JP5854423B2 - モヤモヤ病関連遺伝子及びその利用 - Google Patents
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Description
このコア領域のヌクレオチド配列を網羅的に解析したところ、5つの新たなSNPsが、KIAA1618(SNP1)、C17orf27(RNF213)(SNP2)、FLJ3520(SNP3)、NPTX1(SNP4)及びKIAA1303(SNP5)の各遺伝子内又はその近傍において同定された。これらのSNPsのマイナーアレルの頻度は、モヤモヤ病の発症とよく相関した。試験を行った全ての家族性のモヤモヤ病患者は、SNP2のマイナーアレルを保有していることから、SNP2のマイナーアレルが、アジア人のモヤモヤ病の創始者変異である可能性が示唆された。
このSNP2が位置する予測遺伝子C17orf27及び、SNP1が位置する予測遺伝子KIAA1618のクローニングを行ったところ、驚くべきことに、C17orf27及びKIAA1618はそれぞれ完全な構造遺伝子ではなく、C17orf27とKIAA1618とが1つにつながって、約5000アミノ酸からなる巨大なタンパク質をコードする1つの構造遺伝子を構成していることが明らかとなった。この新規遺伝子をミステリン(Mysterin)と命名した。
ミステリンの機能を解析したところ、E3リガーゼ活性及びATPase活性を有していた。
生体内でのミステリンの機能を解析するため、ヒトのミステリンに相同なゼブラフィッシュミステリン1のアンチセンスモルフォリノをゼブラフィッシュの受精卵に注入することにより、ミステリン1の蛋白発現が抑制されたゼブラフィッシュを作成した。ミステリン1のアンチセンスモルフォリノを注入した胚においては、初期血管発生は正常に進行したものの、それに続く血管新生に異常が見られた。また、ミステリン1の発現が抑制されたゼブラフィッシュにおいては目の周辺に特徴的な異常血管新生が見られた。これらの表現型から、ヒトのミステリンは血管構築の形成に重要な機能を有することが示唆された。
更に、SNP2が、虚血性心疾患の発症頻度や一卵性双生児の分娩頻度と関連することが示された。
更に、白人の家系においてもモヤモヤ病の発症と相関する新たなSNPsを見出した。
以上の知見に基づき、本発明が完成された。
[1]以下の(1)〜(3)から選択されるいずれかのポリペプチド:
(1)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド(ここで、配列番号2で表されるアミノ酸配列における第4810番のアルギニンはリジンに置換されていてもよい);
(2)配列番号2で表されるアミノ酸配列と45%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つユビキチンリガーゼ活性及びATPase活性を有するポリペプチド;及び
(3)配列番号2で表されるアミノ酸配列において1〜500個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つユビキチンリガーゼ活性及びATPase活性を有するポリペプチド。
[2][1]記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
[3][2]記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
[4][3]記載の発現ベクターで形質転換された形質転換体。
[5][1]記載のポリペプチドをコードする遺伝子の機能的欠損を含む非ヒト動物。
[6]血管新生異常の動物モデルとしての、[5]記載の非ヒト動物の使用。
[7][1]記載のポリペプチドをコードする遺伝子の機能的欠損を含む動物細胞。
[8]被検物質が[1]記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現または機能を調節し得るか否かを評価することを含む、血管新生調節剤の候補物質のスクリーニング方法。
[9]配列番号5で表されるヌクレオチド配列の連続した部分配列又はその相補配列を含むポリヌクレオチドであって、該部分配列は、4766 T>C(SNP1)、73097 G>A(SNP2)、120764 G>A(SNP3)、152917 G>A(SNP4)及び232102 G>A(SNP5)からなる群から選択される少なくとも1つのSNPを含み、該部分配列に含まれる該SNPのアレルはマイナーアレルであり、且つ該部分配列又はその相補配列は少なくとも12ヌクレオチドの長さを有する、ポリヌクレオチド。
[10]配列番号5で表されるヌクレオチド配列における4766 T>C(SNP1)、73097 G>A(SNP2)、120764 G>A(SNP3)、152917 G>A(SNP4)及び232102 G>A(SNP5)からなる群から選択される少なくとも1つのSNPを検出することを含む、モヤモヤ病の発症リスクの判定方法。
[11]該SNPが73097 G>A(SNP2)である、[10]記載の方法。
[12]配列番号5で表されるヌクレオチド配列における4766 T>C(SNP1)、73097 G>A(SNP2)、120764 G>A(SNP3)、152917 G>A(SNP4)及び232102 G>A(SNP5)からなる群から選択される少なくとも1つのSNPを特異的に検出し得る核酸プローブ、又は該SNPを含む領域を特異的に増幅し得るプライマーを含む、モヤモヤ病の発症リスクの診断剤。
[13]該SNPが73097 G>A(SNP2)である、[12]記載の診断剤。
[14]配列番号5で表されるヌクレオチド配列における73097 G>A(SNP2)のSNPを検出することを含む、虚血性心疾患の発症リスクの判定方法。
[15]配列番号5で表されるヌクレオチド配列における73097 G>A(SNP2)のSNPを特異的に検出し得る核酸プローブ、又は該SNPを含む領域を特異的に増幅し得るプライマーを含む、虚血性心疾患の発症リスクの診断剤。
[16]配列番号5で表されるヌクレオチド配列における73097 G>A(SNP2)のSNPを検出することを含む、一卵性双生児の分娩可能性の判定方法。
[17]配列番号5で表されるヌクレオチド配列における73097 G>A(SNP2)のSNPを特異的に検出し得る核酸プローブ、又は該SNPを含む領域を特異的に増幅し得るプライマーを含む、一卵性双生児の分娩可能性の診断剤。
[18]以下の(4)〜(7)から選択されるいずれかのポリペプチド:
(4)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド(ここで、配列番号2で表されるアミノ酸配列における第4013番のアスパラギン酸はアスパラギンに置換されている);
(5)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド(ここで、配列番号2で表されるアミノ酸配列における第3962番のアスパラギンはアスパラギン酸に置換されていてもよい);
(6)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド(ここで、配列番号2で表されるアミノ酸配列における第4062番のアルギニンはグルタミンに置換されていてもよい);及び
(7)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド(ここで、配列番号2で表されるアミノ酸配列が、R4810K、D4013N、N3962D及びR4062Qからなる群から選択される、2、3又は4個の置換を含んでいてもよい)。
[19][18]記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
[20][19]記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
[21][20]記載の発現ベクターで形質転換された形質転換体。
[22]配列番号5で表されるヌクレオチド配列の連続した部分配列又はその相補配列を含むポリヌクレオチドであって、該部分配列は、4766 T>C(SNP1)、73097 G>A(SNP2)、120764 G>A(SNP3)、152917 G>A(SNP4)、232102 G>A(SNP5)、55977 G>A(SNP6)、55712 A>G(SNP7)及び57483 G>A(SNP8)からなる群から選択される少なくとも1つのSNPを含み、該部分配列に含まれる該SNPのアレルはマイナーアレルであり、且つ該部分配列又はその相補配列は少なくとも12ヌクレオチドの長さを有する、ポリヌクレオチド。
[23]配列番号5で表されるヌクレオチド配列における4766 T>C(SNP1)、73097 G>A(SNP2)、120764 G>A(SNP3)、152917 G>A(SNP4)、232102 G>A(SNP5)、55977 G>A(SNP6)、55712 A>G(SNP7)及び57483 G>A(SNP8)からなる群から選択される少なくとも1つのSNPを検出することを含む、モヤモヤ病の発症リスクの判定方法。
[24]該SNPが55977 G>A(SNP6)である、[23]記載の方法。
[25]配列番号5で表されるヌクレオチド配列における4766 T>C(SNP1)、73097 G>A(SNP2)、120764 G>A(SNP3)、152917 G>A(SNP4)、232102 G>A(SNP5)、55977 G>A(SNP6)、55712 A>G(SNP7)及び57483 G>A(SNP8)からなる群から選択される少なくとも1つのSNPを特異的に検出し得る核酸プローブ、又は該SNPを含む領域を特異的に増幅し得るプライマーを含む、モヤモヤ病の発症リスクの診断剤。
[26]該SNPが55977 G>A(SNP6)である、[25]記載の診断剤。
[27]モヤモヤ病の発症リスクの診断において使用するための、配列番号5で表されるヌクレオチド配列における4766 T>C(SNP1)、73097 G>A(SNP2)、120764 G>A(SNP3)、152917 G>A(SNP4)、232102 G>A(SNP5)、55977 G>A(SNP6)、55712 A>G(SNP7)及び57483 G>A(SNP8)からなる群から選択される少なくとも1つのSNPを特異的に検出し得る核酸プローブ、又は該SNPを含む領域を特異的に増幅し得るプライマー。
[28]該SNPが4766 T>C(SNP1)、73097 G>A(SNP2)、120764 G>A(SNP3)、152917 G>A(SNP4)及び232102 G>A(SNP5)からなる群から選択される少なくとも1つである、[27]記載の核酸プローブ又はプライマー。
[29]該SNPが73097 G>A(SNP2)である、[27]記載の核酸プローブ又はプライマー。
[30]該SNPが55977 G>A(SNP6)である、[27]記載の核酸プローブ又はプライマー。
[31]虚血性心疾患の発症リスクの診断において使用するための、配列番号5で表されるヌクレオチド配列における73097 G>A(SNP2)のSNPを特異的に検出し得る核酸プローブ、又は該SNPを含む領域を特異的に増幅し得るプライマー。
[32]一卵性双生児の分娩可能性の診断において使用するための、配列番号5で表されるヌクレオチド配列における73097 G>A(SNP2)のSNPを特異的に検出し得る核酸プローブ、又は該SNPを含む領域を特異的に増幅し得るプライマー。
ミステリン遺伝子を発現抑制したゼブラフィッシュの解析等から、ミステリンは血管新生を調節する機能を有することが明らかとなった。従って、ミステリンの発現や機能を調節する物質をスクリーニングすることにより、新規機序に立脚した血管新生調節剤の候補物質を得ることが出来る。
また、本発明により、ミステリン遺伝子座またはその近傍に存在する新たなSNPsが提供される。該SNPsはモヤモヤ病、虚血性心疾患、一卵性双生児の分娩頻度と相関することから、このSNPsを解析することにより、モヤモヤ病や虚血性心疾患の発症リスクや、一卵性双生児の分娩可能性を判定することが可能である。
本発明は、以下の(1)〜(3)から選択されるいずれかのポリペプチドを提供するものである:
(1)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド(ここで、配列番号2で表されるアミノ酸配列における第4810番のアルギニンはリジンに置換されていてもよい);
(2)配列番号2で表されるアミノ酸配列と45%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つユビキチンリガーゼ活性及びATPase活性を有するポリペプチド;及び
(3)配列番号2で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つユビキチンリガーゼ活性及びATPase活性を有するポリペプチド。
(4)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド(ここで、配列番号2で表されるアミノ酸配列における第4013番のアスパラギン酸はアスパラギンに置換されていてもよい);
(5)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド(ここで、配列番号2で表されるアミノ酸配列における第3962番のアスパラギンはアスパラギン酸に置換されていてもよい);
(6)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド(ここで、配列番号2で表されるアミノ酸配列における第4062番のアルギニンはグルタミンに置換されていてもよい);及び
(7)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド(ここで、配列番号2で表されるアミノ酸配列が、R4810K、D4013N、N3962D及びR4062Qからなる群から選択される、2、3又は4個の置換を含んでいてもよい)。
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド(ここで、配列番号2で表されるアミノ酸配列における第4810番のアルギニンはリジンに置換されている);
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド(ここで、配列番号2で表されるアミノ酸配列における第4013番のアスパラギン酸はアスパラギンに置換されている);
(d)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド(ここで、配列番号2で表されるアミノ酸配列における第3962番のアスパラギンはアスパラギン酸に置換されている);
(e)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド(ここで、配列番号2で表されるアミノ酸配列における第4062番のアルギニンはグルタミンに置換されている);
(f)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド(ここで、配列番号2で表されるアミノ酸配列が、以下の群から選択されるいずれか1つの置換の組み合わせを含む;
R4810K+D4013N、
R4810K+N3962D、
R4810K+R4062Q、
D4013N+N3962D、
D4013N+R4062Q、
N3962D+R4062Q、
R4810K+D4013N+N3962D、
R4810K+D4013N+R4062Q、
R4810K+N3962D+R4062Q、
D4013N+N3962D+R4062Q、及び
R4810K+D4013N+N3962D+R4062Q);
(g)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(h)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド(ここで、配列番号2で表されるアミノ酸配列における第4810番のアルギニンはリジンに置換されている);
(i)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド(ここで、配列番号2で表されるアミノ酸配列における第4013番のアスパラギン酸はアスパラギンに置換されている);
(j)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド(ここで、配列番号2で表されるアミノ酸配列における第3962番のアスパラギンはアスパラギン酸に置換されている);
(k)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド(ここで、配列番号2で表されるアミノ酸配列における第4062番のアルギニンはグルタミンに置換されている);及び
(l)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド(ここで、配列番号2で表されるアミノ酸配列が、以下の群から選択されるいずれか1つの置換の組み合わせを含む;
R4810K+D4013N、
R4810K+N3962D、
R4810K+R4062Q、
D4013N+N3962D、
D4013N+R4062Q、
N3962D+R4062Q、
R4810K+D4013N+N3962D、
R4810K+D4013N+R4062Q、
R4810K+N3962D+R4062Q、
D4013N+N3962D+R4062Q、及び
R4810K+D4013N+N3962D+R4062Q)。
本発明は上記本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供するものである。
本発明は、上記本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び該発現ベクターを含む形質転換体を提供するものである。
本発明は、上記本発明のポリペプチドをコードする遺伝子(ミステリン遺伝子)の機能的欠損を含む非ヒト動物を提供する。
(a)ミステリン遺伝子の機能的欠損を含む胚性幹細胞を提供する工程;
(b)該胚性幹細胞を胚に導入し、キメラ胚を得る工程;及び
(c)該キメラ胚を動物に移植し、キメラ動物を得る工程。
(a)ミステリン遺伝子の機能的欠損を含む胚性幹細胞を提供する工程;
(b)該胚性幹細胞を胚に導入し、キメラ胚を得る工程;
(c)該キメラ胚を動物に移植し、キメラ動物を得る工程;及び
(d)該キメラ動物を交配させ、ミステリン遺伝子欠損ヘテロ接合体を得る工程。
本発明は、上記本発明のポリペプチドをコードする遺伝子(ミステリン遺伝子)の機能的欠損を含む動物細胞を提供する。
(a)ミステリン遺伝子の相同組換えを誘導し得るターゲティングベクターを提供する工程;
(b)該ターゲティングベクターを動物細胞に導入する工程;及び
(c)該ターゲティングベクターを導入した細胞から、相同組換えを生じた細胞を選別する工程。
後述の実施例に示すように、ミステリンの発現を抑制した動物においては、血管新生の異常が認められる。従って、本発明はまた、被検物質がミステリン遺伝子の発現または機能を調節し得るか否かを評価することを含む、血管新生調節剤の候補物質のスクリーニング方法、ならびに当該スクリーニング方法により得られる血管新生調節剤の候補物質を提供する。
(a)被検物質とミステリン遺伝子の発現を測定可能な細胞とを接触させる工程;
(b)被検物質を接触させた細胞におけるミステリン遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被検物質を接触させない対照細胞におけるミステリン遺伝子の発現量と比較する工程;及び
(c)上記(b)の比較結果に基づいて、ミステリン遺伝子の発現量を調節する被検物質を選択する工程。
(a)被検物質をミステリンポリペプチドに接触させる工程;
(b)被検物質の存在下でのミステリンポリペプチドの機能を測定し、該機能を被検物質の不在下におけるミステリンポリペプチドの機能と比較する工程;及び
(c)上記(b)の結果に基づいて、ミステリンポリペプチドの機能を調節する被検物質を選択する工程。
(a)被検物質をミステリンポリペプチドに接触させる工程;
(b)被検物質のミステリンポリペプチドに対する結合能を測定する工程;及び
(c)上記(b)の結果に基づいて、ミステリンポリペプチドに結合能を有する被検物質を選択する工程。
本発明は、配列番号5で表されるヌクレオチド配列の連続した部分配列又はその相補配列を含むポリヌクレオチドであって、該部分配列は、4766 T>C(SNP1)、73097 G>A(SNP2)、120764 G>A(SNP3)、152917G>A(SNP4)及び232102 G>A(SNP5)からなる群から選択される少なくとも1つのSNPを含み、該部分配列に含まれる該SNPのアレルはマイナーアレルであり、且つ該部分配列又はその相補配列は少なくとも12ヌクレオチドの長さを有する、ポリヌクレオチドを提供する。
T又はCである第4766位のSNP (本明細書中4766 T>C、又はSNP1と略記する)、
G又はAである第73097位のSNP (本明細書中73097 G>A、又はSNP2と略記する)、
G又はAである第120764位のSNP (本明細書中120764 G>A、又はSNP3と略記する)、
G又はAである第152917位のSNP (本明細書中152917 G>A、又はSNP4と略記する)、及び
G又はAである第232102位のSNP (本明細書中232102 G>A、又はSNP5と略記する)。
G又はAである第55977位のSNP (本明細書中55977 G>A、又はSNP6と略記する)、
A又はGである第55712位のSNP (本明細書中55712 A>G、又はSNP7と略記する)、及び
G又はAである第57483位のSNP (本明細書中57483 G>A、又はSNP8と略記する)。
本発明は、配列番号5で表されるヌクレオチド配列における4766 T>C(SNP1)、73097 G>A(SNP2)、120764 G>A(SNP3)、152917 G>A(SNP4)及び232102 G>A(SNP5)からなる群から選択される少なくとも1つのSNPを検出することを含む、モヤモヤ病の発症リスクの判定方法を提供する。
(a)動物から採取した生体試料について、配列番号5で表されるヌクレオチド配列におけるSNP1、SNP2、SNP3、SNP4及びSNP5からなる群から選択される少なくとも1つのSNPを検出する工程;
(b)検出したSNPのタイプに基づきモヤモヤ病の発症リスクを評価する工程。
(a’)動物から採取した生体試料について、配列番号5で表されるヌクレオチド配列におけるSNP1、SNP2、SNP3、SNP4、SNP5、SNP6、SNP7及びSNP8からなる群から選択される少なくとも1つのSNPを検出する工程;
(b’)検出したSNPのタイプに基づきモヤモヤ病の発症リスクを評価する工程。
SNP1におけるシトシン、
SNP2におけるアデニン、
SNP3におけるアデニン、
SNP4におけるアデニン、及び
SNP5におけるアデニン
からなる群から選択される少なくとも1つ(好ましくは2つ、更に好ましくは3つ、よりこのましくは4つ、最も好ましくは5つ)のマイナーアレルが、当該SNPにおける少なくとも一方のアレルにおいて検出された場合には、該マイナーアレルが検出されない場合と比較して、モヤモヤ病の発症リスクが、相対的に高いと判定することが出来る。特に、SNP2のマイナーアレル(アデニン)が検出された場合には、該マイナーアレルが検出されない場合と比較して、モヤモヤ病の発症リスクが、極めて高いと判定することが出来る。
SNP1におけるシトシン、
SNP2におけるアデニン、
SNP3におけるアデニン、
SNP4におけるアデニン、
SNP5におけるアデニン、
SNP6におけるアデニン、
SNP7におけるグアニン、及び
SNP8におけるアデニン
からなる群から選択される少なくとも1つ(好ましくは2つ、更に好ましくは3つ、よりこのましくは4つ、さらにより好ましくは5つ、6つ、7つ、最も好ましくは8つ)のマイナーアレルが、当該SNPにおける少なくとも一方のアレルにおいて検出された場合には、該マイナーアレルが検出されない場合と比較して、モヤモヤ病の発症リスクが、相対的に高いと判定することが出来る。特に、SNP2又はSNP6のマイナーアレル(SNP2のアデニン/SNP6のアデニン)が検出された場合には、該マイナーアレルが検出されない場合と比較して、モヤモヤ病の発症リスクが、極めて高いと判定することが出来る。
(1)配列番号5で表されるヌクレオチド配列における4766 T>C(SNP1)、73097 G>A(SNP2)、120764 G>A(SNP3)、152917 G>A(SNP4)及び232102 G>A(SNP5)からなる群から選択される少なくとも1つのSNP(好ましくはSNP2)を特異的に検出し得る核酸プローブ、又は
(2)該SNPを含む領域を特異的に増幅し得るプライマー
等を挙げることが出来る。
(1’)配列番号5で表されるヌクレオチド配列における4766 T>C(SNP1)、73097 G>A(SNP2)、120764 G>A(SNP3)、152917 G>A(SNP4)、232102 G>A(SNP5)、55977 G>A(SNP6)、55712 A>G(SNP7)及び57483 G>A(SNP8)からなる群から選択される少なくとも1つのSNP(好ましくはSNP2又はSNP6)を特異的に検出し得る核酸プローブ、又は
(2’)該SNPを含む領域を特異的に増幅し得るプライマー
等を挙げることが出来る。
本発明は、配列番号5で表されるヌクレオチド配列における73097 G>A(SNP2)を検出することを含む、虚血性心疾患の発症リスクの判定方法を提供する。
(a)動物(被検者)から採取した生体試料について、配列番号5で表されるヌクレオチド配列におけるSNP2を検出する工程;
(b)検出したSNPのタイプに基づき虚血性心疾患の発症リスクを評価する工程。
(1)配列番号5で表されるヌクレオチド配列における73097 G>A(SNP2)を特異的に検出し得る核酸プローブ、又は
(2)SNP2を含む領域を特異的に増幅し得るプライマー
等を挙げることが出来る。
本発明は、配列番号5で表されるヌクレオチド配列における73097 G>A(SNP2)を検出することを含む、一卵性双生児の分娩可能性の判定方法を提供する。
(a)動物から採取した生体試料について、配列番号5で表されるヌクレオチド配列におけるSNP2を検出する工程;
(b)検出したSNPのタイプに基づき一卵性双生児の分娩可能性を評価する工程。
(1)配列番号5で表されるヌクレオチド配列における73097 G>A(SNP2)を特異的に検出し得る核酸プローブ、又は
(2)SNP2を含む領域を特異的に増幅し得るプライマー
等を挙げることが出来る。
調査集団
本試験は、京都大学医学部の倫理委員会により承認されたものであり、全ての対象から書面によるインフォームドコンセントを取得した。本試験においては2つのタイプのモヤモヤ病症例参加者が登録された。第1のタイプは、血縁者に1人以上のモヤモヤ病症例が明確に存在するために、本研究へ参加するために選択された家系単位の参加者である。31人の日本人及び3人の韓国人を含む34人のモヤモヤ病家系発端者が本試験に登録された。診断の検証のため、血管病に属する病歴及び危険因子を発端者とその家系メンバーから収集した。京都大学病院又は他の協力病院へ入院した創始者家系のメンバーをリクルートした。患者の同意のもと、試料及び臨床データを採取し、非識別化し、蓄積した。第2のタイプは、家族歴が不明のモヤモヤ病の患者であり、同疾患に罹患した血縁者の存在が不明の症例として個人で本試験に参加した者であり、個人症例として分類された。これらの症例を、京都大学(n = 86)、韓国のソウル国立大学(n = 38)、中国の首都医科大学(n = 10)からリクルートした。対照として、384人の日本人、294人の韓国人、150人の中国人をリクルートした。核磁気共鳴血管撮影(MRA)スクリーニングを、全ての日本人対照について行ったが、韓国人については一部、中国人の対照については行わなかった。家系の創始者又は単発性の参加者についてのモヤモヤ病の診断は、もっぱら日本の診断基準である、いわゆるRCMJ(厚生労働省のモヤモヤ病の検討委員会、日本)診断基準に基づき行った(Clin Neurol Neurosurg, vol. 99, Suppl 2, pages S238-240, 1997)。
全部で17のモヤモヤ病家系について、17q25.3のゲノタイプを解析した。ゲノタイピング、マッピング及びハプロタイプ推定を以前記載したように実施した(Neurology vol70: 2357-2363,2008)。端的にいうと、ゲノムDNAを、QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany)を用いて、患者の血液試料から抽出した。17q25-qter連鎖領域について、5.1-Mbの間隔で、全部で13個のマーカー(D17S2195, D17S1847, D17S1806, D17S784, rs2071148, 125 rs2280147, rs2293099, D17S704, D17S668, D17S928, rs2291395, rs2279395 及び 126 rs2292971)についてゲノタイプした(Neurology vol70: 2357-2363,2008)。マーカーの位置は、NCBI Map Viewer (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/)から取得した。末梢血から抽出したゲノムDNAを蛍光でラベルをしたマーカーと共にPCRにより増幅し、PCR産物をABI Prism 3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA)及びGenescanプログラムを用いて解析した。詳細なマッピングマーカーは、NCBI Map Viewer (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/)からの物理位置情報に従い、デザインした。連鎖解析は、常染色体優性遺伝モデルを仮定した多点パラメトリック連鎖法を用いて行った(J Neurol Neurosurg Psychiatry, vo. 77, pages 1025-1029, 2006及びNeurology vol70: 2357-2363,2008)。以前に報告したように、必然的キャリアーは、発症した者として処理した(Neurology vol70: 2357-2363,2008)。当該家系において、非発症の個人の表現型は、「不明」とし、「非血縁」の配偶者は、「非発症」とした。100,000人あたり6.03人という観察された罹患率に基づけば(Stroke, vol. 39, pages 42-47, 2008)、疾患アレル頻度は、0.00003015に設定されるべきであるが、無症状であっても、磁気共鳴画像(MRI)及びMRAによりモヤモヤ病であると診断された患者の数が近年増加していることに鑑み、そのアレル頻度を、連鎖解析でLOD score を低めに算出する点から、より厳格と考えられる0.0001に設定した(J Clin Neurosci, vol. 13, pages 334-338, 2006;)。表現型模写頻度を0.00001と仮定した。各マイクロサテライトマーカーのアレル頻度は、全ての非血縁配偶者から、Merlinソフトウェアを用いて見積もった(Nat Genet, vol. 30, pages 97-101, 2002)。解析は、GENEHUNTER version 2.0 (http://www.broad.mit.edu/ftp/distribution/software/genehunter/)を用いて実施した(Am J Hum Genet, vol. 58, pages 1347-1363, 1996)。
家系20の個人132は、rs2280147とrs2293099との間での組換えを有していたので、更なる追加的なマーカー、即ち、rs71166116 (CHMP6), rs9896314 (AZI1), rs62075318 (AZI1) 及び P1026P (BAHCC1)により、3’隣接領域を決定した。家系20のハプロタイプは、4つのマーカーのアレル頻度を0.50に設定し、GENEHUNTER(Am J Hum Genet, vol. 58, pages 1347-1363, 1996)を用いて構築した。
KIAA1618、C17orf27(RNF213)、FLJ3520、NPTX1、CARD14、Raptor (KIAA1303)、AATK及びBAHCC1の、全てのコーディングエクソン、イントロン−エクソン境界、仮想的なプロモーター配列及び3’-UTRsを、4人の発症した個人(系統1、2、14及び15における個人12、1411、112及び12)についてのダイレクトシークエンシングにより解析した。コーディングエクソンのためのプライマーは、イントロン−エクソン境界から100ベースペア(bp)より離れたイントロン配列からデザインし、PROLIGO Primers & Probes (Kyoto, Japan; http://www.proligo.com)により商業的に合成した(Neurology vol70: 2357-2363,2008)。Raptorについては、第1エクソンの約2kbp上流の制御領域についてシークエンスした。PCR増幅及び精製の後に、ABI Prism 3100 Avant DNA Sequencer (Applied Biosystems)を用いてシークエンシングを実施した。我々は、Single Nucleotide Polymorphism database (dbSNP)を参考としてチェックした(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/index.html)。
(ミステリンのクローニング)
SNP2が位置する予測遺伝子C17orf27及びSNP1が位置する予測遺伝子KIAA1618のクローニングを行った。
Human Embryonic Kidney 293 細胞株から回収したmRNAから、逆転写により6つのcDNAフラグメントを得た。それらを内在性の制限酵素切断サイトを利用して結合し、全長cDNAを得た。
NCBIが開示しているKIAA1618及びC17orf27のエクソン構造と、今回同定されたミステリンのエクソン構造を比較した(表12)。KIAA1618のエクソン4及びC17orf27のエクソン13及び27が、ミステリンにおいてはスキップされていることが判明した。また、ストップコドンが存在すると考えられていたKIAA1618のエクソン18と、C17orf27のエクソン1との間に、8つのエクソンが存在することが明らかとなった。
C末端にMycエピトープを融合した全長ヒトミステリンタンパク質を、発現ベクターを用いてHEK293細胞に発現させた。推定550kDaの位置に発現がみられ、また、それらは細胞融解後、可溶性画分に回収された(図2)。
HAエピトープを融合した全長ヒトミステリンを、発現ベクターを用いてHela細胞株に発現させ、抗HA抗体を用いて細胞染色を行った。対照に用いたGFPは核を含む細胞質に一様に局在しているのに対してミステリンは主として細胞質ゾルに局在していた(図3)。
HAエピトープを融合した全長ヒトミステリン、あるいはRINGフィンガードメイン欠損ヒトミステリンおよび、Mycエピトープを融合したユビキチンを発現ベクターを用いてHEK293細胞株に共発現させ、抗HA抗体を用いて免疫沈降を行ったのち、抗Myc抗体を用いてウエスタンブロットを行った。自己ユビキチン化されたミステリンのシグナルがRINGフィンガードメイン依存的に検出されたことから、ミステリンがユビキチンリガーゼ活性を持つことが分かった(図4)。
ヒトミステリンのアミノ酸配列について、BLASTプログラムを用いたホモロジー解析を行った。その結果、第2415−2436アミノ酸および第2481−2494アミノ酸の領域がそれぞれ、既知のモチーフであるWalker AおよびWalker Bモチーフと強い相同性を示した(図5)。これらのモチーフは、ダイニン、プロテアソーム、p97、FtsHなどにおいて保存されたモチーフで、それぞれNTP結合モチーフ、二価陽イオン結合モチーフであり、この二つのモチーフが共役してATPase活性をもつことが知られている。このことから、ミステリンがATPase活性をもつことが予想された。
(ミステリン相補DNA断片の部位設定および作成)
ゼブラフィッシュ(Danio rerio)のミステリンオーソログ遺伝子は未同定であったので、ヒトミステリンのcDNA配列に基づき、ゼブラフィッシュのミステリン遺伝子を同定し、cDNAをクローニングした。その結果、2種類のミステリン1(zRNF213)およびミステリン2(zRNF213.1)が存在し、ミステリン1(zRNF213)が、ヒト相同の遺伝子と判明した。ゼブラフィッシュミステリン1のcDNA配列を配列番号3に、アミノ酸配列を配列番号4に、それぞれ示す。尚、配列番号3の第2538〜10462位のヌクレオチド(配列番号4では第847〜3487位のアミノ酸に相当)については、実際にクローニングを行い、実験的にヌクレオチド配列を決定した。残りの部分については、ゼブラフィッシュのゲノム配列を元にGENSCANにより遺伝子予測を行ったヌクレオチド配列を元に、アミノ酸予測を行った。同定された配列情報を元に、ミステリン遺伝子欠損体作成のための相補DNA断片(以下ミステリンアンチセンスモルフォリノ、以下ミステリンMOと略す)の配列を決定し、合成した。ミステリンMOのヌクレオチド配列を配列番号6及び7に示す。
zRNF213spMO1-A:ACTCGTTGATGTCTGAAGTGATAAA(配列番号6)
zRNF213spMO1-D:AGCTAGGAGAAAGTCCTACCAATTT(配列番号7)
ミステリンMOを受精卵に打ち込み、ゼブラフィッシュの発生初期に不完全なミステリンタンパク質を産生させることにより、生体内でミステリンが機能しない個体を作製した。詳細には、以下のようにして、ミステリン欠損ゼブラフィッシュを作成した。
ミステリンMOをインジェクションした胚およびインジェクションしていない野性型胚より全RNAを抽出し、ABI社の逆転写酵素およびランダムプライマー(High capacity cDNA reverse transcription Kit)を用いて、cDNAを合成した。続いてPCR法により、該当エクソン周辺のcDNAを増幅した。具体的にはタカラ社のtaqポリメラーゼ(eX Tag)を用いて反応系を調整し、ニップンテクノクラスタ社のサーマルサイクラー(Palm−Cycler)を用いてPCR(35サイクル)を行うことにより、エクソンスキップの効果を検証した。その結果、野性型胚ではターゲット配列から予測された通りの長さのPCR産物が得られることが確認された(図7)。一方、ミステリンMOをインジェクションした胚では、エクソンがスキップしたと思われる短いPCR産物が得られる結果となった。それぞれのPCR産物を単離しシークエンスを決定したところ、ミステリンMOは実験デザイン通りに有効に機能していることが示された。
蛍光実体顕微鏡、Leica MZ−16FA(ライカ マイクロシステムズ社)により、経時的にGFPの蛍光を観察した。その結果、野性型胚、ミステリンMOをインジェクションした胚ともに血管新生は生じた。一方、36hpf(hours post fertilization)あたりから、ミステリンMOをインジェクションした胚に発生の遅滞が起きていた。初期血管発生はほぼ正常に進行したものの、それに続く血管新生に異常が見られた(図8A及びB)。また、ミステリン発現抑制ゼブラフィッシュにおいては目の周辺に特徴的な異常血管新生が見られた。これらの表現型から、ミステリンは血管構築の形成に重要な機能を有することが示唆された。尾部および眼内における血管新生の異常は、対照(野性型)100個体を観察した中では全く認められなかったが、これに対して、実験群(ミステリンMO)では100匹中92匹にこの表現型が認められた。以上より、ミステリンは、血管構築に重要な機能を持つことが示唆された。
1998年に厚生労働省により行われた国民基礎生活調査の頻度をもとに虚血性心疾患の有病率を年齢階層でもとめ、観察値と比較した。その結果一般的に虚血性心疾患のリスクが低いと想定される35−54歳の比較的若年の女性で、SNP2のマイナーアレル(創始者変異)を有するものでは虚血性心疾患の有病率が有意に高いことが見いだされた(表13)。
SNP2のマイナーアレル(創始者変異)を有する家系では、264分娩中5例で一卵生双生児を認めた。日本における一卵性双生児の出生頻度はおおよそ1000分娩に対して4であると報告されているから(J Prev Soc Med, vol.30, pages 175-179, 1976;Int J Biometeorol, vol. 43, pages 91-95, 1999)、SNP2のマイナーアレルを有していると一卵性双生児の分娩可能性が高くなることが示された(オッズ比=約5、p<0.001)。
チェコ共和国の白人家系(CAU−Ped1、図11)とドイツの12の孤発例を対象に遺伝解析を行った。本家系の発端者(CAU_Ped1_12)は30歳時に軽度の虚血性脳卒中を発症しており、また彼の母は虚血性脳卒中により35歳時に死亡している。発端者は、2名の非血縁配偶者との間に4人の子孫をもうけた。第一の配偶者との第2子(CAU_Ped1_122)は5歳時にモヤモヤ病と診断された。第2の配偶者との第1子(CAU_Ped1_123)は9歳時に不随意運動ともなったモヤモヤ病を発症し、第2子(CAU_Ped1_124)は3歳時に虚血性脳卒中で発症しモヤモヤ病と診断された。モヤモヤ病の診断は磁気共鳴画像(MRI)にて行われ、発症者は全て日本のモヤモヤ病の診断基準を満たすことを確認した。遺伝形式から、典型的な常染色体優性遺伝形式に従うものと判断された。また我々はチェコ共和国のパラツキー大学、オロモウツ大学病院、ドイツのテュービンゲン大学、及びCoriell instituteより購入したCoriell Caucasian Panelより314人を白人対照群として解析を行った。対照群の平均年齢は31.8±14.0歳、男女比は129:185であり、MRIスクリーニングは未施行である。
配列番号5の55712位A>G;ヒトミステリンの第3962番のアミノ酸置換(アスパラギン→アスパラギン酸)(N3962D);及び
配列番号5の57483位G>A;ヒトミステリンの第4062番のアミノ酸置換(アルギニン→グルタミン)(R4062Q)。
ミステリン遺伝子のノックダウンゼブラフィッシュの解析等から、ミステリンは血管新生を調節する機能を有することが明らかとなった。従って、ミステリンの発現や機能を調節する物質をスクリーニングすることにより、新規機序に立脚した血管新生調節剤の候補物質を得ることが出来る。
また、本発明により、ミステリン遺伝子座またはその近傍に存在する新たなSNPsが提供される。該SNPsはモヤモヤ病、虚血性心疾患、一卵性双生児の分娩頻度と相関することから、このSNPsを解析することにより、モヤモヤ病や虚血性心疾患の発症リスクや、一卵性双生児の分娩可能性を判定することが可能である。
本出願は日本で出願された特願2009−244938(出願日:2009年10月23日)を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
Claims (19)
- 配列番号2で表されるアミノ酸配列(ここで、第4810番のアルギニンはリジンに置換されていてもよい)を含むポリペプチドの非ヒトオルソログをコードする遺伝子の機能を欠損させることにより得られる、血管新生異常を呈する非ヒト動物。
- 血管新生異常の動物モデルとしての、請求項1記載の動物の使用。
- 被検物質が以下の(1)〜(4)から選択されるいずれかのポリペプチドをコードする遺伝子の発現または機能を調節し得るか否かを評価することを含む、血管新生調節剤の候補物質のスクリーニング方法:
(1)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド(ここで、配列番号2で表されるアミノ酸配列における第4810番のアルギニンはリジンに置換されていてもよい);
(2)配列番号2で表されるアミノ酸配列と99.5%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つユビキチンリガーゼ活性及びATPase活性を有するポリペプチド;
(3)配列番号2で表されるアミノ酸配列において1〜30個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つユビキチンリガーゼ活性及びATPase活性を有するポリペプチド;及び
(4)(1)のポリペプチドの非ヒトオルソログ。 - 配列番号5で表されるヌクレオチド配列の連続した部分配列又はその相補配列を含むポリヌクレオチドであって、該部分配列は、4766 T>C(SNP1)、73097 G>A(SNP2)、120764 G>A(SNP3)、152917 G>A(SNP4)、232102 G>A(SNP5)、55977 G>A(SNP6)、55712 A>G(SNP7)及び57483 G>A(SNP8)からなる群から選択される少なくとも1つのSNPを含み、該部分配列に含まれる該SNPのアレルはマイナーアレルであり、且つ該部分配列又はその相補配列は少なくとも15ヌクレオチドの長さを有する、モヤモヤ病の発症リスクの診断用ポリヌクレオチドプライマー又はプローブ。
- 該SNPが、4766 T>C(SNP1)、73097 G>A(SNP2)、120764 G>A(SNP3)、152917 G>A(SNP4)及び232102 G>A(SNP5)からなる群から選択される少なくとも1つである、請求項4記載のポリヌクレオチドプライマー又はプローブ。
- 該SNPが73097 G>A(SNP2)である、請求項4記載のポリヌクレオチドプライマー又はプローブ。
- 該SNPが55977 G>A(SNP6)である、請求項4記載のポリヌクレオチドプライマー又はプローブ。
- (a)ヒトから採取した生体試料について、配列番号5で表されるヌクレオチド配列における4766 T>C(SNP1)、73097 G>A(SNP2)、120764 G>A(SNP3)、152917 G>A(SNP4)、232102 G>A(SNP5)、55977 G>A(SNP6)、55712 A>G(SNP7)及び57483 G>A(SNP8)からなる群から選択される少なくとも1つのSNPを検出すること、
(b)少なくとも一方のアレルにおいて該SNPを含むマイナーアレルが検出された場合、該SNPを含むマイナーアレルが検出されない場合と比較して、モヤモヤ病の発症リスクが相対的に高いという基準と、(a)の検出結果とを比較すること
を含む、モヤモヤ病の発症リスクの試験方法。 - 該SNPが、4766 T>C(SNP1)、73097 G>A(SNP2)、120764 G>A(SNP3)、152917 G>A(SNP4)及び232102 G>A(SNP5)からなる群から選択される少なくとも1つである、請求項8記載の方法。
- 該SNPが73097 G>A(SNP2)である、請求項8記載の方法。
- 該SNPが55977 G>A(SNP6)である、請求項8記載の方法。
- 配列番号5で表されるヌクレオチド配列における4766 T>C(SNP1)、73097 G>A(SNP2)、120764 G>A(SNP3)、152917 G>A(SNP4)、232102 G>A(SNP5)、55977 G>A(SNP6)、55712 A>G(SNP7)及び57483 G>A(SNP8)からなる群から選択される少なくとも1つのSNPを特異的に検出し得る核酸プローブ、又は該SNPを含む領域を特異的に増幅し得るプライマーを含む、モヤモヤ病の発症リスクの診断剤。
- 該SNPが、4766 T>C(SNP1)、73097 G>A(SNP2)、120764 G>A(SNP3)、152917 G>A(SNP4)及び232102 G>A(SNP5)からなる群から選択される少なくとも1つである、請求項12記載の診断剤。
- 該SNPが73097 G>A(SNP2)である、請求項12記載の診断剤。
- 該SNPが55977 G>A(SNP6)である、請求項12記載の診断剤。
- (a)ヒトから採取した生体試料について、配列番号5で表されるヌクレオチド配列における73097 G>A(SNP2)のSNPを検出すること、及び
(b)少なくとも一方のアレルにおいて該SNP2を含むマイナーアレルが検出された場合、該マイナーアレルを含まない場合と比較して、虚血性心疾患の発症リスクが相対的に高いという基準と、(a)の検出結果とを比較すること
を含む、虚血性心疾患の発症リスクの試験方法。 - 配列番号5で表されるヌクレオチド配列における73097 G>A(SNP2)のSNPを特異的に検出し得る核酸プローブ、又は該SNPを含む領域を特異的に増幅し得るプライマーを含む、虚血性心疾患の発症リスクの診断剤。
- (a)ヒトから採取した生体試料について、配列番号5で表されるヌクレオチド配列における73097 G>A(SNP2)のSNPを検出すること、及び
(b)少なくとも一方のアレルにおいて該SNP2を含むマイナーアレルが検出された場合、該マイナーアレルを含まない場合と比較して、一卵性双生児を分娩する頻度が相対的に高いという基準と、(a)の検出結果とを比較すること
を含む、一卵性双生児の分娩可能性の試験方法。 - 配列番号5で表されるヌクレオチド配列における73097 G>A(SNP2)のSNPを特異的に検出し得る核酸プローブ、又は該SNPを含む領域を特異的に増幅し得るプライマーを含む、一卵性双生児の分娩可能性の診断剤。
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JP2005514903A (ja) * | 2001-05-18 | 2005-05-26 | インサイト・ゲノミックス・インコーポレイテッド | 受容体と膜結合タンパク質 |
WO2009042680A2 (en) * | 2007-09-24 | 2009-04-02 | Board Of Regents Of The University Of Texas System | Detection of mutations in acta2 and myh11 for assessing risk of vascular disease |
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2010
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WO2009042680A2 (en) * | 2007-09-24 | 2009-04-02 | Board Of Regents Of The University Of Texas System | Detection of mutations in acta2 and myh11 for assessing risk of vascular disease |
Non-Patent Citations (2)
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JPN6010073474; MINEHARU,Y. et al.: 'Autosomal dominant moyamoya disease maps to chromosome 17q25.3' Neurology Vol.70, 2008, p.2357-2363 * |
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Also Published As
Publication number | Publication date |
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