JP5804341B2 - エストロゲン関連疾患の判定方法 - Google Patents
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Landscapes
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Description
本発明は、膜結合型女性ホルモン受容体ＧＰＲ３０（G-protein coupled receptor 30）遺伝子のＯＲＦに存在する少なくとも１種の一塩基多型を解析するエストロゲン関連疾患の判定方法や、ＧＰＲ３０を標的としたエストロゲン関連疾患の治療薬のスクリーニング方法等に関する。
ある集団で１％以上の遺伝子の変異が観察されるものを多型といい、特に一塩基だけが変異したものを一塩基多型（ＳＮＰ；single nucleotide polymorphism）と呼ぶ。これまでに、ヒトゲノムには１億４千２百万のＳＮＰが同定され、１．９キロ塩基ごとに１つの頻度でＳＮＰが存在すること、そして、そのうち６万個のＳＮＰがエキソン（コーディング領域と非翻訳領域）に存在していることなどが明らかになっているが（非特許文献１）、各ＳＮＰの詳細な機能についてはほとんど明らかになっていない。
タンパク質のコーディング領域（ＯＲＦ；オープンリーディングフレーム）におけるミスセンスＳＮＰは、タンパク質におけるアミノ酸配列の変更を伴い、その機能に影響を与える可能性がある。タンパク質の機能に関与するＳＮＰは、個人の体質、薬剤に対する応答、疾患の発症や悪化等に関連している可能性高いことから、重要であるといわれている。特に疾患と関連のあるＳＮＰは臨床分野での疾患の診断や薬剤の使い分けのマーカーとして有用であり、オーダーメイド医療の実現化につながると期待されている。
女性ホルモンの一種であるエストロゲン（Ｅ２）は多彩な生理作用を有しており、エストロゲンによる調節は内分泌系、生殖器、骨組織、血管系で重要な役割を担っている。そして、その異常は異常骨吸収、心血管疾患、中枢神経系傷害及びがんなど種々の疾患の発生や進行に関与すると考えられている。エストロゲンによる調節を受ける細胞には、エストロゲンを認識する受容体タンパク質が存在し、そのシグナルを伝達していると考えられている。そのため、エストロゲン受容体の同定とその機能や制御メカニズムについて明らかにすることは、これらの疾患を治療・予防において、極めて重要である。
エストロゲン受容体として、細胞内に存在するＤＮＡ結合型の核内受容体ＥＲ（Estrogen Receptor）が同定され、多くの研究がなされている。そして、ＥＲ結合性のタモキシフェンやラロキシフェンは、選択的エストロゲン受容体調節薬として、様々なエストロゲンに関連する疾患の治療薬として現在広く用いられている。
その一方で、エストロゲンは血管の弛緩作用や細胞内Ｃａ２＋の流入など、転写が関与しない急性期の反応を引き起こすことも知られており、細胞膜上にもエストロゲン受容体が存在することが示唆されていた。その実体は長らく明らかではなかったが、オーファン受容体であったＧＰＲ３０（G-protein coupled receptor 30）が、エストロゲンの細胞膜受容体として同定され（非特許文献２、３）、子宮筋腫や乳がんなどエストロゲン関連疾患との関連が注目されている。細胞膜上のエストロゲン受容体を標的とした治療薬は、従来の核内エストロゲン受容体ＥＲをターゲットとした治療薬に対し、難治性を示すタイプの患者に有効であることが期待できる。さらに、細胞膜型エストロゲン受容体をターゲットとする薬剤は、必ずしも細胞内や核内に侵入する必要がないため、副作用の低い治療薬開発も期待できる。
ヒトＧＰＲ３０は、１１２８塩基、３７５アミノ酸からなる、推定分子量が約４１ｋＤａの７回膜貫通型Ｇタンパク質共役型受容体のひとつである。本発明者らはＧＰＲ３０を特異的に認識する抗体を開発し、ラット脳組織の内在性ＧＰＲ３０及びＨｅＬａ細胞に過剰発現させたＦＬＡＧ−ＧＰＲ３０が細胞膜上に局在すること、ＨｅＬａ細胞に発現させたＦＬＡＧ−ＧＰＲ３０がエストロゲン応答性を有し、エストロゲン依存的に細胞内カルシウム濃度の上昇を引き起こすことや、エストロゲン依存的に細胞内へ取り込まれることを明らかにしている（特許文献１、非特許文献４、５）。核内受容体ＥＲには結合せず、ＧＰＲ３０に結合する特異的アゴニストＧ−１（1- (4- (6-Bromobenzo [1,3] dioxol-5-yl) -3a, 4, 5, 9b-tetrahydro-3H-cyclopenta [c] quinolin-8-yl) -ethanone）の発見（非特許文献６）や、ＧＰＲ３０ノックアウト動物を用いた解析（非特許文献７〜１０）により、ＧＰＲ３０の生物学的機能の解析が進み、免疫系や循環系、血糖調節における機能が明らかになりつつある。しかしながら、ＧＰＲ３０の生殖器における発現や機能、エストロゲン関連疾患との関連は明らかではない。
非特許文献７〜１０のＧＰＲ３０ノックアウトマウスにエストロゲン関連疾患の表現型が見られないことから、未知の変異によるＧＰＲ３０の機能の異常がエストロゲン関連疾患の病態に関連している可能性が考えられる。その一方で、本発明者らが別途作製したＧＰＲ３０ノックアウトマウスは早期の胎生致死であるという異なる結果も得られている。この理由については明らかではないが、いずれにしてもＧＰＲ３０とエストロゲン関連疾患との関連を明らかにするためには、ノックアウトマウス以外を用いた解析、例えば未知の変異によるＧＰＲ３０の機能の異常に着目した解析が重要だと考えられる。
また、胃癌の組織及び細胞特異的に、ＧＰＲ３０の３’非翻訳領域における２塩基の欠失が検出され、胃癌との関連が示唆されている（非特許文献１１）。この３’非翻訳領域における変異により、ＧＰＲ３０の３’非翻訳領域に存在するalternative splicing form、ＬＥＲＧＵ（Leucine Rich Protein in ＧＰＲ３０ ３’ＵＴＲ）にフレームシフトが起こり、変異ＬＥＲＧＵが胃癌の進展に関与している可能性が推測されているが、ＧＰＲ３０の発現や機能への影響、エストロゲンシグナルとの関連は全く明らかではない。
ＮＣＢＩが提供するＳＮＰデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP）を利用した検索では、ＧＰＲ３０のＯＲＦにおいて９個のＳＮＰが存在することが確認できる。しかし、これらのＳＮＰによるＧＰＲ３０の機能への影響や、疾患との関連は全く明らかではなく、ＧＰＲ３０のＯＲＦにおけるＳＮＰと疾患との関係の有無等を明らかにするためには、疾患患者の組織の解析及びその結果の健常者組織の解析結果との比較が必要であった。
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本発明の課題は、エストロゲン関連疾患組織に存在するＧＰＲ３０の遺伝子多型を同定して、かかる遺伝子多型をもつＧＰＲ３０の機能を明らかにすることにより、エストロゲン関連疾患の判定方法やエストロゲン関連疾患の治療薬のスクリーニング方法を提供することにある。
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、エストロゲン関連疾患患者のＧＰＲ３０遺伝子のＯＲＦに存在するＳＮＰを同定し、かかるＳＮＰをもつＧＰＲ３０が野生型ＧＰＲ３０のもつアポトーシス誘導機能を損なっていることを見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は〔１〕ヒトＧＰＲ３０遺伝子のＯＲＦに存在する一塩基多型を検出することを含むことを特徴とする子宮筋腫の判定を補助する方法であって、一塩基多型が、配列番号１に示される塩基配列の１４番目の塩基がシトシンではなくチミンである一塩基多型である方法からなる。
さらに、本発明は、〔２〕ヒトＧＰＲ３０遺伝子のＯＲＦに存在し、配列番号１に示される塩基配列の１４番目の塩基がシトシンではなくチミンである一塩基多型を含むＧＰＲ３０を発現し、野生型ＧＰＲ３０を発現する細胞株に比べて細胞死の程度が低いことを特徴とする細胞株や、〔３〕上記〔２〕記載の細胞株に被検物質を接触させ、１）細胞の増殖の程度を分析し、細胞の増殖を抑制する物質を選択する工程；又は２）細胞死の程度を分析し、細胞死を促進する物質を選択する工程；を含む子宮筋腫の治療薬のスクリーニング方法や、〔４〕ヒト又は非ヒト動物のＧＰＲ３０遺伝子のＯＲＦに存在し、配列番号１に示される塩基配列の１４番目の塩基がシトシンではなくチミンである一塩基多型、又は非ヒト動物のＧＰＲ３０ホモログ遺伝子に保存された、配列番号１に示される塩基配列の１４番目の塩基に相当するシトシンがチミンである一塩基多型を含むＧＰＲ３０を発現することを特徴とするトランスジェニック非ヒト動物や、〔５〕上記〔４〕記載の変異型ＧＰＲ３０発現トランスジェニック非ヒト動物に被検物質を投与し、子宮筋腫の大きさを測定し、子宮筋腫を縮小させる物質を選択する工程を含む子宮筋腫の治療薬のスクリーニング方法からなる。
本発明によると、子宮筋腫等のエストロゲン関連疾患の検査のターゲットを追加し、さらに創薬のターゲット及びスクリーニングの手法を提供することができる。また、本発明の手法によって大量のサンプルを高速で検査することが可能になり、患者のＧＰＲ３０における変異の有無を判定して予防や治療の方針を検討する、オーダーメイド治療が可能になる。
本発明者は、子宮筋腫及び乳がんのＧＰＲ３０遺伝子ＯＲＦに存在するＳＮＰを同定し、かかるＳＮＰにより癌細胞におけるＧＰＲ３０のアポトーシス誘導機能が低下し、子宮筋腫や乳がんの病態が再現されることを見いだした。かかる知見に基づいて、ＧＰＲ３０遺伝子ＯＲＦ内のＳＮＰを利用することにより、エストロゲン関連疾患の新たな診断、予防法、治療薬の開発が可能になる。以下、本発明の実施の形態についてさらに具体的に説明する。
＜ＧＰＲ３０遺伝子のＯＲＦ＞
本発明におけるヒトＧＰＲ３０遺伝子としては、例えばＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＡＦ０２７９５６、ＧＩ：２７３９１０６を例示することができ、ＧＰＲ３０遺伝子のＯＲＦとしては、配列番号１に示される塩基配列や、配列番号２に示されるアミノ酸配列を例示することができる。
本発明におけるヒトＧＰＲ３０遺伝子としては、例えばＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＡＦ０２７９５６、ＧＩ：２７３９１０６を例示することができ、ＧＰＲ３０遺伝子のＯＲＦとしては、配列番号１に示される塩基配列や、配列番号２に示されるアミノ酸配列を例示することができる。
＜エストロゲン関連疾患＞
本明細書における「エストロゲン関連疾患」としては、エストロゲンとの関連が知られている疾患であれば特に限定はされないが、例えば女性特有の組織、子宮や卵巣、乳房における筋腫やがん等を挙げることができ、好ましくは子宮筋腫、子宮腺筋症、子宮内膜増殖症、子宮内膜がん、子宮体がん、胞状奇胎、絨毛がん、卵巣腫瘍、卵巣嚢腫、卵巣がん、線維腺腫、乳腺症、乳がんを挙げることができ、さらに好ましくは子宮筋腫や乳がんを挙げることができる。
本明細書における「エストロゲン関連疾患」としては、エストロゲンとの関連が知られている疾患であれば特に限定はされないが、例えば女性特有の組織、子宮や卵巣、乳房における筋腫やがん等を挙げることができ、好ましくは子宮筋腫、子宮腺筋症、子宮内膜増殖症、子宮内膜がん、子宮体がん、胞状奇胎、絨毛がん、卵巣腫瘍、卵巣嚢腫、卵巣がん、線維腺腫、乳腺症、乳がんを挙げることができ、さらに好ましくは子宮筋腫や乳がんを挙げることができる。
＜エストロゲン関連疾患の判定方法＞
本発明におけるエストロゲン関連疾患の判定方法は、ＧＰＲ３０遺伝子のＯＲＦにおける少なくとも１種のＳＮＰを検出することにより、エストロゲン関連疾患の発症の可能性、エストロゲン関連疾患の発症の有無、あるいは発症しているエストロゲン関連疾患のタイプを判定する方法である。
本発明におけるエストロゲン関連疾患の判定方法は、ＧＰＲ３０遺伝子のＯＲＦにおける少なくとも１種のＳＮＰを検出することにより、エストロゲン関連疾患の発症の可能性、エストロゲン関連疾患の発症の有無、あるいは発症しているエストロゲン関連疾患のタイプを判定する方法である。
ＧＰＲ３０遺伝子のＯＲＦに存在するＳＮＰの好ましい具体例としては、
（１）ＧＰＲ３０遺伝子ＤＮＡ領域であって、配列番号１に記載の塩基配列の１４番目の塩基がシトシンではなくチミンである一塩基多型；
（２）ＧＰＲ３０遺伝子ＤＮＡ領域であって、配列番号１に記載の塩基配列の４７番目の塩基がシトシンではなくチミンである一塩基多型；
を挙げることができ、本明細書においてはそれぞれ（１）１４Ｃ＞Ｔ、（２）４７Ｃ＞Ｔと表記する場合がある。
（１）ＧＰＲ３０遺伝子ＤＮＡ領域であって、配列番号１に記載の塩基配列の１４番目の塩基がシトシンではなくチミンである一塩基多型；
（２）ＧＰＲ３０遺伝子ＤＮＡ領域であって、配列番号１に記載の塩基配列の４７番目の塩基がシトシンではなくチミンである一塩基多型；
を挙げることができ、本明細書においてはそれぞれ（１）１４Ｃ＞Ｔ、（２）４７Ｃ＞Ｔと表記する場合がある。
また上記（１）及び（２）の塩基配列における変異は、
（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＧＰＲ３０における、５番目のセリンがフェニリアラニンである変異；
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＧＰＲ３０における、１８番目のプロリンがロイシンである変異；
に相当し、本明細書においてはそれぞれ（１）Ｓ５Ｆ、（２）Ｐ１６Ｌと表記する場合がある。
（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＧＰＲ３０における、５番目のセリンがフェニリアラニンである変異；
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＧＰＲ３０における、１８番目のプロリンがロイシンである変異；
に相当し、本明細書においてはそれぞれ（１）Ｓ５Ｆ、（２）Ｐ１６Ｌと表記する場合がある。
例えば、ＧＰＲ３０遺伝子ＯＲＦの塩基配列の１４番目あるいは４７番目の塩基がチミンである場合には、野生型ＧＰＲ３０によるアポトーシス誘導が減少しており、エストロゲン関連疾患が発症している、あるいは発症の可能性が高いと判定することができる。また発症している場合には、その疾患のタイプが従来の核内受容体ＥＲをターゲットとした薬剤に対し難治性のタイプである可能性が示唆される。反対に、ＧＰＲ３０遺伝子ＯＲＦの塩基配列の１４番目あるいは４７番目の塩基がシトシンである場合には、エストロゲン関連疾患の発症の可能性が低いと判定することができる。また発症している場合には、従来の核内受容体ＥＲをターゲットとした薬剤による治療効果が期待できる。
本明細書において、疾患の「判定」とは、疾患発症の有無の判断、疾患発症の可能性の判断（罹患危険性の予想）、疾患の遺伝的要因の解明、疾患が発症した場合の治療薬による効果の予測などをいい、判定のためのデータを収集する行為は含まれるが、医師による診断行為は除外される。また、疾患の「判定」は、上記のＳＮＰの検出法による結果と、所望により他の多型分析（ＶＮＴＲやＲＦＬＰ）又は他の検査結果と合わせて行うこともできる。
＜検出対象＞
ＳＮＰ検出の対象としてはゲノムＤＮＡが好ましいが、ｃＤＮＡやｍＲＮＡを使用することもできる。また、上記対象を採取する試料としては、一般的に核酸採取に用いられる任意の生物学的試料であればよく、例えば血液、骨髄液、精液、腹腔液、尿等の体液や、組織細胞、体毛等を挙げることができる。ゲノムＤＮＡ等は、これらの試料より常法に従い抽出、精製し、調製することができる。また、遺伝子多型を検出するためのテンプレートは、採取したゲノムＤＮＡ等でも、ＰＣＲ法や他の公知の増幅方法、例えばＮＡＳＢＡ法、ＬＣＲ法、ＳＤＡ法、ＬＡＭＰ法等で増幅された増幅産物でもよい。
ＳＮＰ検出の対象としてはゲノムＤＮＡが好ましいが、ｃＤＮＡやｍＲＮＡを使用することもできる。また、上記対象を採取する試料としては、一般的に核酸採取に用いられる任意の生物学的試料であればよく、例えば血液、骨髄液、精液、腹腔液、尿等の体液や、組織細胞、体毛等を挙げることができる。ゲノムＤＮＡ等は、これらの試料より常法に従い抽出、精製し、調製することができる。また、遺伝子多型を検出するためのテンプレートは、採取したゲノムＤＮＡ等でも、ＰＣＲ法や他の公知の増幅方法、例えばＮＡＳＢＡ法、ＬＣＲ法、ＳＤＡ法、ＬＡＭＰ法等で増幅された増幅産物でもよい。
＜検出方法＞
ＳＮＰの検出は、高分解能融解曲線解析（ＨＲＭ法）によると、大量のサンプルを高速で解析できる点で好ましい。ＨＲＭ法は、温度上昇に伴う二本鎖ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡへの解離（融解）が、その長さ、ＧＣ含量、あるいは相補性などにより変化がするという特性に基づき、二本鎖ＰＣＲ産物の融解曲線を分析することにより、その特性を調べる手法である。ＨＲＭ法による遺伝子解析は、ＰＣＲ反応により標的配列が増幅されること、増幅産物が色素等により検出可能な形態であること、色素を検出しつつ温度を上昇させることで二本鎖ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡへの解離を測定、融解曲線データを取得し、ソフトウェアによりその形を認識、分析するシステムであれば特に制限されず、例えば、ＤＮＡ色素存在下で、かかる色素を検出するに適した励起、蛍光波長を放射もしくは検出することができる適切な検出機器を備えたサーマルサイクラーでＰＣＲによる増幅反応、温度上昇を順次行い、ＤＮＡ色素を検出して融解曲線を解析する例を挙げることができる。さらに具体的には、例えば、蛍光色素ＳＹＴＯ９（Invitrogen社製）とTaq polymerase Expand High Fidelity PLUS（Roche社製）を含むＰＣＲ反応液を調製し、Rotor-Gene（登録商標）Q（QIAGEN社製）を用いてＰＣＲ反応及び融解曲線を取得し解析する方法を挙げることができる。また、LightCycler 480 High Resolution Meltingマスターミックス（Roche社製）によりＰＣＲ反応液を調製し、LightCycler（登録商標）480（Roche社製）によりＰＣＲ反応及び融解曲線を取得する方法も挙げることができる。
ＳＮＰの検出は、高分解能融解曲線解析（ＨＲＭ法）によると、大量のサンプルを高速で解析できる点で好ましい。ＨＲＭ法は、温度上昇に伴う二本鎖ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡへの解離（融解）が、その長さ、ＧＣ含量、あるいは相補性などにより変化がするという特性に基づき、二本鎖ＰＣＲ産物の融解曲線を分析することにより、その特性を調べる手法である。ＨＲＭ法による遺伝子解析は、ＰＣＲ反応により標的配列が増幅されること、増幅産物が色素等により検出可能な形態であること、色素を検出しつつ温度を上昇させることで二本鎖ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡへの解離を測定、融解曲線データを取得し、ソフトウェアによりその形を認識、分析するシステムであれば特に制限されず、例えば、ＤＮＡ色素存在下で、かかる色素を検出するに適した励起、蛍光波長を放射もしくは検出することができる適切な検出機器を備えたサーマルサイクラーでＰＣＲによる増幅反応、温度上昇を順次行い、ＤＮＡ色素を検出して融解曲線を解析する例を挙げることができる。さらに具体的には、例えば、蛍光色素ＳＹＴＯ９（Invitrogen社製）とTaq polymerase Expand High Fidelity PLUS（Roche社製）を含むＰＣＲ反応液を調製し、Rotor-Gene（登録商標）Q（QIAGEN社製）を用いてＰＣＲ反応及び融解曲線を取得し解析する方法を挙げることができる。また、LightCycler 480 High Resolution Meltingマスターミックス（Roche社製）によりＰＣＲ反応液を調製し、LightCycler（登録商標）480（Roche社製）によりＰＣＲ反応及び融解曲線を取得する方法も挙げることができる。
ＧＰＲ３０のＯＲＦに存在する少なくとも１種のＳＮＰを含むＤＮＡ領域を増幅する場合に使用するオリゴヌクレオチドプライマーの選択は、例えば、ＳＮＰ部位を含む連続する少なくとも１０塩基以上、好ましくは１００〜１０００塩基、より好ましくは２００〜６００塩基の配列、又はその相補配列を増幅しうるものであれば特に制限されず、また、その長さが１０〜５０塩基、より好ましくは１０〜３５塩基、更に好ましくは１８〜２５塩基、特に好ましくは１８〜２２塩基であるオリゴヌクレオチドを挙げることができる。例えば、配列番号１の塩基配列において、２５〜１８６塩基の増幅に（5’-cttgaaagctgcacggtgca-3’：配列番号３）と（5’-cgagaggaacaggccgatca-3’：配列番号４）、１３０〜３７７塩基の増幅に（5’-aatgggacaggtgagctct-3’：配列番号５）と（5’-atgtcgtagtaccgctcgt-3’：配列番号６）、１３０〜６３４塩基の増幅に（5’-aatgggacag gtgagctct-3’：配列番号７）と（5’-ggacatccgc gaaacaga-3’：配列番号８）、２７９〜５１８塩基の増幅に（5’-ccccgacctgtacttcatcaac-3’：配列番号９）と（5’-tggtgcttggtgcggaac-3’：配列番号１０）、３８８〜６３４塩基の増幅に（5’-tgcaccttcatgtcgctctt-3’：配列番号１１）と（5’-ggacatccgcgaaacaga-3’：配列番号１２）、５９１〜９２９塩基の増幅に（5’-cctgcagcacaccgacga-3’：配列番号１３）と（5’-ttgacaatgtggcccgtga-3’：配列番号１４）、５９１〜８２１塩基の増幅に（5’-cctgcagcacaccgacga-3’：配列番号１５）と（5’-ggcagccagcagacgaag-3’：配列番号１６）、６９５〜９２９塩基の増幅に（5’-gtgctactccctcattgtccg-3’：配列番号１７）と（5’-ttgacaatgtggcccgtga-3’：配列番号１８）、８７４〜１０９５塩基の増幅に（5’-gctccctgcaagcagtct-3’：配列番号１９）と（5’-ctcggtgctgtctggaatg-3’：配列番号２０）、８７４〜１２３０塩基の増幅に（5’-gctccctgcaagcagtct-3’：配列番号２１）と（5’-ctgaccgcagtttagagaca-3’：配列番号２２）、１０００〜１２３０塩基の増幅に（5’-aagctgaggctgtacattga-3’：配列番号２３）と（5’-ctgaccgcagtttagagaca-3’：配列番号２４）を使用することができる。またプライマーは、前記のＳＮＰ部位を含む所定塩基数の配列を増幅するためのプライマーとして機能し得る限り、その配列において１又はそれ以上の置換、欠失、付加を含んでいてもよい。
ＳＮＰの検出は、他の公知の遺伝子多型検出方法、例えばマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）によるＳＮＰ検出法、制限酵素断片長多型分析法（ＲＦＬＰ；Restriction fragment length polymorphism）、ジデオキシ法やMaxam-Gilbert法等の公知の方法により直接配列決定するダイレクトシークエンシング法、変性勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ；denaturing gradient gel electrophoresis）、一本鎖コンフォメーション多型解析（ＳＳＣＰ；single strand conformation polymorphism）、対立遺伝子特異的ＰＣＲ（allele- specific ＰＣＲ）、ＡＳＯ（allele-specific oligonucleotide）によるハイブリダイーゼーション法、ミスマッチ部位の化学的切断（ＣＣＭ；chemical cleavage of mismatches）、ＨＥＴ（heteroduplex method）法、ＰＥＸ（primer extension）法、ＲＣＡ（rolling circle amplification）法、Light CyclerによるMelting Point法、ＴａｑＭａｎ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法、シングルヌクレオチドプライマー法、ＳＮａＰｓｈｏｔ法、MassArray法、Pyrosequncing法、ＳＮＰ−ＩＴ法、BeadArray法、Scorpion法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳによる質量分析等を用いることができる。
＜エストロゲン関連疾患診断用キット＞
上述のプライマーは、これを含むエストロゲン関連疾患診断用キットとして有利に使用することができる。また、ＧＰＲ３０遺伝子ＤＮＡ及びＧＰＲ３０遺伝子のＯＲＦ内にＳＮＰをもつＤＮＡや、これらＤＮＡを含むプラスミドは、かかる診断キットにおいてコントロールとして利用することができる。本発明の診断キットは、ほかに遺伝子多型の分析法に使用される制限酵素、ポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、核酸標識分子、緩衝液等を含んでいてもよい。
上述のプライマーは、これを含むエストロゲン関連疾患診断用キットとして有利に使用することができる。また、ＧＰＲ３０遺伝子ＤＮＡ及びＧＰＲ３０遺伝子のＯＲＦ内にＳＮＰをもつＤＮＡや、これらＤＮＡを含むプラスミドは、かかる診断キットにおいてコントロールとして利用することができる。本発明の診断キットは、ほかに遺伝子多型の分析法に使用される制限酵素、ポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、核酸標識分子、緩衝液等を含んでいてもよい。
＜変異型ＧＰＲ３０発現細胞＞
本発明の細胞株としては、ヒトＧＰＲ３０遺伝子のＯＲＦに存在する少なくとも１種のＳＮＰを含むＧＰＲ３０を発現し、野生型ＧＰＲ３０を発現する細胞株に比べて細胞死の程度が低い細胞株であれば特に制限されず、上記ＳＮＰとしては前記１４Ｃ＞Ｔや４７Ｃ＞Ｔを具体的に例示することができる。これらＳＮＰを含むヒトＧＰＲ３０遺伝子のＯＲＦ領域を含むＤＮＡを動物細胞用発現ベクターに挿入して変異型ＧＰＲ３０組換えベクターを作製し、かかる組換えベクターを宿主細胞株に導入することにより、変異型ＧＰＲ３０を発現する、好ましくは、ＳＮＰを含むヒトＧＰＲ３０遺伝子がゲノムＤＮＡに組み込まれて変異型ＧＰＲ３０を安定的に発現する、本発明の細胞株を調製することができる。宿主細胞の種類は特に制限されず、例えば哺乳動物細胞株、好ましくはヒト由来細胞株、さらに好ましくはヒト子宮頸がん由来細胞ＨｅＬａを挙げることができる。なお、野生型ＧＰＲ３０を発現する細胞株はコントロールとして用いることができる。
本発明の細胞株としては、ヒトＧＰＲ３０遺伝子のＯＲＦに存在する少なくとも１種のＳＮＰを含むＧＰＲ３０を発現し、野生型ＧＰＲ３０を発現する細胞株に比べて細胞死の程度が低い細胞株であれば特に制限されず、上記ＳＮＰとしては前記１４Ｃ＞Ｔや４７Ｃ＞Ｔを具体的に例示することができる。これらＳＮＰを含むヒトＧＰＲ３０遺伝子のＯＲＦ領域を含むＤＮＡを動物細胞用発現ベクターに挿入して変異型ＧＰＲ３０組換えベクターを作製し、かかる組換えベクターを宿主細胞株に導入することにより、変異型ＧＰＲ３０を発現する、好ましくは、ＳＮＰを含むヒトＧＰＲ３０遺伝子がゲノムＤＮＡに組み込まれて変異型ＧＰＲ３０を安定的に発現する、本発明の細胞株を調製することができる。宿主細胞の種類は特に制限されず、例えば哺乳動物細胞株、好ましくはヒト由来細胞株、さらに好ましくはヒト子宮頸がん由来細胞ＨｅＬａを挙げることができる。なお、野生型ＧＰＲ３０を発現する細胞株はコントロールとして用いることができる。
ＧＰＲ３０発現細胞を作製するための動物細胞用の発現ベクターとしては、発現を起こさせるだけでなく、抗生物質耐性遺伝子等のマーカー遺伝子や、プロモーター等の発現を調節する制御配列を含んでいるものが好ましい。動物細胞用のプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルスのＩＥ（immediate early）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等を挙げることができる。かかる動物細胞用の発現ベクターとして、pcDNA3（Stratagene社製）、p3xFLAG-CMV10（Sigma-Aldrich社製）、pEGFP-C3（Clontech社製)等を具体的に例示することができる。変異型ＧＰＲ３０や野生型ＧＰＲ３０を安定的に発現する安定発現株は、薬剤耐性遺伝子を含む発現ベクターを利用して変異型又は野生型ＧＰＲ３０発現配列を細胞内に導入し、選択薬剤を用いて、変異型又は野生型ＧＰＲ３０発現配列がゲノムＤＮＡに組み込まれ、変異型又は野生型ＧＰＲ３０タンパク質を発現する細胞を選択することにより取得することができる。例えば、変異型又は野生型のＧＰＲ３０配列を挿入した、ネオマイシン耐性遺伝子を含む発現ベクターをトランスフェクションした細胞を、０．１〜２．０ｍｇ／ｍｌのＧ４１８硫酸塩を含む細胞培養液中で１週間〜１ヶ月かけて培養し、安定発現株を選択する方法により取得することができる。
また、細胞に遺伝子を導入する方法としては、細胞の種類に応じて適切な方法を用いることができる。具体的には、Davisら（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及びSambrookら（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、感染が挙げられ、FuGENE（登録商標）6 Transfection Reagent（Roche社製）やLipofectamine 2000（Invitrogen社製）等を用いる方法を例示することができる。
＜変異型ＧＰＲ３０発現細胞を用いたエストロゲン関連疾患の治療薬のスクリーニング方法＞
本発明のエストロゲン関連疾患の治療薬のスクリーニング方法は、上記の変異型ＧＰＲ３０発現細胞株に被検物質を接触させ、１）細胞の増殖の程度を分析し、細胞の増殖を抑制する物質を選択する工程；又は２）細胞死の程度を分析し、細胞死を促進する物質を選択する工程を備えている。スクリーニング方法として、具体的には、被検物質存在下、もしくは被検物質及びＧＰＲ３０リガンド／アゴニスト存在下で変異型ＧＰＲ３０発現細胞株の細胞増殖又は細胞死を測定して細胞増殖が減少／細胞死が増加する物質、好ましくは野生型ＧＰＲ３０発現細胞株と同程度に、細胞増殖が減少／細胞死が増加する物質を選択する方法を例示することができる。上記ＧＰＲ３０のリガンドの例としてはエストロゲン、ＧＰＲ３０のアゴニストの例としてはＧ−１が挙げられる。被検物質としては、任意の物質を使用することができ、例えば、個々の低分子合成化合物でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、あるいは化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリー、コンビナトリアルライブラリーでもよい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。
本発明のエストロゲン関連疾患の治療薬のスクリーニング方法は、上記の変異型ＧＰＲ３０発現細胞株に被検物質を接触させ、１）細胞の増殖の程度を分析し、細胞の増殖を抑制する物質を選択する工程；又は２）細胞死の程度を分析し、細胞死を促進する物質を選択する工程を備えている。スクリーニング方法として、具体的には、被検物質存在下、もしくは被検物質及びＧＰＲ３０リガンド／アゴニスト存在下で変異型ＧＰＲ３０発現細胞株の細胞増殖又は細胞死を測定して細胞増殖が減少／細胞死が増加する物質、好ましくは野生型ＧＰＲ３０発現細胞株と同程度に、細胞増殖が減少／細胞死が増加する物質を選択する方法を例示することができる。上記ＧＰＲ３０のリガンドの例としてはエストロゲン、ＧＰＲ３０のアゴニストの例としてはＧ−１が挙げられる。被検物質としては、任意の物質を使用することができ、例えば、個々の低分子合成化合物でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、あるいは化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリー、コンビナトリアルライブラリーでもよい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。
＜細胞増殖の測定方法＞
細胞増殖の測定方法としては、観測開始時点及び１点以上の任意の時間経過後に細胞数や細胞構成因子の量を測定する方法により細胞増殖を解析する方法を挙げることができる。例えば、顕微鏡下で直接に培養ディッシュ上の細胞を数える方法や、一度培養ディッシュから剥がしてから血球計算盤やフローサイトメトリーなどを用いて細胞数を測定する方法が挙げられる。測定に用いる細胞は、蛍光タンパク質の過剰発現や蛍光標識された抗体や分子により蛍光標識されていてもよく、また、以下に挙げる各種染色方法などにより染色したものを用いることができる。例えば、細胞質、核などの細胞構成因子や、細胞に発現させたタンパク質を、トリパンブルーやクリスタルバイオレット、ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、ＢｒｄＵや［３Ｈ］チミジン取り込み法、免疫蛍光染色や各種染色試薬により染色する例が挙げられる。また、例えば細胞をＢｒｄＵ存在下で培養してＤＮＡにＢｒｄＵを取り込ませ、蛍光標識した抗ＢｒｄＵ抗体などによりアッセイ中に取り込まれた核酸量を測定する方法や、還元発色試薬により生細胞中の脱水素酵素活性を測定するＭＴＴ法やＷＳＴ法により、間接的に細胞数を計測する方法も挙げられる。
細胞増殖の測定方法としては、観測開始時点及び１点以上の任意の時間経過後に細胞数や細胞構成因子の量を測定する方法により細胞増殖を解析する方法を挙げることができる。例えば、顕微鏡下で直接に培養ディッシュ上の細胞を数える方法や、一度培養ディッシュから剥がしてから血球計算盤やフローサイトメトリーなどを用いて細胞数を測定する方法が挙げられる。測定に用いる細胞は、蛍光タンパク質の過剰発現や蛍光標識された抗体や分子により蛍光標識されていてもよく、また、以下に挙げる各種染色方法などにより染色したものを用いることができる。例えば、細胞質、核などの細胞構成因子や、細胞に発現させたタンパク質を、トリパンブルーやクリスタルバイオレット、ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、ＢｒｄＵや［３Ｈ］チミジン取り込み法、免疫蛍光染色や各種染色試薬により染色する例が挙げられる。また、例えば細胞をＢｒｄＵ存在下で培養してＤＮＡにＢｒｄＵを取り込ませ、蛍光標識した抗ＢｒｄＵ抗体などによりアッセイ中に取り込まれた核酸量を測定する方法や、還元発色試薬により生細胞中の脱水素酵素活性を測定するＭＴＴ法やＷＳＴ法により、間接的に細胞数を計測する方法も挙げられる。
生細胞の増殖を経時的にモニターする方法としては、顕微鏡によるタイムラプス観察の他、Roche社製のxCELLigenceも利用することもできる。xCELLigenceは、底面にくし型の電極を集積した組織培養Ｅ−プレート上で細胞を培養し、電気的インピーダンスを測定することにより、細胞に標識物を取り込ませること無く、リアルタイムで細胞イベントをモニターするものである。インピーダンスの測定からは、細胞の生物的な状態に関する定量的な情報を取得することができ、生存活性、形態、細胞数などを定量することができる。
＜細胞死の測定方法＞
細胞死の測定方法としては、細胞死を起こしつつある細胞を検出できる方法、好ましくはアポトーシスの特徴を検出する方法であれば特に限定されず、例えば、細胞を固定してSYTOX（登録商標）Green（Invitrogen社製）で染色し、顕微鏡観察によりアポトーシスの特徴である核の断片化を起こしている細胞数を測定したり、蛍光標識アネキシンＶによりアポトーシスを起こしつつある細胞の表面に露出するフォスファチジルセリンを検出し、染色された細胞をフローサイトメトリーで測定する方法を挙げることができる。
細胞死の測定方法としては、細胞死を起こしつつある細胞を検出できる方法、好ましくはアポトーシスの特徴を検出する方法であれば特に限定されず、例えば、細胞を固定してSYTOX（登録商標）Green（Invitrogen社製）で染色し、顕微鏡観察によりアポトーシスの特徴である核の断片化を起こしている細胞数を測定したり、蛍光標識アネキシンＶによりアポトーシスを起こしつつある細胞の表面に露出するフォスファチジルセリンを検出し、染色された細胞をフローサイトメトリーで測定する方法を挙げることができる。
＜変異型ＧＰＲ３０発現トランスジェニック非ヒト動物＞
本発明のトランスジェニック非ヒト動物としては、ヒト又は非ヒト動物のＧＰＲ３０遺伝子のＯＲＦに存在する少なくとも１種のＳＮＰ、好ましくは１４Ｃ＞Ｔや４７Ｃ＞Ｔを含むＧＰＲ３０を発現する非ヒト動物であれば特に制限されず、全身又は部分的に、一時的又は継続的に変異型のＧＰＲ３０タンパク質を発現していてもよい。例えば、変異型ＧＰＲ３０発現配列を組み込んだウィルスベクターを非ヒト動物の子宮組織に注射する方法や、初期発生胚に接触させて感染させる方法や、前核期受精卵やＥＳ細胞にかかるベクターをマイクロインジェクションにより導入する方法で作製されたトランスジェニック非ヒト動物を挙げることができ、好ましくは、トランスジェニック非ヒト動物におけるＧＰＲ３０の発現が、テトラサイクリンによる誘導やＣｒｅ／ＬｏｘＰシステムにより、時期、あるいは組織特異的に制御される例を挙げることができる。また、非ヒト動物の種類としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、モルモット、ハムスター、ラット、マウス等を挙げることができるが、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス又はラットが好ましく、なかでもモルモット、ハムスター、マウス、ラット等の齧歯目がより好ましく、とりわけマウスが好ましい。
本発明のトランスジェニック非ヒト動物としては、ヒト又は非ヒト動物のＧＰＲ３０遺伝子のＯＲＦに存在する少なくとも１種のＳＮＰ、好ましくは１４Ｃ＞Ｔや４７Ｃ＞Ｔを含むＧＰＲ３０を発現する非ヒト動物であれば特に制限されず、全身又は部分的に、一時的又は継続的に変異型のＧＰＲ３０タンパク質を発現していてもよい。例えば、変異型ＧＰＲ３０発現配列を組み込んだウィルスベクターを非ヒト動物の子宮組織に注射する方法や、初期発生胚に接触させて感染させる方法や、前核期受精卵やＥＳ細胞にかかるベクターをマイクロインジェクションにより導入する方法で作製されたトランスジェニック非ヒト動物を挙げることができ、好ましくは、トランスジェニック非ヒト動物におけるＧＰＲ３０の発現が、テトラサイクリンによる誘導やＣｒｅ／ＬｏｘＰシステムにより、時期、あるいは組織特異的に制御される例を挙げることができる。また、非ヒト動物の種類としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、モルモット、ハムスター、ラット、マウス等を挙げることができるが、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス又はラットが好ましく、なかでもモルモット、ハムスター、マウス、ラット等の齧歯目がより好ましく、とりわけマウスが好ましい。
変異型ＧＰＲ３０発現トランスジェニック非ヒト動物の一例として、変異型ＧＰＲ３０発現トランスジェニックマウスを挙げることができる。トランスジェニックマウスは、プロモーター下流に変異型ＧＰＲ３０配列含むターゲティングベクターを作製し、かかるベクターを制限酵素で切断しリニアなＤＮＡとした後に受精卵にマイクロインジェクションし、仮親のマウスにて発生させる方法で得ることができる。また、ターゲティングベクターは、ＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）などのマーカーを適宜含むことができ、かかるマーカーを検出することにより、遺伝子導入を確認することができる。
＜変異型ＧＰＲ３０発現トランスジェニック非ヒト動物を用いたエストロゲン関連疾患の治療薬のスクリーニング方法＞
本発明におけるＧＰＲ３０発現トランスジェニック非ヒト動物を用いたエストロゲン関連疾患の治療薬のスクリーニング方法は、上述の変異ＧＰＲ３０発現トランスジェニック非ヒト動物、好ましくは変異ＧＰＲ３０発現マウスに被検物質を投与し、子宮筋腫の大きさを測定し、子宮筋腫を縮小させる物質を選択する工程を備えている。スクリーニング方法として、具体的には、ＧＰＲ３０発現トランスジェニック非ヒト動物に、塗布、注射、経口投与等の手段により候補物質、あるいは候補物質及びＧＰＲ３０リガンド／アゴニストを投与し、子宮筋腫のサイズを評価し、候補物質の非存在下の条件と比較して子宮筋腫のサイズが縮小する物質、好ましくは同種の野生型動物と同程度に、子宮筋腫が縮小する物質をエストロゲン関連疾患の治療薬として選択する方法を例示することができる。上記ＧＰＲ３０のリガンドの例としてはエストロゲン、ＧＰＲ３０のアゴニストの例としてはＧ−１が挙げられる。被検物質としては、任意の物質を使用することができ、例えば、個々の低分子合成化合物でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、あるいは化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリー、コンビナトリアルライブラリーでもよい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。子宮筋腫のサイズを評価する方法としては、子宮を解剖して組織染色や免疫染色により筋腫又は正常組織を染色し、子宮筋腫のサイズを測定する方法を挙げることができる。また、ＧＰＲ３０発現配列及びＩＲＥＳ（Internal ribosome entry site）−ＧＦＰ配列を含むウィルスベクターを非ヒト動物の子宮組織に注射して子宮筋腫を引き起こし、候補物質の投与前及び投与後に、ｉｎ ｖｉｖｏ蛍光イメージング装置を用いてトランスジェニック非ヒト動物生体内のＧＦＰ蛍光を測定することにより子宮筋腫を可視化し、子宮筋腫のサイズを測定する方法も好適に例示することができる。
本発明におけるＧＰＲ３０発現トランスジェニック非ヒト動物を用いたエストロゲン関連疾患の治療薬のスクリーニング方法は、上述の変異ＧＰＲ３０発現トランスジェニック非ヒト動物、好ましくは変異ＧＰＲ３０発現マウスに被検物質を投与し、子宮筋腫の大きさを測定し、子宮筋腫を縮小させる物質を選択する工程を備えている。スクリーニング方法として、具体的には、ＧＰＲ３０発現トランスジェニック非ヒト動物に、塗布、注射、経口投与等の手段により候補物質、あるいは候補物質及びＧＰＲ３０リガンド／アゴニストを投与し、子宮筋腫のサイズを評価し、候補物質の非存在下の条件と比較して子宮筋腫のサイズが縮小する物質、好ましくは同種の野生型動物と同程度に、子宮筋腫が縮小する物質をエストロゲン関連疾患の治療薬として選択する方法を例示することができる。上記ＧＰＲ３０のリガンドの例としてはエストロゲン、ＧＰＲ３０のアゴニストの例としてはＧ−１が挙げられる。被検物質としては、任意の物質を使用することができ、例えば、個々の低分子合成化合物でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、あるいは化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリー、コンビナトリアルライブラリーでもよい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。子宮筋腫のサイズを評価する方法としては、子宮を解剖して組織染色や免疫染色により筋腫又は正常組織を染色し、子宮筋腫のサイズを測定する方法を挙げることができる。また、ＧＰＲ３０発現配列及びＩＲＥＳ（Internal ribosome entry site）−ＧＦＰ配列を含むウィルスベクターを非ヒト動物の子宮組織に注射して子宮筋腫を引き起こし、候補物質の投与前及び投与後に、ｉｎ ｖｉｖｏ蛍光イメージング装置を用いてトランスジェニック非ヒト動物生体内のＧＦＰ蛍光を測定することにより子宮筋腫を可視化し、子宮筋腫のサイズを測定する方法も好適に例示することができる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
＜ＨＭＲ法による一塩基多型検出の条件の確立＞
臨床サンプルにおけるＧＰＲ３０の未知変異を検出するために、高速に大量サンプルの測定が可能なＨＲＭ法によるＳＮＰの条件を確立した。ＧＰＲ３０の１１２８塩基のＯＲＦを、表１で示される２１１〜５０５塩基の各領域に分け、これらの領域を増幅するためのプライマー（配列番号３〜２４）を作製した。表２で示される９個の既知のＳＮＰを導入した変異型ＧＰＲ３０ＤＮＡ配列をもつプラスミドを作製し、これらをポジティブコントロールのテンプレートとして用いて、塩濃度、４種類のTaq polymerase及び４種類の蛍光色素の組み合わせについて至適条件を検討した。表１に示すように、Ｍｇ２＋ １．５〜２．５ｍＭ存在下でTaq polymerase Expand High Fidelity PLUS（Roche社製）及び蛍光色素ＳＹＴＯ９（Invitrogen社製）を用いた組み合わせの条件が最も高感度であった。
臨床サンプルにおけるＧＰＲ３０の未知変異を検出するために、高速に大量サンプルの測定が可能なＨＲＭ法によるＳＮＰの条件を確立した。ＧＰＲ３０の１１２８塩基のＯＲＦを、表１で示される２１１〜５０５塩基の各領域に分け、これらの領域を増幅するためのプライマー（配列番号３〜２４）を作製した。表２で示される９個の既知のＳＮＰを導入した変異型ＧＰＲ３０ＤＮＡ配列をもつプラスミドを作製し、これらをポジティブコントロールのテンプレートとして用いて、塩濃度、４種類のTaq polymerase及び４種類の蛍光色素の組み合わせについて至適条件を検討した。表１に示すように、Ｍｇ２＋ １．５〜２．５ｍＭ存在下でTaq polymerase Expand High Fidelity PLUS（Roche社製）及び蛍光色素ＳＹＴＯ９（Invitrogen社製）を用いた組み合わせの条件が最も高感度であった。
ヒト子宮検体の正常部位から抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとして用い、ＳＮＰ検出のためのＰＣＲにおいて増幅する領域を含むＧＰＲ３０の領域を増幅し、pBluescriptまたはpFLAGにクローニングした。これらをテンプレートとして用い、確立したＰＣＲ条件にてＳＮＰ解析を行った結果、表２に示すように９個の既知のＳＮＰを検出することができた。すなわち、本手法により大量のサンプルを高速でスクリーングすることが可能になった。
＜臨床サンプルのＧＰＲ３０の一塩基多型の検出＞
正常検体１００例及びヒト子宮筋腫７１例、乳がん２５例の検体から、ゲノムＤＮＡを抽出し、ＨＲＭ法によりＧＰＲ３０のＯＲＦに存在する変異を検出した。さらにＨＲＭ法の結果を評価するため、ＤＮＡシークエンサーを用いて全サンプルにおけるＧＰＲ３０のＯＲＦの配列を調べ、ＳＮＰを確認した。その結果、子宮筋腫サンプルでは表３に示す７個のＳＮＰが同定され、そのうち１４番目のシトシンがチミンに変異した１４Ｃ＞Ｔ（Ｓ５Ｆ）を子宮筋腫に特異的なＧＰＲ３０における新規ＳＮＰとして見いだした。さらにこのＳＮＰの遺伝子型に、子宮筋腫サンプルとコントロールサンプルとの間で統計学的に有意な差があることを見出した。この変異は乳がんサンプルでは検出されず、筋腫の約１２％で検出された。
正常検体１００例及びヒト子宮筋腫７１例、乳がん２５例の検体から、ゲノムＤＮＡを抽出し、ＨＲＭ法によりＧＰＲ３０のＯＲＦに存在する変異を検出した。さらにＨＲＭ法の結果を評価するため、ＤＮＡシークエンサーを用いて全サンプルにおけるＧＰＲ３０のＯＲＦの配列を調べ、ＳＮＰを確認した。その結果、子宮筋腫サンプルでは表３に示す７個のＳＮＰが同定され、そのうち１４番目のシトシンがチミンに変異した１４Ｃ＞Ｔ（Ｓ５Ｆ）を子宮筋腫に特異的なＧＰＲ３０における新規ＳＮＰとして見いだした。さらにこのＳＮＰの遺伝子型に、子宮筋腫サンプルとコントロールサンプルとの間で統計学的に有意な差があることを見出した。この変異は乳がんサンプルでは検出されず、筋腫の約１２％で検出された。
また乳がんのサンプルを用いた解析では、表４に示すように別のアミノ酸変異Ｃ４７Ｔ（４７Ｃ＞Ｔ、Ｐ１６Ｌ）が乳がんサンプルの８％で検出され、本変異は子宮筋腫サンプルでは検出されなかった。
＜ＧＰＲ３０の培養細胞への過剰発現＞
（ＧＰＲ３０発現ベクター）
ヒトの正常腎臓から作製したｃＤＮＡクローンを鋳型にして、開始コドンと停止コドンをそれぞれ含むプライマーのセットでＧＰＲ３０遺伝子のＤＮＡ配列を増幅し、制限酵素EcoRV処理にて平滑末端にしたpBluscript SK(-)にクローニングした。その後、このクローニングされたベクターを鋳型にして、Ｎ末端側にBamHIサイトとHindIIIサイトをそれぞれ含むプライマーでＧＰＲ３０ＤＮＡ配列を増幅し、pFLAG（Sigma社製）にサブクローニングした。それぞれがＮ末端側にNotIサイトを含むプライマーを用いて、両端にNotIサイトをもつＦＬＡＧ−ＧＰＲ３０ＤＮＡ配列を増幅し、pIRES-GFP（Clontech社製）のマルチクローニングサイトにサブクローニングして、ＦＬＡＧ−ＧＰＲ３０とＧＦＰが同時に発現するベクターを構築し、ＧＦＰの発現を確認してから実験を行った。本ベクターはＧＰＲ３０配列下流にＩＲＥＳ及びＧＦＰ配列をもつため、pIRES-GFPのＣＭＶプロモーターによって転写されたＧＰＲ３０配列及びＧＦＰ配列をコードするｍＲＮＡから、ＦＬＡＧ−ＧＰＲ３０タンパク質とＧＦＰタンパク質がそれぞれ発現する。ＧＦＰ蛍光を検出することで、トランスフェクションされたＦＬＡＧ−ＧＰＲ３０発現細胞を選別したり、細胞のＧＦＰ蛍光を蛍光顕微鏡下で観察することにより、トランスフェクション効率を確認することができる。
（ＧＰＲ３０発現ベクター）
ヒトの正常腎臓から作製したｃＤＮＡクローンを鋳型にして、開始コドンと停止コドンをそれぞれ含むプライマーのセットでＧＰＲ３０遺伝子のＤＮＡ配列を増幅し、制限酵素EcoRV処理にて平滑末端にしたpBluscript SK(-)にクローニングした。その後、このクローニングされたベクターを鋳型にして、Ｎ末端側にBamHIサイトとHindIIIサイトをそれぞれ含むプライマーでＧＰＲ３０ＤＮＡ配列を増幅し、pFLAG（Sigma社製）にサブクローニングした。それぞれがＮ末端側にNotIサイトを含むプライマーを用いて、両端にNotIサイトをもつＦＬＡＧ−ＧＰＲ３０ＤＮＡ配列を増幅し、pIRES-GFP（Clontech社製）のマルチクローニングサイトにサブクローニングして、ＦＬＡＧ−ＧＰＲ３０とＧＦＰが同時に発現するベクターを構築し、ＧＦＰの発現を確認してから実験を行った。本ベクターはＧＰＲ３０配列下流にＩＲＥＳ及びＧＦＰ配列をもつため、pIRES-GFPのＣＭＶプロモーターによって転写されたＧＰＲ３０配列及びＧＦＰ配列をコードするｍＲＮＡから、ＦＬＡＧ−ＧＰＲ３０タンパク質とＧＦＰタンパク質がそれぞれ発現する。ＧＦＰ蛍光を検出することで、トランスフェクションされたＦＬＡＧ−ＧＰＲ３０発現細胞を選別したり、細胞のＧＦＰ蛍光を蛍光顕微鏡下で観察することにより、トランスフェクション効率を確認することができる。
ＳＮＰを有する変異型ＧＰＲ３０ＤＮＡ配列は、テンプレートとしてメチル化酵素を持つ大腸菌で増やしたpUC-GPR30と、変異の入ったフォワード及びリバースプライマーとを用いてＰＣＲ反応を行い、反応後に反応液を制限酵素DpnIで処理をしてから大腸菌にトランスフォームしてクローンを回収することにより作製した。このようにして変異を導入した領域のＤＮＡ配列をpCMV-FLAG-GPR30-IRES-GFPの同領域と置換して、ＦＬＡＧ−ＧＰＲ３０（３０Ａ＞Ｇ）、ＦＬＡＧ−ＧＰＲ３０（７８９Ｇ＞Ａ）、ＦＬＡＧ−ＧＰＲ３０（１４Ｃ＞Ｔ）及びＦＬＡＧ−ＧＰＲ３０（４７Ｃ＞Ｔ）発現ベクターを作製した。
実験で使用したＨｅＬａ、ＭＣＦ−７、３Ｔ３、ＣＨＯ、Ｈ９ｃ２細胞は、ＦＢＳ １０％、ペニシリン １００μｇ／ｍｌ、ストレプトマイシン １００ＩＵ／ｍｌ及びフェノールレッド １５μｇ／ｍｌを含むＤＭＥＭ培地を用いて５％ＣＯ２、３７℃で培養した。ＦＢＳにはエストロゲンが含まれるため、エストロゲンやＧ−１を添加する場合はエストロゲンを除去する必要があるが、ＦＢＳを含まない培地では細胞が育たない。そのため、エストロゲンやＧ−１を添加する場合は、トランスフェクションする前まで細胞を上述のＦＢＳを含む培地で培養し、トランスフェクション前にチャコール処理してエストロゲンを除去したＦＢＳ １０％、ペニシリン １００μｇ／ｍｌ及びストレプトマイシン １００ＩＵ／ｍｌを加えた、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭに培地を置換することで、再現性よいデータを得ることができるようになった。トランスフェクションは、エレクトロポレーションにより、マイクロポレーターMP-100（Digital Bio社製）を用いて行った。
＜ＨｅＬａ細胞の細胞増殖におけるＧＰＲ３０の機能＞
野生型及び２種の変異型ＧＰＲ３０（１４Ｃ＞Ｔ、４７Ｃ＞Ｔ）とエストロゲン関連疾患の病態との関連性を調べるため、組織培養Ｅ−プレート上のヒト子宮頸がん由来細胞ＨｅＬａ細胞に野生型又は変異型ＧＰＲ３０発現ベクターをトランスフェクションし、エストロゲン１００ｎＭ存在下の細胞の増殖を、xCELLigence（Roche社製）を用いて測定した（図１）。グラフ縦軸はCell impedance（細胞増殖の指標）を、横軸は経過時間を表す。以下図２〜５、図７〜１２も同様である。本実験で用いたヒト子宮頸がん由来ＨｅＬａ細胞は癌細胞由来であるため、対照（control）では細胞が増加するが、野生型ＧＰＲ３０の過剰発現では、細胞の増殖が見られなかった。しかし１４Ｃ＞Ｔ又は４７Ｃ＞Ｔの変異型ＧＰＲ３０の過剰発現では、野生型ＧＰＲ３０による細胞増殖抑制効果の減少が見られた。
野生型及び２種の変異型ＧＰＲ３０（１４Ｃ＞Ｔ、４７Ｃ＞Ｔ）とエストロゲン関連疾患の病態との関連性を調べるため、組織培養Ｅ−プレート上のヒト子宮頸がん由来細胞ＨｅＬａ細胞に野生型又は変異型ＧＰＲ３０発現ベクターをトランスフェクションし、エストロゲン１００ｎＭ存在下の細胞の増殖を、xCELLigence（Roche社製）を用いて測定した（図１）。グラフ縦軸はCell impedance（細胞増殖の指標）を、横軸は経過時間を表す。以下図２〜５、図７〜１２も同様である。本実験で用いたヒト子宮頸がん由来ＨｅＬａ細胞は癌細胞由来であるため、対照（control）では細胞が増加するが、野生型ＧＰＲ３０の過剰発現では、細胞の増殖が見られなかった。しかし１４Ｃ＞Ｔ又は４７Ｃ＞Ｔの変異型ＧＰＲ３０の過剰発現では、野生型ＧＰＲ３０による細胞増殖抑制効果の減少が見られた。
また、子宮筋腫サンプルで検出された３０Ｇ＞Ａ及び７８９Ｇ＞Ａの変異型ＧＰＲ３０についても、同様にＨｅＬａ細胞に過剰発現させ、細胞の増殖を調べた（図２）。１４Ｃ＞Ｔの変異型ＧＰＲ３０が野生型ＧＰＲ３０よりも低い細胞増殖抑制効果を示したのに対し、３０Ｇ＞Ａ及び７８９Ｇ＞Ａの変異型ＧＰＲ３０は、野生型ＧＰＲ３０と同程度の細胞増殖の抑制効果を示した。すなわち、エストロゲン関連疾患サンプルから検出されたＳＮＰのなかでも、１４Ｃ＞Ｔ及び４７Ｃ＞Ｔ変異はＧＰＲ３０の細胞増殖抑制効果を減少させるが、３０Ｇ＞Ａ及び７８９Ｇ＞Ａ変異はＧＰＲ３０の細胞増殖抑制効果に影響を与えず、ＧＰＲ３０遺伝子のＯＲＦにおけるＳＮＰによる細胞増殖抑制効果の減少は、１４Ｃ＞Ｔ及び４７Ｃ＞Ｔ変異に特異的なものであることがわかった。
ＨｅＬａ細胞に空ベクター又は野生型ＧＰＲ３０発現ベクターを導入し、０μＭ、０．１μＭ又は１μＭのエストロゲン処理を行った後、図１と同様の手法により細胞の増殖を調べた（図３）。同様に、ＨｅＬａ細胞に野生型ＧＰＲ３０又は１４Ｃ＞Ｔ変異型ＧＰＲ３０発現ベクターを導入し、０μＭ、０．１μＭ又は１μＭのエストロゲン処理を行い細胞の増殖を調べた結果を図４に示す。また、ＨｅＬａ細胞に野生型ＧＰＲ３０又は４７Ｃ＞Ｔ変異型ＧＰＲ３０発現ベクターを導入し、０μＭ、０．１μＭ又は１μＭのエストロゲン処理を行い細胞の増殖を調べた結果を図５に示す。空ベクター、野生型ＧＰＲ３０、１４Ｃ＞Ｔ変異型ＧＰＲ３０又は４７Ｃ＞Ｔ変異型ＧＰＲ３０をトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞は、いずれの場合もエストロゲン濃度依存的に細胞増殖が亢進することが確認された。
次に、野生型ＧＰＲ３０及び、１４Ｃ＞Ｔ及び４７Ｃ＞Ｔ変異型ＧＰＲ３０過剰発現による細胞増殖抑制が、アポトーシス誘導によるものか検証した。空ベクター、野生型、又は変異型ＧＰＲ３０発現ベクターをＨｅＬａ細胞に導入し、１００ｎＭ エストロゲンで２４時間処理した細胞を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）とＣｙ５（GE Healthcare社製）標識アネキシンＶで染色してフローサイトメトリー（BD FACSCalibur；Becton Dickinson 社製）で解析した。生細胞は細胞膜に損傷受けていないのでＰＩ色素は細胞内に透過しないが、細胞膜に損傷を受けている細胞は、ＰＩが細胞内へ透過するため染色される。まず、ＧＦＰ発現でゲートをかけてベクターが導入された細胞のみを選択し、さらにその後ＰＩ染色でゲートをかけて死細胞を除去した後、Ｃｙ５標識アネキシンＶの染色を検出することによりアポトーシス細胞をカウントした（図６）。
その結果、アポトーシスを起こした細胞（右半分；Ｍ１領域）がコントロールの細胞では４０．２％であるのに対し、野生型ＧＰＲ３０過剰発現では７０．２％と増加していることがわかった。さらに、１４Ｃ＞Ｔや４７Ｃ＞Ｔの変異型ＧＰＲ３０過剰発現では、アポトーシスを起こしている細胞の割合（それぞれ６０．１％、６０．２％）がコントロールより多く野生型ＧＰＲ３０より少なかった。この結果は図１の実験結果とよく対応しており、野生型ＧＰＲ３０過剰発現では癌細胞にアポトーシスが誘導されて細胞が死ぬことにより細胞増殖が低下するが、１４Ｃ＞Ｔや４７Ｃ＞Ｔの変異型ＧＰＲ３０では、このアポトーシス誘導機能が低下したために野生型ＧＰＲ３０過剰発現ほどの細胞増殖低下が起こらないと考えられる。
＜ＨｅＬａ細胞以外の細胞増殖における、変異型ＧＰＲ３０の機能＞
子宮頸がん細胞（ＨｅＬａ細胞）以外の細胞におけるＧＰＲ３０及び変異型ＧＰＲ３０過剰発現による細胞増殖への影響を調べるために、以下６種類の細胞に野生型ＧＰＲ３０、１４Ｃ＞Ｔ又は４７Ｃ＞Ｔ変異型ＧＰＲ３０をトランスフェクションし、図１と同様の手法にて細胞の増殖を調べた。
１）ヒト子宮頸がん由来ＨｅＬａ細胞（図７）
２）ヒト乳ガン由来ＭＣＦ−７細胞（図８）
３）マウス上皮由来３Ｔ３細胞（図９）
４）ヒト腎臓由来ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（図１０）
５）チャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ細胞（図１１）
６）ラット心臓由来Ｈ９ｃ２細胞（図１２）
子宮頸がん細胞（ＨｅＬａ細胞）以外の細胞におけるＧＰＲ３０及び変異型ＧＰＲ３０過剰発現による細胞増殖への影響を調べるために、以下６種類の細胞に野生型ＧＰＲ３０、１４Ｃ＞Ｔ又は４７Ｃ＞Ｔ変異型ＧＰＲ３０をトランスフェクションし、図１と同様の手法にて細胞の増殖を調べた。
１）ヒト子宮頸がん由来ＨｅＬａ細胞（図７）
２）ヒト乳ガン由来ＭＣＦ−７細胞（図８）
３）マウス上皮由来３Ｔ３細胞（図９）
４）ヒト腎臓由来ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（図１０）
５）チャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ細胞（図１１）
６）ラット心臓由来Ｈ９ｃ２細胞（図１２）
１）ＨｅＬａ細胞では、図１及び図３〜５の結果と同様に、野生型ＧＰＲ３０過剰発現により細胞増殖が強く抑制され、変異体ＧＰＲ３０過剰発現ではその細胞増殖抑制効果が減少したのに対し、２）〜６）の各細胞では、ＨｅＬａ細胞で得られた結果は再現されなかった。２）〜６）の細胞はＨｅＬａ細胞と異なり、過剰発現させたＦＬＡＧ−ＧＰＲ３０が適切な細胞内輸送を経て細胞膜上に局在しない、またエストロゲンシグナルを伝達できない可能性が考えられる。
ＨｅＬａ細胞におけるＦＬＡＧ−ＧＰＲ３０（１４Ｃ＞Ｔ）又はＦＬＡＧ−ＧＰＲ３０（４７Ｃ＞Ｔ）の過剰発現ではＦＬＡＧ−ＧＰＲ３０（野生型）過剰発現で見られる細胞増殖の抑制機能が損なわれており、子宮筋腫や乳がんといったエストロゲン依存性疾患における細胞の過剰な増殖という病態を再現している。すなわち、本実験系はエストロゲン依存性疾患の再現系であり、この系を用いてエストロゲン依存性疾患の治療薬のスクリーニングを行うことができる。
＜ヒト子宮筋腫におけるＧＰＲ３０発現量＞
ＧＰＲ３０遺伝子のＯＲＦに変異を含まない子宮筋腫の臨床サンプル及びＧＰＲ３０遺伝子に１４Ｃ＞Ｔ変異を含む子宮筋腫の臨床サンプルの組織、各約５ｍｇよりMagNA Pure LC mRNA Isolation kit2 （Roche社製；cat no.03172627001）を用いてｍＲＮＡを抽出し、表５に示す反応液を調製した。ランダムプライマーはTOYOBO社製（cat no.FSK-301）を使用した。この反応液をGeneAmp PCR system 2700（Applied bio systems社製）を用いて６５℃で５分間ヒートショックし、その後氷上に１分間置いて冷却した。
ＧＰＲ３０遺伝子のＯＲＦに変異を含まない子宮筋腫の臨床サンプル及びＧＰＲ３０遺伝子に１４Ｃ＞Ｔ変異を含む子宮筋腫の臨床サンプルの組織、各約５ｍｇよりMagNA Pure LC mRNA Isolation kit2 （Roche社製；cat no.03172627001）を用いてｍＲＮＡを抽出し、表５に示す反応液を調製した。ランダムプライマーはTOYOBO社製（cat no.FSK-301）を使用した。この反応液をGeneAmp PCR system 2700（Applied bio systems社製）を用いて６５℃で５分間ヒートショックし、その後氷上に１分間置いて冷却した。
このヒートショック後のｍＲＮＡをテンプレートとして用い、表６に示す反応液を調製し、GeneAmp PCR system 2700（Applied bio systems社製）を用いて２５℃で５分間、３７℃で６０分間、６５℃で２０分間順次反応させて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得た。逆転写酵素（Reverse Transcriptase）はM-MuLV Reverse Transcriptase（NEB社製 cat no.M0253L）を使用した。
得られたｃＤＮＡをテンプレートとして用い、表７に示す反応液を調製し、表８及び表９に示す条件のReal-time ＰＣＲにてＧＰＲ３０、ＥＲα、Ｇ３ＰＤＨ（グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素）のｍＲＮＡ量を定量した。ＧＰＲ３０の増幅に使用したプライマーは配列番号２５及び２６、ＥＲαの増幅に使用したプライマーは配列番号２７及び２８、Ｇ３ＰＤＨの増幅に使用したプライマーは配列番号２９及び３０に示される配列である。Ｇ３ＰＤＨの発現量をコントロールとして用いたΔΔＣｔ法により、各サンプルにおけるＥＲα及びＧＰＲ３０の相対発現量を算出した結果を図１３及び図１４に示す。
ＧＰＲ３０における変異の有無にかかわらず、ＥＲαのｍＲＮＡ発現量は同程度であったが（図１３）、ＧＰＲ３０のｍＲＮＡ発現量は１４Ｃ＞Ｔ変異を含む子宮筋腫サンプルのほうが多かった（図１４）。ＧＰＲ３０に１４Ｃ＞Ｔ変異を含む子宮筋腫では、ＧＰＲ３０が１４Ｃ＞Ｔ変異により細胞死誘導機能が低下しているため、ＧＰＲ３０に変異を含まない子宮筋腫に比べＧＰＲ３０の発現が高く、それにもかかわらず、筋腫が発生している可能性が考えられる。
＜ＧＰＲ３０遺伝子プロモーター依存的にＧＦＰタンパク質が発現するトランスジェニックマウス＞
ＧＰＲ３０遺伝子のプロモーター領域配列の下流にＧＦＰ遺伝子を有するＤＮＡを遺伝子導入し、ＧＰＲ３０遺伝子プロモーター依存的にＧＦＰタンパク質が発現するトランスジェニックマウスを作製した。ゲノムライブラリーのＧＰＲ３０遺伝子の染色体領域が挿入されているＢａｃｐａｃクローンから、制限酵素SalIおよびEcoRVで切り出した７．１ｋｂのＧＰＲ３０遺伝子を含む配列を、pBluescriptにクローニングした。次に、Ｎ末端側にSpeIサイト、EcoRVサイトをそれぞれ含むプライマーのセットで、ＧＰＲ３０遺伝子のプロモーター領域５．８ｋｂ（転写開始点までの領域であり、本明細書において、ＧＬＡ（ＧＰＲ３０ Long Arm）と表すこともある。）とpBluscriptが連結したＤＮＡ配列をＰＣＲ反応で増幅した。Ｎ末端側にSpeIサイト、EcoRVサイトをそれぞれ含むプライマーのセットで、pEGFP-N1からＥＧＦＰ（Enhanced Green Fluorescent Protein）-SV40 polyA配列を増幅し、増幅されたSpeI-ＥＧＦＰ-SV40 polyA-EcoRVを、上述のＧＰＲ３０のプロモーター領域とpBluscriptが連結したＤＮＡ配列にｉｎ ｆｕｓｉｏｎクローニングで組み込み、ターゲティングベクターpBluescript-ＧＬＡ-ＥＧＦＰ-SV40 polyAを作製した。ターゲティングベクターを制限酵素SalIおよびEcoRVで切り出し、全長約６．８ＫｂのリニアなＤＮＡを精製し、このＤＮＡをC57/BL6マウスの受精卵にマイクロインジェクションした。遺伝子を導入した受精卵をマウスの仮親に戻し、生まれたマウスのジェノタイピングを、ゲノムＤＮＡにおけるＧＬＡ−ＧＦＰ遺伝子をＥＧＦＰプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション法で検出することにより行い、ＧＬＡ−ＧＦＰを有するトランスジェニックマウスを選別した。図１５に、Ｎｏ．３及びＮｏ．１１マウスを掛け合わせて生まれたマウスのジェノタイピングの結果を一例として示した。
ＧＰＲ３０遺伝子のプロモーター領域配列の下流にＧＦＰ遺伝子を有するＤＮＡを遺伝子導入し、ＧＰＲ３０遺伝子プロモーター依存的にＧＦＰタンパク質が発現するトランスジェニックマウスを作製した。ゲノムライブラリーのＧＰＲ３０遺伝子の染色体領域が挿入されているＢａｃｐａｃクローンから、制限酵素SalIおよびEcoRVで切り出した７．１ｋｂのＧＰＲ３０遺伝子を含む配列を、pBluescriptにクローニングした。次に、Ｎ末端側にSpeIサイト、EcoRVサイトをそれぞれ含むプライマーのセットで、ＧＰＲ３０遺伝子のプロモーター領域５．８ｋｂ（転写開始点までの領域であり、本明細書において、ＧＬＡ（ＧＰＲ３０ Long Arm）と表すこともある。）とpBluscriptが連結したＤＮＡ配列をＰＣＲ反応で増幅した。Ｎ末端側にSpeIサイト、EcoRVサイトをそれぞれ含むプライマーのセットで、pEGFP-N1からＥＧＦＰ（Enhanced Green Fluorescent Protein）-SV40 polyA配列を増幅し、増幅されたSpeI-ＥＧＦＰ-SV40 polyA-EcoRVを、上述のＧＰＲ３０のプロモーター領域とpBluscriptが連結したＤＮＡ配列にｉｎ ｆｕｓｉｏｎクローニングで組み込み、ターゲティングベクターpBluescript-ＧＬＡ-ＥＧＦＰ-SV40 polyAを作製した。ターゲティングベクターを制限酵素SalIおよびEcoRVで切り出し、全長約６．８ＫｂのリニアなＤＮＡを精製し、このＤＮＡをC57/BL6マウスの受精卵にマイクロインジェクションした。遺伝子を導入した受精卵をマウスの仮親に戻し、生まれたマウスのジェノタイピングを、ゲノムＤＮＡにおけるＧＬＡ−ＧＦＰ遺伝子をＥＧＦＰプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション法で検出することにより行い、ＧＬＡ−ＧＦＰを有するトランスジェニックマウスを選別した。図１５に、Ｎｏ．３及びＮｏ．１１マウスを掛け合わせて生まれたマウスのジェノタイピングの結果を一例として示した。
遺伝子が導入されたマウスを交配し、１５９０、１５９１、１５９２の３系統の、染色体に遺伝子が挿入されているトランスジェニックマウスを得た。これらのマウスは、表１０に示す所見を示した。これら３系統のマウスそれぞれより、表１０に示す部位の組織を採取しＧＰＲ３０遺伝子及びＧＦＰ遺伝子の発現を調べ（図１６、図１７）、ＧＰＲ３０遺伝子及びＧＦＰ遺伝子の発現量に相関があるマウスを選別した。これら３系統のうち、１５９２系列のマウスは、ＧＰＲ３０の発現と相関するＧＦＰの発現が観察された。１５９２系列のマウスは、ＧＰＲ３０プロモーター依存的にＧＦＰ遺伝子が発現していると考えられる。
ＧＰＲ３０遺伝子プロモーター依存的にＧＦＰタンパク質が発現するトランスジェニックマウスの血管では、図１８に示すようにＧＦＰタンパク質が発現していることが確認された。このトランスジェニックマウスを利用することで、マウスを生きたまま、ＧＰＲ３０の発現を解析することが可能であり、例えば、ホルモン周期とＧＰＲ３０の発現の関係を観察することができる。また、今回確立した実施例３の手法によると、ＧＦＰの代わりにＧＰＲ３０配列を挿入したターゲティングベクターを作製してマウスに遺伝子導入することにより、１４Ｃ＞Ｔや４７Ｃ＞Ｔの変異型ＧＰＲ３０を発現するトランスジェニックマウスを作製することができる。
ＧＰＲ３０遺伝子における変異を検出することにより、疾患の予防又は治療法の判定に用いることができる。また、野生型及び変異型ＧＰＲ３０を過剰発現した細胞を用いたスクリーニングにより、ＧＰＲ３０を標的としたエストロゲン関連疾患の予防又は治療薬剤を開発する方法を提供する。
Claims (5)
- ヒトＧＰＲ３０遺伝子のＯＲＦに存在する一塩基多型を検出することを含むことを特徴とする子宮筋腫の判定を補助する方法であって、一塩基多型が、配列番号１に示される塩基配列の１４番目の塩基がシトシンではなくチミンである一塩基多型である方法。
- ヒトＧＰＲ３０遺伝子のＯＲＦに存在し、配列番号１に示される塩基配列の１４番目の塩基がシトシンではなくチミンである一塩基多型を含むＧＰＲ３０を発現し、野生型ＧＰＲ３０を発現する細胞株に比べて細胞死の程度が低いことを特徴とする細胞株。
- 請求項２記載の細胞株に被検物質を接触させ、１）細胞の増殖の程度を分析し、細胞の増殖を抑制する物質を選択する工程；又は２）細胞死の程度を分析し、細胞死を促進する物質を選択する工程；を含む子宮筋腫の治療薬のスクリーニング方法。
- ヒト又は非ヒト動物のＧＰＲ３０遺伝子のＯＲＦに存在し、配列番号１に示される塩基配列の１４番目の塩基がシトシンではなくチミンである一塩基多型、又は非ヒト動物のＧＰＲ３０ホモログ遺伝子に保存された、配列番号１に示される塩基配列の１４番目の塩基に相当するシトシンがチミンである一塩基多型を含むＧＰＲ３０を発現することを特徴とするトランスジェニック非ヒト動物。
- 請求項４記載の変異ＧＰＲ３０発現トランスジェニック非ヒト動物に被検物質を投与し、子宮筋腫の大きさを測定し、子宮筋腫を縮小させる物質を選択する工程を含む子宮筋腫の治療薬のスクリーニング方法。
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