WO2004017994A1 - 喘息の予防および／または治療剤 - Google Patents

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WO2004017994A1
WO2004017994A1 PCT/IB2003/003470 IB0303470W WO2004017994A1 WO 2004017994 A1 WO2004017994 A1 WO 2004017994A1 IB 0303470 W IB0303470 W IB 0303470W WO 2004017994 A1 WO2004017994 A1 WO 2004017994A1
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compound
unsubstituted
seq
asthma
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PCT/IB2003/003470
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Mayumi Saki
Hiromi Nonaka
Hiromasa Miyaji
Naoko Hiura
Haruhiko Manabe
Tsutomu Matsumura
Hitoshi Arai
Katsutoshi Sasaki
Choei Kobatake
Kyoichiro Iida
Takeshi Kuboyama
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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    • C07D403/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms

Definitions

  • the present invention relates to a prophylactic or therapeutic agent for asthma, which comprises, as an active ingredient, a substance that suppresses the function related to GPR4 signal transduction.
  • the present invention also relates to a prophylactic and / or therapeutic agent for asthma containing a nitrogen-containing tricyclic compound or a quaternary ammonium salt thereof or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • Bronchial asthma is an inflammatory disease characterized primarily by airway narrowing and airway hypersensitivity. At present, it is said that daily management of asthma can be sufficiently performed by a combination of inhaled steroids, bronchodilators such as / 3 stimulants ⁇ xanthine, and antiallergic drugs such as antileukotrienes. I have. However, steroid drugs used mainly for treatment have side effects, and some patients have steroid-resistant or intractable patients. Is required.
  • GPR4 a G protein-coupled receptor protein (hereinafter abbreviated as GPCR), is known to be highly expressed in the lungs [Genomics (Genomics :), Vol. 30, pp. 84-88 ( 1995)]. GPR4 has also been reported to bind to the lipid sphingosylphosphorylcholine (SPC) and lysophosphatidylcholine (LPC) and to transmit signals [Journal 'ob' biologic chemistry. Story (J. Biol. Chem.), Vol. 276, 1325-41335 W (2001)]. It has been reported that SPC induces TNF- ⁇ production and ICAM-1 expression [J. Invest.
  • SPC lipid sphingosylphosphorylcholine
  • LPC lysophosphatidylcholine
  • GPCRs known as constitutively active GPCRs which, when overexpressed in cells, cause a signal to flow without the presence of a ligand, are known.
  • the signal that flows in the absence of ligand is called constitutive activity.
  • Constitutively active GPCRs include naturally occurring ones and mutant GPCRs created by introducing mutations such as amino acid substitutions and deletions [Molecular Pharmacol. ), 57 volumes, 890 pages (2000), W098 / 46995] Antagonists that suppress the constitutive activity of GPCRs are called inverse gonists.
  • An object of the present invention is to provide a prophylactic and / or therapeutic agent for asthma containing as an active ingredient a substance that suppresses the function related to GPR4 signal transduction, and to provide a nitrogen-containing tricyclic compound or a quaternary ammonium salt thereof.
  • Those drugs An object of the present invention is to provide a preventive and / or therapeutic agent for asthma, which contains a physiologically acceptable salt as an active ingredient.
  • the present invention relates to the following (1) to (8).
  • a prophylactic and / or therapeutic agent for asthma which comprises, as an active ingredient, a substance that suppresses a signal transmission function of a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11.
  • a preventive and / or therapeutic agent for asthma comprising any one of the above as an active ingredient.
  • a preventive and / or therapeutic agent for asthma comprising any one of the above as an active ingredient.
  • R 1 is a substituted or unsubstituted heterocyclic group, -NR 5 R 6 (wherein R 5 and R 6 are the same or different and are hydrogen, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted R 5 and R 6 represent substituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted lower alkynyl, substituted or unsubstituted aralkyl, or substituted or unsubstituted heterocyclic alkyl, Together with an adjacent nitrogen atom to form a substituted or unsubstituted heterocyclic group), -OR 7 , wherein R 7 is hydrogen, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted Lower alkynyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted lower
  • R 2 is hydrogen, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted lower alkynyl, substituted or unsubstituted aralkyl Or represents a substituted or unsubstituted heterocyclic alkyl,
  • R 3 and are the same or different and each represents hydrogen, lower alkyl, or halogen Represent
  • n 0 or 1
  • Z 1 and Z 2 are the same or different and are hydrogen, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted Represents lower alkynyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted aralkyl, or substituted or unsubstituted heterocyclic alkyl, or wherein Z 1 and Z 2 are each one of two adjacent carbon atoms Forming a substituted or unsubstituted aromatic ring or a substituted or unsubstituted heterocyclic ring,
  • Z 3 is hydrogen, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted lower alkynyl, substituted or unsubstituted aryl.
  • a prophylactic and / or therapeutic agent for asthma containing a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • No Z 1 and Z 2 are placing serial in any one of (4) section, second (7) section to form a 2. one connexion substituted or unsubstituted heterocyclic ring such together with the carbon atom adjacent each An agent for preventing and / or treating asthma.
  • the present invention relates to the following (11) to (23).
  • n, RR 2 , R 3 , RX and Y are as defined above, or a quaternary ammonium salt thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof. Salt.
  • a method for preventing or treating asthma which comprises administering a therapeutically effective amount of a substance that suppresses a signal transduction function of a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11.
  • a method for preventing asthma which comprises administering a therapeutically effective amount of any one of the oligonucleotides or the oligonucleotide derivatives of any one of (1) to (4) described in (2). Yepino or treatment method.
  • a method for preventing and / or treating asthma which comprises administering a therapeutically effective amount of the antibody of any one of (1) to (4) according to (3).
  • the novel nitrogen-containing tricyclic compound described in (11) to (15) or a quaternary ammonium salt thereof or a pharmaceutically acceptable salt thereof is provided.
  • the present inventors have found that a substance that suppresses the function of GPR4, which is a GPCR, related to signal transduction is effective in preventing and / or treating asthma, and has completed the present invention.
  • the present inventors searched for a substance that suppresses the constitutive activity of GPR4, which is a constitutively active GPCR, and found that the substance that suppresses the constitutive activity of GPR4 is effective in preventing or treating asthma. Was found to be.
  • Examples of the substance that suppresses the signal transduction function of GPR4 include a substance that inhibits or suppresses the expression of GPR4 itself, a substance that inhibits the binding of a ligand to GPR4, and a signal transduction caused by binding of a ligand to GPR4 [for example, Changes in intracellular cAMP concentration (increase or decrease), changes in intracellular Ca 2+ concentration (increase), and suppression of mitogen-activated protein (MAP) kinase substances that suppress signal transduction caused by the constitutive activity of GPR4 (including, for example, the inverse agonist of GPR4).
  • the structure of the above substance is not particularly limited as long as it has these functions, and may have a known structure.
  • a protein having the amino acid sequence described in any one selected from SEQ ID NOs: 11, 13, and 17, or any one selected from SEQ ID NOs: 11, 13, and 17 Has an amino acid sequence in which at least one amino acid is deleted, substituted or added in the amino acid sequence described in (1), and has a function related to signal transmission of a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 And proteins.
  • SEQ ID NO: 11 has an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence described in any one of SEQ ID NOs: 11, 13 and 17, and SEQ ID NO: 11
  • the protein having a function related to signal transduction of a protein having the described amino acid sequence is described in [Molecular Cloning, A
  • the number of amino acids deleted, substituted or added is not particularly limited, but is preferably 1 to several tens, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and more preferably:! ⁇ 5.
  • Deletion, substitution, or addition of one or more amino acid residues in the amino acid sequence according to any one of SEQ ID NOs: 11, 13, and 17 means that any amino acid residue in the amino acid sequence And one or more amino acid residues are deleted, substituted or added at one or more positions, and the deletion, substitution or addition may occur simultaneously,
  • the amino acid residue to be substituted or added may be either natural or non-natural.
  • Natural amino acid residues include L-alanine, L-asparagine, L-asparaginic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L- -Lysine, L-arginine, L-methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valin and L- Each residue of cystine and the like can be mentioned.
  • Group A leucine, isoleucine, nonorleucine, norin, nonolein / lin, lanin, 2-aminobutanoic acid, methionine, 0-methinoreserin, tert-ptinoregulin, tert-ptinolelanine, cyclohexinoleranine
  • Group B Aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosperic acid
  • Group D lysine, arginine, ordinine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid
  • Group E Proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline
  • Group F serine, threonine, homoserine
  • Group G pheninoleanine, tyrosine
  • a protein having an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are deleted, substituted or added in the amino acid sequence according to any one of SEQ ID NOs: 11, 13, and 17, In order to have a function relating to signal transduction of a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, the amino acid sequence of the protein and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 must be at least 75% or more, usually at least 80%. Above, it is preferable that they have 90% or more, more preferably 95% or more identity.
  • Substances that inhibit or suppress the expression of GPR itself include, for example, SEQ ID NO:
  • Oligonucleotides having a complementary sequence of 15 to 60 consecutive nucleotides selected from the nucleotide sequence of any one selected from 12, 14, and 18 (hereinafter referred to as anti- DNA sequence having the nucleotide sequence of any one selected from SEQ ID NOS: 12, 14, and 18; and Function related to signal transduction of protein having amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 And oligonucleotide derivatives thereof (hereinafter, referred to as oligonucleotide derivatives), and the like.
  • the antisense oligonucleotide is an oligonucleotide consisting of 15 to 60 consecutive nucleotides selected from the nucleotide sequence of any one selected from SEQ ID NOS: 12, 14, and 18. It is not particularly limited as long as it is an antisense oligonucleotide having a complementary sequence of a gonucleotide, but is preferably 17 to 60 bases, more preferably 20 to 60 bases, and furthermore, Antisense oligonucleotides having an complementary sequence of oligonucleotides preferably consisting of 30 to 60 bases are exemplified.
  • an antisense 'oligonucleotide having the complementary sequence of the translation initiation region of the above-mentioned oligonucleotide.
  • the antisense oligonucleotide is prepared by a conventional method based on the information on the nucleotide sequence of any one selected from SEQ ID NOs: 12, 14, and 18 or the nucleotide sequence of a fragment thereof. For example, it can be prepared by using a DNA synthesizer.
  • Oligonucleotide derivatives include an oligonucleotide derivative in which the phosphoric acid ester bond in the oligonucleotide is converted to a phosphorothioate bond, and a diesterol phosphate bond in the oligonucleotide are ⁇ 3'-.
  • Oligonucleotide derivative converted to P5 'phosphoamide bond Oligonucleotide derivative, Oligonucleotide in which the bond between ribose and phosphate diester in the oligonucleotide is converted to peptide nucleic acid bond
  • Oligonucleotide derivatives in which peracyl in the oligonucleotide is substituted with C-5 propynyl peracyl Oligonucleotide derivatives in which peracyl in the oligonucleotide is substituted with C-5 thiazolyl peracyl, derivatives in oligonucleotide
  • Nucleotides that hybridize under stringent conditions with DNA having the base sequence described in any one selected from SEQ ID NOs: 12, 14, and 18 include SEQ ID NOS: 12, 1 A part or all of the DNA having the nucleotide sequence described in any one of 4 and 18 is used as a probe, and the colony is hybridized, plaque hybridized, Southern blot hybridized, and Southern blot hybridized. Means MA obtained by using the method, etc.
  • a 0.1 to 2 times concentration of SSC solution include a DNA or the like that can be identified Ri by the by washing the filters with 6 5 ° C conditions.
  • Hypri-dailyization is based on the first edition of Morexura's Cloning, the current version of Protoconorez, the second edition of Molecular / Diology, DNA Clonin 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995 ) Etc. It can be carried out according to the method described here. Nucleotides to be hybridized include, for example, 12, 14, and 18 force when calculated using BLAST, FASTA, and the like.
  • DNA having a homology of at least 75% or more to the DNA having a complementary sequence of the DNA having the base sequence described in any one selected from the group consisting of the nucleotides described above, and more preferably 80% or more DNA having homology of more than 95%, more preferably DNA having homology of 95% or more.
  • the nucleotide a DNA which can be used for both DNA and RNA is preferably used.
  • antisense 'oligonucleotide or the antisense' oligonucleotide derivative, or a DNA having the base sequence of any one selected from SEQ ID NOS: 12, 14, and 18 and a string.
  • Nucleotides or nucleotide derivatives that hybridize under transient conditions alone or after introduction into a vector for gene therapy such as a retrovirus vector, adenovirus vector, adenovirus associated virus vector, etc. It can be used as a prophylactic and / or therapeutic agent for asthma prepared in accordance with the conventional method.
  • a gene therapy vector When a gene therapy vector is used as the prophylactic or therapeutic agent, it can be produced by combining the gene therapy vector and the base used for the gene therapy agent [Nature Genet. , 8, 42 (1994)].
  • the above-mentioned base may be any base that is usually used for injections, for example, distilled water, sodium chloride or a salt solution such as a mixture of sodium chloride and an inorganic salt, or the like.
  • examples thereof include sugar solutions such as mannitol, lactose, dextran and pudose, amino acid solutions such as glycine and arginine, and mixed solutions of an organic acid solution or a salt solution and a dalcose solution.
  • an osmotic pressure adjusting agent a pH adjusting agent, a vegetable oil such as sesame oil and soybean oil, or an auxiliary agent such as lecithin or a surfactant such as a nonionic surfactant is added to these bases,
  • the injection may be prepared as a solution, suspension or dispersion. These injections can also be prepared as preparations for dissolution at the time of use by operations such as powdering and freeze-drying.
  • the prophylactic and / or therapeutic agent can be used as it is in the case of a liquid, or in the case of a solid, immediately before administration, if necessary, dissolved in the above-mentioned sterilized base.
  • Examples of the administration method include a method of local administration so that it is absorbed at the treatment site of the patient.
  • non-viral gene transfer DNA can be transported to the target treatment site.
  • Non-viral gene transfer methods include calcium phosphate coprecipitation [Virology, 52, 456-467 (1973); Science, 209, 1414-1422 (1980)], and microinjection [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77. 5399-5403 (1980); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, T_, 7380-7384 (1980); Cell, 27, 223-231 (1981); Nature, 294, 92-94 (1981)], liposome-mediated membrane fusion-mediated transfer method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413-7417 (1987); Biochemistry, 28, 9508-9514 (1989); J. Biol. Chem., 264, 12126-12129 (1989); Hum. Gene Ther., 3, 267-275 (1992); Science, 249, 1285-1288 (1990); Circulation, 83, 2007-2011 (1992). )], Direct DNA uptake or receptor-mediated DNA transfer
  • Examples of the substance that inhibits the binding of a ligand to GPR4 include an antibody that recognizes GPR4, a compound that has an antagonistic effect on GPR4, and the like.
  • any antibody that recognizes GPR4 can be used, but an antibody that specifically recognizes GPR4 is preferable.
  • the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. Examples of such an antibody include a neutralizing antibody that recognizes GPR4.
  • human chimeric antibodies, humanized antibodies and the like can also be used as the antibodies of the present invention.
  • the above antibody can be prepared, for example, according to the following method.
  • a polyclonal antibody can be prepared by using a purified preparation of GPR4 or a partial fragment polypeptide thereof, or a peptide having a partial amino acid sequence of GPR4 as an antigen and administering it to an animal.
  • Animals to be administered include egrets, goats, rats, mice, hamsters, etc. Can be used.
  • the dose of the antigen is preferably 50 to 100 ⁇ g per animal.
  • a peptide When a peptide is used, it is desirable to use, as the antigen, a peptide obtained by covalently binding a peptide to a carrier protein such as keyhole helmet haemocyanin or bovine thyroglobulin.
  • a peptide serving as an antigen can be synthesized by a peptide synthesizer.
  • the administration of the antigen is performed 3 to 10 times every 1 to 2 weeks after the first administration. Blood is collected from the fundus venous plexus 3 to 7 days after each administration, and the reaction of the serum with the antigen used for immunization is determined by enzyme immunoassay [enzyme immunoassay (ELISA): published by Medical Shoin ( 1976), Ant ibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)].
  • enzyme immunoassay enzyme immunoassay
  • a polyclonal antibody can be obtained by obtaining serum from a non-human mammal whose serum has a sufficient antibody titer against the antigen used for immunization, and separating and purifying the serum.
  • Methods for separation and purification include centrifugation, salting out with 40-50% saturated ammonium sulfate, caprinoleic acid precipitation [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)], or DEAE Sephapha.
  • a rat whose serum shows a sufficient antibody titer is produced. Serve as a source of cells.
  • the spleen is removed 3 to 7 days after the last administration of the antigenic substance to the rat showing the antibody titer.
  • the spleen is shredded in a MEM medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), loosened with forceps, centrifuged at 200 rpm for 5 minutes, and the supernatant is discarded.
  • MEM medium manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the spleen cells of the obtained precipitate fraction are washed with Tris-ammonium chloride buffer (PH 7.65) After removing red blood cells by treating for 1 to 2 minutes, the cells are washed three times with a MEM medium, and the obtained spleen cells are used as antibody-producing cells.
  • Tris-ammonium chloride buffer PH 7.65
  • myeloma cells use cell lines obtained from mice or rats.
  • 8-azaguanine-resistant mouse derived from BALB / c
  • myeloma cell line P3-X63Ag8-U1 (hereinafter abbreviated as P3-U1) [Curr. Topics Microbiol. Immunol., 81, 1 (1978), Eur. J Immunol., 6, 511 (1976)], SP2 / 0-Agl4 (SP-2) [Nature, 276, 269 (1978)], P3-X63-Ag8653 (653) [J.
  • a purified plate of GPR4 or its partial fragment polypeptide used as an antigen or a peptide having a partial amino acid sequence of GPR4 is coated on an appropriate plate, and the hybridoma culture supernatant or described later Reacting the purified antibody obtained in (d) above as the first antibody, and further as the second antibody, an anti-rat or anti-mouse immunoglobulin antibody labeled with biotin, an enzyme, a chemiluminescent substance or a radioactive compound, etc.
  • a reaction according to the labeling substance is carried out, and those which specifically react with the polypeptide used as the antigen are selected as the hybridoma producing the monoclonal antibody used in the present invention.
  • hybridoma Using the hybridoma, cloning was repeated twice by the limiting dilution method (first time, using HT medium (medium obtained by removing aminopterin from HAT medium), and second time, using normal medium). Those with a strong antibody titer are selected as the hybridoma strain producing the monoclonal antibody used in the present invention.
  • Pristane-treated [0.5 ml of 2,6,10,14-tetramethinolepentadecane (Pri stane) was intraperitoneally administered and bred for 2 weeks]. ).
  • the hybridoma cells producing the monoclonal antibody used in the present invention obtained in the above step 5 are injected intraperitoneally with 5 to 20 ⁇ 10 e cells / animal. In 10 to 21 days, Hypridoma develops ascites cancer.
  • the ascites is collected from the mouse with ascites tumor and centrifuged at 3,000 rpm for 5 minutes to remove solids.
  • a monoclonal antibody can be purified and obtained in the same manner as the method used for the polyclonal antibody.
  • the subclass of an antibody is determined using a mouse monoclonal antibody typing kit or a rat monoclonal antibody typing kit.
  • Polypeptide amount is calculated from the absorbance of one method or 2 80 nm lorry.
  • the above preventive and / or therapeutic agent for asthma containing an antibody recognizing GPR4 can be prepared as follows.
  • a medicament containing the antibody as an active ingredient can be administered alone, but usually the active ingredient is one or more pharmacologically acceptable. It is desirable to mix it with the body and provide it as a pharmaceutical preparation manufactured by any of the methods well-known in the art of pharmacy.
  • a sterile solution dissolved in water or an aqueous carrier such as an aqueous solution of salt, glycine, glucose, human albumin or the like is used.
  • pharmacologically acceptable additives such as buffering agents and tonicity agents to bring the formulation solution closer to physiological conditions, for example, sodium acetate, sodium chloride, sodium lactate, chloride Potassium, sodium tenoate, etc. can also be added. Alternatively, it can be stored after being freeze-dried and dissolved in an appropriate solvent before use.
  • Dosage forms include tablets, injections and the like.
  • Suitable formulations for oral administration include tablets and the like. Tablets and the like are made up of excipients such as lactose and mannitol, disintegrants such as starch, lubricants such as magnesium stearate, binders such as hydroxypropylcellulose, surfactants such as fatty acid esters, glycerin, etc. It can be manufactured by using a plasticizer or the like as an additive.
  • Formulations suitable for parenteral administration include injections and the like. For example, an injection is prepared using a carrier or the like comprising a salt solution, a pudose solution or a mixture of both.
  • the components exemplified as additives in oral preparations can be added.
  • the dose or frequency of administration varies depending on the desired therapeutic effect, administration method, treatment period, age, body weight, etc., but is usually 10 / g / kg to 8 mg / kg per day for an adult.
  • a substance that suppresses the function related to signal transduction caused by the constitutive activity of GPR4 The quality can also be obtained by searching for a substance that can suppress signal transduction caused by the constitutive activity.
  • Examples of the compound having an antagonistic action on GPR4 include a compound represented by the formula (I).
  • the compound represented by the formula (I) is referred to as compound (I). The same applies to compounds of other formula numbers.
  • the lower alkyl moiety of the lower alkyl and the lower alkanol includes, for example, a linear or branched alkyl having 1 to 10 carbon atoms.
  • a linear or branched alkyl having 1 to 10 carbon atoms specifically, methyl, ethinole, propynole, isopropynole, petitnole, Isobutyl, sec-butyltinole, tert-butylinole, pentinole, isopentinole, neopentinole, hexinole, heptyl, octyl, isooctyl, noel, desinole, and the like.
  • cycloalkyl examples include cycloalkyl having 3 to 8 carbon atoms.Specifically, cyclopropyl, cyclopropyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctynole, etc. Is mentioned.
  • Examples of the lower alkenyl include straight-chain, branched or cyclic alkenyl having 2 to 8 carbon atoms, and specific examples thereof include vinyl, aryl, 1-propenyl, butenol, and pentenyl. Hexeninole, hepteninole, octeninole, cyclohexenyl, 2,6-octactenyl, and the like.
  • Examples of the lower alkynyl include straight-chain or branched alkynyl having 2 to 8 carbon atoms, and specific examples thereof include ethynyl, propininole, butyr, pentynyl, hexynyl, heptynyl, octynyl and the like. Is mentioned.
  • Halogen represents fluorine, chlorine, bromine and iodine atoms.
  • Examples of the aryl and the aromatic ring formed by joining together two adjacent carbon atoms and removing one hydrogen atom include monocyclic groups having 6 to 14 carbon atoms, Examples include bicyclic or tricyclic aryls, and specific examples include phenyl, naphthyl, indenyl, and anthranyl.
  • alkylene portion of aralkyl and heterocyclic alkyl has the same meaning as the above-mentioned definition of lower alkyl (i) except that one hydrogen atom is removed.
  • the aryl moiety of the aralkyl includes, in addition to the groups mentioned in the definition of the aryl (vi), for example, a bicyclic fused ring in which the aryl is fused with a cycloalkyl. Specific examples thereof include indanyl, 1,2,3,4-tetrahydrodronaphthyl, 6,7'8,9-tetrahydro-5-I-I-benzocycline, and the like. Can be
  • heterocyclic group and the heterocyclic group portion of the heterocyclic alkyl and the group obtained by removing one hydrogen atom from a heterocyclic ring formed by joining together two adjacent carbon atoms include, for example, a nitrogen atom A 5- or 6-membered monocyclic heterocyclic group containing at least one atom selected from an oxygen atom and a sulfur atom, a bicyclic or tricyclic fused 3- to 8-membered ring and nitrogen And a condensed heterocyclic group containing at least one atom selected from an atom, an oxygen atom and a sulfur atom.
  • pyridyl pyrazinyl, pyrimidinyl, pyridazinyl, benzodimidazolyl, and 2- Oxobenzimidazolyl, benzotriazolyl, benzofuryl, benzocenyl, prenyl, benzoxazolyl, benzothiazolyl, benzodioxolyl, indazolyl, inn Ril, isoindolyl, quinolinole, isoquinolyl, phthalazinyl, naphthyl ridinyl, quinoxalinyl, pyrrolyl, pyrazolyl, quinazolinyl, cinnolinyl, triazolyl, tetrazolyl, imidazolyl, oxazolyl, thiazolyl, thiazolyl, thiazolyl Chenyl, furyl, pyrrolidinyl, 2,5-dioxopyrroli
  • heterocyclic group formed together with the adjacent nitrogen atom for example, a 5- or 6-membered monocyclic heterocyclic group containing at least one nitrogen atom (the monocyclic heterocyclic group) Heterocyclic groups may contain other nitrogen, oxygen or sulfur atoms), bicyclic or tricyclic condensed 3- to 8-membered ring containing at least one nitrogen atom Heterocyclic group (the condensed heterocyclic group may contain another nitrogen atom, oxygen atom or sulfur atom) and the like, and specifically, pyridyl, tetrahydropyridyl, indolinyl and the like.
  • Substituents in the substituted lower alkyl and the substituted lower alkyl are the same or different and include, for example, cycloalkyl, lower alkanoyl, lower alkoxy, aryloxy, substituted aryloxy having 1 to 3 substituents [the substituted aryloxy] And the same or different, for example, lower alkyl, lower alkoxy, lower alkoxycarbonyl, halogen, cyano, nitro, hydroxy, carboxy, amino and the like having 1 to 3 substituents. No.
  • the lower alkyl has the same meaning as the lower alkyl (i)
  • the halogen has the same meaning as the halogen (V)
  • the lower alkyl part of the lower alkoxy and the lower alkoxycarbonyl has the same meaning as the lower alkyl (i).
  • Aralkyloxy, substituted aralkyloxy [The substituents in the substituted aralkyloxy may be the same or different and include, for example, lower alkyl, lower alkoxy, lower alkoxycarbonyl, lower alkoxycarbonyl, halogen, cyano, nitro having 1 to 3 substituents. B, hydroxy, carboxy, amino and the like.
  • lower alkyl has the same meaning as the above lower alkyl (i), and phenyl and benzene have the same meanings as the above-mentioned hachigen (V).
  • the lower alkyl part of the lower alkoxy and the lower alkoxy carbonyl is the above lower alkyl (i).
  • the groups may be the same or different and include, for example, hydroxy having 1 to 3 substituents, halogen, etc.], substituted lower alkanols [the substituents in the substituted lower alkanols may be the same or different, Examples thereof include halogens having 1 to 3 substituents], mono- or di-lower alkylamino, lower alkynole Norehoniru, lower ⁇ Roh gravel Rusuru alkylsulfonyl, lower alkoxycarbonyl amino And mono- or di-lower alkylaminocarbonyl, mono- or di-lower alkylaminocarbonyloxy, heterocyclic group and the like.
  • the lower alkyl moiety of the lower alkylsulfininole, lower anoroxycarbonylamino and lower alkylamino is the above aryl (vi), cycloalkyl (ii), halogen (v), heterocyclic group (ix), And lower alkyl (i), and the alkylene portion of aralkyloxy has the same meaning as the lower alkyl (i) except for one hydrogen atom.
  • the lower alkyl portion of the mono- or di-lower alkylamino, mono- or di-lower alkylaminocarbonyl and mono- or di-lower alkylaminocarbonyloxy is the same as the lower alkyl (i), respectively.
  • the two lower alkyl moieties of di-lower alkylaminocarbonyl and di-lower alkylamino power may be the same or different.
  • the substituents in a ring group, a substituted aromatic ring each formed with two adjacent carbon atoms, and a substituted heterocyclic ring each formed with two adjacent carbon atoms are: In addition to the groups mentioned in the definition of the substituent (xi) in the substituted lower alkyl, lower alkyl, aryl, substituted aryl, aralkyl, substituted aralkyl, heterocyclic group, substituted heterocyclic group, heterocyclic alkyl, substituted heterocyclic alkyl And so on.
  • the substituent in the substituted aryl and the substituted heterocyclic group formed together with the adjacent nitrogen atom is a lower alkyl [the lower alkyl has the same meaning as the above lower alkyl (i).
  • substituted lower alkyl wherein the lower alkyl is as defined above for the lower alkyl (i)
  • the groups are the same or different, and include, for example, halogens, hydroxy, carboxy, lower alkoxycarbonyl and the like having 1 to 3 substituents.
  • halogen has the same meaning as the above-mentioned halogen (V)
  • the lower alkyl part of the lower alkoxycarbon has the same meaning as the above-mentioned lower alkyl (i).
  • the lower alkyl, aryl, heterocyclic group and the heterocyclic group portion of the heterocyclic alkyl, the aralkyl and the alkylene portion of the heterocyclic alkyl, and the aralkyl portion of the aralkyl shown above are the lower alkyl (i) and the aryl, respectively.
  • the substituent in the substituted aryl, the substituted aralkyl, the substituted heterocyclic group, and the substituted heterocyclic alkyl may be the same or different, for example, lower alkyl having 1 to 3 substituents [the lower alkyl is the lower alkyl. (The lower alkyl portion of the lower alkoxy is the same as the lower alkyl (i)), halogen, and the like (the halogen is the same as the halogen (V)). No.
  • Examples of the quaternary ammonium salt of compound (I) include a lower alkyl halide (the lower alkyl and the halogen are the same as defined above), a halogenated aralkyl, and the like at the basic site of compound (I). (The halogen and the aralkyl are the same as defined above), and quaternary ammonium salts to which hydroxy lower alkyl (the lower alkyl is the same as defined above) and the like are not particularly limited.
  • the quaternary ammonium salt obtained by reacting the quaternary ammonium salt obtained by reacting the compound (I) with a pyrrolidino group with the compound (I) with iodide thiol iodide ions and hydroxide ions are exchanged. And the like.
  • a non-toxic, water-soluble salt is preferable.
  • Alkaline earth metal salts such as metal salts, magnesium salts and calcium salts, metal salts such as aluminum salts and zinc salts, organic amines such as ammonium salts such as ammonium and tetramethylammonium, morpholine addition salts and piperidine addition salts
  • Addition salts or amino acid addition salts such as glycine addition salts, phenylalanine addition salts, lysine addition salts
  • R 9 represents lower alkyl, aryl or benzyl
  • R 1 () and R 11 The same or different, lower alkyl or cycloalkyl, or R 1Q and R 11 taken together with the adjacent nitrogen atom to form a heterocyclic group, and U is halogen, alkoxysulfonyloxy, aryloxy Represents sulfoninoleoxy, anolequinolesulfoninoleoxy or arylsulfonyloxy
  • lower alkyl, cycloalkyl and halogen are as defined above, respectively.
  • the alkyl part of the alkoxysulfonyloxy and alkylsulfonyloxy, and the aryl part of the aryloxysulfonyloxy and arylsulfonyloxy have the same meanings as the lower alkyl and aryl, respectively. It is.
  • the heterocyclic group formed together with the adjacent nitrogen atom has the same meaning as described above.
  • compound (Ilia) as a raw material and reacting it with 1 equivalent to a large excess of YH (where Y is as defined above) according to the method disclosed in JP-A-7-ei983. As a result, compound (IV) can be obtained.
  • the compound (Ilia) can be synthesized by the method disclosed in JP-A-7-61983 or a method analogous thereto.
  • reaction usually proceeds well under acidic conditions, it is preferable to add an acid such as hydrochloric acid, acetic acid, or trifluoroacetic acid into the reaction system as needed.
  • the reaction is usually performed at a temperature between 0 ° C and the boiling point of the solvent used in the reaction, preferably at a temperature between room temperature and 80 ° C, and is completed in 5 minutes to 100 hours.
  • Inert solvents include, for example, water, methanol, ethanol, acetic acid, trifluoroacetic acid, dichloroethane, Cross-linked form, tetrahydrofuran, dimethinoreacetamide, dimethylformamide, acetone, and the like can be used alone or as a mixture, and a mixed solvent of black-formed form and acetic acid is preferably used.
  • Compound (g) can be produced from compound (Ib) by the method shown below.
  • Compound (Ib) is dissolved in an inert solvent in an amount of 1 equivalent to a large excess of R 8 U (wherein R 8 and U have the same meanings as described above), and usually the boiling point of the solvent used in the reaction from 110 ° C.
  • the compound (Ic) can be obtained by reacting at a temperature between the above, preferably at room temperature, for 1 to 48 hours.
  • inert solvent examples include water, methanol, ethanol, benzene, tonolen, xylene, ethynole acetate, hexane, acetonitrile, dichloromethane, dichloroethane, chloroform, carbon tetrachloride, and 1,4.
  • Monodioxane, tetrahydrofuran, dimethylacetamide, dimethylformamide, acetone, and the like can be used alone or in combination.
  • ethyl acetate, dichloromethane, chloroform, and the like are used.
  • Compound (Ib) can be produced from compound (Ic) by the method shown below. Manufacturing method 3
  • Compound (I-c) is reacted with 1 equivalent to a large excess of R 5 RH (in the formula, and R 6 are each as defined above) in an inert solvent, and the solvent used for the reaction is usually used at a temperature of 1-10 ° C.
  • the compound (ib) can be obtained by reacting at a temperature between the boiling points, preferably between 20: and 100 ° C, for 1 to 100 hours.
  • inert solvent examples include water, methanol, ethanol, benzene, tonolene, xylene, ethynole acetate, hexane, acetonitrile, dichloromethane, dichloroethane, black form, carbon tetrachloride, 1 , 4-dioxane, tetrahydrofuran, dimethylacetamide, dimethinoleformamide, acetone and the like are used alone or as a mixture, and preferably, chloroform and dimethylformamide are used. Since the reaction usually proceeds well under basic conditions, it is desirable to add an appropriate base into the reaction system as needed.
  • Bases include, for example, triethylamine, disopropylethylamine, pyridine, N-methylmorpholine, potassium carbonate, sodium hydride, lithium hydride, calcium hydride, diisopropylethylamine. , 1,8-diazabicyclo [5.4.0] indene 7-ene and the like can be used, and among them, triethylamine is preferable.
  • Compound (I-e) can be produced from compound (I-b) using compound (I-d) by the method shown below.
  • R 14 and R 15 are the same or different and are hydrogen, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted Or unsubstituted cycloalkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted lower alkynyl, substituted or unsubstituted aralkyl, or substituted or unsubstituted heterocyclic alkyl, or R 14 and R 15 may form a substituted or unsubstituted heterocyclic ring with the adjacent CH (CH 2 ) m N.
  • R 16 may be hydrogen, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted Represents cycloalkyl, substituted or unsubstituted lower alkenyl, substituted or unsubstituted lower alkynyl, substituted or unsubstituted aralkyl, or substituted or unsubstituted aryl, m is 0 to 3 Represents an integer)
  • Lower alkyl, cycloalkyl, lower alkenyl, lower alkynyl, aralkyl, heterocyclic alkyl, and aryl are the same as defined above, and their substituents are also defined as above.
  • Examples of the substituted or unsubstituted heterocyclic ring formed by R 14 and R 15 together with adjacent CH (CH 2 ) n N include tetrahydropyridine, pyrrolidine, piperidin, and homopiperidine. , Piperazine, homopiperazine, monorephorin, thiomonoreolin, perhydroazepine, penolehydroazozin, tetrahydroquinoline, tetrahydroisoquinoline, etc. It has the same meaning as the substituent of the heterocyclic group formed together with the atom.
  • Compound (Id) is placed in an inert solvent, usually at a temperature between 78 ° C and 40 ° C, at 2 to 4 equivalents of lithium aluminum hydride, aluminum dilithium aluminum hydride, preferably aluminum diisopropyl hydride. Treatment in the presence of reducing agent such as dimethyllithium for 10 minutes to 24 hours, preferably 1 to 3 hours. Compound (Ie) can be obtained.
  • inert solvent for example, dichloromethane, chloroform-form, carbon tetrachloride, dichloroethane, benzene, tonolene, xylene, tetrahydrofuran, getyl ether, etc. can be used alone or in combination.
  • dichloromethane or toluene is used.
  • Compound (If) can be produced from compound (Id) by the following method.
  • Compound (Id) in an inert solvent usually at a temperature between 0 ° C and the boiling point of the solvent used in the reaction, preferably at a temperature between room temperature and 100 ° C, from 1 equivalent to a large excess of the appropriate salt Compound (If) can be obtained by treating for 1 to 48 hours, preferably for 1 to 3 hours in the presence of a group.
  • Suitable bases include, for example, sodium hydroxide, lithium hydroxide, potassium hydroxide, potassium carbonate, cesium carbonate, sodium methoxide, and the like.
  • Examples include sodium hydroxide.
  • the inert solvent for example, water, tetrahydrofuran, dimethyl ether, methanol, ethanol, ethanol, dichloromethane, dichloroethane, benzene, tonylene, xylene, etc. are used alone. Or tetrahydrofuran or methanol, or a mixed solvent thereof with water. From the compound (ic), the compound (i-h) can be produced from the compound (i-g) by the following method.
  • alkyl in trialkylsilyl and trialkyltin has the same meaning as the lower alkyl.
  • Examples of aluminum metal include sodium and steel.
  • the compound (Ih) can be obtained by reacting in the presence for 1 to 200 hours, preferably for 3 to 48 hours.
  • Suitable additives include, for example, silicon tetrachloride, lithium chloride, aluminum chloride, ammonium chloride, trialkyltin chloride, dialkyltin oxide, trialkylaluminum, triethylamine hydrochloride, Lietilamine 'hydrobromide, sodium hydride, potassium tert-butoxide, sodium hydroxide, zinc bromide, etc., preferably, ammonium chloride, dialkyltin oxide, etc. Is mentioned.
  • inert solvent examples include water, acetonitril, dimethylformamide, dimethylacetamide, N-methyl-2-pyrrolidone, Dimethyl snorreoxide, acetic acid, glacial acetic acid, tetrahydrofuran, benzene, toluene, xylene and the like can be used alone or as a mixture, and dimethylformamide or toluene is preferably used.
  • Compound (ii) can be produced from compound (ic) by the following method.
  • R 18 is a substituted or unsubstituted lower alkyl.
  • Q is an alkali metal or an alkaline earth metal
  • p is 1 if Q is an alkali metal
  • p is 2 if Q is an alkaline earth metal.
  • alkali metal is synonymous with the above-mentioned alkali metal, and examples of the alkaline earth metal include magnesium and calcium.
  • inert solvent for example, dimethylacetamide, N-methyl-2-pyrrolidone, dimethylsulfoxide and the like can be used alone or in combination, and dimethylsulfoxide is preferably used.
  • Production of compound (ij) from compound (Ic) by the following method Can be.
  • Compound (Ic) in an inert solvent at a temperature between 0 ° C and the boiling point of the solvent used in the reaction Preferably at a temperature between 30 ° C and 80 ° C, 1 equivalent to a large excess, preferably 1 to 100 hours, preferably in the presence of 2 to 8 equivalents of R 7a SH (wherein R 7a has the same meaning as described above) and 1 to large excess, preferably 1 to 3 equivalents of a suitable base.
  • the compound (Ij) can be obtained by reacting for 3 to 72 hours.
  • Suitable bases include, for example, triethylamine, diisopropylethylamine, pyridine, N-methylmorpholine, potassium carbonate, sodium hydride, potassium hydride, hydrogenation calcium, Jie Sopuro Piruechiruami emissions, 1, 8 - Jiazabishiku b [5-4.0] Undekku one 7-E down or the like can be used, among others 1, 8-Jiazabishiku port [5. 4.0] Undekku one 7 __En is preferred.
  • inert solvent for example, dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, dichloroethane, benzene, toluene, xylene, ethyl ethyl sulphate, dimethylinolacetamide, ⁇ -methyl-2-pyrrolidone, dimethyl sulfoxide, etc.
  • inert solvent for example, dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, dichloroethane, benzene, toluene, xylene, ethyl ethyl sulphate, dimethylinolacetamide, ⁇ -methyl-2-pyrrolidone, dimethyl sulfoxide, etc.
  • black form is used.
  • compound (1-1;) can be produced from compound (Ik) by the following method.
  • Compound (I-1) can be produced by performing the same reaction as in Step 6 of Production Method 5 using compound (I-k).
  • Compound (i-m) can be produced from compound (i-i) by the following method.
  • Compound (I-m) can be produced by performing the same reaction as in Step 6 of Production Method 5 using compound (I-i).
  • Compound (i-n) can be produced from compound (I-m) by the following method. '
  • R 7c represents a group obtained by removing hydrogen from the definition of R 7
  • Compound (Im) is prepared in an inert solvent at a temperature between 0 ° C and the boiling point of the solvent used in the reaction, preferably at a temperature between room temperature and 80 ° C, from 1 equivalent to a large excess, preferably from 1 to In the presence of 3 equivalents of a suitable base, 1 equivalent to a large excess, preferably 1 to 3 equivalents of R 7 ⁇ ; U (wherein R 7 and U are as defined above), and 1 to 48 hours The reaction is preferably performed for 3 to 24 hours to obtain the compound (In).
  • Suitable bases include, for example, potassium carbonate, sodium hydride, lithium hydride, calcium hydride, lower alkyl lithium, and the like.
  • the inert solvent include dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, dichloroethane, benzene, toluene, xylene, ethyl acetate, dimethylinolenolemamide, dimethylacetamide, and N-methylol-2-amide.
  • Pyrrolidone, tetrahydrofuran, getyl ether and the like can be used alone or as a mixture, and chloroform is preferably used.
  • R 2 , RR 4 , X and Y are each as defined above).
  • Compound (I-ma) is prepared in an inert solvent at a temperature between 0 ° C and the boiling point of the solvent used in the reaction, preferably at a temperature between room temperature and 60 ° C, from 1 equivalent to a large excess, preferably Compound (Io) can be obtained by treating in the presence of 3 to 6 equivalents of an appropriate oxidizing agent for 1 to 48 hours, preferably for 3 to 24 hours.
  • Suitable oxidizing agents include, for example, manganese dioxide, chromic acid, pyridinium chromate, pyridinium chromate, potassium permanganate, sulfur trioxide-pyridin, and oxone. Is manganese dioxide.
  • inert solvent examples include dichloromethane, black form, carbon tetrachloride, dichloroethane, benzene, toluene, xylene, ethyl acetate, acetic acid, propionic acid, butyric acid, trifluoroacetic acid, water, Pyridine, dimethylformamide, dimethylacetamide, N-methyl-2-pyrrolidone, 1,4-dioxane, tetrahydrofuran, getyl ether, etc. can be used alone or in combination. Preferably, dimethylformamide, tetrahydrofuran and the like are used.
  • Compound (Ip) can be produced from compound (1-0) by the method shown below.
  • Suitable dehydrating agents include, for example, acetic anhydride, phthalic anhydride, sodium hydrogen sulfate, oxone, sodium formate, dialkyltin oxide, alumina, silica gel, sodium acetate, formamide, pentaamide
  • Illustrative are phosphorus oxide, iron (111) chloride, formic acid, acetic acid, propionic acid, oxychlorinated phosphorus, paratoluenesulfonic acid and the like, preferably acetic anhydride, phthalic anhydride and the like.
  • Suitable bases include, for example, triethylamine, pyridine, sodium hydride, hydride and the like, and preferably triethylamine or pyridine.
  • Inert solvents include, for example, dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, dichloromethane, benzene, toluene / leene, xylene, nitrobenzene, acetonitril, ethyl acetate, acetic acid, propionic acid, Butyric acid, trifluoroacetic acid, pyridin, dimethylformamide, dimethylacetamide, N-methinole-2-pyrrolidone, 1,4-dioxane, tetrahydrofuran, gethyle tenorene, methanolol, ethanol, propanol And the like can be used alone or in combination.
  • acetonitrile, dimethylformamide and the like are used.
  • Compound (I-q) can be produced from compound (I-p) by the following method.
  • Compound (I_q) can be produced by performing the same reaction as in Step 7 of Production Method 6 using compound (I-P).
  • Compound (i-r) can be produced from compound (I-c) by the method shown below.
  • R 2 , R 3 , R 4 , R 5b , R 6b , R 8 , U, n, X and Y are as defined above, and Q a is an alkali metal as defined above
  • Inert solvents include, for example, dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, dichloroethane, benzene, tonolen, xylene, dimethinolehonolemamide, dimethylacetamide, N-methyl-2-pyrrolidone, 1 , 4-Dioxane, Te Trahi Drofuran or the like can be used alone or as a mixture, and dimethylformamide or the like is preferably used.
  • Compound (is) can be produced from compound (ir) by the following method.
  • R 2 , R 3 , R 4 , T, n, X and Y are each as defined above).
  • Compound (I-s) can be produced by performing the same reaction as in Step 7 of Production Method 6 using compound (I-r).
  • Compound (I-1) can be produced from compound (Ir) by the following method.
  • Compound (I-1) can be produced by performing the same reaction as in Step 6 of Production Method 5 using compound (I-r).
  • Compound (Iu) can be produced from compound (nib) by the following method.
  • R 2 R 3, R 4, R 5, R 6, R 5b, R 6b, R 7c, R 8, R 9, R 10 R u, R 18, Q, p, U, X and Y is as defined above.
  • Compound (V) can be produced by performing the same reaction as in step 8 of production method 7 using compound (Illb).
  • Compound (VI) can be produced by performing the same reaction as in Step 6 of Production Method 5 using Compound (V).
  • Compound (VII) can be produced by performing the same reaction as in step 13 of production method 12 using compound (VI). Process 2 2 ⁇
  • Compound (VII) in an inert solvent usually at a temperature between 0 ° C and 80 ° C, with 2-4 equivalents of silver nitrate, silver oxide (1), silver oxide ( ⁇ ), chromic acid, and chromium chromium Pyridinium acid, pyridinium dichromate, potassium permanganate, sodium periodate, sodium perchlorate, hydrogen peroxide, sodium chlorite
  • Compound (VI II) can be obtained by treating for 10 minutes to 24 hours, preferably 1 to 4 hours in the presence of an oxidizing agent such as stream, preferably silver nitrate or sodium perchlorate. Can be manufactured. If necessary, add 0.1 to 4 equivalents of organic substances such as acetic acid or inorganic substances such as sulfuric acid, sodium dihydrogen phosphate, sulfamic acid, and lutemium oxide as additives. Is also good. .
  • inert solvent examples include getyl ether, tetrahydrofuran, 1,4-dioxane, dimethylformamide, dimethylacetamide, dimethylsulfoxide, benzene, tonolenene, xylene, dichloromethane, chlorofozolem, 1,2-dichloroethane, acetonitrile, ethyl acetate, methyl acetate, methylethyl ketone, hydrochloric acid, acetic acid, acetic anhydride, sulfuric acid, water, etc., preferably, acetonitrile, water, etc. These can be used alone or as a mixture. ⁇ Step 2 3>
  • the compound (VIII) is reacted with 1 to 20 equivalents of a halogenating agent for 10 minutes to 24 hours in an inert solvent, usually at a temperature between 0 ° C and 80 ° C, preferably at room temperature, and then 1 equivalent Compound (IX) can be produced by reacting with a large excess of R 7c; 0H (wherein is as defined above).
  • halogenating agent examples include thiol chloride, oxalyl chloride, oxylin chloride and the like, and preferably thiolonyl chloride.
  • inert solvent examples include dichloromethane, chlorophonolem, tetrahydrofuran, dimethylformamide, dimethylacetamide, 1,4-dioxane, acetonitrile, benzene, toluene, xylene, etc. These can be used alone or as a mixture.
  • Preferred examples of the inert solvent include dichloromethane.
  • Compound (IX) is used to perform the same reaction as in Step 2 of Production Method 1. Compound (X) can be produced.
  • Compound (XI) can be produced by performing the same reaction as in step 3 of production method 2 using compound (X).
  • Compound (I-u) can be produced by performing the same reaction as in step 1 of production method 1 using compound (XI).
  • Compound (i-v) can be produced from compound (I-u) by the following method.
  • Compound (I-v) can be produced by performing the same reaction as in Step 6 of Production Method 5 using compound (I-u).
  • Compound (i-w) can be produced from compound (I-v) by the following method.
  • the compound (I-V) is reacted with 1 to 20 equivalents of a halogenating agent for 10 minutes to 24 hours in an inert solvent, usually at a temperature between 0 ° C and 80 ° C, preferably at room temperature.
  • the compound (Iw) can be produced by reacting with 1 equivalent to a large excess of R 5a R 6a NH (wherein R 5a and R 6a have the same meanings as described above). If necessary, one equivalent to a large excess of a suitable base may be added.
  • Examples of the nodulating agent include thionyl chloride, oxalyl chloride, and oxylin chloride, and preferably thionyl chloride.
  • Suitable bases include, for example, pyridine, triethylamine, diisopropylethylamine, N-methylmorpholine and the like, preferably triethylamine.
  • Examples of the inert solvent include dichloromethane, chloroform, tetrahydrofuran, dimethylformamide, dimethylacetamide, 1,4-dioxane, acetonitrile, benzene, toluene, and xylene. These can be used alone or in combination. Preferred examples of the inert solvent include dichloromethane.
  • compound (Iw) In the production of compound (Iw), a method commonly used in peptide chemistry can also be used. That is, in an inert solvent for compound (IV), 1 to 10 equivalents of R 5a R 6a NH (in the formula, R 5a and R 6a are each as defined above) together with 0.5 to 10 equivalents of an appropriate condensing agent.
  • the compound (IW) can be obtained usually by reacting at a temperature between 0 ° C and 50 ° C for 10 minutes to 70 hours.
  • inert solvent examples include getyl ether, tetrahydrofuran, 1,4-dioxane, dimethylformamide, dimethylacetamide, dimethylsnorefoxide, benzene, tonolene, xylene, acetonitrinolole, and ethyl acetate. And tetrachlorofuran, dimethylformamide, and the like. Preferred are tetrahydrofuran, dimethylformamide and the like.
  • Suitable condensing agents include, for example, 1,3-dicyclohexyl carbodiimide, 1-ethyl-3_ (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl Pill) force-bonded polystyrene resin (EDC resin) and the like.
  • EDC resin force-bonded polystyrene resin
  • EDC resin can be produced by the method described in Tetrahedron Letters, Vol. 34, No. 48, p. 7685 (1993).
  • Compound (I-y) can be produced from compound (I-X) in compound (I) by the following method.
  • R 3 , R ⁇ n, X and Y are as defined above, and R 22 and R 23 are the same or different and are hydrogen, substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted Represents a substituted cycloalkyl, a substituted or unsubstituted lower alkenyl, a substituted or unsubstituted lower alkynyl, a substituted or unsubstituted aralkyl, or a substituted or unsubstituted heterocyclic alkyl)
  • lower alkyl, cycloalkyl, lower alkenyl, lower alkyl, aralkyl, and heterocyclic alkyl have the same meanings as described above, and their substituents have the same meanings as described above.
  • Step 2 9 Compound (I- x) in an inert solvent, one equivalent to a large excess, preferably (wherein, R 22 and R 23 each have the same meanings as defined above) 1 to 10 equivalents of R 22 R 23 C0 and , 1 equiv to large excess, preferably in the presence of 1-3 equivalents of a suitable reducing agent, usually - 7 8 temperature between ° Celsius to 100 ° C, a temperature of preferably between at 0 ° Celsius to 50
  • the compound ( ⁇ -y) can be obtained by reacting for 10 minutes to 48 hours.
  • Suitable reducing agents include, for example, sodium borohydride, sodium triacetoxyborohydride, sodium cyanoborohydride, and preferably sodium borohydride.
  • a catalyst amount to a solvent amount preferably 0.5 equivalent to a solvent amount, may be added to a suitable acid.
  • suitable acids include, for example, formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, propionic acid, hydrochloric acid and the like, and preferably acetic acid.
  • Inert solvents include, for example, dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, dichloroethane, benzene, tonolene, xylene, etinoleethenol, 1,4-dioxane, dimethylformamide, dimethylacetamide , Acetonitrile, hexane, formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, propionic acid, hydrochloric acid and the like are exemplified, and these can be used alone or in combination.
  • tetrahydrofuran, acetic acid and the like are mentioned.
  • each functional group in the compound (I) and the starting compound and the conversion of the functional group contained in the substituent may be carried out by a known method [for example, "Compliance” Organic Transformation. Second Edition (Comprehens ive Organization Transformation ons, the second edition), by RC Larock, Shonn Wiley and Sands Incorporated (John) Wiley & Sons Inc.) (1999)].
  • the compound (I) having a desired functional group at a desired position can be obtained by appropriately combining the above methods and the like.
  • Isolation and purification of intermediates and products in the above production method are performed by appropriately combining methods used in ordinary organic synthesis, for example, filtration, extraction, washing, drying, concentration, crystallization, various types of mouth chromatography, etc. be able to. Purification methods commonly used in general parallel synthesis methods such as scavenger resin and ion exchange It can also be performed by a purification method using a replacement resin. In addition, the intermediate can be subjected to the next reaction without purification.
  • Some of the compounds (I) may exist as isomers such as positional isomers, geometric isomers, optical isomers or tautomers, but all possible isomers including these, and the isomers Mixtures in any ratio of can be used in the prophylactic and Z or therapeutic agents for asthma of the present invention.
  • salt of compound (I) When it is desired to obtain a salt of compound (I), if the salt of compound (I) is obtained, it may be purified as it is, and if compound (I) is obtained in a free form, the compound may be purified.
  • (I) may be dissolved or suspended in a suitable solvent, and then isolated and purified by adding an acid or a base.
  • Compound (I) or a pharmacologically acceptable salt thereof may be present in the form of an adduct with water or various solvents, and these adducts are also used in the prevention and / or prevention of asthma of the present invention. Or it can be used as a therapeutic agent.
  • Tables 1 to 13 show specific examples of the compound (I) used as a prophylactic and / or therapeutic agent for asthma of the present invention.
  • the range of compounds used is not limited to these compounds.
  • FIG. 1 shows the inhibitory effect of Compound 1 (intraperitoneal administration) on antigen-induced airway constriction.
  • the symbols (#, **) represent the following meanings, respectively.
  • FIG. 2 shows the inhibitory effect of compound 1 (oral administration) on antigen-induced airway constriction.
  • the symbols (#, #, *) mean the following, respectively.
  • FIG. 3 shows the inhibitory effect of compound 1 on antigen-induced airway hyperresponsiveness.
  • the sign (#) has the following meaning.
  • FIG. 4 shows the inhibitory effect of compound 1 on antigen-induced airway eosinophil infiltration ⁇
  • the symbols (# # #, * * *) mean the following, respectively.
  • Test example 1 GPR4 antagonism
  • the activity (antagonism) of the test compound was represented by an inhibition rate calculated based on the count (seconds) with and without the addition of 17-estradiol as shown in the following formula. IC 5.
  • the value was calculated from the inhibition rate by the linear approximation analysis of the Logit-Log conversion method.
  • A, B, and C represent the following meanings, respectively.
  • mice BALB / c male mice (7 weeks old) were mixed with 50 g ovalbumin and 1 mg aluminum hydroxide in a physiological saline solution (Otsuka Ishoku Injection, Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.). The mice were sensitized by intraperitoneal administration twice, and the last sensitization was carried out for 14 minutes. After 13 days, 18 days and 22 days later, 1% ovalbumin saline solution or saline solution (negative control group) was inhaled for 30 minutes each for antigen-antibody reaction. Evoked.
  • a physiological saline solution Otsuka Ishoku Injection, Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.
  • Each dose was orally administered once per kg (as a solution suspended in 0.5% aqueous methylcellulose solution).
  • a vehicle was administered to the positive control group instead of the test compound suspension.
  • oral administration was performed once one hour before antigen inhalation 14 days after the last sensitization, and intraperitoneal administration was performed once a final sensitization.
  • Vehicle was administered once 30 minutes before inhalation of antigen 14 days after immunization When airway hyperresponsiveness and eosinophil infiltration in the airway were measured, 14 days, 18 days, and 22 days after the last sensitization The vehicle was administered 1 hour before and 6 hours after each antigen inhalation).
  • the airway contraction reaction was measured for 30 minutes by measuring the airway resistance (penh) using a mouse respiratory function analyzer (BioSystem XA; Buxco Electronics, Inc., Sharon, CT, USA) for 30 minutes immediately after inhalation of the antigen 14 days after the last sensitization.
  • the area under the curve (AUC._ 3. nin) was evaluated by calculating the.
  • airway hyperresponsiveness and eosinophil infiltration in bronchoalveolar lavage fluid were evaluated 24 hours after the last antigen inhalation.
  • the airway hypersensitivity test was performed using a mouse respiratory function analyzer (BioSystem XA; Buxco Electronics, Inc.) to measure the airway response after inhalation of 1.5-25 mg / mL methacolin for 3 minutes (inhalation 24 hours after the last sensitization 22 days). , Sharon, CT, USA) and evaluated by calculating the area under the curve (AUC) from the mesacollin dose-airway response curve.
  • AUC area under the curve
  • eosinophil infiltration the total number of cells in the collected alveolar lavage fluid was measured using an automatic blood cell counter (Celltac ⁇ -6158; Nihon Kohden, Tokyo), and the smear was then transferred to Cytospin3 (Shandon, Inc., Pittsburgh). , PA, USA) and morphologically classified and evaluated under a microscope. Eosinophil count was calculated by multiplying the total cell count by the percentage of eosinophil cells. The test was performed with 10 animals per group.
  • FIG. 1 The results for airway constriction are shown in Fig. 1 (intraperitoneal administration) and Fig. 2 (oral administration), the results for airway hyperreactivity are shown in Fig. 3, and the results for airway eosinophil infiltration are shown in Fig. 4.
  • nin (19.61 ⁇ 0.75, mean soil standard error) is the AUC of the negative control group. _ 3 .
  • the AUC of airway hyperresponsiveness in the positive control group (335.13 ⁇ 52.6, mean soil standard error) was significantly increased compared to the AUC of the negative control group (184.7 ⁇ 27.5).
  • AUC of the 1 administration group was 243.23 ⁇ 48.7 And reduced airway hyperreactivity by 60% compared to the positive control group.
  • the AUC of the prednisodin-administered group was 269.12 ⁇ 46.7, which suppressed airway hyperreactivity by 43% compared to the positive control group.
  • Compound 1 administration group and Puredonizo port number of eosinophils in the emissions treatment group 10 5 each per individual 0.92 Sat 0. 26 X, 0. 76 was ⁇ 0. 25 x 10 5.
  • the medicament according to the present invention comprises a nitrogen-containing tricyclic compound represented by the formula (I) or a quaternary ammonium salt or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and a hydrate or a hydrate thereof. And a substance selected from the group consisting of solvates as an active ingredient.
  • the above-mentioned substance which is an active ingredient may be administered as it is, but generally, the above-mentioned substance which is an active ingredient and one or more additives for pharmaceutical preparations are used. It is desirable to administer it in the form of a pharmaceutical composition containing the same.
  • Such a pharmaceutical composition can be manufactured according to a method well known or commonly used in the field of pharmaceuticals.
  • the medicament according to the present invention in the form of a pharmaceutical composition may contain one or more active ingredients of another medicament.
  • the medicament of the present invention is applicable to mammals including human.
  • the administration route of the medicament of the present invention is not particularly limited, and the most effective administration route for treatment and / or prevention can be appropriately selected from either oral administration or parenteral administration such as intravenous administration.
  • preparations suitable for oral administration include, for example, tablets and the like, and examples of preparations suitable for parenteral administration include, for example, injections.
  • excipients such as lactose and mannite
  • disintegrants such as starch
  • lubricants such as magnesium stearate
  • binders such as hydroxypropyl cellulose; And the like
  • a surfactant such as glycerin; and the like.
  • preparations suitable for parenteral administration can be prepared preferably using an aqueous medium isotonic with human blood.
  • an injection is prepared as a solution, suspension or dispersion using an aqueous medium selected from a salt solution, a pudose solution, a mixture of salt water and a pudose solution together with appropriate auxiliaries according to a conventional method.
  • parenteral preparations for example, one or more selected from diluents, flavors, preservatives, excipients, disintegrants, lubricants, binders, surfactants, plasticizers, etc. Can also be used.
  • the dose and frequency of administration of the medicament of the present invention are not particularly limited, and the kind, administration route, purpose of treatment and prevention or prevention, the age and weight of the patient, the nature and severity of symptoms of the active ingredient are described above. It can be appropriately selected according to various conditions such as. For example, it is preferable to administer 0.1 to 100 mg / kg per adult daily in 3 to 4 divided doses. However, these dosages and the number of administrations vary depending on the various conditions described above. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the corresponding fumarate was prepared according to the following method.
  • Example 7 Compound 1 4 ⁇ 2_ (2,5-dihydropyro-l-1-1-methyl) -1 8 — (2-ethyl-5,7-dimethyl-3H-imidazo [4,5-b] pyridine-1 3— Synthesis of 1,11-dihidro-5H-dibenzo [b, f] azepine ⁇
  • Reference Example 8 Compound 15 ⁇ N- [8- (2-Ethyl-5,7-dimethyl-3H-imidazo [4,5-b] pyridin_3-ylmethyl) _10 , 11-Dihydro-5H-dibenzo [b, f] azepine-2-ylmethyl] -1-N-methylamino ⁇ acetic acid methyl ester
  • Reference Example 10 Compound 17 2— ⁇ N_ [8— (2-ethyl-5,7-dimethyl-3H-midazo [4,5-b] pyridin-3-ylmethinole) -1 10,11-dihydro-5H-dibenzo [b , F] azepine-12-ylmethyl] —N-methylamino ⁇ ethanol>
  • Lithium aluminum hydride (15.7 mg, 0.38 mmol) was suspended in tetrahydrofuran (0.3 mL) and cooled on ice.
  • Compound 15 (126 mg, 0.253 mmol) obtained in Reference Example 8 dissolved in tetrahydrofuran (0.9 mL) with stirring under stirring. Was added and stirred at room temperature for 1.5 hours.
  • Reference Example 11 1 Compound 1 8- (11- [8- (2-Ethyl-5,7-dimethyl_3H-imidazo [4,5-b] pyridin-3-3-inoremethinole) -1 10,11-Dihydro-5H-dibenzo [ Synthesis of b, f] azepine-2-ylmethyl] pyridine-14-yl ⁇ methanol> Compound 16 was used in the same manner as in Reference Example 10 except that compound 16 was used instead of compound 15 In%, compound 18 was obtained.
  • Reference Example 13 Compound 20 ⁇ 1— [8— (2-ethyl-5,7—dimethyl-3H—imidazo [4,5-b] pyridin-1-3-ylmethyl) -1,10,11 Synthesis of —dihydro 5H—dibenzo [b, f] azepine-12-ylmethyl] piperidine-14-force rubonic acid) Compound 16 was used in place of compound 15 in the same manner as in Reference Example 12. Compound 20 was obtained with a yield of 70%.
  • Reference Example l 4 Compound 21 ⁇ N- [8- (2-ethyl-5,7-dimethyl-3H-imidazo [ 4,5-b] pyridin-3- (inolemethinole) _ 10,11-dihydro-5H-dibenzo [b, f] azepine-12-ylmethinole] -N-methylamino ⁇ acetonitrinole Synthesis
  • 2-methoxypytilamine was used in place of 2- (pyrrolidine-1-yl) ethylamine, and N— [8— ( 2— 1,7-Dimethyl-3H-imidazo [4,5-b] pyridin-13-ylmethyl) -1 10,11-Dihydro 5H-dibenzo [b, f] azepin-2-ylmethyl] -1 N— ( 2-Methoxyxethyl) amine was obtained.
  • Compound 23 was obtained as a fumarate in the same manner as in Reference Example 1.
  • 2-tritinolone 21 ⁇ ⁇ -tetrazone-1-1-5-innometane-no-nore (2.00 g, 5.84 mmol), N-methino-le-2-2-to-open-mouth benzenesnorrenamide (1.64 g, 7.59) mmol) and triphenylinolephosphine (1.53 g, 5.84 mmol) were dissolved in a mixed solvent of tetrahydrofuran (30 mL) and toluene (20 mL), and a solution of dimethyl diazodicarboxylate (40%, 2.65 mL) was added. , 5.84 mmol) and stirred at room temperature overnight.
  • Reference Example 30 Compound 9 9 ⁇ 2-benzyloxymethinolate 8 -— (2-ethyl-5,7) —Dimethinolay 3H—Imidazo [4,5-b] pyridin-3- (ylmethinole) -1-10,11—dihydro_5H—Dibenzo [b, f] azepine ⁇
  • Compound 100 was obtained in a yield of 38% in the same manner as in Reference Example 25 using 2-phenylethanol in place of methanol.
  • Example 35 Compound 1 0 4 ⁇ 2- (2-Ethyl-5,7-dimethyl-3H-imidazo [4,5-b] pyridine-1-3-ylmethinole) -1 8— (2H-te 5-yl) Synthesis of 10,11-dihydro 5H-dibenzo [b, f] azepine ⁇
  • Reference Example 3 8 Compound 10 7 ⁇ [8- (2-Ethyl_5,7-Dimethyl-3H-imidazo [4,5-b] pyridin-13-ylmethyl) -1 10,11 Dihydro 511-dibenzo [b, f] azepine-12-yl] acetic acid ⁇
  • Reference Example 39 Compound 108 [[8- (2-Ethyl-5,7-dimethyl-3H-imidazo [4,5-b] pyridin-1 3— Synthesis of 10-, 11-dihydro-5H-dibenzo [b, f] azepine-12-inolemethylsnolephanyl] acetic acid methyl ester (lmethyl))
  • Compound 13 obtained in Reference Example 6 (1.04 g, 1.71 mmol) was dissolved in chloroform (17 mL), and methylesterenolate mercaptoacetate (0.199 mL, 2.23 mmol) and 1,8-diazavicic mouth [5,4,0] indene (0.384 mL, 2.57 mmol) and stirred at 40 ° C for 7 hours.
  • the acetic acid (10,11-dihydro-5H-dibenzo [b, f] azepine-12-ylmethyl) estenole (2.85 g, 10.7 mmol) obtained in Step 1 was suspended in methanol (110 mL), and the sodium methoxide was added. Toxide / methanol solution (38%, 1.14 mL, 5.36 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. The reaction solution was concentrated, and the residue was added with saturated saline and black form, and extracted three times with black form. Combine the organic layers, The extract was dried over anhydrous magnesium sulfate and concentrated.
  • 10,11-Dihydro-5H-dibenzo [b, f] azepine-1-2-force obtained in step 5 was combined with ethinolestaine olevonate (443 mg, 1.66 mmol) in chlorofonolem (8.3 mL) and acetic acid. (8.3 mL), mixed with piperidine (0.573 mL, 5.80 mmol) and paraformaldehyde (149 mg, 4.97 mmol), heated to 60 ° C, and stirred for 1.5 days. The reaction solution was concentrated, ethyl acetate and saturated aqueous sodium hydrogen carbonate were added to the residue, and the mixture was extracted with ethyl acetate.
  • the reaction solution was diluted with ethyl acetate, washed sequentially with ice, water, and saturated saline, dried over anhydrous magnesium sulfate, and concentrated.
  • the residue was purified by gel chromatography on silica gel (eluent: methanol / form: 1/99), and the fraction containing the target compound was concentrated. Getyl ether was added to the residue, and the mixture was stirred under heating and refluxing conditions for 0.5 hour and then at room temperature for 1 hour. The precipitated crystals were collected by filtration to give Compound 110.
  • Reference Example 45 5 Compound 1 1 4 ⁇ [8— (2-ethyl 5,7-Dimethyl-3H-midazo [4,5-b] pyridin-3-ylmethyl-1-10,11-dihydro 5H-dibenzo [b, f] azepine 1-2-yl ] (4-Hydroxypyridino) methanone ⁇
  • Reference Example 4 7 Compound 1 16 ⁇ 8- (2-Ethyl-5,7-dimethyl-3H-imidazo [4,5-b] pyridin-1-ylmethyl)-10 , 11—Dihydro-5H-divenzo [b, f] azepine-12-carburonic acid [2- (pyrrolidine-11-yl) ethyl] amide]
  • Reference Example 20 1- [8- (2-Ethyl-5,7-dimethyl-3 ⁇ -imidazo [4,5-b] pyridin-13-ylmethinole) -1 10,11 obtained from Reference Example 10 Using 5H-dibenzo [b, f] azepine-12-ylmethyl] piperidine-14-carbotrile in the same manner as in Step 1 of Reference Example 52, a yield of 92% was obtained.
  • Reference Example 54 Compound 1 2 3 ⁇ 1-1-1 [8- (2-ethyl- 5,7-Dimethyl-13H-imidazo [4,5-b] pyridin-3-ylmethinole) -5-methyl-10,11-dihydro-5H-dibenzo [b, f] azepine-1 Synthesis of pyrimidine] piperidine
  • Reference Example 5 7 Compound 9 1 ⁇ 1,4-bis [4- (3- Benzylamino) -6-cyclopropylcarbonyl_7,8-dihydro-5H-pyrido [4,3-d] pyrimidin-2-yl] pyrazine ⁇
  • the compound (F) (5.0 g, 13.3 mmol) obtained in Step 5 was dissolved in dioxane (100 mL), and tert-butyl-1-piperazinecarboxylate (4.9 g> 2 equivalents) and sodium carbonate (14.0 g , 10 equivalents) and stirred at 90 ° C for 3 days.
  • the obtained reaction solution was filtered to remove sodium carbonate, and the filtrate was extracted with water and quenched form, and the organic layer was dried over magnesium sulfate. After evaporating the solvent, a mixed solvent of hexane / ethyl acetate (3: 1) was added to the residue, and the suspension was stirred for 1 hour. Thereafter, the precipitated crystals were collected by filtration and dried under reduced pressure to obtain Compound (G) (6.4 g, yield 92%).
  • Gal4-ER chimera gene [Cellen, Vol. 54, p. 199 (1988), Proc. I. Dender's Op. The National. Academy. Op. Science 'Ob' The Unites de St. Op. Acer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), vol. 90, p. 1657 (1993)] containing ER a AF2 in pM (distributed by Shigeaki Kato of the University of Tokyo) by Aatll and Ndel. After cleavage, the fragment was treated with Klenow to obtain an Aatll (blunt end) -Ndel (blunt end) fragment.
  • Plasmids were ligated by joining the (blunt-end) _g £ _RI (blunt-end) fragment from pSV2bsr and the ⁇ 11 (blunt-end) -Ndel (blunt-end) fragment from ERo; AF2 in pM described above.
  • pGERbsrR2 was constructed.
  • pGERbsrR2 is a yeast
  • Gal4-ER chimeric protein
  • pAMoERC3Sc Japanese Unexamined Patent Publication No. 05-336963 was digested with Xhol and Nsil, followed by Klenow treatment to obtain a 2.2 kb 3 ⁇ 41 (blunt end) (blunt end) fragment containing the oriP sequence.
  • plasmid pcDNA3-oriP was constructed.
  • pcDNA3-oriP was cut with Xhol and Hindlll to obtain Xhol-Hindlll fragment.
  • pSE01uc2 (W098 / 14474) was digested with Xhol and Ncol, and treated with Klenow to obtain a ⁇ I (blunt end) -Ncol (blunt end) fragment containing the ampicillin resistance gene. By ligating the fragments, a plasmid pASdl-lucl was constructed. After cutting pASdl-lucl with Xhol and Hindlll, a 0.1 kb Xhol-Hindlll fragment was obtained.
  • the Xhol-Hindlll fragment derived from pcDNA3-oriP and the Xhol-Hindlll fragment derived from pASdl-lucl were ligated to form plasmid pcDNA3-oriP-Sdl.
  • pcDNA3-oriP-Sdl was digested with Xhol and Kpnl to obtain an Xhol-Kpnl fragment.
  • Four types of DNAs having the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3, and 4 were synthesized using a DNA synthesizer. The synthetic DNA is mixed and annealed to form a double-stranded DNA having a poly-A-added signal. Each of the synthetic DNAs was
  • Plasmid pcDNA3-oriP-Sdl-pA was constructed by binding the double-stranded DNA to an Xhol-Kpnl fragment derived from pcDNA3-oriP-Sdl.
  • pcDNA3-oriP-Sdl One pA was cut with ⁇ I, and then treated with Klenow to obtain a 1 (blunt end) fragment.
  • pFR-luc manufactured by Stratagene
  • was digested with Hindlll and BamHI it was treated with Klenow to obtain a 0.14 kb iil ⁇ dlll (blunt-ended) ⁇ HI (blunt-ended) fragment.
  • pAGalSdl contains a promoter having a sequence obtained by repeating Gal4p response element (UASG) five times. After pAGalSdl was digested with EcoRI, it was treated with Klenow to obtain an EcoRI (blunt end) fragment.
  • pSE01uc2 (098/14474) was digested with Hindlll and Sacl and treated with Klenow to obtain a 1.7 kb Hindlll (blunt end) — ⁇ 1 (blunt end) fragment containing the firefly luciferase gene.
  • Plasmid pAGalSd to luc was constructed by combining the above-mentioned iLdlll (blunt-end) 1 ⁇ I (blunt-end) fragment derived from pSE01uc2 and the ⁇ RI (blunt-ended) fragment derived from pAGalSdl.
  • Virus oriP was cleaved with Hindlll and Sacl, was acquired with Hindlll- Sacl fragment of 6.9kb including oriP.
  • pAMo-d a JP 2001-211885) was digested with Hindlll and Sacl, were obtained HindIII_SacI fragment containing the tetracycline resistance gene (Tc R).
  • Hindlll -Sacl fragment Hindlll- Sacl fragments, and origin pAMo-d from the above P AGal9-luc plasmid the firefly 'Rushifu Eraze gene portion in pAGal9_luc replaced with Stuffer sequences pAMo-d P AGal9_d was created.
  • pAGa! 9-luc was digested with Hindlll and Sacl to obtain a Hindlll -Sacl fragment of 6.9 kb.
  • Hindlll-Sacl fragment derived from pAGal9-luc and pAMo-nd Hindlll- by combining Sacl fragment, pAGAL 9 - firefly Rushifu Weraze gene portion in luc was constructed a plasmid pAGal9-nd was replaced with Stuffer sequences pAMo-nd.
  • Namalwa KJM-1 cells are serum-free adapted B cell lines that express the EBNA-1 gene.
  • the transformant cells the RPMI1640.ITPSG medium [RPMI1640 medium 8 ml (Nissui Pharmaceutical), 1/40 volume of 7.5 0/0 NaHC0 3, 3 % 200mmol / LL- Gunoretamin soluble ⁇ night (a down-bi 0.5% penicillin. Streptomycin solution (Invitrogen, 5,000 units / ml penicillin, 5,000 g / ml streptomycin), 10ramol / L N_2-H Droxityl piperazine- ⁇ '- 2-ethanesulfonic acid
  • Induced expression plasmid of firefly luciferase in each transformant pAGalSdl-luc was introduced by an electroporation method and cultured for 2 days. After the culture, estradiol (ESS 75 : manufactured by Sigma) (final concentration: lOnmol / L) was added, and after further culturing for 24 hours, the firefly luciferase activity was measured.
  • estradiol ESS 75 : manufactured by Sigma
  • a substrate solution [25 mmol / L Guji Shinoreguji Shin (pH7.8), 15 mmol / L MgS0 4, 5
  • pACREpluc a reporter plasmid capable of expressing the firefly luciferase gene under the control of the cAMP response element (CRE), was constructed by the following method.
  • pACREpluc has a hygromycin resistance gene and an oriP of Epstein's B. inores.
  • a Clal-Mlul fragment was obtained.
  • the ClaI- ⁇ fragment derived from pAMo and the Clal-Mlul fragment derived from pAGE248 were ligated to construct a plasmid pAMoh.
  • ⁇ I-I Hindlll fragment containing the hygromycin resistance gene was obtained.
  • pAGal9-luc was cut with Sail and Hindlll to obtain a Sail-Hindlll fragment containing oriP and Gal4UAS.
  • Plasmid pAGal9h was constructed by combining the Sail-Hindlll fragment derived from pAGal9-luc and the Xhol-Hindlll fragment derived from pAMoh described above.
  • pBluescriptll KS + (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) is cleaved with Sail and Xhol, followed by dephosphorylation using phosphatase (Alkaline Phosphatase E. coli C75, manufactured by Takara Shuzo), and a Sail-Xhol fragment containing the ampicillin resistance gene was obtained.
  • a double-stranded DNA containing two CRE sequences was prepared by annealing synthetic oligonucleotides having the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 5 and 6.
  • pBS-CREI is a plasmid in which the double-stranded DNA is integrated in a direction in which the ⁇ ⁇ 11 cleavage site and the ⁇ I cleavage site are regenerated, and each has one of the above-mentioned cleavage sites.
  • Seal-Xhol fragment was obtained.
  • pBS-CREI was cut with Seal and Sail to obtain a Seal-Sail fragment containing ColEl ori.
  • the pBS-CREI-derived Seat Xhol fragment and the Seat Sail fragment were ligated to construct pBS-CREII containing four CRE sequences.
  • Scal-Xhol fragment was obtained.
  • pBS-CREII was cut with Seal and Sail to obtain a Sea Sail fragment containing ColEl ori.
  • the pBS-CREII-derived Seat Xhol fragment and Seal-Sail fragment were ligated to construct pBS-CREIV containing eight CRE sequences. Cleavage pBS-CREIV with Seal and Xhol, containing ori of phage ⁇
  • Seal-Xhol fragment was obtained.
  • pBS- was cleaved with Seal and Sail to obtain a Seal-Sail fragment containing ColEl ori.
  • the pBS-CREIV-derived Seat Xhol fragment and the Seal-Sail fragment were ligated to construct pBS-CREVIII containing 16 CRE sequences.
  • the pBS-CREVIII was digested with Xhol, treated with Klenow, and digested with Hindlll to obtain a ⁇ dlll-1 (blunt-ended) fragment containing 16 CREs.
  • pAGalSdl was cut with Mlul and Hindlll to obtain a 1. kb Mlul-Hindlll fragment.
  • pAGal9-luc was digested with Xhol and otl to obtain an Xhol-Notl fragment containing the firefly luciferase gene.
  • pACREh was cut with Xhol and otl to contain the CRE sequence — a Notl fragment was obtained.
  • Plasmid pACREluc was constructed by joining the Xhol-Notl fragment derived from pAGal9-luc and the Xhol-Notl fragment derived from pACREh.
  • pACREluc is digested with Hindlll, treated with Klenow, and further digested with Xhol, so that Hindlll (blunt end) -Xhol fragment containing CRE and iii ⁇ dlll (blunt end) I ⁇ I fragment containing firefly luciferase gene Were obtained.
  • Hindlll (blunt end) -Xhol fragments derived from pACREluc a plasmid pACRElucH in which the ndlll site upstream of the CRE sequence in pACREluc had disappeared was constructed.
  • the pGL3-Enhancer vector (Promega) was cut with Hindlll and Hpal to obtain a Hindlll-Hpal fragment containing the luc + gene (modified firefly luciferase gene).
  • pACRElucH was cut with otl, treated with Klenow, and further cut with Hindlll to obtain a Hindi II-Notl (blunt end) fragment containing CRE.
  • a plasmid pACREpluc was constructed by ligating a Hindlll-Hpal fragment derived from the pGL3-Enhancer vector and a Hindlll-Notl (blunt end) fragment derived from pACRElucH.
  • Reference Example 60 Construction of GPR4-induced expression plasmid
  • Single-stranded cDNA was synthesized by the First-Strand Synthesis System for RT-PCR (manufactured by Gipco). Using a solution 5/1 obtained by diluting the single-stranded cDNA O-fold with water as type III, and using a synthetic DNA having the sequence shown in SEQ ID NOs: 7 and 8 as a GPR4 gene-specific primer, PCR was performed. As a result, GPR4 cDNA was obtained.
  • the sequence of the GPR4 gene-specific primer is based on the sequence information of the GPR4 gene (GenBatik accession number: U21051). Designed.
  • PfuTurbo DNA Polymerase (Stratagene) was used.
  • a 10-fold concentration buffer added to the enzyme to be used was used as a buffer for performing PCR.
  • PCR was performed using a thermal cycler DNA engine (manufactured by MJ Research) at 95 ° C for 5 minutes, followed by a reaction consisting of 94 ° C for 1 minute, 60 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 1 minute. Was performed by performing 30 cycles.
  • the amplified GPR4 cDNA fragment was cut with Hindlll and NotI, which cut the sequence designed on the primer.
  • the fragment containing GPR4 cDNA was recovered by agarose gel electrophoresis.
  • GPR4-induced expression plasmid pAGal9-GPR4 was constructed by incorporating the cleaved fragment into Hindlll-NotI of plasmid pAGal9-nd.
  • nucleotide sequence was determined using a DNA Sequencer 377 from Perkin-Elma and a reaction kit (ABI Prism TM BigDye TM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit: Applied Biosystems).
  • GPR4-induced expression plasmid pAGal9-GPR4 (2 ⁇ g) and reporter plasmid KpACREpluc (2 ⁇ g) were co-transfected into KJMGER8 of 6 ⁇ 10 6 cells by the above electroporation method.
  • Nigoshi Suspend the transformant strain RPMI1640'ITPSG medium 8 ml, in C0 2 incubator primary, cultured for 24 hours at 37 ° C. After cultivation, add plasticidin S (2.0 ⁇ g / ml), hygromycin B (300/2 g / ml) and dieneticin (500 g / ml), and further cultivate for 14 days. (Referred to as GPR4 Atsushi cells).
  • the transformant was transformed with plasticidin S (2.0 ⁇ g / ml), hygromycin ⁇ (300 ⁇ g / ml) and dieteticin (500 ⁇ g / ml). ( ⁇ g / ml) in RPMI1640-ITPSG medium.
  • control plasmid pAGal9-nd (2 ⁇ g) and reporter plasmid pACREpluc (2 Atg) were co-transfected into KJMGER8 to obtain a stable transformant (referred to as a control cell).
  • Reference Example 62 Cloning of DNA encoding human GPR4 homolog from mouse
  • polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 was a mouse human GPR4 homolog (mouse GPR4).
  • the DNA encoding mouse GPR4 is an oligonucleotide that can be designed and synthesized based on the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 14, using a mouse cDNA library that can be prepared for sale or by a known method, as type III. Can be obtained by PCR used for the primer set.
  • thermal cycler PTO200 manufactured by MJ Research
  • heat at 95 ° C for 10 minutes, and then process at 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 1 minute as one cycle. After 30 cycles, the mixture was further heated at 72 ° C for 5 minutes.
  • Plasmid pT7RG was obtained by a conventional method from a transformant obtained by transforming Escherichia coli JM109 strain using the obtained recombinant plasmid DNA. As a result of determining the entire nucleotide sequence of plasmid pT7RG, it was found that PT7RG contained a cDNA of about 1.1 kb having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18.
  • SEQ ID NO: 17 shows the amino acid sequence of the polypeptide encoded by the DNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18.
  • the amino acid sequence of human and mouse GPR4 was compared with the amino acid sequence of human and mouse GPR4 using an analysis program [GENETYX f IN ver. 5.0 (manufactured by Softea)] to find that the amino acid sequence was 93.0% and 99.2%, respectively. A% match was found.
  • Example 1 Tablet A tablet having the following composition is prepared by a conventional method. Formulation Compound 1 20 mg
  • a prophylactic and / or therapeutic agent for asthma containing, as an active ingredient, a substance that inhibits the function related to GPR4 signal transduction, and a nitrogen-containing tricyclic compound or a quaternary ammonium salt thereof or
  • the present invention provides a prophylactic and / or therapeutic agent for asthma containing such a pharmacologically acceptable salt as an active ingredient.
  • SEQ ID NO: 2 Description of artificial sequence: synthetic DNA SEQ ID No. 3—Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA SEQ ID No. 4—Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA SEQ ID No. 5—Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA SEQ ID No. 6—Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA SEQ ID No. 7—Artificial Sequence Description: Synthetic DNA SEQ ID No. 8—Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA SEQ ID No. 9—Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA SEQ ID No. 10—Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA SEQ ID No. 15—Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA SEQ ID NO: 16—Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA

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Description

明 細 書
喘息の予防おょぴノまたは治療剤
技術分野
本発明は、 GPR4 のシグナル伝達に関する機能を抑制する物質を有効成分 と して含有する喘息の予防おょぴノまたは治療剤に関する。 また本発明は、 含窒素三環式化合物もしくはその四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学 的に許容される塩を有効成分と して含有する喘息の予防および/または治 療剤に関する。
背景技術
気管支喘息は気道狭窄と気道過敏性亢進を主な特徴とする炎症性疾患で ある。 現在、 吸入ステロイ ド薬、 /3刺激薬ゃキサンチン系薬物等の気管支拡 張薬、抗ロイコ トリエン薬に代表される抗アレルギー薬の組み合わせにより、 喘息の日常管理は十分行うことができるとされている。 しかし、 治療に主と して使用されるステロイ ド薬には副作用があること、ステロイ ド抵抗性や難 治性の患者も存在すること力ゝら、新しい作用機序を有する副作用の少ない治 療剤が求められている。
G蛋白質共役型レセプター蛋白質 （以下、 GPCR と略す） である GPR4につ いては、肺に高発現していることが知られている [ゲノミクス （Genomi c s：)、 30卷、 84- 88頁 （ 1995年）]。 また、 GPR4 は、 脂質であるスフイ ンゴシルホ スホ リ ルコ リ ン ( SPC) ゃリゾホスファチジルコ リ ン ( LPC) と結合し、 シグ ナルを伝達することが報告されている [ジャーナル'ォブ'バイォロジカル · ケミ ス ト リ ー ( J. Bi ol. Chem. )、 276卷、 1325-41335 W ( 2001年）]。 SPC については、 TNF- α産生および ICAM - 1 発現を誘導することが報告され [ジ ャ―ナノレ · ォプ · インべスティゲイティブ · ダーマ ト ロジ一 ( J. Inves t. Dermato l . )、 112卷、 91- 96頁 （1999年）]、 皮膚疾患等のアレルギー性疾患 への関与が示唆されている。 LPCについては、 単球の遊走 [サーキユレーシ ヨ ン . リサーチ （c i r. Res. )、 84卷、 52- 59頁 （2000年）] や内皮細胞での 接着分子の発現 [ジャーナル ·オフ'、 · ク リ二カル ·ィンべスティゲーシ 3ン ( J. Cl in. Inve st . ) , 90卷、 1138-1144頁 （1992年）]、 マク ロ ファージ活 性化 [ジャーナル · ォブ 'ィムノロジー （J. Immunol. ) , 147 卷、 273 - 280 確認用写！ 頁 （1991年）] 等に関与し、 炎症に関与していることが報告されている。 ま た、 LPCについては喘息患者の血漿中で増加していること [ク リ二カル · サ ィエンス （Clinic. Science), 97卷、 595- 601頁 （1999年）] やア レルギー 患者の抗原チヤレンジ後の肺胞洗浄液中で増加すること [ジャーナル · ォ ブ . ェクスペリメ ンタル ' メデイ シン し丁. Exp. Med.)、 183卷、 2235-2245 頁 （1996年）] が報告されている。 LPC産生を抑制するコリ ンの投与が喘息 患者に効果を示したという報告もある [インディアン · ジャーナル ·ォブ · チェス ト 'デイ ジ一ズ .アン ド 'ァライ ド 'サイエンス （Indian J. Chest Dis. Allied Sci. )、 39卷、 149—156頁 （1997年）]。 し力 し、 SPC、 LPCともに GPR4 以外に 0GR- 1 [ネイチヤー · セル ·パイォロジー （Nat. Cell Biol. )、 2卷、 261-267 M (2000年）] や G2A [サイエンス (Science) , 293卷、 702 - 705頁 (2001 年）] 等にも結合することが知られており、 これらの作用が GPR4 を 介した作用であるかどうかについては知られていない。
GPCR には、 細胞内で過剰に発現すると、 リガンドが存在しなくてもシグ ナルを流す、 構成活性型 GPCRと呼ばれる GPCRが知られている。 リガンド非 存在時に流れるシグナルは構成的活性と呼ばれる。 構成活性型 GPCR には、 天然に存在するものと、 アミノ酸の置換、 欠失などの変異を導入することに よ り 造成された変異 GPCR [モ レキュ ラ ー ' フ ア ルマコ ロジー （Mol. Pharmacol. ) , 57卷、 890頁 （2000年）、 W098/46995] 力 ある。 GPCR の構成 的活性を抑制するアンタゴニス トはインバースァゴニス トと呼ばれる。
また、文献 [ブレチン ·デ ·ラ -ソシェテ ·シミ ック (Bulletin de la Societe Chimique) , 185頁 （1981年） およびョ一口ピアン ' ジャーナノレ ' ォプ ' メ ディシナル . ケミス ト リー （Eur. J. Med. Chem. ) , 12卷、 219頁 （1977年）] に、 後述の式 （I) において R1がモルホリ ノを表し、 、 R3および が水素 を表し、 Υに相当する置換基がモルホリノであり、 ηが 1であり、 Xが-（C )2- を表す化合物が開示されている。
発明の開示
本発明の目的は、 GPR4 のシグナル伝達に関する機能を抑制する物質を有 効成分として含有する喘息の予防および または治療剤を提供すること、お よび含窒素三環式化合物もしくはその四級アンモニゥム塩またはそれらの薬 理学的に許容される塩を有効成分と して含有する喘息の予防および/または 治療剤を提供することである。
すなわち、 本発明は、 以下の（ 1 )〜（ 8 )に関する。
( 1 )配列番号 1 1記載のアミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関 する機能を抑制する物質を有効成分と して含有する喘息の予防およびノま たは治療剤。
( 2 ) 以下の 1 ) 〜 4 )
1 )配列番号 1 2記載の塩基配列から選ばれる連続した 5〜 6 0塩基からな るオリ ゴヌク レオチドの相捕的配列を有するォリ ゴヌクレオチドまたは該 オリ ゴヌク レオチ ド誘導体、
2 )配列番号 1 4記載の塩基配列から選ばれる連続した 5〜 6 0塩基からな るオリ ゴヌク レオチドの相捕的配列を有するオリ ゴヌクレオチドまたは該 才リ ゴヌク レオチ ド誘導体、
3 )配列番号 1 8記載の塩基配列から選ばれる連続した 5〜 6 0塩基からな るオリ ゴヌク レオチドの相捕的配列を有するォリ ゴヌクレオチドまたは該 オリ ゴヌク レオチ ド誘導体、
4 ) 配列番号 1 2、 1 4および 1 8から選ばれるいずれか一つに記載の塩基 配列を有する DNA とス トリンジェントな条件下でハィブリダイズし、かつ配 列番号 1 1記載のアミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関する機 能を抑制する 5〜 6 0塩基からなるオリ ゴヌクレオチドまたは該ォリ ゴヌ クレオチド誘導体、 '
のいずれか一つを有効成分として含有する喘息の予防および/または治療 剤。
( 3 ) 以下の 1 ) 〜 4 )
1 ) 配列番号 1 1記載のアミノ酸配列を有する蛋白質を認識する抗体、
2 ) 配列番号 1 3記載のアミノ酸配列を有する蛋白質を認識する抗体、
3 ) 配列番号 1 7記載のアミノ酸配列を有する蛋白質を認識する抗体、
4 ) 配列番号 1 1、 1 3および 1 7から選ばれるいずれか一つに記載のァミ ノ酸配列において一つ以上のァミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸 配列を有し、かつ配列番号 1 1記載のァミノ酸配列を有する蛋白質のシグナ ル伝達に関する機能を有する蛋白質を認識する抗体、
のいずれか一つを有効成分と して含有する喘息の予防および/または治療 剤。
( 4 ) 式 （I )
Figure imgf000007_0001
[式中、 R1は置換もしくは非置換の複素環基、 - NR5R6 (式中、 R5および R6は 同一または異なって水素、 置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換も しく は非置換のシク口アルキル、 置換もしくは非置換の低級アルケニル、 置換も しくは非置換の低級アルキニル、 置換もしくは非置換のァラルキル、 または 置換もしくは非置換の複素環アルキルを表すか、 R5および R6が隣接する窒 素原子と一緒になつて置換もしくは非置換の複素環基を形成する）、 -OR7 (式 中、 R7 は水素、 置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換も しくは非置換の 低級アル力ノィル、 置換もしくは非置換のシク口アルキル、 置換もしくは非 置換の低級アルケニル、 置換もしくは非置換の低級アルキニル、 置換もしく は非置換のァリール、 置換もしくは非置換のァラルキル、 または置換もしく は非置換の複素環アルキルを表す）、- SR7a (式中、 R7aは前記 R7と同義である）、 -C0NR5aR6a (式中、 R5aおよび R6aはそれぞれ前記 R5および前記 R6と同義であ る）、 -C02R7b (式中、 R7bは前記 R7と同義である）、 -N+R5bR6bR8 (式中、 R5bお よび R6bはそれぞれ前記 R5および前記 R6と同義であり、 R8は低級アルキル、 低級アルケニル、 またはァラルキルを表す）、 ホノレミル、 力ルポキシ、 また はシァノを表し、
R2は水素、 置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしく は非置換のシク 口アルキル、 置換も しくは非置換の低級アルケニル、 置換も しくは非置換の 低級アルキニル、 置換もしくは非置換のァラルキル、 または置換もしくは非 置換の複素環アルキルを表し、
R3および は同一または異なって水素、 低級アルキル、 またはハロゲンを 表し、
nは 0または 1 を表し、
Xは-（CH2) 2_または- CH=CH-を表し.
Yは式 （I I )
Figure imgf000008_0001
(式中、 Wは CHまたは窒素原子を表し、
Z1および Z2は同一または異なって水素、 置換も しくは非置換の低級アルキ ル、 置換もしくは非置換のシク口アルキル、 置換もしく は非置換の低級アル ケニル、 置換もしく は非置換の低級アルキニル、 置換もしく は非置換のァリ ール、 置換もしくは非置換のァラルキル、 または置換もしくは非置換の複素 環アルキルを表すか、 Z1および Z2がそれぞれ隣接する 2つの炭素原子と一 緒になって置換も しく は非置換の芳香環または置換もしく は非置換の複素 環を形成し、
Z3は水素、 置換もしく は非置換の低級アルキル、 置換もしく は非置換のシク 口アルキル、 置換もしくは非置換の低級アルケニル、 置換もしくは非置換の 低級アルキニル、 置換もしく は非置換のァリール、 置換もしくは非置換の複 素環基、 置換もしくは非置換のァラルキル、 または置換もしくは非置換の複 素環アルキルを表す） を表す] で表される含窒素三環式化合物もしくはその 四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩を有効成分と して含有する喘息の予防および Zまたは治療剤。
( 5 ) R1が- NR5R6であり、 R5および R6が隣接する窒素原子と一緒になつて置 換もしくは非置換の複秦環基を形成する第 （4 ) 項に記載の喘息の予防およ び Zまたは治療剤。
( 6 ) R2が水素である第 （4 ) 項または第 （ 5 ) 項に記載の喘息の予防およ びノまたは治療剤。
( 7 ) R3および が水素である第 （4 ) 項〜第 （ 6 ) 項のいずれかに記載 の喘息の予防および/または治療剤。
( 8 ) Z1および Z2がそれぞれ隣接する 2.つの炭素原子と一緒になつて置換 もしくは非置換の複素環を形成する第 （4 ) 項〜第 （ 7 ) 項のいずれかに記 載の喘息の予防および/または治療剤。
( 9 ) 第 （4 ) 項〜第 （ 8 ) 項のいずれかに記載の含窒素三環式化合物もし く はその四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩の有 効量を投与することを特徴とする、 喘息の予防およびノまたは治療方法。
( 1 0 )喘息の予防および/または治療剤の製造のための第（ 4 )項〜第（ 8 ) 項のいずれかに記載の含窒素三環式化合物も しく はその四級アンモ-ゥム 塩またはそれらの薬理学的に許容される塩の使用。
さらに本発明は以下の （ 1 1 ) 〜 （ 2 3 ) に関する。
( 1 1 ) 式 （I)
Figure imgf000009_0001
(式中、 n、 R R2、 R3、 R Xおよび Yはそれぞれ前記と同義である） で表される含窒素三環式化合物もしくはその四級アンモニゥム塩またはそ れらの薬理学的に許容される塩。
( 1 2 ) R1が- NR5R6であり、 R5および R6が隣接する窒素原子と一緒になつて 置換もしくは非置換の複素環基を形成する第 （ 1 1 ) 項に記載の含窒素三環 式化合物もしくはその四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学的に許容 される塩。
( 1 3 ) が水素である第 （ 1 1 ) 項もしくは第 （ 1 2 ) 項に記載の含窒素 三環式化合物もしく はその四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学的に 許容される塩。
( 1 4 ) R3および R4が水素である第 （ 1 1 ) 項〜第 （ 1 3 ) 項のいずれか に記載の含窒素 Ξ環式化合物も しく はその四級アンモ-ゥム塩またはそれ らの薬理学的に許容される塩。 ( 1 5 ) Z1および Z2がそれぞれ隣接する 2つの炭素原子と一緒になつて置 換もしくは非置換の複素環を形成する第 （ 1 1 ) 項〜第 （ 1 4 ) 項のいずれ かに記載の含窒素三環式化合物もしく はその四級アンモニゥム塩またはそ れらの薬理学的に許容される塩。
( 1 6 ) 第 （ 1 1 ) 項〜第 （ 1 5 ) 項のいずれかに記載の含窒素三環式化合 物もしく はその四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学的に許容される 塩を有効成分として含有する医薬。
( 1 7 ) 第 （ 1 1 ) 項〜第 （ 1 5 ) 項のいずれかに記載の含窒素三環式化合物 もしくはその四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩を有 効成分として含有する配列番号 1 1記載のァミノ酸配列を有する蛋白質のシグ ナル伝達に関する機能の抑制剤。
( 1 8 )配列番号 1 1記載のアミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に 関する機能を抑制する物質の治療有効量を投与することを特徴とする、 喘息 の予防おょぴ または治療方法。
( 1 9 ) 第 （ 2 ) 項に記載の 1 ) 〜 4 ) のいずれか一つのォリ ゴヌクレオチ ドまたは該ォリ ゴヌクレオチド誘導体の治療有効量を投与することを特徴と する、 喘息の予防おょぴノまたは治療方法。
( 2 0 ) 第 （ 3 ) 項に記載の 1 ) ~ 4 ) のいずれか一つの抗体の治療有効量 を投与することを特徴とする、 喘息の予防およびノまたは治療方法。
( 2 1 ) 喘息の予防おょぴノまたは治療剤の製造のための、 配列番号 1 1記 載のァミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関する機能を抑制する 物質の使用。
( 2 2 ) 喘息の予防およびノまたは治療剤の製造のための、 第 （ 2 ) 項に記 載の 1 ) 〜 4 ) のいずれか一つのオリゴヌクレオチドまたは該オリ ゴヌク レ ォチド誘導体の使用。
( 2 3 ) 喘息の予防および/"または治療剤の製造のための、 第 （ 3 ) 項に記 載の 1 ) 〜 4 ) のいずれか一つの抗体の使用。
すなわち、 本発明により、 第 （ 1 1 ) 項〜第 （ 1 5 ) 項に記載される新規 な含窒素三環式化合物もしくはその四級アンモ-ゥム塩またはそれらの薬 理学的に許容される塩が提供され、 それらを有効成分と して含有する医薬、 および配列番号 1 1記載のァミ ノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に 関する機能の抑制剤が提供される。
本発明者らは、 GPCRである GPR4の有するシグナル伝達に関する機能を抑 制する物質が、喘息の予防および Zまたは治療に有効であるとの新知見を見 い出し、 本発明を完成するに至った。 また、 本発明者らは、 構成活性型の GPCRである GPR4の構成的活性を抑制する物質の探索を行い、 GPR4の構成的 活性を抑制する物質が、喘息の予防おょぴ または治療に有効であることを 見い出した。
GPR4 の有するシグナル伝達に関する機能を抑制する物質と しては、 GPR4 自身の発現を阻害または抑制する物質、 リガンドの GPR4への結合を阻害す る物質、 GPR4へのリガンド結合により生ずるシグナル伝達 [例えば、 細胞内 cAMP 濃度の変化 （上昇または低下）,、 細胞内 Ca2+濃度の変化 （上昇）、 mi togen— activated prote in (MAP)キナーゼのリ ン酸ィ匕等力《含まれる]を抑 $lj する物質、 GPR4の構成的活性によ り生ずるシグナル伝達を抑制する物質（例 えば GPR4 のイ ンバースァゴニス ト等が含まれる） 等が含まれる。 上記物質 は、 これら機能を有する物質であれば、 その構造は特に限定されず、 公知の 構造を有するものでもよい。 GPR4 としては、 例えば配列番号 1 1、 1 3お よび 1 7から選ばれるいずれか一つに記載のァミノ酸配列を有する蛋白質、 あるいは配列番号 1 1、 1 3および 1 7から選ばれるいずれか一つに記載の ァミノ酸配列において一つ以上のァミノ酸が欠失、置換または付加したアミ ノ酸配列を有し、かつ配列番号 1 1記載のアミノ酸配列を有する蛋白質のシ グナル伝達に関する機能を有する蛋白質等が挙げられる。
配列番号 1 1、 1 3および 1 7から達ばれるいずれか一つに記載のァミノ 酸配列において一つ以上のァミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配 列を有し、かつ配列番号 1 1記載のァミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル 伝達に関する機能を有する蛋白質は、 文献 [Mol ecular Cloning, A
Laborat ory Manual , Second Edi t i on, Col d Spring Harbor Laboratory Pre ss
( 1989年） （以下、 モレキュラー · クローニング第 2版と略す）、 Current Protoco l s in Molecular Bi ology, John Wi l ey & Sons ( 1987 - 1997年） （以 下、カレン ト ·プロ トコーノレズ ·ィン ·モレキュラー'バイォ口ジーと略す）、 Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)、 Gene, 34. 315 (1985)、 Nucleic Acids Research, 13., 4431 (1985)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等] 記載の部位特異 的変異導入法を用いて、 例えば配列番号 1 1、 1 3および 1 7から選ばれる いずれか一つに記載のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする DNAに部位 特異的変異を導入することにより、 取得することができる。
欠失、 置換または付加したアミノ酸の数は特に限定されないが、 1個〜数 十個、 好ましくは 1〜 2 0個、 よ り好ましくは 1〜 1 0個、 さらに好ましく は：！〜 5個である。
配列番号 1 1、 1 3および 1 7から選ばれるいずれか一つに記載のァミノ 酸配列において一つ以上のァミノ酸残基が欠失、 置換または付加したとは、 該ァミノ酸配列中の任意かつ 1 もしくは複数の位置において、 1または複数 のァミ ノ酸残基の欠失、 置換または付加があることを意味し、 欠失、 置換ま たは付加が同時に生じてもよく、 欠失、 置換または付加されるァミノ酸残基 については、天然型と非天然型とを問わない。天然型ァミノ酸残基としては、 L-ァラニン、 L-ァスパラギン、 L -ァスパラギン酸、 L-グルタミ ン、 L-グルタ ミン酸、 グリ シン、 L-ヒスチジン、 L-ィ ソロイシン、 L-ロイシン、 L-リ ジン、 L—アルギニン、 L—メチォニン、 L—フエ二ルァラニン、 L-プロリ ン、 L-セ リ ン、 L-スレオニン、 L-ト リプトファン、 L-チロシン、 L-バリ ンおよび L-システィ ンの各残基等が挙げられる。
以下に、 相互に置換可能なァミノ酸残基の好ましい例を示す。 同一群に含 まれるァミノ酸残基は相互に置換可能である。
A群 ： ロイシン、 イ ソロイシン、 ノノレロイシン、 ノ リ ン、 ノノレ/ リ ン、 了 ラニン、 2-ァミ ノブタン酸、 メチォニン、 0-メチノレセリ ン、 tert-プチノレグ リ シン、 tert-プチノレァラニン、 シク ロへキシノレァラニン
B群 ：ァスパラギン酸、 グルタミン酸、 ィソァスパラギン酸、 ィソグルタ ミン酸、 2-アミノアジピン酸、 2-アミノスべリ ン酸
C群 ： ァスパラギン、 グルタ ミ ン
D群 ： リ ジン、 アルギニン、 オル二チン、 2, 4-ジアミ ノブタン酸、 2， 3 - ジァミ ノプロピオン酸 E群 ： プロ リ ン、 3-ヒ ドロキシプロ リ ン、 4-ヒ ドロキシプロ リ ン
F群 ： セ リ ン、 ス レオニン、 ホモセ リ ン
G群 ： フエニノレアラニン、 チロシン
また、 配列番号 1 1、 1 3および 1 7から選ばれるいずれか一つに記載の ァミノ酸配列において一つ以上のァミノ酸残基が欠失、置換または付加した ァミノ酸配列を有する蛋白質が、配列番号 1 1記載のァミノ酸配列を有する 蛋白質のシグナル伝達に関する機能を有するには、そのアミノ酸配列と配列 番号 1 1記載のアミノ酸配列とが、 少なく とも 7 5 %以上、 通常は 8 0 %以 上、 好ましくは 9 0 %以上、 さらには 9 5 %以上の同一性を有していること が好ましい。
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、 Karlin and Altschulによるァノレゴ リ ズム BLAST [Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993) ]や FASTA [Methods Enzymol. , 183_> 63 (1990)] を用いて決定することができる。 このアルゴリ ズム BLASTに基づいて、 BLASTN (塩基対塩基データベース） や BLASTX (塩基 対ァミノ酸データベース） とよばれるプログラムが開発されている [J. Mol. Biol. , 215., 403 (1990)]。 BLASTこ基づ ヽた BLASTN iこよって塩基配歹 ljを角军析 する場合には、 パラメータ一は例えば score= 100、 wordlength= 12とする。 また、 BLASTに基づいて BLASTXによつてアミノ酸配列を解析する場合には、 ノ ラメーターは例えは *SCOre= 50、 wordlength= 3とする。 BLASTと Gapped BLASTプログラムを用いる場合には、 各プログラムのデフォルトパラメータ 一を用いる [Gapped BLASTについては文献 (Nuc. Acids Res. , 25, 3389 - 3402 (1997) ) を参照]。 これ らの解析方法の具体的な手法は公知であ る (http： //www. ncbi. nlm. nih. gov.参照 J。
GPR 自身の発現を阻害または抑制する物質と しては、 例えば、 配列番号
1 2、 1 4および 1 8から選ばれるいずれか一つに記載の塩基配列から選ば れる連続した 1 5〜 6 0塩基からなるオリ ゴヌク レオチドの相捕的配列を 有するオリ ゴヌクレオチド （以下、 アンチセンス .オリ ゴヌクレオチドとも いう）、 配列番号 1 2、 1 4および 1 8から選ばれるいずれか一つに記載の 塩基配列を有する DNAとス ト リ ンジ： ^ン トな条件でハイブリダイズし、配列 番号 1 1記載のァミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関する機能 を抑制するォリ ゴヌク レオチ ド、 これらのオリ ゴヌク レオチ ドの誘導体 （以 下、 オリ ゴヌク レオチド誘導体という） 等が挙げられる。
上記アンチセンス ' オリ ゴヌクレオチ ドと しては、 配列番号 1 2、 1 4お よび 1 8から選ばれるいずれか一つに記載の塩基配列から選ばれる連続し た 1 5〜 6 0塩基からなるオリ ゴヌク レオチ ドの相捕的配列を有するアン チセンス · ォリ ゴヌク レオチ ドであれば特に限定されないが、 好ましく は 1 7〜 6 0塩基、 よ り好ま しく は 2 0〜 6 0塩基、 さ らに好ましく は 3 0〜 6 0塩基からなるォリ ゴヌク レオチドの相捕的配列を有するアンチセン ス ·オリ ゴヌク レオチドが挙げられる。 特に好ま しく は上記ォリ ゴヌク レオ チドの翻訳開始領域の相捕的配列を有するアンチセンス 'オリ ゴヌク レオチ ドが挙げられる。 該アンチセンス ' オリ ゴヌク レオチ ドは、 配列番号 1 2、 1 4および 1 8から選ばれるいずれか一つに記載の塩基配列またはその断 片の塩基配列に関する情報に基づき、 常法によ り、 例えば DNA合成機を用い ることによ り調製するこ とができる。
オリ ゴヌク レオチド誘導体としては、オリ ゴヌク レオチ ド中のリ ン酸ジェ ステル結合がホスホロチォエート結合に変換されたオリ ゴヌク レオチド誘 導体、ォリ ゴヌク レオチド中のリ ン酸ジエステノレ結合が Ν3'- P5'ホスホアミデ 一ト結合.に変換されたオリ ゴヌクレオチ ド誘導体、オリ ゴヌク レオチ ド中の リボース と リ ン酸ジエステルとの結合がぺプチ ド核酸結合に変換されたォ リ ゴヌク レオチド誘導体、 オリ ゴヌク レオチ ド中のゥラシルが C-5プロ ピニ ルゥラシルで置換されたオリ ゴヌクレオチ ド誘導体、オリ ゴヌクレオチ ド中 のゥラシルが C- 5チアゾリルゥラシルで置換されたォリ ゴヌク レオチド誘導 体、 オリ ゴヌク レオチド中のシトシンが C-5プロ ピニルシトシンで置換され たオリ ゴヌク レオチ ド誘導体、オリ ゴヌク レオチ ド中のシトシンがフエノキ サジン修飾シ卜シン （phenoxaz ine- modi f i e d cytos ine) で置換されたオリ ゴヌク レオチ ド誘導体、 オリ ゴヌク レオチ ド中のリ ボースが 2' - 0-プロピル リボースで置換されたオリ ゴヌクレオチ ド誘導体、オリ ゴヌク レオチ ド中の リボースが 2'-メ トキシェ トキシリ ボースで置換されたオリ ゴヌク レオチ ド 誘導体等をあげるこ とができる 〔細胞工学， 1463 ( 1997)〕。
上記アンチセンス 'オリ ゴヌク レオチ ドまたはオリ ゴヌク レオチド誘導体 を用い、 アンチセンス RNA/DNA技術〔バイオサイエンスとインダス ト リー， 50., 322 (1992)、 ィ匕学， 46, 681 (1991)、 Biotechnology, 9, 358 (1992)、 Trends in Biotechnology, 10., 87 (1992) 、 Trends in Biotechnology, 10_, 152 (1992)、 細胞工学， ϋ, 1463 (1997)〕、 ト リ プル ' ヘリ ックス技術 [Trends in Biotechnology, 10, 132 (1992)〕、 ジ ボザィム技術 [Current Op ιηιοη in Chemical Biology, 3, 274 (1999)、 FEMS Microbiology Reviews, 23., 257 (1999)、 Frontiers in Bioscience, 4, D497 (1999)、 Chemistry & Biology, 6, R33 (1999)、 Nucleic Acids Research, 26_, 5237 (1998)、 Trends in Biotechnology, 16., 438 (1998)〕、 あるいはデコイ DNA法 [Nippon Rinsho - Japanese Journal of Clinical Medicine, 56^, 563 (1998)、 Circulation Research, 82, 1023 (1998)、 Experimental Nephrology, 5, 429 (1997)、 Nippon Rinsho - Japanese Journal of Clinical Medicine, 54, 2583 (1996)〕 に準じて、 GPR4自身の発現を阻害または抑制することができる。
配列番号 1 2、 1 4および 1 8から選ばれるいずれか一つに記載の塩基配 列を有する DNAとス ト リ ンジェン トな条件下でハイブリ ダイズするヌクレオ チドとは、 配列番号 1 2、 1 4および 1 8から選ばれるいずれか一つに記載 の塩基配列を有する DNAの一部、 または全部をプロープと して、 コロニー ' ハイブリ ダィゼーシヨ ン法、 プラーク .ハイプリ ダイゼーシヨ ン法、 サザン プロッ トハイプリ ダイゼーショ ン法等を用いることによ り得られる MAを意 味し、 具体的には、 コロニーまたはプラーク由来の DNAを固定化したフィル ターを用いて、 0. 7〜 ： 1 . 0 mol/1の塩化ナ ト リ ウム存在下、 6 5 °Cでハ ィプリ ダイゼーシヨ ンを行った後、 0. 1〜 2倍濃度の SSC溶液 （ 1倍濃度 の SSC溶液の組成は、 1 5 0 mmol/1塩化ナ ト リ ウム、 1 5 mmol/1クェン酸ナ ト リ ウムよ りなる） を用い、 6 5 °C条件下でフィルターを洗浄することによ り同定できる DNA等を挙げることができる。 ハイプリ ダイゼーシヨ ンは、 モ レキユラ一 ' ク ローニング第 2版、 カ レン ト ' プロ トコーノレズ ' イ ン ' モレ キュラー · / ィォロジ一、 DNA Clonin 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995)等 こ記載されてレヽる 方法に準じて行う こ とができる。ハイブリ ダイズするヌク レオチドと しては、 例えば上記 BLASTや FASTA等を用いて計算したときに 1 2、 1 4および 1 8 力、 ら選ばれるいずれか一つに記載の塩基配列を有する DNAの相捕的配列を有す る DNAと少なく とも 7 5 %以上の相同性を有する DNAが好ましく、より好まし くは 8 0 %以上の相同性を有する DNA、 さらに好ましくは 9 5 %以上の相同 性を有する DNAを挙げることができる。 ヌクレオチドと しては、 DNA、 RNA等 いずれも用いられる力 S DNAが好適に用いられる。
上記アンチセンス ' オリ ゴヌク レオチ ドも しくは該アンチセンス ' オリ ゴ ヌクレオチド誘導体、 または配列番号 1 2 、 1 4および 1 8から選ばれるい ずれか一つに記載の塩基配列を有する DNA とス トリ ンジェントな条件下で ハイブリダイズするヌクレオチドもしく は該ヌクレオチド誘導体を単独で またはレトロ ウイルスベクター、 アデノ ウイルスベクター、 アデノ ウイルス ァソシエーテツ ドウィルスべクター等の遺伝子治療用べクターに揷入した 後、下記に記載した常法に従って製剤化したものを喘息の予防およびノまた は治療剤として使用することもできる。
遺伝子治療用べクターを該予防おょぴノまたは治療剤と して用いる場合 には、該遺伝子治療用ベクターと遺伝子治療剤に用いる基剤を調合すること により製造することができる [Nature Genet.， 8 , 42 ( 1994)〕。
上記基剤と しては、通常注射剤に用いる基剤であればどのようなものでも よく、 例えば蒸留水、 塩化ナトリ ゥムまたは塩化ナトリ ウムと無機塩との混 合物等の塩溶液、マン-トール、乳糖、デキス トラン、プドウ糖等の糖溶液、 グリシン、 アルギニン等のアミノ酸溶液、 有機酸溶液または塩溶液とダルコ ース溶液との混合溶液等が挙げられる。 また常法に従い、 これらの基剤に浸 透圧調整剤、 pH調整剤、 ゴマ油、 ダイズ油等の植物油またはレシチンもしく は非イオン界面活性剤等の界面活性剤等の助剤を加えて、 溶液、 懸濁液また は分散液として注射剤を調製してもよい。 これらの注射剤を、 粉末化、 凍結 乾燥等の操作により用時溶解用製剤と して調製することもできる。
該予防および/または治療剤は、液体の場合はそのままで、固体の場合は、 投与直前に、必要により滅菌処理をした上記の基剤に溶解して使用すること ができる。
投与方法と しては、 例えば患者の治療部位に吸収されるよ うに、 局所的に 投与する方法を挙げることができる。 また、 非ウィルス遺伝子移入法によつ ても目的とする治療部位に DNAを輸送することができる。
非ウィルス遺伝子移入法と しては、 リ ン酸カルシウム共沈法 [Virology, 52, 456-467 (1973) ； Science, 209, 1414 - 1422 (1980)〕、 マイクロインジ ェクシヨ ン法 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77. 5399-5403 (1980) ； Proc. Natl. Acad. Sci. USA, T_, 7380-7384 (1980) ； Cell, 27, 223-231 (1981) ； Nature, 294, 92-94 (1981)〕、 リポソームを介した膜融合-介在移入法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413-7417 (1987)； Biochemistry, 28, 9508-9514 (1989) ； J. Biol. Chem.， 264, 12126-12129 (1989) ； Hum. Gene Ther. , 3, 267-275 (1992) ； Science, 249, 1285-1288 (1990) ； Circulation, 83, 2007-2011 (1992)〕、 直接 D N A取り込みまたは受容体-媒介 D N A移入法
(Science, 247, 1465-1468 (1990) ； J. Biol. Chem. , 266, 14338-14342 (1991)； Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3655-3659 (1991)； J. Biol. Chem.， 264, 16985-16987 (1989)； BioTechniques, U_, 474-485 (1991)； Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3410-3414 (1990) ； Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88., 4255-4259 (1991) ； Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 4033 - 4037 ' (1990) ； Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88., 8850-8854 (1991) ； Hum. Gene Ther. , 3, 147-154 (1991)〕 等をあげることができる。
リガンドの GPR4への結合を阻害する物質としては、 例えば、 GPR4を認識す る抗体、 GPR4に拮抗作用を有する化合物等をあげることができる。
上記抗体としては、 GPR4を認識する抗体であればいずれも用いることがで きるが、 GPR4 を特異的に認識する抗体が好ましい。 また該抗体はポリクロ ーナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。 このような抗体として、 例え ば、 GPR4 を認識する中和抗体等をあげることができる。 また、 ヒ ト型キメ ラ抗体、 ヒ ト化抗体等も本発明の抗体と して用いることができる。
上記抗体は、 例えば、 以下の方法に準じて調製することができる。
( 1 ) ポリ クローナル抗体の作製
GPR4またはその部分断片ポリぺプチドの精製標品、 あるいは GPR4の一部 のァミノ酸配列を有するぺプチドを抗原として用い、動物に投与することに よりポリクローナル抗体を作製することができる。
投与する動物としては、 ゥサギ、 ャギ、 ラッ ト、 マウス、 ハムスター等を 用いることができる。
該抗原の投与量は動物 1匹当たり 50〜100 μ gが好ましい。
ぺプチドを用いる場合は、 ペプチドをスカシガイへモシァニン ( keyhol e l impet haemocyanin) や牛チログロブリ ン等のキヤリア蛋白に共有結合させ たものを抗原とするのが望ましい。 抗原とするペプチドは、 ぺプチド合成機 で合成するこ とができる。
該抗原の投与は、 1 回目の投与の後 1〜2週間おきに 3〜10回行う。 各投 与後、 3〜7 日 目に眼底静脈叢より採血し、 該血清が免疫に用いた抗原と反 応することを酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法（ELISA法）：医学書院刊（1976 年)、 Ant ibodi es - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory ( 1988)〕 等で確認する。
免疫に用いた抗原に対し、その血清が充分な抗体価を示した非ヒ ト哺乳動 物より血清を取得し、 該血清を分離、 精製することによりポリ クローナル抗 体を取得することができる。
分離、 精製する方法としては、 遠心分離、 40〜50 %飽和硫酸アンモニゥム ίこよる塩析、 カプリノレ酸沈殿 [ Ant ibodi e s, A Laboratory Manual , Col d Spring Harbor Laboratory, ( 1988)〕、 または DEAE セファ ロースカラム、 陰ィオン交換力ラム、 プロテイン Aまたは G-力ラムあるいはゲル濾過力ラ ム等を用いるクロマトグラフィ一等を、単独でまたは組み合わせて処理する 方法が挙げられる。
( 2 ) モノクローナル抗体の作製
(a)抗体産生細胞の調製
免疫に用いた GPR4またはその部分断片ポリぺプチドの精製標品、 あるい は GPR4の一部のァミノ酸配列を有するぺプチドに対し、 その血清が十分な 抗体価を示したラッ トを抗体産生細胞の供給源と して供する。
該抗体価を示したラッ トに抗原物質を最終投与した後 3〜 7 日 目に、脾臓 を摘出する。
該脾臓を MEM培地 （日水製薬社製） 中で細断し、 ピンセッ トでほぐし、 l , 200rpmで 5分間遠心分離した後、 上清を捨てる。
得られた沈殿画分の脾細胞を トリス—塩化アンモニゥム緩衝液 （PH7. 65 ) で 1~2分間処理し赤血球を除去した後、 MEM培地で 3回洗浄し、 得られた 脾細胞を抗体産生細胞と して用いる。
(b)骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞と しては、マウスまたはラッ トから取得した株化細胞を使用す る。 例えば、 8 -ァザグァニン耐性マウス (BALB/c由来） 骨髄腫細胞株 P3 - X63Ag8- U1 (以下、 P3-U1 と略す） [Curr. Topics Microbiol. Immunol. , 81, 1 (1978)、 Eur. J. Immunol. , 6, 511 (1976)〕、 SP2/0 - Agl4 (SP-2) [Nature, 276, 269 (1978)〕、 P3- X63-Ag8653 (653) [J. Immunol. , 123, 1548 (1979)〕、 P3-X63-Ag8 (X63) [Nature, 256, 495 (1975)〕 等を用いることができる。 こ れらの細胞株は、 8_ァザグァニン培地 〔RPMI_1640培地にグルタ ミ ン
(1.5 ol/l) 2 —メルカプ トエタノール (5 X 10 - /l)、 ジェンタマイシ ン （10/ g/ml) およぴ牛胎児血清 （FCS) (CSL社製、 10%) を加えた培地 （以 下、 正常培地という） に、 さらに 8-ァザグァニン (15 μ g/ml) を加えた培 地〕 で継代するが、 細胞融合の 3 4 日前に正常培地で培養し、 融合には該 細胞を 2X 107個以上用いる。
(c)ハイプリ ドーマの作製
(a)で取得した抗体産生細胞と（b)で取得した骨髄腫細胞を M E M培地ま たは PBS (リ ン酸ニナト リ ゥム 1. 83g、リ ン酸一カリ ウム 0.21g、食塩 7.65g 蒸留水 1 リ ッ トル、 pH7.2) でよく洗浄し、 細胞数が、 抗体産生細胞 ： 骨髄 腫細胞 = 5 10 1になるよう混合し、 l, 200rpmで 5分間遠心分離した後、 上清を捨てる。
得られた沈殿画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に、攪拌しながら、 37°C で、 108抗体産生細胞あたり、ポリエチレングリ コール- 1000 (PEG- 1000) 2g MEM 2mlおよびジメチルスルホキシド (DMS0) 0. 7 mlを混合した溶液を 0. 2 ltnl添加し、 さらに 1 2分間毎に MEM培地 l 2mlを数回添加する。
添加後、 MEM培地を加えて全量が 50mlになるように調製する。 該調製液 を 900rpmで 5分間遠心分離後、上清を捨てる。得られた沈殿画分の細胞を、 ゆるやかにほぐした後、 メ スピペッ トによる吸込み、 吹出しでゆるやかに HAT培地〔正常培地にヒポキサンチン（10— 4mol/l)、チミジン（ 1. 5 X 10—5mol/l) およぴァミノプテリ ン（4X 10—7 mol/1) を加えた培地〕 100ml中に懸濁する。 該懸濁液を 96穴培養用プレートに 100 / 1/穴ずつ分注し、 5 %じ02ィ ンキ ュべ—ター中、 37°Cで？〜 14 日間培養する。
培養後、 培養上清の一部をと りアンチボディィズ [ Ant ibodi es, A Laborat ory Manual , Co l d Spring Harbor Laboratory, Chapter 14 ( 1988) ] 等に述べられている酵素免疫測定法により、本発明のポリぺプチドの部分断 片ポリぺプチドに特異的に反応するハイプリ ドーマを選択する。
酵素免疫測定法の具体例として、 以下の方法をあげることができる。
免疫の際、 抗原に用いた GPR4またはその部分断片ポリぺプチドの精製標 品、 あるいは GPR4の一部のアミノ酸配列を有するペプチドを適当なプレー トにコートし、 ハイプリ ドーマ培養上清もしく は後述の（d)で得られる精製 抗体を第一抗体と して反応させ、 さらに第二抗体と してピオチン、 酵素、 化 学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗ラッ トまたは抗マウスィ ムノグロプリ ン抗体を反応させた後に標識物質に応じた反応を行い、抗原に 用いたポリぺプチドに特異的に反応するものを本発明で用いられるモノク ローナル抗体を生産するハイプリ ドーマとして選択する。
該ハイプリ ドーマを用いて、限界希釈法によりクローニングを 2回繰り返 し 〔1回目は、 HT培地 （HAT培地からァミノプテリンを除いた培地）、 2回目 は、 正常培地を使用する〕、 安定して強い抗体価の認められたものを本発明 で用いられるモノクローナル抗体を産生するハイプリ ドーマ株と して選択 する。
(d)モノ ク ローナル抗体の調製
プリスタン処理 〔2, 6, 10， 14-テ トラメチノレペンタデカン （Pri stane ) 0. 5mlを腹腔内投与し、 2週間飼育する〕 した 8〜10週令のマウスまたはヌ 一ドマウスに、 （c)で取得した本発明で用いられるモノクローナル抗体を産 生するハイブリ ドーマ細胞 5〜20 X 10e細胞/匹を腹腔内に注射する。 10〜 21 日間でハイプリ ドーマは腹水癌化する。
該腹水癌化したマウスから腹水を採取し、 3，000rpmで 5分間遠心分離し て固形分を除去する。
得られた上清より 、ポリ ク ローナル抗体で用いた方法と同様の方法でモノ クローナル抗体を精製、 取得することができる。 抗体のサプクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキッ ト またはラッ トモノク ローナル抗体タイピングキッ トを用いて行う。ポリぺプ チド量は、 ローリ一法あるいは 280nmでの吸光度より算出する。
上記、 GP R 4を認識する抗体を含有する喘息の予防および/または治療剤は 以下のように調製することができる。
該抗体を有効成分と して含有する医薬は、該有効成分を単独で投与するこ とも可能ではあるが、通常は該有効成分を薬理学的に許容される一つあるい はそれ以上の祖体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる 任意の方法により製造した医薬製剤と して提供するのが望ましい。好ましく は水、 あるいは食塩、 グリ シン、 グルコース、 ヒ トアルブミ ン等の水溶液等 の水性担体に溶解した無菌的な溶液が用いられる。 また、 製剤溶液を生理的 条件に近づけるための緩衝化剤や等張化剤のような、薬理学的に許容される 添加剤、 例えば、 酢酸ナト リ ウム、 塩化ナトリ ウム、 乳酸ナトリ ウム、 塩化 カリ ウム、 タエン酸ナトリ ゥム等を添加することもできる。 また、 凍結乾燥 して貯蔵し、 使用時に適当な溶媒に溶解させて用いることもできる。
投与経路は、 治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、 経口 投与、 または静脈内投与等の非経口投与をあげることができる。 投与形態と しては、 錠剤、 注射剤等が挙げられる。
経口投与に適当な製剤と しては、 錠剤等が挙げられる。 錠剤等は、 乳糖、 マンニトール等の賦形剤、 デンプン等の崩壊剤、 ステアリ ン酸マグネシウム 等の滑沢剤、 ヒ ドロキシプロピルセルロース等の結合剤、 脂肪酸エステル等 の界面活性剤、 グリセリ ン等の可塑剤等を添加剤と して用いて製造できる。 非経口投与に適当な製剤としては、 注射剤等が挙げられる。 例えば、 注射 剤は、 塩溶液、 プドウ糖溶液または両者の混合物からなる担体等を用いて調 製する。 また、 非経口剤においても経口剤で添加剤と して例示した成分を添 加することもできる。
投与量または投与回数は、 目的とする治療効果、 投与方法、 治療期間、 年 齢、 体重等により異なるが、 通常成人 1 日当たり 10 / g /kg〜 8 mg/kgであ る。
GPR4 の構成的活性により生じるシグナル伝達に関する機能を抑制する物 質は、該構成的活性により生ずるシグナル伝達を抑制することのできる物質 を探索することによつても取得することができる。
GPR4 に拮抗作用を有する化合物としては、 例えば、 式 （I) で表される化 合物が挙げられる。 以下、 式 （I) で表される化合物を化合物 （I) という。 他の式番号の化合物についても同様である。
化合物（I)の各基の定義において、 以下の例示が挙げられる。
(i)低級アルキルおよび低級アルカノィルの低級アルキル部分としては、 例 えば直鎖または分岐状の炭素数 1〜 1 0のアルキルが挙げられ、具体的には メチル、 ェチノレ、 プロピノレ、 イ ソプロピノレ、 プチノレ、 イ ソブチル、 sec—プ チノレ、 tert—プチノレ、 ペンチノレ、 ィ ソペンチノレ、 ネオペンチノレ、 へキシノレ、 ヘプチル、 ォクチル、 イソォクチル、 ノエル、 デシノレ等が挙げられる。
(ii)シク 口アルキルと しては、例えば炭素数 3〜 8 のシク ロアルキルが挙げ られ、 具体的にはシク ロプロ ピル、 シク ロプチル、 シク ロペンチル、 シク ロ へキシル、 シク口へプチル、 シクロォクチノレ等が挙げられる。
(iii)低級アルケニルと しては、 例えば直鎖、 分岐または環状の炭素数 2〜 8 のアルケニルが挙げられ、 具体的にはビニル、 ァ リ ル、 1 —プロぺニル、 ブテェノレ、 ペンテ二ノレ、 へキセニノレ、 ヘプテニノレ、 ォクテ二ノレ、 シクロへキ セニル、 2， 6 —ォクタジェニル等が挙げられる。
(iv)低級アルキニルと しては、例えば直鎖または分岐状の炭素数 2〜 8のァ ルキニルが挙げられ、 具体的にはェチニル、 プロピニノレ、 ブチュル、 ペンチ ニル、 へキシニル、 へプチニル、 ォクチニル等が挙げられる。
(V)ハロゲンは、 フッ素、 塩素、 臭素およびヨウ素の各原子を表す。
(vi)ァリールおよびそれぞれが隣接する 2つの炭素原子と一緒になつて形 成される芳香環から水素原子を一つ除いた基と しては、 例えば炭素数 6〜 1 4の単環性、 二環性または三環式のァリールが挙げられ、 具体的にはフエ ニル、 ナフチル、 インデニル、 アン トラニル等が挙げられる。
(vii)ァラルキルおよび複素環アルキルのアルキレン部分は、 前記の低級ァ ルキル（i)の定義から水素原子を一つ除いたものと同義である。
(vii i)ァラルキルのァリール部分と しては、前記ァリール（vi)の定義で挙げ た基に加え、例えば前記ァリールがシク口アルキルと縮合した二環性縮合環 基が挙げられ、 具体的にはイ ンダニル、 1 , 2 ， 3 , 4—テ トラヒ ドロナフ チル、 6 ， 7 ' 8 , 9 ーテ トラ ヒ ドロ一 5 I- I—ベンゾシク 口へプチノレ等が挙 げられる。
(iX)複素環基および複素環アルキルの複素環基部分ならびにそれぞれが隣 接する 2つの炭素原子と一緒になつて形成される複素環から水素原子を一 つ除いた基としては、 例えば窒素原子、 酸素原子および硫黄原子から選ばれ る少なく とも 1個の原子を含む 5員または 6員の単環性複素環基、 3〜 8員 の環が縮合した二環または三環式であって窒素原子、酸素原子および硫黄原 子から選ばれる少なく とも 1個の原子を含む縮環性複素環基等が挙げられ、 具体的にはピリ ジル、 ピラジニル、 ピリ ミジニル、 ピリ ダジニル、 ベンゾィ ミダゾリル、 2—ォキソベンゾイ ミダゾリル、 ベンゾトリアゾリル、 ベンゾ フリル、 ベンゾチェニル、 プリ ニル、 ベンゾォキサゾリル、 ベンゾチアゾリ ル、 ベンゾジォキソリル、 インダゾリル、 イン ドリル、 イ ソインドリル、 キ ノ リノレ、イソキノ リル、 フタラジニル、ナフチルリジニル、 キノキサリニル、 ピロ リル、 ピラゾリル、 キナゾリ ニル、 シンノ リ ニル、 ト リ ァゾリル、 テ ト ラゾリル、 イ ミダゾリル、 ォキサゾリル、 イ ソォキサゾリル、 チアゾリル、 イソチアゾリル、 チェニル、 フリル、 ピロ リ ジニル、 2 ， 5 —ジォキソピロ リ ジニル、 チアゾリ ジニル、 ォキサゾリ ジニル、 ピペリ ジル、 ピペリ ジノ、 ピペラジニノレ、 ホモピペラジニノレ、 ホモピペリ ジノレ、 ホモピペリジノ、 モル ホリ ニノレ、 モノレホリ ノ、 チォモノレホリ ニノレ、 チォモノレホリ ノ、 ピラニノレ、 テ トラヒ ドロピリ ジル、 テ トラヒ ドロビラニル、 テ トラヒ ドロフラ -ル、 テ ト ラヒ ドロキノ リル、 テ トラ ヒ ドロイ ソキノ リル、 ォクタヒ ドロキノ リル、 ィ ンドリニル等が挙げられる。
(X)隣接する窒素原子と一緒になつて形成される複素環基と しては、 例えば 少なく とも 1個の窒素原子を含む 5員または 6員の単環性複素環基（該単環 性複素環基は、他の窒素原子、酸素原子または硫黄原子を含んでいてもよい）、 3〜 8員の環が縮合した二環または三環式で少なく とも 1個の窒素原子を 含む縮環性複素環基 （該縮環性複素環基は、 他の窒素原子、 酸素原子または 硫黄原子を含んでいてもよい） 等が挙げられ、 具体的にはピリジル、 テトラ ヒ ドロピリ ジル、 イン ドリ ニル、 イソイ ンドリ ニル、 ピロ リ ジニル、 チアゾ リ ジニル、ォキサゾリ ジニル、 ピぺリ ジノ、 ホモピぺリ ジノ、 ピペラジニル、 ホモピペラジニル、 モノレホリ ノ、 チォモノレホリ ノ、 ぺノレヒ ドロアゼピニノレ、 ペルヒ ドロアゾシニル、テ トラ ヒ ドロキノ リル、テ トラ ヒ ドロイソキノ リル、 ォクタ ヒ ドロキノ リル、 ベンゾイ ミ ダゾリル、 インダゾリル、 インドリル、 イソイ ン ドリル、 プリ ュル、 ジヒ ドロイ ン ドリル、 ピロ リル、 ジヒ ドロピロ リル、 ピラゾリル、 ト リ ァゾリル、 テ トラゾリル、 イ ミダゾリル等が挙げら れる。
( x i )置換低級アルキルおよび置換低級アル力ノィルにおける置換基と して は、 同一または異なって、 例えば置換基数 1〜 3の、 シクロアルキル、 低級 アルカノィル、 低級アルコキシ、 ァリールォキシ、 置換ァリールォキシ [該 置換ァリールォキシにおける置換基と しては、 同一または異なって、 例えば 置換基数 1〜3の、 低級アルキル、 低級アルコキシ、 低級アルコキシカルボ二 ル、 ハロゲン、 シァノ、 ニ トロ、 ヒ ドロキシ、 カルボキシ、 ァミ ノ等が挙げ られる。 ここで低級アルキルは前記低級アルキル（i )と同義であり、 ハロゲ ンは前記ハロゲン（V)と同義であり、 低級アルコキシおよび低級アルコキシ カルボニルの低級アルキル部分は前記低級アルキル（i )と同義である]、ァラ ルキルォキシ、 置換ァラルキルォキシ [該置換ァラルキルォキシにおける置 換基と しては、同一または異なって、例えば置換基数 1〜 3の、低級アルキル、 低級アルコキシ、 低級アルコキシカルボニル、 ハロゲン、 シァノ、 ニ ト ロ、 ヒ ドロキシ、 カルボキシ、 ァミ ノ等が挙げられる。 ここで低級アルキルは前 記低級アルキル（i )と同義でありヽ ノ、口ゲンは前記ハ口ゲン（V )と同義であり、 低級アルコキシおよび低級アルコキシ力ルボニルの低級アルキル部分は前 記低級アルキル（i )と同義である]、 低級アル力ノィルォキシ、 低級アルコキ シカノレポ二ノレ、 ハロゲン、 シァノ、 ニ ト ロ、 ヒ ドロキシ、 カノレボキシ、 アミ ノ、 低級アルキルチオ、 置換低級アルキル [該置換低級アルキルにおける置 換基と しては、 同一または異なって、 例えば置換基数 1〜 3 のヒ ドロキシ、 ハロゲン等が挙げられる]、 置換低級アルカノィル [該置換低級アルカノィ ルにおける置換基と しては、 同一または異なって、 例えば置換基数 1〜 3の ハロゲン等が挙げられる]、 モノまたはジ低級アルキルァミ ノ、 低級アルキ ノレスノレホニル、 低級ァノレキルスルフィニル、 低級アルコキシカルボニルアミ ノ、低級アル力ノィルァミ ノ、モノまたはジ低級アルキルァミ ノカルボニル、 モノまたはジ低級アルキルァミ ノカルボニルォキシ、複素環基等が挙げられ る。
ここで示したァリールォキシおよびァラルキルォキシのァ リール部分、 シ ク ロアルキル、 ハロゲン、 複素環基、 ならびに低級アルカノィル、 低級アル コキシ、 低級アルカノィルォキシ、 低級アルコキシカルボニル、 低級アルキ ルチオ、 低級アルキルスルホ二ノレ、 低級アルキルスルフィ ニノレ、 低級ァノレコ キシカルボニルァミ ノおよび低級アル力ノィルァミ ノ の低級アルキル部分 は、 それぞれ前記ァリール（v i)、 シク ロアルキル（i i )、 ハロゲン（v)、 複素 環基 （ix)、 および低級アルキル（i )と同義であり、 ァラルキルォキシのアル キレン部分は、 前記低級アルキル（i )から水素原子を一つ除いたものと同義 である。
モノまたはジ低級アルキルァミ ノ、モノまたはジ低級アルキルァミ ノカル ボニルおよびモノまたはジ低級アルキルァミ ノカルボニルォキシの低級ァ ルキル部分は、 それぞれ前記低級アルキル（i )と同義であ り 、 ジ低級アルキ ルァミ ノ、 ジ低級アルキルァミ ノカルボニルおよびジ低級アルキルァミ ノ力 ルポ-ルォキシの 2つの低級アルキル部分は、それぞれ同一でも異なってい てもよい。
(x i i )置換ァリ ール、 置換ァラルキル、 置換シク ロアルキル、 置換低級アル ケニル、 置換低級アルキニル、 置換複素環基、 置換複素環アルキル、 隣接す る窒素原子と一緒になつて形成される置換複素環基、それぞれが隣接する 2 つの炭素原子と一緒になつて形成される置換芳香環およびそれぞれが隣接 する 2つの炭素原子と一緒になつて形成される置換複素環における置換基 と しては、 前記置換低級アルキルにおける置換基 （xi ) の定義で挙げた基に 加え、 低級アルキル、 ァリール、 置換ァリール、 ァラルキル、 置換ァラルキ ル、 複素環基、 置換複素環基、 複素環アルキル、 置換複素環アルキル等が挙 げられる。 さ らに、 置換ァリ ールおよび隣接する窒素原子と一緒になって形 成される置換複素環基における置換基は低級アルキル [該低級アルキルは前. 記低級アルキル（i)と同義である] または置換低級アルキル [該低級アルキ ルは前記低級アルキル（i )と同義であり、 該置換低級アルキルにおける置換 基と しては、 同一または異なって、 例えば置換基数 1〜3 の、 ハロゲン、 ヒ ドロキシ、 カルボキシ、 低級アルコキシカルボニル等が挙げられる。 ここで ハロゲンは前記ハロゲン（V)と同義であり、 低級アルコキシカルボ-ルの低 級アルキル部分は前記低級アルキル（i)と同義である] であってもよい。
ここで示した低級アルキル、 ァリール、 複素環基および複素環アルキルの 複素環基部分、ァラルキルおよぴ複素環アルキルのアルキレン部分ならぴに ァラルキルのァリール部分は、それぞれ前記低級アルキル（i )、ァリール（v i ) . 複素環基（ix)、 ァラルキルのァノレキレン部分（vi i )およぴァラルキルのァリ ール部分（v i i i )と同義である。 また、 置換ァリール、 置換ァラルキル、 置換 複素環基、 置換複素環アルキルにおける置換基と しては、 同一または異なつ て、 例えば置換基数 1〜 3の、 低級アルキル [該低級アルキルは前記低級ァ ルキル（i )と同義である]、 低級アルコキシ [該低級アルコキシの低級アルキ ル部分は前記低級アルキル（ i )と同義である]、 ハロゲン [該ハロゲンは前記 ハロゲン （V ) と同義である] 等が挙げられる。
化合物 （I ) の四級アンモニゥム塩と しては、 化合物 （I ) の塩基性部位に ハロゲン化低級アルキル（該低級アルキルおよぴ該ハ口ゲンはそれぞれ前記 と同義である） 、 ハロゲン化ァラルキル (該ハロゲンおよび該ァラルキルは それぞれ前記と同義である） 、 ヒ ドロキシ低級アルキル (該低級アルキルは 前記と同義である）等が付加した四級アンモニゥム塩であれば特に限定され ないが、 例えばジメチルァミノ基を有する化合物 ( I) にヨウ化メチルを作 用させて得られる四級アンモニゥム塩、 ピペリジノ基を有する化合物 （I) にヨウ化メチルを作用させて得られる四級アンモニゥム塩、 ピロリ ジノ基を 有する化合物 ( I ) にヨウ化メチルを作用させて得られる四級アンモニゥム 塩、 モルホリ ノ基を有する化合物 （I) に臭化べンジノレを作用させて得られ る四級アンモニゥム塩、 ピロ リ ジノ基を有する化合物 ( I ) にョゥ化工チル を反応させて得られる四級アンモニゥム塩においてヨウ化物イオンと水酸 化物イオンが交換されて得られる四級アンモニゥム塩等が挙げられる。
化合物（I)の薬理学的に許容される塩と しては、 毒性のない、 水溶性のも のが好ましく、 例えば塩酸塩、 臭化水素酸塩、 硝酸塩、 硫酸塩、 リ ン酸塩等 の無機酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、 クェン酸塩、 フマル酸塩、 ダルコン酸塩、 乳酸塩、 マレイン酸塩、 リ ンゴ酸塩、 シュゥ酸塩、 メタンス ルホン酸塩、 酒石酸塩等の有機酸塩等の酸付加塩、 ナトリ ウム塩、 カリ ウム 塩等のアル力リ金属塩、 マグネシウム塩、 カルシウム塩等のアル力リ土類金 属塩、 アルミニウム塩、 亜鉛塩等の金属塩、 アンモニゥム、 テトラメチルァ ンモニゥム等のアンモニゥム塩、 モルホリ ン付加塩、 ピペリジン付加塩等の 有機アミン付加塩、 またはグリ シン付加塩、 フエ二ルァラニン付加塩、 リ ジ ン付加塩、 ァスパラギン酸付加塩、 グルタ ミ ン酸付加塩等のアミノ酸付加塩 等が挙げられる。
次に化合物（I)の製造法について説明する。
なお、以下に示した製造法において、定義した基が反応条件下変化するカ または方法を実施するのに不適切な場合、 有機合成化学で常用される方法、 例えば官能基の保護、 脱保護等 [例えば、 プロテクティブ ' グループス · ィ ン · ォ一ガニック · シンセシス 第三版 Protective Groups i Organic Synthesis, the third edition)、 グリーン (T. W. Greene) ワッツ (Peter G. M. Wuts) 著、 ジョ ン ' ワイ リー ' アンド ' サンズ ' インコーポレイテッ ド (John Wiley & Sons Inc. ) (1999 年）] の手段に付すことにより容易に製 造を実施することができる。 また、 必要に応じて置換基導入等の反応工程の 順序を変えることもできる。 化合物 （I-a) は、 以下に示す製造方法によって得ることができる。
製造法 1
Figure imgf000027_0001
(式中、 R2、 R3、 R4、 R5、 R6、 Xおよび Yはそれぞれ前記と同義であり、 R9は 低級アルキル、 ァリルまたはベンジルを表し、 R1()および R11は同一または異 なって低級アルキルまたはシクロアルキルを表すか、 R1Qおよび R11が隣接す る窒素原子と一緒になつて複素環基を形成し、 Uはハロゲン、 アルコキシス ルホニルォキシ、 ァ リ ールォキシスルホニノレオキシ、 ァノレキノレスルホニノレオ キシまたはァリールスルホニルォキシを表す）
上記の定義において、 低級アルキル、 シクロアルキルおよびハロゲンはそ れぞれ前記と同義である。アルコキシスノレホニルォキシおよびアルキルスル ホニルォキシのアルキル部分、ァリ一ルォキシスルホニルォキシおよぴァリ 一ルスルホニルォキシのァ リ ール部分は、 それぞれ前記低級アルキル、 ァ リ ールと同義である。隣接する窒素原子と一緒になつて形成される複素環基は 前記と同義である。
<工程 1 〉
化合物 （I lia) を原料と して用い、 特開平 7 _ ei 983 に開示された方法に 従い、 1当量〜大過剰の YH (式中、 Yは前記と同義である） と反応させるこ とにより、 化合物 （IV) を得ることができる。 なお、 化合物 （I li a) は特開 平 7— 61983 に開示された方法またはそれに準じた方法により合成すること ができる。
<工程 2 >
化合物 （IV) を不活性溶媒中、 1当量〜大過剰のホルムアルデヒ ド水溶液 存在下に、 1当量〜大過剰の R¾6NH (式中、 R5および R6はそれぞれ前記と同 義である） またはその塩酸塩と反応させることにより、 化合物 （I-a) を得 ることができる。 また、 ホルムアルデヒ ド水溶液に代え、 トリオキシメチレ ン、パラホルムアルデヒ ド等のホルムアルデヒ ド等価体を用いることもでき る。
反応は通常、酸性条件下で良好に進行するので、必要に応じて塩酸、酢酸、 トリフルォロ酢酸等の酸を反応系内に添加するのが好ましい。 反応は通常、 0°Cから反応に用いた溶媒の沸点の間の温度、 好ましくは室温〜 80°Cの間の 温度で行い、 5分間から 100時間で終了する。 不活性溶媒と しては、 例えば 水、 メタノール、 エタノール、 酢酸、 ト リフルォロ酢酸、 ジクロロェタン、 ク ロ 口ホルム、 テ トラヒ ドロフラン、 ジメチノレアセ トアミ ド、 ジメチルホル ムアミ ド、 ァセ トン等を単独でまたは混合して用いることができ、 好ましく はクロ口ホルムと酢酸の混合溶媒が用いられる。 化合物 （I- b) から、 以下に示す方法によって化合物 （ト c) を製造するこ とができる。
製造法 2
Figure imgf000029_0001
(式中、 R2、 R3、 R4、 R5、 R6、 R5b、 R6b、 R8、 U、 n、 X および Y はそれぞれ前 記と同義である）
<工程 3 >
化合物 （I-b) を不活性溶媒中、 1 当量〜大過剰の R8U (式中、 R8および U はそれぞれ前記と同義である） と、 通常一 10°Cから反応に用いた溶媒の沸点 の間の温度、 好ましく は室温で、 1〜48時間反応させることにより、 化合物 ( I-c) を得ることができる。
不活性溶媒と しては、 例えば水、 メタノール、 エタノール、 ベンゼン、 ト ノレェン、 キシレン、 酢酸ェチノレ、 へキサン、 ァセ トニ ト リノレ、 ジクロロメタ ン、 ジクロロェタン、 クロ口ホルム、 四塩化炭素、 1 , 4一ジォキサン、 テ ト ラ ヒ ドロフラン、 ジメチルァセ トアミ ド、 ジメチルホルムァミ ド、 アセ トン 等を単独でまたは混合して用いることができ、 好ましくは酢酸ェチル、 ジク ロロメタン、 ク ロ口ホルム等が用いられる。 化合物 （I-c) から、 以下に示す方法によって化合物 （I - b ) を製造する とができる。 製造法 3
Figure imgf000030_0001
(式中、 R2、 R3、 R4、 R5、 R6、 R5b、 R6b、 R8、 U、 n、 Xおよび Yはそれぞれ前記 と同義である）
<工程 4 >
化合物 （I- c) を不活性溶媒中、 1 当量〜大過剰の R5R H (式中、 および R6はそれぞれ前記と同義である） と、 通常一 10°Cから反応に用いた溶媒の沸 点の間の温度、 好ま しく は 20 ：〜 100°Cの間の温度で、 1〜100時間反応させ ることによ り、 化合物 ( i-b) を得ることができる。
不活性溶媒と しては、 例えば水、 メタノール、 エタノール、 ベンゼン、 ト ノレェン、 キシレン、 酢酸ェチノレ、 へキサン、 ァセ トニ ト リノレ、 ジクロ ロメタ ン、 ジクロロェタン、 ク ロ 口ホルム、 四塩化炭素、 1， 4 _ジォキサン、 テ ト ラヒ ドロフラン、 ジメチルァセ トアミ ド、 ジメチノレホルムアミ ド、 アセ トン 等が単独でまたは混合して用いられ、 好ましく はクロ口ホルム、 ジメチルホ ルムアミ ド等が用いられる。 反応は通常、 塩基性条件下で良好に進行するの で、 必要に応じて適当な塩基を反応系内に添加することが望ましい。 塩基と しては、例えばト リェチルァミ ン、ジィ ソプロ ピルェチルァミ ン、ピリ ジン、 N -メチルモルホリ ン、 炭酸カ リ ウム、 水素化ナ ト リ ウム、 水素化力リ ウム、 水素化カルシウム、 ジイ ソプロ ピルェチルァミ ン、 1 , 8—ジァザビシク ロ [5. 4. 0]ゥンデックー 7—ェン等を用いることができ、中でも ト リエチルアミ ンが好ましい。 化合物 （I - b) 中、 化合物 （I-d) を用い 以下に示す方法によつて化合物 ( I - e) を製造することができる。
製造法 4
Figure imgf000031_0001
(式中、 R2、 R3、 R4、 n、 Xおよび Yはそれぞれ前記と同義であり、 R14および R15は同一または異なって水素、 置換も しくは非置換の低級アルキル、 置換 もしく は非置換のシク口アルキル、 置換もしくは非置換の低級アルケニル、 置換もしくは非置換の低級アルキニル、 置換もしく は非置換のァラルキル、 または置換もしくは非置換の複素環アルキルを表すか、 R14および R15が隣接 する CH (CH2) mNと一緒になつて置換もしくは非置換の複素環を形成してもよ い。 R16は水素、 置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換 のシク ロアルキル、 置換もしく は非置換の低級アルケニル、 置換もしくは非 置換の低級アルキニル、 置換もしくは非置換のァラルキル、 または置換もし くは非置換のァリールを表し、 mは 0〜3の整数を表す）
低級アルキル、 シク ロアルキル、 低級ァルケエル、 低級アルキニル、 ァラ ルキル、 複素環アルキル、 およびァリールはそれぞれ前記と同義であり、 そ れらの置換基もそれぞれ前記と同義である。
R14および R15が隣接する CH (CH2) nN と一緒になつて形成される置換もしく は非置換の複素環と しては、 テ トラヒ ドロピリジン、 ピロリジン、 ピペリジ ン、 ホモピぺリ ジン、 ピぺラジン、 ホモピぺラジン、 モノレホ リ ン、 チォモノレ ホリ ン、ペルヒ ドロアゼピン、ぺノレヒ ドロアゾシン、テ トラ ヒ ドロキノ リ ン、 テトラヒ ドロイソキノ リ ン等があげられ、それらの置換基は前記の隣接する 窒素原子と一緒になつて形成される複素環基の置換基と同義である。
<工程 5 >
化合物（I-d)を不活性溶媒中、 通常一 78°C〜40 °Cの間の温度で、 2〜4 当 量の水素化アルミユウムリチウム、 ジイソプロピル水素化アルミニゥムリ チウム等、 好ましく はジイソプロピル水素化アルミニゥムリチウム等の還 元剤存在下で 10 分間〜 24 時間、 好ましくは 1〜3 時間処理することによ り化合物（I-e)を得ることができる。
不活性溶媒と しては、 例えばジク ロロメ タン、 ク ロ口ホルム、 四塩化炭 素、 ジク ロロェタン、 ベンゼン、 トノレェン、 キシレン、 テ トラヒ ドロフラ ン、 ジェチルェ一テル等を単独でまたは混合して用いるこ とができ、 好ま しく はジク ロロメタンまたは トルエンが用いられる。 化合物 （I-d) から以下に示す方法によって化合物 （I - f) を製造すること ができる。
製造法 5
Figure imgf000032_0001
(式中、 R2、 R3、 R4、 R14、 R15、 R16、 n、 X、 Yおよび mはそれぞれ前記と同義 である）
<工程 6 >
化合物（I-d)を不活性溶媒中、 通常 0°Cから反応に用いた溶媒の沸点の間 の温度、 好ま しく は室温〜 100°Cの間の温度で、 1 当量〜大過剰の適当な塩 基存在下、 1〜48 時間、 好ま しく は 1〜3 時間処理するこ とによ り化合物 (I- f)を得ることができる。
適当な塩基と しては、 例えば水酸化ナ ト リ ウム、 水酸化リチウム、 水酸 化力 リ ウム、 炭酸力リ ウム、 炭酸セシウム、 ナ ト リ ウムメ トキシ ド等が例 示され、 好ま しく は水酸化ナ ト リ ウムが挙げられる。 不活性溶媒と しては、 例えば水、 テ トラヒ ドロフラン、 ジェチルエーテル、 メ タノール、 ェタノ 一ノレ、 プロ ノ ノ一ノレ、 ジク ロ ロメ タン、 ジク ロロエタン、 ベンゼン、 トノレ ェン、 キシレン等を単独でまたは混合して用いることができ、 好ましく は テ トラ ヒ ドロフランも しく はメ タノール、 またはそれらと水の混合溶媒が 用いられる。 化合物 ( i-c ) 中、 化合物 ( i -g) から以下に示す方法によって化合物 ( i -h ) を製造するこ とができる。
製造法 6
Figure imgf000033_0001
(式中、 R2、 、 R n、 X、 Yおよび mはそれぞれ前記と同義であり、 R17お よび R18aはそれぞれ前記 R14および前記 R15と同義であり、Tはアル力 リ金属、 アンモニゥム、 ト リ アルキルシリル、 または ト リアルキルチンを表す) 上記の定義において ト リ アルキルシリルおよびト リアルキルチンにおけ るアルキルは前記低級アルキルと同義である。アル力 リ金属と してはナト リ ゥム、 力 リ ゥム等があげられる。
<工程 7 >
化合物（Ι-g)を不活性溶媒中、 0°Cから反応に用いた溶媒の沸点の間の温度、 好ましく は室温〜 200°Cの間の温度で、 1 当量〜大過剰、 好ま しく は 2〜4当 量の TN3 (式中、 Tは前記と同義である）と、 通常反応を加速させるために触 媒量〜大過剰、 好ましく は 0. 5〜2 当量の適当な添加剤の存在下、 1〜200時 間、 好ま しく は 3〜48時間反応させるこ とによ り化合物（I-h)を得るこ とが できる。
適当な添加剤と しては、 例えば四塩化けい素、 塩化リチウム、 塩化アルミ 二ゥム、 塩化アンモニゥム、 塩化ト リ アルキルすず、 酸化ジアルキルすず、 ト リアルキルアルミニウム、 ト リェチルァミ ン'塩酸塩、 ト リェチルァミ ン ' 臭化水素酸塩、 水素化ナト リ ウム、 カ リ ウム tert-ブトキシド、 水酸化ナト リ ウム、 臭化亜鉛等が例示され、 好ま しく は塩化アンモ-ゥム、 酸化ジアル キルすず等が挙げられる。不活性溶媒と しては、例えば水、ァセ トニ ト リル、 ジメチルホルムアミ ド、 ジメチルァセ トアミ ド、 N-メチル- 2-ピロ リ ドン、 ジメチルスノレホキシ ド、 酢酸、 氷酢酸、 テ トラヒ ドロフラン、 ベンゼン、 ト ルェン、 キシレン等を単独でまたは混合して用いるこ とができ、 好ま しく は ジメチルホルムアミ ドまたはトルエンが用いられる。 化合物 ( i-c ) から以下に示す方法によつて化合物 ( i- i ) を製造する と ができる。
製造法 7
Figure imgf000034_0001
(式中、 R2、 R3、 R4、 R5、 R6、 R8、 U、 n、 Xおよび Yはそれぞれ前記と同義で あり、 R18は置換も しく は非置換の低級アルキルを表し、 Qはアル力 リ金属ま たはアルカ リ土類金属を表し、 Q がアルカ リ金属の場合には p は 1 ·を表し、 Qがアル力 リ土類金属の場合には pは 2 を表す）
上記の定義においてアル力 リ金属は前記アル力 リ金属と同義であり、アル カ リ土類金属と してはマグネシゥム、 カルシウム等が挙げられる。
<工程 8 >
化合物（I- c)を不活性溶媒中、 0°Cから反応に用いた溶媒の沸点の間の温度. 好ましく は 70°C〜80°Cの間の温度で、 1 当量〜大過剰、 好ま しく は 4〜8 当 量の（R18C02) PQ (式中、 R18、 Q および p はそれぞれ前記と同義である）と、 1 〜 100時間、 好ま しく は 3〜72 時間反応させることによ り化合物（I-i)を得 ることができる。
不活性溶媒と しては、 例えばジメチルァセ トアミ ド、 N -メチル -2-ピロ リ ドン、 ジメチルスルホキシド等を単独でまたは混合して用いるこ とができ、 好ましく はジメチルスルホキシドが用いられる。 化合物 ( I-c ) から以下に示す方法によつて化合物 ( i-j ) を製造すること ができる。
製造法 8
Figure imgf000035_0001
(式中、 R2、 R R4、 R5、 R R7a、 R8、 ϋ、 n、 Xおよび Yはそれぞれ前記と同 義である）
<工程 9 >
化合物（I-c)を不活性溶媒中、 0°Cから反応に用いた溶媒の沸点の間の温度. 好ましく は 30°C ~ 80°Cの間の温度で、 1 当量〜大過剰、 好ま しく は 2〜8 当 量の R7aSH (式中、 R7aは前記と同義である）と、 1 当量〜大過剰、 好ま しく は 1〜3当量の適当な塩基存在下、 1〜100時間、 好ましく は 3〜72時間反応さ せることによ り化合物（I-j)を得ることができる。
適当な塩基と しては、 例えばト リェチルァミ ン、 ジイソプロピルェチルァ ミ ン、 ピリ ジン、 N-メチルモルホリ ン、 炭酸カ リ ウム、 水素化ナ ト リ ゥム、 氷素化カ リ ウム、 水素化カルシウム、 ジィ ソプロ ピルェチルアミ ン、 1 , 8 - ジァザビシク ロ [5· 4. 0]ゥンデック一7—ェン等を用いることができ、 中でも 1 , 8—ジァザビシク 口 [5. 4. 0]ゥンデック一 7 _ェンが好ま しい。 不活性溶媒 と しては、 例えばジクロロメタン、 クロ 口ホルム、 四塩化炭素、 ジクロ ロエタ ン、 ベンゼン、 トルェン、 キシレン、 醉酸ェチル、 ジメチノレアセ トアミ ド、 Ν - メチル -2-ピロ リ ドン、 ジメチルスルホキシド等を単独でまたは混合して用 いるこ とができ、 好ましく はクロ口ホルムが用いられる。 化合物 ( i-j ) 中、 化合物 ( I-k) から以下に示す方法によって化合物 （1-1；) を製造するこ とができる。
製造法 9
Figure imgf000036_0001
(式中、 R2、 R R4、 R15、 R16、 m、 n、 Xおよび Yはそれぞれ前記と同義であ る）
<工程 1 0〉
化合物 （I-k) を用いて製造法 5 の工程 6 と同様な反応を行うことにより 化合物 （I - 1) を製造することができる。 化合物 (i-i) から以下に示す方法によって化合物 (i-m) を製造すること ができる。
製造法 1 0
Figure imgf000036_0002
(式中、 R2、 R R4、 R18、 n、 Xおよび Yはそれぞれ前記と同義である） <工程 1 1 >
化合物 （I - i) を用いて製造法 5 の工程 6 と同様な反応を行うことにより 化合物 （I - m) を製造することができる。 化合物 (I-m) から以下に示す方法によって化合物 (i-n) を製造すること ができる。 '
製造法 1 1
Figure imgf000037_0001
(式中、 R2、 R R4、 U、 n、 Xおよび Yはそれぞれ前記と同義であり、 R7cは 前記 R7の定義から水素を除いた基を表す）
<工程 1 2〉
化合物 （I-m) を不活性溶媒中、 0°Cから反応に用いた溶媒の沸点の間の温 度、 好ましくは室温から 80°Cの間の温度で、 1 当量〜大過剰、 好ましくは 1 〜3当量の適当な塩基存在下、 1当量〜大過剰、 好ましくは 1〜3当量の R7<;U (式中、 R7。および Uはそれぞれ前記と同義である）と、 1〜48時間、 好ましく は 3〜24時間反応させることにより化合物（I - n)を得ることができる。
適当な塩基と しては、 例えば炭酸カリ ゥム、 水素化ナトリ ゥム、 水素化力 リ ウム、 水素化カルシウム、 低級アルキルリチゥム等が例示され、 好ましく は、 水素化ナトリ ゥム、 水素化力リ ゥム等が挙げられる。 不活性溶媒として は、 例えばジクロロメ タン、 クロ口ホルム、 四塩化炭素、 ジクロロェタン、 ベ ンゼン、 トルエン、 キシレン、 酢酸ェチル、 ジメ チノレホノレムアミ ド、 ジメ チ ルァセ トアミ ド、 N-メチノレ- 2—ピロ リ ドン、 テ ト ラ ヒ ドロフラン、 ジェチル エーテル等を単独でまたは混合して用いることができ、好ましくはクロロホ ルムが用いられる。 化合物 ( I-m) において n= l である化合物 ( I-ma) から以下に示す方法に よって化合物 （I-0 ) を製造することができる。
製造法 1 2
Figure imgf000037_0002
(式中、 R2、 R R4、 Xおよび Yはそれぞれ前記と同義である） <工程 1 3 >
化合物 （I- ma) を不活性溶媒中、 0°Cから反応に用いた溶媒の沸点の間の 温度、 好ま しく は室温から 60°Cの間の温度で、 1 当量〜大過剰、 好ましく は 3〜6当量の適当な酸化剤存在下、 1〜48時間、 好ま しく は 3〜24時間処 理することによ り化合物（I-o)を得ることができる。
適当な酸化剤と しては、 例えば二酸化マンガン、 クロム酸、 クロ 口クロム 酸ピリジニゥム、 ニク ロム酸ピリ ジニゥム、 過マンガン酸カ リ ウム、 三酸化硫 黄〜ピリ ジン、 ォキソン等が挙げられ、 好ましく は二酸化マンガンが挙げられ る。 不活性溶媒と しては、 例えばジクロ ロメ タン、 クロ口ホルム、 四塩化炭 素、 ジクロ ロェタン、 ベンゼン、 トルエン、 キシレン、 酢酸ェチル、 酢酸、 プ ロ ピオン酸、 酪酸、 ト リ フルォロ酢酸、 水、 ピリ ジン、 ジメチルホルムアミ ド、 ジメ チルァセ トアミ ド、 N-メチル -2-ピロ リ ドン、 1 , 4 -ジォキサン、 テ トラ ヒ ドロフラン、 ジェチルエーテル等を単独でまたは混合して用いるこ とができ、 好ま しく はジメチルホルムアミ ド、 テ トラ ヒ ドロフラン等が用 いられる。 化合物 （1- 0 ) から以下に示す方法によって化合物 （I-p) を製造すること ができる。
製造法 1 3
Figure imgf000038_0001
(式中、 、 R R4、 Xおよび Yはそれぞれ前記と同義である）
<工程 1 4 >
化合物 （1- 0) を不活性溶媒中、 0°Cから反応に用いた溶媒の沸点の間の温 度、 好ま しく は室温から 90°Cの間の温度で、 1 当量〜大過剰、 好ま しく は 1 〜3 当量のヒ ドロキシルァミ ンも しく はその塩酸塩、 硫酸塩、 パラ トルェン スルホン酸塩等、 0-フヱ二ルカ'ーパミルヒ ドロキルアミ ンも しく はその塩酸 塩、 硫酸塩、 パラ トルエンスルホン酸塩等、 または ヒ ド pキシベンズァ ミ ド、 好ましく はヒ ドロキシルァミ ンと、 1〜48時間、 好ま しくは 3 ~ 24時 間反応させることによ り化合物（I-P)を得ることができる。 必要によ り、 1 当量〜大過剰、 好ま しく は 1〜 3 当量の適当な脱水剤の添加や、 1 当量〜大 過剰、 好ま しく は 2〜6 当量の適当な塩基の添加、 またはマイクロ波照射を 行ってもよい。
適当な脱水剤と しては、 例えば無水酢酸、 無水フタル酸、 硫酸水素ナ ト リ ウ ム、 ォキソン、 ギ酸ナ ト リ ウム、 酸化ジアルキルすず、 アルミナ、 シリカゲル、 酢酸ナト リ ウム、 ホルムアミ ド、 五酸化二リ ン、 塩化鉄（111)、 ギ酸、 酢酸、 プ ロピオン酸、 ォキシ塩化リ ン、 パラ トルエンスルホン酸等が例示され、 好まし くは無水酢酸、 無水フタル酸等が挙げられる。 適当な塩基と しては、 例えばト リエチルァミン、 ピリ ジン、水素化ナ ト リ ウム、水素化力 リ ゥム等が例示され、 好ましく は ト リェチルァミンまたはピリ ジンが挙げられる。
不活性溶媒と しては、 例えばジクロロメ タン、 クロ口ホルム、 四塩化炭素、 ジク ロ ロェタン、 ベンゼン、 卜/レエン、 キシレン、 ニ トロベンゼン、 ァセ トニ ト リル、 酢酸ェチル、 酢酸、 プロピオン酸、 酪酸、 トリ フルォロ酢酸、 ピリ ジ ン、 ジメチルホルムアミ ド、 ジメチルァセ トアミ ド、 N-メチノレ- 2-ピロ リ ド ン、 1 , 4 -ジォキサン、テ トラヒ ドロフラン、ジェチルエーテノレ、 メタノーノレ、 ェタノール、 プロパノール等を単独でまたは混合して用いることができ、 好 ま しく はァセ トニト リル、 ジメチルホルムァミ ド等が用いられる。 化合物 （I - p) から以下に示す方法によって化合物 （I - q) を製造すること ができる。
製造法 1 4
Figure imgf000040_0001
(式中、 R2、 R3、 R4、 T、 Xおよび Yはそれぞれ前記と同義である）
く工程 1 5〉
化合物 （I - P) を用いて製造法 6の工程 7 と同様な反応を行うことにより 化合物 （I_q) を製造することができる。 化合物 ( I-c ) から以下に示す方法によって化合物 ( i-r) を製造すること ができる。
製造法 1 5
Figure imgf000040_0002
(式中、 R2、 R3、 R4、 R5b、 R6b、 R8、 U、 n、 Xおよび Yはそれぞれ前記と同義 であり、 Qaは前記と同義のアルカ リ金属を表す） ，
<工程 1 6〉
化合物 （I-c) を不活性溶媒中、 室温から反応に用いた溶媒の沸点の間の 温度、 好ましくは 40°C〜80°Cの間の温度で、 1当量〜大過剰、 好ましくは 2 〜4 当量の QaCN (式中、 Qaは前記と同義である）、 好ましく は青酸ナト リ ウ ムと、 1〜48時間、好ましくは 3〜24時間反応させることによ り化合物（I- r) を得ることができる。
不活性溶媒と しては、 例えばジクロロメタン、 クロ口ホルム、 四塩化炭素、 ジクロロェタン、 ベンゼン、 トノレェン、 キシレン、 ジメチノレホノレムアミ ド、 ジ メチルァセ トアミ ド、 N -メチル- 2-ピロ リ ドン、 1 , 4 -ジォキサン、 テ トラヒ ドロフラン等を単独でまたは混合して用いることができ、好ましくはジメチ ルホルムアミ ド等が用いられる。 化合物 ( i-r) から以下に示す方法によって化合物 ( i-s ) を製造すること ができる。
製造法 1 6
Figure imgf000041_0001
(式中、 R2、 R3、 R4、 T、 n、 Xおよび Yはそれぞれ前記と同義である） く工程 1 7 >
化合物 （I- r) を用いて製造法 6の工程 7 と同様な反応を行うことにより 化合物 （I - s) を製造することができる。 化合物 ( I-r) から以下に示す方法によって化合物 ( I - 1) を製造すること ができる。
製造法 1 7
Figure imgf000041_0002
(式中、 R2、 R R4、 n、 Xおよび Yはそれぞれ前記と同義である） く工程 1 8 >
化合物 （I - r) を用いて製造法 5の工程 6 と同様な反応を行うことにより 化合物 （I - 1) を製造することができる。 化合物 （nib) から以下に示す方法によって化合物 (I-u) を製造する とができる。
製造法 1 8
Figure imgf000042_0001
(式中、 R2、 R3、 R4、 R5、 R6、 R5b、 R6b、 R7c、 R8、 R9、 R10 Ru、 R18、 Q、 p、 U、 Xおよび Yはそれぞれ前記と同義である）
<工程 1 9 >
化合物 （Illb ) を用いて製造法 7の工程 8 と同様な反応を行うことによ り化合物 （V) を製造することができる。
<工程 2 0 >
化合物 （V) を用いて製造法 5の工程 6 と同様な反応.を行うことにより化 合物 （VI) を製造することができる。
く工程 2 1 〉
化合物 （VI) を用いて製造法 1 2の工程 1 3 と同様な反応を行うことによ り化合物 (VII) を製造することができる。 く工程 2 2 〉
化合物 （VI I ) を不活性溶媒中、 通常 0°C〜80 °Cの間の温度で、 2〜4 当量 の硝酸銀、 酸化銀（1)、 酸化銀（Π)、 クロム酸、 クロ口クロム酸ピリジニゥム、 二クロ口クロム酸ピリ ジ-ゥム、 過マンガン酸カ リ ゥム、 過ョゥ素酸ナ 卜 リ ウ ム、 過塩素酸ナ ト リ ゥム、 過酸化水素、 亜塩素酸ナ ト リ ゥム等の酸化剤、 好ま しくは硝酸銀または過塩素酸ナ ト リ ウム存在下で、 10 分間〜 24 時間、 好ま し くは 1〜4 時間処理することによ り化合物（VI I I)を製造することができる。 必 要によ り、 添加剤と して、 0. 1〜4 当量の酢酸等の有機物、 または硫酸、 リ ン 酸二水素ナ ト リ ウム、 スルファミン酸、 酸化ルテミ ゥム等の無機物を加えても よい。 .
不活性溶媒と しては、 例えばジェチルエーテル、 テ トラヒ ドロフラン、 1 , 4- ジォキサン、 ジメチルホルムアミ ド、 ジメチルァセ トアミ ド、 ジメチルスルホ キシド、 ベンゼン、 トノレエン、 キシレン、 ジクロ ロメ タン、 ク ロ ロホゾレム、 1 , 2— ジクロロェタン、 ァセ トニ ト リル、 酢酸ェチル、 酢酸メチル、 メチルェチルケ トン、 塩酸、 酢酸、 無水酢酸、 硫酸、 水等が挙げられ、 好ましく はァセ トニ ト リル、 水等が挙げられ、 これらは単独でまたは混合して用いることができる。 <工程 2 3 〉
化合物 （VI I I ) を不活性溶媒中、 通常 0°C〜80 °Cの間の温度、 好ましく は 室温で、 1〜20 当量のハロゲン化剤と 10 分間〜 24 時間反応させ、 その後、 1 当量〜大過剰の R7c; 0H (式中、 は前記と同義である） と反応させることによ り化合物（IX)を製造することができる。
ハロゲン化剤と しては、 例えば塩化チォ -ル、 ォキサリルクロ リ ド、 ォキシ 塩化リ ン等が挙げられ、 好ましくは塩化チ'ォニルが挙げられる。 不活性溶媒と しては、 例えばジク ロ ロメ タン、 ク ロ ロホノレム、 テ トラヒ ドロ フラン、 ジメチ ルホルムアミ ド、 ジメ チルァセ トアミ ド、 1 , 4-ジォキサン、 ァセ トニ ト リル、 ベンゼン、 トルエン、 キシレン等が挙げられ、 これらは単独でまたは混合して 用いることができる。 不活性溶媒と して好ましくはジクロ口メタンが挙げられ る。
<工程 2 4〉
化合物 （IX) を用いて製造法 1 の工程 2 と同様な反応を行う ことにより化 合物 （X) を製造することができる。
<工程 2 5 >
化合物 （X) を用いて製造法 2の工程 3と同様な反応を行うことにより化 合物 ( XI) を製造するこ とができる。
<工程 2 6 >
化合物 （XI) を用いて製造法 1の工程 1 と同様な反応を行うことにより化 合物 （I-u) を製造することができる。 化合物 ( I-u) から以下に示す方法によって化合物 ( i-v) を製造すること ができる。
製造法 1 9
Figure imgf000044_0001
(I-u) (l-v)
(式中、 R2、 R3、 R4、 R7\ Xおよび Yはそれぞれ前記と同義である）
<工程 2 7 >
化合物 （I-u) を用いて製造法 5の工程 6 と同様な反応を行うことにより 化合物 （I-v) を製造することができる。 化合物 ( I-v) から以下に示す方法によって化合物 ( i-w) を製造すること ができる。
製造法 2 0
Figure imgf000045_0001
(式中、 R2、 R3、 R4、 R5a、 R6a、 Xおよび Yはそれぞれ前記と同義である） <工程 2 8 >
化合物 （I- V) を不活性溶媒中、 通常 0°C〜80 °Cの間の温度、 ましく は室 温で、 1〜20当量のハロゲン化剤と 10分間〜 24時間反応させ、 その後、 1 当量 〜大過剰の R5aR6aNH (式中、 R5aおよび R6aはそれぞれ前記と同義である） と反 応させることによ り化合物（I-w)を製造することができる。 必要に応じて、 1 当量〜大過剰の適当な塩基を加えてもよい。
ノヽロゲン化剤どしては、 例えば塩化チォニル、 ォキサリルクロ リ ド、 ォキシ 塩化リ ン等が挙げられ、 好ましく は塩化チォニルが挙げられる。 適当な塩基と しては、例えばピリ ジン、 ト リェチルァミ ン、ジィソプロピルェチルァミ ン、 N-メチルモルホリ ン等が例示され、 好ま しく は ト リ ェチルァミ ンが挙げら れる。 不活性溶媒と しては、 例えばジクロロメタン、 クロ口ホルム、 テ トラヒ ドロフラン、ジメチルホルムアミ ド、ジメチルァセ トアミ ド、 1 , 4-ジォキサン、 ァセ トニ ト リル、 ベンゼン、 トルエン、 キシレン等が挙げられ、 これらを単独 でまたは混合して用いることができる。 不活性溶媒と して好ましく はジクロ口 メタンが挙げられる。
化合物（I-w)の製造においては、 ぺプチド化学で常用される手法を用いる こともできる。 すなわち、 化合物（I - V)に不活性溶媒中、 0. 5〜10 当量の適 当な縮合剤と共に 1 〜10 当量の R5aR6aNH (式中、 R5aおよび R6aはそれぞれ前 記と同義である） を加え、 通常、 0°C〜50 °Cの間の温度で 10分間〜 70時間 反応させることによ り化合物（I-W)を得ることができる。
不活性溶媒と しては、例えばジェチルエーテル、テ トラヒ ドロフラン、 1 , 4- ジォキサン、 ジメチルホルムアミ ド、 ジメチルァセ トアミ ド、 ジメチルス ノレホキシド、 ベンゼン、 トノレェン、 キシレン、 ァセ トニ ト リノレ、 酢酸ェチ ル、 ピリ ジン、 ジクロロメタン、 ク ロ口ホルム、 四塩化炭素等が挙げられ、 好ま しく はテ トラヒ ドロフラン、 ジメチルホルムァミ ド等が挙げられる。 適当な縮合剤と しては、 例えば 1 , 3 -ジシク ロへキシルカルポジイ ミ ド、 1 -ェチル -3_ (3-ジメチルァミ ノプロ ピル）カルポジイ ミ ド塩酸塩、 1_ェチル - 3- (3-ジメチルァミ ノプロ ピル）力ルボジィ ミ ド結合ポリ スチレンレジン ( EDC レジン） 等が挙げられる。 また、 N-ヒ ドロキシこはく酸イ ミ ド、 3， 4_ ジヒ ドロ -3-ヒ ドロキシ— 4—ォキソー 1 , 2， 3-ベンゾ ト リアジン、 1—ヒ ドロキシ ベンゾ ト リアゾール等、 好ましく は 1-ヒ ドロキシベンゾ ト リ アゾール等の 添加剤を加えることもできる。
EDC レジンは、 テ 卜ラヘドロン レターズ ( Tetrahe dron Lett ers)、 34卷、 48号、 7685頁 （1993年） 記載の方法で製造することができる。 化合物 （I) 中、 化合物 （I-X ) から、 以下に示す方法によって化合物 （I-y) を製造することができる。
製造法 2 1
Figure imgf000046_0001
(式中、 、 R3、 R\ n、 Xおよび Yはそれぞれ前記と同義であり、 R22および R23 は同一または異なって水素、 置換も しく は非置換の低級アルキル、 置換 も しく は非置換のシクロアルキル、 置換も しく は非置換の低級アルケニル、 置換も しく は非置換の低級アルキニル、 置換も しく は非置換のァラルキル、 または置換も しく は非置換の複素環アルキルを表す）
上記の定義において低級アルキル、 シクロアルキル、 低級アルケニル、 低 級アルキ-ル、 ァラルキル、 および複素環アルキルはそれぞれ前記と同義で あり、 それらの置換基もそれぞれ前記と同義である。
<工程 2 9 > 化合物 （I- x) を不活性溶媒中、 1 当量〜大過剰の、 好ましくは 1 ~ 10 当 量の R22R23C0 (式中、 R22および R23はそれぞれ前記と同義である） と、 1 当 量〜大過剰、 好ましくは 1〜3 当量の適当な還元剤の存在下、 通常 - 78°C〜 100 °Cの間の温度、好ましくは 0°C〜 50 での間の温度で 10分間〜 48時間反 応させることにより化合物（Ι-y)を得ることができる。
適当な還元剤としては、 例えば水素化ホゥ素ナトリ ウム、 ト リァセ トキシ 水素化ホウ素ナトリ ゥム、 シァノ水素化ホウ素ナトリ ゥム等が挙げられ、 好 ましくはシァノ水素化ホウ素ナトリ ウムが挙げられる。 必要により、 触媒量 〜溶媒量、 好ましくは 0. 5当量〜溶媒量の適当な酸を添加してもよい。 適当 な酸と しては、 例えばギ酸、 酢酸、 ト リフルォロ酢酸、 プロピオン酸、 塩酸 等が挙げられ、 好ましくは酢酸が挙げられる。
不活性溶媒と しては、例えばジクロロメタン、クロ口ホルム、四塩化炭素、 ジク ロ ロェタン、 ベンゼン、 トノレェン、 キシレン、 ジェチノレエーテノレ、 1 , 4- ジォキサン、 ジメチルホルムア ミ ド、 ジメ チルァセ トアミ ド、 ァセ トニ ト リ ル、 へキサン、 ギ酸、 酢酸、 トリ フルォロ酢酸、 プロピオン酸、 塩酸等が例 示され、 これらを単独でまたは混合して用いることができる。 好ましく は、 テトラヒ ドロフラン、 酢酸等が挙げられる。 化合物（I)および原料化合物における各官能基の変換および置換基に含ま れる官能基の変換は、 公知の方法 [例えば、 コンプリへンシプ 'オーガニッ ク · 卜 ラ ン ス フ ォ ー メ ー シ ョ ン ズ 第二版 (Comprehens i ve Organi c Transformat i ons, the second edi t i on)、 R. C. ラロ ック (Larock)著、 ショ ン · ワイ リ ー.アン ド'サンズ 'イ ンコーポレーティ ッ ド（John Wi ley & Sons Inc. ) (1999年）に記載の方法] 等によつて行うことができる。
上記の方法等を適宜組み合わせて実施することにより、所望の位置に所望 の官能基を有する化合物（I)を得ることができる。
上記製造法における中間体および生成物の単離 ·精製は、 通常の有機合成 で用いられる方法、 例えば濾過、 抽出、 洗浄、 乾燥、 濃縮、 結晶化、 各種ク 口マトグラフィ一等を適宜組み合わせて行うことができる。 さらに一般的な 並列合成法で常用される精製法、 例えば、 スカベンジャーレジン、 イオン交 換レジンを用いた精製法によっても行うことができる。 また、 中間体におい ては、 特に精製することなく次の反応に供することもできる。
化合物（I)には、 位置異性体、 幾何異性体、 光学異性体または互変異性体 のような異性体が存在し得るものもあるが、 これらを含め可能な全ての異性 体および該異性体のいかなる比率における混合物も本発明の喘息の予防お よび Zまたは治療剤に使用できる。
化合物（I)の塩を取得したい場合には、化合物（I)の塩が得られるときはそ のまま精製すればよく、 また化合物（I)が遊離の形で得られるときは化合物
(I)を適当な溶媒に溶解または懸濁し、 酸または塩基を加えて単離 · 精製す ればよい。
また、 化合物（I)またはその薬理学的に許容される塩は、 水または各種溶 媒との付加物の形で存在することもあるが、 これらの付加物も本発明の喘息 の予防および/または治療剤に使用できる。
以下、第 1表〜第 1 3表に本発明の喘息の予防およびノまたは治療剤とし て用いられる化合物 （I) の具体例を示すが、 本発明の喘息の予防および または治療剤と して用いられる化合物範囲はこれらの化合物に限定される ことはない。
Figure imgf000049_0001
化合物 -NR5R6 番号
— N N-CH3
Figure imgf000049_0002
—N O
Figure imgf000049_0003
-N )-N
Figure imgf000049_0004
10 —
Figure imgf000049_0005
第 1表 (続き) 化合物 -NR5RD
CH3
15 — N 0-CH3
,Ο
16 H3
。
CH3
17 — N OH
\ _ I
Figure imgf000050_0001
CH3一一 NNI
H
19 «-N OH
P
20
OH
CH
21 - N
N
Figure imgf000050_0002
23 -NH O-CH3
24 -NH OH
25 — NH2
CH3 -N N-
26 NH
N
27 -N 第 2表
Figure imgf000051_0001
化合物 -NR5R6 質量分析値
Figure imgf000051_0002
30
ぐ MS m/z 409 (M+H)+
く » MS m/z 471 (M+H)+
Figure imgf000051_0003
第 3表
Figure imgf000052_0001
化合物
-N 5 6 質量分析値
Figure imgf000052_0002
48 -N O Ό MS m/z 501 (M+H)+
49 Ό MS m/z 503 ( +H)+
Figure imgf000052_0003
第 4表
Figure imgf000053_0001
化合物 -NR5R6 -Y 質量分析値 番号
N-
52 •^N N-CH3 H3C~<' MS m/z 452 (M+H)+
\ _ t
Figure imgf000053_0002
N、
58 H3C-<' MS m/z 528 (M+H)
,M
N、
59 -N H~ CH3 ぐ MS m/z510( +H)+
N一
ル
60 — N O H3C-<' MS m/z 439 (M+H)
\ _ I N-
N、
61 H3C MS m/z 441 ( +H)+
CH3 N、
62 H3C MS m/z 439 ( +H)+
63 H3C ' MS m/z 485 (M+H)
Figure imgf000053_0003
第 5表
Figure imgf000054_0001
化合物 -N 5R° 質量分析値
Figure imgf000054_0002
CH3 •CH3
74 - ^-CH3 MS m/z 453 (M+H)+ ■CH3
Figure imgf000054_0003
第 6表
Figure imgf000055_0001
化合物 — R5R6 -Y 質量分折値 番号
H3C
76 •-N N-CH3 MS m z 466 ( +H)+
H3C
77 MS m/z 449 (M+H)+
H3C
78 o MS m/z 437 (M+H
79
80
Figure imgf000055_0002
cro H3C
81 ^ 、
MS m/z 541 ( +H)+
Figure imgf000055_0003
H3C
83 •-N N 。」 CH3 MS m/z 524 (M+H)+
Figure imgf000055_0004
H3C、
85
ト MS m/z 455 (M+H)+
Figure imgf000055_0005
H3C
87 .CO 3 \
MS m/z 499 (M+H)
J 第 7表
Figure imgf000056_0001
化合物 - NR5R。 — Y
88 -N ぐ
N-
Figure imgf000056_0002
N、 N
90 -N
N一
Figure imgf000057_0001
$ 第 9表
Figure imgf000058_0001
化合物 -R'
103
104
N •NH
105
106
-NH
PH
107
O
Figure imgf000058_0002
110 CH3 o
OH
111
O
Figure imgf000059_0001
化合物 -NR5aRお
112 — Ν— CH3
113 — Ν
114 -Ν >— OH
115 -NH OH
116 -NH N-
117 -N p
OH
118 — N
OH
119 -NH2 第 11表
Figure imgf000060_0001
化合物 - NR5R。
120 一
Figure imgf000060_0002
第 12表
Figure imgf000061_0001
化合物
Figure imgf000061_0002
第 13表
化合物
Figure imgf000061_0003
第 14表 化合物 分析値
5 MS m/z 508 (M+H)
6 MS m/z 563 (M+H)4
7 MS m/z 570 (M+H)+
8 MS m/z 571 ( +H)+
9 MS m/z 553 (M+H)+
10 MS m/z 484 (M+H)+
11 MS m/z 482 (M+H)+
12 MS m/z 528 (M+H)+
図面の簡単な説明
第 1図は化合物 1 (腹腔内投与） の抗原誘発気道収縮に対する抑制作用を 示す。 第 1図において符号 （# #、 * *) は各々下記の意味を表す。
# # ： p=0.0043 (陽性対照群の陰性対照群対比 ； student's t-test)
# *： p=0.0047 (化合物 1腹腔内投与群の陽性対照群対比； student's t-test) 第 2図は化合物 1 (経口投与） の抗原誘発気道収縮に対する抑制作用を示 す。 第 2図において符号 （# # #、 *) は各々下記の意味を表す。
# # # ： pく 0.0001 (陽性対照群の陰性対照群対比 ； student's t-test)
# ： p=0.0248 (化合物 1経口投与群の陽性対照群対比 ； student's t-test) 第 3図は化合物 1 の抗原誘発気道過敏性に対する抑制作用を示す。第 3図 において符号 （#) は下記の意味を表す。
# ： p=0.0182 (陽性対照群の陰性対照群対比 ； student's t-test) 第 4図は化合物 1 の抗原誘発気道内好酸球浸潤に対する抑制作用を示す < 第 4図において符号 （# # #、 * * *) は各々下記の意味を表す。
# # # ： p=0.0009 (陽性対照藓の陰性対照群対比 ； Aspin-Welch test) * * * ： p=0.0030 (化合物 1投与群の陽性対照群対比 ； student's t- test)
* * * * ： p=0.0015 (比較対照群の陽性対照群対比 ； student's t- test) 次に化合物の薬理作用について試験例で説明する。
試験例 1 ： GPR4拮抗作用
参考例 6 1で得られた GPR4のアツセィ細胞 （該アツセィ細胞は 17 ーェ ストラジオールの刺激により GPR4を発現する） を白色プレートに 1 ゥエル 当たり 105個播種し、 反応液中 10 nmol/Lになるように 17 j3—エス トラジオ ール （17 |3 -estradiol シグマ社製） を培地で希釈したものと試験化合物を 加え、 37°C、 5%C02 ^ンキュベータ一中で 6 時間反応させた。その後、 Steady Glo Luciferase Assay System (Promega社製） 溶液をカロえて反応を停止し、 トップカウント （Packard, Meriden, CT， USA) で 1秒間の発光量を測定し た。
試験化合物の活性 （拮抗作用） は、 下の式に示す通り 17 —エス トラジ オール添加時と非添加時のカウント数 (count per second) をもとに算出し た阻害率で表した。 IC5。値は、 阻害率から Logit- Log変換法の線形近似解析 法によって算出した。
式中、 A、 B、 Cはそれぞれ以下の意味を表す。
Α : 17 —エス トラジオールおょぴ試験化合物を添加時の力ゥント数 Β : 17 —エス トラジオールおよび試験化合物の両方とも非添加時のカウン ト数
C ： 17 β —エス トラジオールのみ添加時の力ゥント数 阻害率 （％) = [ 1 — { ( A— Β ) / ( C - Β ) }] X 1 0 0 結果を第 1 5表に示す。 5表
化合物番号 IC5oUimol/Lノ
1 4.0
2 3.2
3 2.3
4 5.8
5 14 以上の結果より、 化合物（I)が、 GPR4に拮抗することが示された 試験例 2 ：抗原誘発気道収縮、 気道過敏性および気道内好酸球浸潤に対する 抑制作用
BALB/c雄性マウス（7週齢）に 50 g卵白アルブミンおよび 1 mg水酸化アル ミニゥムを生理食塩液 （大塚生食注、 大塚製薬） に混合させて得られた混合 液を 1週間の間隔をあけて 2回腹腔内投与して感作し、 最終感作 14 13、 18曰お よび 22日後 1 %卵白アルブミン生理食塩溶液または生理食塩液（陰性対照 群）をそれぞれ 30分間吸入させ抗原抗体反応を惹起した。 気道収縮反応測定 の場合は、 0. 5 %メチルセルロース水溶液 （溶媒） に化合物 1を懸濁し、 最 終感作 14日後の抗原吸入 1時間前に 100 mg/kgを経口投与、 または 5分前に 30 mg/kgを腹腔内投与した。 気道過敏性または気道内好酸球浸潤を測定する際 には、 化合物 1を上記と同様に懸濁し、 最終感作 14日、 18ョおよび 22日後の 各抗原吸入 1時間前と 6時間後に 100 mg/kgで経口投与し、 比較対照として、 喘息治療に用いられているステロイ ド類であるプレドニゾ口ンを最終感作 14日、 18日および 22日後の各抗原吸入 1時間前に 30 mg/kg ( 0. 5 %メチルセル ロース水溶液に懸濁させた溶液として） で 1回ずつ経口投与した。 陽性対照 群には試験化合物懸濁液の代わりに溶媒を投与した（気道収縮反応測定の場 合、 経口投与では最終感作 14日後の抗原吸入 1時間前に 1回、 腹腔内投与では 最終感作 14日後の抗原吸入 30分前に 1回、 溶媒を投与した。 気道過敏性およ び気道内好酸球浸潤を測定する場合は、 最終感作 14日、 18日および 22日後の 各抗原吸入の 1時間前と 6時間後にそれぞれ溶媒を投与した） 。
気道収縮反応は最終感作 14 日後の抗原吸入直後から 30 分間の気道抵抗 (penh)をマウス呼吸機能測定装置（BioSystem XA； Buxco Electronics, Inc. , Sharon, CT, USA)で測定し、 30分間の曲線下面積（AUC。_3。nin)を算出して評価 した。 また、 最終抗原吸入の 24時間後に気道過敏性および気管支肺胞洗浄 液中の好酸球浸潤を評価した。
気道過敏性試験は 1.5-25 mg/mLのメサコリ ンを 3分間吸入 （最終感作 22 日後の 24 時間後に吸入） させた後の気道反応をマウス呼吸機能測定装置 (BioSystem XA； Buxco Electronics, Inc. , Sharon, CT, USA)で測定し、 メ サコリ ン用量—気道反応曲線から曲線下面積（AUC)を算出して評価した。 好 酸球浸潤は回収 した肺胞洗浄液中の総細胞数を 自動血球数測定装置 (Celltac α ΜΕΚ-6158； 日本光電、 東京）で測定した後、塗沫標本を Cytospin3 (Shandon, Inc. , Pittsburgh, PA, USA)で作製し、 顕微鏡下、 形態学的に分 類して評価した。好酸球数は総細胞数に好酸球の細胞の百分率を乗じて算出 した。 試験は一群 10匹で実施した。
気道収縮に関する結果を第 1図（腹腔内投与）と第 2図（経口投与）、気道過 敏性に関する結果を第 3図、気道内好酸球浸潤に関する結果を第 4図に示す。 . 第 1図に示すように、陽性対照群の気道収縮反応の AUC。_3。nin (18.22±1.02, 平均土標準誤差）は陰性対照群の AUC。— 3。nin (14.77±0.27)と比べ有意に増加 (P=0.0043、 student's t- test)した。 化合物 1腹腔内投与群の AUC。— 3。min は 14.60±0.46であり、 陽性対照群と比べ、 気道収縮反応を 105%有意に抑制 した（P=0.0047、 student's t-test)0
第 2図に示すように、陽性対照群の気道収縮反応の AUC。— 3。nin (19.61±0.75, 平均土標準誤差）は陰性対照群の AUC。_3。min (13.37±0.20)と比べ有意に増加 (P<0.0001、 student's t-test)した。ィ匕合物 1経口投与群の AUC。— 30nin は 16.85 ±0.84 であり、 陽性対照群と比べ、 気道収縮反応を 44%有意に抑制した (P=0.0248、 student's t-test) 0
第 3図に示すように、 陽性対照群の気道過敏性の AUC (335.13±52.6, 平 均土標準誤差）は陰性対照群の AUC (184.7 ± 27.5) と比べ有意に増加
(P=0.0182、 student's t- test)した。 ィ匕合物 1投与群の AUCは 243.23 ±48.7 であり、 陽性対照群と比べ、 気道過敏性を 60%抑制した。 プレドニゾ D ン 投与群の AUCは 269. 12 ± 46. 7であり、陽性対照群と比べ、気道過敏性を 43 % 抑制した。
第 4図に示すように、陰性対照群の気管支肺胞洗浄液中の好酸球数は一個 体あたり 0. 00 ± 0. 00 X 105個であり、 陽性対照群では 2. 77 ± 0. 46 x 105個 と顕著な増加が認められた（P=0. 0009、 Asp in-Wel ch te st)。 化合物 1投与群 およびプレドニゾ口ン投与群での好酸球数は一個体あたりそれぞれ 0. 92土 0. 26 X 105個、 0. 76 ± 0. 25 x 105個であった。 陽性対照群と比べ、 化合物 1 投与群では、好酸球数を 67 %有意に減少させた（P=0. 0030、 student's t- te s t) : プレドニゾロン投与群では、 好酸球数を 73%有意に減少させた（P=0. 001 5、 student's t一 te s 。
以上の結果から、配列番号 1 1記載のァミノ酸配列を有する蛋白質のシグ ナル伝達に関する機能を抑制する物質は搔痒治療剤と して有用であること が示唆された。
本発明に係る医薬は、 式 （I ) で表される含窒素三環式化合物もしく はそ の四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩、ならびにそれ らの水和物おょぴ溶媒和物からなる群から選ばれる物質を有効成分と して 含むことを特徴とする。 本発明に係る医薬と しては、 有効成分である上記物 質をそのまま投与してもよいが、 一般的には、 有効成分である上記の物質と 1または 2以上の製剤用添加物とを含む医薬組成物の形態で投与すること が望ましい。 このような医薬組成物は、 それ自体製剤学の分野で周知または 慣用の方法に従って製造することが可能である。 また、 医薬組成物の形態で ある本発明に係る医薬には、他の医薬の有効成分が 1または 2以上含まれて いてもよい。 なお、 本発明の医薬は、 ヒ トを含む哺乳類動物に適用可能であ る。
本発明の医薬の投与経路は特に限定されず、経口投与または静脈内投与等 の非経口投与のいずれかから治療および/または予防のために最も効果的 な投与経路を適宜選択することができる。経口投与に適する製剤の例と して は、 例えば、 錠剤等を挙げることができ、 非経口投与に適する製剤の例と し ては、 例えば、 注射剤等を挙げることができる。 錠剤等の固形製剤の製造には、 例えば、 乳糖、 マンニッ ト等の賦形剤 ； デ ンプン等の崩壊剤； ステアリ ン酸マグネシウム等の滑沢剤； ヒ ドロキシプロ ピルセルロース等の結合剤；脂肪酸エステル等の界面活性剤； グリセリ ン等 の可塑剤等を用いることができる。
非経口投与に適する製剤のうち注射剤等の血管内投与用製剤は、好ましく はヒ ト血液と等張の水性媒体を用いて調製することができる。 例えば、 注射 剤は、 塩溶液、 プドウ糖溶液、 塩水とプドウ糖溶液の混合物等から選ばれる 水性媒体を用い、 常法に従って適当な助剤とともに溶液、 懸濁液、 または分 散液と して調製することができる。 非経口用の製剤の製造には、 例えば、 希 釈剤、 香料、 防腐剤、 賦形剤、 崩壊剤、 滑沢剤、 結合剤、 界面活性剤、 可塑 剤等から選択される 1または 2以上の製剤用添加物を用いることもできる。 本発明の医薬の投与量および投与頻度は特に限定されず、有効成分である 上記物質の種類、 投与経路、 治療およびノまたは予防の目的、 患者の年齢お よび体重、症状の性質および重篤度等の種々の条件に応じて適宜選択するこ とが可能である。 例えば、 成人 1 日当り 0. l〜100mg/ kgを 3〜4回に分けて 投与するのが好ましい。 しかしながら、 これら投与量および投与回数は前述 の種々の条件等により変動する。 発明を実施するための最良の形態
以下に、 本発明を参考例および実施例により さらに具体的に説明するが、 本発明の範囲はこれらの実施例等により限定されることはない。
下記参考例中の各化合物の物理化学的データは、以下の機器類によって測 定した。
】H 画： JEOL JNM-EX270 (270 MHz)または JEOL J腿- GX270 (270 MHz) MS : Mi cromass LCTまたは Mi cromass Quatro ( APCI法により測定） 参考例 1 ：化合物 1 {2 - (2—ェチルー 5， 7—ジメチルー 3H—ィミダゾ [4, 5 - b] ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 8—（4—メチルビペラジン一 1一ィルメチル）一 10, 1 1—ジヒ ドロ一5 H—ジベンゾ [b， f]ァゼピン）の合成
特開平 7 - 61983に記載された 2—（2—ェチルー 5 , 7—ジメチルー 3H—イミ ダゾ [4, 5 - b]ピリ ジン _3—ィルメチル）一 10, 11—ジヒ ドロ 一 5H—ジベンゾ [b， f]ァゼピン （30.0 g, 78.4 mmol) をク ロ口ホルム （300 mL) と酢酸 （300 mL) の混合溶媒に溶解し、 1—メチルビペラジン （23.6 g, 236 mmol) およ びホルムアルデヒ ド （37 。/。水溶液、 7.64 g, 94.1 mmol) を加え、 60°Cに加 熱し、 18 時間撹拌した。 反応の進行を薄層クロマトグラフィーで確認した 後、 氷冷下に飽和重曹水を加え、 酢酸ェチルで抽出した。 有機層を飽和重曹 水、 水、 飽和食塩水で順次洗浄し、 無水硫酸ナト リ ゥムで乾燥後、 減圧下で 濃縮した。 析出した結晶を酢酸ェチルでト リチユ レーシヨ ンし、 化合物 1
(27.4 g, 55.4 mmol, 収率 71%) を得た。
APCI-MS: m/z 495 ( [M + H]+)
JH 應 R (CDC13) δ (ppm)： 1.30 (t, J = 7.6 Hz, 3 H) , 2.27 (s, 3 H)， 2.45 (m， 8 H), 2.60 (s， 3 II), 2.63 (s, 3 H) , 2.79 (q, J = 7.6 Hz, 2 II), 2.98 (m, 4 H), 3.38 (s， 2 H) , 5.34 (s， 2 H)， 6.00 (s, 1 H) , 6.57-6.66 (m， 2 H)， 6.79-7.00 (m, 5 H) .
ま 、 対応するフマル酸塩を以下の方法に従って調製した。
上記の化合物 1 (15 g) をメタノール （110 mL) に溶解し、 フマル酸 7.0g (2.0当量） を加えた。 結晶の析出した懸濁液をー且濃縮乾固し、 ァセトニ ト リル （lOO mL) を加え懸濁液を 1時間以上攪拌した。 その後、 結晶を濾取 して、 減圧下、 乾燥することによりにより化合物 1 の 2 フマル酸塩を得た (20.1 g, 収率 91%)。 参考例 2：化合物 2 {2- (2—ェチル—5, 7—ジメチルー 311—ィ ミダゾ [4, 5 - b] ピリ ジン— 3—ィルメチノレ）一 8— (1， 2， 5， 6—テ トラヒ ドロ ピリ ジン一 1ーィ ルメチル）一 10, 11—ジヒ ド口一 51·Ι—ジベンゾ [b, f]ァゼピン） の合成
1ーメチルピペラジンの代わり に 1, 2, 3, 6—テ トラヒ ドロピリ ジンを用い、 参考例 1 と同様にして、 特開平 7— 61983に記載された 2—（2—ェチル—5， 7 ージメチノレー 3H—ィ ミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチノレ）一 10, 11—ジ ヒ ドロ一 5H—ジベンゾ [b， f]ァゼピンから収率 20%で化合物 2を得た。
APCI-MS: m/z 478 ( [M + H]+)
XH NMR (CDCI3) δ (ppm)： 1.30 (t, J = 7.5 Hz, 3 H) , 2.04 (m, 2 H) , 2.53 (t, J = 5.7 Hz, 2 H), 2.60 (s, 3 H) , 2.62 (s, 3 H) , 2.79 (q, J = 7.5 Hz, 2 H)， 2.86-3.02 (m, 6 H) ' 3.45 (s, 2 H) , 5.33 (s， 2 H) , 5.64 (m， 1 H), 5.74 (m, 1 H) , 6.02 (s, 1 H)， 6.57-6.70 (m, 2 H)， 6.78-6.82 (m, 2 H)， 6.88 (s, 1 H), 6.95-7.00 (m， 2 H) . 参考例 3 ：化合物 3 {2- (2—ェチルー 5, 7—ジメチルー 3H—ィ ミダゾ [4， 5-b] ピリ ジン一 3—ィルメチル）—8— (ピロ リ ジン _ 1一ィルメチル）一 10， 11ージ ヒ ドロー 5H—ジベンゾ [b, f ]ァゼピン） の合成
1—メチルビペラジンの代わり にピロ リ ジンを用い、 参考例 1 と同様にし て、 特開平 7— 61983 に記載された 2—（2—ェチル _ 5， 7—ジメチル— 3H—ィ ミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一3—ィルメチル）一 10， 11ージヒ ドロ一 5H—ジベン ゾ [b，f]ァゼピンから収率 20%で化合物 3 を得た。
APCI-MS: m/z 466 ( [M + H]+)
JH NMR (CDC13) δ ( ρπι)： 1.30 (t, J = 7.5 Hz, 3 H) , 1.78 (m, 4 H) , 2.50 (m， 4 H) , 2.60 (s， 3 H) , 2.63 (s, 3 H) , 2.79 (q, J = 7.5 Hz, 2 H) , 2.98 (m, 4 H), 3.50 (s， 2 H)， 5.34 (s， 2 H) , 6.02 (s, 1 H) , 6.58-6.66 (m, 2 H)， 6.79-6.81 (m, 2 H) , 6.88 (s, 1 H) , 6.98-7.02 (m, 2 H) . 参考例 4 ：化合物 4 {2—（2—ェチル _ 5, 7—ジメチルー 3H—ィ ミダゾ [4, 5-b] ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 8 _モノレホ リ ノ メチルー 10， 11ージヒ ドロー 5H 一ジベンゾ [b, f ]ァゼピン } の合成
1—メチルビペラジンの代わり にモルホリ ンを用い、 参考例 1 と同様にし て、 特開平 7— 61983 に記載された 2—（2—ェチル— 5, 7—ジメチルー 3H—ィ ミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 10， 11—ジヒ ドロ一 5H—ジべン ゾ [b, f]ァゼピンから収率 46%で化合物 4を得た。
APCI-MS： m/z 482 ( [M + H]+)
lti NMR (CDC13) δ (pptn)： 1.30 (t, J = 7.5 Hz, 3 H) , 2.43 (m， 4 H) , 2.60 (m, 3 H), 2.63 (m, 3 H) , 2.79 (q, J = 7.5 Hz, 2 H) , 2.98 (m, 4 H) , 3.38 (s, 2 H), 3.69 (m, 4 H)， 5.34 (s, 2 H) , 6.07 (s, 1 H)， 6.58-6.67 (m, 2 H), 6.78-6.81 (m, 2 H) , 6.88 (s, 1 H)， 6.96—7.01 (m, 2 H) . 参考例 5 ： 化合物 5〜化合物 1 2の合成
特開平 7— 61983に記載された 2— (2—ェチル一 5， 7—ジメチル— 3H—イ ミ ダゾ [4, 5_b]ピリジン一 3—ィルメチル）一 10， 11ージヒ ドロ ー 5H—ジベンゾ [b， f]ァゼピン (19 mg, 0.050 mmol) をク ロロホノレム (0.30 mL) と酢酸 （0.30 mL) の混合溶媒に溶解し、 対応する R5R6NHのクロ口ホルム溶液 （1.0mol/L, 0.15 mL) およびホルムアルデヒ ド （37 %水溶液、 0.005 mい を加え、 60。C に加熱し、 20 時間撹拌した。 反応の進行を薄層ク ロマ トグラフィーで確認 した後、溶媒を留去し、残渣をクロロホルムに溶解させ、水洗を 2回施した。 有機層を無水硫酸ナトリ ゥムで乾燥後、 濃縮し、 残渣にクロロホルム （0.50 mL) および N_メチルイサ ト酸無水物 ポリ スチレン （N- Methylisatoic anhydride polystylene, ノ ノ ノくィオケム社製、 0.15 mL) をカロえ、 室温で終 夜撹拌した。 反応混合物中のレジンを濾別し、 残渣をイオン交換クロマ トグ ラフィー (ボンデシル SCX、 バリアン社製、 2 mol/L アンモニア一メタノー ル溶液で溶出） で精製し、 目的物である化合物 5〜化合物 1 2を得た。
化合物の構造を第 1表に、 分析値 （APCI- MS) を第 1 4表に記した。 参考例 6 ： 化合物 1 3 {ョゥ化 1- [8- (2—ェチル—5， 7—ジメチノレ一 3H— ィ ミダゾ [4， 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 10, 11—ジヒ ドロ一 5H—ジべ ンゾ [b, f]ァゼピン一 2—ィルメチル]一 1—メチルピロ リ ジニゥム） の合成 参考例 3で得られた化合物 3 (11.4 g, 24.5 mmol) をジクロロメタン （200 mL) に溶解し、 ヨウ化メチル （1.98 mL, 31.8 mmol) を加え、 室温で 10時 間撹拌した。 反応溶液を減圧下、 濃縮した後、 酢酸ェチルを加えた。 得られ た懸濁液を 60°Cに加熱し 0.5時間撹拌し、 その後室温で 1 時間撹拌した。 析出した固体を濾取して、 化合物 1 3 (13.7 g， 22.5 mmol, 収率 92%) を 得た。
APCI-MS: m/z 480 ( [M - I]+)
JH NMR (CDC13) δ (ppm)： 1.31 (t, J = 7.6 Hz, 3 H) , 2.13 (br s, 2 H) , 2.25 (br s， 2 H)， 2.58 (s， 3 H)， 2.62 (s, 2 H) , 2.79 (q, J = 7.6 Hz, 2 H) , 2.85 (m, 4 H) , 3.06 (s, 3 H) , 3.52 (br s, 2 H) , 3.83 (br s, 2 H) , 4.74 (s, 2 H), 5.32 (s, 2 H) , 6.76 (m， 2 H) , 6.88 (s， 1 H) , 6.95-7.18 (m, 4 H), 7.43 (s, 1 H). 参考例 7 ： 化合物 1 4 {2_ (2, 5—ジヒ ドロ ピロ一ルー 1一ィルメチル）一 8 — (2—ェチルー 5, 7—ジメチルー 3H—ィ ミダゾ [4， 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメ チノレ）一 10, 11—ジヒ ドロー 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン } の合成
1—メチルピペラジンの代わり に 2， 5—ジヒ ドロ ピロールを用い、 参考例 1 と同様にして、 特開平 7— 61983号に記載された 2—（2—ェチル—5, 7—ジ メチル— 3H—ィ ミ ダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル） 10, 11—ジヒ ドロ 一 5H-ジベンゾ [b, f]ァゼピンから収率 82%で化合物 1 4を得た。
APCI-MS: m/z 464 ( [M + H]+)
XH NMR (CDC13) δ (ppm)： 1.30 (t, J = 7.5 Hz, 3 H) , 2.59 (s, 3 H)， 2.63 (s， 3 H), 2.79 (q, J = 7.5 Hz, 2 H) , 2.9—3.1 (m, 4 H) , 3.45 (s， 4 H)， 3.70 (s, 2 H) , 5.34 (s, 2 H) , 5.87 (s, 2 H) , 6.07 (s, 1 H) , 6.59 (d， J = 8.7 Hz, 2 H), 6.63 (d， J = 8.7 Hz, 2 H) , 6.75-6.85 (m， 2H) , 6.88 (s, 1 H)， 7.00-7.05 (m， 2 H) . 参考例 8 ：化合物 1 5 <{N- [8- (2—ェチルー 5, 7—ジメチルー 3H—ィ ミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン _ 3—ィルメチル) _ 10, 11—ジヒ ドロ一 5H-ジべンゾ [b, f] ァゼピン— 2—ィルメチル]一 N—メチルアミ ノ }酢酸メチルエステル〉の合成
1—メチルビペラジンの代わり にサルコシンメチルエステル塩酸塩を用い、 参考例 1 と同様にして、 特開平 7— 61983 号に記載された 2— (2—ェチル一 5, 7—ジメチル一 3H—ィ ミダゾ [4, 5 - b]ピリ ジン _3—イ ノレメチル）一 10, 11— ジヒ ドロー 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピンから収率 31%で化合物 1 5 を得た。 APCI-MS: m/z 498 ( [M + H]+)
JH NMR (CDCI3) δ (ppm)： 1.30 (t, J = 7.6 Hz, 3 H) , 2.36 (s, 3 H) , 2.60 (s， 3 H), 2.63 (s， 3 H) , 2.79 (q, J = 7.6 Hz, 2 H) , 2.98 (m, 4 H) , 3.23 (s， 2 H), 3.53 (s, 2 H) , 3.70 (s， 3 H) , 5.34 (s， 2 H) , 5.98 (s, 1 H) , 6.59-6.67 (m, 2 H) , 6.82 (m， 2 H)， 6.88 (s, 1 H) , 6.97-7.02 (m, 2 H) . 参考例 9 ：化合物 1 6 { 1- [8- (2—ェチルー 5, 7—ジメチル一 3H—ィ ミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 10, 11—ジヒ ドロ一 5H—ジべンゾ [b, f] ァゼピン一 2—ィルメチル]ピペリ ジン一 4一力ルボン酸ェチルエステル } の 合成
1—メチルビペラジンの代わり にィ ソニペコチン酸ェチルエステルを用い. 参考例 1 と同様にして、 特開平 7— 61983 号に記載された 2—（2—ェチルー 5,7—ジメチル一 3H—ィ ミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3_ィルメチル） _ 10, 11— ジヒ ドロ一5 H—ジベンゾ [b, f]ァゼピンから収率 60%で化合物 1 6 を得た。 APCI-MS: m/z 552 ( [M + H]+)
XH NMR (CDC13) δ ( pm)： 1.23 (t, J = 7.0 Hz, 3 H) , 1.30 (t， J = 7.6 Hz, 3 H), 1.68-1.90 (m， 6 H) , 1.97 (td, J = 11.3, 2.7 Hz, 2 H) , 2.26 (m, 1 H), 2.60 (s, 3 H) , 2.62 (s, 3 H) , 2.79 (q, J = 7.6 Hz, 2 H) , 2.83 (m, 2 H), 2.98 (m, 4 H) , 3.36 (s, 2 H) , 4.11 (q, J = 7.0 Hz, 2 H) , 5.33 (s, 2 H) , 6.03 (s, 1 H) , 6.57-6.66 (m， 2 H) , 6.78-6.82 (m, 2 H) , 6.88 (s, 1 H), 6.94-6.99 (m, 2 H) . 参考例 1 0 ： 化合物 1 7く 2— {N_ [8— (2—ェチルー 5, 7—ジメチルー 3H—ィ ミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチノレ）一 10， 11—ジヒ ドロ一 5H—ジべン ゾ [b， f]ァゼピン一 2—ィルメチル]— N—メチルァミ ノ }ェタノ一ル〉の合成 水素化アルミニゥムリチウム (15.7 mg, 0.38 mmol) をテ トラヒ ドロフラ ン （0.3 mL) に懸濁させ、 氷冷下、 攪拌しながら、 テ トラ ヒ ドロフラン （0.9 mL) に溶解した、 参考例 8で得られた化合物 1 5 (126 mg, 0.253 mmol) を 加え、 室温で 1.5時間撹拌した。 反応の進行を薄層クロマ トグラフィ一で確 認した後、 撹拌しながら水（0.016 mL)、 2mol/L 水酸化ナ ト リ ウム水溶液 (0.016 mL), 水（0.048 mL)を順次滴下した。 析出物を濾別し、 濾液を濃縮し た残渣を NH—シリ カゲルク ロマ トグラフィー （溶出溶媒 ： 酢酸ェチル） で 精製して、 化合物 1 7 (47.6 mg, 0.101 mmol, 収率 40%) を得た。
APCI-MS: m/z 470 ( [M + H]+)
NMR (CDCI3) δ (ppm)： 1.30 (t, J = 7.5 Hz, 3 H) , 1.7 (br s, 1 H) , 2.21 (s, 3 H), 2.57 (t, J = 5.5 Hz, 2 H) , 2.60 (s, 3 H) , 2.63 (s, 3 H) , 2.80 (q, J = 7.5 Hz, 2 H) , 2.98 (m, 4 H) , 3.44 (s, 2 H) , 3.61 (t, J = 5.5 Hz, 2 H), 5.34 (s, 2 H) , 5.99 (s, 1 H) , 6.59-6.67 (m, 2 H) , 6.81 (m， 2 H) , 6.88 (s, 1 H)， 6.91-6.98 (m, 2 H) . 参考例 1 1 ：化合物 1 8く {1一 [8—（2—ェチル—5, 7—ジメチル _3H—ィミダ ゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3— イ ノレメ チノレ）一 10, 11—ジヒ ドロ ー 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン—2—ィルメチル]ピぺリ ジン一 4—ィル }メタノ—ル〉の合成 化合物 1 5の代わりに化合物 1 6を用い、 参考例 1 0と同様にして、 収率 50%で化合物 1 8を得た。
APCI-MS: m/z 510 ( [M + H]+)
ュ H 膽 (CDC13) δ (ppm)： 1.30 (t， J = 7.6 Hz, 3 H) , 1.24-1.74 (m， 6 H) , 1.91 (m, 2 H) , 2.60 (s, 3 H) ' 2.63 (s, 3 H) , 2.79 (q, J = 7.6 Hz, 2 H) , 2.86-3.02 (m, 6 H) , 3.37 (s, 2 II) , 3.48 (d, J = 6.3 Hz, 2 H) , 5.34 (s, 2 H)， 5.98 (s， 1 H), 6.58-6.67 (m, 2 H) , 6.82 (m， 2 H) , 6.89 (s， 1 H)， 6.94-7.00 (m, 2 H) . 参考例 1 2 ：化合物 1 9く {N— [8— (2—ェチルー 5, 7—ジメチルー 3H—ィミダ ゾ [4， 5-b]ピリ ジン一 3—イ ノレメ チノレ） _ 10， 11ージヒ ドロ 一 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン— 2—ィルメチル]—N—メチルァミ ノ }酢酸〉の合成
参考例 8で得られた化合物 1 5 (151 mg, 0.303 mmol) をメタノール （3.0 mL) に溶解し、 lmol/L水酸化ナト リ ゥム /メタノ一ル溶液 (1.5 mL) を加え、 60°Cに加熱し、 9時間撹拌した。 反応の進行を薄層クロマトグラフィーで確 認した後、 室温に冷却し、 4mol/L塩酸を加え、 pH を 6.0に調整した。 析出 した結晶を濾取し、 減圧下で乾燥した。 この結晶をェチルエーテルに懸濁さ せ、 加熱還流条件下、 1時間撹拌し、 さらに室温で 1時間撹拌した。 結晶を 濾取し、 減圧下で乾燥させて、 化合物 1 9 (119 mg, 0.246 mmol, 収率 81%) を得た。
APCI-MS: m/z 483 ( [M + H]+)
XH NMR (DMS0-d6) δ (ppm)： 1.23 (t, J = 7.4 Hz, 3 H) , 2.34 (s, 3 H) , 2.48-2.52 (s x 2, 6 H' DMSO とォーノくーラップ) , 2.78 (q, J = 7.4 Hz, 2 H), 2.89 (m, 4 H) , 3.11 (s, 2 H) , 3.66 (s, 2 H) , 5.29 (s, 2 H) , 6.75-7.02 (m, 7 H), 8.36 (s, 1 H) . 参考例 1 3 ：化合物 2 0 {1— [8— (2—ェチルー 5， 7—ジメチルー 3H—イ ミダ ゾ [4， 5-b] ピリ ジン一 3—ィルメ チル）一 10, 11—ジヒ ドロ ー 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン一2—ィルメチル]ピペリ ジン一 4一力ルボン酸） の合成 化合物 1 5の代わりに化合物 1 6を用い、 参考例 1 2と同様にして、 収率 70%で化合物 2 0を得た。
APCI-MS: m/z 524 ( [M + H]+)
JH 腿 (DMS0-d6) δ ( pm)： 1.23 (t, J = 7.4 Hz, 3 H)， 1.52 (m, 2 H) , 1.75 (m, 2 H), 1.97 (m, 2 H) , 2.18 (m, 1 H) , 2.48-2.54 (s x 2, 6 H, DMSO とオーバーラップ）， 2.71-2.92 (m, 8 H) , 3.32 (s, 2 H) , 5.29 (s， 2 H) , 6.75-6.94 (m， 7 H) , 8.23 (s, 1 H) . 参考例 l 4 ：化合物 2 1 <{N- [8- (2—ェチルー 5, 7—ジメチル— 3H—ィ ミダ ゾ [4， 5-b]ピリ ジン一 3—イ ノレメ チノレ） _ 10, 11—ジヒ ドロ 一 5H—ジベンゾ [b，f]ァゼピン一 2—ィルメチノレ]—N—メチルアミ ノ }ァセ トニ ト リノレ〉の合 成
参考例 6で得られた化合物 1 3 (700 mg, 1.15 mmol) をク ロ口ホルム （1.2 mL) に溶解し、 メチルアミ ノアセ トニ ト リル （368 mg, 3.46 mmol) および トリェチルァミ ン （0.561 mL, 4.03 mmol) を加え、 加熱還流条件下、 終夜 撹拌した。 反応液を室温まで冷却し、 飽和重曹水を加え、 クロ口ホルムで 3 回抽出した。 有機層を合わせ、 飽和食塩水で洗浄し、 無水硫酸マグネシウム で乾燥後、 濃縮し、 残渣をシリ力ゲルク 口マ トグラフィー （溶出溶媒 ： メタ ノール/ク ロ口ホルム =1/99) で精製した。 目的物を含む画分の濃縮残渣に エタノールを加え、 得られた懸濁液を 60°Cで 0.5 時間撹拌し、 その後室温 で 1時間撹拌した。析出した結晶を濾取し、減圧下で乾燥させることにより、 化合物 2 1 (415 mg, 0.893 mmol, 収率 78%) を得た。
APCI-MS: m/z 465 ( [M + H]+)
JH NMR (CDC13) δ (ppm)： 1.30 (t, J = 7.5 Hz, 3 H)， 2.42 (s, 3 H)， 2.60 (s, 3 H)， 2.63 (s, 3 H) , 2.79 (q, J = 7.5 Hz, 2 H) , 2.98 (m, 4 H) , 3.43 (s, 2 H)， 3.48 (s, 2 H) , 5.34 (s, 2 H) , 6.10 (s, 1 H) , 6.58-6.69 (m, 2 H)， 6.78-6.83 (m, 2 H) , 6.88 (s, 1 H)， 6.95-7.02 (m, 2 H) . 参考例 1 5 ：化合物 2 2 {N— [8—（2—ェチル—5, 7_ジメチルー 3H—イ ミダ ゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメ チル）一 10， 11—ジヒ ドロ ー 5H—ジベンゾ [b，f]ァゼピン一 2—ィルメチル]— N— [2- (ピロ リ ジン一 1ーィル) ェチル] ァミ ン . 2 フマル酸塩 } の合成
工程 1
後記の参考例 2 4で得られたィ匕合物 9 3 (1.25 g, 3.03 mmol) をクロ口 ホルム （54 mL) およびアセ トン（6 mL)の混合溶媒に溶解し、 二酸化マンガ ン（2.7 g, 31 mmol)を加えて室温で終夜撹拌した。 反応の進行を薄層クロマ トグラフィ一で確認した後、 固形物をセライ トを通じて濾別し、 濾液を濃縮 した。残渣に酢酸ェチルを加えて得られる懸濁液を加熱還流条件下 0.5時間 撹拌し、 その後室温に冷却してさらに 0.5時間撹拌した。 析出した結晶を濾 取し、 減圧下乾燥させることにより 8— (2—ェチルー 5, 7—ジメチル一 3H— ィ ミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル） _ 10, 11—ジヒ ドロー 5H—ジべ ンゾ [b, f]ァゼピン一 2—カルボアルデヒ ド (1.02 g, 2.48 mmol, 収率 82%) を得た。
APCI-MS: m/z 411 ( [M + H]+)
XH 匿 (CDC13) δ (ppm)： 1.31 (t, J = 7.5 Hz, 3 H) , 2.60 (s, 3 H) , 2.64 (s, 3 H) , 2.80 (q, J = 7.5 Hz, 2 H) , 2.99 (m, 2 H) , 3.06 (m, 2 H) , 5.37 (s， 2 H), 6.60-6.91 (m, 6 H) , 7.52-7.61 (m, 2 H) , 9.77 (s, 1 H) . 工程 2
工程 1で得られた 8- (2—ェチル—5, 7-ジメチルー 3I-I—ィミダゾ [4， 5 - b] ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 10, 11—ジヒ ドロ一 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピ ン— 2 _カルボアルデヒ ド (0.300 g , 0.73 mmol) をテ トラヒ ドロフラン (10 mL) およびクロ口ホルム （6 mL) の混合溶媒に懸濁させ、 これに 2—（ピロ リ ジン一 1一ィル）ェチルアミ ン (139 μ L, 1.10 mmol) を加えて 10分間、 加熱還流した。 その後、 反応溶液を室温まで冷却してトリァセ トキシホウ素 化ナトリ ウム （464 mg, 2.19 mmol) を加えて 12時間、 室温で攪拌した。 反 応溶液に酢酸ェチルと 1 mol/L水酸化ナト リ ゥム水溶液を加え、 有機層を無 水硫酸マグネシウムを加えて乾燥させた。 その後、 溶液を減圧下、 濃縮し、 残渣をシリ力ゲルク ロマ トグラフィー （溶出溶媒： クロロホルム/2 mol/L了 ンモニァ . メ タノール溶液 =20/1) で精製して、 N— [8—（2—ェチル一5, 7— ジメチルー 3H—イ ミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 10, 11—ジヒ ド口一 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン _ 2—ィルメチル]一 N— [2— (ピロ リ ジン 一 1—ィル）ェチル]ァミン （0.301 g， 0.592 mmol, 収率 81%) を得た。 こ れを参考例 1 と同様な方法でフマル酸塩と して化合物 2 2を得た。
APCI-MS: m/z 509 ( [M + H]+)
2H NMR (DMS0-d6) 5 (ppm)： 1.23 (t， J = 7.4 Hz, 3 H) , 1.65 - 1.85 (m, 4 H) ,
2.50 (s， 311) , 2.51 (s， 3H) , 2.6-2.7 (m, 4 H) , 2.7-3.0 (m, 8 H) , 3.86 (s, 2 H), 5.29 (s, 2 H) , 6.55 (s, 4 II ) , 6.75-6.95 (m, 6 H) , 7.0-7.15 (m, 2 H)， 8.43 (s， 1 H) . 参考例 1 6 ：化合物 2 3 {N- [8- (2—ェチル一5， 7—ジメチル— 3H—ィ ミダ ゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメ チノレ）一 10, 11—ジヒ ドロ _ 5H—ジベンゾ [b，f]ァゼピン一 2—ィルメチル]—N—（2—メ トキシェチル）ァミ ン · 1 フマ ル酸塩 } の合成
2— (ピロ リ ジン—1—ィル）ェチルァミ ンの代わり に 2-メ トキシェチルァ ミンを用い、 参考例 1 5の工程 2と同様にして、 収率 78%で N— [8—（2—ェ チル一 5, 7—ジメチルー 3H—ィ ミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 10, 11—ジヒ ドロー 5H-ジベンゾ [b, f]ァゼピンー2—ィルメチル]一 N— (2- メ トキシェチル）アミンを得た。 これを参考例 1 と同様な方法でフマル酸塩 として化合物 2 3を得た。
APCI-MS: m/z 470 ( [M + H]+)
NMR (DMS0-d6) δ (ppm)： 1.23 (t, J = 7.4 Hz, 3 H) , 2.50 (s, 3H) , 2.51 (s， 3H), 2.80 (q, J = 7.4 Hz, 2 H) , 2.8-3.0 (m, 6 H) , 3.24 (s, 3 H) ,
3.49 (t, J = 6.5 Hz, 2 H) , 3.80 (s, 2H) , 5.29 (s, 2 H)， 6.48 (s, 2 H) ,
6.84 (d, J = 8.1 Hz, 1 H) , 6.85-7.0 (m, 4 H) , 7.0-7.1 (m, 2 H) , 8.43 (s, 1 H). 参考例 1 7 ：化合物 2 4く 2— {[8— (2—ェチルー 5, 7—ジメチルー 3H—イ ミダ ゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメ チル）一 10, 11—ジヒ ドロ 一 5H—ジベンゾ [b， f]ァゼピン一 2—ィルメチル]アミ ノ }エタノール · 0.5 フマル酸塩〉の合 成
2— (ピロ リ ジン一 1—ィル）ェチルァミ ンの代わりに 2—エタノーノレアミ ン を用い、 参考例 1 5の工程 2と同様にして、 収率 39%で 2— {[8—（2—ェチ ルー 5， 7—ジメ チル一 3H—ィ ミダゾ [4， 5-b]ピ リ ジン— 3—ィルメ チル）一 10， 11—ジヒ ドロ一 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン一 2_ィルメチル]ァミ ノ）ェ タノールを得た。
これを参考例 1 と同様な方法でフマル酸塩と して化合物 2 4を得た。
APCI-MS： m/z 456 ( [M + H]+)
JH NMR (DMSO- d6) δ (ppm)： 1.23 (t, J = 7.4 Hz, 3 H) , 2.50 (s, 3H)， 2.51 (s， 3H)， 2.70-2.75 (m, 2 H) , 2.77 (q， J = 7.4 Hz, 2 H) ' 2.85-2.9 (m, 4 H), 3.55 (t, J = 5.5 Hz, 2 H) , 3.78 (s， 2H) , 5.29 (s， 2 H) , 6.44
(s, 1 H), 6.79 (dd, J = 1.5 Hz, 8.3 Hz, 1 H)， 6.85-6.95 (m， 4 H) , 7.0-7. 1
(m, 2 H), 8.39 (s, 1 H) . 参考例 1 8 ：化合物 2 5く { [8 _ (2—ェチルー 5， 7—ジメチル— 3H—ィミダゾ
[4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 10， 11—ジヒ ドロー 5H—ジべンゾ [b， f] ァゼピン一 2—ィル] メチル } ァミ ン · 1 フマル酸塩〉の合成
参考例 6で得られた化合物 1 3 (0.300 g, 0.516 mmol) を 7mol/Lアンモ ニァメタノール溶液 （5 mL) に溶解し、 封管して 80°Cで 48 時間加熱した。 その後、 反応溶液を減圧下、 濃縮した。 残渣をシリ力ゲルク口マ トグラフィ 一 （溶出溶媒： クロロホルム /2mol/L 了ンモユア ' メタノール溶液 =20/1) で精製して、 { [8- (2—ェチル—5, 7—ジメチルー 3H—ィ ミダゾ [4， 5-b]ピリ ジン一 3_ィルメチル）一 10, 11—ジヒ ドロ一 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン _2 一ィル] メチル } ァミ ン （0.135 g， 0.329 mmol, 収率 64%) を得た。
これを参考例 1 と同様な方法でフマル酸塩と して化合物 2 5を得た。 APCI-MS: m/z 412 ( [M + H]+)
:H NMR (DMSO-d6) δ (ppm)： 1.23 (t, J = 7.4 Hz, 3 H)„ 2.50 (s, 3H)， 2.51 (s, 3H) , 2.77 (q, J = 7.4 Hz, 2 H) , 2.85-2.9 (m， 4 H) ， 3.81 (s, 2H) ,
5.29 (s, 2 H)， 6.42 (s, 2 H) , 6.8-7.0 (m, 5 H) , 7.0-7.15 (m, 2 H)， 8.46 (s, 1 H). 参考例 1 9 ：化合物 2 6 {N— [8— (2—ェチル—5， 7—ジメチルー 3H—イ ミダ ゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメ チル）一 10， 11ージ ヒ ドロ ー 5H—ジベンゾ [b， f]ァゼピン一 2_イ ノレメチノレ] — N—メチノレ一 N_ (2H—テ トラゾーノレ一 5 一ィルメチル）アミ ン} の合成
参考例 6で得られた化合物 1 3 (667 mg, 1.10 mmol) をクロ口ホルム （11 mL) に溶解し、 後記の参考例 2 2で得られた N—メチル—N— (2— ト リ チル 一 2H—テ トラゾールー 5_ィルメチル）アミ ン (390 mg, 1.10 mmol) およぴ ト リェチルァ ミ ン (0.31 mL, 2.3 mmol) を加えて 60°Cで終夜撹拌した。 反 応液を室温まで冷却！^、 飽和重曹水を加え、 ク ロ口ホルムで 3 回抽出した。 有機層を合わせ、 飽和食塩水で洗浄し、 無水硫酸マグネシウムで乾燥し、 濃 縮した。 残渣をシリ カゲル （溶出溶媒 ： メタノール/ク ロ口ホルム = 2/98) に通じて原点成分を除去し、 濃縮した。 残渣にアセ トン （1.9 mL)、 水 （1.9 mL) および酢酸 （1.9 mL) を加え、 60°Cで 1.5時間撹拌した。 反応液を 0°C まで冷却し、 析出物を濾別し、 濾液を濃縮した。 残渣をエタノールから再結 晶して、 化合物 2 6 (66.7 mg, 0.131 mmol, 収率 12%) を得た。
APCI-MS: m/z 508 ( [M + H]+)
XH NMR (CDC13) δ (ppm)： 1.32 (t, J = 5.0 Hz, 3 H)， 2.58 (s, 3 H) , 2.63 (s, 3 H), 2.75-2.79 (m, 7 H) , 2.81 (q, J = 5.0 Hz, 2 H) , 4.08 (s, 2 H) , 4.28 (s, 2 H), 5.34 (s, 2 H) , 6.37 (s, 1 H) , 6.46 (d, J = 8.1 Hz, 1 H) ,
6.58 (d, J = 8.1 Hz, 1 H) , 6.72-6.80 (m, 2 H)， 6.84-6.94 (m, 3 H) . 参考例 2 0 ： 化合物 2 7 {2- (2—ェチルー 5， 7-ジメチル— 3H—ィ ミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）_ 8— [4一（2H—テ トラゾールー 5—ィル) ピペリ ジン一 1 _ィルメチル]一 10， 11ージヒ ドロ一 5H—ジべンゾ [b，： f ]ァゼ ピン) の合成
メチルアミ ノアセ トニ ト リルの代わりにピペリ ジン一 4—カルボ二 ト リル を用い、 参考例 1 4と同様にして、 収率 58%で 1— [8—（2—ェチルー 5, 7— ジメチルー 3H—ィ ミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 10, 11—ジヒ ドロ一 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン一 2—イ ノレメチル]ピペリ ジン一 4—カル ボニトリルを得た。
得られた 1一 [8— (2—ェチルー 5, 7—ジメチル一 3H—ィ ミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 10, 11—ジヒ ドロ - 5H-ジべンゾ [b, f]ァゼピン一 2 — イ ノレメチル]ピぺリジン一 4一力ノレボニ ト リ ノレ (0.252 g, 0.500 mmol) を トルェン (4 ml) に溶解し、 ト リ メチルシリルアジド (0.13 mL, 1.00 mmol) および酸化ジプチルすず （12.4 mg， 0.05 mmol) を加え、 110°Cで 22時間、 加熱攪拌した。反応溶液を減圧下、濃縮した後、残渣にエタノールを加えた。 得られた懸濁液を 0.5時間、 加熱還流した後、 固体を濾取して、 化合物 2 7
(0.110 g、 0.200 mmol, 収率 40%) を得た。
APCI-MS: m/z 548 ( [M + H]+)
Ή NMR (DMS0-d6) 6 ( pm)： 1.22 (t， J = 7.4 Hz, 3 H) , 1.65-1.85 (m, 2 H) ， 1.9-2.05 (m, 2 H) , 2.2-2.35 (m， 2 H) , 2.48 (s, 3H) , 2.58 (s, 3H) , 2.77 (q, J = 7.4 Hz, 2 H) , 2.85-3.05 (m， 7 H) ， 3.52 (s, 2H) , 5.29 (s， 2 H), 6.85-7.05 (m, 8 H)， 8.36 (s, 1 H) . 参考例 2 1 ：化合物 2 8〜化合物 9 0の合成
工程 1
ヨ ウ化 1一 ( 10, 11—ジヒ ドロ一 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン一 2—ィルメ チル） 一 1—メチルピぺリ ジニゥム (0.015 g, 0.050 mmol) をジメチルホル ムアミ ド （0.50 mL) に溶解し、 対応する YH (式中、 Yは前記と同義である） のクロ口ホルム溶液 （1.0 mmol/L, 0.060 mL) および水酸化リチウム · 1水 和物 （0.070 g) を加え、 室温で 20時間撹拌した。 反応の進行を薄層クロマ トグラフィ一で確認した後、 溶媒を留去し、 残渣をジクロロメタンに溶解さ せ、 得られた溶液を水で 3回洗浄した。 有機層を無水硫酸ナト リ ゥムで乾燥 後、 濃縮し、 残渣にクロ口ホルム （0.60 mL) および N—メチルイサト酸無 水物 ポリ スチレン (N-Methylisatoic anhydride polystylene, ノノ ノ ィ オケム社製、 0.15 mL) を加え、 室温で終夜撹拌した。 反応混合物中のレジ ンを濾別し、 濾液を濃縮した後、 残渣をイオン交換ク口マトグラフィー （ボ ンデシル SCX、 バリ アン社製、 2 mol/Lア ンモニア一メ タノール溶液で溶出） で精製し、 製造法 1における化合物 （IV) に相当する各種中間体を得た。 工程 2
参考例 5と同様にして、 工程 1で得られた製造法 1における化合物 （IV) に相当する各種中間体と相当する R5R H (式中、 R5および R6はそれぞれ前記 と同義である） から、 目的物である化合物 2 8〜化合物 9 0を得た。 なお、 化合物 4 1、 4 2、 4 8および 8 9はシユウ酸塩と して単離した。
化合物 2 8〜化合物 8 7の構造と分析値 （APCI- MS) を第 2表〜第 6表に 記した。 また、 化合物 2 9、 3 0、 3 6、 4 1、 4 2、 4 8、 5 3、 5 4、 6 0、 6 5、 6 6、 7 2、 7 7、 7 8および 8 4の分析値 （ MR) を以下 Iこ示した。 ィ匕合物 2 9 {2— (ベンゾィ ミダゾール一 1—ィルメチル） _ 8— (1,2, 5,6—テ トラ ヒ ドロ ピリ ジン一 1—イノレメチル）一 10, 11—ジヒ ドロ ー 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン）
JH NMR (DMS0-d6) δ (ppm)： 2.0-2.1 (m, 2 H) , 2.44 (t, J = 5.6 Hz, 2 H) , 2.75-2.85 (m， 2 H) , 2.9-3.0 (m， 4 H)， 3.32 (s, 2 H) , 5.31 (s， 2 II) , 5.5-5.8 (m, 2 H)， 6.8-7.1 (m, 6 H) , 7.1-7.3 (m， 2 H) , 7.56 (d, J = 7.1 Hz, 1 H), 7.62 (d, J = 7.4 Hz， 1 H) , 8.28 (s， 1 H) , 8.35 (s， 1 H) . 化合物 3 0 {2—（ベンゾイ ミダゾールー 1一ィルメチル）—8— (ピロ リ ジン一 1一ィルメチル)一 10， 11—ジヒ ドロ一 5H-ジべンゾ [b, f]ァゼピン }
XH NMR (DMS0 - d6) 8 (ppm)： 1.5-1.7 (m, 4 H) , 2.3-2.5 (m， 4 H) , 2.8-3.0 (m, 4 H), 3.39 (s, 2 H), 5.31 (s, 2 H) , 6.8-6.95 (m, 4 H) , 6.95-7.0 (m, 2 H) , 7.1-7.3 (m， 2 H) , 7.55 (d, J = 8.9 Hz, 1 H) , 7.63 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 8.26 (s， 1 H), 8.34 (s, 1 H) . 化合物 3 6 {2- (ベンゾィ ミダゾー 1—ィルメチル）一 8—モルホリ ノメチル — 10, 11—ジヒ ドロ一 5H—ジベンゾ [b，f]ァゼピン }
XH NMR (DMS0-d6) δ (ppm)： 2.2-2.4 (m, 4 H) , 2.8-3.0 (m, 4 H) , 3.27 (s, 2 H), 3.5-3.6 (m, 4 H) , 5.30 (s, 2 H) , 6.7-7.1 (m, 6 H) , 7.1-7.25 (m， 2 H), 7.54 (d, J = 7.6 Hz, 1 H) , 7.62(d, J = 7.6 Hz, 1 H)， 8.28 (s， 1 H), 8.34 (s, 1 H). ィ匕合物 4 1 { 2—（2—フエ二ノレべンゾイ ミダゾールー 1—イノレメチノレ）一 8 _ (1, 2, 5, 6—テ トラヒ ドロピリ ジンー1一ィルメチル）一10， 11ージヒ ドロ一 5H —ジベンゾ [b, f]ァゼピン · 1 シユウ酸塩 }
ュ11鍾 (DMS0-d6) δ (ppm)：' 2.2-2.5 (m, 2 H)， 2.7-3.0 (m， 4 H) , 3.0-3.2 (m, 2 H) , 3.4-3.6 (m, 2 H) , 4.05 (s, 2 H) , 5.45 (s, 2 H) , 5.69 (m, 1 H) , 5.85 (m, 1 H), 6.6-6.8 (m， 2 H) , 6.88 (d, J = 8.3 Hz, 1 H) , 6.97 (d, J = 7.9 Hz, 1 H), 7.05-7.2 (m， 2 H) , 7.2-7.5 (m, 2 H) , 7.5-7.7 (tn， 4 H) , 7.7-7.85 (m， 3 H) , 8.54 (s， 1 H) . ィ匕合物 4 2 {2— (2—フエ二ノレべンゾィ ミ ダゾールー 1一イ ノレメチノレ）一 8_ (ピロ リ ジン一 1—ィルメチル）一 10， 11—ジヒ ドロ一 5H—ジベンゾ [b， f]ァゼ ピン · 1 シュゥ酸塩 }
JH NMR (DMS0 - d6) 8 (ppm)： 1.8-2.0 (m, 4 H) , 2.8-3.0 (m, 4 H) , 3.0-3.2 (m, 4 H), 4.12 (s, 2 H), 5.45 (s, 2 H) , 6.6-6.7 (m, 2 H) , 6.88 (d， J = 8.1 Hz, 1 H), 6.96 (d， J = 7.8 Hz, 1 H) , 7.1-7.2 (m, 2 H) , 7.2-7.3 (m, 2 H), 7.4-7.6 (m, 4 H) , 7.6-7.8 (m, 3 H) , 8.53 (s, 1 H) . ィ匕合物 4 8 {2—モルホリ ノメチノレー 8— (2-フエ -ルペンゾィ ミダゾールー 1一ィルメチル）一10, 11—ジヒ ドロ一 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン · 1 シユウ 酸塩 }
XH NMR (DMS0 - d6) δ (ppm)： 2.7-3.0 (m, 8 H) , 3.6-3.8 (m, 4 H) , 3.83 (s， 2 H)， 5.42 (s, 2 H), 6.65-6.7 (m, 2 H) , 6.85 (d, J = 8.2 Hz, 1 H) , 6.92 (d, J = 8.1 Hz, 1 H), 7.0—7.1 (m， 2 H) , 7.2-7.3 (m, 2 H) , 7.4—7.6 (m, 4 H) , 7.65-7.8 (m, 3 H) , 8.44 (s, 1 H) . 化合物 5 3 { 2 _ (2—メチルベンゾィ ミ ダゾール— 1—ィルメチル）一 8— (1, 2, 5， 6—テ トラヒ ドロピリ ジン一 1—ィルメチル）一 10， 11—ジヒ ドロー 5H —ジベンゾ [b， f]ァゼピン }
XH NMR (DMS0-d6) 5 (ppm)： 2.0-2. 1 (m, 2 H) , 2.45 (t, J = 5.6 Hz, 2 H) , 2.54 (s, 3 H), 2.75-2.85 (m, 2 H) , 2.85-3.0 (m, 4 H) , 3.35 (s, 2 H) , 5.28 (s, 2 H) , 5.55-5.75 (m， 2 H) , 6.8-7.0 (m, 6 H)， 7. 1-7.2 (m， 2 H) , 7.4-7.6 (m, 2 H), 8.28 (s， 1 H) . 化合物 5 4 { 2—（2—メチルベンゾイ ミダゾール— 1—ィルメチル）— 8—（ピ 口 リ ジン _ 1—ィルメチル）一 10, 11—ジヒ ドロ一 5H—ジベンゾ [b, f ]ァゼピ ン}
XH NMR (DMS0-d6) δ (ppm)： 1.5-1.8 (m, 4 H) , 2.3-2.5 (m, 4 H) , 2.54 (s，
3 H), 2.8-3.0 (m, 4 H) , 3.39 (s, 2 H)， 5.28 (s, 2 H)， 6.7-6.9 (m, 6 H) , 7.1-7.2 (m, 2 H) , 7.3-7.5 (m， 2 II ) , 8.25 (s， 1 H) . 化合物 6 0 {2- (2-メチルベンゾィ ミダゾー 1—ィルメチル）一 8—モルホリ ノメチノレ一 10， 11—ジヒ ドロ一 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン }
^ 薩 (DMS0-d6) δ (ppm)： 2.2-2.4 (m， 4 H) , 2.49 (s， 3 H)， 2.8-3.0 (m,
4 H), 3.28 (s, 2 H), 3.5-3.6 (m, 4 H) , 5.28 (s， 2 H) , 6.8-7.0 (m, 6 H) , 7.1—7.2 (m, 2 H) , 7.5—7.6 (m， 2 H)， 8.28 (s， 1 H) . 化合物 6 5 { 2—（5， 6—ジメチノレべンゾィ ミダゾ一ルー 1—ィルメチル）— 8 — (1, 2, 5, 6—テ トラ ヒ ドロピリ ジン一 1一イノレメチル）一 10, 11—ジヒ ドロ一 5H—ジベンゾ [b, f ]ァゼピン }
lti NMR (DMS0_d6) δ (ppm)： 2.0-2. 1 (m, 2 H) , 2.2-2.4 (m, 6 H) , 2.45 (t,
J = 5.2 Hz, 2 H), 2.75-2.85 (m, 2 H)， 2.85-3.05 (m, 4 H) , 3.30 (s， 2
H), 5.24 (s, 2 H), 5.6-5.7 (m, 2 H) , 6.8-7.0 (m, 6 H) , 7.31 (s， 1 H)，
7.40 (s, 1 H) , 8.17 (s, 1 H) , 8.27 (s, 1 H) · 化合物 6 6 { 2 _ (5, 6—ジメチルベンゾイ ミ ダゾールー 1一ィルメチル）一 8 一（ピロ リ ジン一 1—ィルメチル）一 10, 11—ジヒ ドロ - 5H-ジベンゾ [b， f]ァ ゼピン }
1{匪 R (DMS0-d6) δ (ppm)： 1.5-1.8 (m, 4 H) , 2.27 (s， 3 H) , 2.28 (s， 3 H) , 2.3-2.4 (m， 4 H) , 2.8-3.0 (m， 4 H)， 3.39 (s， 2 H) , 5.24 (s, 2 H) , 6.8-7.0 (m, 6 H), 7.30 (s, 1 H) , 7.40 (s， 1 H)， 8.16 (s, 1 H)， 8.24 (s, 1 H) . 化合物 7 2 { 2— (5, 6—ジメチルベンゾイ ミ ダゾールー 1—ィルメチル）一 8 —モルホリ ノメチル一10, 11—ジヒ ドロ一 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン） JH 羅 (DMS0-de) δ (ppm)： 2.2-2.4 (m, 10 H) , 2.8-3.0 (m, 4 H) , 3.28 (s, 2 H), 3.5-3.6 (m, 4 H) , 5.24 (s, 2 H) , 6.8-7.0 (m, 6 H) , 7.30 (s, 1 H) , 7.39 (s, 1 H), 8.16 (s, 1 H) , 8.28 (s, 1 H) . 化合物 7 7 { 2— (2 _ェチルベンゾィ ミ ダゾール _ 1一イノレメチル）一 8— (1， 2, 5, 6—テ トラヒ ドロピリ ジン一 1ーィルメチル）一 10, 11—ジヒ ドロ一 5H ージベンゾ [b, f ]ァゼピン }
:H讀 (DMS0-d6) δ (ppm)： 1.28 (t, J = 7.4 Hz, 3 H) , 1.95-2.05 (m, 2 H)， 2.43 (t, J = 5.4 Hz, 2 H) , 2.6-3.0 (m， 8 H) , 3.32 (s, 2 H) , 5.28 (s, 2 H), 5.1-5.5 (m, 2 H) , 6.75-7.0 (m， 6 H) , 7.1-7.25 (m, 2 H) , 7.47 (m, 1 H), 7.55 (m, 1 H) , 8.26 (s, 1 H) . 化合物 7 8 {2- (2—ェチルベンゾィ ミ ダゾール一 1—ィルメチル）一 8— (ピ 口 リ ジン一 1一ィルメチル）一 10， 11—ジヒ ドロ一 5H—ジベンゾ [b， f]了ゼピ ン}
XH 醒 (DMS0-d6) δ (ppm)： 1.28 (t, J = 7.4 Hz, 3 H) , 1.6-1.8 (m, 4 H) , 2.3-2.4 (m, 4H) , 2.8-3.0 (m， 6 H) , 3.32 (s, 2 H) , 5.28 (s, 2 H) , 6.7-7.0 (m， 6 H) , 7.0—7.2 (m, 2 H) , 7.46 (m, 1 H) , 7.54 (m, 1 H) , 8.23 (s, 1 H). 化合物 8 4 {2- (2—ェチルベンゾィミダゾ一1—ィルメチル）— 8_モルホリ ノメチルー 10， 11ージヒ ドロー 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン }
JH NMR (DMS0 - d6) S (ppm)： 1.28 (t, J = 7.4 Hz, 3 H) , 2.2-2.4 (m, 4 H) ,
2.8-3.0 (m, 6 H) , 3.27 (s, 2 H) , 3.5-3.6 (m, 4 H) , 5.27 (s, 2 H) , 6.7-7.0
(m, 6 H) , 7.1-7.2 (m, 2 H) , 7.47 (m, 1 H) , 7.55 (m, 1 H) , 8.26 (s, 1
H). 化合物 8 8〜化合物 9 0の構造を第 7表に、 分析値 （APCI-MS、 XH NMR) を以下に示した。 '
化合物 8 8 {2- (ィ ミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 1一ィルメチル）—8—（1, 2, 5, 6 ーテ トラヒ ドロ ピリ ジン一1—ィルメチル）一 10， 11—ジヒ ドロ一 5H—ジべン ゾ [b, f]ァゼピン }
APCI- S: m/z 422 ( [M + H]+)
-l NMR (DMS0-d6) δ (ppm)： 2.0-2.1 (m， 2 H) , 2.44 (t, J = 5.4 Hz, 2 H) , 2.75-2.8 (m， 2 H) , 2.8-3.0 (m, 4 H) , 3.30 (s， 21-1) , 5.33 (s， 2 H) , 5.5-5.6 (m, 2 H), 6.8-7.0 (m， 4 H) , 7.0-7.05 (m, 2 H)， 7.27 (dd， J = 4.7 Hz, 8.0 Hz, 1 H), 8.06 (d, J = 8.0 Hz, 1 H) , 8.27 (s, 1 H) , 8.37 (d, J = 4.7 Hz, 1 H), 8.54 (s, 1 H) . 化合物 8 9 {2_ (ィ ミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）一8— （1,2, 5,6 ーテ トラヒ ドロピリ ジン一 1—ィルメチル） 一10， 11—ジヒ ドロ _5H_ジベン ゾ [b， f ]ァゼピン · 1 シユウ酸塩 }
APCI-MS: m/z 422 ( [M + H]+)
Ή NMR (DMS0-d6) δ (ppm)： 2.2-2.3 (m, 2 H) , 2.9-3.0 (m, 4 H) , 3.4-3.5 (m, 2 H), 3.60 (t, J = 6.8 Hz, 2 H) , 4.05 (s, 2 H) , 5.37 (s, 2 H) , 5.67 (d, J = 10.8 Hz, 1 H), 5.85 (d, J = 10.8 Hz, 1 H) , 6.9-7.0 (m, 2 H) , 7.0-7.1 (m， 4 H), 7.25 (dd, J = 5.4, 8.1 Hz, 1 H) , 8.01 (d， J = 8.1 Hz, 1 H) , 8.40 (d, J = 5.4 Hz, 1 H) , 8.55 (s， 1 H)， 8.62 (s， 1 H) . 化合物 9 0 {2- (ィ ミダゾ [4, 5-c]ピリ ジン一 1一ィルメチル）一 8— (1， 2, 5, 6 ーテトラヒ ドロ ピリ ジン一 1一ィルメチル） 一 10, 11—ジヒ ドロ一 5H—ジベン ゾ [b, f ]ァゼビン }
APCI-MS: m/z 422 ( [M + H]+)
i NMR (CDC13) δ (ppm)： 2.1-2.2 (m, 2 H) , 2.56 (t, J = 5.7 Hz, 2 II ) ' 2.8-2.9 (m, 2 H), 3.0-3.1 (m, 4 H) , 3.48 (s, 2H) , 5.30 (s, 2 H) , 5.67 (d， J = 10.5 Hz, 1 H), 5.73 (d, J - 10.5 Hz, 1 H) , 6.08 (s, 1 H) , 6.65-6.75 (m, 2 H) , 6.95-7.0 (m, 2 H) , 7.0-7.05 (m, 2 H) , 7.71 (d, J = 5.4 Hz, 1 H)， 8.02 (s, 1 H) , 8.45 (d， J = 5.4 Hz, 1 H) , 8.78 (s， 1 H) . 参考例 2 2 N—メチル一 N— (2- ト リ チルー 2H—テ トラゾール— 5—ィルメ チル）了ミ ンの合成
2- ト リ チノレ 一 21·Ι—テ ト ラ ゾーノレ -一 5—ィノレメ タ ノ ーノレ (2.00 g, 5.84 mmol)、 N—メチノレ- 2—二 ト 口ベンゼンスノレホンァミ ド (1.64 g， 7.59 mmol) およびト リ フエ二ノレホスフィ ン （1.53 g, 5.84 mmol) をテ トラヒ ドロフラ ン （30 mL) およびトルエン （20 mL) の混合溶媒に溶解し、 ァゾジカルボン 酸ジェチルトルエン溶液 （40%, 2.65 mL, 5.84 mmol) を加えて室温で終夜 撹拌した。 シリカゲルを通過 （溶出溶媒 ： 酢酸ェチル /へキサン = 40/60) さ せて原点成分を除去した後、 減圧下濃縮し、 残渣にアセ トン （5 mL) とァセ トニト リル (25 mし) を加えた。
得られた懸濁液にメルカプト酢酸 （0.73 mL, 11 mmol) と 1， 8—ジァザビ シクロ [5, 4, 0]ゥンデックー 7 —ェン (3. l mL, 21 mmol) を加えて 60°Cで 7 時間撹拌した。 反応液を濃縮し、 残渣を酢酸ェチルに溶解した。 得られた溶 液を飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、 濃縮した。 残渣をシリ力ゲルク 口マ トグラフィー （溶出溶媒： ト リェチルァ ミ ン /酢酸ェチル = 1/99) で精製し、 N—メチルー N— (2— ト リ チル— 2H—テ トラゾ一ルー 5—ィルメチル）ァミン (396 mg, 1.11 mmol, 収率 19.0%) を 得た。
JH NMR (CDC13) δ (ppm)： 2.45 (s, 3 H) , 4.07 (s, 2 H) , 7.07-7.36 (m, 15 H). 参考例 2 3 ：化合物 9 2 {酢酸 [8—（2—ェチルー 5， 7—ジメチルー 3H—イ ミ ダゾ [4， 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル） - 10, 11—ジヒ ドロ -5H-ジベンゾ [b， f]ァゼピン一 2—ィルメチノレ]エステル） の合成
参考例 6で得られた化合物 1 3 (7.98 g, 13.1 ramol) をジメチルスルホ キシド （87 mL) に溶解し、 酢酸リチウム （4.33 g， 65.7 mL) を加えて 70°C で 2 日間撹拌した。 反応液を酢酸ェチルで希釈し、 水 （3 回）、 飽和食塩水 で順次洗浄し、 無水硫酸マグネシウムで乾燥し、 濃縮した。 残渣をシリカゲ ノレク ロマ トグラフィー (溶出溶媒：酢酸ェチル） で精製し、 目的物を含む画 分を濃縮し、残渣にエタノールを加えて得られる懸濁液を室温で 0.5時間撹 拌した。析出した結晶を濾取し、化合物 9 2 (2.87 g, 6.31 mmol,収率 48%) を得た。
APCI-MS: m/z 455 ( [M + H]+)
:H 腿 (CDC13) δ (ppm)： 1.30 (t, J = 7.5 Hz, 3 H) , 2.06 (s， 3 H) , 2.60 (s, 3 H), 2.62 (s, 3 H) , 2.79 (q, J = 7.5 Hz, 2 H) , 2.98 (m， 4 H) , 4.98 (s， 2 H), 5.34 (s, 2 H) , 6.13 (s， 1 H) , 6.58-6.83 (m, 4 H) , 6.88 (s, 1 H) , 7.01-7.07 (m, 2 H) . 参考例 2 4 ：化合物 9 3 { [8— (2—ェチル—5， 7—ジメチルー 3H—ィミダゾ [4, 5-b]ピリジン一 3—イ ノレメチル）一 10, 11—ジヒ ドロー 5H—ジベンゾ [b， f] ァゼピン一 2—ィル]メタノ一ノレ } の合成
参考例 2 3で得られた化合物 9 2 (2.79 g, 6.14 mmol) をテトラヒ ドロ フラン （61 mL) に懸濁させ、 ナトリ ウムメ トキシド /メタノール溶液（28%， 6.2 mL, 31 mmol)を加えて室温で 3.5時間撹拌した。 反応の進行を薄層クロ マトグラフィ一で確認した後、反応液に水を加えて室温にて 0.5時間撹拌し た。 析出した結晶を濾取し、 減圧下乾燥させた後、 エタノールに懸濁させ、 加熱還流条件下、 1時間撹拌し、 さらに室温で 1時間撹袢した。 析出した結 晶を濾取し、 減圧下で乾燥させ、 化合物 9 3 (2.04 g, 4.95 mmol, 収率 81%) を得た。
APCI - MS: m/z 413 ( [M + H]+)
JH NMR (CDC13) δ (ppm)： 1.30 (t, J = 7.6 Hz, 3 H) , 1.56 (t, J = 5.6 Hz, 1 H) , 2.60 (s, 3 H), 2.63 (s， 3 H) , 2.79 (q, J = 7.6 Hz, 2 H) , 2.98 (m， 4 H) , 4.55 (d, J = 5.6 Hz, 2 H)， 5.34 (s, 2 H)， 6.03 (s， 1 H) , 6.59-6.85 (m, 3 H), 6.88 (s， 1 H) , 7.03 (m, 2 H) . 参考例 2 5 ： 化合物 9 4 { 2—（2—ェチル— 5, 7—ジメ チル一 3H—ィミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル） -8-メ トキシメチル一 10， 11-ジヒ ドロ — 5H—ジベンゾ [b， f〕ァゼピン） の合成
水素化ナト リ ウム (55%, 11 mg， 0.25 mmol) のテ トラヒ ドロフラン (0.40 mL) 懸濁液にメタノール （20 μ L, 0.50 mmol) を加えて室温で 20分間攪 拌した。 その後、 反応液をテトラヒ ドロフラン（0.20 mL)に懸濁した参考例 6で得られた化合物 1 3 (30 mg, 0.050 mmol) に加え、 60°Cで 3· 5時間反 応させた。 反応液を濃縮した後、 残渣をク口口ホルムに溶解し、 得られた溶 液を水と飽和食塩水で順次洗浄し、 無水硫酸マグネシウムで乾燥し、 濃縮し た。 残渣をシリカゲルク ロマ トグラフィー （溶出溶媒 ： 酢酸ェチル /へキサ ン /トリェチルアミン = 45/50/5) で精製して、化合物 9 4 (6.5 mg, 15 mmol, 収率 30%) を得た。
APCI-MS： m/z 427 ( [M + H]+)
Ml 應 (CDC13) δ (ppm)： 1.30 (t， J = 7.6 Hz, 3 H) , 2.60 (s, 3 II), 2.63 (s, 3 H) ' 2.79 (q, J = 7.6 Hz, 2 H) , 2.98 (m， 4 H) , 3.36 (s, 3 H) , 4.32 (s, 2 H), 5.34 (s, 2 H) , 6.09 (s, 1 H) , 6.58-6.82 (m, 4 H) , 6.88 (s, 1 H), 7.01 (m， 2 H) . 参考例 2 6 ：化合物 9 5 {2—ァリルォキシメチル—8— (2—ェチル—5， 7— ジメチル一 3H—ィ ミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 10, 11—ジヒ ドロ一 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン） の合成
メタノールの代わりにァリルアルコールを用い、参考例 2 5 と同様にして、 収率 34%で化合物 9 5を得た。
APCI-MS: m/z 453 ( [M + H]+)
XH NMR (CDC13) δ (ppm)： 1.30 (t, J = 7.6 Hz, 3 H)， 2.60 (s， 3 H)， 2.63 (s， 3 H), 2.80 (q, J = 7.6 Hz, 2 H) , 2.98 (m, 4 H) , 4.00 (dt, J = 5.6, 1.5 Hz, 2 H), 4.39 (s， 2 H) , 5.19 (dq, J = 10.2, 1.5 Hz, 1 H) , 5.29 (dq, J = 17.0, 1.5 Hz, 1 H), 5.34 (s， 2 H) , 5.95 (m， 1 H) , 6.10 (s, 1 H)， 6.58-6.83 (m, 4 H) , 6.88 (s, 1 H)， 7.03 (m, 2 H) . 参考例 2 7 ： 化合物 9 6 { 2—（2—ェチル一 5， 7—ジメチル _ 3H—ィ ミダゾ [4, 5 - b]ピ リ ジン一 3—ィルメ チル）一 8— （2—メ トキシェ トキシメチル）一 10, 11_ジヒ ド口一 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン } の合成
メタノールの代わり に 2—メ トキシエタノールを用い、 参考例 2 5 と同様 にして、 収率 9.3%で化合物 9 6を得た。
APCI-MS： m/z 495 ( [M + H]+)
JH 鍾 (CDC13) δ (pptn)： 1.30 (t, J = 7.5 Hz, 3 H) , 2.60 (s, 3 H) , 2.63 (s, 3 H) , 2.80 (q, J = 7.5 Hz, 2 H) , 2.98 (m, 4 H)， 3.38 (s, 3 H) , 3.57 (m, 4 H), 4.44 (s, 2 H) , 5.34 (s, 2 H) , 6.01 (s, 1 H)， 6.62 (d, J = 8.6 Hz, 1 H), 6.67 (d， J = 8.1 Hz, 1 H)， 6.82 (m, 2 H) , 6.88 (s, 1 H) , 7.00-7.06 (m, 2 H). 参考例 2 8 ： 化合物 9 7 { 2—（2—ェチル— 5, 7—ジメチル一 3H—イ ミ ダゾ [4, 5 b]ピ Vジン一 3—イノレメチル）一8— (2, 2, 2— ト リ フルォロェ トキシメ チル）一 10， 11—ジヒ ドロー 5H—ジべンゾ [b, f ]ァゼピン） の合成
メタノールの代わり に 2, 2, 2- ト リ フルォロエタノールを用い、 参考例 2 5 と同様にして、 収率 64%で化合物 9 7を得た。
APCI-MS: m/z 495 ( [M + H]+)
XH 讓 (CDC13) δ (ppm)： 1.30 (t， J = 7.6 Hz, 3 H) , 2.60 (s， 3 H) , 2.63 (s， 3 H), 2.79 (q, J = 7.6 Hz, 2 H)'， 2.98 (m, 4 H) , 3.78 (q, J = 8.7 Hz, 2 H) , 4.54 (s， 2 II), 5.34 (s， 2 H) , 6.24 (s, 1 H)， 6.60 (d, J = 7.8 Hz, 1 H), 6.71 (d, J = 8.1 Hz, 1 H)， 6.76—6.82 (m, 2 H) , 6.89 (s, 1 H)， 6.98-7.04 (m, 2 H) . 参考例 2 9 ： 化合物 9 8 {2_ (2—ェチル一5， 7—ジメチル一 3H—イ ミ ダゾ
[4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメ チノレ）一 8— (2—メチルプロポキシメ チル）一 10, 11—ジヒ ドロー 5H—ジベンゾ [b， f〕ァゼピン） の合成
メタノールの代わり に 2—メチル一 1一プロパノールを用い、 参考例 2 5 と同様にして、 収率 11%で化合物 9 8 を得た。
APCI-MS: m/z 469 ( [M + H]+)
JH NMR (CDC13) δ (ppm)： 0.91 (d, J = 6.7 Hz, 6 H) , 1.30 (t, J = 7, 4 Hz, 3 H), 1.89 (m, 1 H) , 2.60 (s, 3 H) , 2.63 (s， 3 H) , 2.79 (q, J = 7.4 Hz, 2 H) , 2.99 (m， 4 H) , 3.20 (d， J = 6.5 Hz, 2 H) , 4.37 (s， 2 H) , 5.34 (s, 2 H)， 6.01 (s, 1 H), 6.60 (d, J = 8.9 Hz, 1 H) , 6.67 (d, J = 7.8 Hz, 1 H), 6.81 (m, 2 H) , 6.88 (s, 1 H) , 6.98-7.05 (m, 2 H) . 参考例 3 0 ： 化合物 9 9 {2—ベンジルォキシメチノレー 8—（2—ェチル一5， 7 —ジメチノレー 3H—ィ ミ ダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチノレ）一 10, 11—ジ ヒ ドロ _ 5H—ジベンゾ [b， f]ァゼピン } の合成
メタノールの代わり にベンジルアルコールを用い、参考例 2 5 と同様にし て、 収率 78%で化合物 9 9 を得た。
APCI-MS: m/z 503 ( [M + H]+)
JH NMR (CDC13) δ (ppm)： 1.30 (t, J = 7.5 Hz, 3 H)， 2.60 (s, 3 H) , 2.62 (s, 2 H) , 2.79 (q, J = 7.5 Hz, 2 H) , 2.97 (m, 4 H) , 4.42 (s, 2 H) , 4.53 (s, 2 H)， 5.33 (s， 2 11) , 6.20 (s， 1 H), 6.59 (d, J = 7.9 Hz, 1 H) , 6.69 (d, J = 7.9 Hz， 1 H), 6.78 (m, 2 H) , 6.88 (s， 1 H) , 7.02 (m, 2 H)， 7.26-7.36 (m, 5 H). 参考例 3 1 ：化合物 1 0 0 {2_ (2—ェチルー 5，7_ジメチルー 3H—イ ミ ダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 8— (2-フエニルェ ト キシメ チル）一 10, 11—ジヒ ドロ一 5H—ジベンゾ [b， f]ァゼピン } の合成
メ タノールの代わり に 2—フエニルエタノールを用い、 参考例 2 5 と同様 にして、 収率 38%で化合物 1 0 0 を得た。
APCI-MS: m/z 517 ( [M + H]+)
JH NMR (CDCI3) S (ppm)： 1.30 (t, J = 7.5 Hz, 3 H) , 2.60 (s, 3 H) , 2.63
(s， 3 H), 2.80 (q, J = 7.5 Hz, 2 H) , 2.91 (t， J = 7.2 Hz, 2 H) , 2.97 (m, 4 H), 3.66 (t, J - 7.2 Hz, 2 H) , 4.39 (s, 2 H) , 5.34 (s, 2 H)， 6.08 (s, 1 H), 6.60 (d， J = 8.7 Hz, 1 H) ' 6.66 (d, J = 8.1 Hz, 1 H) , 6.80 (m, 2 H), 6.88 (s, 1 H) , 6.94—7.01 (m， 2 H) , 7.19—7.30 (m, 5 H) . 参考例 3 2 ：化合物 1 0 1 {2— (2—ェチル一5, 7—ジメチル— 3H—イ ミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 8 _ (ピリ ジン一 2—ィルメ トキシメチ ル）一 10, 11—ジヒ ドロ _ 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン } の合成
メタノールの代わり にピリ ジン— 2—ィルメタノールを用い、 参考例 2 5 と同様にして、 収率 65%で化合物 1 0 1 を得た。
APCI-MS: m/z 504 ( [M + H]+)
】H NMR (CDC13) δ ( pm)： 1.30 (t, J = 7.5 Hz, 3 H) , 2.60 (s, 3 H) ' 2.63 (s, 3 H), 2.80 (q, J = 7.5 Hz, 2 H) , 2.98 (m, 4 H) , 4.52 (s, 2 H) , 4.66 (s, 2 H) , 5.34 (s.， 2 H) , 6.25 (s, 1 II), 6.60 (d, J = 7.9 Hz, 1 H) , 6.70 (d, J = 7.9 Hz, 1 H), 6.76-6.81 (m, 2 H)， 6.88 (s, 1 H) , 7.03-7.08 (m, 2 H), 7.18 (br dd, J = 7.6, 4.8 Hz, 1 H) , 7.47 (d, J = 7.9 Hz, 1 H)， 7.68 (td， J = 7.7, 1.8 Hz, 1 H) , 8.54 (br d, J = 4.8 Hz, 1 H) . 参考例 3 3 ：化合物 1 0 2 {2- (2—ェチルー 5, 7—ジメチル一311—ィ ミダゾ [4， 5-b]ピリ ジン— 3—ィルメチル）一 8—（フラン一 2—ィルメ トキシメチル） — 10， 11ージヒ ド口一 5H—ジべンゾ [b, f]ァゼピン } の合成
メタノールの代わり にフラン一 2—ィルメ タノールを用い、 参考例 2 5 と 同様にして、 収率 77%で化合物 1 0 2 を得た。
APCI-MS: m/z 493 ( [M + H]+)
JH NMR (CDCI3) δ (ppm)： 1.30 (t, J = 7.5 Hz, 3 H) , 2.60 (s, 3 H)， 2.62 (s, 3 H), 2.79 (q, J = 7.5 Hz, 2 H) , 2.97 (m, 4 H) , 4.41 (s, 2 H) , 4.45 (s, 2 H) , 5.33 (s， 2 H) , 6.21 (br s， 1 H)， 6.31 (dd, J = 3.1, 0.8 Hz, 1 H), 6.33 (dd, J = 3.1, 1.8 Hz, 1 H)， 6.58 (d， J = 8.1 Hz, 1 H) , 6.69 (d， J = 7.9 Hz, 1 H), 6.75-6.80 (m, 2 H) , 6.88 (s, 1 H) , 7.00-7.04 (m, 2 H), 7.40 (dd, J = 1.8, 0.8 Hz, 1 H) . 参考例 3 4 ：化合物 1 0 3 {8—（2—ェチルー 5, 7—ジメチルー 3H—ィミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン _ 3—ィルメチル） _ 10, 11—ジヒ ドロ一5H—ジベンゾ [b, f] ァゼピン一 2—カルボ二 ト リル } の合成
参考例 1 5の工程 1 で得られた 8—（2—ェチルー 5， 7—ジメチルー 3H—ィ ミダゾ [4, 5-b]ピリ ジンー3—ィルメチル）一 10, 11—ジヒ ドロ一 5H—ジべン ゾ [b,f]ァゼピン一 2_カルボアルデヒ ド （650 mg, 1.58 mmol) をァセ トニ ト リル（16 mL)に懸濁させ、ヒ ドロキシルアミ ン塩酸塩（153 mg, 2.38 mmol)、 トリエチノレアミン （0.331 mL, 2.38 mmol) およびフタノレ酸無水物 （328 mg, 2.21 mmol) を加えて 80°Cで終夜撹拌した。 反応液を濃縮し、 残渣をクロ口 ホルムに溶解し、 得られた溶液をアンモニア水 （3%) と飽和食塩水で順次 洗浄し、 無水硫酸マグネシウムで乾燥し、 濃縮した。 残渣をシリカゲルクロ マ トグラフィー （溶出溶媒： メタノール/クロ口ホルム = 1/99) で精製し、 目的物を含む画分を濃縮した。 残渣にエタノールを加え、 得られた懸濁液を 60°Cで 0.5時間撹拌し、 室温で 1時間撹拌した。 析出した結晶を濾取し、 減 圧下乾燥して、 化合物 1 0 3 (440 mg, 1.08 mmol, 収率 68%) を得た。 APCI-MS: m/z 408 ( [M + H]+)
JH NMR (CDC13) δ ( pm)： 1.31 (t, J = 7.6 Hz, 3 H) , 2.60 (s, 3 H)， 2.63 (s, 3 H), 2.79 (q, J = 7.6 Hz, 2 H) , 2.98, (m, 4 H) , 5.36 (s, 2 H) , 6.48 (s, 1 H), 6.63-6.90 (m， 5 H) , 7.28-7.33 (m, 2 H) . 参考例 3 5 ：化合物 1 0 4 {2— (2—ェチル—5, 7—ジメチル— 3H—ィミダゾ [4， 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメ チノレ）一 8— (2H-テ トラゾ一ルー 5—ィル）一 10， 11—ジヒ ドロー 5H—ジベンゾ [b，f]ァゼピン } の合成
参考例 3 4で得られた化合物 1 0 3を用い、参考例 2 0の後段と同様にし て、 収率 72%で化合物 1 0 4を得た。
APCI-MS: m/z 451 ( [M + H]+)
:H NMR (DMS0 - d6) δ (ppm)： 1.24 (t， J = 7.4 Hz, 3 H) , 2.48-2.53 (s x 2,
6 H, DMS0 とオーバーラップ）, 2.80 (q, J = 7.4 Hz, 2 H) , 2.86-3.02 (m,
4 H), 5.32 (s， 2 H), 6.83 (dd, J = 8.1, 2.1 Hz, 1 H) , 6.91-6.98 (m, 3
H), 7.10 (d， J = 9.0 Hz, 1 H) , 7.65—7.70 (ra, 2 H)， 8.20 (s, 1 H) . 参考例 3 6 ： 化合物 1 0 5 { [8—（2—ェチル一 5， 7—ジメチル— 3H—ィミダ ゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—イノレメ チル）一 10, 11—ジヒ ド口 一 511—ジベンゾ [b， f]ァゼピン一 2—ィル]ァセ トニ ト リル) の合成
参考例 6で得られた化合物 1 3 (2.04 g, 3.36 mmol) をジメチルホルム アミ ド （17 mL) に溶解して、 青酸ナトリ ウム （361 mg， 7.37 mmol) を加え、 50°Cで 10時間撹拌した。 反応液を室温まで冷却し、 酢酸ェチルで希釈し、 2mol/L水酸化ナトリ ウム水溶液、 水 （2回）、 飽和食塩水で順次洗浄し、 無 水硫酸マグネシウムで乾燥し、 濃縮した。 残渣をエタノールから再結晶し、 化合物 1 0 5 (751 mg, 1.78 mmol, 収率 53%) を得た。
APCI-MS： m/z 422 ( [M + H]+)
NMR (CDC13) δ ( pm)： 1.31 (t, J = 7.5 Hz, 3 H) , 2.60 (s, 3 H) , 2.63 (s, 3 1.1)， 2.79 (q, J = 7.5 Hz, 2 H) , 2.99 (m, 4 H) , 3.62 (s, 2 H) , 5.34 (s, 2 H) , 6.01 (s, 1 H)， 6.59-6.71 (m, 2 H) , 6.80-6.84 (m， 2 H)， 6.88 (s, 1 H), 6.95-7.01 (m, 2 H) . 参考例 3 7 ：化合物 1 0 6 {2- (2—ェチルー 5， 7—ジメチル— 3H—ィミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）ー8_ (2H—テ ト ラゾールー 5—ィルメチ ル）一 10, 11—ジヒ ドロー 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン } の合成
参考例 3 6で得られた化合物 1 0 5を用い、参考例 2 0の後段と同様にし て、 収率 76%で化合物 1 0 6を得た。
APCI-MS: m/z 465 ( [M + H]+)
NMR (DMS0-d6) 8 (ppm)： 1.22 (t, J = 7.6 Hz, 3 H) , 2.48-2.52 (s x 2， 6 H, DMSOとォーパーラップ）， 2.78 (q, J = 7.6 Hz, 2 H) , 2.86 (m, 4 H) , 4.11 (s, 2 H) , 5.28 (s, 2 H) , 6.75-6.94 (m, 7 H)， 8.32 (br s， 1 H) . 参考例 3 8 ： 化合物 1 0 7 { [8— (2—ェチル _ 5， 7—ジメチルー 3H—イミダ ゾ [4， 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 10， 11ージヒ ドロ ー 511—ジベンゾ [b, f]ァゼピン一2—ィル]酢酸 } の合成
参考例 3 6で得られた化合物 1 0 5 (247 mg, 0.586 mmol) をエタノール (12 mL) に懸濁し、 水酸化ナトリ ウム （938 mg, 23.5 mmol) を加えて、 加 熱還流条件下、 3時聞撹袢した。 反応の進行を薄層クロマトグラフィーで確 認した後、 反応液を室温まで冷却し、 lmol/L塩酸で pHを 5に調整した。 析 出した結晶を濾取し、 減圧下乾燥した後、 エタノールに懸濁し、 60°Cで 0.5 時間撹拌し、 室温で 1時間撹拌した。 析出した結晶を濾取し、 減圧下乾燥し て、 化合物 1 0 7 ( 122 mg, 0.243 mmol, 収率 41%) を得た。
APCI-MS: m/z 441 ( [M + H]+)
XH NMR (DMS0-d6) δ (ppm)： 1.23 (t， J = 7.5 Hz, 3 H) , 2.48-2.53 (s x 2， 6 H, DMSOとォーノ ーラップ）， 2.78 (q, J = 7.5 Hz, 2 H)， 2.87 (br s, 4 H), 3.38 (s, 2 H), 5.38 (s, 2 H) , 6.74-6.94 (m， 7 H) , 8.27 (s, 1 H)， 12.15 (br s， 1 H) . 参考例 3 9 ：化合物 1 0 8 { [8- (2—ェチル—5, 7-ジメチル— 3H—ィ ミダ ゾ [4， 5-b]ピ リ ジン一 3—ィルメ チル）一 10, 11—ジ ヒ ドロ 一 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン一 2—イノレメチルスノレファニル]酢酸メチルエステル） の合成 参考例 6で得られた化合物 1 3 (1.04 g, 1.71 mmol) をクロ口ホルム （17 mL) に溶解して、 メルカプト酢酸メチルエステノレ （0.199 mL, 2.23 mmol) および 1， 8—ジァザビシク口 [5， 4， 0]ゥンデック一 7—ェン （0.384 mL, 2.57 mmol) を加え、 40°Cで 7時間撹拌した。 反応液を濃縮し、 残渣をシリカゲル ク ロマ トグラフィー（溶出溶媒：メタノール/ク ロ 口ホルム =1/99)で精製し、 化合物を含む画分を濃縮した。 残渣にエタノールを加え、 得られた懸濁液を 60°Cで 0.5時間、 室温で 1時間撹拌した。 析出した結晶を濾取して、 化合物 1 0 8 (628 mg, 1.25 mmol, 収率 73%) を得た。
APCI-MS: m/z 501 ( [M + H]+)
JH NMR (CDC13) δ (ppm)： 1.30 (t, J = 7.5 Hz, 3 H) , 2.60 (s, 3 H) , 2.63 (s, 3 H), 2.80 (q, J = 7.5 Hz, 2 H) , 2.98 (m, 4 H) , 3.09 (s, 2 H)， 3.72 (s, 3 H), 3.73 (s, 2 H)， 5.34 (s, 2 H) , 6.01 (s, 1 H) , 6.59-6.67 (m, 2 H), 6.82 (ra, 2 H) , 6.88 (s， 1 H) , 6.96-7.03 (m, 2 H) 参考例 4 0 :化合物 1 0 9 { [8- (2—ェチルー 5, 7_ジメチルー 3H—イミダ ゾ [4， 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメ チル）一 10, 11—ジヒ ドロ 一 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン— 2—ィルメチルスルファニル]酢酸） の合成
参考例 3 9で得られた化合物 1 0 8 (350 mg, 0.699 mmol) を用い、 参考 例 1 2と同様にして、 収率 38%で化合物 1 0 9を得た。
APCI-MS: m/z 487 ( [M + H]+)
JH NMR (DMSO - d6) 5 (ppm)： 1.16 (t, J = 7.4 Hz, 3 H) , 2.42-2.50 (s x 2， 6 H, DMSOとォーノ ーラップ）， 2.81 (q, J = 7.4 Hz, 2 H) , 2.88 (m, 6 H) , 3.49 (s, 2 H) , 5.22 (s, 2 H) , 6.67-6.89 (m, 7 H) , 8.18 (s, 1 H) . 参考例 4 1 ：化合物 1 1 0 {8- (2—ェチルー 5, 7—ジメチルー 3H—ィミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 10, 11—ジヒ ドロ一 5H-ジべンゾ [b, f] ァゼピン一 2—カルボン酸ェチルエステノレ } の合成
工程 1
ヨ ウ化 1— (10， 11ージヒ ドロ一 5H—ジべンゾ [b, f]ァゼピン一 2—ィルメ チノレ） _ 1ーメチルピペリジニゥム (6.68 g, 15.4 mmol) をジメチルスルホ キシド （110 mL) に溶解し、 酢酸リチウム （5.07 g， 76.9 mmol) を加えて、 70°Cで 2 日間攪拌した。 反応溶液を酢酸ェチルで希釈し、 水 （3回） と飽和 食塩水で順次洗浄し、 無水硫酸マグネシウムで乾燥し、 濃縮した。 残渣をシ リカゲルクロマトグラフィー (溶出溶媒：酢酸ェチル /へキサン = 30/70) で 精製して、 酢酸 （10, 11—ジヒ ドロ一 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン _2—ィル メチル） エステル （2.85 g, 10.7 mmol, 収率 69%) を得た。
APCI-MS: m/z 268 ( [M + H]+)
XH NMR (CDC13) δ (ppm)： 2.07 (s, 3 H)， 3.07 (br s， 4 H)， 4.99 (s, 2 H) , 6.05 (br s, 1 H) , 6.66-6.85 (m， 3 H) , 7.02-7.11 (m, 4 H) .
X TSE 2
工程 1で得られた酢酸（10, 11—ジヒ ドロ一 5H—ジベンゾ [b，f]ァゼピン一 2—ィルメチル) エステノレ (2.85 g, 10.7 mmol) をメタノーノレ (110 mL) に 懸濁して、 ナトリ ウムメ トキシド /メ タノール溶液 （38%, 1.14 mL, 5.36 mmol) を加え、 室温で 1時間攪拌した。 反応溶液を濃縮し、 残渣に飽和食塩 水とクロ口ホルムを加え、 3 回クロ口ホルムで抽出した。 有機層を合わせ、 無水硫酸マグネシゥムで乾燥し、 濃縮した。 残渣をジィソプロピルエーテル から再結晶して、 10, 11—ジヒ ドロー 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン一 2—ィル メタノール （1.73 g, 7.68 mmol, 収率 72%) を得た。
APCI-MS: m/z 226 ( [M + H]+)
XH丽 R (CDC13) δ (ppra)： 1. 9 (t, J = 5.8 Hz, 1 H) , 3.08 (br s, 4 H) , 4.57 (d, J = 5.8 Hz, 2 H), 6.02 (br s， 1 H) , 6.66-6.87 (m， 3 H) , 7.02-7.11 (m, 4 H).
工程 3
工程 2で得られた 10, 11—ジヒ ドロ -5H-ジベンゾ [b, f]ァゼピン一 2—ィ ルメ タノール (6.1 g， 70 mmol) をクロ口ホルム (77 mし) に溶解して、 二 酸化マンガン （4.55 g, 46.1 mmol) を加え、 室温で 8時間攪拌した。 反応 溶液をセライ トを通じて濾過し、 濾液を濃縮した。 残渣をシリ力ゲルクロマ トグラフィー （溶出溶媒：酢酸ェチル /へキサン = 20/80) で精製して、 10, 11 —ジヒ ドロ一5H—ジベンゾ [b，f]ァゼピン一 2_カルボアノレデヒ ド （1.15 g, 5.15 mmol, 収率 67%) を得た。
APCI-MS： m/z 224 ( [M + H]+)
XH NMR (CDC13) δ (ppm)： 3.11 (m, 4 H) , 6.49 (br s, 1 H) , 6.87-6.91 (m, 3 H) , 7.07-7.17 (m, 2 II), 7.55-7.62 (m, 2 H)， 9.88 (s, 1 H) .
工程 4
工程 3で得られた 10, 11—ジヒ ドロ一 51-1—ジベンゾ [b, f]ァゼピン一 2—力 ルボアルデヒ ド (665 mg, 2.98 mmol) をァセ トニト リル (18 mし) および水
(18 mL) の混合溶媒に溶解して、 ジメチルスルホキシド（2.1 mL, 30 mmol)、 リ ン酸 2水素ナトリ ウム （1.43 g， 11.9 mmol) および亜塩素酸ナトリ ウム
(404 mg, 4.47 mmol) を加え、 50°Cで 4時間攪拌した。 反応溶液に酢酸ェ チルと水を加え、酢酸ェチルで 2回抽出した。有機層を合わせ、水で洗浄し、 無水硫酸マグネシウムで乾燥し、 濃縮した。 残渣に酢酸ェチルとへキサンの 混合溶媒 （ 3 : 1 ) を加え、 得られる懸濁液を 60Cで 0. 5時間撹拌し、 室 温で 1 時間撹拌した。 析出した結晶を濾取して、 10， 11一ジヒ ド u— 5Hージ ベンゾ [b,f]ァゼピン一 2—カルボン酸 （598 mg， 2.50 mmol, 収率 84%) を 得た。 APCI-MS: m/z 240 ( [M + H]+)
JH NMR (CDC13) 6 (ppm)： 3.11 (m, 4 H) , 6.39 (br s, 1 H) , 6.77-6.80 (m, 3 H)， 7.06-7.16 (m, 2 H) , 7.79-7.84 (m, 2 H) .
工程 5
工程 4で得られた 10， 11—ジヒ ドロー 5H_ジベンゾ [b， f]ァゼピンー2—力 ルボン酸 (426 mg, 1.78 mmol) をエタノール （8.9 mL) に溶解して、 塩化 チォニル （0.26 mL, 3.6 mmol) を加え、 加熱還流条件下、 5時間攪拌した。 反応溶液を濃縮し、 クロ口ホルムと飽和重曹水を加え、 クロ口ホルムで 3回 抽出した。 有機層を合わせ、 飽和食塩水で洗浄し、 無水硫酸マグネシウムで 乾燥し、 濃縮した。 残渣をシリ 力ゲルク 口マ トグラフィー （溶出溶媒 ： 酢酸 ェチル /へキサン = 10/90) で精製して、 10, 11—ジヒ ドロ _ 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン一 2—力ルボン酸ェチノレエステノレ (383 mg, 1. 3 mmol, 収率 81%) を得た。
APCI-MS: m/z 268 ( [M + H]+)
!H NMR (CDC13) δ (ppm)： 1.37 (t, J = 7.0 Hz, 3 H) , 3.09 (m, 4 H) , 4.33 (q, J = 7.0 Hz, 2 H), 6.34 (br s， 1 H)， 6.69-6.86 (m, 3 H) , 7.04-7.14 (m, 2 H), 6.72-6.78 (m, 2 H) .
工程 6
工程 5で得られた 10, 11—ジヒ ドロ - 5H-ジベンゾ [b, f]ァゼピン一 2—力 ノレボン酸ェチノレエステノレ （443 mg, 1.66 mmol) をク ロロ ホノレム （8.3 mL) および酢酸（8.3 mL) の混合溶媒に溶解し、 ピぺリ ジン（0.573 mL, 5.80 mmol) およびパラホルムアルデヒ ド （149 mg， 4.97 mmol) を加え、 60°Cに加熱し、 1.5 日間撹拌した。 反応液を濃縮し、 残渣に酢酸ェチルと飽和重曹水を加え て、 酢酸ェチルで抽出した。 有機層を合わせ、 飽和食塩水で洗浄し、 無水硫 酸ナ ト リ ゥムで乾燥後、濃縮した。残渣をシリ力ゲルク口マ トグラフィー（溶 出溶媒 ： 酢酸ェチル /へキサン/ト リ,ェチルァミ ン =ァ0/25/5) で精製し、 目 的物を含む画分を濃縮した。残渣をジェチルエーテルで ト リチユレーシヨ ン し、 8—ピペリ ジノメチルー 10, 11—ジヒ ドロー 5H—ジベンゾ [b,f]ァゼピン 一 2_力ノレボン酸ェチルエステノレ (249 mg, 0.683 mmol, 収率 41%) を得た。 APCI-MS: m/z 365 ( [M + H]+) XH NMR (CDCI3) δ (ppra)： 1.34-1.46 (m, 5 H) , 1.67 (m, 4 H) , 2.36 (br s, 4 H), 3.08 (m, 4 H) , 3.38 (s, 2 H) , 4.33 (q, J = 7.1 Hz, 2 H)， 6.32 (s, 1 H), 6.67-6.74 (m, 2 H) , 6.99-7.06 (m, 2 H)， 7.72-7.76 (m, 2 H) . 工程 7
工程 6で得られた 8—ピペリ ジノ メチルー 10, 11—ジヒ ドロ一5H—ジベン ゾ [b，f]ァゼピン一2—力ルボン酸ェチノレエステル (231 mg, 0.634 mmol) を ジクロロメタン （3.2 mL) に溶解して、 ヨ ウ化メチル （59.2 μ L, 0.951 mmol) を加え、 室温で終夜撹拌した。 反応溶液を減圧下濃縮して、 ヨ ウ化 1一（8_ エトキシカルボ二ルー 10, 11—ジヒ ドロ一 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン _ 2— ィルメ チノレ）一 1—メチノレビペリ ジニゥム (321mg， 0.634 mmol, 収率 100%) を得た。
2H NMR (CDCI3) δ (ppm)： 1.37 (t， J = 7.1 Hz, 3 H) , 1.75-1.95 (m, 6 H) , 2.96 (br s, 4 H)， 3.11 (s, 3 H) , 3.50 (m, 2 H) , 3.70 (m, 2 H) , 4.32 (q, J = 7.1 Hz, 2 H), 4.90 (s， 2 H) , 7.14-7.35 (m, 4 H) , 7.49 (s, 1 H) , 7.71 (m, 2 H).
工程 8
2—ェチル _ 5， 7—ジメチル一 3H—ィ ミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン（180 mg, 1.03 mmol) をジメチルホルムアミ ド （0.60 mL) に溶解し、 攪拌しながら水素化 ナト リ ウム （55%, 33.6 mg, 0.770 mmol) を数回に分けて加えた後、 50°C で 0. 5時間撹袢した。反応液を室温まで冷却し、 ジメチルホルムァミ ド（1.2 mL)に溶解した工程 7で得られたヨ ウ化 1— (8—エ トキシカルボニル一 10， 11 —ジヒ ドロ一 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン一 2—ィルメチノレ）一 1ーメチノレビ ペリ ジニゥム （130 mg， 0.256 mmol) を加え、 室温で 1時間攪拌した。 反応 溶液を酢酸ェチルで希釈し、 氷、 水、 飽和食塩水で順次洗浄し、 無水硫酸マ グネシゥムで乾燥し、 濃縮した。 残渣をシリ力ゲルク口マ トグラフィー （溶 出溶媒： メタノール /ク口口ホルム =1/99) で精製し、 目的物を含む画分を濃 縮した。 残渣にジェチルエーテルを加え、 加熱還流条件で 0.5 時間撹拌し、 その後室温で 1 時間で撹拌した。 析出した結晶を濾取して、 化合物 1 1 0
(76.7mg, 0.169 mmol, 収率 66%) を得た。
APCI - MS: m/z 455 ( [M + H]+) XH NMR (CDCI3) δ (ppm)： 1.31 (t, J = 7.6 Hz, 3 H) , 1. 36 (t, J = 7. 1 Hz, 3 II), 2.60 (s, 3 H) ' 2.63 (s， 3 H)， 2.80 (q, J = 7. 6 Hz, 2 II) , 2.97 (m, 2 H), 3.40 (m, 2 H) , 4.32 (q, J = 7. 1 Hz, 2 H) , 5. 36 (s, 2 H), 6.35 (s， 1 H), 6.64-6. 71 (m, 2 H) , 6.82-6. 90 (m, 3 H) , 7.70-7. 74 (m, 2 H) . 参考例 4 2 ：化合物 1 1 1 { 8- (2—ェチルー 5, 7—ジメチルー 3H—ィミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル） _ 10, 11—ジヒ ドロー 5H—ジベンゾ [b, f] ァゼピン一 2—カルボン酸 } の合成
参考例 4 1で得られた化合物 1 1 0 (900 mg， 1.98 mmol) を用い、 参考 例 1 2と同様にして、 収率 97%で化合物 1 1 1 を得た。
APCI-MS: m/z 427 ( [M + H]+)
:H NMR (DMS0-d6) δ (ppm)： 1.24 (t， J = 7. 5 Hz, 3 H) , 2. 51-2.54 (s x 2, 6 H, DMSO とオーバーラ ップ）， 2.82-2.99 (m, 6 H) , 5.37 (s, 2 H) , 6.84-7.03 (m, 5 H) , 7. 58 (m, 2 H) , 8.87 (br s, 1 H) , 12.25 (br s, 1 H) . 参考例 4 3 ： 化合物 1 1 2 { [8— (2—ェチルー 5, 7—ジメチルー 3H—イミダ ゾ [4, 5-b]ピ リ ジン一 3—ィルメ チル）一 10, 11—ジヒ ドロ 一 5H—ジベンゾ [b， f]ァゼピン一 2—ィル] (4-メチルピペラジン _ 1一ィル）メタノ ン） の合 成
参考例 4 2で得られた化合物 1 1 1 (100 mg, 0.234 mmol) をジメチルホ ルムアミ ド （2.3 mL) およぴテトラヒ ドロフラン （4.6 mL) の混合溶媒に溶 解し、 これに 4ーメチルピペラジン （39 μし, 0.352 mmol) N 1—ェチル _ 3 (3—ジメチルァミ ノプロピル） カルボジィ ミ ド · 1塩酸塩 （89.7 mg, 0. 468 mmol) および 1—ヒ ドロキシベンゾ ト リ アゾール (35.8 mg, 0.234 mmol) を加えて室温で 8時間攪拌した。反応の進行を薄層クロマトグラフィ一で確 認した後、 反応液を濃縮した。 残渣をクロ口ホルムに溶解し、 得られた溶液 を水 （2 回）、 飽和重曹水、 飽和食塩水で順次洗浄し、 無水硫酸マグネシゥ ムで乾燥し、 濃縮した。 残渣にジェチルエーテルを加え、 得られる懸濁液を 室温で 1時間撹拌した後、 固体を濾取して、 化合物 1 1 2 (47.7 mg, 0.0938 mmol, 収率 40%) を得た。 APCI - MS: m/z 509 ( [M + H]+)
XH NMR (CDCI3) δ (ppm)： 1.31 (t, J = 7.5 Hz, 3 H) , 2.33 (s, 3 H) , 2.43 (br s, 4 H)， 2.60 (s, 3 H) , 2.63 (s, 3 H) , 2.80 (q, J = 7.5 Hz, 2 H) , 2.99 (m, 4 H)， 3.66 (br s, 4 H) , 5.35 (s, 2 H) , 6.18 (s, 1 H) , 6.62-6.69 (m, 2 H), 6.83 (m, 2 H) , 6.85 (s, 1 H)， 7.10-7.15 (m, 2 H) . 参考例 4 4 ： 化合物 1 1 3 { [8- (2—ェチル—5, 7—ジメチル— 3H—ィ ミ ダ ゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメ チル） _ 10， 11ージヒ ドロ ー 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン一 2—ィル] (ピロ リ ジン一 1一ィル）メタノ ン } の合成
4—メチルビペラジンの代わり にピロ リ ジンを用い、 参考例 4 3 と同様に して、 収率 90%で化合物 1 1 3を得た。
APCI-MS: m/z 480 ( [M + H]+)
JH NMR (CDCI3) δ (ppm)： 1.31 (t, J = 7.5 Hz, 3 H) , 1.88 (br s, 4 H) , 2.60 (s, 3 H) , 2.63 (s, 3 H)， 2.80 (q, J = 7.5 Hz, 2 H) , 2.99 (m， 4 H) , 3.56 (m, 4 H), 5.35 (s, 2 H)， 6.19 (s, 1 H)， 6.62-6.69 (m, 2 H) , 6.81-6.86 (m， 2 H), 6.89 (s, 1 H) , 7.24-7.29 (m, 2 H) . 参考例 4 5 ： 化合物 1 1 4 { [8—（2—ェチル一 5, 7—ジメチル— 3H—ィ ミ ダ 'ゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメ チル）一 10， 11—ジヒ ドロ ー 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン一2—ィル] (4-ヒ ドロキシピぺリ ジノ）メタノ ン } の合成
4—メチルビペラジンの代わり に 4-ピぺリ ジノールを用い、 参考例 4 3 と同様にして、 収率 62%で化合物 1 1 4を得た。
APCI-MS: m/z 510 ( [M + H]+)
JH NMR (CDCI3) δ (ppm)： 1.31 (t, J = 7.0 Hz, 3 H) , 1.48-1.58 (m, 2 H) , 1.86-1.97 (m, 2 H) , 2.60 (s， 3 H) , 2.63 (s, 2 H) , 2.80 (q, J = 7.0 Hz, 2 H), 2.99 (m, 4 II) , 3.22-3.33 (m， 2 H) , 3.91-4.00 (m, 3 H) , 5.36 (s, 2 H), 6.21 (s, 1 H), 6.62-6.70 (m, 2 H) , 6.81-6.85 (m， 2 H) , 6.89 (s， 1 H), 7.08-7. 14 (m, 2 H) . 参考例 4 6 ：化合物 1 1 5 {8- (2—ェチルー 5, 7—ジメチルー 31トイ ミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）一10， 11ージヒ ドロー 5H—ジベンゾ [b， f] ァゼピン一 2—カルボン酸（2—ヒ ドロキシェチル）アミ ド} の合成
4-メチルピペラジンの代わりにエタノールァミンを用い、 参考例 4 3と 同様にして、 収率 82%で化合物 1 1 5を得た。
APCI-MS: ra/z 470 ( [M + H]+)
XH NMR (CDC13) δ (ppm)： 1.31 (t, J = 7.5 Hz, 3 H) , 1.71 (br s, 1 H) , 2.60 (s， 3 H), 2.63 (s, 3 H)， 2.79 (q, J = 7.5 Hz, 2 H) , 2.97 (m, 4 H) , 3.59 (m, 2 H) , 3.81 (t, J = 9.6 Hz, 2 H) , 5.35 (s， 2 H) , 6.41 (s, 1 H) , 6.54 (t， J = 5.6 Hz, 1 H), 6.63-6.71 (m, 2 H) , 6.80-6.84 (m, 2 H) , 6.99 (s， 1 H), 7.44-7.48 (m, 2 H) . 参考例 4 7 ：化合物 1 1 6 {8- (2—ェチルー 5, 7—ジメチル— 3H—ィミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル） - 10， 11—ジヒ ドロ - 5H-ジべンゾ [b, f] ァゼピン一 2—力ルボン酸 [2— (ピロ リ ジン一 1—ィル) ェチル]ァミ ド} の 合成
4-メチルピペラジンの代わり に 2—（ピロ リジン一 1—ィル）ェチルァミ ン を用い、 参考例 4 3 と同様にして、 収率 92%で化合物 1 1 6を得た。
APCI-MS: m /z 523 ( [M + H]+)
XH NMR (CDC13) δ (ppm)： 1.31 (t, J = 7.6 Hz, 3 H) , 1.78 (m, 4 H) , 1.57 (m， 4 H), 2.60 (s, 3 H) , 2.63 (s, 3 H) , 2.70 (t, J = 5.9 Hz, 2 II), 2.79 (q, J = 7.6 Hz, 2 H) , 2.97 (m, 2 H) , 3.04 (m, 2 H) , 3.53 (q, J = 5.7 Hz, 2 H), 5.35 (s, 2 H)， 6.30 (s， 1 H) , 6.63-6.72 (m, 3 H)， 6.83 (m, 2 H) , 6.89 (s, 1 H), 7.45-7.52 (m, 2 H) . 参考例 4 8 ：化合物 1 1 7 { [8— (2—ェチルー 5, 7—ジメチルー 3H—イミダ ゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメ チル）一 10, 11—ジヒ ドロ 一 5H—ジベンゾ [b，f]ァゼピン— 2—ィル] (モルホリ ノ）メタノン } の合成
4—メチルビペラジンの代わりにモルホリ ンを用い、 参考例 4 3 と同様に して、 収率 98%で化合物 1 1 7を得た。
APCI-MS: m/z 496 ( [M + H]+) :H NMR (CDCI3) δ (ppm)： 1.31 (t, J = 7.5 Hz, 3 H) , 2.60 (s, 3 H) ' 2.63 (s, 3 H)， 2.80 (q， J = 7.5 Hz, 2 H) , 2.99 (m, 4 H)， 3.66 (m, 8 H) , 5.35 (s, 2 H), 6.22 (s， 1 H), 6.62-6.71 (m， 2 H) , 6.81-6.86 (m， 2 H) , 6.89 (s, 1 H), 7.10-7.16 (m， 2 H) . 参考例 4 9 ：化合物 1 1 8 {8— (2—ェチルー 5， 7—ジメチル— 3H—ィ ミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 10， 11ージヒ ドロ一 5H-ジべンゾ [b, f] ァゼピン一 2—力ルボン酸 [ビス（2— ヒ ドロキシェチル）]アミ ド } の合成
4-メチノレビペラジンの代わり に 2— (2-ヒ ドロキシェチノレアミ ノ）ェタノ ールを用い、 参考例 4 3 と同様にして、 収率 38%で化合物 1 1 8 を得た。 APCI-MS: m/z 514 ( [M + H]+)
XH NMR (CDCI3) δ (ppm)： 1.21 (t, J = 7.5 Hz, 3 H) , 2.60 (s, 3 H) , 2.63 (s, 3 H) , 2.80 (q, J = 7.5 Hz, 2 H) , 2.98 (m, 4 H)， 3.23 (br s, 2 H)， 3.63 (br s， 4 H)， 3.87 (br s， 4 H) , 5.35 (s, 2 H) , 6.20 (s, 1 H) , 6.62-6.69 (m， 2 H), 6.83 (m， 2 H)， 6.89 (s, 1 H) , 7.24-7.29 (m, 2 H) . 参考例 5 0 ：化合物 1 1 9 {8—（2—ェチル— 5， 7—ジメチル— 3H—ィ ミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル） - 10, 11一ジヒ ドロ一 5H—ジベンゾ [b, f] ァゼピン一 2—カルボン酸アミ ド} の合成
4—メチルビペラジンの代わり にアンモニアを用い、 参考例 4 3 と同様に して、 収率 57%で化合物 1 1 9 を得た。
APCI-MS: m/z 426 ( [M + H]+)
JH NMR (CDCI3) δ (ppm)： 1.23 (t, J = 7.4 Hz, 3 11) , 2.48-2.52 (s x 2, 6H, DMSO とオーバーラップ) , 2.78 (q, J = 7.4 Hz, 2 H) , 2.92 (br q, J = 7.3 Hz, 4 H), 5.31 (s， 2 H) , 6.78-7.00 (m， 6 H) , 7.52-7.65 (m, 3 H) , 8.68 (s, 1 H). 参考例 5 1 ：化合物 1 2 0 {2—（2—ェチルー 5, 7—ジメチル— 3H—ィ ミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 5—メチル _ 8—（ピロ リ ジン一 1ーィル メチル）一 10, 11—ジヒ ドロー 5H—ジベンゾ [b,f]ァゼピン } の合成 参考例 3で得られた化合物 3 (400 mg, 0.876 mmol) を酢酸 （8.8 mL) に 溶解し、 パラホルムアルデヒ ド （0.47 g, 16 mmol) およびシァノ水素化ホ ゥ素ナトリ ウム （2.2 g, 10 mmol) を加えて室温で 5時間撹拌した。 反応溶 液にクロ口ホルムと飽和重曹水を加え、水層をク口口ホルムで 2回抽出した c 有機層を飽和食塩水で洗浄後、 無水硫酸マグネシウムで乾燥し、 濃縮した。 残渣を NH-シリ力ゲルクロマ トグラフィー （溶出溶媒 ： ク口口ホルム/へキ サン = 50/50) で精製して、 化合物 1 2 0 (342 mg, 0.713 mmol, 収率 81%) を得た。
APCI-MS： m/z 480 ( [M + H]+)
JH NMR (CDC13) δ ( pm)： 1.31 (t, J = 7.5 Hz, 3 H) , 1.76 (m, 4 H) , 2.47 (m， 4 H) , 2.58 (s, 3 H) , 2.62 (s, 3 H) , 2.78 (q, J = 7.5 Hz, 2 H) , 3.06 (in, 4 H) , 3.29 (s， 3 H) , 3.50 (s, 2 H) , 5.35 (s, 2 H) , 6.83-6.98 (m， 5 H), 7.02-7.08 (m， 2 H) . 参考例 5 2 ：化合物 1 2 1 {1— [8—（2—ェチルー 5, 7_ジメチルー 3H—イミ ダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—イノレメチノレ）一 5—メチルー 10, 11—ジヒ ド ロ ー 5H ージベンゾ [b, f]ァゼピン一 2 _ィルメチル]ピぺリ ジン一 4—カルボン酸 }の 合成
工程 1
参考例 9で得られた化合物 1 6 (1.20 g, 2.18 mmol) を酢酸 （10 mL) に 溶解し、 パラホルムアルデヒ ド （0.73 g, 21.8 mmol) およびシァノ水素化 ホウ素ナトリ ウム （0.58 g, 8.70 mmol) を加えて室温で 15時間攪拌した。 反応溶液に酢酸ェチルと lmol/L水酸化ナトリ ウム水溶液を加え、 水層を酢 酸ェチルで抽出した。 有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、 溶媒を減圧 留去した。 残渣を NH—シリ力ゲルク Gマ トグラフィー （溶出溶媒 ： へキサ ンー酢酸ェチル混合溶媒） で精製して、 1一 [8— (2—ェチルー 5， 7—ジメチル 一 3H—ィ ミダゾ [4， 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 5—メ チルー 10, 11—ジ ヒ ドロ 一 5H-ジべンゾ [b， f]ァゼピン一 2—ィルメ チル]ピペ リ ジン一 4一力 ルボン酸ェチルエステル （1, 25 g, 2.18 mmol, 収率 100%) を得た。
APCI-MS: m/z 566 ( [M + ΗΓ) lti NMR (CDC13) δ (ppm)： 1.23 (t, J = 7.4 Hz, 3 H) , 1.31 (t, J = 7.6 Hz, 3 H) , 1.6-2.0 (m, 6 H) , 2.23 (m, 1 H) , 2.58 (s, 3H) , 2.62 (s, 3 H) , 2.73 (q, J = 7.4 Hz, 2 H)， 2.75-2.9 (m, 2 H) , 3.0-3.15 (m, 4 H) , 3.28 (s, 3 H), 3.36 (s, 2 H) , 4.10 (q, J = 7.6 Hz, 2 H) , 5.34 (s, 2 H) , 6.8 - 7.1 (m, 7 H).
31 ¾E 2
工程 1 で得られた 1— [8— (2 _ェチル _ 5, 7—ジメチルー 3H—ィ ミ ダゾ [4， 5-b]ピリ ジン一3—ィルメチル）一 5—メチルー 10, 11—ジヒ ドロ -5H-ジ ベンゾ [b, f]ァゼピン一 2—ィルメチル]ピぺリ ジン一 4—力ノレボン酸ェチル エステルを用い、 参考例 1 2 と同様にして、 収率 42%で化合物 1 2 1 を得 た。
APCI-MS: m/z 538 ( [M + H]+)
Ml NMR (DMS0-d6) 8 (ppm)： 1.23 (t， J = 7.4 Hz, 3 H) , 1.5-1.8 (m， 2 H)， 1.8-2.0 (m, 2 H) , 2.2-2.4 (m, 2 H) , 2.49 (s, 3 H) , 2.50 (s， 3 II) , 2.78 (q, J = 7.4 Hz, 2 H) , 2.8-3.05 (m, 8 H) , 3.22 (s， 2 H) , 3.5-3.9 (m, 2 H), 5.34 (s， 2 10 , 6.85 (dd, J = 2.0, 8.4 Hz, 1 H) , 6.93 (s, 1 H) , 6.94 (d， J = 2.0 Hz, 1 H)， 7.0-7.2 (m, 4 H) . 参考例 5 3 ：化合物 1 2 2 {2- (2—ェチル—5， 7—ジメチルー 31トイ ミ ダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3_ィルメチル）一 5—メチル一8— [4— (2H—テ トラゾー ルー 5—ィル）ピペリ ジノメチル]一 10, 11—ジヒ ドロ -5H-ジベンゾ [b, f]了 ゼピン ·1塩酸塩 } の合成
参考例 2 0で得られた 1- [8- (2—ェチルー 5， 7—ジメチル— 3Η—ィ ミダ ゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメ チノレ） 一 10， 11ージヒ ドロ ー 5H—ジベンゾ [b， f]ァゼピン一 2—ィルメチル]一ピぺリ ジン一 4—カルボュ ト リ ルを用い、 参考例 5 2の工程 1 と同様にして、収率 92%で 1一 [8—（2—ェチルー 5， 7—ジ メ チル— 3H—イ ミ ダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメ チル）一 5—メチル一 10, 11ージヒ ドロ - 5H-ジべンゾ [b, f]ァゼピン一 2—ィルメチル]ピぺリ ジ ン一 4一カルボ二 ト リルを得た。 これを用い、 参考例 2 0の後段と同様にし て、 収率 10%で 2—（2—ェチルー 5， 7—ジメチル一 3H—イ ミダゾ [4, 5 - b]ピリ ジン一 3—ィルメチル）一 5—メチルー 8— [4一（2H—テ トラゾールー 5—ィル） ピペリ ジノメチル]一 10， 11—ジヒ ドロ一 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピンを得た c これをクロ口ホルムに溶解し、 4 mol/L塩化水素 ·酢酸ェチル溶液を加えて 析出した固体を濾取することで、 化合物, 1 2 2を得た。
APCI-MS : m/z 562 ( [M + H]+)
XH麵 (DMS0-d6) δ ( pm)： 1.28 (t, J = 7.6 Hz, 3 H) , 2.0-2.5 (m， 4 H) , 2.58 (s, 3 H)， 2.63 (s, 3 H) , 2.9-3.2 (ra, 8 H) , 3.2-3.3 (m, 4 H) , 3.4-3. 6 (m, 2 H)， 4. 17 (s， 2 H) , 5.56 (s, 2 H) , 7.0-7.2 (m, 4 H) , 7.2 - 7.4 (m, 3H) , 10.79 (s, 1H) . 参考例 5 4 ： 化合物 1 2 3 { {1一 [8—（2—ェチル— 5， 7—ジメチル一 3H—ィ ミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチノレ）一 5—メチルー 10， 11—ジヒ ドロ一 5H-ジべンゾ [b， f]ァゼピン一 2—ィルメチノレ]ピぺリ ジン一 4一イ ノレメ タノ 一ノレ } の合成
参考例 5 2の工程 1 で得られた 1一 [8— (2—ェチルー 5， 7—ジメチルー 3H 一イ ミ ダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—イ ノレメチノレ）一 5—メチル一 10， 11—ジヒ ド 口一 5H—ジベンゾ [b, f]ァゼピン一 2—イノレメチル]ピペリ ジン一 4—カノレポ' ン酸ェチルエステノレ (0.61 g, 1.08 mraol) をジクロロメタン (10 ml) に溶 解して、 一 78°Cに冷却し攪拌した。 この反応溶液に同温度で 1 mol/L水素化 ジィ ソプロ ピノレアルミニゥム /トルエン溶液 (3.20 mL, 3.20 mmol) を加え、 同温度で 3時間、 その後室温で 10分間攪拌した。 反応溶液に飽和ロッシュ ル塩水溶液と酢酸ェチルを加え、 30 分間攪拌した。 水層を酢酸ェチルで抽 出後、 有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、 溶媒を減圧留去した。 残渣 を酢酸ェチルを用いて再結晶に付し、 化合物 1 2 3 (0.26 g, 0. 50 mmol, 収率 46%) を得た。
APCI-MS : m/z 524 ( [M + H]+)
XH NMR (DMS0-d6) δ (ppm)： 1.0-1. 15 (m, 2H) , 1. 23 (t, J = 7. 5 Hz, 3 H) ,
1.25-1. 3 (m, 1 H) , 1. 5-1.65 (m, 2 H) , 1. 7-1.9 (m, 2 H) , 2.49 (s， 3 H) ,
2.50 (s, 3 H) , 2.75 (q, J = 7.5 Hz, 2 H) , 2.95-3.05 (m, 4 H) , 3. 15-3.25 (m, 5 H), 3.25-3.50 (m, 4 H) , 5.32 (s, 2 H) , 6.81 (dd, J = 2.0, 8.5 Hz, 1 H), 6.90-7.05 (m, 6 H) · 参考例 5 5 ：化合物 1 2 4 [2- (2—ェチルー 5, 7—ジメチル— 3H—ィミダゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—ィルメチル） _ 5—メチノレ一 8 _ (2H—テ トラゾールー 5 —ィル）一10, 11—ジヒ ドロー 5H—ジベンゾ [b,f]ァゼピン]の合成
参考例 3 4で得られた化合物 1 0 3を用い、参考例 5 2の工程 1 と同様に して、 収率 83%で 8— (2—ェチル—5, 7—ジメチル一 3H—イ ミダゾ [4， 5-b] ピリジン一 3—イノレメチル）一 5—メチノレー 10, 11—ジヒ ドロ一 5H—ジベンゾ [b， f ]ァゼピン一 2 _カルボ二トリルを得た。
これを用い、 参考例 2 0の後段と同様にして、 収率 20%で化合物 1 2 4 を得た。
APCI-MS: m/z 465 ( [M + H]+)
XH NMR (DMS0-d6) δ (ppm)： 1.24 (t, J = 7.7 Hz, 3 H) , 2.50 (s, 3 H)， 2.51 (s, 3 li) , 2.80 (q, J = 7.7 Hz, 2 H) , 3.0-3.1 (m, 2 H) , 3.3-3.35 (m， 2 H), 3.40 (s, 3 H)， 5.38 (s， 2 H) , 6.90 (dd, J = 2.2, 8.4 Hz, 1 H) ,
6.95 (s, 1 H), 7.02 (d, J = 2.2 Hz, 1 H) , 7.10 (d, J = 8.4 Hz, 1 H) '
7.24 (d, J = 8.4 Hz, 2 H) , 7.75 ( d, J = 2.2 Hz, 1 H) , 7.79 (dd, J = 2.2,
8.4 Hz, 1 H) . 参考例 5 6 ： 化合物 1 2 5 { [8—（2—ェチル一5, 7—ジメチルー 3H—ィミダ ゾ [4, 5-b]ピリ ジン一 3—イ ノレメチル）一 5—メチノレ一 10, 11—ジヒ ドロー 5H— ジベンゾ [b, f]ァゼピン一 2_ィル]酢酸 } の合成
参考例 3 6で得られた化合物 1 0 5を用い、参考例 5 2の工程 1 と同様に して、 収率 94%で [8—（2—ェチルー 5, 7—ジメチル一 3H—イ ミダゾ [4, 5- b] ピリ ジン一 3_イノレメチル）一 5—メチノレー 10， 11—ジヒ ドロ _ 5H—ジベンゾ [b,f]ァゼピン一 2—ィル]ァセ トニ ト リノレを得た。
これを用い、参考例 3 8 と同様にして、収率 86%で化合物 1 2 5を得た。 APCI-MS: m/z 455 ( [M + H]+)
!H NMR (DMS0-d6) 5 (ppm)： 1.22 (t, J = 7.3 Hz, 3 H) , 2.49 (s, 3 H) , 2.50 (s, 3 H) , 2.75 (q, J = 7.3 Hz, 2 H) , 2.9-3.1 (m, 4 H) , 3.19 (s， 3 H) , 3.42 (s， 2 H) , 5.32 (s, 2 H) , 6.81 (d, J = 8.1 Hz, 1 H) , 6.9-7.05 (m, 6 H) . 参考例 5 7 ： 化合物 9 1 { 1, 4-ビス [4— (3—ク口口ベンジルァミノ）一 6— シク ロプロ ピルカルボニル _7， 8—ジヒ ドロ 一 5H—ピリ ド [4, 3— d]ピリ ミ ジ ンー 2—ィル]ピぺラジン } の合成
化合物 9 1は、 以下の工程 1〜工程 8に従って合成した。
Figure imgf000106_0001
工程 1
市販のィ匕合物 (A) ( 100 g, 0.335 mol) をエタ ノーノレ （ 1, 500 mL) に溶解し、 尿素 （100 g， 1.67 mol) およびナ ト リ ウムメ トキシ ド （227 g, 1.18 mol) を加え、 加熱還流条件下、 24 時間反応を行った。 ク ロマ トグラフィーで反応の進行を確認し、 冷却後、 析出 した結晶を 濾取した。 こ の結晶を水に懸濁させ、 その中へ塩酸 （6 mol/L) を加 え、 pH6.0に調整した。 さ らに 1 時間室温で撹拌し、 析出 した結晶を 濾取し、 減圧下で乾燥させ、 化合物 （B) (60 g, 収率 70%) を得た。 工程 2
工程 1で得られた化合物 （B) (30.0 g, 0.116 mol) にォキシ塩化リ ン （300 raL) を加え、 加熱条件下で 5時間撹拌した。 薄層クロマ トグラフィ一で反応 の進行を確認後、 減圧下で過剰のォキシ塩化リ ンを留去した。 その後、 残渣 に 2—プロパノール （300 mL) を加え、 析出した結晶を含む懸濁液を加熱還 流条件下、 1時間撹袢し、 さらに室温で 1時間撹拌した。 析出した結晶を濾 取し、 減圧下で乾燥させ、 化合物 （C) (33 g， 収率 85%) を得た。
工程 3
工程 2で得られた化合物 (C) (35.0 g， 0.106 mol) を 1, 2—ジクロロェ タン （850 mL) に溶解し、 そこへト リェチルァミ ン （14.9 mL, 0.107 mol) およびクロ口蟻酸 1一クロ口ェチル （34. l mL， 0.316 mol) を加え、 加熱還 流条件下、 5時間撹袢した。薄層ク口マトグラフィ一で反応の進行を確認後、 反応混合物を冷却し、 水、 飽和食塩水で順次洗浄し、 無水硫酸マグネシウム で乾燥した。 得られた溶液を濃縮し、 残渣をカラムクロマトグラフィー （シ リ力ゲル、 n—へキサン ： 酢酸ェチル =3： 1) で精製した。 生成物をメタノ ール （850 mL) に溶解し、 加熱還流条件下、 1時間撹拌した。 薄層クロマ ト グラフィ一で反応の進行を確認した後、 濃縮乾固させることにより、 化合物
(D) (23.5 g, 収率 95%) を得た。
工程 4
工程 3で得られた化合物 （D) (11.8 g, 49.1 mmol) をジクロロメタン （300 mL) に溶解し、 シク ロプロパンカルボニルクロ リ ド （5.4 mL, 1.2当量） と トリェチルァミ ン （20.4 mL， 3· 0 当量） を加え、 室温で 1 時間攪拌した。 得られた反応溶液を水、飽和重曹水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥した。 溶媒を留去した後、 残渣にジィソプロピルエーテルを加え、 懸濁液を 1時間 以上攪拌した。 その後、 析出した結晶を濾取し、 減圧下で乾燥させることに より、 化合物 （Ε) (12.5g, 収率 94%) を得た。 工程 5
工程 4で得られた化合物 （E) (12.5g, 45.9 mmol) をテ トラヒ ドロフラン (400 mL) に溶解し、 トリェチルァミ ン （19.2 mL, 3当量） および 3—クロ 口ベンジルァミ ン （11.2 mL, 2当量） を加えた後、 40°Cで 20時間攪拌した。 析出した塩を濾過により除去後、 溶媒を留去した。 残渣をク ロマトグラフィ 一 （ク ロ口ホルム ： メタノール = 100： 1 → 40： 1) で精製し、 目的物を含 む画分の濃縮残渣にへキサン Z酢酸ェチル混合溶媒 （3:1) を加え、 結晶を 析出させた。 結晶を含む懸濁液を 1時間攪拌後、 析出した結晶を濾取し、 減 圧下で乾燥させ、 化合物 （F) (11.9g, 収率 69%) を得た。
工程 6
工程 5で得られた化合物 （F) (5.0g, 13.3 mmol) をジォキサン （100 mL) に溶解し、 tert—プチル 1ーピペラジンカルボキシレート （4.9g> 2 当 量） と炭酸ナトリ ウム （14.0g， 10 当量） を加え、 90°Cで 3 日間攪拌した。 得られた反応溶液を濾過し、 炭酸ナトリ ウムを除去後、 濾液に水およびク口 口ホルムを加えて抽出を行い、 有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した。 溶媒 を留去した後、 残渣にへキサン/酢酸ェチル混合溶媒（3:1)を加え、 懸濁液 を 1時間攙拌した。 その後、 析出した結晶を濾取し、 減圧下で乾燥させ、 化 合物 （G) (6.4g, 収率 92%) を得た。
工程 7
工程 6で得られた化合物 （G) (6.3g, 12.0 mmol) に 20%ト リフルォロ酢 酸のジクロロメタン溶液 （50 mL) を加え、 室温で一時間攪拌した。 反応溶 液から溶媒を留去した後、 残渣にジィソプロピルエーテルを加え、 生成した 懸濁液を 1時間攪拌した。 その後、 析出した結晶を濾取し、 減圧下で乾燥さ せ、 化合物 （H) を得た （4.9 g, 収率 97%)。
工程 8
工程 7で得られた化合物 （H) (3.8 g, 8.90 mmol) と、 工程 5で得られた 化合物（F) (4.5g, 1.05当量） をジォキサン （100 raL) に溶解し、 炭酸ナト リ ウム （10.6g, 10当量） を加え、 90°Cで 1週間攪拌した。 得られた反応溶 液を濾過し、 炭酸ナトリ ゥムを除去後、 濾液に氷を加えクロ口ホルムで抽出 した。 有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、 溶媒を留去した後、 残渣をカラ ムク ロマ トグラフィー（酢酸ェチル ： ト リェチルァミ ン = 10 ： 1 ) で精製し た。 目的物を含む画分の濃縮残渣にへキサン/酢酸ェチル混合溶媒（3 : 1)を 加え、 生成した懸濁液を 1 時間攪拌した。 その後、 析出した結晶を濾取し、 減圧下で乾燥させることにより、 化合物 9 1を得た （l. Og, 収率 23%)。 APCI-MS : m/z 767 ( [M + H]+)
JH NMR (CDC13) 6 (ppm)： 0. 7-0.9 (m, 4 H) , 1.0-1. 1 (m, 4 H) , 1.7-1. 9 (m, 2 H)， 2.6-2.8 (m, 4 H) , 3. 75 (s， 8 H)， 3.8-4.0 (m， 4 H) , 4.3-4.4 (m， 4 H)， 4.6-4.7 (m, 4 H) , 4.8-4.9 (m， 2 H) , 7. 1-7.3 (m, 8 H) .
参考例 5 8 宿主 'ベクター系の構築
( 1 ) Gal4_ER発現プラスミ ド pGERbsrR2の造成
pSV2bsr (科研製薬社製）を PvuIIと EcoRIで切断後、 Klenow処理して 2.6kb の PvuII (平滑末端） _^RI (平滑末端） 断片を取得した。
Gal4- ERキメラ遺伝子 [セノレ (Cell) 54卷、 199頁 （1988年）、 プロシイ一 デンダス ' ォプ . ザ . ナショナル ' アカデミー . ォプ . サイエンス ' ォブ ' ザ ·ュナイテツ ド ·ステーッ ·ォプ 'アメ リカ (Proc. Natl. Acad. Sci. USA)、 90卷、 1657頁 （1993年）] を含有する ER a AF2 in pM (東京大学の加藤茂明先 生より分与） を Aatllと Ndelで切断後、 Klenow処理して、 Aatll (平滑末端） -Ndel (平滑末端） 断片を取得した。
上記の pSV2bsr由来の (平滑末端） _g£ _RI (平滑末端） 断片、 およ び ERo; AF2 in pM由来の ^11 (平滑末端） -Ndel (平滑末端） 断片を結合す ることにより、 プラスミ ド pGERbsrR2を造成した。 pGERbsrR2は、 酵母
(Saccharomyces cerevisiae) 由来の転写因子 Gal4pの DNA結合領域とェス ト ロ ェン受容体のリガンド結合領域のキメラ蛋白質 （Gal4 - ER) を発現する ことができる。
( 2 ) ホタル ' ルシフエラーゼの誘導発現プラスミ ドの造成
pcDNA3 (インビ トロジェン社）を 1で切断後、 Klenow処理して、 Xhol (平 滑末端） 断片を取得した。 該断片を結合することにより、 ^ I切断部位を消 失させた pcDNA3を造成した。 1切断部位を消失させた pcDNA3を で切断 後、 Klenow処理して、 (平滑末端） 断片を取得した。 該断片を結合する ことにより、 ¾1および 切断部位を消失させた PCDNA3を造成した。 該プ ラスミ ドを illで切断後、 Klenow処理し、 ^gill (平滑末端） 断片を取得し た。
pAMoERC3Sc (特開平 05-336963) を Xholと Nsilで切断後、 Klenow処理し、 oriP配列を含む 2.2kbの ¾1 (平滑末端） (平滑末端） 断片を取得し た。
上記の^ 1^1切断部位と^ I切断部位を消失させた pcDNA3由来の^ ill (平 滑末端） 断片、 および PAMoERC3Sc由来の^ I (平滑末端） — il (平滑末端） 断片を結合することにより、 プラスミ ド pcDNA3— oriPを造成した。 pcDNA3 — oriPを Xholと Hindlllで切断し、 Xhol— Hindlll断片を取得した。
pSE01uc2 (W098/14474) を Xhol と Ncolで切断後、 Klenow処理して、 ァ ンピシリ ン耐性遺伝子を含む ^ I (平滑末端） -Ncol (平滑末端） 断片を取 得した。該断片を結合することにより、プラスミ ド pASdl-lucl を造成した。 pASdl-luclを Xhol と Hindlllで切断後、 0. llkbの Xhol-Hindlll断片を取 得した。
上記 pcDNA3-oriP由来の Xhol— Hindlll断片、および pASdl-lucl由来の Xhol-Hindlll断片を結合し、 プラスミ ド pcDNA3— oriP— Sdl を造成した。 pcDNA3-oriP-Sdl を Xhol と Kpnlで切断し、 Xhol-Kpnl断片を取得した。 配列番号 1、 2、 3、 および 4で表される塩基配列を有する 4種の DNAを DNA 合成機で合成した。 該合成 DNAは混合してァニールすることによりポリ A付 加シグナルをもつ 2本鎖 DNAを形成する。 該合成 DNAをそれぞれ T4
polynucleotide kinaseを用いてリン酸化後、 混合してァニ一ノレさせること により、 二本鎖 DNAと した。
該ニ本鎖 DNAと pcDNA3— oriP— Sdl由来の Xhol— Kpnl断片を結合すること により、 プラスミ ド pcDNA3— oriP— Sdl— pAを造成した。 pcDNA3— oriP— Sdl 一 pAを^ Iで切断後、 Klenow処理して、 1 (平滑末端） 断片を取得した。 pFR- luc (ス トラタジーン社製）を Hindlll と BamHIで切断後、 Klenow処理 し、 0.14kbの iil^dlll (平滑末端） 一^ HI (平滑末端） 断片を取得した。 上記の pcDNA3— oriP— Sdl— pA由来の Xhol (平滑末端） 断片、 および pFR-luc由来の HindHI-BamHI断片を結合し、 プラスミ ド pAGalSdl を作製 した。 pAGalSdlは、 Gal4p応答配列 （UASG) を 5回繰り返した配列を有する プロモーターを含有している。 pAGalSdl を EcoRIで切断後、 Klenow処理し、 EcoRI (平滑末端） 断片を取得した。
pSE01uc2 ( 098/14474) を Hindlll と Saclで切断後、 Klenow処理するこ とにより、 ホタル ·ルシフェラーゼ遺伝子を含む 1.7kbの Hindlll (平滑末 端） — ^1 (平滑末端） 断片を取得した。
上記の pSE01uc2由来の iLdlll (平滑末端） 一^ I (平滑末端） 断片、 および pAGalSdl由来の ^ RI (平滑末端） 断片を結合することにより、 プ ラスミ ド pAGalSdト lucを造成した。
pAGalSdl-luc内に存在する二つの Hindlllサイ トのうち、 ホタノレ . ルシ フェラーゼ遺伝子からより離れた Hindlllサイ トのみを Klenow処理により 消失させることにより、 pAGalSd4- lucを造成した。
PAGalSd4-lucを Asp718で切断後、 Stulで部分消化し pAGalSd4-luc由来 の 9.5kbの Asp718-Stul断片を取得した。 該 DNA断片を Klenow処理し、 自 己結合させることによりプラスミ ド pAGal9_lucを造成した。
( 3 ) 誘導発現べクタ一 pAGal9-dおよび pAGal9- ndの造成
ェプスタイン 'バー.ウィルスの oriPを有する発現プラスミ ド PAGal9-luc を Hindlll と Saclで切断し、 oriPを含む 6.9kbの Hindlll— Sacl断片を取 得した。
pAMo-d (特開 2001-211885) を Hindlll と Saclで切断し、 テトラサイク リン耐性遺伝子 （TcR) を含む HindIII_SacI断片を取得した。
上記の PAGal9-luc由来の Hindlll— Sacl断片、 および pAMo-d由来の Hindlll -Sacl断片を結合することにより、 pAGal9_luc中のホタル 'ルシフ エラーゼ遺伝子部分を pAMo-dの Stuffer配列と置き換えたプラスミ ド PAGal9_dを造成した。 pAGa!9-lucを Hindlll と Saclで切断し、 6.9kbの Hindlll -Sacl断片を取得した。
pAMo-nd (特開 2001- 211885) を Hindlllと Saclで切断し、 テトラサイク リ ン耐性遺伝子を含む Hindlll— Sacl断片を取得した。
上記の pAGal9- luc由来の Hindlll— Sacl断片、 およぴ pAMo- nd由来の Hindlll— Sacl断片を結合することにより、 pAGal9- luc中のホタル ·ルシフ ヱラーゼ遺伝子部分を pAMo-ndの Stuffer配列と置き換えたプラスミ ド pAGal9-ndを造成した。
(4) Gal4 - ER発現プラスミ ド pGERbsrR2を Namalwa KJM-1細胞の染色体舰 に組み込んだ細胞株 K JMGER8の造成
Gal4- ERキメラ転写因子発現プラスミ ド pGERbsrR2を、 \ μ も/ 1になるよ う に ΤΕ緩衝液 [10 mmol/L Tris-HCl (ρΗ8. θ) , 1 mmol/L エチレンジァ ミ ン 4醉 酸〕 に溶解した後、 エレク ト口ポレーション法 [サイ トテクノロジー
(Cytotechnology)、 3卷、 133頁 （1990年）] により、 該プラスミ ドを Namalwa KJM-1細胞 [サイ トテクノロジー （Cytotechnology)、 1卷、 151頁 （ 1988年）] に、 6X106細胞あたり 4 導入し、 形質転換細胞を得た。 Namalwa KJM-1細 胞は、 EBNA- 1遺伝子を発現する無血清馴化した B細胞株である。
該形質転換細胞を、 8mlの RPMI1640.ITPSG培地 〔RPMI1640培地 （日水製薬 社製） に、 1/40量の 7.50/0 NaHC03、 3 % 200mmol/L L—グノレタミン溶 ί夜（イ ン ビ トロジェン社製）、 0.5% ペニシリ ン . ス ト レプトマイシン溶液（イ ンビ ト ロジェン社製、 5, 000units/ml ぺニシリ ン、 5, 000 g/ml ス トレプトマイ シ ン）、 10ramol/L N_2 -ヒ ドロキシェチルピペラジン- Ν'- 2-エタンスルホン酸
(Ν-2-hyaroxyethyl iperazme-N' -2-ethanesulronic acid； HEPES)、 3 μ g/ml イ ンシュ リ ン、 5 μ g/ml トラ ンスフェ リ ン、 5 mmol/L ピルビン酸 ナトリ ウム、 125 nmol/L 亜セレン酸ナト リ ウム、 1 mg/ml ガラク トースを 添加した培地〕に懸濁し、 C02ィンキュベータ一中で 37°Cで 24時間培養した。 培養後、 プラス トサイジン S (Blasticidin S) (KK- 400： 科研製薬社製） を 2.0/i g/mlになるように添力 Πし、 9 6穴プレートに分注 （500〜2000細胞 穴） して培養を行い、 pGERbsrR2が染色体 DNAに組み込まれた安定形質転換株
(シングルクローン） を多数取得した。 各形質転換株は、 2.0μ g/mlのブラ ス トサイジン Sを含む RPMI1640'ITPSG培地で継代した。
下記に示す方法により上記安定形質転換株から、 誘導倍率が高く、 かつ非 誘導時のバックダラゥンドが低い優れた安定形質転換株 KJMGER8細胞を選択 した。
各形質転換株にホタル ·ルシフヱラ一ゼの誘導発現プラスミ ド pAGalSdl - lucをエレク トロポレーシヨ ン法によ り導入し、 2 日間培養した。 培養後、 —エス トラジオール（ESS75： シグマ社製） （終濃度 lOnmol/L) を添加し、 さ らに 24時間培養後、 ホタル .ルシフヱラーゼ活性の測定を行つ た。 活性の測定には、 ルミ ノメーター LB953 (ベルトールド社製） を用い、 細胞溶解用緩衝液〔 1 % ト リ トン X-100、 100 mmol/L KH2P04 (pH7.8)、 1 mmol/L ジチオスレィ トール〕 100 1を、 上記培養液に自動注入後、 基質溶液 〔25 mmol/L グジ シノレグジ シン （pH7.8)、 15 mmol/L MgS04、 5 mmol/L ATP, 0. 33 mmol/L ルシフェ リ ン〕 300 1を自動注入し、 10秒間の発光量を測定し、 ル シフェラーゼ活性と した。 比較のために、 17 )3 —エス トラジオール無添加条 件下でのルシフヱラーゼ活性も測定した。
17 β —エス トラジオール添加条件下でのルシフエラーゼ活性と 17 jS —ェ ス トラジオール無添加条件下でのルシフェラーゼ活性を比較することによ り、 遺伝子発現の誘導倍率を算出し、 該誘導倍率が高く 、 かつ 17 —ェス ト ラジオール無添加条件下のルシフエラーゼ活性が低いクローンと して、 K JMGER8細胞を選択した。 参考例 5 9 ： ホタル ' ノレシフ ェラーゼをレポーターとする レポータープラス ミ ド pACREplucの造成
cAMP応答配列 （CRE) の制御下にホタル ' ルシフェラーゼ遺伝子を発現す ることのできるレポータープラスミ ドである pACREplucを以下の方法で造成 した。 pACREplucは、 ハイグロマイシン耐性遺伝子およびェプスタイン ' バ 一 · ゥイノレスの oriPを有している。
pAMo[ジャーナル'ォブ 'バイォロジカル'ケミ ス ト リ一 (J. Biol. Chem. )、 268卷、 22782頁 （1993年）、 別名 pAMoPRC3Sc (特開平 5- 336963) ] を Clalで部 分消化し、 一力所切断された DM断片を取得した。 該 DNA断片を MiiLlで部分消 化し、 9.5kbの Clal-Mlul断片を取得した。 pAGE248 [ジャーナル . ォプ . バ ィォロジカル · ケミス ト リー (J. Biol. Chem. )、 269卷、 14730頁 （1994年）] を Clalおよび Mlu.Iで切断し、 ハイグロマイシン耐性遺伝子を含む 1.5kbの Clal- Mlul断片を取得した。 pAMo由来の ClaI-ΜΐμΙ断片、 および pAGE248由来 の Clal- Mlul断片を結合し、 プラスミ ド pAMohを造成した。 pAMohを Xholと Hindlllで切断後、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含む^^ I 一 Hindlll断片を取得した。 pAGal9— lucを Sailと Hindlllで切断し、 oriP、 Gal4UASを含む Sail— Hindlll断片を取得した。 pAGal9— luc由来の Sail— Hindlll断片、 およぴ上記 pAMoh由来の Xhol— Hindlll断片を結合することに より、 プラスミ ド pAGal9hを造成した。
pBluescriptll KS+ (東洋紡績社製） を Sailおよび Xholで切断した後、 ホスファターゼ (Alkaline Phosphatase E. coli C75、 宝酒造社製） を用い て脱リ ン酸化処理し、 アンピシリ ン耐性遺伝子を含む Sail- Xhol 断片を取 得した。配列番号 5および 6で表される塩基配列を有する合成オリ ゴヌク レ ォチドをァニールさせることにより、 CRE配列を 2つ含む二本鎖 DNAを調製 した。 該ニ本鎖 DNAと pBluescriptll KS+由来の上記 Salト Xhol 断片を結合 し、 CRE配列を 2つ含むプラスミ ド pBS— CREIを造成した。 pBS— CREIは、 該ニ本鎖 DNAが、 ^§11切断部位および^ I切断部位が再生する方向に組み 込まれたプラスミ ドであり、 上記切断部位をそれぞれ 1つ有している。
pBS-CREIを Sealおよび Xholで切断しファージ fl の ori を含む
Seal - Xhol断片を取得した。 pBS— CREIを Sealおよび Sailで切断し ColEl ori を含む Seal-Sail断片を取得した。 pBS— CREI由来の Seaト Xhol断片および Seaト Sail断片を結合し、 CRE配列を 4つ含む pBS— CREIIを造成した。
pBS-CREIIを Sealおよび Xholで切断しファージ fl の oriを含む
Scal-Xhol断片を取得した。 pBS— CREII を Sealおよび Sailで切断し ColEl ori を含む Seaト Sail断片を取得した。 pBS— CREII 由来の Seaト Xhol断片お よび Seal-Sail断片を結合し CRE配列を 8つ含む pBS— CREIVを造成した。 pBS-CREIVを Sealおよび Xholで切断しファージ Π の ori を含む
Seal -Xhol断片を取得した。 pBS— を Sealおよび Sailで切断し ColEl ori を含む Seal- Sail断片を取得した。 pBS— CREIV由来の Seaト Xhol断片お ょぴ Seal- Sail断片を結合し CRE配列を 16含む pBS— CREVIII を造成した。 pBS-CREVIIIを Xholで切断後、 Klenow処理し、 さらに Hindlllで切断す ることにより、 16個の CREを含む ^dlll— 1 (平滑末端） 断片を取得し た。 pAGalSdlを Mlul と Hindlllで切断し、 1. kbの Mlul— Hindlll断片を 取得した。 PAGal9hを ^1で切断後、 Klenow処理し、 さらに Mlulで切断す ることにより 1 (平滑末端） 一 MiiLl断片を取得した。 pBS— CREVIII由来 の HindHI-XhoI (平滑末端） 断片、 pAGalSdl由来の Mlul— Hindlll断片、 および pAGal9h由来の 1 (平滑末端） 一 ^I断片を結合し、 プラスミ ド pACREhを造成した。
pAGal9- lucを Xhol と otlで切断し、 ホタル ·ルシフェラーゼ遺伝子を 含む Xhol - Notl断片を取得した。 pACREhを Xhol と otlで切断し、 CRE配 列を含む — Notl断片を取得した。 pAGal9—luc由来の Xhol - Notl断片、 および pACREh由来の Xhol— Notl断片を結合することによりプラスミ ド pACRElucを造成した。
pACRElucを Hindlllで切断後、 Klenow処理し、 さらに Xholで切断するこ とにより CREを含む Hindlll (平滑末端） -Xhol断片、 およびホタル .ルシ フェラーゼ遺伝子を含む iii^dlll (平滑末端） 一^ I断片をそれぞれ取得し た。 pACREluc由来の上記 2種の Hindlll (平滑末端） -Xhol断片を結合す ることにより、 pACREluc中の CRE配列上流の ndlllサイ トが消失したプ ラスミ ド pACRElucHを造成した。
pGL3-Enhancer vector 〔プロメガ（Promega)社製〕 を Hindlll と Hpalで 切断し、 luc+遺伝子 （改変型のホタル . ルシフェラ一ゼ遺伝子） を含む Hindlll-Hpal断片を取得した。 pACRElucHを otlで切断後、 Klenow処理し、 さらに Hindlllで切断することにより、 CREを含む Hindi II-Notl (平滑末端) 断片を取得した。 pGL3- Enhancer vector由来の Hindlll - Hpal断片、 および pACRElucH由来の Hindlll- Notl (平滑末端） 断片を結合することによりプラ スミ ド pACREplucを造成した。 参考例 6 0 ： GPR4誘導発現プラスミ ドの造成
ヒ ト肺由来の mRNA (クロンテック社製） を l /x g用い、 SUPERSCRIPT
First-Strand Synthesis System for RT-PCR (ギプコ社製） により一本鎖 cDNA を合成した。 該一本鎖 cDNAを水で O倍希釈した溶液 5/ 1を錡型と して、 配 列番号 7および 8に示した配列を有する合成 DNAを GPR4遺伝子特異的プライマ 一と して用い、 PCRにより GPR4 cDNAを取得した。 GPR4遺伝子特異的プライマ 一の配列は、 GPR4遺伝子の配列情報 （GenBatik受入番号 ： U21051) に基いて 設計した。 酵素と しては、 PfuTurbo DNA Polymerase (Stratagene社製） を 用いた。 PCRを行う際の緩衝液と しては、 使用する酵素に付加された 10倍濃 度の緩衝液を使用した。 PCRは、サーマルサイクラ一 DNA engine (MJ Research 社製） を用い、 95°Cで 5分間の処理後、 94°Cで 1分間、 60°Cで 1分間、 72°Cで 1 分間からなる反応を 30サイクル行うことにより実施した。
増幅された GPR4 cDNA断片をプライマー上に設計された配列を切断する Hindlllおよび Not Iで切断した。 GPR4 cDNAを含む断片をァガロースゲル電 気泳動法により回収した。
該切断断片を、 プラスミ ド pAGal9- ndの Hindlll— Not I間へ組み込むこと により、 GPR4誘導発現プラスミ ド pAGal9-GPR4を構築した。
pAGal9-nd中の配列に特異的なプライマー （配列番号 9および 10に示し た配列を有する合成 DN'A) を用いて、 該 cDNAの 5'側および 3'側の配列を決 定した。 決定された配列に特異的な合成 DNAを調製し、 それをプライマーと して用い、 さらに先の塩基配列を決定した。 該操作を繰り返すことによ り、 該 cDNAの全塩基配列を決定し GPR4をコードしていることを確認した。塩基 配列の決定には、 パーキン ·エルマ一社の DNAシークェンサ一 377 と反応キ ッ 卜 ( ABI PrismTM BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit:アプライ ド ·バイオシステムズ社） を使用した。
プラスミ ドに組み込んだ DNA断片の配列を決定し、 GPR4をコードしている ことを確認した。 参考例 6 1 ： GPR4のアツセィ細胞の構築
GPR4誘導発現プラスミ ド pAGal9-GPR4 ( 2 μ g ) およびレポータープラス ミ KpACREpluc ( 2 μ g ) を、 上記ェレク トロポレーンョン法により、 6X 106 細胞の KJMGER8に共導入した。該形質転換株を 8mlの RPMI1640'ITPSG培地に懸 濁し、 C02インキュベータ一中、 37°Cで 24時間培養した。 培養後、 プラス ト サイジン S (2.0μ g/ml) ハイグロマイシン B (300/2 g/ml) およびジエネ ティシン（500 g/ml)を添加し、さ らに 14日間培養して安定形質転換株（GPR4 アツセィ細胞と呼ぶ）を取得した。該形質転換株を、プラス トサイジン S (2.0 μ g/ml) , ハイグロマイシン Β (300 μ g/ml) およぴジエネティシン （500 μ g/ml) を含む RPMI1640-ITPSG培地で継代した。
同様にして、 コント口ールプラスミ ド pAGal9- nd { 2 μ g ) およびレポ一 タープラスミ ド pACREpluc ( 2 At g ) を KJMGER8に共導入し、 安定形質転換株 (コン トロール細胞と呼ぶ） を取得した。 参考例 6 2 ： マウス由来のヒ ト GPR4 ホモログをコードする DNAのクロー- ング
ヒ ト GPR4遺伝子の塩基酉 3歹 IJ'lf報 [Accession(AC) No. U21051]を基【こ、 NCBI のデータベースを対象と して検索を行った。 その結果、 相同性の高い配列と して、 マウスゲノ ム配列（AC073784)および複数の Expression sequence tag(EST)I2^IJ (BF178464, AA968193、 AA798732, AI840893 AI851037)力 S選択 された。該マウスゲノム配列と ESTから構築された遺伝子の塩基配列を配列 番号 14に、 該遺伝子によりコー ドされるポリぺプチドのアミ ノ酸配列を配 列番号 13に示した。 該アミノ酸配列を、 解析プログラム [GENETYX WIN ver. 5.0 (ソフ トウェア社製）] を用いてヒ ト GPR4のァミノ酸配列と比較したと ころ、 92. 7%の一致が認められた。
よって、 配列番号 13で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、 マウスのヒ ト GPR4ホモログ （マウス GPR4) であることが推定された。
従って、 マウス GPR4をコードする DNAは、 巿販、 または公知の方法で調 製することができるマウス cDNAライブラリーを铸型にし、配列番号 14で表 される塩基配列に基づき設計、合成できるオリゴヌクレオチドをプライマー セッ トに用いた PCRにより取得することができる。 参考例 6 3 ： ラッ ト由来のヒ ト GPR4 ホモログをコードする DNAのクロー二 ング
ヒ ト GPR4遺伝子の塩基配列情報（AC No. U21051)を基に、 NCBI のデータべ ースを対象と して検索を行った。 その結果、 相同性の高い配列として 2つの ラッ トゲノム配列（AC119447.2 および AC096180.2)および複数のラッ ト EST 配列（BF544182、 AI170948、 AI008858, AI235374、 AI502871, BQ194515)力 選 択された。 これらの配列と、 配列番号 14で示したマウスの塩基配列情報を 基に配列番号 15および配列番号 16に記載の塩基配列を有するオリ ゴヌクレ ォチドを作製した。
該オリ ゴヌク レオチド各々 1.0μ mol/L をプライマーセッ トとして用い、 ラッ ト肺由来 mRNAから作製した cDNA 2μ Ιを錄型に用い、 後記の各成分の 濃度が 200 μ mol/L となるよう dNTP (dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP)、 Taq Gold (パーキンエルマ一社製） 2.5単位および 1 X Taq Gold (Mg plus) 緩衝液 (パーキンエルマ一社）を含む反応溶液 40 Lを調製し、下記条件下で PCRを 行った。
すなわち、 サーマルサイクラ一 PTO200 (MJ リサーチ社製） を用い、 95°C で 10分間加熱後、 94°Cで 1分間、 55°Cで 1分間、 72°Cで 1分間の工程を 1 サイクノレと して 30サイクノレ行い、 さらに 72°Cで 5分間加熱した。
得られた PCR反応液より 5/z Lを分取し、 ァガロースゲル電気泳動により GPR4 をコードする DNA と予想される約 1. lkb の DNA断片が増幅されたこと を確認後、 QIAEX II Gel Extraction Kit (QIAGEN社製） を用いて、 該製品 に添付されたマニュアルに従い、 DNA断片を溶出し回収した。
上記で回収した DNA断片 50ngと T7Blue T - Vector (Novagen社製） 50ng とを DNA Ligation kit ver.2 (宝酒造社製） を用いて該製品に添付された マニュアルに従って連結し、 組換えプラスミ ド DNAを得た。 得られた組換え プラスミ ド DNAを用いて大腸菌 JM109株を形質転換して得られる形質転換株 から、 常法により プラスミ ド pT7RGを得た。 プラスミ ド pT7RGの全塩基配列 を決定した結果、 PT7RG には配列番号 18 で表される塩基配列を有する約 l. lkbの cDNAが含まれていた。配列番号 18で表される塩基配列からなる DNA にコードされるポリぺプチドのアミノ酸配列を配列番号 17 に示した。 該ァ ミノ酸配列を、解析プログラム [GENETYX f IN ver. 5.0 (ソフ トゥェァ社製）] を用いてヒ ト、 およびマウス GPR4のァミノ酸配列と比較したところ、 それ ぞれ 93.0%、 99. 2%の一致が認められた。
よって、 配列番号 17 で表されるァミノ酸配列を有するポリぺプチドは、 ラッ トのヒ ト GPR4 ホモログ （ラッ ト GPR4) であることが推定された。 実施例 1 ： 錠剤 常法により、 次の組成からなる錠剤を調製する。 処方 化合物 1 20 mg
乳糖 143. 4 mg
馬鈴薯デンプン 30 mg
ヒ ドロキシプロ ピノレセノレロース 6 mg
ステア リ ン酸マグネシウム 0. 6 mg
200 mg 実施例 2： 注射剤
常法により、 次の組成からなる注射剤を調製する 処方 化合物 5 2 mg
精製ダイズ油 200 mg
精製卵黄レシチン 24 mg
注射用グリセリン 50 mg
—注射用蒸留水 ― 1. 72 ml
2. 00 ml
産業上の利用可能性
本発明により、 GPR4 のシグナル伝達に関する機能を抑制する物質を有効 成分と して含有する喘息の予防および/または治療剤、および含窒素三環式 化合物も しく はその四級アンモ -ゥム塩またはそれらの薬理学的に許容さ れる塩を有効成分と して含有する喘息の予防および/または治療剤が提供 される。 配列表フ リーテキス ト
配列番号 1—人工配列の説明 ： 合成 DNA
配列番号 2—人工配列の説明 ： 合成 DNA 配列番号 3—人工配列の説明 ： 合成 DNA 配列番号 4一人工配列の説明 ： 合成 DNA 配列番号 5—人工配列の説明 ： 合成 DNA 配列番号 6—人工配列の説明 ： 合成 DNA 配列番号 7—人工配列の説明 ： 合成 DNA 配列番号 8—人工配列の説明 ： 合成 DNA 配列番号 9一人工配列の説明 ： 合成 DNA 配列番号 1 0—人工配列の説明 ： 合成 DNA 配列番号 1 5—人工配列の説明 ： 合成 DNA 配列番号 1 6—人工配列の説明 ： 合成 DNA

Claims

請求の範囲
1 . 配列番号 1 1記載のァミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関 する機能を抑制する物質を有効成分と して含有する喘息の予防および Zま たは治療剤。
2 . 以下の 1 ) ~ 4 )
1 )配列番号 1 2記載の塩基配列から選ばれる連続した 5〜 6 0塩基からな るオリ ゴヌクレオチドの相捕的配列を有するォリ ゴヌクレオチドまたは該 オリ ゴヌクレオチド誘導体、
2 )配列番号 1 4記載の塩基配列から選ばれる連続した 5〜 6 0塩基からな るオリ ゴヌクレオチドの相捕的配列を有するォリ ゴヌクレオチドまたは該 才リ ゴヌク レオチ ド誘導体、
3 )配列番号 1 8記載の塩基配列から選ばれる連続した 5〜 6 0塩基からな るオリ ゴヌクレオチドの相捕的配列を有するォリ ゴヌクレオチドまたは該 オリ ゴヌク レオチ ド誘導体、
4 ) 配列番号 1 2、 1 4および 1 8から選ばれるいずれか一つに記載の塩基 配列を有する DNAとス トリ ンジェントな条件下でハイプリダイズし、かつ配 列番号 1 1記載のァミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関する機 能を抑制する 5 ~ 6 0塩基からなるオリ ゴヌクレオチドまたは該オリ ゴヌ クレオチド誘導体、
のいずれか一つを有効成分と して含有する喘息の予防および/または治療 剤。
3 . 以下の 1 ) 〜 4 )
1 ) 配列番号 1 1記載のァミノ酸配列を有する蛋白質を認識する抗体、
2 ) 配列番号 1 3記載のアミノ酸配列を有する蛋白質を認識する抗体、
3 ) 配列番号 1 7記載のアミノ酸配列を有する蛋白質を認識する抗体、
4 ) 配列番号 1 1、 1 3および 1 7から選ばれるいずれか一つに記載のアミ ノ酸配列において一つ以上のァミノ酸が欠失、置換または付加したァミノ酸 配列を有し、かつ配列番号 1 1記載のァミノ酸配列を有する蛋白質のシグナ ル伝達に関する機能を有する蛋白質を認識する抗体、
のいずれか一つを有効成分と して含有する喘息の予防およぴ または治療 剤。 .
4 . 式 （I)
Figure imgf000122_0001
[式中、 R1は置換もしくは非置換の複素環基、 -NR5R6 (式中、 R5および R6は 同一または異なって水素、 置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしく は非置換のシク口アルキル、 置換もしくは非置換の低級アルケニル、 置換も しくは非置換の低級アルキニル、 置換もしくは非置換のァラルキル、 または 置換もしくは非置換の複素環アルキルを表すか、 R5および R6が隣接する窒 素原子と一緒になつて置換もしくは非置換の複素環基を形成する）、 -OR7 (式 中、 R7 は水素、 置換もしくは非置換の低級アルキル、 置換もしくは非置換の 低級アル力ノィル、 置換も しくは非置換のシク口アルキル、 置換もしくは非 置換の低級アルケニル、 置換もしくは非置換の低級アルキニル、 置換もしく は非置換のァリール、 置換もしく は非置換のァラルキル、 または置換もしく は非置換の複素環アルキルを表す）、 _SR7a (式中、 R7aは前記 R7と同義である）、 -C0NR5aR6a (式中、 R5aおよび R6aはそれぞれ前記 R5および前記 R6と同義であ る）、 - C02R7b (式中、 R7bは前記 I？7と同義である）、 -N+R5bR6bR8 (式中、 R5bお よび R6bはそれぞれ前記 R5および前記 R6と同義であり、R8は低級アルキル、 低級アルケニル、 またはァラルキルを表す）、 ホルミル、 カルボキシ、 また はシァノを表し、
R2は水素、 置換もしく は非置換の低級アルキル、 置換もしく は非置換のシク 口アルキル、 置換もしくは非置換の低級ァルケ-ル、 置換もしくは非置換の 低級アルキエル、 置換もしくは非置換のァラルキル、 または置換もしくは非 置換の複素環アルキルを表し、
R3および R4は同一または異なって水素、 低級アルキル、 またはハロゲンを 表し、
nは 0または 1を表し、
Xは- (CH2) 2_または- CH-CH—を表し、
Yは式 ( II )
、N X W
(ll)
z1 z2
(式中、 Wは CHまたは窒素原子を表し、
Z1および Z2は同一または異なって水素、 置換もしくは非置換の低級アルキ ル、 置換もしくは非置換のシク口アルキル、 置換'もしく は非置換の低級アル ケニル、 置換もしくは非置換の低級アルキニル、 置換も しく は非置換のァリ ール、 置換もしくは非置換のァラルキル、 または置換も しくは非置換の複素 環アルキルを表すか、 Z1および Z2がそれぞれ隣接する 2つの炭素原子と一 緒になって置換もしく は非置換の芳香環または置換も しく は非置換の複素 環を形成し、
Z は水素、 置換もしく は非置換の低級アルキル、 置換もしく は非置換のシク 口アルキル、 置換もしく は非置換の低級アルケニル、 置換もしくは非置換の 低級アルキニル、 置換もしくは非置換のァリール、 置換もしくは非置換の複 素環基、 置換もしくは非置換のァラルキル、 または置換もしくは非置換の複 素環アルキルを表す） を表す] で表される含窒素三環式化合物もしくはその 四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩を有効成分と して含有する喘息の予防および または治療剤。
5 . R1が- NR5R6であり、 R5および R6が隣接する窒素原子と一緒になつて置 換も しく は非置換の複素環基を形成する請求の範囲第 4項に記載の喘息の 予防および/または治療剤。
6 . R2が水素である請求の範囲第 4項または第 5項に記載の喘息の予防お よび/または治療剤。
7 . R3および R4が水素である請求の範囲第 4項〜第 6項のいずれかに記 載の喘息の予防および/または治療剤。
8 . Z1および Z2がそれぞれ隣接する 2つの炭素原子と一緒になつて置換 もしく は非置換の複素環を形成する請求の範囲第 4項〜第 7項のいずれか に記載の喘息の予防およびノまたは治療剤。
9 . 請求の範囲第 4項〜第 8項のいずれかに記載の含窒素三環式化合物も しく はその四級アンモニゥム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩の 有効量を投与することを特徴とする、 喘息の予防および/または治療方法。
1 0 .喘息の予防および/または治療剤の製造のための請求の範囲第 4項〜 第 8項のいずれかに記載の含窒素三環式化合物もしく はその四級アンモニ ゥム塩またはそれらの薬理学的に許容される塩の使用。
1 1 .配列番号 1 1記載のァミノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関 する機能を抑制する物質の治療有効量を投与することを特徴とする、 喘息の 予防およぴ Zまたは治療方法。
1 2 . 請求の範囲第 2項に記載の 1 ) 〜 4 ) のいずれか一つのオリゴヌタレ ォチドまたは該ォリゴヌクレオチド誘導体の治療有効量を投与することを特 徴とする、 喘息の予防および Zまたは治療方法。
1 3 . 請求の範囲第 3項に記載の 1 ) 〜 4 ) のいずれか一つの抗体の治療有 効量を投与することを特徴とする、 喘息の予防およびノまたは治療方法。
1 4 . 喘息の予防および/または治療剤の製造のための、 配列番号 1 1記載 のァミ ノ酸配列を有する蛋白質のシグナル伝達に関する機能を抑制する物 質の使用。
1 5 . 喘息の予防および または治療剤の製造のための、 請求の範囲第 2項 に記載の 1 ) 〜 4 ) のいずれか一つのォリ ゴヌク レオチ ドまたは該オリ ゴヌ ク レオチ ド誘導体の使用。
1 6 . 喘息の予防および または治療剤の製造のための、 請求の範囲第 3項に 記載の 1 ) 〜 4 ) のいずれか一つの抗体の使用。
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