WO2004017995A1 - 掻痒の予防および／または治療剤 - Google Patents

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WO2004017995A1
WO2004017995A1 PCT/IB2003/003475 IB0303475W WO2004017995A1 WO 2004017995 A1 WO2004017995 A1 WO 2004017995A1 IB 0303475 W IB0303475 W IB 0303475W WO 2004017995 A1 WO2004017995 A1 WO 2004017995A1
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Mayumi Saki
Hiromi Nonaka
Hiromasa Miyaji
Shunji Ichikawa
Chiemi Takashima
Tsutomu Matsumura
Hitoshi Arai
Katsutoshi Sasaki
Choei Kobatake
Yukihito Tsukumo
Kyoichiro Iida
Takeshi Kuboyama
Haruhiko Manabe
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Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a prophylactic and / or therapeutic agent for pruritus comprising, as an active ingredient, a substance that suppresses the function related to GPR4 signal transduction.
  • the present invention also relates to a nitrogen-containing tricyclic compound or a quaternary ammonium salt thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, which is useful as a prophylactic and / or therapeutic agent for pruritus.
  • the present invention relates to a screening agent for the treatment of pruritus, which is based on a decrease in the number of bruising behaviors induced by sphingosylphosphorylcholine (SPC).
  • SPC sphingosylphosphorylcholine
  • GPCR4 a G protein-coupled receptor protein
  • SPC sphingosylphosphorinolecoline
  • LPC lysophosphatidinorecoline
  • LPC another ligand of GPR4, accumulates in psoriatic lesions [Brit. Giannareo ob Pharmacolology (Br. J. Pharmacol.), 134, 398-402 (1995). Induction of edema, erythema and cell infiltration by intradermal administration to humans [Acta. Derm. Venereol., Vol. 80, pp. 242-246 (2000)] Power suggests involvement in dermatitis.
  • 0GR—1 [Nichiya's Senole Biology (Nat. Cell Biol.), Volume 2, pp. 261–267 (2000)], G2A [Science ), 293, 702-705 (2001)]
  • W002 / 24222 literally discloses the use of GPR4 antagonists for the treatment of atopic dermatitis.
  • pruritus is caused by a wide variety of diseases, including various skin diseases (atopic dermatitis, eczema, dermatitis, prurigo, prurigo, xerosis, insect bite, Scabies, mycosis, skin pruritus, hypertrophic scar, psoriasis, bullous disease, drug eruption, etc., liver-biliary disease (primary biliary cirrhosis, cholestasis, cirrhosis, etc.), renal disease (long kidney) Insufficiency, etc.), endocrine 'metabolism disorders (diabetes, thyroid dysfunction, etc.), blood disorders
  • skin diseases atopic dermatitis, eczema, dermatitis, prurigo, prurigo, xerosis, insect bite, Scabies, mycosis, skin pruritus, hypertrophic scar, psoriasis, bullous disease, drug eruption, etc.
  • liver-biliary disease
  • pruritus may be caused by pregnant women, drugs, etc. Pharmaceutical Journal), Vol. 37, No. 1 (issued on January 1, 2001), 73-77 and 79-82H) c
  • a GPCR known as a constitutively active GPCR which, when overexpressed in cells, causes a signal to flow even in the absence of a ligand.
  • the signal that flows in the absence of ligand is called constitutive activity.
  • Constitutively active GPCRs include naturally occurring GPCRs and mutant GPCRs created by introducing mutations such as amino acid substitutions and deletions [Molecular Pharmacol. ), 57 volumes, 890 pages (2000), W098 / 46995].
  • Antagonists that suppress the constitutive activity of GPCRs are called inversegonists.
  • the object of the present invention is to provide a convenient object of the present invention.
  • An object of the present invention is to provide an inhibitor of GPR4 signal transduction function containing a nitrogen-containing tricyclic compound or a quaternary ammonium salt thereof or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. .
  • Another object of the present invention is to provide a screening method for a therapeutic agent for pruritus, which is based on a decrease in the number of SPC-induced breaking actions.
  • the present invention relates to the following (1) to (22).
  • a prophylactic and / or therapeutic agent for pruritus comprising, as an active ingredient, a substance that suppresses a signal transmission function of a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11.
  • a preventive and / or therapeutic agent for pruritus comprising one of the above as an active ingredient.
  • SEQ ID NOS: 11, 13 and 17 wherein one or more amino acids in the amino acid sequence according to any one of deletion, substitution or addition have an amino acid sequence, and An antibody that recognizes a protein having a function related to signal transmission of a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11,
  • R 1 is a substituted or unsubstituted heterocyclic group, -NR 5 R 6 (wherein R 5 and R 6 are the same or different and are hydrogen, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted Or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted lower alkynyl, substituted or unsubstituted aralkyl, or substituted or unsubstituted heterocyclic alkyl Or R 5 and R 6 together with an adjacent nitrogen atom form a substituted or unsubstituted heterocyclic group), -OR 7 (where R 7 is hydrogen, substituted or unsubstituted) Is unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstitute
  • each R 5a and R 6a Ru 6 synonymous der - C0 2 R 7b (wherein, R 7b has the same meaning as the R 7), - N + R 5b R 6b R 8 (wherein, R 5b and R 6b have the same meanings as R 5 and R 6 , respectively, and R 8 represents lower alkyl, lower alkenyl, or aralkyl), formyl, carboxy, or cyano ,
  • R 2 is hydrogen, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted lower alkynyl, substituted or Represents an unsubstituted aralkyl, or a substituted or unsubstituted heterocyclic alkyl,
  • n 0 or 1
  • Z 1 and Z 2 are the same or different and are hydrogen, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted lower alkynyl, substituted Or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted aralkyl, or substituted or unsubstituted heterocyclic alkyl, or Z 1 and Z 2 may be substituted together with two adjacent carbon atoms. Or a substituted or unsubstituted aromatic ring or a substituted or unsubstituted heterocyclic ring,
  • Z 3 is hydrogen, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted lower alkynyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted Represents a substituted heterocyclic group, substituted or unsubstituted aralkyl, or substituted or unsubstituted heterocyclic alkyl)] or a quaternary ammonium salt thereof, or a drug thereof.
  • a physically acceptable salt is hydrogen, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted lower alkynyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted Represents a substituted heterocyclic
  • the nitrogen-containing tricyclic compound or the quaternary ammonium salt thereof or the pharmacologically acceptable salt thereof As an active ingredient, the nitrogen-containing tricyclic compound or the quaternary ammonium salt thereof or the pharmacologically acceptable salt thereof according to any of the items (4) to (8).
  • test compound a substance that reduces the number of ruptures induced by SPC
  • the pruritus is pruritus associated with a skin disease, liver / biliary tract disease, renal disease, endocrine / metabolic disease, blood disease, malignant tumor, neurological disease, or a disease selected from AIDS (1) to (3).
  • the prophylactic and / or therapeutic agent for pruritus according to any of (10) to (10).
  • Pruritus is pruritus associated with skin disease, and the skin disease is atopic dermatitis, eczema, dermatitis, depraved measles, prurigo, xeroderma, insect bite, scabies, mycosis, skin pruritus
  • a method for preventing and / or treating pruritus which comprises administering a therapeutically effective amount of a substance that suppresses a signal transmission function of a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11.
  • the present inventors have found a new finding that a substance that suppresses the signal transduction function of GPR4, which is a GPCR, is effective in preventing or treating pruritus, and completes the present invention. Reached.
  • the present inventors have proposed a constitutionally active type
  • GPR4 which is a GPCR. It has been found that substances that inhibit the activity are effective in preventing and / or treating pruritus.
  • Substances that suppress the function of GPR4 related to signal transmission include substances that inhibit or suppress the expression of GPR4 itself, substances that inhibit the binding of ligand to GPR4, and signals generated by ligand binding to GPR4.
  • FfiU inhibits transmission [eg, changes in intracellular cAMP concentration (increase or decrease), changes in intracellular Ca 2+ concentration (increase), mitogen-activated protein (MAP) kinase, etc.]
  • Substances that suppress signal transduction caused by the constitutive activity of GPR4 for example, GPR4 inverse agonists and the like are included).
  • the structure of the above substance is not particularly limited as long as it has these functions, and may have a known structure.
  • GPR4 includes, for example, a protein having the amino acid sequence described in any one selected from SEQ ID NOS: 11, 13, and 17, or a protein selected from SEQ ID NOs: 11, 13, and 17 Signal transmission of a protein having an amino acid sequence in which at least one amino acid is deleted, substituted or added in the amino acid sequence according to any one of the above, and having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 11 Proteins having a function of
  • SEQ ID NO: 11 having at least one amino acid deleted, substituted or added in the amino acid sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1, 13 and 17, and having SEQ ID NO: 1
  • a protein having a function related to signal transduction of a protein having the amino acid sequence described in 1 is described in [Molecular Cloning, A
  • any of SEQ ID NOS: 11, 13, and 17 It can be obtained by introducing a site-specific mutation into MA encoding a protein having one of the amino acid sequences described above.
  • the number of amino acids deleted, substituted or added is not particularly limited, but is preferably 1 to tens, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and more preferably:! ⁇ 5.
  • the deletion, substitution or addition of one or more amino acid residues in the amino acid sequence according to any one of SEQ ID NOs: 11, 13 and 17 means that the amino acid sequence in the amino acid sequence At any one or more positions of the amino acid residue means that there is a deletion, substitution or addition of one or more amino acid residues, the deletion, substitution or addition may occur simultaneously,
  • the amino acid residue to be substituted or added may be either natural or non-natural.
  • Natural amino acid residues include L-alanine, L-asparagine, L-asparaginate, L-glutamine, L-glutamate, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L- Leucine, L-lysine, L-arginine, L-methionine, L-phenylalanine, L-purine, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-thymosine, L -Various and L-cysteine residues.
  • Group A leucine, isoleucine, nonoleucine, / lin, nonolein / kurin, alanine, 2-aminoptanoic acid, methionine, 0-methylserine, tert-ptinoregulin, tert-ptinolelanine, Cyclohexanolane
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, isoglutamic acid, 2-aminoaminoadipic acid, 2-aminosveric acid
  • Group D lysine, arginine, orditin, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid
  • Group E Proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline
  • Group F serine, threonine, homoserine
  • Group G pheninoleanine, tyrosine
  • a protein having an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, substituted or added in the amino acid sequence according to any one of SEQ ID NOs: 11, 13, and 17, Having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 In order to have a function related to signal transduction of a protein, the amino acid sequence thereof and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 are at least 75% or more, usually at least 80%, preferably at least 90%, and more preferably Preferably have an identity of 95% or more.
  • Examples of the substance that inhibits or suppresses the expression of GPR4 itself include, for example, 15 to 60 consecutive nucleotides selected from the nucleotide sequence of any one selected from SEQ ID NOS: 12, 14, and 18.
  • An oligonucleotide having an complementary sequence of an oligonucleotide consisting of (hereinafter, also referred to as an antisense oligonucleotide); SEQ ID NO: 12, a base selected from any one selected from 14, 14 and 18
  • Oligonucleotides that hybridize with the DNA having the sequence under stringent conditions and suppress the function related to signal transduction of the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, derivatives of these oligonucleotides hereinafter, referred to as Oligonucleotide derivatives
  • the antisense 'oligonucleotide is an oligonucleotide consisting of a continuous 15 to 60 bases selected from the base sequence of any one selected from SEQ ID NOS: 12, 14, and 18.
  • An antisense having a complementary sequence of nucleotides is not particularly limited as long as it is an oligonucleotide.
  • Particularly preferred is an antisense 'oligonucleotide having the complementary sequence of the translation initiation region of the above-mentioned oligonucleotide.
  • the antisense oligonucleotide is prepared by a conventional method based on the information on the nucleotide sequence of any one selected from SEQ ID NOs: 12, 14, and 18 or the nucleotide sequence of a fragment thereof. For example, it can be prepared by using a DNA synthesizer.
  • Oligonucleotide derivatives include an oligonucleotide derivative in which the phosphoric acid ester bond in the oligonucleotide is converted into a phosphorothioate bond, and a phosphoric diester bond in the oligonucleotide.
  • Oligonucleotide derivative converted to '- ⁇ 5' phosphoamidate bond Oligonucleotide derivative, oligonucleotide in which the bond between ribose and phosphoric acid diester in the oligonucleotide is converted to peptide nucleic acid bond
  • Oligonucleotide derivative in which peracyl is substituted with C-5propenylperacyl and oligonucleotide derivative in which peracyl in oligonucleotide is substituted with C-5 thiazolylperacyl, in oligonucleotide
  • Oligonucleotide derivative in which a cytosine is substituted with C-5 propynylcytosine Oligonucleotide derivative in which cytosine in oligonucleotide is substituted with phenoxazine-modified cytosine, origonucleic acid in which ribose in oligonucleotide is substituted with 2,
  • DNA having the base sequence described in any one selected from SEQ ID NOs: 12, 14, and 18 and a nucleotide that hybridizes under stringent conditions are referred to as SEQ ID NOs: 12, 14, and Using a part or all of the DNA having the base sequence described in any one of 18 as a probe as a probe, the colony-hybridization method, the plaque hybridization method, the southern plot DNA obtained by using the hybridization method or the like.Specifically, 0.7 to 1.0 mol / 1 chloride is used by using a filter on which DNA derived from colonies or plaques is immobilized.
  • a 0.1- to 2-fold concentration of SSC solution (the composition of a 1-fold concentration SSC solution is 150 mmolVl Sodium, 15 mmol / 1 citric acid Used consisting birds um), it can be mentioned DNA or the like can be identified by the child filter washed with 6 5 ° C conditions.
  • Hybridization is based on Molecular 'Cloning 2nd Edition, Current' Protocols 'in' Molecular, No, Iology, DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical
  • the nucleotide to be hybridized is, for example, 1% when calculated using the above BLAST, FASTA, etc.)
  • a DNA having at least 75% or more homology with the DNA having the complementary sequence of the DNA having the base sequence of any one selected from 2, 14 and 18 is preferable, and more preferably 8 DNAs having a homology of 0% or more, more preferably DNAs having a homology of 95% or more.
  • RNA and the like can be used, but DNA is preferably used.
  • the antisense 'oligonucleotide or the antisense' oligo A nucleotide derivative or a nucleotide or a nucleotide derivative that hybridizes with a DNA having the nucleotide sequence of any one selected from SEQ ID NOs: 12, 14, and 18 under stringent conditions alone
  • a vector for gene therapy such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, or an adenovirus associated virus vector
  • a drug formulated according to the usual method described below is used as a prophylactic and / or therapeutic agent for pruritus. Can also be used.
  • a gene therapy vector When a gene therapy vector is used as the prophylactic and / or therapeutic agent, it can be produced by preparing the gene therapy vector and a base for use in the gene therapy agent [Nature Genet., 8, 42 (1994)].
  • the above-mentioned base may be any base that is usually used for injections, for example, distilled water, sodium chloride or a salt solution such as a mixture of sodium chloride and an inorganic salt, or the like.
  • examples thereof include sugar solutions such as mannitol, lactose, dextran, and pudose, amic acid solutions such as daricin and arginine, and mixed solutions of an organic acid solution or a salt solution and a dalcose solution.
  • an osmotic pressure regulator, a ⁇ regulator, a vegetable oil such as sesame oil and soybean oil, or an auxiliary agent such as lecithin or a surfactant such as a nonionic surfactant is added to these bases.
  • An injection may be prepared as a solution, suspension or dispersion. These injections can also be prepared as preparations for dissolution at the time of use by operations such as powdering and freeze-drying.
  • the prophylactic and / or therapeutic agent can be used as it is in the case of a liquid, or in the case of a solid, immediately before administration, if necessary, dissolved in the above-mentioned sterilized base.
  • Examples of the method of administration include a method of local administration so as to be absorbed at the treatment site of the patient.
  • DNA can be transported to a target treatment site by a non-viral gene transfer method.
  • Non-viral gene transfer methods include calcium phosphate coprecipitation [Virology, 52, 456-467 (1973); Science, 209, 1414-1422 (1980)], and microinjection [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 5399-5403 (1980); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 7380-7384 (1980); Cell, 27, 223-231 (1981); Nature, 294, 92-94 (1981)], liposome-mediated membrane fusion-mediated transfer [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413-7417 (1987); Biochemistry, 28, 9508-9514 (1989); J. Biol. Chem., 264, 12126-12129 (1989); Hum.
  • Examples of the substance that inhibits the binding of a ligand to GPR4 include an antibody that recognizes GPR4, a compound that has an antagonistic effect on GPR4, and the like.
  • any antibody that recognizes GPR4 can be used, but an antibody that specifically recognizes GPR4 is preferable.
  • the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. Examples of such an antibody include a neutralizing antibody that recognizes GPR4.
  • human chimeric antibodies, humanized antibodies and the like can also be used as the antibodies of the present invention.
  • the above antibody can be prepared, for example, according to the following method.
  • a polyclonal antibody can be prepared by administering a purified sample of GPR4 or a partial fragment thereof polypeptide or a peptide having an amino acid sequence of a part of GPR4 as an antigen to an animal.
  • Animals to be administered include egrets, goats, rats, mice, hamsters and the like.
  • the dose of the antigen is preferably 50 to 100 g per animal.
  • a peptide When a peptide is used, it is desirable to use, as an antigen, a peptide obtained by covalently binding a peptide to a carrier protein such as keyhole limpet haemocyanin or bovine thyroglobulin.
  • a peptide serving as an antigen can be synthesized by a peptide synthesizer.
  • the administration of the antigen is performed 3 to 10 times every 1 to 2 weeks after the first administration.
  • Plasma samples are collected from the fundus venous plexus 3 to 7 days after each administration, and the reaction of the serum with the antigen used for immunization is determined by enzyme immunoassay [enzyme immunoassay (ELISA): published by Medical Shoin ( 1976), AntiDodies-A Laboratory Manual, Cold spring harbor Laboratory (1988)].
  • enzyme immunoassay enzyme immunoassay (ELISA): published by Medical Shoin ( 1976), AntiDodies-A Laboratory Manual, Cold spring harbor Laboratory (1988)].
  • a polyclonal antibody can be obtained by obtaining serum from a non-human mammal whose serum has a sufficient antibody titer against the antigen used for immunization, and separating and purifying the serum. .
  • Methods for separation and purification include centrifugation, salting out with 40-50% saturated ammonium sulfate, and caprinoleic acid precipitation [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)], or DEAE-Sepharose column, A method in which chromatography using an anion exchange power column, protein A or G-power column, gel filtration column, or the like is used alone or in combination.
  • a rat whose serum shows a sufficient antibody titer is produced. Serve as a source of cells.
  • the spleen is removed 3 to 7 days after the last administration of the antigenic substance to the rat showing the antibody titer.
  • the spleen is shredded in a MEM medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical), loosened with forceps, centrifuged at 1,200 rpm for 5 minutes, and the supernatant is discarded.
  • MEM medium manufactured by Nissui Pharmaceutical
  • the spleen cells in the obtained precipitate fraction are treated with Tris-ammonium chloride buffer (pH7.65) for 1 to 2 minutes to remove red blood cells, washed three times with MEM medium, and the resulting spleen cells are used as antibody-producing cells. Used as
  • myeloma cells use cell lines obtained from mice or rats.
  • 8-azaguanine-resistant mouse derived from BALB / c
  • myeloma cell line P3-X63Ag8-U1 (hereinafter abbreviated as P3-U1) [Curr. Topics Microbiol. Immunol., 81, 1 (1978), Eur.J. Immunol., 6, 511 (1976)), SP2 / 0-Agl (SP-2) [Nature, 276, 269 (1978)], P3-X63-Ag8653 (653) [ J.
  • a purified plate of GPR4 or its partial fragment polypeptide used as an antigen, or a peptide having a partial amino acid sequence of GPR4 is coated on an appropriate plate, and the hybridoma culture supernatant or The purified antibody obtained in (d) above is reacted as the first antibody, and the second antibody is an anti-rat or anti-mouse immunoglobulin antibody labeled with biotin, an enzyme, a chemiluminescent substance or a radioactive compound.
  • a reaction according to the labeling substance is carried out, and those which specifically react with the polypeptide used as the antigen are selected as the hybridomas producing the monoclonal antibody used in the present invention.
  • Cloying was repeated twice by the limiting dilution method using the hybridoma [the first time using HT medium (medium obtained by removing aminopterin from the HAT medium), and the second time using normal medium]. Those with a strong antibody titer are selected as the hybridoma strain producing the monoclonal antibody used in the present invention.
  • mice or nude mice 8 to 10 weeks old which were treated with pristane [0.5 ml of 2,6,10,14-tetratramethinolepentadecane (Pristo) intraperitoneally and bred for 2 weeks]
  • Intraperitoneally 5 to 20 ⁇ 10 6 hybridoma cells producing the monoclonal antibody used in the present invention obtained in (c) are injected intraperitoneally.
  • Hybridomas develop ascites cancer between 10 and 21 S.
  • the ascites is collected from the mouse with ascites tumor and centrifuged at 3,000 rpm for 5 minutes to remove solids.
  • a monoclonal antibody can be purified and obtained in the same manner as the method used for the polyclonal antibody.
  • the antibody subclass is determined using a mouse monoclonal antibody typing kit or a rat monoclonal antibody typing kit.
  • Polypeptide amount is calculated Lowry method or from the absorbance at 2 8 0 nm.
  • the above-mentioned preventive and / or therapeutic agent for pruritus containing an antibody recognizing GPR4 can be prepared as follows.
  • compositions containing the antibody as an active ingredient can be administered alone.
  • the active ingredient is usually mixed with one or more pharmacologically acceptable carriers, and the drug is produced by any method well known in the technical field of pharmaceuticals. It is desirable to provide it as a drug product.
  • a sterile solution dissolved in water or an aqueous carrier such as an aqueous solution of salt, glycine, glucose, human albumin or the like is used.
  • pharmacologically acceptable additives such as buffering agents and tonicity agents to bring the formulation solution closer to physiological conditions, such as sodium acetate, sodium chloride, sodium lactate, Potassium chloride, sodium citrate and the like can also be added.
  • it can be stored after being freeze-dried and dissolved in an appropriate solvent before use.
  • Dosage forms include tablets, injections and the like.
  • Suitable formulations for oral administration include tablets and the like. Tablets include excipients such as lactose and mannitol; disintegrators such as starch; lubricants such as magnesium stearate; binders such as hydroxypropylcellulose; surfactants such as fatty acid esters; glycerin; It can be manufactured by using a plasticizer or the like as an additive.
  • Formulations suitable for parenteral administration include injections and the like. For example, an injection is prepared using a carrier comprising a salt solution, a glucose solution or a mixture of both.
  • the components exemplified as additives in oral preparations can be added.
  • a substance that suppresses a function related to signal transduction caused by the constitutive activity of GPR4 can also be obtained by searching for a substance that can suppress signal transduction caused by the constitutive activity.
  • Examples of the compound having an antagonistic action on GPR4 include a compound represented by the formula (I).
  • the compound represented by the formula (I) is referred to as compound (I). The same applies to compounds of other formula numbers.
  • each group of the compound (I) for example, a linear or branched alkyl having 1 to 10 carbon atoms may be used, and specifically, methinole, echinole, Propinole, isopropynole, petitinole, isoptinole, sec-butynole, tert-butylinole, pentinole, isopentinole, neopentyl, hexinole, heptyl, octyl, isoctyl, nonyl, decyl, etc.
  • cycloalkyl examples include cycloalkyl having 3 to 8 carbon atoms, and specific examples thereof include cyclopropyl, cyclobutynole, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl and the like. .
  • Examples of the lower alkenyl include straight-chain, branched or cyclic alkenyl having 2 to 8 carbon atoms, and specific examples thereof include butyl, aryl, 1-propenyl, puttenolene, penteninole, Hexeninole, hepteninole, octeninole, cyclohexyl, 2,6-octactenyl, and the like.
  • Examples of the lower alkynyl include straight-chain or branched alkynyl having 2 to 8 carbon atoms, and specific examples thereof include ethur, propynyl, butynyl, pentyl, hexynyl, heptyl, and octynyl. Is mentioned.
  • Halogen represents each atom of fluorine, chlorine, bromine and iodine.
  • Examples of the aryl and the aromatic ring formed by joining together two adjacent carbon atoms and removing one hydrogen atom include monocyclic groups having 6 to 14 carbon atoms, Examples thereof include bicyclic or tricyclic aryls, and specific examples include phenyl, naphthyl, indul, and anthral.
  • alkylene portion of aralkyl and heterocyclic alkyl has the same meaning as the above-mentioned definition of lower alkyl (i) except that one hydrogen atom is removed.
  • aryl moiety of aralkyl examples include, in addition to the groups defined in the above-mentioned aryl (vi), a bicyclic fused ring group in which the aryl is fused with a cycloalkyl, Specifically, there are indanil, 1,2,3,4-tetrahydrodronaphthyl, 6,7,8,9-tetrahydr-5H-benzocycloheptyl, and the like.
  • Examples of the heterocyclic group and the heterocyclic group portion of the heterocyclic alkyl and the group obtained by removing one hydrogen atom from a heterocyclic ring formed by joining together two adjacent carbon atoms include nitrogen.
  • Selected from atoms, oxygen atoms and sulfur atoms A 5- or 6-membered monocyclic heterocyclic group containing at least one atom, a bicyclic or tricyclic fused 3- to 8-membered ring composed of nitrogen, oxygen and sulfur atoms
  • Examples include a condensed heterocyclic group containing at least one selected atom, such as pyridyl, pyrazinyl, pyrimidinyl, pyridazinyl, benzoimidazolyl, 2-oxobenzoimidazolyl, and benzotol.
  • heterocyclic group formed together with the adjacent nitrogen atom for example, a 5- or 6-membered monocyclic heterocyclic group containing at least one nitrogen atom (the monocyclic heterocyclic group) Heterocyclic groups may contain other nitrogen, oxygen or sulfur atoms),
  • a condensed heterocyclic group containing at least one nitrogen atom which is a bicyclic or tricyclic ring in which a 3- to 8-membered ring is condensed (the condensed heterocyclic group is other nitrogen atom, oxygen atom or sulfur which may contain an atom).
  • pyridyl tetrahydropyridyl, indolinyl, isoindolinyl, pyrrolidinyl, thiazolidinyl, oxazolidinyl ⁇ , pyridino, Homopiperidino, Piperazinyl, Homopirazuranole, Monoreholino, Tiomonoreholino, ⁇ / Lehi Droazepi-Nore, Perhidroazosininole, Te Trahidroquinolyl, Tetrahidroisoquinolyl, Zodrazynol Indolyl, isoindolyl, prenyl, dihydroindolyl, pyrrolyl, dihydrinyl Lil, pyrazolyl, Application Benefits Azori Le, Te Torazoriru, Lee imidazolyl, etc. can be mentioned, et al. It is.
  • Substituents in the substituted lower alkyl and the substituted lower alkyl are the same or different and include, for example, cycloalkyl, lower alkanoyl, lower alkoxy, aryloxy, substituted aryloxy having 1 to 3 substituents [the substituted aryloxy]
  • substituents in the above are the same or different and include, for example, lower alkyl, lower alkoxy, lower alkoxycarbonyl, halogen, cyano, nitro, hydroxy, carboxy, amino, etc. having 1 to 3 substituents. I can do it.
  • the lower alkyl has the same meaning as the lower alkyl (i)
  • the halogen has the same meaning as the halogen (V)
  • the lower alkyl part of the lower alkoxy and the lower alkoxycarbonyl has the same meaning as the lower alkyl (i).
  • A) aralkyloxy, substituted aralkyloxy [Substituents in the substituted aralkyloxy are the same or different, for example, lower alkyl, lower alkoxy, lower alkoxycarbonyl, halogen, cyano, nitro having 1 to 3 substituents. , Hydroxy, carboxy, amino and the like.
  • the lower alkyl has the same meaning as the lower alkyl (i)
  • the halogen has the same meaning as the halogen (V)
  • the lower alkyl part of the lower alkoxy and the lower alkoxycarbol has the same meaning as the lower alkyl (i).
  • substituents may be the same or different and include, for example, a hydroxy group having 1 to 3 substituents, halogen, etc.], a substituted lower alkanol, and the same or different substituents in the substituted lower alkanol.
  • halogens having 1 to 3 substituents, etc. mono- or di-lower alkylamino, lower anorekyls Rehoniru, lower alk keno less Honoré alkylsulfonyl, lower Anorekokishi force Noreboniru ⁇ Mi Bruno, lower Arukanoiruami Roh, mono- or di-lower alkylamino Nokarubo sulfonyl, mono- or di-lower alkylamino Nokarubo - Ruokishi, heterocyclic group and the like.
  • the lower alkyl moieties of ruthio, lower alkylsulfonyl, lower alkylsulfinyl, lower alkoxycarbonylamino and lower alkylamino have the above-mentioned aryl (vi), cycloalkyl (ii), halogen (V;), It has the same meaning as the heterocyclic group (ix) and the lower alkyl (i), and the alkylene portion of the aralkyloxy has the same meaning as the lower alkyl (i) obtained by removing one hydrogen atom.
  • the lower alkyl moiety of the mono- or di-lower alkylamino, mono- or di-lower-alkylaminocarbonyl and mono- or di-lower-alkylaminocarbonyloxy is as defined above for the lower alkyl (i), respectively.
  • the two lower alkyl moieties of the di-lower alkylaminocarbonyl group may be the same or different.
  • (xii) a substituted aryl, a substituted aralkyl, a substituted cycloalkyl, a substituted lower alkenyl, a substituted lower alkynyl, a substituted heterocyclic group, a substituted heterocyclic alkyl, a substituted hetero atom formed together with an adjacent nitrogen atom
  • the substituents in a ring group, a substituted aromatic ring each formed with two adjacent carbon atoms, and a substituted heterocyclic ring each formed with two adjacent carbon atoms are: In addition to the groups mentioned in the definition of the substituent (xi) in the above-mentioned substituted lower alkyl, lower alkyl, aryl, substituted aryl, aralkyl, substituted aralkyl, heterocyclic group, substituted heterocyclic group, heterocyclic group And alkyl, substituted heterocyclic alkyl and the like.
  • the substituent in the substituted aryl and the substituted heterocyclic group formed together with the adjacent nitrogen atom is a lower alkyl [the lower alkyl is the same as the lower alkyl (i)] or Substituted lower alkyl [the lower alkyl has the same meaning as the above lower alkyl (i), and the substituents in the substituted lower alkyl may be the same or different and include, for example, halogen, hydroxy, Carboxy, lower alkoxycarbonyl and the like.
  • the halogen is the same as the halogen (V)
  • the lower alkyl part of the lower alkoxycarboyl is the same as the lower alkyl (i).
  • the aryl portion of aralkyl is the above-mentioned lower alkyl (i), aryl (vi).
  • the substituent in the substituted aryl, the substituted aralkyl, the substituted heterocyclic group, and the substituted heterocyclic alkyl may be the same or different, for example, a lower alkyl having 1 to 3 substituents [the lower alkyl is the lower alkyl. (The lower alkyl portion of the lower alkoxy is the same as the lower alkyl (i)), halogen [the halogen is the same as the halogen (V)], and the like. No.
  • Examples of the quaternary ammonium salt of compound (I) include a lower alkyl halide (the lower alkyl and the halogen are the same as defined above) and an aralkyl halide ( Halogen and the aralkyl are as defined above, and quaternary ammonium salts to which hydroxy lower alkyl (the lower alkyl is as defined above) and the like are not particularly limited.
  • a non-toxic, water-soluble salt is preferable.
  • Acid salts such as organic acid salts, alkaline salts such as sodium salts and potassium salts, metallic salts such as metallic salts, magnesium salts, calcium salts and the like alkaline earth metal salts, aluminum salts, zinc salts, etc.
  • Metal salts such as ammonium and tetramethylammonium, organic amine addition salts such as morpholine addition salt and piperidine addition salt, or glycine addition salt, phenylalanine addition salt and lysine And amino acid addition salts such as aspartic acid addition salt, aspartic acid addition salt and glutamic acid addition salt.
  • R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , X and Y are each as defined above, represents lower alkyl, aryl or benzyl, and R 11 are the same or different.
  • lower alkyl, cycloalkyl and halogen are as defined above, respectively.
  • alkenyl portion of alkoxysulfonyloxy and alkylsulfonyloxy, and the aryl portion of aryloxysynolephonyloxy and arylsulfonyloxy have the same meanings as the lower alkyl and aryl, respectively.
  • the heterocyclic group formed together with the adjacent nitrogen atom has the same meaning as described above.
  • compound (Ilia) as a raw material and reacting it with 1 equivalent to a large excess of YH (wherein Y is as defined above), according to the method disclosed in JP-A-7-61983. As a result, compound (IV) can be obtained.
  • the compound (Ilia) can be synthesized by the method disclosed in JP-A-7-61983 or a method analogous thereto.
  • an acid such as hydrochloric acid, acetic acid, or trifluoroacetic acid into the reaction system as needed.
  • the reaction is usually performed at a temperature between 0 ° C and the boiling point of the solvent used in the reaction, preferably at a temperature between room temperature and 80 ° C, and is completed in 5 minutes to 100 hours.
  • the inert solvent for example, water, methanol, ethanol, acetic acid, trifluoroacetic acid, dichloroethane, cyclomouth honolem, tetrahydrofuran, dimethylinolecetamide, dimethinolehonolemamide, acetone, etc. are used alone. Alternatively, they can be used as a mixture, and preferably a mixed solvent of chloroform and acetic acid is used.
  • Compound (Ic) can be produced from compound (Ib) by the following method. Manufacturing method 2
  • the compound (I-c) can be obtained by reacting at a temperature between the boiling points of, preferably at room temperature for 1 to 48 hours.
  • inert solvent examples include water, methanol, ethanol, benzene, tonolen, xylene, ethynole acetate, hexane, acetonitrinole, dichloromethane, dichloroethane, chlorophonolem, carbon tetrachloride, 4-Dioxane, tetrahydrofuran, dimethylacetamide, dimethylformamide, acetone, and the like can be used alone or in combination, and preferably ethyl acetate, dichloromethane, chloroform, and the like are used.
  • Compound (I-b) can be produced from compound (I-c) by the method shown below.
  • Compound (I-c) was used in an inert solvent in a reaction from 1 equivalent to a large excess of R 5 RH (wherein R 5 and R 6 are as defined above), usually from 1 to 10 ° C.
  • the compound (Ib) can be obtained by reacting at a temperature between the boiling points of the solvents, preferably at a temperature between 20 ° C and 100 ° C for 1 to 100 hours.
  • Inert solvents include, for example, water, methanol, ethanol, benzene, tonolen, xylene, ethynole acetate, hexane, acetonitrile, dichloromethane, dichloroethane, chloroform, carbon tetrachloride, 1, 4-Dioxane, tetrahydrofuran, dimethylacetamide, dimethylformamide, acetone, and the like are used alone or as a mixture, and preferably, chloroform, dimethylformamide and the like are used. Since the reaction usually proceeds well under basic conditions, it is desirable to add an appropriate base into the reaction system as needed.
  • triethynoleamine, diisopropylethylamine, pyridine, N-methylmorpholine, potassium carbonate, sodium hydride, potassium hydride, calcium hydride, diisopropylethylamine, 1,8-Diazabicyclo [5.4.0] indene 7-ene or the like can be used, and among them, triaderamine is preferable.
  • Compound (I-e) can be produced from compound (I-b) using compound (I-d) by the method shown below.
  • R 14 and R 15 is the same or different and is hydrogen, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted lower alkynyl, substituted Or an unsubstituted aralkyl, or a substituted or unsubstituted heterocyclic alkyl, or a substituted or unsubstituted heterocyclic ring wherein R 14 and R 15 are taken together with the adjacent CH (CH 2 ) n N. May be formed.
  • R 16 is hydrogen, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted lower alkynyl, substituted or unsubstituted Represents arylalkyl, or substituted or unsubstituted aryl, and m represents an integer from 0 to 3.
  • Lower alkyl, cycloalkyl, lower alkenyl, lower alkynyl, aralkyl, heterocyclic alkyl, and aryl are each as defined above, and their substituents are also defined as above.
  • Examples of the substituted or unsubstituted heterocyclic ring formed by R 14 and R 15 together with the adjacent CH (CH 2 ) n N include tetrahydropyridine, pyrrolidine, pyridin, and homopyridin. Gin, piperazine, homopiperazine, monorephorin, thiomonoreolin, penolehydrazazepine, penolehydrozoazosin, tetrahydroquinoline, tetrahydroisoquinoline, and the like. It has the same meaning as the substituent of the heterocyclic group formed together with the nitrogen atom.
  • Compound (Id) in an inert solvent is preferably 2-4 equivalents of lithium aluminum hydride, aluminum diisopropyl hydride, and preferably diisopropyl hydride.
  • the compound (ie) can be obtained by treating for 10 minutes to 24 hours, preferably for 1 to 3 hours in the presence of a reducing agent such as aluminum salt.
  • inert solvent for example, dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, dichloroethane, benzene, tonolen, xylene, tetrahydrofuran, getyl ether, etc. can be used alone or in combination.
  • dichloromethane or toluene is used.
  • Compound (Id) in an inert solvent usually at a temperature between 0 ° C and the boiling point of the solvent used in the reaction, preferably at a temperature between room temperature and 100 ° C, from 1 equivalent to a large excess of the appropriate salt Compound (If) can be obtained by treating for 1 to 48 hours, preferably 1 to 3 hours in the presence of a group.
  • Suitable bases include, for example, sodium hydroxide, lithium hydroxide, calcium hydroxide, calcium carbonate, cesium carbonate, sodium methoxide, and the like, and preferred.
  • the inert solvent include water, tetrahydrofuran, acetyl ether, methanol, ethanol, ethanol, ethanol, dichloromethane, dichloroethane, benzene, tonylene, xylene, and the like. They can be used alone or as a mixture, and preferably, tetrahydrofuran or methanol, or a mixed solvent thereof with water is used. From compound (I-c), compound (I-h) can be produced from compound (I-g) by the following method.
  • alkyl in trialkylsilyltrialkyltin has the same meaning as the above lower alkyl.
  • Examples of aluminum metal include sodium and potassium.
  • Compound (I-g) is dissolved in an inert solvent at a temperature between 0 ° C and the boiling point of the solvent used in the reaction, preferably at a temperature between room temperature and 200 ° C, from 1 equivalent to a large excess, preferably 2 to 4 equivalents of TN 3 (where T is as defined above) and usually from catalyst to large excess to accelerate the reaction, preferably 0.5 to 2 equivalents of a suitable additive
  • the compound (I-h) can be obtained by reacting for 1 to 200 hours, preferably 3 to 48 hours in the presence of.
  • Suitable additives include, for example, silicon tetrachloride, lithium chloride, aluminum chloride, ammonium chloride, trialkyltin chloride, dialkyltin oxide, trialkylaluminum, triethylamine hydrochloride, Lietylamine.
  • Examples include hydrobromide, sodium hydride, potassium tert-ptoxide, sodium hydroxide, zinc bromide, and the like, preferably ammonium chloride, dialkyltin oxide, and the like.
  • inert solvent examples include water, acetonitrile, dimethylformamide, dimethylacetamide, N-methyl-2-pyrrolidone, dimethylsulfoxide, acetic acid, glacial acetic acid, tetrahydrofuran, benzene , Toluene, xylene and the like can be used alone or as a mixture, and dimethylformamide or toluene is preferably used.
  • R 18 is a substituted or unsubstituted lower alkyl.
  • Q represents an alkali metal or an alkaline earth metal
  • p represents 1 if Q is an alkali metal
  • p represents 2 if Q is an alkaline earth metal.
  • the alkali metal is synonymous with the alkali metal, and examples of the alkaline earth metal include magnesium and calcium.
  • inert solvent for example, dimethylacetamide, N-methyl-2-pyrrolidone, dimethylsulfoxide and the like can be used alone or in combination, and preferably dimethylsulfoxide is used.
  • Compound (I-j) can be produced from compound (I-c) by the method shown below.
  • Compound (I_c) is prepared in an inert solvent at a temperature between 0 ° C and the boiling point of the solvent used in the reaction, preferably at a temperature between 30 ° C and 80 ° C, from 1 equivalent to a large excess, preferably In the presence of 1 to 8 equivalents of R 7a SH (wherein R 7a is as defined above) and 1 to 3 equivalents, preferably 1 to 3 equivalents of a suitable base, for 1 to 100 hours, preferably 3 to Compound (Ij) can be obtained by reacting for ⁇ 72 hours.
  • Suitable bases include, for example, triethylamine, diisopropylethylamine, pyridine, N-methylmorpholine, potassium carbonate, sodium hydride, calcium hydride, calcium hydride, diisopropylethyl.
  • Amine, 1,8-diazabicyclo [5.4.0] indene-7-ene and the like can be used, and among them, 1,8-diazabicyclo [5.4.0] indene-7-ene is preferable.
  • inert solvent for example, dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, dichloroethane, benzene, toluene, xylene, ethyl acetate, dimethylinolacetamide, N-methyl-2-pyrrolidone, dimethyl sulfoxide, etc. are used alone. Or a mixture thereof, and preferably a form of black mouth is used.
  • Compound (1-1) can be produced from compound (I-k) in compound (I-j) by the following method.
  • Compound (1-1) can be produced by performing the same reaction as in step 6 of production method 5 using compound (I-k).
  • Compound (Im) can be produced from compound (i-i) by the method shown below.
  • R 2 , R 3 , R 4 , R 18 , n, X, and Y are each as defined above).
  • Compound (I-in) can be produced by performing the same reaction as in Step 6 of Production Method 5 using compound (I-i).
  • Compound (I-n) can be produced from compound (I-m) by the following method.
  • R 7c represents a group obtained by removing hydrogen from the definition of R 7 above
  • Suitable bases include, for example, lithium carbonate, sodium hydride, lithium hydride, calcium hydride, lower alkyl lithium, etc., and preferably sodium hydride, hydrogen hydride, etc. Is mentioned.
  • the inert solvent include dichloromethane, chloroform, tetrachloride carbon, dichloroethane, benzene, toluene, xylene, ethyl acetate, dimethylinolenolemamide, dimethylacetoamide, and ⁇ -methinole-2.
  • -Pyrrolidone, tetrahydrofuran, getinoleether and the like can be used alone or as a mixture, and chloroform is preferably used.
  • Compound (I-ma) is prepared in an inert solvent at a temperature between 0 ° C and the boiling point of the solvent used in the reaction, preferably at a temperature between room temperature and 60 ° C, from 1 equivalent to a large excess, preferably
  • the compound (I-o) can be obtained by treating in the presence of 3 to 6 equivalents of an appropriate oxidizing agent for 1 to 48 hours, preferably for 3 to 24 hours.
  • Suitable oxidizing agents include, for example, manganese dioxide, chromic acid, pyridinum chromate, pyridinium chromate, potassium permanganate, sulfur trioxide, monopyridine, oxone And the like, and preferably manganese dioxide.
  • Inert solvents include, for example, dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, dichloroethane, benzene, toluene, xylene, ethyl acetate, acetic acid, propionic acid, butyric acid, trifluoroacetic acid, water, Use pyrimidine, dimethinolehonoremamide, dimethylacetamide, N-methyl-2-pyrrolidone, 1,4-dioxane, tetrahydrofuran, getinoleatenole, etc. alone or in combination It is possible to use dimethylformamide, tetrahydrofuran, or the like.
  • Compound (I-P) can be produced from compound (.) By the following method.
  • Compound (1-0) was heated in an inert solvent at a temperature between 0 ° C and the boiling point of the solvent used in the reaction. , Preferably at a temperature between room temperature and 90 ° C, from 1 equivalent to a large excess, preferably 1 to 3 equivalents of hydroxylamin or its hydrochloride, sulfate, paratoluenesulfonate, etc. -Phenylcarbamylhydroxylamin or its hydrochloride, sulfate, paratoluenesulfonate, etc., or N-hydroxybenzamide, preferably hydroxylamine, for 1 to 48 hours, preferably 3 to 48 hours Compound -P) can be obtained by reacting for 24 hours. If necessary, 1 equivalent to a large excess, preferably 1 to 3 equivalents of a suitable dehydrating agent, or 1 equivalent to a large excess, preferably 2 to 6 equivalents of a suitable base, or microwaves Irradiation may be performed.
  • Suitable dehydrating agents include, for example, acetic anhydride, phthalic anhydride, sodium hydrogensulfate, oxone, sodium formate, dialkyltin oxide, alumina, silica gel, sodium acetate, formamide , Pentoxide, iron (111) chloride, formic acid, acetic acid, propionic acid, oxychlorinated phosphorus, paratoluenesulfonic acid, etc., preferably acetic anhydride, phthalic anhydride, etc. .
  • Suitable bases include, for example, triethylamine, pyridine, sodium hydride, hydrogen hydride, and the like, and preferably triethylamine or pyridine.
  • Inert solvents include, for example, dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, dichloroethane, benzene, tonolene, xylene, nitrobenzene, acetonitrile, ethyl acetate, acetic acid, propionic acid, butyric acid, and triic acid.
  • Compound (I-q) can be produced from compound (I-p) by the following method.
  • Compound (I-q) can be produced by performing the same reaction as in step 7 of Production method 6 using compound (I- ⁇ ).
  • Compound (I-r) can be produced from compound (I-c) by the following method.
  • R 2 , RR 4 , R 5b , R 6b , R 8 , U, n, X and Y are as defined above, and Q a represents an alkali metal as defined above
  • Inert solvents include, for example, dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, dichloroethane, benzene, tonolen, xylene, dimethinolehonolemamide, dimethylacetamide, N-methyl-2-pyrrolidone, 1,4-Dioxane, Te Trahi Drofuran or the like can be used alone or as a mixture, and dimethylformamide or the like is preferably used.
  • Compound (Is) can be produced from compound (tri) by the following method.
  • R 2 , RRT, n, X and Y are each as defined above).
  • Compound (I-s) can be produced by performing the same reaction as in step 7 of Production method 6 using compound (I-r).
  • Compound (I-t) can be produced from compound (tri) by the method shown below.
  • Compound (I ⁇ ) can be produced by performing the same reaction as in Step 6 of Production method 5 using compound (Ir).
  • Compound (Iu) can be produced from compound (Illb) by the following method.
  • R 2, R 3, R 4, R 5, R 6, R 5b, R 6b, R 7c, R 8, R 9, R 10, R u, R 18, Q, p, U, X And Y are as defined above.
  • Compound (V) can be produced by performing the same reaction as in step 8 of production method 7 using compound (Illb).
  • Compound (VI) can be produced by performing the same reaction as in step 6 of production method 5 using compound (V).
  • Compound (VII) can be produced by performing the same reaction as in step 13 of production method 12 using compound (VI). ⁇ Step 2 2>
  • Compound (VII) in an inert solvent usually at a temperature between 0 ° C and 80 ° C, 2-4 equivalents of silver nitrate, silver oxide (1), silver oxide (11), chromic acid, chlorochromic acid Pyridinium, pyridinium dichromate, potassium permanganate, sodium periodate, sodium perchlorate, hydrogen peroxide, sodium chlorite
  • the compound (VI II) is prepared by treating the mixture in the presence of an oxidizing agent such as, for example, silver nitrate or sodium perchlorate for 10 minutes to 24 hours, preferably for 1 to 4 hours. be able to. If necessary, add 0.1 to 4 equivalents of organic substances such as acetic acid or inorganic substances such as sulfuric acid, sodium dihydrogen phosphate, sulfamine phosphorus, and lutemium oxide as additives. You may.
  • inert solvents examples include getyl ether, tetrahydrofuran, 1,4-dioxane, dimethylformamide, dimethylacetamide, dimethylsulfoxide, benzene, toluene / xylene, dichloromethane. And chlorophonolem, 1,2-dichloroethane, acetonitrile, ethyl acetate, methinole acetate, methylethyl ketone, hydrochloric acid, acetic acid, acetic anhydride, sulfuric acid, water, etc., and preferably acetonitrile, Water and the like can be mentioned, and these can be used alone or as a mixture.
  • the compound (VIII) is reacted with 1 to 20 equivalents of a halogenating agent for 10 minutes to 24 hours in an inert solvent, usually at a temperature between 0 ° C and 80 ° C, preferably at room temperature, and then 1 equivalent Compound (IX) can be produced by reacting with a large excess of R ⁇ OH (wherein R 7 is as defined above).
  • halogenating agent examples include thiol chloride, oxalyl chloride, and oxylin chloride, and preferably include thionyl chloride.
  • examples of the inert solvent include dichloromethane, black form, tetrahydrofuran, dimethylformamide, dimethylacetamide, 1,4-dioxane, acetonitrile, benzene, toluene, and the like. Xylene and the like can be mentioned, and these can be used alone or as a mixture.
  • the inert solvent preferably dimethlomethane is used.
  • Compound (IX) is used to carry out the same reaction as in Step 2 of Production Method 1 Compound (X) can be produced.
  • Compound (XI) can be produced by performing the same reaction as in step 3 of production method 2 using compound (X).
  • Compound (I-u) can be produced by performing the same reaction as in step 1 of production method 1 using compound (XI).
  • Compound (I-v) can be produced from compound (I-u) by the following method.
  • Compound (I-v) can be produced by performing the same reaction as in Step 6 of Production Method 5 using compound (I-u).
  • Compound (I-w) can be produced from compound (I-V) by the following method.
  • the compound (IV) is reacted with 1 to 20 equivalents of a halogenating agent for 10 minutes to 24 hours in an inert solvent, usually at a temperature between 0 ° C and 80, preferably at room temperature, and then 1 equivalent
  • the compound (Iw) can be produced by reacting with a large excess of R 5a R 6a NH (wherein R 5a and R 6a have the same meanings as described above). If necessary, one equivalent to a large excess of a suitable base may be added.
  • Examples of the mouth-forming agent include thionyl chloride, oxalyl chloride, and oxylin chloride, and preferably thionyl chloride.
  • Suitable bases include, for example, pyridine, triethylamine, diisopropylaminoethylamine, N-methylmorpholine and the like, preferably triethylamine.
  • Examples of the inert solvent include dichloromethane, chloroform, tetrahydrofuran, dimethylformamide, dimethylacetamide, 1,4-dioxane, acetonitrile, benzene, toluene and xylene. These can be used alone or as a mixture. As the inert solvent, preferably methane is used.
  • the compound (I- W ) In the production of the compound (I- W ), a technique commonly used in peptide chemistry can be used. That is, in an inert solvent of compound (Iv), 0.5 to 10 equivalents of an appropriate condensing agent and 1 to 10 equivalents of R 5a R 6a NH (wherein R 5a and K 6a are each as defined above)
  • the compound (Iw) can be obtained usually by reacting at a temperature between 0 ° C and 50 ° C for 10 minutes to 70 hours.
  • inert solvent examples include getyl ether, tetrahydrofuran, 1,4-dioxane, dimethylformamide, dimethylacetamide, dimethylsnoleoxide, benzene, tonolene, xylene, acetonitrinole, and acetic acid. Jet And tetrachlorofuran, dimethylformamide and the like, and preferably, tetrahydrofuran, dimethylformamide and the like.
  • Suitable condensing agents include, for example, 1,3-dicyclohexylcarbodiimide, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carposimid hydrochloride, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) Pill resin-bonded polystyrene resin (EDC resin).
  • EDC resin Diethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) Pill resin-bonded polystyrene resin
  • N-hydroxysuccinic acid imide, 3,4-dihydroxy-13-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazine, 1-hydroxybenzotriazole and the like are preferable. Additives such as 1-hydroxybenzotriazole can also be added.
  • EDC resin can be produced by the method described in Tetrahedron Letters, Vol. 34, No. 48, p. 7685 (1993).
  • Compound (I-y) can be produced from compound (I-X) in compound (I) by the following method.
  • R 22 and R 23 are the same or different and are hydrogen, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted Represents a substituted cycloalkyl, a substituted or unsubstituted lower alkenyl, a substituted or unsubstituted lower alkynyl, a substituted or unsubstituted aralkyl, or a substituted or unsubstituted heterocyclic alkyl.
  • lower alkyl, cycloalkyl, lower alkenyl, lower alkynyl, aralkyl, and heterocyclic alkyl have the same meanings as described above, and their substituents have the same meanings as described above.
  • Step 2 9 A compound ( ⁇ - ⁇ ) in an inert solvent in an amount of 1 equivalent to a large excess, preferably ⁇ to ⁇ equivalent of 2 R 23 C0 (wherein K 22 and R 23 are as defined above), In the presence of 1 equivalent to a large excess, preferably 1 to 3 equivalents of a suitable reducing agent, usually at a temperature between -78 ° C and 100 ° C, preferably at a temperature between 0 ° C and 50.
  • the compound (Iy) can be obtained by reacting for from minutes to 48 hours.
  • Suitable reducing agents include, for example, sodium borohydride, sodium triacetoxyborohydride, sodium cyanoborohydride, and preferably sodium cyanoborohydride. Is mentioned.
  • a catalyst amount to a solvent amount preferably 0.5 equivalent to a solvent amount, may be added to a suitable acid.
  • suitable acids include, for example, formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, propionic acid, hydrochloric acid and the like, and preferably acetic acid.
  • Inert solvents include, for example, dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, dichloroethane, benzene, tonolene, xylene, ethynoleate, 1,4-dioxane, dimethylformamide, dimethylacetamide, a
  • Examples include, for example, cetonitrile, hexane, formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, propionic acid, and hydrochloric acid, which can be used alone or in combination.
  • tetrahydrofuran, acetic acid and the like are mentioned.
  • the conversion of each functional group and the conversion of the functional group contained in the substituents in the compound (I) and the parent compound can be performed by a known method [for example, a comprehensive transgenic method].
  • John's Daini / jR Comprehensive Organic l'rans format ions, sec edit edit on), R.C., Larock, John * Pilly Lee 'And' Sands' The method described in Incorporated (John Wiley & Sons Inc.) (1999)] can also be used.
  • the compound (I) having a desired functional group at a desired position can be obtained by appropriately combining and carrying out the above methods.
  • the isolation and purification of the intermediate product in the above-mentioned production method is carried out by appropriately combining the methods used in ordinary organic synthesis, for example, filtration, extraction, washing, drying, concentration, crystallization, seed chromatography, etc. Can be done. Further, purification can be performed by a purification method commonly used in a general parallel synthesis method, for example, a purification method using a scavenger resin or an ion exchange resin. Also smells intermediate Alternatively, it can be subjected to the next reaction without purification.
  • the compounds (I) may exist as isomers such as positional isomers, geometric isomers, optical isomers or tautomers, and all possible isomers including these are included. Mixtures of the isomers in any ratio are encompassed by the present invention.
  • the compound (I) may be purified as it is when a salt of compound (I) is obtained, and when compound (I) is obtained in a free form, compound (I) May be dissolved or suspended in an appropriate solvent, and an acid or a base may be added thereto for isolation and purification.
  • the compound (I) or a pharmacologically acceptable salt thereof may be present in the form of an adduct with water or various solvents, and these adducts are also included in the present invention.
  • the compound having antipruritic activity is
  • Examples of mammals other than the above-mentioned humans include mice and the like, and the destructive behavior refers to the behavior in which the animal pushes its body with its hind limbs. More specific examples of the Starchy Jung method for the treatment of pruritus include, for example, the method described in Test Example 2 below.
  • ⁇ _ is. CH 3 MS m / z 524 (M + H) +
  • FIG. 1 shows the inhibitory effect of Compound 1 (oral administration) on SPC-induced pruritus.
  • the symbols (# #, **) represent the following meanings, respectively.
  • FIG. 2 shows the inhibitory effect of compound 3 (oral administration) on SPC-induced pruritus.
  • the symbols (# #, **) represent the following meanings, respectively.
  • Test example 1 GPR4 antagonism 10 5 cells per 1 ⁇ l of the GPR4 ats cells obtained in Reference Example 5 (the ats cells express GPR4 upon stimulation with 17
  • the activity (antagonism) of the test compound was expressed by the inhibition rate calculated based on the counts (count per second) with and without addition of 17] 3-estradiol as shown in the following formula. IC 5.
  • the value was calculated from the inhibition rate by the linear approximation analysis of the Logit-Log conversion method.
  • A, B, and C represent the following meanings, respectively.
  • mice After subcutaneously administering SPC (50 ⁇ g / site) to the back of a ddY male mouse (3 to 4 weeks old) (SPC administration group), the mouse was transferred to an ataryl observation cage (7.5 X 7.5 X). 15 cm), and the behavior of the mouse was photographed using a video camera for 60 minutes in an unmanned environment. The video was regenerated, and the number of hind limb breaking actions (scratching behav ior) was visually counted.
  • the negative control group saline-administered group received saline (0.1 tnL / site) instead of SPC.
  • each of Compound 1 and Compound 3 300 mg / kg was suspended in an ice solution of 0.5 weight / volume (w / v)% methylcellulose (MC), and the SPC was administered for 1 hour. Oral administration before.
  • a 0.5 w / v% MC aqueous solution (10 mL / kg) was orally administered 1 hour before administration of the SPC and the physiological saline, respectively.
  • the test was performed with 10 animals per group.
  • the inhibition rate of the SPC-induced breaking action by the compound was determined by the following formula.
  • a and B represent the following meanings, respectively.
  • ddY mice (4 weeks old) Compound 48/80 (10 ⁇ g / site) was subcutaneously administered to the back (Compound 48 / ⁇ 0 administration group), and the mice were then placed in an Acryl observation cage (7.5 x 7.5 x 15). cm), and the behavior of the mouse was photographed using a video camera for 60 minutes in an unmanned state. The video was played and the number of scratching behaviors by the hind limbs was visually counted. In the negative control group (saline administration group), saline (0.1 mL / site) was administered instead of Compound 48/80.
  • Compound 1 and Compound 3 were suspended in a 0.5 w / vttC aqueous solution, respectively, and orally administered before Compound 48/80 administration 1 B Terama.
  • a 0.5 w / v% MC aqueous solution was orally administered 1 hour before the administration of Compound 48/80 and the physiological saline solution, respectively.
  • the test was performed with 10 animals in each group.
  • the inhibition rate of compound 48 / 80-induced rupture behavior by the compound was determined by the following formula.
  • the number of rupture behaviors in the group treated with Compound 48/80 was 35, which was higher than the number of rupture behaviors in the negative control group (7).
  • the number of rupture behaviors of the compound 1 administration group was 16 times, and the number of rupture behaviors of the compound 48/80 administration group was reduced by 54% in the compound 1 administration group.
  • the number of rupture behaviors in the group treated with Compound 48/80 was 54, which was higher than that in the negative control group (13).
  • the number of rupture behaviors of the compound 3 administration group was 26 times, and the number of rupture behaviors of the compound 48/80 administration group was suppressed by 52% in the compound 3 administration group.
  • Test Example 4 Effect on pruritus in hapten repeated application chronic dermatitis model
  • the hapten repeated application chronic dermatitis model was prepared by the method of Kitagaki et al., “Journal of Investigative Dermatology,” Vol. 105, pp. 749—755 (1995 Year) ”with some modifications.
  • oxazolone manufactured by Sigma-Aldrich
  • acetone manufactured by Kanto Chemical Co., Ltd.
  • An oxazolone-acetone solution (antigen solution) was used.
  • 10 L of the antigen solution was applied to the shaved rostral back of a BALB / c male mouse ( 6 weeks old) to sensitize the mouse, and after 7 days (day 0), 10 / XL antigen solution was applied to the same site. was repeatedly applied for 2 or 3 days until day 16 to create a chronic dermatitis model.
  • Compound 1 was suspended in a 0.5 w / v% MC aqueous solution at a concentration of 10 and 30 mg / mL, respectively, and orally administered at 10 mL / kg one hour before application of the antigen solution on day 16.
  • a control group was also prepared in which only a 0.5 w / v% MC aqueous solution was orally administered.
  • mice on Day 16 An analysis of the pruritic response of mice on Day 16 was carried out using a method described in Kuraishi et al.'S method, "Ichiguchi Bian. Sheena nanole * off 'Fugyo'-Makonichi (European Journal of Pharmacology), Vol. Modified.
  • mice For adapting the mouse to a new environment, and allowed to stand for one hour in a cage for acrylic observation (7 .5 x 8 X 15 cm ). Immediately after the antigen solution was applied to the rostral back (Dayl6), it was returned to the cage, and the behavior was photographed in an unmanned environment using an 8 mm video camera recorder. Video playback was used to observe the rupture behavior for 1 hour after application of the antigen solution. The number of rupture behaviors of the hind limb to and around the application site was counted. The mice exhibited several very fast continuous crushing actions per second, and this series of actions was regarded as one crushing action.
  • the number of rupture behaviors for the compound 1 administration group was 138 ⁇ 33 (mean soil standard error) at 100 mg / kg and 2 ⁇ 1 at 300 mg / kg, and the number of rupture behaviors for the control group (264 ⁇ 29) (**: P ⁇ 0.01, ***: P ⁇ 0.001, Dunnett test).
  • Test Example 5 Analysis of GPR4 mRNA expression in mouse skin and dorsal root ganglion (DRG)
  • GPR4 mRNA in mouse skin and dorsal root ganglion was performed by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) using the fj method. The following genetic experiments were performed using molecular cloning (Molecular Cloning). ).
  • Primers corresponding to the nucleotide sequence were set and synthesized (Invito Jidone).
  • cDNA was prepared from SUPERSCRIPT Preampli cation System (Invitrogen) according to the manual.
  • Re trasncriptase was used as a negative control to confirm the contamination of the genome.
  • GPR4 Since GPR4 is expressed in the skin, substances that suppress the function related to signal transduction of a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 include keratotic skin disease, psoriasis group (psoriasis vulgaris, pustular psoriasis) , Psoriatic erythroderma, psoriatic arthritis), ichthyosis group (ichthyosis vulgaris, vesicular congenital ichthyosis erythroderma, non-vesicular congenital ichthyosis erythroderma), hoof keratosis Pityriasis piliforma / erythematous keratosis, Darie's disease, palmar pustulosis, oral leukoplakia, oral papilloma, oral lichen planus, amyloid lichen, pemphigus group, pemphigus It is suggested that it is useful as a therapeutic agent for
  • GPR4 is expressed in DRG
  • a substance that suppresses the signal transduction function of the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 may be used postoperatively or It is suggested that it is also useful as a therapeutic agent for cancer pain, headache, toothache, menstrual pain, ear pain, sore throat, trauma pain, symptomatic neuralgia and the like.
  • the medicament according to the present invention comprises a nitrogen-containing tricyclic compound represented by the formula (I) or a quaternary ammonium salt thereof or a pharmacologically acceptable salt thereof, and a hydrate and a solvate thereof. It is characterized by containing a substance selected from the group as an active ingredient.
  • the above-mentioned substance as an active ingredient may be administered as it is, but generally, it contains the above-mentioned substance as an active ingredient and one or more pharmaceutical additives. It is desirable to administer it in the form of a pharmaceutical composition.
  • Such a pharmaceutical composition can be produced according to a method known or commonly used in the field of pharmacology itself.
  • the medicament according to the present invention in the form of a pharmaceutical composition may contain one or more active ingredients of another medicament.
  • the medicament of the present invention is applicable to mammals including human.
  • the administration route of the medicament of the present invention is not particularly limited, and the most effective administration route for treatment and / or prevention can be appropriately selected from either oral administration or parenteral administration such as intravenous administration. it can.
  • Examples of formulations suitable for oral administration include, for example, tablets and the like, and examples of formulations suitable for parenteral administration include, for example, injections.
  • excipients such as lactose and mannite
  • disintegrants such as starch
  • lubricants such as magnesium stearate
  • binders such as hydroxypropyl cellulose
  • fatty acid esters A surfactant such as glycerin can be used.
  • preparations suitable for parenteral administration can be prepared preferably using an aqueous medium isotonic with human blood.
  • injection The agent can be prepared as a solution, suspension, or dispersion using an aqueous medium selected from a salt solution, a pudose solution, a mixture of salt water and a glucose solution, and the like, with appropriate auxiliaries according to a conventional method. it can.
  • parenteral preparations for example, one or more selected from diluents, flavors, preservatives, excipients, disintegrants, lubricants, binders, surfactants, plasticizers, etc. Can also be used.
  • the dose and frequency of administration of the medicament of the present invention are not particularly limited, and the kind, administration route, treatment and Z or prevention purpose of the active ingredient, age and weight of the patient, nature and severity of symptoms It can be appropriately selected according to various conditions such as. For example, it is preferable to administer 0.1 to 100 mgZ kg per adult daily in 3 to 4 divided doses. However, these dosages and the number of administrations vary depending on the various conditions described above.
  • JP-A-7 61983 2 _ (2 Echiru 5, 7-dimethyl-3 H- I Mi Dazo [4, 5-b] pyridinium Jin one 3- Irumechiru) one 10, 1 1-dihydrazide mud over 5H —Dibenzo
  • [b, f] azepine (30.0 g, 78.4 mmol) was dissolved in a mixed solvent of chloroform (300 mL) and acetic acid (300 mL), and 1-methylbiperazine (23.6 g, 236 mmol) and formaldehyde (37% aqueous solution, 7.64 g, 94.1 mmol) were added, heated to 60 ° C and stirred for 18 hours. After confirming the progress of the reaction by thin-layer chromatography, a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution was added under ice cooling, and the mixture was extracted with ethyl acetate.
  • Example 2 Compound 2 ⁇ 2- (2-ethyl-5,7-dimethyl-3H-imidazo [4,5-b] pyridin-13-ylmethyl) -18- (1,2,5,6-tetra) Synthesis of hydropyridin-1- (1-methyl) -1-10,11-dihydro-5H-dibenzo [b, f] ylzepin ⁇
  • Example 3 Compound 3 ⁇ 2- (2-Ethyl-5,7-dimethyl-3H-imidazo [4,5-b] Synthesis of pyridin-3-ylmethyl) 8_ (pyrrolidine-1-ylmethyl) —10,11-dihydro-5H-dibenzo [b, f] azepine ⁇
  • [b, f] Azepin (19 mg, 0.050 mmol) was dissolved in a mixed solvent of a click Rorohonoremu (0.30 mL) and ft acid (0.30 mL), corresponding R 6 NH click throat Holm solution (lO mol / L , 0.15 tiiL) and formaldehyde (37% aqueous solution, 0.005 mL) were added. Heated to C and stirred for 20 hours. After confirming the progress of the reaction by thin-layer chromatography, the solvent was distilled off, and the residue was dissolved in lip-mouth form and washed twice with water.
  • Example 6 Compound 1 3 ⁇ 8- (2-ethyl-5,7-dimethyl-3H-imidazo [4,5-b] pyridin-1-3-ylmethyl) -1 10,11 dihydro-1 Synthesis of 5H-dibenzo [b, f] azepine-2-ylmethyl] -1-methylpidinidine Dissolve Compound 3 (11.4 g, 24.5 mmol) obtained in Example 3 in dichloromethane (200 mL) Then, methyl iodide (1.98 mL, 31.8 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 10 hours.
  • Example 9 Compound 16 6 ⁇ 1— [8- ( 2 Echiru 5, 7 - dimethyl 3 H- Imidazo [4, 5-b] pyridinium Jin one 3- Irumechiru) one 10, 11- dihydric chondroitinase 5H- dibenzo [b, f] Azepin one 2- Inoremechinore] Piperi Jin Of 4-Ethyl olevonic acid ester ⁇
  • Example 10 Compound 17 7 2- (N- [8- (2-ethyl-5,7-dimethinoley 3H-imidazo [4,5-b ] Pyridin-3- (inomethyl) -1 10,11-dihydro 51-1-dibenzo [b, f] azepine-12-inolemethinole] -1-N-methylamino) ethanol Synthesis of aluminum hydride Lithium (15.7 mg, 0.38 mmol) was suspended in tetrahydrofuran (0.3 mL) and dissolved in tetrahydrofuran (0.9 mL) with stirring under ice-cooling.
  • Done Objects 1 5 (126 mg, 0.253 mmol) and the mixture was stirred for 1.5 hours at room temperature. After confirming the progress of the reaction by thin-layer chromatography, water (0.016 mL), a 2 mol / L aqueous sodium hydroxide solution (0.016 mL), and water (0.048 mL) were sequentially added dropwise with stirring. The precipitate was filtered, and the residue obtained by concentrating the filtrate was purified by NH-silica gel chromatography (elution solvent: ethyl acetate) to obtain Compound 17 (47.6 mg, 0.101 mmol, yield 40%). Got.
  • Example 11 1 Compound 18 ⁇ 1 1- [8- (2-Ethyl-5,7-dimethyl-3H-imidazo [4,5-b] pyridine-13-ylmethyl) -1 10,11-Dihydrochloride 1-5H-Dibenzo Synthesis of [b, f] azepine-12-ylmethyl] pyridine-14-yl ⁇ methanol> Compound 16 was used in place of compound 15 in the same manner as in Example 10, yield 50%. Thus, compound 18 was obtained.
  • Example 13 Compound 20 0 ⁇ 1— [8— (2-ethyl-5,7-dimethyl-3H—imidazo [4,5-b] pyridine ” One 3-irmethyl) one 10, 11-dihydro_5H-dibenzo
  • Example 14 Compound 21 (N- [8- (2-ethyl-5,7-dimethyl-3H-imidazo) [4,5-b] pyridin-3-ylmethyl) -1,10-dihydro-5H-dibenzo [b, f] azepine-12-ylmethyl] -1-N-methylaminoacetonitrile> Synthesis of
  • Example 15 Compound 22 (N — [8— (2-Ethyl-5,7-dimethyl-3H-imidazo [4,5-b] pyridin-3-ylmethyl) -1,10-dihydro-5H-dibenzo Synthesis of [b, f] azepine-12-ylmethyl] -1-N— [2- (pyrrolidine-1-yl) ethyl] amine / 2 fumarate ⁇
  • reaction solution was cooled to room temperature, sodium triacetoxyborohydride (464 mg, 2.19 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 12 hours.
  • Ethyl acetate and a 1 mol / L aqueous sodium hydroxide solution were added to the reaction solution, and the organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate.
  • Example 16 Compound 2 3 ⁇ N— [8— (2-ethyl-5,7-dimethyl-3H-imidazo [4,5-b] pyridin-1-ylmethyl) 10,11 dihydro 5H-dibenzo [b, f] azepine Synthesis of 2-ylmethyl] —N— (2-methoxethyl) amine monofumarate
  • Example 17 Compound 24 4 2— ⁇ [8- (2-ethyl-5,7— Dimethyl-3H-imidazo [4,5-b] pyridin-3-inolemethyl) -1 10,11 dihydro 5H-dibenzo [b, f] azepine-1-2-ylmethyl: ⁇ aminoethanol 0.5 fumaric acid Salt> 2 using 2-ethanol Amin instead of (pyro lysine one 1 one I le) Echiruami down, in the same manner as in Step 2 of Example 1 5, in 39% yield 2- ⁇ [8 - (2 —Ethyl-5,7_Dimethyl-3H—Imidazo [4,5-b] pyridin-13-ylmethyl) -1 10,11 Dihydro-1-5H—Dibenzo [b, f] azepine-12-ylmethyl] a Mino ethanol was obtained.
  • the compound 24 was obtained as a fumarate in the same manner as in Example 1.
  • Example 19 Compound 26 ⁇ N- [8- (2-ethyl-5,7-dimethyl-3H-imidazo [4,5-b] pyridin-3-ylmethyl) -1 10,11-dihydro) Synthesis of 5H-dibenzo [b, f] azepine-2-inolemethyl] —N-methyl-1-N_ (2H-tetorazol-5-ylmethyl) amine ⁇
  • the compound 13 (667 mg, 1.10 mmol) obtained in Example 6 was dissolved in chloroform (11 mL), and the N-methyl-N— (2-trityl-2H— Tetrazol-5-inolemethinole) amine (390 mg, 1.10 mmol) and triethylamine (0.31 mL, 2.3 mmol) were added, and the mixture was stirred at 60 ° C overnight.
  • the reaction solution was cooled to room temperature, saturated aqueous sodium bicarbonate was added, and the mixture was extracted three times with chloroform. The organic layers were combined, washed with brine, dried over anhydrous magnesium sulfate, and concentrated.
  • Example 20 Compound 2 7 ⁇ 2- (2-Ethyl-5,7-dimethyl-3H-imidazo [4,5-b] pyridin-3-ylmethyl) -1-8- [4- (2H-tetrazol-5-yl) -piperidin-1 Synthesis of 1-ylmethyl] -1 10,11-dihydro_5H-dibenzo [b, f] T-zepin ⁇
  • Yo-Ii-Dani (10,11-dihidro 5H-dibenzo [b, f] azepine-12-ylmethyl) -11-methylbiperidinidine (0.015 g, 0.050 mmol) was dissolved in dimethylformamide (0.50 mL).
  • a solution of the corresponding YH (wherein Y is as defined above) in chloroform (1.0 mmol / L, 0.060 mL) and lithium hydroxide monohydrate (0.070 g) were added, and the mixture was added at room temperature for 20 minutes. Stirred for hours.
  • Example 22 Compound 1 2 5 ⁇ [8- (2-ethyl-5,7-dimethyl-3H-imidazo [4,5-b] pyri) Synthesis of 5- (methyl-3-methyl) -1,5-methyl-10,11-dihydro-5H-dibenzo [b, f] azepine-12-yl] acetic acid ⁇
  • Example 23 Compound 9 2 ⁇ acetic acid [8- (2-ethyl-5,7-dimethyl) — Synthesis of 3H-imidazo [4,5-b] pyridin-3- (inolemethyl) -1,10,11-dihydro 5H-dibenzo [b, f] azepine-12-ylmethyl] ester ⁇
  • Example 24 Compound 93 3 [[8— (2-ethyl-5,7-dimethyl-3H-imidazo [4,5-b] pyridin-3-ylmethyl) -1-10,11 dihidro 5H-dibenzo [b, f] azepine-1-2-inole Methanol synthesis
  • Example 2 3 compound obtained in 9 2 (2.79 g, 6.14 mmol ) was suspended in Tetorahi mud furan (6 1 mL), diisocyanato Li Umume Tokishido / methanol solution (28%, 6.2 mL, 31 mmol) and In addition, the mixture was stirred at room temperature for 3.5 hours. After confirming the progress of the reaction by thin-layer chromatography, water was added to the reaction solution, followed by stirring at room temperature for 0.5 hour. The precipitated crystals were collected by filtration, dried under reduced pressure, suspended in ethanol, stirred for 1 hour under reflux with heating, and further stirred for 1 hour at room temperature. The precipitated crystals were collected by filtration and dried under reduced pressure to obtain Compound 93 (2.04 g, 4.95 mmol, yield 81%).
  • Example 26 Compound 95 5 ⁇ 2-aryloxymethyl-8- (2-ethyl-1, 7-dimethinolee 3H Synthesis of —imidazo [4,5-b] pyridin-3- (inolemethyl) -1-10,11 dihidro 5H-dibenzo [b, f] azepine ⁇
  • Example 27 Compound 96 ⁇ 2- (2-Ethyl_5,7-dimethyl-3H-imidazo [4,5-b] pyridine Synthesis of 1-3-ylmethyl) -1-8- (2-methoxyethoxymethyl) 10,11-dihydro-5H-dibenzo [b, f] azepine ⁇
  • Example 30 Compound 9 9 ⁇ 2-benzyloxymethyl-8- (2-ethyl-5,7-dimethyl-1H-imi) Synthesis of Dazo [4,5-b] pyridin-3-ylmethyl) -1 10,11 dihydro 5H-dibenzo [b, f] azepine ⁇ Compound 99 was obtained in a yield of 78% in the same manner as in Example 25 except that benzyl alcohol was used instead of methanol.
  • Example 31 1 Compound 100 ⁇ 2- (2-ethyl-5,7-dimethyl-3H-imidazo [4,5-b] pyridin-3-inolemethinole) -18- (2-phenyl) Synthesis of 1,11-dihydro-5H-dibenzo [b, f] azepine ⁇
  • Compound 100 was obtained in a yield of 38% in the same manner as in Example 25 except that 2-phenylethanol was used instead of methanol.
  • Example 32 Compound 101 ⁇ 2— (2-ethyl-5,7-dimethyl-3H-imidazo [4, Synthesis of 5-b] pyridin-3-ylmethyl) -8- (pyridin-2-ylmethoxymethyl) -10,11-dihydro-15H-dibenzo [b, f] azepine ⁇
  • Compound 101 was obtained in a yield of 65% in the same manner as in Example 25 except that pyridin-2-ylmethanol was used instead of methanol.
  • Example 15 8- (2-Ethyl-5,7-dimethyl-3H-imidazo [4,5-b] pyridine_3-inoremethinole) -1,10-dihydro-1 obtained in Step 1 of 5 5H dibenzo [b, f] azepine-12-carboaldehyde (650 mg, 1.58 mmol) was suspended in acetonitrile (16 mL), and hydroxylamine hydrochloride (153 mg, 2.38 mmol) , Triethylamine (0.331 mL, 2.38 mmol) and phthalic anhydride (328 mg,
  • Example 3 7 Compound 10 6 ⁇ 2- (2-Ethyl_5,7_dimethyl-3H-imidazo [4,5-b] pyridin-3-ylmethyl) -1-8- (2H-tetrazol-5-lemethyl) -1 10,11-Dihidro 511 -Dibenzo [b, f] azepine ⁇ Synthesis
  • Example 36 Using compound 105 obtained in Example 36, compound 106 was obtained in a yield of 76% in the same manner as in the latter stage of Example 20.
  • Example 38 Compound 107 ⁇ [8- (2-Ethyl-5,7-dimethyl-3H-imidazo [4,5-b] pyridin-13-lemethyl) -1 10,11-dihydro 5H —Synthesis of dibenzo [b, f] azepine-1-yl] acetic acid ⁇
  • Example 39 Compound 108 ⁇ [8- (2-Ethyl-5,7-dimethyl-3H-imidazo [4,5-b] pyridin-3-ylmethyl) -1 10,11-dihydro-1 Synthesis of 5H-dibenzo [b, f] azepine-2-ylmethylsulfanyl] acetic acid methyl ester ⁇ Compound 13 (1.04 g, 1.71 mmol) obtained in Example 6 was added to a closed mouth form (17 mL).
  • acetic acid (10,11-dihydro_5H_dibenzo [b, f] azepine-12-inolemethinole) obtained in step 1 was suspended in methanol (110 mL).
  • a sodium methoxide / methanol solution (38%, 1.14 mL, 5.36 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour.
  • the reaction solution was concentrated, and a saturated saline solution and chloroform were added to the residue, and the mixture was extracted three times with chloroform.
  • the organic layers were combined, dried over anhydrous magnesium sulfate, and concentrated.
  • 1_ (8-ethoxycarbonyl 10,11 dihydro-5H
  • Example 42 Compound 11 1 ⁇ 8- (2-Ethyl-5,7-dimethyl-3H-imidazo [4,5-b] pyridine-13-ylmethyl) -1 10,11-dihydro-5H-dibenzo [b, f] azepine-2 Synthesis of rubonic acid
  • Example 43 Compound 111 2 [[8- (2-ethyl-5,7-dimethyl-3H-imidazo [4,5-b] pyri) Of 1,3-dihydro-5H-dibenzo [b, f] azepine-12-yl] (4-methylpiperazine-1-inole) methanone ⁇
  • Example 4 Compound 1 1 3 ⁇ [8— (2-Ethyl-5,7-dimethyl-3H-imidazo [4,5-b] pyridin-3-3-inoremethino) 1-10,11-dihydro-1 5H-dibenzo [b, f] azepine Synthesis of 2-yl] (pyrrolidine-1-yl) methanone
  • Example 4 5 Compound 1 1 4 ⁇ [8— (2-ethyl-5 , 7-Dimethyl-3H-imidazo [4,5-b] pyridin-3-ylmethyl-1-10,11 dihydro-5H-dibenzo [b, f] azepine-1-2-yl] (4-hydroxypiper Synthesis of dino) methanone
  • Example 46 Compound 1 15 ⁇ 8- (2-ethyl-5,7-dimethyl-3H-imidazo [4,5-b] pyridin_3-ylmethyl) -1 10,11 dihydro — Synthesis of 5H—dibenzo [b, f] azepine-1—2-carboxylic acid (2-hydroxyxethyl) amide
  • Example 47 Compound 1 16 ⁇ 8- (2-Ethyl-5,7-dimethyl-3H-imidazo) [4,5-b] Pyridin-3-ylmethyl) -1,10,11 dihydro-5H-dibenzo [b, f] azepine-1-2-carburonic acid [2- (pyrrolidine-1-1-) Le) ethyl] amide ⁇
  • Example 48 Compound 1 17 ⁇ [8— (2-ethyl-5,7-dimethyl-3H-imidazo [4 , 5-b] Pyridin-13-ylmethyl-1-10,11-dihydro 5H-dibenzo [b, f] azepine-12-yl] (morpholino) methanone ⁇
  • Example 49 Compound 1 18 ⁇ 8— (2-ethyl-5,7-dimethyl-3H-imidazo [ Synthesis of 4,5-b] pyridin-3-ylmethyl) -10,11 dihydro-5H-dibenzo [b, f] azepine-1-bis bis (2-hydroxyxetyl) amide
  • Example 52 Compound 1 2 1 ⁇ 1-1- [8- (2-ethyl-5,7-dimethyl-31-tomidazo [4,5-b] pyridine) Synthesis of 13-ylmethyl) -5-methyl-10,11 dihydro 5H dibenzo [b, f] azepine-12-ylmethyl] piperidine-14
  • Example 53 Compound 122 2 ⁇ 2- (2-Ethyl-5,7-dimethyl-3H-imidazo [4,5-b ] Pyridin-3- (inolemethyl) -1-5-methyl-8_ [4- (2H-tetrazo-l-5-yl) piperidinomethinole]-10,11-dihidro 5H-dibenzo [b, f] azepine ⁇ 1 Synthesis of hydrochloride ⁇
  • Example 54 Compound 1 2 3 ⁇ 1-one [8- (2-ethyl-5,7- Dimethyl-3H-midazo [4,5-b] pyridin-3-inolemethyl) _5-Methinolay 10, 11-Dihidro Synthesis of 5H-dibenzo [b, f] azepine-12-ylmethyl] piperidine-41-ylmethano
  • Example 5 1 obtained in 2 steps 1 [8- (2-Echiru -5, 7-dimethyl ⁇ 3 H - Lee Midazo [4, 5-b] pyridinium Jin one 3- Irumechiru) Single 5- methyl- 10,11-dihydroquinone 511-dibenzo [b, f] azepine-12-inolemethyl] pi-zin-vinyl-4-ethyl ether ester (0.61 g, 1.08 mmol) was added to dichloromethane (10 mL), cooled to -78 ° C and stirred.
  • Example 55 Compound 1 2 4 [2- (2-Ethyl-5,7-dimethyl-3H-imidazo [4,5-b] pyridin-1-3-ylmethyl) _5 Synthesis of —Methyl-8— (211-Tetrazol-5-yl) -1 10,11—Dihydro_5H—Dibenzo [b, f] azepine]
  • 2-tritinole 2H-tetrazole-5-inoremetanol nore (2.00 g, 5.84 mmol)
  • N-methinole 2_nitrobenzenesnolephone amide (1.64 g, 7.59 mmol)
  • triphenylinolephosphine (1.53 g, 5.84 mmol) was dissolved in a mixed solvent of tetrahydrofuran (30 mL) and toluene (20 mL), and a solution of acetyldiazolate in getyltoluene (40%, 2.65 mL, 5.84 mmol) was added. And stirred overnight.
  • pSV2bsr (manufactured by Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.) was digested with PvuII and EcoRI, and treated with Klenow to obtain a 2.6 kb PvuII (blunt-ended) 1 ⁇ RI (blunt-ended) fragment.
  • Gal4-ER chimeric gene [Cell, vol. 54, p. 199 (1988), Procedurals 'ob-the-national' academy 'ob' science 'op-the-united-de-step' ER a AF2 in pM (distributed by Prof. Shigeaki Kato of the University of Tokyo) containing 'America (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), Vol. 90, p. 1657 (1993)] After digestion with [Klenow], ill (blunt end) (blunt end) fragments were obtained.
  • Plasmid pGERbsrR2 was constructed by combining the S (blunt end) -EcoRI (blunt end) fragment from pSV2bsr and the ⁇ 11 (blunt end) -Ndel (blunt end) fragment from ERctAF2 in pM described above. did. pGERbsrR2 can express a chimeric protein (Gal4-ER) of the DNA binding domain of transcription factor Gal4p derived from yeast (Saccharomyces cerevisiae) and the ligand binding domain of estrogen receptor.
  • Gal4-ER chimeric protein
  • pcDNA3 (Invitrogen) was digested with Xhol and treated with Klenow to obtain an Xhol (flat end) fragment. By binding the fragments, pcDNA3 from which the first cleavage site was eliminated was constructed. The pcDNA3 from which the ⁇ I cleavage site had been eliminated was digested with, and treated with Klenow to obtain a (blunt-ended) fragment. By ligating the fragments, pcDNA3 from which and the cleavage site were eliminated was constructed. The plasmid was cut with & gill, and treated with Klenow to obtain a 3 ⁇ 4rill (blunt end) fragment.
  • pAMoERC3Sc Japanese Unexamined Patent Publication No. 05-336963 was digested with Xhol and Nsil, and treated with Klenow to obtain a 2.2 kb 1 (blunt end) (blunt end) fragment containing the oriP sequence.
  • Plasmid pcDNA3— or iP is obtained by joining the Bglll (blunt end) fragment derived from pcDNA3 and the 1 (blunt end) _ (flat end) fragment derived from pAMoERC3Sc in which the above cleavage site and Emil cleavage site have been eliminated. was created.
  • pcDNA3-oriP was digested with ⁇ l ⁇ I and Hindlll to obtain an Xhol-Hindlll fragment.
  • pSE01uc2 W098 / 14474 was digested with Xhol and Ncol, it was treated with Klenow to obtain a 1 (blunt-ended) -Ncol (blunt-ended) fragment containing the ympicillin resistance gene.
  • the plasmid pASdl-lucl was constructed by ligating the fragments. After cutting pASdl-lucl with ⁇ 1 and Hindlll, a 0.1 kb Xhol-Hindlll fragment was obtained.
  • Xhol-Hindlll fragment derived from pcDNA3-oriP and the Xhol-Hindlll fragment derived from pASdl-lucl were ligated to construct plasmid pcDNA3-oriP-Sdl.
  • pcDNA3-oriP-Sdl was digested with Xhol and Kpnl to obtain an Xhol-Kpnl fragment.
  • Four types of DNAs having the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, and 4 were synthesized using a DNA synthesizer. The synthetic DNAs are mixed and annealed to form a double strand with a poly A added signal.
  • Each of the synthesized primates was phosphorylated using T4 polynucleotide kinase, and then mixed and annealed to obtain double-stranded DNA.
  • Plasmid pcDNA3-oriP-Sdl-pA was constructed by binding the double-stranded DNA to an Xhol-Kpnl fragment derived from pcDNA3_oriP_Sdl.
  • pcDNA3-oriP-Sdl-pA was digested with ⁇ I and treated with Klenow to obtain an Xhol (blunt-ended) fragment.
  • pFR_luc manufactured by Stratagene
  • Hindlll and BamHI it was treated with Klenow to obtain a 0.14 kb iidlll (blunt-end) fragment (blunt-end) fragment.
  • the Xhol (blunt end) fragment derived from pcDNA3-oriP-Sdl-pA and the iUjidlll-giHI fragment derived from pFR-luc were ligated to prepare a plasmid pAGalSdl.
  • pAGalSdl contains a promoter having a sequence obtained by repeating Gal4p response element (UASG) five times.
  • USG Gal4p response element
  • P SE01uc2 (W098 / 14474) is digested with Hindlll and Sacl and treated with Klenow to obtain a 1.7 kb iiiLdlll (smooth powder) containing the firefly 'no luciferase gene. End) One ⁇ £ l (blunt end) fragment was obtained.
  • Plasmid pAGalSdl-luc was constructed by ligating the Hindlll (blunt end) -I ⁇ (blunt end) fragment from pSE0luc2 and the ⁇ RI (blunt end) fragment from pAGalSdl.
  • the expression plasmid pAGal9-luc having oriP of the Epstein 'Bir' virus was digested with Hindlll and Sacl to obtain a 6.9 kb Hindlll-Sacl fragment containing oriP.
  • pAMo-d a JP 2001-211885) was digested with Hindlll and Sacl, were obtained Hindlll- Sacl fragment containing the tetracycline re down resistance gene (Tc R).
  • pAMo-nd Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-211885 was cut with Hindlll and Sacl to obtain a iiidlll- ⁇ I fragment containing a tetracycline resistance gene.
  • Gal-ER chimeric transcription factor expression plasmid pGERbsrR2 is reduced to 1 / zg // i
  • TE buffer 10 mmol / L Tris-HCl (pH 8.0), 1 mmol / L ethylenediamine tetraacetic acid
  • Namalwa KJM-1 cells are serum-free adapted B cell lines that express the EBNA-1 gene.
  • the transformant cells the RPMI1640'ITPSG medium [RPMI1640 medium 8 ml (manufactured by Nissui Ltd. Kusurisha), 1/40 volume of 7. 5% NaHC0 3, 3% 200mmol / L L- glutamine solution (I Nbi DOO 0.5% penicillin / streptomycin solution (Invitrogen ⁇ -genene earth, 5,000 units / ml penicin, 5,000 ⁇ g / ml streptmycin), 10 mmol / L N-2-hydroxyxyl piperazine-N'_2-ethanesulfonic acid
  • plasticidin S (Blasticidin S) (KK-400 : manufactured by Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.) to 2.0 / ig / ml and dispense into a 96-well plate (500-2000 cells / well).
  • P GERbsrR2 acquired many stable transformants ⁇ integrated into a chromosome DNA (single clones).
  • Each transformant was subcultured on RPMI1640.ITPSG medium containing 2.0 g / ml of plasticidin S.
  • pAGalSdl-luc was introduced by an electroporation method and cultured for 2 days. After culturing, 17 ⁇ -estradiol ( ⁇ 8875: manufactured by Sigma) (final concentration: lOnmol / L) was added, and after further culturing for 24 hours, firefly luciferase activity was measured.
  • pACREpluc a reporter plasmid capable of expressing the firefly luciferase gene under the control of the cAMP response element (CRE), was constructed by the following method.
  • pACREpluc carries the hygromycin resistance gene oriP of Epstein-Per.
  • pAMo (Jananore 'ob' biologica cane. Chemistry (J. Biol. Chem.), 268 vol., 22782 M (1993), ⁇ IJ name pAMoPRC3Sc (JP-A-5-336963)] was partially digested with Clal A DNA fragment that had been cleaved off was obtained. The DNA fragment was partially digested with Mlul to obtain a 9.5 kb Clal-Mlul fragment. pAGE248 [Journal of Noviological Chemistry (J. Biol. Chem.), vol. 269, p.
  • Plasmid pAGal9h was constructed by ligating the Sail-Hindlll fragment derived from pAGal9-luc and the Xhol_Hindlll fragment derived from pAMoh. After pBluescriptll KS + (Toyobo) is cut with Sail and Xhol, it is dephosphorylated using phosphatase (Alkaline Phosphatase E. coli C75, Takara Shuzo), and the Sall-Xhol fragment containing the ampicillin resistance gene is removed. Obtained. A double-stranded DNA containing two CRE sequences was prepared by annealing synthetic oligonucleotides having the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 5 and 6.
  • pBS-CREI is a plasmid in which the double-stranded DNA is integrated in a direction in which a Sail cleavage site and an I cleavage site are regenerated, and each has one of the above-mentioned cleavage sites.
  • pBS-CREI was cut with Seal and Sail to obtain a Seal-Sail fragment containing ColEl ori.
  • the Xhol fragment and the Scal-Sall fragment derived from pBS_CREI were ligated to construct pBS-CREII containing four CRE sequences.
  • Seal-Xhol fragment was obtained.
  • pBS-CREII was cut with Seal and Sail to obtain a Scal-Sall fragment containing ColEl ori.
  • the pBS-CREII-derived Seat Xhol fragment and Seal-Sail fragment were ligated to construct pBS-CREIV containing eight CRE sequences. Cut pBS-CREIV with Seal and Xhol and contain ori of phage f1
  • Scal-Xhol fragment was obtained.
  • pBS-CREIV was cut with Seal and Sail to obtain a Scal-Sall fragment containing ColEl ori.
  • a pBS-CREIV-derived Seat Xhol fragment and a Scal-Sall fragment were ligated to construct pBS-CREVIII containing 16 CRE sequences.
  • pBS-CREVIII was digested with Xhol, treated with Klenow, and digested with Hindlll to obtain an ndlll-1 (blunt end) fragment containing 16 CREs.
  • pAGalSdl was cut with Mlul and Hindlll to obtain a 1. kb Mlul-Hindlll fragment.
  • pAGal9h was digested with ⁇ 1, treated with Klenow, and further digested with ⁇ _ ⁇ to obtain a 1 (blunt end) — iiiJ fragment.
  • a Hindlll-Xhol (blunt end) fragment derived from pBS-CREVIII, a MluI_HindIII fragment derived from pAGalSdl, and an Xbal (blunt end) -Mlul fragment derived from pAGal9h were ligated to construct a plasmid pACREh.
  • Hindlll (blunt end) -Xhol fragment containing CRE and ⁇ dlll (blunt end) 1 ⁇ I fragment containing firefly luciferase gene were obtained. Acquired each.
  • Hindlll (blunt end) -Xhol fragments derived from pACREluc a plasmid pACRElucH in which the Hindlll site upstream of the CRE sequence in pACREluc had disappeared was constructed.
  • pG-Enhancer vector (Promega) was digested with Hindlll and Hpal to obtain a Hindlll-Hpal fragment containing the luc + gene (modified firefly luciferase gene).
  • pACRElucH was digested with Notl, Klenow-treated, and further digested with ndlll to obtain a Hindlll-Notl (blunt end) fragment containing CRE.
  • a plasmid pACREpluc was constructed by ligating a Hindlll-Hpal fragment derived from the GL3-Enhancer vector and a Hindlll-Notl (blunt end) fragment derived from pACRElucH.
  • Reference Example 4 Construction of GPR4-induced expression plasmid
  • Single-stranded cDNA was synthesized by First-Strand Synthesis System for RT-PCR (manufactured by Gipcone Earth). Using 5 ⁇ l of a solution obtained by diluting the single-stranded cDNA 250-fold with water as type ⁇ , using synthetic DNA having the sequence shown in SEQ ID NOs: 7 and 8 as a primer specific to the GPR4 gene, PCR was performed. GPR4 cDNA was obtained.
  • the sequence of the GPR4 gene-specific primer can be obtained from the sequence information of the GPR4 gene (GenBank accession number:
  • PCR is a thermal cycler
  • the amplified GPR4 cDNA fragment was cut with Hindi II and ⁇ I, which cut the sequence designed on the primer.
  • the fragment containing GPR4 cDNA was recovered by agarose gel electrophoresis.
  • GPR4-induced expression plasmid pAGal9_GPR4 (2 ⁇ g) and reporter plasmid pACREpluc (2 ⁇ g) were co-transfected into KJMGER8 of 6 ⁇ 10 6 cells by the above electroporation method.
  • the transformant strain were suspended in RPMI1640 ⁇ ITPSG culture locations 8 ml, in C0 2 incubator primary, cultured for 24 hours at 37 ° C. After cultivation, add Plasticidin S (2.0 ⁇ g / ml), hygromycin B (300 ⁇ g / ml) and dieneticin (500 g / ml), and further culture for 14 days to obtain a stable transformant (GPR4 assay). Cells).
  • the transformant was subcultured in RPMI 1640 • ITPSG medium containing plasticidin S (2.0 ⁇ g / ml), hygromycin ⁇ (300 ⁇ g / ml) and dieneticin (500 ⁇ g / ml).
  • control plasmid pAGal9-nd (2 ⁇ g) and reporter plasmid pACREpluc (2 ⁇ g) were co-transfected into KJMGER8 to obtain a stable transformant (referred to as control cell).
  • Reference Example 6 Cloning of DNA encoding human GPR4 homolog from mouse
  • polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 was a mouse human GPR4 homolog (mouse GPR4).
  • the DNA encoding mouse GPR4 can be designed and synthesized based on the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 14, using a mouse cDNA library that can be prepared for sale or prepared by a known method. Nucleotides can be obtained by PCR using primer sets. Reference Example 7: Cloning of DNA encoding human GPR4 homolog from rat
  • RNA prepared from rat lung-derived mRNA was used as a type II, and the components described below were used.
  • DNTP dATP, dGTP, dCTP, dTTP
  • Taq Gold PerkinElmer 2.5 units per unit so that the concentration is 200 umol / L IX Taq Gold (Mg plus) Buffer (PerkinElmer)
  • a reaction solution containing 40 / iL was prepared, and PCR was performed under the following conditions.
  • Plasmid pT7RG was obtained by a conventional method from a transformant obtained by transforming Escherichia coli JM109 strain using the obtained recombinant plasmid DNA. Plasmid P T7RG result of determining the total base sequence of the PT7RG contained the cDNA of about 1. ikb having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18.
  • SEQ ID NO: 17 shows the amino acid sequence of the polypeptide encoded by the DNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18.
  • the ⁇ A amino acid sequences were compared analysis program [GENETYX WIN ver. 5 ⁇ 0 ( soft Tuea Ltd.)] human with, and the Amino acid sequence of mouse GPR4, respectively is 93.0%, 99.2% Was found.
  • a tablet having the following composition is prepared by a conventional method.
  • Formulation Compound 1 20 mg
  • a prophylactic and / or therapeutic agent for pruritus a nitrogen-containing cyclic compound having a prophylactic and / or Z or therapeutic effect on pruritus, comprising as an active ingredient a substance that suppresses the function related to GPR4 signal transduction.
  • the quaternary ammonium salt or a pharmacologically acceptable salt thereof, a nitrogen-containing tricyclic compound having an inhibitory effect on the function of GPR4 related to signal transmission, or the quaternary ammonium salt or a quaternary ammonium salt or a salt thereof A prophylactic and / or therapeutic agent for pruritus containing a pharmacologically acceptable salt, a nitrogen-containing tricyclic compound or a quaternary ammonium salt thereof, or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient.

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Description

明 細 書
搔痒の予防および/または治療剤
技術分野
本発明は、 GPR4のシグナル伝達に関する機能を抑制する物質を有効成分と して含有する搔痒の予防およびノまたは治療剤に関する。 また、 本発明は、 搔痒の予防およびノまたは治療剤と して有用な含窒素三環式化合物もしく はその四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩に関す る。 さらに、 スフ イ ンゴシルホスホリルコリ ン （SPC) が誘発する搔破行動 の回数の減少を指標と した搔痒治療剤のスクリ一ユング法に関する。
背景技術
痒みは炎症性皮膚疾患をはじめとする多くの皮膚疾患において重要な症 状であり、 搔破行動を誘起して皮膚症状を悪化させる。 また、 内科的全身疾 患の中にも慢性腎不全、 糖尿病等の痒みを伴うものがある。 代表的な搔痒性 皮膚疾患の一つである奪麻疹の痒みが、主にヒスタミンによって生じること は知られているが、 それ以外の痒みの発生機序は明らかにされていない。 治 療には、 抗アレルギー薬、 抗ヒスタミン剤、 ステロイ ド外用剤が用いられて いるが、 すべての搔痒に有効とはいえない。 また、 ステロイ ド外用剤の長期 使用は副作用を伴うことから、 さらに優れた搔痒の予防または治療剤が求め られている。
一方、 G蛋白質共役型レセプター蛋白質 （以下、 GPCR と略す） である GPR4 はスフィ ンゴシルホスホ リノレコ リ ン (SPC)、 リ ゾホスファチジノレコ リ ン (LPC) を内在性リガンドとする受容体である [ジャーナル'ォブ 'バイオロジカル · ケミス ト リー ( J. B iol . Chem. )、 276卷、 41325 - 41335頁 （2001年）]。 SPC については、 ヒ ト表皮角化細胞において ICAM-1発現、 TNF- α産生を誘導する こと [ジャーナル ' ォブ ' インべスティゲイティブ . ダーマ トロジー （J. Invest. Dermatol. ) 、 112卷、 91-96 ( 1999年）]、 ト ラ ンスグルタミナ一 ゼ活性を増強することからア トピー性皮膚炎をはじめとする皮膚炎で見ら れる皮膚の角化、 炎症 'ァレルギ一反応に関与していることが示唆されてい る [ジャーナル 'ォプ ' リ ピッ ド · リサーチ ( J. Lip i d Re s. )、 42卷、 1562 一 1 δ70頁 （2001年）〕。 さらに、 ア トピー性皮膚炎患者の角層では、 健常人 確認用寧 に比べ、 SPCを産生する酵素活性が増強するため、 SPCの蓄積が見られる [ジ ヤーナノレ · ォプ · インべスティゲイティプ · ダーマ ト ロジー ( J. Inve st. Dermato l . ) , 106卷、 1242— 1249頁 （1996年）]。 また、 SPCによる Ca2+上昇 を抑制する生薬成分がァ トピー性皮膚炎に効果があることも報告されてい る（特開平 9— 124500)。しかし、 SPCの搔痒への直接関与を示す報告はない。 Kura i shi らは compound 48/80または sub stance Pをマウスの皮下に投与す ると搔破行動が誘発されることを報告した [ョ一口ビアン ' ジャーナル ·ォ プ， フアルマコロジ一 ( Eur. J. Pharmacol . ) , 275卷、 229 - 233 Μ ( 1995 年）]。 その後、 搔破行動は搔痒の動物モデルと して用いられているが、 SPC が搔破行動を誘発するという報告もない。
GPR4 のもう一つのリガンドである LPC は乾癬の病変部で蓄積し [プリテ ィ ッシュ · ジヤーナノレ ·ォブ · フアルマコロジー ( Br. J. Pharmacol . )、 134 卷、 398— 402頁 （1995年）]、 ヒ トに皮内投与することにより、 浮腫、 紅斑、 細胞浸潤を誘導する [ァクタ ' デルマ ト ' ベネレオロジカ （Acta. Derm. Venereol. )、 80卷、 242— 246 頁 （2000 年）] こと力 ら、 皮膚炎への関与が 示唆されている。 SPC、 LPC とも GPR4 以外に、 0GR— 1 [ネィチヤ一 ' セノレ · バイオロジー ( Nat. Cel l Bi ol . )、 2卷、 261— 267頁 （2000年）]、 G2A [サ ィエンス ( Sc i ence) , 293卷、 702— 705頁 ( 2001年）] の各受容体に結合し、 シグナル伝達を誘導することが報告されているが、各受容体の作用はいまだ 解明されていない。
W002/24222には GPR4拮抗剤をァトピー性皮膚炎の治療に用いることが文 言上開示されている。
搔痒を引き起こす疾患は多岐に及ぶことが知られており、該疾患と しては、 種々の皮膚疾患 （ァトピー性皮膚炎、 湿疹 ·皮膚炎、尊麻疹、 痒疹、 乾皮症、 虫刺症、 疥癬、 真菌症、 皮膚接痒症、 肥厚性瘢痕、 乾癬、 水疱症、 薬疹等）、 肝 -胆道疾患 （原発性胆汁性肝硬変、 胆汁うっ滞症、 肝硬変等）、 腎疾患 （慢 性腎不全等） 、 内分泌 '代謝疾患 （糖尿病、 甲状腺機能異常等） 、 血液疾患
(真性多血症、 鉄欠乏性貧血等） 、悪性腫瘍 （悪性リンパ腫、 消化器癌等） 、 神経疾患（多発性硬化症、神経症等） 、 A I D S等が挙げられる。 また妊娘、 薬剤等によって搔痒が引き起こされる場合もある （ 「医薬ジャーナル」 （医 薬ジャーナル社） 、 37卷、 第 1 1号 （平成 13年 1 1月 1 日発行） 、 73〜77及 ぴ 79—82 H ) c
GPCR には、 細胞内で過剰に発現すると、 リガンドが存在しなくてもシグ ナルを流す、 構成活性型 GPCR と呼ばれる GPCRが知られている。 リガンド非 存在時に流れるシグナルは構成的活性と呼ばれる。 構成活性型 GPCR には、 天然に存在するものと、.ァミノ酸の置換、 欠失などの変異を導入することに よ り 造成された変異 GPCR [モ レキュ ラー ' フ アルマコ ロジー （ Mo l . Pharmacol . ) , 57卷、 890頁 （2000年）、 W098/46995] がある。 GPCR の構成 的活性を抑制するアンタゴニス トはィンバースァゴニス トと呼ばれる。
文献 [プレチン ·デ · ラ ' ソシェテ ， シミック （Bul let in de la Soc i et e Chimique)、 185頁 （1981年） およびョ一口ビアン ' ジャーナノレ ' ォプ ' メ ディシナル ' ケミス トリー （Eur. J. Me d. Chem. ) N 12巻、 219頁 （1977年）] に、 後述の式 （I) において！?1がモルホリノを表し、 、 R3および]?4が水素 を表し、 Yに相当する置換基がモルホリ ノであり、 n力 S 1であり、Xが-（CH2) 2 - を表す化合物が開示されている。
発明の開示
本発明の目的は、
1 ) GPR4 のシグナル伝達に関する機能を抑制する物質を有効成分と して含 有する搔痒の予防および/または治療剤を提供すること、
2 ) 搔痒の予防および/もしく治療作用、 または GPR4のシグナル伝達に関 する機能の抑制作用を有する含窒素 Ξ環式化合物もしくはその四級アンモ 二ゥム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩を提供すること、
3 )含窒素三環式化合物もしくはその四級アンモ-ゥム塩またはそれらの薬 理学的に許容される塩を有効成分と して含有する搔痒の予防および/また は治療剤を提供すること、 ならびに
4 )含窒素三環式化合物もしくはその四級アンモニゥム塩またはそれらの薬 理学的に許容される塩を有効成分と して含有する GPR4 のシグナル伝達に関 する機能の抑制剤を提供することである。
また、 本発明の別の目的は、 SPC誘発搔破行動の回数の減少を指標にした 搔痒治療剤のスク リ一ユング法を提供することである。
-8- 本発明は、 以下の （ 1 ) 〜 （2 2 ) に関する。
( 1 )配列番号 1 1記載のァミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関 する機能を抑制する物質を有効成分と して含有する搔痒の予防および/ま たは治療剤。
( 2 ) 以下の 1 ) 〜 4 )
1 )配列番号 1 2記載の塩基配列から選ばれる連続した 5〜 6 0塩基からな るォリ ゴヌク レオチドの相捕的配列を有するオリ ゴヌクレオチドまたは該 オリ ゴヌク レオチ ド誘導体、
2 )配列番号 1 4記載の塩基配列から選ばれる連続した 5〜 6 0塩基からな るオリ ゴヌ ク レオチドの相捕的配列を有するオリ ゴヌ ク レオチドまたは該 才リ ゴヌク レオチド誘導体、
3 )配列番号 1 8記載の塩基配列から選ばれる連続した 5〜 6 0塩基からな るオリ ゴヌクレオチドの相捕的配列を有するォリ ゴヌクレオチドまたは該 才リ ゴヌク レオチ ド誘導体、
4 ) 配列番号 1 2、 1 4および 1 8から選ばれるいずれか一つに記載の塩基 配列を有する DNAとス トリンジェン トな条件下でハイブリダイズし、かつ配 列番号 1 1記載のァミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関する機 能を抑制する 5〜 6 0塩基からなるオリ ゴヌクレオチドまたは該オリ ゴヌ クレオチド誘導体、
のいずれかを一つを有効成分と して含有する搔痒の予防および Zまたは治 療剤。
( 3 ) 以下の 1 ) 〜 4 )
1 ) 配列番号 1 1記載のアミノ酸配列を有する蛋白質を認識する抗体、
2 ) 配列番号 1 3記載のアミノ酸配列を有する蛋白質を認識する抗体、
3 ) 配列番号 1 7記載のアミノ酸配列を有する蛋白質を認識する抗体、
4 ) 配列番号 1 1、 1 3および 1 7から選ばれるいずれか一つに記載のァミ ノ酸配列において一つ以上のァミノ酸が欠失、置換または付加したァミノ酸 配列を有し、かつ配列番号 1 1記載のァミノ酸配列を有する蛋白質のシグナ ル伝達に関する機能を有する蛋白質を認識する抗体、
のいずれか一つを有効成分と して含有する搔痒の予防および/または治療 剤 <
4 ) 式 （I )
Figure imgf000008_0001
[式中、 R1は置換も しく は非置換の複素環基、 -NR5R6 (式中、 R5および R6は 同一または異なって水素、 置換も しく は非置換の低級アルキル、 置換も しく は非置換のシク 口アルキル、 置換も しく は非置換の低級アルケニル、 置換も しく は非置換の低級アルキニル、 置換も しく は非置換のァラルキル、 または 置換も しく は非置換の複素環アルキルを表すか、 R5および R6が隣接する窒 素原子と一緒になつて置換も しく は非置換の複素環基を形成する）、 - OR7 (式 中、 R7 は水素、 置換も しく は非置換の低級アルキル、 置換も しく は非置換の 低級アル力ノィル、 置換も しく は非置換のシク 口アルキル、 置換も しく は非 置換の低級アルケニル、 置換も しく は非置換の低級アルキニル、 置換も しく は非置換のァリール、 置換も しく は非置換のァラルキル、 または置換も しく は非置換の複素環アルキルを表す）、- SR7a (式中、 R7aは前記 R7と同義である）、 -C0NR5aR6a (式中、 R5aおよび R6aはそれぞれ前記 および前記！?6と同義であ る）、 - C02R7b (式中、 R7bは前記 R7 と同義である）、 - N+R5bR6bR8 (式中、 R5bお よび R6bはそれぞれ前記 R5および前記 R6 と同義であり、R8は低級アルキル、 低級アルケニル、 またはァラルキルを表す）、 ホルミル、 カルボキシ、 また はシァノ を表し、
R2は水素、 置換も しく は非置換の低級アルキル、 置換も しく は非置換のシク 口アルキル、 置換も しく は非置換の低級アルケニル、 置換も しぐは非置換の 低級アルキニル、 置換も しく は非置換のァラルキル、 または置換も しく は非 置換の複素環アルキルを表し、
および ！?4は同一または異なって水素、 低級アルキル、 またはハロゲンを 表し、
nは 0または 1 を表し、 Xは- (CH2) 2-または- CH=CH -を表し.
Yは式 ( II )
Figure imgf000009_0001
(式中、 Wは CHまたは窒素原子を表し、
Z1および Z2は同一または異なって水素、 置換もしくは非置換の低級アルキ ル、 置換もしくは非置換のシク口アルキル、 置換もしく は非置換の低級アル ケエル、 置換もしくは非置換の低級アルキニル、 置換もしくは非置換のァリ ール、 置換もしくは非置換のァラルキル、 または置換もしくは非置換の複素 環アルキルを表すか、 Z1および Z2がそれぞれ隣接する 2つの炭素原子と一 緒になって置換も しく は非置換の芳香環または置換も しく は非置換の複素 環を形成し、
Z3は水素、 置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしく は非置換のシク 口アルキル、 置換もしくは非置換の低級アルケニル、 置換もしくは非置換の 低級アルキニル、 置換もしくは非置換のァリール、 置換もしくは非置換の複 素環基、 置換もしくは非置換のァラルキル、 または置換もしくは非置換の複 素環アルキルを表す） を表す] で表される含窒素三環式化合物もしくはその 四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩。
( 5 ) R1が- NR5Reであり、 R5および R6が隣接する窒素原子と一緒になつて置 換もしくは非置換の複素環基を形成する第 （4 ) 項に記載の含窒素三環式化 合物もしく はその四級アンモ-ゥム塩またはそれらの薬理学的に許容され る塩。
( 6 ) が水素である第 （4 ) 項または第 （ 5 ) 項に記載の含窒素三環式化 合物もしく はその四級アンモ-ゥム塩またはそれらの薬理学的に許容され る塩。
( 7 ) R3および が水素である第 （4 ) 項〜第 （ 6 ) 項のいずれかに記載 の含窒素三環式化合物もしくはその四級アンモ -ゥム塩またはそれらの薬 理学的に許容される塩。
( 8 ) Z1および Z2がそれぞれ隣接する 2つの炭素原子と一緒になつて置換 もしくは非置換の複素環を形成する第 （4 ) 項〜第 （ 7 ) 項のいずれかに記 載の含窒素三環式化合物も しくはその四級アンモニゥム塩またはそれらの 薬理学的に許容される塩。
( 9 ) 第 （4 ) 項〜第 （ 8 ) 項のいずれかに記載の含窒素 環式化合物も し くはその四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩を有 効成分として含有する医薬。
( 1 0 ) 第 （4 ) 項〜第 （ 8 ) 項のいずれかに記載の含窒素三環式化合物も しく はその四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩を 有効成分として含有する搔痒の予防および/または治療剤。
( 1 1 ) 第 （4 ) 項〜第 （ 8 ) 項のいずれかに記載の含窒素三環式化合物もし くはその四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩を有効 成分として含有する、 配列番号 1 1記載のアミノ酸配列を有する蛋白質のシグ ナル伝達に関する機能の抑制剤。
( 1 2 ) 以下の 1 ) 〜 4 )
1 ) ヒ トを除く哺乳類動物にスフイ ンゴシルホスホリルコ リ ン （SPC) を皮 下および皮内投与することによ り ヒ トを除く哺乳類動物における搔破行動 を誘発する工程、
2 )試験化合物存在下または非存在下での SPCにより誘発されたヒ トを除く 哺乳類動物における搔破行動の回数を測定する工程、
3 )試験化合物存在下と試験化合物非存在下での SPCにより誘発されたヒ ト を除く哺乳類動物における搔破行動の回数を比較する工程、 および
4)試験化合物から SPCにより誘発された搔破行動の回数を減少させる物質 を選択する工程、
を含む搔痒治療剤のスク リーユング法。
( 1 3 ) 第 （4 ) 項〜第 （ 8 ) 項のいずれかに記載の含窒素三環式化合物も しくはその四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩の 有効量を投与することを特徴とする、 搔痒の予防および Zまたは治療方法。
( 1 4 )搔痒の予防およびノまたは治療剤の製造のための第（ 4 )項〜第（ 8 ) 項のいずれかに記載の含窒素三環式化合物もしく はその四級アンモニゥム 塩またはそれらの薬理学的に許容される塩の使用。
( 1 5 ) 搔痒が皮膚疾患、 肝 · 胆道疾患、 腎疾患、 内分泌 ·代謝疾患、 血液 疾患、 悪性腫瘍、 神経疾患および A I D Sから選択される疾患に伴う搔痒で ある第 （ 1 ) 〜 （ 3 ) 項おょぴ第 （ 1 0 ) 項のいずれかに記載の搔痒の予防お よび/または治療剤。
( 1 6 )搔痒が皮膚疾患に伴う接痒であり、該皮膚疾患がァ トピー性皮膚炎、 湿疹 ·皮膚炎、 奪麻疹、 痒疹、 乾皮症、 虫刺症、 疥癬、 真菌症、 皮膚搔痒症、 肥厚性瘢痕、 乾癬、 水疱症および薬疹から選択される皮膚疾患である第 （ 1 5 ) 項記載の搔痒の予防おょぴ Zまたは治療剤。
( 1 7 )配列番号 1 1記載のァミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に 関する機能を抑制する物質の治療有効量を投与することを特徴とする、 搔痒 の予防および/または治療方法。
( 1 8 ) 第 （2 ) 項に記載の 1 ) ~ 4 ) のいずれか一つのオリ ゴヌクレオチ 'ドまたは該オリゴヌク レオチド誘導体の治療有効量を投与することを特徴と する、 搔痒の予防および/または治療方法。
( 1 9 ) 第 （ 3 ) 項に記載の 1 ) ~ 4 ) のいずれか一つの抗体の治療有効量 を投与することを特徴とする、 搔痒の予防おょぴ または治療方法。
( 2 0 )搔痒の予防および/または治療剤の製造のための、配列番号 1 1記載 のァミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関する機能を抑制する物 質の使用。
( 2 1 ) 搔痒の予防および/または治療剤の製造のための、 第 （ 2 ) 項に記載 の 1 ) 〜 4 ) のいずれか一つのオリ ゴヌク レオチ ドまたは該オリ ゴヌク レオ チド誘導体の使用。
( 2 2 ) 搔痒の予防および または治療剤の製造のための第 （ 3 ) 項に記載の 1 ) 〜 4 ) のいずれか一つの抗体の使用。
本発明者らは、 GPCRである GPR4の有するシグナル伝達に関する機能を抑 制する物質が、搔痒の予防おょぴノまたは治療に有効であるとの新知見を見 い出し、 本発明を完成するに至った。 また、 本発明者らは、 構成活性型の
GPCRである GPR4の構成的活性を抑制する物質の探索を行い、 GPR4の構成的 活性を抑制する物質が、搔痒の予防および/または治療に有効であることを 見い出した。
GPR4 の有するシグナル伝達に関する機能を抑制する物質と しては、 GPR4 自身の発現を阻害または抑制する物質、 リガンドの GPR4への結合を阻害す る物質、 GPR4への リ ガン.ド結合により生ずるシグナル伝達 [例えば、 細胞内 cAMP 濃度の変化 （上昇または低下）、 細胞内 Ca2+濃度の変化 （上昇）、 mitogen— activated protein (MAP)キナーゼのリ ン酸ィ匕等カ 含まれる]を抑 ffiU する物質、 GPR4の構成的活性により生ずるシグナル伝達を抑制する物質（例 えば GPR4 のイ ンバースァゴニス ト等が含まれる） 等が含まれる。 上記物質 は、 これら機能を有する物質であれば、 その構造は特に限定されず、 公知の 構造を有するものでもよい。 GPR4 と しては、 例えば配列番号 1 1 、 1 3お よび 1 7から選ばれるいずれか一つに記載のァミノ酸配列を有する蛋白質、 あるいは配列番号 1 1、 1 3および 1 7から選ばれるいずれか一つに記載の ァミノ酸配列において一つ以上のァミノ酸が欠失、置換または付加したァミ ノ酸配列を有し、かつ配列番号 1 1記載のァミノ酸配列を有する蛋白質のシ グナル伝達に関する機能を有する蛋白質等が挙げられる。
配列番号 1 1、 1 3および 1 7から選ばれるいずれか一つに記載のァミノ 酸配列において一つ以上のァミノ酸が欠失、置換または付加したァミノ酸配 列を有し、かつ配列番号 1 1記載のァミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル 伝達に関する機能を有する蛋白質は、 文献 [Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press
(1989年） （以下、 モレキュラー ' クローニング第 2版と略す）、 Current
Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987 - 1997年） （以 下、カ レン ト 'プロ トコーノレズ'イ ン 'モレキュラー 'バイオロジーと略す）、
Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
79, 6409 (1982)、 Gene, 34. 315 (1985)、 Nucleic Acids Research, 13., 4431
(1985)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等] 記載の部位特異 的変異導入法を用いて、 例えば配列番号 1 1、 1 3および 1 7から選ばれる いずれか一つに記載のァミノ酸配列を有する蛋白質をコードする MAに部 位特異的変異を導入することにより、 取得することができる。 欠失、 置換または付加したアミノ酸の数は特に限定されないが、 1個〜数 十個、 好ましく は 1 〜 2 0個、 より好ましくは 1 〜 1 0個、 さらに好ましく は：！〜 5個である。
配列番号 1 1、 1 3および 1 7から選ばれるいずれか一つに記載のァミノ 酸配列において一つ以上のァミ ノ酸残基が欠失、 置換または付加したとは、 該ァミノ酸配列中の任意かつ 1 もしくは複数の位置において、 1または複数 のァミノ酸残基の欠失、 置換または付加があることを意味し、 欠失、 置換ま たは付加が同時に生じてもよく、 欠失、 置換または付加されるァミノ酸残基 については、天然型と非天然型とを問わない。天然型ァミノ酸残基と しては、 L -ァラニン、 L-ァスパラギン、 L-ァスパラギン酸、 L-グルタミ ン、 L-グルタ ミ ン酸、 グリ シン、 L-ヒスチジン、 L-ィ ソロイシン、 L-ロイシン、 L-リジン、 L-アルギニン、 L -メチォニン、 L—フエ二ルァラニン、 L-プ口 リ ン、 L—セリ ン、 L-ス レオニン、 L -ト リプトファン、 L-チ口シン、 L-バリ ンぉよび L-システ ィンの各残基等が挙げられる。
以下に、 相互に置換可能なァミノ酸残基の好ましい例を示す。 同一群に含 まれるァミノ酸残基は相互に置換可能である。
A群： ロイ シン、 イ ソ ロイ シン、 ノノレロイ シン、 / リ ン、 ノノレ/くリ ン、 ァ ラニン、 2-アミ ノプタン酸、 メチォニン、 0 -メチルセリ ン、 tert-プチノレグ リ シン、 tert-プチノレァラニン、 シク ロへキシノレアラ-ン
B群 ： ァスパラギン酸、 グルタミ ン酸、 イ ソァスパラギン酸、 イ ソグルタ ミ ン酸、 2-アミ ノアジピン酸、 2-アミ ノスべリ ン酸
C群 ： ァスパラギン、 グルタ ミ ン
D群 ： リ ジン、 アルギニン、 オル二チン、 2 , 4-ジアミ ノブタン酸、 2 , 3- ジァミ ノプロ ピオン酸
E群 ： プロ リ ン、 3-ヒ ドロキシプロ リ ン、 4-ヒ ドロキシプロ リ ン
F群 ： セリ ン、 スレオニン、 ホモセリ ン
G群 ： フエニノレアラニン、 チロシン
また、 配列番号 1 1、 1 3および 1 7から選ばれるいずれか一つに記載の ァミノ酸配列において一つ以上のァミノ酸残基が欠失、置換または付加した ァミノ酸配列を有する蛋白質が、配列番号 1 1記載のァミノ酸配列を有する 蛋白質のシグナル伝達に関する機能を有するには、そのアミノ酸配列と配列 番号 1 1記載のァミノ酸配列とが、 少なく とも 7 5 %以上、 通常は 8 0 %以 上、 好ましくは 9 0 %以上、 さらには 9 5 %以上の同一性を有していること が好ましい。
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、 Karlin and Altschulによるァルゴ リズム BLAST [Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993) ]や FASTA [Methods Enzymol. , 183» 63 (1990) ]を用いて決定することができる。 このアルゴリ ズム BLAST に基づいて、 BLASTN (塩基対塩基データベース） や BLASTX (塩 基対アミ ノ酸データベース） とよばれるプログラムが開発されている [J. ol. Biol. , 215, 403(l990)]o BLASTに基づいた BLASTNによって塩基配列 を解析する場合には、 パラメータ一は例えば score- 100、 wordlength= 12 とする。 また、 BLAST に基づいて BLASTX によってアミノ酸配列を解析する 場合には、 ノ ラメーターは例えば score = 50、 wordlength= 3 とする。 BLAST と Gapped BLASTプログラムを用いる場合には、 各プログラムのデフォルト ン、0ラメ一ターを用レヽる [Gapped BLASTにつ ヽて 文献 (Nuc. Acids Res. , 25, 3389-3402 (1997)) を参照]。 これらの解析方法の具体的な手法は公知である (http： / /www. ncbi. nlm. nih. gov.参照 J。
GPR4 自身の発現を阻害または抑制する物質と しては、 例えば、 配列番号 1 2、 1 4および 1 8から選ばれるいずれか一つに記載の塩基配列から選ば れる連続した 1 5〜 6 0塩基からなるオリ ゴヌクレオチドの相捕的配列を 有するォリ ゴヌクレオチド （以下、 アンチセンス · オリ ゴヌクレオチドとも いう）、 配列番号 1 2、 1 4および 1 8から選ばれるいずれか一つに記載の 塩基配列を有する DNAとス トリ ンジェントな条件でハイブリダイズし、配列 番号 1 1記載のァミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関する機能 を抑制するオリ ゴヌクレオチド、 これらのオリ ゴヌクレオチドの誘導体 （以 下、 オリゴヌ ク レオチ ド誘導体という） 等が挙げられる。
上記アンチセンス 'オリ ゴヌクレオチドと しては、 配列番号 1 2、 1 4お よび 1 8から選ばれるいずれか一つに記載の塩基配列から選ばれる連続し た 1 5〜 6 0塩基からなるオリゴヌクレオチドの相捕的配列を有するアン チセンス . オリ ゴヌクレオチドであれば特に限定されないが、 好ましく は 1 7〜 6 0塩基、 よ り好ま しく は 2 0〜 6 0塩基、 さ らに好ま しく は 3 0〜 6 0塩基からなるオリ ゴヌク レオチ ドの相捕的配列を有するアンチセン ス · オリ ゴヌク レオチ ドが挙げられる。 特に好ま しく は上記ォリ ゴヌク レオ チドの翻訳開始領域の相捕的配列を有するアンチセンス 'オリ ゴヌク レオチ ドが挙げられる。 該アンチセンス ' オリ ゴヌク レオチ ドは、 配列番号 1 2、 1 4および 1 8から選ばれるいずれか一つに記載の塩基配列またはその断 片の塩基配列に関する情報に基づき、 常法によ り、 例えば DNA合成機を用い ることによ り調製するこ とができる。
オリ ゴヌク レオチ ド誘導体と しては、オリ ゴヌク レオチ ド中のリ ン酸ジェ ステル結合がホスホロチォエー ト結合に変換されたオリ ゴヌク レオチド誘 導体、 ォリ ゴヌク レオチ ド中のリ ン酸ジエステル結合が Ν3'-Ρ5'ホスホアミ デート結合に変換されたオリ ゴヌク レオチ ド誘導体、オリ ゴヌクレオチ ド中 のリボースと リ ン酸ジエステルとの結合がぺプチ ド核酸結合に変換された オリ ゴヌク レオチ ド誘導体、オリ ゴヌク レオチド中のゥラシルが C- 5プロ ピ 二ルゥラシルで置換されたオリ ゴヌク レオチド誘導体、オリ ゴヌク レオチ ド 中のゥラシルが C- 5チアゾリルゥラシルで置換されたオリ ゴヌク レオチ ド 誘導体、ォリ ゴヌク レオチド中のシトシンが C- 5プロピニルシトシンで置換 されたオリ ゴヌク レオチ ド誘導体、オリ ゴヌク レオチド中のシトシンがフエ ノキサジン修飾シトシン （phenoxazine - modified cytosine) で置換された オリ ゴヌク レオチ ド誘導体、 オリ ゴヌク レオチ ド中のリ ボースが 2，- 0-プロ ピルリ ボースで置換されたオリ ゴヌク レオチ ド誘導体、オリ ゴヌク レオチ ド 中のリ ボースが 2' -メ トキシエ トキシリ ボースで置換されたオリ ゴヌク レオ チ ド誘導体等を挙げるこ とができる 〔細胞工学， ϋ， 1463 (1997) ]0 上記アンチセンス 'オリ ゴヌクレオチ ドまたはォリ ゴヌク レオチ ド誘導体 を用い、アンチセンス RNA/DNA技術〔バイォサイエンスとインダス ト リー， 322 (1992)、 化学， 46, 681 (1991)、 Biotechnology, 9, 358 (1992)、 Trends in Biotechnology, 10^, 87 (1992) ヽ Trends in Biotechnology, 10., 152 (1992)、 細胞工学， 1 , 1463 (1997)〕、 ト リプル ' ヘリ ックス技術 [Trends in Biotechnology, 10, 132 (1992)〕、 リボサィム技術 [Current Opinion in
Chemical Biology, 3, 274 (1999)、 FEMS Microbiology Reviews, 23, 257 (1999)、 Frontiers in Bioscience, 4, D497 (1999)、 Chemistry & Biology,
6, R33 (1999)、 Nucleic Acids Research, 26» 5237 (1998)、 Trends in
Biotechnology, 16., 438 (1998)〕、 あるいはデコイ DNA法 [Nippon Rinsho -
Japanese Journal of Clinical Medicine, 56>, t>o3 、1998)、 Circulation
Research, 82, 1023 (1998)、 Experimental Nephrology, 5, 429 (1997)、
Nippon Rinsho - Japanese Journal of Clinical Medicine, 54, 2583 (1996)〕 に準じて、 GPR4 自身の発現を阻害または抑制することができる。
配列番号 1 2、 1 4および 1 8から選ばれるいずれか一つに記載の塩基配 列を有する DNAとス トリ ンジェントな条件下でハイプリダイズするヌクレ ォチドとは、 配列番号 1 2、 1 4および 1 8から選ばれるいずれか一つに記 載の塩基配列を有する DNAの一部、 または全部をプローブと して、 コロニ 一 ·ハイプリダイゼ——ン 3ン法、 プラーク ·ハイブリダイゼーション法、 サ ザンプロッ トハイプリダイゼーション法等を用いることによ り得られる DNA を意味し、 具体的には、 コロニーあるいはプラーク由来の DNAを固定化した フィルターを用いて、 0. 7〜 1 . 0 mol/1の塩化ナト リ ゥム存在下、 6 5 °C でハイプリダイゼーシヨ ンを行った後、 0. 1〜 2倍濃度の SSC溶液 （ 1倍 濃度の SSC溶液の組成は、 1 5 0 mmolVl塩ィ匕ナトリ ウム、 1 5 mmol/1クェ ン酸ナトリ ウムよりなる） を用い、 6 5 °C条件下でフィルターを洗浄するこ とにより同定できる DNA等を挙げることができる。ハイブリダィゼーショ ン は、 モレキュラー 'クローニング第 2版、 カレント 'プロ トコールズ 'イン ' モレキュラー，ノ、ィォロジ一、 DNA Cloning 1： Core Techniques, A Practical
Approach, Second Edition, Oxford University (1995)等（こ記載されて！/ヽる 方法に準じて行うことができる。ハイプリダイズするヌクレオチドとしては、 例えば上記 BLASTや FASTA等を用いて計算したときに 1 2、 1 4および 1 8 から選ばれるいずれか一つに記載の塩基配列を有する DNAの相捕的配列を 有する DNAと少なく とも 7 5 %以上の相同性を有する DNAが好ましく、より 好ましくは 8 0 %以上の相同性を有する DNA、 さらに好ましくは 9 5 %以上 の相同性を有する DNAを挙げることができる。ヌクレオチドと しては、 DNA、
RNA等いずれも用いられるが DNAが好適に用いられる。
上記アンチセンス ' オリ ゴヌク レオチ ドも しく は該アンチセンス ' オリ ゴ ヌクレオチド誘導体、 または配列番号 1 2、 1 4および 1 8から選ばれるい ずれか一つに記載の塩基配列を有する DNA とス ト リ ンジェントな条件下で ハイプリダイズするヌクレオチドもしくは該ヌクレオチド誘導体を単独で またはレトロウイルスベクター、 アデノ ウイルスベクター、 アデノ ウイルス ァソシエーテツ ドウィルスべクター等の遺伝子治療用べクターに挿入した 後、下記に記載した常法に従って製剤化したものを搔痒の予防および/また は治療剤として使用することもできる。
遺伝子治療用べクターを該予防および/または治療剤と して用いる場合 には、該遺伝子治療用べクターと遺伝子治療剤に用いる基剤を調合すること により製造することができる [Nature Genet. , 8, 42 (1994)〕。
上記基剤と しては、通常注射剤に用いる基剤であればどのようなものでも よく、 例えば蒸留水、 塩化ナトリ ゥムまたは塩化ナトリ ウムと無機塩との混 合物等の塩溶液、マンニトール、乳糖、デキス トラン、プドウ糖等の糖溶液、 ダリシン、 アルギニン等のァミノ酸溶液、 有機酸溶液または塩溶液とダルコ ース溶液との混合溶液等が挙げられる。 また常法に従い、 これらの基剤に浸 透圧調整剤、 ρΗ調整剤、 ゴマ油、 ダイズ油等の植物油またはレシチンもし くは非イオン界面活性剤等の界面活性剤等の助剤を用いて、 溶液、 懸濁液ま たは分散液と して注射剤を調製してもよい。 これらの注射剤を、 粉末化、 凍 結乾燥等の操作により用時溶解用製剤と して調製することもできる。
該予防および/または治療剤は、液体の場合はそのままで、固体の場合は、 投与直前に、必要により滅菌処理をした上記の基剤に溶解して使用すること ができる。
投与方法としては、 例えば患者の治療部位に吸収されるよ うに、 局所的に 投与する方法を挙げることができる。 また、 非ウィルス遺伝子移入法によつ ても目的とする治療部位に DNAを輸送することができる。
非ウィルス遺伝子移入法と しては、 リ ン酸カルシウム共沈法 [Virology, 52, 456-467 (1973) ； Science, 209, 1414 - 1422 (1980)〕、 マイクロインジ ェクショ ン法 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 5399-5403 (1980) ； Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 7380-7384 (1980) ； Cell, 27, 223-231 (1981) ； Nature, 294, 92-94 (1981)] , リポソ一ムを介した膜融合-介在移入法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413-7417 (1987)； Biochemistry, 28, 9508-9514 (1989) ； J. Biol. Chem.， 264, 12126 - 12129 (1989) ； Hum. Gene Ther. , 3, 267-275 (1992) ； Science, 249, 1285-1288 (1990) ； Circulation, 83, 2007-2011 (1992)〕、 直接 D N A取り込みまたは受容体-媒介 D N A移入法 [Science, 247, 1465-1468 (1990) ； J. Biol. Chem. , 266, 14338-14342 (1991) ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3655-3659 (1991)； J. Biol. Chem. , 264, 16985-16987 (1989)； BioTechniques, ϋ, 474-485 (1991)； Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3410-3414 (1990) ； Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 4255-4259 (1991)； Proc' Natl. Acad. Sci. USA, 87, 4033-4037 (1990) ； Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 8850-8854 (1991) ； Hum. Gene Ther. , 3, 147-154 (1991)〕 等を挙げることができる。
リガンドの GPR4への結合を阻害する物質としては、例えば GPR4を認識す る抗体、 GPR4に拮抗作用を有する化合物等を挙げることができる。
上記抗体としては、 GPR4を認識する抗体であればいずれも用いることがで きるが、 GPR4 を特異的に認識する抗体が好ましい。 また該抗体はポリクロ ーナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。 このような抗体として、 例え ば、 GPR4 を認識する中和抗体等をあげることができる。 また、 ヒ ト型キメ ラ抗体、 ヒ ト化抗体等も本発明の抗体と して用いることができる。
上記抗体は、 例えば、 以下の方法に準じて調製することができる。
( 1 ) ポリクローナル抗体の作製
GPR4またはその部分断片ポリぺプチドの精製標品、 あるいは GPR4 一部 のァミノ酸配列を有するぺプチドを抗原と して用い、動物に投与することに よりポリクローナル抗体を作製することができる。
投与する動物としては、 ゥサギ、 ャギ、 ラッ ト、 マウス、 ハムスター等を 用いることができる。
該抗原の投与量は動物 1匹当たり 50〜100 gが好ま しい。
ペプチドを用いる場合は、 ペプチドをスカシガイへモシァェン （keyhole limpet haemocyanin) や牛チログロブリ ン等のキヤリァ蛋白に共有結合させ たものを抗原とするのが望ましい。 抗原とするペプチドは、 ぺプチド合成機 で合成することができる。 - 該抗原の投与は、 1 回目の投与の後 1〜 2週間おきに 3〜 10回行う。 各投 与後、 3〜7 日 目に眼底静脈叢より採血し、 該血清が免疫に用いた抗原と反 応することを酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法（ELISA法）：医学書院刊（1976 年)、 AntiDodies-A Laboratory Manual, Cold spring harbor Laboratory (1988)] 等で確認する。
免疫に用いた抗原に対し、'その血清が充分な抗体価を示した非ヒ ト哺乳動 物より血清を取得し、 該血清を分離、 精製することによりポリ クローナル抗 体を取得することができる。
分離、 精製する方法としては、 遠心分離、 40〜50%飽和硫酸アンモニゥム ίこよる塩析、 カプリノレ酸沈殿 [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)〕、 または DEAE -セファロースカラム、 陰イオン交換力ラム、 プロテイン Aまたは G-力ラムあるいはゲル濾過力ラ ム等を用いるクロマトグラフィ一等を、単独でまたは組み合わせて処理する 方法が挙げられる。
( 2 ) モノク ローナル抗体の作製
( 抗体産生細胞の調製
免疫に用いた GPR4またはその部分断片ポリぺプチドの精製標品、 あるい は GPR4の一部のァミノ酸配列を有するぺプチドに対し、 その血清が十分な 抗体価を示したラッ トを抗体産生細胞の供給源と して供する。
該抗体価を示したラッ トに抗原物質を最終投与した後 3〜 7 日 目に、脾臓 を摘出する。
該脾臓を MEM培地 （日水製薬社製） 中で細断し、 ピンセッ トでほぐし、 1, 200rpmで 5分間遠心分離した後、 上清を捨てる。
得られた沈殿画分の脾細胞を トリスー塩化アンモニゥム緩衝液 （pH7.65) で 1〜2分間処理し赤血球を除去した後、 MEM培地で 3回洗浄し、 得られた 脾細胞を抗体産生細胞として用いる。
(b)骨髄腫細胞の調製 '
骨髄腫細胞と しては、マウスまたはラッ トから取得した株化細胞を使用す る。 例えば、 8-ァザグァニン耐性マウス （BALB/c由来） 骨髄腫細胞株 P3 - X63Ag8 - U1 (以下、 P3 - U1 と略す） [Curr. Topics Microbiol. Immunol. , 81, 1 (1978)、 Eur. J. Immunol. , 6, 511 (1976)〕、 SP2/0-Agl (SP-2) [Nature, 276, 269 (1978)〕、 P3-X63-Ag8653 (653) [J. Immunol. , 123., 1548 (1979)〕、 P3-X63-Ag8(X63) [Nature, 256, 495 (1975)〕 等を用いることができる。 こ れらの細胞株は、 8-ァザグァニン培地 〔RPMI-1640培地にグルタミン
(1.5mmol/l)、 2—メルカプトエタノーノレ (5 X 10-5mol/l)、 ジェンタマイシ ン （lO/ g/ml) および牛胎児血清 （FCS) (CSL社製、 10%) を加えた培地 （以 下、 正常培地という） に、 さらに 8-ァザグァニン （15/x g/ml) を加えた培 地〕 で継代するが、 細胞融合の 3〜4 日前に正常培地で培養し、 融合には該 細胞を 2X107個以上用いる。
(c)ハイプリ ドーマの作製
( a )で取得した抗体産生細胞と（ b )で取得した骨髄腫細胞を M E M培地ま たは PBS (リ ン酸ニナトリ ゥム 1.83g、リン酸一カリ ウム 0.21g、食塩 7.65g、 蒸留水 1 リ ッ トル、 pH7.2) でよく洗浄し、 細胞数が、 抗体産生細胞 ： 骨髄 腫細胞 =5~10： 1になるよう混合し、 l,200rPmで 5分間遠心分離した後、 上清を捨てる。
得られた沈殿画分の細胞群をよく ほぐし、該細胞群に、攪拌しながら、 37°C で、 108抗体産生細胞あたり、ポリエチレングリ コール- 1000 (PEG-1000) 2g、 MEM 2mlおよぴジメチルスルホキシ ド （DMS0) 0.7mlを混合した溶液を 0.2 〜lml添加し、 さらに 1〜2分間毎に MEM培地 l~2mlを数回添加する。
添加後、 MEM培地を加えて全量が 50mlになるように調製する。 該調製液 を 900rpniで 5分間遠心分離後、上清を捨てる。得られた沈殿画分の細胞を、 ゆるやかにほぐした後、 メスピペッ トによる吸込み、 吹出しでゆるやかに HAT培地〔正常培地にヒポキサンチン（l(T4mol/l)、チミジン（ 1.5Χ10"½ο1/1) およびァミノプテリ ン （4X10—7 mol/1) を加えた培地〕 100ml中に懸濁する。 該懸濁液を 96穴培養用プレートに 100μ 1/穴ずつ分注し、 5%(：02ィンキ ュベータ一中、 37。Cで？〜 14 日間培養する。
培養後、 培養上清の一部をと りアンチボディィズ [Antibodies, A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14 (1988) ] 等に述べられている酵素免疫測定法により、本発明のポリぺプチドの部分断 片ポリぺプチドに特異的に反応するハイプリ ドーマを選択する。 酵素免疫測定法の具体例として、 以下の方法を挙げることができる。 免疫の際、 抗原に用いた GPR4またはその部分断片ポリぺプチドの精製標 品、 あるいは GPR4の一部のァミノ酸配列を有するぺプチドを適当なプレー トにコートし、 ハイプリ ドーマ培養上清もしくは後述の（d)で得られる精製 抗体を第一抗体と して反応させ、 さらに第二抗体と してビォチン、 酵素、 化 学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗ラッ トまたは抗マウスィ ムノグロプリ ン抗体を反応させた後に標識物質に応じた反応を行い、抗原に 用いたポリぺプチドに特異的に反応するものを本発明で用いられるモノク ローナル抗体を生産するハイプリ ドーマと して選択する。
該ハイプリ ドーマを用いて、限界希釈法によりクローユングを 2回繰り返 し 〔1回目は、 HT培地 （HAT培地からァミノプテリンを除いた培地）、 2回目 は、 正常培地を使用する〕、 安定して強い抗体価の認められたものを本発明 で用いられるモノク ローナル抗体を産生するハイプリ ドーマ株と して選択 する。
(d)モノ ク ローナノレ抗体の調製
プリ スタン処理 〔2, 6, 10， 14-テ トラメチノレペンタデカン ( Pri st騰) 0. 5mlを腹腔内投与し、 2週間飼育する〕 した 8〜10週令のマウスまたはヌ 一ドマウスに、 （c)で取得した本発明で用いられるモノクローナル抗体を産 生するハイプリ ドーマ細胞 5〜20 X 106細胞ノ匹を腹腔内に注射する。 10〜 21 S間でハイブリ ドーマは腹水癌化する。
該腹水癌化したマウスから腹水を採取し、 3，000rpmで 5分間遠心分離し て固形分を除去する。
得られた上清より、ポリ クローナル抗体で用いた方法と同様の方法でモノ クローナル抗体を精製、 取得するこ とができる。
抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキッ ト またはラッ トモノク ローナル抗体タイピングキッ トを用いて行う。ポリぺプ チド量は、 ローリー法あるいは 280nmでの吸光度より算出する。
上記、 GPR4を認識する抗体を含有する搔痒の予防および/または治療剤 は以下のように調製することができる。
該抗体を有効成分として含有する医薬は、該有効成分を単独で投与するこ とも可能ではあるが、通常は該有効成分を薬理学的に許容される一つあるい はそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる 任意の方法により製造した医薬製剤と して提供するのが望ましい。好ましく は水、 あるいは食塩、 グリシン、 グルコース、 ヒ トアルブミン等の水溶液等 の水性担体に溶解した無菌的な溶液が用いられる。 また、 製剤溶液を生理的 条件に近づけるための緩衝化剤や等張化剤のような、薬理学的に許容される 添加剤、 例えば、 酢酸ナト リ ウム、 塩化ナト リ ウム、 乳酸ナトリ ウム、 塩化 カリ ウム、 クェン酸ナトリ ゥム等を添加することもできる。 また、 凍結乾燥 して貯蔵し、 使用時に適当な溶媒に溶解させて用いることもできる。
投与経路は、 治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、 経口 投与、 または静脈内投与等の非経口投与を挙げることができる。 投与形態と しては、 錠剤、 注射剤等が挙げられる。
経口投与に適当な製剤と しては、 錠剤等が挙げられる。 錠剤等は、 乳糖、 マンニトール等の賦形剤、 デンプン等の崩壊剤、 ステアリ ン酸マグネシゥム 等の滑沢剤、 ヒ ドロキシプロピルセルロース等の結合剤、 脂肪酸エステル等 の界面活性剤、 グリセリ ン等の可塑剤等を添加剤と して用いて製造できる。 非経口投与に適当な製剤と しては、 注射剤等が挙げられる。 例えば、 注射 剤は、 塩溶液、 ブドウ糖溶液または両者の混合物からなる担体等を用いて調 製する。 また、 非経口剤においても経口剤で添加剤と して例示した成分を添 加することもできる。
投与量または投与回数は、 目的とする治療効果、 投与方法、 治療期間、 年 齢、 体重等により異なるが、 通常成人 1 日当たり 10 ^ g /kg〜 8 mg/kgであ る。
GPR4 の構成的活性により生じるシグナル伝達に関する機能を抑制する物 質は、該構成的活性により生ずるシグナル伝達を抑制することのできる物質 を探索することによっても取得することができる。
GPR4 に拮抗作用を有する化合物としては、 例えば、 式 （I) で表される化 合物が挙げられる。 以下、 式 ( I ) で表される化合物を化合物 ( I) という。 他の式番号の化合物についても同様である。
化合物（I)の各基の定義において、 以下の例示が挙げられる。 (i)低級アルキルおよぴ低級アル力ノィルの低級アルキル部分と しては、 例 えば直鎖または分岐状の炭素数 1 〜 1 0のアルキルが拳げられ、具体的には メチノレ、 ェチノレ、 プロピノレ、 イ ソプロピノレ、 プチノレ、 イ ソプチノレ、 sec—ブ チノレ、 tert—プチノレ、 ペンチノレ、 イ ソペンチノレ、 ネオペンチル、 へキシノレ、 ヘプチル、 ォクチル、 イ ソォクチル、 ノニル、 デシル等が挙げられる
(ii)シク口アルキルと しては、例えば炭素数 3 〜 8のシク 口アルキルが挙げ られ、 具体的にはシク ロプロ ピル、 シクロプチノレ、 シクロペンチル、 シクロ へキシル、 シクロへプチル、 シクロォクチル等が挙げられる。
(iii)低級アルケニルと しては、 例えば直鎖、 分岐または環状の炭素数 2〜 8のアルケニルが挙げられ、 具体的にはビュル、 ァ リル、 1 一プロぺニル、 プテ-ノレ、 ペンテニノレ、 へキセ二ノレ、 ヘプテニノレ、 ォクテ二ノレ、 シクロへキ セ -ル、 2 , 6—ォクタジェニル等が挙げられる。
(iv)低級アルキニルと しては、例えば直鎖または分岐状の炭素数 2〜 8のァ ルキニルが挙げられ、 具体的にはェチュル、 プロピニル、 プチニル、 ペンチ -ル、 へキシニル、 ヘプチュル、 ォクチニル等が挙げられる。
(V)ハロゲンは、 フッ素、 塩素、 臭素およびヨ ウ素の各原子を表す。
(vi)ァリールおよびそれぞれが隣接する 2つの炭素原子と一緒になつて形 成される芳香環から水素原子を一つ除いた基と しては、 例えば炭素数 6〜 1 4の単環性、 二環性または三環式のァリールが挙げられ、 具体的にはフエ ニル、 ナフチル、 イ ンデュル、 アン トラ -ル等が挙げられる。
(vi i)ァラルキルおよび複素環アルキルのアルキレン部分は、 前記の低級ァ ルキル（i)の定義から水素原子を一つ除いたものと同義である。
(viii)ァラルキルのァリール部分と しては、前記ァリール（vi)の定義で挙げ た基に加え、例えば前記ァリ ールがシク口アルキルと縮合した二環性縮合環 基が挙げられ、 具体的にはイ ンダニル、 1 , 2 , 3 , 4—テ トラヒ ドロナフ チル、 6 , 7 , 8 , 9ーテ トラヒ ドロー 5 H—ベンゾシク ロへプチル等が挙 げられる。
(ix)複素環基および複素環アルキルの複素環基部分ならびにそれぞれが隣 接する 2つの炭素原子と一緒になつて形成される複素環から水素原子を一 つ除いた基と しては、 例えば窒素原子、 酸素原子および硫黄原子から選ばれ る少なく とも 1個の原子を含む 5員または 6員の単環性複素環基、 3 ~ 8員 の環が縮合した二環または三環式であって窒素原子、酸素原子および硫黄原 子から選ばれる少なく とも 1個の原子を含む縮環性複素環基等が挙げられ、 具体的にはピリ ジル、 ピラジニル、 ピリ ミジニル、 ピリダジニル、 ベンゾィ ミダゾリ ル、 2—ォキソベンゾイミダゾリ ル、 ベンゾ ト リァゾリル、 ベンゾ フリル、 ベンゾチェニル、 プリュル、 ベンゾォキサゾリル、 ベンゾチアゾリ ル、 ベンゾジォキソリル、 インダゾリル、 インドリル、 イ ソインドリル、 キ ノ リル、イソキノ リル、 フタラジニル、 ナフチルリ ジ -ル、 キノキサリニル、 ピロ リル、 ピラゾリル、 キナゾリ ニル、 シンノ リ ニル、 ト リ ァゾリル、 テ ト ラゾリル、 イ ミダゾリル、 ォキサゾリル、 イ ソォキサゾリル、 チアゾリル、 イソチアゾリル、 チェ二 Λ^、 フ リ ^/、 ピロ リ ジュノレ、 2， 5 —ジォキソピロ リ ジニル、 チアゾリジ-ル、 ォキサゾリ ジニル、 ピペリ ジル、 ピペリジノ、 ピぺラジュノレ、 ホモピペラジニノレ、 ホモピペリ ジノレ、 ホモピぺリジノ、 モノレ ホリ ニル、 モルホリ ノ、 チオモルホリ ニル、 チオモルホリ ノ、 ピラエル、 テ トラヒ ドロピリ ジル、 テ トラ ヒ ドロビラニル、 テ トラヒ ドロフラニル、 テ ト ラヒ ドロキノ リル、 テ トラ ヒ ドロイソキノ リル、 ォクタヒ ドロキノ リル、 ィ ン ドリ ニル等が挙げられる。
(X)隣接する窒素原子と一緒になつて形成される複素環基と しては、 例えば 少なく とも 1個の窒素原子を含む 5員または 6員の単環性複素環基（該単環 性複素環基は、他の窒素原子、酸素原子または硫黄原子を含んでいてもよい）、
3〜 8員の環が縮合した二環または三環式で少なく とも 1個の窒素原子を 含む縮環性複素環基 （該縮環性複素環基は、 他の窒素原子、 酸素原子または 硫黄原子を含んでいてもよい） 等が挙げられ、 具体的にはピリジル、 テトラ ヒ ドロピリジル、 イン ドリ ニル、 イ ソイン ドリ ニル、 ピロ リ ジニル、 チァゾ リ ジニル、ォキサゾリ ジニ^^、 ピぺリ ジノ、ホモピペリ ジノ、 ピペラジニル、 ホモピぺラジュノレ、 モノレホリ ノ、 チォモノレホリ ノ、 ぺ/レヒ ドロアゼピ-ノレ、 ペルヒ ドロアゾシニノレ、テ トラヒ ドロキノ リル、テ トラ ヒ ドロイソキノ リル、 ォクタヒ ドロキノ リ ル、 ベンゾイ ミ ダゾリ ル、 イ ンダゾリ ル、 イ ン ドリ ル、 イ ソインドリル、 プリ ニル、 ジヒ ドロインドリル、 ピロ リル、 ジヒ ドロ ピロ リル、 ピラゾリル、 ト リ ァゾリ ル、 テ トラゾリル、 イ ミダゾリル等が挙げら れる。
(x i )置換低級アルキルおよび置換低級アル力ノィルにおける置換基と して は、 同一または異なって、 例えば置換基数 1〜 3の、 シク ロアルキル、 低級 アルカノィル、 低級アルコキシ、 ァリールォキシ、 置換ァリールォキシ [該 置換ァリールォキシにおける置換基と しては、 同一または異なって、 例えば 置換基数 1 ~ 3 の、 低級アルキル、 低級アルコキシ、 低級アルコキシカルボ ニル、 ハロゲン、 シァノ、 ニ トロ、 ヒ ドロキシ、 カルボキシ、 ァミ ノ等が挙 げられる。 ここで低級アルキルは前記低級アルキル（i )と同義であり、 ハロ ゲンは前記ハロゲン（V )と同義であり、 低級アルコキシおよび低級アルコキ シカルボニルの低級アルキル部分は前記低級アルキル（i )と同義である]、 ァ ラルキルォキシ、 置換ァラルキルォキシ [該置換ァラルキルォキシにおける 置換基と しては、 同一または異なって、 例えば置換基数 1 ~ 3 の、 低級アル キル、 低級アルコキシ、 低級アルコキシカルボニル、 ハロゲン、 シァノ、 二 トロ、 ヒ ドロキシ、 カルボキシ、 ァミ ノ等が挙げられる。 ここで低級アルキ ルは前記低級アルキル（i )と同義であり、ハロゲンは前記ハロゲン（V)と同義 であり、低級アルコキシおよび低級アルコキシカルボ-ルの低級アルキル部 分は前記低級アルキル（i )と同義である]、 低級アルカノィルォキシ、 低級ァ ノレコキシカノレボニノレ、 ノヽロゲン、 シァノ、 ニ トロ、 ヒ ドロキシ、 カノレボキシ、 ァミ ノ、 低級アルキルチオ、 置換低級アルキル [該置換低級アルキルにおけ る置換基と しては、 同一または異なって、 例えば置換基数 1〜 3のヒ ドロキ シ、 ハロゲン等が挙げられる]、 置換低級アルカノィル [該置換低級アル力 ノィルにおける置換基と しては、 同一または異なって、 例えば置換基数 1〜 3のハロゲン等が挙げられる]、 モノまたはジ低級アルキルァミ ノ、 低級ァ ノレキルスノレホニル、 低級アルキノレスノレフィニル、 低級ァノレコキシ力ノレボニル ァミ ノ、 低級アルカノィルァミ ノ、 モノまたはジ低級アルキルアミ ノカルボ ニル、 モノまたはジ低級アルキルアミ ノカルボ-ルォキシ、 複素環基等が挙 げられる。
ここで示したァリ一ノレォキシおよびァラルキルォキシのァリ ル部分、 シ ク ロアルキル、 ハロゲン、 複素環基、 ならびに低級アルカノィル、 低級アル コキシ、 低級アルカノィルォキシ、 低級アルコキシカルボニル、 低級アルキ ルチオ、 低級アルキルスルホニル、 低級アルキルスルフィ ニル、 低級アルコ キシカルボニルァミ ノおよび低級アル力ノィルァミ ノの低級アルキル部分 は、 それぞれ前記ァリール（v i )、 シク ロアルキル（i i )、 ハロゲン（V；)、 複素 環基（i x)、 および低級アルキル（i )と同義であり、 ァラルキルォキシのアル キレン部分は、 前記低級アルキル（i )から水素原子を一つ除いたものと同義 である。
モノまたはジ低級アルキルァミ ノ、モノまたはジ低級アルキルァミ ノカル ボニルおよびモノまたはジ低級アルキルアミ ノカルボニルォキシの低級ァ ルキル部分は、 'それぞれ前記低級アルキル（i )と同義であり、 ジ低級アルキ ルァミ ノ、 ジ低級アルキルァミ ノカルボニルぉよぴジ低級アルキルァミ ノ力 ルボニルォキシの 2つの低級アルキル部分は、それぞれ同一でも異なってい てもよい。
(x i i )置換ァリ ール、 置換ァラルキル、 置換シク ロアルキル、 置換低級アル ケニル、 置換低級アルキニル、 置換複素環基、 置換複素環アルキル、 隣接す る窒素原子と一緒になつて形成される置換複素環基、それぞれが隣接する 2 つの炭素原子と一緒になつて形成される置換芳香環およびそれぞれが隣接 する 2つの炭素原子と一緒になつて形成される置換複素環における置換基 と しては、 前記置換低級アルキルにおける置換基 （x i ) の定義で挙げた基に 加え、 低級アルキル、 ァ リ ール、 置換ァ リ ール、 ァラルキル、 置換ァラルキ ル、 複素環基、 置換複素環基、 複素環アルキル、 置換複素環アルキル等が挙 げられる。 さ らに、 置換ァリールおよぴ隣接する窒素原子と一緒になつて形 成される置換複素環基における置換基は低級アルキル [該低級アルキルは前 記低級アルキル（i )と同義である] または置換低級アルキル [該低級アルキ ルは前記低級アルキル（i )と同義であり、 該置換低級アルキルにおける置換 基と しては、 同一または異なって、 例えば置換基数 1〜3 の、 ハロゲン、 ヒ ドロキシ、 カルボキシ、 低級アルコキシカルボニル等が挙げられる。 ここで ハロゲンは前記ハロゲン （V) と同義であり、 低級アルコキシカルボエルの 低級アルキル部分は前記低級アルキル（i )と同義である] であってもよい。 ここで示した低級アルキル、 ァリ ール、 複素環基および複素環アルキルの 複素環基部分、 ァラルキルおよび複素環アルキルのアルキレン部分ならびに ァラルキルのァ リ ール部分は、それぞれ前記低級アルキル（i )、ァリ ール（v i ) . 複素環基（i x)、 ァラルキルのアルキレン部分（v i i )およびァラルキルのァリ ール部分（v i i i )と同義である。 また、 置換ァリール、 置換ァラルキル、 置換 複素環基、 置換複素環アルキルにおける置換基と しては、 同一または異なつ て、 例えば置換基数 1〜 3 の、 低級アルキル [該低級アルキルは前記低級ァ ルキル（i )と同義である]、 低級アルコキシ [該低級アルコキシの低級アルキ ル部分は前記低級アルキル（i)と同義である]、 ハロゲン [該ハロゲンは前記 ハロゲン （V ) と同義である] 等が挙げられる。
化合物 （I ) の四級アンモニゥム塩と しては、 化合物 （I ) の塩基性部位に ハロゲン化低級アルキル (該低級アルキルおよび該ハ口ゲンはそれぞれ前記 と同義である） 、 ハロゲン化ァラルキル （該ハロゲンおよび該ァラルキルは それぞれ前記と同義である） 、 ヒ ドロキシ低級アルキル (該低級アルキルは 前記と同義である）等が付加した四級アンモニゥム塩であれば特に限定され ないが、 例えばジメチルァミ ノ基を有する化合物 ( I) にヨ ウ化メチルを作 用させて得られる四級アンモニゥム塩、 ピペリ ジノ基を有する化合物 （I) にヨ ウ化メチルを作用させて得られる四級アンモニゥム塩、 ピロ リ ジノ基を 有する化合物 ( I ) にヨ ウ化メチルを作用させて得られる四級アンモニゥム 塩、 モルホリ ノ基を有する化合物 （I) に臭化ベンジルを作用させて得られ る四級アンモニゥム塩、 ピロ リ ジノ基を有する化合物 （I ) にヨ ウ化工チル を反応させて得られる四級アンモニゥム塩においてヨ ウ化物イオンと水酸 化物イオンが交換されて得られる四級アンモニゥム塩等が挙げられる。
化合物（I)の薬理学的に許容される塩と しては、 毒性のない、 水溶性のも のが好ましく 、 例えば塩酸塩、 臭化水素酸塩、 硝酸塩、 硫酸塩、 リ ン酸塩等 の無機酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、 クェン酸塩、 フマル酸塩、 ダルコン酸塩、 乳酸塩、 マレイン酸塩、 リ ンゴ酸塩、 シュゥ酸塩、 メタンス ルホン酸塩、 酒石酸塩等の有機酸塩等の酸付加塩、 ナト リ ウム塩、 カ リ ウム 塩等のアル力 リ金属塩、 マグネシウム塩、 カルシウム塩等のアル力 リ土類金 属塩、 アルミニウム塩、 亜鉛塩等の金属塩、 アンモニゥム、 テ トラメチルァ ンモニゥム等のアンモ-ゥム塩、 モルホリ ン付加塩、 ピペリ ジン付加塩等の 有機アミ ン付加塩、 またはグリ シン付加塩、 フエ二ルァラニン付加塩、 リ ジ ン付加塩、 ァスパラギン酸付加塩、 グルタミン酸付加塩等のアミノ酸付加塩 等が挙げられる。
次に化合物（I)の製造法について説明する。
なお、以下に示した製造法において、定義した基が反応条件下変化する力 または方法を実施するのに不適切な場合、 有機合成化学で常用される方法、 例えば官能基の保護、 脱保護等 [例えば、 プロテクティブ ' グループス ·ィ ン · オーガニック ， シンセシス 第三版 (Protective Groups in Organic Synthesis, the third edition) , グリーン （T. W. Greene)、 ワッツ (Peter G. M. Wuts) 著、 ジョ ン . ワイ リー ' アンド ' サンズ ' イ ンコーポレイテッ ド (John Wiley & Sons Inc. ) (1999 年）] の手段に付すことにより容易に製 造を実施することができる。 また、 必要に応じて置換基導入等の反応工程の 順序を変えることもできる。 化合物 （I- a) は、 以下に示す製造方法によって得ることができる。
製造法 1
Figure imgf000028_0001
(式中、 R2、 R3、 R4、 R5、 R6、 Xおよび Yはそれぞれ前記と同義であり、 は 低級アルキル、 ァリルまたはベンジルを表し、 。および R11は同一または異 なって低級アルキルまたはシク口アルキルを表すか、 R1。および R11が隣接す る窒素原子と一緒になつて複素環基を形成し、 Uはハロゲン、 アルコキシス ノレホニノレォキシ、 ァリールォキシスノレホニクレオキシ、 ァノレキノレスノレホニノレオ キシまたはァリーノレスルホニルォキシを表す） 上記の定義において、 低級アルキル、 シクロアルキルおよびハロゲンはそ れぞれ前記と同義である。アルコキシスルホニルォキシおよびアルキルスル ホニルォキシのァノレキル部分、ァリールォキシスノレホニルォキシおよびァリ 一ルスルホニルォキシのァリール部分は、 それぞれ前記低級アルキル、 ァリ ールと同義である。隣接する窒素原子と一緒になつて形成される複素環基は 前記と同義である。
<工程 1〉
化合物 （I l ia ) を原料と して用い、 特開平 7— 61983 に開示された方法に 従い、 1当量〜大過剰の YH (式中、 Yは前記と同義である） と反応させるこ とにより、 化合物 （IV) を得ることができる。 なお、 化合物 （Ili a) は特開 平 7— 61983 に開示された方法またはそれに準じた方法により合成すること ができる。
<工程 2 >
化合物 （IV) を不活性溶媒中、 1当量〜大過剰のホルムアルデヒ ド水溶液 存在下に、 1 当量〜大過剰の R H (式中、 R5および はそれぞれ前記と同 義である） またはその塩酸塩と反応させることにより、 化合物 （I-a) を得 ることができる。 また、 ホルムアルデヒ ド水溶液に代え、 トリオキシメチレ ン、パラホルムアルデヒ ド等のホルムアルデヒ ド等価体を用いることもでき る。
反応は通常、酸性条件下で良好に進行するので、必要に応じて塩酸、酢酸、 トリフルォロ酢酸等の酸を反応系内に添加するのが好ましい。 反応は通常、 0°Cから反応に用いた溶媒の沸点の間の温度、 好ましくは室温〜 80°Cの間の 温度で行い、 5分間から 100時間で終了する。 不活性溶媒と しては、 例えば 水、 メタノール、 エタノール、 酢酸、 ト リフルォロ酢酸、 ジクロロェタン、 ク ロ 口ホノレム、 テ ト ラ ヒ ドロフラン、 ジメ チノレアセ トアミ ド、 ジメチノレホノレ ムアミ ド、 ァセ トン等を単独でまたは混合して用いることができ、 好ましく はクロ口ホルムと酢酸の混合溶媒が用いられる。 化合物 （I- b ) から、 以下に示す方法によって化合物 （I-c ) を製造するこ とができる。 製造法 2
Figure imgf000030_0001
(式中、 R2、 R R R5、 R6、 R5b、 R6b、 R8、 U、 n、 X および Y はそれぞれ前 記と同義である）
<工程 3 >
化合物 （I- b) を不活性溶媒中、 1 当量〜大過剰の R8U (式中、 R8および U はそれぞれ前記と同義である） と、 通常一 10°Cから反応に用いた溶媒の沸点 の間の温度、 好ましくは室温で、 1〜48時間反応させることにより、 化合物 ( I - c) を得ることができる。
不活性溶媒と しては、 例えば水、 メタノール、 エタノール、 ベンゼン、 ト ノレェン、 キシレン、 酢酸ェチノレ、 へキサン、 ァセ トニ ト リノレ、 ジクロロメタ ン、 ジクロロェタン、 ク ロ ロ ホノレム、 四塩化炭素、 1 , 4一ジォキサン、 テ ト ラヒ ドロフラン、 ジメチルァセ トアミ ド、 ジメチルホルムアミ ド、 アセ トン 等を単独でまたは混合して用いることができ、 好ましく は酢酸ェチル、 ジク ロロメタン、 ク ロ口ホルム等が用いられる。 化合物 （I-c ) から、 以下に示す方法によって化合物 （I - b) を製造するこ とができる。
製造法 3
Figure imgf000030_0002
(式中、 R2、 R3、 R4、 R5、 R6、 R5b、 R6b、 R8、 U、 n、 Xおよび Yはそれぞれ前記 と同義である）
<工程 4 >
化合物 （I- c) を不活性溶媒中、 1当量〜大過剰の R5R H (式中、 R5および R6はそれぞれ前記と同義である） と、 通常一 10°Cから反応に用いた溶媒の沸 点の間の温度、 好ましくは 20°C〜100°Cの間の温度で、 1〜100時間反応させ ることにより、 化合物 （I-b) を得ることができる。
不活性溶媒と しては、 例えば水、 メタノール、 エタノール、 ベンゼン、 ト ノレェン、 キシレン、 酢酸ェチノレ、 へキサン、 ァセ トニ ト リノレ、 ジクロロメタ ン、 ジクロロェタン、 ク ロ口ホルム、 四塩化炭素、 1 , 4—ジォキサン、 テ ト ラヒ ドロフラン、 ジメチルァセ トアミ ド、 ジメチルホルムアミ ド、 アセ トン 等が単独でまたは混合して用いられ、 好ましくはクロ口ホルム、 ジメチルホ ルムアミ ド等が用いられる。 反応は通常、 塩基性条件下で良好に進行するの で、 必要に応じて適当な塩基を反応系内に添加することが望ましい。 塩基と しては、例えばトリェチノレアミ ン、ジィソプロピルェチルァミ ン、ピリ ジン、 N -メチルモルホリ ン、 炭酸カリ ウム、 水素化ナトリ ウム、 水素化カリ ウム、 水素化カルシウム、 ジイ ソプロ ピルェチルァミ ン、 1 , 8—ジァザビシク ロ [5. 4. 0]ゥンデックー 7—ェン等を用いることができ、中でも トリエヂルァミ ンが好ましい。 化合物 （I- b) 中、 化合物 （I- d) を用い、 以下に示す方法によって化合物 ( I-e) を製造することができる。
製造法 4
Figure imgf000031_0001
(式中、 R2、 R3、 R4、 n、 Xおよび Yはそれぞれ前記と同義であり、 R14および R15 は同一または異なって水素、 置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換 もしく は非置換のシク口アルキル、 置換もしくは非置換の低級ァルケ-ル、 置換もしく は非置換の低級アルキニル、 置換もしく は非置換のァラルキル、 または置換もしくは非置換の複素環アルキルを表すか、 R14および R15が隣接 する CH (CH2) nNと一緒になつて置換もしく は非置換の複素環を形成してもよ い。 R16 は水素、 置換もしく は非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換 のシクロアルキル、 置換も しくは非置換の低級ァルケ-ル、 置換も しくは非 置換の低級アルキニル、 置換もしくは非置換のァラルキル、 または置換もし くは非置換のァリールを表し、 mは 0〜3の整数を表す）
低級アルキル、 シクロアルキル、 低級アルケニル、 低級アルキニル、 ァラ ルキル、 複素環アルキル、 およびァリールはそれぞれ前記と同義であり、 そ れらの置換基もそれぞれ前記と同義である。
R14および R15が隣接する CH (CH2) nN と一緒になつて形成される置換もしく は非置換の複素環としては、 テ トラヒ ドロピリジン、 ピロ リジン、 ピぺリジ ン、 ホモピぺリ ジン、 ピぺラジン、 ホモピぺラジン、 モノレホリ ン、 チォモノレ ホリ ン、ぺノレヒ ドロアゼピン、ぺノレヒ ドロアゾシン、テ トラ ヒ ドロキノ リ ン、 テトラヒ ドロイソキノ リ ン等があげられ、それらの置換基は前記の隣接する 窒素原子と一緒になって形成される複素環基の置換基と同義である。
<工程 5 >
化合物（I-d)を不活性溶媒中、 通常一 78°C ~ 40 °Cの間の温度で、 2〜4 当 量の水素化アルミニゥムリチウム、 ジィソプロピル水素化アルミニゥムリ チゥム等、 好ましくはジィソプロピル水素化アルミニゥムリチゥム等の還 元剤存在下で 10 分間〜 24 時間、 好ましくは 1〜3 時間処理することによ り化合物 (i-e)を得ることができる。
不活性溶媒と しては、 例えばジクロロメタン、 クロ口ホルム、 四塩化炭 素、 ジクロロェタン、 ベンゼン、 トノレェン、 キシレン、 テ トラ ヒ ドロフラ ン、 ジェチルエーテル等を単独でまたは混合して用いることができ、 好ま しくはジクロロメタンまたはトルエンが用いられる。 化合物 （I - から以下に示す方法によって化合物 （I- f ) を製造すること ができる
製造法 5
Figure imgf000033_0001
(式中、 R2、 R R4、 R14、 R15、 R16、 n、 X、 Yおよび mはそれぞれ前記と同義 である）
<工程 6 >
化合物（I-d)を不活性溶媒中、 通常 0°Cから反応に用いた溶媒の沸点の間 の温度、 好ま しく は室温〜 100°Cの間の温度で、 1 当量〜大過剰の適当な塩 基存在下、 1〜48 時間、 好ま しく は 1〜3 時間処理するこ とによ り化合物 (I - f)を得るこ とができる。
適当な塩基と しては、 例えば水酸化ナ ト リ ウム、 水酸化リ チウム、 水酸 化カ リ ウム、 炭酸カ リ ウム、 炭酸セシウム、 ナ ト リ ウムメ トキシ ド等が例 示され、 好ま しく は水酸化ナ ト リ ウムが挙げられる。 不活性溶媒と しては、 例えば水、 テ トラ ヒ ドロフラン、 ジェチルエーテル、 メ タ ノール、 ェタ ノ 一ノレ、 プロノ ノーノレ、 ジク ロ ロメ タン、 ジクロ ロエタン、 ベンゼン、 トノレ ェン、 キシレン等を単独でまたは混合して用いることができ、 好ま しく は テ トラ ヒ ドロフランも しく はメ タノール、 またはそれらと水の混合溶媒が 用いられる。 化合物 （I-c) 中、 化合物 （I- g) から以下に示す方法によって化合物 （I-h) を製造するこ とができる。
製造法 6
Figure imgf000034_0001
(式中、 R2、 R3、 R4、 n、 X、 Yおよび tnはそれぞれ前記と同義であり、 R17お よび R18aはそれぞれ前記 R14および前記 R15と同義であり、Tはアル力 リ金属、 アンモニゥム、 ト リ アルキルシリル、 または ト リ アルキルチンを表す) 上記の定義において ト リ アルキルシリルおょぴト リ アルキルチンにおけ るアルキルは前記低級アルキルと同義である。 アル力リ金属と してはナト リ ゥム、 カ リ ゥム等があげられる。
<工程 7 >
化合物（I- g)を不活性溶媒中、 0°Cから反応に用いた溶媒の沸点の間の温度、 好ま しく は室温〜 200°Cの間の温度で、 1 当量〜大過剰、 好ましく は 2〜4当 量の TN3 (式中、 Tは前記と同義である）と、 通常反応を加速させるために触 媒量〜大過剰、 好ま しく は 0. 5〜2 当量の適当な添加剤の存在下、 1〜200時 間、 好ましく は 3〜48時間反応させるこ とによ り化合物（I - h)を得ることが できる。
適当な添加剤と しては、 例えば四塩化けい素、 塩化リチウム、 塩化アルミ 二ゥム、 塩化アンモニゥム、 塩化ト リ アルキルすず、 酸化ジアルキルすず、 ト リ アルキルアルミニウム、 ト リェチルアミ ン'塩酸塩、 ト リェチルァミ ン . 臭化水素酸塩、 水素化ナト リ ウム、 カ リ ウム t ert-プトキシド、 水酸化ナト リ ウム、 臭化亜鉛等が例示され、 好ま しく は塩化アンモニゥム、 酸化ジアル キルすず等が挙げられる。不活性溶媒と しては、例えば水、ァセ トニ ト リル、 ジメチルホルムァミ ド、 ジメチルァセ トアミ ド、 N-メチル- 2-ピロ リ ドン、 ジメチルスルホキシド、 酢酸、 氷酢酸、 テ トラヒ ドロフラン、 ベンゼン、 ト ルェン、 キシレン等を単独でまたは混合して用いるこ とができ、 好ましく は ジメチルホルムァミ ドまたはトルエンが用いられる。 化合物 （I - c ) から以下に示す方法によって化合物 （I-i ) を製造すること ができる
製造法 7
Figure imgf000035_0001
(式中、 R2、 R3、 R4、 R5、 R6、 R8、 U、 n、 Xおよび Yはそれぞれ前記と同義で あり、 R18は置換も しく は非置換の低級アルキルを表し、 Qはアル力 リ金属ま たはアルカ リ土類金属を表し、 Q がアルカ リ金属の場合には p は 1 を表し、 Qがアルカ リ土類金属の場合には pは 2 を表す）
上記の定義においてアル力リ金属は前記アル力 リ金属と同義であ り、 アル カリ土類金属と してはマグネシウム、 カルシウム等が挙げられる。
く工程 8 >
化合物（I-c)を不活性溶媒中、 0°Cから反応に用いた溶媒の沸点の間の温度, 好ま しく は 70°C〜80°Cの間の温度で、 1 当量〜大過剰、 好ま しく は 4〜8 当 量の（R18C02) pQ (式中、 R18、 Q および p はそれぞれ前記と同義である）と、 1 ~ 100時間、 好ま しく は 3 ~ 72 時間反応させることによ り化合物（I- i )を得 ることができる。
不活性溶媒と しては、 例えばジメチルァセ トアミ ド、 N-メチル -2-ピロ リ ドン、 ジメチルスルホキシド等を単独でまたは混合して用いるこ とができ、 好ま しく はジメチルスルホキシドが用いられる。 化合物 （I - c ) から以下に示す方法によって化合物 （I-j ) を製造すること ができる。
製造法 8
Figure imgf000036_0001
(式中、 R2、 R3、 R4、 R5、 Re、 R7a、 R8、 U、 n、 Xおよび Yはそれぞれ前記と同 義である）
<工程 9 >
化合物（I_c)を不活性溶媒中、 0°Cから反応に用いた溶媒の沸点の間の温度、 好ましくは 30°C〜80°Cの間の温度で、 1 当量〜大過剰、 好ましくは 2〜8当 量の R7aSH (式中、 R7aは前記と同義である）と、 1 当量〜大過剰、 好ましくは 1 ~ 3当量の適当な塩基存在下、 1〜100時間、 好ましくは 3 ~ 72時間反応さ せることにより化合物（I- j)を得ることができる。
適当な塩基と しては、 例えばトリェチルァミン、 ジイソプロピルェチルァ ミ ン、 ピリジン、 N-メチルモルホリ ン、 炭酸力リ ウム、 水素化ナトリ ウム、 水素化カ リ ウム、 水素化カルシウム、 ジイ ソプロピルェチルァミ ン、 1 , 8— ジァザビシクロ [5. 4. 0]ゥンデック ー 7—ェン等を用いることができ、中でも 1， 8—ジァザビシクロ [5. 4. 0]ゥンデックー 7—ェンが好ましい。 不活性溶媒 としては、 例えばジクロロメ タン、 クロ口ホルム、 四塩化炭素、 ジクロロエタ ン、 ベンゼン、 トルエン、 キシレン、 酢酸ェチル、 ジメチノレアセ トアミ ド、 N - メチル -2-ピロリ ドン、 ジメチルスルホキシ ド等を単独でまたは混合して用 いることができ、 好ましくはクロ口ホルムが用いられる。 化合物 （I- j ) 中、化合物 （I-k) から以下に示す方法によって化合物 （1-1 ) を製造することができる。
製造法 9
Figure imgf000037_0001
(式中、 R2、 R\ R4、 R15、 R16、 m、 n、 Xおよび Yはそれぞれ前記と同義であ る）
<工程 1 0 >
化合物 （I-k) を用いて製造法 5の工程 6 と同様な反応を行うことにより 化合物 （1-1) を製造することができる。 化合物 (i-i) から以下に示す方法によって化合物 (I-m) を製造すること ができる。
製造法 1 0
Figure imgf000037_0002
(式中、 R2、 R3、 R4、 R18、 n、 Xおよび Yはそれぞれ前記と同義である） <工程 1 1 >
化合物 （I - i) を用いて製造法 5の工程 6 と同様な反応を行うことにより 化合物 （I - in) を製造することができる。 化合物 (I-m) から以下に示す方法によって化合物 (I-n) を製造すること ができる。
製造法 1 1
Figure imgf000038_0001
(式中、 R2、 R3、 R4、 U、 n、 Xおよび Yはそれぞれ前記と同義であり、 R7cは 前記 R7の定義から水素を除いた基を表す）
く工程 1 2 >
化合物 （I- m) を不活性溶媒中、 0°Cから反応に用いた溶媒の沸点の間の温 度、 好ましくは室温から 80°Cの間の温度で、 1当量〜大過剰、 好ましくは 1 〜 3当量の適当な塩基存在下、 1当量〜大過剰、 好ましくは 1〜 3当量の R7°U (式中、 R7cおよび ϋはそれぞれ前記と同義である）と、 1〜48時間、 好ましく は 3〜24時間反応させることにより化合物（I- η)を得ることができる。
適当な塩基としては、 例えば炭酸力リ ウム、 水素化ナトリ ウム、 水素化力 リ ウム、 水素化カルシウム、 低級アルキルリチゥム等が例示され、 好ましく は、 水素化ナトリ ゥム、 水素化力リ ゥム等が挙げられる。 不活性溶媒として は、 例えばジクロロメ タン、 クロ口ホルム、 四塩ィ匕炭素、 ジクロロェタン、 ベ ンゼン、 トルエン、 キシレン、 酢酸ェチル、 ジメ チノレホノレムアミ ド、 ジメチ ルァセ トアミ ド、 Ν-メチノレ— 2-ピロ リ ドン、 テ ト ラ ヒ ドロ フラン、 ジェチノレ エーテル等を単独でまたは混合して用いることができ、好ましくはクロロホ ルムが用いられる。 化合物 ( i-m) において n= l である化合物 ( I- ma) から以下に示す方法に よって化合物 （I- 0 ) を製造することができる。
製造法 1 2
Figure imgf000038_0002
(式中、 、 R3、 R Xおよび Yはそれぞれ前記と同義である） <工程 1 3 >
化合物 （I-ma) を不活性溶媒中、 0°Cから反応に用いた溶媒の沸点の間の 温度、 好ま しく は室温から 60°Cの間の温度で、 1 当量〜大過剰、 好ましく は 3〜6当量の適当な酸化剤存在下、 1〜48時間、 好ま しく は 3〜24時間処 理することにより化合物（I- o)を得ることができる。
適当な酸化剤と しては、 例えば二酸化マンガン、 ク ロム酸、 クロ口ク ロム 酸ピリ ジニゥム、 ニク ロム酸ピリ ジ-ゥム、 過マンガン酸カ リ ウム、 三酸化硫 黄一ピリ ジン、 ォキソン等が挙げられ、 好ましくは二酸化マンガンが挙げられ る。 不活性溶媒と しては、 例えばジクロロメタン、 ク ロ口ホルム、 四塩化炭 素、 ジク ロ ロェタン、 ベンゼン、 トルエン、 キシレン、 酢酸ェチル、 酢酸、 プ ロ ピオン酸、 酪酸、 ト リ フルォロ酢酸、 水、 ピリ ジン、 ジメチノレホノレムアミ ド、 ジメチルァセ トアミ ド、 N-メチル -2-ピロ リ ドン、 1， 4 -ジォキサン、 テ ト ラ ヒ ドロフラン、 ジェチノレエーテノレ等を単独でまたは混合して用いるこ とができ、 好ま しく はジメチルホルムアミ ド、 テ トラ ヒ ドロフラ ン等が用 いられる。 化合物 （ 。） から以下に示す方法によって化合物 （I - P) を製造すること ができる。
製造法 1 3
Figure imgf000039_0001
(式中、 R2、 、 R Xおよび Yはそれぞれ前記と同義である）
く工程 1 4 >
化合物 （1- 0 ) を不活性溶媒中、 0°Cから反応に用いた溶媒の沸点の間の温 度、 好ましく は室温から 90°Cの間の温度で、 1 当量〜大過剰、 好ま しく は 1 〜3当量のヒ ドロキシルァミ ンも しく はその塩酸塩、 硫酸塩、 パラ トルエン スルホン酸塩等、 0-フエニルカーバミルヒ ドロキルアミ ンも しく はその塩酸 塩、 硫酸塩、 パラ トルエンスルホン酸塩等、 または N-ヒ ドロキシベンズァ ミ ド、 好ま しく はヒ ドロキシルァミ ンと、 1 ~ 48時間、 好ま しく は 3 ~ 24時 間反応させるこ とによ り化合物 - P)を得るこ とができる。 必要によ り、 1 当量〜大過剰、 好ましく は 1〜3 当量の適当な脱水剤の添加や、 1 当量〜大 過剰、 好ま しく は 2〜6 当量の適当な塩基の添加、 またはマイク ロ波照射を 行ってもよい。
適当な脱水剤と しては、 例えば無水酢酸、 無水フタル酸、 硫酸水素ナ ト リ ウ ム、 ォキソン、 ギ酸ナト リ ウム、 酸化ジアルキルすず、 アルミナ、 シリ力ゲル、 酢酸ナ ト リ ウム、 ホルムアミ ド、 五酸化二リ ン、 塩化鉄（111)、 ギ酸、 酢酸、 プ ロ ピオン酸、 ォキシ塩化リ ン、 パラ トルエンスルホン酸等が例示され、 好まし く は無水酢酸、 無水フタル酸等が挙げられる。 適当な塩基と しては、 例えば卜 リェチルァミ ン、 ピリジン、水素化ナ トリ ウム、水素化力 リ ゥム等が例示され、 好ましく は ト リエチルァミンまたはピリ ジンが拳げられる。
不活性溶媒と しては、 例えばジクロロメタン、 クロ口ホルム、 四塩化炭素、 ジク ロ ロェタン、 ベンゼン、 トノレェン、 キシレン、 ニ トロベンゼン、 ァセ トニ ト リル、 酢酸ェチル、 酢酸、 プロピオン酸、 酪酸、 トリ フルォロ酢酸、 ピリ ジ ン、 ジメチルホルムアミ ド、 ジメチルァセ トアミ ド、 N -メチル- 2-ピロ リ ド ン、 1 , 4-ジォキサン、テ トラヒ ドロフラン、 ジェチノレエーテノレ、 メタノーノレ、 エタノール、 プロパノール等を単独でまたは混合して用いることができ、 好 ましく はァセ トニ ト リル、 ジメチルホルムァミ ド等が用いられる。 化合物 ( I - p) から以下に示す方法によって化合物 ( I-q) を製造すること ができる。
製造法 1 4
Figure imgf000041_0001
(式中、 、 R R\ T、 Xおよび Υはそれぞれ前記と同義である）
<工程 1 5 >
化合物 （I - ρ) を用いて製造法 6の工程 7 と同様な反応を行うこと より 化合物 ( I-q) を製造することができる。 化合物 ( I-c) から以下に示す方法によって化合物 ( I-r ) を製造すること ができる。
製造法 1 5
Figure imgf000041_0002
(式中、 R2、 R R4、 R5b、 R6b、 R8、 U、 n、 Xおよび Yはそれぞれ前記と同義 であり、 Qaは前記と同義のアルカ リ金属を表す）
<工程 1 6 >
化合物 （I- c) を不活性溶媒中、 室温から反応に用いた溶媒の沸点の間の 温度、 好ましくは 40°C〜80°Cの間の温度で、 1当量〜大過剰、 好ましくは 2 〜4 当量の QaCN (式中、 Qaは前記と同義である）、 好ましく は青酸ナトリ ウ ムと、 1〜 時間、好ましくは 3〜24時間反応させることによ り化合物（I - r) を得ることができる。
不活性溶媒と しては、 例えばジクロロメ タン、 クロ口ホルム、 四塩化炭素、 ジクロロェタン、 ベンゼン、 トノレェン、 キシレン、 ジメチノレホノレムアミ ド、 ジ メチルァセ トアミ ド、 N-メチル- 2-ピロ リ ドン、 1 , 4 -ジォキサン、 テ トラヒ ドロフラン等を単独でまたは混合して用いることができ、好ましくはジメチ ルホルムアミ ド等が用いられる。 化合物 （ト r) から以下に示す方法によって化合物 （I - s) を製造すること ができる。
製造法 1 6
Figure imgf000042_0001
(式中、 R2、 R R T、 n、 Xおよび Yはそれぞれ前記と同義である） く工程 1 7 >
化合物 （I-r) を用いて製造法 6の工程 7 と同様な反応を行うことにより 化 ^物 （I - s) を製造することができる。 化合物 （ト r) から以下に示す方法によって化合物 （I-t) を製造すること ができる。
製造法 1 7
Figure imgf000042_0002
(式中、 R2、 、 R4、 n、 Xおよび Yはそれぞれ前記と同義である） く工程 1 8 >
化合物 （I-r) を用いて製造法 5の工程 6 と同様な反応を行うこと より化 合物 （I - ) を製造することができる。 化合物 （Illb) から以下に示す方法によって化合物 （I- u) を製造する とができる。
製造法 1 8
Figure imgf000043_0001
(式中、 R2、 R3、 R4、 R5、 R6、 R5b、 R6b、 R7c、 R8、 R9、 R10、 Ru、 R18、 Q、 p、 U、 Xおよび Yはそれぞれ前記と同義である）
<工程 1 9 >
化合物 （Illb ) を用いて製造法 7の工程 8 と同様な反応を行うこ とによ り化合物 （V) を製造することができる。
<工程 2 0 >
化合物 （V) を用いて製造法 5の工程 6 と同様な反応を行うことによ り化 合物 （VI) を製造するこ とができる。
<工程 2 1 〉
化合物 （VI) を用いて製造法 1 2の工程 1 3 と同様な反応を行うことによ り化合物 （VII) を製造することができる。 <工程 2 2 >
化合物 （VI I) を不活性溶媒中、 通常 0°C〜80 °Cの間の温度で、 2〜4 当量 の硝酸銀、 酸化銀（1)、 酸化銀（11)、 クロム酸、 クロ ロクロム酸ピリ ジニゥム、 二クロ口クロム酸ピリ ジニゥム、 過マンガン酸力 リ ウム、 過ヨ ウ素酸ナ ト リ ウ ム、 過塩素酸ナ ト リ ゥム、 過酸化水素、 亜塩素酸ナ ト リ ゥム等の酸化剤、 好ま しく は硝酸銀または過塩素酸ナ ト リ ゥム存在下で、 10 分間〜 24 時間、 好まし くは 1〜4時間処理することによ り化合物（VI I I)を製造することができる。 必 要によ り、 添加剤と して、 0. 1〜4 当量の酢酸等の有機物、 または硫酸、 リ ン 酸二水素ナ ト リ ウム、 スルフア ミン麟、 酸化ルテミ ゥム等の無機物を加えても よい。
不活性溶媒と しては、 例えばジェチルエーテル、 テ トラヒ ドロフラン、 1 , 4- ジォキサン、 ジメチルホルムァミ ド、 ジメチルァセ 卜アミ ド、 ジメチルスルホ キシ ド、 ベンゼン、 ト /レエン、 キシレン、 ジク ロ ロメ タン、 ク ロ ロホノレム、 1, 2- ジクロロエタン、 ァセ トニ ト リル、 酢酸ェチル、 酢酸メチノレ、 メチルェチルケ トン、 塩酸、 酢酸、 無水酢酸、 硫酸、 水等が挙げられ、 好ましく はァセ トニ ト リル、 水等が挙げられ、 これらは単独でまたは混合して用いることができる。 <工程 2 3 >
化合物 （VII I ) を不活性溶媒中、 通常 0°C〜80 °Cの間の温度、 好ましく は 室温で、 1〜20 当量のハロゲン化剤と 10 分間〜 24 時間反応させ、 その後、 1 当量〜大過剰の R^OH (式中、 R7。は前記と同義である） と反応させることによ り化合物（IX)を製造することができる。
ハロゲン化剤と しては、 例えば塩化チォ -ル、 ォキサリルクロ リ ド、 ォキシ 塩化リ ン等が挙げられ、 好ましくは塩化チォニルが挙げられる。 不活性溶媒と しては、 例えばジク ロ ロメ タン、 ク ロ 口ホルム、 テ 卜 ラ ヒ ドロ フラン、 ジメチ ルホルムアミ ド、 ジメチルァセ トアミ ド、 1, 4-ジォキサン、 ァセ トニ ト リル、 ベンゼン、 トルエン、 キシレン等が挙げられ、 これらは単独でまたは混合して 用いることができる。 不活性溶媒と して好ましく はジク口ロメ タンが挙げられ る。
<工程 2 4 >
化合物 （IX) を用いて製造法 1の工程 2 と同様な反応を行う ことによ り化 合物 （X) を製造することができる。
<工程 2 5 >
化合物 （X) を用いて製造法 2の工程 3と同様な反応を行うことにより化 合物 （XI ) を製造することができる。
<工程 2 6 >
化合物 （XI ) を用いて製造法 1の工程 1 と同様な反応を行うことにより化 合物 （I - u) を製造するこ とができる。 化合物 （I - u) から以下に示す方法によって化合物 （I -v) を製造すること ができる。
製造法 1 9
Figure imgf000045_0001
(l-u)
(式中、 R2、 、 R R7\ Xおよび Yはそれぞれ前記と同義である）
<工程 2 7 >
化合物 （I - u) を用いて製造法 5の工程 6 と同様な反応を行うこ と より 化合物 （I-v) を製造することができる。 化合物 （I- V ) から以下に示す方法によって化合物 （I - w ) を製造すること ができる。
製造法 2 0 工程 28
R5aRお NH
Figure imgf000046_0001
R1 5a. ,N
(l-v) (l-w)
(式中、 R2、 R3、 R4、 R5a、 R6a、 Xおよび Yはそれぞれ前記と同義である） <工程 2 8 >
化合物 （I- V) を不活性溶媒中、 通常 0°C〜80 の間の温度、 好ましくは室 温で、 1〜20当量のハロゲン化剤と 10分間〜 24時間反応させ、 その後、 1当量 〜大過剰の R5aR6aNH (式中、 R5aおよび R6aはそれぞれ前記と同義である） と反 応させるこ とによ り化合物（I-w)を製造することができる。 必要に応じて、 1 当量〜大過剰の適当な塩基を加えてもよい。
ハ口ゲン化剤と しては、 例えば塩化チォニル、 ォキサリルクロ リ ド、 ォキシ 塩化リ ン等が挙げられ、 好ましく は塩化チォニルが挙げられる。 適当な塩基と しては、例えばピリジン、 ト リエチルアミ ン、ジイソプロ ピノレエチルァミ ン、 N-メチルモルホリ ン等が例示され、 好ま しく は ト リェチルァミ ンが挙げら れる。 不活性溶媒と しては、 例えばジクロロメタン、 クロ口ホルム、 テ トラヒ ドロフラン、ジメチルホルムァミ ド、ジメチルァセ トアミ ド、 1, 4-ジォキサン、 ァセ トニ ト リル、 ベンゼン、 トルエン、 キシレン等が挙げられ、 これらを単独 でまたは混合して用いることができる。 不活性溶媒と して好ましく はジク口口 メタンが挙げられる。
化合物（I-W)の製造においては、 ぺプチド化学で常用される手法を用いる こ ともできる。 すなわち、 化合物（I-v)に不活性溶媒中、 0. 5〜： 10 当量の適 当な縮合剤と共に 1〜10 当量の R5aR6aNH (式中、 R5aおよび K6aはそれぞれ前 記と同義である） を加え、 通常、 0°C〜50 °Cの間の温度で 10分間〜 70時間 反応させることによ り化合物（I- w)を得ることができる。
不活性溶媒と しては、例えばジェチルエーテル、テ トラ ヒ ドロフラン、 1 , 4- ジォキサン、 ジメチルホルムアミ ド、 ジメチルァセ トアミ ド、 ジメチルス ノレホキシ ド、 ベンゼン、 トノレェン、 キシレン、 ァセ トニ ト リノレ、 酢酸ェチ ル、 ピリ ジン、 ジクロロメタン、 ク ロ口ホルム、 四塩化炭素等が挙げられ、 好ましく はテ トラヒ ドロフラン、 ジメチルホルムァミ ド等が挙げられる。 適当な縮合剤と しては、 例えば 1 , 3 -ジシクロへキシルカルボジイ ミ ド、 1-ェチル- 3- (3 -ジメチルァミ ノプロ ピル）カルポジイ ミ ド塩酸塩、 1-ェチル - 3 -（3-ジメチルァミ ノプロ ピル）力ルポジィ ミ ド結合ポリ スチレンレジン ( EDC レジン） 等が挙げられる。 また、 N-ヒ ドロキシこはく酸イ ミ ド、 3, 4 - ジヒ ドロ一 3—ヒ ドロキシ -4-ォキソ -1， 2, 3-ベンゾ ト リアジン、 1—ヒ ドロキシ ベンゾ ト リ アゾール等、 好ましく は 1-ヒ ドロキシベンゾ ト リ アゾール等の 添加剤を加えること もできる。
EDC レジンは、 テ 卜ラヘドロ ン レターズ ( Tetrahe dron Lett ers)、 34巻、 48号、 7685頁 （1993年） 記載の方法で製造することができる。 化合物 （I) 中、 化合物 （I- X ) から、 以下に示す方法によって化合物 （I-y) を製造することができる。
製造法 2 1
Figure imgf000047_0001
(式中、 R R3、 R4、 n、 Xおよび Yはそれぞれ前記と同義であり、 R22および R23 は同一または異なって水素、 置換も しく は非置換の低級アルキル、 置換 も しく は非置換のシク 口アルキル、 置換も しく は非置換の低級アルケニル、 置換も しく は非置換の低級アルキニル、 置換も しく は非置換のァラルキル、 または置換も しく は非置換の複素環アルキルを表す）
上記の定義において低級アルキル、 シク ロアルキル、 低級アルケニル、 低 級アルキニル、 ァラルキル、 および複素環アルキルはそれぞれ前記と同義で あり、 それらの置換基もそれぞれ前記と同義である。
<工程 2 9 > 化合物 （ι-χ) を不活性溶媒中、 1 当量〜大過剰の、 好ましくは ι〜ιο 当 量の 2 R23C0 (式中、 K22および R23はそれぞれ前記と同義である） と、 1 当 量〜大過剰、 好ましくは 1〜3 当量の適当な還元剤の存在下、 通常 - 78°C〜 100 °Cの間の温度、好ましくは 0°C〜 50 での間の温度で 10分間〜 48時間反 応させることにより化合物（I-y)を得ることができる。
適当な還元剤と しては、 例えば水素化ホゥ素ナトリ クム、 ト リァセ トキシ 水素化ホウ素ナトリ ゥム、 シァノ水素化ホウ素ナトリ ゥム等が挙げられ、 好 ましく はシァノ水素化ホウ素ナトリ ゥムが挙げられる。 必要により、 触媒量 〜溶媒量、 好ましくは 0. 5当量〜溶媒量の適当な酸を添加してもよい。 適当 な酸と しては、 例えばギ酸、 酢酸、 ト リフルォロ酢酸、 プロピオン酸、 塩酸 等が挙げられ、 好ましく は酢酸が挙げられる。
不活性溶媒と しては、例えばジクロロメタン、クロ口ホルム、四塩化炭素、 ジクロ ロェタン、 ベンゼン、 トノレェン、 キシレン、 ジェチノレエーテノレ、 1 , 4- ジォキサン、 ジメチルホルムアミ ド、 ジメチルァセ トアミ ド、 ァセ トニ ト リ ル、 へキサン、 ギ酸、 酢酸、 トリ フルォロ酢酸、 プロピオン酸、 塩酸等が例 示され、 これらを単独でまたは混合して用いることができる。 好ましく は、 テトラヒ ドロフラン、 酢酸等が挙げられる。
化合物（I)および原科化合物における各官能基の変換および置換基に含ま れる官能基の変換は、 公知の方法 [例えば、 コンプリへンシプ 'ォ一ガニッ ク · 卜 ラ ンス フ ォ ー メ ーシ ョ ンズ 第二/ jR (Comprehens ive Organi c l'rans format i ons, se c ond edit i on)、 R. C,ラロ ック （Larock)著、 ジョ ン * ヮ ィ リー 'アン ド 'サンズ 'インコーポレーティ ッ ド （John Wi l ey & Sons Inc. ) ( 1999年）に記載の方法] 等によっても行うことができる。
上記の方法等を適宜組み合わせて実施することにより、所望の位置に所望 の官能基を有する化合物（I)を得るこ とができる。
上記製造法における中間体おょぴ生成物の単離、 精製は、 通常の有機合成 で用いられる方法、 例えば濾過、 抽出、 洗浄、 乾燥、 濃縮、 結晶化、 種ク 口マトグラフィ一等を適宜組み合わせて行うことができる。 さらに一般的な 並列合成法で常用される精製法、 例えば、 スカベンジャーレジン、 イオン交 換レジンを用いた精製法によつても行うことができる。 また、 中間体におい ては、 特に精製することなく次の反応に供することもできる。
化合物（I)には、 位置異性体、 幾何異性体、 光学異性体または互変異性体 のような異性体が存在し得るものもあるが、 これらを含め可能な全ての異性 体おょぴ該異性体のいかなる比率における混合物も本発明に包含される。 化合物（I)の塩を取得したい場合には、化合物（I)の塩が得られるときはそ のまま精製すればよく、 また化合物（I)が遊離の形で得られるときは化合物 (I)を適当な溶媒に溶解または懸濁し、 酸または塩基を加えて単離 · 精製す ればよい。
また、 化合物（I)またはその薬理学的に許容される塩は、 水または各種溶 媒との付加物の形で存在することもあるが、 これらの付加物も本発明に包含 される。 ' 本発明の搔痒治療剤のスク リ一二ング法において、接痒治療活性を有する 化合物は、
1 ) ヒ トを除く哺乳類動物に SPCを皮下および皮内投与することにより ヒ ト を除く哺乳類動物における接破行動を誘発させ、
2 )試験化合物存在下または非存在下での SPCにより誘発されたヒ トを除く 哺乳類動物における搔破行動の回数を測定し、
3 )試験化合物存在下と試験化合物非存在下での SPCにより誘発されたヒ ト を除く哺乳類動物における搔破行動の回数を比較し、
4 )試験化合物から SPCにより誘発された搔破行動の回数を減少させる物質 を選択することにより取得することができる。
上記のヒ トを除く哺乳類動物と しては、 例えばマウス等が挙げられ、 搔破 行動とは動物が後肢で自身の体部を搔く行動をいう。搔痒治療剤のスタ リー ユング法のより具体的な例と しては、例えば後記の試験例 2に記載の方法等 が挙げられる。
以下、 第 1表〜第 1 2表に本発明によって得られる化合物 （I) の具体例 を示すが、 本発明の範囲はこれらの化合物に限定されることはない。 また、 GPR4 のシグナル伝達に関する機能を抑制するその他の化合物の具体例を第 1 3表に示す。
Figure imgf000050_0001
化合物 — R5R6 番号
— N N-CH3 o
Figure imgf000050_0002
— O
Figure imgf000050_0003
— -N
Figure imgf000050_0004
- ,N CH3
Figure imgf000050_0005
CH3
11
12
13 — N + 1
H3d
14
-0
Figure imgf000051_0001
HN 9Z
N N-
I
HO
Z N→ 92
HO HN- εΗΟ-0 HN- \ _ I
Figure imgf000051_0002
HO N- I
Figure imgf000051_0003
S66J0請 Ζ OAV 第 2表
Figure imgf000052_0001
化合物 -NR5R6 一 Y 質量分析値
28 -Ν N-CH3 o MS m/z 438 ( +H)+
Figure imgf000052_0002
32 -N >-N MS m/z 506 (M+H)+
Figure imgf000052_0003
37 一 O MS m/z 427 ( +H)+
CH3
38 O MS m/z 425 ( +H)+
Figure imgf000052_0004
第 3表
Figure imgf000053_0001
化合物 -Y
番号 -NR5R6 質量分析値
Figure imgf000053_0002
S Ν
49 — ぐ
リ MS m z 503 (M+H)+
Ν-
Figure imgf000053_0003
第 4表
Figure imgf000054_0001
化合物 -NR5R6 質量分析値
52 -N N-CH3 H3C MS m/z 452 (M+H)+
53 H3Cベ'
Figure imgf000054_0002
Ό w MS m/z 435 ( +H)+
54 -0 H3C- MS m/z 423 (M+H)+
55 H3C MS m/z 465 (M+H)+
56 0 MS m/z 520 (M+H)+
Figure imgf000054_0003
p
59 — N )+
。; MS m/z510(M+H 」 CH3
u
Figure imgf000054_0004
CH3
62 H3C MS m/z 439 (M+H)
63 MS m/z 485 (M+H)
Figure imgf000054_0005
第 5表
Figure imgf000055_0001
化合物 — NR5R6 質量分析値
64 — N N-CH3 ぐ N CH MS m/z 466 (M+H)+
^^r s CH3: 3
68 - N ) MS m/z 534 (M+H)+
Figure imgf000055_0002
71 -N N-i CH3 AACH MS m/z 524 ( +H)+
Figure imgf000055_0003
CH3
74 — ぐ XT MS m/z 453 (M+H)+
CH3
Figure imgf000055_0004
第 6表
Figure imgf000056_0001
化合物 — NR5R6 -Y 質量分析値 番号
H3C
76 — N-CH3 MS m/z 466 ( +H)+
4
H3C
77 MS m/z 449 ( +H)+
N
4
H3C
78 MS m/z 437 (M+H)+
CH3 H3。
79 - O MS m/z 479 (M+H)+
CH3 4
H3C
80 N )
\ f \ f MS m/z 534 (M+H)+
Figure imgf000056_0002
H3C、
83 — N
\_ is 。」 CH3 MS m/z 524 (M+H)+
H3C、
84 — N O MS m/z 453 ( +H)+
4
Figure imgf000056_0003
-f9-
-N
N- 06
、N 、
N- 68
- N
N- 89
人 N 人— 呦^ q>
Figure imgf000057_0001
S66 J0請 OAV -99-
Figure imgf000058_0001
eHQ O—
86 o— 16 εΗΟ-0 O-
96
Figure imgf000058_0002
εΗΟ— O - f6
HO- £6
Figure imgf000058_0003
SLP 00/£00Zm/lDd S66J0請 OAV -9S-
O.
HO o.
εΗつ * 0
O
HO 601·
O
O I—
εΗ0' 8(H
O.
10
HO
Figure imgf000059_0001
901-
HN ■N
呦^
Figure imgf000059_0002
s.i7Coo/cooiai/x3d S66.T0/tO0i OAV 03475
第 1 0表
Figure imgf000060_0001
化合物 _NR5aR6a
112 — N-CH3
\ _ /
113 -N
114 — N >-OH
115 -NH OH
116 -NH N-
117 -N O
OH
118 -N
OH
119 -NH2 -88-
Figure imgf000061_0001
Figure imgf000061_0002
02
Figure imgf000061_0003
摄
9ygyN-
Figure imgf000061_0004
s.i7Coo/coozai/x3d S66J0請 OAV 第 12表
Figure imgf000062_0001
化合物 -R'
Figure imgf000062_0002
第 13表
化合物
91
Figure imgf000062_0003
第 14表
化合物
分析値
5 MS m/z 508 (M+H)"*
6 MS m/z 563 (M+H)4
7 MS m/z 570 (M+H)"
8 MS m/z 571 (M+H)4
9 MS m/z 553 (M+H)'
10 MS m/z 484 (M+H)4
11 MS m/z 482 (M+H)4
12 MS m/z 528 (M+H)4
図面の簡単な説明
第 1図は化合物 1 (経口投与） の SPC誘発搔痒に対する抑制作用を示す。 第 1図において、 符号 （# #、 * *) は各々下記の意味を表す。
# # ： P=0.0083の有意差を表す （陽性対照群の陰性対象群比 ； Aspin- Welch test
* * ： P=0.0031 の有意差を表す （化合物 1経口投与群の陽性対照群比 ； Aspin Welch test)。 第 2図は化合物 3 (経口投与） の SPC誘発搔痒に対する抑制作用を示す。 第 2図において、 符号 （# #、 * *) は各々下記の意味を表す。
# # ： P-0.0029 の有意差を表す （陽性対照群の陰性対象群比 ； Aspin-Welch test
： P=0.0031 の有意差を表す （化合物 3経口投与群の陽性対照群比 ； Aspin - We丄 ch test) 0 次に化合物の薬理作用について試験例で説明する。
試験例 1 ： GPR4拮抗作用 参考例 5で得られた GPR4アツセィ細胞 （該アツセィ細胞は 17 |3 —ェス ト ラジオールの刺激により GPR4を発現する） を白色プレートに 1 ゥヱル当た り 105個を播種し、 反応液中 10 nmol/Lになるように 17 /3 —エス トラジォー ル （17 j3 -estradiol シグマ社製） を培地で希釈したものと試験化合物を加 え、 37°C、 5%C02インキュベータ一中で 6 時間反応した。 その後、 Steady Glo Lucif erase Assay System (Promega 社製) 溶液 ¾：力卩 反 j¾、 停止し、 トツ プカウント （Packard, Meriden, CT， USA) で 1秒間の発光量を測定した。 試験化合物の活性 （拮抗作用） は、 下の式に示す通り 17]3 —エス トラジ オール添加時と非添加時のカウント数 (count per second) をもとに算出し た阻害率で表した。 IC5。値は、 阻害率から Logit-Log変換法の線形近似解析 法によつて算出した。
式中、 A、 B、 Cは各々以下の意味を表す。
A ： 17 /3—エス トラジオール及び試験化合物を添加時の力ゥント数
B : 173 —エス トラジオールおよび試験化合物の両方が非添加時の力ゥント
C '· 17 β ス トラジオールのみ添加時のカウント数 阻害率 （％) = [ {(Α— Β) ( C - Β ) }] X 1 0 0 結果を第 1 5表に示す < 第 1 5表
化合物番号 IC5o(nmol/Lノ
4.0
2 3.2
3 2.3
4 5.8
5 14 以上の結果より、 化合物（I)は GPR4拮抗作用を有することが示された, 試験例 2 ： SPC誘発接痒に対する抑制作用
ddY雄性マウス（3〜 4週齢）背部に SPC ( 50 μ g/s i te) を皮下投与 （SPC投 与群） 後、 該マウスをアタ リル製観察用ケージ （7. 5 X 7. 5 X 15 c m) に入 れ、 ビデオカメラを用いて 60分間無人下でマウスの行動を撮影した。 ビデ ォを再生し、 後肢による搔破行動（scrat ching behav i or)の回数を目視でカ ゥントした。 陰性対照群 （生理食塩液投与群） には SPCの代わりに生理食塩 液 （0. 1 tnL/si te) を投与した。 化合物投与群では、 0. 5 重量/容量 （w/v) % メチルセルロース （MC)氷溶液にィ匕合物 1および化合物 3 ( 300 mg/kg) をそ れぞれ懸濁し、 SPC投与 1時間前に経口投与した。 なお SPC投与群および生 理食塩液投与群ではそれぞれ SPC および生理食塩液投与 1 時間前に 0. 5 w/v%MC水溶液 （10 mL/kg) を経口投与した。 試験は 1群 10匹で行った。 ィ匕 合物による SPC誘発搔破行動の抑制率は以下の数式で求めた。
数式中、 A、 Bはそれぞれ以下の意味を表す。
A ： SPC投与群の搔破行動（s cratching behavior)の回数
B ：ィ匕合物投与群の搔破行動（s cratching behavi or)の回数 抑制率 （％) = [ ( A— B ) / A ] X 1 0 0 化合物 1の結果を第 1図、 化合物 3の結果を第 2図に示す。
第 1図に示すように、 SPC投与群の搔破行動回数 （78回） は陰性対照群の 搔破行動回数 （23 回） と比べ有意に増加した（P=0. 0083)。 化合物 1投与群 の搔破行動回数は 13回であり、 化合物 1投与群では陽性対照群の接破行動 回数が 83 %抑制された（P=0. 0031)。
第 2図に示すように、 SPC投与群の搔破行動回数 （69回） は陰性対照群の 搔破行動回数 （18 回） と比べ有意に増加した（P=0. 0029)。 化合物 3 投与群 の搔破行動回数は 18回であり、 化合物 1投与群では陽性対照群の搔破行動 回数が 74%抑制された（P=0. 00：31)。
以上の結果から、配列番号 1 1記載のアミノ酸配列を有する蛋白質のシグ ナル伝達に関する機能を抑制する物質は搔痒治療剤と して有用であること が示唆された。 試験例 3： Compound 48/80 (シグマ社製） 誘発搔痒に対する作用
ddY系マウス （4 週齢） 背部に Compound 48/80 (10 μ g/site) を皮下投 与 （Compound 48/δ0投与群） 後、 該マウスをアク リル製観察用ケージ （7.5 X 7.5 X 15 cm) に入れ、 ビデオカメラを用いて 60分間無人下でマウスの行 動を撮影した。 ビデオを再生し、後肢による搔破行動（scratching behavior) の回数を目視でカウントした。陰性対照群（生理食塩液投与群）では Compound 48/80 の代わりに生理食塩液 （0.1 mL/site) を投与した。 化合物投与群で は、 0.5 w/vttC水溶液に化合物 1および化合物 3 (300 mg/kg)をそれぞれ懸 獨し、 Compound 48/80投与 1 B寺間前に経口投与した。 なお Compound 48/80 投与群および生理食塩液投与群ではそれぞれ Compound48/80 および生理食 塩液投与 1時間前に 0.5 w/v%MC水溶液を経口投与した。 試験は各群 10匹で 行った。 化合物による Compound 48/80誘発搔破行動の抑制率は以下の数式 で求めた。
数式中、 C、 Dはそれぞれ以下の意味を表す。
C ： Compound 48/80投与群の搔破行動（scratching behavior)の回数
D ：化合物投与群の搔破行動（scratching behavior)の回数 抑制率 （％) = [(C一 D) ノ C] X 1 0 0 化合物 1の結果を第 1 6表、 化合物 3の結果を第 1 7表に示す。
第 1 6表 搔破回数 抑制率（％)
(回数 60分間)
生理食塩液投与 7
Gompound48/80投与 35
54
化合物 1投与 16
第" I 7表 搔破回数
群 抑制率(％)
(回数 60分間）
生理食塩液投与 13
Compound48/80投与 54
52
化合物 3投与 26
第 1 6表に示すように、 Compound 48/80投与群の搔破行動回数は 35回で、 陰性対照群の搔破行動回数 （7回） と比べ増加した。 化合物 1投与群の搔破 行動回数は 16回であり、 化合物 1投与群では Compound 48/80投与群の搔破 行動回数が 54%抑制された。
第 1 7表に示すように、 Compound 48/80投与群の搔破行動回数は 54回で、 陰性対照群の搔破行動回数 （13 回） と比べ増加した。 化合物 3投与群の搔 破行動回数は 26回であり、 化合物 3投与群では Compound 48/80投与群の搔 破行動回数が 52 %抑制された。
以上の結果から、配列番号 1 1記載のァミノ酸配列を有する蛋白質のシグ ナル伝達に関する機能を抑制する物質は搔痒治療剤と して有用であること が示唆された。 試験例 4 ： ハプテン反復塗布慢性皮膚炎モデルにおける搔痒に対する作用 ハプテン反復塗布慢性皮膚炎モデルの作製は、 北垣らの方法 「ジャーナ ル . ォプ · ィ ンべスティ ゲイティ ブ · ダーマ ト ロ ジ一 ( Journal of Investigative Dermatology), 105卷、 749— 755頁 （1995年）」 を若干改変 して行った。
ハプテンと してォキサゾロン (シグマ . ァルドリ ツチ社製) を用い、 これ をアセ トン （関東化学社製） に溶解して 0.5 w/v°/。ォキサゾロン—アセ トン 溶液 （抗原溶液） と した。 抗原溶液を BALB/c雄性マウス（6 週齢）の剃毛し た吻側背部へ 10 L塗布して該マウスを感作し、 7 日後（day 0)から、 同一 部位に 10 /X L抗原溶液を 2 日、 または 3 日間隔で day 16まで反復塗布チヤ レンジし、 慢性皮膚炎モデルを作製した。
化合物 1は、 0.5 w/v%MC水溶液に 10および 30 mg/mLの濃度でそれぞれ 懸濁し、 day 16における抗原溶液塗布 1時間前に 10 mL/kgを経口投与した。 また、 コント口ール群と して 0.5 w/v%MC水溶液のみを同様に経口投与した 群を設けた。
Day 16におけるマウスの搔痒反応の解析は倉石らの方法 「ョ一口ビアン . シヤーナノレ*オフ 'フ了 '―マコロン一 (European Journal of Pharmacology)、 275卷、 229— 233頁 （1995年）」 を若干改変して行った。
マウスを新しい環境に適応させるため、 アクリル製観察用ケージ （7.5 x 8 X 15 cm) に 1時間放置した。 抗原溶液を吻側背部へ塗布 （Dayl6) 後直ちに ケージに戻し、 8 mm ビデオカメラレコーダーで無人環境下に行動を撮影し た。 ビデオの再生により、 抗原溶液塗布後 1時間の搔破行動を観察した。 後 肢による塗布部位およびその周辺への搔破行動の回数を数えた。マウスは約 1秒間に数回の非常に速い連続した接破行動を示すが、 この一連の行動を 1 回の接破行動とみなした。
結果を第 1 8表に示す。 第 丄 8表
Figure imgf000069_0001
化合物 1投与群の搔破行動回数は lOOmg/kgで 138±33(平均土標準誤差）、 300 mg/kgで 2±1 と、 コン ト口ール群の搔破行動回数（264±29)に比べて有 意に減少していた（**： P< 0.01、 *** : P< 0.001、 Dunnett test)。
以上の結果から、配列番号 1 1記載のァミノ酸配列を有する蛋白質のシグ ナル伝達に関する機能を抑制する物質は搔痒治療剤と して有用であること が示唆された。 試験例 5 ： マウス皮膚および後根神経節（DRG)における GPR4 mRNA の発現解 析
マウス皮膚および後根神経節（DRG)における GPR4 mRNA の発現解析は、 Reverse Transcriptase polymerase chain reaction (RT- PCR 法により' 'fjつ た。、なお、 以下の遺伝子実験操作はモレキュラー 'クローニング（Molecular Cloning)に記載されている方法で行った。
( 1 ) プライマーの設定 ···プライマーは、 マウス GPR4 (配列番号 1 4) の 641-660番目（センス鎖、 配列番号 1 9 )および 943-961 番目 （アンチセンス 鎖、配列番号 2 0 )の塩基配列に相当するプライマーを設定し合成した（ィン ビト 口ジヱン社）。
( 2 ) 铸型 cDNAの作製 ·· 'BALB/cマウスより、 背中の皮膚および DRGを摘 出 し た 。 各 ，祖 識 力 ら の 全 RNA の 抽 出 は 、 guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform (AGPC)法にて行った。 得られた全進（5
/ g)を用 ヽて、 SUPERSCRIPT Preamplifi cation System (Invi trogen社） ίこよ り、 マニュアルに従って cDNAを作製した。 cDNA作製の際、 ゲノムの混入を 確認するためにネガテイブコン ト 口一ノレと して、 Reverse Trasncriptaseを 3 475
添加しないサンプルを作製した [RTase(- )]。
( 3 ) RT-PCRによる発現の確認 · · 'PCR反応は、 サーマルサイクラー PTC- 200 (MJ RESEARCH社）を用いて行った。 PCR反応は、 上記 cDNA 1 μし、 各成分 200 μ mol/L <D dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)、 10 μ mol/L のプライマー（酉 3 列番号 1 9および配列番号 2 0 )、Taq Gold polymerase (PerkinElmer社） 2.5 単位 および 1 X Taq Gold (Mg plus)バッファーを含む反応溶液 20 μ L を 用い、 95°Cで 10分間加熱後、 94°Cで 1分、 63°Cで 30秒を 1サイクルと して 28サイクル行い、 さらに 72 Cで 5分間加熱することによって行った。 反応 終了後、 得られた PCR 反応液よ り 10 /X L を分取し、 2%ァガロースゲル LAgarose Nusieve (FMC Bioproduct社) を Tris-acetate ノ ッファー 、40 mmol/L Tris-acetate, 1 mmol/L Ethylenedi amine tetraacetic acid に溶 力 して作製）〕 にて電気泳動した。 ゲルを Vistra Green nucleic acid gel stain RPN5787 (Amersham and Molecular Dynamics社） 10000倍希釈液にて 30分間染色し、 Fluor Imager (Molecular Dynami cs社）で予想される DNA断 片（0.32 kb)の増幅を確認した。
その結果、 Reverse Trasncr iptase の非存在時 [RTase (-）]には電気泳動後 【こノ ン ドカ S検出されず、 Reverse Trasncr iptase の存在時 [RTase ( + ) ] Β# ίこ は電気泳動後にバンドが検出されたことから、 GPR4 mRNAが皮膚および DRG に発現していることが確認された。
以上の結果からも GPR4拮抗剤である化合物（I)は、搔痒治療剤と して有用 であることが示唆された。
GPR4が皮膚に発現していることから、配列番号 1 1記載のアミノ酸配列を 有する蛋白質のシグナル伝達に関する機能を抑制する物質は、角化性皮膚疾 患、 乾癬群（尋常性乾癬、 膿疱性乾癬、 乾癬性紅皮症、 関節症性乾癬）、 魚鱗 癬群（尋常性魚鱗癬、 水疱型先天性魚鱗癬様紅皮症、 非水疱型先天性魚鱗癬 様紅皮症）、 掌蹄角化症、 毛孔性紅色粃糠疹 ·紅斑性角化症、 ダリ エ一病、 掌躕膿疱症、 口腔白板症、 口腔乳頭腫 ' 口腔扁平苔癬、 アミロイ ド苔癬、 天 疱瘡群、類天疱瘡、ケロイ ド等の治療剤と して有用であることが示唆される。
—方、 GPR4が DRGに発現していることから、 配列番号 1 1記載のァミノ酸 配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関する機能を抑制する物質は、術後や 癌の痛み、 頭痛、 歯痛、 月経痛、 耳痛、 咽喉痛、 外傷痛、 症候性神経痛等の 治療剤と しても有用であることが示唆される。
ま た 、 血 管 内 皮 に GPR4 が 発 現 し て い る [ht tp : //ajpheart. phys i ology, org/c i/reprint/00359. 2003v l . pdf参照〕こ とから、配列番号 1 1記載のァミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に 関する機能を抑制する物質は、 低血圧、 浮腫、 動脈硬化等の治療剤と して有 用であることが示唆される。
さらに、 W002/90925 には、 GPR4拮抗剤を癌の治療に用いることが開示さ れているので、化合物（I)は、癌の治療剤と しても有用であると考えられる。 本発明に係る医薬は、 式 （I ) で表される含窒素三環式化合物もしくはその 四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩、 ならびにそれら の水和物および溶媒和物からなる群から選ばれる物質を有効成分と して含 むことを特徴とする。 本発明に係る医薬と しては、 有効成分である上記物質 をそのまま投与してもよいが、 一般的には、 有効成分である上記の物質と 1 または 2以上の製剤用添加物とを含む医薬組成物の形態で投与することが 望ましい。 このような医薬組成物は、 それ自体製剤学の分野で周知または慣 用の方法に従って製造することが可能である。 また、 医薬組成物の形態であ る本発明に係る医薬には、他の医薬の有効成分が 1または 2以上含まれてい てもよい。なお、本発明の医薬は、ヒ トを含む哺乳類動物に適用可能である。 本発明の医薬の投与経路は特に限定されず、経口投与または静脈内投与等 の非経口投与のいずれかから治療およぴ /または予防のために最も効果的 な投与経路を適宜選択することができる。経口投与に適する製剤の例として は、 例えば、 錠剤等を挙げることができ、 非経口投与に適する製剤の例と し ては、 例えば、 注射剤等を挙げることができる。
錠剤等の固形製剤の製造には、 例えば、 乳糖、 マンニッ ト等の賦形剤 ；デ ンプン等の崩壊剤； ステアリ ン酸マグネシウム等の滑沢剤； ヒ ドロキシプロ ピルセルロース等の結合剤；脂肪酸エステル等の界面活性剤； グリセリ ン等 の可塑剤を用いることができる。
非経口投与に適する製剤のうち注射剤等の血管内投与用製剤は、好ましく はヒ ト血液と等張の水性媒体を用いて調製することができる。 例えば、 注射 剤は、 塩溶液、 プドウ糖溶液、 塩水とブドウ糖溶液の混合物等から選ばれる 水性媒体を用い、 常法に従って適当な助剤とともに溶液、 懸濁液、 または分 散液と して調製することができる。 非経口用の製剤の製造には、 例えば、 希 釈剤、 香料、 防腐剤、 赋形剤、 崩壊剤、 滑沢剤、 結合剤、 界面活性剤、 可塑 剤等から選択される 1または 2以上の製剤用添加物を用いることもできる。 本発明の医薬の投与量および投与頻度は特に限定されず、有効成分である 上記物質の種類、 投与経路、 治療および Zまたは予防の目的、 患者の年齢お よび体重、症状の性質および重篤度等の種々の条件に応じて適宜選択するこ とが可能である。 例えば、 成人 1 日当り 0. l〜100mgZ kgを 3〜4回に分けて 投与するのが好ましい。 しかしながら、 これら投与量および投与回数は前述 の種々の条件等によ り変動する。 発明を実施するための最良の形態
以下に、 本発明を実施例、 参考例および製剤例により さらに具体的に説明 するが、 本発明の範囲はこれらの実施例等により限定されることはない。 下記実施例および参考例中の各化合物の物理化学的データは、以下の機器 類によって測定した。
XH NMR： JE0L 扉 - EX270 (270 MHz)または JEOL J画- GX270 (270 MHz)
MS : Mi cromas s LCTまたは Mi cromass Quatro ( APCI法により測定） 実施例 1 ：化合物 1 {2— (2—ェチルー 5, 7—ジメチル— 3H—ィ ミダゾ [4, 5-b] ピリ ジン一 3—イノレメチル）一 8—（4—メチノレビペラジン _ 1一ィルメチル）一
10, 11一ジヒ ドロー 5H—ジベンゾ [b， f]ァゼピン}の合成
特開平 7— 61983に記載された 2 _ (2—ェチルー 5 , 7—ジメチルー3 H—ィミ ダゾ [4， 5- b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 10, 1 1—ジヒ ドロ ー 5H—ジベンゾ
[b, f]ァゼピン ( 30. 0 g, 78. 4 mmol) をクロ口ホルム ( 300 mL) と酉乍酸 ( 300 mL) の混合溶媒に溶解し、 1ーメチルビペラジン （23. 6 g, 236 mmol ) およ ぴホルムアルデヒ ド （37 %水溶液、 7. 64 g， 94. 1 mmol) を加え、 60°Cに力 U 熱し、 18 時間撹拌した。 反応の進行を薄層クロマトグラフィーで確認した 後、 氷冷下に飽和重曹水を加え、 酢酸ェチルで抽出した。 有機層を飽和重曹 水、 水、 飽和食塩水で順次洗浄し、 無水硫酸ナト リ ゥムで乾燥後、 減圧下で 濃縮した。 析出した結晶を酢酸ェチルでト リチュレーシヨ ンし、 化合物 1
(27.4 g, 55.4 mmol, 収率 71%) を得た。
APCI-MS: m/z 495 ( [M + H]+)
XH匪 R (CDC13) δ (ppm)： 1.30 (t, J = 7.6 Hz, 3 H) , 2.27 (s， 3 H) , 2.45 (m, 8 H), 2.60 (s， 3 H) , 2.63 (s, 3 H) , 2.79 (q, J = 7.6 Hz, 2 H) , 2.98 (m， 4 H) , 3.38 (s, 2 H) , 5.34 (s, 2 H) , 6.00 (s, 1 H) , 6.57-6.66 (m, 2 H), 6.79-7.00 (m， 5 H) .
また、 対応するフマル酸塩を以下の方法に従って調製した。
上記の化合物 1 (15 g) をメタノ一ル （110 tnL) に溶解し、 フマル酸 7, 0g (2.0当量） を加えた。 結晶の析出した懸濁液を一旦濃縮乾固し、 ァセ トニ ト リル （100 mL) を加え懸濁液を 1時間以上攪拌した。 その後、 結晶を濾取 して、 減圧下、 乾燥することによりにより化合物 1の 2 フマル酸塩を得た (20.1 g, 収率 91%)。 実施例 2：化合物 2 {2- (2—ェチルー 5, 7-ジメチルー 3H—ィミダゾ [4, 5-b] ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 8—（1,2, 5， 6—テ ト ラ ヒ ドロ ピリ ジン一 1—ィ ルメチル）一 10, 11—ジヒ ドロー 5H—ジベンゾ [b, f]了ゼピン } の合成
1ーメチルビペラジンの代わりに 1,2, 3, 6—テトラヒ ドロピリジンを用い、 実施例 1 と同様にして、 特開平 7— 61983に記載された 2- (2—ェチル—5, 7 —ジメチルー 3H—ィミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 10, 11—ジ ヒ ドロ一5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピンから収率 20%で化合物 2を得た。
APCI-MS： m/z 478 ( [M + H]+)
JH NMR (CDCI3) δ (ppm)： 1.30 (t, J = 7.5 Hz, 3 H) , 2.04 (m, 2 H) , 2.53 (t， J = 5.7 Hz, 2 H), 2.60 (s, 3 H) , 2.62 (s, 3 H) , 2.79 (q, J = 7.5 Hz, 2 H) , 2.86-3.02 (m, 6 H)， 3.45 (s， 2 H) , 5.33 (s, 2 H) , 5.64 (m, 1 H)， 5.74 (m, 1 H) , 6.02 (s， 1 H) , 6.57-6.70 (m, 2 H)， 6.78-6.82 (ra， 2 H), 6.88 (s, 1 H), 6.95-7.00 (m, 2 H) . 実施例 3：化合物 3 {2- (2—ェチルー 5, 7-ジメチルー 3H—ィミダゾ [4, 5-b] ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 8_ (ピロ リ ジン一 1_ィルメチル）— 10, 11〜ジ ヒ ドロー 5H—ジベンゾ [b, f ]ァゼピン } の合成
1—メチルピペラジンの代わりにピロ リジンを用い、 実施例 1 と同様にし て、 特開平 7-61983に記載された 2— (2—ェチル一5, 7—ジメチルー 3H—ィ ミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 10， 11—ジヒ ドロ一 5H—ジベン ゾ [b， f]ァゼピンから収率 20%で化合物 3を得た。
APCI-MS: m/z 466 ( [M + H]+)
lE NMR (CDC13) 5 (ppm)： 1.30 (t, J = 7.5 Hz, 3 H) , 1.78 (m, 4 H) , 2.50 (m, 4 H), 2.60 (s, 3 H) , 2.63 (s, 3 H) , 2.79 (q， J = 7.5 Hz, 2 H) , 2.98 (m, 4 H), 3.50 (s, 2 H) , 5.34 (s, 2 H) , 6.02 (s, 1 H) , 6.58-6.66 (tn, 2 H), 6.79-6.81 (m, 2 H) , 6.88 (s， 1 H)， 6.98-7.02 (m, 2 H) . 実施例 4：化合物 4 {2—（2—ェチル—5， 7—ジメチルー 3H—ィミダゾ [4, 5-b] ピリ ジン一 3—イノレメチル）一 8—モルホ リ ノ メチル一 10, 11—ジヒ ドロー 5H —ジベンゾ [b, f]ァゼピン } の合成
1一メチルピペラジンの代わりにモルホリ ンを用い、 実施例 1 と同様にし て、 特開平 7— 61983に記載された 2— (2—ェチル一5， 7—ジメチルー 3H—ィ ミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3_ィルメチル）一 10， 11ージヒ ドロ一 5H—ジべン ゾ [b, f]ァゼピンから収率 46%で化合物 4 を得た。
APCI-MS: m/z 482 ( [M + H]+)
NMR (CDC13) δ (ppm)： 1.30 (t, J = 7.5 Hz, 3 H) , 2.43 (m, 4 H) , 2.60 (m, 3 H), 2.63 (m， 3 H) , 2.79 (q, J = 7.5 Hz, 2 H) , 2.98 (m, 4 H) , 3.38 (s, 2 H), 3.69 (m, 4 H) , 5.34 (s, 2 H) , 6.07 (s, 1 H) , 6.58-6.67 (m， 2 H), 6.78-6.81 (m, 2 H) , 6.88 (s, 1 H) , 6.96-7.01 (m， 2 H) . 実施例 5 ：化合物 5〜化合物 1 2の合成
特開平 7— 61983に記載された 2— (2—ェチルー 5, 7—ジメチルー 3H—ィ ミ ダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 10, 11—ジヒ ドロ _ 5H—ジベンゾ
[b, f]ァゼピン (19 mg, 0.050 mmol) をク ロロホノレム （0.30 mL) と ft酸 (0.30 mL) の混合溶媒に溶解し、 対応する R6NHのク ロ口ホルム溶液 （l.O mol/L, 0.15 tiiL) およびホルムアルデヒ ド （37 %水溶液、 0.005 mL) を加え、 60。C に加熱し、 20 時間撹拌した。 反応の進行を薄層クロマ トグラフィーで確認 した後、溶媒を留去し、残渣をク口口ホルムに溶解させ、水洗を 2回施した。 有機層を無水硫酸ナト リ ゥムで乾燥後、 濃縮し、 残渣にクロロホルム （0.50 mL) および N—メチノレイサ ト酸無水物 ポリ スチレン （N- Methylisatoic anhydride polystylene, ノ ノ ノ ィ才ケム社製、 0.15 mL) を力！]え、 室温で終 夜撹拌した。 反応混合物中のレジンを濾別し、 残渣をイオン交換クロマ トグ ラフィ一 （ボンデシル SCX、 ノくリ了ン社製、 2 mol/L ァンモニァ一メタノー ル溶液で溶出） で精製し、 目的物である化合物 5〜化合物 1 2を得た。 化合物の構造を第 1表に、 分析値 （APCI- MS) を第 1 4表に記した。 実施例 6 ：化合物 1 3 {ョ ウイヒ 1一 [8— (2—ェチル—5, 7—ジメチルー 3H— ィ ミダゾ [4， 5- b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 10， 11ージヒ ドロ一 5H—ジべ ンゾ [b, f]ァゼピン—2—ィルメチル]— 1ーメチルピ口 リ ジニゥム } の合成 実施例 3で得られた化合物 3 (11.4 g, 24.5 mmol) をジクロロメタン （200 mL) に溶解し、 ヨウ化メチル （1.98 mL, 31.8 mmol) を加え、 室温で 10時 間撹拌した。 反応溶液を減圧下、 濃縮した後、 酢酸ェチルを加えた。 得られ た懸濁液を 60°Cに加熱し 0.5時間撹拌し、 その後室温で 1時間撹拌した。 析出した固体を濾取して、 化合物 1 3 (13.7 g, 22.5 mmol, 収率 92%) を 得た。
APCI-MS: m/z 480 ( [M - 1]+)
LH NMR (CDC13) δ (ppm)： 1.31 (t， J = 7.6 Hz, 3 H) , 2.13 (br s, 2 H) , 2.25 (br s, 2 H), 2.58 (s, 3 H) , 2.62 (s, 2 H) , 2.79 (q， J = 7.6 Hz, 2 H) , 2.85 (m， 4 H) , 3.06 (s， 3 H) , 3.52 (br s， 2 H) , 3.83 (br s, 2 H) , 4.74 (s, 2 H), 5.32 (s， 2 H) , 6.76 (m, 2 H) , 6.88 (s, 1 H) , 6.95-7.18 (m, 4 H), 7.43 (s, 1 H). 実施例 7 ：化合物 1 4 {2- (2, 5—ジヒ ドロ ピロール〜 1—ィルメチル）一 8
- (2—ェチルー 5， 7—ジメチルー 31-1—ィ ミダゾ [4， 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメ チル）— 10, 11—ジヒ ドロー 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン } の合成 1ーメチルピペラジンの代わりに 2, 5—ジヒ ドロピロールを用い、 実施例 1 と同様にして、 特開平 7— 61983号に記載された 2— (2—ェチルー 5， 7—ジ メチルー 3H—イ ミダゾ [4， 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル) 10, 11ージヒ ドロ — 5H—ジベンゾ [b，f]ァゼピンから収率 82%で化合物 1 4を得た。
APCI-MS: m/z 464 ( [M + H]+)
NMR (CDC13) δ (ppm)： 1.30 (t, J = 7.5 Hz, 3 H) , 2.59 (s， 3 H) , 2.63 (s, 3 H), 2.79 (q, J = 7.5 Hz, 2 H) , 2.9-3.1 (m， 4 H) , 3.45 (s, 4 H) , 3.70 (s, 2 H), 5.34 (s, 2 H)， 5.87 (s, 2 H) , 6.07 (s, 1 H)， 6.59 (d, J = 8.7 Hz , 2 H), 6.63 (d， J = 8.7 Hz , 2 H) , 6.75-6.85 (m, 2H) , 6.88 (s, 1 H), 7.00-7.05 (m, 2 H) . 実施例 8 ：化合物 1 5く {N— [8- (2—ェチルー 5, 7—ジメチルー 3H—ィミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィノレメチノレ）一 10, 11—ジヒ ドロ一 5H—ジべンゾ [b, f] ァゼピン一 2—ィルメチル]一 N—メチルアミノ}酢酸メチルエステル〉の合成
1—メチルビペラジンの代わりにサルコシンメチルエステル塩酸塩を用い、 実施例 1 と同様にして、 特開平 7— 61983 号に記載された 2—（2—ェチルー
5, 7—ジメチル一 3H—イ ミダゾ [4， 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 10, 11— ジヒ ドロー 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピンから収率 31%で化合物 1 5を得た。 APCI-MS: m/z 498 ( [M + H]+)
JH NMR (CDC13) δ (ppm)： 1.30 (t, J = 7.6 Hz, 3 H) , 2.36 (s, 3 H) , 2.60 (s， 3 H)， 2.63 (s， 3 H)， 2.79 (q， J = 7.6 Hz, 2 H) , 2.98 (m, 4 H) , 3.23 (s, 2 H) , 3.53 (s, 2 H)， 3.70 (s, 3 H) , 5.34 (s， 2 H) , 5.98 (s, 1 H) ,
6.59-6.67 (m, 2 H) , 6.82 (m, 2 H)， 6.88 (s, 1 H)， 6.97-7.02 (m， 2 H) . 実施例 9 ：化合物 1 6 {1— [8- (2—ェチルー 5， 7—ジメチルー3 H—ィミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 10, 11—ジヒ ドロ一 5H—ジベンゾ [b, f] ァゼピン一 2—イノレメチノレ]ピペリ ジン一 4—力ノレボン酸ェチルエステル } の 合成
1ーメチルビペラジンの代わりにィソニペコチン酸ェチルエステノレを用い. 実施例 1 と同様にして、 特開平 7— 61983 号に記載された 2—（2—ェチルー 5, 7—ジメチルー 3H—ィ ミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—イ ノレメチル）一 10， 11— ジヒ ドロ一5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピンから収率 60%で化合物 1 6を得た。 APCI-MS : m/z 552 ( [M + H]+)
JH NMR (CDC13) δ ( pm)： 1.23 (t, J = 7.0 Hz, 3 H) , 1. 30 (t, J = 7. 6 Hz, 3 H), 1.68-1.90 (ra, 6 H) , 1. 97 (td, J = 11.3, 2. 7 Hz, 2 H) , 2.26 (m， 1 H) , 2.60 (s, 3 H)， 2. 62 (s, 3 H) , 2. 79 (q, J = 7.6 Hz, 2 H) , 2.83 (m, 2 H) , 2. 98 (m, 4 H) , 3. 36 (s, 2 H) , 4. 11 (q, J = 7.0 Hz, 2 H) , 5.33 (s， 2 H)， 6. 03 (s, 1 H)， 6. 57-6.66 (m, 2 H) , 6.78-6.82 (m， 2 H) , 6.88 (s， 1 H) , 6.94-6.99 (m, 2 H) . 実施例 1 0 ：化合物 1 7く 2— {N- [8- (2—ェチル— 5， 7—ジメチノレー 3H—ィ ミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—イ ノレメチル）一 10, 11—ジヒ ドロー 51-1—ジべン ゾ [b, f]ァゼピン一 2—ィノレメチノレ]一 N—メチルァミ ノ）エタノ一ル〉の合成 水素化アルミニゥム リ チウム (15.7 mg, 0.38 mmol) をテ トラヒ ドロフラ ン （0. 3 mL) に懸濁させ、 氷冷下、 攪拌しながら、 テトラヒ ドロフラン （0. 9 mL) に溶解した、 実施例 8で得られた化合物 1 5 (126 mg, 0.253 mmol) を 加え、 室温で 1.5時間撹拌した。 反応の進行を薄層クロマ トグラフィ一で確 認した後、 撹拌しながら水（0.016 mL)、 2mol/L 水酸化ナ ト リ ウム水溶液 (0.016 mL) , 水（0.048 mL)を順次滴下した。 析出物を濾過し、 濾液を濃縮し た残渣を NH—シリカゲルク ロマ トグラフィー （溶出溶媒 ： 酢酸ェチル） で 精製して化合物 1 7 (47. 6 mg, 0. 101 mmol, 収率 40%) を得た。
APCI-MS: m/z 470 ( [M + H]+)
XH NMR (CDC13) δ (ppm)： 1. 30 (t， J = 7.5 Hz, 3 H) , 1.7 (br s, 1 H) , 2. 21 (s, 3 H) , 2.57 (t, J = 5. 5 Hz, 2 H) , 2. 60 (s, 3 H) , 2.63 (s, 3 H) , 2. 80 (q, J = 7. 5 Hz, 2 H) , 2.98 (m， 4 H)， 3.44 (s， 2 H)， 3. 61 (t, J = 5. 5 Hz, 2 H) , 5.34 (s, 2 H) , 5. 99 (s, 1 H) , 6. 59-6.67 (m, 2 H) , 6.81 (m, 2 H) , 6.88 (s, 1 H) , 6. 91-6. 98 (m， 2 H) . 実施例 1 1 ：化合物 1 8〈{1一 [8—（2—ェチルー 5, 7—ジメチルー 3H—イ ミダ ゾ [4， 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメ チル）一 10， 11—ジヒ ド口 一 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン一 2—ィルメチル]ピぺリ ジン一 4—ィル }メタノール〉の合成 化合物 1 5の代わりに化合物 1 6を用い、 実施例 1 0と同様にして、 収率 50%で化合物 1 8を得た。
APCI-MS: m/z 510 ( [M + H]+)
JH NMR (CDC13) δ (ppm)： 1.30 (t, J = 7.6 Hz, 3 H) , 1.24-1.74 (m, 6 H)， 1.91 (m, 2 H), 2.60 (s, 3 H)， 2.63 (s, 3 H) , 2.79 (q, J = 7.6 Hz, 2 H) , 2.86-3.02 (m, 6 H) , 3.37 (s， 2 H) , 3.48 (d, J = 6.3 Hz, 2 H) , 5.34 (s, 2 H), 5.98 (s, 1 H), 6.58-6.67 (m, 2 H)， 6.82 (m, 2 H)， 6.89 (s， 1 H) , 6.94-7.00 (m, 2 H) . 実施例 1 2 ：化合物 1 9 <{N- [8- (2—ェチルー 5， 7—ジメチルー 3H—ィミダ ゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—イノレメ チル）一 10， 11—ジヒ ドロ ー 5H—ジベンゾ [b,f]ァゼピン一 2—ィルメチル]一 N—メチルアミ ノ）酢酸〉の合成
実施例 8で得られた化合物 1 5 (151 mg, 0.303 mmol) をメタノール （3.0 mL) に溶解し、 lmol/L水酸化ナトリ クム/メタノール溶液 （1.5 mL) を加え、 60°Cに加熱し、 9時間撹拌した。 反応の進行を薄層クロマトグラフィーで確 認した後、 室温に冷却し、 4mol/L塩酸を加え、 pHを 6.0に調整した。 析出 した結晶を濾取し、 減圧下で乾燥した。 この結晶をェチルエーテルに懸濁さ せ、 加熱還流条件下、 1時間撹拌し、 さらに室温で 1時間撹拌した。 結晶を 濾取し、 減圧下で乾燥させ化合物 1 9 (119 mg, 0.246 mmol, 収率 81%) を得た。
APCI-MS: m/z 483 ( [M + H]+) '
XH NMR (DMS0-d6) 8 (ppm)： 1.23 (t, J = 7.4 Hz, 3 H) , 2.34 (s, 3 H) , 2.48-2.52 (s x 2, 6 H, DMS0とォーパーラップ）， 2.78 (q, J = 7.4 Hz, 2 H), 2.89 (m, 4 H) , 3.11 (s, 2 H) , 3.66 (s, 2 H) , 5.29 (s, 2 H) , 6.75-7.02 (m, 7 H), 8.36 (s, 1 H) . 実施例 1 3 :化合物 2 0 {1— [8— (2—ェチルー 5, 7—ジメチルー 3H—ィ ミダ ゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメ チル）一 10, 11—ジヒ ドロ _ 5H—ジベンゾ
[b， f]ァゼピン一 2—ィルメチル]ピぺリ ジン一 4—カルボン酸 } の合成
-75- 化合物 1 5の代わりに化合物 1 6を用い、 実施例 1 2と同様にして、 収率 70%で化合物 2 0を得た。
APCI-MS: m/z 524 ( [M + H]+)
:H蘭 R (DMS0-d6) δ (ppm)： 1.23 (t, J = 7.4 Hz, 3 H) , 1.52 (m, 2 H) , 1.75 (m, 2 H), 1.97 (m， 2 H) , 2.18 (m, 1 H) , 2.48-2.54 (s x 2, 6 H, DMSO とオーバーラップ）， 2.71-2.92 (m, 8 H)， 3.32 (s, 2 H) , 5.29 (s, 2 H) , 6.75-6.94 (m, 7 H)， 8.23 (s, 1 H) . 実施例 1 4 ：化合物 2 1く {N— [8- (2—ェチルー 5， 7—ジメチル— 3H—ィ ミダ ゾ [4， 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメ チル）一 10, 11—ジヒ ドロ 一 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン一 2—ィルメチル]一 N—メ チルァミ ノ）ァセ トニ ト リル〉の合 成
実施例 6で得られた化合物 1 3 (700 mg, 1.15 mmol) をク ロ口ホルム （1.2 mL) に溶解し、 メチルア ミ ノアセ ト ニ ト リ ノレ （368 mg， 3.46 mmol) および トリェチルァミ ン （0.561 mL, 4.03 mmol) を加えて加熱還流条件下、 終夜 撹拌した。 反応液を室温まで冷却し、 飽和重曹水を加え、 クロ口ホルムで 3 回抽出した。 有機層を合わせ、 飽和食塩水で洗浄し、 無水硫酸マグネシウム で乾燥後、 濃縮し、 残渣をシリ力ゲルク口マトグラフィー （溶出溶媒： メタ ノール/ク ロ口ホルム： =1/99) で精製した。 目的物を含む画分の濃縮残渣に エタノールを加え、 得られた懸濁液を 60°Cで 0.5 時間撹拌し、 その後室温 で 1時間撹拌した。析出した結晶を濾別し、減圧下で乾燥させることにより、 化合物 2 1 (415 mg, 0.893 mmol, 収率 78%) を得た。
APCI-MS: m/z 465 ( [M + H]+)
:H NMR (CDC13) δ (ppm)： 1.30 (t, J = 7.5 Hz, 3 H) , 2.42 (s, 3 H) , 2.60 (s, 3 H), 2.63 (s， 3 H) , 2.79 (q, J = 7.5 Hz, 2 H) , 2.98 (m， 4 H) , 3.43 (s, 2 H), 3.48 (s, 2 H) , 5.34 (s, 2 H) , 6.10 (s， 1 H) , 6.58 - 6.69 (m, 2 H)， 6.78-6.83 (ra, 2 H) , 6.88 (s, 1 H) , 6.95 - 7.02 (m, 2 H) . 実施例 1 5 ：化合物 2 2 {N— [8—（2—ェチル—5, 7—ジメチル— 3H—ィ ミダ ゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメ チル）一 10, 11—ジヒ ドロ ー 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン一 2—ィルメチル]一 N— [2—（ピロ リ ジン— 1—ィル）ェチル] ァミン · 2 フマル酸塩 } の合成
工程 1
後記の実施例 2 4で得られた化合物 9 3 ( 1. 25 g, 3. 03 mmol ) をクロ口 ホルム （54 mL) およびアセ トン（6 mL)の混合溶媒に溶解し、 二酸化マンガ ン（2. 7 g, 31 mmol)を加えて室温で終夜撹拌した。 反応の進行を薄層クロマ トグラフィ一で確認した後、 固形物をセライ トを通じて濾別し、 濾液を濃縮 した。残渣に酢酸ェチルを加えて得られる懸濁液を加熱還流条件下 0. 5時間 撹拌し、 その後室温に冷却してさらに 0. 5時間撹拌した。 析出した結晶を濾 取し、 減圧下乾燥させることにより 8—（2—ェチル一5, 7—ジメチルー 3H— イミダゾ [4, 5-b]ピリジン一 3—ィルメチル） _ 10， 1 1—ジヒ ドロー 5H—ジべ ンゾ [b， f]ァゼピン一 2—カルボアルデヒ ド （1. 02 g， 2. 48 mmol , 収率 82 % ) を得た。
APCI-MS : m/z 411 ( [M + H] +)
JH NMR (CDClj) δ (ppm)： 1. 31 (t， J = 7. 5 Hz, 3 H) , 2. 60 ( s， 3 H) , 2. 64 (s， 3 H)， 2. 80 (q, J = 7. 5 Hz , 2 H) , 2. 99 (m, 2 H)， 3. 06 (m, 2 H)， 5. 37 (s, 2 H) , 6. 60-6. 91 (m， 6 II ) , 7. 52-7. 61 (m, 2 H)， 9. 77 (s, 1 H) . 工程 2
工程 1で得られた 8 - (2—ェチル—5, 7—ジメチノレー 3H—ィミダゾ [4, 5-b] ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 10, 1 1—ジヒ ドロー 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピ ン一 2—力ノレボアルデヒ ド （0. 300 g , 0. 73 mmol ) をテ トラ ヒ ドロフラン （10 mL) およびクロ口ホルム （6 mL). の混合溶媒に懸濁させ、 これに 2 _ (ピロ リジン一 1一ィル）ェチルァミン （139 μ L, 1. 10 mmol) を加えて 10分間、 加熱還流した。 その後、 反応溶液を室温まで冷却してトリァセトキシホウ素 化ナト リ ウム （464 mg， 2. 19 mmol ) を加えて 12時間、 室温で攙拌した。 反 応溶液に酢酸ェチルと 1 mol/L水酸化ナト リ ゥム水溶液を加え、 有機層を無 水硫酸マグネシウムを加えて乾燥させた。 その後、 溶液を減圧下、 濃縮し、 残渣をシリ力ゲルクロマ トグラフィー （溶出溶媒： クロロホルム /2mol/Lァ ンモエア ' メタノール溶液 =20/ 1 ) で精製して、 N— [8 - (2—ェチルー5, 7 - ジメチル一 3H—ィ ミダゾ [4， 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 10, 1 1—ジヒ ドロ—5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン一 2—ィルメチル]一 N— [2—（ピロ リ ジン 一 1一ィル）ェチル]ァミ ン （0.301 g, 0.592 mmol, 収率 81%) を得た。 こ れを実施例 1 と同様な方法でフマル酸塩と して化合物 2 2を得た。
APCI-MS: m/z 509 ( [M + H]+)
:H NMR (DMS0 - d6) δ (ppm)： 1.23 (t, J = 7.4 Hz, 3 H) , 1.65 1.85 (m, 4 H)，
2.50 (s, 3H) , 2.51 (s, 3H) , 2.6-2.7 (m, 4 H) , 2.7-3.0 (m, 8 H) , 3.86 (s, 2 H)， 5.29 (s, 2 H) , 6.55 (s, 4 H) , 6.75-6.95 (m, 6 1.1), 7.0-7.15 (m, 2 H), 8.43 (s， 1 H) . 実施例 1 6 ：化合物 2 3 {N— [8— (2—ェチル—5, 7—ジメチルー 3H—イ ミダ ゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメ チル）一 10， 11ージヒ ドロ ー 5H—ジべンゾ [b, f]ァゼピン一 2—ィルメチル]—N— (2—メ トキシェチル）ァミ ン · 1 フマ ル酸塩 } の合成
2—（ピロ リ ジン _ 1—ィル）ェチルァミ ンの代わり に 2-メ トキシェチノレア ミ ンを用い、 実施例 1 5の工程 2 と同様にして、 収率 78%で N— [8— (2—ェ チルー 5, 7—ジメチルー 3H—ィ ミ ダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 10, 11—ジヒ ドロ一 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン一 2—イ ノレメチノレ]— N—（2— メ トキシェチル）アミ ンを得た。 これを実施例 1 と同様な方法でフマル酸塩 と して化合物 2 3 を得た。
APCI-MS: m/z 470 ( [M + H]+)
XH NMR (DMSO-dg) 8 (ppm)： 1.23 (t, J = 7.4 Hz, 3 H)， 2.50 (s， 3H) , 2.51 (s, 3H), 2.80 (q， J = 7.4 Hz, 2 H)， 2.8-3.0 (m, 6 H)， 3.24 (s, 3 H) ,
3.49 (t, J = 6.5 Hz, 2 H) ' 3.80 (s, 2H) , 5.29 (s, 2 H) , 6.48 (s, 2 H) , 6.84 (d, J = 8.1 Hz, 1 H) , 6.85-7.0 (m, 4 H) , 7.0-7.1 (m, 2 H) , 8.43 (s, 1 H). 実施例 1 7 ：化合物 2 4く 2— {[8- (2—ェチルー 5, 7—ジメチルー 3H—ィ ミダ ゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—イノレメ チル）一 10， 11ージヒ ドロ ー 5H—ジベンゾ [b，f]ァゼピン一 2—ィルメチル: Π アミ ノエタノール · 0.5 フマル酸塩〉の合 成 2—（ピロ リ ジン一 1一ィル）ェチルアミ ンの代わり に 2—エタノールアミ ン を用い、 実施例 1 5の工程 2と同様にして、 収率 39%で 2— {[8—（2—ェチ ルー 5， 7 _ジメチルー 3H—ィ ミダゾ [4, 5-b]ピ リ ジン一 3 _ィルメチル）一 10， 11ージヒ ドロ一 5H—ジベンゾ [b， f]ァゼピン一 2—ィルメチル]ァミ ノ }ェ タノールを得た。
これを実施例 1 と同様な方法でフマル酸塩として化合物 2 4を得た。 APCI-MS: m/z 456 ( [M + H]+)
XH NMR (DMS0-d6) δ (ppm)： 1.23 (t, J = 7.4 Hz, 3 H) , 2.50 (s, 3H) , 2.51 (s， 3H) , 2.70-2.75 (m, 2 H) , 2.77 (q, J = 7.4 Hz, 2 H) , 2.85-2.9 (m, 4 H), 3.55 (t, J = 5.5 Hz, 2 H) , 3.78 (s， 2H) , 5.29 (s， 2 H) , 6.44
(s， 1 H) , 6.79 (dd, J = 1.5 Hz, 8.3 Hz, 1 H)， 6.85-6.95 (m, 4 H) , 7.0-7.1
(m, 2 H), 8.39 (s, 1 H) . 実施例 1 8 ：化合物 2 5く { [8— (2—ェチルー 5, 7—ジメチルー 3H—ィミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—イノレメチル）一 10， 11ージヒ ドロー 5H—ジベンゾ [b, f] ァゼピン一 2—ィノレ] メチノレ） ァミ ン · 1 フマノレ酸塩〉の合成
実施例 6で得られた化合物 1 3 (0.300 g, 0.516 mmol) を 7mol/Lアンモ ニァメタノール溶液 （5 mL) に溶解し、 封管して 80°Cで 4 8時間加熱した。 その後、 反応溶液を減圧下、 濃縮した。 残渣をシリカゲルクロマトグラフィ ― (溶出溶媒： ク ロロホルム /2mol/L ァンモニァ ' メ タノール溶液 =20/1) で精製して、 {[8- (2—ェチルー 5， 7—ジメチルー 3H—ィミダゾ [4， 5 - b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 10， 11ージヒ ドロー 5H—ジベンゾ [b， f]ァゼピン一 2 —ィル] メチル }ァミ ン （0.135 g, 0.329 mmol, 収率 64%) を得た。
これを実施例 1 と同様な方法でフマル酸塩と して化合物 2 5を得た。 APCI-MS: m/z 412 ( [M + H]+)
JH NMR (DMS0 - d6) δ (ppm)： 1.23 (t, J = 7.4 Hz, 3 H) , 2.50 (s, 3H) , 2.51
(s, 3H), 2.77 (q, J = 7.4 Hz, 2 H) , 2.85-2.9 (m, 4 H) ， 3.81 (s, 2H) , 5.29 (s， 2 H)， 6.42 (s, 2 H) , 6.8-7.0 (m, 5 H) , 7.0-7.15 (m， 2 H)， 8.46 (s, 1 H). 実施例 1 9 ：化合物 2 6 {N- [8- (2—ェチルー 5, 7—ジメチルー 3H—ィミダ ゾ [4， 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメ チル）一 10， 11—ジヒ ドロ ー 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン一 2—イノレメチル] — N—メチル一 N_ (2H—テ トラゾールー 5 一ィルメチル）アミ ン} の合成
実施例 6で得られた化合物 1 3 (667 mg, 1.10 mmol) をク ロ口ホルム （11 mL) に溶解し、 参考例 1 aで得られた N—メチルー N— (2- ト リチルー 2H— テトラゾール一 5—イ ノレメチノレ）ァミ ン (390 mg, 1.10 mmol) およびトリエ チルァミ ン （0.31 mL, 2.3 mmol) を加えて 60°Cで終夜撹拌した。 反応液を 室温まで冷却し、 飽和重曹水を加え、 クロ口ホルムで 3回抽出した。 有機層 を合わせ、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。 残渣をシリ力ゲル （溶出溶媒： メタノール /ク口口ホルム =2/98) に通じて 原点成分を除去し、 濃縮した。 残渣にアセ トン （1.9 mL)、 水 （1.9 mL)、 酢 酸 （1.9 mL) を加え、 60°Cで 1.5 時間撹拌した。 反応液を 0°Cまで冷却し、 析出物を濾過し、濾液を濃縮して得られた残渣をエタノールから再結晶して、 化合物 2 6 (66.7 mg, 0.131 mmol, 収率 12%) を得た。
APCI-MS: m/z 508 ( [M + H]+)
lH NMR (CDC13) δ (ppm)： 1.32 (t， J = 5.0 Hz, 3 H) , 2.58 (s, 3 H) , 2.63 (s, 3 H) , 2.75-2.79 (m, 7 H) , 2.81 (q, J = 5.0 Hz, 2 H)， 4.08 (s, 2 H) , 4.28 (s， 2 H), 5.34 (s, 2 H) , 6.3.7 (s, 1 H) , 6.46 (d, J = 8.1 Hz, 1 H) , 6.58 (d, J = 8.1 Hz, 1 H), 6.72-6.80 (m, 2 H) , 6.84-6.94 (m, 3 H) . 実施例 2 0 ： 化合物 2 7 {2— (2—ェチルー 5， 7—ジメチルー 3H—ィミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン— 3—ィルメチル）一 8— [4—（2H—テ トラゾール— 5—ィル) ーピペリ ジン一 1—ィルメチル ]一 10， 11—ジヒ ドロ _ 5H—ジベンゾ [b, f] T ゼピン } の合成
メチルアミ ノァセ トニ ト リルの代わりにピペリ ジン— 4一カルボ- ト リル を用い、 実施例 1 4と同様にして、 収率 58%で 1一 [8— (2—ェチル—5, 7— ジメチルー 3Η—ィ ミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 10' 11一ジヒ ドロ ー 5H—ジベンゾ [b， f]ァゼピン一 2—ィルメチル]ーピペリ ジン一 4一力 ルボニトリルを得た。 得られた 1一 [8—（2—ェチルー 5， 7—ジメチルー 3H—イミダゾ [4, 5 - b]ピ リ ジン一 3—ィルメチル）一 10, 11—ジヒ ドロー 5H—ジベンゾ [b， f]ァゼピン一 2 —イ ノレメチノレ]ピペリジン一 4一力ノレボニトリノレ (0.252 g, 0.500 mmol) を トノレェン (4 mL) に溶解し、 ト リ メチルシ リ ルアジド (0.13 mL, 1.00 mmol) および酸化ジブチルすず （12.4 mg, 0.05 mmol) を加え、 110°Cで 22時間、 加熱攪拌した。反応溶液を減圧下、濃縮した後、残渣にエタノールを加えた。 得られた懸濁液を 0.5 時間、 加熱環流した後、 固体を濾取して化合物 2 7
(0.110 g、 0.200 mmol, 収率 40%) を得た。
APCI-MS: m/z 548 ( [M + H]+)
:H NMR (DMS0 - d6) δ (ppm)： 1.22 (t， J = 7.4 Hz, 3 H) , 1.65-1.85 (m, 2 H) , 1.9-2.05 (m, 2 H) , 2.2-2.35 (m, 2 H) ， 2.48 (s, 3H) , 2.58 (s, 3H) , 2.77 (q, J = 7.4 Hz, 2 H) , 2.85-3.05 (m, 7 H) ， 3.52 (s, 2H) , 5.29 (s, 2 H) , 6.85-7.05 (m, 8 H) , 8.36 (s， 1 H) . 実施例 2 1 ： 化合物 2 8〜化合物 9 0の合成
工程 1
ヨウィ匕 1一 （10, 11—ジヒ ドロー 5H—ジベンゾ [b， f]ァゼピン一 2—ィルメ チル） 一 1—メチルビペリ ジニゥム （0.015 g, 0.050 mmol) をジメチルホル ムアミ ド （0.50mL) に溶解し、 対応する YH (式中、 Yは前記と同義である） のクロ口ホルム溶液 （1.0 mmol/L， 0.060 mL) および水酸ィ匕リチウム · 1水 和物 （0.070 g) を加え、 室温で 20時間撹拌した。 反応の進行を薄層クロマ トグラフィーで確認した後、 溶媒を留去し、 残渣をジクロロメタンに溶解さ せ、 得られた溶液を水で 3回洗浄した。 有機層を無水硫酸ナトリ ゥムで乾燥 後、 濃縮し、 残渣にクロ口ホルム （0.60 mL) および N—メチルイサト酸無 水物 ポリ スチレン (N-Methylisatoic anhydride polystylene、 ノ ノくノ ィ オケム社製、 0.15 mL) を加え、 室温で終夜撹拌した。 反応混合物中のレジ ンを濾別し、攄液を濃縮した後に、残渣をイオン交換ク口マトグラフィー（ボ ンデシル SCX、 バリ アン社製、 2 mol/Lアンモニア一メタノール溶液で溶出） で精製し、 製造法 1における化合物 （IV) に相当する各種中間体を得た。 工程 2 実施例 5 と同様にして、 工程 1で得られた製造法 1における化合物 （IV) に相当する各種中間体と相当する R5R H (式中、 R5および はそれぞれ前記 と同義である） から、 目的物である化合物 2 8〜化合物 9 0を得た。 尚、 ィ匕 合物 4 1、 4 2、 4 8、 8 9はシユウ酸塩と して単離した。
化合物 2 8〜化合物 8 7の構造と分析値 （APCI- MS) を第 2表〜第 6表に 記した。 また、 ィ匕合物 2 9、 3 0、 3 6、 4 1、 4 2、 4 8、 5 3、 5 4、 6 0、 6 5、 6 6、 7 2、 7 7、 7 8、 8 4の分析値 （ NMR) を以下に示 した。 化合物 2 9 {2— (ベンゾイ ミダゾールー 1ーィルメチル）ー8—（1， 2， 5， 6—テ トラ ヒ ドロ ピリ ジン一 1一イノレメ チノレ） 一 10， 11ージヒ ドロ ー 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン } ·
XH NMR (DMS0-d6) S (ppm)： 2.0-2.1 (m， 2 H) , 2.44 (t, J = 5.6 Hz, 2 H) , 2.75-2.85 (m, 2 H) , 2.9-3.0 (m, 4 H) , 3.32 (s， 2 H) , 5.31 (s， 2 H) , 5.5-5.8 (m, 2 H)， 6.8—7.1 (m, 6 H) , 7.1—7.3 (m， 2 H) , 7.56 (d， J = 7.1 Hz, 1 H), 7.62 (d, J = 7.4 Hz, 1 H) , 8.28 (s， 1 H) , 8.35 (s， 1 H) . 化合物 3 0 {2- (ベンゾィ ミダゾールー 1—ィルメチル）—8—（ピロ リ ジン— 1—ィルメチル）― 10, 11—ジヒ ドロー 5H-ジベンゾ [b， f]了ゼピン}
XH NMR (DMS0-d6) δ (ppm)： 1.5-1.7 (m, 4 H)， 2.3-2.5 (m, 4 H)， 2.8-3.0 (m， 4 H) , 3.39 (s, 2 H) , 5.31 (s, 2 H)， 6.8-6.95 (m, 4 H) , 6.95-7.0 (m, 2 H) , 7.1-7.3 (m, 2 H) , 7.55 (d， J = 8.9 Hz, 1 H) , 7.63 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 8.26 (s, 1 H), 8.34 (s, 1 H) . 化合物 3 6 { 2— (ベンゾィミダゾ一 1—ィルメチル）一 8—モルホリ ノメチル — 10， 11ージヒ ドロ一 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン }
XH NMR (DMS0-d6) δ (ppm)： 2.2-2.4 (m， 4 H) , 2.8-3.0 (m, 4 H)， 3.27 (s, 2 H), 3.5-3.6 (m， 4 H) , 5.30 (s， 2 H) , 6.7-7.1 (m， 6 H) , 7.1-7.25 (m， 2 H), 7.54 (d, J = 7.6 Hz, 1 H) , 7.62(d, J = 7.6 Hz, 1 H) , 8.28 (s, 1 H), 8.34 (s, 1 H). 化合物 4 1 { 2— （2—フエニルベンゾィ ミダゾール— 1一ィルメチル）一 8 _ (1, 2， 5, 6—テ トラヒ ド ロピリ ジン一 1—ィルメチノレ）一 10, 11—ジヒ ド ロ 一 5H —ジベンゾ [b, f]ァゼピン · 1 シュゥ酸塩 }
XH NMR (DMS0 - d6) δ (ppm)： 2.2-2.5 (m, 2 H) , 2.7-3.0 (m, 4 H) , 3.0-3.2 (m, 2 H), 3.4-3.6 (m, 2 H)， 4.05 (s, 2 H) , 5.45 (s, 2 H) , 5.69 (m, 1 H) , 5.85 (m， 1 H), 6.6-6.8 (m, 2 H)， 6.88 (d， J = 8.3 Hz, 1 H) , 6.97 (d, J = 7.9 Hz, 1 H), 7.05-7.2 (m, 2 H) , 7.2-7.5 (m, 2 H) , 7.5-7.7 (m, 4 H), 7.7-7.85 (m, 3 H) , 8.54 (s, 1 H) . 化合物 4 2 {2- (2—フエニルベンゾィ ミダゾ一ノレ一 1一ィルメチル）一 8— (ピロ リ ジン一 1一ィルメチル）一 10, 11—ジヒ ドロ一 5H—ジベンゾ [b, f ]ァゼ ピン · 1 シュゥ酸塩 }
:H NMR (DMS0-d6) δ (ppm)： 1.8-2.0 (m, 4 H) , 2.8-3.0 (m， 4 H)， 3.0-3.2 (m, 4 H), 4.12 (s, 2 H), 5.45 (s, 2 H)， 6.6-6.7 (m， 2 H) , 6.88 (d, J = 8.1 Hz, 1 H)， 6.96 (d, J = 7.8 Hz, 1 H) , 7.1-7.2 (in, 2 H)， 7.2-7.3 (m, 2 H), 7.4-7.6 (m, 4 H) , 7.6-7.8 (m, 3 H)， 8.53 (s， 1 H) . 化合物 4 8 {2—モルホリ ノメチル _8— (2-フェ -ルベンゾィ ミダゾールー 1一ィルメチル）一 10, 11—ジヒ ドロー 5H—ジべンゾ [b, f]ァゼピン · 1 シユウ 酸塩）
XH NMR (DMS0-d6) δ ( pm)： 2.7-3.0 (m， 8 H) , 3.6-3.8 (m, 4 H) , 3.83 (s, 2 H), 5.42 (s, 2 H), 6.65-6.7 (m, 2 H) , 6.85 (d, J = 8.2 Hz, 1 H) , 6.92 (d, J = 8.1 Hz, 1 H), 7.0-7.1 (m, 2 H) , 7.2-7.3 (m， 2 H) , 7.4-7.6 (m, 4 H), 7.65-7.8 (m, 3 H) , 8.44 (s, 1 H) . 化合物 5 3 {2- (2-メチルベンゾィ ミダゾール一 1一ィルメチノレ）一 8 _ (1， 2, 5， 6—テ トラヒ ドロピリ ジン一 1一ィルメチル）一 10， 11ージヒ ドロー 5H —ジベンゾ [b, f]ァゼピン }
¾ 丽 R (DMS0 - d6) δ (ppm)： 2.0-2.1 (m, 2 H) , 2.45 (t， J = 5.6 Hz, 2 H) , 2.54 (s, 3 H) , 2.75-2.85 (m, 2 H)， 2.85-3.0 (m， 4 H) , 3.35 (s, 2 H) , 5.28 (s, 2 H) , 5.55-5.75 (m, 2 H)， 6.8-7.0 (m, 6 H) , 7.1-7.2 (m, 2 H) , 7.4-7.6 (m, 2 H) , 8.28 (s, 1 H) . 化合物 5 4 {2- (2—メチルベンゾィ ミ ダゾールー 1ーィルメチル）一8— (ピ 口 リ ジン一 1—ィルメチル）一 10， 11ージヒ ドロ一 5H—ジベンゾ [b， f ]ァゼピ ン}
XH NMR (DMS0-d6) δ (ppm)： 1.5-1.8 (m, 4 H)， 2.3-2.5 (m, 4 H) , 2.54 (s,
3 H), 2.8-3.0 (m, 4 H) , 3.39 (s, 2 H) , 5.28 (s, 2 H) , 6.7-6.9 (m, 6 H)， 7.1-7.2 (m, 2 H) , 7.3-7.5 (m, 2 H) , 8.25 (s, 1 H) . 化合物 6 0 {2—（2^メチルベンゾィ ミダゾ一 1一ィルメチル）一 8—モルホリ ノメチルー 10， 11ージヒ ドロ -5H-ジべンゾ [b, f]ァゼピン }
JH NMR (DMS0-d6) δ (ppm)： 2.2-2.4 (m, 4 H)， 2.49 (s, 3 H) , 2.8-3.0 (m,
4 H), 3.28 (s， 2 H), 3.5-3.6 (m, 4 H) , 5.28 (s， 2 H) , 6.8-7.0 (m, 6 H) , 7.1-7.2 (m, 2 H) , 7.5-7.6 (m, 2 H) , 8.28 (s, 1 H) . 化合物 6 5 {2- (5， 6-ジメチルベンゾィ ミ ダゾーノレ一 1—ィルメチル） - 8 — (1, 2, 5， 6—テ トラ ヒ ドロ ピリ ジン一 1一ィルメチル）一 10， 11ージヒ ドロ一 5H-ジベンゾ [b, f]了ゼピン }
:H NMR (DMS0 - d6) δ (ppm)： 2.0-2.1 (m, 2 H) , 2.2-2.4 (m, 6 H) , 2.45 (t, J = 5.2 Hz, 2 H), 2.75-2.85 (m， 2 H) , 2.85-3.05 (m, 4 H) , 3.30 (s， 2 H), 5.24 (s, 2 H) ' 5.6-5.7 (m, 2 H)， 6.8-7.0 (m, 6 H) , 7.31 (s, 1 H) , 7.40 (s， 1 H) , 8.17 (s, 1 H)， 8.27 (s, 1 H) . 化合物 6 6 { 2—（5, 6—ジメチルべンゾィ ミ ダゾ一ノレ一 1—ィルメチノレ）一8 — (ピロ リ ジン一 1一ィルメチル）一10, 11—ジヒ ドロー 5H—ジベンゾ [b，f]ァ ゼピン }
:H NMR (DMS0-d5) 8 (ppm)： 1.5-1.8 (m, 4 H)， 2.27 (s, 3 H)， 2.28 (s, 3 H) ,
2.3-2.4 (m, 4 H) , 2.8-3.0 (m, 4 H) , 3.39 (s， 2 H) , 5.24 (s, 2 H) , 6.8-7.0 (m, 6 H) , 7.30 (s， 1 H) , 7.40 (s, 1 H) , 8.16 (s, 1 H)， 8.24 (s, 1 H) . 化合物 7 2 {2—（5， 6—ジメチルべンゾィ ミ ダゾールー 1—ィルメチル)― 8 一モルホリ ノメチルー 10, 11—ジヒ ド i _ 5H—ジベンゾ [b, f ]ァゼピン } JH NMR (DMS0-d6) δ (ppm)： 2.2-2.4 (m, 10 H) , 2.8-3.0 (m, 4 H) , 3.28 (s, 2 H), 3.5-3.6 (m, 4 H)， 5.24 (s, 2 H)， 6.8-7.0 (m, 6 H) , 7.30 (s, 1 H) , 7.39 (s, 1 H), 8.16 (s, 1 H) , 8.28 (s, 1 H) . 化合物 7 7 {2- (2—ェチルベンゾィ ミ ダゾーノレ一 1—ィルメチル）一 8— (1， 2， 5, 6—テ トラ ヒ ドロピリ ジン一 1ーィルメチル）一 10, 11—ジヒ ドロー 5H ージベンゾ [b, f ]ァゼピン }
^ NMR (DMS0 - d6) δ (ppm)： 1.28 (t, J = 7.4 Hz, 3 H)， 1.95-2.05 (m, 2 H) , 2.43 (t, J = 5.4 Hz, 2 H) , 2.6-3.0 (m, 8 H) , 3.32 (s， 2 H) , 5.28 (s， 2 H)， 5.1-5.5 (m， 2 H) , 6.75-7.0 (m， 6 H) , 7.1-7.25 (m, 2 H) , 7.47 (m, 1 H), 7.55 (m, 1 H) , 8.26 (s, 1 H) . 化合物 7 8 {2_ (2—ェチルベンゾィ ミダゾーノレ一 1—ィルメチル）一 8— (ピ 口 リ ジン一 1ーィルメチノレ） 一 10， 11—ジヒ ドロー 5H-ジベンゾ [b, f]ァゼピ ン}
JH NMR (DMS0 - d6) δ (ppm)： 1.28 (t, J = 7.4 Hz， 3 H) , 1.6-1.8 (m, 4 H) , 2.3-2.4 (m, 4H) , 2.8-3.0 (m, 6 H) , 3.32 (s, 2 H) , 5.28 (s， 2 H) , 6.7-7.0 (m, 6 H), 7.0-7.2 (m, 2 H) , 7.46 (m， 1 H) , 7.54 (m, 1 H) , 8.23 (s， 1 H). 化合物 8 4 {2- (2—ェチルベンゾィ ミダゾー 1一ィルメチル）—8—モルホリ ノメチル一10, 11—ジヒ ドロ一 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン }
XH NMR (DMS0-d6) δ (ppm)： 1.28 (t, J = 7.4 Hz, 3 H)， 2.2-2.4 (ra, 4 H) ,
2.8-3.0 (m, 6H) , 3.27 (s, 2 H) , 3.5-3.6 (m, 4 H) , 5.27 (s， 2 H) , 6.7-7.0
(m, 6 H), 7.1-7.2 (m, 2 H) , 7.47 (m， 1 H) , 7.55 (m, 1 H) , 8.26 (s, 1
H). 化合物 8 8〜化合物 9 0の構造を第 7表に、 分析値 （APCI- MS、 JH NMR) を以下に示した。
化合物 8 8 {2—（イ ミダゾ [4， 5-b]ピリ ジン一 1—ィルメチル）一 8—（1, 2, 5， 6 ーテ トラヒ ド ロピリ ジン一 1—イ ノレメチノレ）一 10, 11ージヒ ド ロ一 5H—ジベン ゾ [b, f]ァゼピン }
APCI-MS: m/z 422 ( [M + H]+)
XH NMR (DMS0-ds) δ (ppm)： 2.0-2.1 (m, 2 H) , 2.44 (t, J = 5.4 Hz, 2 H)， 2.75-2.8 (m， 2 H) , 2.8-3.0 (m, 4 H) , 3.30 (s, 2H) , 5.33 (s, 2 II ) , 5.5-5.6 (m, 2 H)， 6.8-7.0 (m, 4 H) , 7.0-7.05 (m, 2 H) , 7.27 (dd, J = 4.7 Hz, 8.0 Hz, 1 H), 8.06 (d， J = 8.0 Hz, 1 H) , 8.27 (s, 1 H) , 8.37 (d, J = 4.7 Hz, 1 H)， 8.54 (s， 1 H) . 化合物 8 9 {2- (ィ ミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル） -8- (1， 2, 5, 6 ーテ トラヒ ドロピリ ジン一 1—ィノレメチノレ） 一 10, 11ージヒ ドロ -5H-ジベン ゾ [b， f ]ァゼピン · 1 シユウ酸塩 }
APCI-MS: m/z 422 ( [M + H]+)
XH NMR (DMSO - de) δ (ppm)： 2.2-2.3 (m, 2 H) , 2.9-3.0 (m， 4 H) , 3.4-3.5 (m, 2 H), 3.60 (t, J = 6.8 Hz, 2 H) , 4.05 (s, 2 H) , 5.37 (s， 2 H) , 5.67 (d, J = 10.8 Hz, 1 H), 5.85 (d, J = 10.8 Hz, 1 H) , 6.9-7.0 (m, 2 H) , 7.0-7.1 (m, 4 H)， 7.25 (dd, J = 5.4, 8.1 Hz, 1 H) , 8.01 (d, J = 8.1 Hz， 1 H) , 8.40 (d, J = 5.4 Hz, 1 H) , 8.55 (s, 1 H) , 8.62 (s, 1 H) . 化合物 9 0 {2— (イ ミダゾ [4, 5-c]ピリ ジン _ 1一ィルメチル）一 8— (1,2, 5, 6 "テ トラヒ ドロピリ ジン一 1一イノレメチノレ） 一 10, 11—ジヒ ド口一 5H—ジベン ゾ [b, f]ァゼピン }
APCI-MS: m/z 422 ( [M + H]+)
:H NMR (CDC13) δ (ppm)： 2.1-2.2 (m, 2 H) , 2.56 (t, J = 5.7 Hz, 2 H) , 2.8-2.9 (m, 2 H)， 3.0-3.1 (m, 4 H) , 3.48 (s, 2H) , 5.30 (s, 2 H) , 5.67 (d, J = 10.5 Hz, 1 H)， 5.73 (d, J = 10.5 Hz, 1 H) , 6.08 (s, 1 H)， 6.65-6.75 (m, 2 H), 6.95-7.0 (m, 2 H) , 7.0-7.05 (m， 2 H) , 7.71 (d, J = 5.4 Hz, 1 H) , 8.02 (s， 1 H), 8.45 (d, J = 5.4 Hz, 1 H) , 8.78 (s, 1 H) . 実施例 2 2 ： 化合物 1 2 5 { [8—（2—ェチルー 5, 7—ジメチルー 3H—ィミダ ゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチノレ） 一 5—メチルー 10, 11—ジヒ ドロ ー 5H— ジベンゾ [b， f]ァゼピン一 2—ィル]酢酸 } の合成
実施例 3 6で得られた化合物 1 0 5を用い、実施例 5 2の工程 1 と同様に して、 収率 94%で [8— (2—ェチル一5， 7—ジメチル一 3H—ィ ミダゾ [4, 5 - b] ピリ ジン _ 3—ィルメチル）一 5—メチノレー 10, 11—ジヒ ドロ 一 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン一 2—ィル]ァセ トニ ト リルを得た。
これを用い、 実施例 3 8 と同様にして収率 86%で化合物 1 2 5を得た。 APCI-MS: m/z 455 ( [M + H]+)
JH NMR (DMS0-d6) δ (ppm)： 1.22 (t, J = 7.3 Hz, 3 H) , 2.49 (s， 3 H) , 2.50
(s, 3 H) , 2.75 (q， J = 7.3 Hz, 2 H) , 2.9-3.1 (m， 4 H) , 3.19 (s, 3 H) , 3.42 (s, 2 H) , 5.32 (s, 2 H) , 6.81 (d, J = 8.1 Hz, 1 H) , 6.9-7.05 (m, 6 H) . 実施例 2 3 ： 化合物 9 2 {酢酸 [8— (2—ェチル—5， 7—ジメチル— 3H—ィ ミ ダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—イノレメチル）一 10, 11—ジヒ ドロー 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン一 2—ィルメチル]エステル } の合成
実施例 6で得られた化合物 1 3 (7.98 g, 13.1 mmol) をジメチルスルホ キシド （87 mL) に溶解し、 酢酸リチウム （4.33 g, 65.7 mL) を加えて 70°C で 2 日間撹拌した。 反応液を酢酸ェチルで希釈し、 水 （3 回）、 飽和食塩水 で順次洗浄し、 無水硫酸マグネシウムで乾燥し、 濃縮した。 残渣をシリカゲ ルク ロマ トグラフィー （溶出溶媒：酢酸ェチル） で精製し、 目的物を含む画 分を濃縮し、残渣にェタノールを加えて得られる懸濁液を室温で 0.5時間撹 拌した。析出した結晶を濾取して化合物 9 2 (2.87 g, 6.31 mmol，収率 48%) を得た。
APCI-MS: m/z 455 ( [M + H]+)
XH NMR (CDC13) δ (ppm)： 1.30 (t, J = 7.5 Hz, 3 H) , 2.06 (s, 3 H) , 2.60 (s， 3 H), 2.62 (s, 3 H) , 2.79 (q, J = 7.5 Hz, 2 H) , 2.98 (m, 4 H) , 4.98 (s, 2 H), 5.34 (s, 2 H) , 6.13 (s， 1 H)， 6.58-6.83 (m, 4 H) , 6.88 (s, 1 H)， 7.01-7.07 (m, 2 H) . 実施例 2 4 ： 化合物 9 3 { [8— (2—ェチル _ 5， 7—ジメチルー 3H—ィミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 10， 11ージヒ ドロー 5H—ジべンゾ [b, f] ァゼピン一 2—ィノレ]メタノール } の合成
実施例 2 3で得られた化合物 9 2 (2.79 g, 6.14 mmol) をテトラヒ ドロ フラン （61 mL) に懸濁させ、 ナト リ ウムメ トキシド /メタノール溶液（28%, 6.2 mL, 31 mmol)を加えて室温で 3.5時間撹拌した。 反応の進行を薄層クロ マ トダラフィ一で確認した後、反応液に水を加えて室温にて 0.5時間撹拌し た。 析出した結晶を濾取し、 減圧下乾燥させた後にエタノールに懸濁させ、 加熱還流条件下、 1時間撹拌し、 さらに室温で 1時間撹拌した。 析出した結 晶を濾取し、 減圧下で乾燥させ、 化合物 9 3 (2.04 g, 4.95 mmol, 収率 81%) を得た。
APCI-MS: m/z 413 ( [M + H]+)
:H NMR (CDC13) δ (ppm)： 1.30 (t, J = 7.6 Hz, 3 H)， 1.56 (t, J = 5.6 Hz, 1 H) , 2.60 (s, 3 H) , 2.63 (s, 3 H) , 2.79 (q, J = 7.6 Hz, 2 H) , 2.98 (m， 4 H), 4.55 (d, J = 5.6 Hz, 2 H) , 5.34 (s, 2 H) , 6.03 (s， 1 H) , 6.59-6.85 (m, 3 H), 6.88 (s， 1 H)， 7.03 (m, 2 H) . 実施例 2 5 ： 化合物 9 4 {2— （2—ェチルー 5， 7—ジメチルー 3H—イ ミダゾ
[4, 5-b]ピリ ジン _3—ィルメチノレ）一 8—メ トキシメチルー 10， 11—ジヒ ドロ 一 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン } の合成
水素化ナト リ ウム （55%, 11 mg, 0.25 mmol) のテ トラヒ ドロフラン （0.40 mL) 懸濁液にメタノール （20 μ L, 0.50 mmol) を加えて室温で 20分間攪 拌した。 その後、 反応液をテトラヒ ドロフラン（0.20 mL)に懸濁した実施例
6で得られた化合物 1 3 (30 mg, 0.050 mmol) に加え、 60°Cで 3.5時間反 応させた。 反応液を濃縮した後、 残渣をクロ口ホルムに溶解し、 得られた溶 液を水と飽和食塩水で順次洗浄し、 無水硫酸マグネシウムで乾燥し、 濃縮し た。 残渣をシリカゲルク ロマ トグラフィー （溶出溶媒 ： 酢酸ェチル /へキサ ン /ト リ ェチルァミ ン = 45/50/5) で精製して化合物 9 4 (6.5 mg, 15 mmol, 収率 30%) を得た。
APCI-MS: m/z 427 ( [M + H]+)
JH NMR (CDC13) 5 (ppm)： 1.30 (t, J = 7.6 Hz, 3 H) , 2.60 (s, 3 H) , 2.63 (s, 3 H), 2.79 (q, J = 7.6 Hz, 2 H) , 2.98 (m, 4 H) , 3.36 (s, 3 H) , 4.32 (s， 2 H) , 5.34 (s, 2 H)， 6.09 (s, 1 H)， 6.58-6.82 (m, 4 H)， 6.88 (s, 1 H), 7.01 (m, 2 H) . 実施例 2 6 ： 化合物 9 5 { 2—ァリルォキシメチル— 8—（2—ェチル一 5, 7— ジメチノレー 3H—ィ ミ ダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィノレメチル）一 10, 11ージヒ ドロー 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン } の合成
メタノールの代わり にァリルアルコールを用い、実施例 2 5 と同様にして、 収率 34%で化合物 9 5 を得た。
APCI-MS: m/z 453 ( [M + H]+)
JH NMR (CDC13) δ (ppm)： 1.30 (t, J = 7.6 Hz, 3 H) , 2.60 (s， 3 H) , 2.63 (s, 3 H), 2.80 (q, J = 7.6 Hz, 2 H) , 2.98 (m, 4 H) , 4.00 (dt， J = 5.6, 1.5 Hz, 2 H) ' 4.39 (s, 2 11)， 5.19 (dq, J = 10.2， 1.5 Hz, 1 H) , 5.29 (dq, J = 17.0， 1.5 Hz, 1 H), 5.34 (s, 2 H) , 5.95 (m, 1 H) , 6.10 (s, 1 H)， 6.58-6.83 (m, 4 H)， 6.88 (s, 1 H) , 7.03 (m, 2 H) . 実施例 2 7 ： 化合物 9 6 { 2—（2—ェチル _ 5， 7—ジメチルー 3H—イ ミ ダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメ チル）一 8— (2—メ トキシェ トキシメチル）一 10, 11—ジヒ ドロー 5H—ジベンゾ [b,f]ァゼピン } の合成
メタノールの代わり に 2—メ トキシエタノールを用い、 実施例 2 5 と同様 にして、 収率 9.3%で化合物 9 6 を得た。
APCI-MS: m/z 495 ( [M + H]+)
:H NMR (CDC13) δ (ppm)： 1.30 (t, J = 7.5 Hz, 3 H) , 2.60 (s, 3 H) , 2.63 (s, 3 H), 2.80 (q, J = 7.5 Hz, 2 H) , 2.98 (m, 4 H) , 3.38 (s, 3 H) , 3.57 (m, 4 H), 4.44 (s, 2 H) , 5.34 (s, 2 H) , 6.01 (s, 1 H) , 6.62 (d, J = 8.6 Hz, 1 H), 6.67 (d, J = 8.1 Hz, 1 H) , 6.82 (m, 2 H) , 6.88 (s, 1 H) , 7.00-7.06 (m, 2 H). 実施例 2 8 ： 化合物 9 7 {2- (2—ェチルー 5， 7—ジメチルー 31トイ ミ ダゾ [4, 5-b]ピリ ジン _ 3—ィルメチル）一 8— (2, 2, 2— ト リ フルォロェ トキシメ チル） - 10, 11—ジヒ ドロ 一 5H—ジベンゾ [b,f]ァゼピン } の合成
メタノールの代わり に 2, 2, 2- ト リ フルォロエタノールを用い、 実施例 2 5 と同様にして、 収率 64%で化合物 9 7 を得た。
APCI-MS: m/z 495 ( [M + H]+)
¾ NMR (CDC13) δ (ppm)： 1.30 (t， J = 7.6 Hz, 3 H) , 2.60 (s, 3 H) , 2.63 (s， 3 H), 2.79 (q， J = 7.6 Hz, 2 H) , 2.98 (m, 4 H) , 3.78 (q, J = 8.7 Hz, 2 H), 4.54 (s, 2 H) , 5.34 (s, 2 H) , 6.24 (s, 1 H) , 6.60 (d, J = 7.8 Hz, 1 H), 6.71 (d, J = 8.1 Hz, 1 H) , 6.76-6.82 (m， 2 H) , 6.89 (s, 1 H) , 6.98-7.04 (m, 2 H) . 実施例 2 9 ： 化合物 9 8 { 2—（2—ェチルー 5， 7—ジメチル一 3H—イ ミ ダゾ [4, 5- b]ピ リ ジン一 3—ィルメ チル）一 8 _ (2 _メ チルプロポキシメ チル）一 10， 11—ジヒ ドロ一 5H—ジベンゾ [b,f]ァゼピン } の合成
メタノールの代わり に 2—メチルー 1一プロパノールを用い、 実施例 2 5 と同様にして、 収率 11%で化合物 9 8 を得た。
APCI-MS: m/z 469 ( [M + H]+)
:H NMR (CDC13) δ (ppm)： 0.91 (d, J = 6.7 Hz, 6 H) , 1.30 (t, J = 7.4 Hz, 3 H), 1.89 (m, 1 H) , 2.60 (s, 3 H) , 2.63 (s， 3 H) , 2.79 (q, J = 7.4 Hz, 2 H), 2.99 (m， 4 H) , 3.20 (d, J = 6.5 Hz, 2 H) , 4.37 (s, 2 H) , 5.34 (s, 2 H)， 6.01 (s， 1 H), 6.60 (d, J = 8.9 Hz, 1 H) , 6.67 (d， J = 7.8 Hz, 1 H), 6.81 (m, 2 H) , 6.88 (s， 1 H) , 6.98-7.05 (m, 2 H) . 実施例 3 0 ： 化合物 9 9 {2—ベンジルォキシメ チルー 8— (2—ェチルー 5， 7 ージメチル一 3H—ィ ミ ダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 10， 11ージ ヒ ドロー 5H-ジベンゾ [b, f]ァゼピン } の合成 メタノールの代わりにべンジルアルコールを用い、実施例 2 5 と同様にし て、 収率 78%で化合物 9 9を得た。
APCI-MS: m/z 503 ( [M + H]+)
-l NMR (CDC13) δ (ppra)： 1.30 (t, J = 7.5 Hz, 3 H) , 2.60 (s， 3 H) , 2.62 (s, 2 H), 2.79 (q, J = 7.5 Hz, 2 H) , 2.97 (m， 4 H) , 4.42 (s, 2 H)， 4.53 (s， 2 H), 5.33 (s, 2 H)， 6.20 (s, 1 H) , 6.59 (d, J = 7.9 Hz, 1 H) , 6.69 (d, J = 7.9 Hz, 1 H), 6.78 (m, 2 H) , 6.88 (s, 1 H) , 7.02 (m, 2 H) , 7.26-7.36 (m, 5 H). 実施例 3 1 ：化合物 1 0 0 {2— (2—ェチルー 5， 7—ジメチル— 3H—ィミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—イノレメチノレ）一 8—（2-フエニ ノレエ ト キシメチノレ） 一 10， 11—ジヒ ドロー 5H—ジベンゾ [b,f]ァゼピン } の合成
メタノールの代わりに 2—フェニルエタノールを用い、 実施例 2 5 と同様 にして、 収率 38%で化合物 1 0 0を得た。
APCI-MS: m/z 517 ( [M + H]+)
-I NMR (CDCI3) δ (ppm)： 1.30 (t, J = 7.5 Hz, 3 H) , 2.60 (s, 3 H) , 2.63 (s, 3 H), 2.80 (q, J = 7.5 Hz, 2 H) , 2.91 (t, J = 7.2 Hz, 2 H) , 2.97 (m, 4 H), 3.66 (t, J = 7.2 Hz, 2 H) , 4.39 (s, 2 H)， 5.34 (s, 2 H) , 6.08 (s, 1 H), 6.60 (d, J = 8.7 Hz, 1 H) , 6.66 (d, J = 8.1 Hz, 1 H)， 6.80 (m, 2 H), 6.88 (s， 1 H) , 6.94-7.01 (m, 2 H) , 7.19-7.30 (m， 5 H) . 実施例 3 2 ：化合物 1 0 1 { 2—（2—ェチルー 5， 7—ジメチルー 3H—ィミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 8— (ピリ ジン一 2—ィルメ トキシメチ ル）一 10, 11—ジヒ ドロ一5H—ジベンゾ [b，f]ァゼピン } の合成
メタノールの代わり にピリ ジン _2—ィルメタノールを用い、 実施例 2 5 と同様にして、 収率 65%で化合物 1 0 1 を得た。
APCI-MS: m/z 504 ( [M + H]+)
:H NMR (CDCI3) δ (ppm)： 1.30 (t, J = 7.5 Hz, 3 H) , 2.60 (s, 3 H) , 2.63
(s, 3 H), 2.80 (q, J = 7.5 Hz, 2 H) , 2.98 (m, 4 H) , 4.52 (s, 2 H) , 4.66
(s, 2 H), 5.34 (s, 2 H), 6.25 (s, 1 H) , 6.60 (d， J = 7.9 Hz, 1 H) , 6.70 (d, J = 7.9 Hz, 1 H) , 6.76-6.81 (m, 2 H) , 6.88 (s, 1 H) , 7.03-7.08 (m, 2 H), 7.18 (br dd, J = 7.6， 4.8 Hz, 1 H) , 7.47 (d, J = 7.9 Hz, 1 H)， 7.68 (td, J = 7.7, 1.8 Hz, 1 H) , 8.54 (br d, J = 4.8 Hz, 1 H) . 実施例 3 3 ：化合物 1 0 2 {2_ (2—ェチルー 5, 7—ジメチル— 3H—ィミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）一8—（フラン一 2—ィルメ トキシメチル） — 10, 11—ジヒ ドロー 5H—ジベンゾ [b，f]ァゼピン } の合成
メタノールの代わり にフラン一 2—ィルメタノールを用い、 実施例 2 5 と 同様にして、 収率 77%で化合物 1 0 2を得た。
APCI-MS: m/z 493 ( [M + H]+)
NMR (CDC13) δ (ppm)： 1.30 (t, J = 7.5 Hz, 3 H)， 2.60 (s, 3 H) , 2.62 (s, 3 H)， 2.79 (q, J = 7.5 Hz, 2 H) , 2.97 (m, 4 H) , 4.41 (s, 2 H) , 4.45 (s, 2 H)， 5.33 (s, 2 H) , 6.21 (br s, 1 H) , 6.31 (dd, J = 3.1, 0.8 Hz, 1 H)， 6.33 (dd, J = 3.1, 1.8 Hz, 1 H)， 6.58 (d, J = 8.1 Hz， 1 H) , 6.69 (d， J = 7.9 Hz, 1 H), 6.75-6.80 (m, 2 H) , 6.88 (s, 1 H) , 7.00-7.04 (m, 2 H), 7.40 (dd, J = 1.8, 0.8 Hz, 1 H) . 実施例 3 4 ：化合物 1 0 3 {8- (2—ェチル— 5> 7—ジメチル— 3H—ィミダゾ
[4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 10, 11—ジヒ ドロ一 5H—ジべンゾ [b， f] ァゼピン _ 2—カルボ二 ト リノレ } の合成
実施例 1 5の工程 1で得られた 8- (2—ェチルー 5, 7—ジメチルー 3H—ィ ミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン _ 3—イ ノレメチノレ）一 10, 11—ジヒ ド ロ 一 5H _ジべン ゾ [b, f]ァゼピン一 2—カルボアルデヒ ド (650 mg, 1.58 mmol) をァセ トニ トリル（16 mL)に懸濁させ、ヒ ドロキシルァミ ン塩酸塩（153 mg, 2.38 mmol), ト リェチルァミン （0.331 mL, 2.38 mmol) およびフタル酸無水物 （328 mg,
2.21 mmol) を加えて 80°Cで終夜撹拌した。 反応液を濃縮し、 残渣をクロ口 ホルムに溶解し、 得られた溶液をアンモニア水 （3%) と飽和食塩水で順次 洗浄し、 無水硫酸マグネシゥムで乾燥し、 濃縮した。 残渣をシリ力ゲルク口 マ トグラフィ一 （溶出溶媒 ： メタノール /ク口口ホルム = 1/") で精製し、 目的物を含む画分を濃縮して残渣にエタノールを加え、 得られた懸濁液を 60°Cで 0.5時間撹拌し、 室温で 1時間撹拌した。 析出した結晶を濾取し、 減 圧下乾燥して化合物 1 0 3 (440 mg, 1.08 mmol, 収率 68%) を得た。 APCI-MS: m/z 408 ( [M + H]+)
:H NMR (CDC13) δ (ppm)： 1.31 (t, J = 7.6 Hz, 3 H)， 2.60 (s， 3 H) , 2.63 (s, 3 H), 2.79 (q, J = 7.6 Hz, 2 H) , 2.98 (m, 4 H) , 5.36 (s, 2 H) , 6.48 (s, 1 H), 6.63-6.90 (m, 5 H)， 7.28-7.33 (m, 2 H) . 実施例 3 5 ：化合物 1 0 4 {2- (2—ェチルー 5, 7—ジメチルー 3H—ィミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—イノレメ チル）一 8— (2H—テ トラゾールー 5—ィル）一 10, 11—ジヒ ドロー 5H—ジベンゾ [b, f ]ァゼピン } の合成
実施例 3 4で得られた化合物 1 0 3を用い、実施例 2 0の後段と同様にし て収率 72%で化合物 1 0 4を得た。
APCI-MS： m/z 451 ([M + H]+)
APCI-MS: m/z 451 ( [M + H]+)
JH NMR (DMSO - d6) δ (ppm)： 1.24 (t, J = 7.4 Hz, 3 H)， 2.48-2.53 (s x 2, 6 H, DMSOとオーバーラップ）， 2.80 (q, J = 7.4 Hz, 2 H)， 2.86-3.02 (m, 4 H) , 5.32 (s, 2 H), 6.83 (dd, J = 8.1, 2.1 Hz, 1 H) , 6.91-6.98 (m, 3 H) , 7.10 (d， J = 9.0 Hz, 1 H) , 7.65-7.70 (m, 2 H) , 8.20 (s， 1 H) . 実施例 3 6 ：化合物 1 0 5 { [8- (2—ェチルー 5, 7-ジメチル— 3H—ィミダ ゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメ チル）一 10, 11—ジヒ ドロ ー 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン— 2—ィル]ァセ トニト リル } の合成
実施例 6で得られた化合物 1 3 (2.04 g， 3.36 mmol) をジメチルホルム アミ ド （17 mL) に溶解して、 青酸ナトリ ウム （361 mg, 7.37 mmol) を加え、 50°Cで 10時間撹拌した。 反応液を室温まで冷却し、 酢酸ェチルで希釈し、 2mol/L水酸化ナトリ ウム水溶液、 水 （2回）、 飽和食塩水で順次洗浄し、 無 水硫酸マグネシウムで乾燥し、 濃縮した。 残渣をエタノールから再結晶し、 目的物である化合物 1 0 5 (751 mg, 1.78 mmol, 収率 53% ) を得た。 APCI-MS: m/z 422 ( [M + H]+)
XH NMR (CDCI3) δ (ppm)： 1.31 (t, J = 7. 5Hz, 3 H)， 2.60 (s, 3 H) , 2.63 (s, 3 H), 2.79 (q, J = 7.5 Hz, 2 H) , 2.99 (m, 4 H)， 3.62 (s, 2 H) , 5.34 (s， 2 H 6.01 (s， 1 H), 6.59-6.71 (m, 2 H) , 6.80-6.84 (m, 2 H) , 6.88 (s, 1 H), 6.95-7.01 (m, 2 H) . 実施例 3 7 ：化合物 1 0 6 {2- (2—ェチル _ 5, 7_ジメチル— 3H—ィミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 8— (2H—テ トラゾール一 5— レメチ ル）一 10, 11—ジヒ ドロー 511-ジベンゾ [b， f ]ァゼピン } の合成
実施例 3 6で得られた化合物 1 0 5を用い、実施例 2 0の後段と同様にし て、 収率 76%で化合物 1 0 6を得た。
APCI-MS: m/z 465 ( [M + H]+)
XH NMR (DMS0-d6) 6 (ppm)： 1.22 (t, J = 7.6 Hz, 3 H) , 2.48-2.52 (s x 2, 6 H， DMSOとオーバ一ラップ）， 2.78 (q, J = 7.6 Hz, 2 H) , 2.86 (m, 4 H) , 4.11 (s, 2 H), 5.28 (s, 2 H)， 6.75-6.94 (m, 7 H) , 8.32 (br s， 1 H) . 実施例 3 8 ：化合物 1 0 7 { [8- (2—ェチルー 5, 7—ジメチルー 3H—ィミダ ゾ [4， 5-b]ピリ ジン一 3— レメ チル）一 10, 11—ジヒ ドロ ー 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン一 2—ィル]酢酸 } の合成
実施例 3 6で得られた化合物 1 0 5 (247 mg, 0.586 ramol) をエタノール (12 mL) に懸濁し、 水酸化ナトリ ウム （938 mg, 23.5 mmol) を加えて、 カロ 熱還流条件下、 3時間撹拌した。 反応の進行を薄層クロマトグラフィーで確 認した後に、 反応液を室温まで冷却し、 lmol/L塩酸で pH 5に調整した。 析 出した結晶を濾過し、 減圧下乾燥した後、 エタノールに懸濁し、 60°Cで 0.5 時間撹拌し、 室温で 1時間撹拌した。 析出した結晶を濾取し、 減圧下乾燥し て化合物 1 0 7 (122 mg, 0.243 mmol, 収率 41%) を得た。
APCI-MS: m/z 441 ( [M + H]+)
:H NMR (DMS0-d6) 6 (ppm)： 1.23 (t, J = 7.5 Hz, 3 H) , 2.48-2.53 (s x 2, 6 H, DMSOとオーバーラップ）， 2.78 (q， J = 7.5 Hz, 2 H)， 2.87 (br s， 4 H), 3.38 (s, 2 H), 5.38 (s, 2 H) , 6.74-6.94 (ra, 7 H) , 8.27 (s, 1 H) , 12.15 (br s, 1 H) . 実施例 3 9 ： 化合物 1 0 8 { [8—（2—ェチルー 5, 7—ジメチルー 3H—ィ ミダ ゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメ チル）一 10, 11—ジヒ ドロ一 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン— 2—ィルメチルスルファニル]酢酸メチルエステル } の合成 実施例 6で得られた化合物 1 3 (1.04 g, 1.71 mmol) をク ロ口ホルム （17 mL) に溶角 して、 メルカプト酢酸メチルエステノレ （0.199 mL, 2.23 mmol) および 1, 8—ジァザビシクロ [5， 4, 0]ゥンデック一 7—ェン （0.384 mL, 2.57 匪 ol) を加え、 40°Cで 7時間撹拌した。 反応液を濃縮し、 残渣をシリカゲル クロマ トグラフィー（溶出溶媒：メタノール /ク口口ホルム =1/99)で精製し、 化合物を含む画分を濃縮した。 残渣にエタノールを加え、 得られた懸濁液を 60°Cで 0.5時間、 室温で 1時間撹拌した。 析出した結晶を濾取して、 化合物 1 0 8 (628 mg, 1.25 mmol, 収率 73%) を得た。
APCI-MS: m/z 501 ( [M + H]+)
lti 讀 (CDC13) δ (ppm)： 1.30 (t, J = 7.5 Hz, 3 H) , 2.60 (s, 3 H) , 2.63 (s, 3 H), 2.80 (q, J = 7.5 Hz, 2 H) , 2.98 (m, 4 H) , 3.09 (s， 2 H) , 3.72 (s， 3 H)， 3.73 (s， 2 H) , 5.34 (s， 2 H)， 6.01 (s， 1 H) , 6.59-6.67 (m， 2 H) , 6.82 (m， 2 H) , 6.88 (s， 1 H)， 6.96-7.03 (m, 2 H) 実施例 4 0 ： 化合物 1 0 9 { [8—（2 _ェチル—5, 7—ジメチルー 3H—ィミダ ゾ [4, 5-b]ピ リ ジン一 3—ィルメ チル）一 10, 11—ジヒ ドロ 一 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン一 2—ィルメチルスルファニル]酢酸） の合成
実施例 3 9で得られた化合物 1 0 8 (350 mg, 0.699 mmol) を用い、 実施 例 1 2 と同様にして、 収率 38%で化合物 1 0 9を得た。
APCI-MS: m/z 487 ( [M + H]+)
JH NMR (DMS0 - d6) δ (ppm)： 1.16 (t, J = 7.4 Hz, 3 H) , 2.42-2.50 (s x 2, 6 H, DMS0とォ一バーラップ）， 2.81 (q, J = 7.4 Hz, 2 H) , 2.88 (m, 6 H)， 3.49 (s, 2 H) , 5.22 (s, 2 H) , 6.67-6.89 (m, 7 H) , 8.18 (s, 1 H) . 実施例 4 1 ：化合物 1 1 0 {8—（2—ェチルー 5, 7-ジメチル— 3H—ィ ミダゾ
[4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 10, 11—ジヒ ドロー 5H—ジべンゾ [b， f] ァゼピン一 2—カルボン酸ェチルエステル } の合成 工程 1
ヨ ウ化 1— ( 10, 11—ジヒ ドロ一 5H—ジべンゾ [b, f]ァゼピン一 2—ィルメ チル） 一 1—メチノレ ビペリ ジニゥム (6.68 g, 15.4 mmol) をジメチルスノレホ キシド （110 mL) に溶解し、 酢酸リチウム （5. 07 g, 76.9 mmol) を加えて、 70°Cで 2 日間攪拌した。 反応溶液を酢酸ェチルで希釈し、 水 （3回） と飽和 食塩水で順次洗浄し、 無水硫酸マグネシウムで乾燥し、 濃縮した。 残渣をシ リカゲルク ロマ トグラフィー （溶出溶媒 ： 酢酸ェチル /へキサン = 30/70) で 精製して、 酢酸 （10, 11—ジヒ ドロ一 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン一 2—ィル メチル） エステル （2.85 g, 10.7 mmol, 収率 69%) を得た。
APCI-MS : m/z 268 ( [M + H]+)
JH賺 (CDC13) δ (ppm)： 2.07 (s， 3 H) , 3.07 (br s， 4 H) , 4.99 (s, 2 H)， 6.05 (br s, 1 H) , 6.66-6.85 (m, 3 H) , 7.02-7. 11 (m, 4 H) .
工程 2
工程 1 で得られた酢酸（10, 11—ジヒ ドロ _ 5H_ジベンゾ [b, f〕ァゼピン一 2—イノレメチノレ） エステノレ (2.85 g, 10. 7 mmol) をメタノーノレ (110 mL) に 懸濁して、 ナ ト リ ウムメ トキシド /メ タノール溶液 （38%, 1. 14 mL, 5. 36 mmol) を加え、 室温で 1時間攪拌した。 反応溶液を濃縮し、 残渣に飽和食塩 水とクロ口ホルムを加えて 3 回クロ口ホルムで抽出した。 有機層を合わせ、 無水硫酸マグネシウムで乾燥し、 濃縮した。 残渣をジィ ソプロピルエーテル から再結晶して、 10, 11—ジヒ ドロ一 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン一 2—ィル メタノール （1.73 g, 7.68 mmol, 収率 72%) を得た。
APCI-MS： m/z 226 ( [M + H]+)
:H NMR (CDC13) δ (ppm)： 1.49 (t， J = 5.8 Hz, 1 H) , 3.08 (br s, 4 H) , 4. 57 (d, J = 5. 8 Hz, 2 H), 6.02 (br s, 1 H)， 6.66-6.87 (m, 3 H) , 7. 02-7. 11 (m, 4 H) .
工程 3
工程 2で得られた 10, 11—ジヒ ドロ一 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン一 2—ィ ルメタノール （6. 1 g, 70 mmol) をクロ 口 ルム （77 mL) に溶解して、 二 酸化マンガン （4. 55 g, 46. 1 mmol) を加え、 室温で 8 時間攪拌した。 反応 溶液をセライ トを通じて濾過し、 濾液を濃縮した。 残渣をシリカゲルク ロマ トグラフィー （溶出溶媒 ： 酢酸ェチル /へキサン ==20/80) で精製して 10, 11 ージヒ ドロー 5H—ジベンゾ [b.f]ァゼピン一 2—カルボアルデヒ ド （1.15 g, 5.15 mmol, 収率 67%) を得た。
APCI-MS: m/z 224 ( [M + H]+)
JH NMR (CDC13) δ (ppm)： 3.11 (m, 4 H) , 6.49 (br s, 1 H)， 6.87-6.91 (m， 3 H)， 7.07-7.17 (m, 2 H) , 7.55-7.62 (m, 2 H) , 9.88 (s, 1 H) .
工程 4
工程 3で得られた 10， 11—ジヒ ドロ一 5H—ジベンゾ [b， f]ァゼピン一 2—力 ルボアルデヒ ド （665 mg， 2.98 mmol) をァセ トニ ト リル (18 mL) および水
(18 mL) の混合溶媒に溶解して、 ジメチルスルホキシド （2.1 mL, 30 mmol)、 リ ン酸 2 水素ナ ト リ ウム （1.43 g, 11.9 mmol) および亜塩素酸ナ ト リ ウム
(404 mg, 4.47 mmol) を加え、 50°Cで 4時間攪拌した。 反応溶液に酢酸ェ チルと水を加え、酢酸ェチルで 2回抽出した。有機層を合わせ、水で洗浄し、 無水硫酸マグネシウムで乾燥し、 濃縮した。 残渣に酢酸ェチルとへキサンの 混合溶媒 （ 3 ： 1 ) を加えて得られる懸濁液を 60°Cで 0. 5時間撹拌し、 室 温で 1 時間撹拌した。 析出した結晶を濾過して、 10, 11—ジヒ ドロー 5H—ジ ベンゾ [b, f]ァゼピン一 2—力ノレボン酸 (598 mg, 2.50 mmol, 収率 84%) を 得た。
APCI-MS: m/z 240 ( [M + H]+)
:H NMR (CDCI3) δ (ppm)： 3.11 (m, 4 H) , 6.39 (br s, 1 H) , 6.77-6.80 (m， 3 H)， 7.06-7.16 (m, 2 H) , 7.79-7.84 (m, 2 H) .
工程 5
工程 4で得られた 10, 11—ジヒ ドロー 5H—ジベンゾ [b， f]ァゼピン一 2〜力 ルボン酸 （426 mg, 1.78 mmol) をエタノール （8.9 mL) に溶解して、 塩化 チォニル （0.26 mL, 3.6 mmol) を加え、 加熱還流条件下 5 時間攪拌した。 反応溶液を濃縮し、 ク ロ口ホルムと飽和重曹水を加え、 クロ口ホルムで 3回 抽出した。 有機層を合わせ、 飽和食塩水で洗浄し、 無水硫酸マグネシウムで 乾燥し、 濃縮した。 残渣をシリ力ゲルク ロマ トグラフィー （溶出溶媒 ： 酢酸 ェチル /へキサン = 10/90) で精製して、 10， 11ージヒ ドロ _ 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン一 2—力ルボン酸ェチルエステノレ (383 mg, 1.43 mmol, 収率 81%) を得た。
APCI-MS: m/z 268 ( [M + H]+)
XH 匿 (CDC13) δ (ppm)： 1.37 (t, J = 7.0 Hz, 3 H) , 3.09 (m, 4 H) , 4.33 (q, J = 7.0 Hz, 2 H), 6.34 (br s, 1 H)， 6.69-6.86 (m, 3 H) , 7.04-7.14 (m, 2 H), 6.72-6.78 (m, 2 H) .
工程 6
工程 5で得られた 10， 11—ジヒ ドロ 一 5H—ジベンゾ [b， f]ァゼピン一 2—力 ノレボン酸ェチノレエステノレ (443 mg, 1.66 mmol) をク ロロホノレム （8.3 mL) および酢酸（8.3 mL) の混合溶媒に溶解し、 ピぺリジン（0.573 mL, 5.80 mmol) およびパラホルムァノレデヒ ド （149 mg， 4.97 mmol) を加え、 60°Cに力!]熱し、 1.5 日間撹拌した。 反応液を濃縮し、 残渣に酢酸ェチルと飽和重曹水を加え て、 酢酸ェチルで抽出した。 有機層を合わせ、 飽和食塩水で洗浄し、 無水硫 酸ナト リ ゥムで乾燥後、濃縮した。残渣をシリ力ゲルク ロマ トグラフィー（溶 出溶媒： 酢酸ェチル /へキサン/ト リェチルァミ ン = 70/25/5) で精製し、 目 的物を含む面分を濃縮した。残渣をジェチルエーテルでトリチユレーシヨ ン し、 8—ピペ リ ジノ メチノレ一 10， 11—ジヒ ドロ ー 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン —2—カルボン酸ェチルエステル (249 mg, 0.683 mmol, 収率 41%) を得た。 APCI-MS: m/z 365 ( [M + H]+)
JH NMR (CDC13) δ (ppm)： 1.34-1.46 (m, 5 H) , 1.67 (m, 4 H) , 2.36 (br s, 4 H), 3.08 (m, 4 H)， 3.38 (s, 2 II), 4.33 (q, J = 7.1 Hz, 2 H) , 6.32 (s, 1 H), 6.67-6.74 (m， 2 H) , 6.99-7.06 (m, 2 H) , 7.72-7.76 (m, 2 H) . 工程 7
工程 6で得られた 8—ピペリ ジノメチル一 10， 11—ジヒ ドロ -5H-ジベン ゾ [b,f]ァゼピン一2—力ルボン酸ェチルエステル (231 mg, 0.634 mmol) を ジクロロメタン （3.2 mL) に溶解して、 ヨ ウ化メチル （59.2 μ L, 0.951 mmol) を加え、 室温で終夜撹拌した。 反応溶液を減圧下濃縮して、 ヨウ化 1一（8— ェ トキシカルボ-ノレ一 10, 11—ジヒ ドロ _ 5H—ジベンゾ [b， f]ァゼピン一 2— イノレメチル）一 1ーメチノレビペリ ジニゥム (321mg , 0.634 mmol, 収率 100%) を得た。
:H NMR (CDCI3) δ (ppm)： 1.37 (t, J = 7.1 Hz, 3 H) , 1.75— 1.95 (m, 6 H) , 2.96 (br s, 4 H) , 3.11 (s， 3 H) , 3.50 (m, 2 H) , 3.70 (m, 2 H) , 4.32 (q, J = 7.1 Hz, 2 H)， 4.90 (s, 2 H) , 7.14-7.35 (m, 4 H) , 7.49 (s, 1 H) , 7.71 (m, 2 H).
工程 8
2—ェチルー 5， 7-ジメチルー 3H—ィ ミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン（180 mg, 1.03 mmol) をジメチルホルムアミ ド （0.60 mL) に溶解し、 攪拌しながら水素化 ナト リ ウム （55%, 33.6 mg, 0.770 mmol) を数回に分けて加えた後、 50C で 0. 5時間撹袢した。反応液を室温まで冷却し、ジメチルホルムァミ ド（1.2 mL)に溶解した工程 7で得られたョウイヒ 1_ (8—ェトキシカルボ二ルー 10, 11 ージヒ ドロ -- 5H-ジベンゾ [b, f]ァゼピン一 2—ィルメチノレ）一 1ーメチノレピ ペリジニゥム （130 mg， 0.256 mmol) を加え、 室温で 1時間攪拌した。 反応 溶液を酢酸ェチルで希釈し、 水、 水、 飽和食塩水で順次洗浄し、 無水硫酸マ グネシゥムで乾燥し、 濃縮した。 残渣をシリカゲルク口マ トグラフィー （溶 出溶媒： メタノール/ク ロ口ホルム =1/99) で精製し、 目的物を含む画分を濃 縮した。 残渣にジェチルエーテルを加え、 加熱還流条件で 0.5時間撹拌し、 その後室温で 1 時間で撹拌した。 析出した結晶を濾取して化合物 1 1 0
(76.7mg, 0.169 mmol, 収率 66%) を得た。
APCI-MS: m/z 455 ( [M + H]+)
XH NMR (CDC13) δ (ppm)： 1.31 (t, J = 7.6 Hz, 3 H) , 1.36 (t， J = 7.1 Hz, 3 H)， 2.60 (s, 3 H), 2.63 (s， 3 H) , 2.80 (q, J = 7.6 Hz, 2 H)， 2.97 (m, 2 H), 3.40 (m， 2 H) , 4.32 (q， J = 7.1 Hz, 2 H) , 5.36 (s, 2 H) , 6.35 (s, 1 H), 6.64-6.71 (m, 2 H) , 6.82-6.90 (m， 3 H) , 7.70-7.74 (m, 2 H) . 実施例 4 2 ：化合物 1 1 1 {8- (2—ェチルー 5, 7—ジメチルー 3H—ィミダゾ [4, 5-b]ピリジン一 3—ィルメチル）一 10， 11—ジヒ ドロ一 5H—ジベンゾ [b, f] ァゼピン— 2—力ルボン酸 } の合成
実施例 4 1で得られた化合物 1 1 0 (900 mg, 1.98 mmol) を用い、 実施 例 1 2 と同様にして、 収率 97%で化合物 1 1 1を得た。
APCI-MS: m/z 427 ( [M + H]+)
l NMR (DMS0 - d6) δ (ppm)： 1.24 (t, J = 7.5 Hz, 3 H) , 2.51-2.54 (s x 2, 6 H, DMSO と オーバ一ラ ップ）， 2.82-2.99 (m, 6 H) , 5.37 (s, 2 H)， 6.84-7.03 (m, 5 H)， 7.58 (m, 2 H)， 8.87 (br s， 1 H) , 12.25 (br s， 1 H) . 実施例 4 3 ： 化合物 1 1 2 { [8—（2—ェチルー 5， 7—ジメチルー 3H—ィミダ ゾ [4, 5-b] ピリ ジン一 3—ィルメ チル）一 10, 11—ジヒ ドロ ー 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン一 2—ィル] (4—メチルピペラジン一 1ーィノレ）メ タノ ン} の合 成
実施例 4 2で得られた化合物 1 1 1 (100 mg, 0.234 mmol) をジメチノレホ ルムアミ ド （2.3 mL) およびテ トラヒ ドロフラン （4.6 mL) の混合溶媒に溶 解し、 これに 4ーメチルビペラジン (39 μ L' 0.352 mmol)、 1ーェチルー 3 (3—ジメチルァミ ノプロ ピノレ） 力ノレボジィ ミ ド · 1塩酸塩 (89.7 mg, 0.468 mmol) および 1—ヒ ドロキシベンゾ ト リ アゾール (35.8 mg, 0.234 mmol) を加えて室温で 8時間攪拌した。反応の進行を薄層ク口マトグラフィ一で確 認した後、 反応液を濃縮した。 残渣をクロ口ホルムで溶解し、 得られた溶液 を水 （2 回）、 飽和重曹水、 飽和食塩水で順次洗浄し、 無水硫酸マグネシゥ ムで乾燥し、 濃縮した。 残渣にジェチルエーテルを加え、 得られる懸濁液を 室温で 1 時間撹拌した後、 固体を濾取して化合物 1 1 2 (47.7 mg, 0.0938 mmol, 収率 40%) を得た。
APCI-MS: m/z 509 ( [M + H]+)
XH NMR (CDC13) δ ( pm)： 1.31 (t， J = 7.5 Hz, 3 H) , 2.33 (s， 3 H) , 2.43 (br s, 4 H), 2.60 (s， 3 H)， 2.63 (s， 3 H)， 2.80 (q, J = 7.5 Hz, 2 H)， 2.99 (m, 4 H) , 3.66 (br s, 4 H)， 5.35 (s， 2 H) , 6.18 (s, 1 H) , 6.62-6.69 (m, 2 H) ' 6.83 (m， 2 H) , 6.85 (s, 1 H) , 7.10-7.15 (m, 2 H) . 実施例 4 4 ：化合物 1 1 3 { [8— (2—ェチルー 5, 7—ジメチルー 3H—ィミダ ゾ [4， 5-b]ピリ ジン一 3—イ ノレメ チノレ）一 10， 11—ジヒ ドロ 一 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン一 2—ィル] (ピロ リ ジン一 1—ィル）メタノ ン） の合成
4-メチルピペラジンの代わりにピ ΰ リ ジンを用い、 実施例 4 3 と同様に して、 収率 90%で化合物 1 1 3を得た。
APCI-MS: m/z 480 ( [M + H]+) XH NMR (CDCI3) δ (ppm)： 1.31 (t, J = 7.5 Hz, 3 H) , 1.88 (br s, 4 H) , 2.60 (s, 3 H), 2.63 (s, 3 H) , 2.80 (q, J = 7.5 Hz, 2 H) , 2.99 (m, 4 H) , 3.56 (m, 4 H) , 5.35 (s， 2 H) , 6.19 (s, 1 H) , 6.62-6.69 (m, 2 H) , 6.81-6.86 (m, 2 H), 6.89 (s, 1 H) , 7.24-7.29 (m, 2 H) . 実施例 4 5 ： 化合物 1 1 4 { [8—（2—ェチルー 5, 7—ジメチルー 3H—イミダ ゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメ チル）一 10， 11ージヒ ドロ一 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン一 2—ィル] (4一ヒ ドロキシピペリ ジノ）メタノ ン } の合成
4-メチルピペラジンの代わり に 4一ピぺリ ジノールを用い、 実施例 4 3 と同様にして、 収率 62%で化合物 1 1 4を得た。
APCI-MS: m/z 510 ( [M + H]+)
:H NMR (CDC13) δ (ppm)： 1.31 (t， J = 7.0 Hz, 3 H) , 1.48—1.58 (m, 2 H) , 1.86 - 1.97 (m, 2 H) , 2.60 (s, 3 H) , 2.63 (s, 2 H) , 2.80 (q, J = 7.0 Hz, 2 H) , 2.99 (m, 4 H) , 3.22-3.33 (m, 2 H)， 3.91-4.00 (m, 3 H) , 5.36 (s， 2 H), 6.21 (s， 1 H), 6.62-6.70 (m， 2 H)， 6.81-6.85 (m, 2 H) , 6.89 (s， 1 H) , 7.08-7.14 (m， 2 H) . 実施例 4 6 ：化合物 1 1 5 { 8—（2—ェチルー 5, 7—ジメチルー 3H—イミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン _ 3—ィルメチル）一 10, 11ージヒ ドロ— 5H—ジべンゾ [b, f] ァゼピン一 2—力ルボン酸（2—ヒ ドロキシェチル）アミ ド} の合成
4—メチルビペラジンの代わりにエタノールアミンを用い、 実施例 4 3 と 同様にして、 収率 82%で化合物 1 1 5を得た。
APCI-MS: m/z 470 ( [M + H]+)
-l NMR (CDCI3) δ (ppm)： 1.31 (t, J = 7.5 Hz, 3 H) , 1.71 (br s, 1 H) , 2.60 (s, 3 1.1)， 2.63 (s, 3 H)， 2.79 (q, J = 7.5 Hz, 2 H) , 2.97 (. m, 4 H) , 3.59 (m, 2 H), 3.81 (t, J = 9.6 Hz, 2 H) , 5.35 (s, 2 H) , 6.41 (s, 1 H)， 6.54 (t， J = 5.6 Hz, 1 H), 6.63-6.71 (m, 2 H) , 6.80-6.84 (m, 2 H) , 6.99 (s, 1 H), 7.44-7.48 (m, 2 H) . 実施例 4 7 ：化合物 1 1 6 {8- (2—ェチル— 5,7—ジメチルー 3H—ィミダゾ [4， 5-b]ピリ ジン _ 3—ィルメチル)一 10， 11ージヒ ドロ一 5H-ジべンゾ [b, f] ァゼピン一 2—力ルボン酸 [2— (ピロ リ ジン一 1—ィル) ェチル]アミ ド} の 合成
4-メチルピペラジンの代わり に 2— (ピ口 リ ジン一 1—ィル）ェチルアミン を用い、 実施例 4 3 と同様にして、 収率 92%で化合物 1 1 6を得た。
APCI-MS: ra/z 523 ( [M + H]+)
ι 應 (CDC13) δ (ppm)： 1.31 (t, J = 7.6 Hz, 3 H) , 1.78 (m， 4 H) , 1.57 (m, 4 H), 2.60 (s, 3 H) , 2.63 (s, 3 H) , 2.70 (t， J = 5.9 Hz, 2 H) ' 2.79 (q， J = 7.6 Hz, 2 H)， 2.97 (m, 2 H) , 3.04 (m, 2 H) , 3.53 (q， J = 5.7
Hz, 2 H) ' 5.35 (s, 2 H) , 6.30 (s, 1 H) , 6.63-6.72 (m, 3 H) , 6.83 (m,
2 H) , 6.89 (s, 1 H) , 7.45-7.52 (m， 2 H) . 実施例 4 8 ： 化合物 1 1 7 { [8— (2—ェチルー 5, 7—ジメチルー 3H—ィミダ ゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメ チル）一 10， 11—ジヒ ドロ ー 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン一 2—ィル] (モルホリ ノ）メタノ ン } の合成
4-メチルピペラジンの代わりにモルホリ ンを用い、 実施例 4 3 と同様に して、 収率 98%で化合物 1 1 7を得た。
APCI-MS： m/z 496 ( [M + H]+)
JH NMR (CDC13) δ (ppm)： 1.31 (t, J = 7.5 Hz, 3 H) , 2.60 (s, 3 II), 2.63 (s， 3 H), 2.80 (q J = 7.5 Hz, 2 H)， 2.99 (m, 4 H) , 3.66 (m， 8 H) , .5.35 (s, 2 H), 6.22 (s， 1 H), 6.62-6.71 (m, 2 H) , 6.81-6.86 (m, 2 H) , 6.89 (s, 1 H)， 7.10-7.16 (m, 2 H) . 実施例 4 9 ：化合物 1 1 8 {8—（2—ェチル—5, 7—ジメチルー 3H—ィミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル） - 10, 11ージヒ ドロ -5H-ジべンゾ [b, f] ァゼピン一 2—力ルボン酸ビス（2—ヒ ドロキシェチル）アミ ド} の合成
4-メチルピペラジンの代わり に 2—（2—ヒ ドロキシェチルァミノ）ェタノ ールを用い、 実施例 4 3 と同様にして、 収率 38%で化合物 1 1 8を得た。 APCI-MS： m/z 514 ( [M + H]+)
JH NMR (CDC13) 5 (ppm)： 1.21 (t, J = 7.5 Hz, 3 H) , 2.60 (s, 3 H) , 2.63 (s， 3 H), 2.80 (q, J = 7.5 Hz, 2 H) , 2.98 (m, 4 H) , 3.23 (br s, 2 H) , 3.63 (br s, 4 H) , 3.87 (br s, 4 H) , 5.35 (s, 2 H) , 6.20 (s, 1 H) , 6.62-6.69 (m, 2 H), 6.83 (m, 2 H)， 6.89 (s, 1 H) , 7.24-7.29 (m, 2 H) . 実施例 5 0 ：化合物 1 1 9 {8— (2—ェチルー 5, 7—ジメチル— 3H—ィミダゾ [4， 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル） _ 10, 11—ジヒ ドロー 5H—ジべンゾ [b, f] ァゼピン一 2—カルボン酸アミ ド} の合成
4一メチルピペラジンの代わりにアンモニアを用い、 実施例 4 3 と同様に して、 収率 57%で化合物 1 1 9を得た。
APCI-MS: m/z 426 ( [M + H]+)
3H NMR (CDC13) δ (ppm)： 1.23 (t, J = 7.4 Hz, 3 H) , 2.48-2.52 (s x 2, 6H, DMSOとォ一ノくーラップ)， 2.78 (q, J = 7.4 Hz, 2 11) , 2.92 (br q, J = 7.3 Hz, 4 H), 5.31 (s, 2 H) , 6.78-7.00 (tn, 6 H) , 7.52-7.65 (m, 3 H)， 8.68 (s, 1 H). 実施例 5 1 ：化合物 1 2 0 {2— (2—ェチル一5, 7—ジメチルー 3H—ィミダゾ [4, 5-b]ピリジン一 3—ィルメチル）一5—メチルー 8—（ピロ リジン _ 1ーィル メチル）— 10, 11—ジヒ ドロー 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン } の合成
実施例 3で得られた化合物 3 (400 mg, 0.876 mmol) を酢酸 （8· 8 mL) に 溶解し、 パラホルムアルデヒ ド （0.47 g, 16 mmol) およびシァノ水素ィ匕ホ ゥ素ナトリ ウム （2.2 g, 10 mmol) を加えて室温で 5時間撹拌した。 反応溶 液にクロ口ホルムと飽和重曹水を加え、水層をクロ口ホルムで 2回抽出した。 有機層を飽和食塩水で洗浄し、 無水硫酸マグネシウムで乾燥し、 濃縮した。 残渣を NH -シリ力ゲルクロマ トグラフィー (溶出溶媒 ： ク口 口ホルム/へキ サン = 50/50) で精製して、 化合物 1 2 0 (342 mg, 0.713 mmol, 収率 81%) を得た。
APCI-MS: m/z 480 ( [M + H]+)
XH NMR (CDCI3) δ (ppm)： 1.31 (t， J = 7.5 Hz, 3 H) , 1.76 (m, 4 H) , 2.47
(m, 4 H), 2.58 (s, 3 H) , 2.62 (s， 3 H) , 2.78 (q， J = 7.5 Hz, 2 H) , 3.06
(m, 4 H) , 3.29 (s, 3 H)， 3.50 (s， 2 H) , 5.35 (s， 2 H)， 6.83-6.98 (m, 5 H), 7.02-7.08 (m, 2 H) . 実施例 5 2 ：化合物 1 2 1 {1一 [8— (2—ェチルー 5， 7—ジメチルー 31トイミ ダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 5—メチルー 10， 11ージヒ ドロー 5H ージベンゾ [b, f]ァゼピン一 2—ィルメチル]ピぺリ ジン一 4一力ルボン酸）の 合成
工程 1
実施例 9で得られた化合物 1 6 (1.20 g， 2.18 mmol) を酢酸 （10 mL) に 溶解し、 パラホルムアルデヒ ド （0.73 g, 21.8 mmol) およびシァノ水素化 ホウ秦ナトリ ゥム （0.58 g, 8.70 mmol) を加えて室温で 1 5時間攪拌した。 反応溶液に酢酸ェチルと lmol/L水酸化ナトリ ウム水溶液を加え、 水層を酢 酸ェチルで抽出した。 有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、 溶媒を減圧 留去した。 残渣を NH—シリ力ゲルクロマ トグラフィー （溶出溶媒 ： へキサ ンー酢酸ェチル混合溶媒） で精製して、 1一 [8—（2—ェチルー 5，7—ジメチル —3H—ィ ミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチノレ）一 5—メチルー 10， 11—ジ ヒ ドロ一 5H—ジべンゾ [b， f]ァゼピン一 2—ィルメチル]ピペリ ジン一 4—力 ルボン酸ェチルエステノレ （1.25 g， 2.18 mmol, 収率 100%) を得た。
APCI-MS: m/z 566 ( [M + H]+)
:H NMR (CDC13) δ (ppm)： 1.23 (t, J = 7.4 Hz, 3 H) , 1.31 (t, J = 7.6 Hz, 3 H) , 1.6-2.0 (m, 6 H) , 2.23 (in, 1 H) , 2.58 (s, 3H) , 2.62 (s, 3 H) , 2.73 (q, J = 7.4 Hz, 2 11), 2.75 - 2.9 (m, 2 H) , 3.0-3.15 (m, 4 H) , 3.28 (s, 3 H), 3.36 (s, 2 H), 4.10 (q, J = 7.6 Hz, 2 H) , 5.34 (s， 2 H) , 6.8-7.1 (ra, 7 H).
工程 2
工程 1 で得られた 1一 [8— (2—ェチルー 5, 7—ジメ チル一 3H—ィ ミ ダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 5—メチルー 10， 11—ジヒ ドロ一 5H—ジ ベンゾ [b， f]ァゼピン— 2—ィルメチル]ピぺリ ジン一 4—カルボン酸ェチル エステルを用い、 実施例 1 2と同様にして、 収率 42%で化合物 1 2 1を得 た。
APCI-MS: m/z 538 ( [M + H]+) XH NMR (DMS0-d6) δ (ppm)： 1.23 (t, J = 7.4 Hz, 3 H) , 1.5-1.8 (m, 2 H)， 1.8-2.0 (m, 2 H), 2.2-2.4 (m, 2 H)， 2.49 (s， 3 H) , 2.50 (s, 3 H) , 2.78 (q, J = 7.4 Hz, 2 H) , 2.8-3.05 (m， 8 H) , 3.22 (s, 2 H)， 3.5-3.9 (m， 2 H)， 5.34 (s, 2 H) , 6.85 (dd， J = 2.0, 8.4 Hz, 1 H) , 6.93 (s, 1 H)， 6.94 (d, J = 2.0 Hz, 1 H) , 7.0-7.2 (m, 4 H) . 実施例 5 3 ：化合物 1 2 2 {2—（2—ェチル—5， 7—ジメチルー 3H—ィ ミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—イノレメチル）一 5—メチルー 8_ [4— (2H—テ トラゾ一 ルー 5—ィル）ピペリ ジノメチノレ]— 10, 11—ジヒ ドロー 5H-ジベンゾ [b， f]ァ ゼピン ·1塩酸塩 } の合成
実施例 2 0で得られた 1一 [8— (2—ェチル—5， 7-ジメチルー 3Η—ィ ミダ ゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—イ ノレメ チル）一 10， 11ージヒ ドロ ー 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン— 2—ィルメチル]—ピペリ ジン— 4一カルボ二 ト リルを用い、 実施例 5 2の工程 1 と同様にして、収率 92%で 1_ [8— (2—ェチル—5， 7—ジ メ チル _ 3H—イ ミダゾ [4， 5-b]ピリ ジン一 3—イノレメ チル）一 5—メチル一 10， 11—ジヒ ドロ一 5H—ジベンゾ [b， f]ァゼピン一 2—ィルメチル]ピペリ ジ ンー 4—カルボ二 ト リルを得た。 これを用い、 実施例 2 0の後段と同様にし て、 収率 10%で 2—（2—ェチノレ _ 5, 7—ジメチル一 3H—イ ミダゾ [4， 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 5—メチル一8— [4— (2H—テ トラゾールー 5—ィル） ピペリ ジノメチル]一 10， 11—ジヒ ドロ一 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピンを得た。 これをク口口ホルムに溶解し、 4tnol/L塩化水素 · 酢酸ェチル溶液を加えて 析出した固体を濾取することで、 化合物 1 2 2を得た。
APCI-MS: m/z 562 ( [M + H]+)
】H NMR (DMS0-d6) δ (ppm)： 1.28 (t, J = 7.6 Hz, 3 H) , 2.0-2.5 (m， 4 H)， 2.58 (s, 3 H) , 2.63 (s， 3 H) , 2.9-3.2 (m， 8 H) , 3.2-3.3 (m, 4 H) , 3.4-3.6 (m, 2 H), 4.17 (s， 2 H)， 5.56 (s, 2 H) , 7.0-7.2 (m, 4 H) , 7.2-7.4 (m， 3H)， 10.79 (s, 1H) . 実施例 5 4 ：化合物 1 2 3 { {1一 [8—（2—ェチル—5， 7—ジメチルー 3H—ィ ミダゾ [4, 5 - b]ピリ ジン一 3—イノレメチル） _5—メチノレー 10, 11—ジヒ ドロー 5H-ジベンゾ [b, f]ァゼピン 一 2—ィルメチル]ピぺリ ジン一 4一ィルメタノ 一ノレ }の合成
実施例 5 2の工程 1 で得られた 1— [8—（2—ェチル—5, 7—ジメチル〜 3H —イ ミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 5—メチルー 10, 11—ジヒ ド 口一 511-ジべンゾ [b, f]ァゼピン一 2—イノレメチル]ピぺ Vジン一 4一力ルポ' ン酸ェチルエステル （0.61 g, 1.08 mmol) をジクロロメ タン （10 mL) に溶 解して、 一 78°Cに冷却し攪拌した。 この反応溶液に同温度で 1 mol/L水素化 ジイ ソプロピルアルミ ニウム/トノレエン溶液 (3.20 mL, 3.20 mmol) を加え、 同温度で 3時間、 その後室温で 1 0分間攪拌した。 反応溶液に飽和ロッシェ ル塩水溶液と酢酸ェチルを加え、 3 0分間攪拌した。 水層を酢酸ェチルで抽 出後、 有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、 溶媒を減圧留去した。 残渣 を酢酸ェチルを用いて再結晶に付し、 化合物 1 2 3 (0.26 g, 0.50 mmol, 収率 46%) を得た。
APCI-MS: m/z 524 ( [M + H]+)
JH NMR (DMS0-d6) δ (ppm)： 1.0-1.15 (m, 2H) , 1.23 (t, J = 7.5 Hz, 3 H) , 1.25-1.3 (m, 1 H), 1.5-1.65 (m， 2 H) , 1.7-1.9 (m, 2 II) , 2.49 (s， 3 H)， 2.50 (s, 3 H) , 2.75 (q, J = 7.5 Hz, 2 H) , 2.95-3.05 (m, 4 H) , 3.15-3.25 (m, 5 1-1), 3.25-3.50 (m, 4 H) , 5.32 (s, 2 H)， 6.81 (dd, J = 2.0, 8.5 Hz, 1 H), 6.90-7.05 (m, 6 H) . 実施例 5 5 ： 化合物 1 2 4 [2— (2—ェチル—5， 7—ジメチルー 3H—ィミダゾ [4， 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）_5—メチルー 8— (211-テ トラゾールー 5 一ィル）一 10, 11—ジヒ ドロ _ 5 H—ジベンゾ [ b， f ]ァゼピン]の合成
実施例 3 4で得られた化合物 1 0 3を用い、実施例 5 2の工程 1 と同様に して、 収率 83%で 8—（2—ェチルー 5, 7—ジメチルー 3H—ィ ミ ダゾ [4, 5 - b] ピリ ジン一 3—ィルメチル）一5_メチル一10， 11ージヒ ドロ一5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン一 2—カルボ二 ト リルを得た。
これを用い、 実施例 2 0の後段と同様にして、 収率 20%で化合物 1 24 を得た。
APCI-MS: m/z 465 ( [M + H]+) :H NMR (DMS0-d6) 5 (ppm)： 1.24 (t， J = 7.7 Hz, 3 H) , 2.50 (s， 3 H) , 2.51 (s， 3 H) , 2.80 (q, J = 7.7 Hz, 2 H)， 3.0-3.1 (m, 2 H)， 3.3-3.35 (m, 2 H), 3.40 (s， 3 H) , 5.38 (s, 2 H)， 6.90 (dd, J = 2.2, 8.4 Hz, 1 H) ,
6.95 (s, 1 H), 7.02 (d, J = 2.2 Hz, 1 H) , 7.10 (d， J = 8.4 Hz, 1 H) ,
7.24 (d， J = 8.4 Hz, 2 H) , 7.75 (d， J = 2.2 Hz， 1 H) , 7.79 ( dd, J = 2.2,
8.4 Hz, 1 H) . 参考例 1 ： 化合物 9 1 {1,4—ビス [4一 (3-ク 口 口ベンジルァミ ノ）一 6—シ ク ロプロ ピルカルボ二ルー 7, 8—ジヒ ドロ一 5H—ピリ ド [4, 3— d]ピリ ミ ジン 一 2—ィル]ピペラジン } の合成
化合物 9 1は、 以下の工程 1〜工程 8に って合成した。
Figure imgf000110_0001
工程 1
市販の化合物 （A) ( 100 g, 0.335 mol) をエタ ノ ール'（ 1 , 500 mL) に溶解し、 尿素 （ 100 g， 1.67 mol) およびナ ト リ ウムメ トキシ ド （227 g, 1. 18 mol) を加え、 加熱還流条件下、 24 時間反応を行った。 薄層 ク ロマ ト グラ フィーで反応の進行を確認し、 冷却後、 析出 した結晶を 濾取した。 こ の結晶を水に懸濁させ、 その中へ塩酸 （6 mol/L) を加 え、 pH6.0 に調整した。 さ らに 1 時間室温で撹拌し、 析出した結晶を 濾取し、 減圧下で乾燥させ、 化合物 （ B) ( 60 g, 収率 70% ) を得た。 工程 2
工程 1 で得られた化合物 （B) (30.0 g, 0.116 mol) にォキシ塩化リ ン （300 mL) を加え、 加熱条件下で 5時間撹拌した。 薄層クロマ トグラフィーで反応 の進行を確認後、 減圧下で過剰のォキシ塩化リ ンを留去した。 その後、 残渣 に 2 _プロパノール （300 mL) を加え、 析出した結晶を含む懸濁液を加熱還 流条件下、 1時間撹拌し、 さらに室温で 1時間撹拌した。 析出した結晶を濾 取し、 減圧下で乾燥させ、 化合物 （C) (33 g, 収率 85%) を得た。
工程 3
工程 2で得られた化合物 (C) (35.0 g, 0.106 mol) を 1, 2—ジクロロェ タン (850 mL) に溶解し、 そこへ ト リェチルァミ ン (14.9 mL, 0.107 mol) およびクロ口蟻酸 1—クロ口ェチル （34. l mL, 0.316 mol) を加え、 加熱還 流条件下、 5時間撹拌した。薄層クロマ トグラフィ一で反応の進行を確認後、 反応混合物を冷却し、 水、 飽和食塩水で順次洗浄し、 無水硫酸マグネシウム で乾燥した。 得られた溶液を濃縮し、 残渣をカラムクロマ トグラフィー （シ リカゲル、 n—へキサン ： 酢酸ェチル =3 ： 1) で精製した。 生成物をメタノ ール （850 mL) に溶解し、 加熱還流条件下、 1時間撹拌した。 薄層クロマト グラフィ一で反応の進行を確認した後、 濃縮乾固させることにより、 化合物
(D) (23.5 g, 収率 95%) を得た。
工程 4
工程 3で得られた化合物 （D) (11. '8 g, 49.1 mmol) をジクロロメタン （300 mL) に溶解し、 シク ロプロパンカルボニルクロ リ ド （5.4 mL, 1.2当量） と トリェチルァミン （20.4 mL, 3.0 当量） を加え、 室温で 1 時間攪拌した。 得られた反応溶液を水、飽和重曹水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥した。 溶媒を留去した後、 残渣にジイソプロピルエーテルを加え、 懸濁液を 1時間 以上攪拌した。 その後、 析出した結晶を濾取し、 減圧下で乾燥させることに より、 化合物 （E) (12. 5g, 収率 94%) を得た。
工程 5
工程 4で得られた化合物 （E) (12. 5g, 45.9 mmol) をテトラヒ ドロフラン (400 mL) に溶解し、 トリェチルァミ ン （19.2 mL, 3当量） および 3—クロ 口ベンジルァミン （11· 2 mL, 2当量） を加えた後、 40°Cで 20時間攪拌した。 析出した塩を濾過により除去後、 溶媒を留去した。 残渣をクロマトグラフィ 一 （クロ口ホルム ： メタノール = 100： 1 → 40： 1) で精製し、 目的物を含 む画分の濃縮残渣にへキサンノ酢酸ェチル混合溶媒 （3: 1) を加え、 結晶を 析出させた。 結晶を含む懸濁液を 1時間攪拌後、 析出した結晶を濾取し、 減 圧下で乾燥させ、 化合物 （F) (11. 9g, 収率 69%) を得た。
工程 6
工程 5で得られた化合物 (F) (5.0g, 13. 3 mmol) をジォキサン (100 mL) に溶解し、 tert—ブチル 1ーピペラジンカルボキシレート （4.9g， 2 当 量） と炭酸ナトリ ウム （14.0g, 10 当量） を加え、 90°Cで 3 日間攪拌した。 得られた反応溶液を濾過し、 炭酸ナトリ ゥムを除去後、 濾液に水およびク口 口ホルムを加えて抽出を行い、 有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した。 溶媒 を留去した後、 残渣にへキサン/酢酸ェチル混合溶媒（3 : 1)を加え、 懸濁液 を 1時間攪拌した。 その後、 析出した結晶を濾取し、 減圧下で乾燥させ、 化 合物 （G) (6.4g, 収率 92%) を得た。
工程 7
工程 6で得られた化合物 （G) (6.3g, 12. 0 mmol) に 20%トリフルォロ酢 酸のジクロロメタン溶液 （50 mL) を加え、 室温で一時間攪拌した。 反応溶 液から溶媒を留去した後、 残渣にジィソプロピルエーテルを加え、 生成した 懸濁液を 1時間攪拌した。 その後、 析出した結晶を濾取し、 減圧下で乾燥さ せ、 化合物 （H) を得た （4.9 g， 収率 97%)。
工程 8
工程 7で得られた化合物 （H) (3.8 g, 8.90 mmol) と、 工程 5で得られた 化合物（F) (4.5g, 1.05当量） をジォキサン （100 mL) に溶解し、 炭酸ナト リ ウム （10.6g， 10当量） を加え、 90°Cで 1週間攪拌した。 得られた反応溶 液を濾過し、 炭酸ナトリ ゥムを除去後、 濾液に水を加えク口口ホルムで抽出 した。 有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、 溶媒を留去した後、 残渣をカラ ムクロマ トグラフィー（酢酸ェチル ： ト リエチルァミ ン = 10 : 1 ) で精製し た。 目的物を含む画分の濃縮残渣にへキサンノ酢酸ェチル混合溶媒（3:1)を 加え、 生成した懸濁液を 1 時間攪拌した。 その後、 析出した結晶を濾取し、 減圧下で乾燥させることにより、 化合物 9 1 を得た （l. Og, 収率 23%)。 APCI-MS: m/z 767 ( [M + H]+)
JH NMR (CDC13) 5 (ppm)： 0.7-0.9 (m, 4 H) , 1.0-1.1 (m, 4 H)， 1.7-1.9 (m, 2 H), 2.6-2.8 (m, 4 H)， 3.75 (s, 8 H) , 3.8-4.0 (m, 4 H) , 4.3-4.4 (m, 4 H), 4.6-4.7 (m, 4 H)， 4.8-4.9 (m, 2 H)， 7.1-7.3 (m, 8 H) . 参考例 l a N—メチル一 N—（2_ ト リ チル一 2H—テ トラゾールー 5_ィルメ チル）ァミ ンの合成
2 - ト リ チノレ ー 2H—テ ト ラ ゾールー 5—ィノレメ タ ノーノレ (2.00 g, 5.84 mmol)、 N—メチノレー 2_ニ トロベンゼンスノレホンアミ ド (1.64 g, 7.59 mmol) およびト リ フエ二ノレホスフィ ン (1.53 g, 5.84 mmol) をテ トラヒ ドロフラ ン （30 mL) およびトルエン （20 mL) の混合溶媒に溶解し、 ァゾジカルボン 酸ジェチルトルエン溶液 （40%, 2.65 mL, 5.84 mmol) を加えて室温で終夜 撹拌した。 シリカゲルカラムを通過 （溶出溶媒 ： 酢酸ェチル /へキサン = 40/60) させて原点成分を除去した後、 減圧下濃縮して得られる残渣にァセ トン （5 mL) とァセ トニ ト リル (25 mL) を加えた。
得られた懸濁液にメルカプト酢酸 （0.73 mL, 11 mmol) と 1,8—ジァザビ シクロ [5, 4, 0]ゥンデックー 7—ェン (3.1 mL, 21 mmol) を加えて 60°Cで 7 時間撹拌した。 反応液を濃縮し、 残渣を酢酸ェチルに溶解した。 得られた溶 液を飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシゥムで乾燥後、 濃縮した。 残渣をシリ力ゲルク口マトグラフィー （溶出溶媒： トリェチルァ ミ ン /酢酸ェチル = 1/99) で精製し、 N—メチルー N— (2- ト リチルー 2H—テ トラゾールー 5—ィル） メチルァミ ン （396 mg, 1.11 mmol, 収率 19.0%) を得た。 ·
XH NMR (CDCI3) δ (ppm)： 2.45 (s, 3H)， 4.07 (s, 2H) , 7.07-7.36 (m, 15 H) . 参考例 2 ：宿主 ' ベクター系の構築
( 1 ) Gal4-ER発現プラスミ ド pGERbsrR2 の造成
pSV2bsr (科研製薬社製）を PvuIIと EcoRIで切断後、 Klenow処理して 2.6kb の PvuII (平滑末端） 一^ RI (平滑末端） 断片を取得した。
Gal4 - ERキメラ遺伝子 [セル (Cell) , 54卷、 199頁 （ 1988年）、 プロシイ ーデングス ' ォブ · ザ ·ナショナル ' アカデミー ' ォブ ' サイエンス ' ォプ · ザ -ュナイテツ ド'ステーッ ·ォプ 'ァメ リカ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA)、 90卷、 1657頁 （1993年）] を含有する ER a AF2 in pM (東京大学の加藤茂明 先生より分与） を ill と M ^[で切断後、 Klenow処理して、 ill (平滑 末端） (平滑末端） 断片を取得した。
上記の pSV2bsr由来の ΖΣϋΙΙ (平滑末端） -EcoRI (平滑末端） 断片、 お よび ERctAF2 in pM由来の ^11 (平滑末端） -Ndel (平滑末端） 断片を結 合することにより、 プラスミ ド pGERbsrR2を造成した。 pGERbsrR2は、 酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 由来の転写因子 Gal4pの DNA結合領域とエス トロジェン受容体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質 （Gal4-ER) を発現す ることができる。
( 2 ) ホタル . ルシフェラーゼの誘導発現プラスミ ドの造成
pcDNA3(ィンビトロジェン社）を Xholで切断後、 Klenow処理して、 Xhol (平 滑末端） 断片を取得した。 該断片を結合するこ とによ り、■ ¾1切断部位を 消失させた pcDNA3を造成した。 ^ I切断部位を消失させた pcDNA3を で切断後、 Klenow処理して、 (平滑末端） 断片を取得した。 該断片を 結合することにより、 および 切断部位を消失させた pcDNA3を造 成した。 該プラスミ ドを &gillで切断後、 Klenow処理し、 ¾rill (平滑末端） 断片を取得した。
pAMoERC3Sc (特開平 05-336963)を Xhol と Nsilで切断後、 Klenow処理し、 oriP配列を含む 2.2kbの 1 (平滑末端） (平滑末端） 断片を取得 した。 上記の 切断部位と Emil切断部位を消失させた pcDNA3由来の Bglll (平滑末端） 断片、 および pAMoERC3Sc由来の 1 (平滑末端） _ (平 滑末端）断片を結合することにより、プラスミ ド pcDNA3— oriPを造成した。 pcDNA3- oriPを ^l^Iと Hindlllで切断し、 Xhol— Hindlll断片を取得した。 pSE01uc2 (W098/14474) を Xhol と Ncolで切断後、 Klenow処理して、 了 ンピシリ ン耐性遺伝子を含む 1 (平滑末端） -Ncol (平滑末端） 断片を取 得した。該断片を結合することにより、プラスミ ド pASdl - luclを造成した。 pASdl-luclを ^1 と Hindlll で切断後、 0. llkbの Xhol- Hindlll断片を取 得した。
上記 pcDNA3— oriP由来の Xhol -Hindlll断片、および pASdl- lucl由来の Xhol-Hindlll断片を結合し、 プラスミ ド pcDNA3 _ oriP— Sdl を造成した。 pcDNA3- oriP-Sdlを Xhol と Kpnlで切断し、 Xhol-Kpnl断片を取得した。 配列番号 1、 2、 3、および 4で表される塩基配列を有する 4種の DNAを DNA 合成機で合成した。該合成 DNAは混合してァニールすることによりポリ A付 加シグナルをもつ 2本鎖匪を形成する。 該合成醒をそれぞれ T4 polynucleotide kinaseを用いてリ ン酸ィ匕後、 混合してァニールさせること により、 二本鎖 DNAと した。
該ニ本鎖 DNAと pcDNA3_oriP_ Sdl由来の Xhol -Kpnl断片を結合するこ とにより、 プラスミ ド pcDNA3— oriP— Sdl— pAを造成した。 pcDNA3- oriP 一 Sdl— pAを ^ Iで切断後、 Klenow処理して、 Xhol (平滑末端） 断片を取 得した。
pFR_luc (ス 卜ラタジーン社製）を Hindlll と BamHIで切断後、 Klenow処理 し、 0. 14kbの iidlll (平滑末端） 一^ ϋΐΗΙ (平滑末端） 断片を取得した。 上記の pcDNA3— oriP— Sdl— pA由来の Xhol (平滑末端） 断片、 および pFR-luc由来の iUjidlll— g iHI断片を結合し、 プラスミ ド pAGalSdlを作製 した。 pAGalSdlは、 Gal4p応答配列 (UASG) を 5回繰り返した配列を有する プロモーターを含有している。 pAGalSdl を EcoRIで切断後、 Klenow処理し、 EcoRI (平滑末端） 断片を取得した。
PSE01uc2 (W098/14474) を Hindlll と Sacl で切断後、 Klenow処理するこ とにより、 ホタル 'ノレシフェラーゼ遺伝子を含む 1.7kbの iiiLdlll (平滑末 端） 一^ £l (平滑末端） 断片を取得した。
上記の pSE0luc2由来の Hindlll (平滑末端） 一^ I (平滑末端） 断片、 および pAGalSdl由来の ^ RI (平滑末端） 断片を結合することにより、 プ ラスミ ド pAGalSdl-lucを造成した。
pAGalSdl-luc内に存在する二つの Hindlllサイ トのうち、 ホタル 'ルシ フェラーゼ遺伝子からょり離れた Hindlllサイ トのみを Klenow処理により 消失させることにより、 pAGalSd4- lucを造成した。
pAGalSd4-lucを AsP718で切断後、 Stulで部分消ィ匕し pAGalSd4 - luc由来 の 9.5kbの Asp718-Stul断片を取得した。 該 DNA断片を Klenow処理し、 自 己結合させることによりプラスミ ド pAGal9 - lucを造成した。
( 3 ) 誘導発現べクター pAGal9- dおよび AGal9-ndの造成
ェプスタイン'バー'ウィルスの oriPを有する発現プラスミ ド pAGal9- luc を Hindlll と Saclで切断し、 oriPを含む 6· 9kbの Hindlll-Sacl断片を取 得した。
pAMo-d (特開 2001-211885) を Hindlll と Saclで切断し、 テトラサイク リ ン耐性遺伝子 （TcR) を含む Hindlll— Sacl断片を取得した。
上記の pAGal9 - luc由来の Hindlll— Sacl断片、 および pAMo-d由来の Hindlll— Sacl断片を結合することによ り、 pAGal9- luc中のホタル 'ルシフ ェラーゼ遺伝子部分を pAMo_dの Stuffer配列と置き換えたプラスミ ド pAGal9-dを造成した。 PAGal9-lucを Hindlll と Saclで切断し 6.9kbの Hindlll— Sacl断片を取得した。
pAMo—nd (特開 2001- 211885) を Hindlll と Saclで切断し、 テトラサイク リン耐性遺伝子を含む iiidlll— ^ I断片を取得した。
上記の AGal9-luc由来の Hindlll— Sacl断片、 およぴ pAMo-nd由来の
Hindlll— Sacl断片を結合することにより、 pAGal9- luc中のホタル'ルシフ ェラーゼ遺伝子部分を pAMo- ndの Stuffer配列と置き換えたプラスミ ド pAGal9-ndを造成した。
( 4 )Gal4 - ER発現プラスミ ド PGERbsrR を Namalwa KJM - 1細胞の染色体 DNA に組み込んだ細胞株 K JMGER8 の造成
Gal4-ERキメラ転写因子発現プラスミ ド pGERbsrR2を、 1/z g//i 1になるよ う に TE緩衝液 〔10 mmol/L Tris—HCl (pH8. 0)、 1 mmol/L エチレンジァミン 4酢酸〕 に溶解した後、 エレク ト口ポレーショ ン法 [サイ トテクノロジー
(Cytotechnology)、3卷、 133頁（1990年）]により、該プラスミ ドを Namalwa KJM- 1細胞 [サイ トテクノロジー （Cytotechnology)、 1巻、 151頁（ 1988年）] に、 6X 106細胞あたり 4 μ g導入し、 形質転換細胞を得た。 Namalwa KJM - 1 細胞は、 EBNA- 1遺伝子を発現する無血清馴化した B細胞株である。
該形質転換細胞を、 8mlの RPMI1640'ITPSG培地 〔RPMI1640培地 （日水製 薬社製） に、 1/40量の 7. 5% NaHC03、 3 % 200mmol/L L-グルタミン溶液（ィ ンビ ト ロジェン社製）、 0. 5% ぺニシリ ン · ス ト レプトマイシン溶液（イ ンビ 卜 αジェンネ土製、 5, 000units/ml ぺニシジ ン、 5, 000 μ g/ml ス 卜 レプ卜マイ シン）、 10mmol/L N-2-ヒ ドロキシェチルピペラジン- N'_2 -エタンスルホン酸
(Ν-2-hydroxyethyl iperazine-N' -2- ethane sulfonic acid; HEPES)、 3 μ g/ml イ ンシュ リ ン、 5 μ g/ml ト ランスフェ リ ン、 5 mmol/L ピノレビン酸 ナト リ ウム、 125 nmol/L 亜セレン酸ナト リ ウム、 1 mg/ml ガラク トースを 添加した培地〕 に懸濁し、 C02インキュベータ一中で 37°Cで 24時間培養し た。
培養後、 プラス トサイジン S (Blasticidin S) (KK-400 : 科研製薬社製） を 2.0/i g/mlになるように添加し、 9 6穴プレートに分注 （500〜2000細胞 /穴） して培養を行い、 PGERbsrR2が染色体 DNAに組み込まれた安定形質転 換株 （シングルクローン） を多数取得した。 各形質転換株は、 2.0 g/ml の プラス トサイジン Sを含む RPMI1640.ITPSG培地で継代した。
下記に示す方法により上記安定形質転換株から、 誘導倍率が高く、 かつ非 誘導時のバックグラウンドが低い優れた安定形質転換株 KJMGER8細胞を選 択した。
各形質転換株にホタル ·ルシフエラーゼの誘導発現プラスミ ド
pAGalSdl-lucをエレク ト口ポレーション法により導入し、 2 日間培養した。 培養後、 17 β —エス トラジオール（Ε8875：シグマ社製） （終濃度 lOnmol/L) を添加し、 さらに 24時間培養後、 ホタル ·ルシフ： ラーゼ活性の測定を行 つた。 活性の測定には、 ルミノメ一ター LB953 (ベルトールド社製） を用い、 細胞溶解用緩衝液〔 1 %卜リ 卜ン X_100、 100 mmol/L KH2P04 (pH7.8)、 1 mmol/L ジチオスレィ トール〕 100 1 を、 上記培養液に自動注入後、 基質溶液 〔25 mmol/L グリ シルグリ シン （pH7.8)、 15 mmol/L MgS04、 5 mmol/L ATP、 0.33 mmol/L ルシフエ リ ン〕 300 1 を自動注入し、 10秒間の発光量を測定し、 ル シフエラーゼ活性と した。 比較のために、 17 ]3 —エス トラジオール無添加条 件下でのルシフエラーゼ活性も測定した。
17/3 —ェス トラジオール添加条件下でのルシフェラーゼ活性と 17 /3 —ェ ス トラジオール無添加条件下でのルシフェラーゼ活性を比較することによ り、 遺伝子発現の誘導倍率を算出し、 該誘導倍率が高く、 かつ 17 |3 —エス トラジオール無添加条件下のルシフェラーゼ活性が低いクローンと して、 KJMGER8細胞を選択した。 参考例 3 ： ホタル .ルシフェラーゼをレポーターとする レポータープラス ミ ド pACREpluc の造成
cAMP応答配列 （CRE) の制御下にホタル . ルシフェラーゼ遺伝子を発現す ることのできる レポータープラス ミ ドである pACREpluc を以下の方法で造 成した。 pACREplucは、 ハイグロマイシン耐性遺伝子おょぴェプスタイン - パー . ゥイノレスの oriP を有している。
pAMo[ジャーナノレ'ォブ'バイォロジカノレ.ケミス ト リー（J. Biol. Chem. )、 268卷、 22782 M (1993年）、 另 IJ名 pAMoPRC3Sc (特開平 5-336963) ] を Clal で部分消化し、 一力所切断された DNA断片を取得した。 該 DNA断片を Mlul で部分消化し、 9.5kbの Clal - Mlul断片を取得した。 pAGE248 [ジャーナル · ォブ · ノ ィォ口ジカル · ケミス ト リー (J. Biol. Chem. )、 269卷、 14730頁 (1994年）] を £1^1および MiiLlで切断し、 ハイグロマイ シン耐性遺伝子を 含む 1.5kbの Clal- Mlul断片を取得した。 pAMo由来の Clal-Mlul断片、 お よび pAGE248由来の Clal-Mlul断片を結合し、プラスミ ド pAMohを造成した。 pAMoh を hol と Hindlllで切断後、 ハイグロマイシン耐性遺伝子を含む Xhol- Hindi II断片を取得した。 pAGal9— luc を ^il と Hindlllで切断し、 oriP、 Gal4UAS を含む Sail— Hindlll断片を取得した。 pAGal9— luc 由来の Sail— Hindlll断片、 およぴ上記 pAMoh由来の Xhol _ Hindlll断片を結合す ることによ り 、 プラスミ ド pAGal9hを造成した。 pBluescriptll KS+ (東洋紡績社製） を Sailおよび Xholで切断した後、 ホスファターゼ （Alkaline Phosphatase E. coli C75、 宝酒造社製） を用い て脱リン酸化処理し、 アンピシリ ン耐性遺伝子を含む Sall-Xhol 断片を取 得した。配列番号 5および 6で表される塩基配列を有する合成オリゴヌク レ ォチドをァニールさせることにより、 CRE配列を 2つ含む二本鎖 DNAを調製 した。 該ニ本鎖 DNAと Bluescriptll KS +由来の上記 Sal! [- Xhol 断片を結合 し、 CRE配列を 2つ含むプラスミ ド pBS— CREIを造成した。 pBS— CREIは、 該ニ本鎖 DNAが、 Sail切断部位および I切断部位が再生する方向に組み 込まれたプラスミ ドであり、 上記切断部位をそれぞれ 1つ有している。
pBS-CREIを Sealおよび 1で切断しファージ Πの ori を含む
Seaト Xhol断片を取得した。 pBS— CREIを Sealおよび Sailで切断し ColEl ori を含む Seal - Sail断片を取得した。 pBS_CREI由来の Seaト Xhol断片および Scal-Sall断片を結合し、 CRE配列を 4つ含む pBS— CREIIを造成した。
pBS-CREIIを Sealおよび Xholで切断しファージ fl の ori を含む
Seal -Xhol断片を取得した。 pBS— CREII を Sealおよび Sailで切断し ColEl oriを含む Scal-Sall断片を取得した。 pBS— CREII由来の Seaト Xhol断片お よび Seal - Sail断片を結合し、 CRE配列を 8つ含む pBS— CREIVを造成した。 pBS一 CREIVを Sealおよび Xholで切断しファージ f 1 の ori を含む
Scal-Xhol断片を取得した。 pBS— CREIVを Sealおよび Sailで切断し ColEl oriを含む Scal-Sall断片を取得した。 pBS— CREIV由来の Seaト Xhol断片お よび Scal-Sall断片を結合し、 CRE配列を 16含む pBS— CREVIIIを造成した。 pBS-CREVIIIを Xholで切断後、 Klenow処理し、 さらに Hindlllで切断す ることにより、 16個の CREを含む ndlll— 1 (平滑末端） 断片を取得し た。 pAGalSdlを Mlul と Hindlllで切断し、 1. kbの Mlul - Hindlll断片を 取得した。 pAGal9hを ^1で切断後、 Klenow処理し、 更に ϋ_Ιで切断する ことにより 1 (平滑末端） — iiiJ断片を取得した。 pBS— CREVIII由来の Hindlll— Xhol (平滑末端） 断片、 pAGalSdl 由夹の MluI_HindIII断片、 お よび pAGal9h由夹の Xbal (平滑末端)一 Mlul断片を結合し、プラスミ ド pACREh を造成した。
pAGal9- lucを hol と Notlで切断し、 ホタル .ルシフェラーゼ遺伝子を 含む Xhol— Notl断片を取得した。 ACREhを Xhol と Notlで切断し、 CRE配 列を含む 1一 Notl断片を取得した。 PAGal9- luc由来の 1一 Notl断片、 および pACREh由来の Xhol - Notl断片を結合することによりプラスミ ド pACRElucを造成した。
pACRElucを Hindlllで切断後、 Klenow処理し、 さらに Xholで切断するこ とにより CREを含む Hindlll (平滑末端） -Xhol断片、 およびホタル .ルシ フェラーゼ遺伝子を含む ^dlll (平滑末端） 一^ I断片をそれぞれ取得し た。 pACREluc由来の上記 2種の Hindlll (平滑末端） 一 Xhol断片を結合す ることにより、 pACREluc中の CRE配列上流の Hindlllサイ トが消失したプ ラスミ ド pACRElucHを造成した。
pG - Enhancer vector 〔プロメガ（Promega)社製〕 を Hindlll と Hpalで 切断し、 luc+遺伝子 （改変型のホタル .ルシフェラーゼ遺伝子） を含む Hindlll- Hpal断片を取得した。 pACRElucHを Notlで切断後、 Klenow処理し、 更に ndlllで切断することにより、 CREを含む Hindlll- Notl (平滑末端） 断片を取得した。 GL3-Enhancer vector由来の Hindlll-Hpal断片、 および pACRElucH由来の Hindlll-Notl (平滑末端） 断片を結合することによりプラ スミ ド pACREplucを造成した。 参考例 4 ： GPR4誘導発現プラスミ ドの造成
ヒ ト肺由来の mRNA (クロンテック社製） を 用い、 SUPERSCRIPT
First-Strand Synthesis System for RT-PCR (ギプコネ土製） により一本鎖 cDNAを合成した。 該一本鎖 cDNAを水で 250倍希釈した溶液 5 μ 1を铸型と して、 配列番号 7および 8に示した配列を有する合成 DNAを GPR4遺伝子特 異的プライマーと して用い、 PCRにより GPR4 cDNAを取得した。 GPR4遺伝子 特異的プライマーの配列は、 GPR4遺伝子の配列情報 （GenBank受入番号：
U21051) ίこ基!/ヽて設計した。 酵素と して ίま、 PfuTurbo DNA Polymerase
(Stratagene社製） を用いた。 PCRを行う際の緩衝液と しては、 使用する酵 素に付加された 10倍濃度の緩衝液を使用した。 PCRは、 サーマルサイクラ
-DNA engine (MJ Research社製） を用い、 95°Cで 5分間の処理後、 94°Cで
1分間、 60°Cで 1分間、 72°Cで 1分間からなる反応を 30サイクル行うこと により実施した。
増幅された GPR4 cDNA断片をプライマー上に設計された配列を切断する Hindi IIおよび ^ Iで切断した。 GPR4 cDNAを含む断片をァガロースゲル 電気泳動法により回収した。
該切断断片を、 プラスミ ド PAGal9-nd の Hindlll— Not I間へ組み込むこ とにより、 GPR4誘導発現プラスミ ド pAGal9- GPR4を構築した。
PAGal9-nd中の配列に特異的なプライマー （配列番号 9および 10に示し た配列を有する合成 DNA) を用いて、 該 cDNAの 5'側おょぴ 3，側の配列を決 定した。 決定された配列に特異的な合成 DNAを調製し、 それをプライマーと して用い、 さらに先の塩基配列を決定した。 該操作を繰り返すことによ り、 該 cDNAの全塩基配列を決定し GPR4をコードしていることを確認した。塩基 配列の決定には、 パーキン ·エルマ一社の DNAシークェンサ一 377 と反応キ ッ (ABI PrismTM BigDyeiM Terminator Cycle Sequencing Ready React ion kit:アプライ ド ·バイオシステムズ社） を使用した。
プラスミ ドに組み込んだ DNA断片の配列を決定し、 GPR4をコードしてい φこ とを確認した。 参考例 5 ： GPR4のアツセィ細胞の構築
GPR4誘導発現プラスミ ド pAGal9_GPR4 ( 2 μ g ) およびレポータープラス ミ ド pACREpluc ( 2 μ g ) を、 上記ェレク トロポレーション法により、 6X 106細胞の KJMGER8に共導入した。該形質転換株を 8mlの RPMI1640 · ITPSG培 地に懸濁し、 C02インキュベータ一中、 37°Cで 24時間培養した。 培養後、 プ ラス トサイジン S (2.0 μ g/ml) ハイグロマイシン B (300 μ g/ml) および ジエネティシン （500 g/ml) を添加し、 さらに 14 日間培養して安定形質転 換株 （GPR4アツセィ細胞と呼ぶ） を取得した。 該形質転換株を、 プラス ト サイジン S (2.0μ g/ml) , ハイグロマイシン Β (300〃 g/ml) およびジエネ ティシン （ 500 μ g/ml) を含む RPMI 1640 · ITPSG培地で継代した。
同様にして、 コントロールプラスミ ド pAGal9- nd ( 2 μ g ) およびレポ一 タープラスミ ド pACREpluc ( 2 μ g ) を KJMGER8に共導入し、 安定形質転換 株 （コントロール細胞と呼ぶ） を取得した。 参考例 6 ： マウス由来のヒ ト GPR4 ホモログをコードする DNAのク ローニン グ
ヒ ト GPR4遺伝子の塩基配列情報 [Ac c ess i on (AC) No. U21051 ]を基に、 NCBI のデータベースを対象と して検索を行った。 その結果、 相同性の高い配列と して、 マウスゲノム配歹 IJ (AC073784)および複数の Expre s s i on s equenc e tag (EST)配列（BF178464、 AA968193、 AA798732 , AI840893、 AI851037)力 S選択 された。該マウスゲノム配列と ESTから構築された遺伝子の塩基配列を配列 番号 14 に、 該遺伝子により コードされるポリペプチドのアミノ酸配列を配 列番号 13に示した。 該アミノ酸配列を、 解析プログラム [GENETYX WIN ver. 5. 0 (ソフ トウェア社製） ]を用いてヒ ト GPR4のアミノ酸配列と比較したと ころ、 92. 7 %の一致が認められた。
よって、 配列番号 13で表されるァミノ酸配列を有するポリぺプチドは、 マウスのヒ ト GPR4ホモログ （マウス GPR4) であることが推定された。
従って、 マウス GPR4をコードする DNAは、 巿販、 または公知の方法で調 製することができるマウス cDNAライブラリーを錶型にし、配列番号 14で表 される塩基配列に基づき設計、合成できるオリ ゴヌクレオチドをプライマー セッ トに用いた PCRにより取得することができる。 参考例 7 ： ラッ ト由来のヒ ト GPR4 ホモログをコードする DNAのクローニン グ
ヒ ト GPR4遺伝子の塩基配列情報（AC No. U21051 )を基に、 NCBIのデータべ ースを対象と して検索を行った。 その結果、 相同性の高い配列として 2つの ラッ トゲノム配列（AC1 19447. 2 および AC096180. 2)およぴ複数のラッ ト EST 配列（BF544182、 AI 170948、 AI008858 , AI235374, AI 502871、 BQ194515)カ 選 択された。 これらの配列と、 配列番号 14で示したマウスの塩基配列情報を 基に配列番号 15および配列番号 16に記載の塩基配列を有するォリ ゴヌクレ ォチドを作製した。
該オリ ゴヌクレオチド各々 1 . 0 μ mol /L をプライマーセッ トと して用い、 ラッ ト肺由来 mRNAから作製した cDNA 2 μ Lを錄型に用い、 後記の各成分の 濃度が 200 u mol/L となるよう dNTP (dATP, dGTP、 dCTP、 dTTP)、 Taq Gold (パーキンエルマ一社製） 2.5単位おょぴ I X Taq Gold (Mg plus) 緩衝液 (パーキンエルマ一社）を含む反応溶液 40/i Lを調製し、下記条件下で PCRを 行った。
すなわち、 サーマルサイクラ一 PTC-200 (MJ リサーチ社製） を用い、 95°C で 10分間加熱後、 94°Cで 1分間、 55°Cで 1分間、 72°Cで 1分間の工程を 1 サイクルと して 30サイクル行い、 さらに 72°Cで 5分間加熱した。
得られた PCR反応液より 5/ L を分取し、 ァガロースゲル電気泳動により GPR4 をコードする DNA と予想される約 1. Ikb の DNA断片が増幅されたこと を確認後、 QIAEX II Gel Extraction Kit (QIAGEN社製） を用いて、 該製品 に添付されたマニュアルに従い、 DNA断片を溶出し回収した。
上記で回収した腿断片 50ng と pT7Blue T - Vector (Novageti社製） 50ng とを DNA Ligation kit ver.2 (宝酒造社製） を用いて該製品に添付された マニュアルに従って連結し、 組換えプラスミ ド DNAを得た。 得られた組換え プラスミ ド DNAを用いて大腸菌 JM109株を形質転換して得られる形質転換株 から、 常法によりプラスミ ド pT7RGを得た。 プラスミ ド PT7RGの全塩基配列 を決定した結果、 PT7RG には配列番号 18 で表される塩基配列を有する約 1. Ikbの cDNAが含まれていた。配列番号 18で表される塩基配列からなる DNA にコードされるポリべプチドのアミノ酸配列を配列番号 17 に示した。 該ァ ミノ酸配列を、解析プログラム [GENETYX WIN ver. 5· 0 (ソフ トゥエア社製） ] を用いてヒ ト、 およびマウス GPR4のァミノ酸配列と比較したところ、 それ ぞれ 93.0%、 99.2%の一致が認められた。
よって、 配列番号 17で表されるァミノ酸を有するポリぺプチドは、 ラッ トのヒ ト GPR4ホモログ （ラッ ト GPR4) であることが明らかとなった。 製剤例 1 ： 錠剤
常法により、 次の組成からなる錠剤を調製する。 処方 化合物 1 20 mg
乳糖 143. 4 mg
デンプン 30 mg
ヒ ドロキシプロ ピノレセノレロース 6 mg
ステアリ ン酸マグネシウム 0. 6 mg
200 mg 製剤例 2： 注射剤
常法により、 次の組成からなる注射剤を調製する, 処方 化合物 5 2 mg
精製ダイズ油 200 mg
精製卵黄レシチン 24 mg
注射用グリセリ ン 50 mg
注射用蒸留水 1. 72 ml
2. 00 ml
産業上の利用可能性
本発明により、 GPR4 のシグナル伝達に関する機能を抑制する物質を有効 成分と して含有する搔痒の予防および/または治療剤、搔痒の予防および Z または治療作用を有する含窒素 Ξ環式化合物も しくはその四級アンモニゥ ム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩、 GPR4 のシグナル伝達に関す る機能の抑制作用を有する含窒素三環式化合物も しく はその四級アンモニ ゥム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩、含窒素三環式化合物もしく はその四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩を有効 成分と して含有する搔痒の予防および/または治療剤、含窒素三環式化合物 もしく はその四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩 を有効成分と して含有する GPR4のシグナル伝達に関する機能の抑制剤、 な らぴに SPC 誘発搔破行動の回数の減少を指標にした搔痒治療剤のスク リ一 ニング法が提供される。 配列表フリーテキス ト
配列番号 1—人工配列の説明 ： 合成 DNA
配列番号 2—人工配列の説明 ： 合成 DNA
配列番号 3—人工配列の説明 ： 合成 DNA
配列番号 4—人工配列の説明 ： 合成 DNA
配列番号 5—人工配列の説明 ： 合成 DNA
配列番号 6—人工配列の説明 ： 合成 DNA
配列番号 7—人工配列の説明 ： 合成 MA
配列番号 8—人工配列の説明 ： 合成 DNA
配列番号 9一人工配列の説明 ： 合成 DNA
'配列番号 1 0—人工配列の説明 ：合成 DNA
配列番 1 5—人工配列の説明 ：合成 DNA
配列番号 1 6—人工配列の説明 ：合成 DNA
配列番号 1 9—人工配列の説明 ：合成 DNA
配列番号 2 0—人工配列の説明 ：合成 DNA

Claims

請求の範囲
1 . 配列番号 1 1記載のアミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関 する機能を抑制する物質を有効成分と して含有する搔痒の予防および ま たは治療剤。
2 · 以下の 1 ) 〜 4 )
1 )配列番号 1 2記載の塩基配列から選ばれる連続した 5〜 6 0塩基からな るオリゴヌクレオチドの相捕的配列を有するォリ ゴヌクレオチドまたは該 オリ ゴヌク レオチ ド誘導体、
2 )配列番号 1 4記載の塩基配列から選ばれる連続した 5〜 6 0塩基からな るオリ ゴヌクレオチドの相捕的配列を有する'ォリ ゴヌクレオチドまたは該 オリ ゴヌク レオチ ド誘導体、
3 )配列番号 1 8記載の塩基配列から選ばれる連続した 5〜 6 0塩基からな るオリゴヌク レオチドの相捕的配列を有するオリ ゴヌクレオチドまたは該 才リ ゴヌク レオチ ド誘導体、
4 ) 配列番号 1 2、 1 4および 1 8から選ばれるいずれか一つに記載の塩基 配列を有する DNAとス トリ ンジヱントな条件下でハイブリダイズし、かつ配 列番号 1 1記載のァミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関する機 能を抑制する 5〜 6 0塩基からなるオリ ゴヌクレオチドまたは該ォリ ゴヌ クレオチド誘導体、
のいずれか一つを有効成分と して含有する搔痒の予防および/または治療 剤。
3 . 以下の 1 ) 〜 4 )
1 ) 配列番号 1 1記載のアミノ酸配列を有する蛋白質を認識する抗体、
2 ) 配列番号 1 3記載のアミノ酸配列を有する蛋白質を認識する抗体、
3 ) 配列番号 1 7記載のァミノ酸配列を有する蛋白質を認識する抗体、
4 ) 配列番号 1 1、 1 3および 1 7から選ばれるいずれか一つに記載のァミ ノ酸配列において一つ以上のァミノ酸が欠失、置換または付加したァミノ酸 配列を有し、かつ配列番号 1 1記載のァミノ酸配列を有する蛋白質のシグナ ル伝達に関する機能を有する蛋白質を認識する抗体、
のいずれか一つを有効成分と して含有する搔痒の予防およびノまたは治療 剤。
4 式 （I )
Figure imgf000127_0001
[式中、 R1は置換もしくは非置換の複素環基、 - NR5R6 (式中、 R5および R6は 同一または異なって水素、 置換もしく は非置換の低級アルキル、 置換もしく は非置換のシク口アルキル、 置換もしくは非置換の低級アルケエル、 置換も しくは非置換の低級アルキニル、 置換もしくは非置換のァラルキル、 または 置換もしくは非置換の複素環アルキルを表すか、 R5および R6が隣接する窒 素原子と一緒になつて置換もしくは非置換の複素環基を形成する）、- OR7 (式 中、 R7 は水素、 置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換の 低級アル力ノィル、 置換もしくは非置換のシク口アルキル、 置換もしくは非 置換の低級アルケニル、 置換もしくは非置換の低級アルキニル、 置換もしく は非置換のァリ一ル、 置換もしくは非置換のァラルキル、 または置換もしく は非置換の複素環アルキルを表す）、 -SR7a (式中、 R7aは前記 R7と同義である）、 -C0NR5aR6a (式中、 aおよび R6aはそれぞれ前記 R5および前記 R6と同義であ る）、 -C02R7b (式中、 K7bは前記 R7と同義である）、 -N+R5bR6bR8 (式中、 R5bお よび bはそれぞれ前記 R5および前記 と同義であり、 は低級アルキル、 低級アルケニル、 またはァラルキルを表す）、 ホルミル、 カルボキシ、 また はシァノを表し、
R2は水素、 ft換もしく は非 S換の低級アルキル、 置換もしく は非置換のシク 口アルキル、 置換も しくは非置換の低級アルケエル、 置換もしくは非置換の 低級アルキニル、 置換もしくは非置換のァラルキル、 または置換もしくは非 置換の複素環アルキルを表し、
R3および R4は同一または異なって水素、 低級アルキル、 またはハロゲンを 表し、
nは 0または 1 を表し、
Xは-（CH2) 2-または - CH-CH-を表し、
Yは式 ( I I ) で
•N Λ W (II)
('式中、 Wは CHまたは窒素原子を表し、
Z1および Z2は同一または異なって水素、 置換もしくは非置換の低級アルキ ル、 置換もしく は非置換のシク口アルキル、 置換もしく は非置換の低級アル ケニル、 置換もしくは非置換の低級アルキニル、 置換も しくは非置換のァリ ール、 置換もしくは非置換のァラルキル、 または置換もしくは非置換の複素 環アルキルを表すか、 Z1および Z2がそれぞれ隣接する 2つの炭素原子と一 緒になって置換もしくは非置換の芳香環または置換も しく は非置換の複素 環を形成し、
Z3は水素、 置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしく は非置換のシク 口アルキル、 置換もしくは非置換の低級アルケニル、 置換もしくは非置換の 低級アルキニル、 置換もしくは非置換のァリール、 置換もしくは非置換の複 素環基、 置換もしくは非置換のァラルキル、 または置換もしくは非置換の複 素環アルキルを表す） を表す] で表される含窒素三環式化合物もしくはその 四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩。
5 . R1が- NR5R6であり、 および R6が隣接する窒素原子と一緒になつて置 換もしくは非置換の複素環基を形成する請求の範囲第 （ 4 ) 項に記載の含窒 素三環式化合物もしく はその四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学的 に許容される塩。
6. R2が水素である請求の範囲第 （4 ) 項または第 （ 5 ) 項に記載の含窒 素三環式化合物もしく はその四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学的 に許容される塩。
7. R3および R4が水素である請求の範囲第 （4 ) 項〜第 （ 6 ) 項のいず れかに記載の含窒素三環式化合物も しく はその四級アンモニゥム塩または それらの薬理学的に許容される塩。
8. Z1および Z2がそれぞれ隣接する 2つの炭素原子と一緒になつて置換 もしくは非置換の複素環を形成する請求の範囲第 （ 4 ) 項〜第 （ 7 ) 項のい ずれかに記載の含窒素三環式化合物もしく はその四級アンモニゥム塩また はそれらの薬理学的に許容される塩。
9. 請求の範囲第 （4 ) 項〜第 （ 8 ) 項のいずれかに記載の含窒素三環式 化合物もしく はその四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学的に許容さ れる塩を有効成分と して含有する医薬。
1 0. 請求の範囲第 （4 ) 項〜第 （ 8 ) 項のいずれかに記載の含窒素三環式 化合物もしく はその四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学的に許容さ れる塩を有効成分と して含有する搔痒の予防および/または治療剤。
1 1. 請求の範囲第 （4 ) 項〜第 （8 ) 項のいずれかに記載の含窒素三環式化 合物も しくはその四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学的に許容される 塩を有効成分として含有する、 配列番号 1 1記載のアミノ酸配列を有する蛋白 質のシグナル伝達に関する機能の抑制剤。
1 2. 以下の 1 ) 〜 4 )
1 ) ヒ トを除く哺乳類動物にスフイ ンゴシルホスホ リ ルコ リ ン （SPC) を皮 下および皮内投与することにより ヒ トを除く哺乳類動物における接破行動 を誘発する工程、
2 )試験化合物存在下または非存在下での SPCにより誘発されたヒ トを除く 哺乳類動物における搔破行動の回数を測定する工程、
3 )試験化合物存在下と試験化合物非存在下での SPCにより誘発されたヒ ト を除く哺乳類動物における搔破行動の回数を比較する工程、 および
4 )試験化合物から SPCにより誘発された搔破行動の回数を減少させる物質 を選択する工程、
を含む搔痒治療剤のスクリ一二ング法。
1 3. 請求の範囲第 （4 ) 項〜第 （ 8 ) 項のいずれかに記載の含窒素三環 式化合物も しくはその四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学的に許容 される塩の有効量を投与することを特徴とする、搔痒の予防および/または 治療方法。
1 4. 接痒の予防およびノまたは治療剤の製造のための請求の範囲第 （ 4 ) 項〜第 （ 8 ) 項のいずれかに記載の含窒素三環式化合物もしくはその四級ァ ンモニゥム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩の使用。
1 5. 搔痒が皮膚疾患、 肝 ·胆道疾患、 腎疾患、 内分泌 ·代謝疾患、 血液疾 患、 悪性腫瘍、 神経疾患および A I D Sから選択される疾患に伴う搔痒であ る請求の範囲第 （ 1 ) 〜 （ 3 ) 項および第 （ 1 0 ) 項のいずれかに記載の搔痒 の予防および/または治療剤。
1 6. 搔痒が皮膚疾患に伴う接痒であり、 該皮膚疾患がアトピー性皮膚炎、 湿疹 ·皮膚炎、 尊麻疹、 痒疹、 乾皮症、 虫刺症、 疥癬、 真菌症、 皮膚搔痒症、 肥厚性瘢痕、 乾癬、 水疱症およぴ薬疹から選択される皮膚疾患である請求の 範囲第 （ 1 5 ) 項記載の搔痒の予防および/または治療剤。
1 7.配列番号 1 1記載のァミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関 する機能を抑制する物質の治療有効量を投与することを特徴とする、 搔痒の 予防および/または治療方法。
1 8. 請求の範囲第 （ 2 ) 項に記載の 1 ) 〜 4 ) のいずれか一つのオリ ゴヌ ク レオチ ドまたは該ォリ ゴヌク レオチ ド誘導体の治療有効量を投与するこ とを特徴とする、 搔痒の予防および/または治療方法。
1 9. 請求の範囲第 （ 3 ) 項に記載の 1 ) 〜 4 ) のいずれか一つの抗体の治 療有効量を投与することを特徴とする、 搔痒の予防および/または治療方法。
20. 搔痒の予防および/または治療剤の製造のための、 配列番号 1 1記載の ァミ ノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関する機能を抑制する物質 の使用。
2 1. 搔痒の予防および/または治療剤の製造のための、 請求の範囲第 （ 2 ) 項に記載の 1 ) 〜4) のいずれか一つのオリ ゴヌク レオチドまたは該オリ ゴ ヌク レオチ ド誘導体の使用。
2 2. 搔痒の予防および/または治療剤の製造のための、 請求の範囲第 （ 3 ) 項に記載の 1 ) 〜4 ) のいずれか一つの抗体の使用。
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