JPH1118782A - 新規なヒト・ニューロテンシン・レセプター２型およびそのスプライス変種 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 細菌、真菌感染などのある種の機能不全また
は疾患の予防、改善または矯正において役割を果たしう
る、さらなるレセプターを同定および特徴付ける必要が
ある。 【解決手段】 本発明は、配列番号２のヒト・ニューロ
テンシン・２型のポリペプチドをコードするヌクレオチ
ド配列とその全長にわたって少なくとも８８％の同一性
を有するヌクレオチド配列、または該ヌクレオチド配列
に相補的なヌクレオチド配列からなる単離されたポリヌ
クレオチドを提供するものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新たに同定された
ポリヌクレオチド、それによりコードされるポリペプチ
ド、このようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの
使用およびその生成に関する。さらに詳しくは、本発明
のポリヌクレオチドおよびポリペプチドはＧ−タンパク
質結合７−トランスメンブランレセプター（以下、ヒト
・ニューロテンシン・２型という）に関する。本発明は
また、かかるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの作
用を阻害または活性化することに関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】多く
の医学的に重要な生物学的プロセスには、Ｇ−タンパク
質および／またはセカンドメッセンジャー、例えば、ｃ
ＡＭＰが関与するシグナルトランスダクション経路に関
係するタンパク質が介在することが十分に確立されてい
る（Lefkowitz、Nature、1991、351:353-354）。これら
のタンパク質を、本明細書中、Ｇ−タンパク質を伴う経
路に関与するタンパク質またはＰＰＧタンパク質とい
う。これらのタンパク質として、例えば、アドレナリン
作動物質およびドーパミンについてのタンパク質などの
ＧＰＣレセプター（Kobilka, B.K.ら、Proc. Natl. Aca
d. Sci.、USA、1987、84:46-50;Kobilka, B.K.ら、Scie
nce、1987、238:650-656;Bunzow, J.R.ら、Nature、198
8、336:783-787）、Ｇ−タンパク質それ自体、エフェク
ター・タンパク質、例えば、ホスホリパーゼＣ、アデニ
ルサイクラーゼおよびホスホジエステラーゼ、および作
動タンパク質、例えばプロテインキナーゼＡおよびプロ
テインキナーゼＣ（Simon, M.I.ら、Science、1991、25
2:802-8）が挙げられる。

【０００３】例えば、シグナルトランスダクションの一
つの形態において、ホルモンの結合した結果が、細胞内
での酵素、アデニレートサイクラーゼの活性化である。
ホルモンによる酵素の活性化は、ヌクレオチドＧＴＰの
存在に依存する。ＧＴＰもホルモン結合に影響を与え
る。Ｇ−タンパク質は、ホルモンレセプターをアデニレ
ートサイクラーゼと結合させる。Ｇ−タンパク質は、ホ
ルモンレセプターによって活性化されると、ＧＴＰと結
合したＧＤＰとを交換することが判明した。ついで、Ｇ
ＴＰを有する形態が活性化されたアデニレートサイクラ
ーゼに結合する。Ｇ−タンパク質それ自体によって触媒
されるＧＴＰのＧＤＰへの加水分解は、Ｇ−タンパク質
をその基底の不活性形態に戻す。かくしてＧ−タンパク
質は、レセプターからエフェクターへのシグナルを中継
する中間体として、およびシグナルの持続期間を制御す
る時計のとしての２つの役割を果たしている。

【０００４】Ｇ−タンパク質結合レセプターの膜タンパ
ク質遺伝子超科は、７つの推定トランスメンブランドメ
インを有することで特徴づけられる。そのドメインは細
胞外ループまたは細胞質ループによって結合するトラン
スメンブランαヘリックスを示すと考えられている。Ｇ
−タンパク質結合レセプターは、ホルモンレセプター、
ウイルスレセプター、成長因子レセプターおよび神経レ
セプターなどの、広範囲の生物学的活性レセプターを包
含する。

【０００５】Ｇ−タンパク質結合レセプター（７−トラ
ンスメンブランレセプターとしても知られている）は、
約２０ないし３０個のアミノ酸のこれら７つの保存的疎
水性鎖を含み、少なくとも８つの多様な親水性ループを
連結するものとして特徴づけられる。結合レセプターの
Ｇ−タンパク質ファミリーは、精神病および神経疾患を
治療するために使用される向精神薬に結合するドーパミ
ンレセプターを包含する。このファミリーのメンバーと
して他に、カルシトニン、アドレナリン様物質、エンド
セリン、ｃＡＭＰ、アデノシン、ムスカリン様物質、ア
セチルコリン、セロトニン、ヒスタミン、トロンビン、
キニン、卵胞刺激ホルモン、オプシン、内皮細胞分化遺
伝子-１、ロドプシン、オドラントおよびサイトメガロ
ウイルスレセプターが挙げられるが、これらに限定され
ない。

【０００６】ほとんどのＧ−タンパク質結合レセプター
は、機能的タンパク質構造を安定化すると考えられてい
るジスルフィド結合を形成する最初の２つの細胞外ルー
プの各々において１個の保存システイン残基を有する。
７−トランスメンブラン領域を、ＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ
３、Ｔ４、ＴＭ５、ＴＭ６およびＴＭ７と命名する。Ｔ
Ｍ３はシグナルトランスダクションに関係している。シ
ステイン残基のリン酸化および脂質付加（パルミチル化
またはファルネシル化）は、いくつかのＧ−タンパク質
結合レセプターのシグナルトランスダクションに影響を
与え得る。ほとんどのＧ−タンパク質結合レセプター
は、第３の細胞質ループおよび／またはカルボキシ末端
に潜在的リン酸化部位を含有する。βアドレナリンレセ
プターのごときいくつかのＧタンパク質結合レセプター
について、プロテインキナーゼＡおよび／または特異的
レセプターキナーゼによるリン酸化がレセプターの脱感
作を媒介する。

【０００７】いくつかのレセプターでは、Ｇタンパク質
結合レセプターのリガンド結合部位は、いくつかのＧタ
ンパク質結合レセプタートランスメンブランドメインに
よって形成される親水性ソケットを有しており、該ソケ
ットはＧタンパク質結合レセプターの疎水性残基によっ
て取り囲まれていると考えられている。各Ｇタンパク質
結合レセプタートランスメンブランヘリックスの親水性
側は内向きになっており、極性のリガンド結合部位を形
成すると仮定されている。いくつかのＧタンパク質結合
レセプターにおいて、ＴＭ３アスパラギン酸残基などの
リガンド結合部位を有することにＴＭ３が関係してい
る。ＴＭ５セリン、ＴＭ６アスパラギン、および、ＴＭ
６またはＴＭ７のフェニルアラニンまたはチロシンもリ
ガンド結合に関係している。

【０００８】Ｇタンパク質結合レセプターは、様々な細
胞内酵素、イオンチャンネルおよび輸送体とヘテロ３量
体Ｇタンパク質によって細胞内で結合させることができ
る（Johnsonら、Endoc. Rev.、1989、10:317-331参
照）。異なるＧタンパク質αサブユニットは、特定のエ
フェクターを優先的に刺激して、細胞内の種々の生物学
的機能を調節する。Ｇタンパク質結合レセプターの細胞
質側残基のリン酸化は、いくつかのＧタンパク質結合レ
セプターのＧタンパク質結合を調節するための重要な機
構として同定されている。Ｇタンパク質結合レセプター
は、哺乳動物宿主内の多数の部位において見いだされ
る。過去１５年間、７−トランスメンブランレセプター
を標的とした３５０種近くの治療薬が市販され成功裏に
ある。

【０００９】これは、これらレセプターが治療標的とし
て確立され、かつ立証された歴史を有することを示して
いる。限定するものではないが、細菌、真菌、原生動物
およびウイルス感染、詳細には、ＨＩＶ−１またはＨＩ
Ｖ−２によって引き起こされる感染；痛み；腫瘍；拒食
症；過食症；喘息；パーキンソン病；急性心不全；低血
圧；高血圧；閉尿；骨粗鬆症；狭心症；心筋梗塞；潰
瘍；喘息；アレルギー；良性前立腺肥大；および、不安
症、精神分裂症、躁鬱病、精神錯乱、痴呆、重度の知恵
遅れ、ならびに、ハンチントン病またはジルス・デラ・
トレット（Gillesdela Tourett's）症候群のごとき運動
障害を含め、機能不全または疾患の予防、改善または矯
正において役割を果たしうる、さらなるレセプターを同
定および特徴付ける必要があるのは明らかである。

【００１０】

【課題を解決するための手段】一の態様において、本発
明はヒト・ニューロテンシン・２型のポリペプチドおよ
び組換え材料ならびにその製法に関する。本発明の別の
態様は、そのようなヒト・ニューロテンシン・２型のポ
リペプチドおよびポリヌクレオチドを用いる方法に関す
る。かかる使用は、とりわけ、細菌、真菌、原生動物お
よびウイルス感染、詳細には、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ
−２によって引き起こされる感染；痛み；腫瘍；拒食
症；過食症；喘息；パーキンソン病；急性心不全；低血
圧；高血圧；閉尿；骨粗鬆症；狭心症；心筋梗塞；潰
瘍；喘息；アレルギー；良性前立腺肥大；および、不安
症、精神分裂症、躁鬱病、精神錯乱、痴呆、重度の知恵
遅れ、ならびに、ハンチントン病またはジルス・デラ・
トレット症候群のごとき運動障害の治療を包含する。さ
らに別の態様において、本発明は、該発明により得られ
る材料を用いてアゴニストおよびアンタゴニストを同定
する方法、およびヒト・ニューロテンシン・２型の平衡
異常に付随する症状をその同定した化合物を用いて治療
することに関する。本発明のさらに別の態様は不適当な
ヒト・ニューロテンシン・２型活性またはレベルに伴う
疾患を検出するための診断アッセイに関する。

【００１１】

【発明の実施の形態】

定義 以下の定義は、本明細書で汎用する用語の理解を容易に
するためのものである。「ヒト・ニューロテンシン・２
型」は、とりわけ、配列番号2に示されるアミノ酸配列
を有するポリペプチドまたはその対立遺伝子変種をい
う。「ヒト・ニューロテンシン・２型の活性」または
「ヒト・ニューロテンシン・２型の生物学的活性」と
は、類似の活性または改良された活性あるいは望ましく
ない副作用の減じたこれらの活性を含め、該ヒト・ニュ
ーロテンシン・２型の代謝的または生理学的機能をい
う。該ヒト・ニューロテンシン・２型の抗原的および免
疫原的活性も含まれる。

【００１２】「ヒト・ニューロテンシン・２型遺伝子」
とは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する
ポリヌクレオチドまたはその対立遺伝子変種および／ま
たはそれらの相補物をいう。本明細書で用いる「抗体」
は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、キメ
ラ、１本鎖、およびヒト化抗体、ならびにＦａｂの産物
または他の免疫グロブリン発現ライブラリーを含め、Ｆ
ａｂフラグメントを包含する。「単離」とは、「人間の
手により」天然の状態から変えられたことを意味する。
「単離」された組成物または物質が天然に存在する場
合、その本来の環境から変えられるかもしくは取り除か
れ、またはその両方がなされたことを意味する。例え
ば、天然の状態で生存動物に存在するポリヌクレオチド
またはポリペプチドは「単離」されていないが、その天
然状態で共存する物質から分離されているその同一のポ
リヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書に用い
る用語である、「単離」がなされている。

【００１３】「ポリヌクレオチド」とは、一般に、修飾
されていないＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾された
ＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい、いずれかのポリリ
ボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを
いう。「ポリヌクレオチド」は、一本鎖および二本鎖Ｄ
ＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、
一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、および一本鎖および二本鎖
領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖もしくはより典型的
には二本鎖、または一本鎖および二本鎖領域の混合物で
あってもよいＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分
子を包含するが、これに限定されるものではない。加え
て、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡま
たはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域をいう。ポ
リヌクレオチドなる用語はまた、一つまたはそれ以上の
修飾された塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡ、ならび
に安定性またはその他の理由で修飾された骨格を有する
ＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。「修飾された」塩基
は、例えば、トリチル化された塩基およびイノシンなど
の通常でない塩基を包含する。種々の修飾がＤＮＡおよ
びＲＮＡに対してなされている。よって、「ポリヌクレ
オチド」は、典型的には天然において見いだされるよう
な化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態のポリ
ヌクレオチド、ならびにウイルスおよび細胞に特徴的な
化学的形態のＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。また、
「ポリヌクレオチド」は、しばしばオリゴヌクレオチド
と称される比較的短いポリヌクレオチドも包含する。

【００１４】「ポリペプチド」は、ペプチド結合により
互いに結合している２個またはそれ以上のアミノ酸を有
してなるペプチドまたはタンパク質あるいは修飾された
ペプチド結合により互いに結合している２個またはそれ
以上のアミノ酸を有してなるペプチドまたはタンパク
質、すなわち、ペプチドアイソスターをいう。「ポリペ
プチド」は、通常、ペプチド、オリゴペプチドまたはオ
リゴマーと称される短鎖、およびタンパク質と称される
長鎖の両方をいう。ポリペプチドは遺伝子によりコード
された２０種のアミノ酸とは異なるアミノ酸を含有して
もよい。「ポリペプチド」は、翻訳後プロセッシングな
どの自然の工程により、または当業者に周知の化学修飾
技法により修飾されたアミノ酸配列を含有する。このよ
うな修飾は基本テキストにて、およびさらに詳細な研究
論文にて、ならびに膨大な研究文献において詳しく記載
されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およ
びアミノまたはカルボキシル末端を含め、ポリペプチド
のどこででも起こり得る。同一の型の修飾が所定のポリ
ペプチドの幾つかの部位で、同一または異なる程度で存
在し得ることは理解されよう。また、所定のポリペプチ
ドは多くの型の修飾を含んでいてもよい。ポリペプチド
はユビキチネーションの結果として分岐していてもよ
く、分岐しているかまたはしていない、環状であっても
よい。環状、分岐および分岐した環状ポリペプチドは翻
訳後の天然プロセスにより生じたものであってもよく、
または合成法により製造されたものであってもよい。修
飾は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、ア
ミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌ
クレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質
または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトー
ルの共有結合、交差架橋、環化、ジスルフィド結合形
成、脱メチル化、交差架橋共有結合形成、システイン形
成、ピログルタメート形成、ホルミル化、ガンマ−カル
ボキシル化、糖鎖形成、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキ
シル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、
タンパク質分解的プロセッシング、リン酸化、プレニル
化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化な
どのトランスファーＲＮＡ媒介のタンパク質へのアミノ
酸付加、ならびにユビキチネーションを包含する。例え
ば、PROTEINS‐STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES、
第２版、T.E.Creighton、W.H.Freeman and Company、Ne
w York（1993）およびPOSTTRANSLATIONAL COVALENT MOD
IFICATION OF PROTEINS、B.C.Johnson編、Academic Pre
ss、New York（1983）のWold,F.、Posttranslational P
rotein Modifications：Perspectives and Prospects、
1〜12頁；Seifterら、“Analysis for protein modific
ations and nonprotein cofactors”、Meth.Enzymol. 1
82：626-646（1990）およびRattanら、“Protein Synth
esis：Posttranslational Modifications and Aging"、
Ann.N.Y.Acad.Sci.663：48-62（1992）を参照のこと。

【００１５】本明細書で用いる「変種」なる用語は、各
々、対照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異な
るが、本質的な特性は保持している、ポリヌクレオチド
またはポリペプチドである。典型的なポリヌクレオチド
の変種は、別の対照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド
配列が異なる。変種のヌクレオチド配列における変化
は、対照ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプ
チドのアミノ酸配列と変わっていてもよく、変わってい
なくてもよい。ヌクレオチドの変化は、後記するよう
に、対照配列によりコードされるポリペプチドにおいて
アミノ酸置換、付加、欠失、融合および末端切断をもた
らしうる。典型的なポリペプチドの変種は、別の対照ポ
リペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般に、差異
は、対照ポリペプチドおよび変種の配列が、全体的に極
めて類似しており、多くの領域で同一であるように限定
される。変種および対照ポリペプチドは、１またはそれ
以上の置換、付加、欠失のいずれかの組み合わせによ
り、アミノ酸配列にて異なっていてもよい。置換または
挿入されたアミノ酸残基は、遺伝暗号によりコードされ
たものであってもなくてもよい。ポリヌクレオチドまた
はポリペプチドの変種は、対立遺伝子変種のような天然
物であってもよく、または天然に発生することが知られ
ていない変種であってもよい。ポリヌクレオチドおよび
ポリペプチドの天然に生じない変種は、突然変異誘発技
術により、または直接的合成により製造できる。

【００１６】「同一性」は、ヌクレオチド配列またはア
ミノ酸配列のある程度の同一性をいう。一般に、配列は
最高の対合が得られるように配置される。「同一性」自
体は、当該分野にて認識されている意義を有しており、
公開されている方法を用いて計算することができる。例
えば、（COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY，Lesk,A.M.
編、Oxford University Press、New York、1988年；BIO
COMPUTING：INFORMATICS AND GENOME PROJECTS、Smith,
D.W.編、Academic Press、New York、1993年；COMPUTER
ANALYSIS OF SEQUENCE DATA，PARTＩ，Griffin,A.M.お
よびGriffin,H.G.編、Humana Press、New Jersey、1994
年；SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY，von He
inje,G.、Academic Press、1987年；およびSEQUENCE AN
ALYSIS PRIMER，Gribskov,M.およびDevereux,J.編、Ｍ
Stockton Press、New York、1991年）を参照のこと。二
つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の間の同
一性を測定するのに多数の方法があるが、「同一性」な
る用語は当業者に周知である（Carillo,H.およびLipto
n,D.，SIAM J.Applied Math.，48：1073（1988））。２
つの配列間の同一性または類似性を測定するために通常
用いられる方法は、Guide to Huge Computers、Martin
J. Bishop,編、Academic Press、San Diego、1994年、
およびCarillo,H.およびLipton,D.，SIAM J.Applied Ma
th.，48：1073（1988）に開示されている方法を包含す
るが、これらに限定されるものではない。同一性および
類似性を決定するための方法はコンピュータープログラ
ムに集成されている。二つの配列間の同一性および類似
性を測定するための好ましいコンピュータープログラム
法は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux,J.ら、N
ucleic Acids Research 12（1）：387（1984））、BLAS
TP、BLASTN、FASTA（Atschul,S.F.ら、J.Molec.Biol. 2
15：215-403（1990））を包含するが、これらに限定さ
れるものではない。

【００１７】一例として、配列番号１の対照ヌクレオチ
ド配列に対して少なくとも、例えば９５％の「同一性」
を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
は、そのポリヌクレオチド配列が配列番号１の対照ヌク
レオチド配列のヌクレオチド各１００個当たり５個まで
の点突然変異を有していてもよいことを除き、ポリヌク
レオチドのヌクレオチド配列が対照配列と同一であるこ
とを意図とする。言い換えれば、対照ヌクレオチド配列
と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有す
るポリヌクレオチドを得るためには、その対照配列にお
けるヌクレオチドの５％までが欠失または別のヌクレオ
チドで置換されていてもよく、または対照配列における
全ヌクレオチドの５％までの数のヌクレオチドが対照配
列中に挿入されていてもよい。対照配列のこれらの変異
は、対照ヌクレオチド配列の５または３末端位置で、ま
たはそれら末端位置の間のどこで起こってもよく、対照
配列中のヌクレオチド間に個々に、または対照配列内の
一またはそれ以上の隣接する基において点在してもよ
い。

【００１８】同様に、配列番号２の対照アミノ酸配列に
対して少なくとも、例えば９５％の同一性を有するアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドは、そのポリペプチド配
列が配列番号２の対照アミノ酸のアミノ酸各１００個当
たり５個までのアミノ酸変異を有していてもよいことを
除き、そのポリペプチドのアミノ酸配列が、対照配列と
同一であることを意図とする。言い換えれば、対照アミ
ノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸
配列を有するポリペプチドを得るためには、その対照配
列におけるアミノ酸残基の５％までが欠失または別のア
ミノ酸で置換されていてもよく、または対照配列におけ
る全アミノ酸残基の５％までの数のアミノ酸が対照配列
中に挿入されていてもよい。対照配列のこれらの変化は
対照アミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端位置
で、またはそれら末端位置の間のどこで起こってもよ
く、対照配列中の残基間に個々に、または対照配列内の
一またはそれ以上の隣接する基において点在してもよ
い。

【００１９】本発明のポリペプチド 一の態様において、本発明はヒト・ニューロテンシン・
２型のポリペプチドに関する。ヒト・ニューロテンシン
・２型のポリペプチドは、配列番号２のポリペプチド；
ならびに配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチ
ド；および配列番号２のアミノ酸配列とその全長にわた
って少なくとも８８％の同一性、より好ましくは配列番
号２と少なくとも９０％の同一性、さらにより好ましく
は少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列から
なるポリペプチドを包含する。ヒト・ニューロテンシン
・２型のポリペプチドはまた、配列番号２のアミノ酸配
列を有するポリペプチドとその全長にわたって少なくと
も９０％の同一性、より好ましくは配列番号２と少なく
とも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリ
ペプチドも包含する。好ましくは、ヒト・ニューロテン
シン・２型のポリペプチドは少なくとも１つのヒト・ニ
ューロテンシン・２型の生物学的活性を示す。

【００２０】ヒト・ニューロテンシン・２型のポリペプ
チドは「成熟」タンパク質の形態であってもよく、ある
いは融合タンパク質などの大型のタンパク質の一部であ
ってもよい。分泌またはリーダー配列、プロ配列、複数
のヒスチジン残基のごとき精製を促進する配列、または
組換え操作の間の安定性のための付加的な配列を含む付
加的なアミノ酸配列を含んでいることが有利なことがよ
くある。

【００２１】ヒト・ニューロテンシン・２型のポリペプ
チドの生物学的に活性なフラグメントも本発明に含まれ
る。フラグメントは、前記のヒト・ニューロテンシン・
２型のポリペプチドのアミノ酸配列のすべてではなく一
部に対して全く同一であるアミノ酸配列を有するポリペ
プチドである。ヒト・ニューロテンシン・２型のポリペ
プチドでは、フラグメントは「自立している」である
か、またはフラグメントが一部分もしくは一領域を形成
する大型のポリペプチド内に含まれていてもよく、最も
好ましくは単一の連続した領域として含まれる。本発明
のポリペプチドフラグメントの典型例は、例えば、ヒト
・ニューロテンシン・２型のポリペプチドのアミノ酸番
号約１〜２０、２１〜４０、４１〜６０、６１〜８０、
８１〜１００および１０１から末端までからなるフラグ
メントを包含する。この意味において、「約」とは、片
方または両端において、特記された数よりも数個、５
個、４個、３個、２個または１個だけ多いかまたは少な
い範囲を含む。

【００２２】好ましいフラグメントは、例えば、アミノ
末端を含む一連の残基が欠失、またはカルボキシル末端
を含む一連の残基が欠失、あるいは一方がアミノ末端で
もう一方がカルボキシル末端を含む２つの一連の残基が
欠失していること以外は、ヒト・ニューロテンシン・２
型のポリペプチドのアミノ酸配列を有する切断ポリペプ
チドを包含する。また、アルファーヘリックスおよびア
ルファーヘリックス形成領域、ベータシートおよびベー
タシート形成領域、ターンおよびターン形成領域、コイ
ルおよびコイル形成領域、親水領域、疎水領域、アルフ
ァー両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、可変領域、表
面形成領域、基質結合領域および高抗原性指標領域を有
するフラグメントなどの構造的または機能的属性により
特徴付けられるフラグメントも好ましい。生物学的に活
性なフラグメントは、類似活性または改良された活性を
有する、あるいは望ましくない活性を減じたものを含
め、レセプター活性を媒介する、フラグメントである。
動物、とりわけヒトにおいて抗原的または免疫原的なフ
ラグメントもまた含まれる。

【００２３】好ましくは、これらのポリペプチドフラグ
メントはすべて、抗原的活性を含め、レセプターの生物
学的活性を保持している。定義した配列の変種およびフ
ラグメントも本発明の一部を形成する。好ましい変種
は、同類アミノ酸置換により対照と異なるものであり、
すなわち、一の残基が同様の特徴を有する他の残基によ
り置換されているものである。典型的なかかる置換は、
Ala、Val、LeuおよびIleの間：SerおよびThrの間；酸性
残基AspおよびGluの間；AsnおよびGlnの間；ならびに塩
基性残基LysおよびArgの間；あるいは芳香族残基Pheお
よびTyrの間におけるものである。数個、５ないし１０
個、１ないし５個、または１ないし２個のアミノ酸がい
ずれかの組み合わせで置換、欠失または付加されている
変種が特に好ましい。

【００２４】いずれか適当な方法にて本発明のヒト・ニ
ューロテンシン・２型のポリペプチドを製造することが
できる。かかるポリペプチドは、単離された天然ポリペ
プチド、組換え技法で産生されたポリペプチド、合成法
により産生されたポリペプチド、またはこれらの方法の
組み合わせにより産生されたポリペプチドを包含する。
かかるポリペプチドの製造手段は当該分野においてよく
知られている。

【００２５】本発明のポリヌクレオチド 本発明のもう一つ別の態様はヒト・ニューロテンシン・
２型のポリヌクレオチドに関する。ヒト・ニューロテン
シン・２型のポリヌクレオチドは、ヒト・ニューロテン
シン・２型のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレ
オチドおよびフラグメント、ならびにそのポリヌクレオ
チドに密接に関連するポリヌクレオチドに関する。さら
に詳細には、本発明のヒト・ニューロテンシン・２型の
ポリヌクレオチドは、配列番号2のヒト・ニューロテン
シン・２型のポリペプチドをコードする配列番号1に示
されるヌクレオチド配列を有してなるポリヌクレオチ
ド、および配列番号1の特定の配列を有するポリヌクレ
オチドを包含する。ヒト・ニューロテンシン・２型のポ
リヌクレオチドは、さらには、配列番号２のヒト・ニュ
ーロテンシン・２型のポリペプチドをコードするヌクレ
オチド配列とその全長にわたって少なくとも８８％の同
一性を有するヌクレオチドからなるポリヌクレオチド、
および配列番号１のポリヌクレオチドとその全長にわた
って少なくとも８８％同一であるポリヌクレオチドを包
含する。この点において、少なくとも９０％同一である
ポリヌクレオチドが特に好ましく、少なくとも９５％同
一であるのがさらに好ましい。さらには、少なくとも９
７％同一であるのがより好ましく、少なくとも９８−９
９％の同一性を有するものがより一層好ましく、少なく
とも９９％の同一性を有するものが最も好ましい。さら
に、増幅させるのにあるいはプローブまたはマーカーと
しての用途に用いることのできる条件下で、ハイブリッ
ド形成するのに配列番号１に含まれるヌクレオチド配列
と十分な同一性を有するヌクレオチド配列もヒト・ニュ
ーロテンシン・２型のポリヌクレオチドに含められる。
本発明はまた、かかるヒト・ニューロテンシン・２型の
ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを提供す
る。

【００２６】ヒト・ニューロテンシン・２型をコードす
るｃＤＮＡを配列決定した結果から明らかなように、本
発明のヒト・ニューロテンシン・２型は、G−タンパク
質結合７−トランスメンブランレセプター種の他のタン
パク質に構造的に関連付けられる。ｃＤＮＡ配列は、４
１１個のアミノ酸のポリペプチドをコードする読み枠を
含んでいる。表１（配列番号２）のアミノ酸配列は、ラ
ット・ニューロテンシン・２型レセプターと４１１個の
アミノ酸残基にて約８６.８６％の同一性（Bestfitを使
用）を有する（P. Chalonら、FEBS lett. ３８６（２−
３）：９１−９４、１９９６）。さらには、ヒト・ニュ
ーロテンシン・２型は、Mus Musculus脳ニューロテンシ
ン２型レセプターと、２０９個のアミノ酸残基にわたっ
て８１％同一である（J. Mazellaら、J. Neuroscience
１６(１８)：５６１１−５６２０、１９９６）。

【００２７】表１（配列番号１）のヌクレオチド配列
は、ラット・ニューロテンシン・２型レセプターと１５
２９個のヌクレオチド残基にて約７９.０％の同一性（B
estfitを使用）を有する（P. Chalonら、FEBS lett. ３
８６（２−３）：９１−９４、１９９６）。さらには、
ヒト・ニューロテンシン・２型は、Mus Musculus 脳ニ
ューロテンシン２型レセプターと、６０６個のヌクレオ
チド塩基残基にわたって８５％同一である（J. Mazella
ら、J. Neuroscience １６(１８)：５６１３−５６２
０、１９９６）。

【００２８】

【表１】 表１^a 10 30 50 GAATTCGGCTTACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGTGCGGGATGGAAAC M E T 70 90 110 CAGCAGCCCGCGGCCCCCGCGGCCCAGCTCCAACCCGGGGCTGAGCCTGGACGCCCGGCT S S P R P P R P S S N P G L S L D A R L 130 150 170 GGGCGTGGACACTCaCCTCTGGGCCAAGGTGCTGTTCACCGCGCTCTACGCACTCATCTG G V D T H L W A K V L F T A L Y A L I W 190 210 230 GGCGCTGGGCGCGGCGGGCAATGCGCTGTCCGTGCACGTGGTGCTGAAGGCGCGGGCCGG A L G A A G N A L S V H V V L K A R A G 250 270 290 GCGCGCGGGGCGCCTGCGCCACCACGTGCTCAGCCTGGCGCTCGCGGGCCTGCTGCTGCT R A G R L R H H V L S L A L A G L L L L 310 330 350 GCTGGTCGGCGTGCCGGTGGAACTCTACAGCTTCGTGTGGTTCCACTACCCCTGGGTCTT L V G V P V E L Y S F V W F H Y P W V F 370 390 410 CCGCGACCTGGGCTGCCGCGGCTACTACTTCGTGCACGAGCTGTGCGCCTACGCCACGGT R D L G C R G Y Y F V H E L C A Y A T V 430 450 470 GCTGAGCGTGGCAGGCCTGAGCGCCGAGCGCTGCCTAGCCGTGTGCCAGCCCCTGCGTGC L S V A G L S A E R C L A V C Q P L R A 490 510 530 CCGCAGCCTGCTGACGCCACGCCGGACCCGGTGGCTGGTGGCGCTCTCGTGGGCCGCCTC R S L L T P R R T R W L V A L S W A A S 550 570 590 GCTCGGCCTCGCCCTGCCCATGGCCGTCATCATGGGGCAGAAGCACGAACTCGAGACGGC L G L A L P M A V I M G Q K H E L E T A 610 630 650 GGACGGGGAGCCGGAGCCCGCCTCGCGAGTGTGCACGGTGCTGGTGAGCCGCACCGCGCT D G E P E P A S R V C T V L V S R T A L 670 690 710 CCAAGTCTTTATCCAGGaAGCCATCGTGGTCATGTATGTCATCTGCTGGCTGCCGTACCA Q V F I Q E A I V V M Y V I C W L P Y H 730 750 770 TGCCCGCAGGCTCATGTACTGCTACGTACCTGATGACGCGTGGACTGACCCACTGTACAA A R R L M Y C Y V P D D A W T D P L Y N 790 810 830 TTTCTACCACTACTTCTACATGGTGACCAACACACTTTTCTACGTCAGCTCAGCTGTGAC F Y H Y F Y M V T N T L F Y V S S A V T 850 870 890 TCCTCTTCTCTACAACGCCGTGTCCTCCTCCTTCAGAAAACTCTTCCTGGAAGCCGTCAG P L L Y N A V S S S F R K L F L E A V S 910 930 950 CTCCCTGTGTGGAGAGCACCACCCCATGAAGCGGTTACCCCCGAAGCCCCAGAGTCCCAC S L C G E H H P M K R L P P K P Q S P T 970 990 1010 CCTAATGGATACAGCTTCAGGCTTTGGGGATCCCCCAGAAACCCGGACCTGAATGTAATG L M D T A S G F G D P P E T R T * 1030 1050 1070 CAAGAATGAACAGAACAAGCAAAATGACCAGCTGCTTAGTCACCTGGCAAAGCAGGTGAG 1090 1110 1130 CAACCTCATCACTAATCATTCAAGCTTCGCAGCCAGGGCGACTTCTATCAACCCCTGCTC 1150 1170 1190 TGCTGAGAACCATCAAGCGCAGGGAAGCCACGTGACCCCTCCTAGCCTCAGGCTCCCTCG 1210 1230 1250 TCTGTGTAGTGGAGATAAAGAACAGCACCCATCTCTTAGTGTTGCCTGAGACTAAAGTGC 1270 1290 1310 TTAGCACAGAACCTGGTGCGTAGTAGATGCTCAATAAATTTTTGCTGGCAAAAAAAAAAA 1330 AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA^a ヒト・ニューロテンシン・２型のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列（各 々、配列番号１および２）

【００２９】ヒトの脳の細胞中のｍＲＮＡから由来のｃ
ＤＮＡライブラリーより標準的クローニングおよびスク
リーニングを用い、発現配列タグ（ＥＳＴ）分析（Adam
s,M.D.ら、Science 252：1651-1656（1991）；Adams,M.
D.ら、Nature 355：632-634（1992）；Adams,M.D.ら、N
ature 377 Supp：3-174（1995））を用いて、ヒト・ニ
ューロテンシン・２型をコードする本発明の１のポリヌ
クレオチドを得てもよい。ゲノムＤＮＡライブラリーの
ごとき天然源から本発明のポリヌクレオチドを得ること
もでき、あるいはよく知られ、かつ商業上利用可能な方
法を用いて合成することもできる。

【００３０】配列番号2のヒト・ニューロテンシン・２
型のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、表
１（配列番号１）に示されるコード配列とその全長にわ
たって同一であってもよく、または配列番号２のポリペ
プチドをコードするこのヌクレオチド配列の変形であっ
てもよく、または配列番号２のポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列と高度に同一であってもよい。好ま
しくは、本発明のポリヌクレオチドは、ヒト・ニューロ
テンシン・２型のポリペプチドと高度に同一、少なくと
も８８％同一であるか、またはヒト・ニューロテンシン
・２型のポリペプチドをコードする表１に含まれる配列
と、少なくとも８７％同一であるか、または配列番号２
のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と少なく
とも８８％同一であるヌクレオチド配列を有する。

【００３１】本発明のポリヌクレオチドをヒト・ニュー
ロテンシン・２型のポリペプチドの組換え生産に用いる
場合、ポリヌクレオチドはそれ自体、成熟ポリペプチド
またはそのフラグメントのコーディング配列を含むもの
であってもよく；読み枠中に、リーダーまたは分泌配
列、プレ、プロ、もしくはプレプロタンパク質配列をコ
ードするコーディング配列、または他の融合ペプチド部
分などの、他のコーディング配列を伴った、成熟ポリペ
プチドまたはフラグメントのコーディング配列を含むも
のであってもよい。例えば、融合ポリペプチドの精製を
促進するマーカー配列をコードすることもできる。本発
明のこの態様の特に好ましい具体例において、マーカー
配列は、ｐＱＥベクター（Qiagen,Inc.）で得られ、Gen
tzら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，86:821-824（1989）
に記載されるような、ヘキサ−ヒスチジンペプチドであ
るか、またはＨＡタグである。ポリヌクレオチドはま
た、非コーディング５’および３’配列、例えば、転写
された非翻訳配列、スプライスおよびポリアデニル化シ
グナル、リボソーム結合部位およびmＲＮＡを安定化す
る配列などを含有していてもよい。

【００３２】さらなる好ましい具体例は、表１（配列番
号２）のヒト・ニューロテンシン・２型のポリペプチド
のアミノ酸配列を有し、数個、５ないし１０個、１ない
し５個、１ないし３個、１ないし２個または１個のアミ
ノ酸残基がいずれかの組み合わせで置換、欠失または付
加されているヒト・ニューロテンシン・２型の変種をコ
ードするポリヌクレオチドである。本発明は、さらに
は、本明細書において前記した配列とハイブリッド形成
するポリヌクレオチドにも関する。この点において、本
発明は、特に、本明細書において前記したポリヌクレオ
チドにストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーシ
ョンするポリヌクレオチドに関する。本明細書で用いる
用語の「ストリンジェントな条件」とは、配列間に少な
くとも９５％、好ましくは少なくとも９７−９９％の同
一性がある場合にのみハイブリダイゼーションが起こる
ことを意味する。

【００３３】本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１
に含まれるヌクレオチド配列またはそのフラグメントに
対して同一または十分に同一であり、ｃＤＮＡおよびゲ
ノムＤＮＡ用のハイブリダイゼーションプローブとして
用いてヒト・ニューロテンシン・２型をコードする全長
のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離し、ヒト・ニュ
ーロテンシン・２型遺伝子に対して高配列類似性を有す
る他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離す
ることができる。かかるハイブリダイゼーション法は当
業者に知られている。典型的には、これらのヌクレオチ
ド配列は、対照配列と７０％同一、好ましくは８０％同
一、より好ましくは９５％同一である。一般に、プロー
ブは少なくとも１５個のヌクレオチドを含むであろう。
好ましくは、かかるプローブは少なくとも３０個のヌク
レオチドを有し、少なくとも５０個のヌクレオチドを有
していてもよい。特に好ましいプローブは３０ないし５
０個のヌクレオチドの範囲にある。

【００３４】一の具体例において、ヒト・ニューロテン
シン・２型のポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドを得るには、適当なライブラリーをストリンジェント
なハイブリダイゼーション条件下で配列番号１を有する
標識したプローブまたはそのフラグメントでスクリーニ
ングし、該ポリヌクレオチド配列を含有する全長のｃＤ
ＮＡおよびゲノムクローンを単離する工程からなる。そ
のようなハイブリダイゼーション法は当業者に周知であ
る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
は、前記されているとおりであるか、あるいはまた５０
％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ NaCl、１５
ｍＭ クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ リン酸ナトリウ
ム（ｐＨ７.６）、５ｘDenhardt's溶液、１０％硫酸デ
キストランおよび２０マイクログラム／ｍｌの変性切断
サケ精子ＤＮＡを有してなる溶液中で一夜４２℃でイン
キュベートし、つづいてそのフィルターを約６５℃で
０.１ｘＳＳＣにて洗浄する条件である。研究試薬なら
びに動物およびヒトの疾患の治療および診断を見いだす
ための材料として本発明のポリヌクレオチドおよびポリ
ペプチドを用いてもよい。

【００３５】ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド（複数でも
可）を含むベクター、本発明のベクターで遺伝子操作す
る宿主細胞および組換え技法による本発明のポリペプチ
ドの製造にも関する。無細胞翻訳系を用い、本発明のＤ
ＮＡ構築物から由来のＲＮＡを用いてかかるタンパク質
を製造できる。

【００３６】組換え体を製造するために、宿主細胞を遺
伝子操作して、本発明のポリヌクレオチドについての発
現系もしくはそれらの一部を組み込むことができる。ポ
リヌクレオチドの宿主細胞への導入は、Davisら、BASIC
METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY（1986）；Sambrook
ら、MOLECUR CLONING：A LABORATORY MANUAL、第２版、
Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring H
arbor、N.Y.（1989）のような、多くの標準的な実験マ
ニュアルに記載される方法により行うことができ、例え
ばリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−
デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベク
ション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介
トランスフェクション、エレクトロポレーション、トラ
ンスダクション、スクレープ負荷、バリスティック導入
または感染等がある。

【００３７】適当な宿主の代表的なものとして、細菌細
胞、例えば連鎖球菌属（streptococci）、ブドウ球菌属
（staphylococci）、大腸菌（E.coli）、ストレプトミ
セス（Streptomyces）および枯草菌（Bacillus subtili
s）細胞；真菌細胞、例えば酵母細胞およびアスペルギ
ルス属（Aspergillus）細胞；昆虫細胞、例えばドロソ
フィラＳ２（Drosophila S2）およびスポドプテラＳｆ
９（Spodoptera Sf9）細胞；動物細胞、例えばCHO、CO
S、HeLa、Ｃ１２７、３Ｔ３、BHK、HEK２９３およびボ
ウズ（Bows）黒色腫細胞；ならびに植物細胞が挙げられ
る。

【００３８】多種の発現系を用いることができる。この
ような系として、とりわけ、染色体、エピソームおよび
ウイルス由来系、例えば細菌プラスミドから、バクテリ
オファージから、トランスポゾンから、酵母エピソーム
から、挿入エレメントから、酵母染色体エレメントか
ら、バキュロウイルス、パポバウイルスなどの、例えば
ＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘
ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等
のウイルスから由来のベクター、ならびにその組み合わ
せから由来のベクター、例えばコスミドおよびファージ
ミドなどのプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝因
子から由来のベクターが挙げられる。発現系は発現を制
御および引き起こす調節領域を含有していてもよい。一
般に、ポリヌクレオチドを保持、伸長または発現させ、
宿主にてポリペプチドを産生するのに適した系またはベ
クターを使用できる。種々の周知かつ慣用的な技法、例
えば、Sambrookら、MOLECULAR CLONING、A LABORATORY
MANUAL（前掲）に記載されている技法により、適当なヌ
クレオチド配列を発現系に挿入できる。

【００３９】翻訳タンパク質を、小胞体内腔、周辺腔ま
たは細胞外環境へ分泌させるために、適当な分泌シグナ
ルを所望のポリペプチドに組み込むことができる。これ
らのシグナルはポリペプチドに固有のシグナルであって
もよく、あるいは異種性のシグナルであってもよい。ヒ
ト・ニューロテンシン・２型のポリペプチドをスクリー
ニングアッセイにて用いるために発現させる場合、一般
に、そのポリペプチドを細胞表面で生成させることが好
ましい。この場合、スクリーニングアッセイに使用する
前に細胞を集めてもよい。ヒト・ニューロテンシン・２
型のポリペプチドが培地中に分泌されるならば、培地を
回収してポリペプチドを回収し精製することができる。
細胞内に生成されるならば、まず細胞を溶解し、次い
で、ポリペプチドを回収しなければならない。

【００４０】ヒト・ニューロテンシン・２型のポリペプ
チドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽
出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、
ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水相互作用ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよび
レクチンクロマトグラフィーを含め、周知の方法によ
り、組換え細胞培養物から回収および精製できる。高性
能液体クロマトグラフィーを精製に用いるのが最も好ま
しい。ポリペプチドが単離および／または精製中に変性
する場合、タンパク質を再生するための周知方法を用
い、再び活性な立体配座とすることができる。

【００４１】診断アッセイ 本発明はまた診断薬として用いるためのヒト・ニューロ
テンシン・２型のポリヌクレオチドの使用にも関する。
機能不全に関与するヒト・ニューロテンシン・２型遺伝
子の変異形の検出は、ヒト・ニューロテンシン・２型の
過少発現、過剰発現または発現の変化よりもたらされる
疾患の診断または疾患の疑いを特定することのできる診
断手段を提供する。ヒト・ニューロテンシン・２型遺伝
子に変異のある個体は、種々の方法によりＤＮＡレベル
で検出できる。

【００４２】診断に供する核酸は、対象の細胞、例え
ば、血液、尿、唾液、組織生検または剖検材料より得る
ことができる。ゲノムＤＮＡは、検出するのに直接使用
してもよく、または分析の前にＰＣＲもしくはその他の
増幅法を用いることにより酵素的に増幅させてもよい。
ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた同じ方法で用いることがで
きる。正常な遺伝子型との比較における増幅産物の大き
さの変化により、欠失および挿入を検出できる。点突然
変異は、増幅ＤＮＡを標識化ヒト・ニューロテンシン・
２型のヌクレオチド配列とハイブリッド形成させること
により同定できる。完全に対合した配列はＲＮase消化
により、または融解温度の違いにより、誤対合二重らせ
んから区別できる。ＤＮＡ配列の違いはまた、変性物質
と一緒にまたはなしで、ゲル中のＤＮＡフラグメントの
電気泳動の移動度の変化により、または直接的ＤＮＡ配
列決定法により検出できる。例えばMyersら、Science 2
30：1242（1985）を参照のこと。特異的な位置での配列
の変化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ、例えばRＮa
seおよびＳ１保護または化学的切断法によっても明らか
にすることができる。Cottonら、Proc. Natl. Acad. Sc
i., USA，85：4397-4401（1985）を参照のこと。もう１
つの具体例において、ヒト・ニューロテンシン・２型の
ヌクレオチド配列またはそのフラグメントからなるオリ
ゴヌクレオチドプローブのアレイ（array）を構築し
て、例えば遺伝的変異の効果的なスクリーニングを行う
ことができる。アレイ法はよく知られており、適用範囲
が広く、その方法を用いて、遺伝子発現、遺伝的連鎖お
よび遺伝的変化を含め、分子遺伝学における種々の問題
と取り組むことができる（例えば、M.Cheeら、Science,
Vol274, pp610-613（1996）を参照のこと）。

【００４３】診断アッセイは、記載した方法によりヒト
・ニューロテンシン・２型遺伝子中の変異を検出するこ
とによる、細菌、真菌、原生動物およびウイルス感染、
詳細には、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２によって引き起
こされる感染；痛み；腫瘍；拒食症；過食症；喘息；パ
ーキンソン病；急性心不全；低血圧；高血圧；閉尿；骨
粗鬆症；狭心症；心筋梗塞；潰瘍；喘息；アレルギー；
良性前立腺肥大；および、不安症、精神分裂症、躁鬱
病、精神錯乱、痴呆、重度の知恵遅れ、ならびに、ハン
チントン病またはジルス・デラ・トレット症候群のごと
き運動障害への罹病し易さを診断または測定する方法を
提供する。

【００４４】加えて、細菌、真菌、原生動物およびウイ
ルス感染、詳細には、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２によ
って引き起こされる感染；痛み；腫瘍；拒食症；過食
症；喘息；パーキンソン病；急性心不全；低血圧；高血
圧；閉尿；骨粗鬆症；狭心症；心筋梗塞；潰瘍；喘息；
アレルギー；良性前立腺肥大；および、不安症、精神分
裂症、躁鬱病、精神錯乱、痴呆、重度の知恵遅れ、なら
びに、ハンチントン病またはジルス・デラ・トレット症
候群のごとき運動障害は、対象から由来の試料より、異
常に上昇または低下したヒト・ニューロテンシン・２型
のポリペプチドまたはヒト・ニューロテンシン・２型の
ｍＲＮＡのレベルを測定することを特徴とする方法によ
って診断することができる。発現の増加または低下は、
ポリヌクレオチドの定量法として当該分野で周知の方
法、例えば、ＰＣＲ、ＲＴ-ＰＣＲ、ＲＮase保護、ノー
ザンブロッティングおよび他のハイブリダイゼーション
法を用いてＲＮＡレベルで測定できる。宿主から由来の
試料中のヒト・ニューロテンシン・２型のポリペプチド
などのタンパク質のレベルを決定するために用いること
ができるアッセイ法は、当業者に周知である。このよう
なアッセイ法には、ラジオイムノアッセイ、競争結合ア
ッセイ、ウェスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッ
セイが挙げられる。

【００４５】染色体アッセイ 本発明のヌクレオチド配列は染色体の同定にも価値があ
る。該配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置を特異
的に標的とし、これとハイブリッド形成しうる。本発明
に従って、関連する配列を染色体にマッピングする工程
は、それらの配列を遺伝子関連疾患と関連づける重要な
第１工程である。配列を正確な染色体位置にマッピング
したならば、染色体上の配列の物理的位置を遺伝地図の
データと関連づけることができる。かかるデータは、例
えば、V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man（J
ohns Hopkins University Welch Medical Libraryから
オンラインで利用できる）にて見られる。ついで、連鎖
分析（物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝）により、同
じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との関係
を同定する。

【００４６】罹病個体と未罹病個体との間のｃＤＮＡま
たはゲノム配列の相違も測定することができる。いくつ
かまたはすべての罹病個体において変異が観察される
が、正常個体においては観察されない場合、その変異は
該疾患の原因である可能性がある。

【００４７】抗体 本発明のポリペプチドもしくはそれらのフラグメントま
たはそのアナログ、あるいはそれらを発現する細胞を免
疫原として用いて、ヒト・ニューロテンシン・２型のポ
リペプチドに対して免疫特異的な抗体を得ることもでき
る。「免疫特異的」なる語は、抗体が先行技術における
他の関連ポリペプチドに対するアフィニティーよりも、
本発明のポリペプチドに対して実質的により大きなアフ
ィニティーを有することを意味する。

【００４８】ヒト・ニューロテンシン・２型のポリペプ
チドに拮抗して生じる抗体は、ポリペプチドまたはエピ
トープ担持フラグメント、アナログまたは細胞を、動
物、好ましくはヒト以外の動物に、通常の実験法を用い
て投与することにより得ることができる。モノクローナ
ル抗体の産生には、連続的セルライン培養により得られ
る抗体を提供するいずれの方法も用いることができる。
例えば、ハイブリドーマ法（Kohler,G.およびMilstein,
C.、Nature 256：495-497（1975）、トリオーマ法、ヒ
トB-細胞ハイブリドーマ法（Kozborら、Immunology Tod
ay 4：72（1983）およびEBV-ハイブリドーマ法（Cole
ら、MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY、７７
−９６頁、Alan R. Liss, Inc.,（1985））が挙げられ
る。

【００４９】一本鎖抗体を産生するのに記載された技術
（米国特許第４９４６７７８号）を適用して、本発明の
ポリペプチドに対する一本鎖抗体を産生できる。また、
トランスジェニックマウスまたは他の哺乳動物を含め、
他の生物を用いて、ヒト化抗体を発現させることができ
る。前記した抗体を用いて、ポリペプチドを発現するク
ローンを単離または同定してもよく、あるいはアフィニ
ティークロマトグラフィーによりポリペプチドを精製し
てもよい。

【００５０】ヒト・ニューロテンシン・２型のポリペプ
チドに対する抗体を用いて、とりわけ、細菌、真菌、原
生動物およびウイルス感染、詳細には、ＨＩＶ−１また
はＨＩＶ−２によって引き起こされる感染；痛み；腫
瘍；拒食症；過食症；喘息；パーキンソン病；急性心不
全；低血圧；高血圧；閉尿；骨粗鬆症；狭心症；心筋梗
塞；潰瘍；喘息；アレルギー；良性前立腺肥大；およ
び、不安症、精神分裂症、躁鬱病、精神錯乱、痴呆、重
度の知恵遅れ、ならびに、ハンチントン病またはジルス
・デラ・トレット（Gilles dela Tourett's）症候群の
ごとき運動障害を治療してもよい。

【００５１】ワクチン 本発明の別の態様は、哺乳動物における免疫学的応答を
誘起する方法であって、抗体および／またはＴ細胞免疫
応答を生じさせるに十分なヒト・ニューロテンシン・２
型のポリペプチドまたはそのフラグメントを哺乳動物に
接種して、とりわけ、細菌、真菌、原生動物およびウイ
ルス感染、詳細には、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２によ
って引き起こされる感染；痛み；腫瘍；拒食症；過食
症；喘息；パーキンソン病；急性心不全；低血圧；高血
圧；閉尿；骨粗鬆症；狭心症；心筋梗塞；潰瘍；喘息；
アレルギー；良性前立腺肥大；および、不安症、精神分
裂症、躁鬱病、精神錯乱、痴呆、重度の知恵遅れ、なら
びに、ハンチントン病またはジルス・デラ・トレット症
候群のごとき運動障害から該動物を防御することからな
る方法に関する。本発明のもう１つ別の態様は、哺乳動
物における免疫学的応答を誘導する方法であって、イン
ビボにてヒト・ニューロテンシン・２型のポリペプチド
の発現を指令するベクターを介してヒト・ニューロテン
シン・２型をデリバリーし、かかる免疫学的応答を誘発
させ、抗体を産生し、該動物を疾患から保護することか
らなる方法に関する。

【００５２】本発明のさらなる態様は免疫学的／ワクチ
ン処方（組成物）であって、哺乳動物宿主中に導入され
た場合、その哺乳動物にてヒト・ニューロテンシン・２
型のポリペプチドに対する免疫学的応答を誘導する処方
（該組成物はヒト・ニューロテンシン・２型のポリペプ
チドまたはヒト・ニューロテンシン・２型遺伝子を含ん
でなる）に関する。ワクチン処方は、さらに適当な担体
を含んでいてもよい。ヒト・ニューロテンシン・２型の
ポリペプチドは胃で分解されるかもしれないため、好ま
しくは非経口的（皮下、筋肉内、静脈内、皮内注射等を
包含する）に投与する。非経口投与に適した処方は、抗
酸化剤、バッファー、静菌剤および処方を患者の血液と
等張にする溶質を含有してもよい水性および非水性滅菌
注射用溶液；ならびに懸濁剤または増粘剤を含んでいて
もよい水性および非水性滅菌懸濁液を包含する。処方を
１回投与または複数回投与用容器、例えば、密封アンプ
ルおよびバイアルに入れて提供してもよく、使用直前に
滅菌液体担体を添加するだけでよい凍結乾燥状態にて保
存してもよい。またワクチン処方は、水中油系および当
該分野で知られた他の系などの処方の免疫原性を高める
ためのアジュバント系を含んでいてもよい。用量は、ワ
クチンの個々の活性に依存しており、通常の実験により
容易に決定することができる。

【００５３】スクリーニングアッセイ 本発明のヒト・ニューロテンシン・２型のポリペプチド
は、本発明のレセプターと結合し、そのポリペプチドの
活性を活性化（アゴニスト）または阻害（アンタゴニス
ト）する化合物についてのスクリーニング法にて用いて
もよい。かくして、本発明のポリペプチドを用いて、例
えば細胞、無細胞調製物、化学ライブラリーおよび天然
物の混合物における小型分子基質およびリガンドの結合
を評価してもよい。これらの天然の基質およびリガンド
は、天然の基質およびリガンドであってもよく、あるい
は構造または機能を模倣したものであってもよい。Coli
ganら、Current Protocols in Immunology 1（2）：第5
章（1991）を参照のこと。

【００５４】ヒト・ニューロテンシン・２型のポリペプ
チドは、哺乳動物宿主に遍在しており、種々の病原性を
含め、多くの生物学的機能に関与している。したがっ
て、一方でヒト・ニューロテンシン・２型を刺激する化
合物および薬剤を、他方でヒト・ニューロテンシン・２
型機能を阻害しうる化合物または薬剤を見いだすことが
望ましい。一般に、アゴニストは、細菌、真菌、原生動
物およびウイルス感染、詳細には、ＨＩＶ−１またはＨ
ＩＶ−２によって引き起こされる感染；痛み；腫瘍；拒
食症；過食症；喘息；パーキンソン病；急性心不全；低
血圧；高血圧；閉尿；骨粗鬆症；狭心症；心筋梗塞；潰
瘍；喘息；アレルギー；良性前立腺肥大；および、不安
症、精神分裂症、躁鬱病、精神錯乱、痴呆、重度の知恵
遅れ、ならびに、ハンチントン病またはジルス・デラ・
トレット症候群のごとき運動障害のような症状について
の治療および予防目的に利用される。アンタゴニスト
は、細菌、真菌、原生動物およびウイルス感染、詳細に
は、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２によって引き起こされ
る感染；痛み；腫瘍；拒食症；過食症；喘息；パーキン
ソン病；急性心不全；低血圧；高血圧；閉尿；骨粗鬆
症；狭心症；心筋梗塞；潰瘍；喘息；アレルギー；良性
前立腺肥大；および、不安症、精神分裂症、躁鬱病、精
神錯乱、痴呆、重度の知恵遅れ、ならびに、ハンチント
ン病またはジルス・デラ・トレット症候群のごとき運動
障害などの症状の種々の治療および予防目的に利用でき
る。

【００５５】一般に、かかるスクリーニング操作は、本
発明のレセプターのポリペプチドを細胞表面に発現する
適当な細胞を作り出すことからなる。かかる細胞は、哺
乳動物、酵母、DrosophilaまたはE.coli由来の細胞を包
含する。ついで、レセプター（または発現したポリペプ
チドを有する細胞膜）を発現する細胞を、試験化合物と
接触させて結合または機能的応答の刺激もしくは阻害を
観察する。

【００５６】一つのスクリーニング方法は、レセプター
活性化によって引き起こされる細胞外ｐＨまたは細胞内
カルシウム変化を測定する系における、ヒト・ニューロ
テンシン・２型を発現する細胞（例えば、トランスフェ
クトされたＣＨＯ細胞）の使用を包含する。この方法に
おいて、化合物を本発明レセプターポリペプチドを発現
する細胞に接触させてもよい。次いで、潜在的化合物が
レセプターを活性化または阻害するかどうかを決定する
ために、セカンドメッセンジャー応答、例えば、シグナ
ルトランスダクション、ｐＨ変化、または、カルシウム
レベルの変化を測定する。

【００５７】もう一つの方法は、レセプターが媒介する
ｃＡＭＰおよび／またはアデニレートサイクラーゼの蓄
積の阻害または促進を測定することによる、レセプター
の阻害剤をスクリーニングすることを包含する。かかる
方法は、本発明レセプターで真核細胞をトランスフェク
ションし、細胞表面にレセプターを発現させることを包
含する。次いで、本発明レセプターの存在下、細胞を潜
在的アンタゴニストに曝露する。次いで、ｃＡＭＰの蓄
積量を測定する。潜在的アンタゴニストがレセプターに
結合し、かくしてレセプターの結合を阻害するならば、
レセプターが媒介するｃＡＭＰまたはアデニレートサイ
クラーゼ活性のレベルは減少または増加するであろう。
本発明レセプターのアゴニストまたはアンタゴニストを
検出するもう一つの方法は、米国特許第５,４８２,８３
５号に記載のごとき酵母を基本とする方法である。

【００５８】該アッセイは、候補化合物に直接または間
接的に結合した標識を用いて、あるいは標識競争物質と
の競争を用いるアッセイにおいて、レセプターを有する
細胞への付着を検出する、候補化合物の結合を簡単に試
験することができる。さらには、候補化合物がレセプタ
ーの活性化により発生するシグナルを生じるかどうか
を、その表面にレセプターを有する細胞に適した検出系
を用いて、これらのアッセイにより試験してもよい。活
性化の阻害剤は、一般に、既知アゴニストの存在下でア
ッセイされ、候補化合物の存在がアゴニストによる活性
化に及ぼす作用を観察する。かかるスクリーニングアッ
セイを実施するための標準的方法は、当該分野にてよく
知られている。

【００５９】潜在的なヒト・ニューロテンシン・２型の
アンタゴニストの例は、抗体、またはある場合には、ヒ
ト・ニューロテンシン・２型のリガンドに密接に関連す
るオリゴヌクレオチドまたはタンパク質、例えば、リガ
ンドのフラグメント、またはレセプターの活性が妨げら
れるように、該レセプターに結合するが、応答を惹起し
ない、小型分子を包含する。

【００６０】予防および治療方法 本発明は、過剰および不十分な量の両方のヒト・ニュー
ロテンシン・２型活性に関連する異常な症状の治療方法
を提供する。ヒト・ニューロテンシン・２型活性が過剰
な場合、いくつかの方法を用いることができる。１の方
法は、リガンドのヒト・ニューロテンシン・２型との結
合を遮断することにより、または別のシグナルを阻害す
ることにより活性化を阻害するのに効果的な量の前記し
た阻害化合物（アンタゴニスト）を医薬上許容される担
体と共に対象に投与し、そのことにより異常な症状を改
善することからなる。もう１つ別の方法において、内在
性ヒト・ニューロテンシン・２型と競争してリガンドと
の結合能を有する可溶形のヒト・ニューロテンシン・２
型のポリペプチドを投与してもよい。かかる競争物質の
典型例はヒト・ニューロテンシン・２型のポリペプチド
のフラグメントからなる。

【００６１】さらにもう１つ別の方法において、発現遮
断法を用いて内在性ヒト・ニューロテンシン・２型をコ
ードする遺伝子の発現を阻害してもよい。公知のかかる
方法は、内部生成した、あるいは別個に投与されたアン
チセンス配列の使用からなる。例えば、Oligodeoxynucl
eotides as Antisense Inhibitors of Gene Expressio
n，CRC Press，Boca Raton, FL（1988）中、O'Connor、
J.Neurochem 56：560（1991）を参照のこと。別法とし
て、遺伝子と共に三重らせんを形成するオリゴヌクレオ
チドを供給することもできる。例えば、Leeら、Nucleic
Acids Res 6：3073（1979）；Cooneyら、Science 24
1：456（1988）；Dervanら、Science 251：1360（199
1）を参照のこと。これらのオリゴマーはそれ自体投与
することができ、あるいは関連するオリゴマーをインビ
ボで発現させることもできる。

【００６２】ヒト・ニューロテンシン・２型およびその
活性の過少発現に関連する異常な症状を治療するのに、
またいくつかの方法が利用可能である。１の方法は、ヒ
ト・ニューロテンシン・２型を活性化する治療上有効量
の化合物（すなわち、前記のアゴニスト）を医薬上許容
される担体とともに対象に投与し、そのことにより異常
な状態を改善することからなる。別法として、遺伝子治
療を用いて、対象中の関連細胞によるヒト・ニューロテ
ンシン・２型の内因的生成を有効ならしめてもよい。例
えば、前記のごとく、複製欠損レトロウイルスベクター
にて発現するように、本発明のポリヌクレオチドを操作
してもよい。ついで、該レトロウイルス発現構築物を単
離し、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡ含有の
レトロウイルスプラスミドベクターでトランスダクショ
ンしたパッケージング細胞中に導入して、パッケージン
グ細胞が目的とする遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を
生成するようにしてもよい。これらのプロデューサー細
胞を対象に投与して細胞をインビボで操作し、インビボ
でポリペプチドを発現するようにしてもよい。遺伝子治
療の概説としては、Human Molecular Genetics,T.Strac
han and A. P. Read, BIOS Scientific Publishers Ltd
（1996）中、第２０章、Gene Therapy and other Molec
ular Genetic-based Therapeutic Approaches（および
その中の引用文献）を参照のこと。

【００６３】処方および投与 可溶形のヒト・ニューロテンシン・２型のポリペプチド
のごときペプチド、ならびにアゴニストおよびアンタゴ
ニストペプチドまたは小型分子を、適当な医薬担体と組
み合わせて処方してもよい。かかる処方は、治療上有効
量のポリペプチドまたは化合物、および医薬上許容され
る担体もまたは賦形剤を含んでなる。かかる担体として
は、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセ
ロール、エタノール、およびその組み合わせを包含する
が、これらに限定されない。処方は投与経路に適したも
のとすべきであり、当業者によく知られている。さらに
本発明は、前記した本発明の組成物の１種またはそれ以
上の成分を充填した、１個またはそれ以上の容器を含ん
でなる医薬パックおよびキットにも関する。

【００６４】本発明のポリペプチドおよび他の化合物を
単独で使用してもよく、あるいは治療化合物のごとき他
の化合物と一緒に使用してもよい。医薬組成物の全身系
投与の好ましい形態は、典型的には静脈注射による注射
を包含する。皮下、筋肉内または腹腔内などの他の注射
経路を用いることもできる。全身系投与のための別の手
段は、胆汁酸塩またはフシジン酸などの浸透剤または他
の界面活性剤を用いる経粘膜または経皮投与を包含す
る。加えて、腸溶処方またはカプセル処方にうまく処方
されるならば、経口投与も可能である。これらの化合物
の投与は、膏薬、パスタ、ゲル等の形態にて、局所的お
よび／または局在化であってもよい。

【００６５】必要な用量範囲は、ペプチドの選択、投与
経路、処方の性質、対象の症状の性質、および顧問医の
判断に依存する。しかしながら、適当な用量は対象１ｋ
ｇ当たり０.１ないし１００μｇの範囲である。しか
し、使用可能な種々の化合物および種々の投与経路の効
力の違いを考慮すれば、必要な用量は広範囲なものと思
われる。例えば、経口投与には静脈注射よりも多い用量
が必要であると考えられる。当該分野においてよく知ら
れた最適化のための標準的な経験的慣用操作を用いてこ
れらの用量の変更を行うことができる。しばしば「遺伝
子治療」と称される前記した治療方法において、治療に
用いられるポリペプチドを対象中において内在的に得る
こともできる。よって、例えば、レトロウイルスプラス
ミドベクターを用いて対象由来の細胞をＤＮＡまたはＲ
ＮＡなどのポリヌクレオチドで操作し、ポリペプチドを
エクスビボでコードしてもよい。次いで、細胞を対象に
導入する。

【００６６】

【実施例】以下の実施例は、特記する場合を除き、当業
者に周知かつ慣用的な、標準方法を用いて行う。実施例
は例示であって、本発明を限定するものではない。

【００６７】実施例１ ヒト・ニューロテンシン・２型
のクローニング法 部分的クローン（HGS：HFBPT３０、ATG１００３４、９
８４ｂｐ）をHuman Genome Science databaseをランダ
ムにサーチすることで同定した。該クローンを完全に配
列決定し、このクローンが部分的クローンであることが
わかった。このクローンは５’コーディング領域を欠い
ていた。BLAST分析によれば、このクローンがラット・
ニューロテンシン・２型レセプターと有意な配列相同性
を有した。欠失５’領域をクローンするために、前記の
ヒト・クローンの配列（５’−CGGCAG CCA GCA GAT GAC
ATA CAT GAC−３’（配列番号３））に基づくアンチセ
ンス・オリゴおよび公開されているラット配列（Geneba
nk Accession＃X97121；プライマー：５’−ATG GAG AC
C AGC AGT CCG TGG CCT CCG AGG−３’(配列番号４)）
を、Human Whole Brain ｃDNA ライブラリー（Gibco、B
RL Bethsda、MD）とのPCR反応に付した。得られた９０
０ｂｐ産物をゲル精製し、その配列を分析し、そのコー
ディング配列を５’末端でさらに３５０ｂｐ伸長させ
た。ラット・オリゴを用いた際のギャップを充填するた
めに、新たなPCR反応を用いて、HFPBT３０特異的アンチ
センスプライマーおよびベクター特異的センスプライマ
ーを用いるPCR（センスプライマーＡ：５’−CCTCCGGAC
TCTAGCCTAGGCTTTTGC−３’（配列番号５）およびＢ：
５’−GCCTGCAGGTACCGGTCCGGAATTCCC−３’（配列番号
６）；アンチセンスプライマーＡ：５’−GGTAGTGGAACC
ACACGAAGCTGTAGACTTC−３’（配列番号７）およびＢ：
５’−CTTCAGCACCACGTGCACGGACAGCGC−３’（配列番号
８））によりさらなるフラグメントを得、このフラグメ
ントの配列情報を確認し、欠失している５’領域を完全
なものとした。さらなるスプライス変種をサーチし、完
全長の遺伝子を確認するために、PCRプライマーを種々
の組織からの６種のｃDNAライブラリーと共に用いた
（センスプライマーＡ：５’−GAGCGGAATTCCATGGAAACCA
GCAGC−３’（配列番号９）およびＢ：５’−GCCCATGGC
CGTCATCATGGGGCAGAAG−３’（配列番号１０）；および
アンチセンスプライマーＡ：５’−GAGCATCTACTACGCACC
AGGTTCTGTG−３’（配列番号１１）およびＢ：５’−CA
GGTACGTAGCAGTACATGAGCCTGCGGG−３’（配列番号１
２））。PCR分析および配列確認により、ラット・ニュ
ーロテンシン・２型と共直線的である最長クローン（配
列番号１および２）に加えて、３種の別のスプライス変
種が見つかった。第１の変種は配列番号１のヌクレオチ
ド８１８−８８５で６７ｂｐの欠失がある。第２の変種
は配列番号１のヌクレオチド６１０−８８４で２７６ｂ
ｐの欠失がある。第３の変種は配列番号１のヌクレオチ
ド６１０−７０１で８９ｂｐの欠失がある。

【００６８】実施例２： 哺乳動物細胞発現 本発明のレセプターを、ヒト・胎児腎２９３（ＨＥＫ２
９３）細胞または付着性ｄｈｆｒＣＨＯ細胞のいずれか
で発現させる。レセプター発現を最大にするために、典
型的には、ｐＣＤＮまたはｐＣＤＮＡ３ベクター中に挿
入する前に、すべての５'および３'非翻訳領域（ＵＴＲ
ｓ）をレセプターｃＤＮＡから除去する。リポフェクチ
ンによって細胞を個々のレセプターｃＤＮＡでトランス
フェクションし、４００ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８の存在下
選択する。選択後３週間で、個々のクローンを拾い上
げ、さらなる解析を行う。ベクターのみでトランスフェ
クションしたＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞を負の対照
として用いる。個々のレセプターを安定に発現する細胞
系を単離するために、典型的に約２４個のクローンを選
択し、次いで、ノザンブロット解析によって解析する。
一般に、レセプターｍＲＮＡは、解析したＧ４１８耐性
クローンの約５０％において検出される。

【００６９】実施例：３ 結合および機能アッセイのた
めのリガンドバンク 推定の２００を超えるレセプターリガンドのバンクをス
クリーニングのために作成した。そのバンクは、ヒト・
７トランスメンブラン（７−トランスメンブラン）レセ
プターを介して作用することが知られているトランスミ
ッター、ホルモンおよびケモカイン；ヒト・７−トラン
スメンブランレセプターの推定アゴニストであってもよ
い天然化合物、哺乳動物での対応物がまだ同定されてい
ない非哺乳動物の生物学的活性ペプチド；および、天然
には見いだされないが、未知の天然リガンドとともに７
−トランスメンブランレセプターを活性化する化合物を
含んでなる。最初に、このバンクを使用して、結合アッ
セイと同様、２機能性（即ち、カルシウム、ｃＡＭＰ、
マイクロフィジオメーター、卵母細胞電気生理学など以
下参照）を用いて、既知のリガンドのためのレセプター
をスクリーニングする。

【００７０】実施例４： リガンド結合アッセイ リガンド結合アッセイは、レセプター薬理学を確認する
ための直接的方法を提供し、高処理量フォーマットに適
合する。精製されたレセプターリガンドは、結合研究の
ために高比活性（５０-２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）に放
射性ラベルされる。次いで、放射性ラベルの工程がリガ
ンドのレセプターに対する活性を消失させないように測
定が行われる。緩衝液、イオン、ｐＨおよびヌクレオチ
ドのごとき他のモジュレーターに関するアッセイ条件が
最適化され、膜および全細胞レセプター供給源のいずれ
についても使用可能なシグナル対ノイズ比を確立する。
これらのアッセイについて、全結合放射活性から過剰の
非ラベル競合リガンドの存在下で測定された放射活性を
引いたものとして、特異的なレセプター結合が定義され
る。可能ならば、一つ以上のリガンドを使用して、残存
する非特異的結合を定義する。

【００７１】実施例５： アフリカツメガエル（Xenopu
s）卵母細胞における機能アッセイ 標準的方法に従って、ＲＮＡポリメラーゼを用いて、本
発明のレセプターｃＤＮＡをコードする直鎖状にされた
プラスミド鋳型からのキャップＲＮＡ転写物をインビト
ロで合成する。インビトロ転写物を最終濃度０.２ｍｇ
／ｍｌになるように水に懸濁する。成体メスのヒキガエ
ルから卵巣葉を取り出し、ステージＶの脱胞卵母細胞を
得て、次いで、マイクロインジェクション装置を用い
て、ＲＮＡ転写物（１０ｎｇ／卵母細胞）を５０ｎｌの
ボーラスで注入する。２つの電極電圧クランプを使用し
て、アゴニスト曝露に応答した個々のアフリカツメガエ
ル卵母細胞からの電流を測定する。室温でＣａ²⁺不含の
バース培地（Barth's medium）中で記録する。アフリカ
ツメガエルの系は、既知のリガンドおよび活性化リガン
ドについて組織／細胞抽出物をスクリーニングするため
に使用することができる。

【００７２】実施例６： 微小生理機能測定アッセイ 多種のセカンドメッセンジャー系の活性化により、細胞
から少量の酸の放出が起こる。生成した酸は、主に、細
胞内シグナル伝達工程にエネルギーを供給するために必
要な代謝活性を増大させる。細胞の周りの培地のｐＨ変
化は非常に小さいが、CYTOSENSOR微小生理機能測定器
（Molecular Devices Ltd., Menlo Park,CA）によって
検出可能である。かくして、CYTOSENSORは、本発明のレ
セプターに共役したＧタンパク質のごとく、細胞内シグ
ナル伝達経路を使用するエネルギーに共役しているレセ
プターの活性化を検出することができる。

【００７３】実施例７： 抽出物／細胞上清スクリーニ
ング 多数の哺乳動物レセプターが存在し、それらについて未
だに同種の活性化リガンド（アゴニスト）は残っていな
い。かくして、これらのレセプターの活性リガンドは、
現在までに同定されたリガンドバンク中に包含されてい
なくてもよい。従って、天然のリガンドを同定するため
に組織抽出物に対して本発明の７−トランスメンブラン
レセプターを（カルシウム、ｃＡＭＰ、微小生理機能測
定器、卵母細胞電気生理学など機能的スクリーニングを
使用して）機能的にもスクリーニングする。活性化リガ
ンドが単離同定されるまで、陽性の機能応答を生じる抽
出物を連続して分画することができる。

【００７４】実施例８： カルシウムおよびｃＡＭＰの
機能アッセイ ＨＥＫ２９３細胞において発現している７−トランスメ
ンブランレセプターは、ＰＬＣの活性化およびカルシウ
ムの移動、および／またはｃＡＭＰ刺激または阻害に機
能的に共役していることが示されている。レセプタート
ランスフェクションまたはベクター制御細胞におけるＨ
ＥＫ２９３細胞の基礎的カルシウムレベルは、正常には
１００ｎＭないし２００ｎＭの範囲内で観察された。組
換えレセプターを発現しているＨＥＫ２９３細胞をｆｕ
ｒａ２で負荷し、カルシウム移動を誘導するアゴニスト
について、１日で１５０を超えるリガンドを選択し、ま
たは組織／細胞抽出物を評価する。同様に、組換えレセ
プターを発現しているＨＥＫ２９３細胞を、標準的ｃＡ
ＭＰ定量アッセイを用いてｃＡＭＰ産生の刺激または阻
害について評価する。応答がレセプターを発現している
トランスフェクションされた細胞でのみ起こっているの
かどうかを調べるために、ベクター制御細胞において、
カルシウムの一時的変動またはｃＡＭＰ変動を引き起こ
すアゴニストを試験する。

【００７５】

【配列表】

（１）一般的情報 （ｉ）出願人： バーグスマ，ダーク シャボン，ウスマン （ｉｉ）発明の名称： 新規なヒト・ニューロテンシン
・レセプター２型 （ｉｉｉ）配列の数：１２ （ｉｖ）郵送先 （Ａ）名称： スミスクライン・ビーチャム・コーポレ
イション （Ｂ）通り名：スウェードランド・ロード・７０９ （Ｃ）都市名： キング・オブ・プルシア （Ｄ）州名：ＰＡ （Ｅ）国名： （Ｆ）郵便番号：１９４０６ （ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム： （Ａ）媒体タイプ：ディスケット （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭコンパチブル （Ｃ）オペレーティング・システム：ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：Window Version２．０用のFastＳ
ＥＯ （ｖ）現出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日：１９９７年４月０２日 （Ｃ）分類番号： （ｖｉ）先の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （ｖｉｉｉ）代理人情報： （Ａ）名称：キング，ウィリアム・テイ （Ｂ）登録番号：３０９５４ （Ｃ）代理人等における処理番号：ＧH５００２０ （ｉｘ）テレコミュニケーション情報： （Ａ）電話番号：６１０−２７０−５５１５ （Ｂ）ファックス番号：６１０−２７０−５０９０ （Ｃ）テレックス番号：

【００７６】（２）配列番号１に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１３４２塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号１： GAATTCGGCT TACTCACTAT AGGGCTCGAG CGGCCGCCCG GGCAGGTGCG GGATGGAAAC 60 CAGCAGCCCG CGGCCCCCGC GGCCCAGCTC CAACCCGGGG CTGAGCCTGG ACGCCCGGCT 120 GGGCGTGGAC ACTCACCTCT GGGCCAAGGT GCTGTTCACC GCGCTCTACG CACTCATCTG 180 GGCGCTGGGC GCGGCGGGCA ATGCGCTGTC CGTGCACGTG GTGCTGAAGG CGCGGGCCGG 240 GCGCGCGGGG CGCCTGCGCC ACCACGTGCT CAGCCTGGCG CTCGCGGGCC TGCTGCTGCT 300 GCTGGTCGGC GTGCCGGTGG AACTCTACAG CTTCGTGTGG TTCCACTACC CCTGGGTCTT 360 CCGCGACCTG GGCTGCCGCG GCTACTACTT CGTGCACGAG CTGTGCGCCT ACGCCACGGT 420 GCTGAGCGTG GCAGGCCTGA GCGCCGAGCG CTGCCTAGCC GTGTGCCAGC CCCTGCGTGC 480 CCGCAGCCTG CTGACGCCAC GCCGGACCCG GTGGCTGGTG GCGCTCTCGT GGGCCGCCTC 540 GCTCGGCCTC GCCCTGCCCA TGGCCGTCAT CATGGGGCAG AAGCACGAAC TCGAGACGGC 600 GGACGGGGAG CCGGAGCCCG CCTCGCGAGT GTGCACGGTG CTGGTGAGCC GCACCGCGCT 660 CCAAGTCTTT ATCCAGGAAG CCATCGTGGT CATGTATGTC ATCTGCTGGC TGCCGTACCA 720 TGCCCGCAGG CTCATGTACT GCTACGTACC TGATGACGCG TGGACTGACC CACTGTACAA 780 TTTCTACCAC TACTTCTACA TGGTGACCAA CACACTTTTC TACGTCAGCT CAGCTGTGAC 840 TCCTCTTCTC TACAACGCCG TGTCCTCCTC CTTCAGAAAA CTCTTCCTGG AAGCCGTCAG 900 CTCCCTGTGT GGAGAGCACC ACCCCATGAA GCGGTTACCC CCGAAGCCCC AGAGTCCCAC 960 CCTAATGGAT ACAGCTTCAG GCTTTGGGGA TCCCCCAGAA ACCCGGACCT GAATGTAATG 1020 CAAGAATGAA CAGAACAAGC AAAATGACCA GCTGCTTAGT CACCTGGCAA AGCAGGTGAG 1080 CAACCTCATC ACTAATCATT CAAGCTTCGC AGCCAGGGCG ACTTCTATCA ACCCCTGCTC 1140 TGCTGAGAAC CATCAAGCGC AGGGAAGCCA CGTGACCCCT CCTAGCCTCA GGCTCCCTCG 1200 TCTGTGTAGT GGAGATAAAG AACAGCACCC ATCTCTTAGT GTTGCCTGAG ACTAAAGTGC 1260 TTAGCACAGA ACCTGGTGCG TAGTAGATGC TCAATAAATT TTTGCTGGCA AAAAAAAAAA 1320 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AA 1342

【００７７】（２）配列番号２に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３１９アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子の型：タンパク質 （ｘｉ）配列の記載：配列番号２： Met Glu Thr Ser Ser Pro Arg Pro Pro Arg Pro Ser Ser Asn Pro Gly 1 5 10 15 Leu Ser Leu Asp Ala Arg Leu Gly Val Asp Thr His Leu Trp Ala Lys 20 25 30 Val Leu Phe Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Ile Trp Ala Leu Gly Ala Ala 35 40 45 Gly Asn Ala Leu Ser Val His Val Val Leu Lys Ala Arg Ala Gly Arg 50 55 60 Ala Gly Arg Leu Arg His His Val Leu Ser Leu Ala Leu Ala Gly Leu 65 70 75 80 Leu Leu Leu Leu Val Gly Val Pro Val Glu Leu Tyr Ser Phe Val Trp 85 90 95 Phe His Tyr Pro Trp Val Phe Arg Asp Leu Gly Cys Arg Gly Tyr Tyr 100 105 110 Phe Val His Glu Leu Cys Ala Tyr Ala Thr Val Leu Ser Val Ala Gly 115 120 125 Leu Ser Ala Glu Arg Cys Leu Ala Val Cys Gln Pro Leu Arg Ala Arg 130 135 140 Ser Leu Leu Thr Pro Arg Arg Thr Arg Trp Leu Val Ala Leu Ser Trp 145 150 155 160 Ala Ala Ser Leu Gly Leu Ala Leu Pro Met Ala Val Ile Met Gly Gln 165 170 175 Lys His Glu Leu Glu Thr Ala Asp Gly Glu Pro Glu Pro Ala Ser Arg 180 185 190 Val Cys Thr Val Leu Val Ser Arg Thr Ala Leu Gln Val Phe Ile Gln 195 200 205 Glu Ala Ile Val Val Met Tyr Val Ile Cys Trp Leu Pro Tyr His Ala 210 215 220 Arg Arg Leu Met Tyr Cys Tyr Val Pro Asp Asp Ala Trp Thr Asp Pro 225 230 235 240 Leu Tyr Asn Phe Tyr His Tyr Phe Tyr Met Val Thr Asn Thr Leu Phe 245 250 255 Tyr Val Ser Ser Ala Val Thr Pro Leu Leu Tyr Asn Ala Val Ser Ser 260 265 270 Ser Phe Arg Lys Leu Phe Leu Glu Ala Val Ser Ser Leu Cys Gly Glu 275 280 285 His His Pro Met Lys Arg Leu Pro Pro Lys Pro Gln Ser Pro Thr Leu 290 295 300 Met Asp Thr Ala Ser Gly Phe Gly Asp Pro Pro Glu Thr Arg Thr 305 310 315

【００７８】（２）配列番号３に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２７塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号３： ＣＧＧＣＡＧＣＣＡＧ ＣＡＧＡＴＧＡＣＡＴ ＡＣＡＴＧＡＣ
２７

【００７９】（２）配列番号４に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号４： ATGGAGACCA GCAGTCCGTG GCCTCCGAGG 30

【００８０】（２）配列番号５に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２７塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号５： CCTCCGGACT CTAGCCTAGG CTTTTGC 27

【００８１】（２）配列番号６に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２７塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号６： GCCTGCAGGT ACCGGTCCGG AATTCCC 27

【００８２】（２）配列番号７に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号７： GGTAGTGGAA CCACACGAAG CTGTAGACTT C 31

【００８３】（２）配列番号８に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２７塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号８： CTTCAGCACC ACGTGCACGG ACAGCGC 27

【００８４】（２）配列番号９に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２７塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号９： GAGCGGAATT CCATGGAAAC CAGCAGC 27

【００８５】（２）配列番号１０に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号１０： GCCCATGGCC GTCATCATGG GGCAGAAG 28

【００８６】（２）配列番号１１に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号１１： GAGCATCTAC TACGCACCAG GTTCTGTG 28

【００８７】（２）配列番号１２に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号１２： ＣＡＧＧＴＡＣＧＴＡ ＧＣＡＧＴＡＣＡＴＧ ＡＧＣＣＴＧＣＧＧＧ
３０

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/68 Ａ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｔ 33/50 33/68 33/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ウスマン・シャボン アメリカ合衆国19081ペンシルベニア州ス ワースモアー、サウス・スワースモアー・ アベニュー225番

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号２のヒト・ニューロテンシン・
   ２型のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とそ
   の全長にわたって少なくとも８８％の同一性を有するヌ
   クレオチド配列、または該ヌクレオチド配列に相補的な
   ヌクレオチド配列からなる単離されたポリヌクレオチ
   ド。
2. 【請求項２】 ＤＮＡまたはＲＮＡである請求項１記載
   のポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 ヌクレオチド配列が配列番号１に含まれ
   るヌクレオチド配列と少なくとも８８％同一である請求
   項1記載のポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 ヌクレオチド配列が配列番号１に含まれ
   るヒト・ニューロテンシン・２型のポリペプチドをコー
   ドする配列を有する請求項３記載のポリヌクレオチド。
5. 【請求項５】 配列番号1のポリヌクレオチドである請
   求項３記載のポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 発現系を有してなるＤＮＡまたはＲＮＡ
   分子であって、発現系が適合可能な宿主細胞中にある場
   合に、その発現系が配列番号2のポリペプチドと少なく
   とも８８％の同一性を有するアミノ酸配列を有してなる
   ヒト・ニューロテンシン・２型のポリペプチドを産生す
   ることができるＤＮＡまたはＲＮＡ分子。
7. 【請求項７】 請求項６の発現系を有してなる宿主細
   胞。
8. 【請求項８】 ヒト・ニューロテンシン・２型のポリペ
   プチドの産生法であって、請求項７の宿主を、そのポリ
   ペプチドを産生するのに十分な条件下で培養し、そのポ
   リペプチドを培養物から回収することからなる産生法。
9. 【請求項９】 ヒト・ニューロテンシン・２型のポリペ
   プチドを産生する細胞の産生法であって、宿主細胞が、
   適当な培養条件下、ヒト・ニューロテンシン・２型のポ
   リペプチドを産生するように、該宿主細胞を請求項６の
   発現系で形質転換またはトランスフェクションすること
   からなる方法。
10. 【請求項１０】 配列番号２のアミノ酸配列とその全長
    にわたって少なくとも８８％同一であるアミノ酸配列か
    らなるヒト・ニューロテンシン・２型のポリペプチド。
11. 【請求項１１】 配列番号２のアミノ酸配列からなる請
    求項１０記載のポリペプチド。
12. 【請求項１２】 請求項１０のヒト・ニューロテンシン
    ・２型のポリペプチドに免疫特異的な抗体。
13. 【請求項１３】 請求項１０のヒト・ニューロテンシン
    ・２型のポリペプチドの活性または発現を強化する必要
    性のある対象の治療法であって、 （ａ）該対象に治療上有効量の該レセプターに対するア
    ゴニストを投与し；および／または（ｂ）インビボにて
    該レセプター活性を生じさせるような形態にて、請求項
    １のポリヌクレオチドを該対象に付与することからなる
    方法。
14. 【請求項１４】 請求項１０のヒト・ニューロテンシン
    ・２型のポリペプチドの活性または発現を阻害する必要
    性のある対象の治療法であって、 （ａ）該対象に治療上有効量の該レセプターに対するア
    ンタゴニストを投与し；および／または（ｂ）該対象に
    該レセプターをコードするヌクレオチド配列の発現を阻
    害する核酸分子を投与し；および／または（ｃ）該対象
    にそのリガンドについて該レセプターと競合する治療上
    有効量のポリペプチドを投与することからなる方法。
15. 【請求項１５】 対象での請求項１０のヒト・ニューロ
    テンシン・２型のポリペプチドの発現または活性に関連
    付けられる対象の疾患または罹病し易さの診断方法であ
    って、 （ａ）該対象のゲノム中のヒト・ニューロテンシン・２
    型のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列におけ
    る変異の有無を測定し；および／または（ｂ）該対象か
    ら由来の試料中のヒト・ニューロテンシン・２型のポリ
    ペプチドの発現の存在または量について分析することか
    らなる方法。
16. 【請求項１６】 請求項１０のヒト・ニューロテンシン
    ・２型のポリペプチドに対するアゴニストの同定方法で
    あって、 （ａ）請求項９で産生される細胞を候補化合物と接触さ
    せ、 （ｂ）候補化合物がヒト・ニューロテンシン・２型のポ
    リペプチドの活性化により生じるシグナルを発するかど
    うかを測定することからなる方法。
17. 【請求項１７】 請求項１６の方法により同定されるア
    ゴニスト。
18. 【請求項１８】 請求項１０のヒト・ニューロテンシン
    ・２型のポリペプチドに対するアンタゴニストの同定方
    法であって、 （ａ）請求項９で産生される細胞をアゴニストと接触さ
    せ、 （ｂ）該アゴニストにより生じるシグナルが候補化合物
    の存在で減じるかどうかを測定することからなる方法。
19. 【請求項１９】 請求項１８の方法により同定されるア
    ンタゴニスト。