ES2163384T3 - Receptores acoplados a proteinas g humanos, activados de forma constitutiva, no endogenos. - Google Patents

Receptores acoplados a proteinas g humanos, activados de forma constitutiva, no endogenos.

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ES2163384T3 ES99951991T ES99951991T ES2163384T3 ES 2163384 T3 ES2163384 T3 ES 2163384T3 ES 99951991 T ES99951991 T ES 99951991T ES 99951991 T ES99951991 T ES 99951991T ES 2163384 T3 ES2163384 T3 ES 2163384T3
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Abstract

Una versión no endógena constitutivamente activa de un receptor acoplado a la proteína G (GPCR) de orfan, endógeno, humano, que comprende los siguientes restos de aminoácidos (en la orientación desde el extremo carboxi al extremo amino) a lo largo de las regiones transmembrana6 (TM6) y de bucle-3 intracelular (IC3) del GPCR no endógeno: P 1 AA15X en donde: (1) P 1 es un resto de aminoácido localizado dentro de la región TM6 del GPCR no endógeno, seleccionándose P 1 entre el grupo compuesto por (i) el resto de prolina del GPCR de orfan endógeno, y (ii) un resto de aminoácido no endógeno distinto de prolina; (2) AA15 son 15 restos de aminoácido seleccionados entre el grupo compuesto por (a) los 15 restos de aminoácido endógenos del GPCR de orfan endógeno, (b) 15 restos de aminoácido no endógenos y (c) una combinación de 15 restos de aminoácido, comprendiendo la combinación al menos un resto de aminoácido endógeno del GPCR de orfan endógeno y al menos un resto de aminoácido no endógeno, con laexcepción de que ninguno de los 15 restos de aminoácido endógenos que están situados dentro de la región TM6 de GPCR sea prolina; y (3) X es un resto de aminoácido no endógeno localizado dentro de la región IC3 de dicho GPCR no endógeno.

Description

Receptores acoplados a proteínas G humanos, activados de forma constitutiva, no endógenos.
Campo de la invención
La invención que se describe en este documento de patente se refiere a receptores transmembrana, y de forma más particular a receptores acoplados a proteínas G humanos (GPCR) que han sido alterados de tal forma que los GPCR están activados de forma constitutiva. Lo más preferiblemente, los GPCR humanos se usan para seleccionar compuestos terapéuticos.
Antecedentes de la invención
Aunque existen numerosas clases de receptores en los seres humanos, de lejos la más abundante y relevante terapéuticamente está representada por la clase de receptores acoplados a proteínas G (GPCR). Se estima que existen aproximadamente 100.000 genes en el genoma humano y, de estos, se estima que aproximadamente 2% o 4000 genes, codifican GPCR. De estos, existen aproximadamente 100 GPCR para los que se ha identificado el ligando endógeno que se une al GPCR. Debido al significativo lapso de tiempo que existe entre el descubrimiento de un GPCR endógeno y su ligando endógeno, puede presumirse que el resto de los 1900 GPCR se identificarán y caracterizarán mucho antes de que se identifiquen los ligandos endógenos para estos receptores. De hecho, la rapidez con la que el Proyecto del genoma humano está secuenciando los 100.000 genes humanos indica que el resto de los GPCR humanos se secuenciará completamente en los próximos años. Sin embargo, y a pesar de los esfuerzos para secuenciar el genoma humano, todavía está muy poco claro cómo los científicos serán capaces de explotar esta información de forma rápida, eficaz y eficiente para mejorar y potenciar la condición humana. La presente invención está dirigida a este importante objetivo.
Los receptores, incluidos los GPCR, para los que se ha identificado el ligando endógeno se denominan receptores "conocidos", mientras que los receptores para los que no se ha identificado el ligando endógeno se denominan receptores "huérfanos". Esta distinción no es meramente semántica, en particular en el caso de los GPCR. Los GPCR representan un área importante para el desarrollo de productos farmacéuticos: el 60% de todos los fármacos de prescripción se han desarrollado a partir de aproximadamente 20 de los 100 GPCR conocidos. Así, los GPCR huérfanos son para la industria farmacéutica lo que el oro fue para California al final del siglo 19 - una oportunidad de conseguir crecimiento, expansión, potenciación y desarrollo. Sin embargo, existe un inconveniente grave con respecto a los receptores huérfanos con respecto al descubrimiento de sustancias terapéuticas novedosas. Esto es debido a que la estrategia tradicional para el descubrimiento y desarrollo de fármacos ha necesitado del acceso tanto al receptor como a su ligando endógeno. Así, hasta la fecha los GPCR huérfanos han ofrecido a la técnica un recurso incitador y sin desarrollar para el descubrimiento de fármacos.
Con la estrategia tradicional para el descubrimiento de sustancias terapéuticas potenciales, generalmente lo que sucede es que primero se identifica el receptor. Antes de que puedan iniciarse las tentativas para el descubrimiento de fármacos, típicamente se desarrollan procedimientos que llevan mucho tiempo y son caros para identificar, aislar y generar el ligando endógeno del receptor - este procedimiento puede llevar entre 3 y 10 años por receptor, con un coste de aproximadamente 5 millones de dólares estadounidenses por receptor. Este tiempo y estos recursos financieros deben invertirse antes de que pueda comenzar la estrategia tradicional para el descubrimiento de fármacos. Esto es debido a que las técnicas de descubrimiento de fármacos tradicionales dependen de los denominados "análisis de unión competitiva" por los que los agentes terapéuticos putativos son "seleccionados" con el receptor en un intento de descubrir compuestos que, o bien bloquean el ligando endógeno para que no se una al receptor ("antagonistas"), o potencian o imitan los efectos del ligando que se une al receptor ("agonistas"). El objetivo general es identificar compuestos que evitan la activación celular cuando el ligando se une al receptor (los antagonistas), o que potencian o aumentan la actividad celular que se produciría de otro modo si el ligando estuviera verdaderamente unido al receptor (los agonistas). Debido a que, por definición, los ligandos endógenos para los GPCR huérfanos no han sido identificados, la capacidad de descubrir sustancias terapéuticas únicas y novedosas para estos receptores usando las técnicas de descubrimiento de fármacos tradicionales no es posible. La presente invención, tal como se describirá en más detalle más adelante, supera estas y otras limitaciones graves creadas por las técnicas de descubrimiento de fármacos de ese tipo.
Los GPCR comparten un motivo estructural común. Todos estos receptores tienen siete secuencias de entre 22 y 24 aminoácidos hidrófobos que forman siete hélices alfa, cada una de las cuales traspasa la membrana (cada vez que la traspasa se identifica con un número, es decir, transmembrana-1 (TM-1), transmembrana-2 (TM-2), etc.). Las hélices transmembrana están unidas por tiras de aminoácidos entre transmembrana-2 y transmembrana-3, transmembrana-4 y transmembrana-5, y transmembrana-6 y transmembrana-7 en el exterior, o "lado extracelular" de la membrana celular (éstas se denominan regiones "extracelulares" 1, 2 y 3 (EC-1, EC-2 y EC-3), respectivamente). Las hélices transmembrana también están unidas por tiras de aminoácidos entre transmembrana-1 y transmembrana-2, transmembrana-3 y transmembrana-4, y transmembrana-5 y transmembrana-6 en el interior o "lado intracelular" de la membrana celular (éstas se denominan regiones "intracelulares" 1, 2 y 3 (IC-1, IC-2 y IC-3), respectivamente). El extremo "carboxi" ("C") del receptor queda en el espacio intracelular en el interior de la célula y el extremo "amino" ("N") del receptor queda en el espacio extracelular en el exterior de la célula. La estructura general de los receptores acoplados a proteínas G se representa en la Figura 1.
De forma general, cuando un ligando endógeno se une al receptor (a menudo denominado "activación" del receptor), se produce un cambio en la conformación de la región intracelular que permite el acoplamiento entre la región intracelular y una "proteína G" intracelular. Aunque existen otras proteínas G, actualmente Gq, Gs, Gi, y Go son las proteínas G que se han identificado. El acoplamiento de GPCR activado por ligandos endógenos con la proteína G inicia un proceso de cascada de señalización (que se denomina "transducción de señales"). En condiciones normales, la transducción de señales finalmente produce la activación celular o la inhibición celular. Se cree que el bucle IC-3 así como el extremo carboxi del receptor interactúan con la proteína G. Un objetivo principal de esta invención se refiere a la región transmembrana-6 (TM6) y a la región intracelular-3 (IC3) del GPCR.
En condiciones fisiológicas, los GPCR existen en la membrana celular en equilibrio entre dos conformaciones diferentes: un estado "inactivo" y un estado "activo". Tal como se muestra esquemáticamente en la Figura 2, un receptor en un estado inactivo es incapaz de engranarse en la ruta de transducción intracelular de señales para producir una respuesta biológica. Al cambiar la conformación del receptor al estado activo permite el engranaje en la ruta de transducción (mediante la proteína G) y produce una respuesta biológica.
Un receptor puede estabilizarse en un estado activo mediante un ligando endógeno o un compuesto tal como un fármaco. Descubrimientos recientes, que incluyen pero no se limitan exclusivamente a las modificaciones de la secuencia de aminoácidos del receptor, proporcionan medios distintos de los ligandos endógenos o fármacos para promover y estabilizar el receptor en la conformación de estado activo. Estos medios de forma eficaz estabilizan el receptor en un estado activo simulando el efecto de un ligando endógeno que se une al receptor. La estabilización por tales medios independientes de ligandos se denomina "activación constitutiva del receptor."
Tal como se ha señalado anteriormente, el uso de un receptor huérfano para fines de selección no ha sido posible. Esto es debido al "dogma" tradicional respecto a que la selección de compuestos exige conocer el ligando para el receptor. Por definición entonces, esta estrategia no puede aplicarse con respecto a los receptores huérfanos. Así, al observar esta estrategia dogmática para el descubrimiento de sustancias terapéuticas, la técnica, en esencia, ha enseñado y ha sido enseñada a renunciar al uso de los receptores huérfanos a no ser y hasta que se descubra el ligando endógeno para el receptor. Dado que existe una estimación de 2.000 receptores acoplados a proteínas G, la mayoría de los cuales son receptores huérfanos, tal dogma castiga una estrategia creativa, única y diferente para el descubrimiento de sustancias terapéuticas.
La información respecto a las secuencias de ácidos nucleicos y/o de aminoácidos de una variedad de GPCR se resume a continuación en la Tabla A. Debido a que un enfoque importante de la invención que se describe en el presente documento se refiere a los GPCR huérfanos, muchas de las referencias que se citan más adelante se refieren a los GPCR huérfanos. Sin embargo, no se pretende que esta lista implique, ni esta lista debe interpretarse legalmente, ni de ningún otro modo, que la invención que se describe en el presente documento sea aplicable únicamente a los GPCR huérfanos o los GPCR específicos que se enumeran más adelante. Además, ciertos receptores que han sido aislados no son tema de publicaciones per se; por ejemplo, se hace referencia a una base de datos de receptores acoplados a proteínas G en la "world-wide web" (ni los inventores nombrados ni el cesionario tienen ninguna afiliación con este sitio) que enumera los GPCR. Otros GPCR son objeto de solicitudes de patente propiedad del presente cesionario y estas no se enumeran a continuación (incluyendo GPR3, GPR6 y GPR12; véase el documento de Estados Unidos con número provisional 60/094879):
TABLA A
Nombre del receptor Referencia de la publicación
GPR1 23 Genomics 609 (1994)
GPR4 14 DNA and Cell Biology 25 (1995)
GPR5 14 DNA and Cell Biology 25 (l99S)
GPR7 28 Genomics 84 (1995)
GPR8 28 Genomics 84 (1995)
GPR9 184 J. Exp. Med. 963 (1996)
GPR10 29 Genomics 335 (l99S)
GPR15 32 Genomics 462 (1996)
GPR17 70 J Neurochem. 1351 (1998)
GPR18 42 Genomics 462 (1997)
TABLA A (continuación)
Nombre del receptor Referencia de la publicación
GPR20 187 Gen 75 (1997)
GPR21 187 Gen 75 (1997)
GPR22 187 Gen 75 (1997)
GPR24 398 FEBS Lett. 253 (1996)
GPR30 45 Genomics 607 (1997)
GPR31 42 Genomics 519 (1997)
GPR32 50 Genomics 281 (1997)
GPR40 239 Biochem. Biophys. Res. Commun. 543 (1997)
GPR41 239 Biochem. Biophys. Res. Commun. 543 (1997)
GPR43 239 Biochem. Biophys. Res. Commun. 543 (1997)
APJ 136 Gene 355 (1993)
BLR1 22 Eur. J. lmmunol. 2759 (1992)
CEPR 231 Biochem. Biophys. Res. Commun. 651 (1997)
EBI1 23 Genomics 643 (1994)
EBI2 67 J. Virol. 2209 (1993)
ETBR-LP2 424 FEBS Lett. 193 (1998)
GPCR-CNS 54 Brain Res. Mol. Brain Res. 152 (1998); 45 Genomics 68 (1997)
GPR-NGA 394 FEBS Lett. 325 (1996)
H9 386 FEBS Lett. 219 (1996)
HBA954 1261 Biochim. Biophys. Acta 121 (1995)
HG38 247 Biochem. Biophys. Res. Commun. 266 (1998)
HM74 5 Int. Immunol. 1239 (1993)
OGR1 35 Genomics 397 (1996)
V28 163 Gen 295 (1995) 
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se describirá y explicará en mayor detalle más adelante, la utilización de un casete de mutación para modificar la secuencia endógena de un GPCR humano lleva a una versión de GPCR humano activado de forma constitutiva. Estas versiónes no endógenas, activadas de forma constitutiva de GPCR humanos puede utilizarse, entre otros, para la selección de compuestos candidato para identificar directamente compuestos, por ejemplo, de relevancia terapéutica.
El documento WO 97/21731 describe una versión activa de forma constitutiva de un GPCR humano endógeno, el receptor de CCK-B/gastrina, que se caracteriza porque el residuo de valina, que se encuentra en la posición 16 contando a partir del residuo de prolina endógeno en la región transmembrana-6 en dirección desde el extremo C al el extremo N, se alteró a un residuo de ácido glutámico no endógeno.
\newpage
El documento WO 98/38217 describe un procedimiento de alineación para identificar en las secuencias de los GPCR el aminoácido equivalente al residuo de alanina en la posición 293 del receptor alfa 1B-adrenérgico. Enseña a aplicar el procedimiento de alineación para crear versiones activas de forma constitutiva de otros GPCR.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona un procedimiento para crear una versión no endógena, activa de forma constitutiva de un receptor acoplado a proteína G humano endógeno (GPCR), comprendiendo dicho GPCR endógeno una región transmembrana 6 y una región de bucle intracelular 3, comprendiendo el procedimiento:
(a) seleccionar un GPCR humano endógeno que comprende un residuo de prolina en la región transmembrana 6;
(b) identificar el residuo aminoacídico n.º 16 endógeno a partir del residuo de prolina de la etapa (a), en dirección desde el extremo carboxi al extremo amino;
(c) alterar el residuo aminoacídico identificado de la etapa (b) a un residuo aminoacídico no endógeno creando una versión no endógena del GPCR humano endógeno; y
(d) determinar si la versión no endógena del GPCR humano endógeno de la etapa (c) está activa de forma constitutiva midiendo una diferencia en una señal intracelular medida para la versión no endógena comparada con una señal inducida por el GPCR endógeno.
En el presente documento se describe un receptor acoplado a proteína G humano endógeno que comprende (a) como región de secuencia de aminoácidos más preferida (orientación del extremo C al extremo N) y/o (b) como región de secuencia de ácidos nucleicos más preferida (orientación 3' a 5') que atraviesa las regiones transmembrana-6 (TM6) y el bucle intracelular-3 (IC3) del GPCR:
(a) P^{1}AA_{15}X
en el que:
(1) P^{1} es un residuo aminoacídico localizado en la región TM6 del GPCR, donde P^{1} se selecciona del grupo que consiste en (i) el residuo de prolina del GPCR endógeno, y (II) un residuo aminoacídico no endógeno distinto de prolina;
(2) AA_{15} son 15 aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste en (a) los aminoácidos endógenos de GPCR (b) residuos aminoacídicos no endógenos, y (c) una combinación de los aminoácidos endógenos de GPCR y de aminoácidos no endógenos, con la excepción de que ninguno de los 15 residuos aminoacídicos endógenos que están localizados en la región TM6 del GPCR es prolina; y
(3) X es un residuo aminoacídico no endógeno localizado en la región IC3 de dicho GPCR, que preferiblemente se selecciona del grupo que consiste en lisina, histidina y arginina, y lo más preferiblemente lisina, con la excepción de que cuando el aminoácido endógeno en la posición X, es lisina, entonces X es un aminoácido distinto de lisina, preferiblemente alanina;
y/o
(b) P^{codón} (AA-codón)_{15}X_{codón}
en el que:
(1) P^{codón} es una secuencia de ácidos nucleicos en la región TM6 del GPCR, en el que P^{codón} codifica un aminoácido que se selecciona del grupo que consiste en (i) el residuo de prolina del GPCR endógeno, y (ii) un residuo aminoacídico no endógeno distinto de prolina;
(2) (AA-codón)_{15} son 15 codones que codifican 15aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste en (a) los aminoácidos endógenos de GPCR (b) residuos aminoacídicos no endógenos y (c) una combinación de los aminoácidos del GPCR endógeno y aminoácidos no endógenos, con la excepción de que ninguno de los 15 codones endógenos en la región TM6 del GPCR codifica un residuo aminoacídico de prolina; y
(3) X_{codón} es una región que codifica ácidos nucleicos localizada en la región IC3 de dicho GPCR, donde X_{codón} codifica un aminoácido no endógeno que preferiblemente se selecciona del grupo que consiste en lisina, histidina y arginina, y lo más preferiblemente lisina, con la excepción de que cuando la región codificante endógena en la posición X_{codón} codifica el aminoácido lisina, entonces X_{codón} codifica un aminoácido distinto de lisina, preferiblemente alanina.
Los términos endógeno y no endógeno en referencia a estos casetes de secuencias son relativos al GPCR endógeno. Por ejemplo, una vez se ha localizado el residuo de prolina endógeno en la región TM6 de un GPCR particular y se ha localizado el aminoácido n.º 16 de la misma para ser mutado para activar el receptor de forma constitutiva, también es posible mutar el residuo de prolina endógeno (es decir, una vez se ha localizado el marcador y se ha identificado el aminoácido n.º 16 a mutar, puede mutarse el marcador en sí), aunque lo más preferido es que el residuo de prolina no sea mutado. De forma similar, y aunque lo más preferido es que se mantengan los AA_{15} en sus formas endógenas, estos aminoácidos también pueden mutarse. El único aminoácido que debe mutarse en la versión no endógena del GPCR humano es X es decir, el aminoácido endógeno que está a 16 residuos de P^{1} no puede mantenerse en su forma endógena y debe ser mutado, tal como se describe adicionalmente en el presente documento. Dicho de otra forma, aunque se prefiere que en la versión no endógena del GPCR humano, P^{1} y AA_{15} permanezcan en sus formas endógenas (es decir, idénticos a sus formas naturales), una vez se ha identificado X y se ha mutado, cualquiera y/o todos de P^{1} y AA_{15} pueden mutarse. Esto también es aplicable a las secuencias de ácidos nucleicos también. En aquellos casos en los que el aminoácido endógeno en la posición X sea lisina, entonces en la versión no endógena de tal GPCR, X es un aminoácido distinto de lisina, preferiblemente alanina.
En consecuencia, y como ejemplo hipotético; si el GPCR endógeno tiene la siguiente secuencia de aminoácidos endógenos en las posiciones referidas anteriormente:
P-AACCTTGGRRRDDDDE-Q
entonces cualquiera de los siguientes casetes ejemplares e hipotéticos entraría en el alcance de la descripción (los aminoácidos no endógenos se incluyen en negrita:
200
También es posible añadir residuos aminoacídicos dentro de AA_{15}, pero tal estrategia no está particularmente avanzada. De hecho, en las realizaciones más preferidas, el único aminoácido que difiere en la versión no endógena del GPCR humano comparada con la versión endógena de ese GPCR es el aminoácido de la posición X; la mutación de este aminoácido en sí conlleva la activación constitutiva del receptor.
Así, en realizaciones particularmente preferidas, P^{1} y P^{codón} son prolina endógena y una región que codifica un ácido nucleico endógeno que codifica prolina, respectivamente; y X y X_{codón} son lisina o alanina no endógenas y una región que codifica un ácido nucleico no endógeno que codifica lisina o alanina, respectivamente, siendo lisina lo más preferido. Debido a que lo más preferido es que las versiones no endógenas de los GPCR humanos que incorporan estas mutaciones están incorporados en células mamíferas y se utilicen para la selección de compuestos candidatos, entonces, el GPCR humano endógeno que incorpora la mutación no tiene que ser purificado y aislado per se (es decir, estos están incorporados en la membrana celular de una célula mamífera), aunque tales GPCR humanos no endógenos purificados y aislados están dentro del ámbito de esta descripción. Los mamíferos no humanos con genes dirigidos y transgénicos (preferiblemente ratas y ratones) que incorporan los GPCR humanos no endógenos están también dentro del ámbito de esta descripción; en particular los mamíferos con genes dirigidos son los más preferidos ya que estos animales incorporarán las versiones no endógenas de los GPCR humanos en lugar de la región que codifica el GPCR no humano endógeno del mamífero (las técnicas para generar tales mamíferos no humanos para sustituir la región que codifica la proteína del mamífero no humano por una región codificante humana son notorias; véase por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.º 5.777.194).
Se ha descubierto que estos cambios a un GPCR humano endógeno hacen que el GPCR esté activo de forma constitutiva de tal forma que, tal como se describirá adicionalmente en el presente documento, puede usarse la versión activada de forma constitutiva no endógena del GPCR humano, entre otros, para la selección directa de compuestos candidatos sin necesidad del ligando endógeno. Así, procedimientos para usar estos materiales, y productos identificados por estos procedimientos están también dentro del ámbito de la siguiente descripción.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra una estructura generalizada de un receptor acoplado a proteína G con los números asignados a las hélices transmembrana, los bucles intracelulares, y los bucles extracelulares.
La Figura 2 muestra esquemáticamente los dos estados, activo e inactivo, para un receptor acoplado a proteína G típico y el engranaje del estado activo en la ruta de transducción del segundo mensajero.
La Figura 3 es un diagrama de las secuencias del vector preferido pCMV, incluyendo las localizaciones de los sitios de restricción enzimática.
La Figura 4 es una representación diagramática de la señal medida comparando la inhibición de GPR30 activo de forma constitutiva, no endógeno en pCMV de la activación mediada por GPR6 del testigo CRE-Luc con la inhibición de GPR30 endógeno de la activación mediada por GPR6 del testigo CRE-Luc.
La Figura 5 es una representación diagramática de la señal medida comparando la inhibición de GPR17 activo de forma constitutiva, no endógeno en pCMV de la activación mediada por GPR3 del testigo CRE-Luc con la inhibición de GPR30 endógeno de la activación mediada por GPR3 del testigo CRE-Luc.
La Figura 6 proporciona resultados diagramáticos de la señal medida comparando APJ endógeno en pCMV control y APJ no endógeno.
La Figura 7 proporciona una ilustración de la producción de IP_{3} a partir del receptor 5-HT_{2A} humano no endógeno comparado con la versión endógena de este receptor.
La Figura 8 son los resultados en formato de inmunotransferencia en puntos para GPR1 (8A), GPR308B) y APJ (8C).
Descripción detallada
La bibliografía científica que se ha desarrollado en torno a los receptores ha adoptado un número de términos para referirse a los ligandos que tienen diversos efectos sobre los receptores. Con fines de claridad y consistencia, las siguientes definiciones se usarán a lo largo de este documento de patente. En la medida en la que estas definiciones entren en conflicto con otras definiciones para estos términos, las siguientes definiciones prevalecerán:
Agonistas querrá decir compuestos que activan la respuesta intracelular cuando se unen al receptor, o que potencian la unión de GTP a las membranas.
Abreviaturas de aminoácidos que se usan en el presente documento se aportan a continuación:
Alanina ALA A
Arginina ARG R
Asparragina ASN N
Ácido Aspártico ASP D
Cisteina CYS C
Ácido Glutámico GLU E
Glutamina GLN Q
Glicina GLY G
Histidina HIS H
Isoleucina ILE I
Leucina LEU L
Lisina LYS K
Metionina MET M
Fenilalanina PHE F
Prolina PRO P
Serina SER S
Treonina THR T
(Continuación)
Triptófano TRP W
Tirosina TYR Y
Valina VAL V 
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Agonistas parciales querrá decir compuestos que activan la respuesta intracelular cuando se unen al receptor en un grado/medida menor que los agonistas o que potencian la unión de GTP a membranas en un grado/medida menor que los agonistas.
Antagonista querrá decir compuestos que se unen competitivamente al receptor en el mismo sitio que los agonistas pero que no activan la respuesta intracelular iniciada por la forma activa del receptor, y así pueden inhibir las respuestas intracelulares iniciadas por los agonistas o los agonistas parciales. Los Antagonistas no disminuyen la respuesta intracelular basal en ausencia de un agonista o agonista parcial.
Compuesto candidato querrá decir una molécula (por ejemplo, y sin limitación, un compuesto químico) que puede ser objeto de una técnica de selección. Preferiblemente, la frase "compuesto candidato" no incluye compuestos que se conocía públicamente que eran compuestos que se seleccionan del grupo que consiste en agonista inverso, agonista o antagonista de un receptor, tal como se había determinado previamente mediante un procedimiento de identificación indirecta ("compuesto identificado indirectamente"); más preferiblemente, no incluye un compuesto identificado indirectamente que previamente se había determinado que tenía eficacia como sustancia terapéutica al menos en un mamífero, y lo más preferiblemente, no incluye un compuesto identificado indirectamente que previamente se había determinado que tenía utilidad como sustancia terapéutica en seres humanos.
Codón querrá decir un grupo de tres nucleótidos (o equivalentes a nucleótidos) que generalmente comprenden un nucleósido (adenosina (A), guanosina (G), citidina (C), uridina (U) y timidina (T)) acoplado a un grupo fosfato y que, cuando se traduce, codifica un aminoácido.
Eficacia del compuesto querrá decir una medición de la capacidad de un compuesto de inhibir o estimular la función del receptor, contrapuesto a la afinidad de unión al receptor. Un medio preferido para detectar la eficacia del compuesto es por medición, por ejemplo de la unión a [^{35}S]GTP\gammaS, tal como se describe adicionalmente en la sección de Ejemplos de este documento de patente.
Receptor activado de forma constitutiva querrá decir un receptor sometido a activación constitutiva del receptor. De acuerdo con la invención que se describe en el presente documento, un receptor acoplado a proteína G activado de forma constitutiva, humano, no endógeno es uno que ha sido mutado para que incluya el casete de aminoácidos P^{1}AA_{15}X, tal como se describe en mayor detalle más adelante.
Activación constitutiva del receptor querrá decir estabilización de un receptor en el estado activo por medios distintos de la unión del receptor a su ligando endógeno o a un equivalente químico del mismo. Preferiblemente, un receptor acoplado a proteína G sometido a activación constitutiva del receptor de acuerdo con la invención que se describe en el presente documento evidencia al menos un 10% de diferencia en la respuesta (aumento o descenso, según sea el caso) de la señal medida para la activación constitutiva comparada con la forma endógena de ese GPCR, más preferiblemente, aproximadamente una diferencia del 25% en dicha respuesta comparativa, y lo más preferiblemente aproximadamente una diferencia del 50% en dicha respuesta comparativa. Cuando se usa para los fines de identificar directamente compuestos candidato, lo más preferido es que la diferencia en la señal sea al menos aproximadamente 50% de tal forma que exista una diferencia suficiente entre la señal endógena y la señal no endógena para diferenciar entre los compuestos candidatos seleccionados. En la mayoría de los casos, la "diferencia" será un aumento de la señal; sin embargo, con respecto a los GPCR acoplados a G, la "diferencia" medida es preferiblemente un descenso, tal como se describirá en mayor detalle más adelante.
Contacto o Contactar querrá decir juntar al menos dos restos, ya sea en un sistema in vitro o en un sistema in vivo.
Identificar directamente o identificado directamente, relacionados con la frase "compuesto candidato" querrá decir la selección de un compuesto candidato con un receptor acoplado a proteína G activado de forma constitutiva, y evaluar la eficacia del compuesto de tal compuesto. Esta frase, bajo ninguna circunstancia, debe interpretarse o entenderse como que está englobada o que engloba la frase "identificar indirectamente" o "identificado indirectamente".
Endógeno querrá decir un material que es producido de forma natural por el genoma de la especie. Endógeno con respecto a, por ejemplo y sin limitación, GPCR, querrá decir aquel que es producido de forma natural por un ser humano, un insecto, una planta, una bacteria o un virus. Por el contrario, el término no endógeno en este contexto querrá decir aquel que no es producido de forma natural por el genoma de una especie. Por ejemplo, y sin limitación, un receptor que no está activado de forma constitutiva en su forma endógena, pero que se muta usando los casetes descritos en el presente documento y después de esto se vuelve activo de forma constitutiva, de la forma más preferible se denomina en el presente documento "receptor activado de forma constitutiva, no endógeno," Ambos términos pueden utilizarse para describir tanto sistemas in vivo como sistemas in vitro. Por ejemplo, y sin limitación, en una estrategia de selección, el receptor endógeno o no endógeno puede ser refiriéndose a un sistema de detección in vitro por el que el receptor se expresa en la superficie celular de una célula de mamífero. Como ejemplo adicional y no como limitación, cuando el genoma de un mamífero ha sido manipulado para que incluya un receptor activado de forma constitutiva no endógeno, es viable la selección de un compuesto candidato mediante un sistema in vivo.
Célula Hospedadora querrá decir una célula capaz de tener un plásmido y/o vector incorporado en ella. En el caso de una célula hospedadora procariota, un plásmido típicamente se replica como una molécula autónoma al irse replicando la célula hospedadora (generalmente, el plásmido se aísla después para su introducción en una célula hospedadora eucariota); en el caso de una célula hospedadora eucariota, un plásmido se integra en el ADN celular de la célula hospedadora, de tal forma que cuando la célula hospedadora eucariota se replica, el plásmido se replica. Preferiblemente, para los fines de la invención que se describe en el presente documento, la célula hospedadora es eucariota, más preferiblemente, mamífera, y lo más preferiblemente se selecciona del grupo que consiste en las células 293, 293T y COS-7.
Identificar indirectamente o identificado indirectamente quiere decir la estrategia tradicional para el procedimiento de descubrimiento que implica la identificación de un ligando endógeno específico para un receptor endógeno, la selección de los compuestos candidatos con el receptor para determinar los que interfieren y/o compiten con la interacción entre ligando y receptor, y la evaluación de la eficacia del compuesto para afectar al menos una ruta de mensajero secundario asociada al receptor activado.
Inhibir o inhibición relacionado con el término "respuesta" querrá decir que una respuesta disminuye o se evita en presencia de un compuesto comparada con la ausencia del compuesto.
Agonistas inversos querrá decir compuestos que se unen o a la forma endógena del receptor o a la forma activada de forma constitutiva del receptor, y que inhiben la respuesta intracelular basal iniciada por la forma activa del receptor por debajo del nivel basal normal de actividad que se observa en ausencia de agonistas o agonistas parciales, o hacen descender la unión de GTP a membranas. Preferiblemente, la respuesta intracelular basal es inhibida por la presencia del agonista inverso al menos en un 30%, más preferiblemente al menos en un 50%, y lo más preferiblemente al menos en un 75%, comparada con la respuesta basal en ausencia del agonista inverso.
Receptor conocido querrá decir un receptor endógeno para el que se ha identificado el ligando endógeno específico para ese receptor.
Ligando querrá decir una molécula natural, endógena específica para un receptor natural, endógeno.
Mutante o mutación relacionado con una secuencia de ácidos nucleicos y/o aminoácidos de un el receptor endógeno querrá decir un cambio o cambios especificados en tales secuencias endógenas de tal forma que una forma mutada de un receptor no activado de forma constitutiva, endógeno evidencie la activación constitutiva del receptor. En términos de equivalentes para las secuencias específica, una forma mutada subsiguiente de un receptor humano se considera que es equivalente a una primera mutación del receptor humano si (a) el nivel de activación constitutiva de la forma mutada subsiguiente del receptor es sustancialmente la misma que evidencia la primera mutación del receptor; y (b) la homología porcentual de la secuencia (aminoácidos y/o ácidos nucleicos) entre la forma mutada subsiguiente del receptor y la primera mutación del receptor es al menos aproximadamente 80%, más preferiblemente al menos aproximadamente 90% y lo más preferiblemente al menos 95%. De forma ideal, y debido al hecho de que los casetes más preferidos que se describen en el presente documento para lograr la activación constitutiva incluyen un cambio de un único aminoácido y/o codón entre las formas endógena y no endógena del GPCR (es decir X o X_{codón}, la homología porcentual entre las secuencias debería ser al menos 98%.
Receptor huérfano querrá decir un receptor endógeno para el que el ligando endógeno específico para ese receptor no se ha identificado o no es conocido.
Composición farmacéutica querrá decir una composición que comprende al menos un ingrediente activo, por el que la composición puede someterse a investigación para un resultado eficaz específico en un mamífero (por ejemplo, y sin limitación, un ser humano). Las personas de experiencia ordinaria en la técnica, entenderán y apreciarán las técnicas apropiadas para determinar si un ingrediente activo tiene un resultado eficaz deseado basándose en las necesidades del experto.
Plásmido querrá decir la combinación de un Vector y ADNc. En general un plásmido se introduce en una célula hospedadora con el fin de la replicación y/o expresión del ADNc en forma de una proteína.
Estimular o estimulador, relacionado con el término "respuesta" querrá decir que se aumenta una respuesta en presencia de un compuesto comparado con la ausencia del compuesto.
Atravesado o que atraviesa, relacionado con una secuencia de ácidos nucleicos definida o una secuencia de aminoácidos definida, querrá decir que la secuencia está localizada en al menos dos regiones diferentes y definidas. Por ejemplo, en una secuencia de aminoácidos que tiene una longitud de 10 restos aminoacídicos, donde 3 de los 10 restos están en la región TM6 de un GPCR y los 7 restos restantes están en la región IC3 del GPCR, el resto de 10 aminoácidos puede describirse como que atraviesan las regiones TM6 y IC3 del GPCR.
Vector relacionado con ADNc querrá decir un ADN circular capaz de incorporar al menos un ADNc y capaz de incorporarse en una célula hospedadora.
El orden de las siguientes secciones se expone para una presentación más eficaz y no se pretende, ni debe interpretarse, como limitación de la descripción o de las reivindicaciones más adelante.
A. Introducción
El estudio tradicional de los receptores siempre ha progresado desde una suposición a priori (con base histórica) de que el ligando endógeno debe identificarse primero antes de que el descubrimiento pudiera progresar para encontrar antagonistas y otras moléculas que podrían afectar al receptor. Incluso en los casos en los que podría haberse conocido un antagonista primero, la búsqueda inmediatamente se ampliaba a buscar el ligando endógeno. Este modo de pensar ha persistido en la investigación de los receptores incluso después del descubrimiento de los receptores activados de forma constitutiva. Lo que no se ha reconocido hasta ha fecha es que el estado activo del receptor es lo más útil para descubrir agonistas, agonistas parciales, y agonistas inversos del receptor. Para aquellas enfermedades que son resultado de un receptor demasiado activo o de un receptor poco activo, lo que se desea de un fármaco terapéutico es un compuesto que actúe para disminuir el estado activo de un receptor o que potencie la actividad del respectivamente, no necesariamente un fármaco que sea un antagonista del ligando endógeno. Esto es debido a que un compuesto que reduce o potencia la actividad del estado de receptor activo no tiene que unirse al mismo sitio que el ligando endógeno. Así, según enseña un procedimiento de esta invención, cualquier búsqueda de compuestos terapéuticos debería iniciarse con la selección de compuestos con el estado activo independiente del ligando.
La selección de compuestos candidato contra los GPCR activados de forma constitutiva no endógenos permite la identificación directa de compuestos candidatos que actúan sobre estos receptores de la superficie celular, sin que sea necesario ningún conocimiento anterior ni el uso del ligando endógeno del receptor. Al determinar áreas del cuerpo en las que se expresan y/o expresan excesivamente las versiones endógenas de tales GPCR, es posible determinar estados de enfermedad/trastorno que están asociados a la expresión y/o expresión excesiva de estos receptores; tal estrategia se describe en este documento de patente.
B. Identificación y/o selección de enfermedades/trastornos
Lo más preferiblemente, los agonistas inversos de los GPCR activados de forma constitutiva, no endógenos pueden identificarse usando los materiales de esta invención. Tales agonistas inversos son candidatos ideales como compuestos directores en los programas de descubrimiento de fármacos para tratar enfermedades relacionadas con estos receptores. Debido a la capacidad de identificar directamente agonistas inversos, agonistas parciales o agonistas de estos receptores, permitiendo así desarrollar composiciones farmacéuticas, es posible una búsqueda de enfermedades y trastornos asociados a estos receptores. Por ejemplo, la exploración de muestras de tejidos enfermos y normales para determinar la presencia de estos receptores ahora se convierte en más que un ejercicio académico o uno que puede realizarse con vistas a identificar, en el caso de un eceptor huérfano, un ligando endógeno. Las exploraciones tejidos pueden realizarse con un amplio abanico de tejidos sanos y enfermos. Tales exploraciones de tejidos proporcionan una primera etapa preferida para asociar un receptor específico a una enfermedad y/o trastorno.
Preferiblemente, se usa la secuencia de ADN del GPCR endógeno para formar una sonda para ADNc radiomarcado o para la identificación por RT-PCR de la expresión del GPCR en muestras de tejido. Preferiblemente, puede utilizarse la presencia de un receptor en un tejido enfermo, o la presencia del receptor a concentraciones elevadas o disminuidas en un tejido enfermo comparado con un tejido normal para identificar una correlación con esa enfermedad. Mediante esta técnica pueden localizarse receptores en regiones de órganos igualmente bien. Basándose en las funciones conocidas de los tejidos específicos en los que se localiza el receptor, puede deducirse el papel funcional putativo del receptor.
C. Un algoritmo de "marcador de prolina en GPCR humano" y la creación de GPCR humanos activos de forma constitutiva, no endógenos
Entre los muchos retos a los que se enfrenta la técnica biotecnológica está la imprevisibilidad al recoger información genética de una especie y correlacionar esa información con otra especie (en ninguna otra parte en esta técnica este problema se muestra con una exacerbación tan irritante como en las secuencias genéticas que codifican los ácidos nucleicos y las proteínas. Así, para ser consistentes y debido a la naturaleza altamente impredecible de esta técnica, la siguiente invención está limitada, en términos de mamíferos, a los GPCR humanos) la aplicabilidad de esta invención a otras especies de mamíferos, aunque es una posibilidad potencial, se considera que sobrepasa la mera aplicación rutinaria.
En general, cuando se trata de aplicar "reglas" comunes de una secuencia proteínica relacionada a otra o de una especie a otra, la técnica típicamente ha recurrido a la alineación de secuencias, es decir, las secuencias se hacen lineales y después se intenta encontrar regiones comunes entre dos o más secuencias. Aunque útil, esta estrategia no siempre produce información significativa. En el caso de los GPCR, aunque el motivo estructural general es idéntico para todos los GPCR, las variaciones de las longitudes de las TM, EC y IC hace que tales estrategias de alineación de un GPCR a otro sean difíciles en el mejor de los casos. Así, aunque puede ser deseable aplicar una estrategia consistente, por ejemplo, para la activación constitutiva de un GPCR a otro, debido a la gran diversidad de la longitud de las secuencias, la fidelidad, etc. de un GPCR al siguiente, en esencia no es posible una estrategia de alineación de mutaciones fácilmente exitosa y aplicable de forma general. En una analogía, una estrategia de ese tipo es igual que hacer que un viajero inicie un viaje en el punto A proporcionándole docenas de mapas diferentes para llegar al punto B, sin escalas ni marcadores de distancia en ninguno de los mapas y después pedir al viajero que encuentre el camino más corto y más eficaz para el destino B usando solamente los mapas. En una situación de ese tipo, la tarea puede simplificarse fácilmente teniendo (a) un "marcador de localización" común en cada mapa, y (b) la capacidad de medir la distancia desde el marcador de localización al destino B, esto entonces, permitirá al viajero seleccionar la ruta más eficaz desde el punto inicial A al destino B.
En esencia, una característica de la invención es proporcionar tales coordenadas en los GPCR humanos que permita fácilmente la creación de una forma activa de forma constitutiva de los GPCR humanos.
Tal como apreciarán los expertos en la técnica, la región transmembrana de una célula es altamente hidrófoba; así, al usar técnicas estándar de representación de las características hidrófobas, los expertos en la técnica fácilmente serán capaces de determinar las regiones TM de un GPCR y específicamente TM6 (esta misma estrategia también puede aplicarse para determinar las regiones EC e IC de los GPCR). Se ha descubierto que en la región TM6 de los GPCR humanos, un residuo de prolina común (generalmente en medio de TM6), actúa como un "marcador" de la activación constitutiva. Al contar 15 aminoácidos desde el marcador de prolina, el aminoácido n.º 16 (que está localizado en el bucle IC3), cuando se muta de su forma endógena a una forma no endógena, conlleva la activación constitutiva del receptor. Para mayor comodidad, los presentes inventores lo denominan el Algoritmo "marcador de prolina de GPCR humano". Aunque el aminoácido no endógeno en esta posición puede ser cualquiera de los aminoácidos, lo más preferiblemente, el aminoácido no endógeno es lisina. Aunque no se desea estar obligado por ninguna teoría, los presentes inventores creen que esta posición misma es única y que la mutación en esta locación repercute en el receptor permitiendo la activación constitutiva.
Los presentes inventores observan que, por ejemplo, cuando el aminoácido endógeno en la posición 16ª ya es lisina (como es el caso con GPR4 y GPR32), entonces para que X sea un aminoácido no endógeno, debe ser distinto de lisina; así, en esas situaciones en las que el GPCR endógeno tiene un residuo de lisina endógeno en la posición 16ª, la versión no endógena de ese GPCR preferiblemente incorpora un aminoácido distinto de lisina, preferiblemente alanina, histidina y arginina, en esta posición. Debe observarse además, que se ha determinado que GPR4 parece estar ligado a G y es activo en su forma endógena (no se muestran datos).
Debido a que solamente existen 20 aminoácidos naturales (aunque también es viable el uso de aminoácidos no naturales), es viable la selección de un aminoácido particular no endógeno para sustituir esta posición 16ª y permite la selección eficaz de un aminoácido no endógeno que se ajuste a las necesidades del investigador. Sin embargo, tal como se ha apuntado, los aminoácidos más preferidos no endógenos en la posición 16ª son lisina, histidina, arginina y alanina, siendo lisina el más preferido. Se cree que las personas de experiencia ordinaria en la técnica tendrán capacidad para determinar fácilmente procedimientos competentes para cambiar la secuencia de un codón para lograr la mutación deseada.
También se ha descubierto que, a veces, pero no siempre, el marcador de residuo de prolina en TM6 estará precedido de W2 (es decir, W2P^{1}AA_{15}X) en el que W es triptófano y 2 es cualquier residuo aminoacídico.
El descubrimiento de los investigadores, entre otras cosas, niega la necesidad de estrategias de alineación de secuencias impredecibles y complicadas que habitualmente usa la técnica. De hecho, la fuerza del descubrimiento de los inventores, es que aunque es de naturaleza algorítmica, puede ser aplicada de forma fácil a los GPCR humanos, con simplicidad diestra por los expertos en la técnica, logrando un producto final único y muy útil, es decir, una versión activada de forma constitutiva de un GPCR humano. Debido a que serán necesarios muchos años y cantidades significativas de dinero para determinar los ligandos endógenos para los GPCR humanos que el Proyecto del genoma humano no cubre, la invención descrita, no solamente reduce el tiempo necesario para explotar de forma positiva esta información de la secuencias, sino que lo hace con un ahorro significativo de los costes. Esta estrategia valida verdaderamente la importancia del Proyecto del genoma humano porque permite la utilización de información genética no solo para entender el papel de los GPCR, por ejemplo, en enfermedades, sino que también proporciona la oportunidad de mejorar la condición humana.
D. Selección de compuestos candidatos 1. Técnicas de análisis de selección de GPCR genéricas
Cuando un receptor de proteína G se vuelve activo de forma constitutiva, se acopla con una proteína G (por ejemplo Gq, Gs, Gi, Go) y estimula la liberación y unión subsiguiente de GTP a la proteína G. La proteína G después actúa como una GTPasa y lentamente hidroliza el GTP a GDP, por lo que el receptor, en condiciones normales, se desactiva. Sin embargo, los receptores activados de forma constitutiva, incluidos los GPCR activos de forma constitutiva, no endógenos de la presente invención, continúan cambiando GDP por GTP. Puede usarse un análogo no hidrolizable de GTP, [^{35}S]GTP\gammaS, para controlar la unión potenciada a proteínas G presentes en las membranas que expresan receptores activados de forma constitutiva. Se ha reseñando que [^{35}S]GTP\gammaS puede usarse para controlar el acoplamiento de proteína G a las membranas en ausencia y presencia de ligandos. Un ejemplo de este control, entre otros ejemplos notorios y disponibles para los expertos en la técnica, fue reseñado por Traynor y Nahorski en 1995. El uso preferido de este sistema de análisis es para la selección inicial de compuestos candidatos porque el sistema generalmente puede aplicarse a todos los receptores acoplados a proteínas G independientemente de la proteína G particular que interactúe con el dominio intracelular del receptor.
2. Técnicas de análisis de selección de GPCR específicas
Una vez se identifican los compuestos candidatos usando el análisis de receptor acoplado a proteína G "genérico" (es decir, un análisis para seleccionar compuestos que son agonistas, agonistas parciales o agonistas inversos), se prefiere una selección ulterior para confirmar que los compuestos han interactuado con el sitio del receptor. Por ejemplo, un compuesto identificado por el análisis "genérico" puede no unirse receptor, sino que en vez de eso puede meramente "desacoplar" la proteína G del dominio intracelular.
a. Gs y Gi
Gs estimula la enzima adenililciclasa. Gi (y Go), por otra parte, inhiben esta enzima. La adenililciclasa cataliza la conversión de ATP en AMPc; así, los GPCR activados de forma constitutiva que se unen a la proteína Gs está asociados a niveles celulares aumentados de AMPc. Por otra parte, los GPCR activados de forma constitutiva que se acoplan a la proteína Gi (o Go) están asociados a niveles celulares disminuidos de AMPc. Véase, de forma general, "Indirect Mechanisms of Synaptic Transmission," Capítulo 8, From Neuron To Brain (3ª Edición) Nichols, J.G. y cols. Editores Sinauer Associates, Inc. (1992). Así, pueden utilizarse análisis que detectan AMPc para determinar si un compuesto candidato es, por ejemplo, un agonista inverso del receptor (es decir, tal compuesto disminuiría los niveles de AMPc). Pueden utilizarse una variedad de estrategias conocidas en la técnica para medir AMPc; la estrategia más preferida se basa en el uso de los anticuerpos contra AMPc en un formato con base de ELISA. Otro tipo de análisis que puede utilizarse es un análisis con un sistema testigo de mensajero secundario en células enteras. Los promotores de los genes dirigen la expresión de las proteínas que codifica un gen particular. El AMP cíclico dirige la expresión génica al promover la unión de una proteína que se une a ADN o factor de transcripción (CREB) que responde a AMPc, que después se une al promotor en sitios específicos denominados elementos de respuesta a AMPc y dirige la expresión del gen. Pueden construirse sistemas testigos que tienen un promotor que contiene múltiples elementos que responden a AMPc antes del gen testigo, por ejemplo, \beta-galactosidasa o luciferasa. Así, un receptor ligado a G activado de forma constitutiva provoca la acumulación de AMPc que después activa el gen y la expresión de la proteína testigo. La proteína testigo tal como \beta-galactosidasa o luciferasa puede detectarse después usando análisis bioquímicos estándar (Chen y cols. 1995). Con respecto a los GPCR que se unen a Gi (o Go), y así disminuyen los niveles de AMPc, se describe una estrategia para la selección, por ejemplo, de agonistas inversos, basándose en la utilización de receptores que se unen a Gs (y así aumentan los niveles de AMPc) en la sección de Ejemplos con respecto a GPR17 y
GPR30.
b. Go y Gq
Gq y Go están asociadas a la activación de la enzima fosfolipasa C, que a su vez hidroliza el fosfolípido PIP_{2}, liberando dos mensajeros intracelulares: diacilcoglicerol (DAG) y 1,4,5-trifosfato de inistol (IP_{3}). La acumulación aumentada de IP_{3} está asociada a la activación de receptores asociados a Gq y Go. Véase, de forma general, "Indirect Mechanisms of Synaptic Transmission," Capítulo 8, From Neuron To Brain (3ª Edición) Nichols, J.G. y cols. Editores Sinauer Associates, Inc. (1992). Pueden utilizarse análisis que detectan la acumulación de IP_{3} para determinar si un compuesto candidato es, por ejemplo, un agonista inverso de un receptor asociado a Gq o Go (es decir, tal compuesto disminuiría los niveles de IP_{3}). Los receptores asociados a Gq también pueden examinarse usando un análisis de testigo de AP1 en el que la fosfolipasa C dependiente de Gq provoca la activación de genes que contienen elementos AP1; así, los receptores asociados a Gq activados evidenciarán un aumento de la expresión de tales genes, por lo que los agonistas inversos de ellos evidenciarán un descenso en tal expresión, y los agonistas evidenciarán un aumento en tal expresión. Hay análisis disponibles comercialmente para tal detección.
E. Química médicinal
De forma general, pero no siempre, la identificación directa de compuestos candidatos preferiblemente se realiza junto con compuestos generados mediante técnicas químicas combinatorias, por las que miles de compuestos se preparan aleatoriamente para tal análisis. Generalmente, los resultados de tal selección serán compuestos que tienen estructuras nucleares únicas; después de lo cual estos compuestos preferiblemente se someten a modificación química adicional alrededor de una(s) estructura(s) nuclear(es) preferida(s) para potenciar más sus propiedades medicinales. Tales técnicas son conocidas por los expertos en la técnica y no se abordarán en detalle en este documento de
patente.
F. Composiciones farmacéuticas
Compuestos candidatos que se seleccionan para desarrollo ulterior pueden formularse en composiciones farmacéuticas usando técnicas notorias en la técnica. Vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados están disponibles para los expertos en la técnica; véase por ejemplo Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª Edición, 1980, Mack Publishing Co., (Oslo y cols., editores).
G. Otras utilidades
Aunque un uso preferido de las versiones no endógenas de los GPCR humanos es para la identificación directa de compuestos candidatos como agonistas inversos, agonistas o agonistas parciales (preferiblemente para usar como agentes farmacéuticos), estos receptores también pueden utilzarse en entornos de investigación. Por ejemplo, pueden utilizarse sistemas in vitro e in vivo que incorporen estos receptores para elucidar y entender más los papeles de los receptores en la condición humana, tanto normal como enferma, así como para entender el papel de la activación constitutiva aplicada a la comprensión de la cascada de señales. La importancia de estos receptores no endógeno es que su utilidad como herramienta de investigación es mayor ya que, debido a sus características únicas, los receptores descritos pueden usarse para entender el papel de un receptor particular en el cuerpo humano antes de que se identifique el ligando endógeno para el mismo. Otros usos de los receptores descritos se harán obvios para los expertos en la técnica basándose, entre otros, en una revisión de este documento de patente.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se presentan con fines de elucidación, y no de limitación, de la presente invención. Siguiendo las enseñanzas de este documento de patente de que puede utilizarse un casete de mutación en el bucle IC3 de los GPCR humanos basándose en una posición relativa a un residuo de prolina en TM6 para activar el receptor de forma constitutiva, y aunque en el presente documento se describen secuencias específicas de ácidos nucleicos y aminoácidos, se cree que las personas de experiencia ordinaria en la técnica tendrán la capacidad de realizar modificaciones menores a estas secuencias logrando resultados iguales o sustancialmente similares a los que se reseñan más adelante. Estrategias particulares para las mutaciones de secuencias están dentro del ámbito del experto basándose en las necesidades particulares del experto.
Ejemplo 1 Preparación de GPCR humanos endógenos
En los Ejemplos a continuación se utilizó una variedad de GPCR. Algunos GPCR humanos endógenos fueron gentilmente proporcionados en vectores de expresión (tal como se reconoce más adelante) y otros GPCR humanos endógenos se sintetizaron de novo usando información de secuencias disponible públicamente.
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1. GPR1 (Número de acceso de GenBank: U13666)
La secuencia de ADNc humano para GPR1 fue proporcionada en pRcCMV por Brian O'Dowd (Universidad de Toronto). Se excindió ADNc de GPR1 (fragmento de 1,4 kb) del vector pRcCMV en forma de un fragmento NdeI-XbaI y se subclonó en el sitio NdeI- XbaI del vector pCMV (véasela Figura 3). Después se determinaron y verificaron las secuencias de ácidos nucleicos (SEC. ID. N.º: 1) y aminoácidos (SEC. ID. N.º: 2) para GPR1 humano.
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2. GPR4 (Números de acceso de GenBank: L36148, U35399, U21051)
La secuencia de ADNc humano para GPR4 fue proporcionada en pRcCMV por Brian O'Dowd (Universidad de Toronto). Se excindió ADNc de GPR1 (fragmento de 1,4 kb) del vector pRcCMV en forma de un fragmento Apal(romo)-XbaI y se subclonó (eliminando la mayor parte de la región 5' no traducida) en el sitio HindIII(romo)-XbaI del vector pCMV. Después se determinaron y verificaron las secuencias de ácidos nucleicos (SEC. ID. N.º: 3) y aminoácidos (SEC. ID. N.º: 3) para GPR4 humano.
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3. GPR5 (Número de acceso de GenBank: L36149)
El ADNc para GPR5 humano se generó y clonó en el vector de expresión pCMV de la forma siguiente: se realizó una PCR usando ADN genómico como plantilla y polimerasa rTth (Perkin Elmer) con el sistema de tampón proporcionado por el fabricante, 0,25 \muM de cada cebador, y 0,2 mM de cada uno de los 4 nucleótidos. Las condiciones de los ciclos fueron 30 ciclos de: 94°C durante 1 minuto; 64ºC durante 1 minuto; y 72ºC durante 1,5 minutos. El cebador 5' de la PCR contenía un sitio EcoRI con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-TATGAATTCAGATGCTCTAAACGTCCCTGC-3' (SEC. ID. N.º: 5)
y el cebador 3' contenía sitio BamHI con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-TCCGGATCCACCTGCACCTGCGCCTGCACC-3' (SEC. ID. N.º: 6). 
\newpage
El fragmento de la PCR de 1,1 kb se digirió con EcoRI y BamHI y se clonó en el sitio EcoRI-BamHI del vector de expresión pCMV. Después se determinaron y verificaron las secuencias de ácidos nucleicos (SEC. ID. N.º: 7) y aminoácidos (SEC. ID. N.º: 8) para GPR5 humano.
4. GPR7 (Número de acceso de GenBank: U22491)
El ADNc para GPR7 humano se generó y se clonó en el vector de expresión pCMV de la forma siguiente: condiciones de la PCR- se realizó una PCR usando ADN genómico como plantilla y polimerasa rTth (Perkin Elmer) con el sistema de tampón proporcionado por el fabricante, 0,25 \muM de cada cebador, y 0,2 mM de cada uno de los 4 nucleótidos. Las condiciones de los ciclos fueron 30 ciclos de: 94ºC durante 1 minuto; 62ºC durante 1 minuto; y 72ºC durante 1 minuto y 20 segundos. El cebador 5' de la PCR contenía un sitio HindIII con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-GCAAGCTTGGGGACGCCAGGTCGCCGGCT-3' (SEC. ID. N.º: 9)
y el cebador 3' contenía un sitio BamHI con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-GCGGATCCGGACGCTGGGGGAGTCAGGCTGC-3' (SEC. ID. N.º: 10).
El fragmento de la PCR de 1,1 kb se digirió con HindIII y BamHI y se clonó en el sitio HindIII-BamHI del vector de expresión pCMV. Después se determinaron y verificaron las secuencias de ácidos nucleicos (SEC. ID. N.º: 11) y aminoácidos (SEC. ID. N.º: 12) para GPR7 humano.
\vskip1.000000\baselineskip
5. GPR8 (Número de acceso de GenBank: U22492)
El ADNc para GPR8 humano se generó y se clonó en el vector de expresión pCMV de la forma siguiente: se realizó una PCR usando ADN genómico como plantilla y polimerasa rTth (Perkin Elmer) con el sistema de tampón proporcionado por el fabricante, 0,25 \muM de cada cebador, y 0,2 mM de cada uno de los 4 nucleótidos. Las condiciones de los ciclos fueron 30 ciclos de: 94ºC durante 1 minuto; 62ºC durante 1 minuto; y 72ºC durante 1 minuto y 20 segundos. El cebador 5' de la PCR contenía un sitio EcoRI con la secuencia
\hskip0,5cm 5'-CGGAATTCGTCAACGGTCCCAGCTACAATG-3' (SEC. ID. N.º: 13).
y el cebador 3' contenía un sitio BamHI con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-ATGGATCCCAGGCCCTTCAGCACCGCAATAT-3' (SEC. ID. N.º: 14).
El fragmento de 1,1 kb de la PCR se digirió con EcoRI y BamHI y se clonó en el sitio EcoRI-BamHI del vector de expresión pCMV. Los 4 clones de ADNc secuenciados contenían un posible polimorfismo que implicaba un cambio del aminoácido 206 de Arg a Gln. Aparte de esta diferencia, después se determinaron y verificaron las secuencias de ácidos nucleicos (SEC. ID. N.º: 15) y aminoácidos (SEC. ID. N.º: 16) para GPR8 humano.
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6. GPR9 (Número de acceso de GenBank: X95876)
El ADNc para GPR9 humano se generó y se clonó en el vector de expresión pCMV de la forma siguiente: se realizó una PCR usando un clon (proporcionado por Brian O'Dowd) como plantilla y polimerasa pfu (Stratagene) con el sistema de tampón proporcionado por el fabricante suplementado con DMSO al 10%, 0,25 \muM de cada cebador, y 0,5 mM de cada uno de los 4 nucleótidos. Las condiciones de los ciclos fueron 25 ciclos de: 94ºC durante 1 minuto; 56ºC durante 1 minuto; y 72ºC durante 2,5 minutos. El cebador 5' de la PCR contenía un sitio EcoRI con la
secuencia:
\hskip0,5cm 5'-ACGAATTCAGCCATGGTCCTTGAGGTGAGTGACCACCAAGTGCTAAAT-3' (SEC. ID. N.º: 17)
y el cebador 3' contenía un sitio BamHI con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-GAGGATCCTGGAATGCGGGGAAGTCAG-3' (SEC. ID. N.º: 18).
El fragmento de la PCR de 1,2 se digirió con EcoRI y se clonó en el sitio EcoRI-SmaI del vector de expresión pCMV. Después se determinaron y verificaron las secuencias de ácidos nucleicos (SEC. ID. N.º: 19) y aminoácidos (SEC. ID. N.º: 20) para GPR9 humano.
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7. GPR9-6 (Número de acceso de GenBank: U45982)
El ADNc para GPR9-6 humano se generó y se clonó en el vector de expresión pCMV de la forma siguiente: se realizó una PCR usando ADN genómico como plantilla y polimerasa rTth (Perkin Elmer) con el sistema de tampón proporcionado por el fabricante, 0,25 \muM de cada cebador, y 0,2 mM de cada uno de los 4 nucleótidos. Las condiciones de los ciclos fueron 30 ciclos de: 94ºC durante 1 minuto; 62ºC durante 1 minuto; y 72ºC durante 1 minuto y 20 segundos. El cebador 5' de la PCR contenía la quinasa con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-TTAAGCTTGACCTAATGCCATCTTGTGTCC-3' (SEC. ID. N.º: 21)
y el cebador 3' contenía un sitio BamHI con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-TTGGATCCAAAAGAACCATGCACCTCAGAG-3' (SEC. ID. N.º: 22).
El fragmento de 1,2 kb de la PCR se digirió con BamHI y se clonó en el sitio EcoRI-BamHI del vector de expresión pCMV. Después se determinaron y verificaron las secuencias de ácidos nucleicos (SEC. ID. N.º: 23) y aminoácidos (SEC. ID. N.º: 24) para GPR9-6 humano.
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8. GPR10 (Número de acceso de GenBank: U32672)
La secuencia de ADNc humano para GPR10 fue proporcionada en pRcCMV por Brian O'Dowd (Universidad de Toronto). El ADNc de GPR10 (fragmento de 1,3 kb) se escindió del vector pRcCMV en forma de un fragmento EcoRI-XbaI y se subclonó en el sitio EcoRI-XbaI del vector pCMV. Después se determinaron y verificaron las secuencias de ácidos nucleicos (SEC. ID. N.º: 25) y aminoácidos (SEC. ID. N.º: 26) para GPR10 humano.
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9. GPR15 (Número de acceso de GenBank: U34806)
La secuencia de ADNc humano para GPR15 fue proporcionada en pCADN3 por Brian O'Dowd (Universidad de Toronto). El ADNc de GPR15 (fragmento de 1,5 kB) se escindió del vector pCADN3 en forma de un fragmento HindIII-Bam y se subclonó en el sitio HindIII-Bam del vector pCMV. Después se determinaron y verificaron las secuencias de ácidos nucleicos (SEC. ID. N.º: 27) y aminoácidos (SEC. ID. N.º: 28) para GPR15 humano.
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10. GPR17 (Número de acceso de GenBank: Z94154)
El ADNc para GPR17 humano se generó y se clonó en el vector de expresión pCMV de la forma siguiente: se realizó una PCR usando ADN genómico como plantilla y polimerasa rTth (Perkin Elmer) con el sistema de tampón proporcionado por el fabricante, 0,25 \muM de cada cebador, y 0,2 mM de cada uno de 4 nucleótidos. Las condiciones de los ciclos fueron 30 ciclos de: 94ºC durante 1 minuto; 56ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 1 minuto y 20 segundos. El cebador 5' de la PCR contenía un sitio EcoRI con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-CTAGAATTCTGACTCCAGCCAAAGCATGAAT-3' (SEC. ID. N.º: 29)
y el cebador 3' contenía un sitio BamHI con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-GCTGGATCCTAAACAGTCTGCGCTCGGCCT-3' (SEC. ID. N.º: 30).
El fragmento de 1,1 kb de la PCR se digirió con EcoRI y BamHI y se clonó en el sitio EcoRI-BamHI del vector de expresión pCMV. Después se determinaron y verificaron las secuencias de ácidos nucleicos (SEC. ID. N.º: 31) y aminoácidos (SEC. ID. N.º: 32) para GPR17 humano.
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11. GPR18 (Número de acceso de GenBank: L42324)
El ADNc para GPR18 humano se generó y se clonó en el vector de expresión pCMV de la forma siguiente: se realizó una PCR usando ADN genómico como plantilla y polimerasa rTth (Perkin Elmer) con el sistema de tampón proporcionado por el fabricante, 0,25 \muM de cada cebador, y 0,2 mM de cada uno de los 4 nucleótidos. Las condiciones de los ciclos fueron 30 ciclos de: 94ºC durante 1 minuto; 54ºC durante 1 minuto; y 72ºC durante 1 minuto y 20 segundos. El cebador 5' de la PCR contenía la quinasa con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-ATAAGATGATCACCCTGAACAATCAAGAT-3' (SEC. ID. N.º: 33)
y el cebador 3' contenía un sitio EcoRI con la secuencia:
\hskip0,5cm 5-TCCGAATTCATAACATTTCACTGTTTATATTGC-3' (SEC. ID. N.º: 34).
El fragmento de 1,0 kb de la PCR se digirió con EcoRI y se clonó en el sitio EcoRI romo del vector de expresión pCMV. Los 8 clones de ADNc secuenciados contenían 4 polimorfismos posibles que implicaban cambios del aminoácido 12 de Thr a Pro, del aminoácido 86 de Ala a Glu, del aminoácido 97 de Ile a Leu y del aminoácido 310 de Leu a Met. Aparte de estos cambios, después se determinaron y verificaron las secuencias de ácidos nucleicos (SEC. ID. N.º: 35) y aminoácidos (SEC. ID. N.º: 36) para GPR18 humano.
12. GPR20 (Número de acceso de GenBank: U66579)
El ADNc para GPR20 humano se generó y se clonó en el vector de expresión pCMV de la forma siguiente: se realizó una PCR usando ADN genómico como plantilla y polimerasa rTth (Perkin Elmer) con el sistema de tampón proporcionado por el fabricante, 0,25 \muM de cada cebador, y 0,2 mM de cada uno de los 4 nucleótidos. Las condiciones de los ciclos fueron 30 ciclos de: 94ºC durante 1 minuto; 62ºC durante 1 minuto; y 72ºC durante 1 minuto y 20 segundos. El cebador 5' de la PCR contenía la quinasa con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'CCAAGCTTCCAGGCCTGGGGTGTGCTGG-3' (SEC. ID. N.º: 37)
y el cebador 3' contenía un sitio BamHI con la secuencia:
\hskip0,5cm ATGGATCCTGACCTTCGGCCCCTGGCAGA-3' (SEC. ID. N.º: 38).
El fragmento de 1,2 kb de la PCR se digirió con BamHI y se clonó en el sitio EcoRV - BamHI del vector de expresión pCMV. Después se determinaron y verificaron las secuencias de ácidos nucleicos (SEC. ID. N.º: 39) y aminoácidos (SEC. ID. N.º: 40) para GPR20 humano.
13. GPR21 (Número de acceso de GenBank: U66580)
El ADNc para GPR21 humano se generó y se clonó en el vector de expresión pCMV de la forma siguiente: se realizó una PCR usando ADN genómico como plantilla y polimerasa rTth (Perkin Elmer) con el sistema de tampón proporcionado por el fabricante, 0,25 \muM de cada cebador, y 0,2 mM de cada uno de los 4 nucleótidos. Las condiciones de los ciclos fueron 30 ciclos de: 94ºC durante 1 minuto; 62ºC durante 1 minuto; y 72ºC durante 1 minuto y 20 segundos. El cebador 5' de la PCR contenía la quinasa con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-GAGAATTCACTCCTGAGCTCAAGATGAACT-3' (SEC. ID. N.º: 41)
y el cebador 3' contenía un sitio BamHI con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-CGGGATCCCCGTAACTGAGCCACTTCAGAT-3' (SEC. ID. N.º: 42).
El fragmento de 1,1 kb de la PCR se digirió con BamHI y se clonó en el sitio EcoRI-BamHI del vector de expresión pCMV. Después se determinaron y verificaron las secuencias de ácidos nucleicos (SEC. ID. N.º: 43) y aminoácidos (SEC. ID. N.º: 44) para GPR21 humano.
14. GPR22 (Número de acceso de GenBank: U66581)
El ADNc para GPR22 humano se generó y se clonó en el vector de expresión pCMV de la forma siguiente: se realizó una PCR usando ADN genómico como plantilla y polimerasa rTth (Perkin Elmer) con el sistema de tampón proporcionado por el fabricante, 0,25 \muM de cada cebador, y 0,2 mM de cada uno de los 4 nucleótidos. Las condiciones de los ciclos fueron 30 ciclos de: 94ºC durante 1 minuto; 50ºC durante 1 minuto; y 72ºC durante 1,5 minutos. El cebador 5' de la PCR contenía la quinasa con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-TCCCCCGGGAAAAAAACCAACTGCTCCAAA-3' (SEC. ID. N.º: 45)
y el cebador 3' contenía un sitio BamHI con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-TAGGATCCATTTGAATGTGGATTTGGTGAAA-3' (SEC. ID. N.º: 46).
El fragmento de 1,38 kb de la PCR se digirió con BamHI y se clonó en el sitio EcoRI-BamHI del vector de expresión pCMV. Después se determinaron y verificaron las secuencias de ácidos nucleicos (SEC. ID. N.º: 47) y aminoácidos (SEC. ID. N.º: 48) para GPR22 humano.
15. GPR24 (Número de acceso de GenBank: U71092)
El ADNc para GPR24 humano se generó y se clonó en el vector de expresión pCMV de la forma siguiente: se realizó una PCR usando ADN genómico como plantilla y polimerasa rTth (Perkin Elmer) con el sistema de tampón proporcionado por el fabricante, 0,25 \muM de cada cebador, y 0,2 mM de cada uno de los 4 nucleótidos. Las condiciones de los ciclos fueron 30 ciclos de: 94ºC durante 1 minuto; 56ºC durante 1 minuto; y 72ºC durante 1 minuto y 20 segundos. El cebador 5' de la PCR contiene un sitio HindIII con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-GTGAAGCTTGCCTCTGGTGCCTGCAGGAGG-3' (SEC. ID. N.º: 49)
y el cebador 3' contiene un sitio EcoRI con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-GCAGAATTCCCGGTGGCGTGTTGTGGTGCCC-3' (SEC. ID. N.º: 50).
El fragmento de 1,3 kb de la PCR se digirió con HindIII y EcoRI y se clonó en el sitio HindIII-EcoRI del vector de expresión pCMV. Después se determinaron y verificaron las secuencias de ácidos nucleicos (SEC. ID. N.º: 51) y aminoácidos (SEC. ID. N.º: 52) para GPR24 humano.
16. GPR30 (Número de acceso de GenBank: U63917)
El ADNc para GPR30 humano se generó y se clonó de la forma siguiente: la secuencia codificante de GPR30 (1128 pb de longitud) se amplificó a partir de ADN genómico usando los cebadores:
\hskip0,5cm 5'-GGCGGATCCATGGATGTGACTTCCCAA-3' (SEC. ID. N.º: 53) y
\hskip0,5cm 5'-GGCGGATCCCTACACGGCACTGCTGAA-3' (SEC. ID. N.º: 54).
Después, el producto amplificado se clonó en un vector disponible comercialmente), pCR2.1 (Invitrogen), usando un "TOPO-TA Cloning Kit" (Invitrogen, n.º K4500-01), siguiendo las instrucciones del fabricante. El inserto de GPR30 de longitud completa se liberó digiriendo con BamHI, se separó del vector mediante electroforesis en gel de agarosa, y se purificó usando a un kit Sephaglas Bandprep^{TM} (Pharmacia, n.º 27-9285-01) siguiendo las instrucciones del fabricante. Después se determinaron y verificaron las secuencias de ácidos nucleicos (SEC. ID. N.º: 55) y aminoácidos (SEC. ID. N.º: 56) para GPR30 humano.
17. GPR31 (Número de acceso de GenBank: U65402)
El ADNc para GPR31 humano se generó y se clonó en el vector de expresión pCMV de la forma siguiente: se realizó una PCR usando ADN genómico como plantilla y polimerasa rTth (Perkin Elmer) con el sistema de tampón proporcionado por el fabricante, 0,25 \muM de cada cebador, y 0,2 mM de cada uno de los 4 nucleótidos. Las condiciones de los ciclos fueron 30 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 58ºC durante 1 minuto; y 72ºC durante 2 minutos. El cebador 5' de la PCR contenía un sitio EcoRI con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-AAGGAATTCACGGCCGGGTGATGCCATTCCC-3' (SEC. ID. N.º: 57)
y el cebador 3' contenía un sitio BamHI con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-GGTGGATCCATAAACACGGGCGTTGAGGAC-3' (SEC. ID. N.º: 58).
El fragmento de 1,0 kb de la PCR se digirió con EcoRI y BamHI y se clonó en el sitio EcoRI-BamHI del vector de expresión pCMV. Después se determinaron y verificaron las secuencias de ácidos nucleicos (SEC. ID. N.º: 59) y aminoácidos (SEC. ID. N.º: 60) para GPR31 humano.
18. GPR32 (Número de acceso de GenBank: AF045764)
El ADNc para GPR32 humano se generó y se clonó en el vector de expresión pCMV de la forma siguiente: se realizó una PCR usando ADN genómico como plantilla y polimerasa rTth (Perkin Elmer) con el sistema de tampón proporcionado por el fabricante, 0,25 \muM de cada cebador, y 0,2 mM de cada uno de los 4 nucleótidos. Las condiciones de los ciclos fueron 30 ciclos de: 94ºC durante 1 minuto; 56ºC durante 1 minuto; y 72ºC durante 1 minuto y 20 segundos. El cebador 5' de la PCR contenía un sitio EcoRI con la secuencia:
\hskip0,5cm 5-TAAGAATTCCATAAAAATTATGGAATGG-3' (SEC. ID. N.º: 243)
y el cebador 3' contenía un sitio BamHI con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-CCAGGATCCAGCTGAAGTCTTCCATCATTC-3' (SEC. ID. N.º: 244).
El fragmento de 1,1 kb de la PCR se digirió con EcoRI y BamHI y se clonó en el sitio EcoRI-BamHI del vector de expresión pCMV. Después se determinaron y verificaron las secuencias de ácidos nucleicos (SEC. ID. N.º: 245) y aminoácidos (SEC. ID. N.º: 246) para GPR32 humano.
19. GPR40 (Número de acceso de GenBank: AF024687)
El ADNc para GPR40 humano se generó y se clonó en el vector de expresión pCMV de la forma siguiente: se realizó una PCR usando ADN genómico como plantilla y polimerasa rTth (Perkin Elmer) con el sistema de tampón proporcionado por el fabricante, 0,25 \muM de cada cebador, y 0,2 mM de cada uno de 4 nucleótidos. Las condiciones de los ciclos fueron 30 ciclos de: 94ºC durante 1 minuto, 65ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 1 minuto y 10 segundos. El cebador 5' de la PCR contenía un sitio EcoRI con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-GCAGAATTCGGCGGCCCCATGGACCTGCCCCC-3' (SEC. ID. N.º: 247)
y el cebador 3' contenía un sitio BamHI con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-GCTGGATCCCCCGAGCAGTGGCGTTACTTC-3' (SEC. ID. N.º: 248).
El fragmento de 1 kb de la PCR se digirió con EcoRI y BamHI y se clonó en el sitio EcoRI-BamHI del vector de expresión pCMV. Después se determinaron y verificaron las secuencias de ácidos nucleicos (SEC. ID. N.º: 249) y aminoácidos (SEC. ID. N.º: 250) para GPR40 humano.
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20. GPR41 (Número de acceso de GenBank AF024688)
El ADNc para GPR41 humano se generó y se clonó en el vector de expresión pCMV de la forma siguiente: se realizó una PCR usando ADN genómico como plantilla y polimerasa rTth (Perkin Elmer) con el sistema de tampón proporcionado por el fabricante, 0,25 \muM de cada cebador, y 0,2 mM de cada uno de 4 nucleótidos. Las condiciones de los ciclos fueron 30 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 65ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 1 minuto y 10 segundos. El cebador 5' de la PCR contenía un sitio HindIII con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-CTCAAGCTTACTCTCTCTCACCAGTGGCCAC-3' (SEC. ID. N.º: 251)
y el cebador 3' contenía la quinasa con la secuencia
\hskip0,5cm 5'-CCCTCCTCCCCCGGAGGACCTAGC-3' (SEC. ID. N.º: 252).
El fragmento de 1 kb de la PCR se digirió con HindIII y se clonó en el sitio romo HindIII del vector de expresión pCMV. Después se determinaron y verificaron las secuencias de ácidos nucleicos (SEC. ID. N.º: 253) y aminoácidos (SEC. ID. N.º: 254) para GPR41 humano.
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21. GPR43 (Número de acceso de GenBank AF024690)
El ADNc para GPR43 humano se generó y se clonó en el vector de expresión pCMV de la forma siguiente: se realizó una PCR usando ADN genómico como plantilla y polimerasa rTth (Perkin Elmer) con el sistema de tampón proporcionado por el fabricante, 0,25 \muM de cada cebador, y 0,2 mM de cada uno de 4 nucleótidos. Las condiciones de los ciclos fueron 30 ciclos de 94ºC durante 1 minuto; 65ºC durante 1 minuto; y 72ºC durante 1 minuto y 10 segundos. El cebador 5' de la PCR contiene un sitio HindIII con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-TTTAAGCTTCCCCTCCAGGATGCTGCCGGAC-3' (SEC. ID. N.º: 255)
y el cebador 3' contenía un sitio EcoRI con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-GGCGAATTCTGAAGGTCCAGGGAAACTGCTA-3' (SEC. ID. N.º: 256).
El fragmento de 1 kb de la PCR se digirió con HindIII y EcoRI y se clonó en el sitio HindIII-EcoRI del vector de expresión pCMV. Después se determinaron y verificaron las secuencias de ácidos nucleicos (SEC. ID. N.º: 257) y aminoácidos (SEC. ID. N.º: 258) para GPR43 humano.
\vskip1.000000\baselineskip
22. APJ (Número de acceso de GenBank: U03642)
ADNc de APJ humano (en el vector pRcCMV) fue proporcionado por Brian O'Dowd (Universidad de Toronto). El ADNc de APJ humano se escindió del vector pRcCMV en forma de un fragmento EcoRI-XbaI (romo) y se subclonó en el sitio EcoRI-SmaI del vector pCMV. Después se determinaron y verificaron las secuencias de ácidos nucleicos (SEC. ID. N.º: 61) y aminoácidos (SEC. ID. N.º: 62) para APJ humano.
\vskip1.000000\baselineskip
23. BLR1 (Número de acceso de GenBank: X68149)
El ADNc para BLR1 humano se generó y se clonó en el vector de expresión pCMV de la forma siguiente: se realizó una PCR usando ADNc de timo como plantilla y polimerasa rTth (Perkin Elmer) con el sistema de tampón proporcionado por el fabricante, 0,25 \muM de cada cebador y 0,2 mM de cada uno de los 4 nucleótidos. Las condiciones de los ciclos fueron 30 ciclos de: 94ºC durante 1 minuto; 62ºC durante 1 minuto; y 72ºC durante 1 minuto y 20 segundos. El cebador 5' de la PCR contenía un sitio EcoRI con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-TGAGAATTCTGGTGACTCACAGCCGGCACAG.3' (SEC. ID. N.º: 63):
y el cebador 3' contenía un sitio BamHI con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-GCCGGATCCAAGGAAAAGCAGCAATAAAAGG-3' (SEC. ID. N.º: 64).
El fragmento de 1,2 kb de la PCR se digirió con EcoRI y BamHI y se clonó en el sitio EcoRI-BamHI del vector de expresión pCMV. Después se determinaron y verificaron las secuencias de ácidos nucleicos (SEC. ID. N.º: 65) y aminoácidos (SEC. ID. N.º: 66) para BLR1 humano.
\vskip1.000000\baselineskip
24. CEPR (Número de acceso de GenBank: U77827)
El ADNc para CEPR humano se generó y se clonó en el vector de expresión pCMV de la forma siguiente: se realizó una PCR usando ADN genómico como plantilla y polimerasa rTth (Perkin Elmer) con el sistema de tampón proporcionado por el fabricante, 0,25 \muM de cada cebador y 0,2 mM de cada uno de los 4 nucleótidos. Las condiciones de los ciclos fueron 30 ciclos de: 94ºC durante 1 minuto; 65ºC durante 1 minuto; y 72ºC durante 1 minuto y 20 segundos. El cebador 5' de la PCR contenía la quinasa con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-CAAAGCTTGAAAGCTGCACGGTGCAGAGAC-3' (SEC. ID. N.º: 67)
y el cebador 3' contenía un sitio BamHI con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-GCGGATCCCGAGTCACACCCTGGCTGGGCC-3' (SEC. ID. N.º: 68).
El fragmento de 1,2 kb de la PCR se digirió con BamHI y se clonó en el sitio EcoRI-BamHI del vector de expresión pCMV. Después se determinaron y verificaron las secuencias de ácidos nucleicos (SEC. ID. N.º: 69) y aminoácidos (SEC. ID. N.º: 70) para CEPR humano.
\vskip1.000000\baselineskip
25. EBI1 (Número de acceso de GenBank: L31581)
El ADNc para humano EBI1 se generó y se clonó en el vector de expresión pCMV de la forma siguiente: se realizó una PCR usando ADNc de timo como plantilla y polimerasa rTth (Perkin Elmer) con el sistema de tampón proporcionado por el fabricante, 0,25 \muM de cada cebador, y 0,2 mM de cada uno de los 4 nucleótidos. Las condiciones de los ciclos fueron 30 ciclos de: 94ºC durante 1 minuto; 62ºC durante 1 minuto; y 72ºC durante 1 minuto y 20 segundos. El cebador 5' de la PCR contenía un sitio EcoRI con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-ACAGAATTCCTGTGTGGTTTTACCGCCCAG-3' (SEC. ID. N.º: 71)
y el cebador 3' contenía un sitio BamHI con la secuencia;
\hskip0,5cm 5'-CTCGGATCCAGGCAGAAGAGTCGCCTATGG-3' (SEC. ID. N.º: 72).
El fragmento de 1,2 kb de la PCR se digirió con EcoRI y BamHI y se clonó en el sitio EcoRI-BamHI del vector de expresión pCMV. Después se determinaron y verificaron las secuencias de ácidos nucleicos (SEC. ID. N.º: 73) y aminoácidos (SEC. ID. N.º: 74) para EBI1 humano.
\vskip1.000000\baselineskip
26. EBI2 (Número de acceso de GenBank: L08177)
El ADNc para humano EBI2 se generó y se clonó en el vector de expresión pCMV de la forma siguiente: se realizó una PCR usando un clon de ADNc (gentilmente proporcionado por Kevin Lynch, Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Virginia; el vector utilizado no fue identificado por la fuente) como plantilla y polimerasa pfu (Stratagene) con el sistema de tampón proporcionado por el fabricante suplementado con DMSO al 10%, 0,25 \muM de cada cebador, y 0,5 mM de cada uno de los 4 nucleótidos. Las condiciones de los ciclos fueron 30 ciclos de: 94ºC durante 1 minuto; 60ºC durante 1 minuto; y 72ºC durante 1 minuto y 20 segundos. El cebador 5' de la PCR contenía un sitio EcoRI con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-CTGGAATTCACCTGGACCACCACCAATGGATA-3' (SEC. ID. N.º: 75)
y el cebador 3' contenía a un sitio BamHI site con la secuencia
\hskip0,5cm 5'-CTCGGATCCTGCAAAGTTTGTCATACAGTT-3' (SEC. ID. N.º: 76).
El fragmento de 1,2 kb de la PCR se digirió con EcoRI y BamHI y se clonó en el sitio EcoRI-BamHI del vector de expresión pCMV. Después se determinaron y verificaron las secuencias de ácidos nucleicos (SEC. ID. N.º: 77) y aminoácidos (SEC. ID. N.º: 78) para EBI2 humano.
\vskip1.000000\baselineskip
27. ETBR-LP2 (Número de acceso de GenBank: D38449)
El ADNc para ETBR-LP2 humano se generó y se clonó en el vector de expresión pCMV de la forma siguiente: se realizó una PCR usando ADNc de cerebro como plantilla y polimerasa rTth (Perkin Elmer) con el sistema de tampón proporcionado por el fabricante, 0,25 \muM de cada cebador, y 0,2 mM de cada uno de los 4 nucleótidos. Las condiciones de los ciclos fueron 30 ciclos de: 94ºC durante 1 minuto; 65ºC durante 1 minuto; y 72ºC durante 1,5 minutos. El cebador 5' de la PCR contenía un sitio EcoRI con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-CTGGAATTCTCCTGCTCATCCAGCCATGCGG-3' (SEC. ID. N.º: 79)
y el cebador 3' contenía un sitio BamHI con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-CCTGGATCCCCACCCCTACTGGGGCCTCAG-3' (SEC. ID. N.º: 80).
El fragmento de 1,5 kb de la PCR se digirió con EcoRI y BamHI y se clonó en el sitio EcoRI - BamHI del vector de expresión pCMV. Después se determinaron y verificaron las secuencias de ácidos nucleicos (SEC. ID. N.º: 81) y aminoácidos (SEC. ID. N.º: 82) para ETBR-LP2 humano.
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28. GHSR (Número de acceso de GenBank: U60179)
El ADNc para GHSR humano se generó y se clonó en el vector de expresión pCMV de la forma siguiente: se realizó una PCR usando ADNc de hipocampo como plantilla y polimerasa TaqPlus Precision (Stratagene) con el sistema de tampón proporcionado por el fabricante, 0,25 \muM de cada cebador, y 0,2 mM de cada uno de los 4 nucleótidos. Las condiciones de los ciclos fueron 30 ciclos de: 94ºC durante 1 minuto; 68ºC durante 1 minuto; y 72ºC durante 1 minuto y 20 segundos. Durante la primera tanda de la PCR la secuencia del cebador 5' era:
\hskip0,5cm 5'-ATGTGGAACGCGACGCCCAGCG-3' (SEC. ID. N.º: 83)
y la secuencia del cebador 3' era:
\hskip0,5cm 5'-TCATGTATTAATACTAGATTCT-3' (SEC. ID. N.º: 84).
Se usaron dos microlitros de la primera tanda de PCR como plantilla para la segunda tanda de PCR, en la que el cebador 5' contenía la quinasa con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-TACCATGTGGAACGCGACGCCCAGCGAAGAGCCGGGGT-3' (SEC. ID. N.º: 85)
y el cebador 3' contenía un sitio EcoRI con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-CGGAATTCATGTATTAATACTAGATTCTGTCCAGGCCCG-3' (SEC. ID. N.º: 86).
El fragmento de 1,1 kb de la PCR se digirió con EcoRI y se clonó en el sitio EcoRI romo del vector de expresión pCMV. Después se determinaron y verificaron las secuencias de ácidos nucleicos (SEC. ID. N.º: 87) y aminoácidos (SEC. ID. N.º: 88) para GHSR humano.
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29. GPCR-CNS (Número de acceso de GenBank: AFO17262)
El ADNc para GPCR-CNS humano se generó y se clonó en el vector de expresión pCMV de la forma siguiente: se realizó una PCR usando ADNc de cerebro como plantilla y polimerasa rTth (Perkin Elmer) con el sistema de tampón proporcionado por el fabricante, 0,25 \muM de cada cebador, y 0,2 mM de cada uno de los 4 nucleótidos. Las condiciones de los ciclos fueron 30 ciclos de: 94ºC durante 1 minuto; 65ºC durante 1 minuto; y 72ºC durante 2 minutos. El cebador 5' de la PCR contenía un sitio HindIII con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-GCAAGCTTGTGCCCTCACCAAGCCATGCGAGCC-3' (SEC. ID. N.º: 89)
y el cebador 3' contenía un sitio EcoRI con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-CGGAATTCAGCAATGAGTTCCGACAGAAGC-3' (SEC. ID. N.º: 90).
El fragmento de 1,9 kb de la PCR se digirió con HindIII y EcoRI y se clonó en el sitio HindIII-EcoRI del vector de expresión pCMV. Los nueve clones secuenciados contenían un polimorfismo potencial que implicaba un cambio en S284C. Aparte de esta diferencia, después se determinaron y verificaron las secuencias de ácidos nucleicos (SEC. ID. N.º: 91) y aminoácidos (SEC. ID. N.º: 92) para GPCR-CNS humano.
\vskip1.000000\baselineskip
30. GPR-NGA (Número de acceso de GenBank: U55312)
El ADNc para GPR-NGA humano se generó y se clonó en el vector de expresión pCMV de la forma siguiente: se realizó una PCR usando ADN genómico como plantilla y polimerasa rTth (Perkin Elmer) con el sistema de tampón proporcionado por el fabricante, 0,25 \muM de cada cebador, y 0,2 mM de cada uno de los 4 nucleótidos. Las condiciones de los ciclos fueron 30 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 56ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 1,5 minutos. El cebador 5' de la PCR contenía un sitio EcoRI con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-CAGAATTCAGAGAAAAAAAGTGAATATGGTTTTT-3' (SEC. ID. N.º: 93)
y el cebador 3' contenía un sitio BamHI con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-TTGGATCCCTGGTGCATAACAATTGAAAGAAT-3' (SEC. ID. N.º: 94).
El fragmento de 1,3 kb de la PCR se digirió con EcoRI y BamHI y se clonó en el sitio EcoRI-BamHI del vector de expresión pCMV. Después se determinaron y verificaron las secuencias de ácidos nucleicos (SEC. ID. N.º: 95) y aminoácidos (SEC. ID. N.º: 96) para GPR-NGA humano.
31. H9 (Número de acceso de GenBank: U52219)
El ADNc para HB954 humano se generó y se clonó en el vector de expresión pCMV de la forma siguiente: se realizó una PCR usando ADNc de pituitaria como plantilla y polimerasa rTth (Perkin Elmer) con el sistema de tampón proporcionado por el fabricante, 0,25 \muM de cada cebador, y 0,2 mM de cada uno de 4 nucleótidos. Las condiciones de los ciclos fueron 30 ciclos de: 94ºC durante 1 minuto, 62ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos. El cebador 5' de la PCR contiene un sitio HindIII con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-GGAAAGCTTAACGATCCCCAGGAGCAACAT-3' (SEC. ID. N.º: 97)
y el cebador 3' contiene un sitio BamHI con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-CTGGGATCCTACGAGAGCATTTTTCACACAG-3' (SEC. ID. N.º: 98).
El fragmento de 1,9 kb de la PCR se digirió con HindIII y BamHI y se clonó en el sitio HindIII-BamHI del vector de expresión pCMV. Al comparar con las secuencias publicadas, también se identificó una isoforma diferente con una inserción en marco de 12 pb en la cola citoplasmática y se denominó "H9b". Ambas isoformas contienen dos polimorfismos potenciales que implican cambios del aminoácido P320S y el aminoácido G448A. La isoforma H9a contenía otro polimorfismo potencial del aminoácido S493N, mientras que la isoforma H9b contenía dos polimorfismos potenciales adicionales que implicaban cambios del aminoácido I502T y el aminoácido A532T (que corresponde al aminoácido 528 de la isoforma H9a). Después se determinaron y verificaron las secuencias de ácidos nucleicos (SEC. ID. N.º: 99) y aminoácidos (SEC. ID. N.º: 100) para H9 humano (en la sección más adelante, ambas isoformas se mutaron de acuerdo con el Algoritmo de marcador de prolina de GPRC humano).
32. HB954 (Número de acceso de GenBank: D38449)
El ADNc para HB954 humano se generó y se clonó en el vector de expresión pCMV de la forma siguiente: se realizó una PCR usando ADNc de cerebro como plantilla y polimerasa rTth (Perkin Elmer) con el sistema de tampón proporcionado por el fabricante, 0,25 \muM de cada cebador y 0,2 mM de cada uno de los 4 nucleótidos. Las condiciones de los ciclos fueron 30 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 58ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos. El cebador 5' de la PCR contenía un sitio HindIII con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-TCCAAGCTTCGCCATGGGACATAACGGGAGCT-3' (SEC. ID. N.º: 101)
y el cebador 3' contenía un sitio EcoRI con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-CGTGAATTCCAAGAATTTACAATCCTTGCT-3' (SEC. ID. N.º: 102).
El fragmento de 1,6 kb de la PCR se digirió con HindIII y EcoRI y se clonó en el sitio HindIII-EcoRI del vector de expresión pCMV. Después se determinaron y verificaron las secuencias de ácidos nucleicos (SEC. ID. N.º: 103) y aminoácidos (SEC. ID. N.º: 104) para HB954 humano.
33. HG38 (Número de acceso de GenBank: AF062006)
El ADNc para HG38 humano se generó y se clonó en el vector de expresión pCMV de la forma siguiente: se realizó una PCR usando ADNc de cerebro como plantilla y polimerasa rTth (Perkin Elmer) con el sistema de tampón proporcionado por el fabricante, 0,25 \muM de cada cebador, y 0,2 mM de cada uno de 4 nucleótidos. Las condiciones de los ciclos fueron 30 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 56ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 1 minuto y 30 segundos. Se realizaron dos reacciones de PCR para obtener el fragmento 5' y el fragmento 3' separados. Para el fragmento 5', el cebador 5' de la PCR contenía un sitio HindIII con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-CCCAAGCTTCGGGCACCATGGACACCTCCC-3' (SEC. ID. N.º: 259)
y el cebador 3' contenía un sitio BamHI con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-ACAGGATCCAAATGCACAGCACTGGTAAGC-3' (SEC. ID. N.º: 260).
Este fragmento 5' de 1,5 kb de la PCR se digirió con HindIII y BamBI y se clonó en un sitio HindIII-BamHI del pCMV. Para el fragmento 3', el cebador 5' de la PCR contenía la quinasa con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-CTATAACTGGGTTACATGGTTTAAC-3' (SEC. ID. N.º: 261)
y el cebador 3' contenía un sitio EcoRI con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-TTTGAATTCACATATTAATTAGAGACATGG-3' (SEC. ID. N.º: 262).
El fragmento 3' de 1,4 kb de la PCR se digirió con EcoRI y se subclonó en un sitio EcoRI romo del vector pCMV. Los fragmentos 5' y 3' se ligaron después mediante un sitio EcoRV común generando el clon de ADNc de longitud completa. Después se determinaron y verificaron las secuencias de ácidos nucleicos (SEC. ID. N.º: 263) y aminoácidos (SEC. ID. N.º: 264) para HG38 humano.
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34. HM74 (Número de acceso de GenBank: D10923)
El ADNc para HM74 humano se generó y se clonó en el vector de expresión pCMV de la forma siguiente: se realizó la PCR usando ADN genómico o ADNc de timo (agrupado) como plantilla y polimerasa rTth (Perkin Elmer) con el sistema de tampón proporcionado por el fabricante, 0,25 \muM de cebador, y 0,2 mM de cada uno de los 4 nucleótidos. Las condiciones de los ciclos fueron 30 ciclos de: 94ºC durante 1 minuto; 65ºC durante 1 minuto; y 72ºC durante 1 minuto y 20 segundos. El cebador 5' de la PCR contenía un sitio EcoRI con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-GGAGAATTCACTAGGCGAGGCGCTCCATC-3' (SEC. ID. N.º: 105)
y el cebador 3' contenía la quinasa con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-GGAGGATCCAGGAAACCTTAGGCCGAGTCC-3' (SEC. ID. N.º: 106).
El fragmento de 1,3 kb de la PCR se digirió con EcoRI y se clonó en el sitio EcoRI-SmaI del vector de expresión pCMV. Los clones secuenciados relevaron un polimorfismo potencial que implicaba un cambio en N94K. Aparte de esta diferencia, después se determinaron y verificaron las secuencias de ácidos nucleicos (SEC. ID. N.º: 107) y aminoácidos (SEC. ID. N.º: 108) para HM74 humano.
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35. MIG (Números de acceso de GenBank: AFO44600 y AFO44601)
El ADNc para MIG humano se generó y se clonó en el vector de expresión pCMV de la forma siguiente: se realizó una PCR usando ADN genómico como plantilla y polimerasa TaqPlus Precision (Stratagene) para la primera tanda de PCR o polimerasa pfu (Stratagene) para la segunda tanda de PCR con el sistema de tampón proporcionado por el fabricante, 0,25 \muM de cada cebador, y 0,2 mM (TaqPlus Precision) o 0,5 mM (Pfu) de cada uno de los 4 nucleótidos. Cuando se usó pfu, se incluyó DMSO al 10% en el tampón. Las condiciones de los ciclos fueron 30 ciclos de: 94ºC durante 1 minuto; 65ºC durante 1 minuto; y 72ºC durante: (a) 1 minuto para la primera tanda de PCR; y (b) 2 minutos para la segunda tanda de PCR. Debido a que existe un intrón en la región codificante, se usaron dos grupos de cebadores de forma separada para generar fragmentos 5' y 3' solapados. Los cebadores del fragmento 5' de la PCR fueron:
\hskip0,5cm 5'-ACCATGGCTTGCAATGGCAGTGCGGCCAGGGGGCACT-3' (codificante externo)
(SEC. ID. N.º: 109) y
\hskip0,5cm 5'-CGACCAGGACAAACAGCATCTTGGTCACTTGTCTCCGGC-3' (no codificante interno)
(SEC. ID. N.º: 110).
Los cebadores del fragmento 3' de la PCR fueron:
\hskip0,5cm 5'-GACCAAGATGCTGTTTGTCCTGGTCGTGGTGTTTGGCAT-3' (codificante externo)
(SEC. ID. N.º: 111) y
\hskip0,5cm 5'-CGGAATTCAGGATGGATCGGTCTCTTGCTGCGCCT-3' (no codificante interno con un
sitio EcoRI) (SEC. ID. N.º: 112).
Los fragmentos 5' y 3' se ligaron usando la primera tanda de la PCR como plantilla y el cebador codificante externo con quinasas y el cebador no codificante externo para realizar la segunda tanda de la PCR. El fragmento de 1,2 kb de la PCR se digirió con EcoRI y se clonó en el sitio EcoRI romo del vector de expresión pCMV. Después se determinaron y verificaron las secuencias de ácidos nucleicos (SEC. ID. N.º: 113) y aminoácidos (SEC. ID. N.º: 114) para MIG humano.
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36. OGR1 (Número de acceso de GenBank: U48405)
El ADNc para OGR1 humano se generó y se clonó en el vector de expresión pCMV de la forma siguiente: se realizó una PCR usando ADN genómico como plantilla y polimerasa rTth (Perkin Elmer) con el sistema de tampón proporcionado por el fabricante, 0,25 \muM de cada cebador, y 0,2 mM de cada uno de los 4 nucleótidos. Las condiciones de los ciclos fueron 30 ciclos de 94ºC durante 1 minuto; 65ºC durante 1 minuto; y 72ºC durante 1 minuto y 20 segundos. El cebador 5' de la PCR contenía la quinasa con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-GGAAGCTTCAGGCCCAAAGATGGGGAACAT-3' (SEC. ID. N.º: 115);
y el cebador 3' contenía un sitio BamHI con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-TGCTCTAGATTCCAGATAGGTGAAAACTTG-3' (SEC. ID. N.º: 116).
El fragmento de 1,1 kb de la PCR se digirió con BamHI y se clonó en el sitio EcoRV - BamHI del vector de expresión pCMV. Después se determinaron y verificaron las secuencias de ácidos nucleicos (SEC. ID. N.º: 117) y aminoácidos (SEC. ID. N.º: 118) para OGR1 humano.
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37. Serotonina 5HT_{2A}
El ADNc que codifica el receptor 5HT_{2A} humano endógeno se obtuvo por RT-PCR usando ARN poli-A^{+} de cerebro humano; un cebador 5' a partir de la región 5' sin traducir con un sitio de restricción Xho I:
\hskip0,5cm 5'-GACCTCGAGTCCTTCTACACCTCATC-3' (SEC. ID. N.º: 119)
y un cebador 3' a partir de la región 3' sin traducir que contenía un sitio Xba I:
\hskip0,5cm 5'-TGCTCTAGATTCCAGATAGGTGAAAACTTG-3' (SEC. ID. N.º: 120).
Se realizó una PCR usando o polimerasa TaqPlus^{TM} precision (Stratagene) o polimerasa rTth^{TM} (Perkin Elmer) con el sistema de tampón proporcionado por el fabricante, 0,25 \muM de cada cebador, y 0,2 mM de cada uno de los 4 nucleótidos. Las condiciones de los ciclos fueron 30 ciclos de 94ºC durante 1 minuto; 57ºC durante 1 minuto; y 72ºC durante 2 minutos. El fragmento de 1,5 kb de la PCR se digirió con Xba I y se subclonó en el sitio EcoRV-Xba I de pBluescript. Los clones de ADNc resultantes se secuenciaron completamente y se encontró que codificaban dos cambios de aminoácidos de las secuencias publicadas. El primero era una mutación T25N en el dominio extracelular del extremo N; el segundo es una mutación H452Y. Dado que los clones de ADNc derivados de dos reacciones de PCR independientes usando polimerasa Taq de dos fuentes comerciales diferentes (TaqPlus^{TM} de Stratagene y rTth^{TM} de Perkin Elmer) contenían las dos mutaciones iguales, es probable que estas mutaciones representen polimorfismos de la secuencia en lugar de errores de la PCR. Con estas excepciones, después se determinaron y verificaron las secuencias de ácidos nucleicos (SEC. ID. N.º: 121) y aminoácidos (SEC. ID. N.º: 122) para 5HT_{2A} humano.
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38. Serotonina 5HT_{2C}
El ADNc que codifica el receptor 5HT_{2C} humano endógeno se obtuvo por RT-PCR usando ARN poli-A^{+} de cerebro humano. Los cebadores 5' y 3' se derivaron de las regiones 5' y 3' sin traducir y contenían las siguientes secuencias
\hskip0,5cm 5'-GACCTCGAGGTTGCTTAAGACTGAAGC-3' (SEC. ID. N.º: 123)
\hskip0,5cm 5'-ATTTCTAGACATATGTAGCTTGTACCG-3' (SEC. ID. N.º: 124)
Después se determinaron y verificaron las secuencias de ácidos nucleicos (SEC. ID. N.º: 125) y aminoácidos (SEC. ID. N.º: 126) para 5HT_{2C} humano.
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39. V28 (Número de acceso de GenBank: U20350)
El ADNc para V28 humano se generó y se clonó en el vector de expresión pCMV de la forma siguiente: se realizó una PCR usando ADNc de cerebro como plantilla y polimerasa rTth (Perkin Elmer) con el sistema de tampón proporcionado por el fabricante, 0,25 \muM de cada cebador, y 0,2 mM de cada uno de los 4 nucleótidos. Las condiciones de los ciclos fueron 30 ciclos de: 94ºC durante 1 minuto; 65ºC durante 1 minuto; y 72ºC durante 1 minuto y 20 segundos. El cebador 5' de la PCR contenía un sitio HindIII con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-GGTAAGCTTGGCAGTCCACGCCAGGCCTTC-3' (SEC. ID. N.º: 127)
y el cebador 3' contenía un sitio EcoRI con la secuencia:
\hskip0,5cm 5'-TCCGAATTCTCTGTAGACACAAGGCTTTGG-3' (SEC. ID. N.º: 128)
El fragmento de 1,1 kb de la PCR se digirió con HindIII y EcoRI y se clonó en el sitio HindIII-EcoRI del vector de expresión pCMV. Después se determinaron y verificaron las secuencias de ácidos nucleicos (SEC. ID. N.º: 129) y aminoácidos (SEC. ID. N.º: 130) para V28 humano.
Ejemplo 2 Preparación de gpcr humanos no endógenos 1. Mutagénesis dirigida al sitio
Se realizó mutagénesis basada en la estrategia del marcador de prolina en GPCR humanos que se describe en el presente documento en los GPCR humanos endógenos anteriores usando Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit (Clontech) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para esta estrategia de mutagénesis se utilizaron una sonda de mutación y una sonda marcadora de selección (a no ser que se indique lo contrario, la sonda de la SEC. ID. N.º: 132 era la misma todo el tiempo), y las secuencias de éstas para las secuencias especificadas se enumeran a continuación en la Tabla B (el nombre entre paréntesis es el SEC. ID. N.º: ). Para mayor comodidad, también se refleja la mutación del codón incorporada en el GPCR humano, en forma estándar:
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA B
2
3 
\newpage
Después se secuenciaron los GPCR humanos no endógenos y las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos derivadas y verificadas se enumeran en la "Lista de secuencias" que se acompaña como apéndice a este documento de patente, tal como se resume en la Tabla C a continuación:
TABLA C
GPCR mutado Listado de secuencia de ácidos nucleicos Listado de secuencia de aminoácidos
GPR1 SEC. ID. N.º: 163 SEC. ID. N.º: 164
(F245K)
GPR4 SEC. ID. N.º: 165 SEC. ID. N.º: 166
(K223A)
GPR5 SEC. ID. N.º: 167 SEC. ID. N.º: 168
(V224K)
GPR7 SEC. ID. N.º: 169 SEC. ID. N.º: 170
(T250K)
GPR8 SEC. ID. N.º: 171 SEC. ID. N.º: 172
(T259K)
GPR9 SEC. ID. N.º: 173 SEC. ID. N.º: 174
(M254K)
GPR9-6 SEC. ID. N.º: 175 SEC. ID. N.º: 176
(L241K)
GPR10 SEC. ID. N.º: 177 SEC. ID. N.º: 178
(F276K)
GPR15 SEC. ID. N.º: 179 SEC. ID. N.º: 180
(I240K)
GPR17 SEC. ID. N.º: 181 SEC. ID. N.º: 182
(V234K)
GPR18 SEC. ID. N.º: 183 SEC. ID. N.º: 184
(I231K)
GPR20 SEC. ID. N.º: 185 SEC. ID. N.º: 186
(M240K)
GPR21 SEC. ID. N.º: 187 SEC. ID. N.º: 188
(A251K)
GPR22 SEC. ID. N.º: 189 SEC. ID. N.º: 190
(F312K)
GPR24 SEC. ID. N.º: 191 SEC. ID. N.º: 192
(T304K)
GPR30 SEC. ID. N.º: 193 SEC. ID. N.º: 194
(L258K)
GPR31 SEC. ID. N.º: 195 SEC. ID. N.º: 196
(Q221K)
GPR32 SEC. ID. N.º: 269 SEC. ID. N.º: 270
(K255A)
TABLA C (continuación)
GPCR mutado Listado de secuencia de ácidos nucleicos Listado de secuencia de aminoácidos
GPR40 SEC. ID. N.º: 271 SEC. ID. N.º: 272
(A223K)
GPR41 SEC. ID. N.º: 273 SEC. ID. N.º: 274
(A223K)
GPR43 SEC. ID. N.º: 275 SEC. ID. N.º: 276
(V221K)
APJ SEC. ID. N.º: 197 SEC. ID. N.º: 198
(K247K)
BLR1 SEC. ID. N.º: 199 SEC. ID. N.º: 200
(V258K)
CEPR SEC. ID. N.º: 201 SEC. ID. N.º: 202
(258K)
EBI1 SEC. ID. N.º: 203 SEC. ID. N.º: 204
(I262K)
EBI2 SEC. ID. N.º: 205 SEC. ID. N.º: 206
(L243K)
ETBR-LP2 SEC. ID. N.º: 207 SEC. ID. N.º: 208
(N358K)
GHSR SEC. ID. N.º: 209 SEC. ID. N.º: 210
(V262K)
GPCR-CNS SEC. ID. N.º: 211 SEC. ID. N.º: 212
(N491K)
GPR-NGA SEC. ID. N.º: 213 SEC. ID. N.º: 214
(I275K)
H9a SEC. ID. N.º: 215 SEC. ID. N.º: 216
(F236K)
H9b SEC. ID. N.º: 217 SEC. ID. N.º: 218
(F236K)
HB954 SEC. ID. N.º: 219 SEC. ID. N.º: 220
(H265K)
HG38 SEC. ID. N.º: 277 SEC. ID. N.º: 278
(V765K)
HM74 SEC. ID. N.º: 221 SEC. ID. N.º: 222
(I230K)
MIG SEC. ID. N.º: 223 SEC. ID. N.º: 224
(T273K)
OGR1 SEC. ID. N.º: 225 SEC. ID. N.º: 226
(Q227K)
TABLA C (continuación)
GPCR mutado Listado de secuencia de ácidos nucleicos Listado de secuencia de aminoácidos
Serotonina 5HT_{2A} SEC. ID. N.º: 227 SEC. ID. N.º: 228
(C322K)
Serotonina 5HT_{2C} SEC. ID. N.º: 229 SEC. ID. N.º: 230
(S310K)
V28 SEC. ID. N.º: 231 SEC. ID. N.º: 232
(I230K) 
\vskip1.000000\baselineskip
2. Estrategias de mutación alternativas para el empleo del Algoritmo de marcador de prolina: APJ; serotonina 5HT_{2A}; serotonina 5HT_{2c}; y GPR30
Aunque la estrategia de mutagénesis dirigida al sitio se prefiere particularmente, pueden utilizarse otras estrategias para crear tales mutaciones; se cree que los expertos en la técnica fácilmente pueden seleccionar estrategias para mutar un GPCR que encaje en las necesidades particulares del experto.
a. APJ
La preparación del receptor APJ humano no endógeno se logró mutando L247K. Se sintetizaron dos oligonucleótidos que contenían esta mutación:
\hskip0,5cm 5'-GGCTTAAGAGCATCATCGTGGTGCTGGTG-3' (SEC. ID. N.º: 233)
\hskip0,5cm 5'-GTCACCACCAGCACCACGATGATGCTCTTAAGCC-3' (SEC. ID. N.º: 234)
Los dos oligonucleótidos se hibridan y se usan para sustituir el fragmento NaeI-BstEII de APJ endógeno humano generando la versión de APJ humano no endógena.
b. Serotonina 5HT_{2A}
Se construyó ADNc que contenía la mutación puntual C322K utilizando el sitio de la enzima de restricción Sph I que comprende el aminoácido 322. Se usó un cebador que contenía la mutación C322K:
\hskip0,5cm 5'-CAAAGAAAGTACTGGGCATCGTCTTCTTCCT-3' (SEC. ID. N.º: 235)
junto con el cebador de la región 3' sin traducir del receptor:
\hskip0,5cm 5'-TGCTCTAGATTCCAGATAGGTGAAAACTTG-3' (SEC. ID. N.º: 236)
para llevar a cabo una PCR (en las condiciones que se describen anteriormente). Después el fragmento de la PCR resultante se usó para sustituir el extremo 3' del ADNc de 5HT_{2A} endógeno a través del sitio Sph I romo de polimerasa T4.
c. Serotonina 5HT_{2C}
El ADNc que contenía una mutación S310K se construyó sustituyendo el fragmento de restricción Sty I que contenía el aminoácido 310 con oligonucleótidos bicatenarios sintéticos que codifican la mutación deseada. La secuencia de la cadena codificante que se utilizó tenía la secuencia siguiente:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  \hskip0,5cm 
5'-CTAGGGGCACCATGCAGGCTATCAACAATGAAAGAAAAGCTAAGAAAGTC-3'\+\cr
 \+ (SEC. ID. N.º:
237)\cr}
y la secuencia de la cadena no codificante utilizada tenía la secuencia siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,2cm 5'-CAAGGACTTTCTTAGCTTTTCTTTCATTGTTGATAGCCTGCATGGTGCCC-3'
(SEC. ID. N.º: 238)
d. GPR30
Antes de generar GPR30 no endógeno, se secuenciaron totalmente varios receptores aislados de pCR2.1/GPR30 para identificar clones con mutaciones no generadas por PCR. Un clon que no tenía mutaciones se digirió con EcoRI y el fragmento de ADNc de GPR30 endógeno se transfirió al plásmido de expresión dirigido de CMV pCI-neo (Promega), digiriendo pCI-Neo con EcoRI y subclonando el fragmento de GPR30 liberado por EcoRI a partir de pCR2.1/GPR30, generando pCI/GPR30. Después, la leucina en el codón 258 se mutó a lisina usando un Quick Change^{TM} Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene; n.º 200518), de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y los cebadores siguientes:
\hskip0,5cm 5'-CGGCGGCAGAAGGCGAAACGCATGATGATCCCTCGCGCGT-3' (SEC. ID. N.º: 239) y
\hskip0,5cm 5'-ACCGCGAGGATCATGCGTTTCGCCTTCTGCCGCCG-3' (SEC. ID. N.º: 240)
Ejemplo 3 Expresión de los receptores (endógenos y mutados)
Aunque hay disponibles en la técnica una variedad de células para la expresión de proteínas, lo más preferido es utilizar células de mamífero. La razón primordial para ello implica razones prácticas, es decir, lautilización, por ejemplo, de células de levadura para la expresión de un GPCR, aunque posible, introduce en el protocolo una célula no mamífera que puede no incluir (de hecho, en el caso de la levadura, no incluye) el mecanismo genético de acoplamiento del receptor y las rutas de secreción que se han desarrollado en los sistemas mamíferos, y así los resultados obtenidos en células no mamíferas, aunque de uso potencial, no son tan preferidos como los obtenidos en células de mamífero. De las células de mamífero, las células COS-7, 293 y 293T son particularmente preferidas, aunque las células de mamífero específicas utilizadas pueden decidirse dependiendo de las necesidades particulares del experto.
A no ser que se indique lo contrario en el presente documento, se utilizó el siguiente protocolo para la expresión de los GPCR humanos endógenos y no endógenos. La Tabla D enumera las células de mamífero y el número utilizado (por placa de 150 mm) para la expresión de GPCR.
TABLA D
Nombre del receptor (Endógeno o no Endógeno) Célula mamífera (Número utilizado)
GPR17 293 (2 X10^{4})
GPR30 293 (4 X10^{4})
APJ COS-7 (5 X10^{6})
ETBR-LP2 293 (1 X10^{7})
293T (1 X10^{7})
GHSR 293 (1 X10^{7})
293T (1 X10^{7})
MIG 293 (1 X10^{7})
Serotonina 5HT_{2A} 293T (1 X10^{7})
Serotonina 5HT_{2C} 293T (1 X10^{7})
El día uno se plaquearon las células de mamífero. El día dos, se prepararon dos tubos de reacción (las proporciones a seguir para cada tubo son por placa): el tubo A se preparó mezclando 20 \mug de ADN (por ejemplo, vector pCMV; vector pCMV con ADNc de receptor endógeno, y vector pCMV con ADNc de receptor no endógeno) en 1,2 ml de DMEM sin suero (Irvine Scientific, Irvine, CA); el tubo B se preparó mezclando 120 \mul de lipofectamina (Gibco BRL) en 1,2 ml de DMEM sin suero. Después se mezclaron los tubos A y B invirtiéndolos (varias veces), seguido de incubación a temperatura ambiente durante 30-45min. La mezcla se denomina "mezcla de transfección". Las células plaqueadas se lavaron con 1 x PBS, seguido de la adición de 10 ml de DMEM sin suero. Después se añadieron 2,4 ml de la mezcla de transfección a las células, seguido de incubación durante 4 horas a 37ºC y CO_{2} al 5%. La mezcla de transfección después se eliminó por aspiración, seguida de la adición de 25 ml de DMEM / suero bovino fetal al 10%. Después, las células se incubaron a 37ºC y CO_{2} al 5%. Después de 72 horas de incubación, después se recolectaron las células y se utilizaron para el análisis.
1. Receptores acoplados a Gi: Co-transfección con receptores acoplados a Gs
En el caso de GPR30, se ha determinado que este receptor se acopla a la proteína G Gi. Se sabe que Gi inhibe la adenililciclasa, que es necesaria para catalizar la conversión de ATP a AMPc. Así, una forma de GPR30 activada de forma constitutiva no endógena sería de esperar que estuviera asociada a niveles disminuidos de AMPc. La confirmación mediante análisis de una forma de GPR30 activada de forma constitutiva, no endógena, directamente midiendo niveles decrecientes de AMPc, aunque es viable, puede medirse preferiblemente mediante el uso cooperativo de un receptor acoplado a Gs. Por ejemplo, un receptor que está acoplado a Gs estimulará adenililciclasa, y así estará asociado a un aumento de AMPc. El cesionario de la presente solicitud de patente ha descubierto que el receptor huérfano GPR6 es un GPCR activado de forma constitutiva, endógeno. GPR6 se acopla a la proteína Gs. Así, cuando se transfectan conjuntamente, puede verificarse fácilmente que una mutación putativa de GPR30 conlleva la activación constitutiva del mismo: es decir, una célula con GPR6 activado de forma constitutiva, endógeno y GPR30 no activado de forma constitutiva, endógeno manifestará un nivel elevado de AMPc, comparado con una con GPR6 activado de forma constitutiva, endógeno y GPR30 activado de forma constitutiva, no endógeno (éste manifestará un nivel comparativamente menor de AMPc).
Pueden utilizarse análisis que detectan AMPc para determinar si un compuesto candidato es por ejemplo un agonista inverso de un receptor asociado a Gs (es decir, un compuesto de ese tipo disminuiría los niveles de AMPc) o un receptor asociado a Gi (o un receptor asociado a Go) (es decir, un compuesto candidato de ese tipo aumentaría los niveles de AMPc). Pueden utilizarse una variedad de estrategias conocidas en la técnica para la medición de AMPc; una estrategia preferida se basa en el uso de anticuerpos contra AMPc. Otra estrategia, y la más preferida, utiliza un análisis de sistema testigo de segundo mensajero. Los promotores de los genes dirigen la expresión de las proteínas que un gen particular codifica. El AMP cíclico dirige la expresión génica al promover la unión de una proteína que se une a ADN o factor de transcripción (CREB) que responde a AMPc, que después se une al promotor en sitios específicos denominados elementos de respuesta a AMPc y dirige la expresión del gen. Pueden construirse sistemas testigos que tienen un promotor que contiene múltiples elementos de respuesta a AMPc antes del gen testigo, por ejemplo,\beta-galactosidasa o luciferasa. Así, un receptor tal como GPR6 activado provoca la acumulación de AMPc que después activa el gen y la expresión de la proteína testigo. De la forma más preferible, células 293 se cotransfectan con plásmidos con GPR6 (u otro receptor ligado a Gs) y GPR30 (u otro receptor ligado a Gi), preferiblemente en una relación 1:1, lo más preferiblemente en una relación 1:4. Debido a que GPR6 es un receptor endógeno, activo de forma constitutiva que estimula la producción de AMPc, GPR6 activa fuertemente el gen testigo y su expresión. La proteína testigo tal como \beta-galactosidasa o luciferasa puede detectarse después usando análisis bioquímicos estándar (Chen y cols. 1995). La cotransfección de GPR6 activo de forma constitutiva, endógeno, con GPR30 no activo de forma constitutiva, endógeno, manifiesta un aumento de la proteína testigo luciferasa. A la inversa, la cotransfección de GPR6 activo de forma constitutiva, endógeno, con GPR30 activo de forma constitutiva, no endógeno, manifiesta un descenso drástico en la expresión de luciferasa. Varios plásmidos testigo son conocidos y están disponibles en la técnica para la medición de un análisis de segundo mensajero. Se considera que está dentro de la técnica de la persona de experiencia en la técnica determinar un plásmido testigo apropiado para una expresión génica particular basándose primordialmente en las necesidades particulares del experto. Aunque hay disponible una variedad de células para la expresión, las células de mamífero son las más preferidas, y de estos tipos, las células 293 son las más preferidas. Células 293 se tranfectaron con el plásmido testigo pCRE-Luc/GPR6 y GPR30 activado de forma constitutiva, no endógeno usando un protocolo de precipitación con CaPO_{4} con un kit Mammalian Transfection^{TM} (Stratagene, n.º 200285) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (véase, 28 Genomics 347 (1995) para la secuencia publicada de GPR6 endógeno). El precipitado contenía 400 ng de testigo, 80 ng de plásmido de expresión de CMV (que tenía una relación entre GPR6 y GPR30 endógeno o GPR30 no endógeno de 1:4) y 20 ng de CMV-SEAP (un plásmido de control de la transfección que codifica fosfatasa alcalina segregada). El 50% del precipitado se dividió en 3 pocillos, de una placa de cultivo tisular de 96 pocillos (que contenía 4 x 10^{4} células/pocillo); el 50% restante se desechó. A la mañana siguiente, se cambió el medio. 48 horas después del inicio de la transfección, se lisaron las células y se examinaron para determinar la actividad de luciferasa usando un kit Luclite^{TM} (Packard, n.º de catálogo 6016911) y un contador de centelleo líquido y luminiscencia Trilux 1450 Microbeta^{TM} (Wallac) según las instrucciones del vendedor. Los datos se analizaron usando GraphPad Prism 2.0a (GraphPad Software Inc.).
Con respecto a GPR17, que también se determinó que estaba unido a Gi, se utilizó una modificación de la estrategia anterior, basándose, entre otros, en el uso de otro receptor endógeno ligado a Gs, GPR3, (véase 23 Genomics 609 (1994) y 24 Genomics 391 (1994)). Lo más preferiblemente, se utilizan células 293. Estas células se plaquearon en placas de 96 pocillos con una densidad de 2 x 10^{4} células por pocillo y se transfectaron usando Reactivo Lipofectamina (BRL) el día siguiente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se preparó una mezcla de ADN/lípido para cada transfección de 6 pocillos de la forma siguiente: 260 ng de ADN plasmídico en 100 \mul de DMEM se mezclaron suavemente con 2 \mul de lípido en 100 \mul de DMEM (los 260 ng de ADN plasmídico consistían en 200 ng de un plásmido testigo 8xCRE-Luc (véase más adelante), 50 ng de pCMV que comprendía receptor endógeno o receptor no endógeno o pCMV solo, y 10 ng de un plásmido de expresión de GPRS (GPRS en pcDNA3. (Invitrogen)). El plásmido testigo 8xCRE-Luc se preparó de la forma siguiente: el vector SRIF-\beta-gal se obtuvo clonando el promotor de la somatostatina de rata (-71/+51) en el sitio BglV-HindIII en el vector p\betagal-Basic (Clontech). Se obtuvieron ocho (8) copias de elemento de respuesta a AMPc por PCR a partir de una plantilla de adenovirus AdpCF126CCRE8 (véase7 Human Gen Therapy 1883 (1996)) y se clonaron en el vector SRIF-\beta-gal en el sitio Kpn-BgIV, dando como resultado el vector testigo 8xCRE-\beta-gal. El plásmido testigo 8xCRE-Luc se generó sustituyendo el gen de beta-galactosidasa en el plásmido testigo 8xCRE-Luc con el gen de luciferasa obtenido a partir del vector pG13-basic (Promega) en el sitio HindIII-BamHI. Después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente, la mezcla de ADN y lípido se diluyó con 400 \mul de DMEM y se añadieron 100 \mul de mezcla diluida a cada pocillo. Se añadieron 100 \mul de DMEM con FCS al 10% a cada pocillo después de una incubación de 4 horas en una incubadora de cultivo celular. A la mañana siguiente, las células transfectadas se cambiaron con 200 \mul/pocillo de DMEM con FCS al 10%. Ocho (8) horas después, los pocillos se cambiaron a 100 \mul/pocillo de DMEM sin rojo fenol, después de un lavado con PBS. La actividad de la luciferasa se midió al día siguiente usando el kit de gen testigo LucLite^{TM} (packard) siguiendo las instrucciones del fabricante y se leyó en un contador de centelleo líquido y luminiscencia Trilux 1450 Microbeta^{TM} (Wallac).
La Figura 4 muestra que GPR30 activo de forma constitutiva inhibe la activación mediada por GPR6 del testigo CRE-Luc en células 293. La luciferasa se midió a aproximadamente 4,1 unidades lumínicas relativas en el vector de expresión pCMV. GPR30 endógeno expresaba luciferasa a aproximadamente 8,5 unidades lumínicas relativas, mientras que GPR30 activo de forma constitutiva, no endógeno (L2S8K), expresó luciferasa a aproximadamente 3,8 y 3,1 unidades lumínicas relativas, respectivamente. La cotransfección de GPR6 endógeno con GPR30 endógeno, en una relación de 1:4, aumentó drásticamente la expresión de luciferasa a aproximadamente 104,1 unidades lumínicas relativas. La cotransfección de GPR6 endógeno con GPR30 no endógeno (L258K) en la misma relación, disminuyó drásticamente la expresión, que es evidente a aproximadamente 18,2 y 29,5 unidades lumínicas relativas, respectivamente. Se observaron resultados similares con respecto a GPR17, con respecto a la cotransfección con GPR3, tal como se describe en la Figura 5.
Ejemplo 3 Análisis para la determinación de la actividad constitutiva de GPCR no endógenos A. Análisis de unión a membranas 1. Análisis de [^{35}S]GTP\gammaS
Cuando un receptor acoplado a proteína G está en su estado activo, bien como resultado de la unión de ligandos o de la activación constitutiva, el receptor se acopla a una proteína G y estimula la liberación de GDP y la subsiguiente unión de GTP a la proteína G. La subunidad alfa del complejo de proteína G y receptor actúa como una GTPasa y lentamente hidroliza el GTP a GDP, momento en el cual, el receptor normalmente se desactiva. Los receptores activados de forma constitutiva continúan cambiando GDP por GTP. Puede usarse un análogo no hidrolizable de GTP, [^{35}S]GTP\gammaS, para demostrar la unión potenciada de [^{35}S]GTP\gammaS a las membranas que expresan receptores activados de forma constitutiva. La ventaja de usar la unión de [^{35}S]GTP\gammaS para medir la activación constitutiva es que: (a) puede aplicarse genéricamente a todos los receptores acoplados a proteínas G; (b) esta situado proximal a la superficie de la membrana haciendo que sea menos probable que capte moléculas que afecten a la cascada intracelular.
El análisis utiliza la capacidad de los receptores acoplados a proteínas G de estimular la unión de [^{35}S]GTP\gammaS a membranas que expresan receptores relevantes. El análisis, por lo tanto, puede usarse en un procedimiento de identificación directa para seleccionar compuestos candidatos para receptores acoplados a proteínas G conocidos, huérfanos y activados de forma constitutiva. El análisis es genérico y tiene aplicación en el descubrimiento de fármacos en todos los receptores acoplados a proteínas G.
El análisis [^{35}S]GTP\gammaS se incubó en HEPES 20 mM y MgCl_{2} entre 1 y aproximadamente 20 mM (esta cantidad puede ajustarse para la optimización de los resultados, aunque se prefiere 20 mM) a pH 7,4, tampón de unión con [^{35}S]GTP\gammaS entre aproximadamente 0,3 y aproximadamente 1,2 nM (esta cantidad puede ajustarse para la optimización de los resultados, aunque se prefiere 1,2) y de 12,5 a 75 \mug de proteína de membrana (por ejemplo, células COS-7 que expresan el receptor; esta cantidad puede ajustarse para la optimización de los resultados, aunque se prefiere 75 \mug) y GDP 1 \muM (esta cantidad puede cambiarse para optimizar) durante 1 hora. Después se añadieron perlas de aglutinina de germen de trigo (25 \mul; Amersham) y la mezcla se incubó durante otros 30 minutos a temperatura ambiente. Después los tubos se centrifugaron a 1500 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente y después se contaron en un escintilómetro.
Una alternativa menos costosa pero igualmente aplicable ha sido identificada que también cubre las necesidades de la selección a gran escala. Pueden utilizarse Flashplates^{TM} y tiras de centelleo Wallac^{TM} para conformar un análisis de unión de [^{35}S]GTP\gammaS de alto rendimiento. Además, usando esta técnica, puede utilizarse el análisis para GPCR conocidos para controlar simultáneamente la unión de ligandos tritiados al receptor al mismo tiempo que se controla la eficacia mediante la unión de [^{35}S]GTP\gammaS. Esto es posible porque el contador Wallac beta puede cambiar las ventanas de energía para observar tanto las sondas marcadas con tritio como con ^{35}S. Este análisis, también puede usarse para detectar otros tipos de eventos de activación de la membrana que producen la activación de receptores. Por ejemplo, el análisis puede usarse para controlar la fosforilación con ^{32}P de una variedad de receptores (tanto receptores acoplados a proteínas G como de tirosina-quinasa). Cuando las membranas se sedimentan por centrifugación al fondo del pocillo el [^{35}S]GTP\gammaS unido o el receptor fosforilado con ^{32}P activarán el centelleante que recubre los pocillos. Se han usado tiras Scinti® (Wallac) para demostrar este principio. Además, el análisis también tiene utilidad para la medición de la unión de ligandos a los receptores usando ligandos marcados radioactivemente. De forma similar, cuando el ligando unido radiomarcado se sedimenta por centrifugado al fondo del pocillo, la marca de la tira de centelleo se acerca al ligando radiomarcado produciendo la activación y detección.
En la Figura 6, se exponen resultados representativos de gráficas que comparan control (pCMV), APJ endógeno y APJ no endógeno, basados en el protocolo anterior.
2. Adeninilciclasa
Se modificó un kit Flash Plate^{TM} Adenylyl Cyclasa (New England Nuclear; No. de Cat. SMP004A) diseñado para análisis con base celular para usar con membranas citoplasmáticas brutas. Los pocillos de la Flash Plate contienen un recubrimiento centelleante que también contiene un anticuerpo específico que reconoce AMPc.
El AMPc generado en los pocillos se cuantificó mediante una competición directa por la unión del marcador AMPc radioactivo al anticuerpo contra AMPc. Lo siguiente sirve como breve protocolo para la medición de cambios de los niveles de AMPc en membranas que expresan los receptores.
Las células transfectadas se recogieron aproximadamente tres días después de la transfección. Las membranas se prepararon homogeneizando células suspendidas en tampón que contenía HEPES 20 mM, a pH 7,4 y MgCl_{2} 10 mM. La homogenización se realizó sobre hielo usando un Brinkman Polytron^{TM} durante aproximadamente 10 segundos. EL homogeneizado resultante se centrifugó a 49.000 X g durante 15 minutos a 4ºC. El sedimento resultante después se resuspendió en tampón que contenía HEPES 20 mM, a pH 7,4 y EDTA 0,1 mM, se homogeneizó durante 10 segundos, seguido de centrifugación a 49.000 X g durante 15 minutos a 4ºC. El sedimento resultante se almacenó a -80ºC hasta su utilización. El día de la medición, el sedimento de membranas se descongeló lentamente a temperatura ambiente, se resuspendió en tampón que contenía HEPES 20 mM, a pH 7,4 y MgCl_{2} 10 mM (estas cantidades pueden optimizarse, aunque se prefieren los valores que se recogen en el presente documento), proporcionando una concentración final de proteína de 0,60 mg/ml (las membranas resuspendidas se introdujeron en hielo hasta su uso).
Los patrones de AMPc y el Tampón de detección (que comprende 2 \muCi de marcador [^{125}IAMPc (100 \mul)] en 11 ml de Tampón de detección) se prepararon y conservaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El Tampón de análisis que se preparó reciente para la selección y contenía HEPES 20 mM, a pH 7,4, MgCl_{2} 10 mM, 20 mM (Sigma), 0,1 unidades/ml de creatina fosfoquinasa (Sigma), GTP 50 \muM (Sigma), y ATP 0,2 mM (Sigma); el Tampón de análisis puede almacenarse en hielo hasta su utilización. El análisis se inició mediante la adición de 50 \mul de tampón de análisis seguido de la adición de 50 \mul de suspensión de membranas a la NEN Flash Plate. La mezcla de análisis resultante se incubó durante 60 minutos a temperatura ambiente seguido de la adición de 100 \mul de tampón de detección. Después las placas se incubaron 2-4 horas más seguido de conteo en un escintilómetro Wallac MicroBeta. Los valores de AMPc/pocillo se extrapolan a partir de una curva de patrones de AMPc contenida en cada placa de análisis. El análisis anterior se utilizó con respecto al análisis de MIG.
B. Análisis basados en testigos 1. Análisis de testigos con CREB (receptores asociados a Gs)
Un procedimiento para detectar la estimulación por Gs depende de la conocida propiedad del factor de transcripción CREB, que se activa de forma dependiente de AMPc. Se utilizó un PathDetect CREB trans-Reporting System (Stratagene, n.º de catálogo 219010) para analizar la actividad acoplada a Gs en células 293 o 293T. Las células se transfectaron con los componentes plasmídicos de este sistema anterior y el plásmido de expresión indicado que codifica receptor endógeno o mutante usando a un Mammalian Transfection Kit (Stratagene, n.º de catálogo 200285) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Resumiendo, se combinaron 400 ng de pFR - Luc (plásmido testigo de Iuciferasa que contenía secuencias de reconocimiento de Gal4), 40 ng de pFA2-CREB (proteína de fusión de Gal4-CREB que contenía el dominio de unión y ADN de Gal4), 80 ng de plásmido de expresión del receptor y CMV (que comprende el receptor) y 20 ng de CMV-SEAP (plásmido de expresión de fosfatasa alcalina segregada); la actividad de la fosfatasa alcalina se mide el medio de las células transfectadas para controlar las variaciones en la eficiencia de transfección entre muestras diferentes) en un precipitado de fosfato cálcico según las instrucciones del kit. La mitad del precipitado se distribuyó equitativamente en 3 pocillos en una placa de 96 pocillos, las células se mantuvieron toda la noche, y se sustituyó el medio por medio reciente a la mañana siguiente. Cuarenta y ocho (48) horas después del inicio de la transfección, se trataron las células y se analizaron para determinar la actividad de la luciferasa tal como se describe con respecto al sistema GPR30 anteriormente. Este análisis se usó con respecto a GHSR.
2. Análisis de testigo de AP1 (receptores asociados a Gq)
Un procedimiento para detectar la estimulación por Gq depende de la conocida propiedad de la fosfolipasa C dependiente de Gq de provocar la activación de genes que contienen elementos AP1 en su promotor. Se utilizó un Pathdetect AP-1 cis-Reporting System (Stratagene n.º de catálogo 219073) siguiendo el protocolo descrito anteriormente con respecto al análisis de testigo con CREB, con la excepción de que los componentes del precipitado de fosfato cálcico eran 410 ng de pAPI-Luc, 80 ng de plásmido de expresión del receptor y 20 ng de CMV-SEAP. Este análisis se usó con respecto a ETBR-LP2.
C. Análisis de acumulación de IP3 intracelular
El día 1, se plaquearon células que comprendían los receptores de serotonina (endógenos y mutados) en placas de 24 pocillos, usualmente a 1 x 10^{5} células/pocillo. El día 2, las células se transfectaron primero mezclando 0,25 ng de ADN con 50 \mul de DMEM sin suero/pocillo y 2 \mul de lipofectamina en 50 \mul de DMEM sin suero/pocillo. Las soluciones se mezclaron suavemente y se incubaron durante 15-30 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron con 0,5 ml de PBS y 400 \mul de medio sin suero con el medio de transfección y se añadió a las células. Las células después se incubaron durante 3-4 horas a 37ºC/CO_{2} al 5% y después se eliminó el medio de transfección y se sustituyó por 1 ml/pocillo de medio de crecimiento normal. El día 3, las células se marcaron con ^{3}H-mioinositol. Resumiendo, el medio se eliminó, las células se lavaron con 0,5 ml de PBS. Después se añadió 0,5 ml de medio sin inositol y sin suero (GIBCO BRL)/pocillo con 0,25 \muCi de ^{3}H-mioinositol/pocillo y las células se incubaron durante 16-18 horas a 37ºC/CO_{2} al 5%. El día 4, las células se lavaron con 0,5 ml de PBS y se añadieron 0,45 ml de medio de análisis que contenía medio sin inositol y sin suero, pargilina 10 \muM, cloruro de litio 10 mM o 0,4 ml de medio de análisis y 50 \mul de 10 x quetanserina (ket) a una concentración final de 10 \muM. Después las células se incubaron durante 30 minutos a 37ºC. Después, las células se lavaron con 0,5 ml de PBS y se añadieron 200 \mul de solución de terminación reciente y helada (KOH 1 M; borato sódico 18 mM; EDTA 3,8 mM) por pocillo. La solución se conservó en hielo durante 5-10 minutos o hasta que se lisaron las células y después se neutralizó con 200 \mul de solución de neutralización reciente y helada (HCl al 7,5%). El lisado después se transfirió a tubos eppendorf de 1,5 ml y se añadió 1 ml de cloroformo/metanol (1:2)/tubo. La solución se agitó en un vórtice durante 15 segundos y la fase superior se aplicó a una resina de intercambio de aniones Biorad AG1-X8 (100-200 mesh). Primeramente, la resina se lavó con agua a 1:1,25 p/v y se cargaron 0,9 ml de la fase superior en la columna. La columna se lavó con 10 ml de mioinositol 5 mM y 10 ml de borato sódico 5 mM y formiato sódico 60 nM. Los inositol tris fosfatos se eluyeron en viales de centelleo que contenían 10 ml de cóctel de centelleo con 2 ml de ácido fórmico 0,1 M y formiato amónico 1 M. Las columnas se regeneraron lavando con 10 ml de ácido fórmico 0,1 M y formiato amónico 3 M y se enjuagaron dos veces con H_{2}O deuterada y se almacenaron a 4ºC en agua.
La Figura 7 proporciona una ilustración de la producción de IP3 a partir del receptor humano 5-HT_{2A} que incorpora la mutación C322K. Aunque estos resultados indican que la estrategia del Algoritmo de mutación de prolina activa este receptor de forma constitutiva, con el fin de usar tal receptor para seleccionar para la identificación de sustancias terapéuticas potenciales, se preferiría una diferencia más sólida. Sin embargo, dado que el receptor activado puede utilizarse para comprender y elucidar el papel de la activación constitutiva y para la identificación de compuestos que pueden examinarse posteriormente, los presentes inventores creen que esta diferencia es útil en sí para diferenciar entre las versiones endógenas y no endógenas del receptor 5HT_{2A} humano.
D. Resumen de los resultados
Los resultados para los GPCR analizados se describen en la Tabla E, en la que el Aumento porcentual indica la diferencia porcentual entre los resultados observados para el GPCR no endógeno comparado con el GPRC endógeno; estos valores van seguidos de indicaciones entre paréntesis relativas al tipo de análisis utilizado. Además, el sistema de análisis que se utiliza se refleja entre paréntesis (y, en los casos en los que se usaron células hospedadoras diferentes, se reflejan ambas). Tal como indican estos resultados, pueden utilizarse una variedad de análisis para determinar la actividad constitutiva de las versiones no endógenas de los GPCR humanos. Los expertos en la técnica, basándose en lo anterior y refiriéndose a la información disponible en la técnica, se cree que tendrán la capacidad de seleccionar y/o maximizar una estrategia de análisis particular que sea adecuada a las necesidades particulares del investigador.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA E
Identificador del receptor (Mutación del Codón) Diferencia porcentual
GPR17 74,5
(V234K) (CRE-Luc)
GPR30 71,6
(L258K) (CREB)
APJ 49,0
(L247K) (GTPyS)
ETBR-LP2 48,4 (AP1-Luc - 293)
(N358K) 61,1 (AP1-Luc - 293T)
GHSR 58,9 (CREB - 293)
(V262K) 35,6 (CREB - 293T)
MIG 39 (AMPc)
(I230K)
TABLA E (continuación)
Identificador del receptor (Mutación del Codón) Diferencia porcentual
Serotonina 5HT_{2A} 33,2 (IP_{3})
(C322K)
Serotonina 5HT_{2c} 39,1(IP_{3})
(S310K)
Ejemplo 6 Distribución tisular de GPCR huérfanos endógenos
Usando un formato de transferencia en puntos de tejido humano disponible comercialmente, GPCR huérfanos endógenos se sometieron a sondas para determinar las áreas en las que se localizan dichos receptores. Excepto donde se indique más adelante, se usó el ADNc completo del receptor (radiomarcado) como sonda: la sonda radiomarcada se generó usando el ADNc completo del receptor (escindido del vector) usando un Prime-It II^{TM} Random Primer Labeling Kit (Stratagene, n.º 300385), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se hibridó un ARN humano Master Blot^{TM} (Clontech, n.º 7770-1) con la sonda radiomarcada de GPCR y se lavó en condiciones astringentes de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La transferencia se expuso a película Kodak BioMax Autoradiography a 80ºC.
Los resultados representativos del formato de transferencia en puntos se presentan en la Figura 8 para GPR1. (8A), GPR30 (8B), y APJ (8C), resumiéndose los resultados para todos los receptores en la Tabla F.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA F
GPCR Distribución tisular (niveles mas elevados, comparados con otros
tejidos en la transferencia por puntos)
GPR1 Placenta, ovario, suprarrenal
GPR4 Amplia; más elevados en corazón, pulmón, suprarrenal,
tiroides, médula espinal
GPR5 Placenta, timo, timo fetal
Niveles menores en bazo, bazo fetal
GPR7 Hígado, bazo, médula espinal, placenta
GPR8 No se detecta expresión
GPR9-6 Timo, timo fetal
Niveles menores en intestino delgado
GPR18 Bazo, nódulo linfático, bazo fetal, testículo
GPR20 Amplia
GPR21 Amplia, abundancia muy baja
GPR22 Corazón, corazón fetal
Niveles menores en cerebro
GPR30 Estómago
GPR31 Amplia
BLR1 Bazo
TABLA F (continuación)
GPCR Distribución tisular (niveles mas elevados, comparados
con otros tejidos en la transferencia por puntos)
CEPR Estómago, hígado, tiroides, putamen
EBI1 Páncreas
Niveles menores en tejidos linfoides
EBI2 Tejidos linfoides, aorta, pulmón, médula espinal
ETBR-LP2 Amplia; tejido cerebral
GPCR-CNS Cerebro
Niveles menores en testículos, placenta
GPR-NGA Pituitaria
Niveles menores en cerebro
H9 Pituitaria
HB954 Aorta, cerebelo
Niveles menores en la mayoría de los
otros tejidos
HM74 Bazo, leucocitos, médula espinal,
glándulas mamarias, pulmón, tráquea
MIG Niveles bajos en riñón, hígado,
páncreas, pulmón, bazo
ORG1 Pituitaria, estómago, placenta
V28 Cerebro, bazo, leucocitos periféricos
Basándose en la información anterior, se observa que también puede evaluarse la distribución de los GPCR humanos en tejido enfermo; después pueden utilizarse las evaluaciones comparativas entre tejido "normal" y "enfermo" para determinar el potencial de expresión excesiva o expresión insuficiente de un receptor particular en un estado de enfermedad. En aquellas circunstancias en las que sea deseable utilizar las versiones no endógenas de los GPCR humanos con el fin de seleccionar para identificar directamente compuestos candidatos de potencial relevancia terapéutica, se observa que los agonistas inversos son útiles en el tratamiento de enfermedades y trastornos en los que un GPCR humano particular está expresado excesivamente, mientras que los agonistas o agonistas parciales son útiles en el tratamiento de enfermedades y trastornos en los que un GPCR humano particular está expresado insuficientemente.
Según se desee, puede utilizarse una localización celular más detallada de los receptores, usando técnicas notorias para los expertos en la técnica (por ejemplo, hibridación in situ) para identificar células particulares dentro de estos tejidos en los que se expresa en receptor de interés.
Tal como apreciarán los expertos en la técnica, pueden realizarse numerosos cambios y modificaciones en las realizaciones preferidas de la invención sin desviarse del alcance de las reivindicaciones.
Aunque existen una variedad de vectores de expresión disponibles para los expertos en la técnica, con el fin de utilizar tanto los GPCR humanos endógenos, como no endógenos, lo más preferido es que el vector utilizado sea pCMV.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\hskip1,5cm Behan, Dominic P.
\hskip1,5cm Chalmers, Derek. T.
\hskip1,5cm Liaw, Chen W.
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Receptores huérfanos acoplados a Proteínas G humanos activados de forma constitutiva, no endógenos
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 280
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN POSTAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: Arena Pharmaceuticals, Inc.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 6166 Nancy Ridge Drive
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: San Diego
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: CA
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: EE. UU.
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 92122
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA DE LECTURA INFORMATIZADA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE SOPORTE: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release n.º 1.0, Versión 1.30
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: US
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Burgoon, Richard P.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 34.787
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: (619) 453-7200
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: (619) 453-7210
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1068 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
5 
\vskip1.000000\baselineskip
(3) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 355 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: irrelevante
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 2:
6
7 
\vskip1.000000\baselineskip
(4) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1089 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
8 
\vskip1.000000\baselineskip
(5) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 362 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: irrelevante
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 4:
9
10 
\vskip1.000000\baselineskip
(6) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TATGAATTCA GATGCTCTAA ACGTCCCTGC 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(7) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCCGGTCCA CCTGCACCTG CGCCTGCACC 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(8) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1002 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
13 
\vskip1.000000\baselineskip
(9) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 333 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: irrelevante
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 8:
14 
\newpage
15 
\vskip1.000000\baselineskip
(10) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCAAGCTTGG GGGACGCCAG GTCGCCGGCT 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(11) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCGGATCCGG ACGCTGGGGG AGTCAGGCTG C 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
(12) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 987 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 11:
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(13) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 328 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: irrelevante
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 12:
19
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(14) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGGGAATTCGT CAACGGTCCC AGCTACAATG 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(15) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATGGATCCCA GGCCCTTCAG CACCGCAATA T 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
(16) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1002 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(17) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 333 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: irrelevante
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 16:
24
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(18) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 48 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACGAATTCAG CCATGGTCCT TGAGGTGAGT GACCACCAAG TGCTAAAT 
\hfill
48 
\vskip1.000000\baselineskip
(19) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAGGATCCTG GAATGCGGGG AAGTCAG 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
(20) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1107 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(21) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 368 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: irrelevante
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 20:
29
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(22) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTAAGCTTGA CCTAATGCCA TCTTGTGTCC 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(23) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTGGATCCAA AAGAACCATG CACCTCAGAG 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(24) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1074 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(25) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 357 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: irrelevante
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 24:
34
35 
\vskip1.000000\baselineskip
(26) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1110 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
36 
\vskip1.000000\baselineskip
(27) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 369 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: irrelevante
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 26:
37
38 
\vskip1.000000\baselineskip
(28) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1083 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
39
40 
\vskip1.000000\baselineskip
(29) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 360 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: irrelevante
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
41
42 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(30) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTAGAATTCT GACTCCAGCC AAAGCATGAA T 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
(31) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCTGGATCCT AAACAGTCTG CGCTCGGCCT 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(32) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1020 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
46 
\vskip1.000000\baselineskip
(33) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 32:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 339 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: irrelevante
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 32:
47
48 
\vskip1.000000\baselineskip
(34) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 33:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATAAGATGAT CACCCTGAAC AATCAAGAT 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(35) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 34:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCCGAATTCA TAACATTTCA CTGTTTATAT TGC 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(36) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 35:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 996 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 35:
51 
\vskip1.000000\baselineskip
(37) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 36:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 331 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: irrelevante
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 36:
52
53 
\vskip1.000000\baselineskip
(38) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 37:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 37:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCAAGCTTCC AGGCCTGGGG TGTGCTGG 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(39) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 38:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 38:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATGGATCCTG ACCTTCGGCC CCTGGCAGA 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(40) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 39:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1077 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 39:
56 
\vskip1.000000\baselineskip
(41) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 40:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 358 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: irrelevante
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 40:
57
58 
\vskip1.000000\baselineskip
(42) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 41:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 41:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAGAATTCAC TCCTGAGCTC AAGATGAACT 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(43) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 42:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 42:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGGGATCCCC GTAACTGAGC CACTTCAGAT 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(44) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 43:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1050 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 43:
\vskip1.000000\baselineskip
61 
\vskip1.000000\baselineskip
(45) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 44:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 349 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: irrelevante
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 44:
62
63 
\vskip1.000000\baselineskip
(46) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 45:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 45:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCCCCCGGGA AAAAAAACCAA CTGCTCCAAA 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(47) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 46:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 46:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAGGATCCAT TTGAATGTGG ATTTGGTGAA A 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
(48) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 47:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1302 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 47:
66 
\vskip1.000000\baselineskip
(49) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 48:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 433 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: irrelevante
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 48:
67
68 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(50) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 49:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 49:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTGAAGCTTG CCTCTGGTGC CTGCAGGAGG 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(51) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 50:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 50:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCAGAATTCC CGGTGGCGTG TTGTGGTGCC C 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
(52) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 51:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1209 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 51:
\vskip1.000000\baselineskip
71 
\vskip1.000000\baselineskip
(53) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 52:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 402 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: irrelevante
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 52:
\vskip1.000000\baselineskip
72
73 
\vskip1.000000\baselineskip
(54) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 53:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 53:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGCGGATCCA TGGATGTGAC TTCCCAA 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
(55) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 54:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 54:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGCGGATCCC TACACGGCAC TGCTGAA 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
(56) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 55:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1128 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 55:
\vskip1.000000\baselineskip
76 
\vskip1.000000\baselineskip
(57) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 56:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 375 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: irrelevante
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 56:
77
78 
\vskip1.000000\baselineskip
(58) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 57:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 57:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAGGAATTCA CGGCCGGGTG ATGCCATTCC C 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
(59) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 58:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 58:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGTGGATCCA TAAACACGGG CGTTGAGGAC 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(60) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 59:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 960 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 59:
81 
\vskip1.000000\baselineskip
(61) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 60:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 319 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 60:
82
83 
\vskip1.000000\baselineskip
(62) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 61:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1143 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 61:
\vskip1.000000\baselineskip
84
85 
\vskip1.000000\baselineskip
(63) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 62:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 380 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: irrelevante
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 62:
86
87 
\vskip1.000000\baselineskip
(64) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 63:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 63:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGAGAATTCT GGTGACTCAC AGCCGGCACA G 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
(65) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 64:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 64:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCCGGATCCA AGGAAAAGCA GCAATAAAAG G 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
(66) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 65:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1119 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 65:
\vskip1.000000\baselineskip
90
91 
\vskip1.000000\baselineskip
(67) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 66:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 372 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: irrelevante
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 66:
92
93
94 
\vskip1.000000\baselineskip
(68) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 67:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 67:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAAAGCTTGA AAGCTGCACG GTGCAGAGAC 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(69) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 68:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 68:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCGGATCCCG AGTCACACCC TGGCTGGGCC 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(70) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 69:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1128 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 69:
\vskip1.000000\baselineskip
97 
\vskip1.000000\baselineskip
(71) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 70:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 375 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 70:
98
99 
\vskip1.000000\baselineskip
(72) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 71:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 71:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACAGAATTCC TGTGTGGTTT TACCGCCCAG 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(73) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 72:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 72:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTCGGATCCA GGCAGAAGAG TCGCCTATGG 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(74) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 73:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1137 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 73:
\vskip1.000000\baselineskip
102 
\vskip1.000000\baselineskip
(75) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 74:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 378 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: irrelevante
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 74:
103
104 
\vskip1.000000\baselineskip
(76) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 75:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 75:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTGGAATTCA CCTGGACCAC CACCAATGGA TA 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
(77) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 76:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 76:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTCGGATCCT GCAAAGTTTG TCATACAGTT 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(78) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 77:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1085 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 77:
\vskip1.000000\baselineskip
107 
\vskip1.000000\baselineskip
(79) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 78:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 361 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: irrelevante
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 78:
108
109 
\vskip1.000000\baselineskip
(80) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 79:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 79:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTGGAATTCT CCTGCTCATC CAGCCATGCA C 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
(81) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 80:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 80:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCTGGATCCC CACCCCTACT GGGGCCTCAG 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(82) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 81:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1446 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 81:
\vskip1.000000\baselineskip
112
113 
\vskip1.000000\baselineskip
(83) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 82:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 481 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: irrelevante
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 82:
\vskip1.000000\baselineskip
114
115
116 
\vskip1.000000\baselineskip
(84) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 83:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 83:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATGTGGAACG CGACGCCCAG CG 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(85) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 84:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 84:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCATGTATTA ATACTAGATT CT 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(86) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 85:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 85:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TACCATGTGG AACGCGACGG CCAGCGAAGA GCCGGGGT 
\hfill
38 
\vskip1.000000\baselineskip
(87) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 86:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 86:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGGAATTCAT GTATTAATAC TAGATTCTGT CCAGGCCCG 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
(88) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 87:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1101 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 87:
\vskip1.000000\baselineskip
121
122 
\vskip1.000000\baselineskip
(89) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 88:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 366 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: irrelevante
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 88:
\vskip1.000000\baselineskip
123
124
125 
\vskip1.000000\baselineskip
(90) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 89:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 89:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCAAGCTTGT GCCCTCACCA AGCCATGCGA GCC 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(91) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 90:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 90:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGGAATTCAG CAATGAGTTC CGACAGAAGC 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(92) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 91:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1842 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 91:
\vskip1.000000\baselineskip
128
129 
\vskip1.000000\baselineskip
(93) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 92:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 613 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: irrelevante
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 92:
\vskip1.000000\baselineskip
130
131
132 
\vskip1.000000\baselineskip
(94) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 93:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 93:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGAATTCAG AGAAAAAAAG TGAATATGGT TTTT 
\hfill
34 
\vskip1.000000\baselineskip
(95) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 94:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 94:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTGGATCCCT GGTGCATAAC AATTGAAAGA AT 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
(96) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 95:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1248 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 95:
\vskip1.000000\baselineskip
135 
\vskip1.000000\baselineskip
(97) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 96:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 415 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: irrelevante
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 96:
\vskip1.000000\baselineskip
136
137 
\vskip1.000000\baselineskip
(98) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 97:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 97:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGAAAAGCTTA ACGATCCCCA GGAGCAACAT 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(99) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 98:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 98:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTGGGATCCT ACGAGAGCAT TTTTCACACA G 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
(100) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 99:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1842 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 99:
140
141 
\vskip1.000000\baselineskip
(101) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 100:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 613 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: irrelevante
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 100:
\vskip1.000000\baselineskip
142
143
144 
\vskip1.000000\baselineskip
(102) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 101:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 101:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCCAAGCTTC GCCATGGGAC ATAACGGGAG CT 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
(103) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 102:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 102:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGTGAATTCC AAGAATTTAC AATCCTTGCT 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(104) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 103:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1548 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 103:
\vskip1.000000\baselineskip
147 
\vskip1.000000\baselineskip
(105) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. Nº: 104:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 515 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: irrelevante
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 104:
148
149

Claims (17)

1. Un procedimiento para crear una versión activa de forma constitutiva, no endógena, de un receptor acoplado a proteína G humano endógeno (GPCR), comprendiendo dicho GPCR endógeno una región transmembrana 6 y una región de bucle intracelular 3, comprendiendo el procedimiento:
(a) seleccionar un GPCR humano endógeno que comprende un residuo de prolina en la región transmembrana 6;
(b) identificar el residuo aminoacídico n.º 16 endógeno a partir del residuo de prolina de la etapa (a), en dirección desde el extremo carboxi al extremo amino;
(c) alterar el residuo aminoacídico identificado de la etapa (b) a un residuo aminoacídico no endógeno creando una versión no endógena del GPCR humano endógeno; y
(d) determinar si la versión no endógena del GPCR humano endógeno de la etapa (c) está activa de forma constitutiva midiendo una diferencia en una señal intracelular medida para la versión no endógena comparada con una señal inducida por el GPCR endógeno.
2. Un procedimiento para identificar directamente un compuesto que se selecciona del grupo constituido por agonista inverso, agonista y agonista parcial de un receptor acoplado a proteína G humano, activado de forma constitutiva, no endógeno, comprendiendo dicho receptor una región transmembrana 6 y una región de bucle intracelular 3, comprendiendo el procedimiento las etapas (a) a (d) de la reivindicación 1 y comprendiendo además las etapas:
(e) poner en contacto un compuesto candidato con un GPCR activo de forma constitutiva, no endógeno identificado en la etapa (d); y
(f) determinar, midiendo la eficacia del compuesto en dicho receptor con el que se pone en contacto, si dicho compuesto es un agonista inverso, agonista o agonista parcial de dicho receptor.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el residuo aminoacídico que está a dos residuos de dicho residuo de prolina en la región transmembrana 6, en dirección desde el extremo carboxi al extremo amino, es triptófano.
4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el residuo aminoacídico n.º 16 endógeno a partir de dicho residuo de prolina en dirección desde el extremo carboxi al extremo amino ha sido alterado a un residuo de lisina.
5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el residuo aminoacídico n.º 16 endógeno a partir de dicho residuo de prolina en dirección desde el extremo carboxi al extremo amino ha sido alterado a un residuo de alanina.
6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el residuo aminoacídico n.º 16 endógeno a partir de dicho residuo de prolina en dirección desde el extremo carboxi al extremo amino ha sido alterado a un residuo de arginina
7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el residuo aminoacídico n.º 16 endógeno a partir de dicho residuo de prolina en dirección desde el extremo carboxi al extremo amino ha sido alterado a un residuo de histidina.
8. Un procedimiento para crear una versión activa de forma constitutiva, no endógena de un receptor acoplado a proteína G humano endógeno (GPCR), comprendiendo dicho GPCR endógeno una región transmembrana 6 y una región de bucle intracelular 3, comprendiendo el procedimiento:
(a) proporcionar un polinucleótido, codificando dicho polinucleótido un GPCR humano endógeno, comprendiendo dicho GPCR endógeno una región transmembrana 6 y una región de bucle intracelular 3, comprendiendo dicha región transmembrana 6 un residuo de prolina;
(b) identificar el codón de dicho polinucleótido que corresponde al residuo aminoacídico n.º 16 endógeno a partir de dicho residuo de prolina de dicho GPCR de la etapa (a), en dirección desde el extremo carboxi al extremo amino;
(c) alterar dicho codón identificado de la etapa (b) para que codifique un residuo aminoacídico no endógeno, proporcionando un polinucleótido no endógeno;
(d) expresar dicho polinucleótido no endógeno en una célula hospedadora, proporcionando así una versión no endógena del GPCR humano no endógeno; y
\newpage
(e) determinar si la versión no endógena del GPCR humano endógeno de la etapa (d) es activa de forma constitutiva midiendo una diferencia en una señal intracelular medida para la versión no endógena comparada con una señal inducida por el GPCR endógeno.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que el residuo aminoacídico que está a dos residuos de dicho residuo de prolina en la región transmembrana 6, en dirección desde el extremo carboxi al extremo amino, es triptófano.
10. El procedimiento de la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en el que dicho codón identificado de la etapa (b) ha sido alterado para que sea un codón que codifica lisina.
11. El procedimiento de la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en el que dicho codón identificado de la etapa (b) ha sido alterado para que sea un codón que codifica alanina.
12. El procedimiento de la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en el que dicho codón identificado de la etapa (b) ha sido alterado para que sea un codón que codifica arginina.
13. El procedimiento de la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en el que dicho codón identificado de la etapa (b) ha sido alterado para que sea un codón que codifica histidina.
14. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el compuesto identificado directamente es un agonista inverso.
15. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el compuesto identificado directamente es un agonista.
16. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el compuesto identificado directamente es un agonista parcial.
17. El procedimiento de la reivindicación 2, que además comprende la etapa (g) de formular el compuesto en una composición farmacéutica.
ES99951991T 1998-10-13 1999-10-12 Receptores acoplados a proteinas g humanos, activados de forma constitutiva, no endogenos. Expired - Lifetime ES2163384T3 (es)

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