaccionan. Por tanto, la interacción de estos polipéptidos puede medirse usando un gen indicador ligado a un sitio de unión a ADN de GAL4 que puede activar la transcripción de dicho gen indicador.
Fields y Song, 1989, Nature 340; 245-246, describen este formato de ensayo de doble híbrido. Este también puede usarse en células de mamífero y en levaduras. En la técnica se dispone de otras combinaciones de dominio de unión a ADN y dominio de activación transcripcional y pueden preferirse las del dominio de unión a ADN de LexA y el domino de activación transcripcional VP60.
Los expertos en la técnica pueden variar el formato exacto de cualquiera de los métodos de exploración o ensayo de la presente invención usando la destreza técnica y el conocimiento rutinarios. El experto en la técnica conoce bien la necesidad de emplear experimentos de control apropiados.
La presente invención proporciona adicionalmente el uso de una cadena polipeptídica de un receptor descrito en este documento o fragmento peptídico del mismo, o un receptor como se describe, para la exploración de una sustancia o compuesto que puede influir en la unión entre las cadenas polipeptídicas del receptor, o el influir en la unión entre el receptor y el ligando o influir en la actividad del receptor.
La realización de un método de ensayo en este documento puede ir precedida del aislamiento y/o preparación y/o uso de un compuesto, sustancia o molécula que se ensaya de manera positiva para determinar su capacidad de modular la interacción pertinente o influir en la función biológica o actividad pertinente. Después de la identificación de un agente adecuado, este puede investigarse adicionalmente y puede modificarse o derivatizarse para modificar una o más propiedades, sin anular su capacidad para modular la interacción pertinente o influir en la función biológica pertinente. Por ejemplo, una molécula de anticuerpo Fv monocatenaria puede reformatearse en un anticuerpo completo que comprende las regiones constantes del anticuerpo, por ejemplo un anticuerpo IgG. Cualquier molécula peptidílica puede modificarse por adición, sustitución, inserción o deleción de uno o más aminoácidos o mediante la unión de un resto de adición o dominio de proteína. Un agente activo puede someterse a modelado molecular computacional y pueden crearse uno o más miméticos del agente originalmente identificado.
Adicionalmente, un agente activo descrito en este documento puede prepararse y/o usarse en la preparación, es decir preparación o formulación, de una composición tal como un medicamento, una composición farmacéutica o un fármaco. Estos pueden administrarse a individuos.
Un compuesto, ya sea un péptido, anticuerpo, pequeña molécula u otra sustancia que se observa que puede influir en la unión entre las cadenas polipeptídicas de un receptor descrito en este documento o en la unión de dicho receptor a un ligando tiene potencial terapéutico y otro en diversos contextos. Para el tratamiento terapéutico dicho compuesto puede usarse en combinación con cualquier otra sustancia activa.
Generalmente, dicha sustancia identificada en este documento y usada posteriormente se proporciona en una forma asilada y/o purificada, es decir sustancialmente pura. Esto puede incluir que esta se encuentre en una composición en la represente al menos aproximadamente el 92% del ingrediente activo, más preferiblemente al menos aproximadamente el 95%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 98%. Dicha composición puede, sin embargo, incluir materiales transportadores inertes u otros excipientes farmacéutica y fisiológicamente aceptables. Por tanto, una composición puede comprender el ingrediente activo obtenido usando la invención y un transportador inerte. Adicionalmente, una composición como se describe puede incluir además de un compuesto modulador como se describe, una o más de las otras moléculas de uso terapéutico tales como un agente antitumoral.
La invención proporciona adicionalmente el uso de un modulador de un complejo de IL-22R e IL-20R\beta en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un sujeto que padece un neoplasma o un queratoderma, en el que el modulador del complejo de IL-22R e IL-20R\beta es una forma soluble de IL-22R o un anticuerpo contra
IL-22R.
La invención proporciona adicionalmente el uso de un modulador de un complejo de IL-22R e IL-20R\beta para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un sujeto que padece una afección cutánea, en la que el modulador comprende una forma soluble de IL-22R, a condición de que cuando la afección cutánea sea psoriasis, eczema, dermatitis atópica o por contacto, dicho modulador no sea un polipéptido heterodimérico IL-22R/IL-20R\beta soluble.
El propósito terapéutico/profiláctico de dicho uso puede referirse a cualquier afección asociada a una molécula que se une a un receptor de la invención o asociado a una actividad o función de un receptor descrito en este documento. Las afecciones que pueden tratarse incluyen afecciones cutáneas, tales como dermatitis atópica, psoriasis, queratitis seborreica, queratodermas y otras afecciones que implican la proliferación excesiva de células epidérmicas y/o cutáneas. Por ejemplo, las proteínas mda-7 supuestamente tienen actividad antitumoral porque los adenovirus que expresan este gen tienen efectos antitumorales en ratones tanto in vitro como in vivo. Por lo tanto, los resultados sugieren que IL-20 y hasta cierto punto, IL-19 tienen la misma actividad, lo que sugiere la eficacia como agentes antitumorales.
También se describe una composición farmacéutica, medicamento, fármaco u otra composición para este propósito, comprendiendo la composición una o más de estas sustancias, el uso de esta sustancia en un método de tratamiento médico, un método que comprende la administración de esta sustancia a un paciente, por ejemplo para el tratamiento (que puede incluir tratamiento preventivo) de una afección médica, el uso de esta sustancia en la preparación de una composición, medicamento o fármaco para la administración para dicho propósito, por ejemplo para el tratamiento de una afección médica, y un método para preparar una composición farmacéutica que comprende mezclar esta sustancia con un excipiente, vehículo o transportador farmacéuticamente aceptable y opcionalmente otros ingredientes.
Cualquiera que sea la sustancia para los usos de la presente invención, la administración es preferiblemente en una "cantidad profilácticamente eficaz" o una "cantidad terapéuticamente eficaz" (como puede ser el caso, aunque la profilaxis pueda considerarse terapia), siendo esto suficiente para mostrar beneficios al individuo. La cantidad real administrada, y la velocidad y evolución de la administración, dependerá de la naturaleza y gravedad de lo que se está tratando. La prescripción del tratamiento, por ejemplo decisiones sobre la dosificación etc., es responsabilidad de los médicos generalistas y otros médicos tratantes.
Las composiciones farmacéuticas para usar de acuerdo con la presente invención, pueden incluir, además del ingrediente activo, un excipiente transportador, tampón, estabilizantes u otros materiales farmacéuticamente aceptables bien conocidos por los expertos en la materia. Dichos materiales deben ser no tóxicos y no deben interferir con la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza exacta del transportador u otro material dependerá de la vía de administración, que puede ser oral o por inyección, por ejemplo cutánea, subcutánea o intravenosa.
Las composiciones farmacéuticas para la administración oral pueden ser en comprimidos, cápsulas, pulverizaciones para inhalar en polvo (por ejemplo nebulizadores) o formas líquidas. Un comprimido puede incluir un transportador sólido tal como gelatina o un adyuvante. Las composiciones farmacéuticas líquidas generalmente incluyen un transportador líquido tal como agua, vaselina, o aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintético. Puede incluirse una solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución sacárida o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol.
Para la inyección intravenosa, cutánea o subcutánea en el sitio de la dolencia, el ingrediente activo estará en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable que no tenga pirógeno y que tenga un pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Los expertos en la materia pertinente pueden preparar bien soluciones adecuadas usando, por ejemplo vehículos isotónicos tales como inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de Ringer lactato. También pueden incluirse, según las necesidades, conservantes, estabilizantes, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos. En Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, Osol, A. (ed), 1980 pueden encontrase ejemplos de las técnicas y protocolos mencionados anteriormente.
En lugar de administrar estas sustancias directamente, estas pueden producirse en células diana para la expresión a partir de un ácido nucleico codificante introducido en las células, por ejemplo a partir de un vector viral o como ADN "desnudo" administrado en el organismo. El ácido nucleico que codifica la sustancia, por ejemplo, un péptido que puede modular, por ejemplo interferir con, la interacción de una primera y segunda cadena polipeptídica de un receptor descrito en este documento, puede por tanto usarse en métodos de terapia génica, por ejemplo en el tratamiento de individuos, por ejemplo con el objetivo de prevenir o curar (total o parcialmente) una afección.
Las propiedades de unión de los receptores descritos en este documento proporcionan adicionalmente el uso de materiales y métodos para establecer la presencia o ausencia de citocinas particulares u otros ligandos de dicho receptor en una muestra de ensayo. Por ejemplo, un complejo de IL-20R\alpha e IL-20R\beta que se une a cualquiera de IL-19, IL-20 y mda-7. Por lo tanto, una muestra de interés puede ponerse en contacto con un receptor que comprende IL-20R\alpha e IL-20R\beta, o con células que presentan dicho receptor, y puede determinarse si se produce la unión. Si se produce la unión, entonces una de estas citocinas está presente. En una segunda etapa, la muestra puede ponerse en contacto con un receptor que comprende IL-20R\beta e IL-22R o con células que presentan dicho receptor. Si no se detecta unión, esto proporciona indicación de que IL-19 está presente en la muestra, pero no IL-20 o mda-7. Si se detecta unión, esto proporciona indicación de que cualquiera de las dos o las dos de mda-7 e IL-20 están presentes en la muestra. Puede determinarse otra definición del contenido de la muestra comparando la unión de los materiales a los complejos IL-22R/IL-20R\beta y a los complejos IL-20R\alpha/IL-20R\beta, porque el primero se une a mda-7 mejor que el último.
También se describe un método para determinar la presencia de una o más citocinas en una muestra, comprendiendo el método poner en contacto la muestra con un receptor de la invención (como se describe) y determinar si el receptor se une o no a la muestra. Preferiblemente, la muestra se pone en contacto con una o más combinaciones de diferentes receptores de la invención para identificar la citocina o citocinas presentes en la muestra.
Como se ha indicado, anteriormente, experimentos en ratones transgénicos establecen que IL-20 se asociada con letalidad neonatal y con diversas irregularidades cutáneas. Por lo tanto, se puede inhibir, por ejemplo, el efecto de IL-20 en células receptivas poniendo en contacto las células con otras citocinas que compiten por la unión con IL-20 o poniendo en contacto el receptor, por ejemplo, con un inhibidor de unión al receptor, tal como un anticuerpo, o alguna otra forma de molécula inhibidora. Son ejemplos de dichos antagonistas o inhibidores, por ejemplo, mutantes de mda-7 o IL-19 que se han mutado para anular la actividad sin anular su afinidad por el receptor, compañeros de unión solubles para IL-20, tales como fragmentos extracelulares solubles de los receptores de IL-20 y así sucesivamente.
Este mecanismo proporciona una estrategia para terapias en las que está contraindicada la proliferación de células epidérmicas, tales como células cutáneas. Son ejemplos de dichas afecciones la dermatitis atópica, psoriasis, queratitis seborreica, queratodermas y otras afecciones que implican la proliferación excesiva de células epidérmicas y/o cutáneas. En estas estrategias terapéuticas, se administra a un sujeto que lo necesita una cantidad de un agente que se une a IL-20. Estos agentes pueden ser cualquiera de los inhibidores descritos anteriormente, incluyendo anticuerpos, partes de las moléculas de anticuerpos que se unen al receptor o receptores de IL-20, fragmentos en sí de IL-20 que pueden unirse al receptor pero que no tienen función efectora, formas mutadas de IL-20 que no han perdido la afinidad por el receptor pero que no son activas. Dichas formas de moléculas se conocen para otras interleucinas, formas solubles de receptores de IL-20 y así sucesivamente.
Esta observación, es decir, que IL-20 estimula la proliferación de células epidérmicas, tales como células cutáneas, permite al experto en la materia desarrollar ensayos para determinar si una sustancia de ensayo de interés tiene un efecto inhibidor sobre la proliferación de dichas células. En efecto, se combina la sustancia de interés con IL-20 y células epidérmicas, tales como células cutáneas, se determina la proliferación y se comparan los resultados con respecto al uso de IL-20 solo en el sistema. Una disminución de la proliferación indica un efecto inhibidor de la sustancia del ensayo. Adicionalmente puede caracterizarse la actividad específica de la sustancia del ensayo realizando experimentos paralelos usando una muestra celular, en la que las células presentan los complejos de IL-22R e IL-20R\beta en su superficie y en la que están presentes los complejos de IL-20R\alpha e IL-20R\beta. Por ejemplo, si después de la estimulación de las células con una sustancia de ensayo e IL-20, hay inhibición y los valores son iguales, entonces el inhibidor probablemente actuaría sobre cualquier IL-20 por sí mismo o IL-20R\beta. Si en las células que presentan los complejos IL-22R/IL-20R\beta la inhibición es mayor que en las que presentan los complejos IL-20R\alpha/IL-20R\beta, entonces la inhibición probablemente actúa a través de IL-22R y viceversa.
De manera similar, la observación de que IL-20 responde a complejos de IL-22R e IL-20R\beta sugiere métodos para potenciar o proporcionar la unión de IL-20 a células. Esto puede conseguirse, por ejemplo, transfectando las células diana con moléculas de ácido nucleico que codifican IL-20R\beta, en cantidades suficientes para formar complejos receptores "de tipo II" adicionales. Como se ha indicado anteriormente, se sabe que IL-20 y mda-7 tienen efectos específicos sobre las células. Estos efectos pueden potenciarse, por ejemplo, transformando o transfectando células diana de manera que presenten un mayor número de IL-22R e IL-20R\beta. Por lo tanto, si las células diana expresan IL-22R pero no IL-20R\beta, se pueden transformar o transfectar las células con vectores que expresen IL-20R\beta, para generar receptores adicionales. Como alternativa, se puede transformar o transfectar la célula con moléculas de ácido nucleico que codifican estas dos moléculas o construcciones que codifican proteínas de fusión de las dos moléculas, una molécula completa y la parte de unión de la otra o dos partes de unión. Las partes o moléculas pertinentes podrían unirse, por ejemplo, mediante una secuencia enlazadora o algunas otras construcciones que facilitan el plegamiento y funcionalidad adecuados de la molécula.
Los resultados indican que, mediante una selección apropiada de transfectantes, se pueden "clasificar" muestras, tales como muestras extraídas de pacientes, para determinar si están presentes citocinas particulares y cuantificarlas. Por ejemplo, se ha observado, anteriormente, que los complejos de IL-20R\alpha e IL-20R\beta se unen a todas las IL-19, IL-20 y mda-7. Por tanto, en una primera parte de un ensayo, se pone en contacto una muestra de interés con células que presentan complejos de IL-20R\alpha e IL-20R\beta y se determina si se produce cualquier unión. Si se produce la unión, entonces una de estas citocinas está presente. En una segunda etapa, la muestra puede ensayarse con complejos de IL-20R\beta e IL-22R. Si los resultados de este ensayo son negativos, entonces se puede llegar a la conclusión de que IL-19 está presente en la muestra, pero no IL-20 o mda-7.
De manera similar, si los dos ensayos son positivos, se puede llegar a la conclusión de que cualquiera de las dos o las dos de mda-7 e IL-20 están presentes en la muestra. Puede determinarse otra definición del contenido de la muestra comparando la unión de los materiales a los complejos IL-22R/IL-20R\beta y a los complejos IL-20R\alpha/IL-20R\beta, porque el primero se une a mda-7 mejor que el último.
Para los expertos habituales en la técnica, serán evidentes otros aspectos y realizaciones de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Referencias citadas en la descripción
Esta lista de referencias citadas por el solicitante únicamente es para comodidad del lector. Dicha lista no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO rechaza toda responsabilidad a este respecto.
Documentos de patentes citados en la descripción
\bullet WO 0146261 A [0003]
\bullet WO 920147 A [0090]
\bullet WO 0024758 A [0004]
\bullet US 09915735 B [0124]
\bullet WO 02072607 [0005]
Bibliografía no relativa a patentes citada en la descripción
\bulletMoore et al. Annu. Rev. Immunol, 2001, vol. 19, 683 [0002]
\bulletJiang et al. Oncogene, 1995, vol. 11, 2477 [0002]
\bulletSchaefer et al. J. Immunol, 2001, vol. 166, 5859 [0002]
\bulletZhang et al. J. Biol. Chem. 2000, vol. 275, 24436 [0002]
\bulletSoo et al. J. Cell Biochem., 1999, vol. 74.1 [0002]
\bulletGallagher et al. Genes Immun. 2000, vol. 1, 442 [0003]
\bulletBlumberg et al. Cell, 2001, vol. 104, 9 [0003]
\bulletKnappe et al. J Virol, 2000, vol. 74, 3381 [0004]
\bulletDumoutier et al. J. Immunol, 2000, vol. 164, 1814 [0004]
\bulletDumoutier et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 2000, vol. 97, 10144 [0004] [0005] [0043]
\bulletKotenko et al. J. Biol. Chem, 2000, vol. 276, 2725 [0004] [0005]
\bulletXie et al. J. Biol. Chem, 2000, vol. 275, 31335 [0004] [0005]
\bulletDumoutier et al. J. Immunol, 2001, vol. 166, 7090 [0004] [0040]
\bulletKotenko et al. J. Immunol, 2001, vol. 166, 7096 [0004] [0040]
\bulletDemoulin et al. Mol. Cell Biol., 1996, vol. 16, 4710 [0020]
\bulletSambrook; Russell. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001 [0052]
\bulletAusubel et al. Current Protocole in Molecular Biology. John Wiley and Sons, 1992 [0052]
\bulletAltschul et al. J. Mol. Biol., 1999, vol. 215, 405-410 [0055]
\bulletPearson; Lipman. PNAS USA, 1988, vol. 85, 2444-2448 [0055]
\bulletSmith; Waterman. J. Mol Biol, 1981, vol. 147, 195-197 [0055]
\bullet S. Moller; M.D.R. Croning; R. Apweiler. Evaluaron of methods for the prediction of membrane spanning regions. Bioinformatics, July 2001, vol. 17 (7), 646-653 [0083]
\bullet A. Krogh; B. Larsson; G. von Heijne ; E.L.L. Sonnhammer. Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: Application to complete genomes. Journal of Molecular Biology, January 2001, vol. 305 (3), 567-580 [0083]
\bulletArmitage et al. Nature, 1992, vol. 357,80-82 [0089]
\bulletFields; Song. Nature, 1989, vol. 340, 245-246 [0100]
\bullet Remington's Pharmaceutical Sciences. 1980 [0114]
<110> Dumoutier, Laure; Renauld, Jean-Christophe
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Nuevos Receptores de Citocinas de Clase II y Usos de los Mismos
\vskip0.400000\baselineskip
<130> LUD 5734.1
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 09/915.735
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 26-07-2001
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
100 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
101 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
102 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
103 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
104 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
105 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
106 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
107 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm
108 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm
109 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm
110 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm
111 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador oligonucleotídico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm
112

Claims (12)

1. Uso de un modulador de un complejo de IL-22R e IL-20R\beta, para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de un sujeto que padece un neoplasma o un queratoderma, en el que el modulador del complejo de IL-22R e IL-20 es una forma soluble de IL-22R o un anticuerpo contra IL-22R.
2. Modulador de un complejo de IL-22R e IL-20R\beta, para usar en el tratamiento de un sujeto que padece un neoplasma o un queratoderma, en el que el modulador del complejo de IL-22R e IL-20R\beta es una forma soluble de IL-22R o un anticuerpo contra IL-22R.
3. Método para determinar si una sustancia posee una actividad de inhibición de la proliferación de células epidérmicas, que comprende mezclar una muestra de células epidérmicas, que presentan un complejo de receptores que comprenden IL-20R\beta e IL-22R, y una sustancia a ensayar combinada con IL-20, medir la proliferación de las células epidérmicas y comparar dicha proliferación con la proliferación resultante de mezclar una muestra de dichas células epidérmicas, que presentan dicho complejo de receptores, solo con IL-20, indicando una disminución de la proliferación que dicha sustancia posee una actividad de inhibición de la proliferación de las células epidérmicas.
4. Método de la reivindicación 3, en el que dichas células epidérmicas son células cutáneas.
5. Método para modular el efecto de la interleucina-20 (IL-20) o de mda-7 en una célula in vitro, que comprende poner en contacto dicha célula con un modulador de un complejo de IL-22R e IL-20R\beta, en el que el modulador comprende una forma soluble aislada de IL-22R, siempre que dicho modulador no sea un polipéptido heterodimérico IL-22R/IL-20R\beta soluble.
6. Método para modular el efecto de la interleucina-20 (IL-20) o de mda-7 en una célula cutánea in vitro, que comprende poner en contacto dicha célula con un modulador de un complejo de IL-22R e IL-20R\beta, en el que el modulador comprende una forma soluble aislada de IL-22R.
7. Uso de un modelador de un complejo de IL-22R e IL-20R\beta para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de un sujeto que padece una afección cutánea, en el que el modulador comprende una forma soluble de IL-22R, a condición de que cuando dicha afección cutánea sea soriasis, eczema, dermatitis atópica o de contacto, dicho modulador no sea un polipéptido heterodimérico IL-22R/IL-20R\beta soluble.
8. Modulador de un complejo de IL-22R e IL-20R\beta, para usar en el tratamiento de un sujeto que padece una afección cutánea, en el que el modulador comprende una forma soluble de IL-22R, a condición de que cuando dicha afección cutánea sea soriasis, eczema, dermatitis atópica o por contacto, dicho modulador no sea un polipéptido heterodimérico IL-22R/IL-20R\beta soluble.
9. Uso de la reivindicación 7 o el modulador para el uso de la reivindicación 8, en el que la afección cutánea es soriasis, a condición de que dicho modulador no sea un polipéptido heterodimérico IL-22R/IL-20R\beta soluble.
10. Uso de la reivindicación 7 o el modulador para el uso de la reivindicación 8, en el que la afección cutánea es dermatitis atópica, a condición de que dicho modulador no sea un polipéptido heterodimérico IL-22R/IL-20R\beta soluble.
11. Uso de un modulador de un complejo de IL-22R e IL-20R\beta para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de un sujeto que padece queratitis seborreica, en el que el modulador comprende una forma soluble aislada de IL-22R.
12. Modulador de un complejo de IL-22R e IL-20R\beta para el uso en el tratamiento de un sujeto que padece queratitis seborreica, en el que el modulador comprende una forma soluble aislada de IL-22R.
ES02756665T 2001-07-26 2002-07-24 Receptores de la citoquina de clase ii y usos de los mismos. Expired - Lifetime ES2345040T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US915735 1978-06-15
US09/915,735 US20030023033A1 (en) 2001-07-26 2001-07-26 Novel class II cytokine receptors and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2345040T3 true ES2345040T3 (es) 2010-09-14

Family

ID=25436193

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES02756665T Expired - Lifetime ES2345040T3 (es) 2001-07-26 2002-07-24 Receptores de la citoquina de clase ii y usos de los mismos.

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20030023033A1 (es)
EP (1) EP1527178B1 (es)
JP (2) JP2005508879A (es)
AT (1) ATE465177T1 (es)
AU (2) AU2002322657B2 (es)
CA (1) CA2454802A1 (es)
DE (1) DE60236109D1 (es)
ES (1) ES2345040T3 (es)
WO (1) WO2003010290A2 (es)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030012788A1 (en) * 2000-07-27 2003-01-16 Jean-Christophe Renauld Method for influencing kinase pathways with IL-22
US6902930B2 (en) * 2001-08-29 2005-06-07 Vanderbilt University Human Mob-5 (IL-24) receptors and uses thereof
AU2003235948A1 (en) * 2002-04-25 2003-11-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Remedy for lung cancer
WO2005014028A1 (en) * 2003-08-08 2005-02-17 Novo Nordisk A/S Interleukin-20 for treating and diagnosing conditions associated with neovascularisation
US20050142108A1 (en) * 2003-12-03 2005-06-30 Gabriele Grunig Methods of modulating cytokine activity; related reagents
CN100515491C (zh) * 2005-01-04 2009-07-22 健能隆医药技术（上海）有限公司 白介素-22的医药用途
EP1954719A2 (en) * 2005-12-02 2008-08-13 Genentech Inc. Compositions and methods for the treatment of diseases and disorders associated with cytokine signaling involving antibodies that bind to il-22 and il-22r
CN101935347B (zh) * 2010-07-27 2014-11-05 郑骏年 mda-7/IL-24去泛素化突变体
US20160071655A1 (en) * 2013-04-04 2016-03-10 The Regents Of The University Of California Electrochemical solar cells

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2347066C (en) * 1998-10-26 2011-05-03 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid molecules which encode t cell inducible factors (tifs), the proteins encoded, and uses thereof
EP2295079A3 (en) * 1999-12-23 2011-03-23 ZymoGenetics, L.L.C. Method for treating inflammation
ATE478148T1 (de) * 2000-07-27 2010-09-15 Wyeth Llc Verwendung von il-10 rezeptor beta antagonistische antikörper zur hemmung einer il- tif/il-21 induktion von akutphasen-proteine
WO2002072607A2 (en) * 2001-03-09 2002-09-19 Zymogenetics, Inc. Soluble heterodimeric cytokine receptor

Also Published As

Publication number Publication date
EP1527178A4 (en) 2005-12-14
EP1527178B1 (en) 2010-04-21
CA2454802A1 (en) 2003-02-06
JP2009132715A (ja) 2009-06-18
US20030023033A1 (en) 2003-01-30
EP1527178A2 (en) 2005-05-04
ATE465177T1 (de) 2010-05-15
WO2003010290A2 (en) 2003-02-06
AU2008202589A1 (en) 2008-07-03
WO2003010290A3 (en) 2005-03-10
AU2002322657B2 (en) 2008-03-13
DE60236109D1 (de) 2010-06-02
JP2005508879A (ja) 2005-04-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Minami et al. Association of p56lck with IL‐2 receptor beta chain is critical for the IL‐2‐induced activation of p56lck.
ES2464459T3 (es) Modulación del sistema receptor Trpv:receptor de dominio Vps 10p para el tratamiento del dolor
Brott et al. GTPase-activating protein interactions with the viral and cellular Src kinases.
US7569667B2 (en) Isolated soluble IL-TIF/IL-22 receptor or binding protein which binds to IL-TIF/IL-22, and uses thereof
Marie-Cardine et al. SKAP-HOM, a novel adaptor protein homologous to the FYN-associated protein SKAP55
JP2007267750A (ja) 可溶性ｉｌ−ｔｉｆ／ｉｌ−２２レセプターまたはｉｌ−ｔｉｆ／ｉｌ−２２に結合する結合タンパク質をコードする単離された核酸分子、およびその使用
JP2018513384A (ja) Ｒｏｒ１−ｒｏｒ２結合のモジュレーター
AU2008202589A1 (en) Novel class II cytokine receptors and uses thereof
ES2275268T3 (es) Uso de un receptor de la interleuquina 11 humana.
JP2020517262A (ja) 獣医学的使用のためのｉｌ４／ｉｌ１３受容体分子
WO2020086886A1 (en) Il4/il13 receptor molecule for veterinary use
Salvati et al. Interleukin-6 (IL-6) Antagonism by Soluble IL-6 Receptor⃰ Mutated in the Predicted gp130-binding Interface
ES2282304T3 (es) Procedimiento para seleccionar antiplaquetas.
US20040236075A1 (en) Novel glass II cytokine receptors, and uses thereof
AU2002322657A1 (en) Novel class II cytokine receptors and uses thereof
US20050282215A1 (en) Isolated cytokine receptor LICR-2
ES2295224T3 (es) Anticuerpo antagonista anti-pro842.
ES2325165T3 (es) Polipeptidos y dna de xrec2.
ES2319386T3 (es) Proteina 2 del canal del calcio de tipo trp (tlcc-2) humana.
US20060115816A1 (en) Splice variant cannabinoid receptor (cb1b)
US7029892B1 (en) Serine threonine kinase member, h2520-59
KR101462329B1 (ko) 디스코이딘 도메인 리셉터 2의 ｊｍ2 도메인의 발현 촉진제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물
AU2001292918B2 (en) Isolated nucleic acid molecules which encode a soluble IL-TIF/IL-22 receptor or binding protein which binds to IL-TIF/IL-22, and uses thereof
ES2745220T3 (es) Modulación del sistema receptor Trpv:receptor de dominio Vps10p para el tratamiento del dolor
Salvatij et al. Interleukin-6 (IL-6) Antagonism by Soluble IL-6 Receptor o Mutated in the Predicted gp130-binding Interface