WO2004093912A1 - 好中球性炎症疾患の予防および／または治療剤 - Google Patents

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hydrogen
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Mayumi Saki
Hiromi Nonaka
Hiromasa Miyaji
Chisa Takahashi
Haruhiko Manabe
Naoko Hiura
Ichiro Miki
Yuzuru Abe
Katsutoshi Sasaki
Choei Kobatake
Shunji Ichikawa
Akihisa Goto
Toshio Suda
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Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd.
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    • C07D471/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains two hetero rings
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Definitions

  • the present invention relates to a prophylactic and / or therapeutic agent for neutrophilic inflammatory diseases, which contains, as an active ingredient, a substance that suppresses the function related to GPR4 signal transduction.
  • the present invention also relates to a prophylactic and / or therapeutic agent for neutrophilic inflammatory diseases comprising a nitrogen-containing tricyclic compound or a quaternary ammonium salt thereof or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient. . ⁇
  • Neutrophils infiltrate the inflamed area, produce superoxydion ions, tumor inflammatory cytokines such as tumor necrosis factor (TNF) -hi, etc., and have the effect of promoting inflammation.
  • TNF tumor necrosis factor
  • Neutrophils have been implicated in various inflammatory diseases such as chronic obstructive pulmonary disease (C0PD), arthritis, sepsis, ischemia-reperfusion injury and pulmonary fibrosis (Laboratory — 'Investigation (Laboratory) Investigation), 2000, Vol. 80, p. 617-653).
  • C0PD chronic obstructive pulmonary disease
  • Sepsis ischemia-reperfusion injury
  • pulmonary fibrosis fibrosis
  • Neutrophil infiltration is also induced by neutrophil chemotactic factors. Therefore, suppressing neutrophil migration factor production or neutrophil infiltration is thought to be important in the treatment of these inflammatory diseases.
  • Inflammatory diseases involving neutrophils include C0PD, arthritis, sepsis, ischemia-reperfusion injury and pulmonary fibrosis, as well as emphysema, chronic bronchitis, acute respiratory distress syndrome (ARDS), acute lung disease Injury (ALI), rhinitis, sarcoidosis, interstitial pneumonia, rheumatoid arthritis, pett's disease, Zwögren's syndrome, scleroderma, psoriasis, arthro- dermatitis, contact dermatitis, rash, vasculitis, erythema Conjunctivitis, eosinophilia, puddle meningitis, alopecia areata, eczema, lichen planus, bullous disease, pemphigus, proctitis, eosinophilic gastroenteritis, mastocytosis, Crohn's disease, ulcerative colon Inflammation, food allergy, multiple sclerosis, at
  • GPR4 is a G protein-coupled receptor protein (hereinafter abbreviated as GPCR). It binds to the lipid sphingosylphosphorylcholine (SPC) and lysophosphatidylcholine (LPC) to transmit signals and to express GPR4-expressing cells. It has been reported to induce the migration of J. Biol. Chem., 276, p. 41325-41335 (2001)].
  • GPCR G protein-coupled receptor protein
  • a GPCR called a constitutively active GPCR which, when overexpressed in a cell, allows a signal to flow even in the absence of a ligand.
  • the signal that flows in the absence of ligand is called constitutive activity.
  • Constitutively active GPCRs include naturally occurring ones and mutant GPCRs created by introducing mutations such as amino acid substitutions and deletions [Molecular 'Pharmacol., Vol. 57, vol. , 890 pages (2000), W098 / 46995].
  • Antagonists that suppress the constitutive activity of GPCRs are called inverse gonists.
  • R 1 represents morpholino
  • R 2 , R 3 and R 4 represent hydrogen
  • the substituent corresponding to Y is morpholino
  • An object of the present invention is to provide a prophylactic and / or therapeutic agent for neutrophilic inflammatory disease containing a substance that suppresses a function related to GPR4 signal transduction as an active ingredient, a nitrogen-containing tricyclic compound or a quaternary ammonium salt thereof, or a quaternary ammonium salt thereof.
  • a prophylactic and / or therapeutic agent for neutrophilic inflammatory diseases comprising a pharmacologically acceptable salt of the following as an active ingredient, a compound represented by the following formula (II) or a quaternary ammonium salt thereof, or
  • An object of the present invention is to provide a prophylactic and / or therapeutic agent for neutrophilic inflammatory diseases, which comprises a pharmacologically acceptable salt of the above as an active ingredient.
  • the present invention relates to the following (1) to (13).
  • a prophylactic and / or therapeutic agent for neutrophilic inflammatory diseases which comprises, as an active ingredient, a substance that suppresses a signal transduction function of a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11. '
  • a preventive and / or therapeutic agent for neutrophilic inflammatory disease comprising any one of the above as an active ingredient.
  • R 1 is a substituted or unsubstituted heterocyclic group
  • -R 5 R 6 (wherein R 5 and R 6 are the same or different and are hydrogen, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted Represents a cycloalkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted lower alkynyl, substituted or unsubstituted aralkyl, or substituted or unsubstituted heterocyclic alkyl, or R 5 and R s are Together with an adjacent nitrogen atom to form a substituted or unsubstituted heterocyclic group), -OR 7 (wherein R 7 is hydrogen, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted lower alkanoyl) Substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted
  • R 3 and R 4 are the same or different and represent hydrogen, lower alkyl, or halogen
  • n 0 or 1
  • Z 1 and Z 2 are the same or different and are hydrogen, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted lower alkynyl, substituted or unsubstituted Represents an aryl, a substituted or unsubstituted aralkyl, or a substituted or unsubstituted heterocyclic alkyl, or a substituted or unsubstituted aromatic wherein Z 1 and Z 2 are taken together with the two carbon atoms to which they are adjacent. Z 1 and Z 2 together with two adjacent carbon atoms form a substituted or unsubstituted heterocyclic ring; or
  • Z 3 is hydrogen, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted lower alkynyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted A heterocyclic group, substituted or unsubstituted aralkyl, or substituted or unsubstituted heterocyclic alkyl)] or a quaternary ammonium salt thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • a prophylactic and / or therapeutic agent for neutrophilic inflammatory disease comprising a salt acceptable for neutrophils as an active ingredient.
  • R A is hydrogen, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted lower alkynyl, substituted or unsubstituted aryl.
  • R A represents a substituted or unsubstituted aralkyl, a substituted or unsubstituted acoyl, a substituted or unsubstituted heterocyclic group, or a substituted or unsubstituted heterocyclic alkyl,
  • Q is a substituted or unsubstituted Me phenylene (where location substituent in the substituted Fuweniren is Shiano, nitro, C0NH 2, - NHS0 in 2 R Q (wherein, R Q is as defined above R A) and a lower Sub
  • a group in which two hydrogen atoms have been removed from a 7-membered monocyclic heterocyclic ring (however, a substituted unsaturated or 2- to 6-carbon atom arbitrarily selected from nitrogen, oxygen and sulfur) Partially unsaturated 5- to 7-membered monocyclic heterocycles Kicking substituents Shiano, nitro, C0NH 2, - NHS0 2 R Q (wherein ⁇ is as defined above R A), and not a lower Arukogishi force Ruponiru), nitrogen C4-10, oxygen and Two hydrogen atoms are removed from a substituted or unsubstituted unsaturated or partially unsaturated bicyclic heterocyclic ring having 8 to 11 atoms arbitrarily selected from sulfur and having 1 to 4 atoms.
  • bicyclic ring having 4 to 10 carbon atoms and optionally 1 to 4 atoms selected from nitrogen, oxygen and sulfur and having 8 to 11 unsaturated or partially unsaturated ring constituent atoms
  • a group in which two hydrogen atoms have been removed from a heterocycle is
  • X is x [where R x is hydrogen, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted lower alkanol, substituted or unsubstituted cycloalkylcarbonyl, substituted or unsubstituted Represents a substituted aryl, a substituted or unsubstituted aralkyl, a substituted or unsubstituted aroyl or a substituted or unsubstituted aromatic heterocyclic group (excluding tetrazolyl)], an oxygen atom or a sulfur atom ,
  • Y is a nitrogen atom or CR X1 (where R xl is hydrogen, lower alkyl, Same or different selected from the group consisting of: lower alkyl substituted with 1 to 3 substituents [Substituent group A: halogen, hydroxy, formyl, trifluoromethyl, vinyl, styryl, phenyletinyl, aroyl, substituted or unsubstituted Alicyclic heterocyclic group and substituted or unsubstituted aromatic heterocyclic group (excluding tetrazolyl)], substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted lower alkanol, substituted or unsubstituted cycloalkylcarbo ; le, if substituted Ku is unsubstituted Ariru, substituted or unsubstituted Ararukiru, substituted or unsubstituted Aroiru, substituted or unsubstituted aromatic Hajime Tamaki (
  • R 7x CR 8x
  • R 7x and R 8x are the same or different and are hydrogen, lower alkoxycarbonyl, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted Substituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted lower alkanoyl, substituted or unsubstituted cycloalkylcarbonyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted aroyl or substituted or unsubstituted aromatic complex ring Represents a group (excluding tetrazolyl)] or C ⁇ C,
  • R 6 is hydrogen, lower alkoxycarbonyl, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted lower alkanol, substituted or unsubstituted cycloalkylcarbonyl, substituted or unsubstituted Represents aryl, substituted or unsubstituted arylo or substituted or unsubstituted aromatic heterocyclic group (excluding tetrazolyl) ⁇
  • nal represents an integer of 0 to 3, and al and "are the same or different and are hydrogen, halogen, lower alkoxycarbonyl, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted Or unsubstituted lower alkanoyl, substituted or unsubstituted cycloalkylcarbonyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted arylo, or substituted or unsubstituted aromatic heterocyclic group (excluding tetrazolyl).
  • R 9al and R 9bl together with adjacent carbon atoms form a saturated aliphatic ring
  • R 1Qx is substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted lower alkanol, substituted or unsubstituted cycloalkylcarbonyl, substituted or unsubstituted aralkyl, substituted or unsubstituted Represents aryl, substituted or unsubstituted aroyl or substituted or unsubstituted aromatic heterocyclic group (excluding tetrazolyl)].] Represents nitrogen atom with 4 to 10 carbon atoms; A group in which two hydrogen atoms have been removed from a substituted or unsubstituted bicyclic heterocyclic ring having 8 to 11 ring atoms and having 1 to 4 atoms arbitrarily selected from oxygen and sulfur The substituents in are not nitro, cyano and lower alkoxycarbonyl>,
  • R s is hydrogen, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted lower alkynyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted Aralkyl, substituted or unsubstituted aroyl, substituted or unsubstituted heterocyclic group, substituted or unsubstituted heterocyclic alkyl, halogen, cyano, nitro, hydroxy, carboxy, amino, lower alkoxy, or mono- or di-lower Represents alkylamino,
  • Ring E represents a benzene ring or an aromatic heterocyclic ring having at least one element selected from nitrogen, oxygen and sulfur.
  • R S1 , R T , RU and R v are the same or different and are hydrogen, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted A substituted or unsubstituted aryl, a substituted or unsubstituted aralkyl, a substituted or unsubstituted arylo, a substituted or unsubstituted heterocyclic group, a substituted or unsubstituted heterocyclic alkyl, halogen, cyano, Nitro, hydroxy, carboxy, amine R, R u and R v are the same or different and may be lower alkoxycarbonyl or mono- or di-lower alkylaminocarbonyl, and T is single bond, - 0-, - S -, -SO-, - S0 2 -, -
  • U is a single bond,-(C3 ⁇ 4) ml CR3 ⁇ 4 P- (where ml represents an integer of 0 to 2, and R K and R p are the same or different, each of which is synonymous with R A ), Or a substituted or unsubstituted phenylene,
  • V is carboxy, tetrazole - 5-I le, - C0NH 2, - C0NHS.0 2 R Q (wherein, R Q is as defined before Symbol R A), -S0 3 R Q (wherein, R Q the same meanings as defined above) is, - S0 2 NHR Q (wherein is as defined above), - S0 in 2 NHC0R Q (wherein, R Q is as defined above), -S0 2 NHC0NR RA R EB (where R RA and H RB are the same or different and are each the same as R A ),-Maraudal S0 2 R Q (where R Q is as defined above),-P ( 0) (0R) (0R RD ), wherein R RC and R are the same or different and each has the same meaning as R A , represents a substituted or unsubstituted lower alkoxycarbonyl, cyano, or nitro ⁇
  • quaternary ammonium salt thereof or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient a prophylactic and / or therapeutic agent for neutrophilic inflammatory diseases.
  • R s , R T , Hu and R v are the same or different and are hydrogen, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted Substituted lower alkynyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted aralkyl, substituted or unsubstituted arylo, substituted or unsubstituted heterocyclic group, substituted or unsubstituted heterocyclic alkyl, Represents halogen, cyano, nitro, hydroxy, carboxy, amino, lower alkoxy, or mono- or di-lower alkylamino, wherein A 5 and A 6 are as defined above,
  • B 3 , B 4 and B 5 are the same or different and represent -0- or -S-,
  • Ring E represents a benzene ring or an aromatic heterocyclic ring having at least one element selected from nitrogen, oxygen and sulfur.
  • the present invention relates to the following (14) to (48).
  • n, RR 2 , R 3 , R ⁇ X and Y are as defined above, or a quaternary ammonium salt thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof. Salt.
  • Z 1 and Z 2 are the (1 4) forming the same it is together such connexion location ⁇ or unsubstituted two carbon atoms adjacent heterocyclic claim, second (1 7) any claim Or a quaternary ammonium salt thereof or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • test compound a substance that reduces neutrophil infiltration in bronchoalveolar veins induced by SPC or LPC;
  • a method for screening a therapeutic agent for neutrophilic inflammatory disease comprising:
  • a method for preventing and / or treating a neutrophilic inflammatory disease which comprises administering an effective amount of a substance that suppresses a signal transduction function of a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11.
  • a neutrophilic inflammatory disease characterized by administering an effective amount of any one of the oligonucleotides or the oligonucleotide derivatives according to any one of (1) to (4) described in (3). Prevention and / or treatment methods.
  • a method for preventing and / or treating neutrophilic inflammatory disease which comprises administering an effective amount of any one of the antibodies of (1) to (4) described in (4).
  • the neutrophilic inflammatory disease is a neutrophilic inflammatory disease selected from arthritis, sepsis and acute respiratory distress syndrome (ARDS). Or a therapeutic agent.
  • Neutrophilic inflammatory diseases include chronic obstructive pulmonary disease (C0PD), arthritis, sepsis and And neutrophilic inflammatory diseases selected from acute respiratory distress syndrome (ARDS)
  • C0PD chronic obstructive pulmonary disease
  • ARDS acute respiratory distress syndrome
  • the neutrophilic inflammatory disease is a neutrophilic inflammatory disease selected from chronic obstructive pulmonary disease (C0PD), arthritis, sepsis, and acute respiratory distress syndrome (ARDS).
  • C0PD chronic obstructive pulmonary disease
  • ARDS acute respiratory distress syndrome
  • C0PD Chronic obstructive pulmonary disease
  • arthritis sepsis and acute
  • ARDS respiratory distress syndrome
  • ARDS respiratory distress syndrome
  • SEQ ID NO: for the manufacture of a prophylactic and / or therapeutic agent for neutrophilic inflammatory disease selected from chronic obstructive pulmonary disease (C0PD), arthritis, sepsis and acute respiratory distress syndrome (ARDS)
  • C0PD chronic obstructive pulmonary disease
  • ARDS acute respiratory distress syndrome
  • a prophylactic and / or therapeutic agent for neutrophilic inflammatory diseases selected from chronic obstructive pulmonary disease (C0PD), arthritis, sepsis and acute respiratory distress syndrome (ARDS), Use of the oligonucleotide or the oligonucleotide derivative according to any one of 1) to 4) described in the item 3).
  • C0PD chronic obstructive pulmonary disease
  • ARDS acute respiratory distress syndrome
  • the nitrogen-containing tricyclic compound or the quaternary ammonium salt thereof or the pharmacologically acceptable salt thereof according to any one of the above items (5) to (9) is contained as an active ingredient.
  • An effective amount of the nitrogen-containing tricyclic compound or the quaternary ammonium salt thereof or the pharmacologically acceptable salt thereof according to any of the items (5) to (9) is administered.
  • the nitrogen-containing tricyclic compound or the quaternary ammonium salt thereof or the pharmacologically acceptable salt thereof as described in any of the above items (5) to (9) is contained as an active ingredient.
  • ARDS acute respiratory distress syndrome
  • the present inventors have found a new finding that a substance that suppresses the signal transduction function of GPR4, which is a GPCR, is effective for the prevention and / or treatment of neutrophilic inflammatory diseases, and completes the present invention. Reached.
  • the present inventors also searched for a substance that suppresses the constitutive activity of GPR4, which is a constitutively active GPCR, and the substance that suppresses the constitutive activity of GPR4 prevents the neutrophilic inflammatory disease and / or Or found that it is effective for treatment.
  • Substances that suppress the function of GPR4 related to signal transduction include substances that inhibit or suppress the expression of GPR4 itself, substances that inhibit the binding of ligand to GPR4, and signal transduction caused by ligand binding to GPR4 [for example, intracellular A substance that suppresses changes in cAMP concentration, changes in intracellular Ca 2+ concentration, mitogen-activated protein (MAP) kinase, etc.], and signaling caused by the constitutive activity of GPR4 Substances that suppress GPR4 (eg, include inverse agonists of GPR4), substances that reduce GPR4-expressing cells due to antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC activity), and the like are included.
  • substances that suppress GPR4 eg, include inverse agonists of GPR4
  • ADCC activity antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • GPR4 Is for example, a protein having the amino acid sequence of any one selected from SEQ ID NOs: 11, 13 and 17, or one in the amino acid sequence of any one selected from SEQ ID NOs: 11, 13 and 17. Proteins having the amino acid sequence in which the above amino acids have been deleted, substituted or added, and having a function related to signal transduction of a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 and the like can be mentioned.
  • Neutrophilic inflammatory diseases include C0PD, ischemia-reperfusion injury, emphysema, chronic bronchitis, AMS, ALI, rhinitis, sarcoidosis, interstitial pneumonia, pulmonary fibrosis, sepsis, arthritis, rheumatoid arthritis, Ichthys disease, Sjogren's syndrome, scleroderma, psoriasis, atopic dermatitis, contact dermatitis, pulmonary measles, vasculitis, erythema, 'conjunctivitis, eosinophilia, bud's meningitis, alopecia areata Eczema, lichen planus, bullous disease, pemphigus, proctitis, eosinophilic gastroenteritis, mastocytosis, Crohn's disease, ulcerative colitis, food allergy, multiple sclerosis, atherosclerosis , AIDS, systemic l
  • amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 11, 13 and 17 has an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added, and the amino acid sequence IJ of SEQ ID NO: 11 has been deleted.
  • Proteins having functions related to signal transduction of proteins having the same are described in the literature [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) (hereinafter abbreviated as Molecular Cloning 2nd Edition)], Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley h Sons (1987-1997) (hereinafter abbreviated as current protocol 'in' molecular 'biology), Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the number of amino acids deleted, substituted or added is not particularly limited, but is 1 to several tens, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and still more preferably 1 to 5.
  • Deletion, substitution or addition of one or more amino acid residues in the amino acid sequence of any one selected from SEQ ID NOs: 11, 13 and 17 means that any one or more amino acid residues in the amino acid sequence Means that there is a deletion, substitution or addition of one or more amino acid residues at a plurality of positions; the deletion, substitution or addition may occur simultaneously;
  • the amino acid residue may be either natural or non-natural.
  • Natural amino acid residues include L-alanine, L-asparagine, aspartic acid, L-glumin, L-gluminic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, 'L-leucine, L- Residues of lysine, L-arginine, L-methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine and L-cystine No. '
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, NO, 'phosphorus, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, 0-methylserine, tert-butylglycine, tert-butylylalanine, cyclohexylalanine
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosperic acid
  • Group D lysine, arginine, orditin, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid
  • Group E Proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline
  • Group F serine, threonine, homoserine
  • Group G Phenylalanine, Tyrosine
  • amino acid sequence and nucleotide sequence identity can be determined by the algorithm of Karlin and Aitschul B'LAST [Pro. Natl, Acad. Sci.
  • Examples of the substance that inhibits or suppresses the expression of GPR4 itself include, for example, complementary oligonucleotides consisting of 15 to 60 consecutive nucleotides selected from the nucleotide sequence of any one selected from SEQ ID NOs: 12, 14, and 18.
  • An oligonucleotide having a sequence (hereinafter, also referred to as an antisense oligonucleotide), having a base sequence of any one selected from SEQ ID NOs: 12, 14, and 18, and hybridizing under stringent conditions; Oligonucleotides that inhibit or suppress the expression of the protein having the amino acid sequence described in 11, and derivatives of these oligonucleotides (hereinafter, referred to as oligonucleotide derivatives).
  • the above antisense oligonucleotides include SEQ ID NOs: 12, 14 and
  • the antisense oligonucleotide is not particularly limited as long as it is an antisense oligonucleotide having a complementary sequence of an oligonucleotide consisting of 15 to 60 consecutive nucleotides selected from the base sequence described in any one selected from 18, but is preferably 17 to
  • An antisense 'oligonucleotide having a complementary sequence of an oligonucleotide consisting of 60 bases, more preferably 20 to 60 bases, and still more preferably 30 to 60 bases, may be mentioned.
  • an antisense 'oligonucleotide having a sequence complementary to the translation initiation region of the above-mentioned oligonucleotide.
  • the antisense oligonucleotide is prepared by a conventional method, for example, using an A synthesizer, based on the information on the base sequence of any one selected from SEQ ID NOs: 12, 14, and 18 or the base sequence of the fragment thereof. Can be prepared.
  • oligonucleotide derivatives are converted phosphate Jefferies ester bond phosphorothioate Chio benzoate is converted to bound oligonucleotide derivative conductor in the oligonucleotide, the phosphodiester bond in the oligonucleotide N3 5-P5 5 Hosuhoa Mideto bond Oligonucleotide derivative in which the bond between ribose and phosphodiester in the oligonucleotide has been converted to a peptide nucleic acid bond, oligonucleotide derivative in which peracyl in the oligonucleotide has been replaced with C-5 propynyl peracyl, Oligonucleotide derivatives in which peracyl in the nucleotide is substituted with C-5 thiazolyl peracyl, oligonucleotide derivatives in which cytosine in the oligonucleotide is substituted with C-5 propynylcytosine
  • a nucleotide that hybridizes under stringent conditions with a DNA having the nucleotide sequence of any one selected from SEQ ID NOs: 12, 14, and 18 is any one selected from SEQ ID NOs: 12, 14, and 18.
  • the nucleotide to be hybridized is, for example, a DN.A having a complementary sequence of a DNA having a base sequence described in any one of 12, 14, and 18 when calculated using BLAST, FASTA, or the like.
  • a DNA having at least 75% or more homology is preferable, a DNA having 80% or more homology is more preferable, and a DNA having 95% or more homology is more preferable.
  • the nucleotide any of DNA, RNA and the like can be used, but DNA is preferably used.
  • the nucleotide derivative alone was introduced into a gene therapy vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, etc., and then formulated into a pharmaceutical preparation according to the usual method described below. It can also be used as a prophylactic and / or therapeutic agent for neutrophilic inflammatory diseases.
  • the gene therapy vector When used as the prophylactic and / or therapeutic agent, it can be produced by combining the gene therapy vector and the base used for the gene therapy agent (Nature Genet., 8, 42 (1994)].
  • the above-mentioned base may be any base which is usually used for injections, for example, distilled water, a salt solution such as a mixture of sodium chloride or sodium chloride and an inorganic salt, mannitol, lactose, dextrin and the like.
  • a salt solution such as a mixture of sodium chloride or sodium chloride and an inorganic salt
  • mannitol such as a mixture of sodium chloride or sodium chloride and an inorganic salt
  • lactose such as mannitol, lactose, dextrin and the like.
  • examples include a sugar solution such as tolan and glucose, an amino acid solution such as glycine and arginine, and a mixed solution of an organic acid solution or a salt solution and a glucose solution.
  • an osmotic pressure adjusting agent a pH adjusting agent, a vegetable oil such as sesame oil and soybean oil, or an auxiliary agent such as lecithin or a surfactant such as a nonionic surfactant is added to these bases,
  • the injection may be prepared as a solution, suspension or dispersion. These injections can also be prepared as preparations for dissolution at the time of use by operations such as powdering and freeze-drying.
  • the prophylactic and / or therapeutic agent can be used as it is in the case of a liquid, or in the case of a solid, immediately before administration, if necessary, dissolved in the above-mentioned sterilized base.
  • Examples of the administration method include a method of local administration so that it is absorbed at the treatment site of the patient.
  • DNA can be transported to a target treatment site by a non-viral gene transfer method.
  • Non-viral gene transfer methods include calcium phosphate coprecipitation method [Virology, 52, 456-467 (1973); Science, 209, 1414-1422 (1980)], microinjection method CProc. Natl. Acad. Sci. USA, 77> 5399-5403 (1980); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 7380-7384 (1980); Cell, 27, 223-231 (1981); Nature, 294> 92-94 (1981)], Ribosome-mediated membrane fusion-mediated transfer !: Pro Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413-7417 (1987); Biochemistry, 28, 9508-9514 ( 1989); J. Biol. Chem., 264, 12126-12129 (1989); Hum.
  • Examples of the substance that inhibits the binding of a ligand to GPR4 include an antibody that recognizes GPR4, a compound that has an antagonistic effect on GPR4, and the like.
  • any antibody that recognizes GPR4 can be used, but an antibody that specifically recognizes GPR4 is preferable.
  • the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • Such antibodies include, for example, deprivation of neutralizing antibodies that recognize GPR4.
  • human chimeric antibodies, humanized antibodies and the like can also be used as the antibodies in the present invention.
  • Antibodies that reduce GPI-expressing cells and suppress their function include, for example, antibodies having antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC activity).
  • the above antibody can be prepared, for example, according to the following method.
  • a purified antibody of GPR4 or its partial fragment polypeptide or a peptide having a partial amino acid sequence of GPR4 can be used as an antigen to administer to an animal to prepare a monoclonal antibody.
  • the animals to be used may be egrets, goats, rats, mice, hams or the like.
  • the dose of the antigen is preferably 50 to 100 mg per animal.
  • peptide When peptide is used, the peptide is transferred to keyhole mussel (keyhole). l impet haemocyanin) ⁇ It is desirable to use an antigen that is covalently bound to a carrier protein such as bovine thyroglobulin.
  • the peptide used as an antigen can be synthesized by a peptide synthesizer.
  • the administration of the antigen is performed 3 to 1.0 times every 1 to 2 weeks after the first administration. Three to seven days after each administration, blood is sampled from the fundus venous plexus to determine that the serum reacts with the antigen used for immunization.
  • Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): published by Medical Shoin ( 1976), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)].
  • a polyclonal antibody can be obtained by obtaining serum from a non-human mammal whose serum has a sufficient antibody titer against the antigen used for immunization, and separating and purifying the serum.
  • Methods for separation and purification include centrifugation, salting out with 40-50% saturated ammonium sulfate, and prillic acid precipitation (Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)), or a DEAE-Sepharose column, Examples of the method include a method in which chromatography using an anion exchange column, a protein A or G-column, a gel filtration column, or the like is performed alone or in combination.
  • the purified serum of GPR4 or its partial fragment polypeptide used for immunization, or a peptide having a partial amino acid sequence of GPR4 was used for antibody-producing cells whose serum showed a sufficient antibody titer.
  • the spleen is shredded in a MEM medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical), loosened with forceps, centrifuged at 200 rpm for 5 minutes, and the supernatant is discarded.
  • MEM medium manufactured by Nissui Pharmaceutical
  • the spleen cells in the resulting precipitate fraction are treated with Tris-ammonium chloride buffer (PH7.65) for 1 to 2 minutes to remove red blood cells, washed three times with MEM medium, and the resulting spleen cells are treated with antibody. Used as a production cell.
  • myeloma cells As myeloma cells, cell lines obtained from mice or rats are used. For example, 8-azaguanine-resistant mouse (derived from BALB / c) myeloma cell line
  • P3-X63Ag8-U1 Curr.Topics Microbiol. Immunol., 81, 1 (1978), Eur.J. Immunol., 6, 511 (1976)), SP2 / 0-Agl4 ( SP-2) CNature, 276, 269 (1978)), P3-X63-Ag8653 (653) [J.I thigh painting '1.,, 1548 (1979)] ⁇ P3-X63-Ag8 (X63) CNature, 256 , 495 (1975)].
  • These cell lines were prepared in 8-azaguanine medium (glutamine in RPMI-1640 medium).
  • the cell group of the precipitate fraction obtained was thoroughly loosened, and the cell group was agitated at 37 ° C. with stirring at 37 ° C. for 10 8 antibody-producing cells per 2 g of polyethylene glycol-100Q (PEG-1000), 2 ml of MEM and 2 ml of dimethyl sulfoxide. (DMS0) Add 0.2 to 1 ml of a mixed solution of 0.7 ml, and add 1 to 2 ml of MEM medium several times every 1 to 2 minutes.
  • PEG-1000 polyethylene glycol-100Q
  • MEM dimethyl sulfoxide
  • a purified plate of GPR4 or its partial fragment polypeptide used as an antigen, or a peptide having a partial amino acid sequence of GPR4 is coated on an appropriate plate, and the hybridoma culture supernatant or (d)
  • the purified antibody obtained in (1) is reacted as the first antibody, and the second antibody is reacted with an anti-rat or anti-mouse immunoglobulin antibody labeled with biotin, an enzyme, a chemiluminescent substance or a radioactive compound, and then reacted with the labeled substance.
  • a reaction corresponding to the polypeptide is performed, and one that specifically reacts with the polypeptide used as the antigen is selected as a hybridoma that produces the monoclonal antibody used in the present invention.
  • Cloning is repeated twice by the limiting dilution method using the hybridoma (the first time uses an HT medium (a medium obtained by removing aminopterin from the HAT medium), and the second time uses a normal medium).
  • HT medium a medium obtained by removing aminopterin from the HAT medium
  • Those having a stable and strong antibody titer are selected as the hybridoma strain producing the monoclonal antibody used in the present invention.
  • Ascites is collected from the mouse with ascites tumor and centrifuged at 3,000 rpm for 5 minutes to remove solids. ; ''
  • a monoclonal antibody can be purified and obtained in the same manner as the method used for the polyclonal antibody.
  • the antibody subclass is determined using a mouse monoclonal antibody typing kit or a rat monoclonal antibody typing kit.
  • the amount of the polypeptide is calculated by the Lowry method or from the absorbance at 280 nm.
  • the above-mentioned preventive and / or therapeutic agent for neutrophilic inflammatory disease containing an antibody recognizing GPR4 can be prepared as follows.
  • a drug containing the antibody as an active ingredient can be administered alone, but usually the active ingredient is one or more pharmacologically acceptable carriers. And provided as pharmaceutical preparations prepared by any of the methods well-known in the art of pharmacy. Preferably, a sterile solution dissolved in water or an aqueous carrier such as an aqueous solution of common salt, glycine glucose, human albumin or the like is used. Also, pharmacologically acceptable additives such as buffering agents and isotonicity agents to bring the formulation solution closer to physiological conditions, for example, sodium acetate, sodium chloride, sodium lactate, potassium chloride, citrate Sodium and the like can be added. Alternatively, it can be stored after being freeze-dried and dissolved in an appropriate solvent before use.
  • the administration route is preferably the one that is most effective for treatment, and may be oral administration or parenteral administration such as intravenous administration.
  • Dosage forms include tablets, injections and the like.
  • Formulations suitable for oral administration include 'tablets and the like. Tablets etc. are excipients such as lactose and mannitol, disintegrants such as starch, lubricants such as magnesium stearate, binders such as hydroxypropylcellulose, surfactants such as fatty acid esters, plasticizers such as glycerin etc. Can be produced as an additive.
  • Formulations suitable for parenteral administration include injections and the like. For example, an injection is prepared using a carrier comprising a salt solution, a glucose solution or a mixture of both.
  • the components exemplified as additives in oral preparations can be added.
  • the dose or frequency of administration varies depending on the intended therapeutic effect, administration method, treatment period, age, body weight, etc., but is usually 10 mg / kg to 8 rag / kg per adult per day.
  • a substance that suppresses signal transduction generated by the constitutive activity of GPR4 can also be obtained by searching for a substance that can suppress signal transduction generated by the constitutive activity.
  • Examples of the compound having a GPR4 antagonistic activity include a compound represented by the formula (I).
  • the compound represented by the formula (I) is referred to as compound (I). The same applies to compounds of other formula numbers.
  • the lower alkyl moiety of lower alkyl and lower alkanol, lower alkoxy, lower alkoxycarbonyl, mono- or di-lower alkylamino, mono- or di-lower alkylaminocarbonyl includes, for example, straight-chain or branched And alkyl of 10 to 10, specifically, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, isopentyl, neopentyl, hexyl, heptyl, octyl, isooctyl, nonyl, Decyl and the like.
  • Examples of the cycloalkyl include cycloalkyl having 3 to 8 carbon atoms, and specific examples include cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl and the like.
  • the cycloalkyl part of cycloalkyl carbonyl is synonymous with dicycloalkyl (ii).
  • Examples of the lower alkenyl include straight-chain, branched or cyclic alkenyl having 2 to 8 carbon atoms. Specific examples include vinyl,, aryl, 1-propenyl, butenyl, pentenyl, hexenyl, Heptenyl, octenyl, cyclohexenyl, 2,6-octenyl and the like.
  • lower alkynyl examples include straight-chain or branched alkynyl having 2 to 8 carbon atoms.Specifically, ethynyl, propynyl, butynyl, pentynyl, hexynyl, heptynyl, octynyl And the like.
  • Halogen represents fluorine, chlorine, bromine and iodine atoms.
  • Examples of the group obtained by removing one hydrogen atom from an aryl and an aromatic ring formed by joining two adjacent carbon atoms thereof include, for example, a monocyclic or bicyclic group having 6 to 14 carbon atoms. And tricyclic aryl. Specific examples include phenyl, naphthyl, indenyl, and anthranyl.
  • alkylene portion of aralkyl and heterocyclic alkyl has the same meaning as the above-mentioned definition of lower alkyl (i) except that one hydrogen atom is removed.
  • the aryl moiety of aralkyl and aryloyl includes, in addition to the groups mentioned in the definition of the aryl (vi), for example, the aryl is fused with cycloalkyl And specific examples thereof include indanyl, 1,2,3,4-tetrahydronaphthyl, 6,7,8,9-tetrahydro-5H-benzocyclohex. Chill and the like.
  • Examples of the heterocyclic group and the heterocyclic group portion of the heterocyclic alkyl and the heterocyclic group formed by joining the two adjacent carbon atoms and removing one hydrogen atom include, for example, a nitrogen atom A 5- or 6-membered monocyclic heterocyclic group containing at least one atom selected from an oxygen atom and a sulfur atom, a bicyclic or tricyclic fused 38-membered ring and a nitrogen atom, Examples include a condensed heterocyclic group containing at least one atom selected from an oxygen atom and a sulfur atom, and specific examples thereof include pyridyl, pyrazinyl, pyrimidinyl, pyridazinyl, benzimidazolyl, 2-oxopenzoimidazolyl, Penzotriazolyl, Penzofuryl, Penzochenil, Purinyl, Penzoxazolyl, 'Penzothiazolyl, Penzodioxolyl, Ind
  • heterocyclic group formed together with the adjacent nitrogen atom examples include a 5- or 6-membered monocyclic heterocyclic group containing at least one nitrogen atom (the monocyclic heterocyclic group).
  • the group may contain other nitrogen, oxygen or sulfur atoms), a bicyclic or tricyclic fused 3- to 8-membered ring containing at least one nitrogen atom.
  • a cyclic group (the condensed heterocyclic group may contain another nitrogen atom, oxygen atom or sulfur atom), and specific examples thereof include pyridyl, pyridyl tetrahydrido, indolinyl, isoindolinyl, Pyrrolidinyl, thiazoly Dinyl, oxazolidinyl, piperidino, homopiperidino, piperazinyl, homopiperazinyl, morpholino, thiomorpholino, perhydroazepinyl, perhydroazoizinyl, tetrahydroquinolyl, tetrahydroisoquinolyl, oxohydrolinolyl, benzodindolyl , Purinyl, dihydroindolyl, piperyl, dihydropyrrolyl, pyrazolyl, triazolyl, tetrazolyl, imidazolyl and the like.
  • substituents in the substituted lower alkyl, substituted lower alkoxycarbonyl and substituted lower alkanoyl the same or different, for example, having 1 to 3 substituents, cycloalkyl, lower alkanol, lower alkoxy, aryloxy, Substituted aryloxy
  • substituents in the substituted aryloxy are the same or different and include, for example, lower alkyl, lower alkoxy, lower alkoxycarbonyl, halogen, cyano, nitro, hydroxy, carboxy, amino and the like having 1 to 3 substituents.
  • lower alkyl has the same meaning as the above lower alkyl (i)
  • halogen has the same meaning as the above halogen (V)
  • the lower alkyl part of the lower alkoxy and lower alkoxycarbonyl has the same meaning as the above lower alkyl (i).
  • Aralkyloxy, substituted aralkyloxy [substituents in the substituted aralkyloxy may be the same or different and include, for example, lower alkyl, lower alkoxy, lower alkoxycarbonyl, halogen, cyano, nitro, and the like. Hydroxy, carboxy, amino and the like.
  • lower alkyl has the same meaning as the lower alkyl (i)
  • halogen has the same meaning as the halogen (V)
  • the lower alkyl portion of the lower alkoxy and the lower alkoxycarbonyl has the same meaning as the lower alkyl (i).
  • the lower alkyl moiety of lower alkylsulfonyl, lower alkylsulfinyl, lower alkoxycarbonylamino and lower alkanoylamino may be the aforementioned aryl (vi), cycloalkyl (ii), halogen (v), heterocyclic (ix) And lower alkyl (i), and have the same meaning as the alkylene portion of aralkyloxy, except that one hydrogen atom has been removed from the lower alkyl (i). '
  • the lower alkyl moiety of the mono- or di-lower alkylamino, mono- or di-lower alkylaminocarbonyl and mono- or di-lower alkylaminocarbonyloxy is the same as the lower alkyl (i), respectively.
  • the two lower alkyl moieties of luponyloxy may each be the same or different.
  • the substituent in the substituted aryl and the substituted heterocyclic group formed together with the adjacent nitrogen atom is a lower alkyl [the lower alkyl is the same as the lower alkyl (i)] or a substituted lower alkyl [the Lower alkyl has the same meaning as the above lower alkyl (i).
  • the substituents include the same or different substituents, and examples thereof include halogen, hydroxy, carboxy, and lower alkoxycarbonyl having 1 to 3 substituents.
  • halogen has the same meaning as the above-mentioned halogen (V)
  • the lower alkyl part of the lower alkoxycarbonyl has the same meaning as the above-mentioned lower alkyl (i).
  • the lower alkyl, aryl, heterocyclic group and the heterocyclic group portion of the heterocyclic alkyl, the alkylene portion of the aralkyl and the heterocyclic alkyl, and the aryl portion of the aralkyl shown here are the lower alkyl (i), aryl ( V i ), The heterocyclic group (ix), the alkylene moiety (vii) of aralkyl and the aryl moiety (viii) of aralkyl.
  • the substituents in the substituted aryl, the substituted aralkyl, the substituted heterocyclic group and the substituted heterocyclic aralkyl in the above are the same or different, for example, lower alkyl having 1 to 3 substituents [the lower alkyl is the same as the lower alkyl (i) Synonymous], lower alkoxy [the lower alkyl part of the lower alkoxy is the same as the lower alkyl (i)], halogen [the halogen is the same as the halogen (V)], and the like.
  • phenylene examples include 1,2-phenylene, 1,3-phenylene, and i, 4-phenylene.
  • the unsaturated or partially unsaturated 5- to 7-membered monocyclic heterocycle having 1 to 4 atoms arbitrarily selected from nitrogen, oxygen and sulfur having 2 to 6 carbon atoms includes the following: Examples include, but are not limited to, pyrrol, imidazole, virazole, pyridine, pyridazine, pyrimidine, pyrazine, 1,2,4-triazine, 1,2,3-triazine, 1 , 3,5-Triazine, Tetrazole, Furan, Pyran, Oxazole, Isoxazole, 1,2,3-Oxadiazole, 1,2,4-Oxadiazole, 1,3,4-Oxadiazole, Thiophene, Thiazol, Isothiazo — 1,2,3-thiadiazole, 1,2,4-thiadiazole, 1,3,4-thiadiazole, furazane, thiopyran, pyrrolidine, pyrroline, pyrrolidone, piperidone,
  • an unsaturated or partially unsaturated bicyclic heterocyclic ring having 8 to 11 carbon atoms having 1 to 4 atoms arbitrarily selected from nitrogen, oxygen and sulfur having 4 to 10 carbon atoms are not necessarily limited to the following examples, but include, for example, indole, isoindole, benzimidazole, quinoline, isoquinoline, quinolidine, quinazoline, indolizine, naphthyridine, quinoxaline, cinnoline, pteridine, indazole, Purine, phthalazine, indoline, isoindoline, benzofuran, isobenzofuran, chroman, isochroman, chromene, benzodioxane, penzothiophene, penzoxazole, benzothiazole, quinolone, tetrahydroquinoline, tetrahydroisoquinoline, tetrahydroquinoline , Pi Dopyr
  • aryl (the aryl is synonymous with the aryl (vi)), substituted aryl (the aryl is synonymous with the aryl (vi), and May be the same or different, for example, lower alkyl having 1 to 3 substituents (the lower alkyl is the same as the lower alkyl (i)), lower alkoxy (the lower alkyl moiety of the lower alkoxy is the lower alkyl (i) )), Halogen (the halogen is the same as the halogen (V)), etc.], and aralkyl (the alkylene portion of the aralkyl and the aryl portion of the aralkyl are each an alkylene of the aralkyl).
  • substituted aralkyl [the alkylene part of the aralkyl and The aryl part of the aralkyl has the same meaning as the alkylene part (vii) of the aralkyl and the aryl part (viii) of the aralkyl, respectively, and the substituents in the substituted aralkyl may be the same or different.
  • Lower alkyl having 1 to 3 substituents (the lower alkyl is the same as the lower alkyl (i)), lower alkoxy (the lower alkyl portion of the lower alkoxy is the same as the lower alkyl (i)) ), Halogen (the halogen is the same as the halogen (V)) and the like; a substituted heterocyclic group [the heterocyclic group is the same as the heterocyclic group (ix);
  • the substituents in the group may be the same or different and include, for example, lower alkyl having 1 to 3 substituents (the lower alkyl is the same as the lower alkyl (i)), lower alkoxy (the lower alkyl The lower alkyl portion of the lower alkoxy is the same as the lower alkyl (i), halogen (the halogen is the same as the halogen (V)), etc., and the heterocyclic alkyl (the The heterocyclic group portion and the alkylene portion of the heterocyclic alkyl have the same meaning as
  • lower alkyl having 1 to 3 substituents the lower alkyl is the same as the lower alkyl (i)
  • lower alkoxy the lower alkyl The lower alkyl part of the alkoxy is the same as the lower alkyl (i)
  • the halogen is the same as the halogen (V)), and the like.
  • lower alkyl in addition to the above substituents, lower alkyl
  • Aroyl (the aroyl is the same as the above-mentioned aroyl (viii)), Conversion Aroiru (the Aroiru is the Aroiru (viii) has the same meaning as the substituent in the substituted arylo, the substituent in the substituted arylo has the same meaning as the substituent (xii) in the substituted arylo, and a substituted heterocyclic group (the heterocyclic group has the same meaning as the heterocyclic group (ix))
  • the substituent in the substituted heterocyclic group is, for example, a group excluding lower alkyl, lower alkoxy, and halogen from the definition of the substituent (xii) in the substituted heterocyclic group, and the like.
  • heterocyclic group portion of the heterocyclic alkyl and the alkylene portion of the heterocyclic alkyl have the same meaning as the heterocyclic group portion (ix) of the heterocyclic alkyl and the alkylene portion (vii) of the heterocyclic alkyl, respectively.
  • the substituent in the substituted heterocyclic alkyl is, for example, a group excluding lower alkyl, lower alkoxy and halogen from the definition of the substituent '(xii) in the substituted heterocyclic alkyl. May be filed in the are).
  • the quaternary ammonium salt of the compound (I) may be selected from the following: a lower alkyl halide (the lower alkyl and the halogen are each as defined above); Aralkyl (the halogen and the aralkyl are as defined above), hydroxy lower alkyl (the lower alkyl is as defined above), halogenated lower alkenyl (the lower alkenyl and the halogen are
  • a lower alkyl halide the lower alkyl and the halogen are each as defined above
  • Aralkyl the halogen and the aralkyl are as defined above
  • hydroxy lower alkyl the lower alkyl is as defined above
  • halogenated lower alkenyl the lower alkenyl and the halogen are
  • the quaternary ammonium salts obtained by adding methyl iodide to the compound (I.) having a dimethylamino group include, but are not particularly limited to, quaternary ammonium salts having the same
  • the substituent R 1 of the compound (I) is -NR e (wherein, R 5 and R 6 have the same meanings as described above, respectively) ),
  • a lower alkyl halide (the lower alkyl and the halogen are each as defined above), an aralkyl halide (the halogen and the aralkyl are each as defined above), Hydroxy lower alkyl (said lower alkyl is as defined above), a halogenated lower alkenyl (the lower alkenyl and the halogen are synonymous therewith it above) Hitoshiga ⁇ - in addition to NR 5 R 6 parts,
  • the place corresponding to the substituent R 1 is -N + R 5b R sb R 8 (wherein, R 5b and R 6b have the same meanings as R 5 and R e , respectively, and R 8 is lower alkyl or lower alkenyl. Or a aralkyl).
  • a non-toxic, water-soluble salt is preferable.
  • Acid addition salts such as organic acid salts such as tartaric acid salts, alkaline metal salts such as sodium salts and potassium salts, alkaline earth metal salts such as magnesium salts and calcium salts, metal salts such as aluminum salts and zinc salts
  • Ammonium salts such as ammonium, tetramethylammonium, organic amine addition salts such as morpholine addition salts, piperidine addition salts, or glycine addition salts, phenylalanine addition salts, with
  • Examples of the quaternary ammonium salt of the compound (II) include a lower alkyl halide (the lower alkyl and the halogen are the same as defined above), an aralkyl halide and the like in the compound (JI).
  • the halogen and the aralkyl are as defined above), hydroxy lower alkyl
  • Examples include quaternary ammonium salts obtained by exchanging iodide ions and hydroxide ions in a sodium salt.
  • a non-toxic, water-soluble salt is preferable.
  • hydrochloride, hydrobromide, nitrate, sulfate, phosphoric acid Inorganic acid salts such as salts, benzenesulfonate, benzoate, citrate, fumarate, dalconate, lactate, maleate, malate, oxalate, methanesulfonate, Acid addition salts of organic acid salts such as tartrate salts; alkaline metal salts such as sodium salts and sodium salts; alkaline earth metal salts such as magnesium salts and calcium salts; and metals such as aluminum salts and zinc salts.
  • salts ammonium salts such as ammonium and tetramethylammonium, organic amine addition salts such as morpholine addition salts and piperidine addition salts, or glycine addition salts, phenylalanine addition salts, with lysine Salts, aspartic acid addition salts, glutamic acid addition salts and other amino acid addition salts.
  • R 9 represents lower alkyl, aryl or benzyl
  • R 1D and R 11 are the same or different.
  • R 1G and R 11 together with an adjacent nitrogen atom form a heterocyclic group, and U is halogen RNI, alkoxysulfonyloxy, aryloxysulfonyloxy, Represents alkylsulfonyloxy or arylsulfonyloxy
  • lower alkyl, cycloalkyl and halogen are each as defined above.
  • the alkyl portion of alkoxysulfonyloxy and alkylsulfonyloxy, and the aryl portion of aryloxysulfonyloxy and arylsulfonyloxy have the same meanings as the lower alkyl and aryl, respectively.
  • the heterocyclic group formed together with the adjacent nitrogen atom is as defined above.
  • the compound (Ilia) is used as a starting material, and is reacted with 1 equivalent to a large excess of YH (where Y is as defined above) according to the method disclosed in JP-A-7-61983.
  • Compound (IV) can be obtained.
  • the compound (Ilia) can be synthesized by the method disclosed in JP-A-7-61983 or a method analogous thereto.
  • the reaction is usually performed at a temperature between 0 ° C and the boiling point of the solvent used in the reaction, preferably at a temperature between room temperature and 80 ° C, and is completed in 5 minutes to 100 hours.
  • the inert solvent for example, water, methanol, ethanol, acetic acid, trifluoroacetic acid, dichloroethane, chloroform, tetrahydrofuran, dimethylacetamide, dimethylformamide, acetone, etc., alone or as a mixture are used.
  • a mixed solvent of chloroform and acetic acid is preferably used.
  • Compound -c) can be produced from compound (Ib) by the method shown below.
  • Compound (I-b) was used in an inert solvent with 1 equivalent to a large excess of R 8 U (wherein R 8 and U are as defined above), and the reaction was usually performed at a temperature of 10 ° C.
  • the compound (I-c) can be obtained by reacting at a temperature between the boiling points of the solvents, preferably at room temperature, for 1 to 48 hours.
  • inert solvent examples include water, methanol, ethanol, benzene, toluene, xylene, ethyl acetate, hexane, acetonitrile, dichloromethane, dichloroethane, chloroform, carbon tetrachloride, 1,4-dioxane, Tetrahydrofuran, dimethylacetamide, dimethylformamide, acetone and the like can be used alone or in combination, and preferably ethyl acetate, dichloromethane, chloroform and the like are used.
  • Compound (Ib) can be produced from compound (Ic) by the method shown below.
  • R 2 , R 3 , R ⁇ R 5 , R 6 , R 5b , R 6b , R 8 , U, n, X and Y are as defined above.
  • the compound (I-c) was used in an inert solvent with 1 equivalent to a large excess of R3 ⁇ 4H (wherein R 5 and R 6 are as defined above), usually at a temperature of 1 ° C.
  • the compound (Ib) can be obtained by reacting at a temperature between the boiling points of the solvents, preferably at a temperature between 20 ° C and 100 ° C for 1 to 100 hours.
  • inert solvent examples include water, methanol, ethanol, benzene, toluene, xylene, ethyl acetate, hexane, acetonitrile, dichloromethane, dichloroethane, chloroform, carbon tetrachloride, 1,4-dioxane, Tetrahydrofuran, dimethylacetamide, dimethylformamide, acetone and the like are used alone or as a mixture, and preferably chloroform and dimethylformamide are used.
  • the reaction usually proceeds well under basic conditions It is desirable to add an appropriate base to the reaction system as needed.
  • Suitable bases include, for example, triethylamine, diisopropylethylamine, pyridine, N-methylmorpholine, potassium carbonate, sodium hydride, potassium hydride, calcium hydride, diisopropylethylamine, 1, 8-Diazacyclo [5.4.0] indene-7-ene and the like can be used, and among them, triethylamine is preferable.
  • Compound (Ie) can be produced from compound (Id) of compound (Ib) by the following method.
  • R 2 , R 3 , R 4 , n, X and Y have the same meanings as above, respectively, and R 14 and R 15 are the same or different and are hydrogen, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted.
  • lower alkyl, cycloalkyl, lower alkenyl, lower alkynyl, aralkyl, heterocyclic alkyl, and aryl are each as defined above, and their substituents are also as defined above.
  • heterocyclic ring R “and R 15 are formed together with the adjacent CH (CH 2) ra N, Tetorahi Doropirijin, pyrrolidine, piperidine, Homopi Bae lysine, Pi Perazine, Homopi Bae Rajin, morpholine, Thiomorpholine, perhydroazepine, perhydroazozin, tetrahydroquinoline, tetrahydroisoquinoline, etc., and the substituent is a heterocyclic group formed together with the adjacent nitrogen atom. Is synonymous with
  • Compound ( ⁇ ⁇ -d) is preferably placed in an inert solvent at a temperature between ⁇ 78 ° C. to 40 ° C., preferably 2 to 4 equivalents of lithium aluminum hydride, diisopropyl aluminum lithium hydride, or the like.
  • the compound (Ie) can be obtained by treating in the presence of a reducing agent such as lithium diisopropylaluminum hydride for 10 minutes to 24 hours, preferably ⁇ to 3 hours.
  • inert solvent for example, dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, dichloroethane, benzene, toluene, xylene, tetrahydrofuran, dimethyl ether and the like can be used alone or in combination, and preferably dichloromethane or toluene is used. Used.
  • Compound (If) can be produced from compound (Id) by the following method.
  • Y and m are the same as above Compound (Id) in an inert solvent, usually at a temperature between 0 ° C. and the boiling point of the solvent used in the reaction, preferably at a temperature between S temperature and 100 ° C., 1 equivalent to a large excess Compound (If) can be obtained by treating for 1 to 48 hours, preferably for 1 to 3 hours in the presence of a suitable base.
  • Suitable bases include, for example, sodium hydroxide, lithium hydroxide, potassium hydroxide, potassium carbonate, cesium carbonate, sodium methoxide and the like, and preferably sodium hydroxide.
  • the inert solvent for example, water, tetrahydrofuran, dimethyl ether, methanol, ethanol, propanol, dichloromethane, dichloroethane, benzene, toluene, xylene, or the like can be used alone or as a mixture. Furan or methanol, or a mixed solvent thereof with water is used.
  • Compound (I-h) can be produced from compound (I-g) in compound (I-b) by the following method.
  • R 2 , R 3 , R 4 , ⁇ , X, ⁇ , and m are as defined above, R 17 and R 18a are as defined above and as R 15 , respectively, and T is Represents alkali metal, ammonium, trialkylsilyl, or trialkyltin)
  • alkyl in trialkylsilyl and trialkyltin has the same meaning as the lower alkyl.
  • Examples of aluminum metal include sodium and potassium.
  • Suitable additives include, for example, silicon tetrachloride, lithium chloride, aluminum chloride, ammonium chloride, trialkyltin chloride, dialkyltin oxide, trialkylaluminum, dimethyl, triethylamine hydrochloride, tritylamine.
  • silicon tetrachloride lithium chloride, aluminum chloride, ammonium chloride, trialkyltin chloride, dialkyltin oxide, trialkylaluminum, dimethyl, triethylamine hydrochloride, tritylamine.
  • examples thereof include hydrobromide, sodium hydride, potassium tert-butoxide, sodium hydroxide, zinc bromide and the like, and preferably include ammonium chloride, dialkyltin oxide and the like.
  • inert solvent for example, water, acetonitrile, dimethylformamide, dimethylacetamide, N-methyl-2-pyrrolidone, dimethylsulfoxide, acetic acid, glacial acetic acid, tetrahydrofuran, benzene, toluene, xylene, etc. are used alone. Or dimethylformamide or toluene.
  • Compound (I-i) can be produced from compound (I-c) by the method shown below.
  • R 18 represents a substituted or unsubstituted lower alkyl.
  • Q represents an alkali metal or an alkaline earth metal
  • p represents 1 when Q is an alkali metal
  • p represents 2 when Q is an alkaline earth metal.
  • the alkali metal is synonymous with the alkali metal, and examples of the alkaline earth metal include magnesium and calcium.
  • inert solvent for example, dimethylacetamide, N-methyl-2-pyrrolidone, dimethylsulfoxide and the like can be used alone or in combination, and dimethylsulfoxide is preferably used.
  • Compound (I-j) can be produced from compound (I-c) by the method shown below.
  • R 2 , R 3 , R 4 , R 5b , R 6b , R 8 , U, n, X and Y are as defined above.
  • Suitable bases include, for example, triethylamine, diisopropylethylamine, pyridine, N-methylmorpholine, potassium carbonate, sodium hydride, Potassium hydride, calcium hydride, diisopropylethylamine, 1,8-diazapicyclo [5.4.0] indene-1-ene and the like can be used, and among them, 1,8-diazabicyclo [5.4. [0] Index 7 is preferred.
  • inert solvent examples include dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, dichloroethane, benzene, toluene, xylene, ethyl acetate, dimethylacetamide, N-methyl-2-pyrrolidone, and dimethylsulfoxide. They can be used alone or as a mixture, and preferably form-form is used.
  • Compound (1-1) can be produced from compound (I-k) in compound (I-j) by the following method.
  • Compound (1-1) can be produced by performing the same reaction as in step 6 of production method 5 using compound (I-k).
  • Compound (I-m) can be produced from compound (I-i) by the following method.
  • Compound (I-m) can be produced by performing the same reaction as in Step 6 of Production Method 5 using compound (I-i).
  • Compound (I-n) can be produced from compound (I-m) by the following method.
  • R 7e represents a group obtained by removing hydrogen from the definition of the aforementioned R 7 .
  • the compound (In) can be obtained by reacting, preferably for 3 to 24 hours.
  • Suitable bases include, for example, potassium carbonate, sodium hydride, hydrogenating power
  • examples thereof include lithium, calcium hydride, and lower alkyllithium, and preferably include sodium hydride and lithium hydride.
  • the inert solvent include dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, dichloroethane, benzene, toluene, xylene, ethyl acetate, dimethylformamide, dimethylacetoamide, N-methyl-2-pyrrolidone, tetrahydrofuran, and ethyl ether. And the like can be used alone or as a mixture. Preferably, black form is used.
  • the compound (1-0) can be obtained by treating for 1 to 48 hours, preferably for 3 to 24 hours in the presence of up to 6 equivalents of a suitable oxidizing agent.
  • Suitable oxidants include, for example, manganese dioxide, chromic acid, pyridinium chromate, pyridinium dichromate, potassium permanganate, sulfur trioxide-pyridine, oxone and the like, preferably manganese dioxide.
  • the inert solvent include dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, dichloroethane, benzene, toluene, xylene, butyl acetate, acetic acid, propionic acid, butyric acid, trifluoroacetic acid, water, pyridine and dimethylforme.
  • Compound (1-0) is prepared in an inert solvent at a temperature between 0 ° C and the boiling point of the solvent used in the reaction, preferably at a temperature between room temperature and 90 ° C, from 1 equivalent to a large excess, preferably 1 to 3 equivalents of hydroxylamine or its hydrochloride, sulfate, paratoluenesulfonate, etc., 0-phenylca-bamylhydroxylamine or its hydrochloride, sulfate, paratoluenesulfonate, or N
  • the compound (I-P) can be obtained by reacting -hydroxypenzamide, preferably hydroxylamine, for 1 to 48 hours, preferably 3 to 24 hours. If necessary, 1 equivalent to a large excess, preferably 1 to 3 equivalents of a suitable dehydrating agent, 1 equivalent to a large excess, preferably 2 to 6 equivalents of a suitable base, or microwave irradiation You may go.
  • Suitable dehydrating agents include, for example, acetic anhydride, hydrofluoric anhydride, sodium hydrogen sulfate, oxone, sodium formate, dialkyltin oxide, alumina, silica gel, sodium acetate, formamide, nirin pentoxide, iron chloride ( 111), formic acid, Examples thereof include acetic acid, propionic acid, phosphorus oxychloride, and paratoluenesulfonic acid, and preferably include acetic anhydride and phthalic anhydride.
  • Suitable bases include, for example, triethylamine, pyridine, sodium hydride, lithium hydride and the like, and preferably include triethylamine or pyridine.
  • inert solvent examples include dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, dichloromethane, benzene, toluene, xylene, nitrobenzene, acetate nitrile, ethyl acetate, acetic acid, propionic acid, butyric acid, trifluoroacetic acid, and pyridine.
  • Acetonitrile, dimethylformamide and the like are preferably used.
  • Compound (Id) can be produced from compound (IP) by the following method. '
  • R 2 , R 3 , R 4 , T, X and ⁇ are as defined above.
  • Compound (1-.) Can be produced by performing the same reaction as in Step 7 of Production Method 6 using Compound (I- ⁇ ).
  • Compound (Ir) can be produced from Compound (I-c) by the method shown below. ) Can be manufactured.
  • R 2 , R 3 , R 4 , RR 6 ⁇ R 8 , U, n, X and Y are as defined above, and ⁇ represents an alkali metal as defined above
  • Compound (Ir) ′ can be obtained by reacting with an equivalent amount of Q a CN (wherein Q a has the same meaning as described above), preferably sodium cyanate, for 1 to 48 hours, preferably 3 to 24 hours. .
  • inert solvents examples include dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, dichloroethane, benzene, toluene, xylene, dimethylformamide, dimethylacetamide, N-methyl-2-pyrrolidone, and 1,4- Dioxane, tetrahydrofuran or the like can be used alone or in combination, and dimethylformamide or the like is preferably used.
  • Compound (I-S) can be produced from compound (I-r) by the method shown below.
  • Compound (Is) can be produced by performing the same reaction as in step 7 of Production method 6 using compound (Ir).
  • Compound (I-1) can be produced from compound (I-1 ") by the following method.
  • Compound (I-) can be produced by performing the same reaction as in Step 6 of Production Method 5 using compound (I-r).
  • Compound (Iu) can be produced from compound (Illb) by the following method.
  • R 2 R 3, R 4, R 5 ⁇ R 6, R 5 ⁇ R 6 ⁇ R 7c, R 8, R s, R 1Q, R u, R 18, Q, p, U, X And Y are as defined above.
  • Compound (V) can be produced by performing the same reaction as in step 8 of production method 7 using compound (Illb).
  • Compound (VII) can be produced by performing the same reaction as in step 13 of production method 12 using compound (VI).
  • Compound (VII) in an inert solvent usually at a temperature between 0 ° C and 80 ° C, 2-4 equivalents of silver nitrate, silver oxide (1), 'silver oxide (11), chromic acid, Pyridini acid Oxidizing agents such as pyridinium dichromate, potassium permanganate, sodium periodate, sodium perchlorate, hydrogen peroxide, sodium chlorite, preferably in the presence of silver nitrate or sodium perchlorate
  • Compound (VIII) can be produced by treating for 10 minutes to 24 hours, preferably for 1 to 4 hours. If necessary, 0.1 to 4 equivalents of an organic substance such as acetic acid or an inorganic substance such as sulfuric acid, sodium dihydrogen phosphate, sulfamic acid or lutemium oxide may be added as an additive.
  • inert solvent examples include getyl ether, tetrahydrofuran, 1,4-dioxane, dimethylformamide, dimethylacetamide, dimethylsulfoxide, benzene, tonorene, xylene, dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethane, and acetonitrile.
  • Compound (VI II) is reacted with 1 to 20 equivalents of a halogenating agent for 10 minutes to 24 hours in an inert solvent, usually at a temperature between 0 ° C. and 80 ° C., preferably at room temperature.
  • the compound (IX) can be produced by reacting with an equivalent to a large excess of R 7e 0H (wherein R 7e is as defined above).
  • halogenating agent examples include thionyl chloride, oxalyl chloride, phosphorus oxychloride, and the like, and preferably, thionyl chloride.
  • inert solvent examples include dichloromethane, chloroform, tetrahydrofuran, dimethylformamide, dimethylacetamide, 1,4-dioxane, acetonitrile, benzene, toluene, xylene and the like. Or mixed. Dichloromethane is preferably used as the inert solvent.
  • Compound (X) can be produced by performing the same reaction as in Step 2 of Production Method 1 using compound (IX).
  • the conjugated product (I-u) By performing the same reaction as in Step 1 of Production Method 1 using the conjugated product (II), the conjugated product (I-u) can be produced.
  • Compound (IV) can be produced from compound (Iu) by the following method.
  • Compound ( ⁇ - ⁇ ) can be produced by performing the same reaction as in Step 6 of Production Method 5 using compound (Iu).
  • Compound (Iw) can be produced from compound (I-V) by the following method.
  • the compound (I-V) is reacted with 1 to 20 equivalents of a halogenating agent for 10 minutes to 24 hours in an inert solvent, usually at a temperature between 0 ° C and 80 ° C, preferably at room temperature. , 1 equivalent to a large excess of R 5a R 6a NH (wherein R 5a and R 6a are as defined above) to produce compound (Iw). If necessary, one equivalent to a large excess of a suitable base may be added.
  • halogenating agent examples include thionyl chloride, oxalyl chloride, phosphorus oxychloride, and the like, and preferably, thionyl chloride.
  • Suitable bases include, for example, pyridine, triethylamine, diisopropylethylamine, N-methylmorpholine and the like, and preferably include triethylamine.
  • the inert solvent examples include dichloromethane, chloroform, tetrahydrofuran, dimethylformamide, dimethylacetamide, 1,4-dioxane, acetonitrile, benzene, toluene, xylene and the like. Or a mixture thereof.
  • Preferred examples of the inert solvent include dichloromethane.
  • inert solvent examples include getyl ether, tetrahydrofuran, 1,4-dioxane, dimethylformamide, dimethylacetamide, dimethylsulfoxide, benzene, toluene, xylene, acetonitrile, ethyl acetate, pyridine, dichloromethane, chloroform, Tetrahydrocarbon, etc., preferably, tetrahydrofuran, dimethylformamide and the like.
  • Suitable condensing agents include, for example, 1,3-dicyclohexylcarpoimide, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carpoimide hydrochloride, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl ) Carbodimid-bonded polystyrene resin (EDC resin). Further, N-hydroxysuccinic acid imide, 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazine, trihydroxybenzotriazole and the like, preferably 1-hydroxypentazotriazole, etc. Additives such as sols can also be added. .
  • EDC resin can be produced by the method described in Tetrahedron Letters, Vol. 34, No. 48, p. 7685 (1993).
  • Compound (I-y) can be produced from compound (I-X) in compound (I) by the following method.
  • R 22 and R 23 are the same or different and are hydrogen, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted Represents cycloalkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted lower alkynyl, substituted or unsubstituted aralkyl, or substituted or unsubstituted heterocyclic alkyl)
  • lower alkyl, cycloalkyl, lower alkenyl, lower alkynyl, aralkyl, and heterocyclic alkyl have the same meanings as described above, and their substituents have the same meanings as described above.
  • Compound (I- X) an inert solvent, one equivalent to a large excess, preferably (wherein, R 22 and R 23 are as defined it it it the) 1 to 10 equivalents of R 22 R 23 CO and In the presence of 1 equivalent to a large excess, preferably 1 to 3 equivalents of a suitable reducing agent, usually from -78 ° C to; a temperature between LOO ° C, preferably between 0 ° C and Allow to react at temperature for 10 minutes to 48 hours.
  • a suitable reducing agent usually from -78 ° C to; a temperature between LOO ° C, preferably between 0 ° C and Allow to react at temperature for 10 minutes to 48 hours.
  • Suitable reducing agents include, for example, sodium borohydride, sodium triacetoxyborohydride, sodium cyanoborohydride and the like, preferably sodium cyanoborohydride.
  • a catalyst amount to a solvent amount preferably 0.5 equivalent to a solvent amount, may be added to a suitable acid.
  • suitable acids include, for example, formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, propionic acid, hydrochloric acid and the like, preferably acetic acid.
  • Examples of the inert solvent include dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, dichloromethane, benzene, toluene, xylene, dimethyl ether, tetrahydrofuran, 1,4-dioxane, dimethylformamide, dimethylacetamide, Examples thereof include acetonitrile, hexane, formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, propionic acid, and hydrochloric acid, and these can be used alone or in combination. Preferably, tetrahydrofuran, acetic acid and the like are mentioned.
  • the conversion of each functional group in the compound (I) and the starting compound and the conversion of the functional group contained in the substituent can be performed by a known method [for example, Comprehensive “Organic Transformations 2nd edition” (Comprehensive Organic Transformation).
  • the compound (I) having a desired functional group at a desired position can be obtained by appropriately combining the above methods and the like.
  • Isolation and purification of intermediates and products in the above production methods are performed by appropriately combining methods used in ordinary organic synthesis, such as filtration, extraction, washing, drying, concentration, crystallization, and various types of mouth chromatography. be able to. Further, it can be carried out by a purification method commonly used in a general parallel synthesis method, for example, a purification method using a scavenger resin or an ion exchange resin. Further, the intermediate can be subjected to the next reaction without particular purification.
  • Some of the compounds (I) may exist as isomers such as positional isomers, geometric isomers, optical isomers or tautomers. Mixtures of the isomer and the isomers in any ratio can be used in the prophylactic and / or therapeutic agents for neutrophilic inflammatory diseases of the present invention.
  • the compound (I) may be purified as it is when a salt of compound (I) is obtained, and when compound (I) is obtained in a free form, compound (I) May be dissolved or suspended in a suitable solvent, and then isolated and 'purified' by adding an acid or a base.
  • the compound (I) or a pharmacologically acceptable salt thereof may be present in the form of an adduct with water or various solvents, and these adducts are also included in the present invention.
  • Tables 1 to 13 show specific examples of the compound (I) used as a prophylactic and / or therapeutic agent for neutrophilic inflammatory diseases of the present invention.
  • the range of compounds used as prophylactic and / or therapeutic agents for inflammatory diseases is not limited to these compounds.
  • a part of the compound (II) is known as a compound having a use other than a preventive and / or therapeutic drug for neutrophil inflammatory disease [JP 2002-30085, JP 2001-39874, JP-A-11-255750, GI 8 / 6,720, JP-A-7-165689, W095 / 2,596, JP-A-6-73047, FR2,693,197, WO94 / 450, EP569,013, EP546,449, EP 533,058, EP 543,491, EP 514, 197, .W094 / 22, 859, US 5,332,820, WOOO / 1,389, WO94 / 12,500 W091 / ll, 999, DE4,313,747, W093 / 24,487, EP400,974, EP399,73U Special Kaihei 6-73051, JP-A-6-360874, EP560,330, US5,151,435, EP520,724, EP520,72,72
  • Compound (II) can be produced by or according to the production methods described in the above-mentioned publications, etc., and quaternary ammonium salt of compound (II) or a pharmacologically acceptable salt thereof. Can also be produced in the same manner as in the case of compound (I).
  • the animal used for the method for screening a therapeutic agent for neutrophilic inflammatory disease is not particularly limited, and examples include mammals other than humans.
  • the substance that induces neutrophil infiltration in bronchoalveolar alveoli is not particularly limited, but includes SPC and the like.
  • FIG. 1 shows the inhibitory action of compound 1 on lipopolysaccharide WE.coli 055: B5 (manufactured by Sigma-Aldrich, hereinafter abbreviated as LPS) -induced neutrophil infiltration in the respiratory tract.
  • LPS lipopolysaccharide
  • FIG. 1 shows the inhibitory action of compound 1 on lipopolysaccharide WE.coli 055: B5 (manufactured by Sigma-Aldrich, hereinafter abbreviated as LPS) -induced neutrophil infiltration in the respiratory tract.
  • the symbols (##, * ⁇ ) mean the following, respectively.
  • ##: p 0.G021 (positive control group of negative control group compared; Student 3 s t-test) **:.
  • P 0.Q87 ( Compound 1 administration group of the positive control group ratio; Student 3 s t- test)
  • FIG. 2 shows the inhibitory effect of compound 1 on LPS-induced TNF-fibril production.
  • the symbols (##, * ') represent the following meanings, respectively.
  • FIG. 3 shows the inhibitory effect of Compound 1 on SPC-induced neutrophil infiltration in airways.
  • the symbols (###, *) represent the following meanings, respectively.
  • FIG. 4 shows the inhibitory effect of compound 1 on LPC-induced airway neutrophil infiltration.
  • the symbols (##, **) represent the following meanings, respectively.
  • FIG. 6 shows the inhibitory effect of Compound 1 on LPC-induced airway KC production.
  • the symbols (###, * ⁇ ) mean the following, respectively.
  • FIG. 8 shows the expression of GPR4 mRNA in airway infiltrating cells in an LPS-induced lung injury model.
  • FIG. 9 shows the expression of GPR4 mRNA in SPC-induced airway infiltrating cells.
  • Test example 1 GPR4 antagonism
  • the GPR4 bacterium cells obtained in Reference Example 61 the bacterium cells express GPR4 upon stimulation with 17-estradiol
  • 17 becomes L -? es' Toraji ol (17 -? Estradiol, sigma Co.) as diluted test compound 1 mol / L was added in the culture medium, 37 ° C, 5% C0 2 incubator Bae Isseki The reaction was carried out for 6 hours in one.
  • the reaction was stopped by adding a solution of Steady Glo Luciferase Assay System (manufactured by Promega), and the amount of luminescence per second was measured with a top count (Packard, Meriden, CT, USA).
  • the activity (antagonism) of the test compound was represented by an inhibition rate calculated based on the number of counts (count per second) with and without 17-estradiol as shown in the following formula.
  • Test Example 2 Inhibitory effect on LPS-induced lung injury model
  • BALB / c mice male, 7 weeks old, Nippon Charles River
  • LPS phosphatidylcholine
  • saline saline
  • Ql mL saline
  • BLF bronchoalveolar lavage fluid
  • Compound 1 was suspended in an aqueous solution (solvent) containing 0.5% of methylcellulose, and orally at 100 mg / k 1 hour before LPS administration.
  • a solvent was administered to the positive control group instead of the compound 1 suspension.
  • the neutrophil count was determined by preparing a coated sample from the collected BALF using Cytospin3 (Shandon, Inc., Pittsburgh, PA, USA), staining with light, and then counting under a microscope.
  • the TNF- ⁇ concentration in BALF was measured using Enzyme-noise kit (R & D systems, MN, USA). The test was performed with 7 animals per group.
  • the results of the neutrophil count are shown in FIG. 1, and the results of the TNF-serum concentration measurement are shown in FIG.
  • the number of neutrophils in BALF in the negative control group was 4 (0.12 ⁇ 0.1) xlO (mean S.E.R.) per individual, and in the positive control group (16.14 ⁇ 4.90)
  • the positive control group (16.14 ⁇ 4.90)
  • the number of neutrophils 9.59 ⁇ 2.4) ⁇ 4 was 4 and the increase in the number of neutrophils was suppressed by 41% compared to the positive control group.
  • the concentration of TNF-BA in BALF in the negative control group was 118 ⁇ 25 pg / mL (mean SEM), and in the positive control group was 3521 ⁇ 810 pg / mL, which was A significant increase in ⁇ concentration was observed.
  • the TNF-spin concentration was 1418 ⁇ 179 pg / mL, and the increase in TNF-spin concentration was suppressed by 62% compared to the positive control group.
  • This model is widely used as an ARDS evaluation model [Chest, Apr; 105 (4), pl241-5 (1994)].
  • Compound 1 was shown to be effective in this model, and it is considered that Compound (I) is also effective for ARD, S.
  • Test Example 3 Inhibitory effect on SPC-induced airway neutrophil infiltration
  • mice Male, 7 weeks old, Nippon Charles River
  • Alveolar lavage was performed on the mice, and neutrophil infiltration in the collected BALF was evaluated.
  • Compound 1 was suspended in an aqueous solution (solvent) containing 0.5% of methylcellulose, and 100 mg / kg was orally administered 1 hour before SPC administration. A solvent was administered to the positive control group instead of the compound 1 suspension.
  • Neutrophil infiltration was determined by measuring the total number of cells in the collected BALF using an automatic blood cell counter (Celltac MEK-6158; Nihon Kohden, Tokyo), and then applying the coated sample to Cytospin3 (Shandon, Inc., Pittsburgh). , PA, USA) and morphologically classified as neutrophils under a microscope and evaluated. Neutrophil count was calculated by multiplying the total cell count by the percentage of neutrophils. The test consisted of 7 animals in the negative control group, 5 animals in the positive control group, and 6 animals in the compound 1 administration group.
  • BALB / c mice male, 7 weeks old, Nippon Charles River
  • 1% / mL LPC solution or 0.1% bovine serum albumin phosphate buffer dissolved in 0.1% bovine serum albumin phosphate buffer 0.1 mL of the liquid (negative control group) was administered intratracheally, and alveolar lavage was performed 6 hours later, and neutrophil infiltration in the collected BALF was evaluated.
  • Compound 1 and Compound 18 were suspended in an aqueous solution (solvent) containing 0.5% methylcellulose, and orally administered at 10 mg / kg one hour before LPC administration. A solvent was administered to the positive control group instead of the compound 1 suspension.
  • the infiltration of neutrophils was determined by measuring the total number of cells in the recovered BALF using an automatic blood cell counter (Celltac MEK-6158; Nihon Kohden, Tokyo). , Pittsburgh, PA, USA) and counted neutrophils under a microscope. Neutrophil count was calculated by multiplying the total cell count by the percentage of neutrophils. The test was performed with 6 animals per group.
  • the neutrophil count in BALF of the negative control group was (0.13 ( ⁇ 0.07) xlO 5 (average soil standard error).
  • the positive control group (1.55 ⁇ 0.24) ⁇ 10 5 neutrophils were significantly increased.
  • the compound 1 administration group the number of neutrophils was (0.57 ⁇ 0.09) ⁇ 10 5 per individual.
  • the increase in neutrophil count was 71% suppressed in the compound 1 administration group.
  • BALB / c mice male, 7 weeks old, Nippon Charles River
  • 1% / mL LPC solution or 0.1% bovine serum albumin phosphate buffer dissolved in 0.1% bovine serum albumin phosphate buffer 0.1 mL of the solution (negative control group) was intratracheally administered, and 3 hours later, alveolar lavage was performed, and KC and MIP-2 in the collected BALF supernatant were evaluated.
  • Compound 1 was suspended in an aqueous solution (solvent) containing 0.5% methylcellulose and orally administered at 10 mg / kg one hour before LPC administration. A solvent was administered to the positive control group instead of the compound 1 suspension.
  • KC Keratinocyte-derived chemokine
  • the recovered BALF supernatant was collected and measured by ELISA kit (DuoSet, R & D Systems) according to a standard method. The test was performed with 6 animals per group.
  • KC and MIP-2 in BALF supernatant of the negative control group were 0.04 ⁇ 0.02 ng / mL and 0.06 ⁇ 0.02 ng / mL (mean standard error of standard) per animal, respectively. 1.75 ⁇ 0.11 ng / mL and 1.38 ⁇ 0.11 ng / mL showed significant increases in both cases.
  • the values were 0.80 ⁇ 0.14 ng / mL and 0.71 ⁇ 0.11 ng / mL, respectively, per individual.
  • KC and MIP-2 production were suppressed by 56% and 51%, respectively, in the compound 1 administration group.
  • Test Example 6 Analysis of GPR4 mRNA expression in airway infiltrating cells of LPS-induced lung injury model
  • GPR4 quantitative polymerase chain reaction
  • TaqMan probes and primers were designed and synthesized using Primer Express TM Version 1.5 (software manufactured by Applied Biosystems).
  • a TaqMan probe a probe corresponding to the nucleotide sequence at bases 577-601 (SEQ ID NO: 19) of DNA encoding SEQ ID NO: 14 (SEQ ID NO: 19) was synthesized (Suddy Technology Inc.).
  • primers the nucleotide sequences of nucleotides 549 to 570 (sense strand, SEQ ID NO: 20) and 604 to 622 (antisense strand, SEQ ID NO: 21) of DNA encoding mouse GPR4 (SEQ ID NO: 14)
  • a primer corresponding to was prepared and synthesized (Invitrogen). .
  • As an internal standard As an internal standard
  • G3PDH Glyceralde yde-3-phosphate dehydrogenase
  • the G3PDH sequence used sequence information of the G3PDH gene (GenBank accession number: M32599).
  • a probe was synthesized that matches the nucleotide sequence of the nucleotide number 784-813 (sequence number 22) of DM encoding mouse G3PDH (Suddy Technology Co., Ltd.).
  • primers corresponding to the nucleotide sequences of mouse G3PDH nucleotides 756-776 (sense strand, SEQ ID NO: 23) and nucleotides 816-836 (antisense strand, SEQ ID NO: 24) were set and synthesized ( Invitrogen).
  • G3PDH was synthesized by setting a primer corresponding to the nucleotide sequence of nucleotides 257 to 278 (SEQ ID NO: 25) of mouse G3PDH in order to prepare a plasmid for standard (Invitrogen).
  • Mouse GPR4 is a mouse lung cDNA of type III, SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21.
  • the PCR was performed using the above-mentioned cDNA 1 ju 0.25 ⁇ mol / L of each primer, 20 Q jumol / l of each dNTP (dATP, dGTP ⁇ dCTP ⁇ dTTP) Ampli Tag Gold (Applied Biosystems) 0.2 ⁇ L and 10 ⁇ PCR buffer ( (Attached to the enzyme.) ⁇
  • the reaction was performed using a reaction mixture of 40 L containing 4 L.
  • a DNA binding reaction was carried out by adding 50 ng of the PCR amplified fragment and pT7Blue T-vector, and Escherichia coli JM109 strain was transformed with the obtained recombinant plasmid DNA to obtain a plasmid pT7mrGPR4.
  • the nucleic acid sequence was confirmed using an ABI377 automatic sequencer (Applied Biosystems) to obtain a partial sequence of mouse GPR4 (SEQ ID NO: 26).
  • Mouse G3PDH used as an internal standard was obtained by performing PCR using a primer (SEQ ID NO: 25 ') and a primer (SEQ ID NO: 24) with cDNA derived from mouse ears as type II.
  • the PCR reaction was carried out using 1 ⁇ L of cMA and 0.2 mol / L of each primer, 200 ⁇ mol / L of each dNTP (dATP dGTP ⁇ dCTP dTTP) Advantage 2 polymerase mix (Clontech) 0.2 ⁇ L and 10 ⁇
  • the reaction was performed using a 50 L reaction solution containing PCR buffer-1 (Clontech). After heating at 95 ° C for 2 minutes using a thermal cycler PTC-200 (MJ RESEARCH), 30 cycles of 94 ° C for 15 seconds and 60 ° C for 1 minute were performed 30 times, and finally at 72 ° C. Perform treatment for 5 minutes.
  • the FCR product was subjected to agarose gel electrophoresis, and the fragment was purified.
  • the purified fragment was subcloned into pT7Blue T-vector (Novagen) by a DNA combination reaction.
  • a DNA binding reaction was performed by adding 50 ng of the PCR amplified fragment and pT7Blue T-vector, and Escherichia coli JM109 strain was transformed with the obtained recombinant plasmid DM to obtain plasmid pT7mg3-3.
  • the nucleic acid sequence was confirmed using an ABI377 automatic sequencer (Applied Biosystems) to obtain a partial sequence of mouse G3PDH (SEQ ID NO: 27).
  • RNA ' was prepared by SUPERSCRIPT Prearaplification System (Invitrogen) according to the attached manual. .
  • the quantification of GPR4 mRNA by TaqMan PCR was performed using ABI PRISM 7700 Sequence Detection System ('Applied Biosystems). PCR was performed using 15 ⁇ L of the above cDNA 1 j 2 x TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems II), 250 nmol / L of TaqMan probe (SEQ ID NO: 19), and 1 ⁇ mol / L of each primer (SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21). Using a 30 ⁇ ⁇ L reaction solution containing the mixture, hold at 50 ° C for 2 minutes and at 95 ° C for 10 minutes, and then repeat the cycle of 95 ° C for 15 seconds and 60 ° C for 1 minute 40 times. Was.
  • the expression level of GPR4 mRNA was calculated by calculating the ratio of GPR4 mRNA to G3PDH mRNA at each time, and expressed as a relative value with 1 being the reference LPS administration 0 hour. The results are shown in FIG. This indicated that GPR4 was expressed in cells invading BALF.
  • Test Example 7 Analysis of GPR4 mRNA expression in SPC-induced airway infiltrating cells.
  • GPR4 mRNA was quantified using the same method as in Test Example 6.
  • CDNA was prepared using Preamplification System (Invitrogen) according to the attached manual.
  • the quantification of GPR4mMA by TaqMan PCR was performed using ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems). PCR was performed using the above cMA 1 1L, 2 x TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems' (? T) 15 / L, TaqMan probe (SEQ ID NO: 19), 250 nmol / Ls primer (SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21) Using a 30 ⁇ L reaction solution containing 1 mol / L, hold at 50 ° C for 2 minutes and 95 ° C for 10 minutes, and then cycle for 400 seconds at 95 ° C for 15 seconds and 60 ° C for 1 minute.
  • mice Male, 7 weeks old, Nippon Charles River
  • a phosphate buffer solution LPS, NaGl: 9g, Na 2 HP0 4 ⁇ 7H 2 O: 0.795g, KH 2 P0 4: dissolving 0.144g of distilled water 1L, dissolved in those high-pressure steam sterilization
  • the lmL per 100g body weight was administered into the tail vein One hour later, blood was collected from the fundus to separate serum.
  • Test Example 9 Evaluation in a rat streptococcal cell wall-induced arthritis model
  • the rat streptococcal cell wall-induced arthritis model was determined by the method of Schi Ryuer et al. (Schimmer RC. Et al., J. Am., Et al.) Using a Lewis-type rat (female, 8 weeks old, Nippon Charles Riva). Im dish nol., 15i, 4103-4108, 1997). .
  • PG-PS 100P peptide glycan polysaccharide 100P derived from streptococcal cell wall (hereinafter referred to as SCW) (hereinafter referred to as PG-PS 100P, manufactured by Lee Laboratories) Dilute with sterile PBS to 0.6 mg / mL, and sonicate for 20 minutes using an ultrasonic cleaner (US-1 type, manufactured by Sennedy). It was administered into the hind limb joints. On the other hand, 10 / zL sterile PBS was injected into the left hind limb heel joint per animal.
  • SCW streptococcal cell wall
  • PG-PS 100P was diluted with sterile PBS to 0.2 mg / mL and sonicated for 20 minutes at 100 ⁇ g / 500 L / animal via the tail vein.
  • test compound 1 was suspended in a 0.5 w / v% methylcellulose solution, and once a day from the sensitization on days 21 to 24, each animal was orally administered lmL per 100 g of body weight.
  • a 0.5 w / v% methylcellulose solution was orally administered to the solvent-administered group.
  • the hind limb volume of the rat was measured with a plethysmother TK-101 (manufactured by Unicom), and the edema volume change was calculated according to the following formula. .
  • Edema inhibition rate (%) [(A-B) / (A-C)] X 100
  • A Change in edema volume in the solvent administration group
  • B Change in edema volume in the test compound administration group
  • Compound 1 was suspended in a 0.5 w / v% methylcellulose 400 cP (MC, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) solution at 3 and 10 mg / mL to form a drug suspension.
  • a solvent (0.5 w / v% MC) and a drug suspension were orally administered to the solvent-administered group and the drug-administered group at a volume of 10 mL / kg 3 hours before and 10 hours after the start of cigarette smoke exposure.
  • the unexposed group did not receive solvent administration or cigarette smoke exposure.
  • Bronchoalveolar lavage was performed 24 hours after cigarette smoke exposure.
  • rats were anesthetized by intraperitoneal administration of somnopentyl (Takeda Schering, Brau Animal Health), and BAL was performed with phosphate buffered saline. (ICN) through tracheal force neura. Got '.
  • BALF total white blood cell count was measured using an automatic blood cell counter (Nihon Kohden).
  • a smear of the cells was prepared, stained with Giemsa, observed under an optical microscope, and the number of neutrophil cells was counted to calculate the ratio.
  • the neutrophil count was calculated by multiplying the total leukocyte count by the neutrophil cell count ratio.
  • Compound 1 suppressed the increase in neutrophils in BALF by 62 and 64% in the vehicle-administered group at doses of 30 and 100 mg / kg, respectively. In other words, administration of the compound suppressed neutrophil infiltration into the lungs.
  • C0PD is a condition that includes chronic bronchitis and emphysema almost exclusively. Neutrophil infiltration into the vesicle is observed (Thorax, 53, 137-147, 1998). One of the main causes of COPD is thought to be smoking (Tho rax, 53, 137-147, 1998). From the above results in Test Example 10, which is widely used as a pathological model for COPD, compound (I) or a pharmacologically acceptable salt thereof can provide a therapeutic and / or prophylactic effect against lung diseases such as C0PD it is conceivable that.
  • the medicament according to the present invention is a substance that suppresses the function related to signal transmission of a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, complementary to an oligonucleotide consisting of 15 to 60 consecutive bases selected from the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12.
  • -Containing tricyclic compound represented by formula (I) or a quaternary ammonium salt thereof such as an antibody that recognizes a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, such as an oligonucleotide having a specific sequence or an oligonucleotide derivative thereof.
  • the above-mentioned substance which is an active ingredient may be administered as it is, but generally, a medicament comprising the above-mentioned substance which is an active ingredient and one or more pharmaceutical additives is used. It is desirable to administer it in the form of a composition.
  • a pharmaceutical composition can itself be produced according to a method known or commonly used in the field of pharmaceuticals.
  • the medicament according to the present invention in the form of a pharmaceutical composition may contain one or more active ingredients of another medicament.
  • the medicament of the present invention is applicable to mammals including humans.
  • Administration route of the medicament of the present invention is not particularly limited, oral administration or: other appropriately selecting the most effective route of administration for the treatment and / or prophylaxis of any of the parenteral administration of intravenous administration, etc.
  • preparations suitable for oral administration include, for example, tablets and the like, and examples of preparations suitable for parenteral administration include, for example, injections.
  • preparations suitable for parenteral administration can be preferably prepared using an aqueous medium isotonic with human blood.
  • an injection is prepared using an aqueous medium selected from a salt solution, a glucose solution, a mixture of saline and a glucose solution, and the like, and prepared as a solution, suspension, or dispersion together with appropriate auxiliaries according to a conventional method.
  • a aqueous medium selected from a salt solution, a glucose solution, a mixture of saline and a glucose solution, and the like, and prepared as a solution, suspension, or dispersion together with appropriate auxiliaries according to a conventional method.
  • appropriate auxiliaries for example, one or more selected from diluents, flavors, preservatives, excipients, disintegrants, lubricants, binders, surfactants, plasticizers, etc. Can also be used.
  • the dose and frequency of administration of the medicament of the present invention are not particularly limited, and the kind, administration route, treatment and Z or prevention purpose of the active ingredient, age and weight of the patient, nature and severity of symptoms It can be appropriately selected according to various conditions such as. For example, it is preferable to administer 0.1 to 100 mg Zkg per adult per day in 3 to 4 divided doses. However, these dosages and the number of administrations vary depending on the above-described various conditions and the like. The present invention will be described more specifically with reference examples and examples, but the scope of the present invention is not limited by these examples and the like.
  • the resin in the reaction mixture was separated by filtration, and the residue was purified by ion-exchange chromatography (Bondecyl SCX, manufactured by Varian, eluting with a 2 mol / L ammonia-methanol solution) to give the desired compound 5 to compound 12. Obtained.
  • the structure of the compound is shown in Table 1, and the analytical values (APCI-MS) are shown in Table 14.
  • Reference Example 11 1 Compound 18 (1— [8— (2-Ethyl—5,7—dimethyl-3H—midamide) Synthesis of azo [4,5-pyridine-13-ylmethyl) -1 10,11-dihydro-5H-dibenzo [t), f] azepine-12-ylmethyl] .piperidine-1-4-yl ⁇ methanol Compound 15 was used in the same manner as in Reference Example 10 except that Compound 18 was used in a yield of 50%.
  • Reference Example 1 2 Compound 19 (N- [8- (2-ethyl-5,7-dimethyl-3—-imidazo [4,5-b] pyridin-3-ylmethyl)) 10, 11—Jihidoro 5 ⁇ —Dipenza
  • Step 1 Carboxaldehyde (0.300 g, 0.73 mmol) was suspended in a mixed solvent of tetrahydrofuran (10 mL) and chloroform (6 mL), and 2- (pyrrolidin-1-yl) ethylamine (139 mL, (1.10 mmol) and heated to reflux for 10 minutes.
  • reaction solution was cooled to room temperature, sodium triacetoxyborohydride (464 mg, 2.19 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 12 hours.
  • Ethyl acetate and an aqueous solution of lmol / L sodium hydroxide were added to the reaction solution, and the organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate.
  • Compound 25 was obtained in the same manner as in Reference Example 1 as a fumarate.
  • Reference Example 30 Compound 9 9 ⁇ 2-pen Ziroxymethyl-8- (2-ethyl-5,7-dimethyl-13H-imidazo [4,5-b] pyridine-13-ylmethyl) -10,11-dihydro-5H-dibenzo [b, f] azepine ⁇ Composition.
  • Compound 100 was obtained in a yield of 38% in the same manner as in Reference Example 25 using 2-phenylethanol instead of methanol.
  • the acetic acid (10,11-dihydro-5H-dibenzo [b, f] azepine-12-ylmethyl) ester (2.85 g, 10.7 mmol) obtained in Step 1 was suspended in methanol (110 mL), and sodium methoxide / A methanol solution (38%, 1.14 mL, 5.36 ft) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour.
  • the reaction solution was concentrated, and a saturated aqueous solution of sodium chloride and chloroform were added to the residue, and the mixture was extracted three times with chloroform.
  • the organic layers were combined, dried over anhydrous magnesium sulfate, and concentrated.
  • the reaction solution was diluted with ethyl acetate, washed sequentially with water, water, and saturated saline, dried over anhydrous magnesium sulfate, and concentrated.
  • Reference Example 46 Compound 1 15 ⁇ 8— (2-ethyl-5,7-dimethyl-3H-imidazo [4,5-b] pyridin-3-ylmethyl) -1 10,11 —Synthesis of dihydro-5H—dibenzo [b, f] azepine-12-potassium ribonate (2-hydroxyethyl) amide
  • Example 54 Compound 1 23 ⁇ 1- [8- (2-Ethyl-5,7-dimethyl-1H-midazo [4,5-b] pyridine_3-ylmethyl) -1 5-Methyl-10,11-Dihi Synthesis of Dro-5H-dibenzo [b, .f] azepine-12-ylmethyl] piperidine-14-ylmethanol
  • pSV21) sr (manufactured by Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.) was digested with Zml'I and il, and treated with Klenow to obtain a 2.6 kb PvuII (blunt end) — I ⁇ RI (blunt end) fragment.
  • Gal4-ER chimeric gene [Cell, Vol. 54, pp. 199 (1988), Procedurals of the national academy of the science of ob. ER-hi AF2 in pM (distributed by Shigeaki Kato of the University of Tokyo) containing Boomerica (Pro Natl. Acad. Sci. USA), Vol. 90, p. 1657 (1993) Then, it was treated with Klenow to obtain a 1 ⁇ (blunt end) -Ndel (blunt end) fragment.
  • Plasmid pGERbsrR2 was obtained by ligating the 3 ⁇ 411 (blunt end) -RI (blunt end) fragment from pSV2bsr and the ⁇ (blunt end) -Ndel (blunt end) fragment from ER and AF2 in pM described above. Was created.
  • pGERbsrR2 is a yeast
  • pcDNA3 (Invitrogen) was digested with ⁇ ; and treated with Klenow to obtain a 1 (smooth end) fragment.
  • PCDNA3 from which one cleavage site had been deleted was constructed.
  • the PCDNA3 from which the II cleavage site had disappeared was cleaved with IMI, and treated with Klenow to obtain a Kml (blunt end) fragment.
  • UCDNA3 in which the Xhol and Kpnl cleavage sites were eliminated was constructed.
  • the plasmid was digested with Bg_lII, treated with Klenow to obtain a ⁇ II (blunt end) fragment.
  • pAMoERC3Sc Japanese Unexamined Patent Publication No. 05-336963 was digested with I and I, followed by Klenow treatment to obtain a 2.2 kb 1 (blunt end)- ⁇ 1 (blunt end) fragment containing the oriP sequence.
  • Plasmid PCDNA3 is obtained by joining the ⁇ ill (flat end) fragment derived from pcDNA3 and the 3 ⁇ 4oI (blunt end) -LI (blunt end) fragment derived from MMoERC3Sc, in which the above-mentioned 1 and l cleavage sites have been eliminated. — Created oriP.
  • One oriP of pcDNA3 was cut with ⁇ I and EiIII to obtain an Xhol-Hindlll fragment.
  • Plasmid pASd lucl was constructed by ligating the fragments.
  • Plasmid pcDM3-oriP-Sdl-pA was constructed by binding the double-stranded DNA to an I-HMI fragment derived from pcDNA3-oriP-Sdl.
  • pcDNA3-oriP-Sdl One pA was cut with ⁇ I, and then treated with Klenow to obtain a 1 (flat end) fragment.
  • pFR-luc manufactured by Straugene
  • Siidlll and lHI After pFR-luc (manufactured by Straugene) was digested with Siidlll and lHI, it was treated with Klenow to obtain a 0.14 kb Hidlll (blunt end) -to-lHI (blunt end) fragment.
  • pAGalSdl contains a promoter with a sequence of 5 repeats of the Gal4p response element (UASG). After cutting pAGalSdl with EcoRI, Klenow treatment and EcoRI (Blunt ends) Fragments were obtained. The pSE01uc2 (W098 / 14474) was cut with udlll and ⁇ l and treated with Klenow to obtain a 1.7 kb iiiidlll (blunt end) -Sacl (blunt end) fragment containing the firefly luciferase gene.
  • Plasmid pAGalSdl-luc was constructed by ligating the aforementioned Si dlll (blunt end) — (blunt end) fragment derived from pSE01uc2 and the EcoRI (mutual end) fragment derived from GalSdl.
  • the plasmid pAGal9-luc was constructed by subjecting the DNA fragment to Klenow treatment and self-ligating.
  • the expression plasmid pAGal9-luc having oriP of Epstein-Barr virus was digested with SiHdlll and ⁇ l to obtain a 6.9 kb lidlll- ⁇ l fragment containing oriP.
  • pAMo-d Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-211885 was digested with ndl II and 1, and a liiidlll-1 fragment containing a tetracycline resistance gene (Tc R ) was obtained.
  • the phorucyl luciferase gene portion in pAGal9-luc is ligated to the pAMo-d Stuffer sequence.
  • pAGal9-luc was digested with Sindlll and ⁇ I to obtain a Hindlll-Sacl fragment of 6.9 kb.
  • pAMo-nd Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-211885
  • idi II and ⁇ I were cut with idi II and ⁇ I to obtain a Hiadin fragment containing a tetracycline resistance gene.
  • Namalwa KJM-1 cells are serum-free adapted B cell lines that express the EBNA-1 gene. .
  • the transformed cell in RPMI1640 ⁇ ITPSG medium CRPMI1640 medium 8 ml (Nissui Pharmaceutical), 1/40 volume of 7.5% NaHC0 3, 3% 200 negation ol / LL - (manufactured in Bitorojen Co.) glutamine solution, 0.5% Penicillin 'streptomycin solution (Invitrogen, 5,000 imits / ml penicillin, 5, ⁇ / zg / ml. Streptomycin), 10 t ol / L N-2-hydroxyxyl piperazine-N, -2-ethanesulfonic acid
  • Blasticidin S (KK-400: manufactured by Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.) to 2.0 ⁇ g / ml and dispense into a 96-well plate (500-2000 cells / well) to culture.
  • Strain transformed with pGERbsrR2 integrated into chromosomal DNA (KK-400: manufactured by Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.)
  • pAGalSdl-luc was introduced by the electroporation method and cultured for 2 days. After culturing, add 17? -Stradiol (E8875: Sigma) (final concentration lOnmol / L), and after culturing for another 24 hours, measure the luciferase activity.
  • E8875 17? -Stradiol
  • lOnmol / L final concentration lOnmol / L
  • the activity was measured using a luminometer LB953 (manufactured by Peltold) and a cell lysis buffer [1% Triton X-100, 100 mmol / LKH 2 PO 4 (pH 7.8), lmmol / L dithiolase] tall] IOO I, 'after automatic injection into the culture medium, a substrate solution [25 Momori 1 / L grayed' Rishirugurishin ( ⁇ 7.8), 15 s Awakening ol / L MgS0 4, 5 mmol / L .ATP, 0.33 thigh ol / L luciferin] 300 ⁇ 1 was auto-injected and the amount of luminescence for 10 seconds was measured to determine luciferase activity. For comparison, the luciferase activity under the condition without 175-estradiol was also measured.
  • a luminometer LB953 manufactured by Peltold
  • a cell lysis buffer [1% Triton X-100, 100 m
  • KJMGER8 cells were selected.
  • Reference Example 59 Construction of Reporter Plus Mid pACREpluc Using Firefly Luciferase as Reporter
  • pACREpluc a repo overnight plasmid capable of expressing the luciferase gene under the control of the cAMP response element (CRE), was constructed by the following method.
  • pACREpluc has the hygromy'sin resistance gene and the Epstein-Barr-virus oriP.
  • pAGal9-luc was digested with l and ndlll to obtain an I-idi II fragment containing oriP and GaUUAS.
  • plasmid pAGal9h was constructed.
  • a double-stranded DNA containing two CRE sequences was prepared by annealing synthetic oligonucleotides having the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 5 and 6. The double-stranded DNA was ligated with the above-mentioned all-11 ⁇ 1 fragment derived from pBluescriptll KS + to construct plasmid pBS-CREI containing two CRE sequences.
  • pBS-CREI is a plasmid in which the double-stranded DM is integrated in the direction in which the ⁇ I cleavage site and one cleavage site are regenerated, and has one of the above-mentioned cleavage sites.
  • pBS-CREI was cut with Seal and 3 ⁇ 4oI to obtain a Scal-Xhol fragment containing ori of phage fl.
  • PBS—CREI was cut with Seal and Sail to obtain a Seal-Sail fragment containing ColEl ori.
  • the -Xhol fragment and ⁇ I-Sail fragment derived from pBS-CRE I were ligated to construct pBS-CREII containing four CRE sequences.
  • pBS-CREII was cut with Seal and Xhol to obtain a Seal-Xhol fragment containing ori of phage fl.
  • PBS-CREII was cut with Seal and Sail to obtain a Seal-Sail fragment containing ColEl ori.
  • the Seal-Sail fragment was ligated to construct pBS-CREIV containing eight CRE sequences.
  • uBS-CREIV was cut with Seal and Xhol to obtain a Seal-Xhol fragment containing ori of phage fl.
  • PBS-CREIV was cut with Seal and Sail to obtain a Seal-Sail fragment containing ColEl ori.
  • the Seal-Sail fragment was ligated to construct pBS_CREVIII containing 16 CRE sequences.
  • the pBS-CREVIII was digested with 1, digested with Klenow, and further digested with Hind'III to obtain a ldlll-1 (blunt end) fragment containing 16 CREs.
  • pAGalSdl was cut with Mlul and Hindlll to obtain a 1.4 kb Mlul-Hindlll fragment.
  • pAGal9h was digested with XI, treated with Klenow, and further digested with MiI to obtain an Xbal (blunt end) -Mlul fragment.
  • the plasmid pACREh was constructed by ligating the Hindlll-Xhol (blunt-ended) fragment derived from PBS-CREVIII, the Sindlll fragment derived from pAGalSdl, and the (blunt-ended) -Ell fragment derived from pAGal9h.
  • ACREh was digested with XhoI and Noj.I to obtain a l fragment containing the CRE sequence.
  • Plasmid pACREluc was constructed by ligating the 11 il fragment derived from pAGal9-luc and the Xhol-Notl fragment derived from pACREh.
  • pGL3-Enhancer vector Promega cut with Hindlll and Hpal, containing luc + gene (modified firefly 'luciferase gene)
  • Hindlll-Hpal fragment was obtained. After pACRElucH was cut with] ⁇ il, it was treated with Klenow, and further cut with ndlll to obtain an ilidlll-Notl (blunt end) fragment containing CRE.
  • a plasmid pACREpluc was constructed by ligating a Hindlll-Hpal fragment derived from the pGL3-Enhancer vector and a Hindi II-Notl (blunt end) fragment derived from pACRElucH.
  • Reference Example 60 Construction of GPR4-induced expression plasmid
  • Single-stranded cDNA was synthesized by SUPERSCRIPT First-Strand Synthesis System for RT-PCR (manufactured by Gibco) using lg of mRNA derived from human lung (manufactured by Clontech).
  • GPR4C DNA was obtained by PCR using solution 51 obtained by diluting the single-stranded cDNA 250-fold with water as type III, and synthetic DNA having the sequences shown in SEQ ID NOs: 7 and 8 as GPR4 gene-specific primers. .
  • the sequence of the GPR4 gene-specific primer was designed based on the sequence information of the GPR4 gene (GenBank accession number: U21051). PfuTurbo DNA Polymerase (Stratagene) was used as the enzyme.
  • a 10-fold concentrated buffer added to the enzyme to be used was used as a buffer for performing PCR.
  • PCR was performed using a thermal cycler DNA engine (manufactured by MJ Research) at 95 ° C for 5 minutes, followed by a reaction consisting of 94 ° C for 1 minute, 60 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 1 minute. Was performed by performing 30 cycles.
  • the amplified GPR4 cDNA fragment was cut with Hindlll and NotI, which cut the designed sequence on the primer.
  • the fragment containing GPR4 cDNA was recovered by agarose gel electrophoresis.
  • the cleaved fragment was inserted between Hindlll and NotI of plasmid pAGal9-nd to construct GPR4-induced expression plasmid pAGal9-GPR4. ⁇
  • GPR4-induced expression plasmid pAGal9-GPR4 (2 jug) and repo overnight plasmid pACREpluc (2 ⁇ -g) were co-transfected into KJMGER8 of 6 ⁇ 10 6 cells by the above-mentioned electroporation method.
  • the transformant strain were suspended in RPMI1640 ⁇ ITPSG medium 8 ml, in C0 2 incubator primary, cultured for 24 hours at 37 ° C. After cultivation, add blasticidin S (2.0 zg / ml), hygromycin B (300 ⁇ g / ml) and dineteicin (500 g / ml), and further cultivate for 14 days. (Referred to as Atsushi cells).
  • the transformant was subcultured on RPMI1640 • ITPSG medium containing plastisin S (2.0 / zg / ml), hygromycin B (300 / g / ml) and dienetin (500 ⁇ g / inl).
  • control plasmid pAGal9-nd (2 jug) and reporter plasmid pACREpluc (2 jug) were co-transfected into KJMGER8 to obtain a stable transformant (called a control cell).
  • Reference Example 62 Cloning of DNA encoding mouse-derived human GPR4 homolog
  • Nucleotide sequence information of human GPR4 gene Based on the above, a search was conducted using the NCBI database. As a result, a mouse genome sequence (AC073784) and a plurality of Expression sequence tag (EST) sequences (BF178464, AA968193, AA798732, AI840893, AI851037) were selected as sequences having high homology.
  • the nucleotide sequence of the gene constructed from the mouse genomic sequence and EST is shown in SEQ ID NO: 14, and the amino acid sequence of the polypeptide encoded by the gene is shown in SEQ ID NO: 13.
  • the amino acid sequence of human GPR4 was compared with the amino acid sequence of human GPR4 using an analysis program [GENETYXWIN ver. 5.0 (manufactured by Software)], and a 92.7% match was found.
  • polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 was a mouse human GPR4 homolog (mouse GPR4).
  • the DNA encoding mouse GPR4 can be obtained by converting a mouse cDNA library, which can be commercially available or prepared by a known method, into a type I, and an oligonucleotide that can be designed and synthesized based on the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 14 as a primer set. Can be obtained by the PCR used for Reference Example 63: Cloning of DNA encoding human GPR4 homolog from rat
  • oligonucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 were prepared.
  • cDM prepared from rat lung-derived mRNA was used for type I, and dNTP (dATP ⁇ dGTP) was used so that the concentration of each component described below was 200 mol / L. ⁇ dCTP ⁇ dTTP), Tag Gold (part A reaction solution containing 2.5 units of IX Taq Gold (Mg plus) buffer (Perkin Elmer) was prepared and PCR was performed under the following conditions.
  • Plasmid PT7RG was obtained from a transformant obtained by transforming Escherichia coli JM109 strain using the obtained recombinant plasmid DNA by a conventional method. As a result of determining the entire nucleotide sequence of plasmid pT7RG, PT7RG contained a cDNA of about l.lkb having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18.
  • SEQ ID NO: 17 shows the amino acid sequence of the polypeptide encoded by the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 18.
  • the amino acid 'sequence was compared with the amino acid sequences of human and mouse GPR4 using an analysis program [GENETYX WIN ver. 5.0 (manufactured by Software)]. As a result, 93.0% and 99.2% matches were found, respectively.
  • polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 was a rat human GPR4 homolog (rat GPR4).
  • a tablet having the following composition is prepared by a conventional method.
  • Formulation Compound 1 20 mg
  • a prophylactic and / or therapeutic agent for neutrophilic inflammatory disease a nitrogen-containing tricyclic compound or a quaternary ammonium salt thereof or a quaternary ammonium salt thereof, which contains a substance that inhibits the function related to GPR4 signal transduction as an active ingredient
  • a prophylactic and / or therapeutic agent for neutrophilic inflammatory disease containing a pharmacologically acceptable salt as an active ingredient, a compound represented by the above formula (II) or a quaternary ammonium salt thereof or
  • the present invention provides a prophylactic and / or therapeutic agent for neutrophilic inflammatory diseases, which contains such a pharmacologically acceptable salt as an active ingredient.
  • SEQ ID NO: 7 Description of Artificial Sequence :: Synthetic MA SEQ ID NO: 8—Description of Artificial Sequence: Synthetic ⁇ SEQ ID NO: 9—Description of Artificial Sequence: Synthetic ⁇ SEQ ID NO: 10 Description of Artificial Sequence: Synthetic MA SEQ ID NO: 15 Description of Artificial Sequence: Synthetic MA SEQ ID NO: 16 —Description of artificial sequence: Synthetic DNA SEQ ID NO: 19 —Description of artificial sequence: Synthetic DNA SEQ ID NO: 20 Description of artificial sequence: Synthetic DM SEQ ID NO: 21 Description of artificial sequence: Synthetic DNA SEQ ID NO: 22 Description of sequence: Synthetic DM SEQ ID NO: 23 Description of artificial sequence: Synthetic DNA SEQ ID NO: 24 Description of artificial sequence: Synthetic DNA SEQ ID NO: 25 Description of artificial sequence: Synthetic DM

Description

明 細 書
好中球性炎症疾患の予防および/または治療剤
技術分野
本発明は、 GPR4のシグナル伝達に関する機能を抑制する物質を有効成分と して含有する好中球性炎症疾患の予防および/または治療剤に関する。また 本発明は、含窒素三環式化合物もしくはその四級アンモ ウム塩またはそれ らの薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する好中球性炎症疾患 の予防および/または治療剤に関する。 ·
背景技術
好中球は、 炎症部位に浸潤し、 スーパーォキサイ ドア二オン、 炎症性サイ トカインである腫瘍壊死因子（TNF ) -ひ等を産生し、炎症を促進する作用を有 している。 慢性閉塞性肺疾患 （C0PD) 、 関節炎、 敗血症、 虚血再灌流障害、 肺繊維症等種々の炎症性疾患で好中球の関与が示唆されている（ラボラトリ — ' インべスティゲーシヨン （Laboratory Investigat i on) 、 2000年、 80 卷、 p . 617-653 )。また、好中球の浸潤は、好中球遊走因子により誘導される。 したがって、 好中球遊走因子の産生または好中球の浸潤を抑制することが、 これらの炎症性疾患の治療に重要であると考えられている。
好中球が閧与する炎症疾患としては、 C0PD、 関節炎、 敗血症、 虚血再灌流 障害および肺繊維症以外にも、 例えば、 肺気腫、 慢性気管支炎、 急性呼吸窮 迫症候群 (ARDS )、 急性肺損傷（ALI )、 鼻炎、 サルコィ ドーシス、 間質性肺炎、 関節リウマチ、 ペーチヱッ ト病、 シヱーングレン症候群、 強皮症、 乾癬、 ァ トビー性皮膚炎、 接触性皮膚炎、 尊麻疹、 血管炎、 紅斑、 結膜炎、 好酸球増 多症、 プドウ膜炎、 円形脱毛症、 湿疹、扁平苔癬、 水疱症、 天疱症、 直腸炎、 好酸球性胃腸炎、肥満細胞症、クローン病、潰瘍性大腸炎、食物アレルギー、 多発性硬化症、 ァテローム性動脈硬化症、 後天性免疫不全症候群 （AIDS ) 、 全身性エリテマトーデス、 橋本病、 ネフローゼ症候群、 重症筋無力症、 I型 糖尿病、 好酸球性筋膜炎、 高 I gE血漿、 ライ病、 紫斑病、 移植片拒絶、 扁平 上皮がん、 肺がん、 嚢胞性繊維症、 脳卒中、 心臓および末梢肢における再灌 流障害、 痛風、 過敏性腸症候群、 炎症性肺疾患、 炎症性大腸疾患、 肝炎、 脬 炎、 アレルギー、 潰瘍、 肺繊維症以外の繊維症、 偏頭痛、 心疾患、 循環器疾 患、炎症性皮膚疾患、放射線による炎症、髄膜炎等の炎症、虚血（心筋梗塞、 脳虚血、 骨格筋虚血、 腸虚血等） 、 脳障害、 内毒症、 石綿沈着症等が知られ ている （WO00/62766、 US2003/191088、 EP1262176, US6627621) 。
GPR4は、 G蛋白質共役型レセプター蛋白質 （以下、 GPCRと略す）.であり、 脂質であるスフインゴシルホスホリルコリン （SPC) ゃリゾホスファチジル コリン （LPC) と結合し、 シグナルを伝達することおよび GPR4発現細胞の遊 走を誘導することが報告されている [ジャーナル ·ォブ ·バイオロジカル . ケミス トリ一 （J . Bi o l . C em . ) 、 276卷、 p .41325- 41335 ( 2001年） ] 。
GPCRとしては、 細胞内で過剰に発現すると、 リガンドが存在しなくてもシ グナルを流す、 構成活性型 GPCRと呼ばれる GPCRも知られている。 リガンド非 存在時に流れるシグナルは構成的活性と呼ばれる。構成活性型 GPCRには、 天 然に存在するものと、 アミノ酸の置換、 欠失等の変異を導入することにより 造成された変異 GPCR [モレキュラー'フアルマコロジー（Mo l . Pharmacol . ) , 57巻、 890頁 （2000年） 、 W098/46995] がある。 GPCRの構成的活性を抑制す るアン夕ゴニス トはィンバースァゴニス トと呼ばれる。
また、 ブレチン ·デ · ラ · ソシェテ · シミヅク （Bul letin de la Soci ete Chimique 、 185頁 （1981年） およびョ一口ビアン ' ジャーナル 'ォブ ' メ ディシナル ' ケミストリー （Eur . J . Med . Chem . ) 、 12卷、 219頁 （1977年） に、 後述の式 （I ) において R1がモルホリノを表し、 R2、 R3および R4が水素を 表し、 Yに相当する置換基がモルホリノであり、 nが 1を表し、 Xが-（CH2 ) 2 -を 表す化合物が開示されている。
発明の開示 ,
本発明の目的は、 GPR4のシグナル伝達に関する機能を抑制する物質を有効 成分として含有する好中球性炎症疾患の予防および/または治療剤、含窒素 三環式化合物もしくはその四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学的に 許容される塩を有効成分として含有する好中球性炎症疾患の予防および/ または治療剤、 後述の式 （I I ) で表される化合物もしくはその四級アンモニ ゥム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する 好中球性炎症疾患の予防および/または治療剤等を提供することである。 本発明は、 以下の（ 1 )〜（ 1 3 )に関する。 ( 1 )配列番号 11記載のアミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関す る機能を抑制する物質を有効成分として含有する好中球性炎症疾患の予防 および/または治療剤。 '
( 2 ) 好中球性炎症疾患が、 慢性閉塞性肺疾患（C0PD )である第 （ 1 ) 項記載 の好中球性炎症疾患の予防および/または治療剤。
( 3 ) 以下の 1 ) 〜4 )
1 )配列番号 12記載の塩基配列から選ばれる連続した 15〜60塩基からなるォ リゴヌクレオチドの相補的配列を有するオリゴヌクレオチドまたは該オリ ゴヌクレオチド誘導体、，
2 )配列番号 14記載の塩基配列から選ばれる連続した 15〜 60塩基からなるォ リゴヌクレオチドの相補的配列を有するオリゴヌクレオチドまたは該オリ ゴヌクレオチド誘導体、
3 )配列番号 18記載の塩基配列から選ばれる連続した 15〜 60塩基からなるォ リゴヌクレオチドの相補的配列を有するオリゴヌクレオチドまたは該オリ ゴヌクレオチド誘導体、
4 )配列番号 12、 14および 18から選ばれるいずれか一つに記載の塩基配列を 有する DNAとストリンジェントな条件下でハイプリダイズし、 かつ配列番号 11記載のァミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関する機能を抑制 する 15〜60塩基からなるオリゴヌクレオチドまたは該オリゴヌクレオチド 誘導体、
のいずれか一つを有効成分として含有する好中球性炎症疾患の予防および /または治療剤。 '
( 4 ) 以下の 1 ) 〜4 )
1 ) 配列番号 11記載のアミノ酸配列を有する蛋白質を認識する抗体、
2 ) 配列番号 13記載のァミノ酸配列を有する蛋白質を認識する抗体、 3 ) 配列番号 17記載のァミノ酸配列を有する蛋白質を認識する抗体、
4 )配列番号 11、 13および 17から選ばれるいずれか一つに記載のアミノ酸配 列において一つ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列を 有し、かつ配列番号 11記載のアミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に 関する機能を有する蛋白質を認識する抗体、 のいずれか一つを有効成分として含有する好中球性炎症疾患の予防および /または治療剤。
( 5 ) 式 （I )
Figure imgf000006_0001
[式中、 R1は置換もしくは非置換の複素環基、 -腿5 R6 (式中、 R5および R6は同 一または異なって水素、 置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは 非置換のシクロアルキル、 置換もしくは非置換の低級アルケニル、 置換もし くは非置換の低級アルキニル、 置換 しくは非置換のァラルキル、 または置 換もしくは非置換の複素環アルキルを表すか、 R5および Rsが隣接する窒素原 子と一緒になって置換もしくは非置換の複素環基を形成する）、- OR7 (式中、 R7は水素、 置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換の低級 アルカノィル、 置換もしくは非置換のシクロアルキル、 置換もしくは非置換 の低級アルケニル、 置換もしくは非置換の低級アルキニル、 置換もしくは非 置換のァリール、 置換もしくは非置換のァラルキル、 または置換もしくは非 置換の複素環アルキルを表す） 、 - SR7a (式中、 R7aは前記 R7と同義である） 、 - C0NR5aRSa (式中、 および R6aはそれそれ前記 R5および前記 R6と同義である）、 -C02R7b (式中、 R7bは前記 R7と同義である） 、 ホルミルまたはシァノを表し、 R2は水素、 置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換のシク 口アルキル、 置換もしくは非置換の低級アルケニル、 置換もしくは非置換の 低級アルキニル、 置換もしくは非置換のァラルキル、 または置換もしくは非 置換の複素環アルキルを表し、
R3および R4は同一または異なって水素、 低級アルキル、 またはハロゲンを表 し、
nは 0または 1を表し、
Xは-（CH2 ) 2-または- CH=CH-を表し、 Yは式 (A)
Figure imgf000007_0001
(式中、 Wは CHまたは窒素原子を表し、
Z1および Z2は同一または異なって水素、置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換,もしくは非置換の低級アルケニ ル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のァリール、 置換もしくは非置換のァラルキル、または置換もしくは非置換の複素環アル キルを表すか、 Z1および Z2がそれそれが隣接する 2つの炭素原子と一緒にな つて置換もしくは非置換の芳香環を形成するか、 または Z1および Z2がそれそ れが隣接する 2つの炭素原子と一緒になつて置換もしくは非置換の複素環 を形成し、
Z3は水素、 置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換のシク 口アルキル、 置換もしくは非置換の低級アルケニル、 置換もしくは非置換の 低級アルキニル、 置換もしくは非置換のァリール、 置換もしくは非置換の複 素環基、 置換もしくは非置換のァラルキル、 または置換もしくは非置換の複 素環アルキルを表す） を表す] で表される含窒素三環式化合物もしくはその 四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩を有効成分と して含有する好中球性炎症疾患の予防および/または治療剤。
( 6 ) R1が -腿5 であり、 ^および が隣接する窒素原子と一緒になつて置換 もしくは非置換の複素環基を形成する第 （ 5 )項記載の好中球性炎症疾患の 予防および/または治療剤。
( 7 ) R2が水素である第 （ 5 ) 項または第 （ 6 ) 項に記載の好中球性炎症疾 患の予防および/または治療剤。
( 8 ) R3および R4が水素である第 （ 5 ) 項〜第 （ 7 ) 項のいずれかに記載の 好中球性炎症疾患の予防および/または治療剤。 ( 9 ) Z1および Z2がそれぞれが隣接する 2つの炭素原子と一緒になつて置換 もしくは非置換の複素環を形成する第 （ 5 ) 項〜第 （ 8 ) 項のいずれかに記 載の好中球性炎症疾患の予防および/または治療剤。
( 1 0 ) 第 （ 5 ) 項〜第 （ 9 ) 項のいずれかに記載の含窒素三環 ¾化合物も しくはその四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩の 有効量を投与することを特徴とする、好中球性炎症疾患の予防および/また は治療方法。
( 1 1 ) 好中球性炎症疾患の予防および/または治療剤の製造のための第
( 5 ) 項〜第 （ 9 ) 項のいずれかに記載の含窒素三環式化合物もしくはその 四級アンモニゥム塩またはそれら C 薬理学的に許容される塩の使用。
( 1 2 ) 式 （I I )
Figure imgf000008_0001
{式中、 RAは水素、 置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置 換のシクロアルキル、 置換もしくは非置換の低級アルケニル、 置換もしくは 非置換の低級アルキニル、 置換もしくほ非置換のァリール、 置換もしくは非 置換のァラルキル、 置換もしくは非置換のァコイル、 置換もしくは非置換の 複素環基、 または置換もしくは非置換の複素環アルキルを表し、
A1- A2- A3- A4は CRC-CRD=CRE (式中、 Rcヽ RDおよび REは同一または異なって、 そ れそれ前記 RAと同義である） 、 CRB=GRC-CR =CRE (式中、 RB、 Rcヽ RDおよび REは 同一または異なって、 それそれ前記 RAと同義である） 、 N=CRe- N=CHE (式中、 RGおよび REは同一または異なって、 それぞれ前記 RAと同義である） または CRB=C C-N=CRE (式中、 RB、 Reおよび REは同一または異なって、 それそれ前記 RAと同義である） を表し、 Qは、 置換もしくは非置換めフエ二レン （但し、 置換フヱニレンにおける置 換基はシァノ、 ニトロ、 C0NH2、 - NHS02RQ (式中、 RQは前記 RAと同義である） および低級アルコキシカルボニルではない）、 置換もしくは非置換のナフチ レン（但し、置換ナフチレンにおける置換基はシァノ、ニトロ、 C0NH2、 -NHS02RQ (式中、 RQは前記 RAと同義である） および低級アルコキシカルボニルではな い） 、 炭素数 2〜6で窒素、 酸素および硫黄から任意に選ばれる原子数 1〜4 である置換もしく,は非置換の不飽和もしくは部分的に不飽和の 5〜7員の単 環式複素環から 2つの水素原子が除かれた基 （但し、 炭素数 2〜6で窒素、 酸 素および硫黄から任意に選ばれる原子数 1〜4である置換の不飽和もしくは 部分的に不飽和の 5〜7員の単環式複素環における置換基はシァノ、 ニトロ、 C0NH2、 - NHS02RQ (式中、 ^は前記 RAと同義である），および低級アルコギシ力 ルポニルではない） 、 炭素数 4〜10で窒素、 酸素および硫黄から任意に選ば れる原子数 1〜4である置換もしくは非置換の不飽和もしくは部分的に不飽 和の環構成原子数が 8〜1 1の二環式複素環から 2つの水素原子が除かれた基 <但し、 炭素数 4〜10で窒素、 酸素および硫黄から任意に選ばれる原子数 1 〜4である不飽和もしくは部分的に不飽和の環構成原子数が 8〜11の二環式 複素環から 2つの水素原子が除かれた基が、
Figure imgf000009_0001
{式中、
Xは x [式中、 Rxは水素、 置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしく は非置換のシクロアルキル、 置換もしくは非置換の低級アルカノィル、 置換 もしくは非置換のシクロアルキルカルボニル、置換もしくは非置換のァリ一 ル、 置換もしくは非置換のァラルキル、 置換もしくは非置換のァ.ロイルまた は置換もしくは非置換の芳香族複素璟基 （テトラゾリルを除く） を表す] 、 酸素原子または硫黄原子を表し、
Yは窒素原子または CRX1 〔式中、 Rxlは水素、 低級アルキル、 以下の置換基群 A から選ばれる同一のまたは異なる.1〜3の置換基で置換された低級アルキル [置換基群 A：ハロゲン、 ヒドロキシ、 ホルミル、 ト リフルォロメチル、 ビ ニル、 スチリル、 フエ二ルェチニル、 ァロイル、 置換もしくは非置換の脂環 式複素璟基および置換もしくは非置換の芳香族複素環基（テトラゾリルを除 く） ] 、 置換もしくは非置換のシクロアルキル、 置換もしくは非置換の低級 アルカノィル、 置換もしくは非置換のシクロアルキルカルボ；ル、 置換もし くは非置換のァリール、 置換もしくは非置換のァラルキル、 置換もしくは非 置換のァロイル、 置換もしくは非置換の芳香族複素環基（テトラゾリルを除 く） 、 式 （A1) .
—— Q— V ~ R6 (A1)
' {式中、 Q- - -Vは CR7x=CR8x [式中、 R7xおよび R8xは同一または異なって、水素、 低級アルコキシカルボニル、 置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もし くは非置換のシクロアルキル、 置換もしくは非置換の低級アルカノィル、 置 換もしくは非置換のシクロアルキルカルボニル、置換もしくは非置換のァリ ール、置換もしくは非置換のァロイルまたは置換もしくは非置換の芳香族複 素環基 （テトラゾリルを除く） を表す] または C≡Cを表し、
R6は水素、低級アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換の低級アルカノ ィル、 置換もしくは非置換のシクロアルキルカルボニル、 置換もしくは非置 換のァリール、置換もしくは非置換のァロイルまたは置換もしくは非置換の 芳香族複素環基 （テトラゾリルを除く） を表す }
または式 （B1)
Figure imgf000010_0001
[式中、 nalは 0〜3の整数を表し、 alおよび "は、 同一または異なって水 素、 ハロゲン、 低級アルコキシカルボニル、 置換もしくは非置換の低級アル キル、 置換もしくは非置換のシクロアルキル、 置換もしくは非置 の低級ァ ルカノィル、 置換もしくは非置換のシクロアルキルカルボニル、 置換もしく は非置換のァリール、置換もしくは非置換のァロイルまたは置換もしくは非 置換の芳香族複素環基 （テトラゾリルを除く） を表すか、 または R9alと R9bl が隣接する炭素原子と一緒になつて飽和脂肪族環を形成し、
R1Qxは置.換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換のシクロア ルキル、 置換もしくは非置換の低級アルカノィル、 置換もしくは非置換のシ クロアルキルカルボニル、 置換もしくは非置換のァラルキル、 置換もしくは 非置換のァリール、置換もしくは非置換のァロイルまたは置換もしくは非置 換の芳香族複素璟基 （テトラゾリルを除く） を表す] を表す〕 を表す } を表 すときは、 炭素数 4〜； 10で窒素、 酸素および硫黄から任意に選ばれる原子数 1 〜4である置換の不飽和もしくは部分的に不飽和の環構成原子数が 8〜11の 二環式複素環から 2つの水素原子が除かれた基における置換基は二ト口、シ ァノおよび低級アルコキシカルボニルではない >、
式 （B)
Figure imgf000011_0001
[式中、 A5は- CR G- (式中、 Rpおよび RGは同一または異なって、 水素、 置換 もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換のァリール、 置換もし くは非置換の複素環基、 カルボキシ、 低級アルコキシカルボニル、 またはモ ノもしくはジ低級アルキルアミノカルボニルを表す）、 - CRFRG- CRHRj- (式中、 RFおよび RGはそれそれ前記と同義であり、 RHおよび はそれそれ前記 Rpおよび RGと同義である） 、 -N=CRH- (式中、 RHは前記と同義である） 、 - CRF=N- (式 中、 Rpは前記と同義である） 、 - CRp=CI H- (式中、 RFおよび RHはそれそれ前記 と同義である）、 - 0CR¾ （式中、 RHおよび はそれそれ前記と同義である）、 -CRFRG0- (式中、 RFおよび RGはそれそれ前記と同義である） 、 -SOnlCR¾J- (式 中、 RHおよび^はそれそれ前記と同義であり、 nlは 0〜2の整数を表す） 、 -CRFR¾Onl- (式中、 Rp、 RGおよび nlはそれぞれ前記と同義である） 、 - 0-、 ま たは- S0nl- (式中、 nlは前記と同義である） を表し、
A6は- CRPaRGa- (式中、 RPaおよび RGaはそれぞれ前記 および RGと同義である）、 -C (=0 ) -または-腿11- (式中、 RRは前記 RAと同義である） を表し、
Rsは、 水素、 置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換のシ クロアルキル、 置換もしくは非置換の低級アルケニル、 置換もしくは非置換 の低級アルキニル、 置換もしくは非置換のァリール、 置換もしくは非置換の ァラルキル、 置換もしくは非置換のァロイル、 置換もしくは非置換の複素環 基、 置換もしくは非置換の複素環アルキル、 ハロゲン、 シァノ、 ニトロ、 ヒ ドロキシ、 カルボキシ、 ァミノ、 低級アルコキシ、 またはモノもしくはジ低 級アルキルァミノを表し、
環 Eはベンゼン環、 または窒素、 酸素および硫黄から任意に選ばれる元素を 1 個以上有する芳香族複素環を表す] 、 または式 （C)
Figure imgf000012_0001
(式中、 RS1、 RT、 RUおよび Rvは同一または異なって、 水素、 置換もしくは非 置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換のシクロアルキル、 置換もしくは 非置換の低級アルケニル、 置換もしくは非置換の低級アルキニル、 置換もし くは非置換のァリール、 置換もしくは非置換のァラルキル、 置換もしくは非 置換のァロイル、 置換もしくは非置換の複素環基、 置換もしくは非置換の複 素環アルキル、 ハロゲン、 シァノ、 ニトロ、 ヒドロキシ、 カルボキシ、 アミ ノ、 低級アルコキシ、 またはモノもしくはジ低級アルキルアミノを表し、 Ru および Rvは同一または異なって、 さらに低級アルコキシカルボニル、 または モノもしくはジ低級アルキルアミノカルボニルであってもよい） を表し、 Tは単結合、 - 0-、 - S -、 -SO-、 - S02-、 - NRK- (式中、 RKは前記 RAと同義である）、 - C(=0)-、 - C(=0) NRK- (式中、 RKは前記と同義である） 、 -NRKC(=0)- (式中、 RKは前記と同義である）、 - 0CH2-、 - CH20-、 -SCH2-、 - S0CH2-ヽ - S02CH2-ヽ -CH2S -、 - CH2S0-、 - CH2SOr、 -NRKCR¾M - (式中、 RKは前記と同義であり、 RLおよび RM は同一または異なって、 それそれ RAと同義である） 、 - NRKS02- (式中、 RKは 前記と同義である） 、 -S02NRK- (式中、 RKは前記と同羲である） 、 - CR MNRK -
(式中、 RK、 RLおよび RMはそれそれ前記と同義である）、 - CH2CH2-、 -CH=CH -、 -CH(0RKA)- (式中、 RKAは前記 RAと同義である） 、 -CH(0C0RKB)- (式中、 RKB は前記 RAと同義である） 、 または- CH(NRK¾KD)- (式中、 RKGおよび RKDは同一ま たは異なって、 それそれ前記 RAと同義である） を表し、
Uは単結合、 -（C¾)ml CR¾P- (式中、 mlは 0〜2の整数を表し、 RKおよび Rpは同 一または異なって、 それそれ前記 RAと同義である） 、 または置換もしくは非 置換のフエ二レンを表し、
Vはカルボキシ、 テトラゾール- 5-ィル、 - C0NH2、 - C0NHS.02RQ (式中、 RQは前 記 RAと同義である） 、 -S03RQ (式中、 RQは前記と同義である） 、 - S02NHRQ (式 中、 は前記と同義である） 、 - S02NHC0RQ (式中、 RQは前記と同義である） 、 -S02NHC0NRRAREB (式中、 RRAおよび HRBは同一または異なって、 それそれ前記 RA と同義である）、 -匪 S02RQ (式中、 RQは前記と同義である）、 - P(0)(0R )(0RRD) (式中、 RRCおよび R は同一または異なって、それそれ前記 RAと同義である）、 置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニル、 シァノ、 またはニトロを 表す }
で表される化合物もしくはその四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学 的に許容される塩を有効成分として含有する好中球性炎症疾患の予防およ び/または治療剤。
( 1 3 ) Qが下式
Figure imgf000014_0001
[式中、 Rs、 RT、 Huおよび Rvは同一または異なって水素、 置換もしくは非置 換の低級アルキル、 置換もしくは非置換のシクロアルキル、 置換もしくは非 置換の低級アルケニル、 置換もしくは非置換の低級アルキニル、 置換もしく は非置換のァリール、 置換もレくは非置換のァラルキル、 置換もしくは非置 換のァロイル、 置換もしくは非置換の複素環基、 置換もしくは非置換の複素 環アルキル、 ハロゲン、 シァノ、 ニトロ、 ヒドロキシ、 カルボキシ、 ァミノ、 低級アルコキシ、 またはモノもしくはジ低級アルキルァミノを表し、 A5および A6はそれそれ前記と同義であり、
B3、 B4および B5は同一または異なって- 0-または- S-を表し、
B ま- CRR- (式中、 RRは前記と同義である） または- N-を表し、
環 Eはベンゼン環、 または窒素、 酸素および硫黄から任意に選ばれる元素を 1 個以上有する芳香族複素環を表す] で表される第 （ 1 2) 項記載の好中球性 炎症疾患の予防および/または治療剤。
さらに本発明は以下の （ 1 4) 〜 （ 4 8) に関する。
( 14 ) 式 （I)
Figure imgf000015_0001
(式中、 n、 R R2、 R3、 R\ Xおよび Yはそれそれ前記と同義である） で表さ れる含窒素三環式化合物もしくはその四級アンモニゥム塩またはそれらの 薬理学的に許容される塩。
( 1 5 ) . R1が- NR5R6であり、 R5および が隣接する窒素原子と一緒になつて置 換もしくは非置換の複素環基を形成する第 （ 1 4)項に記載の含窒素三環式 化合物もしくはその四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学的に許容さ れる塩。
( 1 6 ) R2が水素である第 （ 1 4 ) 項または第 （ 1 5 ) 項に記載の含窒素三 環式化合物もしくはその四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学的に許 容される塩。
( 1 7 ) および R4が水素である第 （ 1 4) 項〜第 （ 1 6 ) 項のいずれかに 記載の含窒素三璟式化合物もしくはその四級アンモニゥム塩またはそれら の薬理学的に許容される塩。
( 1 8 ) Z1および Z2がそれそれが隣接する 2つの炭素原子と一緒になつて置 痪もしくは非置換の複素環を形成する第 （ 1 4) 項〜第 （ 1 7 ) 項のいずれ かに記載の含窒素三環式化合物もしくはその四級アンモニゥム塩またはそ れらの薬理学的に許容される塩。
( 1 9 ) 第 （ 1 4 ) 項〜第 （ 1 8 ) 項のいずれかに記載の含窒素三環式化合 物もしくはその四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学的に許容される 塩を有効成分として含有する医薬。
( 2 0 ) 第 （ 1 4 ) 項〜第 （ 1 8 ) 項のいずれかに記載の含窒素三環式化合 物もしくはその四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学的に許容される 塩を有効成分として含有する配列番号 11記載のアミノ酸配列を有する蛋白 質のシグナル伝達に関する機能の抑制剤。
(2 1 ) 以下の工程 1 ) 〜4) 1 )ヒトを除く哺乳類動物に SPCまたは LPCを気道内投与することによりヒト を除く哺乳類動物における気管支肺胞に好中球浸潤を誘発する工程、
2 )試験化合物存在下または非存在下での SPCまたは LPCにより誘発されたヒ トを除く哺乳類動物における気管支肺胞中の好中球浸潤を測定する工程、
3 )試験化合物存在下と試験化合物非存在下での SPCまたは LPCにより誘発さ れたヒトを除く哺乳類動物における気管支肺胞中の好中球浸潤を比較する 工程、 および
4)試験化合物から SPCまたは LPCにより誘発された気管支肺胞中の好中球浸 潤を減少させる物質を選択する工程、
を含む好中球性炎症疾患治療剤のスクリーニング法。
( 22 ) 配列番号 11記載のアミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に 関する機能を抑制する物質の有効量を投与することを特徴とする、好中球性 炎症疾患の予防および/または治療方法。
( 2 3 ) 第 （ 3 ) 項に記載の 1 ) 〜4 ) のいずれか一つのオリゴヌクレオチ ドまたは該オリゴヌクレオチド誘導体の有効量を投与することを特徴とす る、 好中球性炎症疾患の予防および/または治療方法。
( 24 ) 第 （4) 項に記載の 1 ) 〜4 ) のいずれか一つの抗体の有効量を投 与することを特徴とする、好中球性炎症疾患の予防および/または治療方法。
( 2 5 )好中球性炎症疾患の予防および/または治療剤の製造のための、 配 列番号 11記載のアミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関する機能 を抑制する物質の使用。
( 2 6 )好中球性炎症疾患の予防および/または治療剤の製造のための、 第
( 3 ) 項に記載の 1 ) 〜4) のいずれか一つのォリゴヌクレオチドまたは該 オリゴヌクレオチド誘導体の使用。 '
( 2 7 )好中球性炎症疾患の予防および/または治療剤の製造のための、 第
(4) 項に記載の 1 ) 〜4 ) のいずれか一つの抗体の使用。
( 28 ) 好中球性炎症疾患が、 関節炎、 敗血症および急性呼吸窮迫症候群 (ARDS)から選ばれる好中球性炎症疾患である第 （ 1 )項記載の好中球性炎症 疾患の予防および/または治療剤。
( 2 9 ) 好中球性炎症疾患が、 慢性閉塞性肺疾患（C0PD)、 関節炎、 敗血症お よび急性呼吸窮迫症候群（ARDS)から選ばれる好中球性炎症疾患である第
( 3 ) 項記載の好中球性炎症疾患の予防および/または治療剤。
( 3 0 ) 好中球性炎症疾患が、 慢性閉塞性肺疾患（C0PD)、 関節炎、 敗血症お よび急性呼吸窮迫症候群 (ARDS)から選ばれる好中球性炎症疾患である第
( 4 ) 項記載の好中球性炎症疾患の予防および/または治療剤。
( 3 1 ) 配列番号 11記載のアミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に 関する機能を抑制する物質の有効量を投与することを特徴とする、慢性閉塞 性肺疾患（C0PD)、 関節炎、 敗血症および急性呼吸窮迫症候群（ARDS)から選ば れる好中球性炎症疾患の予防および/または治療方法。
( 3 2 ) 第 （ 3 ) 項に記載の 1 ) 〜 4 ) のいずれか一つのオリゴヌクレオ,チ ドまたは該オリゴヌクレオチド誘導体の有効量を投与することを特徴とす る、 慢性閉塞性肺疾患（C0PD)、 関節炎、 敗血症および急性呼吸窮迫症候群 (ARDS)から選ばれる好中球性炎症疾患の予防および Zまたは治療方法。
( 3 3 ) 第 （4 ) 項に記載の 1 ) 〜4 ) のいずれか一つの抗体の有効量を投 与することを特徴とする、 慢性閉塞性肺疾患（C0PD)、 関節炎、 敗血症および 急性呼吸窮迫症候群（ARDS)から選ばれる好中球性炎症疾患の予防および/ または治療方法。
( 3 4 ) 慢性閉塞性肺疾患（C0PD)、 関節炎、 敗血症および急性呼吸窮迫症候 群（ARDS)から選ばれる好中球性炎症疾患の予防および/または治療剤の製 造のための、 配列番号 11記載のアミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝 達に関する機能を抑制する物質の使用。
( 3 5 )慢性閉塞性肺疾患（C0PD)、 関節炎、 敗血症および急性呼吸窮迫症候 群（ARDS)から選ばれる好中球性炎症疾患の予防および/または治療剤の製 造のための、 第 （ 3 ) 項記載に記載の 1 ) 〜4 ) のいずれか一つのオリゴヌ クレオチドまたは該ォリゴヌクレオチド誘導体の使用。
( 3 6 )慢性閉塞性肺疾患（C0PD)、 関節炎、 敗血症および急性呼吸窮迫症候 群（ARDS)から選ばれる好中球性炎症疾患の予防および/または治療剤の製 造のための、 第 （4 ) 項に記載の 1 ) 〜4 ) のいずれか一つの抗体の使用。
( 3 7 ) 第 （ 5 ) 項〜第 （ 9 ) 項のいずれかに記載の含窒素三環式化合物も しくはその四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩を 有効成分として含有する慢性閉塞性肺疾患（ COPD )の予防および/または治 療剤。
(38 ) 第 （ 5 ) 項〜第 （ 9 ) 項のいずれかに記載の含窒素三環式化合物も しくはその四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩の 有効量を投与することを特徴とする、慢性閉塞性肺疾患（COPD)の予防および /または治療方法。
(3 9 )慢性閉塞性肺疾患（COPD)の予防および または治療剤の製造のため の第（ 5 ) 項〜第 （ 9 ) 項のいずれかに記載の含窒素三環式化合物もしくは その四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩の使用。
(40 ) 第 （ 5 ) 項〜第 （ 9 ) 項のいずれかに記載の含窒素三環式化合物も しくはその四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩を 有効成分として含有する関節炎の予防および/または治療剤。
(4 1 ) 第 （ 5) 項〜第 （ 9 ) 項のいずれかに記載の含窒素三環式化合物も しくはその四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩の 有効量を投与することを特徴とする、関節炎の予防および/または治療方法。
(42 ) 関節炎の予防および/または治療剤の製造のための第 （5 ) 項〜第
( 9 )項のいずれかに記載の含窒素三環式化合物もしくはその四級アンモニ ゥム塩またはそれらの薬理学的に許^される塩の使用。
(43 ) 第 （ 5) 項〜第 （ 9 ) 項のいずれかに記載の含窒素三環式化合物も しくはその四級アン 二ゥム'塩またはそれらの薬理学的に許容される塩を 有効成分として含有する敗血症の予防および/または治療剤。
(44 ) 第 （ 5) 項〜第 （ 9 ) 項のいずれかに記載の含窒素三環式化合物も しくはその四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩の 有効量を投与することを特徴とする、敗血症の予防および/または治療方法。
(45 ) 敗血症の予防および/または治療剤の製造のための第 （5 ) 項〜第
( 9 )項のいずれかに記載の含窒素三環式化合物もしくはその四級アンモニ ゥム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩の使用。
(46 ) 第 （ 5 ) 項〜第 （ 9 ) 項のいずれかに記載の含窒素三環式化合物も しくはその四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩を 有効成分として含有する急性呼吸窮迫症候群（ARDS)の予防および/または 治療剤。
( 4 7 ) 第 （ 5 ) 項〜第 （ 9 ) 項のいずれかに記載の含窒素三環式化合物も しくはその四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩の 有効量を投与することを特徴とする、急性呼吸窮迫症候群（ARDS )の予防およ び/または治療方法。
( 4 8 )急性呼吸窮迫症候群（ARDS )の予防および/または治療剤の製造のた めの第 （ 5 ) 項〜第 （ 9 ) 項のいずれかに記載の含窒素三環式化合物もしく はその四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩の使用。 すなわち、 本発明により、 第 （ 1 4 ) 項〜第 ( 1 8 ) 項に記載される新規 な含窒素三環式化合物もしくはその四級アンモニゥム塩またはそれらの薬 理学的に許容される塩が提供され、 それらを有効成分として含有する医薬、 および配列番号 1 1記載のァミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に 関する機能の抑制剤が提供される。 また、 好中球性炎症疾患治療剤のスクリ 一ニング法も提供される。
本発明者らは、 GPCRである GPR4の有するシグナル伝達に関する機能を抑制 する物質が、好中球性炎症疾患の予防および/または治療に有効であるとの 新知見を見い出し、 本発明を完成するに至った。 また、 本発明者らは、 構成 活性型の GPCRである GPR4の構成的活性を抑制する物質の探索を行い、 GPR4 の構成的活性を抑制する物質が、好中球性炎症疾患の予防および/または治 療に有効であることを見い出した。
GPR4の有するシグナル伝達に関する機能を抑制する物質としては、 GPR4 自身の発現を阻害または抑制する物質、 リガンドの GPR4への結合を阻害する 物質、 GPR4へのリガンド結合により生ずるシグナル伝達 [例えば、細胞内 cAMP 濃度の変化、 細胞内 Ca2+濃度の変化、 mitogen- act ivated prote in (MAP )キナ —ゼのリン酸化等が含まれる]を抑制する物質、 GPR4の構成的活性により生 ずるシグナル伝達を抑制する物質（例えば GPR4のインバースァゴニス ト等が 含まれる） 、 抗体依存性細胞障害活性 （ADCC活性） 等により GPR4発現細胞を 減少させる物質等が含まれる。上記物質は、 これら機能を有する物質であれ ば、 その構造は特に限定されず、 公知の構造を有するものでもよい。 GPR4 としては、 例えば配列番号 11、 13および 17から選ばれるいずれか一つに記載 のアミノ酸配列を有する蛋白質、 あるいは配列番号 11、 13および 17から選ば れるいずれか一つに記載のアミノ酸配列において一つ以上のアミノ酸が欠 失、 置換または付加したアミノ酸配列を有し、 かつ配列番号 11記載のァミノ 酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関する機能を有する蛋白質等が挙 げられる。
好中球性炎症疾患としては、 C0PD、 虚血再灌流障害、 肺気腫、 慢性気管支 炎、 AMS、 ALI、 鼻炎、 サルコィ ドーシス、 間質性肺炎、 肺繊維症、 敗血症、 関節炎、.関節リウマチ、 ベ一チヱッ ト病、 シヱーングレン症候群、 強皮症、 乾癬、 アトピー性皮膚炎、 接触性皮膚炎、 蓐麻疹、 血管炎、 紅斑、'結膜炎、 好酸球増多症、 ブドゥ膜炎、 円形脱毛症、 湿疹、扁平苔癬、水疱症、 天疱症、 直腸炎、 好酸球性胃腸炎、 肥満細胞症、 クローン病、 潰瘍性大腸炎、 食物ァ レルギ一、 多発性硬化症、 ァテローム性動脈硬化症、 AIDS、 全身性エリテマ トーデス、 橋本病、 ネフローゼ症候群、 重症筋無力症、 I型糖尿病、 好酸球 性筋膜炎、 高 IgE血漿、 ライ病、 紫斑病、 移植片拒絶、 扁平上皮がん、 肺が ん、 嚢胞性繊維症、 脳卒中、 心臓および末梢肢における再灌流障害、 .痛風、 過敏性腸症候群、炎症性肺疾患、炎症性大腸疾患、肝炎、腌炎、 アレルギー、 潰瘍、 肺繊維症以外の繊維症、 偏頭痛、 心疾患、 循環器疾患、 炎症性皮膚疾 患、 放射線による炎症、 髄膜炎等の炎症、 虚血 （心筋梗塞、 脳虛血、 骨格筋 虚血、 腸虚血等） 、 脳障害、 内毒症、 石綿沈着症等が挙げられる。
配列番号 11、 13および 17から選ばれるいずれか一つに記載のアミノ酸配列 において一つ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列を有 し、かつ配列番号 11記載のアミノ酸配歹 IJを有する蛋白質のシグナル伝達に閧 する機能を有する蛋白質は、文献 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual , Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press ( 1989年) (以下、 モレキュラー · クロ一ニング第 2版と略す） 、 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley h Sons (1987- 1997年） （以下、 カレン ト · プロトコ一ルズ 'ィン 'モレキュラー 'バイオロジーと略す）、 Nucleic Acids Research, 10, 6487 ( 1982) 、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 7i, 6409 (1982 ), Gene, 34, 315 (1985)、 Nucleic Acids Research, U, 4431 (1985)、 Proc. Natl . Acad . Sc i . USA , 82 > 488 ( 1985 )等] 記載の部位特異的変異導入法を 用いて、 例えば配列番号 11、 13および 17から選ばれるいずれか一つに記載の アミノ酸配列を有する蛋白質をコードする DNAに部位特異的変異を導入する ことにより、 取得することができる。
欠失、 置換または付加したアミノ酸の数は特に限定されないが、 1個〜数 十個、 好ましくは 1〜20個、 より好ましくは 1〜10個、 さらに好ましくは 1〜5 個である。
配列番号 11、 13および 17から選ばれるいずれか一つに記載のアミノ酸配列 において一つ以上のアミノ酸残基が欠失、 置換または付加したとは、 該アミ ノ酸配列中の任意かつ 1もしぐは複数の位置において、 1または複数のアミ ノ酸残基の欠失、 置換または付加があることを意味し、 欠失、 置換または付 加が同時に生じてもよく、 欠失、 置換または付加されるアミノ酸残基につい ては、 天然型と非天然型とを問わない。 天然型アミノ酸残基としては、 L - ァラニン、 L-ァスパラギン、 アスパラギン酸、 L-グル夕ミン、 L-グル夕ミ ン酸、 グリシン、 L-ヒスチジン、 L-イソロイシン、 ' L-ロイシン、 L-リジン、 L -アルギニン、 L -メチォニン、 L-フエ二ルァラニン、 L-プロリン、 L-セリン、 L-スレオニン、 L-トリプトファン、 L-チロシン、 L-バリンおよび L-システィ ンの各残基等が挙げられる。 '
以下に、 相互に置換可能なァミノ酸残基の好ましい例を示す。 同一群に含 まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
A群： ロイシン、 イソロイシン、 ノルロイシン、 ノ、 'リン、 ノルバリン、 ァ ラニン、 2-アミノブタン酸、 メチォニン、 0 -メチルセリン、 tert-ブチルグ リシン、 tert-プチルァラニン、 シクロへキシルァラニン
B群：ァスパラギン酸、 グルタミン酸、 イソァスパラギン酸、 イソグル夕 ミン酸、 2-アミノアジピン酸、 2-アミノスペリン酸
C群：ァスパラギン、 グルタミン
D群： リジン、 アルギニン、 オル二チン、 2 , 4-ジァミノブタン酸、 2 , 3- ジァミノプロピオン酸
E群： プロリン、 3-ヒドロキシプロリン、 4-ヒドロキシプロリン
F群：セリン、 スレオニン、 ホモセリン G群： フエ二ルァラニン、 チロシン
また、 配列番号 11、 13および 17から選ばれるいずれか一つに記載のァミノ 酸配列において一つ以上のアミノ酸残基が欠失、置換または付加したアミノ 酸配列を有する蛋白質が、配列番号 11記載のアミノ酸配列を有する蛋白質の シグナル伝達に関する機能を有するには、 そのアミノ酸配列と配列番号 11 記載のアミノ酸配列とが、 少なくとも 75%以上、 通常は 80%以上、 好ましく は 90%以上、 さらには 95%以上の同一性を有していることが好ましい。 アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、 Karlin and Aitschulによるァルゴ リズム B'LAST[Pro. Natl, Acad. Sci. USA, 90, 5873 ( 1993 ) ]や FASTA[Methods Enzymol., 183, 63 ( 1990 ) ]を用いて決定することができる。 このアルゴリ ズム BLASTに基づいて、 BLASTN (塩基対塩基データペース） や BLASTX (塩基 対アミノ酸データベース）とよばれるプログラムが開発されている [J. Mol. Biol. , 215, 403 (1990 )] 。 BLASTに基づいた BLASTNによって塩基配列を解析 する場合には、 パラメ一夕一は例えば score = 100、 wordlength=12とする。 また、 BLASTに基づいて BLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、 パラメ一夕一は例えば score=50、 wordlength= 3とする。 BLASTと Gapped BLASTプログラムを用いる場合には、 各プログラムのデフオルトパラメ一夕 一を用いる [Gapped BLASTについては文献 (Nuc. Acids Res. , 25, 3389-3402 (1997 )) を参照] 。 これらの解析方法の具体的な手法は公知である
(http://www.ncbi . nlm.nih.gov. 。
GPR4自身の発現を阻害または抑制する物質としては、例えば、配列番号 12、 14および 18から選ばれるいずれか一つに記載の塩基配列から選ばれる連続 した 15〜 60塩基からなるオリゴヌクレオチドの相補的配列を有するオリゴ ヌクレオチド （以下、 アンチセンス ·オリゴヌクレオチドともいう） 、 配列 番号 12、 14および 18から選ばれるいずれか一つに記載の塩基配列を有する ΜΑとストリンジヱントな条件でハイブリダィズし、 かつ配列番号 11記載の アミノ酸配列を有する蛋白質の発現を阻害または抑制するオリゴヌクレオ チド、 これらのオリゴヌクレオチドの誘導体 （以下、 オリゴヌクレオチド誘 導体という） 等が挙げられる。
上記アンチセンス ·オリゴヌクレオチドとしては、 配列番号 12、 14および 18から選ばれるいずれか一つに記載の塩基配列から選ばれる連続した 15〜 60塩基からなるオリゴヌ レオチドの相補的配列を有するアンチセンス 'ォ リゴヌクレオチドであれば特に限定されないが、 好ましくは 17〜60塩基、 よ り好ましくは 20〜60塩基、さらに好ましくは 30〜60塩基からなるオリゴヌク レオチドの相補的配列を有するアンチセンス 'オリゴヌクレオチドが挙げら れる。特に好ましくは上記ォリゴヌクレオチドの翻訳開始領域の相補的配列 を有するアンチセンス 'オリゴヌクレオチドが挙げられる。 該アンチセン ス ·オリゴヌクレオチドは、 配列番号 12、 14および 18から選ばれるいずれか 一つに記載の塩基配列またはその断片の塩基配列に関する情報に基づき、常 法により、 例えば A合成機を用いることにより調製することができる。 オリゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジェ ステル結合がホスホロチォエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘 導体、 オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合が N3 5 -P55 ホスホア ミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド 中のリボースとリン酸ジエステルとの結合がぺプチド核酸結合に変換され たオリゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のゥラシルが C- 5プロ ピニルゥラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチ ド中のゥラシルが C- 5チアゾリルゥラシルで置換されたォリゴヌクレオチド 誘導体、 オリゴヌクレオチド中のシトシンが C-5プロピニルシトシンで置換 されたオリゴヌクレオチド誘導体、ォリゴヌクレオチド中のシトシンがフエ ノキサジン修飾シトシン （phenoxazine- modif i ed cytos ine ) で置換された オリゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のリボースが 2， - 0-プロ ピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド 中のリボースが 2， -メ トキシェトキシリボースで置換されたォリゴヌクレオ チド誘導体等をあげることができる 〔細胞工学， ϋ, 1463 ( 1997 )〕 。
上記アンチセンス 'オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体 を用い、アンチセンス RNA/DNA技術〔バイォサイエンスとインダス トリー， , 322 ( 1992 )、 化学， 46 , 681 ( 1991 )、 Bi otechno l ogy , 9 , 358 ( 1992 )、 Trends in Biotechno logy , 10 > 87 ( 1992 ) 、 Trends in Bi otechno l ogy , 10 > 152 ( 1992 )、 細胞工学， ϋ, 1463 ( 1997 )〕 、 トリプル 'ヘリ ックス技術 〔Trends in Biotechnology, 10> 132 ( 1992 )〕 、 リボザィム技術 (Current Opinion in Chemical Biology, 3, 274 (1999)、 FEMS Microbiology Reviews, 23, 257 (1999)、 Frontiers in Bioscience, 4, D497 (1999)、 Chemistry & Biology, 6, R33 (1999)、 Nucleic Acids Research, 26, 5237 (1998)、 Trends in- Biotechnology, 16, 438 (1998 )〕 、 あるいはデコイ DNA法 〔Nippon Rinsho一 Japanese Journal of Clinical Medicine , 51> 563 ( 1998に Circulation Research, 81, 1023 (1998)、 Experimental Nephrology, 5, 429 (1997)、 Nippon Rinsho - Japanese Journal of Clinical Medicine, 54> 2583 (1996 )〕 に準じて、 GPR4自身の発現を阻害または抑制することができる。
配列番号 12、 14および 18から選ばれるいずれか一つに記載の塩基配列を有 する DNAとストリンジヱントな条件下でハイプリダイズするヌクレオチドと は、 配列番号 12、 14および 18から選ばれるいずれか一つに記載の塩基配列を 有する DNAの一部、 または全部をプローブとして、 コロニー 'ハイプリダイ ゼ一シヨン法、 プラーク .ハイブリダィゼーシヨン法、 サザンブロッ トハイ ブリダイゼーシヨン法等を用いることにより得られる DNAを意味じ、 具体的 には、コロニーまたはプラーク由来の MAを固定化したフィル夕一を用いて、 0.7~1.0mol/lの塩化ナトリゥム存在下、 65°Cでハイプリダイゼ一ションを 行った後、 0.1〜2倍濃度の SSC溶液（ 1倍濃度の SSC溶液の組成は、 150 IM01八 塩化ナトリウム、 15 腿 ol/lクェン酸ナトリウムよりなる） を用い、 65°C条 件下でフィルターを洗浄すること'により同定できる DNA等を挙げることがで きる。 ハイプリダイゼーシヨンは、 モレキュラー · クローニング第 2版、 力 レント ' プロトコールズ 'イン 'モレキュラー ·バイォロジ一、 DNA Cloning 1： Core Techniques , A Practical Approach, Second Edition, Oxford University ( 1995 )等に記載されている方法に準じて行うことができる。 ハ ィプリダイズするヌクレオチドとしては、例えば上記 BLASTや FASTA等を用い て計算したときに 12、 14および 18から選ばれるいずれか一つに記載の塩基配 列を有する DNAの相補的配列を有する DN.Aと少なくとも 75%以上の相同性を 有する DNAが好ましく、 より好ましくは 80%以上の相同性を有する DNA、 さら に好ましくは 95%以上の相同性を有する DNAを挙げることができる。 ヌクレ ォチドとしては、 DNA、 RNA等いずれも用いられるが DNAが好適に用いられる。 上記アンチセンス ·オリゴヌクレオチドもしくは該アンチセンス ·ォリゴ ヌクレオチド誘導体、 または配列番号 12、 14および 18から選ばれるいずれか 一つに記載の塩基配列を有する DNAとス トリンジェントな条件下でハイプリ ダイズするヌクレオチドもしくは該ヌクレオチド誘導体を単独で.またはレ トロウィルスベクター、 アデノウイルスベクター、 アデノウイルスァソシェ 一テツ ドウィルスベクター等の遺伝子治療用ベクターに揷入した後、下記に 記載した常法に従って製剤化したものを好中球性炎症疾患の予防および/ または治療剤として使用することもできる。
遺伝子治療用べクタ一を該予防および/または治療剤として用いる場合 には、該遺伝子治療用べクタ一と遺伝子治療剤に用いる基剤を調合すること により製造することができる 〔Nature Genet. , 8, 42 ( 1994)〕 。
上記基剤としては、通常注射剤に用いる基剤であればどのようなものでも よく、 例えば蒸留水、 塩化ナトリウムまたは塩化ナトリゥムと無機塩との混 合物等の塩溶液、マンニトール、乳糖、デキス トラン、ブドウ糖等の糖溶液、 グリシン、 アルギニン等のアミノ酸溶液、 有機酸溶液または塩溶液とグルコ ース溶液との混合溶液等が挙げられる。 また常法に従い、 これらの基剤に浸 透圧調整剤、 pH調整剤、 ゴマ油、 ダイズ油等の植物油またはレシチンもしく は非イオン界面活性剤等の界面活性剤等の助剤を加えて、 溶液、 懸濁液また は分散液として注射剤を調製してもよい。 これらの注射剤を、 粉末化、 凍結 乾燥等の操作により用時溶解用製剤として調製することもできる。
該予防および/または治療剤は、液体の場合はそのままで、固体の場合は、 投与直前に、必要により滅菌処理をした上記の基剤に溶解して使用すること ができる。
投与方法としては、 例えば患者の治療部位に吸収されるように、 局所的に 投与する方法を挙げることができる。 また、 非ウィルス遺伝子移入法によつ でも目的とする治療部位に DNAを輸送することができる。
非ウィルス遺伝子移入法としては、 リン酸カルシウム共沈法 〔Virology， 52, 456-467 (1973 )； Science, 209, 1414-1422 (1980)〕 、 マイクロインジ ェクシヨン法 CProc. Natl. Acad. Sci. USA, 77> 5399-5403 ( 1980 )； Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 7380-7384 (1980) ； Cell, 27, 223-231 (1981)； Nature, 294> 92-94 ( 1981 )〕、 リボソームを介した膜融合-介在移入法!: Pro Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413-7417 (1987 )； Biochemistry, 28, 9508-9514 (1989 )； J. Biol. Chem.， 264, 12126-12129 ( 1989 ) ； Hum. Gene Ther. , 3, 267-275 (1992)； Science, 249, 1285-1288 (1990) ； Circulation, 83. 2007-2011 ( 1992 )〕、直接 DNA取り込みまたは受容体-媒介 DNA移入法〔Science， 247, 1465-1468 ( 1990)； J. Biol. Chem., 261, 14338- 342.(1991 )； Proc. Natl. Acad . Sci. USA, 87> 3655-3659 (1991) ； J. Biol. Chem. , 264, 16985-16987 (1989 ); BioTechniques , 11, 474-485 (1991) ;Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87.3410-3414 ( 1990)； Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 4255-4259 (1991)； Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 4033-4037 (1990)； Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 8850-8854 (1991 );H碰. Gene Ther. , 3, 147-154 (1991 )〕 等をあげることができる。
リガンドの GPR4への結合を阻害する物質としては、 例えば、 GPR4を認識す 'る抗体、 GPR4に拮抗作用を有する化合物等をあげることができる。
上記抗体としては、 GPR4を認識する抗体であればいずれも用いることがで きるが、 GPR4を特異的に認識する抗体が好ましい。 また該抗体はポリクロー ナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。このような抗体として、例えば、 GPR4を認識する中和抗体奪をあげることができる。また、ヒト型キメラ抗体、 ヒト化抗体等も本発明における抗体として用いることができる。 GPI を発現 している細胞を減少させて、 その機能を抑制する抗体として、 例えば、 抗体 依存性細胞障害活性 （ADCC活性） をもつ抗体等をあげることもできる。
上記抗体は、 例えば、 以下の方法に準じて調製することができる。
( 1 ) ポリクローナル抗体の作製
GPR4またはその部分断片ポリべプチドの精製標品、あるいは GPR4の一部の アミノ酸配列を有するぺプチドを抗原として用い、動物に投与することによ りポリクロ.ーナル抗体を作製することができる。
投与する動物としては、 ゥサギ、 ャギ、 ラッ ト、 マウス、 ハムス夕一等を 用いることか:できる。
該抗原の投与量は動物 1匹当たり 50〜100〃gが好ましい。
ペプチドを用いる場合は、 ペプチドをスカシガイへモシァニン （keyhole l impet haemocyanin) ゃ牛チログロブリン等のキヤリァ蛋白に共有結合させ たものを抗原とするのが望ましい。抗原とするぺプチドは、 ぺプチド合成機 で合成することができる。
該抗原の投与は、 1 回目の投与の後 1〜2週間おきに 3〜1,0回行'う。 各投与 後、 3〜7日目に眼底静脈叢より探血し、 該血清が免疫に用いた抗原と反応す ることを酵素免疫測定法 〔酵素免疫測定法 （ELISA法） ： 医学書院刊 （1976 年) 、 Antibodies - A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory ( 1988 )〕 等で確認する。
免疫に用いた抗原に対し、その血清が充分な抗体価を示した非ヒト哺乳動 物より血清を取得し、 該血清を分離、 精製することによりポリクローナル抗 体を取得することができる。
分離、 精製する方法としては、 遠心分離、 40〜50 %飽和硫酸アンモニゥム による塩析、 力プリル酸沈殿 〔Antibodies , A Laboratory Manual , Col d Spring Harbor Laboratory , ( 1988 )〕 、 または DEAE-セファロースカラム、 陰イオン交換カラム、 プロティン Aまたは G-カラムあるいはゲル濾過カラム 等を用いるクロマトグラフィー等を、単独でまたは組み合わせて処理する方 法が挙げられる。
( 2 ) モノクローナル抗体の作製
(a )抗体産生細胞の調製
免疫に用いた GPR4またはその部分断片ポリべプチドの精製標品、あるいは GPR4の一部のアミノ酸配列を有するぺプチドに対し、その血清が十分な抗体 価を示したラ、ソ トを抗体産生細胞の供給源として供する。
• 該抗体価を示したラツトに抗原物質を最終投与した後 3〜 7日目に、脾臓 を摘出する。
該脾臓を MEM培地 （日水製薬社製） 中で細断し、 ピンセッ トでほぐし、 l，200rpmで 5分間遠心分離した後、 上清を捨てる。
得られた沈殿画分の脾細胞をトリス—塩化アンモニゥム緩衝液 （PH7 . 65 ) で 1〜2分間処理し赤血球を除去した後、 MEM培地で 3回洗浄し、 得られた脾細 胞を抗体産生細胞として用いる。
(b )骨髄腫細胞の調製 骨髄腫細胞としては、マウスまたはラッ トから取得した株化細胞を使用す る。 例えば、 8-ァザグァニン耐性マウス （BALB/c由来） 骨髄腫細胞株
P3-X63Ag8- U1 (以下、 P3 - U1と略す) Curr. Topics Microbiol. Immunol. , 81, 1 (1978)、 Eur. J. Immunol. , 6, 511 (1976)〕 、 SP2/0-Agl4(SP-2) CNature, 276, 269 ( 1978 )〕、 P3-X63-Ag8653 ( 653 )〔J. I腿画' 1.， , 1548 ( 1979 )〕ヽ P3-X63-Ag8(X63) CNature, 256, 495 ( 1975)〕 等を用いることができる。 こ れらの細胞株は、 8-ァザグァニン培地 〔RPMI- 1640培地にグルタミン
(l,5mmol/l) 、 2-メルカプトエタノール （5 x l(T5mol/l) 、 ジェンタマイシ ン （10 g/ml)および牛胎児血清 （FCS) (CSL社製、 10%) を加えた培地（以 下、 正常培地という） に、 さらに 8-ァザグァニン （15 g/ml) を加えた培地〕 で継代するが、 細胞融合の 3〜4日前に正常培地で培養し、 融合には該細胞を 2X107個以上用いる。 '
(c)ハイブリ ドーマの作製
(a)で取得した抗体産生細胞と（b)で取得した骨髄腫細胞を MEM培地または PBS (リン酸ニナトリゥム 1.83g、 リン酸一力リゥム 0.21g、 食塩 7.65g、 蒸留 水 1リッ トル、 PH7.2) でよく洗浄し、 細胞数が、 抗体産生細胞：骨髄腫細胞 =5〜10： 1になるよう混合し、 l,200rpmで 5分間遠心分離した後、 上清を捨 てる。
得られた沈殿画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に、攪拌しながら、 37°C で、 108抗体産生細胞あたり、ポリエチレングリコール- 100Q (PEG- 1000) 2g、 MEM 2mlおよびジメチルスルホキシド （DMS0) 0.7mlを混合した溶液を 0.2〜 1ml添加し、 さらに 1〜2分間毎に MEM培地 l〜2mlを数回添加する。
添加後、 MEM培地を加えて全量が 50mlになるように調製する。 該調製液を 900rpmで 5分間遠心分離後、 上清を捨てる。 得られた沈殿画分の細胞を、 ゆ るやかにほく、した後、 メスピぺヅ トによる吸込み、 吹出しでゆるやかに HAT 培地〔正常培地にヒポキサンチン （1(Γ¾ιο1/1) 、 チミジン （1.5χΓ(Γ5ιηο1/1) およびアミノプテリン （4X10— ¾ol/l) を加えた培地〕 100ml中に懸濁する。 該懸濁液を 96穴培養用プレート 100 /1/穴ずつ分注し、 5%C0 ンキュ ぺ一夕—中、 37°Cで？〜 14日間培養する。
培養後、 培養上清の一部をとりアンチボディィズ CAntibodies, A Laboratory Manual , Col d Spr ing Harbor Laborat ory , Chapter 14 ( 1988 )〕 等に述べられている酵素免疫測定法により、本 ¾明のポリぺプチドの部分断 片ポリべプチドに特異的に反応するハイプリ ドーマを選択する。
酵素免疫測定法の具体例として、 以下の方法をあげることがで.きる。
免疫の際、抗原に用いた GPR4またはその部分断片ポリべプチドの精製標品、 あるいは GPR4の一部のアミノ酸配列を有するペプチドを適当なプレートに コートし、 ハイプリ ドーマ培養上清もしくは後述の（d )で得られる精製抗体 を第一抗体として反応させ、 さらに第二抗体としてビォチン、 酵素、 化学発 光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗ラツ トまたは抗マウスィムノ グロプリン抗体を反応させた後に標識物質に応じた反応を行い、抗原に用い たポリぺプチドに特異的に反応するものを本発明で用いられるモノクロ一 ナル抗体を生産するハイプリ ドーマとして選択する。
該ハイプリ ドーマを用いて、 限界希釈法によりクロ一ニングを 2回繰り返 し 〔1回目は、 HT培地 （HAT培地からアミノプテリンを除いた培地） 、 2回目 は、 正常培地を使用する〕、 安定して強い抗体価の認められたものを本発明 で用いられるモノク Πί—ナル抗体を産生するハイプリ ドーマ株として選択 する。
( d )モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理 〔2 , 6 , 10 , U-テトラメチルペン夕デカン （Pri s tane ) 0 . 5mlを腹腔内投与し、 2週間飼育する〕 した 8〜10週令のマウスまたはヌー ドマウスに、 （c )で取得した本発明で用いられるモノクローナル抗体を産生 するハイプリ ドーマ細胞 5〜20 X 106細胞/匹を腹腔内に注射する。 10〜21日 間でハイプリ ドーマは腹水癌化する。
該腹水癌化したマウスから腹水を採取し、 3 , 000rpmで 5分間遠心分離して 固形分を除去する。 ； ' '
得られた上清より、ポリクロ一ナル抗体で用いた方法と同様の方法でモノ クローナル抗体を精製、 取得することができる。
抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクロ一ナル抗体タイピングキヅ ト またはラッ トモノクローナル抗体タイビングキットを用いて行う。ポリぺプ チド量は、 ローリー法あるいは 280nmでの吸光度より算出する。 上記、 GPR4を認識する抗体を含有する好中球性炎症疾患の予防および/ま たは治療剤は以下のように調製することができる。
該抗体を有効成分どして含有する医薬は、該有効成分を単独で投与するこ とも可能ではあるが、通常は該有効成分を薬理学的に許容される一つあるい はそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる 任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。好ましく は水、 あるいは食塩、 グリシン グルコース、 ヒトアルブミン等の水溶液等 の水性担体に溶解した無菌的な溶液が用いられる。 また、 製剤溶液を生理的 条件に近づけるための緩衝化剤や等張化剤のような、薬理学的に許容される 添加剤、 例えば、 酢酸ナトリウム、 塩化ナトリゥム、 乳酸ナトリウム、 塩化 カリウム、 クェン酸ナトリウム等を添加することもできる。 また、 凍結乾燥 して貯蔵し、 使用時に適当な溶媒に溶解させて用いることもできる。
投与経路は、 治療に し最も効果的なものを使用するのが望ましく、 経口 投与、 または静脈内投与等の非経口投与をあげることができる。投与形態と しては、 錠剤、 注射剤等が挙げられる。
経口投与に適当な製剤としては、 '錠剤等が挙げられる。 錠剤等は、 乳糖、 マンニトール等の賦形剤、 デンプン等の崩壊剤、 ステアリン酸マグネシウム 等の滑沢剤、 ヒドロキシプロピルセルロース等の結合剤、 脂肪酸エステル等 の界面活性剤、 グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。 非経口投与に適当な製剤としては、 注射剤等が挙げられる。 例えば、 注射 剤は、 塩溶液、 ブドウ糖溶液または両者の混合物からなる担体等を用いて調 製する。 また、 非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添 加することもでき'る。
投与量または投与回数は、 目的とする治療効果、 投与方法、 治療期間、 年 齢、体重等により異なるが、通常成人 1日当たり 10〃 g /kg〜8rag/kgである。
GPR4の構成的活性により生じるシグナル伝達を抑制する物質は、該構成的 活性により生ずるシグナル伝達を抑制することのできる物質を探索するこ とによっても取得することができる。
GPR4に转抗作用を有する化合物としては、 例えば、 式 （I ) で表される化 合物が挙げられる。 以下、 式 （I ) で表される化合物を化合物 （I ) という。 他の式番号の化合物についても同様である。
化合物（I)および化合物 （II) の各基の定義において、 以下の例示が挙げ られる。
(i)低級アルキルおよび低級アルカノィル、 低級アルコキシ、 低錄アルコキ シカルボニル、 モノもしくはジ低級アルキルァミノ、 モノもしくはジ低級ァ ルキルアミノカルボニルの低級アルキル部分としては、例えば直鎖または分 岐状の炭素数 1〜10のアルキルが挙げられ、 具体的にはメチル、 ェチル、 プ 口ピル、 イソプロピル、 プチル、 イソブチル、 sec—プチル、 tert—ブチル、 ペンチル、 イソペンチル、 ネオペンチル、 ヘキシル、 ヘプチル、 ォクチル、 イソォクチル、 ノニル、 デシル等が挙げられる。
(ii)シクロアルキルとしては、例えば炭素数 3〜8のシクロアルキルが挙げら れ、 具体的にはシクロプロピル、 シクロブチル、 シクロペンチル、 シクロへ キシル、 シクロへプチル、 シクロォクチル等が挙げられる。 シクロアルキル カルボ二ルのシクロアルキル部分は、 ジクロアルキル （ii) と同義である。
(iii)低級アルケニルとしては、 例えば直鎖、 分岐または環状の炭素数 2〜8 のアルケニルが挙げられ、 具体的にはビニル、， ァリル、 1一プロぺニル、 ブ テニル、 ペンテニル、 へキセニル、 ヘプテニル、 ォクテニル、 シクロへキセ ニル、 2，6—ォク夕ジェニル等が挙げられる。
(iv)低級アルキニルとしては、例えば直鎖または分岐状の炭素数 2〜8のアル キニルが挙げられ、 具体的にはェチニル、 プロピニル、 プチニル、 ペンチ二 ル、 へキシニル、 へプチニル、 ォクチ'ニル等が挙げられる。
(V)ハロゲンは、 フッ素、 塩素、 臭素およびヨウ素の各原子を表す。
(vi)ァリールおよびそれそれが隣接する 2つの炭素原子と一緒になつて形 成される芳香環から水素原子を一つ除いた基としては、 例えば炭素数 6〜14 の単環性、二環性または三環式のァリールが挙げられ、具体的にはフヱニル、 ナフチル、 インデニル、 アントラニル等が挙げられる。
(vii)ァラルキルおよび複素環アルキルのアルキレン部分は、 前記の低級ァ ルキル（i)の定義から水素原子を一つ除いたものと同義である。
(viii)ァラルキルおよびァロイルのァリ一ル部分としては、 前記ァリール (vi)の定義で挙げた基に加え、例えば前記ァリールがシクロアルキルと縮合 した二環性縮合環基が挙げられ、 具体的にはインダニル、 1 , 2 , 3 , 4—テトラ ヒドロナフチル、 6 , 7 , 8 , 9—テトラヒドロ一 5H—ペンゾシクロへフ。チル等が 挙げられる。
( i x )複素環基および複素環アルキルの複素環基部分ならびにそれそれが隣 接する 2つの炭素原子と一緒になつて形成される複素環から水素原子を一 つ除いた基としては、 例えば窒素原子、 酸素原子および硫黄原子から選ばれ る少なくとも 1個の原子を含む 5員または 6員の単環性複素環基、 3 8員の環 が縮合した二環または三環式であって窒素原子、酸素原子および硫黄原子か ら選ばれる少なくとも 1個の原子を含む縮環性複素環基等が挙げられ、具体 的にはピリジル、 ピラジニル、 ピリミジニル、 ピリダジニル、 ベンゾイミダ ゾリル、 2 _ォキソペンゾイミダゾリル、 ペンゾトリアゾリル、 ペンゾフリ ル、 ペンゾチェ二ル、 プリニル、 ペンゾォキサゾリル、'ペンゾチアゾリル、 ペンゾジォキソリル、 インダゾリル、 インドリル、 イソインドリル、 キノ リ ル、 イソキノリル、 フタラジニル、 ナフチルリジニル、. キノキサリニル、 ピ 口リル、 ピラゾリル、 キナゾリニル、 シンノリニル、 トリァゾリル、 テトラ ゾリル、 ィ ミダゾリル、 ォキサゾリル、 イソォキサゾリル、 チアゾリル、 ィ ソチアゾリル、 チェニル、 フリル、 ピロリジニル、 2 , 5—ジォキソピロリジ ニル、 チアゾリジニル、 ォキサゾリジニル、 ピペリジル、 ピペリジノ、 ピぺ ラジニル、 ホモピペラジニル、 ホモピペリジル、 ホモピペリジノ、 モルホリ ニル、 モルホリノ、 チオモルホリニル、 チオモルホリノ、 ビラニル、 テトラ ヒドロピリジル、 テトラヒ ドロビラニル、 テトラヒ ドロフラニル、 テトラヒ ドロキノリル、 テトラヒドロイソキノリル、 ォク夕ヒ ドロキノリル、 インド リニル等が挙げられる。 '
( X )隣接する窒素原子と一緒になつて形成される複素環基としては、 例えば 少なく とも 1個の窒素原子を含む 5員または 6員の単環性複素環基（該単環性 複素璟基は、他の窒素原子、酸素原子または硫黄原子を含んでいてもよい）、 3〜8員の環が縮合した二環または三環式で少なくとも 1個の窒素原子を含 む縮環性複素環基 （該縮環性複素環基は、 他の窒素原子、 酸素原子または硫 黄原子を含んでいてもよい） 等が挙げられ、 具体的にはピリジル、 テトラヒ ド口ピリジル、 インドリニル、 イソインドリニル、 ピロリジニル、 チアゾリ ジニル、 ォキサゾリジニル、 ピペリジノ、 ホモピペリジノ、 ピペラジニル、 ホモピペラジニル、 モルホリノ、 チオモルホリノ、 ペルヒドロアゼピニル、 ペルヒ ドロアゾシニル、テトラヒドロキノリル、テトラヒ ドロイソキノ リル、 ォク夕ヒドロキノリル、 ベンゾィミダゾリル、 ィンダゾリル、 ィンドリル、 イソインドリル、 プリニル、 ジヒドロインドリル、 ピ口リル、 ジヒ ドロピロ リル、 ピラゾリル、 トリァゾリル、 テトラゾリル、 ィミダゾリル等が挙げら れる。
( X i )置換低級アルキル、置換低級アルコキシカルボ'ニルおよび置換低級アル カノィルにおける置換基としては、 同一または異なって、 例えば置換基数 1 〜3の、 シクロアルキル、 低級アルカノィル、 低級アルコキシ、 ァリールォ キシ、置換ァリールォキシ [該置換ァリールォキシにおける置換基としては、 同一または異なって、 例えば置換基数 1〜3の、 低級アルキル、 低級アルコキ シ、 低級アルコキシカルボニル、 ハロゲン、 シァノ、 ニトロ、 ヒドロキシ、 カルボキシ、 ァミノ等が挙げられる。 ここで低級アルキルは前記低級アルキ ル（i )と同義であり、 ハロゲンは前記ハロゲン（V )と同義であり、 低級アルコ キシおよび低級アルコキシカルボニルの低級アルキル部分は前記低級アル キル（i )と同義である] 、 ァラルキルォキシ、 置換ァラルキルォキシ [該置 換ァラルキルォキシにおける置換基としては、 同一または異なって、 例えば 置換基数 1〜3の、 低級アルキル、 低級アルコキシ、 低級アルコキシカルボ二 ル、 ハロゲン、 シァノ、 ニトロ、 ヒドロキシ、 カルボキシ、 ァミノ等が挙げ られる。 ここで低級アルキルは前記低級アルキル（i )と同義であり、 ハロゲ ンは前記ハロゲン（V )と同義であり、 低級アルコキシおよび低級アルコキシ カルボニルの低級アルキル部分は前記低級アルキル（i )と同義である] 、 低 級アルカノィルォキシ、 低級アルコキシカルボニル、 ハロゲン、 シァノ、 二 トロ、 ヒドロキシ、 カルボキシ、 ァミノ、 低級アルキルチオ、 置換低級アル キル [該置換低級アルキルにおける置換基としては、 同一または異なって、 例えば置換基数 1〜3のヒドロキシ、 ハロゲン等が挙げられる] 、 置換低級ァ ルカノィル [該置換低級アルカノィルにおける置換基としては、伺一または 異なって、 例えば置換基数 1〜3のハロゲン等が挙げられる] 、 モノまたはジ 低級アルキルァミノ、低級アルキルスルホニル、低級アルキルスルフィニル、 低級アルコキシカルボニルァミノ、 低級アルカノィルァミノ、 モノまたはジ 低級アルキルァミノカルボニル、モノまたはジ低級アルキルァミノカルボ二 ルォキシ、 複素環基等が挙げられる。
ここで示したァリ一ルォキシおよびァラルキルォキシのァリ一ル部分、シ クロアルキル、 ハロゲン、'複素環基、 ならびに低級アルカノィル、 低級アル コキシ、 低級アルカノィルォキシ、 低級アルコキシカルボニル、 低級アルキ ルチオ、 低級アルキルスルホニル、 低級アルキルスルフィニル、 低級アルコ キシカルボニルアミノおよび低級アルカノィルアミノの低級アルキル部分 は、 それそれ前記ァリール（v i )、 シクロアルキル（i i )、 ハロゲン（v )、 複素 環基 （i x) 、 および低級アルキル（i )と同義であり、 ァラルキルォキシのァ ルキレン部分ほ、 前記低級アルキル（i )から水素原子を一つ除いたものと同 義である。 '
モノまたはジ低級アルキルァミノ、モノまたはジ低級アルキルアミノカル ボニルおよびモノまたはジ低級アルキルアミノカルボニルォキシの低級ァ ルキル部分は、 それそれ前記低級アルキル（i )と同義であり、 ジ低級アルキ ルアミノ、ジ低級アルキルァミノカルボ二ルぉよびジ低級アルキルァミノ力 ルポニルォキシの 2つの低級アルキル部分は、それそれ同一でも異なってい てもよい。
( x i i )置換ァリール、置換ァラルキル、置換ァロィル、置換シクロアルキル、 置換低級アルケニル、 置換低級アルキニル、 置換複素璟基、'置換複素環アル キル、 瞵接する窒素原子と一緒になつて形成される置換複素環基、 それそれ が隣接する 2つの炭素原子と一緒になつて形成される置換芳香環およびそ れそれが隣接する 2つの炭素原子と一緒になって形成される置換複素環に おける置換基としては、 前記置換低級アルキルにおける置換基 （x i ) の定義 で挙げた基に加え、 低級アルキル、 ァリール、 置換ァリール、 ァラルキル、 置換ァラルキル、 複素環基、 置換複素環基、 複素環アルキル、 置換複素環ァ ルキル等が挙げられる。 さらに、 置換ァリールおよび隣接する窒素原子と一 緒になって形成される置換複素環基における置換基は低級アルキル [該低級 アルキルは前記低級アルキル（i )と同義である]または置換低級アルキル [該 低級アルキルは前記低級アルキル（i )と同義であり、 該置換低級アルキルに おける置換基としては、 同一または異なって、 例えば置換基数 1〜3の、 ハロ ゲン、ヒドロキシ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル等が挙げられる。 ここでハロゲンは前記ハロゲン（V)と同義であり、 低級アルコキシカルボ二 ルの低級アルキル部分は前記低級アルキル（i)と同義である] であってもよ い。
ここで示した低級アルキル、 ァリール、 複素環基および複素環アルキルの 複素環基部分、ァラルキルおよび複素環アルキルのアルキレン部分ならびに ァラルキルのァリール部分は、 それそれ前記低級アルキル （i) 、 ァリール (Vi)、 複素環基（ix)、 ァラルキルのアルキレン部分（vii)およびァラルキル のァリール部分（viii)と同義である。 また、 置換基 （xi) の定義で挙げた基 に加えた 「低級アルキル、 ァリール、 置換ァリール、 ァラルキル、 置換ァラ ルキル、 複素璟基、 置換複素環基、 複素環アルキル、 置換複素環アルキル」 における置換ァリール、 置換ァラルキル、 置換複素璟基および置換複素環ァ ルキルにおける置換基としては、 同一または異なって、 例えば置換基数 1〜 3の、低級アルキル [該低級アルキルは前記低級アルキル（ i )と同義 ある]、 低級アルコキシ [該低級アルコキシの低級アルキル部分は前記低級アルキル (i)と同義である] 、 ハロゲン [該ハロゲンは前記ハロゲン （V) と同義であ る] 等が挙げられる。
(xiii) フエ二レンとしては、 1，2-フエ二レン、 1,3-フエ二レン、 i,4-フエ 二レンが挙げられる。
(xiv) ナフチレンとしては、 1,2-ナフチレン、 1,3-ナフチレン、 1,4-ナフ チレン、 1，5-ナフチレン、 1,6-ナフチレン、 1,7-ナフチレン、 1,8-ナフチレ ンが挙げられる。'
(XV) 炭素数 2〜6で窒素、 酸素および硫黄から任意に選ばれる原子数 1〜4 である不飽和もしくは部分的に不飽和の 5〜7員の単環式複素環としては、以 下の例示に限定されることはないが、 例えばピロ一ル、 イ ミダゾール、 ビラ ゾ一ル、 ピリジン、 ピリダジン、 ピリ ミジン、 ピラジン、 1 , 2 , 4-トリアジン、 1,2, 3-トリアジン、 1,3, 5-トリアジン、 テトラゾール、 フラン、 ピラン、 ォ キサゾール、 イソォキサゾール、 1,2,3-ォキサジァゾール、 1，2,4-ォキサジ ァゾール、 1,3,4-ォキサジァゾール、 チォフェン、 チアゾ一ル、 イソチアゾ —ル、 1 , 2 , 3-チアジアゾール、 1，2 , 4-チアジアゾール、 1 , 3 , 4-チアジアゾー ル、 フラザン、 チォピラン、 ピロリジン、 ピロリン、 ピロリ ドン、 ピペリ ド ン、 ピぺリジン、 ホモピぺリジン、 ピぺラジン、 ホモピぺラジン、 イミダゾ' リジン、 ビラゾリジン、 ビラゾリン、 テトラヒ ドロピリジン、 テトラヒ ドロ ピラン、 テトラヒ ドロフラン、 ジォキサン、 モルホリン、 チオモルホリン等 が挙げられる。
(xvi )炭素数 4〜10で窒素、 酸素および硫黄から任意に選ばれる原子数 1〜4 である不飽和もしくは部分的に不飽和の環構成原子数が 8〜11の二環式複素 環としては、 必ずしも以下の例示に限定されることはないが、 例えばインド ール、 イソインドール、 ベンゾイ ミダゾール、 キノリン、 イソキノ リン、 キ ノリジン、 キナゾリン、 インドリジン、 ナフチリジン、 キノキサリン、 シン ノリン、 プテリジン、 インダゾール、 プリン、 フタラジン、 インドリン、 ィ ソインドリン、ベンゾフラン、イソべンゾフラン、クロマン、イソクロマン、 クロメン、 ベンゾジォキサン、 ペンゾチォフェン、 ペンゾォキサゾール、 ベ ンゾチアゾ一ル、 キノロン、 テトラヒ ドロキノリン、 テトラヒドロイソキノ リン、 ォク夕ヒドロキノリン、 ピリ ドピリ ミジン、 テトラヒドロピリ ドピリ ミジン、ペンズァゼピン、テトラヒドロペンゾァゼピン、ペンゾジァゼピン、 テトラヒドロべンゾジァゼピン、 ペンゾォキセピン、 テトラヒドロべ'ンゾォ キセピン、 ペンゾォキサゼピン、 テトラヒドロべンゾォキサゼピン、 ペンゾ チェピン、 テトラヒドロペンゾチェピン、 ペンゾチアゼピン、 テトラ ドロ ペンゾチアゼピン、 ピロ口ピリジン、 ピロ口ピリミジン、 フロピリジン、 フ 口ピリ ミジン、チェノビリジン、チェノビリ ミジン、イミダゾピリジン、 1 , 3- ペンゾジォキサゾール、 1，3-ペンゾジチアゾ一ル、 1，3-ォキサチォ口べンゼ ン等が挙げられる。
(xvi i )置換もしくは非置換のフヱニレン、 置換もしくは非置換のナフチレ ン、 炭素数 2〜6で窒素、 酸素および硫黄から任意に選ばれる原子数 1〜4であ る置換の不飽和もしくは部分的に不飽和の 5〜7員の単環式複素環、および炭 素数 4〜10で窒素、 酸素および硫黄から任意に選ばれる原子数 1〜4である置 換の不飽和もしくは部分的に不飽和の環構成原子数が 8〜11の二環式複素環 における置換基としては、 前記置換低級アルキルにおける置換基（xi ) の定 義で挙げた基に加え、 ァリール （該ァリールは前記ァリール（vi)と同義であ る） 、 置換ァ'リール [該ァリールは前記ァリール（vi)と同義であり、 該置換 ァリールにおける置換基としては、 同一または異なって、 例えば置換基数 1 〜3の、低級アルキル（該低級アルキルは前記低級アルキル（i)と同義である）、 低級アルコキシ（該低級アルコキシの低級ァルキル部分は前記低級ァルキル (i)と同義である） 、 ハロゲン （該ハロゲンは前記ハロゲン （V) と同義であ る） 等が挙げられる] 、 ァラルキル (該ァラルキルのアルキレン部分および 該ァラルキルのァリール部分は、それそれ前記ァラルキルのアルキレン部分 (vii)および前記ァラルキルのァリ一ル部分（viii)と同義である） 、 置換ァ ラルキル [該ァラルキルのアルキレン部分および該ァラルキルのァリ一ル部 分はそれぞれ前記ァラルキルのアルキレン部分（vii)および前記ァラルキル のァリ一ル部分（viii)と同義であり、該置換ァラルキルにおける置換基とし ては、 同一または異なって、 例えば置換基数 1〜3の、 低級アルキル （該低級 'アルキルは前記低級アルキル（i)と同義である） 、 低級アルコキシ （該低級 アルコキシの低級アルキル部分は前記低級アルキル（i)と同義である） 、 ハ ロゲン （該ハロゲンは前記ハロゲン （V) と同義である）等が挙げられる]、 置換複素環基 [該複素環基は前記複素環基（ix)と同義であり、 該置換複素環 基における置換基としては、同一または異なって、例えば置換基数 1〜 3の、 低級アルキル （該低級アルキルは前記低級アルキル（i)と同義である） 、 低 級アルコキシ （該低級アルコキシの低級アルキル部分は前記低級アルキル (i)と同義である） 、 ハロゲン （該ハロゲンは前記ハロゲン （V) と同義であ る） 等が挙げられる] 、 複素環アルキル （該複素環アルキルの複素環基部分 および該複素環アルキルのアルキレン部分は、 それそれ前記複素環基（ix) および前記ァラルキルのアルキレン部分（vii)と同義である） 、 置換複素環 アルキル [該複素璟アルキルの複素環基部分および該複素環アルキルのアル キレン部分は、それそれ前記複素環基（ ix )および前記ァラルキルのアルキレ ン部分（vii)と同義であり、該置換複素璟アルキルにおける置換基としては、 同一または異なって、 例えば置換基数 1〜3の、 低級アルキル （該低級アル キルは前記低級アルキル（i)と同義である） 、 低級アルコキシ （該低級アル コキシの低級アルキル部分は前記低級アルキル（i)と同義である） 、 ハロゲ ン （該ハロゲンは前記ハロゲン （V) と同義である） 等が挙げられる] 等が 挙げられる。
前記の炭素数 2〜6で窒素、酸素および硫黄から任意に選ばれる原子数 1〜4 である置換の不飽和もしくは部分的に不飽和の 5〜7員の単環式複素環、およ ぴ前記の炭素数 4〜10で窒素、 酸素および硫黄から任意に選ばれる原子数 1 〜4である置換の不飽和もしくは部分的に不飽和の環構成原子数が 8〜11の 二環式複素環における置換基としては上記置換基に加えて、 低級アルキル
(該低級アルキルは前記低級アルキル （i) と同義である） 、 置換低級アル キル （該低級アルキルは前記低級アルキル （i) と同義であり、 該置換低級 アルキルにおける置換基としては前記置換低級アルキルにおける置換基
(xi) の定義からヒドロキシおよびハロゲンを除いた基等が挙げられる） 、 置換シクロアルキル （該シクロアルキルは前記シクロアルキル （ii) と同義 であり、該置換シクロアルキルにおける置換基は前記置換シクロアルキルに おける置換基 （xii) と同義である） 、 低級アルケニル （該低級'アルケニル ば前記低級アルケニル （iii) と同義である） 、 置換低級アルケニル （該低 級アルケニルは前記低級アルケニル （iii) と同義であり、 該置換低級アル ケニルにおける置換基は前記置換低級アルケニルにおける置換基 （xii) と 同義である）、低級アルキニル（該低級アルキニルは前記低級アルキニル（iv) と同義である） 、 置換低級アルキニル （該低級アルキニルは前記低級アルキ ニル （iv) と同義であり、 該置換低級アルキニルにおける置換基は前記置換 低級アルキニルにおける置換基 （xii) と同義である） 、 置換ァリール （該 ァリールは前記ァリール （vi) と同義であり、 該置換ァリールにおける置換 基としては前記置換ァリールにおける置換基 （xii) の定義から、 低級アル キル、 低級アルコキシおよびハロゲンを除いた基等が挙げられる） 、 置換ァ ラルキル（該ァラルキルのァリール部分および該ァラルキルのアルキレン部 分は、 それそれ前記ァリール（vi)および前記ァラルキルのアルキレン部分 (vii)と同義であり、 該置換ァラルキルにおける置換基としては前記置換ァ ラルキルにおける置換基 （xii) の定義から低級アルキル、 低級アルコキシ およびハロゲンを除いた基等が挙げられる） 、 ァロイル （該ァロイルは前記 ァロイル（viii)と同義である） 、 置換ァロイル （該ァロイルは前記ァロイル (viii)と同義であり、 該置換ァロイルにおける置換基は、 前記置換ァロィル における置換基 （xii) と同義である） 、 置換複素璟基 （該複素環基は前記 複素環基（ix) と同義であり、 該置換複素環基における置換基は前記置換複 素環基における置換基 （xii) の定義から、 低級アルキル、 低級アルコキシ および.ハロゲンを除いた基等が挙げられる） 、 置換複素環アルキル （該複素 環アルキルの複素環基部分および該複素環アルキルのアルキレン部分はそ れそれ前記複素環アルキルの複素環基部分（ix) および前記複素環アルキル のアルキレン部分 （vii) と同義であり、 該置換複素環アルキルにおける置 換基は前記置換複素環アルキルにおける置換基'（xii) の定義から、 低級ァ ルキル、 低級アルコキシおよびハロゲンを除いた基等が挙げられる） であつ てもよい。 - 化合物 （I) の四級アンモニゥム塩としては、 '化合物 （I) における塩基性 窒素含有官能基にハロゲン化低級アルキル（該低級アルキルおよび該ハロゲ ンはそれそれ前記と同義である） 、 ハロゲン化ァラルキル （該ハロゲンおよ び該ァラルキルはそれそれ前記と同義である）、ヒドロキシ低級アルキル（該 低級アルキルは前記と同義である） 、 ハロゲン化低級アルケニル （該低級ァ ルケ二ルぉよび該ハロゲンはそれそれ前記と同義である）等が付加した四級 アンモニゥム塩であれば特に限定されないが、例えばジメチルァミノ基を有 する化合物（I.)にヨウ化メチルを作用させて得られる四級アンモニゥム塩、 ピペリジノ を有する化合物 （I) にヨウ化メチルを作用させて得られる四 級アンモニゥム塩、 ピロリジノ基を有する化合物 （I) にヨウ化メチルを作 用させて得られる四級アンモニゥム塩、 モルホリノ基を有する化合物 （I) に臭化ペンジルを作用させて得られる四級アンモニゥム塩、ピロリジノ基を 有する化合物 （I) にヨウ化工チルを反応させて得られる四級アンモニゥム 塩においてヨウ化物イオンと水酸化物イオンが交換されて得られる四級ァ ンモニゥム塩等が挙げられる。 また、 化合物 （I) の四級アンモニゥム塩の 具体的な一態様としては、 化合物 （I) の置換基 R1が- NR e (式中、 R5および R6はそれそれ前記と同義である）である場合に、ハロゲン化低級アルキル（該 低級アルキルおよび該ハロゲンはそれそれ前記と同義である）、 ハロゲン化 ァラルキル（該ハロゲンおよび該ァラルキルはそれそれ前記と同義である）、 ヒドロキシ低級アルキル （該低級アルキルは前記と同義である） 、 ハロゲン 化低級アルケニル（該低級アルケニルおよび該ハロゲンはそれそれ前記と同 義である） 等が該- NR5R6部に付加して、 置換基 R1に相当する箇所が - N+R5bRsbR8 (式中、 R5bおよび R6bはそれそれ前記 R5および前記 Reと同義であり、 R8は低級 アルキル、 低級アルケニルまたはァラルキルを表す） に変換された化合物等 が挙げられる。
化合物（I )もしくはその四級アンモニゥム塩の薬理学的に許容される塩と しては、 毒性のない、 水溶性のものが好ましく、 例えば塩酸塩、 臭化水素酸 塩、 硝酸塩、 硫酸塩、 リン酸塩等の無機酸塩、 ベンゼンスルホン酸塩、 安息 香酸塩、 クェン酸塩、 フマル酸塩、 グルコン酸塩、 乳酸塩、 マレイン酸塩、 リンゴ酸塩、 シユウ酸塩、 メタンスルホン酸塩、 酒石酸塩等の有機酸塩等の 酸付加塩、ナトリゥム塩、力リゥム塩等のアル力リ金属塩、マグネシウム塩、 カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等の金属塩、 アンモニゥム、 テトラメチルアンモニゥム等のアンモニゥム塩、 モルホリン 付加塩、 ピぺリジン付加塩等の有機アミン付加塩、 またはグリシン付加塩、 フエ二ルァラニン付加塩、 リジン付加塩、 ァスパラギン酸付加塩、 グルタミ ン酸付加塩等のアミノ酸付加塩等が挙げられる。
化合物 （I I ) の四級アンモニゥム塩としては、 化合物 （J I ) における塩基 性窒素含有官能基にハロゲン化低級アルキル（該低級アルキルおよび該ハロ ゲンはそれそれ前記と同義である） 、 ハロゲン化ァラルキル （該ハロゲンお よび該ァラルキルはそれそれ前記と同義である）、 ヒ ドロキシ低級アルキル
(該低級アルキルは前記と同義である） 、 ハロゲン化低級アルケニル （該 級アルケニルおよび該ハロゲンはそれぞれ前記と同義である）等が付加した 四級アンモニゥム塩であれば特に限定されないが、例えばジメチルァミノ基 を有する化合物 （I I ) にヨウ化メチルを作用させて得られる四級アンモニゥ ム塩、 ピペリジノ基を有する化合物 （I I ) にヨウ化メチルを作用させて得ら れる四級アンモニゥム塩、 ピロリジノ基を有する化合物 （Π ) にヨウ化メチ ルを作用させて得られる四級アンモニゥム塩、モルホリノ基を有する化合物
( I I ) に臭化ベンジルを作用させて得られる四級アンモニゥム塩、 ピロリジ ノ基を有する化合物（I I ) にヨウ化工チルを反応させて得られる四級アンモ ニゥム塩においてョゥ化物イオンと水酸化物イオンが交換されて得られる 四級アンモニゥム塩等が挙げられる。
化合物（I I )もしくはその四級アンモニゥム塩の薬理学的に許容される塩 としては、 毒性のない、 水溶性のものが好ましく、 例えば塩酸塩、 臭化水素 酸塩、 硝酸塩、 硫酸塩、 リン酸塩等の無機酸塩、 ベンゼンスルホン酸塩、 安 息香酸塩、 クェン酸塩、 フマル酸塩、 ダルコン酸塩、乳酸塩、 レイン酸塩、 リンゴ酸塩、 シユウ酸塩、 メタンスルホン酸塩、 酒石酸塩等.の有機酸塩等の 酸付加塩、ナトリゥム塩、力リゥム塩等のアル力リ金属塩、マグネシウム塩、 カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム'塩、亜鉛塩等の金属塩、 アンモニゥム、 テトラメチルアンモニゥム等のアンモニゥム塩、 モルホリン 付加塩、 ピぺリジン付加塩等の有機アミン付加塩、 またはグリシン付加塩、 フエ二ルァラニン付加塩、 リジン付加塩、 ァスパラギン酸付加塩、 グルタミ ン酸付加塩等のァミノ酸付加塩等が挙げられる。 次に化合物（I )の製造法について説明する。
なお、以下に示した製造法において、定義した基が反応条件下変化するか、 または方法を実施するのに不適切な場合、 有機合成化学で常用される方法、 例えば官能基の保護、 脱保護等 [例えば、 プロテクティブ · グループス · ィ ン ·オーガニヅク · シンセシス 第三版 (Protective Groups in Organic Synthes is , the third edition)、 グリーン (T . W. Greene ) 、 ヮヅヅ (Peter G . M. Wuts) 著、 ジョン ' ワイリー 'アンド 'サンズ · ィンコーポレイテヅ ド ( John Wi ley & Sons Inc . ) ( 1999年） ] の手段に付すことにより容易に製 造を実施することができる。 また、 必要に応じて置換基導入等の反応工程の 順序を変えることもできる。 化合物 （I-a) は、 以下に示す製造方法によって得ることができる。
製造法 1 '
Figure imgf000042_0001
(式中、 R2、 、 R4、 R5、 R6、 Xおよび Yはそれそれ前記と同義であり、 R9は低 級アルキル、 ァリルまたはベンジルを表し、 R1Dおよび R11は同一または異な つて低級アルキルまたはシクロアルキルを表すか、. R1Gおよび R11が隣接する 窒素原子と一緒になつて複素環基を形成し、 Uはハロゲン RNI 、 アルコキシスル ホニルォキシ、 ァリールォキシスルホニルォキシ、 アルキルスルホ二ルォキ シまたはァリ一ルスルホニルォキシを表す）
上記の定義において、 低級アルキル、 シクロアルキルおよびハロゲンはそ れそれ前記と同義である。アルコキシスルホニルォキシおよびアルキルスル ホニルォキシのアルキル部分、ァリ一ルォキシスルホニルォキシおよびァリ 一ルスルホニルォキシのァリール部分は、それぞれ前記低級アルキルおよび ァリールと同義である。隣接する窒素原子と一緒になつて形成される複素環 基は前記と同義である。
<工程 1 >
化合物 （I l ia) を原料として用い、 特開平 7— 61983に開示された方法に従 い、 1当量〜大過剰の YH (式中、 Yは前記と同義である） と反応させることに より、 化合物 （IV) を得ることができる。 なお、 化合物 （I l ia) は特開平 7 — 61983に開示された方法またはそれに準じた方法により合成することがで ぎる。
<工程 2 >
化合物 （IV) を不活性溶媒中、 1当量〜大過剰のホルムアルデヒド水溶液 存在下に、 1当量〜大過剰の R5R6NH (式中、 R5および Rsはそれそれ前記と同義 である） またはその塩酸塩と反応させることにより、 化合物 （I - a) を得る ことができる。また、ホルムアルデヒ ド水溶液に代え、 トリオキシメチレン、 パラホルムアルデヒド等のホルムアルデヒド等価体を用いることもできる。 反応は通常、酸性条件下で良好に進行するので、必要に応じて塩酸、酢酸、 トリフルォロ酢酸等の酸を反応系内に添加するのが好ましい。 反応は通常、 0°Cから反応に用いた溶媒の沸点の間の温度、 好ましくは室温〜 80°Cの間の 温度で行い、 5分間から 100時間で終了する。不活性溶媒としては、例えば水、 メ夕ノ ル、 エタノール、 酢酸、 トリフルォロ酢酸、 ジクロロエタン、 クロ 口ホルム、 テトラヒドロフラン、 ジメチルァセトアミ ド、 ジメチルホルムァ ミ ド、 ァセトン等を単独でまたは混合して用いることができ、 好ましくはク ロロホルムと酢酸の混合溶媒が用いられる。 化合物 （I- b) から、 以下に示す方法によって化合物 - c ) を製造するこ とができる。
製造法 2
Figure imgf000043_0001
(式中、 R2、 R3、 R4、 R5、 R6、 R5b、 R6b、 R8、 U、 n、 Xおよび Yはそれそれ前記と 同義である）
<工程 3 >
化合物 （I- b ) を不活性溶媒中、 1当量〜大過剰の R8U (式中、 R8および Uは それそれ前記と同義である） と、 通常一 10°Cから反応に用いた溶媒の沸点の 間の温度、好ま,しくは室温で、 1〜48時間反応させることにより、化合物（I - c ) を得ることができる。 不活性溶媒としては、 例えば水、 メタノール、 エタノール、 ベンゼン、 ト ルェン、 キシレン、 酢酸ェチル、 へキサン、 ァセ トニトリル、 ジクロロメ夕 ン、 ジクロロェタン、 クロ口ホルム、 四塩化炭素、 1，4—ジォキサン、 テト ラヒドロフラン、 ジメチルァセトアミ ド、 ジメチルホルムアミ ド、 ァセトン 等を単独でまたは混合して用いることができ、 好ましくは酢酸ェチル、 ジク ロロメタン、 クロ口ホルム等が用いられる。 化合物 （I-c) から、 以下に示す方法によって化合物 （I - b) を製造するこ とができる。
製造法 3>
Figure imgf000044_0001
(式中、 R2、 R3、 R\ R5、 R6、 R5b、 R6b、 R8、 U、 n、 Xおよび Yはそれそれ前記と 同義である）
<工程 4 >
化合物 （I- c) を不活性溶媒中、 1当量〜大過剰の R¾ H (式中、 R5および R6はそれそれ前記と同義である） と、 通常一10°Cから反応に用いた溶媒の沸 点の間の温度、 好ましくは 20°C〜100°Cの間の温度で、 1〜100時間反応させ ることにより、 化合物 （I-b) を得ることができる。
不活性溶媒としては、 例えば水、 メタノール、 エタノール、 ベンゼン、 ト ルェン、 キシレン、 酢酸ェチル、 へキサン、 ァセ トニトリル、 ジクロロメ夕 ン、 ジクロロェタン、 クロ口ホルム、 四塩化炭素、 1 , 4一ジォキサン、 テト ラヒドロフラン、 ジメチルァセトアミ ド、 ジメチルホルムアミ ド、 アセトン 等が単独でまたは混合して用いられ、 好ましくはクロ口ホルム、 ジメチルホ ルムアミ ド等が用いられる。反応は通常、 塩基性条件下で良好に進行するの で、 必要に応じて適当な塩基を反応系内に添加することが望ましい。適当な 塩基としては、 例え «トリェチルァミン、 ジィソプロピルェチルァミン、 ピ リジン、 N-メチルモルホリン、 炭酸カリウム、 水素化ナトリウム、 水素化力 リウム、 水素化カルシウム、 ジイソプロピルェチルァミン、 1 , 8—ジァザビ シクロ [ 5 .4.0 ]ゥンデヅク一 7—ェン等を用いることができ、中でも トリエチ ルァミンが好ましい。 化合物（I - b)中、化合物（I- d)から、以下に示す方法によって化合物（I-e ) を製造することができる。
製造法 4
Figure imgf000045_0001
(式中、 R2、 R3、 R4、 n、 Xおよび Yはそれそれ前記と同義であり、 R14および R15 は同一または異なって水素、 置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もし くは非置換のシクロアルキル、 置換もしくは非置換の低級アルケニル、 置換 もしくは非置換の低級アルキニル、 置換もしくは非置換のァラルキル、 また は置換もしくは.非置換の複素環アルキルを表すか、 R"および R15が隣接する CH ( CH2 ) mNと一緒になつて置換もしくは非置換の複素環を形成し、 6は水素、 置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のシクロアルキル、 置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルキニ ル、 置換もしくは非置換のァラルキル、 または置換もしくは非置換のァリ一 ルを表し、 mは 0〜3の整数を表す）
上記の定義において、 低級アルキル、 シクロアルキル、 低級アルケニル、 低級アルキニル、 ァラルキル、 複素環アルキル、 およびァリールはそれぞれ 前記と同義であり、 それらの置換基もそれそれ前記と同義である。 R"および R15が隣接する CH ( CH2 )raNと一緒になって形成される複素環として は、 テトラヒ ドロピリジン、 ピロリジン、 ピぺリジン、 ホモピぺリジン、 ピ ペラジン、 ホモピぺラジン、 モルホリン、 チオモルホリン、 ペルヒ ドロアゼ ピン、 ペルヒ ドロアゾシン、 テトラヒドロキノリン、 テトラヒドロイソキノ リン等があげられ、そ'れらの置換基は前記の隣接する窒素原子と一緒になつ て形成される複素環基の置換基と同義である。
く工程 5 >
化合物（·Ι- d )を不活性溶媒中、 通常— 78°C〜40 °Cの間の温度で、 2〜4 当 量の水素化アルミニゥムリチウム、ジイソプロピル水素化アルミニゥムリチ ゥム等、好ましくはジィソプロピル水素化アルミニウムリチウム等の還元剤 存在下で 10 分間〜 24 時間、 好ましくは Ί〜3 時間処理することにより化 合物（I-e )を得ることができる。
不活性溶媒としては、例えばジクロロメタン、クロ口ホルム、四塩化炭素、 ジクロロェタン、 ベンゼン、 トルエン、 キシレン、 テトラヒドロフラン、 ジ ェチルエーテル等を単独でまたは混合して用いることができ、好ましくはジ クロロメタンまたはトルエンが用いられる。 化合物 （I- d) から以下に示す方法によって化合物 （I- f ) を製造すること ができる。
製造法 5
Figure imgf000046_0001
Yおよび mはそれそれ前記と同 化合物（I- d )を不活性溶媒中、通常 0°Cから反応に用いた溶媒の沸点の間の 温度、 好ましくは S温〜 100°Cの間の温度で、 1当量〜大過剰の適当な塩基存 在下、 1〜48時間、 好ましくは 1〜3 時間処理することにより化合物（I-f ) を得ることができる。
適当な塩基としては、 例えば水酸化ナトリゥム、 水酸化リチウム、 水酸化 カリウム、 炭酸カリウム、 炭酸セシウム、 ナトリウムメ トキシド等が例示さ れ、 好ましくは水酸化ナト リゥムが挙げられる。 不活性溶媒としては、 例え ば水、 テトラヒ ドロフラン、 ジェチルエーテル、 メタノール、 エタノール、 プロパノール、 ジクロロメタン、 ジクロロェタン、 ベンゼン、 トルエン、 キ シレン等を単独でまたは混合して用いることができ、好ましくはテトラヒド 口フランもしくはメタノール、 またはそれらと水の混合溶媒が用いられる。 化合物（I- b) 中、化合物（I- g)から以下に示す方法によって化合物（I-h) を製造することができる。
製造法 6
Figure imgf000047_0001
(式中、 R2、 R3、 R4、 η、 X、 Υおよび mはそれそれ前記と同義であり、 R17およ び R18aはそれぞれ前記 および前記 R15と同義であり、 Tはアルカリ金属、 ァ ンモニゥム、 トリアルキルシリル、 またはトリアルキルチンを表す）
上記の定義において トリアルキルシリルおよびトリアルキルチンにおけ るアルキルは前記低級アルキルと同義である。アル力リ金属としてはナトリ ゥム、 カリゥム等があげられる。
<工程 7 >
化合物（I-g )を不活性溶媒中、 0°Cから反応に用いた溶媒の沸点の間の温度、 好ましくは室温〜 200°Cの間の温度で、 1当量〜大過剩、 好ましくは 2〜4当量 の TN3 (式中、 Tは前記と同義である）と、 通常反応を加速させるために触媒量 〜大過剰、 好ましくは 0 . 5〜2当量の適当な添加剤の存在下、 1〜200時間、 好 ましくは 3〜48時間反応させることにより化合物（I-h )を得ることができる。 適当な添加剤としては、 例えば四塩化けい素、 塩化リチウム、 塩化アルミ 二ゥム、 塩化アンモニゥム、 塩化トリアルキルすず、 酸化ジアルキルすず、 トリアルキルアルミ,二ゥム、 トリェチルアミン ·塩酸塩、 トリ チルァミン · 臭化水素酸塩、 水素化ナト リウム、 カリウム tert-ブトキシド、 水酸化ナト リウム、 臭化亜鉛等が例示され、 好ましくは塩化アンモニゥム、 酸化ジアル キルすず等が挙げられる。不活性溶媒としては、例えば水、ァセトニトリル、 ジメチルホルムアミ ド、 ジメチルァセトアミ ド、 N-メチル -2-ピロリ ドン、 ジメチルスルホキシド、 酢酸、 氷酢酸、 テトラヒドロフラン、 ベンゼン、 ト ルェン、 キシレン等を単独でまたは混合して用いることができ、 好ましくは ジメチルホルムアミ ドまたはトルエンが用いられる。 化合物 （I- c ) から以下に示す方法によって化合物 （I- i ) を製造すること ができる。
製造法 7
Figure imgf000048_0001
(式中、 R2、 R3、 R4、 R5\ R6b、 R8、 U、 n、 Xおよび Yはそれそれ前記と同義で あり、 R18は置換もしくは非置換の低級アルキルを表し、 Qはアルカリ金属ま たはアルカリ土類金属を表し、 Qがアルカリ金属の場合には pは 1を表し、 Q がアル力リ土類金属の場合には pは 2を表す）
上記の定義においてアル力リ金属は前記アルカリ金属と同義であり、アル 力リ土類金属としてはマグネシウム、 カルシウム等が挙げられる。 <工程 8 >
化合物（I-c )を不活性溶媒中、 0°Cから反応に用いた溶媒の沸点の間の温度、 好ましくは 70°C〜80°Cの間の温度で、 1当量〜大過剰、 好ましくは 4〜8当量 の（R18C02 ) pQ (式中、 R18、 Qおよび pはそれそれ前記と同義である）と、 1〜100 時間、 好ましくは 3〜72時間反応させることにより化合物（I-i )を得ること ができる。 .
不活性溶媒としては、 例えばジメチルァセ トアミ ド、 N-メチル -2-ピロリ ドン、 ジメチルスルホキシド等を単独でまたは混合して用いることができ、 好ましくはジメチルスルホキシドが用いられる。 化合物 （I-c ) から以下に示す方法によって化合物 （I- j ) を製造すること ができる。
製造法 8
Figure imgf000049_0001
(式中、 R2、 R3、 R4、 R5b、 R6b、 R8、 U、 n、 Xおよび Yはそれそれ前記と同 義である）
<工程 9 >
化合物（I-c )を不活性溶媒中、 0°Cから反応に用いた溶媒の沸点の間の温度、 好ましくは 30°C〜80°Cの間の温度で、 1当量〜大過剰、 好ましくは 2〜8当量 の R7aSH (式中、 R7aは前記と同義である）と、 1当量〜大過剰、 好ましくは 1〜3 当量の適当な塩基存在下、 1〜100時間、 好ましくは 3〜72時間反応させるこ とにより化合物（I-j )を得ることができる。
適当な塩基としては、 例えばトリェチルァミン、 ジイソプロピルェチルァ ミン、 ピリジン、 N-メチルモルホリン、 炭酸カリウム、 水素化ナトリウム、 水素化カリウム、 水素化カルシウム、 ジイソプロピルェチルァミン、 1 , 8— ジァザピシクロ [ 5 .4. 0 ]ゥンデヅク一 7—ェン等を用いることができ、中でも 1 , 8—ジァザビシクロ [ 5 .4. 0 ]ゥンデヅク一 7—ェンが好ましい。 不活性溶媒 とじては、 例えばジクロロメタン、 クロ口ホルム、 四塩化炭素、 ジクロロェ 夕ン、ベンゼン、 トルェン、 キシレン、酢酸ェチル、 ジメチルァセトアミ ド、 N-メチル -2-ピロリ ドン、 ジメチルスルホキシド等を単独でまたは混合して 用いることができ、 好ましくはクロ口ホルムが用いられる。 化合物（I- j ) 中、 化合物（I- k)から以下に示す方法によって化合物（1-1 ) を製造することができる。
製造法 9
Figure imgf000050_0001
(式中、 R2、 、 R4、 R15、 R16、 m、 n、 Xおよび Yはそれそれ前記と同義である） く工程 1 0 >
化合物 （I- k) を用いて製 法 5の工程 6と同様な反応を行うことにより 化合物 （1-1 ) を製造することができる。 化合物 （I- i ) から以下に示す方法によって化合物 （I- m) を製造すること ができる。
製造法 1 0
Figure imgf000051_0001
(式中、 R2、 R3、 R4、 R18、 η、 Xおよび Yはそれそれ前記と同義である） <工程 1 1 >
化合物 （I-i ) を用いて製造法 5の工程 6と同様な反応を行うことにより 化合物 （I- m) を製造することができる。 化合物 （I-m) から以下に示す方法によって化合物 （I- n) を製造すること ができる。
製造法 1 1
Figure imgf000051_0002
(式中、 、 R3、 R4、 U、 n、 Xおよび Yはそれそれ前記と同義であり、 R7eは前 記 R7の定義から水素を除いた基を表す）
<工程 1 2 >
化合物 （I- m) を不活性溶媒中、 0°Cから反応に用いた溶媒の沸点の間の温 度、 好ましくは室温から 80°Cの間の温度で、 1当量〜大過剩、 好ましくは 1 〜3当量の適当な塩基存在下、 1当量〜大過剰、好ましくは 1〜3当量の R7eU (式 中、 I ^および Uはそれそれ前記と同義である）と、 1〜48時間、 好ましくは 3 〜24時間反応させることにより化合物（I-n )を得ることができる。
適当な塩基としては、 例えば炭酸カリウム、 水素化ナトリウム、 水素化力 リウム、 水素化カルシウム、 低級アルキルリチウム等が例示され、 好ましく は、 水素化ナトリゥム、 水素化力リウム等が挙げられる。 不活性溶媒として は、 例えばジクロロメタン、 クロ口ホルム、 四塩化炭素、 ジクロロェタン、 ベンゼン、 トルエン、 キシレン、 酢酸ェチル、 ジメチルホルムアミ ド、 ジメ チルァセトアミ ド、 N-メチル -2-ピロリ ドン、 テトラヒドロフラン、 ジェチ ルエーテル等を単独でまたは混合して用いることができ、好ましくはクロ口 ホルムが用いられる。 . 化合物 （I- m) において n=lである化合物 （I- ma) から以下に示す方法によ つて化合物 （J- 0 ) を製造することができる。
製造法 1 2
Figure imgf000052_0001
(式中、 R2、 \ R\ Xおよび Yはそれそれ前記と同義である）
<工程 1 3 >
化合物 （I- ma) を不活性溶媒中、 0°Cから反応に用いた溶媒の沸点の間の 温度、 好ましくは室温から 60°Cの間の温度で、 1当量〜大過剰、 好ましくは 3 〜6当量の適当な酸化剤存在下、 1〜48時間、 好ましくは 3〜24時間処理する ことにより化合物（1- 0 )を得ることができる。
適当な酸化剤としては、 例えば二酸化マンガン、 クロム酸、 クロ口クロム 酸ピリジニゥム、 ニクロム酸ピリジニゥム、 過マンガン酸カリウム、 三酸化 硫黄一ピリジン、 ォキソン等が学げられ、 好ましくは二酸化マンガンが挙げ られる。 不活性溶媒としては、 例えばジクロロメタン、 クロ口ホルム、 四塩 化炭素、 ジクロロェタン、 ベンゼン、 トルエン、 キシレン、 酢酸 チル、 酢 酸、 プロピオン酸、 酪酸、 トリフルォロ酢酸、 水、 ピリジン、 ジメチルホル ムアミ ド、 ジメチルァセトアミ ド、 N-メチル -2-ピロリ ドン、 1，4-ジォキサ ン、 テトラヒドロフラン、 ジェチルエーテル.等を単独でまたは混合して用い ることができ、 好ましくはジメチルホルムアミ ド、 テトラヒ ドロフラン等が 用いられる。 . 化合物 （1 - 0 ) から以下に示す方法によって化合物 （I - p ) を製造する'こと ができる。 '
'製造法 1 3 ,,
Figure imgf000053_0001
(式中、 R2、 R\ R4、 Xおよび Yはそれそれ前記と同義である）
<工程 1 .4 >
化合物 （1 -0 ) を不活性溶媒中、 0°Cから反応に用いた溶媒の沸点の間の温 度、 好ましくは室温から 90°Cの間の温度で、 1当量〜大過剰、 好ましくは 1 〜3当量のヒドロキシルァミンもしくはその塩酸塩、 硫酸塩、 パラトルエン スルホン酸塩等、 0-フエ二ルカ一バミルヒドロキルアミンもしくはその塩酸 塩、 硫酸塩、 パラ トルエンスルホン酸塩等、 または N-ヒドロキシペンズァミ ド、 好ましくはヒ ドロキシルァミンと、 1〜48時間、 好ましくは 3〜24時間 反応させることにより化合物 （I- P ) を得ることができる。 必要により、 1 当量〜大過剩、 好ましくは 1〜3当量の適当な脱水剤の添加や、 1当量〜大過 剰、'好ましくは 2〜6当量の適当な塩基の添加、 またはマイクロ波照射を行つ てもよい。
適当な脱水剤としては、 例えば無水酢酸、 無水フ夕ル酸、 硫酸水素ナトリ ゥム、 ォキソン、 ギ酸ナトリウム、 酸化ジアルキルすず、 アルミナ、 シリカ ゲル、 酢酸ナトリゥム、 ホルムアミ ド、 五酸化ニリン、 塩化鉄（111 )、 ギ酸、 酢酸、 プロピオン酸、 ォキシ塩化リン、 パラトルエンスルホン酸等が例示さ れ、 好ましくは無水酢酸、 無水フ.タル酸等が挙げられる。 適当な塩基として は、 例えばトリェチルァミン、 ピリジン、 水素化ナトリウム、 水素化力リウ ム等が例示され、好ましくはトリエチルァミンまたはピリジンが挙げられる。 不活性溶媒としては、例えばジクロロメタン、クロ口ホルム、四塩化炭素、 ジクロ口エタン、 ベンゼン、 トルエン、 キシレン、 ニトロベンゼン、 ァセ ト 二トリル、 酢酸ェチル、 酢酸、 プロピオン酸、 酪酸、 トリフルォロ酢酸、 ピ リジン、 ジメチルホルムアミ ド、 ジメヂルァ乇トアミ ド、 N-メチル - 2-ピロ リ ドン、. 1 , 4-ジォキサン、 テトラヒドロフラン、 ジェチルエーテル、 メ夕ソ ール、 エタノール、 プロパノール等を単独でまたは混合して用いることがで き、 好ましくはァセトニトリル、 ジメチルホルムアミ ド等が用いられる。 化合物 （I- P) から以下に示す方法によって化合物 （I- d) を製造すること ができる。 . '
製造法 1 4
Figure imgf000054_0001
(式中、 R2、 R3、 R4、 T、 Xおよび Υはそれそれ前記と同義である）
<工程 1 5 >
化合物 （I- ρ) を用いて製造法 6の工程 7と同様な反応を行うことにより 化合物 （1-。 を製造することができる。 化合物 （I- c) から以下に示す方法によって化合物 （I-r) を製造すること ができる。
製造法 1 5
Figure imgf000055_0001
(式中、 R2、 R3、 R4、 R R6\ R8、 U、 n、 Xおよび Yはそれぞれ前記と同義で あり、 ^は前記と同義のアルカリ金属を表す）
<工程 1 6 > .
化合物 （I-c ) を不活性溶媒中、 室温から反応に用いた溶媒の沸点の間の 温度、 好ましくは 40°C〜80°Cの間の温度で、 1当量〜大過剰、 好ましくは 2 〜4当量の QaCN (式中、 Qaは前記と同義である） 、 好ましくは青酸ナトリウム と、 1〜48時間、 好ましくは 3〜24時間反応させることにより化合物（I-r )' を得ることができる。
, 不活性溶媒としては、例えばジクロロメタン、クロ口ホルム、四塩化炭素、 ジクロロェタン、 ベンゼン、 トルエン、 キシレン、 ジメチルホルムアミ ド、 ジメチルァセトアミ ド、 N-メチル -2-ピロリ ドン、 1 , 4-ジォキサン、 テトラ ヒドロフラン等を単独でまたは混合して用いるごとができ、好ましくはジメ チルホルムアミ ド等が用いられる。 化合物 （I- r) から以下に示す方法によって化合物 （I-S ) を製造すること ができる。
製造法 1 6 .
Figure imgf000055_0002
(式中、 R2、 R3、 R4、 T、 n、 Xおよび Yはそれぞれ前記と同義である）
<工程 1 Ί >
化合物 （I- r) を用いて製造法 6の工程 7と同様な反応を行うことにより 化合物 （I- s) を製造することができる。 化合物 （I- 1") から以下に示す方法によって化合物 （I- 1) を製造する.こと ができる。
製造法 1 7
Figure imgf000056_0001
(式中、 R2、 R\ R4、 n、 Xおよび Yはそれそれ前記と同義である）
<工程 1 8 > '
化合物 （I-r) を用いて製造法 5の工程 6と同様な反応を行うことにより 化合物 （I- ) を製造することができる。 化合物 （Illb) から以下に示す方法によって化合物 （I-u) を製造するこ と できる。
製造法 1 8
Figure imgf000057_0001
(式中、 R2、 R3、 R4、 R5ヽ R6、 R5\ R6\ R7c、 R8、 Rs、 R1Q、 Ru、 R18、 Q、 p、 U、 Xおよび Yはそれそれ前記と同義である）
<工程 1 9 >
化合物（Illb) を用いて製造法 7の工程 8と同様な反応を行うことにより 化合物 （V) を製造することができる。
<工程 20 > . ' 化合物 （V) を用いて製造法 5の工程 6と同様な反応を行うことにより化 合物 （VI) を製造することができる。 '
<工程 2 1 >
化合物（VI) を用いて製造法 1 2の工程 1 3と同様な反応を行うことによ り化合物 （VII) を製造することができる。
<工程 22 >
化合物 （VII) を不活性溶媒中、 通常 0°C〜80 °Cの間の温度で、 2〜4当量 の硝酸銀、 酸化銀（1)、'酸化銀（11)、 クロム酸、 クロ口クロム酸ピリジニゥ ム、 ニクロム酸ピリジニゥム、 過マンガン酸力リウム、 過ヨウ素酸ナトリウ ム、 過塩素酸ナトリゥム、 過酸化水素、 亜塩素酸ナトリゥム等の酸化剤、.好 ましくは硝酸銀または過塩素酸ナトリウム存在下で、 10分間〜 24時間、 好 ましくは 1〜4時間処理することにより化合物（VI I I )を製造することができ る。 必要により、 添加剤として、 0 . 1〜4 当量の酢酸等の有機物、 または硫 酸、 リン酸二水素ナトリウム、 スルファミン酸、 酸化ルテミゥム等の無機物 を加えてもよい。
不活性溶媒としては、例えばジェチルエーテル、テトラヒドロフラン、 1 , 4 - ジォキサン、 ジメチルホルムアミ ド、 ジメチルァセ トアミ ド、 ジメチルスル ホキシド、ベンゼン、 トノレエン、キシレン、 ジクロロメタン、 クロ口ホルム、 1，2-ジクロロェタン、 ァセトニトリル、 酢酸ェチル、 酢酸メチル、 メチルェ チルケトン、 塩酸、 酢酸、 無水酢酸、 硫酸、 水等が挙げられ、 好ましくはァ セトニトリル、 水等が挙げられ、 これらは単独でまたは混合して用いること ができる。
<工程 2 3 >
化合物.（VI I I ) を不活性溶媒中、 通常 0°C〜80 °Cの間の温度、 好ましくは 室温で、 1〜20当量のハロゲン化剤と 10分間〜 24時間反応させ、 その後、 1 当量〜大過剰の R7e0H (式中、 R7eは前記と同義である） と反応させることに より化合物（IX )を製造することができる。
ハロゲン化剤としては、 例えば塩化チォニル、 ォキサリルクロリ ド、 ォキ シ塩化リン等が挙げられ、 好ましくは塩化チォニルが挙げられる。不活性溶 媒としては、 例えばジクロロメタン、 クロ口ホルム、 テトラヒドロフラン、 ジメチルホルムアミ ド、 ジメチルァセトアミ ド、 1 , 4-ジォキサン、 ァセトニ ト リル、 ベンゼン、 トルエン、 キシレン等が挙げられ、 これらは単独でまた は混合して用いることができる。不活性溶媒として好ましくはジクロロメ夕 ンが挙げられる。
<工程 2 4 >
化合物（IX) を用いて製造法 1の工程 2と同様な反応を行うことにより化 合物 （X) を製造することができる。
<工程 2 5 > 化合物 （X) を用いて製造法 2の工程 3と同様な反応を行うことにより化 合物 （XI ) を製造することができる。
く工程 2 6 >
ィ.匕合物（Π ) を用いて製造法 1の工程 1 と同様な反応を行うことによりィ匕 合物 （I-u) を製造することができる。 化合物 （I- u) から以下に示す方法によって化合物 （I- V ) を製造すること ができる。
製造法 1 9
Figure imgf000059_0001
(式中、 R2、 R3、 R\ R7e、 Xおよび Yはそれそれ前記と同義である）
く工程 2 7 >
化合物 （I- u) を用いて製造法 5の工程 6と同様な反応を行うことにより 化合物 （Ι-ν) を製造することができる。 化合物 （I- V) から以下に示す方法によって化合物 （I- w) を製造すること ができる。
製造法 2 0
Figure imgf000059_0002
(式中、 R2、 R3、 R4、 R5\ R6a、 Xおよび Yはそれそれ前記と同義である） <工程 2 8 >
化合物 （I- V ) を不活性溶媒中、 通常 0°C〜80 °Cの間の温度、 圩ましくは 室温で、 1〜20当量のハロゲン化剤と 10分間〜 24時間反応させ、 その後、 1 当量〜大過剰の R5aR6aNH (式中、 R5aおよび R6aはそれそれ前記と同義である） と反応させることにより化合物（I-w)を製造することができる。 必要に応じ て、 1当量〜大過剰の適当な塩基を加えてもよい。
ハロゲン化剤としては、 例えば塩化チォニル、 ォキサリルクロリ ド、 ォキ シ塩化リン等が挙げられ、 好ましくは塩化チォニルが挙げられる。 適当な塩 基としては、 例えばピリジン、 トリェチルァミン、 ジイソプロピルェチルァ ミン、 N-メチルモルホリン等が例示され、 好ましくはトリェチルァミンが挙 げられる。 不活性溶媒としては、 例えばジクロロメタン、 クロ口ホルム、 テ トラヒドロフラン、 ジメチルホルムアミ ド、 ジメ ルァセトアミ ド、 1 , 4- ジォキサン、ァセ トニトリル、ベンゼン、 トルエン、キシレン等が挙げられ、 これらを単独でまたは混合して用いることができる。不活性溶媒として好ま しくはジクロロメタンが挙げられる。
化合物（I-w )の製造においては、 ぺプチド化学で常用される手法を用いる こともできる。 すなわち、 化合物（I-v )に不活性溶媒中、 0 . 5〜10当量の適当 な縮合剤と共に 1〜10当量の R5aR6aNH (式中、 R5aおよび R6aはそれぞれ前記と 同義である） を加え、 通常、 0°C ~ 50 °Cの間の温度で 10分間〜 70時間反 さ せることにより化合物（I-w )を得ることができる。
不活性溶媒としては、例えばジェチルエーテル、テトラヒドロフラン、 1 , 4- ジォキサン、 ジメチルホルムアミ ド、 ジメチルァセ トアミ ド、 ジメチルスル ホキシド、 ベンゼン、 トルエン、 キシレン、 ァセトニトリル、 酢酸ェチル、 ピリジン、 ジクロロメタン、 クロ口ホルム、 四塩ィ 炭素等が挙げられ、 好ま しくはテトラヒ ドロフラン、 ジメチルホルムアミ ド等が挙げられる。
適当な縮合剤としては、 例えば 1 , 3-ジシクロへキシルカルポジィ ミ ド、 1- ェチル -3- ( 3-ジメチルァミノプロピル）カルポジイミ ド塩酸塩、 1-ェチル - 3 -（3-ジメチルァミノプロピル）カルボジィミ ド結合ポリスチレンレジン (EDCレジン） 等が挙げられる。 また、 N-ヒドロキシこはく酸イミ ド、 3 , 4 - ジヒドロ- 3-ヒドロキシ -4-ォキソ -1 , 2 , 3-ペンゾトリァジン、 卜ヒドロキシ ペンゾトリァゾール等、好ましくは 1-ヒ ドロキシペンゾトリァゾール等の添 加剤を加えることもできる。 .
EDCレジンは、 テトラへドロン レターズ（Tetrahedron Letters )、 34卷、 48号、 7685頁 （1993年） 記載の方法で製造することができる.。 化合物 （I ) 中、 化合物（I- X ) から、 以下に示す方法によって化合物（I - y) を製造することができる。
製造法 2 1
Figure imgf000061_0001
(式中、 R R3、 R4、 n、 Xおよび Yはそれそれ前記と同義であり、 R22および R23 は同一または異なって水素、 置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もし くは非置換のシクロアルキル、 置換もしくは非置換の低級アルケニル、 置換 もしくは非置換の低級アルキニル、 置換もしくは非置換のァラルキル、 また は置換もしくは非置換の複素環アルキルを表す）
上記の定義において低級アルキル、 シクロア^キル、 低級アルケニル、 低 級アルキニル、 ァラルキル、 および複素環アルキルはそれそれ前記と同義で あり、 それらの置換基もそれそれ前記と同義である。
<工程 2 9 >
化合物 （I- X ) を不活性溶媒中、 1当量〜大過剰の、 好ましくは 1〜10当量 の R22R23CO (式中、 R22および R23はそれそれ前記と同義である） と、 1当量〜大 過剰、 好ましくは 1〜3当量の適当な還元剤の存在下、 通常 - 78°C〜； LOO °Cの 間の温度、 好ましくは 0°C；〜 50 °Cの間の温度で 10分間〜 48時間反応させるこ とにより化合物（I- y )を得ることができる。.
適当な還元剤としては、 例えば水素化ホウ素ナトリゥム、 トリァセトキシ 水素化ホウ素ナトリウム、 シァノ水素化ホウ素ナトリゥム等が挙げられ、 好 ましくはシァノ水素化ホウ素ナトリゥムが挙げられる。必要により、 触媒量 〜溶媒量、 好ましくは 0 . 5当量〜溶媒量の適当な酸を添加してもよい。 適当 な酸としては、 例えばギ酸、 酢酸、 トリフルォロ酢酸、 プロピオン酸、 塩酸 等が挙げられ、 好ましくは酢酸が挙げられる。
不活性溶媒としては、例えばジクロロメタン、クロ口ホルム、四塩化炭素、 ジクロ口ェタン、 ベンゼン、 トルエン、 キシレン、 ジェチルエーテル、 テト ラヒドロフラン、 1， 4-ジォキサン、 ジメチルホルムアミ ド、 ジメチルァセ ト アミ ド、 ァセ トニトリル、 へキサン、 ギ酸、 酢酸、 トリフルォロ酢酸、 プロ ピオン酸、 塩酸等が例示され、 これらを単独でまたは混合して用いることが できる。 好ましくは、 テトラヒドロフラン、 酢酸等が挙げられる。 化合物（I )および原料化合物における各官能基の変換および置換基に含ま れる官能基の変換は、 公知の方法 [例えば、 コンプリヘンシブ 'オーガニヅ ク · トランスフォーメーションズ 第二版 ( Comprehensive Organic
Transformati ons , the second editi on ) R . C .ラロック (Larock )著、 ジョン · ワイリー.アンド.サンズ.ィンコ—ポレーティ ヅ ド（John Wi ley & Sons Inc . )
( 1999年）に記載の方法] 等によって行うことができる。
上記の方法等を適宜組み合わせて実施することにより、所望の位置に所望 の官能基を有する化合物（I )を得ることができる。
上記製造法における中間体および生成物の単離 ·精製は、 通常の有機合成 で用いられる方法、 例えば濾過、 抽出、 洗浄、 乾燥、 濃縮、 結晶化、 各種ク 口マトグラフィ一等を適宜組み合わせて行うことができる。さらに一般的な 並列合成法で常用される精製法、 例えば、 スカペンジャーレジン、 イオン交 換レジンを用いた精製法によっても行うことができる。 また、 中間体におい て fま、 特に精製することなく次の反応に供することもできる。
化合物（I )には、 位置異性体、 幾何異性体、 光学異性体または互変異性体 のような異性体が存在し得るものもあるが、 これらを含め可能な全ての異性 体およぴ該異性体のいかなる比率における混合物も本発明の好中球性炎症 疾患の予防および/または治療薬に使用することができる。
化合物（I)の塩を取得したい場合には、化合物（I)の塩が得られるときはそ のまま精製すればよく、 また化合物（I)が遊離の形で得られるときは化合物 (I)を適当な溶媒に溶解または懸濁し、 酸または塩基を加えて単離 '精製す 'ればよい。
また、 化合物（I)またはその薬理学的に許容される塩は、 水または各種溶 媒との付加物の形で存在することもあるが、 これらの付加物も本発明に包含 される。' 以下、第 1表〜第 1 3表に本発明の好中球性炎症疾患の予防および/また は治療剤として用いられる化合 (I) の具体例を示すが、 本発明の好中球 性炎症疾患の予防および/または治療剤として用いられる化合物範囲はこ れらの化合物に限定されることはない。 ，
また、 化合物 （II) の一部が、 好中球炎症性疾患の予防および/または治 療薬以外の用途を有する化合物として知られている [特開 2002 - 30085号、 特 開 2001- 39874号、. 特開平 11- 255750号、 議 8/6, 720、 特開平 7- 165689号、 W095/2 ,596、 特開平 6- 73047号、 FR2,693,197、 WO94/450、 EP569,013、 EP 546,449, EP 533,058、 EP 543,491, EP 514, 197、 .W094/22 , 859、 US 5,332,820, WOOO/1,389, WO94/12,500 W091/ll,999, DE4,313,747, W093/24,487、 EP400，974、 EP399,73U 特開平 6- 73051号、 特開平 6- 360874号、 EP560，330、 US5, 151,435、 EP520，724、 EP520,723、 EP450,566、 EP429，257ヽ US5, 734,615, US5,208,235N EP488,532] 。
化合物 （II) は、 上記の公報等に記載の製造方法によりまたはそれらに準 じて製造することが可能であり、 化合物 （Π) の四級アンモニゥム塩または それらの薬理学的に許容される塩も、 化合物 （I) の場合と同様にして製造 することが可能である。
好中球性炎症疾患治療剤のスクリーニング法に用いる動物は特に限定さ れないが、 例えばヒトを除く哺乳類動物等が挙げられる。 気管支肺胞中の好 中球浸潤を誘発する物質としては、 特に限定されないが、 SPC等が挙げられ Z9
Figure imgf000064_0001
0C6S00/l700Zdf/X3d ZI6£60請 OAV
Figure imgf000065_0001
Figure imgf000065_0002
Figure imgf000065_0003
Figure imgf000065_0004
Figure imgf000065_0005
63 第 1表 （続き) 化合物 -NR5R
Figure imgf000066_0001
17 N \ _ / OH
18 — N
OH
Figure imgf000066_0002
20
d OH
CH3
21 —
Figure imgf000066_0003
23 — NH O-CH3
24 — H OH
Figure imgf000066_0004
第 2表
Figure imgf000067_0001
化合物 — NR5R6 ·— Y 質量分析値 番号
Figure imgf000067_0002
Figure imgf000068_0001
Figure imgf000068_0002
第 4表
Figure imgf000069_0001
化合物 — NR5R6 — Y 質 S分析値 番号
Figure imgf000069_0002
第 5表
Figure imgf000070_0001
化合物 — NR5R6 — Y g量分析镇
Figure imgf000070_0002
72 — 0 《 MS m/z 453 ( +H)+
\ _ I CH3
CH3
73 MS m/z 455 (M+H)+
CH3
Figure imgf000070_0003
第 6表
Figure imgf000071_0001
— R5R6 — Y 分析値
76 •HM、 N-CH3 Η3Η iΌ MS m/z 466 (M+H)+
77 MS m/z 449 (M+H)+
78 Η3ΗΌ MS m/z 437 (M+H)+
Figure imgf000071_0002
81 , ro Η3ΗΌ . MS m/z 541 (M+H)+
Figure imgf000071_0003
第了表
Figure imgf000072_0001
化合物 -NR5RD — Y
Figure imgf000072_0002
Figure imgf000073_0001
丫。
ZL
Figure imgf000074_0001
0C6S00/l700Zdf/X3d 第 10表
Figure imgf000075_0001
化合物 — NR5aR6a
112 -N N-CH3
Figure imgf000075_0002
114 — )— OH
115 — NH OH
Figure imgf000075_0003
117 -N 0
PH
118
OH
119 — H2 第 11表
Figure imgf000076_0001
化合物 -NR5R6
Figure imgf000076_0002
第 12表
Figure imgf000077_0001
化合物 - R，
Figure imgf000077_0002
125 -OH
O
第 13表 化合物
¾.g.
Figure imgf000077_0003
第 14表 ^ 質量分析値
5 MS m/z 508 (M+H)+
6 MS m/z 563 ( +H)+
7 MS m/z 570 (M+H)+
8 MS m/z 571 (M+H)+
9 MS m/z 553 (M+H)+
10 MS m/z 484 (M+H)+
11 MSm/z482( +H)+
12 MS m/z 528 (M+H)+
図面の簡単な説明 、
第 1図は化合物 1のリポポリサヅカライ ド W E.coli 055:B5 (シグマ ' ァ ルドリ ッチ社製、 以下、 LPSと略す） 誘発気道内好中球浸潤に対する抑制作 用を示す。 第 1図において符号 （##、 *氺） は各々下記の意味を表す。 ## ： p=0.G021 (陽性対照群の陰性対照群対比； Student3 s t-test) . ** : p=0.Q87 (化合物 1投与群の陽性対照群比； Student3 s t-test)
'第 2図は化合物 1の LPS誘発 TNF-ひ産生に対する抑制作用を示す。 第 2図 において符号 （##、 *') は各々下記の意味を表す。
## ： p=0.0057 (陽性対照群の陰性対照群対比； Student' s t-test) * ： p=0,0410 (化合物 1投.与群の陽性対照群対比； Student' s t-test) 第 3図は化合物 1の SPC誘発気道内好中球浸潤に対する抑制作用を示す。 第 3図において符号 （###、 *) は各々下記の意味を表す。 ### ： p〈0,0001 (陽性対照群の陰性対照群対比； Student' s t-test)
* ： p=0, 01668 (化合物 1投与群の陽性対照群対比； Steel test) 第 4図は化合物 1の LPC誘発気道内好中球浸潤に対する抑制作用を示す。 第 4図において符号 （##、 * *) は各々下記の意味を表す。
## ： p=0.0015 (陽性対照群の陰性対照群対比 ； Aspin- welch test) * * ： p=0.0031 (化合物 1投与群の陽性対照群対比； Student' s t-test) 第 5図は化合物 18の LPC誘発気道内好中球浸潤に対する抑制作用を示す。 第 5図において符号 （##、 は各々下記の意味を表す。
## ： p二 0.0028 (陽性対照群の陰性対照群対比； Aspin- welch test)
* * * ： p=0.0007 (化合物 18投与群の陽性対照群対比； Student' s t-test) 第 6図は化合物 1の LPC誘発気道内 KC産生に対する抑 ίί作用を示す。 第 6 図において符号 （###、 *氺） は各々下記の意味を表す。
### ： pく 0.0001 (陽性対照群の陰性対照群対比； Aspin- welch test) ： p=0.0013 (化合物 1投与群の陽性対照群対比 ； Student' s t-test) 第 7図は化合物 1の LPC誘発気道内 MIP- 2産生に対する抑制作用を示す。第 7図において符号 （###、 * *) は各々下記の意味を表す。
### ： p = 0.0002 (陽性対照群の陰性対照群対比；. Student' s t-test) * * ： p=0.0040 (化合物 1投与群の陽性対照群対比 ； Student' s t-test) 第 8図は LPS誘発肺障害モデルの気道内浸潤細胞における GPR4 mRNAの発 現を示す。 第 9図は SPC誘発気道内浸潤細胞における GPR4 mRNAの発現を示す。 次に化合物の薬理作用について試験例で説明する。
試験例 1： GPR4拮抗作用 参考例 61で得られた GPR4のァヅセィ細胞（該ァヅセィ細胞は 17 ?—エス ト ラジオールの刺激により GPR4を発現する） を白色プレートに 1ゥヱル当たり 105個播種し、 反応液中 10腿 ol/Lになるように 17 ?—エス'トラジオール （17 ? - estradiol、 シグマ社製） を培地で希釈したものと試験化合物 1 mol/L を加え、 37°C、 5%C02インキュぺ一夕一中で 6時間反応させた。その後、 Steady Glo Luciferase Assay System (Promega社製） 溶液を加えて反応を停止し、 トヅプカウント（Packard, Meriden, CT, USA)で 1秒間の発光量を測定した。 試験化合物の活性 （拮抗作用） は、 下の式に示す通り 17 ?—ェストラジオ ール添加時と非添加時のガウント数 （count per second) をもとに算出した 阻害率で表した。
式中、 A、 B、 Cはそれそれ以下の意味を表す。
A： 17 ?—エストラジオールおよび試験化合物を添加時のカウント数 B ： 17 /5—エストラジオールおよび試験化合物の両方とも非添加時のカウント数 C ： 17 ?—エストラジオールのみ添加時のカウント数 ' 阻害率 （％) = [ 1— {(A-B) / (C-B)}] X 1 00 結果を第 1 5表に示す。 第 1 5表
化合物番号 阻害率（％)
1 89
2 97
3 96
4 96
5 85
18 96 以上の結果より、 化合物（I)が、 GPR4に拮抗することが示された。 試験例 2： LPS誘発肺障害モデルに対する抑制作用
BALB/c系マウス （雄性、 7週齢、 日本チヤ一ルス · リバ一） に生理食塩水 に溶解した LPS (30 ng/mL)もしくは生理食塩水（陰性対照群） Q.l mLを気管内 投与して、 6時間後に肺胞洗浄を行い、 回収した気管支肺胞洗浄液 （BALF) 中の好中球数および T N F -ひ濃度を測定した。 メチルセルロースを 0.5 %含む 水溶液 (溶媒）に化合物 1を懸濁し、 LPS投与 1時間前に 100 mg/k を経口投与し た。 また陽性対照群には化合物 1懸濁液の代わりに溶媒を投与した。好中球 数は回収した BALF中から塗沬標本を Cytospin3 (Shandon, Inc. , Pittsburgh, PA, USA),で作製し、ライ ト染色後、顕微鏡下 計数した。また、 BALF中の TNF- α濃度はェンザィムィムノァヅセィキヅ.ト (R&D systems, MN, USA)を用いて 測定した。 試験は 1群 7匹で行った。
好中球数計数の結果を第 1図、 TNF-ひ濃度測定の結果を第 2図に示す。 第 1図に示すように、陰性対照群の BALF中好中球数は、一個体あたり（0.12 · ±0.1) xlO4個（平均値土標準誤差）であり、 陽性対照群では、 （16.14±4.90) X 104個と好中球数の顕著な増加が認められた。 化合物 1投与群では、 好中 球数（9.59±2.4) x lO4個 あり、 陽性対照群と比べ好中球数の増加が 41%抑 制された。
第 2図に示すように、 陰性対照群の BALF中 TNF-ひ濃度は、 118±25 pg/mL (平均値土標準誤差） であり、 陽性対照群では、 3521±810 pg/mLと TNF- α 濃度の顕著な増加が認められた。化合物 1投与群では、 TNF-ひ濃度 1418 ±179 pg/mLであり、 陽性対照群と比べ TNF -ひ濃度の上昇が 62%抑制された。 . 本モデルは、 ARDSの評価モデルとしても汎用されている [チェス ト（Chest)、 Apr;105(4)、 pl241-5 (1994年） ] 。 上記のように、 化合物 1が本モデルにお いて効果があることが示され、 化合物 （I) が ARD,Sに対しても有効であると 考えられる。 試験例 3： SPC誘発気道内'好中球浸潤に対する抑制作用
BALB/c系マウス （雄性、 7週齢、 日本チヤ一ルス · リバ一） に 0.1%牛血清 アルブミン加リン酸緩衝液に溶解した 1 mg/mL SPC溶液もしくは 0.1%牛血清 アルブミン加リン酸緩衝液（陰性対照群） 0.1 mLを気管内投与して、 6時間後. に肺胞洗浄を行い、 回収した BALF中の好中球浸潤を評価した。 メチルセル口 ースを 0.5%含む水溶液（溶媒）に化合物 1を懸濁し、 SPC投与 1時間前に 100 mg/kgを経口投与した。 また陽性対照群には化合物 1懸濁液の代わりに溶媒 を投与した。好中球の浸潤は、 回収した BALF中の総細胞数を自動血球数測定 装置（Celltac a MEK-6158； 日本光電、 東京）で測定した後、 塗沬標本を Cytospin3 (Shandon, Inc. , Pittsburgh, PA, USA)で作製し、.顕微鏡下、 形 態学的に好中球に分類して評価した。好中球数は総細胞数に好中球の百分率 を乗じて算出した。 試験は、 陰性対照群では 7匹、 陽性対照群では 5匹、 化合 物 1投与群では 6匹で実施した。
結果を第 3図に示す。
陰性対照群の BALF中好中球数は、 一個体あたり（0.31±0.07) x 105個 （平 均値土標準誤差） であり、 陽性対照群では、 （1.66±0.18) 105個と好中球 数の顕著な増加が認められた。 化合物 1投与群では、 好中球数 1個体あたり (0.20±0,02) X 105個であった。 陽性対照群と比べ、 化合物 1投与群では好 中球数の増加が 109% 抑制された。. 試験例 4： LPC誘発気道内好中球浸潤に対する抑制作用 -
BALB/c系マウス （雄性、 7週齢、 日本チヤ一ルス · リバ一） に 0.1%牛血清 アルブミン加リン酸緩衝液に溶解した 1 mg/mL LPC溶液もしくは 0.1%牛血清 アルブミン加リン酸緩衝液（陰性対照群） 0.1 mLを気管内投与して、 6時間後 に肺胞洗浄を行い、 回収した BALF中の好中球浸潤を評価した。 メチルセル口 ースを 0.5%含む水溶液（溶媒）に化合物 1および化合物 18を懸濁し、 LPC投与 1時間前に 10 mg/kgを経口投与した。 また陽性対照群には化合物 1懸濁液の 代わりに溶媒を投与した。好中球の浸潤は、 回収した BALF中の総細胞数を自 動血球数測定装置（Celltac a MEK- 6158； 日本光電、 東京）で測定した後、 ' 塗沬標本を Cytospin 3 (Shandon, Inc., Pittsburgh, PA, USA)で作製し、 顕微鏡下に好中球数をカウントした。好中球数は総細胞数に好中球の百分率 を乗じて算出した。 試験は、 一群 6匹で実施した。
化合物 1の結果を第 4図に、 化合物 18の結果を第 5図に示す。
第 4図に示すように、陰性対照群の BALF中好中球数は、一個体あたり（0.13 ±0.07) xlO5個 (平均値土標準誤差)であり、 陽性対照群では、 (1.55±0.24) X 105個と好中球数の顕著な増加が認められた。 化合物 1投与群では、 好中 球数一個体あたり（0.57±0.09 ) X 105個であった。 陽性対照群と比べ、 化合 物 1投与群では好中球数の増加が 71% 抑制された。
'第 5図に示すように、陰性対照群の BALF中好中球数は、一個体あたり（0.13 ± 0.06 ) X 105個（平均値土標準誤差）であり、陽性対照群では、.（2.80±0.42) X 105個と好中球数の顕著な増加が認められた。 化合物 18投与群では、 好中 球数一個体あたり（0.72±0.14) X 105個であった。 陽性対照群と比べ、 化合 物 18投与群では好中球数の増加が 78 % 抑制された。 試験例 5： LPC誘発気道内 KCおよび MIP- 2産生に対する抑制作用
BALB/c系マウス （雄性、 7週齢、 日本チヤ一ルス · リバ一） に 0.1%牛血清 アルブミン加リン酸緩衝液に溶解した 1 mg/mL LPC溶液もしくは 0.1%牛血清 アルブミン加リン酸緩衝液（陰性対照群） 0.1 mLを気管内投与して、 3時間後 に肺胞洗浄を行い、 回収した BALF上清中の KCおよび MIP- 2を評価した。 メチ ルセルロースを 0.5%含む水溶液（溶媒）に化合物 1を懸濁し、 LPC投与 1時間 前に 10mg/kgを経口投与した。 また陽性対照群には化合物 1懸濁液の代わり に溶媒を投与した。 好中球'を遊走させる KC (keratinocyte-derived c emokine, ケラチノサイ ト由来ケモカイン） および MIP- 2
(macrophage- inflammation protein - 2、 マクロファージ炎症性蛋白質 - 2 ) は、 回収した BALF上清を回収し、 ELISA kit (DuoSet, R&D Systems )で定法 に従い測定した。 試験は、 一群 6匹で実施した。
結果を第 6図、 第 7図に示す。
陰性対照群の BALF上清中 KC、 MIP- 2は、 一個体あたりそれそれ 0.04±0.02 ng/mL、 0.06±0.02 ng/mL (平均値土標準誤差） であり、 陽性対照群では、 それそれ 1.75±0.11 ng/mL, 1.38±0.11 ng/mLといずれも有意な増加が認め られた。化合物 1投与群では、一個体あたりそれそれ 0.80±0.14ng/mL、 0.71 ±0.11 ng/mLであった。 陽性対照群と比べ、 化合物 1投与群では KC、 MIP- 2 の産生がそれそれ 56%、 51% 抑制された。 試験例 6： LPS誘発肺障害モデルの気道内浸潤細胞における GPR4 mRNAの発現 解析
BALF中の浸潤細胞における GPR4の発現解析は、 リアルタイムモニタリング (こよる定量的 polymerase chain reaction (PCR)法 (TaqMair法)【こより行った。 本法は TaqMan プローブと呼ばれる両端に蛍光色素を持つプローブにより標 的 PCRプロダクト量に比例する蛍光発光量を検出し、 標的核酸配列を定量す る原理に基づいている。
なお、 以下の遺伝子実験操作はモレキュラー · クローニング（Molecular Cloning)第 2版に記載されている方法で行った。
( 1 ) TaqMan プローブおよびプライマーの設定 '
TaqMan プローブおよびプライマーは、 Primer Express ™ Version 1.5 (Applied Biosystems社製ソフ トゥヱァ）を用いて設計し合成した。 TaqMan プローブとしてはマウス GPR4をコードする DNA (配列番号 14)の塩基番号 577- 601番目（配列番号 19)の塩基配列に一致するプローブを合成した（サヮ ディーテクノロジ一社）。 プライマ一としては、 マウス GPR4をコ一ドする DNA (配列番号 14) の塩基番号 549- 570番目（ ンス鎖、 配列番号 20)および 604- 622番目 (アンチセンス鎖、 配列番号 21)の塩基配列に相当するプライマ —を設定し合成した（インビトロジヱン社）。. 内部標準として
glyceralde yde-3-phosphate dehydrogenase (G3PDH)を用いた。 G3PDHの配列 は G3PDH遺伝子の配列情報（GenBank受入番号： M32599 )を用いた。 TaqManプロ ーブとしてはマウス G3PDHをコードする DMの塩基番号 784- 813番目（配列番 号 22)の塩基配列に一致するプローブを合成した（サヮディーテクノロジ一 社）.。 ブライマーとしてはマウス G3PDHの塩基番号 756-776番目（センス鎖、 配 列番号 23)および塩基番号 816-836番目（アンチセンス鎖、配列番号 24)の塩基 配列に相当するプライマーを設定し合成した（ィンビ トロジェン社）。 また G3PDHについてはスタンダ一ド用プラスミ ドを作製するためにマウス G3PDH の塩基番号 257- 278番目（配列番号 25)の塩基配列に相当するプライマーを設 定し合成した（インビトロジヱン社）。
( 2 ) TaqMan PGR 検量線作成用プラスミ ドの作製
マウス GPR4は、 マウス肺 cDNAを铸型とし、 配列番号 20および配列番号 21 で表される塩基配列からなる DNAをプライマーに用いた PCRによって取得し た。 該 PCRは、 上記 cDNA 1 ju 0.25 〃mol/Lの各プライマー、 20Q jumol/l の各 dNTP (dATP、 dGTPヽ dCTPヽ dTTP) Ampli Tag Gold (Applied Biosystems 社） 0.2 〃Lおよび 10 X PCRバッファー （酵素に添付） · 4〃Lを含む 40 〃Lの 反応液を用いて行った。 サ一マルサイクラ一 PTC- 200 (MJ RESEARCH社）を用 い、 95°Cで 10分間加熱後、 94°Cで 1分間、 55°Cで 1分間、 72°Cで 1分間のサイ クルを 30回行い、 最後に 72°Cで 5分間の処理を行った。該 PCR産物をァガ口一 スゲル電気泳動し、 断片を精製した。 精製した断片は DM結合反応により pT7Blue T- vector (Novagen社).にサブクローニングした。 PCR増幅断片と pT7Blue T- vector 50 ngを加えて DNA結合反応を行い、 得られた組換えブラ スミ ド DNAを用いて大腸菌 JM109株を形質転換し、 プラスミ ド pT7mrGPR4を得 た。 核酸配列の確認は ABI377自動シーケンサ一（Applied Biosystems社）を用 いて行い、 マウス GPR4の部分配列 （配列番号 26) を得た。 内部標準に用いる マウス G3PDHは、 マウス耳由来の cDNAを錶型とし、 プライマー（配列番号 25') およびプライマー（配列番号 24)を用いて PCRを行うことにより取得した。 該 PCR反応'は、 上記 cMA 1 〃L、 0.2 mol/Lの各プライマ一、 200 〃mol/Lの 各 dNTP (dATP dGTPヽ dCTP dTTP) Advantage 2 polymerase mix (Clontech 社） 0.2 〃Lおよび 10 X PCRバッファ一 （Clontech社） を含む 50 Lの反応 液を用いて行った。 サ一マルサイクラ一 PTC- 200 (MJ RESEARCH社）を用い、 95°Cで 2分間加熱後、 94°Cで 15秒間、 60°Cで 1分間のサイクルを 30回行い、 最 後に 72°Cで 5分間の処理を行っ 。 該 FCR産物をァガロースゲル電気泳動し、 断片を精製した。 精製した断片は DNA转合反応により pT7Blue T- vector (Novagen社）にサブクローニングした。 PCR増幅断片と pT7Blue T- vector 50 ngを加えて DNA結合反応を行い、得られた組換えプラスミ ド DMを用いて大腸 菌 JM109株を形質転換し、 プラスミ ド pT7mg3- 3を得た。 核酸配列の確認は ABI377自動シーケンサー（Applied Biosystems社）を用いて行い、 マウス G3PDHの部分配列 （配列番号 27) を得た。
(3 ) 鎳型 cDNAの作製
試験例 2と同様の方法で、 BALB/c系マウス （雄性、 7週齢、 日本チヤール ス · リバ一） に生理食塩水に溶解した 30 ng/mL LPS溶液 0.1 mLを気管内投与 し、 0、 3、 6、 12時間後（各群 n=6)に肺胞洗浄を行い、 BALFを回収した。 BALF は 4°C、 3000 rpmで 10分簡遠心分離し、 上清を除去後、 沈殿した細胞を肺浸 潤細胞試料とした。 全 RNAの抽出は、 guanidini面
thiocyanate-phenol-c loroform (AGPC)法にて行った。得られた全 RNA(20 u L)の半量を用いて、 SUPERSCRIPT Prearapl if ication System(Invitrogen社) により、 添付のマニュアルに従って cDNA'を作製した。 .
(4) TaqMan PCRによる定量
TaqMan PCRによる GPR4mRNAの定量は ABI PRISM 7700 Sequence Detection System('Applied Biosystems社）を用いて行った。 PCRは、 上記 cDNA 1 j 2 x TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems¾) 15 〃L、 TaqMan プローブ（配列番号 19 ) 250 nmol/L プライマー（配列番号 20および配列番号 21)各々 1 〃mol/Lを含む 30 〃Lの反応液を用い、 50°Cで 2分間、 95°C で 10 分間保持した後、 95°Cで 15秒間、 60°Cで 1分間のサイクルを 40回繰り返すこ とにより行った。 検量線を作成するだめに上記 （2 ) で作製したプラスミ ド を用いて濃度の異なる標準サンプルを調製し、肺浸潤細胞試料 cDNAと同時に PCRを行った。 反応終了後、 蛍光発光量より PCRプロダクト量を算出し、 作成 した検量線から肺浸潤細胞試料における GPR4 mRNAの量を算出した。 内部標 準に用いた G3PDH mRNAの定量は TaqManプローブ（配列番号 22)、 プライマー (配列番号 23および配列番号 24)を用いて同様の方法で行った。 GPR4 mRNAの 発現量は、 各時間で G3PDH mRNAに対する比を求め、 さらに基準となる LPS投 与 0時間を 1とした相対値で表した。結果を第 8図に示す。 これより BALF中に 浸潤してくる細胞に GPR4が、 発現していることが示された。 試験例 7： SPC誘発気道内浸潤細胞における GPR4 mRNAの発現解析 .
試験例 6と同様の方法を用いて GPR4 mRNAの定量を行った。
( 1 ) 鎳型 cDNAの作製
試験例 3と同様の方法で、 BALB/c系マウス （雄性、 7週齢、 日本チヤール ス · リバ一） に 0.1%牛血清アルブミン水溶液に溶解した 1 mg/mL SPC溶液 0.1 mLを気管内投与し、 0
Figure imgf000086_0001
6 (n=10)、 24 (n=ll )時間後に肺胞洗浄を行 い、 BALFを回収した。 BALFは 4° 3000 rpmで 10分間遠心分離し、 上清を除 去後、' 沈殿した細胞を肺浸潤細胞試料とした。 全 RNAの抽出は、 AGPC法にて 行った。 得られた全 RM(20 〃L)の半量を用いて、 SUPERSCRIPT
Preamplif ication System( Invitrogen社)により、 添付のマニュアルに従つ て cDNAを作製した。
( 2 ) TaqMan PCRによる定量
TaqMan PCRによる GPR4mMAの定量は ABI PRISM 7700 Sequence Detection System(Applied Biosystems社）を用いて行った。 PCRは、 上記 cMA 1 〃L、 2 x TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems '(？ t) 15 /L、 TaqMan プローブ (配列番号 19 ) 250 nmol/Ls プライマー（配列番号 20および配列番号 21)各々 1 mol/Lを含む 30 〃Lの反応液を用い、 50°Cで 2分間、 95°Cで 10分 間保持した後、 95°Cで 15秒間、 60°Cで 1分間のサイクルを 400繰り返すこと により行った。 検量線を作成するために試験例 6の （ 2 ) に記載したプラス ミ ドを用いて濃度の異なる標準サンプルを調製し、肺浸潤細胞試料 cDNAと同 時に PCR反応を行った。反応終了後、 蛍光発光量より PCRプロダクト量を算出 し、 作成した検量線から肺浸潤細胞試料における GPR4mRNAの量 _を算出した。 内部 準に用いた G3 PDH rnRNAの定量は TaqManプローブ（配列番号 22 )、 プライ マー（配列番号 23および配列番号 24)を用いて同様の方法で行った。 GPR4 mRNAの発現量は、 各時間で G3PDHmRNAに対する比 求め、 さらに基準となる SPC投与 0時間を 1とした相対値で表した。結果を第 9図に示す。これより, BALF 中に浸潤してくる細胞に GPR4が、 発現していることが示された。 試験例 8： マウス敗血症モデルでの TNF- 産^抑制作用
BALB/c系マウス （雄性、 7週齢、'日本チヤ一ルス · リバ一） に、 LPSを最 終濃度 0.2mg/inLとなるように滅菌したリン酸緩衝溶液 （以下 PBSと記す、 NaGl:9g, Na2HP04 · 7H2O:0.795g, KH2P04: 0.144gを 1Lの蒸留水に溶解し、 高圧 蒸気滅菌したもの） に溶解し、 体重 100gあたり lmLを尾静脈内投与し、 1時 間後に眼底より採血して血清を分離した。 試験化合物投与群には、 LPS投与 60分前に化合物 1を 0.5w/v%メチルセルロース溶液 （和光純薬工業社製） に 懸濁させた溶液を、 体重 100gあたり ImL経口投与した。 また、 溶媒投与群と して 0.5w/v%メチルセルロース溶液のみを同様に経口投与した。 血清中の TNF- 濃度は、 ELISAキヅ ト （エンドジヱン社製） により測定した。 TNF-ひ 産生の抑制率 （％) は、 各群の TNF-ひ濃度から下記の式にしたがって計算し た。 阻害率 （％) = {(A-B) /C} X 1 0 0
A ：溶媒投与群
B ：試験化合物投与群
C ：溶媒投与群 ' その結果を第 1 6表に示した。 値は平均値土標準誤差を意味し、 は P<0.001(溶媒投与群対比、 Dunnett検定）を表す。なお、'第 1 6表中の「N.D.」 - は 「検出せず （not detective) 」 を表す。 . '
'第 1 0 表 '
投与群 用量 ' TNF-ひ産生量
, (rag/kg) (pg/mL) 阻害率（％ ) . 未処置 - N.D. . - 溶媒 - 1733.9 ±143.9 - 化合物 1 30 800.9 ±86.3*** 54
100 560.9 ±66,O 68
上記の結果は、 化合物 （I) の投与により TNF- の産生が抑制されること を示している。
本モデルは、 古くから敗血症モデルとしてよく用いられてきた [ィムノ ロジー（I腿 miology) Jul;70(3)、 p309-14 ( 1990年）]。 上記のように、 化合 物 1が本モデルで有効であったことから、 化合物 （I) の投与により敗血症を 抑制できると考えられる。 _. W
試験例 9： ラッ ト連鎖球菌細胞壁誘発関節炎モデルでの評価
ラッ ト連鎖球菌細胞壁誘発関節炎モデルは、 Lewis系ラッ ト （雌性、 8週 齢、 日本チヤ一ルス · リバ一社） を用いて、 Schi龍 erらの方法（Schimmer RC. et al.， J. Im皿 nol., 15i, 4103-4108, 1997) に準じ、 以下の うにして 作製した。 .
' 連鎖球菌細胞壁 （streptococcal cell wall, 以下 SCWと記す） 由来のぺプ チドグリカンポリサヅカライ ド (peptidoglycan polysaccharide) 100Pフラ クシヨン溶液 （以下 PG- PS 100Pと記す、 リー ' ラボラ トリーズ社製） を滅菌 した PBSで希釈して 0.6mg/mLとし、 超音波洗浄器 （US-1型、' エスェヌディ社 製） を用いて 20分間超音波粉碎した後、 一匹あたり 6〃g/10 Lで右後肢踵閧 節内に投与した。 一方、 左後肢踵関節内には、 一匹あたり 10/zL滅菌 PBSを投 与した。 さらに感作後 21日目に、 PG-PS 100Pを滅菌 PBSで希釈して 0.2mg/mL とし、 20分間超音波粉砕したものを一匹あたり 100〃g/500 Lで尾静脈より 静脈内投与して関節炎を誘発させた。 一群は 6匹とした。 試験化合物投与群 には、 試験化合物 1を 0.5w/v%メチルセルロース溶液に懸濁し、 感作後 21 日目から 24日目まで、 1日 1回、 各個体に体重 100gあたり lmLを経口投与し た。 また、 溶媒投与群には、 0.5w/v%メチルセルロース溶液を同様に経口投 与した。 さらに未処置群をおき、 これらには SCW投与および薬物投与を行わ なかった。 初回感作日 （0日目） と初回感作後 24日目に、 ラッ ト後肢容積 をプレチスモメ一夕一 TK- 101 (ュニコム社製） で測定し、 下記の式に従って 浮腫容積変化を計算した。
' 浮腫容積変化 = (24日目の右後肢容積一 0日目の右後肢容積） 一
(24日目の左後肢容積一 0日目の左後肢容積） また浮腫抑制率 （％) は、 下記の式にしたがって計算した。 浮腫抑制率 （％) = [(A-B) / (A- C)] X 1 00
A：溶媒投与群の浮腫容積変化 B ：試験化合物投与群の浮腫容積変化
C ：未処置群の浮腫容積変化 その結果を第 1 7表に示した。 値は平均値土標準誤差を意味し、 † † 卞は Pく 0.001 (未処置群対比、 Aspin-Welch検定） 、 は Pく 0.001 (溶媒投与群対 比、 DunneU検定） を表す。
1 7
投与群 用量 浮腫容積変化
(mg/kg) (mD 浮腫抑制率（％ 未処置 -0.01± 0.00
0.74土 0.05†††
化合物 1
Figure imgf000090_0001
本試験においては、 抗 TNF-ひ抗体が著効を示すことが報告されており (Sc rier DJ. et al.， J. Leukoc. Biol. , 63, 359-363, 1998) 、 ヒトに おける関節リゥマチや乾癬性関節炎との類似性が高い.。従って、 本試験の結 果は、 化合物 （ I ) の投与により関節リウマチや乾癬性関節炎などの関節炎 の症状を抑制できることを示していると考えられる。 試験例 10： タバコ煙誘発気道内好中球浸潤に対する抑制作用
以下の試験は、 公知の方法 [ジャーナル'ォプ'ナショナル 'キャンサ一 · インスティチュー卜 (Journal of the National Cancel1 Institut;e)、 64卷、
273- 84ページ （ 1980年）] を改変して行った'。
7週齢の雄性 SD ラッ トを噴霧用プラスチックケージにラッ トを入れ、 喫 煙曝露装置を用いてタバコ煙を 5分間 (タバコ 5— 6本） 曝露した後、 空気 で 10分間換気した。 この操作を 8回繰り返した。 また、 タバコ煙曝露にお けるタバコと空気の希釈比率は、 1 : 9 (10% タバコ煙） とした。
化合物 1 は 3および 10 mg/mLになるように 0.5 w/v%メチルセルロース 400cP (MC、 和光純薬工業社）溶液に懸濁して薬物懸濁液とし 。 溶媒投与群 および薬物投与群にそれぞれ溶媒 （0.5 w/v%MC) および薬物懸濁液を 10 mL/kgの容量でタバコ煙曝露開始め 3 時間前と 10時間後に経口投与した。 非曝露群には溶媒投与およびタバコ煙曝露を行わなかった。
タバコ煙曝露 24時間後に気管支肺胞洗浄 （BAL) を実施した。 すなわち、 ラヅ トをソムノペンチル （武田シエリング■ブラウアニマルヘルス社） 腹腔 内投与により麻酔し、 気管力ニューレを介して phosphate buffered saline. (ICN社）で BALを実施し、 気管支肺胞洗浄液 （BALF)'を得た。
BALF の総白血球数は自動血球カウンター （日本光電社） を用いて測定し た。 また、 細胞の塗抹標本を作成し、 ギムザ染色をした後、 光学顕微鏡にて 観察し、 好中球の細胞数を数えて比率を算出した。 好中球数は総白血球数に 好中球の細胞数比率を掛け合わせて算出した。
結果を第 1 8表に示す。なお好中球数の各値は平均値土標準誤差で示して ある。 第 18表 投与量（mg/kg) 個体数 _好中球（106/BALF) 抑制率は) 非曝露 12 0.00±0.00
溶媒 11 1.11±0.49
化合物 1 11 0.42±0.08
化合物 1 12 0.40±0.13
以上の結果、 化合物 1は 30および 100 mg/kgの用量で、 溶媒投与群にお ける BALF中好中球の増加をそれぞれ 62、 64%抑制した。 つまり、 化合物を 投与することにより肺への好中球の浸潤が抑制された。
C0PD は慢性気管支炎と肺気腫をほぼ含む病態であり、 その特徴として肺 胞内への好中球浸潤が認められる（Thorax , 53 , 137-147 , 1998 )。 COPDの主 原因の 1 つは喫煙であると考えられている （Tho rax , 53 , 137-147 , 1998 )。 COPDの病態モデルとして汎用されている試験例 10における上記の結果から 化合物（I )またはその薬理学的に許容される塩は C0PD などの肺疾患に対し て、 治療および/または予防効果が得られると考えられる。 本発明に係る医薬は、配列番号 11記載のアミノ酸配列を有する蛋白質のシ グナル伝達に関する機能を抑制する物質、配列番号 12記載の塩基配列から選 ばれる連続した 15〜60塩基からなるオリゴヌクレオチドの相補的配列を有 するオリゴヌクレオチドまたは該オリゴヌクレオチド誘導体等、配列番号 11 記載のアミノ酸配列を有する蛋白質を認識する抗体等、 式 （I ) で表される 含窒素三環式化合物もしくはその四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理 学的に許容される塩、ならびにそれらの水和物および溶媒和物からなる群か ら選ばれる物質を有効成分として含むことを特徴とする。本発明に係る医薬 としては、 有効成分である上記物質をそのまま投与してもよいが、 一般的に は、有効成分である上記の物質と 1または 2以上の製剤用添加物とを含む医 薬組成物の形態で投与することが望ましい。 このような医薬組成物は、 それ 自体製剤学の分野で周知または慣用の方法に従って製造することが可能で ある。 また、 医薬組成物の形態である本発明に係る医薬には、 他の医薬の有 効成分が 1または 2以上含まれていてもよい。 なお、 本発明の医薬は、 ヒ トを 含む哺乳類動物に適用可能である。
本発明の医薬の投与経路は特に限定されず、経口投与ま :たは静脈内投与等 の非経口投与のいずれかから治療および/または予防のために最も効果的 な投与経路を適宜選択することができる。経口投与に適する製剤の例として は、 例えば、 錠剤等を挙げることができ、 非経口投与に適する製剤の例とし ては、 例えば、 注射剤等を挙げることができる。
錠剤等の固形製剤の製造には、 例えば、 乳糖、 マンニツ ト等の賦形剤；デ ンプン等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤；ヒドロキシプロ ピルセルロース等の結合剤；脂肪酸エステル等の界面活性剤；グリセリン等 の可塑剤等を用いることができる。 非経口投与に適する製剤のうち注射剤等の血管内投与用製剤^:、好ましく はヒト血液と等張の水性媒体を用いて調製することができる。例えば、 注射 剤は、 塩溶液、 ブドウ糖溶液、 塩水とブドウ糖溶液の混合物等から選ばれる 水性媒体を用い、 常法に従って適当な助剤どともに溶液、 懸濁液、.または分 散液として調製することができる。 非経口用の製剤の製造には、 例えば、 希 釈剤、 香料、 防腐剤、 賦形剤、 崩壊剤、 滑沢剤、 結合剤、 界面活性剤、 可塑 剤等から選択される 1または 2以上の製剤用添加物を用いることもできる。 本発明の医薬の投与量および投与頻度は特に限定されず、有効成分である 上記物質の種類、 投与経路、 治療および Zまたは予防の目的、 患者の年齢お よび体重、症状の性質および重篤度等の種々の条件に応じて適宜選択するこ とが可能である。 例え (ま、 成人 1日当り 0.1〜100mgZkgを 3〜4回に分けて投 与するのが好ましい。 しかしながら、 これら投与量および投与回数は前述の 種々の条件等により変動する。 以下に、 本発明を参考例および実施例によりさらに具体的に説明するが、 本発明の範囲はこれらの実施例等により限定されることはない。
下記参考例中の各化合物の物理化学的データは、以下の機器類によって測 定した。
!H腿： JEOL JNM-EX270 (270 MHz)または JEOL JNM-GX270 (270 MHz) MS: Micromass LCTまたは Micromass Quatro (APCI法により測定） 参考例 1 ：化合物 1 {2— (2—ェチル— 5，7—ジメチルー 3H—ィ ミダゾ [4,5 - b] ピリジン— 3—ィルメチル）一8— (4—メチルピぺラジン一 1—ィルメチル）一 10， 11ージヒドロー 5H—ジペンゾ [b，f]ァゼピン }の合成
特開平 7— 61983に記載された 2— (2—ェチル一5，7—ジメチルー 3H—ィ ミ ダゾ [4, 5- b]ピリジン一 3—ィルメチル）一 10 , 11—ジヒドロー 5H—ジペンゾ [b,f]ァゼピン （30. O g, 78.4 mmol) をクロ口ホルム （300 mL) と酢酸 （300 mL) の混合溶媒に溶解し、 1ーメチルビペラジン （23.6 g, 236 mmol) およ びホルムアルデヒド （37 %水溶液、 7.64 g, 94.1 mmol) を加え、 60°Cに加 熱し、 18時間撹拌した。反応の進行を薄層クロマトグラフィ一で確認した後、 氷冷下に飽和重曹水を加え、 酢酸ェチルで抽出した。 有機層を飽和重曹水、 水、 飽和食塩水で順次洗浄し、 無水硫酸ナトリウムで乾燥後、 減圧下で濃縮 した。 析出した結晶を酢酸ェチルでトリチュレーシヨンし、 化合物 1 (27.4 g, 55.4 mmol, 収率 71%) を得た。 '
APCI-MS: m/z 495 ([M + H]+)
¾ NMR (CDC13) δ (ppm)： 1.30 (t, J = 7.6 Hz, 3 H), 2.27 (.s , ·3 H), 2.45 (m, 8 H) , 2.60 (s, 3 H)， 2.63 (s, 3 H), 2.79 (q, J = 7.6 Hz, 2 H), 2.98 (m, 4 H), 3.38 (s， 2 H) , 5.34 (s, 2 H), 6.00 (s, 1 H), 6.57-6.66 (m, 2 H), 6.79-7,00 (m, 5 H) .
また、 対応するフマル酸塩を以下の方法に従って調製した。
上記の化合物 1 (15 g) をメタノール （110 mL) に溶解し、 フマル酸 7.0g (2.0当量） を加えた。 結晶の析出した懸濁^を一旦濃縮乾固し、 ァセトニ トリル （100 mL) を加え懸濁液を 1時間以上攪拌した。 その後、 結晶を濾取 して、 減圧下、 乾燥することによりにより化合物 1の 2フマル酸塩を得た (20.1 g, 収率 91%)。 参考例 2：化合物 2 { 2—（ 2—ェチル— 5 , 7—ジメチルー 3 H—イ ミダゾ [ 4 , 5 - b ] ピリジン一 3 _ィルメチル）一 8— ( 1， 2 , 5 , 6—テトラヒ ドロピリジン一 1ーィ ルメチル）— 10, .11—ジヒドロー 5H—ジベンゾ [b,f]ァゼピン } の合成
1—メチルビペラジンの代わりに 1,2,3,6—テトラヒドロピリジンを用い、 参考例 1と同様にして、 特開平 7— 61983に記載された 2— (2—ェチル—5, 7 >—ジメチル— 3H—ィミダゾ [4,5- b]ピリジン一3—ィルメチル）— 10,11—ジ ヒド口— 5H—ジペンゾ [b,f]ァゼピンから収率 20%で化合物 2を得た。
APCI-MS: m/z 478 ([M + H]+)
¾ NMR (CDC13) 6 (ppm)： 1.30 (t, J = 7.5 Hz, 3 H) , 2.04 (m, 2 H), 2.53 (t, J = 5.7 Hz, 2 H), 2.60 (s, 3 H), 2.62 (s, 3 H), 2,79 (q, J = 7.5 Hz, 2 H), 2.86-3.02 (m, 6 H)， 3,45 (s, 2 H), 5.33 (s, 2 H), 5.64 (m, 1 H), 5.74 (m, 1 H)， 6.02 (s, 1 H)， 6.57-6.70 (m, 2 H), 6.78-6.82 (in, 2 H), 6.88 (s, 1 H), 6.95-7.00 (ra, 2 H). 参考例 3：化合物 3 {2— (2—ェチル— 5,7—ジメチルー 3H—ィ ミダゾ [4,5-b] ピリジン _ 3—ィルメチル）一 8— (ピロリジン一 1—ィルメチル）一 10， 11ージ ヒドロー 5H—ジペンゾ [b,f ]ァゼピン } の合成
1—メチルビペラジンの代わりにピロリジンを用い、 参考例 1 ^同様にし て、特開平 7— 61983に記載された 2—（2—ェチル— .5,7—ジメチル一 3H—ィ ミ ダゾ [ 4， 5- b]ピリジン一 3—ィルメチル）_ 10 , 11—ジヒドロ一 5H—ジペンゾ [b,f]ァゼピンから収率 20%で化合物 3を得た。
APCI-MS: m/z 46'6 ([M + H] + )
¾ NMR '(CDClg) δ (ppm)： 1,30 (t, J = 7.5 Hz, 3 H), 1.78 (m， 4 H), 2.50 (m， 4 H), 2,60 (s, 3 H), 2,63 (s， 3 H), 2.79 (q, J = .7.5' Hz, 2 H), 2:98 (in, 4 H)， 3.50 (s, '2 H), 5,34 (s, 2 H), 6.02' (s, 1 H), 6.58-6.66 (m, 2 H)， 6,79-6.81 (m, 2 H) , 6.88 (s, 1 H), 6.98-7.02 (m, 2 H) . 参考例 4：化合物 4 {2—（2—ェチル—5, 7—ジメチルー 3H—ィ ミダゾ [4,5 - b] ピリジン一 3—ィルメチル）一8—モルホリノメチル一 10, 11—ジヒ ドロー 5H —ジベンゾ [b，f]ァゼピン } の合成
1—メチルビペラジンの代わりにモルホリンを用い、 参考例 1と同様にし て、特開平 7— 61983に記載された 2— (2—ェチル— 5,7—ジメチル— 3H—ィ ミ ダゾ [ 4 , 5 - b ]ピリジン一 3—ィルメチル）一 10 , 11—ジヒドロ一 5 H—ジペンゾ [b,f]ァゼピンから収率 46%で化合物 4を得た。 .
APGI-MS: m/z 482 ([M + H]+)
ln NMR (CDC13) δ (ppm)： 1,30 (t, J = 7.5 Hz, 3 H), 2.43 (m, 4 H), 2.60 (m, 3 H) , 2.63 (m, 3 H), 2.79 (q, J = 7.5 Hz, 2 H), 2.98 (m, 4 H), 3.38 (s, 2 H), 3.69 (m, 4 H), 5.34 (s, 2 H), 6.07 (s, 1 H)， 6.58-6.67 (m, 2 H) , 6.78-6.81 (m, 2 H) , 6.88 (s， 1 H), 6.96-7.01 (m, 2 H). 参考例 5 ：化合物 5〜化合物 1 2の合成
特閧平 7— 61983に記載された 2— (2—ェチル— 5,7—ジメチル— 3H—ィ ミ ダゾ [ 4, 5-b ]ピリジン一 3—ィルメチル）一 10 , 11—ジヒドロ一 5H—ジベンゾ [b,f]ァゼピン （19mg, 0.050醒 ol) をクロ口ホルム （0.30 mL) と酢酸（0.30 mL) の混合溶媒に溶解し、 対応する R5R6NHのクロ口ホルム溶液 （1.0 mol/L, 0.15 niL) およびホルムアルデ-ヒド （37 %水溶液、 0.005 mL) を加え、 60°C に加熱し、 20時間撹拌した。反応の進行を薄層クロマトグラフィ一で確認し た後、 溶媒を留去し、 残渣をクロ口ホルムに溶解させ、 水洗を 2HI施した。 有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、 濃縮し、 残渣にクロ口ホルム （0.50 mL) および N—メチルイサト酸無水物 ポリスチレン （N-Methylisatoic anhydride polystylene^ ノババイオケム社製、 0.15 ιώ) を加え、 室温で終 夜撹拌した。反応混合物中のレジンを濾別し、 残渣をイオン交換クロマトグ ラフィ一 （ボンデシル SCX、 バリアン社製、 2 mol/Lアンモニア一メタノール 溶液で溶出） で精製し、 目的物である化合物 5〜化合物 12を得た。 化合物の構造を第 1表に、 分析値 （APCI- MS) を第 1 4表に記した。 参考例 6 ：化合物 ί 3 {ヨウ化 1— [8—（2—ェチル— 5，7—ジメチルー 3Η—ィ ミダゾ [4, 5- b]ピリジンー 3—ィルメチル）一 10， 11ージヒドロ一 5H—ジベン ゾ [b,f]ァゼピン一 2—ィルメチル]—1一メチルピロリジニゥム } の合成 参考例 3で得られた化合物 3 (11.4 g, 24.5腿01) をジクロロメタン （ 0 mL) に溶解し、 ヨウ化メチル （1.98 mL, 31.8 mmol) を加え、 室温で 10時間 撹拌した。 反応溶液'を減圧下、 濃縮した後、 酢酸ェチルを加えた。 得られた 懸濁液を 60°Cに加熱し 0.5時間撹拌し、 その後室温で 1時間撹拌した。析出し た固体を濾取して、 化合物 1 3 (13.7 g， 22.5 mmol, 収率 92%) を得た。 APCI-MS: ιη/ζ '480 ([M - I]つ
JH腿 (CDC13)5 (ppm): 1.31 (t， J = 7.6 Hz, 3 H), 2.13 (br s, 2 H), 2.25 (br s, 2 H), 2.58 (s, 3 H), 2.62 (s, 2 H), 2.79 (q, J = 7.6 Hz, 2 H), 2.85 (m, 4 H)， 3.06 (s, 3 H), 3.52 (br s, 2 H), 3.83 (br s, 2 H), 4.74 (s, 2 H), 5.32 (s, 2 H), 6.76 (m, 2 H), 6.88 (s， 1 H)， 6.95-7.18 (in, 4 H)， 7.43 (s, 1 H). 参考例 7 ：化合物 1 4 {2— (2,5—ジヒ ドロピロ一ルー 1一ィルメチル）—8 一（2—ェチル— 5,7—ジメチルー 3H—イ ミダゾ [4,5- b]ピリジン一 3—ィルメ チル）一10,11—ジヒ ドロ— 5H—ジペンゾ [b,f]ァゼピン } の合成
1—メチルビペラジンの代わりに 2，5—ジヒ ドロピロールを用い、参考例 1 と同様にして、特開平 7— 61983号に記載された 2— (2—ェチルー 5, 7—ジメチ ルー 3H—ィ ミダゾ [4， 5- b]ピリジン一3—ィルメチル） 10,11—ジヒドロ一 5H —ジペンゾ [b,f]ァゼピンから収率 82%で化合物 1 4を得た。
APCI-MS: m/z 464 ([M + H]+)
¾ NMR (CDC13) δ (ppra)： 1,30 (t, J = 7.5 Hz, 3 H), 2.59 (s, 3 H), 2.63 (s, 3 H), 2.79 (q, J = 7.5 Hz, 2 H), '2.9-3.1 (m, 4 H), 3.45 (s, 4 H), 3.70 (、s'， 2 H), 5.34 (s， 2 H), 5.87 (s, 2 H)， 6.07 (s, 1 H), 6.59 (d, J = 8.7 Hz, 2 H), 6.63 (d, J = 8.7 Hz, 2 H)， 6.75-6.85 (m, 2H) ， 6.88 (s, 1 H), 7.00-7.05 (m, 2 H). 参考例 8 ：化合物 1 5 <{N-[8- (2—ェチル— 5,7—ジメチルー 3H—ィミダゾ [4, 5- b]ピリジン一 3—ィルメチル）一 10 , 11—ジヒドロー 5H—ジペンゾ [b , f] ァゼピン一 2—ィルメチル]—N—メチルアミノ }酢酸メチルエステル〉の合成
1—メチルビペラジンの代わりにサルコシンメチルエステル塩酸塩を用い、 参考例 1と同様にして、特開平 7— 61983号に記載された 2_ (2—ェチル—5, 7 —ジメチル— 3H—ィミダゾ [4,5-b]ピリジン一 3—ィルメチル）一10， 11—ジ ヒドロ— 5H—ジベンゾ [b，f]ァゼピンから収率 31%で化合物 1 5を得た。 APCI-MS: m/z 498 ([M + H]+)
¾ NMR (CDClg) δ (ppm)： 1,30 (t, J = 7.6 Hz, 3 H), 2.36 (s, 3 H), 2.60 (s, 3 Hi, 2.63 (s, 3 H), 2.79 (q, J = 7.6 Hz, 2 H), 2.98 (m, 4 H), 3.23 (s, 2 H), 3.53 (s, 2 H), 3.70 (s, 3 H), 5.34 (s, 2 H), 5.98 (s, 1 H), 6.59-6.67 (m, 2 H), 6.82 (m, 2 H), 6.88 (s, 1 H), 6.97-7.02 (m, 2 H). 参考例 9 ：化合物 1 6 {1— [8— (2—ェチル—5,7—ジメチル— 3H—ィミダゾ [4,5-b]ピリジン一 3—ィルメチル）一 10， 11—ジヒドロー 5H—ジぺンゾ , f ] ァゼピン一 2—ィルメチル]ピペリジン一 4—カルボン酸ェチルエステル } の 合成
1—メチルビペラジンの代わりにィソニペコチン酸ェチルエステルを用い、 参考例 1と同様にして、特開平 7— 61983号に記載された 2— (2—ェチル—5,7 —ジメチル— 3H—ィ ミダゾ [4,5- b]ピリジン一 3—ィルメチル）— 10, 11—ジ ヒド口— 5H—ジペンゾ [t),f]ァゼピンから収率 60%で化合物 1 6を得た。 APCI-MS: m/z 552 ([M + H]+)
[ NMR (CDC13) δ (ppm): 1,23 (t, J = 7.0 Hz, 3 H), 1.30 (t, J = 7.6 Hz 3 H), 1.68-1.90 (in, 6 H), 1.97 (td, J = 11:3, 2.7 Hz, 2. H), 2.26 (m
1 H), 2.60 (s, 3 H)， 2.62 (s, 3 H), 2.79 (q, J = 7.6 Hz, 2 H): 2.83 (m 2 H), 2.98 (m, 4 H), 3.3'6 (s, 2 H), 4.11 (q, J 二 7.0 Hz, 2 H), 5.33 (s
Figure imgf000098_0001
参考例 1 0 ：化合物 1 7く 2 _{N— [8— (2—ェチルー 5, 7—ジメチルー 3H—ィ ミダゾ [4, 5- b]ピリジン一 3—ィルメチル）一 10 , 11—ジヒ ドロー 5H—ジベン ゾ [b，f]ァゼピン一 2—ィルメチル]—N—メチルァミノ }エタノール >の合成 水素化アルミニウムリチウム （15.7 mg, 0.38 mmol) をテトラヒドロフラ ン （0.3 mL) に懸濁させ、 氷冷下、 攪拌しながら、 テトラ.ヒ ドロフラン （0.9 mL) に溶解した、 参考例 8で得られた化合物 1 5 (126 mg, 0.253 mmol) を 加え、 室温で 1.5時間撹拌した。 反応の進行を薄層クロマトグラフィーで確 認した後、 撹拌しながら水（0.016 mL), 2mol/L水酸化ナトリウム水溶液 (0.016 mL)、 水（0.048 mL)を順次滴下した。 析出物を濾別し、 濾液を濃縮し た残渣を NH—シリ力ゲルク口マトグラフィ一 （溶出溶媒：酢酸ェチル） で精 製して、 化合物 1 7 (47.6 mg, 0.101 mmol, 収率 40%) を得た。
APCI-MS: m/z 470 ([M + H]+)
!H NMR (CDC13) δ (ppm)： 1.30 (t, J = 7.5 Hz, 3 H), 1.7 (br s, 1 H), 2.21 (s, 3 H) , 2.57 (t, J = 5.5 Hz, 2 H), 2.60 (s, 3 H), 2.63 (s, 3 H), 2,80 (q, J = 7.5 Hz, 2 H), 2.98 (m, 4 H), 3.44 (s, 2 H), 3.61 (t, J = 5.5 Hz, 2 H), 5.34 (s， 2 H), 5.99 (s, 1 H), 6.59-6.67 (m, 2 H), 6.81 (m, 2 H)， 6,88 (s, 1 H), 6.91-6.98 (m, 2 H). 参考例 1 1 ：化合物 1 8く {1— [8— (2—ェチル— 5,7—ジメチルー 3H—ィ ミダ ゾ [4 , 5- ピリジン一 3—ィルメチル）一 10， 11—ジヒ ドロ一 5H—ジベンゾ [t)，f]ァゼピン一 2—ィルメチル].ピぺリジン一 4ーィル }メタノール〉の合成 化合物 1 5の代わりに化合物 1 6を用い、 参考例 1 0と同様にして、 収率 50%で化合物 1 8を得た。
APCI-MS: m/z 510 ([M + H]+)
l NMR (CDC13) δ (ppm)： 1.30 (t, J = 7.6 Hz, 3 H), 1,24-1.74 (m, 6 H), 1.91 (m, 2 H), 2.60 (s， 3 H), 2.63 (s， 3 H)， 2.79 (q, J = 7.6 Hz, 2 H), 2.86-3.02 (m, 6 H) ， 3.37 (s, 2 H) ， 3.48 (d, J = 6.3 Hz, 2 H), 5.34 (s, 2 H) ， '5.98 (s, 1 H)， 6.58-6.67 (m, 2 H)， 6.82 (m, 2 H), 6.89 (s, 1 H) ， 6.94-7.00 (m, 2 H) . 参考例 1 2 ：化合物 1 9く {N— [8— (2—ェチルー 5, 7—ジメチル— 3Η—ィミダ ゾ [4 , 5- b]ピリジン一 3—ィルメチル）一 10 , 11—ジヒ ドロ一 5Η—ジペンゾ
[b,f]ァゼピン一 2—ィルメチル]一 N—メチルアミノ }酢酸〉の合成 .
参考例 8で得られた化合物 1 5 (151 mg, 0.303讓01) をメタノ一ル （3.0 mL) に溶解し、 lmol/L水酸化ナトリゥム /メタノール溶液 （1.5 mL) を加え、 60°Cに加熱し、 9時間撹拌した。 反応の進行を薄層クロマトグラフィーで確 認した後、 室温に冷却し、 4mol/L塩酸を加え、 pHを 6.0に調整した。 析出し た結晶を濾取し、減圧下で乾燥した。この結晶をェチルエーテルに懸濁させ、 加熱還流条件下、 1時間撹拌し、さらに室温で 1時間撹拌した。結晶を濾取し、 減圧下で乾燥させて、 化合物 1 9 (119 mg, 0.246匪 ol, 収率 81%) を得た。 APCI-MS: m/z 483 ([M + H]つ
¾ NMR (DMSO-d6)(5 (ppm)： 1.23 (t, J = 7.4 Hz, 3 H) , 2.34 (s， 3 H), 2.48-2.52 (s x 2, 6 H, DMSOとオーバーラップ）， 2.78 (q, J = 7.4 Hz, 2 H), 2.89 (m, 4 H), 3.11 (s, 2 H), 3.66 (s, 2 H), 5.29 (s, 2 H), 6.75-7.02 (m, 7 H)， 8.36 (s, 1 H). ' 参考例 1 3 ：化合物 2 0 {1一 [8— (2—ェチル—5, 7—ジメチル— 3H—ィ ミダ V [4,5-b]ピリジン一 3—ィルメチル）一 10， 11—ジヒ ドロ一 5H—ジペンゾ
[b,f]ァゼピン一 2—ィルメチル]ピペリジン一 4一力ルボン酸 } の合成 化合物 1 5の代わりに化合物 1 6を用い、 参考例 1 2と同様にして、 収率 70%で化合物 2 0を得た。
APCI-MS: πι/ζ 524 ( [M + H] + )
¾ NMR (DMS0-d6)5 (ppm): 1.23 (t, J = 7.4 Hz, 3 H), 1.52 (m, 2 H), 1.75 (m, 2 H), 1.97 (m, 2 H), 2.18 (m, 1 H)， 2.48-2.54 (s x 2, 6 H, DMSO とオーバーラップ）， 2.71-2.92(111, 8 H)， 3.32 (s, 2 H), 5,29 (s, 2 H)， 6.75-6.94 (m， 7 H), 8,23 (s, 1 H) . 参考例 1 ：化合物 2 1く {N— [8— (2—ェチル— 5，7—ジメチル— 3H—ィ ミダ ゾ [4， 5- b]ピリジン一 3—ィルメチル）一 10， 11—ジヒドロ一 5H—ジベンゾ [b，f]ァゼピン一 2—ィルメチル]一 N—メチルアミノ }ァセ トニトリル〉の合 成
参考例 6で得られた化合物 1 3 (700 rag, 1.15 mmol) をクロ口ホルム （1.2 mL) に溶解し、 メチルアミノアセトニトリル （ 368 mg, 3.46 mmol) および トリェチルァミン （0.561 mL, 4.03 mmol) を加え、 加熱還流条件下、 終夜 撹拌した。 反応液を室温まで冷却し、 飽和重曹水を加え、 クロ口ホルムで 3 回抽出した。 有機層を合わせ、 飽和食塩水で洗浄し、 無水硫酸マグネシウム で乾燥後、 濃縮し、 残渣をシリカゲルクロマトグラフィー （溶出溶媒： メタ ノール/クロ口ホルム = 1/99) で精製した。 目的物を含む画分の濃縮残渣に エタノールを加え、 得られた懸濁液を 60°Cで 0.5時間撹拌し、 その後室温で 1 時間撹拌した。 析出した結晶を濾取し、 減圧下で乾燥させることにより、 .化 合物 2 1 (415 mg, 0.893 mmol, 収率 78%) を得た。
APCI-MS: m/z 465 ([M + H]+)
JH NMR (CDC13)5 ( pm): 1.30 (t, J = 7.5 Hz, 3 H), 2.42 (s, 3 H), 2.60 (s, 3 H) , 2,63 (s, 3 H), 2.79 (q, J = 7.5 Hz, 2 H), 2.98 (m, 4 H), 3.43 (s, 2 H), 3.48 (s, 2 H), '5.34 (s, 2 H), 6.10 (s, 1 H), 6.58-6.69 (m, 2 H)， 6.78-6.83 (m, 2 H) , 6.88 (s, 1 H), 6.95-7.02 (m, 2 H). 参考例 1 5 ：化合物 2 2 {N—[ 8— (2—ェチルー 5, 7—ジメチル— 3H—イ ミダ ゾ [4,5- b]ピリジン一 3—ィルメチル）一10, 11—ジヒ ドロ一 5H—ジべンゾ [b,f]ァゼピン一 2—ィルメチル]—N— [2— (ピロリジン一 1一ィル） ェチル] アミン · 2フマル酸塩 } の合成
工程 1
後記の参考例 24で得られた化合物 9 3 (1.25 g, 3.03 匪 ol) をクロ口 ホルム （54 mL) およびアセトン（6 mL)の混合溶媒に溶解し、 二酸化マンガ ン（2.7 g, 31匪 ol)を加えて室温で終夜撹拌した。 反応の進行を薄層クロマ トグラフィ一で確認した後、 固形物をセライ トを通じて濾別し、 濾液を濃縮 した。 残渣に酢酸ェチルを,加えて得られる懸濁液を加熱還流条件下 0.5時間 撹拌し、'その後室温に冷却してさらに 0.5時間撹拌した。 析出した結晶を濾 取し、減圧下乾燥させることにより 8—（2—ェチル一5，7—ジメチルー 3H—ィ ミダゾ [4， 5- b]ピリジン _ 3—ィルメチル）一 10 , 11—ジヒドロ一 5H—ジペン ゾ [b,f]ァゼピン— 2—カルボアルデヒド （1.02 g, 2.48 mmol, 収率 82%) を得た。
APCI-MS: m/z 411 ([M + H]+)
¾ NMR (CDC13) δ (ppm)： 1.31 (t, J = 7.5 Hz, 3 H) , 2.60 (s, 3 H), 2.64 (s, 3 H) , 2.80 (q, J = 7.5 Hz, 2 H) , 2.99 (m, 2 H), 3.06 (m, 2 H), 5.37 (s, 2 H), 6.60-6,91 (m， 6 H) , 7.52-7.61 (m, 2 H), 9.77 (s, 1 H) . 工程 2
工程 1で得られた 8— (2—ェチル— 5,7—ジメチルー 3H—ィミダゾ [4,5- b] ピリジン一 3—ィルメチル）一 10， 11—ジヒドロ一 ジベンゾ [b , f]ァゼピ ンー 2—カルボアルデヒド （0.300g， 0.73 mmol) をテトラヒドロフラン （10 mL) およびクロ口ホルム （6mL) の混合溶媒に懸濁させ、 これに 2—（ピロリ ジン一 1—ィル）ェチルァミン （139 〃L, 1.10 mmol) を加えて 1 0分間、 加 熱還流した。 その後、 反応溶液を室温まで冷却してトリアセトキシホウ素化 ナトリウム （464 mg, 2.19 mmol) を加えて 12時間、 室温で攪拌した。 反応 溶液に酢酸ェチルと lmol/L水酸化ナトリウム水溶液を加え、 有機層を無水 硫酸マグネシウムを加えて乾燥させた。 その後、 溶液を減圧下、 濃縮し、 残 渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ一（溶出溶媒：クロロホルム /2mol/L アンモニア ' メタノール溶液 =20 ） で精製して、 N— [8— (2—ェチルー 5,7 一ジメチルー 3H—ィミダゾ [4,5- b]ピリジン一 3—ィルメチル）一10, 11—ジ ヒドロ一 5H—ジベンゾ [b,f]ァゼピン一 2—ィルメチル]—N— [2— (ピロリジ ンー 1一ィル）ェチル],ァミン （0.301 g， 0.592 mniol, 収率 81%) を得た。 こ れを参考例 1と同様な方法でフマル酸塩として化合物 2 2を得た。
APGI-MS: m/z 509 ([M + H]+)
!H NMR (DMS0-d6)(5 (pp.m): 1.23 (t, J = 7.4 Hz, 3 H), 1.65-1,85 (m, 4 H), 2.50 (s, 3H) , 2.51 (s, 3H) , 2.6-2.7 (m, 4 H), 2.7-3.0 (m, 8 H), 3.86 (s， 2 H), 5.29 (s, 2 H), 6.55 (s, 4 H), 6.75-6.95 (m， 6 H), 7.0-7.15 (m, 2 H), 8.43 (s, 1 H) . 参考例 1 6 ：化合物 2 3 {N— [8— (2—ェチル— 5,7—ジメ'チル— 3H—ィ ミダ ゾ [4 , 5- b]ピリジン一 3—ィルメチル）一 10 , 11—ジヒ ドロ一 5H—ジベンゾ
[¾,f]ァゼピン一 2—ィルメチル]—N— (2—メ トキシェチル）ァミン · 1フマル 酸塩 } の合成
2—（ピロリジン一 1一ィル）ェチルアミンの代わりに 2-メ トキシェチルァ ミンを用い、 参考例 1 5の工程 2と同様にして、 収率 78%で N— [8—（2—ェ チルー 5, 7—ジメチルー 3H—イミダゾ [4， 5- b]ピリジン一 3—ィルメチル）一 10,11—ジヒドロー 5H—ジペンゾ [b,f]ァゼピン一 2—ィルメチル]一 N— (2- メ トキシェチル）アミンを得た。 これを参考例 1と同様な方法でフマル酸塩 として化合物 2 3を得た。
APCI-MS: m/z 470 ([M + H]+)
JH NMR (DMS0-d6)(5 (ppm): 1.23 (t, J = 7.4 Hz, 3 H), 2.50 (s, 3H) ， 2.51 (s, 3H) , 2.80 (q, J = 7,4 Hz, 2 H)， 2.8-3.0 (m, 6 H), 3.24 (s， 3 H), 3.49 (t, J = 6.5 Hz, 2 H), 3.80 (s, 2H) ， 5.29 (s, 2 H), 6.48 (s, 2 H), 6.84 (d, J = 8.1 Hz, 1 H), 6.85-7.0 (m, 4 H), 7.0-7.1 (ill, 2 H), 8.43 (s, 1 H). 参考例 1 7 ：化合物 2 4〈2— {[8— (2—ェチルー 5,7—ジメチル—311—ィミダ ゾ [4, 5- b]ピリジン一 3—ィルメチル）一 10， 11—ジヒ ドロー 5H-ジベンゾ
[b,f]ァゼピン一 2—ィルメチル]ァミノ： [エタノール · 0.5フマル酸塩〉の合成 2—（ピロリジン一 1—ィル）ェチルァミンの代わりに 2—エタノールアミン を用い、 参考例 1 5の工程 2と同様にして、 収率 39%で 2— {[8— (2—ェチル 一 5 , 7—ジメチルー 3H—イミダゾ [4, 5- b]ピリジン一 3—ィルメチル）一 10 , 11 —ジヒドロ一 5H—ジベンゾ [b,f]ァゼピン _ 2—ィルメチル]アミノ }ェタノ ールを得た。
これを参考例 1と同様な方法でフマル酸塩として化合物 2 を得た。
APCI-MS: m/z 456 ([M + H]+) .
JH NMR (丽 SO- d6)(5 (ppm): 1.23 (t, J = 7.4 Hz, 3 H), 2.50 (s, 3H) , 2.51 (s， 3H) , 2.70-2.75 (m, 2 H), 2.77 (q, J = 7.4 Hz, 2 H), 2.85-2.9 (m, 4 H), 3.55 (t, J二 5.5 Hz, 2 H), 3.78 (s， 2H) , 5.29 (s, 2 H), 6.44
(s, 1 H), 6.79 (dd, J = 1.5 Hz, 8.3 Hz, 1 H)， 6.85-6.95 (m, 4 H), 7.0-7.1
(m, 2 H), 8.39 (s,.1 H). 参考例 18 ：化合物 2 5 < {[8— (2—ェチル—5，7—ジメチル— 3H—ィミダゾ [4,5- b]ピリジン一 3—ィルメチル）一10,11—ジヒドロ一 5H—ジペンゾ [t),f] ァゼピン— 2—ィル] メチル } アミン · 1フマル酸塩〉の合成
参考例 6で得られた化合物 1 3 (0.300 , 0.516 mmol) を 7mol/L-アンモ ニァ /メタノール溶液 （5 mL) に溶解し、 封管して 80°Cで 48時間加熱した。 その後、 反応溶液を減圧下、 濃縮した。 残渣をシリカゲルクロマトグラフィ 一 （溶出溶媒： クロ口ホルム / 2mol/L アンモニア /メタノール溶液 = 20/1) で精製して、 {[8— (2—ェチル一 5,7—ジメチルー 3H—ィ ミダゾ [4，5- b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 10 , 11—ジヒドロ一 5H—ジペンゾ [b , f ]ァゼピン一 2 一ィル] メチル } ァミン （0.135 g, 0.329 mmol, 収率 64%) を得た。
これを参考例 1と同様な方法でフマル酸塩として化合物 2 5を得た。
APCI-MS: m/z 412 ([M + H]+)
NMR (腿 SO- d6)6 (ppm): 1.23 (t, J = 7.4 Hz, 3 H), 2.50 (s, 3H) , 2.51 (s, 3H) , 2.77 (¾； J = 7.4Hz, 2 H), 2.85-2.9 (m, 4 H) ， 3.81 (s, 2H) , 5.29 (s, 2 H), 6.42 (s, 2 H), 6,8-7.0 (m, 5 H), 7.0-7.15 (m, 2 H), 8.46 (s, 1 H). 参考例 1 9 ：化合物 2 6 {N— [8—（2—ェチル— 5,7—ジメチルー 3H—ィ ミダ ゾ [4, 5- 1)]ピリジン一 3—ィルメチル）一 10， 11—ジヒ ドロ一 5H—ジペンゾ [b,f]ァゼピン一 2—ィルメチル] — N—メチルー N— (2H—テトラゾール一5 一ィルメチル）アミン} の合成
参考例 6で得られた化合物 1 3 (667 mg, 1.10腿 ol) をクロ口ホルム （11 DiL)に溶解し、 後記の参考例 22で得られた N—メチルー N— (2—トリチルー 2H—テトラゾ一ルー 5—ィルメチル）アミン （ 390 mg, 1.10 mmol) およぴト リエチルァミン （0.31 niL, 2.3 mmol) を加えて 60°Cで終夜撹拌した。 反応 液を室温まで冷却し、 飽和重曹水を加え、 クロ口ホルムで 3回抽出した。 有 機層を合わせ、 飽和食塩水で洗浄し、 無水硫酸マグネシウムで乾燥し、 濃縮 した。 残渣をシリカゲル （溶出溶媒： メタノール/クロ口ホルム = 2/98) に 通じて原点成分を除去し、 濃縮した。残渣にァセトン （1.9 mL)、水（1.9 mL) および酢酸 （1.9m を加え、 60°Cで 1.5時間撹拌した。 反応液を 0°Cまで冷 却し、析出物を濾別し、濾液を濃縮した。残渣をエタノールから再結晶して、 化合物 2.6 (66.7 mg, 0.131 腿 ol, 収率 12%) を得た。
APCI-MS: m/z 508 ([M + H]つ
¾腿 (GDC13) δ (ppm)： 1.32 (t, J 二 5.0 Hz, 3 H), 2.58 (s， 3 H), 2.63 (s,,3 H), 2.75-2.79 (m, 7 H) , 2.81 (q, J ='5.0 Hz, 2 H), 4.08 (s, 2 H)， 4.28 (s, 2 H), 5.34 (s, 2 H), 6.37 (s, 1 H), 6.46 (d, J = 8.1 Hz, 1 H)', 6.58 (d, J = 8.1 Hz, 1 H), 6.72-6.80 (m, 2 H), 6.84-6.94 (m， 3 H). 参考例 20 ：化合物 2 7 {2— (2—ェチルー 5, 7—ジメチルー 3H—イミダゾ [4,5-b]ピリジン一 3—ィルメチル）一8— [4— (2H—テトラゾール一5—ィル） ピぺリジン一 1—ィルメチル]— 10 , 11—ジヒドロ一 5 H—ジベンゾ [ b , f ]ァゼ ピン } の合成
メチルァミノァセトニトリルの代わりにピペリジン一 4—カルボ二トリル を用い、 参考例 1 4と同様にして、 収率 58%で 1—[ 8— (2—ェチルー 5, 7—ジ メチル一 3H—ィ ミダゾ [4,5-b]ピリジン一 3—ィルメチル）一10，11—ジヒド ロー 5H—ジベンゾ [b， f ]ァゼピン一 2—ィルメチル]ピぺリジン一 4—カルボ 二トリルを得た。
得られた 1— [8— (2—ェチル—5, 7—ジメチル一 3H—ィミダゾ [4，5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 10 , 11—ジヒ ドロ一 5H—ジベンゾ [b , f ]ァゼピン一 2 一ィルメチル]ピぺリジン一 4—カルボ二トリル （0.252 g, 0.500 mraol) を トルエン （4mL) に溶解し、 トリメチルシリルアジド （0.13 mL, 1.00 mmol) および酸化ジブチルすず （12.4 mg, 0.05 mmol) を加え、 110°Cで 22時間、 加熱攪拌した。反応溶液を減圧下、濃縮した後、残渣にエタノールを加えた。 得られた懸濁液を 0.5時間、 加熱還流した後、 固体を濾取して、 化合物 27
(0.110 g、 0.200 mmol, .収率 40%) を得た。
APCI-MS: m/z 548 ([M + H]+)
¾ NMR (DMS0-d6)<5 (ppm): 1.22· (t, J = 7.4 Hz, 3 H), 1.65-1.85 (m, 2 H) , 1.9-2.05 (in, 2 H) , 2.2-2.35 (m, 2 H) , 2.48 (s, 3H) ， 2.58 (s, 3H) , 2.77 (q, J = 7.4 Hz, 2 H) , 2.85-3.05 (m, 7 H) ， 3.52 (s, 2H) ， 5.29 (s, 2 H), 6.85-7.05 (m, 8 H) , 8.36 (s, 1 H). 参考例 2 1 ：化合物 28〜化合物 9 0の合成
工程 1
ヨウ化 1— (10, 11—ジヒ .ドロ一 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン一 2—ィルメチ ル） —1—メチルビペリジニゥム （0.015 g， 0.050腿 ol) をジメチルホルム アミ ド （0.50mL) に溶解し、 対応する YH (式中、 Yは前記と同義である） の クロ口ホルム溶液 （1.0 mmol/L, 0.060 mL) および水酸化リチウム · 1水和 物 （0.070 g) を加え、 室温で 20時間撹拌した。 反応の進行を薄層クロマト グラフィ一で確認した後、溶媒を留去し、残渣をジクロロメタンに溶解させ、 得られた溶液を水で 3回洗浄した。 有機層を無水硫酸ナトリゥムで乾燥後、 濃縮し、残渣にクロ口ホルム（0.60 mL)および N—メチルイサト酸無水物 ポ リスチレン (N-Methylisatoic anhydride polystylene ノノ ノ ィ才ゲムネ土 製、 0.15 mL) を加え、 室温で終夜撹拌した。 反応混合物中のレジンを濾別 し、 濾液を濃縮した後、 残渣をイオン交換クロマトグラフィー （ボンデシル SCX、バリアン社製、 2 mol/Lアンモニア一メタノール溶液で溶出）で精製し、 製造法 1における化合物 （IV) に相当する各種中間体を得た。
工程 2
参考例 5と同様にして、 工程 1で得られた製造法 1における化合物 （IV) に相当する各種中間体と相当する R5R6NH (式中、 R5および R6はそれそれ前記 と同義である） から、 目的物である化合物 2 8〜化合物 9 0を得た。 なお、 化合物 4 1、 4 2、 4 8および 8 9はシユウ酸塩として単離した。
. 化合物 2 8〜化合物 87の構造と分析値 （APCI-MS) を第 2表〜第 6表に 記した。 また、 化合物 2 9、 3 0、 3 6、 4 1、 4 2、 48、 5 3、 5 4、 6 0、 6 5、 6 6、 7 2、 7 7、 7 8および 84の分析値 （ 丽 R) を以下 に示した。 化合物 2 9 {2— (ベンゾィ ミダゾ一ルー 1ーィルメチル）—8— (1,2,5,6—テ トラヒ ドロピリジン一 1一ィルメチル）一10,11—ジヒ ドロ一 5H—ジペンゾ [b,f]ァゼピン }
NMR (DMS0-d6) δ (ppm)： 2.0-2.1 (m, 2 H) , 2.44 (t, J = 5.6 Hz, 2 H) , 2.75-2.85 (in, 2 H), 2.9-3.0 (m, 4H), 3,32 (s, 2 H), 5.31 (s, 2 H), 5.5-5.8 (m, 2 H), 6.8-7.1 (m, 6 H)， 7.1-7.3 (m, 2 H), 7.56 (d, J = 7,1 Hz, 1 H), 7.62 (d, J = 7.4 Hz, 1 H), 8.28 (s, 1 H), 8.35 (s, 1 H). 化合物 3 0 {2— (ペンゾィミダゾ一ル一 1—ィルメチル）一 8— (ピロリジン一 1」ィルメチル）一10, 11—ジヒドロ一 5H—ジペンゾ [b,f]ァゼピン }
¾ NMR (DMS0-d6) δ (ppm)： 1.5-1.7 (m, 4 H), 2.3-2.5 (m, 4 H), 2.8-3.0 (m, 4 H), 3.39 (s, 2 H)， 5.31 (s, 2 H), 6.8-6,95 (m， 4 H), 6.95-7.0 (m, 2 H)， 7.1-7.3 (m, 2 H), 7.55 (d, J = 8.9 Hz, 1 H) , 7.63 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 8.26. (s, 1 H), 8,34 (s, 1 H). 化合物 3 6 {2— (ベンゾィ ミダゾ—1—ィルメチル）一 8—モルホリノメチル — 10 , 11—ジヒドロー 5 H—ジペンゾ [ b , f ]ァゼピン }
JH NMR (DMS0-d6)(5 (ppm): '2.2-2.4 (in, 4 H), 2.8-3.0 (m, 4 H), 3.27 (s, 2.H), 3.5-3.6 (m, 4 H) , 5.30 (s, 2 H), 6.7-7.1 (m, 6 H), 7.1-7.25 (m, 2 H), 7.54 (d, J 二 7.6 Hz, 1 H)， 7.62(d, J = 7.6 Hz, 1 H)， 8.28 (s， 1 H), 8.34 (s, 1 H). 化合物 41 {2^(2—フエ二ルペンゾイ ミダゾールー 1—ィルメチル）—8— (1，2,5,6—テトラヒドロピリジン一 1一ィルメチル）一 10，11—ジヒドロー 5H —ジペンゾ' [b,f]ァゼピン · 1シユウ酸塩 }
¾匪 R (DMS0-d6) δ (ppm)： 2.2-2.5 (m, 2 H), 2.7-3.0 (m, 4 H), 3.0-3.2 (m, 2 H), 3.4-3.6 (m, 2 H)， 4,05 (s, 2 H), 5.45 (s, 2 H), 5..69 (m, 1 H), 5.85 (m, 1 H), 6.6-6.8 (m, 2 H), 6.88 (d, J = 8.3 Hz, 1 H), 6.97 (d, J = 7/9 Hz, 1 H), 7.05-7.2 (in, 2 H),' 7.2-7.5 (m, 2 H)， 7.5-7.7 (m， 4 H)， 7.7-7.85 (m, 3 H)， 8.54 (s, 1 H). 化合物 42 {2— (2—フエニルベンゾィミダゾール一 1—ィルメチル）—8— (ピロリジン一 1ーィルメチル）一10,11—ジヒ ドロ一 5H—ジペンゾ [b,f]ァゼ ピン · 1シユウ酸塩 }
¾丽 R (DMS0-d6) δ (ppm)： 1.8-2.0 (m, 4 H), 2.8-3.0 (m, 4 H), 3.0-3,2 (m, 4 H), 4.12 (s, 2 H), 5.45 (s, 2 H), 6.6-6.7 (m, 2 H)， 6.88 (d, J = 8,1 Hz, 1 H), 6.96 (d, J 二 7.8 Hz, 1 H)， 7.1-7.2 '(m, 2 H), 7.2-7.3 (m, 2 H), 7.4-7,6 (m， 4 H), 7.6-7.8 (m， 3 H), 8.53 (s, 1 H). 化合物 48 {2—モルホリノメチル一8— (2—フエ二ルペンゾィミダゾールー 1—ィルメチル）一10, 11—ジヒドロー 5H—ジペンゾ [b，f]ァゼピン · 1シユウ 酸塩 }
¾ NMR (DMS0-d6)(5 (ppm): 2.7-3.0 (m, 8 H), 3.6-3.8 (m, 4 H), 3.83 (s. 2 H), 5.42 (s, 2 H)， 6.65-6.7 (m, 2 H), 6.85 (d, J = 8.2 Hz, 1 H), 6.92 (d, J = 8.1 Hz, 1 H), 7.0-7.1 (m, 2 H), 7.2-7.3 (m, 2 H), 7.4-7.6 (m, 4' H), 7.65-7.8 (m, 3 H), 8.44 (s, 1 H). 化合物 53 {2— (2—メチルペンゾィミダゾールー 1一ィルメチル）一 8— (1,2,5,6—テトラヒドロピリジン一 1—ィルメチル）一10，11—ジヒドロ一 5H —ジペンゾ [b,f]ァゼピン }
¾ NMR
Figure imgf000107_0001
(ppm): 2.0-2.1 (m, 2 H), 2.45 (t, J = 5.6 Hz, 2 H), 2,54 (s, 3 H), 2.75-2.85 (m, 2 H), 2.85-3.0 (m, 4 H) , 3.35 (s, 2 H), 5.28 (s, 2 H), 5.55-5.75 (m, 2 H), 6.8-7.0 (m, 6 H), 7.1-7.2 (m, 2 H), 7.4-7.6 (m, 2 H) , 8.28 (s, 1 H) , 化合物 54 {2— (2—メチルベンゾィミダゾ" ^ル— 1一ィルメチル）—8— (ピ 口リジンー1ーィルメチル）一10,11—ジヒドロ一 5H—ジペンゾ [b,f ]ァゼピ ン}
¾ NMR (DMS0-d6)5 (ppm): 1.5-1.8 (m, 4 H), 2.3-2.5 (m, 4 H), 2.54 (s,
3 H), 2·.8-3.0 (m, 4 H), 3.39 (s, 2 H) , 5.28 (s， 2 H), 6.7-6.9 (m, 6 H), 7,1-7.2 (m, 2 H), 7.3-7.5 (m, 2 H), 8.25 (s, 1 H).. 化合物 6 0 {2_(2—メチルベンゾィミダゾ一 1一ィルメチル）—8—モルホリ ノメチル一 10, 11—ジヒドロー 5H—ジベンゾ [b,f]ァゼピン }
¾ NMR (DMSO-d6)(5 (ppm): 2.2-2.4 (m, 4 H), 2.49 (s, 3 H), 2.8-3.0 (m,
4 H), 3.28 (s, 2 H), 3.5-3.6 (m, 4Ή), 5.28 (s, 2 H), 6.8-7,0 (m, 6 H), 7.1-7.2 (m, 2 H), 7.5-7.6 (m, 2 H), 8.28 (s, 1 H) . 化合物 6 5 {2— (5,6—ジメチルペンゾィミダゾ一ル— 1—ィルメチル）一8 — (1,2,5,6—テトラヒ ドロピリジン一 1—ィルメチル）一10, 11—ジヒドロー 5H—ジベンゾ [b,f ]ァゼピン } '
!H NMR (DMS0-d6)d (ppm): 2.0-2.1 (m, 2 H), 2.2-2.4 (m, 6 H), 2.45 (t, J = 5.2 Hz, 2 H), 2.75-2.85 (m, 2 H), 2.85-3.05 (m, 4 H), 3.30 (s, 2 H)， 5.24 (s, 2,H), 5.6-5,7 (m, H)， 6.8—7.0 (m, 6 H), 7.31 (s, 1 H), 7.40 (s, 1 H), 8.17 (s， 1 H), 8.27 (s， 1 H). 化合物 6 6 {2—（5, 6—ジメチルペンゾィミダゾール— 1—ィルメチル）—8 一（ピロリジン一 1—ィルメチル）一10,11—ジヒドロ一 5H—ジペンゾ [b,f]ァ ゼピン }
¾ NMR (DMS0-de)5 (ppm): 1.5-1.8 (m, 4 H), 2.27 (s, 3 H), 2.28 (s, 3 H), 2.3-2.4 (m, 4 H), 2.8-3,0 (m, 4 H), 3.39 (s, 2 H), 5.24 (s, 2 H), 6.8-7,0 (m, 6 H), 7.30 (s, 1 H), 7,40 (s, 1 H), 8.16 (s, 1 H), 8.24 (s, 1 H) . 化合物 72 {2— (5,6—ジメチルベンゾィ ミダゾ一ルー 1一ィルメチル）—8 —モルホリノメチル— 10, 11—ジヒド口一 5H—ジベンゾ [b,f]ァゼピン } ¾ NMR (DMS0-d6) d (ppm)： 2.2-2.4 (m, 10 H), 2.8-3.0 (m, 4 H), 3.28 (s, 2 H), 3.5-3.6 (m, 4 H), 5.24 (s, 2 H), 6.8-7.0 (m, 6 H), 7.30 (s, 1 H), 7.39 (s, .1 H) , 8.16 (s, 1 H).， 8.28 (s， 1 H) . 化合物 7 7 {2—（2—ェチルベンゾィミダゾ一ルー 1—ィルメチル）一 8— (1,2， 5, 6—テトラヒドロピリジン一1—ィルメチル）一10,11—ジヒドロー 5H —ジペンゾ [b,f]ァゼピン }
l NMR (DMS0-d6)d (ppm): 1.28 (t, J = 7.4 Hz, 3 H), 1.95-2.05 (m, 2 H), 2.43 (t， J = 5,4 Hz, 2 H), 2.6-3.0 (m, 8 H), 3.32 (s， 2 H), 5.28 (s， 2 H), 5.1-5.5 (m, 2 H), 6.75-7.0 (m, 6 H), 7.1-7.25 (m, 2 H)， 7.47 (m, 1 H)， 7.55 (m, 1 H), 8.26 (s， 1 H). 化合物 78 {2—（2—ェチルペンゾィミダゾ一ルー 1一ィルメチル）一 8— (ピ 口リジン一 1—ィルメチル）一10，11ージヒ ドロ一 5H—ジベンゾ ァゼピ ン}
Ή腿 (MS0-d6) δ (ppm): 1.28 (t, J = 7.4 Hz, 3 H), 1.6-1.8 (m, 4 H), 2.3-2.4 (m, 4H), 2.8-3,0 (m, 6 H) , 3.32 (s, 2 H), 5.28 (s, 2 H), 6.7-7,0 (m, 6 H), 7.0-7.2 (m, 2 H), 7.46 (m, l'H) , 7.54 (m， 1 H), 8.23 (s， 1 H). . 化合物 84 {2—（2—ェチルベンゾィ ミダゾ— 1—ィルメチル）—8—モルホリ ノメチル一 10, 11—ジヒドロー 5H—ジベンゾ [b,f]ァゼピン： F
!H NMR (DMSO-dJ^ (ppm): 1.28 (t, J = 7.4 Hz, 3 H), 2.2-2.4 (in,' 4 H),
2.8-3.0 (m, 6 H), 3,27 (s, 2 H), 3.5-3.6 (m, 4 H), 5.27 (s， 2 H), 6.7-7.0
(m, 6 H)， 7.1-7.2 (m, 2 H), 7.47 (m, 1 H) , 7.55 (m, 1 H)， 8.26 (s， 1
H). 化合物 88〜化合物 90の構造を第 7表に、 分析値 （APCI- MS、 ^ 題 R) を以下に示した。 化合物 88 {2'—(ィ ミダゾ [4,5-b]ピリジン— 1一ィルメチル）—8—（1,2, 5, 6 —テトラヒ ドロピリジン一 1一ィルメチル）一10， 11—ジヒ ドロ.一 5H—ジベン ゾ [l3，f]ァゼピン }
APCI- MS: m/z 422 ([M + H]+)
¾ NMR (DMS0-d6) δ (ppm)： 2.0-2.1 (m， 2 H), 2.44 (t, J = 5.4 Hz, 2 H), 2.75-2.8 (m, 2 H), 2.8-3.0 (m, 4H), 3.30 (s, 2H) , 5.33 (s， 2 H), 5.5-5.6 (m, 2 H), 6.8-7.0 (m, 4 H)， 7,0-7.05 (m, 2 H) , 7.27 (dd, J = 4.7 Hz, 8.0 Hz, 1 H), 8.06 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 8.27 (s， 1 H), 8.37 (d, J = 4.7 Hz, 1 H), 8.54 (s, 1 H) . 化合物 89 {2— (ィ ミダゾ [4,5-b]ピリジン— 3—ィルメチル）—8— (1,2， 5， 6 —テトラヒドロピリジン一 1—ィルメチル）一 10, 11—ジヒドロー 5H—ジベン ゾ [t),f]ァゼピン · 1シユウ酸塩 }
APCI -MS: m/z 422 ( [M + H]+)
NMR (DMS0-d6) δ (ppm)： 2.2-2.3 (m, 2 H), 2.9-3.0 (ffl， 4 H), 3.4-3.5 (m, 2 H), 3,60. (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 4.05 (s, 2 H), 5.37 (s, 2 H)， 5.67 (d, J = 10.8 Hz, 1 H)， 5.85 (d, J = 10.8 Hz, 1 H)， 6.9-7.0 (m， 2 H), 7.0-7.1 (m, 4 H), 7.25 (dd, J = 5,4, 8.1 Hz, 1 H), 8.01 (d, J = 8.1 Hz, 1 H), 8.40 (d, J = 5.4 Hz, 1 H)， 8.55 (s, 1 H), 8.62 (s, 1 H) . 化合物 90 {2—(ィ ミダゾ [4,5- c]ピリジン一 1—ィルメチル）一8— (1,2,5,6 ーテトラヒドロピリジン一 1—ィルメチル）一 10, 11—ジヒドロ一 5H—ジベン ゾ [b,f]ァゼピン }
APCI - MS: m/z 422 ( [M + H]+)
¾ NMR (GDC13)(5 (ppm)： 2.1-2.2 (m, 2 H), 2.56 (t, J二 5.7 Hz, 2 H), 2.8-2.9 (in, 2 H), 3.0-3.1 (m, 4 H) , 3,48 (s, 2H) , 5.30 (s, 2 H), 5.67 (d, J = 10.5 Hz, 1 H), 5.73 (d, J = 10.5 Hz, 1 H) , 6.08 (s, 1 H), 6.65-6.75 (m, 2 H), 6.95-7.0 (m, 2 H), 7.0-7.05 (m， 2 H), 7.71 (d， J = 5.4 Hz, 1 H), 8.02 (s.， 1 H), 8.45 (d, J = 5.4 Hz, 1 H), 8.78 (s， 1 H) . 参考例 22 ： N—メチル _N— (2—トリチル— 2H—テトラゾール—5—ィ,ルメ チル）ァミンの合成 .
2-トリチルー 2H—テトラゾールー 5—ィルメタノール （2.00 g, 5.84 腿 ol) 、 N-メチル- 2-二ト口ベンゼンスルホンアミ ド （1.64 g, 7.59 mmol) およびトリフエニルホスフィ ン （1.53 g, 5.84 mmol) をテトラヒドロフラ ン （30 mL) およびトルエン （20 ιώ) の混合溶媒に溶解し、 ァゾジカルボン 酸ジェチルトルエン溶液 （40%, 2.65 mL, 5.84 mmol) を加えて室温で終夜 撹拌した。 シリカゲルを通過 （溶出溶媒：酢酸ェチル /へキサン = 40/60) さ せて原点成分を除去した後、 減圧下濃縮し、 残渣にアセ トン （5mL) とァセ トニト'リル （25 mL) を加えた。
得られた懸濁液にメルカプト酢酸 （0.73 mL, 11 mmol) と 1，8—ジァザビ シクロ [5, 4,0]ゥンデヅク _ 7—ェン （3.1 mL, 21 mmol) を加えて 60°Cで 7 時間撹拌した。 反応液を濃縮し、 残渣を酢酸ェチルに溶解した。得られた溶 液を飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、 濃縮した。 残渣をシリ力ゲルクロマトグラフィ一 （溶出溶媒： トリエチルァ ミン/酢酸ェチル = 1/99) で精製し、 N—メチル— N— (2— トリチル一 2H—テ トラゾ一ル—5—ィルメチル）ァミン （396 mg, 1.11 mmol, 収率 19.0%) を 得た。
l NMR (CDC13)(5 (ppm): 2.45 (s, 3 H), 4.07 (s, 2 H), 7.07-7.36 (m, 15 H). 参考例 23 ：化合物 9 2 {酢酸 [8—（2_ チル— 5,7—ジメチル— 3H—イミ ダゾ [4, 5-b]ピリジン一 3—ィルメチル）一 10, 11—ジヒドロ一 5H—ジペンゾ [b,f]ァゼピン一 2—ィルメチル]エステル； ί の合成
参考例 6で得られた化合物 1 3 (7.98 g, 13.1 mmol) をジメチルスルホ キシド （87 mL) に溶解し、 酢酸リチウム （4.33 g, 65.7 mL) を加えて 70°C で 2日間撹拌した。 反応液を酢酸ェチルで希釈し、 水 （3回） 、 飽和食塩水 で順次洗浄し、 無水硫酸マグネシウムで乾燥し、 濃縮した。 残渣をシリカゲ ルクロマトグラフィー （溶出溶媒：酢酸ェチル） で精製し、 目的物を含む画 分を濃縮し、 残渣にエタノールを加えて得られる懸濁液を室温で.0.5時間撹 拌した。析出した結晶を濾取し、化合物 9 2 (2.87 g, 6.31腿 ol,収率 48%) を得た。
APCI-MS: m/z 455 ([M + H]+)
!H NMR (CDC13) δ (ρρπι)： 1.30 (t, J = 7.5 Hz, 3 H), 2.06 (s, J H), 2.60 (s, 3 H) , 2.62 (s， 3 H), 2.79 (q, J = 7.5 Hz, 2 H) , 2.98 (HI, H), 4.98 (s, 2 H)， 5.34 (s, 2 H), 6.13 (s, 1 H), 6.58-6.83 (m, 4 H), 6.88 (s, 1 H)， 7.01-7.07 (m, 2 H) . ： 参考例 24 ：化合物 9 3 {[8- (2—ェチル—5, 7—ジメチル— 3H—ィミダゾ [4,5- b]ピリジン一 3—ィルメチル）一10, 11—ジヒドロー 5H—ジペンゾ [b,f] ァゼピン一2—ィル]メタノール } の合成
参考例 2 3で得られた化合物 92 (2.79 g, 6.14 mmol) をテトラヒドロ フラン （61 mL) .に懸濁させ、 ナトリウムメ トキシド /メタノール溶液（28%， 6.2 mL, 31 mmol )を加えて室温で 3.5時間撹拌した。 反応の進行を薄層クロ マトグラフィ一で確認した後、 反応液に水を加えて室温にて 0.5時間撹拌し た。 析出した結晶を濾取し、 減圧下乾燥させた後、 エタノールに懸濁させ、 加熱還流条件下、 1時間撹拌し、 さらに室温で 1時間撹拌した。 析出した結晶 を濾取し、 減圧下で乾燥させ、 化合物 9 3 (2.04 g, 4.95腿01, 収率 81%) を得た。
APCI-MS: m/z 413 ([M + H]+)
ΐ NMR (CDGlg) δ (ppm)： 1.30 (ts J = 7.6 Hz, 3 H) , 1,56 (t, J = 5,6 Hz, 1 H), 2.60 (s, 3 H), 2.63 (s, 3 H), 2.79 (q, J = 7.6 Hz, 2 H), 2.98 (m, 4 H) , 4.55 (d, J = 5.6 Hz, 2 H), 5.34 (s, 2 H), 6.03 (s, 1 H), 6.59-6.85 (m, 3 H)', 6.88 (s, 1 H) , 7.03 (m, 2 H) . 参考例 25 ：化合物 94 {2— (2—ェチルー 5,7—ジメチル— 3H—イミダゾ [4,5- b]ピリジン一 3—ィルメチル）一8—メ トキシメチルー 10,11—ジヒ ドロ 一 5H—ジペンゾ [b,f]ァゼピン } の合成
水素化ナ十リウム （55%, 11 mg, 0.25 mmol) のテトラヒドロフラン （0.40 mL) 懸濁液にメタノール （20 JUL , 0.50腿 ol) を加えて室温で 2.0分間攪拌 した。 その後、 反応液をテトラヒドロフラン（0.20 mL)に懸濁した参考例 6 で得られた化合物 1 3 (30 rag, 0.050腿 ol) に加え、 60°Cで 3.5時間反応さ せた。 反応液を濃縮した後、 残渣をクロ口ホルムに溶解し、 得られた溶液を 水と飽和食塩水で順次洗浄し、 無水硫酸マグネシウムで乾燥し、 濃縮した。 残渣をシリ力ゲルクロマトグラフィー （溶出溶媒：酢酸ェチル /へキサン/ トリェチルアミン = 45/50/5) で精製して、 化合物 94 (6.5 mg, 15 腿 ol, 収率 30%) を得た。
APCI-MS: m/z' 427 ([M + H] + )
^ NMR (CDG13)5 (ρριιι): 1.30 (t, J = 7.6 Hz, 3 H), 2.60 (s, 3 H), 2.63 (s, 3 H) , 2.79 (q, J = 7.6 Hz, 2 H), 2.98 (m, 4 H), 3.36 (s, 3 H), 4.32 (s, 2 H), 5.34 (s, 2 H), 6.09 (s, 1 H), 6.58-6.82 (m, 4' H), 6.88 (s， 1 H), 7.01 (m, 2 H). ' 参考例 26 ：化合物 9 5 {2—ァリルォキシメチルー 8_(2—ェチル—5, 7— ジメチルー ィミダゾ [4, 5-1)]ピリジン一 3—ィルメチル）一 10, 11—ジヒ ドロ一^—ジペンゾ [b,f]ァゼピン } の合成
メ夕ノールの代わりにァリルアルコールを用い、参考例 25と同様にして、 収率 34%で化合物 9 5を得た。
APCI-MS: m/z 453 ([M + H]+)
Ή NMR (CDCI3) δ (ppm)： 1.30 (t, J = 7.6 Hz, 3 H), 2.60 (s, 3 H), 2.63 (s, 3 H), 2,80 (q, J = 7.6 Hz, 2 H), 2.98 (m, 4 H), 4,00 (dt, J = 5.6, 1.5 Hz, 2 H)， 4,39 (s, 2 H), 5.19 (dq, J = 10.2, 1.5 Hz, 1 H), 5.29 (dq, J = 17.0, 1.5 Hz, 1 H) , 5.34 (s， 2 H), 5.95 (m, 1 H), 6.10 (s, 1 H), 6.58-6.83 (m, 4 H), 6.88 (s, 1 H) , 7.03 (m, 2 H). 参考例 27 ：化合物 9 6 {2— (2—ェチル— 5,7—ジメチル— 3H—ィミダゾ [4,5- b]ピリジン一 3—ィルメチル）一8— (2—メ トキシェトキシメチル）一 10,11—ジヒドロ— 5H—ジベンゾ [b,f]ァゼピン } の合成
メ夕ノールの代わりに 2—メ トキシェタノールを用い、 参考例 2 5と同様 にして、 収率 9.3%で化合物 9 6を得た。
APCI-MS: m/z 495 ([M + H]+) '
!H NMR (CDC13) δ (ppm)： 1.30 (t, J = 7.5 Hz, '3 H), 2.60 (s, 3 H), 2.63 (s, 3 H), 2.80 (q, J = 7.5 Hz, 2 H), 2.98 (m, 4 H), 3.38 (s, 3 H), 3.57 (m, 4 H), 4.44 (s, 2 H), 5.34 (s, 2 H), 6,01 (s, 1 H), 6.62 (d, J = 8.6 Hz, 1 H')， 6.67 (d, J = 8.1 Hz， 1H), 6.82 (m, 2 H), 6.88 (s, 1 H)， 7.00-7.06 (m, 2 H). ' 参考例 28 ：化合物 9 7 {2—（2—ェチル— 5,7—ジメチル— 3H—イミダゾ [4,5- b]ピリジン一 3—ィルメチル）一8— (2, 2, 2—ト リフルォロェトキシメ チル）一10, 11—ジヒドロー 5H—ジベンゾ [b，f]ァゼピン } の合成
メ夕ノールの代わりに 2, 2，2—トリフルォロエタノールを用い、 参考例 2 5と同様にして、 収率 64%で化合物 9 7を得た。
APCI-MS: m/z 495 ([M + H]+)
¾ NMR (CDC13) 6 (ppm)： 1.30 '(t, J = 7.6 Hz, 3 H), 2.60 (s, 3 H), 2.63 (s, 3 H), 2.79 (q, J 二 7.6 Hz, 2 H), 2.98 (m, 4 H)， 3.78 (q, J = 8.7 Hz, 2 H), 4.54 (s, 2 H), 5,34 (s, 2 H), 6,24 (s, 1 H), 6.60 (d， J = 7.8 Hz, 1 H), 6.71 (d, J = 8.1 Hz, 1 H), 6.76-6.82 (m, 2 H), 6.89 (s, 1 H), 6.98-7.04 (m, 2 H) . 参考例 2 9 ：化合物 9 8 {2—（2—ェチル— 5,7—ジメチルー 3H—イミダゾ [4,5- b]ピリジン一 3—ィルメチル）一8— (2—メチルプロポキシメチル）一 10,11—ジヒドロ— 5H—ジベンゾ [b,f]ァゼピン } の合成
メ夕ノールの代わりに 2—メチルー 1一プロパノールを用い、参考例 2 5と 同様にして、 収率 11%で化合物 9 8を得た。
APCI-MS: m/z 469 ([M + H]+)
^ NMR (CDC13) δ (ppm)： 0.91 (d, J = 6.7 Hz, 6 H) , 1.30 (t, J = 7.4 Hz, 3 H), 1.89 (m, 1 H), 2.60 (s, 3 H), 2.63 (s, 3 H), 2.79 (q, J = 7.4 Hz, 2 H), 2.99 (m, 4 H), 3.20 (d, J = 6.5 Hz, 2 H), 4.37 (s, 2 H), 5.34 (s, 2 H), 6.01 (s, 1 H)， 6.60 (d, J = 8.9 Hz, 1 H)， 6.67 (d, J = 7.8 Hz, 1 H), 6.81 (m, 2 H), 6.88 (s， 1 H), 6.98-7.05 (m, 2 H) . 参考例 3 0 ：化合物 9 9 {2—ペンジルォキシメチルー 8— (2—ェチル—5, 7 ージメチル一 3H—ィ ミダゾ [4,5- b]ピリジン一 3—ィルメチル）— 10, 11—ジ ヒドロ— 5H—ジベンゾ [b，f ]ァゼピン } の合成.
メタノールの代わりにペンジルアルコールを用い、参考例 2 5と同様にし て、 収率 78%で化合物 9 9を得た。
APCI-MS: m/z 503 ([M + H]+)
lE NMR (CDC13) δ (ppm)： 1.30 (t， J = 7.5 Hz, 3 H), 2.60 (s, 3 H), 2.62 (s, 2 H), 2.79 (q, J = 7.5 Hz , , 2 H) , 2.97 (m, 4 H) , 4.42 (s, 2 H), 4.53 (s, 2 H), 5.33 (s, 2 H), 6.20 (s, 1 H), 6,59 (d,'J = 7.9 Hz, 1 H), 6.69 (d, J = 7.9 Hz, 1 H), 6.78 (m, 2 H),'6.88 (s， 1 H), 7.02 (m, 2 H), 7.26-7.36 (m, 5 H), 参考例 3 1 ：化合物 1 0 0 {2— (2—ェチルー 5, 7—ジメチルー 3H—ィミダゾ [4,5- b]ピリジン一 3—ィルメチル）一8— (2-フ'ェニルェトキシメチル）一 10,11—ジヒ ロ一 5H—ジペンゾ [b,f]ァゼピン } の合成
メタノールの代わりに 2—フヱニルエタノールを用い、 参考例 2 5と同様 にして、 収率 38%で化合物 1 0 0を得た。
APGI-MS: m/z 517 ([M + H]+)
^ NMR (CDCI3) δ (ppm): 1.30 (t, J = 7.5 Hz, 3 H) , 2.60 (s, 3 H), 2.63 (s, 3 H), 2.80 (q, J = 7.5 Hz, 2 H), 2.91 (t, J = 7.2 Hz, 2 H), 2,97 (m, 4 H), 3.66 (t, J = 7.2 Hz, 2 H), 4.39 (s, 2 H) , 5.34 (s, 2 H), 6.08 (s， 1 H), 6.60 (d, J = 8.7 Hz, 1 H), 6.66 (d, J = 8.1 Hz, 1 H)， 6.80 (m, 2 Hi, 6.88 (s, 1 H), 6.94-7.01 (m, 2 H), 7.19-7.30 (m, 5 H). 参考例 3 2 ：化合物 1 0 1 {2—（2—ェチル— 5,7—ジメチルー 3H—ィミダゾ [4,5-lD]ピリジン一 3—ィルメチル）一 8—（ピリジン一 2—ィルメ トキシメチ ル）— 10,11—ジヒドロー 5H—ジベンゾ [b,f]ァゼピン } の合成
メ夕ノールの代わりにピリジン一 2—ィルメタノールを用い、 参考例 2 5 と同様にして、 収率 65%で化合物 1 0 1を得た。
APCI-MS: m/z 504 ([M + H]+) -
^ NMR (CDGlg) δ (ppni)： 1.30 (t, J = 7.5 Hz, 3 H), 2.60 (.s, 3 H), 2.63 (s, 3 H), 2,80 (q, J = 7.5 Hz, 2 H) , 2.98 (m, 4 H)， 4.52 (s， 2 H)， 4.66 (s, 2 H), 5.34 (s, 2 H), 6.25 (s， 1 H), 6.60 (d, J = 7.9 Hz, 1 H)'， 6.70 (d, J =, 7.9 Hz, 1 H), 6.76-6.81 (m, 2 H)， 6.88 (s, 1 H), 7.03-7.08 (m, 2 H), 7,18 (br dd, J = 7.6, 4.8 Hz, 1' H), 7.47 (d, J = 7.9 Hz, 1 H), 7.68 (td, J = 7.7,.1.8 Hz, 1 H), 8.54 (br d, J = 4.8 Hz, 1 H) · 参考例 3 3 ：化合物 1 0 2 {2- (2—ェチル— 5,7—ジメチル— 3H—ィミダゾ [4 , 5- b]ピリジン一 3—ィルメチル）一 8— (フラン一 2—ィルメ トキシメチル） — 10,11—ジヒドロ— 5H—ジペンゾ [b,f]ァゼピン } の合成
メ夕ノールの代わりにフラン一 2—ィルメタノールを用い、 参考例 2 5と 同様にして、 収率 77%で化合物 1 0 2を得た。
APGI-MS: m/z 493 ([M + H]+) +
!H MR (CDC13) δ (ppm)： 1.30 (t, J = 7.5 Hz, 3 H), 2.60 (s, 3 H), 2.62 (s, 3 H)， 2.79 (q, J = 7.5 Hz, 2 H), 2.97 (m, 4 H) , 4.41 (s， 2 H), 4.45 (s, 2 H), 5.33 (s, 2 H), 6.21 (br s, 1 H)， 6.31 (dd, J = 3.1, 0.8 Hz, 1 H), 6.33 (dd, J = 3.1, 1,8 Hz, 1 H), 6.58 (d, J = 8.1 Hz, 1 H)， 6.69 (d, J = 7.9 Hz, 1 H), 6.75-6.80 (m, 2 H), 6.88 (s， 1 H), 7.00-7.04 (m, 2 H), 7.40 (dd, J = 1.8, 0.8 Hz, 1 H) . 参考例 34 ：化合物 1 0 3 {8— (2—ェチル— 5,7—ジメチル— 3H—ィ ミダゾ [4 , 5-b]ピリジン一 3—ィルメチル）一 10 , 11—ジヒドロ一 5H—ジベンゾ [b , f ] ァゼピン一 2—カルボ二トリル} の合成
参考例 1 5の工程 1で得られた 8— (2—ェチル— 5,7—ジメチルー 3H—ィ ミダゾ [4, 5- ID]ピリジン一 3—ィルメチル）一 10 , 11—ジヒドロー 5H—ジベン ゾ [b，f]ァゼピン— 2—カルボアルデヒド （ 650 mg, 1.58 mmol) をァセトニ トリル（16 mL)に懸濁させ、ヒドロキシルアミン塩酸塩（153 mg, 2.38 mmol), トリェチルアミン （0.331 mL， 2.38 mmol) およびフ夕ル酸無水物 （ 328 mg, 2.21 mmol) を加えて 80°Cで終夜撹拌した。 反応液を濃縮し、 残漳をクロ口 ホルムに溶解し、 得られた溶液をアンモニア水 （3%) と飽和食塩水で順次 洗浄し、 無水硫酸マグネシウムで乾燥し、 濃縮した。 残渣をシリカゲルクロ マトグラフィー （溶出溶媒： メタノール/クロ口ホルム = 1/99) で精製し、 目的物を含む画分を濃縮した。残渣にエタノールを加え、 得られた懸濁液を 60°Cで 0.5時間撹拌し、 室温で 1時間撹拌した。 析出した結晶を濾取し、 減圧 下乾燥して、 化合物 1 03 (440 mg, 1.08 mmol, 収率 68%) を得た。
APCI-MS: m/z 408 ([M + H]+)
¾ 讓 (CDC13) δ (ppm)： 1.31 (t, J二 7.6 Hz, 3 H), 2.60 (s, 3 H), 2.63 (s, 3 H), 2.79 (q, J 7.6 Hz, 2 H), 2.98 (m, 4 H ) , 5.36 (s, 2 H), 6.48 (s, 1 H), 6.63-6.90 (m， 5 H), 7.28-7.33 (m, 2 H) . 参考例 35 ：化合物 1 04' {2—（2—ェチル— 5,7—ジメチル— 3H—ィミダゾ [4，5- b]ピリジン一3—ィルメチル）一8— (2H—テトラゾ一ルー 5—ィル）一 ,10,11—ジヒドロ— 5H—ジペンゾ [b,f]ァゼピン } の合成
参考例 34で得られた化合物 1 0 3を用い、参考例 2 0の後段と同様にし て、 収率 72%で化合物 1 04を得た。
APCI-MS: m/z 451 ([M + H]+)
l NMR (DMS0-d6)5 (ppm): 1.24 (t, J = 7.4 Hz, 3 H), 2.48-2.53 (s x 2, 6 H, DMS0とオーバーラヅプ）， 2.80 (q, J = 7.4 Hz, 2 H), 2.86-3.02 (m, 4 H), 5.32 (s， 2 H), 6.83 (dd, J = 8.1, 2.1 Hz, 1 H), 6.91-6.98 (m, 3 H), 7.10 (d， J = 9.0 Hz, 1 H), 7.65-7.70 (m, 2 H)， 8.20 (s, 1 H) . 参考例 36 ：化合物 1 05 {[8—（2—ェチル—5, 7—ジメチルー 3H—ィミダ ゾ [4, 5- b]ピリジン一 3—.ィルメチル）一 10 , 11—ジヒ ドロー 5H-ジペンゾ
[b,f]ァゼピン一 2—ィル]ァセトニトリル } の合成
参考例 6で得られた化合物 1 3 (2.04 s, 3.36 mmol) をジメチルホルム アミ ド （17mL) に溶解して、 青酸ナトリゥム （361mg, 7.37腿 ol) を加え、 50°Cで 10時間撹拌した。 反応液を室温まで冷却し、 酢酸ェチルで希釈し、 2iiiol/L水酸化ナトリウム水溶液、 水 （2回）'、 飽和食塩水で順次洗浄し、 無 水硫酸マグネシウムで乾燥し、 濃縮した。 残渣をェ夕ノールから再結晶し、 化合物 1 05 (751 mg， 1.78 mmol， 収率 53%) を得た。
APCI-MS: m/z 422 ([M + H]+) .
¾ NMR (CDC13) ά (ppm)： 1.31 (t, J = 7.5 Hz, 3 H), 2.60 (s, 3 H)， 2.63 (s, 3 H) , 2.79 (q， J = 7.5 Hz, 2 H), 2.99 (m, 4 H) , 3.62 (s, 2 H), 5.34 (s, 2 H), 6.01 (s， 1 H), 6.59-6.71 (m, 2 H), 6.80-6.84 (m, 2 H) , 6.88 (s, 1 H), 6,95-7.01 (m— , 2 H). 参考例 37 ：化合物 1 06 {2— (2—ェチルー 5，7—ジメチル— 3H—ィ ミダゾ [4， 5-b]ピリジン一 3—ィルメチル）一 8— (2H—テトラゾール一 5—ィルメチ ル）一 10, 11—ジヒドロ一 5H—ジペンゾ [b,f]ァゼピン } の合成
参考例 3 6で得られた化合物 1 0 5を用い、参考例 20の後段と同様にし て、 収率 76%で化合物 1 0 6を得た。
APCI-MS: m/z 465 ([M + H]+]
!H NMR (DMSO-de) δ (ppm)： 1.22 (t， J = 7.6 Hz, 3 H) , 2.48-2.52 (s x 2, 6 H, DMSOとオーバーラップ）， .78 (q, J = 7.6 Hz, 2 H), 2.86 (m, 4 H), 4.11 (s, 2 H), 5.28 (s, 2 H)， 6.75-6.94 (m, 7 H), 8.32 (br s, 1 H). 参考例 38 ：化合物 1 07 {[8— (2—ェチル—5, 7—ジメチルー 3H—ィミダ ゾ ピリジン一 3—ィルメチル）一10，11—ジヒ ドロー 5H—ジベンゾ
[b, f]ァゼピン一 2—ィル]酢酸 } の合成
参考例 3 6で得られた化合物 1 0 5. (247 mg, 0.586 mmol) をエタノール (12 mL) に懸濁し、 水酸化ナトリウム （ 938 mg, 23.5 mmol) を加えて、 加 熱還流条件下、 3時間撹拌した。 反応の進行を薄層クロマトグラフィーで確 認した後、 反応液を室温まで冷却し、 lmol/L塩酸で pHを 5に調整した。 析出 した結晶を濾取し、 減圧下乾燥した後、 エタノールに懸濁し、 60°Cで 0.5時 間撹拌し、室温で 1時間撹拌した。析出した結晶を濾取し、減圧下乾燥して、 化合物 1 0 7 (122 mg, 0.243 mmol, 収率 41%) を得た。
APCI-MS: m/z 441 ([M + H]+) ·
¾ NMR (DMS0-d6) 6 (ppm)： 1.23 (t, J = 7.5 Hz, 3 H), 2.48-2.53 (s x 2,
6 H， DMSOとオーバーラヅプ）， 2.78 (q, J = 7.5 Hz, 2 H), 2.87 (br s, 4
H), 3.38 (s， 2 H), 5.38 (s, 2 H)， 6.74-6.94 (m, 7 H), 8.27 (s, 1 H),
12.15 (br s, ,1 H). . 参考例 3 9 ：化合物 1 08 {[8— (2—ェチルー 5，7—ジメチル— 3H—ィ ミダ ゾ [4 , 5，b]ピリジン一 3—ィルメチル）一 10 , 11—ジヒ ドロ一 5H—ジベンゾ
[b,f]ァゼピン一 2—ィルメチルスルファニル]酢酸メチルエステル } の合成 参考例 6で得られた化合物 1 3 (1.04 g, 1.71腿 ol) をクロ口ホルム （17 mL) に溶解して、 メルカプト酢酸メチルエステル （0.199 mL, 2.23 mmol) および 1，8—ジァザビシクロ [.5, 4,0]ゥンデヅク一 7—ェン （0.384 mL, 2.57 腿 ol) を加え、 40°Cで 7時間撹拌した。 反応液を濃縮し、 残渣をシリカゲル クロマトグラフィ一（溶出溶媒：メタノール/クロ口ホルム = 1/99)で精製し、 化合物を含む画分を濃縮した。残渣にエタノールを加え、 得られた懸濁液を 60°Cで 0.5時間、 室温で 1時間撹拌した。 析出した結晶を濾取して、 化合物 1 0 8 (628 mg, 1.25 mmol, 収率 73%) を得た。
APCI-MS: m/z 501 ([M + H]+)
!H NMR (GDG13)(5 (ppm)： 1.30 (t, J = 7.5 Hz, 3 H), 2.60 (s, 3' H), 2.63 (s, 3 H) , 2.80 (q, J = 7.5 Hz, 2 H)， 2.98 (m, 4 H), 3.09 (s， 2 H), 3.72 (s, 3 H), 3.73 (s, 2 H), 5.34 (s， 2 H), 6.01 (s, 1 H)， 6.59-6.67 (m, 2 H)， 6.82 (in, 2 H), 6.88 (s, 1 H), 6.96-7.03 (m, 2 H). 参考例 40 ：化合物 1 0 9 {[8— (2—ェチルー 5, 7—ジメチルー 3H—ィ ミダ ゾ [4， 5- ピリジン一 3—ィルメチル）一 10 , 11—ジヒ ドロ一 5H—ジペンゾ
[b,f]ァゼピン— 2—ィルメチルスルファニル]酢酸 } の合成
参考例 3 9で得られた化合物 1 0 8 (350 mg, 0.699 mmol) を用い、 参考 例 1 2と同様にして、 収率 38%で化合物 1 0 9を得た。
APCI-MS: m/z 487 ([M + H]+) NMR (DMS0-d6) δ (ppm)： 1.16 (t, J = 7.4 Hz, 3 H)， 2.42-2.50 (s x 2, 6 H, DMSOとオーバーラヅプ）， 2.81 (q， J- = 7.4 Hz, 2 H), 2.88 (ra, 6 H), 3,49 (s, 2 H), 5.22 (s, 2 H)， 6.67-6.89 (m, 7 H), 8.18 (s, 1 H) . 参考例 41 ：化合物 1 1 0 {8— (2—ェチルー 5, 7—ジメチルー 3H—ィ ミダゾ [4,5- b]ピリジン一 3—ィルメチル）一10，11—ジヒドロ一 5H—ジペンゾ [b,f] ァゼピン一 2—カルボン酸ェチルエステル } の合成
工程 1 .
ヨウ化 1一（10,11—ジヒドロ一 5H—ジベンゾ [b，f]ァゼピン一 2—ィルメチ ル） —1—メチルビペリジニゥム （6.68 g, 15.4 mmol) をジメチルスルホキ シド （110 mL) に溶解し、 酢酸リチウム （5.07 ， 76,9 mmol) を加えて、 70°Cで 2日間攪拌した。 反応溶液を酢酸ェチルで希釈し、 水 （3回） と飽和食 塩水で順次洗浄し、 無水硫酸マグネシウムで乾燥し、 濃縮した。残渣をシリ 力ゲルクロマトグラフィー （溶出溶媒：酢酸ェチル '/へキサン = 30/70) で精 製して、 酢酸 （10,11—ジヒドロー 5H—ジベンゾ [b,f]ァゼピン一 2—ィルメ チル） エステル （2.85 g, 10.7 mmol, 収率 69%) を得 。 ' '
APCI-MS: m/z 268 ([M + H]+)
NMR (CDG13) 6 (ppm)： 2.07 (s， 3 H), 3.07 (br s, 4 H), 4.99 (s， 2 H), 6.05 (br s, 1 H), 6.66-6.85 (m, 3 H), 7.02-7.11 (m, 4 H). '
工程 2 . · '
工程 1で得られた酢酸（10, 11—ジヒドロー 5H—ジペンゾ [b，f]ァゼピン一 2—ィルメチル） エステル （2.85 g, 10.7 mmol) をメタノール （110 mL) に 懸濁して、 ナトリウムメ トキシド /メタノール溶液 （38%， 1.14 mL, 5. ,36 腿 ol) を加え、 室温で 1時間攪拌した。 反応溶液を濃縮し、 残渣に飽和食塩 水とクロ口ホルムを加え、 3回クロ口ホルムで抽出した。 有機層を合わせ、 無水硫酸マグネシウムで乾燥し、 濃縮した。残渣をジイソプロピルエーテル から再結晶して、 10, 11—ジヒドロ一 5H—ジペンゾ [b，f]ァゼピン— 2—ィル メタノール （1.73 g, 7.68 mmol, 収率 72%) を得た。
APCI-MS: m/z 226 ([M + H]+)
¾ NMR (CDCl3)d(ppm): 1.49 (t, J = 5.8 Hz, 1 H), 3.08 (br s, 4 H), 4.57 (d, J = 5.8 Hz, 2 H), 6.02 (br s, 1 H), 6.66-6.87 (m, 3 H), 7.02-7.11 (m, 4 H).
工程 3
工程 2で得られた 10, 11—ジヒドロ一 5H—ジペンゾ [b,f]ァゼピン一 2—ィ .ルメ夕ノール （6.1 g, 70 匪 ol) をクロ口ホルム （77 mL) に溶解して、 二 酸化マンガン （4.55 g, 46,1 mmol) を加え、 室温で 8時間攪拌した。 反応溶 液をセライ トを通じて濾過し、 濾液を濃縮した。残渣をシリカゲルクロマト グラフィー （溶出溶媒：酢酸ェチル /へキサン = 20/80) で精製して、 10,11 —ジヒ ドロ一 5H—ジペンゾ [b,f]ァゼピン一 2—カルボアルデヒド （1.15 g, 5.15 mmol, 収率 67%) を得た。
APCI-MS: m/z 224 ([M + H]+)
^丽 R (CDG13) δ (ppm)： 3.11 (m, 4 H), 6.49 (br s, 1 H), 6.87-6..91 (m, 3 H)， 7.07-7.17 (m, 2 H) , 7.55-7.62 (m, 2 H), 9.88 (s， 1 H) .
工程 4
工程 3で得られた 10， 11—ジヒドロ一 5H—ジベンゾ [b , f]ァゼピン一 2—力 ルポアルデヒド （ 665 mg, 2,98 mmol) をァセ トニトリル （18 mL) および水 (18 mL)の混合溶媒に溶解して、ジメチルスルホキシド（2.1 mL， 30匪 ol)、 リン酸 2水素ナトリゥム（1.43 g, 11.9腿 ol)および亜塩素酸ナトリゥム（404 mg, 4.47匪 ol) を加え、 50°Cで 4時間攪拌した。 反応溶液に酢酸ェチルと水 を加え、 酢酸ェチルで 2回抽出した。 有機層を合わせ、 水で洗浄し、 無水硫 酸マグネシウムで乾燥し、 濃縮した。残渣に酢酸ェチルとへキサンの混合溶 媒 （ 3 ： 1 ) を加え、 得られる懸濁液を 60°Cで 0. 5時間撹拌し、 室温で 1時 間撹拌した。 析出した結晶を濾取して、 10, 11—ジヒ ドロ一5H—ジベンゾ . [b,f]ァゼピン— 2—カルボン酸 （ 598 mg, 2.50 mmol, 収率 84%) を得た。
APCI-MS: m/z 240 ([M + H]つ
^ NMR (CDC13) 6 (ppm)： 3.11 (m, 4 H), 6.39 (br s, 1 H), 6.77-6.80 (m, 3 H), 7.06-7.16 (in, 2 H)， 7.79-7.84 (m, 2 H) .
― . 工程 5
工程 4で得られた 10 , 11—ジヒドロ一 5H—ジペンゾ [b, f]ァゼピン一 2—力 ルボン酸 （ 426 rag, 1.78 mmol) をエタノール (8.9 mL) に溶解して、 塩化 チォニル （0.26 mL， 3.6 mmol) を加え、 加熱還流条件下、 5時間攪拌した。 反応溶液を濃縮し、 クロ口ホルムと飽和重曹水を加え、 クロ口ホルムで 3回 抽出した。 有機層を合わせ、 飽和食塩水で洗浄し、 無水硫酸マグネシウムで 乾燥し、 濃縮した。 残渣をシリカゲルクロマトグラフィー （溶出獰媒：酢酸 ェチル /へキサン = 10/90) で精製して、 10，11ージヒドロ一 5H—ジベンゾ [b,f]ァゼピン— 2—カルボン酸ェチルエステル （ 383 mg, 1.43 mmol, 収率 81%) を得た。
APCI-MS: m/z 268 ([M + H]+)
!H NMR (CDC13) δ (ppin)： 1.37 (t， J = 7.0 Hz, 3 H), 3.09 (m, 4 H), 4.33 (q, J 二 7.0 Hz, 2 H), 6.34 (br s, 1 H), 6.69-6.86 (m, 3 H), 7.04-7.14 (m, 2 H), 6,72-6.78 (m, 2 H). ,
工程 6
工程 5で られた 10 , 11—ジヒドロ一 5H—ジベンゾ [b， f]ァゼピン一 2—力 ルボン酸ェチルエステル （443 mg, 1.66 mmol) をクロ口ホルム （8.3 mL) および酢酸（8.3 mL)の混合溶媒に溶解し、 ピペリジン（ 0.573 mL， 5.80 mmol) およびパラホルムアルデヒド （14911^, 4.97匪01) を加え、 60°Cに加熱し、 1.5日間撹拌した。 反応液を濃縮し、 残渣に酢酸ェチルと飽和重曹水を加え て、 酢酸ェチルで抽出した。 有機層を合わせ、 飽和食塩水で洗浄し、 無水硫 酸ナトリウムで乾燥後、濃縮した。残渣をシリ力ゲルクロマトグラフィー（溶 出溶媒：酢酸ェチル /へキサン/トリェチルァミン = 70/25/5) で精製し、 目 的物を含む画分を濃縮した。残渣をジェチルエーテルでトリチユレーシヨン し、 8—ピペリジノメチル一10,11—ジヒ ドロ一 5H—ジペンゾ [b，f]ァゼピン —2—力ルボン酸ェチルエステル （ 249 mg, 0.683匪 ol， 収率 41%) を得た。 APCI-MS: m/z 365 ([M + H]+)
^ NMR (CDC13) δ (ppm)： 1.34-1.46 (m, 5 H), 1.67 (m, 4 H), 2.36 (br s, 4 H), 3.08 (m, 4 H), 3.38 (s, 2 H), 4.33 (q, J = 7.1 Hz, 2 H), 6.32 (s, 1 H), 6,67-6.74 (m, 2 H), 6.99-7.06 (m, 2 H), 7.72-7.76 (m, 2 H) . 工程 7
工程 6で得られた 8—ピペリジノメチル一 10,11—ジヒドロ一 5H—ジペン ゾ [b，f]ァゼピン—2—カルボン酸ェチルエステル （231 mg, 0.634 mmol) を ジクロロメタン（3.2 mL) に溶解して、 ヨウ化メチル（59.2〃L, 0.951 mraol) を加え、 室温で終夜撹拌した。 反応溶液を減圧下濃縮して、 ヨウ化 1一（8— ェトキシカルボニル一 10,11—ジヒ ド口一 5H—ジペンゾ [b,f ]ァゼピン一 2— ィルメチル）一1ーメチルビペリジニゥム （321mg , 0.634 mmol, 取率 100%) を得た。
¾ NMR (CDC13) δ (ppm)： 1.37 (t, J = 7.1 Hz, 3 H), 1.75-1.95 (m， 6 H)， 2.96 (br s, 4 H)， 3.11 (s, 3 H)， 3.50 (m, 2 H), 3.70 (m, 2 H), 4.32 (q, J = 7.1 Hz, 2 H), 4.90 (s, 2 H), 7.14-7.35 (m, 4 H), 7.49 (s, 1 H), 7.71 (m, 2 H).
工程 8
2—ェチルー 5, 7—ジメチル一 3H—ィミダゾ [4,5- b]ピリジン（180rag, 1.03 醒 ol) をジメチルホルムアミ ド （0.60 mL) に溶解し、 攪拌しながら水素化 ナトリウム （55%, 33.6 mg, 0.770 mmol) を数回に分けて加えた後、 50°C で 0. 5時間撹拌した。反応液を室温まで冷却し、 ジメチルホルムアミ ド （1.2 mL)に溶解した工程' 7で得られたヨウ化 1— (8—エトキシカルボ二ルー 10, 11 —ジヒドロ一 5H—ジペンゾ [b, f]ァゼピン一 2—ィルメチル）一 1—メチルピ ベリジニゥム （130 mg, 0.256 mmol) を加え、 室温で 1時間攪拌した。 反応 溶液を酢酸ェチルで希釈し、 水、 水、 飽和食塩水で順次洗浄し、 無水硫酸マ グネシゥムで乾燥し、 濃縮した。 残渣をシリカゲルクロマトグラフィー （溶 出溶媒：メタノール/クロ口ホルム =1/99) で精製し、 目的物を含む画分を濃 縮した。 残渣にジェチルエーテルを加え、 加熱還流条件で 0.5時間撹拌し、 その後室温で 1時間で撹拌した。 析出した結晶を濾取して、 化合物 1 1 0 (76.7mg, 0.169 mmol, 収率 66%) を得た。
APCI-MS: m/z 455 ([M + H]+) .
!H NMR (CDC13) δ (ppm)： 1.31 (t, J = 7.6 Hz, 3 H), 1.36 (t, J = 7.1 Hz, 3 H), 2.60 (s, 3 H), 2.63 (s, 3 H), 2.80 (q, J = 7.6 Hz, 2 H), 2.97 (m, 2 H), 3.40 (m, 2 H), 4.32 (q, J = 7.1 Hz, 2 H), 5.36 (s, 2 H)， 6.35 (s, 1 H), 6.64-6.71 (m, 2 H), 6.82-6.90 (m, 3 H), 7.70-7.74 (m, 2 H) . 参考例 42 ：化合物 1 1 1 {8—（2—ェチルー 5, 7—ジメチルー 3H—イミダゾ [4,5-b]ピリジン一 3—ィルメチル）一 10 , 11—ジヒドロ一 5H—ジベンゾ [b， f ] ァゼピン— 2—力ルボン酸 } の合成
参考例 4 1で得られた化合物 1 10 (900 mg, 1.98 mmol) を用い、 参考 例 1 2と同様にして、 収率 97%で化合物 1 1 1を得た。
APCI-MS: m/z 427 ([M + H]+)
!Η NMR (DMS0-d6) δ (ppm): 1.24 (t, J = 7.5 Hz, 3 H), 2.51-2.54 (s x 2, 6 H, DMSOとオーバ一ラップ）， 2,82-2.99 (m, 6 H), 5.37 (s, 2 H)， 6.84-7.03 (m, 5 H) , 7.58 (m, 2 H), 8.87 (br s, 1 H), 12.25 (br s, 1 H) . 参考例 43 ：化合物 1 12 {[8— (2—ェチルー 5, 7—ジメチル— 3H—ィ ミダ ゾ [4， 5- b]ピリジン一 3 _ィルメチル）一 10 , 11—ジヒ ドロ一 5H—ジベンゾ
[b,f]ァゼピン一 2—ィル] (4—メチルビペラジン一 1—ィル）メタノン } の合 成
' 参考例 4 2で得られた化合物 1 1 1 (100 mg, 0.23 mmol) をジメチルホ ルムアミ ド （2.3 mL) およびテトラヒドロフラン （4.6 mL) の混合溶媒に溶 解し、 これに 4—メチルビペラジン （39 ul, 0.352 mmol) 、 1—ェチルー 3 (3—ジメチルァミノプロピル） カルボジィミ ド · 1塩酸塩 （89.7 mg, 0.468 腿 ol) および 1—ヒドロキシベンゾトリアゾ一ル （35.8 mg， 0.234 mmol) を 加えて室温で 8時間攪拌した。 反応の進行を薄層クロマトグラフィ一で確認 した後、 反応液を濃縮した。 残渣をクロ口ホルムに溶解し、 得られた溶液を 水 （2回） 、 飽和重曹水、 飽和食塩水で順次洗浄し、 無水硫酸マグネシウム で乾燥し、 濃縮した。 残渣にジェチルエーテルを加え、 得られる懸濁液を室 温で 1時間撹拌した後、固体を濾取して、化合物 1 1 2 (47.7mg, 0.0938 mmol 5 収率 40%) を得た。
APCI-MS: m/z 509 ([M + H]+)
¾ NMR (CDC13) 6 (ppm)： 1.31 (t, J = 7.5 Hz, 3 H), 2.33 (s, 3 H), 2.43 (br s, 4 H), 2.60 (s, 3 H), 2.63 (s, 3 H), 2.80 (q, J = 7.5 Hz, 2 H), 2.99 (m, 4 H), 3.66 (br s, 4 H), 5.35 (s, 2 H), 6.18 (s, 1 H), 6.62-6.69 (m, 2 H)， 6.83 (m, 2 H), 6.85 (s, 1 H), 7.10-7.15 (m, 2 H) . 参考例 44 ：化合物 1 1 3 {[8— (2—ェチル— 5,7—ジメチル— 3H—ィミダ ゾ [ 4 , 5 - b ]ピリジン一 3—ィルメチル）一 10 , 11—ジヒ ドロ一 5 H—ジペンゾ [b,f]ァゼピン一 2—ィル] (ピロリジン一 1一ィル）メタノン } の合成
4ーメチルビペラジンの代わりにピロリジンを用い、 参考例 4 3と同様に して、 収率 90%で化合物 1 1 3を得た。
APCI-MS: m/z 480 ([M + H]+) .
¾腿 (CDC13) 5 (ppm)： 1.31 (t， J = 7.5 Hz, 3 H) , 1.88 (br s, 4 H)， 2.60 (s, 3 H), 2.63 (s, 3 H), 2.80 (q,. J = 7.5 Hz, 2 H) , 2.99 (m, 4 H), 3.56 (m, 4 H), 5.35 (s, 2 H), 6.19 (s, 1 H), 6.62-6.69 (m, 2 H), 6.81-6.86 (m, 2 H)， 6.89 (s, 1 H), 7.24-7.29 ,(m, 2 H). , 参考例 45 ：化合物 1 1 {[8— (2—ェチル— 5,7—ジメチルー 3H—ィミダ ゾ [4 , 5- b]ピリジン一 3—ィルメチル）一 10 , 11—ジヒ ドロ一 5H—ジペンゾ [b,f]ァゼピン一 2—ィル] (4—ヒドロキシピペリジノ）メタノン } の合成
4—メチルビペラジンの代わりに 4一ピペリジノールを用い、参考例 4 3と 同様にして、 収率 62%で化合物 1 1 4を得た。
APCI-MS: m/z 510 ([M + H]+)
¾腿 (CDC13) δ (ppm)： 1.31 (t, J = 7.0 Hz, 3 H), 1.48-1.58, (m， 2 H), 1.86-1.97 (m, 2.H), 2.60 (s, 3 H)， 2.63 (s, 2 H), 2.80 (q, J = 7.0 Hz, 2 H), 2.99 (m,' 4 H)， 3.22-3.33 (m, 2 H)， 3.91-4.00 (m, 3 H), 5.36 (s, 2 H), 6.21 (s, 1 H) , 6.62-6.70 (m, 2 H), 6.81-6.85 (m, 2 H)， 6.89 (s, 1 H)+， 7.08-7.14 (m, 2 H) . 参考例 46 ：化合物 1 1 5 {8— (2—ェチルー 5，7—ジメチル— 3H—ィミダゾ [4, 5-b]ピリジン一 3—ィルメチル）一 10 , 11—ジヒドロー 5H—ジペンゾ [b , f ] ァゼピン一 2—力ルボン酸（2—ヒドロキシェチル）アミ ド} の合成
4—メチルビペラジンの代わりにエタノールアミンを用い、 参考例 43と 同様にして、 収率 82%で化合物 1 1 5を得た。
APCI-MS: m/z 470 ( [M + H]+)
MR (CDC13) δ (ppm): 1.31 (t, J = 7.5 Hz, 3 H) , 1.71 (br s, 1 H), 2.60 (s, 3 H) , 2.63 (s, 3 H), 2.79 (q, J = 7.5 Hz, 2 H)， 2.97 (m， 4 H), 3.59 (m, 2 H) , 3.81 (t, J = 9.6 Hz, 2 H) , 5.35 (s， 2 H), 6.41 (s, 1 H), 6.54
(t, J = 5.6 Hz, 1 H), 6.63-6.71 (m, 2 H), 6.80-6,84 (m, 2 H), 6.99 (s,
1 H), 7.44-7.48 (m, 2 H) , 参考例 47 ：化合物 1 1 6 {8— (2—ェチルー 5，7—ジメチルー 3H—ィミダゾ [4 , 5- b]ピリジン一 3—ィルメチル）一 10， 11—ジヒ ドロ一 5H—ジペンゾ [b， f] ァゼピン一 2—カルボン酸 [2— (ピロリジン一 1—ィル) ェチル]アミ ド} の 合成
4—メチルビペラジンの代わりに 2—（ピロリジン一 1—ィル）ェチルアミン を用い、 参考例 4 3と同様にして、 収率 92%で化合物 1 1 6を得た。
APCI-MS: m/z 523 ('[Μ + Η] + )
¾ NMR (GDC13) 6 (ppm): 1.31 (t, J = 7.6 Hz, 3 H)， 1.78 (m, 4 H), 1.57 (m, 4 H)， 2.60 (s, 3 H), 2.63 (s, 3 H), 2.70 (t， J = 5.9 Hz, 2 H), 2.79 (q, J = 7.6 Hz, 2 H), 2.97 (m, 2 H)， 3.04 (m, 2 H)， 3.53 (q, J = 5.7 Hz, 2 H), 5.35 (s, 2 H), 6.30 (s, 1 H), 6.63-6.72 (m, 3 H), 6.83 (m, 2 H), 6.89 (s, l.H)， 7.45-7.52 (m, 2 H). 参考例 48 ：化合物 1 1 Ί {['8—（2—ェチル— 5,7—ジメチル—311—ィミダ ゾ [ 4， 5 - b ]'ピリジン一 3—ィルメチル）一 10 , 11—ジヒ ドロ一 5 Η—ジベンゾ
[b,f]ァゼピン一 2—ィル] (モルホリノ）メタノン } の合成
4ーメチルビペラジンの代わりにモルホリンを用い、 参考例 4 3と同様に して、 収率 98%で化合物 1 1 7を得た。
APCI-MS: m/z 496 ([M + H]+) · ¾ NMR (CDG13) δ (ppm)： 1.31 (t， J = 7.5 Hz, 3 H)， 2.60 (s, 3 H)， 2.63 (s， 3 H), 2.80 , J = 7.5 Hz, 2 H), 2.99 (in, 4 H), 3.66 (m, 8 H), 5.35 (s， 2 H), 6.22 (s, 1 H)， 6.62-6.71 (m, 2 H)， 6.81-6.86 (m, 2 H), 6.89 (s， 1 H), 7.10-7.16 (m, 2 H), 参考例 49 ：化合物 1 1 8 {8— (2—ェチル—5,7—ジメチルー 3H—イ ミダゾ [4,5- b]ピリジン一 3—ィルメチル）一10, 11—ジヒ ドロ一 5H—ジペンゾ [b,f] ァゼピン一 2—カルボン酸 [ビス（2—ヒドロキシェチル）]アミ ド} の合成
4—メチルビペラジンの代わりに 2—（2—ヒ ド,ロキシェチルアミノ）ェ夕ノ ールを用い、 参考例 43と同様にして、 収率 38%で化合物 1 18を得た。 APCI-MS: m/z 514 ([M + Η] + )'
¾ NMR (CDC13) δ (ppm)： 1,21 (t, J = 7.5 Hz, 3 H), 2.60 (s, 3 H), 2.63 (s, 3 H), 2.80 (q, J = 7.5 Hz, 2 H), 2.98 (m, 4 H) , 3.23 (br s， 2 H), 3,63 (br s, 4 H), 3.87 (br s, 4 H), 5.35 (s, 2 H), 6.20 (s, 1 H), 6.62-6.69 (m, 2 H'), 6.83 (m, 2 H)， 6.89 (s, 1 H)， 7.24-7.29 (m, 2 H) . 参考例 50 ：化合物 1 1 9 {8— (2—ェチル—5, 7—ジメチルー 3H—ィミダゾ [4 , 5- b]ピリジン一 3—ィルメチル）一 10 , 11—ジヒドロー 5H—ジペンゾ [b , f] ァゼピン— 2—カルボン酸アミ ド} の合成
4ーメチルビペラジンの代わりにアンモニアを用い、 参考例 43と同様に して、 収率 57%'で化合物 1 1 9を得た。
APCI-MS: m/z 426 ([M + H]+)
NMR (CDC.13)(5 (ppm)： 1.23 (t, J = 7.4 Hz, 3 H), 2.48-2.52 (s x 2, 6H, DMSOとオーバーラヅプ）， 2.78 (q, J = 7.4 Hz, 2 H), 2.92 (br q, J = 7.3 Hz, 4 H)， 5.31 (s， 2 H), 6.78-7.00 (m， 6 H), 7.52-7.65 (m, 3 H) , 8.68 (s, 1 H). 参考例 51 ：化合物 1 2 0 {2— (2—ェチルー 5, 7—ジメチルー 3H—ィ ミダゾ [4，5- b]ピリジン _ 3—ィルメチル）一5—メチル一8— (ピロリジン一 1ーィル メチル）一 10，11ージヒドロ— 5H—ジベンゾ [b,f]ァゼピン } の合成
参考例 3で得られた化合物 3 (400 mg, 0.876 mraol) を酢酸 （8.8 mL) に 溶解し、 パラホルムアルデヒド （0.47 g, 16 mmol) およびシァノ水素化ホ ゥ素ナトリウム （2.2 g, 10 mmol) を加えて室温で 5時間撹拌した。 反応溶 液にクロ口ホルムと飽和重曹水を加え、水層をクロ口ホルムで 2回抽出した。 有機層を飽和食塩水で洗浄後、 無水硫酸マグネシウムで乾燥し、 濃縮した。 残渣を腿-シリ力ゲルクロマトグラフィ一（溶出溶媒：クロロホルム/へキサ ン = 50/50) で精製して、 化合物 1 2 0 (342 mg, 0.713 mmol, 収率 81%) を得た。
APCI-MS: m/z 480 ([M + H]+)
!H NMR (CDC13)5 (ppm): 1.3L (t, J = 7.5 Hz, 3 H), 1.76 (m, 4 H), 2.47 (m, 4 H), 2,58 (s, 3 H)， 2.62 (s, 3 H), 2.78 (q, J = 7.5 Hz, 2 H), 3.06 (m, 4 H), 3.29 (s, 3 H), 3.50 (s, 2 H), 5.35 (s, 2 H)， .6.83-6,98 (m, 5 H), 7.02-7.08 (m, 2 H) . 参考例 5 2 ：化合物 1 2 1 {1ー[8— (2—ェチル— 5,7—ジメチル—311—ィ ミ ダゾ [4,5- b]ピリジン一 3—ィルメチル） _ 5—メチル一10, 11—ジヒドロ一 5H —ジペンゾ [b,f]ァゼピン一 2—ィルメチル]ピペリジン一 4—カルボン酸 }の 合成
工程 1 '
参考例 9で得られた化合物 1 6 (1,20 g, 2.18 mmol) を酢酸 （10 mL) に 溶解し、 パラホルムアルデヒド （0.73 g, 21.8 mmol) およびシァノ水素化 ホウ素ナトリウム （0.58 g, 8.70 mmol) を加えて室温で 15時間攪拌した。 反応溶液に酢酸 チルと lmol/L水酸化ナトリゥム水溶液を加え、水層を酢酸 ェチルで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、 溶媒を減圧留 去した。 残渣を NH—シリカゲルクロマトグラフイー 溶出溶媒：へキサン一 酢酸ェチル混合溶媒） で精製して、 1— [8—（2—ェチル—5, 7—ジメチルー 3H 一イミダゾ [4,5-¾]ピリジン一 3—ィルメチル）一 5—メチル一10, 11—ジヒ ド 口一 5H—ジベンゾ ' [b , f]ァゼピン一 2—ィルメチル]ピぺリジン一 4一力ルボ 酸ェチルエステル （1.25 g, 2.18 mmol, 収率 100%) を得た。
APCI-MS: m/z 566 ([M + H]+)
Ή NMR (CDCl3)5(ppm): 1.23 (t, J = 7.4 Hz, 3 H) ， 1.31 (t, J = 7.6 Hz, 3 H)， 1.6-2.0 (m, 6 H), 2.23 (m, 1 H), 2.58 (s, 3H) , 2.62 (s, 3 H), 2.73 (q, J = 7.4 Hz, 2 H), 2.75-2.9 (m, 2 H), 3.0-3.15 (m, 4 H), 3.28 (s, 3 H), 3.36 (s, 2 H), 4.10 (q, J = 7.6 Hz, 2 H), 5.34 (s, 2 H), 6.8-7.1 (m, 7 H).
工程 2 工程 1で得られた 1一 [8—（2—ェチルー 5， 7—ジメチルー 3H—ィ ミダゾ [4, 5-b]ピリジン一 3—ィルメチル）一 5—メチル一 10 , 11—ジヒドロ一 5H—ジ ベンゾ [b,f]ァゼピン一 2—ィルメチル]ピペリジン一 4一力ルボン酸ェチル エステルを用い、参考例 1 2と同様にして、収率 42%で化合物 1 2.1を得た。 APCI-MS: m/z 538 ([M + H]+)
!H NMR (DMS0-d6)5 (ppm) :1.23 (t, J =.7.4 Hz,, 3 H) , 1.5-1.8 (m， 2 H) ， 1.8-2.0 (in, 2 H) , 2.2-2.4 (m, 2 H) , 2.49 (s, 3 H) ， 2.50 (s, 3 H) ， 2.78 (q, J = 7.4 Hz, 2 H) , 2.8-3.05 (m, 8 H), 3.22 (s, 2 H) , 3.5-3.9 (m, 2 Η·), 5,34 (s, 2 H) , 6.85 (dd, J = 2,0, 8,4 Hz, 1 H) , 6.93 (s， 1 H), 6.94 (d, J = 2.0 Hz, 1 H)， 7.0-7.2 (m, 4 H) , 参考例 53 ：化合物 1 22 {2- (2—ェチル— 5,7—ジメチルー 3H—イミダゾ [4,5-b]ピリジン一 3—ィルメチル）一5—メチル一8— [4_ (2H—テトラゾー. ル一 5 _ィル)ピペリジノメチル ]一 10 , 11—ジヒ ドロ一 5H—ジベンゾ [t)， f ]ァ ゼピン ' 1塩酸塩 } の合成 '
参考例 20で得られた 1— [8— (2—ェチル— 5,7—ジメチルー 3H—ィミダ ゾ [4, 5- b]ピリジン一 3—ィルメチル）一 10 , 11—ジヒドロ一 5H—ジべンゾ
[b，f]ァゼピン一 2—ィルメチル]—ピペリジン— 4—カルボ二トリルを用い、 参考例 52の工程 1と同様にして、 収率 92%で 1— [8— (2—ェチル—5，7—ジ メチルー 3H—ィミダゾ [4,5- b]ピリジン「3—ィルメチル）一5—メチル一 10 , 11—ジヒドロ一 5H—ジベンゾ [b , f ]ァゼピン一 2—ィルメチル ]ピペリジ ン— 4一カルボ二トリルを得た。 これを用い、 参考例 2 0の後段と同様にし て、収率 10%で 2— ( 2—ェチル— 5， 7—ジメチルー 3H—イミダゾ [ 4 , 5- b ]ピリジ ン一 3—ィルメチル）一 5—メチル一 8— [4— (2H—テトラゾール一 5—ィル）ピ ペリジノメチル]— 10, 11—ジヒドロー 5H-ジベンゾ [t),f ]ァゼピンを得た。 これをクロ口ホルムに溶解し、 4mol/L塩化水素 ·酢酸ェチル溶液を加えて 析出した固体を濾取することで、 化合物 1 22を得た。
APCI-MS: m/z 562 ([M + H]+)
^腿 (DMSO-d6)(5 (ppm) :1.28 (t, J = 7.6 Hz, 3 H) , 2.0-2.5 (m, 4 H) , 2.58 (s, 3 H) , 2.63 (s, 3 H) , 2.9-3.2 (m, 8H), 3.2-3.3 (m, 4H), 3.4-3.6 (m, 2 H)， 4.17 (s， 2 H) ， 5.56 (s, 2 H), 7.0-7.2 (m, 4 H), 7.2-7.4 (m, 3H) , 10.79 (s, 1H) . 参考例 54 ：化合物 1 23 {{1ー[8—（2—ェチル— 5,7—ジメチ 一 3H—ィ ミダゾ [4， 5- b]ピリジン _ 3—ィルメチル）一 5—メチルー 10, 11—ジヒ ドロ一 5H—ジベンゾ [b ,.f ]ァゼピン一 2—ィルメチル]ピぺリジン一 4—ィルメタノ 一ル} の合成
参考例 5 2の工程 1で得られた 1— [8— (2—ェチル— 5,7—ジメチルー 3H 一イミダゾ [4,5-b]ピリジン一 3—ィルメチル）一5—メチル一10, 11—ジヒ ド 口一 5H—ジペンゾ [b, f]ァゼピン一 2—ィルメチル]ピぺリジン一 4—力ルボ ン酸ェチルエステル （0.61 g, 1.08 mmol) をジクロロメタン （10 mL) に溶 解して、 一 78°Cに冷却し攪拌した。 この反応溶液に同温度で 1 mol/L水素化 ジィソプロピルアルミニゥム /トルエン溶液 （3.20 mL， 3.20 mmol) を加え、 同温度で 3時間、 その後室温で 10分間攪拌した。 反応溶液に飽和ロッシエル 塩水溶液と酢酸ェチルを加え、 30分間攪拌した。水層を酢酸ェチルで抽出後、 有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、 溶媒を減圧留去した。残渣を酢酸 チルを用いて再結晶に付し、化合物 1 2 3 (0.26 g, 0.50 mmol,収率 46%) を得た。
APCI-MS: m/z 524 ([M + H]+)
l NMR (DMS0-d6) 6 (ppm)： 1.0-1.15 (m, 2H) ， 1.23 (t, J = 7.5 Hz, 3 H) ， 1.25-1.3 (m, 1 H) , 1.5-1.65 (m, 2 H) ， 1.7-1.9 (m, 2 H) , 2.49 (s, 3 H) ， 2.50 (s, 3 H) ， 2.75 (q, J = 7.5 Hz, 2 H) , 2.95-3.05 (m, 4 H), 3,15-3.25 (m, 5 H), 3.25-3.50 (m, 4 H)， 5.32 (s, 2 H) , 6.81 (dd, J = 2.0, 8.5 Hz, .1 H) , 6.90-7.05 (m, 6 H). 参考例 55 ：化合物 1 24 [2— (2—ェチル— 5,7—ジメチル— 3H—ィミダゾ [4,5-b]ピリジン一 3—ィルメチル）一5—メチル一8— (2H—テトラゾール一5 一ィル）一 10,11—ジヒドロー 5H—ジペンゾ [b，f]ァゼピン]の合成
参考例 34で得られた化合物 1 0 3を用い、参考例 5 2の工程 1と同様に して、 収率 83%で 8— (2—ェチル—5，7—ジメチル一 3H—ィミダゾ [4,5- b]ピ リジン— 3—ィルメチル）一5—メチル一10, 11—ジヒ ドロ一 5H—ジペンゾ [b,f]ァゼピンー2—カルボ二トリルを得た。 ·
これを用い、 参考例 2 0の後段と同様にして、 収率 20%で化合物 1 2 4を 得た。 '
APCI-MS: m/z 465 ([M + H]+) .
¾ 腿' (DMS0-d6)d (ρριιι) :1,24 (t, J = 7.7 Hz, 3 H) , 2.5.0 (s, 3 H) ， 2.51 (s， 3 H) , 2.80 (q, J = 7.7 Hz, 2 H) , 3.0-3.1 (m, 2 H), 3,3-3.35 (m, 2 H), 3.40 (s, 3 H) ， 5,38 (s， 2 H) , 6.90 (dd, J = 2.2, 8.4 Hz, 1 H) , '6.95 (s， 1 H) , 7,02 (d， J = 2.2 Hz, 1 H) , 7.10 (d, J = 8.4 Hz, 1 H) ， 7.24 (d, J 二 8.4 Hz, 2 H) , 7.75 (d, J = 2.2 Hz, 1 H) , 7.79 (dd, J = 2.2, 8.4 Hz, 1 H) . 参考例 5 6 ：化合物 1 2 5 {[8— (2—ェチル—5，7—ジメチル— 3H—イミダ ゾ [4, 5- b]ピリジン一 3—ィルメチル）一 5—メチル一 10， 11—ジヒドロ一 5H— ジペンゾ [b，f]ァゼピン一 2—ィル]酢酸 } の合成
参考例 3 6で得られた化合物 1 0 5を用い、参考例 5 2の工程 1と同様に して、 収率 94%で [8— (2—ェチル— 5,7—ジメチル一 3H—ィ ミダゾ [4,5 - ピリジン一 3—ィルメチル）一 5—メチル一 10 , 11—ジヒドロ一 5H—ジベンゾ [b，f]ァゼピン一 2—ィル]ァセトニトリルを得た。
これを用い、 参考例 3 8と同様にして、 収率 86%で化合物 1 2 5を得た。 APCI-MS: m/z 455 ([M + H]+)
NMR (DMS0-d6)5 (ρρπι) :1.22 (t, J = 7.3 Hz, 3 H) ， 2.49 (s, 3 H) , 2.50 (s, 3 H) , 2.75 (q, J = 7.3 Hz, 2 H) , 2.9-3,1 (in, 4 H), 3.19 (s, 3 H) , 3.42 (s, 2 H) , 5.32 (s, 2 H) ， 6.81 (d, J = 8.1 Hz, 1 H) , 6.9-7.05 (m, 6 H). ' 参考例 5 7 ：化合物 9 1 {1,4一ビス [4— (3—クロ口ペンジルァミノ）ー 6— シクロプロピルカルボニル一 7,8—ジヒドロ一 5H—ピリ ド [4,3— d]ピリミジ ンー 2—ィル]ピぺラジン } の合成
化合物 9 1は、 以下の工程 1〜工程 8に従って合成した。
Figure imgf000132_0001
工程 1
市販の化合物 （A) (100 g, 0.335 mol) をエタノール （1,500 mL) に 溶解し、 尿素 （100g, l,67mol) およびナトリゥムメ トキシド （227 g, 1.18 mol) を加え、 加熱還流条件下、 24時間反応を行った。 薄層クロマトグラフ ィ一で反応の進行を確認し、 冷却後、 析出した結晶を濾取した。 この結晶を 水に懸濁させ、 その中へ塩酸 （6mol/L) を加え、 pH6.0に調整した。 さらに 1時間室温で撹拌し、 析出した結晶を濾取し、 減圧下で乾燥させ、化合物（B) (60 g, 収率 70%) を得た。
工程 2
工程 1で得られた化合物（B) (30.0 g, 0.116 mol)にォキシ塩 リン（300 mL) を加え、 加熱条件下で 5時間撹拌した。 薄層クロマトグラフィーで反応 の進行を確認後、 減圧下で過剰のォキシ塩化リンを留去した。 その後、 残渣 に 2—プロパノール （ 300 mL) を加え、 析出した結晶を含む懸濁液を加熱還 流条件下、 1時間.撹拌し、 さらに室温で 1時間撹拌した。析出した結晶を濾取 し、 減圧下で乾燥させ、 化合物 （C) (33 g, 収率 85%) を得た。
工程 3 ·
工程 2で得られた化合物 （C) (35.0 g, 0.106 mol) を 1,2—ジクロロェ タン （ 850 mL),に溶解し、 そこへトリェチルァミン （14.9 mL, 0.107 mol) およびクロ口蟻酸 1—クロ口ェチル （34.1 mL, 0.316 mol) を加え、 加熱還 流条件下、 5時間撹拌した。薄層クロマトグラフィ一で反応の進行を確認後、 反応混合物を冷却し、 水、 飽和食塩水で順次洗浄し、 無水硫酸マグネシウム で乾燥した。 得られた溶液を濃縮し、 残渣をカラムクロマトグラフィー （シ リカゲル、 n—へキサン ：酢酸ェチル =3 ： 1) で精製した。 生成物をメ夕ソ ール （ 850 mL) に溶解し、 加熱還流条件下、 1時間撹拌した。 薄層クロマト グラフィ一で反応の進行を確認した後、 濃縮乾固させることにより、 化合物 (D) (23.5 g, 収率 95%) を得た。 '
ヱ程 4 ' ·
工程 3で得られた化合物（D) (11.8 g, 49.1匪 ol)をジクロロメタン（300 mL) に溶解し、 シクロプロパンカルボニルクロリ ド （5.4 mL, 1.2当量） と トリエチルアミン （20.4 mL, 3.0当量） を加え、 室温で 1時間攪拌した。 得 られた反応溶液を氷、 飽和重曹水で洗浄後、 硫酸マグネシウムで乾燥した。 溶媒を留去した後、 残渣にジイソプロピルエーテルを加え、 懸濁液を 1時間 以上攪拌した。 その後、 析出した結晶を濾取し、 減圧下で乾燥させることに より、 化合物 （E) (12.5g, 収率 94%) を得た。
工程 5
工程 4で得られた化合物 （E) (12.5g, 45.9 mmol) をテトラヒドロフラ ン （400 mL) に溶解し、 トリェチルァミン （19.2 mL， 3当量） および 3—ク ロロベンジルァミン（11.2 mL, 2当量）を加えた後、 40°Cで 20時間攪拌した。 析出した塩を濾過により除去後、 溶媒を留去した。残渣をクロマトグラフィ 一 （クロ口ホルム ： メタノール = 100： 1 40： 1) で精製し、 目的物を含 む画分の濃縮残渣にへキサン/酢酸ェチル混合溶媒 （3:1) を加え、 結晶を 析出させた。 結晶を含む懸濁液を 1時間攪拌後、 析出した結晶を濾取し、 減 圧下で乾燥させ、 化合物 （F) (11.9g, 収率 69%) を得た。
工程 6
工程 5で得られた化合物 （F)' (5.0g, 13.3腿 ol) をジォキサン （100 mL) に溶解し、 tert—ブチル 1ーピペラジンカルボキシレート （4.9g， 2当量） と炭酸ナトリウム （14. Og, 10当量） を加え、 90°Cで 3日間攪拌した。 得られ た反応溶液を濾過し、 炭酸.ナトリゥムを除去後、 濾液に水およびクロ口ホル ムを加えて抽出を行い、 有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を留去 した後、 残渣にへキサン/酢酸ェチル混合溶媒（3:1)を加え、 懸濁液を 1時間 攪拌した。 その^、 析出した結晶を濾取し、 減圧下で乾燥させ、 化合物 （G)
(6.4g, 收率 92%) を得た。
工程 7
工程 6で得られた化合物 （G) (6.3g， 12.0 腿 ol) に 20%トリフルォロ酢 酸のジクロロメタン溶液 （50 mL) を加え、 室温で一時間攪拌した。 反応溶 液から溶媒を留去した後、 残渣にジィソプロピルエーテルを加え、 生成した 懸濁液を 1時間攪拌した.。 その後、 析出した結晶を濾取し、 減圧下で乾燥さ せ、 化合物 （H) を得た （4.9 g, 収率 ' 97%) 。
工程 8
工程 7で得られだ化合物 （H) (3.8 g, 8.90 mmol) と、 工程 5で得られ た化合物（F) (4.5g, 1.05当量） をジォキサン （100 mL) に溶解し、 炭酸ナ トリウム （10.6g, 10当量） を加え、 90°Cで 1週間攪拌した。 得られた反応溶 液を濾過し、 炭酸ナトリウムを除去後、 濾液に水を加えクロ口ホルムで抽出 した。 有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、 溶媒を留去した後、 残渣をカラ ムクロマトグラフィー（酢酸ェチル： トリェチルァミン =10： 1 ) で精製し た。 目的物を含む画分の濃縮残渣にへキサン/酢酸ェチル混合溶媒（3:1)を 加え、 生成した懸濁液を 1時間攪拌した。 その後、 析出した結晶を濾取し、 減圧下で乾燥させることにより、 化合物 9 1を得た （l.Og, 収率 23%) 。 APCI-MS: m/z 767 ([M + H]+)
¾ NMR (CDC13)5 (ρρηι): 0.7-0.9 (m, 4 H), 1.0-1.1 (m, 4 H), 1,7-1.9 (m, 2 H), 2.6-2.8 (m, 4 H), 3.75 (s, 8 H)， 3.8-4.0 (m, 4 H)， 4.3-4.4 (m, 4Ή), 4.6-4,7 (m, 4 H), 4.8-4.9 (m, 2 H), 7.1-7.3' (m, 8 H) . 参考例 58 ：宿主 'ベクター系の構築
(1 ) Gal4- ER発現プラスミ ド pGERbsrR2の造成
pSV21)sr (科研製薬社製）を Zml'Iと ilで切断後、 Klenow処理して 2.6kb の PvuII (平滑末端） — I^RI (平滑末端） 断片を取得した。
Gal4-ERキメラ遺伝子 [セル （Cell) 、 54卷、 199頁 （ 1988年） 、 プロシイ ーデングス ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·ァカデミ一 ·ォブ ·サイエンス ·ォブ · ザ.ュナイテヅ ド'ステーヅ'ォブ 'ァメリカ（Pro Natl. Acad. Sci . USA), 90卷、 1657頁 （ 1993年）] を含有する ERひ AF2 in pM (東京大学の加藤茂明先 生より分与） を Πと Iで切断後、 Klenow処理して、 1Π (平滑末端） -Ndel (平滑末端） 断片を取得した。
上記の pSV2bsr由来の ¾11 (平滑末端） 一 RI (平滑末端） 断片、 およ び ERひ AF2 in pM由来の ίΠ (平滑末端） -Ndel (平滑末端） 断片を結合す ることにより、 プラスミ ド pGERbsrR2を造成した。 pGERbsrR2は、 酵母
(Saccharomycescerevisiae) 由来の転写因子 Gal4pの DNA結合領域とエス ト 口ジヱン受容体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質 （GaU- ER) を発現する ことができる。
(2) ホタル .ルシフヱラーゼの誘導発現プラスミ ドの造成
pcDNA3(インビトロジェン社）を^;で切断後、 Klenow処理して、 1 (平 滑末端） 断片を取得した。 該断片を結合することにより、 1切断部位を消 失させた PCDNA3を造成した。 I I切断部位を消失させた PCDNA3を IMIで切断 後、 Klenow処理して、 Kml (平滑末端） 断片を取得した。 該断片を結合する ことにより、 Xholおよび Kpnl切断部位を消失させた UCDNA3を造成した。該プ ラスミ ドを Bg_lIIで切断後、 Klenow処理し、 丄 II (平滑末端） 断片を取得し た。
pAMoERC3Sc (特開平 05- 336963) を と Iで切断後、 Klenow処理し、 oriP配列を含む 2.2kbの 1 (平滑末端） — 丄1 (平滑末端） 断片を取得し た。
上記の 1切断部位と l切断部位を消失させた pcDNA3由来の^ ill (平 滑末端） 断片、 および MMoERC3Sc由来の ¾oI (平滑末端） 一 LI (平滑末端） 断片を結合することにより、 プラスミ ド PCDNA3— oriPを造成した。 pcDNA3 一 oriPを^ Iと Ei IIIで切断し、 Xhol— Hindlll断片を取得した。
pSE01uc2 (W098/14474) を 1と で切断後、 Klenow処理して、 アンピ シリン耐性遺伝子を含む (平滑末端） - 1 (平滑末端） 断片を取得し た。 該断片を結合することにより、 プラスミ ド pASd卜 luclを造成した。
pASd iuclを 1 : [と iii dlllで切断後、 0. llkbの Xhol- Hindlll断片を取得し た。
上記 pcDNA3— oriP由来の I I—iindlll断片、 および pAS(U-lucl由来の Xhol-Hindlll断片を結合し、 プラスミ ド pcDNA3— oriP— Sdlを造成した。 pcDM3— oriP— Sdlを 1と Iで切断し、 Xhol— Kpnl断片を取得した。 配列番号 1、 2、 3、'および 4で表される塩基配列を有する 4種の DNAを DNA 合成機で合成した。 該合成 DNAは混合してァニールすることによりポリ Α付 加シグナルをもつ 2本鎖 DNAを形成する。 該合成 DMをそれそれ T4
polynucleotide kinaseを用いてリン酸化後、 混合してァニールさせること により、 二本鎖 DNAとした。
該ニ本鎖 DNAと pcDNA3— oriP— Sdl由来の I— HMI断片を結合すること により、 プラスミ ド pcDM3— oriP— Sdl— pAを造成した。 pcDNA3— oriP— Sdl 一 pAを^ Iで切断後、 Klenow処理して、 1 (平 ί 末端） 断片を取得した。 pFR- luc (ス トラ夕ジーン社製）を Siidlllと lHIで切断後、 Klenow処理し、 0.14kbの Hidlll (平滑末端） 一 lHI (平滑末端） 断片を取得した。
上記の PCDNA3— oriP— Sdl— pA由来の I I (平滑末端）断片、および pFR- luc 由来の Hlndlll— IMHI断片を結合し、 プラスミ ド pAGalSdlを作製した。
pAGalSdlは、 Gal4p応答配列 （UASG) を 5回繰り返した配列を有するプロモ 一夕一を含有している。 pAGalSdlを EcoRIで切断後、 Klenow処理し、 EcoRI (平滑末端） 断片を取得した。 . pSE01uc2 (W098/14474) を udlllと^ lで切断後、 Klenow処理すること により、 ホタル レシフェラーゼ遺伝子を含む 1.7kbの iiiidlll (平滑末端） -Sacl (平滑末端） 断片を取得した。
上記の pSE01uc2由来の Si dlll (平滑末端） — (平滑末端） 断片、 お よび GalSdl由来の EcoRI (牟滑末端） 断片を結合することにより、 プラス ミ ド pAGalSdl- lucを造成した。
pAGalSdl- luc内に存在する二つの ndlllサイ トのうち、 ホタル . ルシフ ヱラーゼ遺伝子からより離れた Sijidniサイ トのみを Klenow処理により消失 させることにより、 pAGalSd4- lucを造成した。
pAGalSd4- lucを £718で切断後、 Stulで部分消化し pAGalSd4- luc由来の 9.5kbの Asp718— Still断片を取得した。該 DNA断片を Klenow処理し、 自己結合 させることによりプラスミ ド pAGal9-lucを造成した。
(3) 誘導発現ベクター pAGal9-dおよび pAGal9- ndの造成
ェプスタイン ·バー · ウィルスの oriPを有する発現プラスミ ド pAGal9- luc を SiHdlllと^ lで切断し、 oriPを含む 6.9kbの li dlll— ^ l断片を取得し た。
pAMo-d (特開 2001- 211885) を ndl IIと 1で切断レ、 テトラサイクリン 耐性遺伝子 （TcR) を含む liiidlll— 1断片を取得した。
上記の pAGa.19- luc由来の lindlll— l断片、および pAMo- d由来の Siidlll — ^ l断片を結合することにより、 pAGal9-luc中のホ夕ル ·ルシフェラーゼ 遺伝子部分を pAMo-dの Stuffer配列と置き換えたプラスミ ド pAGal9- dを造成 した。 pAGal9- lucを Sindlllと^ Iで切断し、 6.9kbの Hindlll— Sacl断片を 取得した。
pAMo-nd (特開 2001- 211885) を idi IIと^ Iで切断し、 テトラサイクリ ン耐性遺伝子を含む Hiadin— 断片を取得した。
上記の pAGal9-luc由来の aindlll— ^ I断片、 および pAMo-nd由来の gjjldlll— ^1断片を結合することにより、 pAGal9-luc中のホ夕ル .ルシフ エラーゼ遺伝子部分を pAMo-ndの Stuffer配列と置き換えたプラスミ ド pAGal9- ndを造成した。 (4) Gal4- ER発現プラスミ ド pGERbsrR2を Namalwa KJM- 1細胞の染色体 DNA に組み込んだ細胞株 KJMGER8の造成
Gal4-ERキメラ転写因子発現プラスミ ド pGERbsrR2を、 l〃g/〃lになるよう に TE緩衝液 〔10匪 ol/L Tris-HCl(pH8.0)、 1 mmol/Lエチレンジァミン 4酢 酸〕 に溶解した後、 エレク トロボレ一シヨン法 [サイ トテクノロジー
(Cytotechnology)、 3卷ヽ 133頁 (1990年) ]により、該プラス.ミ ドを Namalwa KJM-1細胞 [サイ トテクノロジー（Cytot chnology)、 1卷、 151頁 （1988年） ] に、 6X106細胞あたり 4' g導入し、 形質転換細胞を得た。 Namalwa KJM-1細 胞は、 EBNA- 1遺伝子を発現する無血清馴化した B細胞株である。.
該形質転換細胞を、 8mlの RPMI1640 · ITPSG培地 CRPMI1640培地 （日水製薬 社製） に、 1/40量の 7.5% NaHC03、 3 % 200匪 ol/L L -グルタミン溶液（イン ビトロジェン社製）、 0.5% ぺニシリン 'ストレプトマイシン溶液（ィンビト ロジェン社製、 5，000imits/mlペニシリン、 5 , ΟΟ /zg/ml.ス トレブトマイシ ン）、 10腿 ol/L N-2-ヒ ドロキシェチルピペラジン- N， -2 -エタンスルホン酸
(Ν-2-hydroxyethylpiperazine-N' -2-et anesulf onic acid; HEPES) 3 g/ml インシュリン、 5 /g/ml トランスフェリン、 5 mmol/L ピルビン酸ナ トリウム、 1 & nmol/L 亜セレン酸ナトリウム、 1 rag/ml ガラクトースを添 加した培地〕 に懸濁し、 C02インキュぺ一夕一中で 37°Cで 24時間培養した。 培養後、 ブラス トサイジン S (BlasticidinS) (KK- 400：科研製薬社製） を 2.0〃g/mlになるように添加し、 96穴プレートに分注 （500〜2000細胞/ 穴） して培養を行い、 pGERbsrR2が染色体 DNAに組み込まれた安定形質転換株
(シングルクロ一ン） を多数取得した。 各形質転換株は、 2.0〃g/mlのブラ ストサイジン Sを含む RPMI1640 · ITPSG培地で継代した。
下記に示す方法により上記安定形質転換株から、 誘導倍率が高く、 かつ非 誘導時のバツクグラ ンドが低い優れた安定形質転換株 KJMGER8細胞を選択 した。
各形質転換株にホタル · ルシフヱラーゼの誘導発現プラスミ ド
pAGalSdl-lucをエレク トロポレーシヨン法により導入し、 2日間培養した。 培養後、 17 ?—ェ.ス トラジオール（E8875：シグマ社製） （終濃度 lOnmol/L) を添加し、 さらに 24時間培養後、 ホ夕ル ·ルシフェラーゼ活性の測定を行つ た。 活性の測定には、 ルミノメータ一 LB953 (ペルト一ルド社製） を用い、 細胞溶解用緩衝液〔1 % ト リ トン X-100、100mmol/LKH2PO4(pH7.8)、 lmmol/L ジチオスレィ トール〕 IOO Iを、 '上記培養液に自動注入後、 基質溶液 〔25 腿り 1/Lグ'リシルグリシン （ρΗ7.8) 、 15醒 ol/L MgS04、 5 mmol/L .ATP、 0.33 腿 ol/L ルシフヱリン〕 300〃1を自動注入し、 10秒間の発光量を測定し、 ル シフェラーゼ活性とした。 比較のために、 175—エス トラジオール無添加条 件下でのルシフェラーゼ活性も測定した。
17/5—エストラジオ一ル添加条件下でのルシフヱラーゼ活性と 17 ?—ェ ス トラジオール無添加条件下でのルシフヱラーゼ活性を比較することによ り、 遺伝子発現の誘導倍率を算出し、 該誘導倍率が高く、 かつ 17 ?—エス ト ラジオ一ル無添加条件下のルシフヱラーゼ活性が低いクローンとして、
KJMGER8細胞を選択した。
参考例 59 ：ホタル'ルシフ ラ一ゼをレポ一ターとするレポータープラス ミ ド pACREplucの造成
cAMP応答配列 （CRE) の制御下にホ夕ル .ルシフェラーゼ遺伝子を発現す ることのできるレポ一夕一プラスミ ドである pACREplucを以下の方法で造成 した。 pACREplucは、 ハイグロマイ'シン耐性遺伝子およびェプスタイン · バ 一 · ウィルスの oriPを有している。
pAMo [ジャーナル'ォブ'バイオロジカル'ケミス トリー（J. Biol. Chem.), 268卷、 22782頁 ( 1993年） 、 別名 pAMoPRC3Sc (特閧平 5- 336963) ] を Clal で部分消化し、 一力所切断された DNA断片を取得した。 該 DNA断片を i lで部 分消化し、 9.5kbの Clal-Mlul断片を取得した。 pAGE248 [ジャーナル ·ォブ . バイオロジカル ' ケミスト リー （J. Biol. Ghem.) 、 269卷、 14730頁 （1994 年） ]を Clalおよび Mlulで切断し、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含む 1.5kb の Clal- Mlul断片を取得した。 pAMo由来の Clal- Mlul断片、 および pAGE248由 来の Clal-Mlul断片を結合し、 プラスミ ド pAMohを造成した。
pAMohを 1と Hiadlllで切断後、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含む] l 一 iii dlll断片を取得した。 pAGal9— lucを lと ndlllで切断し、 oriP、 GaUUASを含む I— idi II断片を取得した。 pAGal9— luc由来の Sail— Hindlll断片、 および上記 pAMoh由来の] [ I— indlll断片を結合することに より、 プラスミ ド pAGal9hを造成した。
pBluescriptll KS+ (東洋紡績社製） を Sailおよび Xholで切断した後、 ホ スファターゼ （Alkaline Phosphatase E.coli C75、 宝酒造社製） を用いて 脱リン酸化処理し、 アンピシリン耐性遺伝子を含む^ U- 1断片を取得し た。配列番号 5および 6で表される塩基配列を有する合成ォリゴヌクレオチド をァニールさせることにより、 CRE配列を 2つ含む二本鎖 DNAを調製した。該 二本鎖 DNAと pBluescriptll KS +由来の上記 all- 11^1 断片を結合し、 CRE配 列を 2つ含むプラスミ ド pBS— CREIを造成した。 pBS— CREIは、 該ニ本鎖 DM が、 丄 I切断部位および 1切断部位が再生する方向に組み込まれたプラス ミ ドであり、 上記切断部位をそれそれ 1つ有している。
pBS— CREIを Sealおよび ¾oIで切断しファージ flの oriを含む Scal-Xhol断 片を取得した。 PBS— CREIを Sealおよび Sailで切断し ColEl oriを含む Seal -Sail断片を取得した。 pBS— CRE I由来の -Xhol断片および^ I -Sail 断片を結合し、 CRE配列を 4つ含む pBS— CREIIを造成した。
pBS— CREIIを Sealおよび Xholで切断しファ一ジ flの oriを含む Seal- Xhol 断片を取得した。 PBS— CREIIを Sealおよび Sailで切断し ColEl oriを含む Seal-Sail断片を取得した。 pBS— CREII由来の Seal- Xhol断片および
Seal- Sail断片を結合し CRE配列を 8つ含む pBS— CREIVを造成した。
uBS— CREIVを Sealおよび Xholで切断しファ一ジ flの oriを含む Seal- Xhol 断片を取得した。 PBS— CREIVを Sealおよび Sailで切断し ColEl oriを含む Seal- Sail断片を取得した。 pBS— CREIV由来の Seal- Xhol断片および
Seal- Sail断片を結合し CRE配列を 16含む pBS_CREVIIIを造成した。
pBS— CREVIIIを 1で切断後、 Klenow処理し、 さらに Hind'IIIで切断する ことにより、 16個の CREを含む li dlll— 1 (平滑末端） 断片を取得した。 pAGalSdlを Mlulと Hindlllで切断し、 1.4kbの Mlul— Hindlll断片を取得した。 pAGal9hを X Iで切断後、 Klenow処理し、 さらに Mi lで切断することにより Xbal (平滑末端）— Mlul断片を取得した。 PBS— CREVIII由来の Hindlll— Xhol (平滑末端） 断片、 pAGalSdl由来の 1一 Sindlll断片、 および pAGal9h由来 の (平滑末端） —Ell断片を結合し、 プラスミ ド pACREhを造成した。 pAGal9—
Figure imgf000140_0001
と NoJIで切断し、 ホ夕ル ·ルシフェラーゼ遺伝子を含 む I— MI断片を取得した。 ACREhを Xho Iと Noj.Iで切断し、 CRE配列を含 む l断片を取得した。 pAGal9— luc由来の 1一 il断片、 および pACREh由来の Xhol— Notl断片を結合することによりプラスミ ド pACRElucを 造成した。
pACRElucを iiindlllで切断後、 Kl'enow処理し、 さらに Xholで切断すること により CREを含む iiiidlll (平滑末端） — 1 I断片、 およびホタル .ルシフエ ラ一ゼ遺伝子を含む ndlll (平滑末端） 一^ l断片をそれそれ取得した。 pACREluc由来の上記 2種の iiindlll (平滑末端） — 1断片を結合すること により、' pACREluc中の CRE配列上流の Hindlllサイ トが消失したプラスミ ド pACRElucHを造成した。
pGL3- Enhancer vector 〔プロメガ（Promega)社製〕 を Hindlllと Hpalで切 断し、 luc+遺^子 （改変型のホタル 'ルシフェラ一ゼ遺伝子） を含む
Hindlll- Hpal断片を取得した。 pACRElucHを]^ ilで切断後、 Klenow処理し、 さらに ndlllで切断することにより、 CREを含む ilidlll- Notl (平滑末端） 断片を取得した。 pGL3-Enhancer vector由来の Hindlll-Hpal断片、 および pACRElucH由来の Hindi II- Notl (平滑末端） 断片を結合することによりブラ スミ ド pACREplucを造成した。 参考例 60 ： GPR4誘導発現プラスミ ドの造成
ヒト肺由来の mRNA (クロンテヅク社製） を l〃g用い、 SUPERSCRIPT First-Strand Synthesis System for RT-PCR (ギブコ社製) により一本鎖 cDNA を合成した。 該一本鎖 cDNAを水で 250倍希釈した溶液 5 1を錶型として、 配 列番号 7および 8に示した配列を有する合成 DNAを GPR4遺伝子特異的プライマ —として用い、 PCRにより GPR4CDNAを取得した。 GPR4遺伝子特異的プライマ 一の配列は、 GPR4遺伝子の配列情報 （GenBank受入番号： U21051) に基いて 設計した。 酵素としては、 PfuTurbo DNA Polymerase (Stratagene社製） を 用いた。 PCRを行う際の緩衝液としては、 使用する酵素に付加された 10倍濃 度の緩衝液を使用した。 PCRは、サーマルサイクラ一 DNA engine (MJ Research 社製） を用い、 95°Cで 5分間の処理後、 94°Cで 1分間、 60°Cで 1分間、 72°Cで 1 分間からなる反応を 30サイクル行うことにより実施した。 増幅された GPR4 cDNA断片をプライマ一上に設計された配列を切断する Hindlllおよび Not Iで切断した。 GPR4 cDNAを含む断片をァガロースゲル電 気泳動法により回収した。
該切断断片を、 プラスミ ド pAGal9- ndの Hindlll— Not I間へ組み込むこと により、 GPR4誘導発現プラスミ ド pAGal9- GPR4を構築した。 ■
pAGal 9-nd中の配列に特異的なプライマ一（配列番号 9および 10に示した配 列を有する合成 DNA) を用いて、 該 cDNAの 側および 3' 側の配列を決定し た。 決定された配列に特異的な合成 DNAを調製し、 それをプライマ一として 用い、さ'らに先の塩基配列を決定した。該操作を繰り返すことにより、該 cDNA の全塩基配列を決定し GPR4をコードしていることを確認した。塩基配列の決 定には、 パーキン 'エルマ一社の DMシークェンサ一 377と反応キヅ ト （ABI PrismTM BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit:ァプ ライ ド 'バイオシステムズ社） を使用した。
プラスミ ドに組み込んだ DNA断片の配列を決定し、 GPR4をコードしている ことを確認した。 - 参考例 6 1 ： GPR4のアツセィ細胞の構築
GPR4誘導発現プラスミ ド pAGal9- GPR4 ( 2 ju g ) およびレポ一夕一プラス ミ ド pACREpluc ( 2 μ- g) を、 上記エレク トロポレーシヨン法により、 6X106 細胞の KJMGER8に共導入した。 該形質転換株を 8mlの RPMI1640 · ITPSG培地に 懸濁し、 C02インキュベータ一中、 37°Cで 24時間培養した。 培養後、 ブラス トサイジン S (2.0 zg/ml) 、 ハイグロマイシン B (300〃g/ml) およびジヱ ネテイシン （ 500 g/ml) を添加し、 さらに 14日間培養して安定形質転換株 ' (GPR4アツセィ細胞と呼ぶ） を取得した。 該形質転換株を、 プラス トサイジ ン S (2.0/zg/ml) 、 ハイグロマイシン B ( 300 /g/ml) およびジエネテイシ ン （500〃g/inl) を含む RPMI1640 · ITPSG培地で継代した。
同様にして、 コントロールプラスミ ド pAGal9- nd ( 2 ju g) およびレポ一 タープラスミ ド pACREpluc ( 2 ju g) を KJMGER8に共導入し、 安定形質転換株 (コン トロール細胞と呼ぶ） を取得した。 参考例 62 ： マウス由来のヒト GPR4ホモログをコードする DNAのクローニン グ
ヒト GPR4遺伝子の塩基配列情報
Figure imgf000143_0001
を基に、 NCBI のデータペースを対象として検索を行った。 その結果、 相同性の高い配列と して、 マウスゲノム配列（AC073784 )および複数の Expression sequence tag(EST)配列（BF178464、 AA968193、 AA798732, AI840893、 AI851037 )が選択 された。 該マウスゲノム配列と ESTから構築された遺伝子の塩基配列を配列 番号 14に、該遺伝子によりコードされるポリペプチドのアミノ'酸配列を配列 番号 13に示した。該'ァミノ酸配列を、 解析プログラム [GENETYXWIN ver. 5.0 (ソフ トウエア社製）]を用いてヒト GPR4のァ.ミノ酸配列と比較したところ、 92.7%の一致が認められた。
よって、 配列番号 13で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、 マ ウスのヒト GPR4ホモログ （マウス GPR4) であることが推定された。
従って、 マウス GPR4をコードする DNAは、 市販、 または公知の方法で調製 することができるマウス cDNAライブラリーを鍩型にし、配列番号 14で表され る塩基配列に基づき設計、合成できるオリゴヌクレオチドをプライマーセヅ トに用いた PCRにより取得することができる。 参考例 63 ： ラヅト由来のヒ ト GPR4ホモログをコードする DNAのクローニン グ
ヒト GPR4遺伝子の塩基配列情報（ACNO.U21051)を基に、 NCBIのデータべ一 スを対象として検索を行った。 その結果、'相同性の高い配列として 2つのラ ヅ トゲノム配列（AC11.9447.2および AC096180.2 )および複数のラッ ト EST配列 (BF544182, AI170948, AI008858, AI235374, AI50287U BQ194515 )が選択さ れた。 これらの配列と、 配列番号 14で示したマウスの塩基配列情報を基に配 列番号 15および配列番号 16に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド を作製した。
該オリゴヌクレオチド各々 1.0 zmol/Lをプライマーセヅ トとして用い、ラ ット肺由来 mRNAから作製した cDM を鍩型に用い、 後記の各成分の濃度 が 200〃mol/Lとなるよう dNTP (dATPヽ dGTPヽ dCTPヽ dTTP) 、 Tag Gold (パー キンエルマ一社製） 2.5単位および I X Taq Gold (Mg plus) 緩衝液（パーキ ンエルマ一社）を含む反応溶液 を調製し、 下記条件下で PCRを行った。 すなわち、 サーマルサイクラ一 PTC- 200 (MJリサーチ社製） を用い、 95°C で 10分間加熱後、 94°Cで 1分間、 55°Cで 1分間、 72°Cで 1分間の工程.を 1サイク ルとして 30サイクル行い、 さらに 72°Cで 5分間加熱した。
得られた PCR反応液より 5〃Lを分取し、 ァガロースゲル電気泳動により ' GPR4をコードする DNAと予想される約 1. lkbの DNA断片が増幅されたことを確 認後、 QIAEX II Gel Extraction Kit (QIAGEN社製） を用いて、 該製品に添 付されたマニュアルに従い、 DNA断片を溶出し回収した。
上記で回収した DNA断片 50ngと pT7Blue T-Vector (Novagen社製) 50ngとを DNA Ligation- kit ver.2 (宝酒造社製） を用いて該製品に添付されたマニュ アルに従って連結し、 組換えプラスミ ド DNAを得た。 得られた組換えプラス ミ ド DNAを用いて大腸菌 JM109株を形質転換して得られる形質転換株から、常 法によりプラスミ ド PT7RGを得た。プラスミ ド pT7RGの全塩基配列を決定した 結果、 PT7RGには配列番号 18で表される塩基配列を有する約 l.lkbの cDNAが含 まれていた。 配列番号 18で表される塩基配列から.なる DNAにコードされるポ リペプチドのァミノ酸配列を配列番号 17に示した。該ァミノ酸'配列を、 解析 プログラム [GENETYX WIN ver. 5.0 (ソフトウェア社製） ] を用いてヒト、 およびマウス GPR4のアミノ酸配列と比較したところ、 それぞれ 93.0%、 99.2%の一致が認められた。
よって、 配列番号 17で表されるアミノ酸配列を有するポリべプチドは、 ラ ヅ トのヒト GPR4ホモログ （ラ ト GPR4) であることが推定された。 実施例 1
常法により、 次の組成からなる錠剤を調製する。 処方 化合物 1 20 mg
乳糖 1143,4 mg
馬鈴薯デンプン
ヒ ドロキシプロピルセルロース ステアリン酸マグネシウム 0 . 6 mg
200 mg 実施例 2
常法により、 次の組成からなる注射剤を調製する。 処方 化合物 5 2 mg
精製ダイズ油 200 ' mg
• 精製卵黄レシチン 24 mg
注射用グリセリン 50 rag
注射用蒸留水 1 . 72 ml
2 . 00 ml 産業上の利用可能性
本発明により、 GPR4のシグナル伝達に関する機能を抑制する物質を有効成 分として含有する好中球性炎症疾患の予防および/または治療剤、含窒素三 環式化合物もしくはその四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学的に許 容される塩を有効成分として含有する好中球性炎症疾患の予防および Zま たは治療剤、 上記の式 （I I ) で表される化合物もしくはその四級アンモニゥ ム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩を有効成分として含有す,る好 中球性炎症疾患の予防および/または治療剤等が提供される。 配列表フリ一テキス ト
配列番号 1一人工配列の説明 ：合成 DNA
配列番号 2一人工配列の説明： ：合成 DM
配列番号 3一人工配列の説明 ：合成 DM
配列番号 4 -人工配列の説明 ：合成 DNA
配列番号 5一人工配列の説明： ：合成 MA
配列番号 6 -人工配列の説明： ：合成 DNA
配列番号 7一人工配列の説明 ： ：合成 MA 配列番号 8―人工配列の説明：合成丽 配列番号 9 ―人工配列の説明：合成赚 配列番号 1 0一人工配列の説明 ：合成 MA 配列番号 1 5一人工配列の説明 ：合成 MA 配列番号 1 6 —人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 1 9 —人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 2 0一人工配列の説明 ：合成 DM 配列番号 2 1一人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 2 2一人工配列の説明 ：合成 DM 配列番号 2 3一人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 2 4一人工配列の説明 ：合成 DNA 配列番号 2 5一人工配列の説明 ：合成 DM

Claims

請求の範囲
1 . 配列番号 11記載のアミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関す る機能を抑制する物質を有効成分として含有する好中球性炎症疾患の予防 および/または治療剤。
2 . 好中球性炎症疾患が、 慢性閉塞性肺疾患（C0PD )である請求の範囲第 1 項記載の好中球性炎症疾患の予防および/または治療剤。
3 . 以下の 1 ) 〜 4 )
1 )配列番号 12記載の塩基配列から選ばれる連続した 15〜 60塩基からなるォ リゴヌクレオチドの相補的配列を有するオリゴヌクレオチドまたは該オリ ゴヌクレオチド誘導体、
2 )配列番号 14記載の塩基配列から選ばれる連続した 15〜 60塩基からなるォ リ 'ゴヌクレオチドの相補的配列を有するオリゴヌクレオチドまたは該オリ ゴヌクレオチド誘導体、
3 )配列番号 18記載の塩基配列から選ばれる連続した 15〜 60塩基からなるォ リゴヌクレオチドの相補的配列を有するオリゴヌクレオチドまたは該オリ ゴヌクレオチド誘導体、
4 )配列番号 12、 14および 18から選ばれるいずれか一つに記載の塩基配列を 有する DNAとストリンジヱントな条件下でハイブリダィズし、 かつ配列番号. 11記載のアミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関する機能を抑制 する 15〜60塩基からなるオリゴヌクレオチドまたは該オリゴヌクレオチド 誘導体、
のいずれか一つを有効成分として含有する好中球性炎症疾患の予防および '/または治療剤。
4 . 以下の 1 ) 〜 4 )
1 ) 配列番号 11記載のアミノ酸配列を有する蛋 13質を認識する抗体、
2 ) 配列番号 13記載のァミノ酸配列を有する蛋白質を認識する抗体、
3 ) 配列番号 17記載のアミノ酸配列を有する蛋白質を認識する抗体、
4 )配列番号 11、 13および 17から選ばれるいずれか一つに記載のアミノ酸配 列において一つ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列を 有し、かつ配列番号 11記載のアミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に 関する機能を有する蛋白質を認識する抗体、 . のいずれか一つを有効成分として含有する好中球性炎症疾患の予防および /または治療剤。
5 . 式 （I )
Figure imgf000148_0001
[式中、 R1は置換もしくは非置換の複素環基、 - NR 6 (式中、 R5および は同 一または異なって水素、 置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは 非置換のシクロアルキル、 置換もしくは非置換の低級アルケニル、 置換もし くは非置換の低級アルキニル、 置換もしくは非置換のァラルキル、 または置 換もしくは非置換の複素環アルキルを表すか、 R5および R6が隣接する窒素原 子と一緒になつて置換もしくは非置換の複素環基を形成する）、- OR7 (式中、 は水素、 置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換の低級 アルカノィル、 置換もしくは非置換のシクロアルキル、 置換もしくは非置換 の低級アルケニル、 置換もしくは非置換の低級アルキニル、 置換もしくは非 置換のァリール、 置換もしくは非置換のァラルキル、 または置換もしくは非 置換の複素環アルキルを表す） 、 -SR7a (式中、 R7aは前記 R7と同義である） 、 -C0NR Sa (式中、 R5aおよび R6aはそれそれ前記 R5および前記 と同義である）、 - C02R7b (式中、 R7bは前記 R7と同義である）、 ホルミル、 またはシァノを表し、 R ま水素、 置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換のシク 口アルキル、 置換もしくは非置換の低級アルケニル、 置換もしくは非置換の 低級アルキニル、 置換もしくは非置換のァラルキル、 または置換 ¾)しくは非 置換の複素璟アルキルを表し、 '
および R4は同一または異なって水素、 低級アルキル、 またはハロゲンを表 し、
nは 0または 1を表し、
Xは ( CH2 ) 2 -または- CH=CH -を表し、
Yは式 （A)
Figure imgf000149_0001
(式中、 Wは CHまたは窒素原子を表し、
Ζ1および Ζ2は同一または異なって水素、置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニ ル、置換もしくは非置換の低級アルキニル、置換もしくは非置換のァリール、 置換もしくは非置換のァラルキル、または置換もしくは非置換の複素環アル キルを表すか、 Ζ1および Ζ2がそれぞれが隣接する 2つの炭素原子と一緒にな つて置換もしくは非置換の芳香環を形成するか、 または Ζ1および Ζ2がそれそ れが瞵接する 2つの炭素原子と一緒になつて置換もしくは非置換の複素環 を形成し、
Ζ3は水素、 置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換のシク 口アルキル、 置換もしくは非置換の低級アルケニル、 置換もしくは非置換の 低級アルキニル、 置換もしくは非置換のァリール、 置換もしくは非置換の複 素環基、 置換もしくは非置換のァラルキル、 または置換もしくは非置換の複 素環アルキルを表す） を表す]で表される含窒素三環式化合物もしくはその 四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩を有効成分と して含有する好中球性炎症疾患の予防および/または治療剤。
6 . R1が-冊5 Rsであり、 R5および ϋ6が隣接する窒素原子と一緒に つて置換 もしぐは非置換の複素環基を形成する請求の範囲第 5項記載の好中球性炎 症疾患の予防および/または治療剤。.
7 . R2が水素である請求の範囲第 5項または第 6項に記載の好中球性炎症 疾患の予防および/または治療剤。
8 . R3および が水素である請求の範囲第 5項〜第 7項のいずれかに記載 の好中球性炎症疾患の予防および/または治療剤。
9 . Ζ1および Ζ2がそれそれが隣接する 2つの炭素原子と一緒になつて置換 もしくは非置換の複素環を形成する請求の範囲第 5項〜第 8項のいずれか に記載の好中球性炎症疾患の予防および Ζまたは治療剤。
1 0 .請求の範囲第 5項〜第 9項のいずれかに記載の含窒素三環式化合物も しくはその四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩の 有効量を投与することを特徴とする、好中球性炎症疾患の予防および/また は治療方法。
1 t .好中球性炎症疾患の予防および/または治療剤の製造のための請求の 範囲第 5項〜第 9項のいずれかに記載の含窒素三環式化合物もしくはその 四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩の使用。
1 2 . 式 （I I )
Figure imgf000151_0001
{式中、 RAは水素、 置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置 換のシクロアルキル、 置換もしくは非置換の低級アルケニル、 置換もしくは 非置換の低級アルキニル、 置換もしくは非置換のァリール、 置換もしくは非 置換のァラルキル、 置換もしくは非置換のァロイル、 置換もしくは非置換の 複素環基、 または置換もしくは非置換の複素環アルキルを表し、
Aし A2- A3 -^は N=CRC- CRD=CRE (式中、 Rc、 RDおよび REは同一または異なって、 そ れそれ前記 RAと同義である） 、 CRB=CRe- CRD=CRE (式中、 RB、 Re、 RDおよび REは 同一または異なって、 それそれ前記 RAと同義である） 、 N=CR°- N二 CRE (式中、 RGおよび REは同一または異なって、 それそれ前記 ϋΑと同義である） または CRB=CRC-N=CRE (式中、 RB、 Reおよび REは同一または異なって、 それそれ前記 RAと同義である） を表し、 ,
Qは、 置換もしくは非置換のフヱニレン （但し、 置換フヱニレンにおける置 換基はシァノ、 ニトロ、 C0NH2、 - NHS02RQ (式中、 RQは前記 RAと同義である） および低級アルコキシカルボニルではない）'、 置換もしくは非置換のナフチ レン（但し、置換ナフチレンにおける置換基はシァノ、ニトロ、 C0NH2、 - NHS02RQ
(式中、 RQは前記 RAと同義である） および低級アルコキシカルボニルではな い） 、 炭素数 2〜6で窒素、 酸素および硫黄から任意に選ばれる原子数 1〜4 である置換もしくは非置換の不飽和もしくは部分的に不飽和の 5〜7員の単 環式複素環から 2つの水素原子が除かれた基 （但し、 炭素数 2〜6で窒素、 酸 素および硫黄から任意に選ばれる原子数 1〜4である置換の不飽和もしくは 部分的に不飽和の 5〜7員の単環式複素璟における置換基はシァノ、 ニトロ、 C0NH2、 -NHS02RQ (式中、 RQは前記 RAと同義である） および低級アルコキシ力 ルポニルではない） 、 炭素数 4〜10で窒素、 酸素および硫黄から任意に選ば れる原子数 1〜4である置換もしくは非置換の不飽和もしくは部分的に不飽 和の環構成原子数が 8〜11の二環式複素環から 2つの水素原子が除かれた基 <但し、 炭素数 4〜10で窒素、 酸素および硫黄から任意に選ばれる原子数 1 〜4である不飽和もしくは部分的に不飽和の環構成原子数が 8〜11の二環式 複素環から 2つの水素原子が除かれた基が、
Figure imgf000152_0001
{式中、
Xは NRX [式中、 Rxは水素、 置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしく は非置換のシクロアルキル、 置換もしくは非置換の低級アルカノィル、 置換 もしくは非置換のシクロアルキルカルボニル、置換もしくは非置換のァリ一 ル、 置換もしくは非置換のァラルキル、 置換もしくは非置換のァロイルまた は置換もレくは非置換の芳香族複素環基 （テトラゾリルを除く） を表す] 、 酸素原子または硫黄原子を表し、 '
Yは窒素原子または CRX1 〔式中、 Rxlは水素、 低級アルキル、 以下の置換基群 A から選ばれる同一のまたは異なる 1〜3の置換基で置換された低級アルキル [置換基群 A：ハロゲン、 ヒドロキシ、 ホルミル、 ト リフルォロメチル、 ビ ニル、 スチリル、 フヱニルェチニル、 ァロイル、 置換もしくは非置換の脂環 式複素環基および置換もしくは非置換の芳香族複素環基（テトラゾリルを除 く） ] 、 置換もしくは非置換のシクロアルキル、 置換もしくは非置換の低級 アルカノィル、 置換もしくは非置換のシクロアルキルカルボニル、 置換もし くは非置換のァリール、 置換もしくは非置換のァラルキル、 置換もしくは非 置換のァロイル、 置換もしくは非置換の芳香族複素環基（テトラゾリルを除 く） 、 式 (A1)
Q— V ~ R6 (A1) {式中、 Qzz Vは CR7x= 8x [式中、 R7xおよび R8xは同一または異なって、水素、 低級アルコキシカルボニル、 置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もし くは非置換のシクロアルキル、 置換もしくは非置換の低級アルカノィル、 置 換もしくは非置換のシクロアルキルカルボエル、置換もしくは非顰換のァリ ール、置換もしくは非置換のァロイルまたは置換もしくは非置換の芳香族複 素環基 （テトラゾリルを除く） を表す] または C≡Cを表し、 .
R6は水素、低級アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換のシクロアルキル、置換もしくは非置換の低級アルカノ ィル、 置換もしくは非置換のシクロアルキルカルボニル、 置換もしくは非置 換のァリール、置換もしくは非置換のァロイルまたは置換もしくは非置換の 芳香族複素環基 （テトラゾリルを除く） を表す }
または式 （B1)
Figure imgf000153_0001
[式中、 nalは 0〜3の整数を表し、 R9alおよび Mは、 同一または異なって水 素、 ハロゲン、 低級-アルコキシカルボニル、 置換もしくは非置換の低級アル キル、 置換もしくは非置換のシクロアルキル、 置換もしくは非置換の低級ァ ルカノィル、 置換もしくは非置換のシクロアルキルカルボニル、 置換もしく は非置換のァリール、置換もしくは非置換のァコイルまたは置換もしくは非 置換の芳香族複素環基 （テトラゾリルを除く） を表すか、 または R9alと R9bl が隣接する炭素原子と一緒になって飽和脂肪族環を形成し、
Il1Qxは置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換のシクロア ルキル、 置換もしくは非置換の低級アルカノィル、 置換もしくは非置換のシ クロアルキルカルボニル、 置換もしくは非置換のァラルキル、 置換.もしくは 非置換のァリール、置換もしくは非置換のァロイルまたは置換もしくは非置 換の芳香族複素環基 （テトラゾリルを除く） を表す] を表す〕 ¾表す } を表 すときは、 炭素数 4〜10で窒素、 酸素および硫黄から任意に選ばれる原子数 1 〜4である置換の不飽和もしくは部分的に不飽和の環構成原子数が 8〜11の 二環式複素環から 2つの水素原子が除かれた基における置換基は二ト口、シ ァノおよび低級アルコキシカルボニルではない >、
式 （B)
Figure imgf000154_0001
[式.中、 A5は- CR G- (式中、 Rpおよび RGは同一または異な.つて、 水素、 置換 もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換のァリール、 置換もし くは非置換の複素環基、 カルボキシ、 低級アルコキシカルボニル、 またはモ ノもしくはジ低級アルキルアミノカルボニルを表す）、 - CRPRG- (式中、 RFおよび RGはそれそれ前記と同義であり'、 および はそれそれ前記 RFおよび RGと同義である） 、 - N=CRH- (式中、 RHは前記と同義である） 、 - CRP二 N- (式 中、 RFは前記と同義である） 、 -CIip=CRH- (式中、 Rpおよび RHはそれそれ前記 と同義である）、 - 0CRHRL (式中、 iiHおよび はそれそれ前記と同義である）、 - CR¾G0- (式中、 ^および RGはそれそれ前記と同義である） 、 -SOnlCR¾J- (式 中、 RHおよび RJはそれそれ前記と同義であり、 nlは 0〜2の整数を表す） 、 - CR ¾Onl- (式中、 Rp、 RGおよび nlはそれそれ前記と同義である） 、 - 0-、 ま たは- S0nl- (式中、 nlは前記と同義である） を表し、
A6は- CRFaRGa- (式中、 RFaおよび RGaはそれそれ前記 Rpおよび RGと同義である）、 - C ( =0 ) -または - NRR- (式中、 RRは前記 RAと同義である） を表し、 .
Rsは、 水素、 置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換のシ クロアルキル、 置換もしくは非置換の低級アルケニル、 置換もしくは非置換 の低級アルキニル、 置換もしくは非置換のァリール、 置換もしくは非置換の ァラルキル、 置換もしくは非置換のァロイル、 置換もしくは非置換の複素環 基、 置換もしくは非置換の複素環アルキル、 ハロゲン、 シァノ、 ニトロ、 ヒ ドロキシ、 カルボキシ、 ァミノ、 低級アルコキシ、 またはモノもしくはジ低 級アルキルアミノを表し、
環 Eはベンゼン環、 または窒素、 酸素および硫黄から任意に選ばれる元素を 1 個以上有する芳香族複素環を表す] 、 または式 （C)
Figure imgf000155_0001
(式中、 Rsl、 RT、 Ruおよび Rvは同一または異なって、 水素、 置換もしくは非 置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換のシクロアルキル、 置換もしくは 非置換の低級アルケニル、 置換もしくは非置換の低級アルキニル、 置換もし くは非置換のァリール、 置換もしくは非置換のァラルキル、 置換もしくは非 置換のァロイル、 置換もしくは非置換の複素璟基、 置換もしくは非置換の複 素環アルキル、 ハロゲン、 シァノ、 ニトロ、 ヒドロキシ、 カルボキシ、 アミ ノ、 低級アルコキシ、 またはモノもしくはジ低級アルキルアミノを表し、 Ru および ϋνは同一または異なって、 さらに低級アルコキシカルボニル、 または モノもしくはジ低級アルキルァミノカルボニルであってもよい） を表し、 Τは単結合、 -◦-、 - S -、 - SO-、 - S02-、 - NRK- (式中、 RKは前記 RAと同義である）、 - C (=0 )-、 - C ( =0 ) NRK - (式中、 RKは前記と同義である） 、 - NRKC (=0 ) - (式中、 RKは前記と同義である）、 - 0CH2 -、 - CH20-、 - SCH2-、 -S0CH2 -、 - S02CH2-ヽ - CH2S -、 - CH2S0 -、 - CH2S02-、 -NRKCR¾M - (式中、 RKは前記と同義であり、 RLおよび RM は同一または異なって、 それそれ前記 RAと同義である） 、 - NRKS02- (式中、 RKは前記と同義である）、 - S02NRK- (式中、 RKは前記と同義である）、 - CR MNRK-
(式中、 RK、 RLおよび RMはそれそれ前記と同義である）、 - CH2CH2-、 - CH=CH -、 -CH(0RKA) - (式中、 RKAは前記 RAと同義である） 、 -CH(0C0RKB) - (式中、 RKB は前記 RAと同義である） 、 または- CH (NRK¾KD )- (式中、 RKGおよび RKDは同一ま たは異なって、 それそれ前記 RAと同義である） を表し、 Uは単結合、 -（CH2 CR¾P- (式中、 mlは 0〜2の整数を表し、 RNおよび Rpは同 一または異なって、 それそれ前記 RAと同義である） 、 または置換もしくは非 置換のフエ二レンを表し、
Vはカルボキシ、 テトラゾール- 5-ィル、 -C0NH2、 -C0NHS02RQ (式中、 RQは前 記 RAと同義である） 、 -S03RQ (式中、 RQは前記と同義である） 、 - S02NHRQ (式 中、 RQは前記と同義である） 、 - S02NHC0RQ (式中、 RQは前記と同義である） 、 -S02NHC0NRRARRB (式中、 RRAおよび RRBは同一または異なって、 それそれ前記 RA と同義である）、 -NHS02RQ (式中、 RQは前記と同義である）、 -P (0 ) (0RRC ) (0RRD) (式中、 RRGおよび RRDは同ーまたは異なって、それそれ前記 RAと同義である）、 置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニル、 シァノ、 またはニトロを 表す }
で表される化合物もしくはその四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学 的に許容される塩を有効成分として含有する好中球性炎症疾患の予防およ び/または治療剤。
1 3 . Qが下式
Figure imgf000156_0001
[式中、 Rs、 RT、 Ruおよび Rvは同一または異なって水素、 置換もしくは非置 換の低級アルキル、 置換もしくは非置換のシクロアルキル、 置換もしくは非 置換の低級アルケニル、 置換もしくは非置換の低級アルキニル、 置換もしく は非置換のァリール、 置換もしくは非置換のァラルキル、 置換もしくは非置 換のァロイル、 置換もしくは非置換の複素環基、 置換もしくは非置換の複素 環アルキル、 ハロゲン、 シァノ、 ニトロ、 ヒ.ドロキシ、 カルボキシ、 ァミノ、 低級アルコキシ、 またはモノもしくはジ低級アルキルアミノを表し、
A5および A6はそれそれ前記と同義であり、
B3、 B4および B5は同一または異なって- 0-または- S-を表し、
B6は - CRR- (式中、 ^は前記と同義である） または- N-を表し、
環 Eはベンゼン環、 または窒素、 酸素および硫黄から任意に選ばれる元素を 1 個以上有ずる芳香族複素環を表す] - で表される請求の範囲第 1 2項記載の好中球性炎症疾患の予防および/ま たは治療剤。
1 4 .好中球性炎症疾患が、関節炎、敗血症および急性呼吸窮迫症候群（ARDS ) から選ばれる好中球性炎症疾患である請求の範囲第 1項記載の好中球性炎 症疾患の予防および/または治療剤。
1 5 . 配列番号 11記載のアミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関 する機能を抑制する物質の有効量を投与することを特徴とする、好中球性炎 症疾患の予防および/または治療方法。
1 6 . 請求の範囲第 3項に記載の 1 ) 〜4 ) のいずれか一つのオリゴヌクレ ォチドまたは該オリゴヌクレオチド誘導体の有効量を投与することを特徴 とする、 好中球性炎症疾患の予防および/または治療方法。
1 7 . 請求の範囲第 4項に記載の 1 ) 〜4 ) のいずれか一つの抗体の有効量 を投与することを特徴とする、好中球性炎症疾患の予防および/または治療 方法。
1 8 . 好中球性炎症疾患の予防および/または治療剤の製造のための、 配列 番号 11記載のアミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関する機能を 抑制する物質の使用。
1 9 . 好中球性炎症疾患の予防および/または治療剤の製造のための、 請求 の範囲第 3項に記載の 1 ) 〜4 ) のいずれか一つのォリゴヌクレオチドまた は該オリゴヌクレオチド誘導体の使用。
2 0 . 好中球性炎症疾庳の予防および/または治療剤の製造のための、 請求 の範囲第 4項に記載の 1 ) 〜4 ) のいずれか一つの抗体の使用。
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