JPH10337182A - 新規なヒト７−トランスメンブランレセプターをコードするｃＤＮＡクローンＨＡＣＣＨ９４ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規ヒト７−膜貫通レセプターのＨＡＣＣＨ
９４ポリペプチドおよびこれをコードするｃＤＮＡを提
供する。 【解決手段】 ＨＡＣＣＨ９４ポリペプチドおよびポリ
ヌクレオチド、ならびにそれらの製造方法、さらに感染
症等の治療プロトコールの設計におけるＨＡＣＣＨ９４
ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの使用。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新たに同定された
ポリヌクレオチド、それによりコードされるポリペプチ
ド、このようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの
使用およびその生成に関する。さらに詳しくは、本発明
のポリヌクレオチドおよびポリペプチドはＧ−タンパク
質結合レセプター（以下、ＨＡＣＣＨ９４という）に関
する。本発明はまた、かかるポリヌクレオチドおよびポ
リペプチドの作用を阻害または活性化することに関す
る。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】医学
的に重要な多くの生物学的プロセスが、Ｇタンパク質お
よび／またはセカンドメッセンジャー、例えばｃＡＭＰ
が関係しているシグナルトランスダクション経路に関係
するタンパク質によって媒介されることはよく確立され
ている（Lefkowitz, Nature, 1991, 351:353-354）。本
明細書中、これらのタンパク質は、Ｇタンパク質または
ＰＰＧタンパク質とともに経路に関係しているタンパク
質をいう。これらのタンパク質のいくつかの例は、アド
レナリン作動性因子およびドパミンのためのタンパク質
のごときＧＰＣレセプター（Kobilka, B. K. et al.,Pr
oc. Natl. Acad. Sci., USA, 1987, 84:46-50;Kobilka,
B. K. et al., Science, 1987, 238:650-656;Bunzow,
J. R., et al., Nature, 1988, 336:783-787）、Ｇタン
パク質そのもの、エフェクター・タンパク質、例えば、
ホスホリパーゼＣ、アデニルサイクラーゼおよびホスホ
ジエステラーゼ、および、アクチュエイター・タンパク
質、例えばプロテインキナーゼＡおよびプロテインキナ
ーゼＣ（Simon, M. I., et al., Science, 1991, 252:8
02-8）を包含する。

【０００３】例えば、シグナルトランスダクションの一
つの形態において、ホルモン結合の効果は、酵素である
アデニレートサイクラーゼの細胞内部での活性化であ
る。ホルモンによる酵素の活性化は、ヌクレオチドＧＴ
Ｐの存在に依存している。ＧＴＰはホルモン結合にも影
響する。Ｇタンパク質は、アデニレートサイクラーゼに
対するホルモンレセプターに結合する。Ｇタンパク質
は、ホルモンレセプターによって活性化されると結合型
ＧＤＰをＧＴＰに交換することが示された。ついで、有
ＧＴＰ形態はアデニレートサイクラーゼに結合して活性
化する。Ｇタンパク質自体によって触媒されるＧＴＰの
ＧＤＰへの加水分解は、Ｇタンパク質をもとの不活性形
態に戻す。かくしてＧタンパク質は、レセプターからエ
フェクターへシグナルを伝達する媒体のごとき、およ
び、シグナルの持続期間を制御する時計のごとき２つの
役割を果たしている。

【０００４】Ｇタンパク質結合レセプターの膜タンパク
質遺伝子スーパーファミリーは、７つの推定膜貫通ドメ
インを有するものとして特徴づけられる。そのドメイン
は細胞外ループまたは細胞質ループによって連結される
膜貫通αヘリックスを表すと考えられている。Ｇタンパ
ク質結合レセプターは、ホルモンレセプター、ウイルス
レセプター、成長因子レセプターおよび神経レセプター
のごとき、広範囲の生物学的活性レセプターを包含す
る。

【０００５】Ｇタンパク質結合レセプター（もしくは７
ＴＭレセプターとして知られているもの）は、約２０な
いし３０個のアミノ酸のこれら７つの保存的疎水的スト
レッチを包含し、少なくとも８つの多様な親水性ループ
を連結するものとして特徴づけられる。レセプター結合
Ｇタンパク質ファミリーは、精神病および神経疾患を治
療するために使用される向精神薬に結合するドパミンレ
セプターを包含する。このファミリーのメンバーの他の
例は、カルシトニン、アドレナリン様物質、エンドセリ
ン、ｃＡＭＰ、アデノシン、ムスカリン様物質、アセチ
ルコリン、セロトニン、ヒスタミン、トロンビン、キニ
ン、卵胞刺激ホルモン、オプシン、内皮細胞分化遺伝子
-１、ロドプシン、オドラント、およびサイトメガロウ
イルスレセプターを包含するが、これらに限定されな
い。

【０００６】ほとんどのＧタンパク質結合レセプター
は、機能的タンパク質構造を安定化すると考えられてい
るジスルフィド結合を形成する最初の２つの細胞外ルー
プの各々において単一の保存的システイン残基を有す
る。７つの膜貫通領域を、ＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３、Ｔ
Ｍ４、ＴＭ５、ＴＭ６およびＴＭ７と命名する。ＴＭ３
はシグナルトランスダクションに関係している。システ
イン残基のリン酸化および脂質付加（パルミチル化また
はファルネシル化）は、いくつかのＧタンパク質結合レ
セプターのシグナルトランスダクションに影響し得る。
ほとんどのＧタンパク質結合レセプターは、第３の細胞
質ループおよび／またはカルボキシ末端に潜在的リン酸
化部位を含有する。βアドレナリンレセプターのごとき
いくつかのＧタンパク質結合レセプターについて、プロ
テインキナーゼＡおよび／または特異的レセプターキナ
ーゼによるリン酸化がレセプターの脱感作を媒介する。

【０００７】いくつかのレセプターについては、Ｇタン
パク質結合レセプターのリガンド結合部位は、いくつか
のＧタンパク質結合レセプター膜貫通ドメインによって
形成される親水性ソケットを含んでなり、該ソケットは
Ｇタンパク質結合レセプターの疎水性残基によって取り
囲まれていると考えられている。各Ｇタンパク質結合レ
セプター膜貫通ヘリックスの親水性側は内向きになって
おり、極性のリガンド結合部位を形成すると仮定されて
いる。ＴＭ３は、いくつかのＧタンパク質結合レセプタ
ーにおいて、ＴＭ３アスパラギン酸残基のごときリガン
ド結合部位を有することにＴＭ３が関係している。複数
のＴＭ５セリン、ＴＭ６アスパラギン、および、ＴＭ６
またはＴＭ７のフェニルアラニンまたはチロシンもリガ
ンド結合に関係している。

【０００８】Ｇタンパク質結合レセプターは、様々な細
胞内酵素、イオンチャンネルおよび輸送体とヘテロ３量
体Ｇタンパク質によって細胞内で結合している可能性が
ある（Johnson et al., Endoc. Rev., 1989, 10:317-33
1参照）。異なるＧタンパク質αサブユニットは、特定
のエフェクターを優先的に刺激して、細胞内の様々な生
物学的機能をモジュレートする。Ｇタンパク質結合レセ
プターの細胞質側残基のリン酸化は、いくつかのＧタン
パク質結合レセプターのＧタンパク質結合調節のための
重要な機構として同定されている。Ｇタンパク質結合レ
セプターは、哺乳動物宿主内の多数の部位において見い
だされる。過去１５年間、７膜貫通（７ＴＭ）レセプタ
ーを標的にした３５０種近くの治療薬が市場に導入され
成功している。

【０００９】これは、これらレセプターが治療標的とし
て確立され、かつ立証された歴史を有することを示して
いる。限定するものではないが、細菌、真菌、原生動物
およびウイルス感染、詳細には、ＨＩＶ−１またはＨＩ
Ｖ−２によって引き起こされる感染；痛み；腫瘍；拒食
症；過食症；喘息；パーキンソン病；急性心不全；低血
圧；高血圧；閉尿；骨粗鬆症；狭心症；心筋梗塞；潰
瘍；喘息；アレルギー；良性前立腺肥大；および、不安
症、精神分裂症、躁鬱病、精神錯乱、痴呆、重度の知恵
遅れ、ならびに、ハンチントン病またはジルス・デラ・
トレット（Gillesdela Tourett's）症候群のごとき運動
障害を含め、機能不全または疾患の予防、改善または矯
正において役割を果たしうる、さらなるレセプターを同
定および特徴付ける必要があるのは明らかである。

【００１０】

【課題を解決するための手段】一の態様において、本発
明はＨＡＣＣＨ９４ポリペプチドおよび組換え材料なら
びにその製法に関する。本発明の別の態様は、そのよう
なＨＡＣＣＨ９４ポリペプチドおよびポリヌクレオチド
を用いる方法に関する。かかる使用は、とりわけ、細
菌、真菌、原生動物およびウイルス感染、詳細には、Ｈ
ＩＶ−１またはＨＩＶ−２によって引き起こされる感
染；痛み；腫瘍；拒食症；過食症；喘息；パーキンソン
病；急性心不全；低血圧；高血圧；閉尿；骨粗鬆症；狭
心症；心筋梗塞；潰瘍；喘息；アレルギー；良性前立腺
肥大；および、不安症、精神分裂症、躁鬱病、精神錯
乱、痴呆、重度の知恵遅れ、ならびに、ハンチントン病
またはジルス・デラ・トレット（Gilles dela Tourett'
s）症候群のごとき運動障害の治療を包含する。さらに
別の態様において、本発明は、該発明により得られる材
料を用いてアゴニストおよびアンタゴニストを同定する
方法、およびＨＡＣＣＨ９４の平衡異常に付随する症状
をその同定した化合物を用いて治療することに関する。
本発明のさらに別の態様は不適当なＨＡＣＣＨ９４活性
またはレベルに伴う疾患を検出するための診断アッセイ
に関する。

【００１１】

【発明の実施の形態】

定義 以下の定義は、本明細書で汎用する用語の理解を容易に
するためのものである。「ＨＡＣＣＨ９４」は、とりわ
け、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するポリペ
プチドまたはその対立遺伝子変種をいう。「レセプター
の活性」または「レセプターの生物学的活性」とは、類
似の活性または改良された活性あるいは望ましくない副
作用の減じたこれらの活性を含め、該ＨＡＣＣＨ９４の
代謝的または生理学的機能をいう。該ＨＡＣＣＨ９４の
抗原的および免疫原的活性も含まれる。

【００１２】「ＨＡＣＣＨ９４遺伝子」とは、配列番号
１に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチ
ドまたはその対立遺伝子変種および／またはそれらの相
補物をいう。本明細書で用いる「抗体」は、ポリクロー
ナルおよびモノクローナル抗体、キメラ、１本鎖、およ
びヒト化抗体、ならびにＦａｂの産物または他の免疫グ
ロブリン発現ライブラリーを含め、Ｆａｂフラグメント
を包含する。「単離」とは、「人間の手により」天然の
状態から変えられたことを意味する。「単離」された組
成物または物質が天然に存在する場合、その本来の環境
から変えられるかもしくは取り除かれ、またはその両方
がなされたことを意味する。例えば、天然の状態で生存
動物に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは
「単離」されていないが、その天然状態で共存する物質
から分離されているその同一のポリヌクレオチドまたは
ポリペプチドは、本明細書に用いる用語である、「単
離」がなされている。

【００１３】「ポリヌクレオチド」とは、一般に、修飾
されていないＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾された
ＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい、いずれかのポリリ
ボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを
いう。「ポリヌクレオチド」は、一本鎖および二本鎖Ｄ
ＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、
一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、および一本鎖および二本鎖
領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖もしくはより典型的
には二本鎖、または一本鎖および二本鎖領域の混合物で
あってもよいＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分
子を包含するが、これに限定されるものではない。加え
て、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡま
たはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域をいう。ポ
リヌクレオチドなる用語はまた、一つまたはそれ以上の
修飾された塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡ、ならび
に安定性またはその他の理由で修飾された骨格を有する
ＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。「修飾された」塩基
は、例えば、トリチル化された塩基およびイノシンなど
の通常でない塩基を包含する。種々の修飾がＤＮＡおよ
びＲＮＡに対してなされている。よって、「ポリヌクレ
オチド」は、典型的には天然において見いだされるよう
な化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態のポリ
ヌクレオチド、ならびにウイルスおよび細胞に特徴的な
化学的形態のＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。また、
「ポリヌクレオチド」は、しばしばオリゴヌクレオチド
と称される比較的短いポリヌクレオチドも包含する。

【００１４】「ポリペプチド」は、ペプチド結合により
互いに結合している２個またはそれ以上のアミノ酸を有
してなるペプチドまたはタンパク質あるいは修飾された
ペプチド結合により互いに結合している２個またはそれ
以上のアミノ酸を有してなるペプチドまたはタンパク
質、すなわち、ペプチドアイソスターをいう。「ポリペ
プチド」は、通常、ペプチド、オリゴペプチドまたはオ
リゴマーと称される短鎖、およびタンパク質と称される
長鎖の両方をいう。ポリペプチドは遺伝子によりコード
された２０種のアミノ酸とは異なるアミノ酸を含有して
もよい。「ポリペプチド」は、翻訳後プロセッシングな
どの自然の工程により、または当業者に周知の化学修飾
技法により修飾されたアミノ酸配列を含有する。このよ
うな修飾は基本テキストにて、およびさらに詳細な研究
論文にて、ならびに膨大な研究文献において詳しく記載
されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およ
びアミノまたはカルボキシル末端を含め、ポリペプチド
のどこででも起こり得る。同一の型の修飾が所定のポリ
ペプチドの幾つかの部位で、同一または異なる程度で存
在し得ることは理解されよう。また、所定のポリペプチ
ドは多くの型の修飾を含んでいてもよい。ポリペプチド
はユビキチネーションの結果として分岐していてもよ
く、分岐しているかまたはしていない、環状であっても
よい。環状、分岐および分岐した環状ポリペプチドは翻
訳後の天然プロセスにより生じたものであってもよく、
または合成法により製造されたものであってもよい。修
飾は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、ア
ミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌ
クレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質
または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトー
ルの共有結合、交差架橋、環化、ジスルフィド結合形
成、脱メチル化、交差架橋共有結合形成、シスチン形
成、ピログルタメート形成、ホルミル化、ガンマ−カル
ボキシル化、糖鎖形成、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキ
シル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、
タンパク質分解的プロセッシング、リン酸化、プレニル
化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化な
どのトランスファーＲＮＡ媒介のタンパク質へのアミノ
酸付加、ならびにユビキチネーションを包含する。例え
ば、PROTEINS‐STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES、
第２版、T.E.Creighton、W.H.Freemanand Company、New
York（1993）およびPOSTTRANSLATIONAL COVALENT MODI
FICATION OF PROTEINS、B.C.Johnson編、Academic Pres
s、New York（1983）のWold,F.、Posttranslational Pr
otein Modifications：Perspectives and Prospects、1
〜12頁；Seifterら、“Analysis for protein modifica
tions and nonproteincofactors”、Meth.Enzymol. 18
2：626-646（1990）およびRattanら、“ProteinSynthes
is：Posttranslational Modifications and Aging"、An
n.N.Y.Acad.Sci.663：48-62（1992）を参照のこと。

【００１５】本明細書で用いる「変種」なる用語は、各
々、対照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異な
るが、本質的な特性は保持している、ポリヌクレオチド
またはポリペプチドである。典型的なポリヌクレオチド
の変種は、別の対照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド
配列が異なる。変種のヌクレオチド配列における変化
は、対照ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプ
チドのアミノ酸配列と変わっていてもよく、変わってい
なくてもよい。ヌクレオチドの変化は、後記するよう
に、対照配列によりコードされるポリペプチドにおいて
アミノ酸置換、付加、欠失、融合および末端切断をもた
らしうる。典型的なポリペプチドの変種は、別の対照ポ
リペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般に、差異
は、対照ポリペプチドおよび変種の配列が、全体的に極
めて類似しており、多くの領域で同一であるように限定
される。変種および対照ポリペプチドは、１またはそれ
以上の置換、付加、欠失のいずれかの組み合わせによ
り、アミノ酸配列にて異なっていてもよい。置換または
挿入されたアミノ酸残基は、遺伝暗号によりコードされ
たものであってもなくてもよい。ポリヌクレオチドまた
はポリペプチドの変種は、対立遺伝子変種のような天然
物であってもよく、または天然に発生することが知られ
ていない変種であってもよい。ポリヌクレオチドおよび
ポリペプチドの天然に生じない変種は、突然変異誘発技
術により、または直接的合成により製造できる。

【００１６】「同一性」は、ヌクレオチド配列またはア
ミノ酸配列のある程度の同一性をいう。一般に、配列は
最高の対合が得られるように配置される。「同一性」自
体は、当該分野にて認識されている意義を有しており、
公開されている方法を用いて計算することができる。例
えば、（COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY，Lesk,A.M.
編、Oxford University Press、New York、1988年；BIO
COMPUTING：INFORMATICS AND GENOME PROJECTS、Smith,
D.W.編、Academic Press、New York、1993年；COMPUTER
ANALYSIS OF SEQUENCE DATA，PARTＩ，Griffin,A.M.お
よびGriffin,H.G.編、Humana Press、New Jersey、1994
年；SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY，von He
inje,G.、Academic Press、1987年；およびSEQUENCE AN
ALYSIS PRIMER，Gribskov,M.およびDevereux,J.編、Ｍ
Stockton Press、New York、1991年）を参照のこと。二
つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の間の同
一性を測定するのに多数の方法があるが、「同一性」な
る用語は当業者に周知である（Carillo,H.およびLipto
n,D.，SIAM J.Applied Math.，48：1073（1988））。２
つの配列間の同一性または類似性を測定するために通常
用いられる方法は、Guide to Huge Computers、Martin
J. Bishop,編、Academic Press、San Diego、1994年、
およびCarillo,H.およびLipton,D.，SIAM J.Applied Ma
th.，48：1073（1988）に開示されている方法を包含す
るが、これらに限定されるものではない。同一性および
類似性を決定するための方法はコンピュータープログラ
ムに集成されている。二つの配列間の同一性および類似
性を測定するための好ましいコンピュータープログラム
法は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux,J.ら、N
ucleic Acids Research 12（1）：387（1984））、BLAS
TP、BLASTN、FASTA（Atschul,S.F.ら、J.Molec.Biol. 2
15：215-403（1990））を包含するが、これらに限定さ
れるものではない。

【００１７】一例として、配列番号１の対照ヌクレオチ
ド配列に対して少なくとも、例えば９５％の「同一性」
を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
は、そのポリヌクレオチド配列が配列番号１の対照ヌク
レオチド配列のヌクレオチド各１００個当たり５個まで
の点突然変異を有していてもよいことを除き、ポリヌク
レオチドのヌクレオチド配列が対照配列と同一であるこ
とを意図とする。言い換えれば、対照ヌクレオチド配列
と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有す
るポリヌクレオチドを得るためには、その対照配列にお
けるヌクレオチドの５％までが欠失または別のヌクレオ
チドで置換されていてもよく、または対照配列における
全ヌクレオチドの５％までの数のヌクレオチドが対照配
列中に挿入されていてもよい。対照配列のこれらの変異
は、対照ヌクレオチド配列の５’または３’末端位置
で、またはそれら末端位置の間のどこで起こってもよ
く、対照配列中のヌクレオチド間に個々に、または対照
配列内の一またはそれ以上の隣接する基において点在し
てもよい。

【００１８】同様に、配列番号２の対照アミノ酸配列に
対して少なくとも、例えば９５％の同一性を有するアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドは、そのポリペプチド配
列が配列番号２の対照アミノ酸のアミノ酸各１００個当
たり５個までのアミノ酸変異を有していてもよいことを
除き、そのポリペプチドのアミノ酸配列が、対照配列と
同一であることを意図とする。言い換えれば、対照アミ
ノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸
配列を有するポリペプチドを得るためには、その対照配
列におけるアミノ酸残基の５％までが欠失または別のア
ミノ酸で置換されていてもよく、または対照配列におけ
る全アミノ酸残基の５％までの数のアミノ酸が対照配列
中に挿入されていてもよい。対照配列のこれらの変化は
対照アミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端位置
で、またはそれら末端位置の間のどこで起こってもよ
く、対照配列中の残基間に個々に、または対照配列内の
一またはそれ以上の隣接する基において点在してもよ
い。

【００１９】本発明のポリペプチド 一の態様において、本発明はＨＡＣＣＨ９４ポリペプチ
ドに関する。ＨＡＣＣＨ９４ポリペプチドは、配列番号
２のポリペプチド；ならびに配列番号２のアミノ酸配列
を含むポリペプチド；および配列番号２のアミノ酸配列
とその全長にわたって少なくとも８０％の同一性、より
好ましくは配列番号２と少なくとも９０％の同一性、さ
らにより好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する
アミノ酸配列を含むポリペプチドを包含する。ＨＡＣＣ
Ｈ９４ポリペプチドはまた、配列番号２のアミノ酸配列
を有するポリペプチドとその全長にわたって少なくとも
８０％の同一性、より好ましくは配列番号２と少なくと
も９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９
５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
も包含する。好ましくは、ＨＡＣＣＨ９４ポリペプチド
は少なくとも１つのレセプターの生物学的活性を示す。

【００２０】ＨＡＣＣＨ９４ポリペプチドは「成熟」タ
ンパク質の形態であってもよく、あるいは融合タンパク
質などの大型のタンパク質の一部であってもよい。分泌
またはリーダー配列、プロ配列、複数のヒスチジン残基
のごとき精製を促進する配列、または組換え操作の間の
安定性のための付加的な配列を含む付加的なアミノ酸配
列を含んでいることが有利なことがよくある。

【００２１】ＨＡＣＣＨ９４ポリペプチドの生物学的に
活性なフラグメントも本発明に含まれる。フラグメント
は、前記のＨＡＣＣＨ９４ポリペプチドのアミノ酸配列
のすべてではなく一部に対して全く同一であるアミノ酸
配列を有するポリペプチドである。ＨＡＣＣＨ９４ポリ
ペプチドでは、フラグメントは「独立している」もので
あるか、またはフラグメントが一部分もしくは一領域を
形成する大型のポリペプチド内に含まれていてもよく、
最も好ましくは単一の連続した領域として含まれる。本
発明のポリペプチドフラグメントの典型例は、例えば、
ＨＡＣＣＨ９４ポリペプチドのアミノ酸番号約１〜２
０、２１〜４０、４１〜６０、６１〜８０、８１〜１０
０および１０１から末端までからなるフラグメントを包
含する。この意味において、「約」とは、片方または両
端において、特記された数よりも数個、５個、４個、３
個、２個または１個だけ多いかまたは少ない範囲を含
む。

【００２２】好ましいフラグメントは、例えば、アミノ
末端を含む一連の残基が欠失、またはカルボキシル末端
を含む一連の残基が欠失、あるいは一方がアミノ末端で
もう一方がカルボキシル末端を含む２つの一連の残基が
欠失していること以外は、ＨＡＣＣＨ９４ポリペプチド
のアミノ酸配列を有する切断ポリペプチドを包含する。
また、アルファーヘリックスおよびアルファーヘリック
ス形成領域、ベータシートおよびベータシート形成領
域、ターンおよびターン形成領域、コイルおよびコイル
形成領域、親水領域、疎水領域、アルファー両親媒性領
域、ベータ両親媒性領域、可変領域、表面形成領域、基
質結合領域および高抗原性指標領域を有するフラグメン
トなどの構造的または機能的属性により特徴付けられる
フラグメントも好ましい。生物学的に活性なフラグメン
トは、類似活性または改良された活性を有する、あるい
は望ましくない活性を減じたものを含め、レセプター活
性を媒介する、フラグメントである。動物、とりわけヒ
トにおいて抗原的または免疫原的なフラグメントもまた
含まれる。

【００２３】好ましくは、これらのポリペプチドフラグ
メントはすべて、抗原的活性を含め、レセプターの生物
学的活性を保持している。定義した配列の変種およびフ
ラグメントも本発明の一部を形成する。好ましい変種
は、同類アミノ酸置換により対照と異なるものであり、
すなわち、一の残基が同様の特徴を有する他の残基によ
り置換されているものである。典型的なかかる置換は、
Ala、Val、LeuおよびIleの間：SerおよびThrの間；酸性
残基AspおよびGluの間；AsnおよびGlnの間；ならびに塩
基性残基LysおよびArgの間；あるいは芳香族残基Pheお
よびTyrの間におけるものである。数個、５ないし１０
個、１ないし５個、または１ないし２個のアミノ酸がい
ずれかの組み合わせで置換、欠失または付加されている
変種が特に好ましい。

【００２４】いずれか適当な方法にて本発明のＨＡＣＣ
Ｈ９４ポリペプチドを製造することができる。かかるポ
リペプチドは、単離された天然ポリペプチド、組換え技
法で製造されたポリペプチド、合成法により製造された
ポリペプチド、またはこれらの方法の組み合わせにより
産生されたポリペプチドを包含する。かかるポリペプチ
ドの製造手段は当該分野においてよく知られている。

【００２５】本発明のポリヌクレオチド 本発明のもう一つ別の態様はＨＡＣＣＨ９４ポリヌクレ
オチドに関する。ＨＡＣＣＨ９４ポリヌクレオチドは、
ＨＡＣＣＨ９４ポリペプチドをコードする単離ポリヌク
レオチドおよびフラグメント、ならびにそのポリヌクレ
オチドに密接に関連するポリヌクレオチドに関する。さ
らに詳細には、本発明のＨＡＣＣＨ９４ポリヌクレオチ
ドは、配列番号２のＨＡＣＣＨ９４ポリペプチドをコー
ドする配列番号1に示されるヌクレオチド配列を有して
なるポリヌクレオチド、および配列番号1の特定の配列
を有するポリヌクレオチドを包含する。ＨＡＣＣＨ９４
ポリヌクレオチドは、さらには、配列番号２のＨＡＣＣ
Ｈ９４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とそ
の全長にわたって少なくとも８０％の同一性を有するヌ
クレオチドを含むポリヌクレオチド、および配列番号１
のヌクレオチド配列とその全長にわたって少なくとも８
０％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオ
チドを包含する。この点において、少なくとも９０％同
一であるポリヌクレオチドが特に好ましく、少なくとも
９５％同一であるのがさらに好ましい。さらには、少な
くとも９７％同一であるのがより好ましく、少なくとも
９８−９９％の同一性を有するものがより一層好まし
く、少なくとも９９％の同一性を有するものが最も好ま
しい。さらに、増幅させるのにあるいはプローブまたは
マーカーとしての用途に用いることのできる条件下で、
ハイブリッド形成するのに配列番号１に含まれるヌクレ
オチド配列と十分な同一性を有するヌクレオチド配列も
ＨＡＣＣＨ９４ポリヌクレオチドに含められる。本発明
はまた、かかるＨＡＣＣＨ９４ポリヌクレオチドに相補
的なポリヌクレオチドを提供する。

【００２６】ヒトＨＡＣＣＨ９４をコードするｃＤＮＡ
を配列決定した結果に示されるように、本発明のＨＡＣ
ＣＨ９４は、Ｇ−タンパク質結合レセプターの他のタン
パク質に構造的に関連付けられる。ｃＤＮＡ配列は、３
８１個のアミノ酸のポリペプチドをコードする読み枠を
含んでいる。表１（配列番号２）のアミノ酸配列は、Ｐ
ＡＦレセプターと、３０７個のアミノ酸残基にて、約２
９．３％の同一性（Fastaを使用）を有する(Nakamura,
M., Honda,Z., Izumi,T., Sakanaka,C., Mutoh,H., MIn
ami,M.,Bito,H., Seyama,Y., Noma,M., Mtsumoto,T. an
d Shimizu,T. Molecular cloning and Expression of P
latelet-activating Factor Receptor from Human Leuk
ocytesJ. Biol. Chem. 266, 20400-20405(1991))。さら
に、ＨＡＣＣＨ９４（配列番号２）は、ケモカインレセ
プターと、３０５アミノ酸残基にて、約２８．５％の同
一性を有する(Loetscher M, Gerber B, Loetscher P.,
Jones S., Piali L, Clark-Lewis I, Baggiolini M, an
d Moser B. 1996 Chemokine receptor specific for IP
10 and Mig: Structure, function, and expression in
activated T-lymphocytes J. Exp. Med 184, 963-96
9)。さらに、ＨＡＣＣＨ９４（配列番号２）は、トロン
ビンレセプターと、３１７アミノ酸残基にて、２５．６
％の同一性を有する(Runge,M.S., Corson,M.A., Hayze
r,D.J. and Zhong,C.Molecular cloning of the rat va
scular smooth muscle thrombin receptor: Evidence f
or in Vitro regulation by basic fibroblast growth
factor J.Biol. Chem. 267, 16975-16979 (1992))。表
１（配列番号１）のヌクレオチド配列は、Ｈ９７３１１
ＥＳＴ４２ｊ１０ＷＡＴＭ１ ホモサピエンスｃDNA
クローン（Ｈ９７３１１）と４５３ヌクレオチド残基に
おいて約９９％の同一性、ホモサピエンスｃＤＮＡクロ
ーン（ＡＡ１３０３９２）と４６２にわたり９８％の同
一性、ホモサピエンスｃＤＮＡクローン（Ｎ４０１７
４）と４７７ヌクレオチドにわたり９９％の同一性を有
する。

【００２７】

【表１】表１^a ATGAGAAGTCATACCATAACAATGACgACAACTTCAGTCAGCAGCTGGCCTTACTCCTCC M R S H T I T M T T T S V S S W P Y S S CACAGAATGCGCTTTATAACCAATCATAGCGACCAACCGCCACAAAACTTCTCAGCAACA H R M R F I T N H S D Q P P Q N F S A T CCAAATGTTACTACCTGTCCCATGGATGAAAAATTGCTATCTACTGTGTTAACCACATCC P N V T T C P M D E K L L S T V L T T S TACTCTGTTATTTTCATCGTGGGACTGGTTGGGAACATAATCGCCCTCTATGTATTTCTG Y S V I F I V G L V G N I I A L Y V F L GGTATTCACCGTAAAAGAAATTCCATTCAAATTTATCTACTTAACGTAGCCATTGCAGAC G I H R K R N S I Q I Y L L N V A I A D CTCCTACTCATCTTCTGCCTCCCTTTCCGAATAATGTATCATATTAACCAAAACAAGTGG L L L I F C L P F R I M Y H I N Q N K W ACACTAGGTGTGATTCTGTGCAAGGTTGTGGGAACACTGTTTTATATGAACATGTACATT T L G V I L C K V V G T L F Y M N M Y I AGCATTATTTTGCTTGGATTCATCAGTTTGGATCGCTATATAAAAATTAATCGGTCTATA S I I L L G F I S L D R Y I K I N R S I CAGCAACGGAAGGCAATAACAACCAAACAAAGTATTTATGTCTGTTGTATAGTATGGATG Q Q R K A I T T K Q S I Y V C C I V W M CTTGCTCTTGGTGGATTCCTAACTATGATTATTTTAACACTTAAGAAAGGAGGGCATAAT L A L G G F L T M I I L T L K K G G H N TCCACAATGTGTTTCCATTACAGAGATAAGCATAACGCAAAAGGAGAAGCCATTTTTAAC S T M C F H Y R D K H N A K G E A I F N TTCATTCTTGTGGTAATGTTCTGGCTAATTTTCTTACTAATAATCCTTTCATATATTAAG F I L V V M F W L I F L L I I L S Y I K ATTGGGAAGAATCTATTGAGGATTTCTAAAAGGAGGTCAAAATTTCCTAATTCTGGTAAA I G K N L L R I S K R R S K F P N S G K TATGCCACTACAGCTCGTAACTCCTTTATTGTACTTATCATTTTTACTATATGTTTTGTT Y A T T A R N S F I V L I I F T I C F V CCCTATCATGCCTTTCGATTCATCTACATTTCTTCACAGCTAAATGTATCATCTTGCTAC P Y H A F R F I Y I S S Q L N V S S C Y TGGAAAGAAATTGTTCACAAAACCAATGAGATCATGCTGGTTCTCTCATCTTTCAATAGT W K E I V H K T N E I M L V L S S F N S TGCTTAGATCCAGTCATGTATTTCCTGATGTCCAGTAACATTCGCAAAATAATGTGCCAA C L D P V M Y F L M S S N I R K I M C Q CTTCTTTTTAGACGATTTCAAGGTGAACCAAGTAGGAGTGAAAGCACTTCAGAATTTAAA L L F R R F Q G E P S R S E S T S E F K CCAGGATACTCCCTGCATGATACATCTGTGGCAGTGAAAATACAGTCTAGTTCTAAAAGT P G Y S L H D T S V A V K I Q S S S K S ACTTGA T ^a ヒトＨＡＣＣＨ９４からのヌクレオチドおよび推定ア
ミノ酸配列。それぞれ配列番号１および２。

【００２８】ヒト胎盤の細胞中のｍＲＮＡから由来のｃ
ＤＮＡライブラリーより標準的クローニングおよびスク
リーニングを用い、発現配列タグ（ＥＳＴ）分析（Adam
s,M.D.ら、Science 252：1651-1656（1991）；Adams,M.
D.ら、Nature 355：632-634（1992）；Adams,M.D.ら、N
ature 377 Supp：3-174（1995））を用いて、ＨＡＣＣ
Ｈ９４をコードする本発明の１のポリヌクレオチドを得
てもよい。ゲノムＤＮＡライブラリーのごとき天然源か
ら本発明のポリヌクレオチドを得ることもでき、あるい
はよく知られ、かつ商業上利用可能な方法を用いて合成
することもできる。

【００２９】配列番号２のＨＡＣＣＨ９４ポリペプチド
をコードするヌクレオチド配列は、表１（配列番号１）
に示されるコーディング配列とその全長にわたり同一で
あってもよく、または配列番号２のポリペプチドをコー
ドするこのヌクレオチド配列の縮重形態であってもく、
または配列番号２のポリペプチドをコードするヌクレオ
チド配列と高度に同一であってもよい。好ましくは、本
発明のポリヌクレオチドは、ＨＡＣＣＨ９４ポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列と高度に同一、少なく
とも８０％同一、またはＨＡＣＣＨ９４ポリペプチドを
コードする表１（配列番号１）中に含まれる配列と少な
くとも８０％同一、または、配列番号２のポリペプチド
をコードするヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一
のヌクレオチド配列を含む。

【００３０】本発明のポリヌクレオチドをＨＡＣＣＨ９
４ポリペプチドの組換え生産に用いる場合、ポリヌクレ
オチドはそれ自体、成熟ポリペプチドまたはそのフラグ
メントのコーディング配列を含むものであってもよく；
読み枠中に、リーダーまたは分泌配列、プレ、プロ、も
しくはプレプロタンパク質配列をコードするコーディン
グ配列、または他の融合ペプチド部分などの、他のコー
ディング配列を伴った、成熟ポリペプチドまたはフラグ
メントのコーディング配列を含むものであってもよい。
例えば、融合ポリペプチドの精製を促進するマーカー配
列をコードすることもできる。本発明のこの態様の特に
好ましい具体例において、マーカー配列は、ｐＱＥベク
ター（Qiagen,Inc.）で得られ、Gentzら、Proc.Natl.Ac
ad.Sci.,USA，86:821-824（1989）に記載されるよう
な、ヘキサ−ヒスチジンペプチドであるか、またはＨＡ
タグである。ポリヌクレオチドはまた、非コーディング
５’および３’配列、例えば、転写された非翻訳配列、
スプライスおよびポリアデニル化シグナル、リボソーム
結合部位およびmＲＮＡを安定化する配列などを含有し
ていてもよい。

【００３１】さらなる好ましい具体例は、表１（配列番
号２）のＨＡＣＣＨ９４ポリペプチドのアミノ酸配列を
有し、数個、５ないし１０個、１ないし５個、１ないし
３個、１ないし２個または１個のアミノ酸残基がいずれ
かの組み合わせで置換、欠失または付加されているＨＡ
ＣＣＨ９４の変種をコードするポリヌクレオチドであ
る。本発明は、さらには、本明細書において前記した配
列とハイブリッド形成するポリヌクレオチドにも関す
る。この点において、本発明は、特に、本明細書におい
て前記したポリヌクレオチドにストリンジェントな条件
下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドに関
する。本明細書で用いる用語の「ストリンジェントな条
件」とは、配列間に少なくとも９５％、好ましくは少な
くとも９７％の同一性がある場合にのみハイブリダイゼ
ーションが起こることを意味する。

【００３２】本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１
に含まれるヌクレオチド配列またはそのフラグメントに
対して同一または十分に同一であり、ｃＤＮＡおよびゲ
ノムＤＮＡ用のハイブリダイゼーションプローブとして
用いてＨＡＣＣＨ９４をコードする全長のｃＤＮＡおよ
びゲノムクローンを単離し、ＨＡＣＣＨ９４遺伝子に対
して高い配列類似性を有する他の遺伝子のｃＤＮＡおよ
びゲノムクローンを単離することができる。かかるハイ
ブリダイゼーション法は当業者に知られている。典型的
には、これらのヌクレオチド配列は、対照配列と７０％
同一、好ましくは８０％同一、より好ましくは９５％同
一である。一般に、プローブは少なくとも１５個のヌク
レオチドを含むであろう。好ましくは、かかるプローブ
は少なくとも３０個のヌクレオチドを有し、少なくとも
５０個のヌクレオチドを有していてもよい。特に好まし
いプローブは３０ないし５０個のヌクレオチドの範囲に
ある。

【００３３】一の具体例において、ＨＡＣＣＨ９４をコ
ードするポリヌクレオチドを得るには、適当なライブラ
リーをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
下で配列番号１を有する標識したプローブまたはそのフ
ラグメントでスクリーニングし、該ポリヌクレオチド配
列を含有する全長のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単
離する工程からなる。そのようなハイブリダイゼーショ
ン法は当業者に周知である。ストリンジェントなハイブ
リダイゼーション条件は、前記されているとおりである
か、あるいはまた５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１
５０ｍＭ NaCl、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）、５０
ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７.６）、５ｘDenhardt's
溶液、１０％硫酸デキストランおよび２０マイクログラ
ム／ｍｌの変性切断サケ精子ＤＮＡを有してなる溶液中
で一夜４２℃でインキュベートし、つづいてそのフィル
ターを約６５℃で０.１ｘＳＳＣにて洗浄する条件であ
る。研究試薬ならびに動物およびヒトの疾患の治療およ
び診断を見いだすための材料として本発明のポリヌクレ
オチドおよびポリペプチドを用いてもよい。

【００３４】ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド（複数でも
可）を含むベクター、本発明のベクターで遺伝子操作す
る宿主細胞および組換え技法による本発明のポリペプチ
ドの製造にも関する。無細胞翻訳系を用い、本発明のＤ
ＮＡ構築物から由来のＲＮＡを用いてかかるタンパク質
を製造できる。組換え体を製造するために、宿主細胞を
遺伝子操作して、本発明のポリヌクレオチドについての
発現系もしくはそれらの一部を組み込むことができる。
ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、Davisら、BAS
IC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY（1986）；Sambrook
ら、MOLECUR CLONING：A LABORATORY MANUAL、第２版、
Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring H
arbor、N.Y.（1989）のような、多くの標準的な実験マ
ニュアルに記載される方法により行うことができ、例え
ばリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−
デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベク
ション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介
トランスフェクション、エレクトロポレーション、トラ
ンスダクション、スクレープ負荷、バリスティック導入
または感染等がある。

【００３５】適当な宿主の代表的なものとして、細菌細
胞、例えば連鎖球菌属（streptococci）、ブドウ球菌属
（staphylococci）、大腸菌（E.coli）、ストレプトミ
セス（Streptomyces）および枯草菌（Bacillus subtili
s）細胞；真菌細胞、例えば酵母細胞およびアスペルギ
ルス属（Aspergillus）細胞；昆虫細胞、例えばドロソ
フィラＳ２（Drosophila S2）およびスポドプテラＳｆ
９（Spodoptera Sf9）細胞；動物細胞、例えばCHO、CO
S、HeLa、Ｃ１２７、３Ｔ３、BHK、HEK２９３およびボ
ウズ（Bows）黒色腫細胞；ならびに植物細胞が挙げられ
る。

【００３６】多種の発現系を用いることができる。この
ような系として、とりわけ、染色体、エピソームおよび
ウイルス由来系、例えば細菌プラスミドから、バクテリ
オファージから、トランスポゾンから、酵母エピソーム
から、挿入エレメントから、酵母染色体エレメントか
ら、バキュロウイルス、パポバウイルスなどの、例えば
ＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘
ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等
のウイルスから由来のベクター、ならびにその組み合わ
せから由来のベクター、例えばコスミドおよびファージ
ミドなどのプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝因
子から由来のベクターが挙げられる。発現系は発現を制
御および引き起こす調節領域を含有していてもよい。一
般に、ポリヌクレオチドを保持、伸長または発現させ、
宿主にてポリペプチドを産生するのに適した系またはベ
クターを使用できる。種々の周知かつ慣用的な技法、例
えば、Sambrookら、MOLECULAR CLONING、A LABORATORY
MANUAL（前掲）に記載されている技法により、適当なヌ
クレオチド配列を発現系に挿入できる。

【００３７】翻訳タンパク質を、小胞体内腔、周辺腔ま
たは細胞外環境へ分泌させるために、適当な分泌シグナ
ルを所望のポリペプチドに組み込むことができる。これ
らのシグナルはポリペプチドに固有のシグナルであって
もよく、あるいは異種性のシグナルであってもよい。Ｈ
ＡＣＣＨ９４ポリペプチドをスクリーニングアッセイに
て用いるために発現させる場合、一般に、そのポリペプ
チドを細胞表面で生成させることが好ましい。この場
合、スクリーニングアッセイに使用する前に細胞を集め
てもよい。ＨＡＣＣＨ９４ポリペプチドが培地中に分泌
されるならば、培地を回収してポリペプチドを回収し精
製することができる。細胞内に生成されるならば、まず
細胞を溶解し、ついで、ポリペプチドを回収しなければ
ならない。

【００３８】ＨＡＣＣＨ９４ポリペプチドは、硫酸アン
モニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまた
は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロース
クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシル
アパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマト
グラフィーを含め、周知の方法により、組換え細胞培養
物から回収および精製できる。高性能液体クロマトグラ
フィーを精製に用いるのが最も好ましい。ポリペプチド
が単離および／または精製中に変性する場合、タンパク
質を再生するための周知方法を用い、再び活性な立体配
座とすることができる。

【００３９】診断アッセイ 本発明はまた診断薬として用いるためのＨＡＣＣＨ９４
ポリヌクレオチドの使用にも関する。機能不全に関与す
るＨＡＣＣＨ９４遺伝子の変異形の検出は、ＨＡＣＣＨ
９４の過少発現、過剰発現または発現の変化よりもたら
される疾患の診断または疾患の疑いを特定することので
きる診断手段を提供する。ＨＡＣＣＨ９４遺伝子に変異
のある個体は、種々の方法によりＤＮＡレベルで検出で
きる。

【００４０】診断に供する核酸は、対象の細胞、例え
ば、血液、尿、唾液、組織生検または剖検材料より得る
ことができる。ゲノムＤＮＡは、検出するのに直接使用
してもよく、または分析の前にＰＣＲもしくはその他の
増幅法を用いることにより酵素的に増幅させてもよい。
ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた同じ方法で用いることがで
きる。正常な遺伝子型との比較における増幅産物の大き
さの変化により、欠失および挿入を検出できる。点突然
変異は、増幅ＤＮＡを標識化ＨＡＣＣＨ９４のヌクレオ
チド配列とハイブリッド形成させることにより同定でき
る。完全に対合した配列はＲＮase消化により、または
融解温度の違いにより、誤対合二重らせんから区別でき
る。ＤＮＡ配列の違いはまた、変性物質と一緒にまたは
なしで、ゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳動の移動
度の変化により、または直接的ＤＮＡ配列決定法により
検出できる。例えばMyersら、Science 230：1242（198
5）を参照のこと。特異的な位置での配列の変化はま
た、ヌクレアーゼ保護アッセイ、例えばRＮaseおよびＳ
１保護または化学的切断法によっても明らかにすること
ができる。Cottonら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA，8
5：4397-4401（1985）を参照のこと。もう１つの具体例
において、ＨＡＣＣＨ９４のヌクレオチド配列またはそ
のフラグメントを含むオリゴヌクレオチドプローブのア
レイ（array）を構築して、例えば遺伝的変異の効果的
なスクリーニングを行うことができる。アレイ法はよく
知られており、適用範囲が広く、その方法を用いて、遺
伝子発現、遺伝的連鎖および遺伝的変化を含め、分子遺
伝学における種々の問題と取り組むことができる（例え
ば、M.Cheeら、Science, Vol 274, pp610-613（1996）
を参照のこと）。

【００４１】診断アッセイは、記載した方法によりＨＡ
ＣＣＨ９４遺伝子中の変異を検出することによる、細
菌、真菌、原生動物およびウイルス感染、詳細には、Ｈ
ＩＶ−１またはＨＩＶ−２によって引き起こされる感
染；痛み；腫瘍；拒食症；過食症；喘息；パーキンソン
病；急性心不全；低血圧；高血圧；閉尿；骨粗鬆症；狭
心症；心筋梗塞；潰瘍；喘息；アレルギー；良性前立腺
肥大；および、不安症、精神分裂症、躁鬱病、精神錯
乱、痴呆、重度の知恵遅れ、ならびに、ハンチントン病
またはジルス・デラ・トレット症候群のごとき運動障害
への罹病し易さを診断または測定する方法を提供する。

【００４２】加えて、細菌、真菌、原生動物およびウイ
ルス感染、詳細には、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２によ
って引き起こされる感染；痛み；腫瘍；拒食症；過食
症；喘息；パーキンソン病；急性心不全；低血圧；高血
圧；閉尿；骨粗鬆症；狭心症；心筋梗塞；潰瘍；喘息；
アレルギー；良性前立腺肥大；および、不安症、精神分
裂症、躁鬱病、精神錯乱、痴呆、重度の知恵遅れ、なら
びに、ハンチントン病またはジルス・デラ・トレット症
候群のごとき運動障害は、対象から由来の試料より、異
常に上昇または低下したＨＡＣＣＨ９４ポリペプチドま
たはＨＡＣＣＨ９４のｍＲＮＡのレベルを測定すること
を特徴とする方法によって診断することができる。発現
の増加または低下は、ポリヌクレオチドの定量法として
当該分野で周知の方法、例えば、ＰＣＲ、ＲＴ-ＰＣ
Ｒ、ＲＮase保護、ノーザンブロッティングおよび他の
ハイブリダイゼーション法を用いてＲＮＡレベルで測定
できる。宿主から由来の試料中のＨＡＣＣＨ９４ポリペ
プチドなどのタンパク質のレベルを決定するために用い
ることができるアッセイ法は、当業者に周知である。こ
のようなアッセイ法には、ラジオイムノアッセイ、競争
結合アッセイ、ウェスタンブロット分析およびＥＬＩＳ
Ａアッセイが挙げられる。

【００４３】染色体アッセイ 本発明のヌクレオチド配列は染色体の同定にも価値があ
る。該配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置を特異
的に標的とし、これとハイブリッド形成しうる。本発明
に従って、関連する配列を染色体にマッピングする工程
は、それらの配列を遺伝子関連疾患と関連づける重要な
第１工程である。配列を正確な染色体位置にマッピング
したならば、染色体上の配列の物理的位置を遺伝地図の
データと関連づけることができる。かかるデータは、例
えば、V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man（J
ohns Hopkins University Welch Medical Libraryから
オンラインで利用できる）にて見られる。ついで、連鎖
分析（物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝）により、同
じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との関係
を同定する。罹病個体と未罹病個体との間のｃＤＮＡま
たはゲノム配列の相違も測定することができる。いくつ
かまたはすべての罹病個体において変異が観察される
が、正常個体においては観察されない場合、その変異は
該疾患の原因である可能性がある。

【００４４】抗体 本発明のポリペプチドもしくはそれらのフラグメントま
たはそのアナログ、あるいはそれらを発現する細胞を免
疫原として用いて、ＨＡＣＣＨ９４ポリペプチドに対し
て免疫特異的な抗体を得ることもできる。「免疫特異
的」なる語は、抗体が先行技術における他の関連ポリペ
プチドに対するアフィニティーよりも、本発明のポリペ
プチドに対して実質的により大きなアフィニティーを有
することを意味する。

【００４５】ＨＡＣＣＨ９４ポリペプチドに拮抗して生
じる抗体は、ポリペプチドまたはエピトープ担持フラグ
メント、アナログまたは細胞を、動物、好ましくはヒト
以外の動物に、通常の実験法を用いて投与することによ
り得ることができる。モノクローナル抗体の産生には、
連続的セルライン培養により得られる抗体を提供するい
ずれの方法も用いることができる。例えば、ハイブリド
ーマ法（Kohler,G.およびMilstein,C.、Nature 256：49
5-497（1975）、トリオーマ法、ヒトB-細胞ハイブリド
ーマ法（Kozborら、Immunology Today 4：72（1983）お
よびEBV-ハイブリドーマ法（Coleら、MONOCLONAL ANTIB
ODIES AND CANCER THERAPY、７７−９６頁、Alan R. Li
ss, Inc.,（1985））が挙げられる。

【００４６】一本鎖抗体を産生するのに記載された技術
（米国特許第４９４６７７８号）を適用して、本発明の
ポリペプチドに対する一本鎖抗体を産生できる。また、
トランスジェニックマウスまたは他の哺乳動物を含め、
他の生物を用いて、ヒト化抗体を発現させることができ
る。前記した抗体を用いて、ポリペプチドを発現するク
ローンを単離または同定してもよく、あるいはアフィニ
ティークロマトグラフィーによりポリペプチドを精製し
てもよい。

【００４７】ＨＡＣＣＨ９４ポリペプチドに対する抗体
を用いて、とりわけ、細菌、真菌、原生動物およびウイ
ルス感染、詳細には、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２によ
って引き起こされる感染；痛み；腫瘍；拒食症；過食
症；喘息；パーキンソン病；急性心不全；低血圧；高血
圧；閉尿；骨粗鬆症；狭心症；心筋梗塞；潰瘍；喘息；
アレルギー；良性前立腺肥大；および、不安症、精神分
裂症、躁鬱病、精神錯乱、痴呆、重度の知恵遅れ、なら
びに、ハンチントン病またはジルス・デラ・トレット
（Gilles dela Tourett's）症候群のごとき運動障害を
治療してもよい。

【００４８】ワクチン 本発明の別の態様は、哺乳動物における免疫学的応答を
誘起する方法であって、抗体および／またはＴ細胞免疫
応答を生じさせるに十分なＨＡＣＣＨ９４ポリペプチド
またはそのフラグメントを哺乳動物に接種して、とりわ
け、細菌、真菌、原生動物およびウイルス感染、詳細に
は、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２によって引き起こされ
る感染；痛み；腫瘍；拒食症；過食症；喘息；パーキン
ソン病；急性心不全；低血圧；高血圧；閉尿；骨粗鬆
症；狭心症；心筋梗塞；潰瘍；喘息；アレルギー；良性
前立腺肥大；および、不安症、精神分裂症、躁鬱病、精
神錯乱、痴呆、重度の知恵遅れ、ならびに、ハンチント
ン病またはジルス・デラ・トレット症候群のごとき運動
障害から該動物を防御することを含む方法に関する。本
発明のもう１つ別の態様は、哺乳動物における免疫学的
応答を誘導する方法であって、ＨＡＣＣＨ９４ポリペプ
チドをベクターを介してデリバリーし、かかる免疫学的
応答を誘発させ、抗体を産生し、該動物を疾患から保護
するように、インビボにてＨＡＣＣＨ９４ポリヌクレオ
チドの発現を指令することを含む方法に関する。

【００４９】本発明のさらなる態様は免疫学的／ワクチ
ン処方（組成物）であって、哺乳動物宿主中に導入され
た場合、その哺乳動物にてＨＡＣＣＨ９４ポリペプチド
に対する免疫学的応答を誘導する処方（該組成物はＨＡ
ＣＣＨ９４ポリペプチドまたはＨＡＣＣＨ９４遺伝子を
含んでなる）に関する。ワクチン処方は、さらに適当な
担体を含んでいてもよい。ＨＡＣＣＨ９４ポリペプチド
は胃で分解されるかもしれないため、好ましくは非経口
的（皮下、筋肉内、静脈内、皮内注射等を包含する）に
投与する。非経口投与に適した処方は、抗酸化剤、バッ
ファー、静菌剤および処方を患者の血液と等張にする溶
質を含有してもよい水性および非水性滅菌注射用溶液；
ならびに懸濁剤または増粘剤を含んでいてもよい水性お
よび非水性滅菌懸濁液を包含する。処方を１回投与また
は複数回投与用容器、例えば、密封アンプルおよびバイ
アルに入れて提供してもよく、使用直前に滅菌液体担体
を添加するだけでよい凍結乾燥状態にて保存してもよ
い。またワクチン処方は、水中油系および当該分野で知
られた他の系などの処方の免疫原性を高めるためのアジ
ュバント系を含んでいてもよい。用量は、ワクチンの個
々の活性に依存しており、通常の実験により容易に決定
することができる。

【００５０】スクリーニングアッセイ 本発明のＨＡＣＣＨ９４ポリペプチドは、本発明のレセ
プターと結合し、そのポリペプチドの活性を活性化（ア
ゴニスト）または阻害（アンタゴニスト）する化合物に
ついてのスクリーニング法にて用いてもよい。かくし
て、本発明のポリペプチドを用いて、例えば細胞、無細
胞調製物、化学ライブラリーおよび天然物の混合物にお
ける小型分子基質およびリガンドの結合を評価してもよ
い。これらの天然の基質およびリガンドは、天然の基質
およびリガンドであってもよく、あるいは構造または機
能を模倣したものであってもよい。Coliganら、Current
Protocols in Immunology 1（2）：第5章（1991）を参
照のこと。

【００５１】ＨＡＣＣＨ９４ポリペプチドは、哺乳動物
宿主のいたるところに存在し、種々の病原性を含め、多
くの生物学的機能に関与している。したがって、一方で
ＨＡＣＣＨ９４を刺激する化合物および薬剤を、他方で
ＨＡＣＣＨ９４機能を阻害しうる化合物または薬剤を見
いだすことが望ましい。一般に、アゴニストは、細菌、
真菌、原生動物およびウイルス感染、詳細には、ＨＩＶ
−１またはＨＩＶ−２によって引き起こされる感染；痛
み；腫瘍；拒食症；過食症；喘息；パーキンソン病；急
性心不全；低血圧；高血圧；閉尿；骨粗鬆症；狭心症；
心筋梗塞；潰瘍；喘息；アレルギー；良性前立腺肥大；
および、不安症、精神分裂症、躁鬱病、精神錯乱、痴
呆、重度の知恵遅れ、ならびに、ハンチントン病または
ジルス・デラ・トレット症候群のごとき運動障害のよう
な症状についての治療および予防目的に利用される。ア
ンタゴニストは、細菌、真菌、原生動物およびウイルス
感染、詳細には、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２によって
引き起こされる感染；痛み；腫瘍；拒食症；過食症；喘
息；パーキンソン病；急性心不全；低血圧；高血圧；閉
尿；骨粗鬆症；狭心症；心筋梗塞；潰瘍；喘息；アレル
ギー；良性前立腺肥大；および、不安症、精神分裂症、
躁鬱病、精神錯乱、痴呆、重度の知恵遅れ、ならびに、
ハンチントン病またはジルス・デラ・トレット症候群の
ごとき運動障害などの症状の種々の治療および予防目的
に利用できる。

【００５２】一般に、かかるスクリーニング操作は、本
発明のレセプターのポリペプチドを細胞表面に発現する
適当な細胞を作り出すことを含む。かかる細胞は、哺乳
動物、酵母、DrosophilaまたはE.coli由来の細胞を包含
する。ついで、レセプター（または発現したポリペプチ
ドを有する細胞膜）を発現する細胞を、試験化合物と接
触させて結合または機能的応答の刺激もしくは阻害を観
察する。

【００５３】一つのスクリーニング方法は、レセプター
活性化によって引き起こされる細胞外ｐＨまたは細胞内
カルシウム変化を測定する系における、本発明レセプタ
ーを発現する細胞（例えば、トランスフェクトされたＣ
ＨＯ細胞）の使用を包含する。この方法において、化合
物を本発明レセプターポリペプチドを発現する細胞に接
触させてもよい。ついで、潜在的化合物がレセプターを
活性化または阻害するかどうかを決定するために、セカ
ンドメッセンジャー応答、例えば、シグナルトランスダ
クション、ｐＨ変化、または、カルシウムレベルの変化
を測定する。

【００５４】もう一つの方法は、レセプターが媒介する
ｃＡＭＰおよび／またはアデニレートサイクラーゼの蓄
積の阻害または促進を測定することによる、レセプター
の阻害剤をスクリーニングすることを包含する。かかる
方法は、本発明レセプターで真核細胞をトランスフェク
ションし、細胞表面にレセプターを発現させることを包
含する。ついで、本発明レセプターの存在下、細胞を潜
在的アンタゴニストに曝露する。ついで、ｃＡＭＰの蓄
積量を測定する。潜在的アンタゴニストがレセプターに
結合し、かくしてレセプターの結合を阻害するならば、
レセプターが媒介するｃＡＭＰまたはアデニレートサイ
クラーゼ活性のレベルは減少または増加するであろう。
本発明レセプターのアゴニストまたはアンタゴニストを
検出するもう一つの方法は、米国特許第５,４８２,８３
５号に記載のごとき酵母をによる方法である。

【００５５】該アッセイは、候補化合物に直接または間
接的に結合した標識を用いて、あるいは標識競争物質と
の競争を用いるアッセイにおいて、レセプターを有する
細胞への付着を検出する、候補化合物の結合を簡単に試
験することができる。さらには、候補化合物がレセプタ
ーの活性化により発生するシグナルを生じるかどうか
を、その表面にレセプターを有する細胞に適した検出系
を用いて、これらのアッセイにより試験してもよい。活
性化の阻害剤は、一般に、既知アゴニストの存在下でア
ッセイされ、候補化合物の存在がアゴニストによる活性
化に及ぼす作用を観察する。該スクリーニングアッセイ
を行うための標準的は方法は、当業者においてよく理解
されるものである。潜在的なＨＡＣＣＨ９４のアンタゴ
ニストの例は、抗体、またはある場合には、ＨＡＣＣＨ
９４のリガンドに密接に関連するオリゴヌクレオチドま
たはタンパク質、例えば、リガンドのフラグメント、ま
たはレセプターの活性が妨げられるように、該レセプタ
ーに結合するが、応答を惹起しない、小型分子を包含す
る。

【００５６】予防および治療方法 本発明は、過剰および不十分な量の両方のＨＡＣＣＨ９
４活性に関連する異常な症状の治療方法を提供する。Ｈ
ＡＣＣＨ９４活性が過剰な場合、いくつかの方法を用い
ることができる。１の方法は、リガンドのＨＡＣＣＨ９
４との結合を遮断することにより、または別のシグナル
を阻害することにより活性化を阻害するのに効果的な量
の前記した阻害化合物（アンタゴニスト）を医薬上許容
される担体と共に対象に投与し、そのことにより異常な
症状を改善することを含む。もう１つ別の方法におい
て、内在性ＨＡＣＣＨ９４と競争してリガンドとの結合
能を有する可溶形のＨＡＣＣＨ９４ポリペプチドを投与
してもよい。かかる競争物質の典型例はＨＡＣＣＨ９４
ポリペプチドのフラグメントを含む。

【００５７】さらにもう１つ別の方法において、発現遮
断法を用いて内在性ＨＡＣＣＨ９４をコードする遺伝子
の発現を阻害してもよい。公知のかかる方法は、内部生
成した、あるいは別個に投与されたアンチセンス配列の
使用を含む。例えば、Oligodeoxynucleotides as Antis
ense Inhibitors of Gene Expression，CRC Press，Boc
a Raton, FL（1988）中、O'Connor、J.Neurochem 56：5
60（1991）を参照のこと。別法として、遺伝子と共に三
重らせんを形成するオリゴヌクレオチドを供給すること
もできる。例えば、Leeら、Nucleic Acids Res 6：3073
（1979）；Cooneyら、Science 241：456（1988）；Derv
anら、Science 251：1360（1991）を参照のこと。これ
らのオリゴマーはそれ自体投与することができ、あるい
は関連するオリゴマーをインビボで発現させることもで
きる。

【００５８】ＨＡＣＣＨ９４およびその活性の過少発現
に関連する異常な症状を治療するのに、またいくつかの
方法が利用可能である。１の方法は、ＨＡＣＣＨ９４を
活性化する治療上有効量の化合物（すなわち、前記のア
ゴニスト）を医薬上許容される担体とともに対象に投与
し、そのことにより異常な状態を改善することを含む。
別法として、遺伝子治療を用いて、対象中の関連細胞に
よるＨＡＣＣＨ９４の内因的生成を有効ならしめてもよ
い。例えば、前記のごとく、複製欠損レトロウイルスベ
クターにて発現するように、本発明のポリヌクレオチド
を操作してもよい。ついで、該レトロウイルス発現構築
物を単離し、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡ
含有のレトロウイルスプラスミドベクターでトランスダ
クションしたパッケージング細胞中に導入して、パッケ
ージング細胞が目的とする遺伝子を含む感染性ウイルス
粒子を生成するようにしてもよい。これらのプロデュー
サー細胞を対象に投与して細胞をインビボで操作し、イ
ンビボでポリペプチドを発現するようにしてもよい。遺
伝子治療の概説としては、Human Molecular Genetics,
T.Strachan and A. P. Read, BIOS Scientific Publish
ers Ltd（1996）中、第２０章、Gene Therapy and othe
r Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches
（およびその中の引用文献）を参照のこと。

【００５９】処方および投与 可溶形のＨＡＣＣＨ９４ポリペプチドのごときペプチ
ド、ならびにアゴニストおよびアンタゴニストペプチド
または小型分子を、適当な医薬担体と組み合わせて処方
してもよい。かかる処方は、治療上有効量のポリペプチ
ドまたは化合物、および医薬上許容される担体もまたは
賦形剤を含んでなる。かかる担体としては、食塩水、緩
衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノ
ール、およびその組み合わせを包含するが、これらに限
定されない。処方は投与経路に適したものとすべきであ
り、当業者によく知られている。さらに本発明は、前記
した本発明の組成物の１種またはそれ以上の成分を充填
した、１個またはそれ以上の容器を含んでなる医薬パッ
クおよびキットにも関する。

【００６０】本発明のポリペプチドおよび他の化合物を
単独で使用してもよく、あるいは治療化合物のごとき他
の化合物と一緒に使用してもよい。医薬組成物の全身系
投与の好ましい形態は、典型的には静脈注射による注射
を包含する。皮下、筋肉内または腹腔内などの他の注射
経路を用いることもできる。全身系投与のための別の手
段は、胆汁酸塩またはフシジン酸などの浸透剤または他
の界面活性剤を用いる経粘膜または経皮投与を包含す
る。加えて、腸溶処方またはカプセル処方にうまく処方
されるならば、経口投与も可能である。これらの化合物
の投与は、膏薬、パスタ、ゲル等の形態にて、局所的お
よび／または局在化したものであってもよい。

【００６１】必要な用量範囲は、ペプチドの選択、投与
経路、処方の性質、対象の症状の性質、および顧問医の
判断に依存する。しかしながら、適当な用量は対象１ｋ
ｇ当たり０.１ないし１００μｇの範囲である。しか
し、使用可能な種々の化合物および種々の投与経路の効
力の違いを考慮すれば、必要な用量は広範囲なものと思
われる。例えば、経口投与には静脈注射よりも多い用量
が必要であると考えられる。当該分野においてよく知ら
れた最適化のための標準的な経験的慣用操作を用いてこ
れらの用量の変更を行うことができる。しばしば「遺伝
子治療」と称される前記した治療方法において、治療に
用いられるポリペプチドを対象中において内在的に得る
こともできる。よって、例えば、レトロウイルスプラス
ミドベクターを用いて対象由来の細胞をＤＮＡまたはＲ
ＮＡなどのポリヌクレオチドで操作し、ポリペプチドを
エクスビボでコードしてもよい。ついで、細胞を対象に
導入する。

【００６２】

【実施例】以下の実施例は、特記する場合を除き、当業
者に周知かつ慣用的な、標準方法を用いて行う。実施例
は例示であって、本発明を限定するものではない。

【００６３】実施例１ ＥＳＴ(HGS:1887705) (Project ID HACCH94)により、塩
基５１から２５１は７ＴＭスーパーファミリー配列と相
同性のあることが示された。これらの領域からのオリゴ
ヌクレオチドを消化し、マラソン（Marathon）ＰＣＲ方
法を用いて５’および３’コーディング領域を得た。
５’オリゴは、CAGTGTTCCCACAACCTTGCACAGAATCACおよび
ACCTAGTGTCCACTTGTTTTGG、それぞれ配列番号３および４
であった。３’オリゴは、GTGATTCTGTGCAAGGTTGTGGGAAC
ACTGおよびGAACATGTACATTAGCATTATTTTGC、それぞれ配列
番号５および６であった。約５００ｂｐ（５’フラグメ
ント）および１０００ｂｐ（３’フラグメント）を得
た。両方のフラグメントをＰＣＲ２．１ベクター(Invit
rogene)中にサブクローニングし、ついで配列決定し
た。配列解析により、読み枠はヌクレオチド１８９（Ａ
ＴＧ）で開始し、ヌクレオチド１３３２（ＴＧＡ）で終
止することが示された。コーディング配列は、３８１ア
ミノ酸のタンパク質をコードする１１４５ヌクレオチド
である。タンパク質は、約４１，９１０の分子量を有す
ると予想される。

【００６４】実施例２： 哺乳動物細胞発現 本発明レセプターを、ヒト・胎児腎２９３（ＨＥＫ２９
３）細胞または付着性ｄｈｆｒＣＨＯ細胞のいずれかで
発現させる。レセプター発現を最大にするために、典型
的には、ｐＣＤＮまたはｐＣＤＮＡ３ベクター中に挿入
する前に、すべての５'および３'非翻訳領域（ＵＴＲ
ｓ）をレセプターｃＤＮＡから除去する。リポフェクチ
ンによって細胞を個々のレセプターｃＤＮＡでトランス
フェクションし、４００ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８の存在下
選択する。選択後３週間で、個々のクローンを拾い上
げ、さらなる解析を行う。ベクターのみでトランスフェ
クションしたＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞をネガティ
ブ対照として用いる。個々のレセプターを安定に発現す
る細胞系を単離するために、典型的に約２４個のクロー
ンを選択し、ついで、ノザンブロット解析によって解析
する。一般に、レセプターｍＲＮＡは、解析したＧ４１
８耐性クローンの約５０％において検出される。

【００６５】実施例：３ 結合および機能アッセイのた
めのリガンドバンク 推定の２００を超えるレセプターリガンドのバンクをス
クリーニングのために作成した。そのバンクは、ヒト・
７膜貫通（７ＴＭ）レセプターを介して作用することが
知られているトランスミッター、ホルモンおよびケモカ
イン；ヒト・７ＴＭレセプターの推定アゴニストであっ
てもよい天然化合物、哺乳動物での対応物がまだ同定さ
れていない非哺乳動物の生物学的活性ペプチド；およ
び、天然には見いだされないが、未知の天然リガンドと
ともに７ＴＭレセプターを活性化する化合物を含んでな
る。最初に、このバンクを使用して、結合アッセイと同
様、２機能性（即ち、カルシウム、ｃＡＭＰ、マイクロ
フィジオメーター、卵母細胞電気生理学など以下参照）
を用いて、既知のリガンドのためのレセプターをスクリ
ーニングする。

【００６６】実施例４： リガンド結合アッセイ リガンド結合アッセイは、レセプター薬理学を確認する
ための直接的方法を提供し、高処理量フォーマットに適
合する。精製されたレセプターリガンドは、結合研究の
ために高比活性（５０-２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）に放
射性ラベルされる。ついで、放射性ラベルの工程がリガ
ンドのレセプターに対する活性を消失させないように測
定が行われる。緩衝液、イオン、ｐＨおよびヌクレオチ
ドのごとき他のモジュレーターに関するアッセイ条件が
最適化され、膜および全細胞レセプター供給源のいずれ
についても使用可能なシグナル対ノイズ比を確立する。
これらのアッセイについて、全結合放射活性から過剰の
非ラベル競合リガンドの存在下で測定された放射活性を
引いたものとして、特異的なレセプター結合が定義され
る。可能ならば、一つ以上のリガンドを使用して、残存
する非特異的結合を定義する。

【００６７】実施例５： アフリカツメガエル卵母細胞
での機能アッセイ 標準的方法に従って、ＲＮＡポリメラーゼを用いて、本
発明レセプターｃＤＮＡをコードする直鎖状にされたプ
ラスミド鋳型からのキャップＲＮＡ転写物をインビトロ
で合成する。インビトロ転写物を最終濃度０.２ｍｇ／
ｍｌになるように水に懸濁する。成体メスのカエルから
卵巣葉を取り出し、ステージＶの脱胞卵母細胞を得て、
ついで、マイクロインジェクション装置を用いて、ＲＮ
Ａ転写物（１０ｎｇ／卵母細胞）を５０ｎｌボーラス
（bolus）で注入する。２つの電極電圧クランプを使用
して、アゴニスト曝露に応答した個々のアフリカツメガ
エル卵母細胞からの電流を測定する。室温でＣａ２＋を
含まないバース培地（Barth's medium）中で記録する。
アフリカツメガエルの系は、既知のリガンドおよび活性
化リガンドについて組織／細胞抽出物をスクリーニング
するために使用することができる。

【００６８】実施例６： 微小生理機能測定アッセイ 非常に多様なセカンドメッセンジャー系の活性化によ
り、細胞から少量の酸の放出が起こる。生成した酸は、
主に、細胞内シグナリング工程にエネルギーを供給する
ために必要な代謝活性を増大させる。細胞の周りの培地
のｐＨ変化は非常に小さいが、CYTOSENSOR微小生理機能
測定器（Molecular Devices Ltd., MenloPark, CA）に
よって検出可能である。かくして、CYTOSENSORは、本発
明レセプターに共役したＧタンパク質のごとく、細胞内
シグナル伝達経路を使用するエネルギーに共役している
レセプターの活性化を検出することができる。

【００６９】実施例７： 抽出物／細胞上清スクリーニ
ング 多数の哺乳動物レセプターが存在し、それらについて未
だに同種の活性化リガンド（アゴニスト）は残っていな
い。かくして、これらのレセプターの活性リガンドは、
現在までに同定されたリガンドバンク中に包含されてい
なくてもよい。従って、天然のリガンドを同定するため
に組織抽出物に対して本発明７ＴＭレセプターを（カル
シウム、ｃＡＭＰ、微小生理機能測定器、卵母細胞電気
生理学など機能的スクリーニングを使用して）機能的に
もスクリーニングする。活性化リガンドが単離同定され
るまで、陽性の機能応答を生じる抽出物を連続して分画
することができる。

【００７０】実施例８： カルシウムおよびｃＡＭＰの
機能アッセイ ＨＥＫ２９３細胞において発現している７ＴＭレセプタ
ーは、ＰＬＣの活性化およびカルシウムの移動、および
／またはｃＡＭＰ刺激または阻害に機能的に共役してい
ることが示されている。レセプタートランスフェクショ
ンまたはベクター制御細胞におけるＨＥＫ２９３細胞の
基礎的カルシウムレベルは、正常には１００ｎＭないし
２００ｎＭの範囲内で観察された。組換えレセプターを
発現しているＨＥＫ２９３細胞をｆｕｒａ２で負荷し、
カルシウム移動を誘導するアゴニストについて、１日で
１５０を超えるリガンドを選択し、または組織／細胞抽
出物を評価する。同様に、組換えレセプターを発現して
いるＨＥＫ２９３細胞を、標準的ｃＡＭＰ定量アッセイ
を用いてｃＡＭＰ産生の刺激または阻害について評価す
る。応答がレセプターを発現しているトランスフェクシ
ョンされた細胞でのみ起こっているのかどうかを調べる
ために、ベクター制御細胞において、カルシウムの一時
的変動またはｃＡＭＰ変動を引き起こすアゴニストを試
験する。

【００７１】

【配列表】

（１）一般的情報 （ｉ）出願人： サザ・ギャネシュ エルショーバギー・ナビル （ｉｉ）発明の名称： 新規なヒト７−トランスメンブ
ランレセプターをコードするｃＤＮＡクローンＨＡＣＣ
Ｈ９４ （ｉｉｉ）配列の数：６ （ｉｖ）郵送先 （Ａ）名称： スミスクライン・ビーチャム・コーポレ
ーション（Ｂ）通り名： スウェードランド・ロード７
０９番 （Ｃ）都市名： キング・オブ・プルシア （Ｄ）州名：ＰＡ （Ｅ）国名：ＵＳＡ （Ｆ）郵便番号：１９４０６ （ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム： （Ａ）媒体タイプ：ディスケット （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭコンパチブル （Ｃ）オペレーティング・システム：ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：Window Version２．０用FastＳＥ
Ｑ （ｖ）現出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日：１９９７年４月１５日 （Ｃ）分類番号：不明 （ｖｉ）先の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （ｖｉｉｉ）代理人情報： （Ａ）名称：ハン，ウィリアム・ティ （Ｂ）登録番号：３４３４４ （Ｃ）代理人等における処理番号：ＧＨ−５００２５ （ｉｘ）テレコミュニケーション情報： （Ａ）電話番号：６１０−２７０−５２１９ （Ｂ）ファックス番号：６１０−２７０−４０２６ （Ｃ）テレックス番号：

【００７２】（２）配列番号１に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１１４６塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号１： ATGAGAAGTC ATACCATAAC AATGACGACA ACTTCAGTCA GCAGCTGGCC TTACTCCTCC 60 CACAGAATGC GCTTTATAAC CAATCATAGC GACCAACCGC CACAAAACTT CTCAGCAACA 120 CCAAATGTTA CTACCTGTCC CATGGATGAA AAATTGCTAT CTACTGTGTT AACCACATCC 180 TACTCTGTTA TTTTCATCGT GGGACTGGTT GGGAACATAA TCGCCCTCTA TGTATTTCTG 240 GGTATTCACC GTAAAAGAAA TTCCATTCAA ATTTATCTAC TTAACGTAGC CATTGCAGAC 300 CTCCTACTCA TCTTCTGCCT CCCTTTCCGA ATAATGTATC ATATTAACCA AAACAAGTGG 360 ACACTAGGTG TGATTCTGTG CAAGGTTGTG GGAACACTGT TTTATATGAA CATGTACATT 420 AGCATTATTT TGCTTGGATT CATCAGTTTG GATCGCTATA TAAAAATTAA TCGGTCTATA 480 CAGCAACGGA AGGCAATAAC AACCAAACAA AGTATTTATG TCTGTTGTAT AGTATGGATG 540 CTTGCTCTTG GTGGATTCCT AACTATGATT ATTTTAACAC TTAAGAAAGG AGGGCATAAT 600 TCCACAATGT GTTTCCATTA CAGAGATAAG CATAACGCAA AAGGAGAAGC CATTTTTAAC 660 TTCATTCTTG TGGTAATGTT CTGGCTAATT TTCTTACTAA TAATCCTTTC ATATATTAAG 720 ATTGGGAAGA ATCTATTGAG GATTTCTAAA AGGAGGTCAA AATTTCCTAA TTCTGGTAAA 780 TATGCCACTA CAGCTCGTAA CTCCTTTATT GTACTTATCA TTTTTACTAT ATGTTTTGTT 840 CCCTATCATG CCTTTCGATT CATCTACATT TCTTCACAGC TAAATGTATC ATCTTGCTAC 900 TGGAAAGAAA TTGTTCACAA AACCAATGAG ATCATGCTGG TTCTCTCATC TTTCAATAGT 960 TGCTTAGATC CAGTCATGTA TTTCCTGATG TCCAGTAACA TTCGCAAAAT AATGTGCCAA 1020 CTTCTTTTTA GACGATTTCA AGGTGAACCA AGTAGGAGTG AAAGCACTTC AGAATTTAAA 1080 CCAGGATACT CCCTGCATGA TACATCTGTG GCAGTGAAAA TACAGTCTAG TTCTAAAAGT 1140 ACTTGA 1146

【００７３】（２）配列番号２に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３８１アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：タンパク質 （ｘｉ）配列の記載：配列番号２： Met Arg Ser His Thr Ile Thr Met Thr Thr Thr Ser Val Ser Ser Trp 1 5 10 15 Pro Tyr Ser Ser His Arg Met Arg Phe Ile Thr Asn His Ser Asp Gln 20 25 30 Pro Pro Gln Asn Phe Ser Ala Thr Pro Asn Val Thr Thr Cys Pro Met 35 40 45 Asp Glu Lys Leu Leu Ser Thr Val Leu Thr Thr Ser Tyr Ser Val Ile 50 55 60 Phe Ile Val Gly Leu Val Gly Asn Ile Ile Ala Leu Tyr Val Phe Leu 65 70 75 80 Gly Ile His Arg Lys Arg Asn Ser Ile Gln Ile Tyr Leu Leu Asn Val 85 90 95 Ala Ile Ala Asp Leu Leu Leu Ile Phe Cys Leu Pro Phe Arg Ile Met 100 105 110 Tyr His Ile Asn Gln Asn Lys Trp Thr Leu Gly Val Ile Leu Cys Lys 115 120 125 Val Val Gly Thr Leu Phe Tyr Met Asn Met Tyr Ile Ser Ile Ile Leu 130 135 140 Leu Gly Phe Ile Ser Leu Asp Arg Tyr Ile Lys Ile Asn Arg Ser Ile 145 150 155 160 Gln Gln Arg Lys Ala Ile Thr Thr Lys Gln Ser Ile Tyr Val Cys Cys 165 170 175 Ile Val Trp Met Leu Ala Leu Gly Gly Phe Leu Thr Met Ile Ile Leu 180 185 190 Thr Leu Lys Lys Gly Gly His Asn Ser Thr Met Cys Phe His Tyr Arg 195 200 205 Asp Lys His Asn Ala Lys Gly Glu Ala Ile Phe Asn Phe Ile Leu Val 210 215 220 Val Met Phe Trp Leu Ile Phe Leu Leu Ile Ile Leu Ser Tyr Ile Lys 225 230 235 240 Ile Gly Lys Asn Leu Leu Arg Ile Ser Lys Arg Arg Ser Lys Phe Pro 245 250 255 Asn Ser Gly Lys Tyr Ala Thr Thr Ala Arg Asn Ser Phe Ile Val Leu 260 265 270 Ile Ile Phe Thr Ile Cys Phe Val Pro Tyr His Ala Phe Arg Phe Ile 275 280 285 Tyr Ile Ser Ser Gln Leu Asn Val Ser Ser Cys Tyr Trp Lys Glu Ile 290 295 300 Val His Lys Thr Asn Glu Ile Met Leu Val Leu Ser Ser Phe Asn Ser 305 310 315 320 Cys Leu Asp Pro Val Met Tyr Phe Leu Met Ser Ser Asn Ile Arg Lys 325 330 335 Ile Met Cys Gln Leu Leu Phe Arg Arg Phe Gln Gly Glu Pro Ser Arg 340 345 350 Ser Glu Ser Thr Ser Glu Phe Lys Pro Gly Tyr Ser Leu His Asp Thr 355 360 365 Ser Val Ala Val Lys Ile Gln Ser Ser Ser Lys Ser Thr 370 375 380

【００７４】（２）配列番号３に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号３： CAGTGTTCCC ACAACCTTGC ACAGAATCAC 30

【００７５】（２）配列番号４に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２２塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：その他 （ｘｉ）配列の記載：配列番号４： ACCTAGTGTCCACTTGTTTTGG 22

【００７６】（２）配列番号５に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号５： GTGATTCTGT GCAAGGTTGT GGGAACACTG 30

【００７７】（２）配列番号６に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２６塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号６： GAACATGTAC ATTAGCATTA TTTTGC 26

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＤＺ Ａ６１Ｋ 48/00 ＡＡＥ 48/00 ＡＡＥ ＡＢＪ ＡＢＪ ＡＢＸ ＡＢＸ ＡＣＤ ＡＣＤ ＡＣＬ ＡＣＬ ＡＣＶ ＡＣＶ ＡＤＹ ＡＤＹ Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ０７Ｋ 14/705 16/28 16/28 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＥ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ナビル・エイ・エルショーバギー アメリカ合衆国19380ペンシルベニア州ウ エスト・チェスター、バウ・トゥリー・ド ライブ1648番

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号２のＨＡＣＣＨ９４ポリペプチ
   ドをコードするヌクレオチド配列とその全長にわたって
   少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を
   含む単離されたポリヌクレオチド、またはそのヌクレオ
   チド配列に相補的なヌクレオチド配列。
2. 【請求項２】 ＤＮＡまたはＲＮＡである請求項１記載
   のポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 ヌクレオチド配列が配列番号１に含まれ
   るものと少なくとも８０％同一である請求項1記載のポ
   リヌクレオチド。
4. 【請求項４】 ヌクレオチド配列がＨＡＣＣＨ９４ポリ
   ペプチドをコードする配列番号１に含まれる配列を含む
   請求項３記載のポリヌクレオチド。
5. 【請求項５】 配列番号１のポリヌクレオチドである請
   求項３記載のポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 発現系を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子で
   あって、発現系が適合可能な宿主細胞中にある場合に、
   その発現系が配列番号２のポリペプチドと少なくとも８
   ０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＡＣＣＨ９
   ４ポリペプチドを産生することができるＤＮＡまたはＲ
   ＮＡ分子。
7. 【請求項７】 請求項６の発現系を有してなる宿主細
   胞。
8. 【請求項８】 請求項７の宿主を、そのポリペプチドを
   産生するのに十分な条件下で培養し、そのポリペプチド
   を培養物から回収することを含むＨＡＣＣＨ９４ポリペ
   プチドの産生法。
9. 【請求項９】 ＨＡＣＣＨ９４ポリペプチドを産生する
   細胞の製造方法であって、宿主細胞が、適当な培養条件
   下、ＨＡＣＣＨ９４ポリペプチドを産生するように、該
   宿主細胞を請求項６記載の発現系でトランスフォーメー
   ションまたはトランスフェクションすることを含む方
   法。
10. 【請求項１０】 配列番号２のアミノ酸配列とその全長
    にわたって少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を
    含むＨＡＣＣＨ９４ポリペプチド。
11. 【請求項１１】 配列番号２のアミノ酸配列を含む請求
    項１０記載のポリペプチド。
12. 【請求項１２】 請求項１０記載ののＨＡＣＣＨ９４ポ
    リペプチドに免疫特異的な抗体。
13. 【請求項１３】 請求項１０記載のＨＡＣＣＨ９４ポリ
    ペプチドの活性または発現を強化する必要性のある対象
    の治療法であって、 （ａ）該対象に該レセプターに対する治療上有効量のア
    ゴニストを投与し；および／または（ｂ）インビボにて
    該レセプターの活性を生じさせるような形態にて、請求
    項1記載のポリヌクレオチドを該対象に付与することを
    含む方法。
14. 【請求項１４】 請求項１０のＨＡＣＣＨ９４ポリペプ
    チドの活性または発現を阻害する必要性のある対象の治
    療法であって、 （ａ）該対象に該レセプターに対する治療上有効量のア
    ンタゴニストを投与し；および／または（ｂ）該対象に
    該レセプターをコードするヌクレオチド配列の発現を阻
    害する核酸分子を投与し；および／または（ｃ）該対象
    にそのリガンドについて該レセプターと競合する治療上
    有効量のポリペプチドを投与することを含む方法。
15. 【請求項１５】 対象での請求項１０記載のＨＡＣＣＨ
    ９４ポリペプチドの発現または活性に関連付けられる対
    象の疾患または疾患への罹病し易さの診断方法であっ
    て、 （ａ）該対象のゲノム中のＨＡＣＣＨ９４ポリペプチド
    をコードするヌクレオチド配列における変異の有無を測
    定し；および／または（ｂ）該対象から由来の試料中の
    ＨＡＣＣＨ９４ポリペプチドの発現の存在または量につ
    いて分析することを含む方法。
16. 【請求項１６】 請求項１０記載のＨＡＣＣＨ９４ポリ
    ペプチドに対するアゴニストの同定方法であって、 （ａ）請求項９に記載の方法により産生される細胞を候
    補化合物と接触させ、（ｂ）候補化合物がＨＡＣＣＨ９
    ４ポリペプチドの活性化により生じるシグナルを発する
    かどうかを測定することを含む方法。
17. 【請求項１７】 請求項１６記載の方法により同定され
    るアゴニスト。
18. 【請求項１８】 請求項１０記載のＨＡＣＣＨ９４ポリ
    ペプチドに対するアンタゴニストの同定方法であって、 （ａ）請求項９記載の方法により産生される細胞をアゴ
    ニストと接触させ、（ｂ）該アゴニストにより生じるシ
    グナルが候補化合物の存在で減じるかどうかを測定する
    ことを含む方法。
19. 【請求項１９】 請求項１８記載の方法により同定され
    るアンタゴニスト。