ES2282304T3 - Procedimiento para seleccionar antiplaquetas. - Google Patents
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Abstract
El uso de (1) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID. Nº 2. (2) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos en la que entre uno y diez aminoácidos están borrados, sustituidos y/o añadidos en la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID. Nº 2, y muestran una actividad supresora de una actividad de la adenilato ciclasa por enlace con ADP y acoplamiento con Gi; o (3) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con una secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID. Nº 2, y muestran una actividad supresora de una actividad de la adenilato ciclasa por enlace en ADP y acoplamiento con Gi como herramienta de selección de un agente antiplaquetas.
Description
Procedimiento para seleccionar
antiplaquetas.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para seleccionar agentes antiplaqueta.
Las plaquetas fueron descubiertas en 1842 por
Donne [C.R. Acad. Sci. (París), 14, 336-368, 1842] y
durante mucho tiempo se ha considerado un componente de la sangre
necesario para la hemostasis. Se sabe en la actualidad que las
plaquetas no solo juegan un papel principal en el sistema
hemostático, sino también papeles multifuncionales, por ejemplo, un
generación clínicamente notable de arteriosclerosis, enfermedades
circulatorias entre las que se incluyen enfermedades trombóticas,
metástasis del cáncer, inflamación, rechazo tras injerto,
participación en la reacción inmune, o similares.
En la actualidad, la revascularización por
procedimientos farmacológicos o físicos se realiza para tratar las
enfermedades trombóticas y las enfermedades isquémicas. Sin embargo,
se ha encontrado de manera reciente que la activación, adhesión,
y/o agregación de las plaquetas se promueve mediante el colapso del
tejido de los vasos sanguíneos que incluye una célula endotelial
tras la revascularización, o un colapso de un equilibrio de
fibrinolisis-coagulación producido por un
medicamento per se, que llega a ser un problema clínico. Por
ejemplo, se conoce que, tras la revascularización por una terapia
trombolítica usando t-PA o similar, se activan la
actividad fibrinolítica y/o la actividad coagulativa, y a
continuación, el equilibrio sistémico
fibrinolisis-coagulación colapsa. Clínicamente,
esto produce la reoclusión y llega a ser un problema
terapéuticamente crítico (J. Am. Coll. Cardiol. 12,
616-623, 1988).
De manera adicional, la terapia PTCA
(Angioplastia coronaria transluminal percutánea) ha llegado
rápidamente a ser muy usada, y ha conseguido buenos resultados en
el tratamiento de las enfermedades basadas en la aortostenosis o
estenosis coronaria tal como angina, infarto de miocardio, o
similar. Sin embargo, la terapia lesiona el tejido de los vasos
sanguíneos que incluyen una célula endotelial, y la obstrucción
coronaria aguda, y la restenosis, que se observan en
aproximadamente un 30% de los casos, llegan a ser un problema.
Las plaquetas juegan un papel importante en
estos diversos trastornos trombóticos (tales como la reoclusión o
similares) tras la terapia de revascularización. Por tanto, se desea
un agente antiplaqueta como agente como para tratar o prevenir
estos trastornos trombóticos.
En relación con esto, se conoce el 5' difosfato
de adenosina (ADP) como un factor importante que induce o promueve
la activación, adhesión, y agregación de las plaquetas. El ADP se
elimina de la plaquetas activadas mediante colágeno, trombina o
similar, o a partir de los hemocitos, las células endoteliales
vasculares, o los órganos lesionados por la revascularización o
similares. Se considera que el ADP activa las plaquetas mediante
una proteína G acoplada al receptor P2T del ADP localizado en la
membrana de las plaquetas (Biochem. J., 336,
513-523, 1998).
Se ha sugerido que el receptor P2T_{PLC} del
ADP de las plaquetas que se acopla con Gq, una de las proteínas G,
e incrementa la concentración intracelular de Ca^{2+} mediante la
fosfolipasa C (PLC), y un receptor P2T_{AC} del ADP de las
plaquetas que se acopla con Gi, una de las proteínas G, y suprime la
actividad de la adenilato ciclasa (AC) están presentes como
receptores del ADP de las plaquetas. En la actualidad se ha
identificado el receptor P2T_{LC} del ADP de las plaquetas como el
receptor que se conoce como receptor P2Y1 del ADP de las plaquetas,
pero no se ha identificado en su totalidad el receptor P2T_{AC}
del ADP de las plaquetas (Kunapuli, S. P. y col., Trenes Pharmacol.
Sci., 19, 391-394, 1988).
Se considera que Ticlopidine o Clopidogrel
usados como agentes antiplaquetas actúan por inhibición del receptor
P2T_{AC} del ADP mediante su metabolito en un cuerpo (Savi, P.
J., Pharmacol. Exp. Ther., 269, 772-777, 1994).
Además, el ARL67085, cuando se sintetiza como derivado de trifosfato
de adenosina (ATP) que es un antagonista del receptor ADP en un
cuerpo, muestra actividad supresora de la agregación de plaquetas
por actividad agonista frente al receptor P2T_{AC} del ADP de las
plaquetas, y la eficacia del mismo se demuestra usando un modelo de
trombosis. (Mills, D. C., Thromb. Hemost., 76,
835-856, 1996; y Humphries, R. G., Trends Pharmacol.
Sci., 16, 179-181, 1995). Además, un derivado del
Ap4A
[P^{1},P^{4}-di(adenosina-5')tetrafosfato]
muestra actividad supresora de la agregación de las plaquetas por
el ADP, mediante la actividad antagonista frente al receptor
P2T_{AC} del ADP de las plaquetas, y la eficacia del mismo se
demuestra usando un modelo de trombosis (Kim, B. K., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 89, 2370-2373, 1992).
A partir de la información anterior, se desea un
antagonista frente al receptor P2T_{AC} del ADP de las plaquetas
que sea un fuerte agente antiplaquetas. Sin embargo, Ticlopidine o
Clopidogrel muestran una débil actividad antiplaquetas y tienen
problemas tales como fuertes efectos secundarios o similares.
Además, el ARL67085 o derivados del mismo (análogos del ATP), los
derivados del Ap4A, o similares, que se han estudiado como
antagonistas del receptor del ADP son derivados de nucleótidos y por
tanto su biodisponibilidad oral no es suficiente, y aparecen
problemas adicionales tales como, una débil actividad supresora de
la agregación de plaquetas. Por tanto, se desea intensamente un
antagonista del receptor del ADP que tenga una fuerte
biodisponibilidad oral (CAPRIE STEERING COMMITTEE, Lancet, 348,
1329-1339, 1996). Sin embargo, no se ha identificado
todavía la proteína P2T_{AC} del receptor de ADP. Por tanto, es
difícil construir un sistema conveniente para seleccionar dicho
compuesto y, más aún, no ha progresado el desarrollo de antagonistas
P2T_{AC} del receptor de ADP.
En relación con esto, respecto a un ADN que
codifique un polipéptido constituido por la misma secuencia de
aminoácidos que la proteína P2T_{AC} del receptor de ADP humano,
que se pueda usar en la presente invención, y una secuencia de
aminoácidos deducida a partir del ADN, hay varios informes
(Documento WO 00/22131, Documento WO 00/31258, Documento WO
00/28028, y Documento WO 98/50549). Sin embargo, no se elucidan los
ligandos en los informes, y ninguno de los informes describe que la
proteína es un receptor de ADP localizado en las plaquetas.
Por tanto, el objeto de la presente invención es
proporcionar un sistema de selección conveniente para obtener un
antagonista P2T_{AC} del receptor del difosfato de adenosina (ADP)
que sea útil como agente antiplaquetas, y un nuevo agente
antiplaquetas.
Con el deseo de resolver los problemas
anteriormente mencionados, los inventores de la presente invención
han realizado intensos estudios y, como resultado, han aislado con
éxito un ácido nucleico (más concretamente un gen HORK3) que
codifica el receptor P2T_{AC}, y han determinado la secuencia de
nucleótidos del mismo y la secuencia de aminoácidos deducida.
Además, los inventores han preparado un vector que comprende el
ácido nucleico que codifica el receptor y una célula huésped que
comprende el vector, y han hecho posible la producción de un nuevo
receptor P2T_{AC} recombinante, mediante la expresión del receptor
P2T_{AC} por uso de la célula huésped. Los inventores confirmaron
que el receptor mostraba una actividad P2T_{AC} del receptor de
ADP, y por tanto el receptor y la célula que expresa el receptor,
podrían usarse como herramienta de selección de un agente
antiplaquetas. Los inventores establecieron un procedimiento para
detectar si un compuesto de ensayo es o no es un ligando,
antagonista, o agonista del P2T_{AC} del receptor de ADP mediante
el uso del receptor o de la célula que expresa el receptor, y un
procedimiento para seleccionar un agente antiplaquetas usando el
procedimiento de detección. Los inventores confirmaron que los
compuestos por mostrar una actividad antiplaquetas (de manera más
particular 2MeSAMP o AR-C69931MX) mostraron una
actividad antagonista del receptor, mediante el uso del
procedimiento de detección y demostraron que un antagonista del
receptor era ciertamente útil como agente antiplaquetas. Además,
los inventores establecieron un procedimiento para la fabricación
de una composición farmacéutica para antiplaquetas, que comprende la
etapa de detección y completaron la presente invención.
A saber, la presente invención se refiere a:
[1] una herramienta de selección para un agente
antiplaqueta, en el que la herramienta es
- (1)
- un polipéptido (denominado algunas veces a partir de ahora en el presente documento como "proteína P2T_{AC} del receptor de ADP humano") que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC DE ID Nº: 2, o
- (2)
- un polipéptido (denominado a partir de ahora en el presente documento como "variación funcionalmente equivalente") que tiene una secuencia de aminoácidos en la que se borran, sustituyen y/o añaden uno o varios aminoácidos en una o varias posiciones en una secuencia de aminoácidos de la SEC DE ID Nº 2, y que presentan una actividad (denominada a partir de ahora en el presente documento como "actividad P2T_{AC} del receptor de ADP") de supresión de una actividad de la adenilato ciclasa por enlace con el ADP y acoplamiento con Gi:
[2] una herramienta de selección de un agente
antiplaquetas, en la que la herramienta es un polipéptido
(denominada a partir de ahora en el presente documento como
"proteína homóloga") que tiene una secuencia de aminoácidos
que tiene una homología del 90% o más con la secuencia de
aminoácidos de la SEC DE ID Nº: 2, y presenta una actividad de
supresión de la actividad de la adenilato ciclasa por enlace con el
ADP y acoplamiento con Gi (a partir de ahora en el presente
documento, las herramientas de selección de los puntos [1] y [2] de
un agente antiplaquetas y denominadas colectivamente como
"herramienta de selección tipo polipéptido de un agente
antiplaquetas");
[3] una herramienta de selección para un agente
antiplaquetas, en la que la herramienta es un transformante que
está transformado con un vector de expresión que comprende un ADN
que codifica (1) un polipéptido que tiene una secuencia de
aminoácidos de la SEC DE ID Nº: 2 (es decir, la proteína P2T_{AC}
del receptor de ADP humano) o (2) un polipéptido que tiene una
secuencia de aminoácidos en la que se borran, sustituyen, y/o
añaden uno o varios aminoácidos en una o varias posiciones en una
secuencia de aminoácidos de la SEC DE ID Nº: 2, y que presentan
una actividad de supresión de la actividad de la adenilato ciclasa
por enlace con el ADP y acoplamiento con Gi (es decir, la variación
funcionalmente equivalente), y se expresa el polipéptido;
[4] una herramienta de selección de un agente
antiplaquetas, en la que la herramienta es un transformante que
está transformado con un vector de expresión que comprende un ADN
que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos
que tiene una homología del 90% o superior con la secuencia de
aminoácidos de la SEC DE ID Nº: 2, y muestra actividad supresora de
la actividad de la adenilato ciclasa por enlace con el ADP y
acoplamiento con Gi (es decir, la proteína homóloga), y expresa el
polipéptido partir de ahora en el presente documento las
herramientas de selección de los puntos [3] y [4] de un agente
antiplaquetas se denominan colectivamente como "herramienta de
selección tipo transformante de un agente antiplaquetas");
[5] un procedimiento para detectar si un
compuesto a ensayar es o no un ligando de la P2T_{AC} del receptor
de ADP, que comprende las etapas de:
- poner en contacto un polipéptido de los puntos [1] ó [2] (es decir, la proteína P2T_{AC} del receptor de ADP humano, una variación funcionalmente equivalente, o una proteína homóloga), una fracción de membrana celular que comprende el polipéptido, o un transformante de los puntos [3] ó [4], con el compuesto a ensayar, en presencia de un ligando marcado de un P2T_{AC} del receptor de ADP,
- y
- analizar la variación de la cantidad de ligando marcado que se enlaza con el polipéptido, la fracción de membrana celular, o el transformante (denominado a partir de ahora en el presente documento como "procedimiento de detección del ligando");
[6] un procedimiento para detectar si un
compuesto a ensayar es o no un antagonista o agonista del P2T_{AC}
del receptor de ADP, que comprende las etapas de:
- poner en contacto el compuesto a ensayar con un transformante de los puntos [3] ó [4] que coexpresan una proteína G quimérica que comprende un fragmento del polipéptido que tiene una actividad estimulante de la actividad de una fosfolipasa C de una proteína G que estimula la actividad de la fosfolipasa C y un fragmento de polipéptido que tiene actividad acoplada al receptor de Gi, dicha proteína G quimérica tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC DE ID Nº: 11 en el término C; y
- analizar la variación de la concentración de Ca^{2+} en el transformante (denominado a partir de ahora en el presente documento como "procedimiento de detección tipo Ca^{2+}");
[7] un procedimiento para detectar si un
compuesto a ensayar es o no un antagonista o agonista del P2T_{AC}
del receptor de ADP, que comprende las etapas de:
- poner en contacto un transformante de los puntos [3] ó [4] con el compuesto a ensayar, en presencia de un agonista del P2T_{AC} del receptor de ADP de las plaquetas, y
- analizar la variación de la concentración de AMPc intracelular en el transformante (denominado a partir de ahora en el presente documento como "procedimiento de detección tipo AMPc");
[8] un procedimiento para seleccionar un agente
antiplaquetas que comprende las etapas de:
- detectar si un compuesto a ensayar es o no un ligando antagonista o agonista del P2T_{AC} del receptor de ADP, mediante el procedimiento de detección del ligando, el procedimiento de detección tipo Ca^{2+}, o el procedimiento de detección tipo AMPc, o una combinación de los mismos, y seleccionar el antagonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP; y
[9] un procedimiento para fabricar una
composición farmacéutica para antiplaquetas, que comprende las
etapas de: detectar si un compuesto a ensayar es o no un ligando
antagonista o agonista del P2T_{AC} del receptor de ADP, mediante
el procedimiento de detección del ligando, el procedimiento de
detección tipo Ca^{2+}, o el procedimiento de detección tipo
AMPc, o una combinación de los mismos, y preparar un
medicamento.
La "Gi" es una subfamilia de las proteínas
G que se acoplan a un receptor, y funcionan como una señal de
transducción y factor de amplificación en una célula, y una
proteína G que suprime la actividad de la adenilato ciclasa. Cuando
se suprime, por ejemplo, la actividad de la adenilato ciclasa,
disminuye la concentración intracelular de AMPc.
La "proteína G" que estimula la actividad
de la fosfolipasa C es una subfamilia de las proteínas G que se
acoplan a un receptor, y funcionan como una señal de transducción y
factor de amplificación en una célula, y una proteína G que
estimula la actividad de la fosfolipasa C. Cuando se induce la
actividad de la fosfolipasa C, por ejemplo, aumenta la
concentración intracelular de Ca^{2+}. Como proteína G que
estimula la actividad de la fosfolipasa C se puede mencionar, por
ejemplo, la Gq.
El "P2T_{AC} del receptor de ADP "
significa un polipéptido que tiene el P2T_{AC} del receptor de
ADP.
La Fig. 1 es un gráfico que muestra el efecto de
2MeSAMP sobre la agregación de plaquetas inducida por ADP en un
plasma rico en plaquetas (PRP) derivado de sangre humana tratado con
citrato de sodio.
La Fig. 2 es un gráfico que muestra el efecto de
AR-C69931MX sobre la agregación de plaquetas
inducida por ADP en PRP derivado de sangre humana tratado con
citrato de sodio.
La presente invención se explicará en detalle a
partir de ahora en el presente documento.
La herramienta de selección de la presente
invención de un agente antiplaquetas incluye una herramienta de
selección de tipo polipéptido de un agente antiplaquetas y una
herramienta de selección de tipo transformante de un agente
antiplaquetas.
La herramienta de selección de tipo polipéptido
de la presente invención de un agente antiplaquetas incluye
(i) una herramienta de selección de un agente
antiplaquetas, en la que la herramienta es el P2T_{AC} del
receptor de la proteína ADP humana, es decir, el polipéptido que
tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID. Nº: 2;
(ii) una herramienta de selección de un agente
antiplaquetas, en la que la herramienta es una variación
funcionalmente equivalente, es decir, un polipéptido que tiene una
secuencia de aminoácidos en la que uno o varios aminoácidos se han
borrado, sustituido, y/o añadido en una o varias posiciones de la
secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID. Nº: 2, y muestra la
actividad del P2T_{AC} del receptor de ADP; y
(iii) una herramienta de selección de un agente
antiplaquetas, en la que la herramienta es una proteína análoga, es
decir, un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que
tiene una homología del 90% o más con la secuencia de aminoácidos
de la SEC. DE ID. Nº: 2, y muestra la actividad P2T_{AC} del
receptor de ADP.
El polipéptido que tiene la secuencia de
aminoácidos de la SEC. DE ID. Nº: 2, que se puede usar como la
herramienta de selección de tipo polipéptido de la presente
invención de un agente antiplaquetas, es una proteína P2T_{AC}
del receptor de ADP humana constituida por 342 residuos de
aminoácido. Aunque se ha sugerido que la proteína P2T_{AC} del
receptor de ADP proteína existe en las plaquetas, la realidad de la
misma no se ha identificado hasta que los inventores de la presente
invención elucidaron su función por vez primera.
Por tanto, se publicó por primera vez en una
referencia tras la fecha de prioridad de la presente solicitud que
el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE
ID. Nº: 2 receptor del ADP de las plaquetas [Nature, 409, 11 enero
2001, 202-207; J. B. C., 276, (11), marzo 16,
8608-8615, 2001; Documento WO01/46454]. En la
solicitud de patente básica de la prioridad del Documento
WO01/46454, aunque se clonó un gen del receptor de ADP de rata, y
se determinó la secuencia de la misma, como para el receptor de ADP
humano, solamente se obtuvo un clon que contenía una secuencia
parcial, y se determinó la secuencia de la misma. Por tanto, se
lleva a cabo por primera vez por parte del solicitante actual la
obtención de la proteína P2T_{AC} del receptor de ADP humano y
del polinucleótido que codifica la anterior, se elucidó la función
de las misma, y se ha presentado una solicitud de patente referida
a la invención del procedimiento para seleccionar un agente
antiplaquetas.
La variación funcionalmente equivalente que se
puede usar como la herramienta de selección de tipo polipéptido de
la presente invención de un agente antiplaquetas no está limitada en
particular, siempre que sea un polipéptido que tenga una secuencia
de aminoácidos en la que uno o más aminoácidos (preferiblemente
entre 1 y 10, más preferiblemente entre 1 y 5) están borrados,
sustituidos, y/o añadidos en una o varias posiciones de la secuencia
de aminoácidos de la SEC. DE ID. Nº: 2, y muestra la actividad
P2T_{AC} del receptor de ADP. Demás, el origen de la variación
funcionalmente equivalente no se limita al ser humano.
La variación funcionalmente equivalente incluye,
por ejemplo, variaciones humanas de la P2T_{AC} del receptor de
ADP humano, y P2T_{AC} de receptores de ADP derivados de
organismos diferentes al ser humano (tal como un ratón, una rata,
un hámster, o un perro), o variaciones de los mismos, y otras
proteínas obtenidas mediante modificación artificial de estas
proteínas nativas, (es decir, variaciones humanas, o P2T_{AC} de
receptores de ADP derivados de organismos diferentes al ser humano
o variaciones de los mismos) o de la P2T_{AC} del receptor de ADP
humano por técnicas de ingeniería genética. El término
"variación" tal como se usa en el presente documento significa
una diferencia individual entre las mismas proteínas en la misma
especie o una diferencia entre proteínas homólogas en varias
especies.
Las variaciones humanes de la P2T_{AC} del
receptor de ADP humano, o las P2T_{AC} de receptores de ADP
derivados de organismos diferentes al ser humano se pueden obtener
por las personas expertas en la técnica basándose en la información
de una secuencia de nucleótidos (por ejemplo, la secuencia de
nucleótidos de la SEC. DE ID. Nº: 1) del gen de la P2T_{AC} del
receptor de ADP. En relación con esto, se pueden llevas a cabo
técnicas de ingeniería genética de acuerdo con procedimientos
conocidos (por ejemplo, Maniatis, T. y col., "Molecular
Cloning-A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor
Laboratory, NY, 1982, o similares), a no ser que se especifique otra
cosa.
Por ejemplo, se diseñan una sonda apropiada o
cebadores apropiados de acuerdo con la información de la secuencia
base del gen de la P2T_{AC} del receptor de ADP. Se lleva a cabo
un procedimiento PCR o un procedimiento de hibridación usando una
muestra (por ejemplo, ARN total o un resto de ARNm, una biblioteca
de ADNc, o una biblioteca de fagos) derivado de un organismo (por
ejemplo, un mamífero tal como un ser humano, un ratón, una rata, un
hámster, o un perro) de interés, y los cebadores o la sonda para
obtener un gen que codifica la proteína. Se puede obtener una
proteína deseada expresando el gen resultante en un sistema de
expresión adecuado, y confirmando que la proteína expresada suprime
la actividad de la adenilato ciclasa por enlace con el ADP y
acoplamiento con Gi, por ejemplo, mediante el procedimiento descrito
en el Ejemplo 3 ó 4.
Además, se puede obtener la proteína modificada
de forma artificial por técnicas de ingeniería genética mediante
por ejemplo, el siguiente procedimiento. Se obtiene un gen que
codifica la proteína mediante un procedimiento convencional tal
como la mutagénesis específica del emplazamiento (Mark, D. F. y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5662-5666,
1984). Se puede obtener una proteína deseada expresando el gen
resultante en un sistema de expresión adecuado, y confirmando que
la proteína expresada suprime la actividad de la adenilato ciclasa
por enlace con el ADP y acoplamiento con Gi, por ejemplo, mediante
el procedimiento descrito en el Ejemplo 3 ó 4.
La proteína homóloga que se puede usar como la
herramienta de selección de tipo polipéptido de la presente
invención de un agente antiplaquetas no está limitada de forma
particular, siempre que sea un polipéptido que tenga una secuencia
de aminoácidos que tenga una homología del 90% o más con la
secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID. Nº: 2, y muestra la
actividad de la P2T_{AC} del receptor de ADP. La proteína
homóloga puede tener una secuencia de aminoácidos que tenga
preferiblemente una homología del 95% o más, más preferiblemente
una homología del 98% o más, lo más preferible una homología del 99%
o más, con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID.
Nº: 2.
El término "homología" tal como se usa en
el presente documento significa un valor que se puede obtener
mediante el paquete BLAST [Basic local alignment search tool;
Altschul, S. F. y col., J. Mol. Biol., 215, 403-410,
(1990)]. La homología en la secuencia de aminoácidos se puede
calcular mediante el algoritmo de búsqueda BLAST. De manera más
concreta, este valor se puede obtener usando un programa bl2seq
(Tatiana A. Tatusova y Thomas L. Madden, FEMS Microbiol. Lett.,
174, 247-250, 1999) con un parámetro por defecto en
un paquete BLAST (edición sgi32bit, versión 2,0,12; obtenida de
NCBI). Los parámetros por defecto en el programa bl2seq incluyen
"blastp" como el programa de búsqueda, "0" como el coste
de extender una separación, "SEG" como filtro de la secuencia
de petición, y "BLOSUM62" como matriz.
Los polipéptidos que se pueden usar como la
herramienta de selección de tipo polipéptido de la presente
invención de un agente antiplaquetas (es decir, la proteína
P2T_{AC} del receptor de ADP humano, las variaciones
funcionalmente equivalentes, y las proteínas homólogas; denominados
partir de ahora en el presente documento como "el polipéptido de
la herramienta de selección") se pueden obtener mediante
diferentes procedimientos conocidos, tales como técnicas conocidas
de ingeniería genética usando un gen que codifica la proteína de
interés. Más concretamente, el polipéptido de la herramienta de
selección se puede preparar mediante el cultivo de un transformante
que se describe más adelante (es decir, un transformante que se
transforma con un vector de expresión que comprende un ADN que
codifica que el polipéptido de la herramienta de selección y expresa
el polipéptido) en condiciones en las que se puede llevar a cabo la
expresión del polipéptido de la herramienta de selección, y
separando y purificando la proteína de interés del cultivo
resultante mediante procedimientos comúnmente usados para la
separación y purificación de proteínas del
receptor.
receptor.
Cuando se prepara el polipéptido de la
herramienta de selección, el procedimiento para obtener el gen que
codifica el polipéptido no está limitado en particular. Por ejemplo,
cuando se prepara la proteína P2T_{AC} del receptor de ADP
humano, se puede usar por ejemplo, el ADN constituido por la
secuencia de nucleótidos de la SEC. DE ID. Nº: 1 como el gen que
codifica la proteína. A este respecto, se conocen codones para cada
aminoácido, y de manera opcional se pueden selección y determinar
por procedimientos convencionales, por ejemplo, tomando un uso del
codón de cada huésped para tomar en consideración Crantham, R. y
col., Nucleic Acids Res., 9, r43-r74, 1981).
Se puede obtener el ADN constituido por la
secuencia de nucleótidos de la SEC. DE ID. Nº: 1 por ejemplo,
enlazando fragmentos de ADN preparados mediante un procedimiento de
síntesis química, o un procedimiento de reacción en cadena de la
polimerasa PCR) (Saiki, R. K. y col., Science, 239,
487-491, 1988) usando una biblioteca de ADN
derivados de una célula o tejido capaz de producir la proteína
P2T_{AC} del receptor de ADP humano como plantilla, y un conjunto
adecuado de cebadores diseñados de acuerdo con la secuencia de
nucleótidos de la SEC. DE ID. Nº: 1. Como célula o tejido capaz de
producir la proteína P2T_{AC} del receptor de ADP humano se
pueden mencionar, por ejemplo, plaquetas humanas, el cerebro humano,
o similares. Como el conjunto de cebadores, se pueden mencionar,
por ejemplo, una combinación de un oligonucleótido constituido por
la secuencia de nucleótidos de la SEC. DE ID. Nº: 3 y un
oligonucleótido constituido por la secuencia de nucleótidos de la
SEC. DE ID. Nº: 4.
El procedimiento de purificación y separación
que se puede usar para preparar el polipéptido de la herramienta de
selección no está particularmente limitado, sino que se puede
realizar, por ejemplo, de acuerdo con el siguiente procedimiento.
Por ejemplo, se puede obtener un resto de membrana celular que
contiene el polipéptido de la herramienta de selección cultivando
células que expresan el polipéptido de la herramienta de selección
en la superficie de las mismas, suspender las células cultivadas en
un tampón, homogeneizar la suspensión, y centrifugar el homogenato.
Tras la solubilización del resto de membrana celular resultante, se
puede purificar el polipéptido de la herramienta de selección
tratando la mezcla con un tratamiento usado normalmente con un
precipitante de proteína, ultrafiltración, diferentes técnicas de
cromatografía líquida tal como la cromatografía de tamiz molecular
(filtración en gel), cromatografía de adsorción, cromatografía de
afinidad, o cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), o
diálisis, o una combinación de las mismas. A este respecto, cuando
se solubiliza el resto de membrana celular, se pueden mantener las
características del receptor tras la solubilización usando un
agente solubilizante tan suave como sea posible (tal como CHAPS,
Triton X-100, digitonina o similares).
Cuando se prepara el polipéptido de la
herramienta de selección, se puede llevar a cabo con facilidad la
confirmación de la localización intracelular del mismo, la
purificación del mismo, o similar, expresando el polipéptido de la
herramienta de selección en forma de proteína de de fusión con una
secuencia de marcación marco adecuada, si es necesario. Como
secuencia de marcación se puede mencionar, por ejemplo, un epítopo
FLAG, una marca de hexa-histidina, una marca de
hemoaglutinina, un epítopo myc, o similares. Además, mediante la
inserción de una secuencia específica que se puede reconocer
mediante una proteasa tal como una enteroquinasa, factor Xa,
trombina, o similares entre la secuencia de marcación y el
polipéptido de la herramienta de selección, se puede eliminar la
secuencia de marcación mediante la proteasa. Por ejemplo, hay un
informe en el que el receptor muscarínico de la acetilcolina y una
marca de hexa-histidina se conectaron mediante una
secuencia de reconocimiento de la trombina (Hayashi, M. K. y Haga,
T., J. Biochem., 120, 1232-1238, 1996).
La herramienta de selección de tipo
transformante de la presente invención de un agente antiplaquetas
incluye
(i) una herramienta de selección de un agente
antiplaquetas, en la que la herramienta es un transformante que se
transforma con un vector de expresión que comprende un ADN que
codifica la proteína P2T_{AC} del receptor de ADP humano y que
expresa el polipéptido;
(ii) una herramienta de selección de un agente
antiplaquetas, en la que la herramienta es un transformante que se
transforma con un vector de expresión que comprende un ADN que
codifica la variación funcionalmente equivalente y que expresa el
polipéptido; y
(iii) una herramienta de selección de un agente
antiplaquetas, en la que la herramienta es un transformante que se
transforma con un vector de expresión que comprende un ADN que
codifica la proteína homóloga y que expresa el polipéptido.
Una célula huésped que se puede usar para la
preparación de los transformantes (denominados a partir de ahora en
el presente documento como "transformante de la herramienta de
selección") que se puede usar como la herramienta de selección
de tipo transformante de la presente invención de un agente
antiplaquetas no está limitada en particular, siempre que se pueda
expresar el polipéptido de la herramienta de selección. Como célula
huésped, se pueden mencionar, microorganismos conocidos de uso
habitual tales como Escherichia coli o Saccharomyces
cerevisiae, o células cultivadas conocidas, tales como células
de vertebrados, por ejemplo, una célula CHO, una célula HEK293, o
una célula COS) o células de insectos (por ejemplo, una célula
Sf9l). Como la célula de vertebrado se pueden mencionar, por
ejemplo, una célula COS como una célula de simio (Gluzman, Y., Cell,
23, 175-182, 1981), una cepa de ovario de hámster
chino defectiva en dihidrofolato reductasa (CHO) (Urlaub, G. y
Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77,
4216-4220, 1980), una célula HEK293 derivada de
riñón de embrión humano, una célula 293-EBNA
(Invitrogen) obtenida introduciendo un gen EBNA-1 de
virus Epstein Barr en la célula HEK293.
Un vector de expresión que se puede usar para la
preparación del transformante de la herramienta de selección no
está limitado en particular, siempre que se pueda expresar el
polipéptido de la herramienta de selección. Se puede seleccionar un
vector de expresión apropiado de acuerdo con la célula huésped a
usar.
Como vector de expresión de una célula de
vertebrado, se puede usar por lo general un vector que contiene un
promotor colocado corriente arriba del gen a expresar, un
emplazamiento de ayustado del ARN, un emplazamiento de
poliadenilación, una secuencia de finalización de la transcripción y
similares. El vector puede contener además un origen de
replicación, si es necesario. Como vectores de expresión se pueden
mencionar, por ejemplo, el vector pSV2dhfr que contiene un promotor
temprano SV40 (Subramani, S. y col., Mol. Cell. Biol., 1,
854-864, 1981), pEF-BOS que
contiene un factor promotor de elongación humano (Mizushima, S. y
Nagata, S., Nucleic Acids Res., 18,5322, 1990), pCEP4 que contiene
un promotor de citomegalovirus (Invitrogen), o similares.
De forma más particular, cuando se usa COS como
célula huésped, se puede usar como el vector de expresión un vector
que tiene un origen de replicación SV40, capaz de realizar una
replicación autónoma en la célula COS, y que tiene un promotor de
transcripción, una señal de finalización de la transcripción y un
emplazamiento de ayustado del ARN. Como vectores, se pueden
mencionar, por ejemplo, pME18S (Maruyama, K. y Takebe, Y., Med.
Immunol., 20, 27-32, 1990), pEF-BOS
(Mizushima, S. y Nagata, S., Nucleic Acids Res., 18, 5322, 1990),
pCDM8 (Seed, B., Nature, 329, 840-842, 1987), o
similares.
El vector de expresión se puede incorporar en
las células COS mediante, por ejemplo, un procedimiento
DEAE-dextrano (Luthman, H. Y Magnusson, G., Nucleic
Acids Res., 11, 1295-1308, 1983), un procedimiento
de coprecipitación de fosfato de calcio - ADN (Graham, F. F. y van
der Ed, a, J. Virology, 52, 456-457, 1973), un
procedimiento que usa un reactivo de liposoma catiónico
(lipofectamine; Gibco BRL), un procedimiento de electroporación
(Neumann, E. y col., EMBO J., 1, 841-845, 1982), o
similares.
\newpage
Cuando se usa la célula CHO como célula huésped,
se puede obtener un transformante capaz de producir de manera
estable el polipéptido de la herramienta de selección llevando a
cabo la cotransfectación de un vector de expresión que comprende el
ADN que codifica el polipéptido de la herramienta de selección,
junto con un vector capaz de expresar un neogen que funciona como
un marcador de resistencia a G418 tal como pRSVneo (Sambrook, J. y
col., "Molecular Cloning-A Laboratory Manual",
Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989), pSV2-neo
(Southern, P. J. y Berg, P., J. Mol. Appl. Genet., 1,
327-341,1982), o similares, y seleccionar una
colonia resistente a G418.
Cuando se usa la célula 293-EBNA
como célula huésped, por ejemplo, se puede usar pCEP4 (Invitrogen)
que contiene origen de replicación de virus Epstein Barr y es capaz
de realizar una replicación autónoma en la célula
293-EBNA o similares como el vector de
expresión.
El transformante de la herramienta de selección
se puede cultivar de acuerdo con un procedimiento convencional, y
el polipéptido de la herramienta de selección se produce en la
célula o en la superficie celular. Como medio a usar en el cultivo,
se puede seleccionar de manera apropiada un medio habitualmente
usado en una célula huésped seleccionada, se pueden usar por
ejemplo, un medio tal como un medio RPMI-1640, un
medio mínimo esencial de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), o
similares, suplementándolos con un componente seral tal como suero
fetal bovino (FBS) o similares si es necesario. En el caso de las
células 293-EBNA, se puede usar un medio tal como
un medio mínimo esencial de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) o
similar suplementándolo con un componente seral tal como suero
fetal bovino (FBS) o similares, y G418.
El transformante de la herramienta de selección
no está limitado en particular, siempre que se exprese el
polipéptido de la herramienta de selección. Como transformante de la
herramienta de selección, es preferible que exprese una proteína G
en la que la secuencia de aminoácidos en el término C sea la de la
SEC. DE ID. Nº: 11
(Asp-Cys-Gly-Leu-Fe),
además de la del polipéptido de la herramienta de selección. La
secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID. Nº: 11 es aquella que
está constituida por cinco residuos de aminoácido en el término C
de Gi. A partir de ahora en el presente documento, la "proteína G
en la que la secuencia de aminoácidos en el término C sea la de la
SEC. DE ID. Nº: 11" se denomina como "proteína G de tipo Gi en
el término C".
Como Proteína G de tipo Gi en el término C, se
pueden mencionar, por ejemplo,
(1) Gi, o
(2) una proteína G quimérica que comprende un
fragmento de polipéptido que tiene actividad estimulante de la
fosfolipasa C de una proteína G (tal como Gq) que estimula la
actividad de la fosfolipasa C y un fragmento de polipéptido que
tiene la actividad de Gi acoplada con el receptor, y que además
tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID. Nº: 11 en el
término C. A partir de ahora en el presente documento, la proteína G
quimérica que comprenden un fragmento de polipéptido que tiene la
actividad estimulante de la actividad de la fosfolipasa C y un
fragmento de polipéptido que tiene la actividad de Gi acoplada con
el receptor se denominará como Gqi.
El polipéptido de la herramienta de selección
reconoce la secuencia de aminoácidos constituida por cinco residuos
de aminoácido en el término C de Gi (es decir, la secuencia de
aminoácidos de la SEC. DE ID. Nº: 11), y se enlaza con Gi. Por
tanto, el polipéptido de la herramienta de selección se puede
enlazar no solamente con Gi, sino también con Gqi. Cuando el
polipéptido de la herramienta de selección y la Proteína G de tipo
Gi en el término C se expresan en el transformante de la
herramienta de selección, estos polipéptidos se pueden enlazar entre
sí en la célula.
El "fragmento de polipéptido que tiene la
actividad estimulante de la actividad de la fosfolipasa C de Gq"
no está limitado en particular, siempre que o comprenda una
secuencia de aminoácidos en el término C que sea necesaria para
enlazarse a una P2T_{PLC} del receptor del ADP de las plaquetas
acoplada con Gq, y muestra la actividad estimulante de la actividad
de la fosfolipasa C. Se pueden mencionar, por ejemplo, un fragmento
de polipéptido en el lado del término N de Gq en el que se borra la
secuencia de aminoácidos constituida por cinco residuos de
aminoácido en el término C.
El "fragmento de polipéptido que tiene una
actividad acoplada a receptor de Gi" no está limitada en
particular, siempre que comprenda la secuencia de aminoácidos
constituida por cinco residuos de aminoácido en el término C de Gi,
y no muestre actividad supresora de la actividad de de la adenilato
ciclasa. Se pueden mencionar, por ejemplo, un fragmento de
polipéptido en el lado del término C de Gi, constituida por la
secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID. Nº: 11.
Se puede detectar si un compuesto de ensayo es o
no un ligando, antagonista, o agonista, de la P2T_{AC} del
receptor de ADP usando el polipéptido de la herramienta de selección
o el transformante de la herramienta de selección como herramienta
de detección.
El procedimiento de la presente invención para
detectar si un compuesto de ensayo es o no un ligando, antagonista,
o agonista, de la P2T_{AC} del receptor de ADP incluye:
1) un procedimiento para detectar si un
compuesto de ensayo es o no un ligando de la P2T_{AC} del receptor
de ADP de las plaquetas (es decir, procedimiento de detección de
ligando);
2) un procedimiento para detectar si un
compuesto de ensayo es o no un antagonista o agonista de la
P2T_{AC} del receptor de ADP de las plaquetas, mediante el uso de
las variaciones de la concentración de Ca^{2+} intracelular en el
transformante como indicador (es decir, procedimiento de detección
tipo Ca^{2+});
3) un procedimiento para detectar si un
compuesto de ensayo es o no un antagonista o agonista de la
P2T_{AC} del receptor de ADP de las plaquetas, mediante el uso de
las variaciones en el contenido de AMPc intracelular en el
transformante como indicador (es decir, procedimiento de detección
tipo AMPc); y
4) un procedimiento para detectar si un
compuesto de ensayo es o no un antagonista o agonista de la
P2T_{AC} del receptor de ADP de las plaquetas, mediante el uso de
un procedimiento de enlace GTP\gammaS (es decir, procedimiento de
detección tipo GTP GTP\gammaS).
Estos procedimientos de detección se explicarán
en este orden a partir de ahora en el presente documento.
El procedimiento de detección de ligando de la
presente invención no está limitado en particular, siempre que
(i) la proteína P2T_{AC} del receptor de ADP
humano, variación funcionalmente equivalente, o proteína homóloga
(a partir de ahora en el presente documento denominado como
"polipéptido de la herramienta de detección"), un resto de
membrana celular que comprende el polipéptido de la herramienta de
detección, o un transformante que expresa el polipéptido de la
herramienta de detección (a partir de ahora en el presente documento
el polipéptido de la herramienta de detección, el resto de membrana
celular, y el transformante se denominan colectivamente como
"herramienta de detección de ligando") y
(ii) se usa un ligando marcado. Se puede llevar
a cabo, por ejemplo, de acuerdo con el siguiente procedimiento.
Se prepara la herramienta de detección de
ligando. Se optimizan las condiciones de ensayo (por ejemplo, el
tampón a usar y concentración del mismo, iones a añadir al tampón y
concentración de las mismas, y el pH del sistema de ensayo). La
herramienta de detección de ligando y un ligando marcado se incuban
en el tampón optimizado, junto con un compuesto de ensayo, durante
un tiempo predeterminado. Como ligando marcado se puede usar por
ejemplo, [^{3}H] 2-tío-ADP
(2mesadp). Tras la reacción, el conjunto se mezcla con un filtro de
vidrio o similar, y el filtro se lava con un volumen apropiado del
tampón. Se mide la radiactividad remanente en el filtro mediante un
contador de centelleo en medio líquido o similar. Se puede detectar
si el compuesto de ensayo es o no un ligando de la P2T_{AC} del
receptor de ADP, mediante la inhibición del enlace obtenida con el
ligando radiactivo como indicador. De manera más concreta, cuando la
radiactividad residual en el filtro en presencia del compuesto de
ensayo es menor que en ausencia del compuesto de ensato, se puede
decidir que el compuesto de ensayo es un ligando de la P2T_{AC}
del receptor de ADP. Se puede llevar a cabo, por ejemplo, en las
condiciones que se describen en el Ejemplo 6.
En el procedimiento de detección tipo Ca^{2+}
de la presente invención, un transformante (a partir de ahora en el
presente documento denominado como transformante de la detección
tipo Ca^{2+}) se coexpresan:
(i) el polipéptido de la herramienta de
detección y
(ii) se usa como transformante una proteína G
quimérica (tal como Gqi) que comprende un fragmento de polipéptido
que tiene la actividad estimulante de la actividad de la fosfolipasa
C de una proteína G estimulante de la actividad de la fosfolipasa C
y un fragmento de polipéptido que tiene una actividad acoplada a
receptor de Gi, y que además tiene una secuencia de aminoácidos de
la SEC. DE ID. Nº: 11 en el término C. Como transformante, es
preferible usar como célula huésped una célula en la que la
concentración intracelular de Ca^{2+} no aumente debido al ADP
antes de la transformación. Como célula huésped, se pueden
mencionar, por ejemplo, C6-15, una de las líneas de
glioma de rata (Change, K. y col., J. Biol. Chem., 270,
26152-26158, 1995).
En el caso de detectar si un compuesto de ensayo
es o no un agonista en el procedimiento de detección tipo Ca^{2+}
de la presente invención, el transformante del procedimiento de
detección tipo Ca^{2+} se pone en contacto con un compuesto de
ensayo, y a continuación se analizan las variaciones en la
concentración intracelular de Ca^{2+} (es decir, medidas o
detectadas), de forma directa o indirecta. Las variaciones en la
concentración intracelular de Ca^{2+} se pueden, por ejemplo,
analizar directamente mediante el uso de un reactivo fluorescente
que se enlace con el calcio, (tales como fura2, fluo3, o similares),
o analizar indirectamente analizando la actividad transcripcional
de un gen [tal como un gen obtenido mediante la introducción de una
secuencia responsable de una proteína activadora 1 (AP1) corriente
arriba de un gen de la luciferasa] en la que la regulación de la
transcripción es dependiente de la concentración de Ca^{2+}.
Cuando el transformante del procedimiento de
detección tipo Ca^{2+} se pone en contacto con un compuesto de
ensayo, y a continuación aumenta la concentración intracelular de
Ca^{2+} en su interior, se puede decidir si el compuesto de
ensayo es un agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP. A este
respecto, como control, se lleva a cabo un procedimiento similar
usando un transformante de control que no expresa el polipéptido de
la herramienta de detección pero que expresa Gqi, o una célula
huésped antes de la transformación, en lugar del transformante del
procedimiento de detección tipo Ca^{2+} coexpresando el
polipéptido de la herramienta de detección y Gqi, y por lo tanto
esto es preferible para confirmar si no se ha incrementado mediante
el compuesto de ensayo la concentración intracelular de Ca^{2+}
en el transformante de control o célula huésped.
En el caso de detectar si un compuesto de ensayo
es o no un antagonista en el procedimiento de detección tipo
Ca^{2+} de la presente invención, el transformante del
procedimiento de detección tipo Ca^{2+} se pone en contacto con
un compuesto de ensayo en presencia de un agonista de la P2T_{AC}
del receptor de ADP de las plaquetas (tales como 2MeSADP o ADP), y
a continuación se analizan las variaciones en la concentración
intracelular de Ca^{2+} de forma directa o indirecta. Cuando se
pone en contacto el transformante del procedimiento de detección
tipo Ca^{2+} con un compuesto de ensayo en presencia de un
agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP de las plaquetas, y a
continuación el incremento en la concentración intracelular de
Ca^{2+} en el interior del mismo por el agonista está estimulado
o suprimido mediante el compuesto de ensayo, puede decidirse que el
compuesto de ensayo es un antagonista de la P2T_{AC} del receptor
de ADP. Esto se lleva a cabo, por ejemplo, en las condiciones
descritas en el Ejemplo 3.
A este respecto, como control, el transformante
para la detección mediante Ca^{2+} se pone en contacto con el
agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP de las plaquetas en
ausencia del compuesto de ensayo, y a continuación es necesario
confirmar el grado de aumento en la concentración intracelular de
Ca^{2+} en el interior del mismo mediante el
agonista.
agonista.
Tal como se ha descrito más arriba en el
procedimiento de detección de tipo Ca^{2+} de la presente
invención, no se usa Gi per se como la proteína acoplada,
sino que se usa Gqi. Por tanto, es posible detectar si un compuesto
de ensayo es o no un antagonista o agonista mediante el análisis de
la concentración de Ca^{2+} y no la concentración de AMPc. En
general, la medida se puede llevar a cabo más fácil y rápidamente
usando la concentración de Ca^{2+}, en comparación con la
concentración de AMPc.
En el procedimiento de detección de tipo AMPc de
la presente invención, se usa como transformante un transformante
que expresa el polipéptido de la herramienta de detección (a partir
de ahora en el presente documento denominado como "transformante
de la detección tipo AMPc"). Gi se expresa de forma constitutiva
en una célula huésped normalmente usada, y así se puede obtener el
transformante de la detección tipo AMPc transformando una célula
huésped con un vector de expresión que comprenden a ADN que codifica
el polipéptido de la herramienta de detección. Como transformante,
es preferible usar una célula en la que no disminuya debido al ADP
la concentración intracelular de AMPc tal como una célula huésped
antes de la transformación. Como célula huésped, se pueden
mencionar, por ejemplo, una célula CHO.
En el caso de detectar si un compuesto de ensayo
es o no un agonista en el procedimiento de detección de tipo AMPc
de la presente invención, el transformante de la detección tipo AMPc
se pone en contacto con un compuesto de ensayo, y a continuación se
analizan las variaciones de la concentración intracelular de AMPc en
el transformante de la detección tipo AMPc (es decir, medidas o
detectadas) directa o indirectamente. Es preferible que el
transformante de la detección tipo AMPc se ponga en contacto con un
compuesto de ensayo en presencia de un compuesto (tal como
forskolin) capaz de aumentar la concentración de AMPc.
Las variaciones en la concentración de AMPc
pueden, por ejemplo, analizarse de forma directa mediante el uso de
un kit de medida de AMPc comercialmente disponible (Amersham o
similares), o indirectamente analizando la actividad
transcripcional de un gen 8tal como un gen obtenido introduciendo un
elemento de respuesta AMPc (CRE) corriente arriba de un gen de la
luciferasa) en el que la regulación de la transcripción es
dependiente de la concentración de AMPc.
Cuando el transformante de la detección tipo
AMPc se pone en contacto con un compuesto de ensayo, y entonces
disminuye la concentración intracelular de AMPc en el anterior, se
puede decidir que el compuesto de ensayo es un agonista de la
P2T_{AC} del receptor de ADP. En este caso, la disminución en la
concentración de AMPc mediante un compuesto puede decidirse
fácilmente cuando coexiste un compuesto (tal como forskolin) capaz
de incrementar la concentración de AMPc. A este respecto, como
control, se lleva a cabo un procedimiento similar usando una célula
huésped que no expresa el polipéptido de la herramienta de
detección, en lugar del transformante de la detección tipo AMPc que
expresa el polipéptido de la herramienta de detección y Gi, y
entonces es preferible confirmar que la concentración intracelular
de AMPc no se disminuye mediante el compuesto de ensayo.
En el caso de detectar si un compuesto de ensayo
es o no un antagonista en el procedimiento de detección de tipo
AMPc de la presente invención, el transformante de la detección tipo
AMPc se pone en contacto con un compuesto de ensayo en presencia de
un agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP de las plaquetas
(tales como 2MeSADP o ADP), y entonces se analizan las variaciones
en la concentración intracelular de AMPc (es decir, medidas o
detectadas) directa o indirectamente. Cuando el transformante de la
detección tipo AMPc se pone en contacto con un compuesto de ensayo
en presencia de un agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP de
las plaquetas (tales como 2MeSADP o ADP) y entonces la disminución
en la concentración intracelular de AMPc en el mismo debido al
agonista se inhibe o suprime mediante el compuesto de ensayo, se
puede decidir que el compuesto de ensayo es un antagonista de la
P2T_{AC} del receptor de ADP. Se puede llevar a cabo, por ejemplo,
en las condiciones descritas en el Ejemplo 4 ó 5.
Además, como control, el transformante de la
detección tipo AMPc se pone en contacto con el agonista de la
P2T_{AC} del receptor de ADP de las plaquetas en ausencia del
compuesto de ensayo, y entones es necesario confirmar el grado de
disminución en la concentración intracelular de AMPc de la anterior
mediante el agonista.
En el procedimiento de detección tipo enlace de
GTP\gammaS de la presente invención, se puede detectar si un
compuesto de ensayo es o no un antagonista o agonista de la
P2T_{AC} del receptor de ADP de las plaquetas mediante un
procedimiento de enlace de GTP\gammaS (Lazareno, S. y Birdsall, N.
J. M., Br. J. Pharmacol., 109, 1120-1127, 1993),
usando el polipéptido de la herramienta de detección, un resto de
membrana celular que comprende el polipéptido, o un transformante
que expresa el polipéptido, por ejemplo, de acuerdo con el siguiente
procedimiento:
Se mezcla una membrana celular que expresa el
polipéptido de la herramienta de detección con GTP\gammaS marcado
con ^{35}S (400 pmol/L) en una solución mezclada de 20 mmol/L de
HEPES (pH 7,4), 100 mmol/L de NaCl, 10 mmol/L de MgCl2, y 50 mmol/L
de GDP. Tras incubación en presencia de compuesto de ensayo y en
ausencia de compuesto de ensayo, cada líquido de reacción se filtró
usando un filtro de vidrio o similar, y a continuación se midió la
radiactividad del GTP\gammaS remanente en el filtro usando un
contador de centelleo en medio líquido o similar. Se puede detectar
si el compuesto de ensayo es o no un agonista de la P2T_{AC} del
receptor de ADP usando el incremento específico del enlace
GTP\gammaS en presencia del compuesto de ensayo como indicador.
Además, se puede detectar si el compuesto de ensayo es o no un
antagonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP usando la
supresión del aumento del enlace GTP\gammaS mediante un ligando de
la P2T_{AC} del receptor de ADP de las plaquetas (tales como
2MeSADP o ADP) en presencia del compuesto de ensayo, como
indicador.
Se puede seleccionar un ligando, antagonista, o
agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP de las plaquetas
usando la herramienta de selección (incluyendo tanto la herramienta
de selección de tipo polipéptido de un agente antiplaquetas y la
herramienta de selección de tipo transformante de un agente
antiplaquetas) de la presente invención de un agente
antiplaquetas.
Tal como se ha descrito más arriba, se sabe que
el ADP es un factor importante que induce o estimula la activación,
adhesión, y agregación de las plaquetas. Además, se considera que el
ASDP activa las plaquetas mediante un receptor P2T de ADP acoplado
a la proteína G localizado en la membrana de las plaquetas (Biochem.
J., 336, 513-523, 1998). Además, se considera que
Ticlopidine o Clopidogrel, que son conocidos agentes antiplaquetas,
actúan inhibiendo la P2T_{AC} del receptor de ADP vía su
metabolito en un organismo (Savi, P. J., Pharmacol. Exp. Ther.,
269, 772-777, 1994). Se sabe que ARL67085 o
derivados del mismo (análogos de ATP), derivados de Ap4A
[P^{1},P^{4}-di(adenosina-5')tetrafosfato],
o similares muestran una actividad supresora de la agregación de
las plaquetas debida al ADP, mediante actividad antagonista de la
P2T_{AC} (Mills, D. C., Thromb. Hemost., 76,
835-856, 1996; Humphries, R. G., Trends Pharmacol.
Sci., 16, 179-181, 1995; y Kim, B. K., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 89, 2370-2373, 1992). Como se
muestra en el Ejemplo 7, los antagonistas de la P2T_{AC} del
receptor de ADP (tales como 2MeSAMP o AR-C69931MX)
muestran actividad antiplaquetas.
A partir de la información anterior, el ligando
o antagonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP de las plaquetas
es útil como sustancia capaz de controlar la activación, adhesión, y
agregación de las plaquetas. Por tanto, el anteriormente mencionado
polipéptido de la herramienta de selección per se, o el
transformante de la herramienta de selección per se se
pueden usar para la selección de un agente antiplaquetas. Más
concretamente, el polipéptido de la herramienta de selección per
se, o el transformante de la herramienta de selección per
se pueden usar como herramienta de selección.
Los compuestos a ensayar que se pueden
seleccionar usando la herramienta de selección de la presente
invención de un agente antiplaquetas no están limitados en
particular, pero se pueden mencionar, por ejemplo, diferentes
compuestos conocidos (incluyendo péptidos) registrados en archivos
químicos, compuestos obtenidos mediante técnicas de química
combinatoria (Terrett, N. K. y col., Tetrahedron, 51,
8135-8137, 1995), o péptidos aleatorios preparados
empleando un procedimiento de presentación de fago (Felici, F. y
col., J. Mol. Biol., 222, 301-310, 1991) o
similares. Además, los sobrenadantes de cultivos de microorganismos,
componentes naturales derivados de plantas, o extractos de tejidos
animales se pueden usar como compuestos de ensayo para la selección.
Además, se pueden usarlos compuestos (incluyendo péptidos)
obtenidos modificando compuestos de manera química o biológica
(incluyendo péptidos) seleccionados mediante la herramienta de
selección de la presente invención de un agente antiplaquetas.
Los procedimientos de selección de la presente
invención se pueden dividir principalmente en los siguientes cuatro
grupos de acuerdo con el procedimiento de detección a usar. Usando
uno cualquiera de los procedimientos de detección, o una
combinación de los mismos, se puede seleccionar una sustancia que
sea útil como agente antiplaquetas detectando si un compuesto de
ensayo es o no un ligando, antagonista, o agonista de la P2T_{AC}
del receptor de ADP, y seleccionando a continuación un antagonista
entre los compuestos de ensayo. Los procedimientos de selección de
la presente invención, es decir,
1) un procedimiento para seleccionar un ligando
de la P2T_{AC} del receptor de ADP de las plaquetas (denominado a
partir de ahora en el presente documento como procedimiento de
selección de ligando);
2) un procedimiento para seleccionar un
antagonista o agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP de las
plaquetas mediante el uso de la variación de la concentración
intracelular de Ca^{2+} en el transformante como indicador
(denominado a partir de ahora en el presente documento como
procedimiento de selección tipo Ca^{2+});
3) un procedimiento para seleccionar un
antagonista o agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP de las
plaquetas mediante el uso de la variación en la concentración
intracelular de AMPc en el transformante como indicador (denominado
a partir de ahora en el presente documento como procedimiento de
selección tipo AMPc); y
4) un procedimiento para seleccionar un
antagonista o agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP de las
plaquetas mediante el uso de un procedimiento de enlace GTP\gammaS
(denominado a partir de ahora en el presente documento como
procedimiento de selección tipo enlace GTP\gammaS)
se explicarán en este orden a partir de ahora en
el presente documento.
El procedimiento de selección de ligando de la
presente invención no está limitado en particular, siempre que
comprenda las etapas de:
detectar si un compuesto de ensayo es o no un
ligando de la P2T_{AC} del receptor de ADP usando el procedimiento
de detección de ligando de la presente invención, y
seleccionar el ligando de la P2T_{AC} del
receptor de ADP.
Se puede seleccionar un ligando de la P2T_{AC}
del receptor de ADP mediante el uso de la inhibición del enlace
usando del ligando radiactivo obtenido mediante el procedimiento de
detección de ligando como indicador. Por ejemplo, un compuesto de
ensayo se hace reaccionar en las condiciones descritas en el Ejemplo
6 durante un tiempo predeterminado, y entonces se puede seleccionar
como ligando mediante el uso de la inhibición del enlace de
[^{3}H]-2MeSADP como indicador un compuesto de
ensayo que tenga una CI_{50} de 10 \muM o menos (preferiblemente
1 \muM o
menos).
menos).
Se puede seleccionar una sustancia útil como
agente antiplaquetas aplicando el ligando que se ha seleccionado
mediante el procedimiento de selección de ligando de la presente
invención mediante el siguiente procedimiento de selección tipo
Ca^{2+}, procedimiento de selección tipo AMPc, y/o procedimiento
de detección tipo enlace de GTP\gammaS, y a continuación
seleccionar un antagonista.
El procedimiento de selección tipo Ca^{2+} de
la presente invención no está limitado en particular, siempre que
comprenda las etapas de:
detectar si un compuesto de ensayo es o no un
antagonista o agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP usando
el procedimiento de selección tipo Ca^{2+} de la presente
invención, y
seleccionar el antagonista o agonista de la
P2T_{AC} del receptor de ADP.
Se puede seleccionar un agonista mediante el uso
del incremento en la concentración intracelular de Ca^{2+}
mediante un compuesto de ensayo en el transformante de la detección
tipo Ca^{2+} como indicador en el procedimiento de detección tipo
Ca^{2+}.
Se puede seleccionar un antagonista mediante un
indicador en el que el incremento en la concentración intracelular
de Ca^{2+} en el transformante de la detección tipo Ca^{2+}
mediante un agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP de las
plaquetas (tales como 2MeSADP o ADP) se inhiba o suprima mediante un
compuesto de ensayo en el procedimiento de detección tipo
Ca^{2+}.
Por ejemplo, se hace reaccionar un compuesto de
ensayo en las condiciones descritas en el Ejemplo 3 durante un
tiempo predeterminado, y entonces se puede seleccionar como una
sustancia que muestra una actividad antagonista mediante el uso de
la inhibición del aumento de la concentración intracelular de
Ca^{2+} mediante 2MeSADP o ADP como indicador un compuesto de
ensayo que tenga una CI_{50} de 10 \muM o menos (preferiblemente
1 \muM o menos).
Se puede seleccionar una sustancia útil como
agente antiplaquetas seleccionado un antagonista usando el
procedimiento de selección tipo Ca^{2+} de la presente
invención.
El procedimiento de selección tipo AMPc de la
presente invención no está limitado en particular, siempre que
comprenda las etapas de:
detectar si un compuesto de ensayo es o no un
antagonista o agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP usando
el procedimiento de detección tipo AMPc de la presente invención,
y
seleccionar el antagonista o agonista de la
P2T_{AC} del receptor de ADP.
Se puede seleccionar un agonista mediante el uso
de la disminución en la concentración intracelular de AMPc mediante
un compuesto de ensayo en el transformante de la detección tipo AMPc
como indicador en el procedimiento de detección tipo AMPc.
Se puede seleccionar un antagonista mediante un
indicador en el que la disminución en la concentración intracelular
de AMPc en el transformante de la detección tipo AMPc mediante un
agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP de las plaquetas
(tales como 2MeSADP o ADP) se inhiba o suprima mediante un compuesto
de ensayo en el procedimiento de detección tipo AMPc.
Por ejemplo, se hace reaccionar un compuesto de
ensayo en las condiciones descritas en el Ejemplo 4 ó 5 durante un
tiempo predeterminado, y entonces se puede seleccionar un compuesto
de ensayo que tenga una CI_{50} de 10 \muM o menos
(preferiblemente 1 \muM o menos) como una sustancia que muestra
una actividad antagonista mediante el uso de la inhibición de la
disminución de la concentración intracelular de AMPc mediante
2MeSADP o ADP como indicador.
Se puede seleccionar una sustancia útil como
agente antiplaquetas seleccionado un antagonista usando el
procedimiento de selección tipo AMPc de la presente invención.
El procedimiento de detección tipo enlace de
GTP\gammaS de la presente invención no está limitado en
particular, siempre que comprenda las etapas de:
detectar si un compuesto de ensayo es o no un
antagonista o agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP usando
el procedimiento de detección tipo enlace de GTP\gammaS de la
presente invención, y
seleccionar el antagonista o agonista de la
P2T_{AC} del receptor de ADP.
Se puede seleccionar un agonista mediante el uso
del incremento del enlace GTP\gammaS específico mediante un
compuesto de ensayo como indicador en el procedimiento de detección
tipo enlace de GTP\gammaS.
Se puede seleccionar un antagonista mediante un
indicador en el que en incremento en el enlace GTP\gammaS mediante
un agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP de las plaquetas
(tales como 2MeSADP o ADP) se suprime mediante un compuesto de
ensayo.
Se puede seleccionar una sustancia útil como
agente antiplaquetas seleccionado un antagonista usando el
procedimiento de selección tipo enlace GTP\gammaS de la presente
invención.
La presente invención incluye un agente
antiplaquetas, que contiene, como ingrediente activo, un antagonista
de la P2T_{AC} del receptor de ADP (por ejemplo, compuestos,
péptidos, anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo) seleccionados
mediante los procedimientos de selección 2) a 4) o mediante una
combinación de los procedimientos de selección 1) o 4).
Se puede confirmar si el antagonista de la
P2T_{AC} del receptor de ADP elegido muestra la actividad
antiplaquetas por detección de la actividad inhibitoria de la
agregación de las plaquetas humanas, por ejemplo, según el
procedimiento descrito en el Ejemplo 7.
Además, la presente invención incluye un
procedimiento para fabricar una composición farmacéutica
antiplaquetas que comprende las etapas de:
detectar, en un ensayo de control de calidad de
la composición farmacéutica antiplaquetas, si es o no un ligando,
antagonista, o agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP
mediante el procedimiento de detección de ligando, procedimiento de
detección tipo Ca^{2+}, procedimiento de detección tipo AMPc, y/o
procedimiento de detección tipo enlace de GTP\gammaS, y
preparar un medicamento.
La preparación de la presente invención que
contiene el antagonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP (por
ejemplo, compuestos, péptidos, anticuerpos, o fragmentos de
anticuerpo) como ingrediente activo se puede preparar usando
vehículos, rellenos, y/u otros aditivos usados en general en la
preparación de medicamentos, de acuerdo con el ingrediente
activo.
Los ejemplos de administración incluyen
administración oral mediante comprimidos, píldoras, cápsulas,
gránulos, gránulos finos, polvos, soluciones orales y similares; y
la administración parenteral mediante inyecciones (por ejemplo,
intravenosa, intramuscular o similares), supositorios, preparaciones
transdérmicas, preparaciones de absorción transmucosa, y similares.
De manera particular, en el caso de péptidos que se digieren en el
estómago, se prefiere una administración parenteral tal como una
inyección intravenosa, o similar, o técnicas de preparación en las
que el polipéptido no es digerido, tal como la técnica de
preparación que se describe en el Documento WO95/28963.
En la composición sólida para uso en
administración oral, se pueden mezclar una o más sustancias activas
con al menos un diluyente inerte tal como lactosa, manitol,
glucosa, celulosa microcristalina, hidroxipropilcelulosa, almidón,
polivinil pirrolidona, o silicato de aluminio y magnesio. En el modo
habitual, la composición puede contener aditivos diferentes al
diluyente inerte, tal como un lubricante, un agente desintegrante,
un agente estabilizante, o un solubillizante o un agente de ayuda a
la solubilización. Si es necesario, los comprimidos o las píldoras
se pueden recubrir con un recubrimiento de azúcar, o una película de
sustancia gástrica o entérica.
La composición líquida para administración oral
puede incluir, por ejemplo, emulsiones, soluciones, suspensiones,
jarabes, y elixires, y puede contener un diluyente inerte
generalmente usado tal como agua purificada o alcohol etílico. La
composición puede contener aditivos diferentes al diluyente inerte,
tal como agentes humectantes, agentes suspensores, endulzantes,
aromatizantes o antisépticos.
Las inyecciones para administración parenteral
pueden incluir soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no
acuosas asépticas. Entre los ejemplos de diluyente para uso en
soluciones y suspensiones acuosas se incluyen agua destilada para
uso de inyección y suero salino fisiológico. Entre los ejemplos de
diluyente para uso en soluciones y suspensiones no acuosas se
incluyen propilenglicol, polietilenglicol, aceite vegetal (por
ejemplo, aceite de oliva), alcoholes (por ejemplo, etanol),
polysorbate 80 y similares. Dicha composición puede contener además
un agente humectante, un agente estabilizante, un solubilizante o un
agente de ayuda a la solubilización, un antiséptico o similar.
Estas composiciones se pueden esterilizar, por ejemplo, mediante
filtración a través de un filtro de retención de bacterias, mezcla
de un germicida, o mediante irradiación. Alternativamente, se puede
usar esterilizando las composiciones sólidas en primer lugar y
disolviéndolos en agua estéril u otros solventes estériles para uso
en inyección, antes de su uso.
La dosis se decide de manera opcional teniendo
en cuenta la fortaleza de cada ingrediente activo seleccionado
mediante el procedimiento de selección mencionado más arriba, o
síntomas, edad, sexo o similares de cada paciente a administrar.
Por ejemplo, en el caso de la administración
oral, la dosificación habitual para un adulto (60 kg de peso) es
aproximadamente de entre 0,1 y 100 mg, preferiblemente de entre 0,1
y 50 mg por día. En el caso de la administración parenteral, la
dosificación habitual es aproximadamente de entre 0,01 y 50 mg,
preferiblemente de entre 0,01 y 10 mg por día en forma de
inyección.
La presente invención se ilustrará ahora de
manera adicional mediante, pero de manera alguna limitada a, los
siguientes Ejemplos. Se pueden llevar a cabo los procedimientos de
acuerdo con procedimientos conocidos (Maniatis, T., y col.,
"Molecular Cloning-A Laboratory Manual", Cold
Spring Harbor Laboratory, NY, 1982, o similares), a no se que se
especifique otra cosa.
En el presente ejemplo, se obtuvo un ADNc de
longitud completa de un gen HORK3 de la P2T_{AC} del receptor de
ADP (denominado a partir de ahora en el presente documento de manera
breve como gen HORK3) mediante el procedimiento PCR que usa un ADNc
de cerebro humano (fabricado por Clontech) como una plantilla de
acuerdo con el siguiente procedimiento.
De manera más particular, se usó un
oligonucleótido constituido por la secuencia de nucleótidos de la
SEC DE ID Nº: 3 como cebador directo, y se usó un oligonucleótido
constituido por la secuencia de nucleótidos de la SEC DE ID Nº: 4
como cebador inverso. Se añadió una secuencia de nucleótidos que
contenía la secuencia de reconocimiento XbaI a cada uno de los
términos 5' de los cebadores directo e inverso. Se llevó a cabo una
PCR usando la Taq ADN Polimerasa (Ex Taq DNA polimerase; fabricada
por Takara-shuzo) en presencia de sulfóxido de
dimetilo al 5%. En la PCR se repitió 5 veces un ciclo constituido
por tratamientos a 94ºC durante 20 segundos, 58ºC durante 20
segundos, y 74ºC durante 1,5 minutos, se repitió 5 veces un ciclo
constituido por tratamientos a 94ºC durante 20 segundos, 55ºC
durante 20 segundos, y 74º C durante 1,5 minutos, y se repitió 25
veces un ciclo constituido por tratamientos a 94ºC durante 20
segundos, 50ºC durante 20 segundos, y 74ºC durante 1,5 minutos.
Como resultado, se amplificó un fragmento de ADN de aproximadamente
1,0 Kpb. Se digirió el fragmento de ADN con XbaI, y se insertó en
el emplazamiento XbaI de un plásmido
pEF-BOS-dhfr (Mizushima, S y Nagata,
S., Nucleic Acids Res., 18, 5322, 1990) para obtener un plásmido
pEF-BOS-dhfr-HORK3.
Se determinó la secuencia de nucleótidos del gen
HORK3 en el plásmido
pEF-BOS-dhfr-HORK3
usando un secuenciador de ADN (Secuenciador de ADN ABI377;
fabricado por Applied Biosystems) mediante un procedimiento de
finalizador dideoxi. La secuencia de nucleótidos del gen HORK3 fue
la de la SEC DE ID Nº: 1.
La secuencia de nucleótidos de la SEC DE ID
Nº:1 contiene un marco de lectura abierto (ORF) constituido por
1029 bases. La secuencia de aminoácidos (342 aminoácidos) deducida a
partir de la ORF fue la de la SEC DE ID Nº: 2.
Se recogió sangre de un voluntario sano usando
heparina, y se centrifugó a 400 x g durante 10 minutos. Se tomó la
capa superior como plasma rico en plaquetas.
Se añadió a la capa inferior 1/3 de volumen de
dextrano al 6% / solución salina fisiológica, y a continuación se
dejó reposar el conjunto a temperatura ambiente durante 1 hora. Se
tomó el sobrenadante y se centrifugó a 150 x g durante 5 minutos, y
a continuación se suspendió el residuo en HBSS (Solución de Sales
Equilibradas de Hanks). Se dispuso en capas la suspensión en un
volumen igual de Ficoll (Ficoll Paque; Pharmacia) y a continuación
se centrifugó el conjunto a 400 x g durante 30 minutos. Se tomaron
la capa intermedia resultante y el residuo como "una fracción
celular mononuclear" y los leucocitos polimorfonucleares, de
manera respectiva.
Se añadieron microperlas CD16 (fabricadas por
Daiichi Pure Chemicals) a los leucocitos polimorfonucleares y a
continuación se separó "una fracción neutrófila" de "una
fracción eosinófila" usando un agitador magnético.
Se añadió EDTA al plasma rico en plaquetas
obtenido anteriormente hasta una concentración final de 2 mmol/L, y
a continuación se centrifugó el conjunto a 2500 x g durante 15
minutos. Se volvió a suspender el residuo resultante en 120 mmol/L
de NaCl / 2 mmol /L de EDTA / 30 mmol/L de Tris-HCl
(pH 7,4), y a continuación se centrifugó la suspensión a 2500 x g
durante 15 minutos para obtener el residuo como "una fracción de
plaquetas". Se lavaron de manera respectiva la fracción celular
mononuclear, la fracción neutrófila, y la fracción eosinófila con
solución salina fisiológica.
Se purificaron los ARN totales procedentes de la
fracción celular mononuclear, la fracción neutrófila, la fracción
eosinófila, y la fracción de plaquetas usando un reactivo
purificante de ARN total comercialmente disponible (isogen;
fabricado por Nippon Gene), de manera respectiva. Se hizo reaccionar
el ARN total (5 \mug) derivado de cada fracción con DNasa
(fabricada por Nipón Gene) a 37ºC durante 15 minutos. Se convirtió
el ARN total tratado con DNasa en ADNc mediante un sistema
Superscript de primera cepa (para RT-PCR; fabricado
por GIBCO).
Se llevó a cabo un análisis de un nivel de
expresión del ARNm de HORK3 en los hemocitos usando cada uno de los
anteriores ADNc como plantilla y un detector de secuencia (Detector
de Secuencia Prism7700; fabricado por Applied Biosystems). Se
usaron como un primer conjunto de cebadores un oligonucleótido
constituido por la secuencia de bases de la SEC DE ID Nº: 5 y un
oligonucleótido constituido por la secuencia de bases de la SEC DE
ID Nº: 6. Se usó como sonda un oligonucleótido constituido por la
secuencia de nucleótidos de la SEC DE ID Nº: 7, en la que se marcó
el término 5' de la misma con un indicador de fluorescencia FAM
(6-carboxi-fluoresceína) y se marcó
el término 3' con un indicador de fluorescencia TAMRA
(6-carboxi-tetrametil-rodamina),
que reconoce de manera específica el ADNc de HORK3.
Se llevó a cabo la PCR usando un reactivo de PCR
comercialmente disponible (Reactivo núcleo de PCR Taqman; fabricado
por Applied Biosystems) y repitiendo 50 veces un ciclo constituido
por tratamientos a 95ºC durante 15 segundos y 60ºC durante 60
segundos en presencia de DMSO al 5%. De manera adicional, se llevó a
cabo una PCR para obtener una curva estándar para calcular un nivel
de expresión del ARNm, bajo las mismas condiciones, usando un ADN
genómico humano como plantilla y el conjunto de cebadores y la sonda
anteriores [J. Neurosci. Methods. 98, 9-20
(2000)].
Además, para calcular, como un estándar interno,
un nivel de expresión de la \beta-actina humana,
se llevó a cabo una PCR bajo las mismas condiciones, usando como
plantilla cada ADNc anterior o el ADN genómico humano, un
oligonucleótido constituido por la secuencia de bases de la SEC DE
ID Nº: 8 y un oligonucleótido constituido por la secuencia de bases
de la SEC DE ID Nº: 9 como conjunto de cebadores, y un
oligonucleótido constituido por la secuencia de nucleótidos de la
SEC DE ID Nº: 100, en la que se marcó el término 5' de la misma con
un indicador de fluorescencia FAM y se marcó el término 3' de la
misma con un indicador de fluorescencia TAMRA, como sonda que
reconoce de manera específica la \beta-actina.
Los niveles de expresión del ARNm de la
\beta-actina en la fracción celular mononuclear,
fracción neutrófila, fracción eosinófila, y fracción de plaquetas
fueron 15000 copias, 19000 copias, 25000 copias, y 33000 copias por
1 ng de ARN total, de manera respectiva. En contraste, se encontró
que el ARNm de HORK3 se expresaba de manera específica en las
plaquetas, pero se expresaba poco en las células mononucleares,
neutrófilas, y eosinófilas.
Cuando se añaden a una célula la mayor parte de
las purinas tales como ADP, 2MeSADP
(2-metiltio-ADP, o similares, se
observa el aumento del Ca^{2+} intracelular mediante el receptor
endógeno de membrana celular. Por tanto, para analizar si reacciona
o no una proteína derivada de un gen introducido exógenamente con
ADP o 2MeSADP, es preferible expresar la proteína usando una célula
que no reaccione con ADP o 2MeSADP. Se conoce que
c6-15, una línea celular de glioma de rata, no
reacciona con ADP o similares (Change, K. y col., J. Biol. Chem.,
270, 25152-26158, 1995). En el presente ejemplo, se
usaron las células c6-15 para expresar la proteína
HORK3.
De manera adicional, se usó el plásmido
pEF-BOS-dhfr-HORK3
obtenido en el Ejemplo 1 como un plásmido de expresión que se va a
usar para expresar la proteína HORk3.
Se preparó un vector de expresión para expresar
las proteínas quiméricas de Gq y Gi usadas en el presente ejemplo
de acuerdo con un procedimiento de Conklin, B. R. y col. (Nature,
363, 274-276, 1993) clonando un gen (denominado a
partir de ahora en el presente documento como gen Gqi), que había
sido construido sustituyendo cinco aminoácidos
(Glu-Tyr-Asn-Leu-Val;
la secuencia de aminoácidos de la SEC DE ID Nº: 12) en el término C
de Gq con cinco aminoácidos
(Asp-Cys-Gly-Leu-Phe;
la secuencia de aminoácidos de la SEC DE ID Nº: 11) en el término C
de Gi, en el plásmido pEF-BOS. Se nombró el plásmido
construido plásmido pEF-BOS-Gqi.
Se sembraron las células c6-15
en placas de 96 pocillos (placas de fondo negro / transparente con
96 pocillos, recubiertas con colágeno I; fabricadas por BECTON
DICKINSON) de tal manera que la concentración de las células llegó
a ser de 2 x 10^{4} células / pocillo) tras cultivar durante 48
horas, se llevó a cabo una transfección del gen usando un reactivo
de transfección (LipofectAMINE 2000; fabricado por GIBCO BRL) y la
combinación del plásmido
pEF-BOS-dhfr-HORK3
(50 ng / pocillo) y el plásmido
pEF-BOS-Gqi (50 ng / pocillo). Como
control, se llevó a cabo una transfección del gen usando la
combinación del plásmido
pEF-BOS-dhfr (es decir, un vector
vacío sin el gen HORK3) y el plásmido
pEF-BOS-Gqi, en vez de la
combinación del plásmido
pEF-BOS-dhfr-HORK3 y
el plásmido pEF-BOS-Gqi.
Después de 24 horas a partir del procedimiento
de transfección del gen, se eliminó el medio, y a continuación se
añadió HBBS (Solución de Sal Equilibrada de Hank; 100 \muL /
pocillo) que contenía 4 \mumol/L de Fluo-3, AM
(fabricado por Molecular Probe), ácido plurónico al 0,004% (marca
comercial = Pluronic F127, fabricado por Molecular Probe), suero
bovino fetal (FBS) al 1%, 20 mmol/L de HEPES, y 2,5 mmol/L de
probenecid. Tras incubar a 37ºC durante 1 hora, se lavaron las
células 4 veces con HBBS (fabricado por GIBCO) que contenía 20
mmol/L de HEPES y 2,5 mmol/L de probenecid, y a continuación se
añadió HBBS (100 \muL / pocillo) que contenía 20 mmol/L de HEPES
y 2,5 mmol/L de probenecid.
Se midió el curso temporal del cambio en la
concentración de Ca^{2+} intracelular usando FLIPR (fabricado por
Molecular Device). De manera más particular, tras 10 segundos del
comienzo de la medida, se añadieron 2MeSADP o ADP a los pocillos
hasta una concentración final de 3 x 10^{-5} mol/L a 1 x
10^{-12} mol/L. Tras la adición, se midió cada intensidad de
fluorescencia en un intervalo de 1 segundo durante 50 segundos, y a
continuación en un intervalo de 6 segundos durante 4 minutos.
Se observó el aumento de la concentración de
Ca^{2+} intracelular dependiente de la concentración de 2MeSADP o
ADP en las células en las cuales se había transfectado la
combinación del plásmido
pEF-BOS-dhfr-HORK3 y
el plásmido pEF-BOS-Gqi. En
contraste, no se observó el cambio de la concentración de Ca^{2+}
intracelular mediante 2MeSADP o ADP en las células en las cuales se
había transfectado la combinación del plásmido
pEF-BOS-dhfr (vector vacío) y el
plásmido pEF-BOS-Gqi.
Se midió el cambio de la concentración de
Ca^{2+} intracelular mediante 2MeSADP o ADP en las células en las
cuales se había transfectado el plásmido
pEF-BOS-dhfr-HORK3 y
el plásmido pEF-BOS-Gqi, se
representó gráficamente cada valor punta en diversas
concentraciones de 2MeSADP o ADP, y a continuación se analizó la
dependencia de la concentración usando un procedimiento logístico
de regresión. Como resultado, se encontró que la DE_{50} de
2MeSADP era 5,4 nmol/L, y que la DE_{50} de ADP era 220 nmol/L.
Tal como se ha descrito anteriormente, se confirmó que el cambio
dependiente de la dosis en la concentración de Ca^{2+}
intracelular se indujo haciendo reaccionar el transformante con
2MeSADP o ADP para la detección de tipo Ca^{2+} que coexpresa el
polipéptido para una herramienta de detección y Gqi.
Tal como se ha descrito anteriormente, se
encontró que la proteína HORK3, uno de los polipéptidos para la
detección, es un receptor acoplado a Gi que reacciona con ADP. De
manera adicional, como resulta evidente a partir de los resultados
del presente ejemplo, llega a ser factible seleccionar un agonista o
antagonista midiendo el cambio de la concentración de Ca^{2+}
intracelular en la célula C6-15 que coexpresa la
proteína HORK3 (uno de los polipéptidos para una herramienta de
detección) y Gqi.
Se encontró a partir del Ejemplo 3 que el
receptor de ADP era un receptor acoplado a Gi, y de esta manera se
espera que el receptor de ADP tenga una actividad de supresión de la
actividad de la adenilato ciclasa. Por tanto, cuando se lleva a
cabo el procedimiento de selección de tipo AMPc de la presente
invención, es preferible seleccionar una línea celular que no tenga
una actividad de supresión de la actividad de la adenilato ciclasa
mediante ADP o 2MeSADP, como una célula huésped que se va a usar
para expresar la proteína del receptor de ADP. Se encontró que las
células CHO eran las más preferibles investigando para una célula en
la que una cantidad de AMPc producido mediante un estímulo de
forskolina no disminuyó mediante el ADP o 2MeSADP de acuerdo con el
siguiente procedimiento, y de esta manera se usaron las células CHO
como las células que se van a usar para expresar la proteína del
receptor de ADP. A este respecto, se usó en el presente ejemplo la
línea celular que carecía de dihidrofolato reductasa [línea
CHO-dhfr (-)] (DHFR; un enzima esencial para la
síntesis de novo de ácidos nucleicos). Se usó el plásmido
pEF-BOS-dhfr-HORK3
como un plásmido de expresión que se va a usar para expresar la
proteína HORK3.
Se sembró la línea CHO-dhfr (-)
sobre cada placa petri de 10 cm (1 x 10^{6} células / placa)
usando un medio \alphaMEM (con ácidos nucleicos. Tras cultivar
durante 1 día, se llevó a cabo una transfección del gen usando un
reactivo de transfección (LipofectAMINE 2000; fabricado por GIBCO
BRL) y el plásmido
pEF-BOS-dhfr-HORK3
(8 \mug). Como control, se llevó a cabo una transfección del gen
usando el plásmido pEF-BOS-dhfr (es
decir, un vector vacío sin el gen HORK3), en vez del plásmido
pEF-BOS-dhfr-HORK3.
Después de 24 horas a partir del procedimiento
de transfección del gen, se tomaron las células transfectadas y se
suspendieron en un medio \alphaMEM (sin ácidos nucleicos) que
contenía 100 nmol/L de metotrexato (un inhibidor competitivo de
DHFR; fabricado por Wako Pure Chemical Industries). Se diluyó
gradualmente cada suspensión y se volvió a sembrar sobre cada placa
petri de 10 cm. Se tomaron individualmente las colonias que
aparecieron después de 2 semanas, y se usaron como células CHO que
expresan la proteína HORK3 o una célula CHO control transfectada
con el vector vacío en el siguiente experimento.
Se sembraron las células CHO que expresaban la
proteína HORK3 o las células CHO transfectadas con el vector vacío
sobre una placa con 24 pocillos (1 x 10^{5} células / pocillo).
Tras cultivar durante 1 día, se trataron las células con un medio
\alphaMEM (sin ácidos nucleicos) que contenía 1 mmol/L de
3-isobutil-1-metilxantina
(fabricada por Sigma) y BSA al 0,1% durante 10 minutos, y a
continuación la combinación de 2 \mumol/L de forskolina
(fabricada por Wako Pure Chemical Industries) y 2MeSADP
(concentración final = 1 x 10^{-12} a 1 x 10^{-7} mol/L), o se
añadió gota a gota la combinación de 3 \mumol/L de forskolina y
ADP (concentración final = 1 x 10^{-10} a 1 x 10^{-5} mol/L).
Tras incubar a 37ºC durante 30 minutos se eliminó el sobrenadante
del cultivo, y a continuación se disolvieron las células en un
reactivo de lisis celular contenido en un sistema
AMPc-EIA (BIOTRAK; fabricado por Amersham).
Se midió la cantidad de AMPc producido en cada
célula bajo cada condición usando el sistema
AMPc-EIA de acuerdo con un protocolo unido a lo
anterior. Cuando se consideró como el 100% la cantidad de AMPc
producido por estimulación con 3 \mumol/L de forskolina sola, se
trazó una curva dependiente de la concentración para la cantidad de
AMPc en presencia de 2MeSADP o ADP. A partir de la curva dependiente
de la concentración, la respuesta de 2MeSADP y ADP frente a la
proteína HORK3 fue DE_{50} = 0,07 nmol/L y DE_{50} = 35 nmol/L,
de manera respectiva.
En contraste, no se observaron cambios en la
cantidad de AMPc producido mediante el estímulo de forskolina en la
célula CHO transfectada con el vector vacío, incluso si se añadieron
2MeSADP o ADP.
Se encontró que la célula C6-15
era también la más preferible como célula en la que no disminuía la
cantidad de AMPc producido mediante el estímulo de forskolina
mediante ADP o 2MeSADP, y, de esta manera, se usó también la célula
C6-15 como célula que se va a usar para expresar la
proteína del receptor de ADP.
Se usó el plásmido
pEF-BOS-dhfr-HORK3
como vector de expresión que se va a usar para expresar la proteína
HORK3.
Se sembraron las células C6-15
sobre en placa petri de 10 cm (1 x 10^{6} células / placa) usando
un medio DMEM. Tras cultivar durante 1 día, se llevó a cabo una
transfección del gen usando un reactivo de transfección
(LipofectAMINE 2000; fabricado por GIBCO BRL), y los plásmidos
pEF-BOS-dhfr-HORK3
(8 \mug) y pEF-BOS-neo (Nucleic
Acid Res., 18, 5322, 1990; 0,8 \mug):
Después de 24 horas a partir del procedimiento
de transfección del gen, se tomaron las células transfectadas y se
suspendieron en un medio DMEM que contenía 0,6 mg/mL de G418
(fabricado por GIBCO BRL). Se diluyó gradualmente cada suspensión y
se volvió a sembrar sobre cada placa petri de 10 cm. Se tomaron
individualmente las colonias que aparecieron después de 2 semanas,
y se usaron como una célula C6-15 que expresa la
proteína HORK3 en el siguiente experimento.
Se sembraron las células C6-15
que expresaban la proteína HORK3 sobre una placa con 96 pocillos (1
x 10^{4} células / pocillo). Tras cultivar durante 1 día, se
trataron las células con un medio DMEM que contenía 1 mmol/L de
3-isobutil-1-metilxantina
(fabricado por Sigma) y BSA al 0,1% durante 10 minutos, y a
continuación la combinación de 1 \mumol/L de forskolina
(fabricado por Wako Pure Chemical Industries) y 2MeSADP (una
concentración final = 1 x 10^{-12} a 1 x 10^{-7} mol/L), o se
añadió gota a gota la combinación de 1 \mumol/L de forskolina y
ADP (concentración final = 1 x 10^{-10} a 1 x 10^{-5} mol/L).
Tras incubar a 37ºC durante 30 minutos, se eliminó el sobrenadante
del cultivo, y a continuación se disolvieron las células en PBS que
contenía Triton X-100 al 0,2%.
Se midió la cantidad de AMPc producido en cada
célula bajo cada condición usando un kit AMPc HTRF. (fabricado por
CIS bio international) de acuerdo con un protocolo unido a lo
anterior. Cuando se consideró como el 100% la cantidad de AMPc
producido mediante estimulación con 1 \mumol/L de forskolina sola,
se trazó una curva dependiente de la concentración para la cantidad
de AMPc en presencia de 2MeSADP o ADP. a partir de la curva
dependiente de la concentración, la respuesta de 2MeSADP y ADP
frente a la proteína HORK3 fue DE_{50} = 0,08 nmol/L y DE_{50}
= 42 nmol/L, de manera respectiva. La célula C6-15
que expresaba la proteína HORK3 presentó casi la misma propiedad
que la de la célula CHO que expresaba la proteína HORK3 descrita en
el Ejemplo 4.
A continuación, se examinaron los efectos de los
compuestos, que se conocen por suprimir la agregación de las
plaquetas, sobre la supresión de la cantidad de AMPc producido
mediante el estímulo de forskolina en la célula
C6-15 que expresa la proteína HORK3 mediante
2MeSADP. Como compuestos que suprimen la agregación de plaquetas,
se usaron 2 MeSAMP (monofosfato de 2-metiltio
adenosina) (Thromb. Haemost., 81, 111-117, 1999) o
AR-C69931MX ácido
(N6-[2-metiltioetil]-2-[3,3,3-trifluoropropiltio]-5'-adenílico,
monoanhídrido con ácido diclorometilenobifosfónico) (J. Med. Chem.,
42, 213-220, 1999). En el sistema de medida
anterior, se trataron las células con una solución [preparada
disolviendo 2MeSAMP (10^{-7} a 10^{-4} mol/L) o
AR-C69931MX (10^{-12} a 10^{-6} mol/L) en medio
DMEM que contenía 1 mmol/L de
3-isobutil-1-metilxantina
(fabricada por Sigma) y BSA al 0,1%] durante 10 minutos, y a
continuación se añadió gota a gota la combinación de 1 \mumol/L de
forskolina (fabricada por Wako Pure Chemical Industries) y 10 nmol
de 2MeSADP. Tras incubar a 37ºC durante 30 minutos, se eliminó el
sobrenadante del cultivo, y a continuación se disolvieron las
células en PBS que contenía Triton X-100 al 0,2%.
Se midió la cantidad de AMPc producido usando el kit AMPc HTRF de
acuerdo con un protocolo unido a lo anterior. Cuando se consideró
como 0% la cantidad de AMPc producido por estimulación con 1
\mumol/L de forskolina sola, y que se consideró como 100% por
estimulación con la combinación de 1 \mumol/L de forskolina y 10
nmol/L de 2MeSADP, se trazó una curva dependiente de la
concentración de cada inhibidor. A partir de la curva dependiente
de la concentración, los efectos inhibidores de 2MeSAMP y
AR-C69931MX sobre la supresión mediante 2MeSADP en
la cantidad de AMPc producido por el estímulo de forskolina fueron
DI_{50} = 5 \mumol/L y DI_{50} = 2,4 nmol/L, de manera
respectiva.
Se tomaron y se lavaron las células
C6-15 que expresan la proteína HORK3 preparada en el
Ejemplo 5, y se suspendieron a continuación en 20 mmol/L de
Tris-HCl (pH 7,4) que contenía 5 mmol/L de EDTA y un
conjunto de cóctel inhibidor de la proteasa (Complete ^{TM},
fabricado por Boeringer Mannheim). Se homogeneizó el conjunto usando
un POLYTRON, y se ultracentrifugó. Se suspendió el residuo en 50
mmol/L de Tris-HCl (pH 7,4) que contenía 1 mmol/L
de EDTA, 100 mmol/L de NaCl, BSA al 0,1%, y Complete ^{TM} para
obtener una fracción de membrana.
Después se añadió
[^{3}H]-2MeSADP (fabricado por Moravek
Biochemical) a 20 \mug de la fracción de membrana hasta una
concentración final de 0,25 a 50 nmol/L, y se incubó en 250 \muL
de 50 mmol/L de Tris-HCl (pH 7,4) que contenía 1
mmol(L de EDTA, 100 mmol/L de NaCl, BSA al 0,1%, y Complete
^{TM} a temperatura ambiente durante 1 hora, se recogió el
conjunto en un filtro de vidrio usando un cosechador celular. Se
añadió un microcentelleador al filtro de vidrio, y a continuación
se midió la cantidad total de enlace a la fracción de membrana
usando un contador líquido por centelleo. De manera adicional, se
midió una cantidad de enlace no específico de la fracción de
membrana añadiendo 2MeSADP (concentración final = 50 \mumol/L) en
el ensayo anterior. Como resultado, se encontró que
[^{3}H]-2MeSADP se enlazaba de manera específica
con la fracción de membrana de la célula C6-15 que
expresa la proteína HORK3. Como resultado del análisis Scatchard
para el enlace, la constante de disociación de enlace de
[^{3}H]-2MeSADP con la fracción de membrana de la
célula C6-15 que expresa la proteína HORK3 fue Kd =
0,27 nmol/L, y el enlace máximo fue Bmax = 3,7 pmol/mg. En
contraste, no se observó dicho enlace específico en la fracción de
membrana de la célula C6-15 huésped que no expresaba
la proteína HORK3.
A continuación, se examinó un efecto de 2MeSAMP
o AR-C69931MX usando la fracción de membrana de la
célula c6.15 que expresaba la proteína HORK3 preparada en el
Ejemplo 6, y usando una actividad de inhibición del enlace del
[^{3}H]-2MeSADP como indicador. De manera más
particular, se añadieron después 2 MeSAMP (10^{-7} a 10^{-4}
mol/L) o AR-C69931MX (10^{-12} a 10^{-6} mol/L)
y 1 nmol/L de [^{3}H]-2MeSADP a 20 \mug de la
fracción de membrana de la célula C6-15 que
expresaba la proteína HORK3, y se incubaron a temperatura ambiente
durante 2 horas, se recogió el conjunto en un filtro de vidrio
usando un cosechador celular. Se añadió un microcentelleador al
filtro de vidrio, y a continuación se midió la radioactividad usando
un contador líquido por centelleo. De manera adicional, se midió la
radioactividad pero sin añadir el compuesto y añadiendo 2MeSADP
(concentración final = 10 \mumol/L) en el ensayo anterior, como
cantidad total de enlace y como cantidad de enlace no específico,
de manera respectiva. A partir de la curva dependiente de la
concentración de cada compuesto, los efectos inhibidores de 2MeSAMP
y AR-C69931MX sobre el enlace de 2MeSADP con la
proteína HORK3 fueron DI_{50} = 4,9 \mumol/L y DI_{50} = 9,8
nmol/L, de manera respectiva.
De manera adicional a los resultados del Ejemplo
3, se suprimió en los Ejemplos 4 y 5 la cantidad de AMPc producido
por el estímulo de forskolina en las células CHO y
C6-15 que expresaban la proteína HORK3 mediante
2MeSADP o ADP, de manera respectiva. Estos resultados hacen más
claro que el receptor de ADP se acopló con Gi. De manera adicional,
a partir de los resultados de los Ejemplos 4 y 5, llega a ser
factible seleccionar un agonista o antagonista midiendo el cambio
de la concentración de AMP intracelular en la célula CHO o
C6-15 que expresa la proteína HORK3 (uno de los
polipéptidos para la herramienta de selección). Además, es posible
seleccionar un ligando midiendo la inhibición del enlace de 2MeSADP
con la fracción de membrana de la célula C6-15 que
expresa la proteína HORK3, de acuerdo con el procedimiento descrito
en el Ejemplo 6.
Tal como se ha descrito anteriormente, la
proteína HORK3 es un receptor acoplado a Gi expresado en las
plaquetas, a partir de los resultados en los Ejemplos 2 a 6, y de
esta manera, se considera que la proteína HORK3 es una entidad del
receptor P2T_{AC} del ADP de la plaqueta en el que se ha sugerido
la existencia del anterior.
Se recogió sangre de una persona sana (adulto,
varón) usando 1/10 de volumen de citrato de sodio, y a continuación
se preparó plasma rico en plaquetas (PRP) de acuerdo con un
procedimiento de De Marco y col. (J. Clin. Invest., 77,
1272-1277, 1986). Se usó el PRP tras preparar este
con 3 x 10^{8} células/mL usando un contador automático de
células sanguíneas (MEK6258; Nihon Kodehen Corporation). Como
inductor de la agregación, se usó ADP, que es un producto fabricado
por MC Medical Corporation) De manera adicional, se usaron 2MeSAMP o
AR-C69931MX, y se usó solución salina fisiológica
como solvente que se va a usar para disolver los compuestos. A este
respecto, se confirmó en el Ejemplo 5 que 2MeSAMP o
AR-C69931MX presentaron una actividad como un
antagonista de la proteína HORK3.
Se midió la agregación de plaquetas usando un
agregómetro (MCM Hema Tracer 212; MC Medical Corporation). De
manera más particular, se incubaron a 37ºC durante 1 minuto PRP (80
\muL) y una muestra (2MeSAMP o AR-C6))31MX) o el
solvente (10 \muL), y a continuación se añadieron 10 \muL de ADP
(20 a 100 \mumol/L). Se registraron los cambios de luz
transmitida durante 10 minutos, y a continuación se calculó una
inhibición de la agregación (%) a partir del índice de agregación
máxima.
Se muestran en las Figs. 1 y 2, de manera
respectiva, los resultados cuando se usaron 2MeSAMP y
AR-C69931MX. Se representan los datos para 2MeSAMP
(Fig. 1) mediante el "promedio" de los resultados del
experimento obtenidos usando dos voluntarios. Se representan los
datos para AR-C69931MX (Fig. 2) mediante el
"promedio + el error estándar" de los resultados del
experimento obtenidos usando tres voluntarios. Ambos agentes
inhibieron la agregación de plaquetas inducidas por el ADP
dependiente de la concentración. La fuerza inhibidora fue
dependiente de la concentración de ADP como inductor.
Es evidente a partir del presente ejemplo que un
antagonista de la proteína HORK3 presenta una actividad
antiplaquetas.
Una sustancia que inhibe la actividad del
receptor P2T_{AC} del ADP de las plaquetas presenta una actividad
antiplaquetas, y hace posible tratar trastornos trombóticos.
Por tanto, de acuerdo con la herramienta de
selección de la presente invención para un agente antiplaquetas, es
posible seleccionar y evaluar un antagonista del receptor P2T_{AC}
del ADP de las plaquetas que es útil como un agente
antiplaquetas.
Es posible seleccionar un antagonista del
receptor P2T_{AC} del ADP de las plaquetas y seleccionar una
sustancia que es útil como un agente antiplaquetas, usando el
procedimiento de detección del presente procedimiento para un
antagonista o agonista, o usando la combinación del procedimiento de
detección del ligando de la presente invención y el procedimiento
de detección del presente procedimiento para un antagonista o
agonista.
Además, es posible fabricar una composición
farmacéutica antiplaquetas preparando un medicamento usando la
sustancia seleccionada mediante el procedimiento de selección
anterior como el ingrediente activo, y vehículos, rellenos, y/u
otros aditivos.
Además, es posible usar el procedimiento de
detección de la presente invención de un ligando, antagonista, o
agonista so sólo para seleccionar la sustancia útil como agente
antiplaquetas, sino también como ensayo de control de calidad de la
composición farmacéutica antiplaquetas.
Es posible fabricar una composición farmacéutica
antiplaquetas por la detección de si un compuesto de ensayo es o no
un ligando, antagonista, o agonista de la P2T_{AC} del receptor de
ADP usando el procedimiento de detección de la presente invención
de un ligando, antagonista, o agonista, y a continuación preparando
un medicamento usando el antagonista o ligando.
Las características de la "secuencia
artificial" se describen con el identificador numérico
<223> en el listado de secuencias. De manera más particular,
cada oligonucleótido constituido por la secuencia de bases de la
SEC. DE ID. Nº: 3 o 4 es una secuencia de cebador artificialmente
sintetizada.
Tal como anteriormente, la presente invención se
explica con referencia a formas de realización concretas, pero se
incluyen en el alcance de la presente invención las modificaciones y
mejoras obvias por aquellas personas expertas en la técnica.
<110> Yamanouchi Pharmaceutical Co.,
Ltd.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento de selección de
agentes antiplaquetas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
YO122-PCT-656
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 2000-334721
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
11-01-2001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 2001-3575
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
11-01-2001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1029
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1029)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 342
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctctagaat gcaagccgtc gacaacctca cctc
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctctagact attacattgg agtctcttca tttg
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcaagccgtc gacaacc
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgattttgta gtctctggtg caca
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacctctgcg cctggtaaca ccag
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcactgagcgc ggctaca
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttaatgtca cgcacgattt cc
\hfill22
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<210> 10
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 10
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\hskip-.1em\dddseqskipcttcaccacc acggccgagc
\hfill20
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<210> 11
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<211> 5
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 11
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\sa{Asp Cys Gly Leu Phe}
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<210> 12
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<211> 5
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Tyr Asn Leu Val}
Claims (8)
1. El uso de
- (1)
- un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID. Nº 2.
- (2)
- un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos en la que entre uno y diez aminoácidos están borrados, sustituidos y/o añadidos en la secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID. Nº 2, y muestran una actividad supresora de una actividad de la adenilato ciclasa por enlace con ADP y acoplamiento con Gi; o
- (3)
- un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 95% o más con una secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID. Nº 2, y muestran una actividad supresora de una actividad de la adenilato ciclasa por enlace en ADP y acoplamiento con Gi como herramienta de selección de un agente antiplaquetas.
2. El uso de acuerdo con la reivindicación
1, en el que la herramienta es un polipéptido que tiene la
secuencia de aminoácidos de la SEC. DE ID. Nº 2.
3. El uso de un transformante que es
transformado con un vector de expresión que comprende un ADN que
codifica el polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 y que
expresa el polipéptido como herramienta de selección de un agente
antiplaquetas, en el que el transformante no es un ser humano.
4. El uso de acuerdo con la reivindicación
3, en el que la herramienta es un transformante que es transformado
con un vector de expresión que comprende un ADN que codifica un
polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC. DE
ID. Nº 2 y que expresa el polipéptido.
5. Un procedimiento para detectar si un
compuesto a ensayar es o no un ligando de la P2T_{AC} del receptor
de ADP, que comprende las etapas de:
- poner en contacto un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, un resto de membrana transformante que comprende el polipéptido, o un transformante de acuerdo con la reivindicación 3 con el compuesto a ensayar en presencia de un ligando marcado de la P2T_{AC} del receptor de ADP; y
- analizar la variación en la cantidad de ligando marcado que se enlaza con el polipéptido, el resto de membrana transformante, o el transformante.
6. Un procedimiento para detectar si un
compuesto a ensayar es o no un agonista o antagonista de la
P2T_{AC} del receptor de ADP, que comprende las etapas de:
- poner en contacto el compuesto a ensayar en contacto con un transformante de acuerdo con la reivindicación 3 que coexpresa una proteína G quimérica que comprende un fragmento de polipéptido que tienen una actividad promotora de una actividad de la fosfolipasa C y un fragmento de polipéptido que tiene una actividad acoplada al receptor de Gi, dicha proteína G quimérica tiene una secuencia de aminoácidos de la SEC. de ID. Nº 11 en el término C; y
- analizar la variación en concentración intracelular de Ca^{+2} en el transformante.
7. Un procedimiento para detectar si un
compuesto a ensayar es o no un agonista o antagonista de la
P2T_{AC} del receptor de ADP, que comprende las etapas de:
- poner en contacto un transformante de acuerdo con la reivindicación 3 con el compuesto a ensayar, en presencia de un agonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP de las plaquetas; y
- analizar la variación en concentración intracelular de AMPc en el transformante.
8. Un procedimiento para seleccionar un
agente antiplaquetas, que comprende las etapas de:
- Detectar si un compuesto a ensayar es un ligando, agonista o antagonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP mediante el procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, o una combinación de las mismas; y
- seleccionar el antagonista de la P2T_{AC} del receptor de ADP.
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