CN107108730A - Il‑17a结合蛋白 - Google Patents

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Abstract

IL‑17A的结合分子。所述结合分子可用于治疗病症，例如银屑病。

Description

IL-17A结合蛋白
发明领域
本发明涉及IL-17A结合分子，以及这样的结合分子在疾病的治疗中的用途。
引言
银屑病(psoriasis)是影响世界人口的2-3％(～1.25亿患者)的慢性的复发和缓和的炎性皮肤病，其导致显著的发病率和降低的生活品质，这主要归因于在皮肤的可见区域中的临床发作和损毁容貌的病变、系统性表现和药物相关的副作用。在多于80％的患者中观察到了被称为“寻常斑块状银屑病(plaque psoriasis vulgaris)”的疾病的常见形式并且其特征在于红色鳞状斑块(通常在肘部、膝盖、头皮和臀部)，其尺寸可以从最小变化至涉及整个皮肤表面。
取决于体表面积(BSA)涉及的程度，银屑病可以分类为轻度(<3％BSA涉及)、中度(3-10％BSA)和重度(>10％BSA)疾病。局部药剂如皮质类固醇(corticosteroid)、维生素D衍生物、煤焦油和局部类视色素(topical retinoid)是银屑病的初期控制的基础并且是在整个疾病严重程度范围内施加至患者的治疗阶梯(treatment ladder)的重要部分。通常为被诊断患有轻度至中度疾病的患者指定局部药剂作为单一疗法。通常为患有重度疾病的患者指定局部药剂作为光疗法或系统性(小分子)疗法如甲氨蝶呤(methotrexate)、环孢菌素(cyclosporine)或口服类视色素的辅助。用于中度至重度银屑病的治疗方案还包括基于抗体的疗法。
目前市场上用于治疗银屑病的治疗性产品提供不同程度的症状缓解和降低的复发率，但是目前都不被认为是治愈性的并且它们因此需要长期施用。尽管许多现有的局部药剂可以在短时间段内有效，由于限制治疗的毒性，大多数限于短期使用。这意味着，患者需要对副作用的常规监测和新治疗方案的常规循环。
通常为患有重度疾病的患者指定局部药剂作为光疗法或系统性(小分子)疗法如甲氨蝶呤(methotrexate)、环孢菌素(cyclosporine)或口服类视色素的辅助(Nast等人，Arch Dermatol Res(2007)299:111–138)。光疗法可以是有效的，但是是不方便的并且与显著的皮肤癌风险有关。小分子系统性疗法与增加的心血管风险；肾功能障碍、白细胞减少症和血小板减少症有关。例如，甲氨蝶呤可能会导致中性粒细胞减少症(neutropenia)和肝损伤并且在没有适当预防措施的情况下对生育期的男性和女性是禁用的。环孢菌素是强效的免疫抑制剂，其对肾脏和血压具有潜在的副作用。阿昔曲丁(acitretin)是具有一定范围的副作用的口服类视色素，并且在没有适当预防措施的情况下对生育期的女性也是禁用的(Nast等人，Arch Dermatol Res(2007)299:111–138)。
用于中度至重度银屑病的治疗方案还包括基于抗体的疗法。批准的治疗包括阿达木单抗(adalimumab)具有针对TNF-alpha(α)的活性的人源化单克隆抗体、TNF-α抑制剂依那西普(etanercept)TNF-α抑制剂英夫利昔单抗(infliximab)和最近的优特克单抗(ustekinumab)靶向常见的IL12和IL23的p40亚基的人mAb，从而阻断两种细胞因子的信号传导。
近年来，Th17通路的重要性已经在银屑病中充分验证并且多种靶向IL17的单克隆抗体(mAb)已经显示出调节这些细胞因子和影响银屑病的显著重要性。IL-17，衍生自T细胞的细胞因子，是针对皮肤中的局部疗法的靶标。尽管银屑病可以在一些患者中具有系统性组成，该疾病主要是皮肤的疾病。由Th17细胞分泌的IL-17通过在这些细胞上存在的IL-17R配合物作用于表皮角质形成细胞，以引发角质形成细胞过度增殖和正在进行的炎症的反馈回路，从而产生银屑病斑块。据信，病理活性的基本要素是局部在皮肤中的，并且因此IL-17/IL-17R相互作用的抑制是针对局部疗法的最佳验证的靶标。这是与其他验证的Th17靶向相比，如IL-23，其中活性的明显阶段是在区域淋巴结中。
已经显示在开发中的多种其他单克隆抗体药剂明显地降低患有中度至重度斑块状银屑病的患者中的疾病严重程度。这些药剂包括伊赛珠单抗(ixekizumab)(Eli Lilly)和苏金单抗(secukinumab)(Novartis)，二者均靶向IL-17A，并且包括布罗达单抗(brodalumab)(Amgen)，其与IL-17RA结合并且抑制IL-17RA的信号传导并且因此将会预期阻断使用这种受体的IL1-7家族成员，包括IL-17A、IL-17F、IL-17A/F和可能的IL-17E。针对IL-17抑制剂的初步临床结果表明了IL-17A在银屑病病理生理学中的重要性。在至多达并且包括基本上确定的III期试验的独立临床试验程序中，已经报道在患有中度至重度斑块状银屑病的患者中所有三种药剂均明显地降低疾病严重程度。已经显示苏金单抗反向调节与病变皮肤中的炎性反应有关的细胞因子、趋化因子和蛋白质。总而言之，IL-17A的抑制允许选择性干预以处理斑块中失调的免疫系统(Girolomoni等人，The British Journal ofDermatology.2012a；167(4):717-724,Huebner等人，Gut 2012；61:1693-700,Papp等人，New Engl J Med 2012；366:1181-9,Mease 等人，N Engl J Med.2014 12；370(24):2295-306以及Langley等人，New Engl J Med 2014；371:326-38)。
目前市场上用于治疗银屑病的治疗性产品提供不同程度的症状缓解和降低的复发率，但是目前都不被认为是治愈性的并且因此需要长期施用。尽管许多现有的局部药剂可以在短时间段内有效，由于限制治疗的毒性，大多数限于短期使用。这意味着，患者需要对副作用的常规监测和新治疗方案的常规循环。光疗法可以是有效的，但是是不方便的并且与显著的皮肤癌风险有关，并且许多常规(小分子)系统性疗法与增加的心血管风险；肾功能障碍、白细胞减少症和血小板减少症有关。系统性生物制剂已经转变了中度至重度银屑病的治疗，但是与任何免疫抑制方案一样，长期使用可能会具有明显的副作用，如增加的感染或恶性肿瘤的风险。
当前的治疗干预都不是治愈性的，并且因此均需要长期使用。治疗方案必须通过采取降低毒性的策略来考虑这些，包括轮换或连续疗法、药物假期(drug holiday)、和联合疗法。重要的是，对于一些药物来说，对任何一名患者可以安全接受的暴露存在绝对寿命限制。
因此，存在对用于局部和全身用途二者的新型的高度有效并且安全的疗法选项的需要。尤其是，因此存在对在患有重度疾病的患者中具有生物功效的新型局部药物的清楚的未满足的需要，其中长期维持疗法可以在系统性mAb使用之后保持症状处于控制之下并且因此提高长期使用的安全性。类似地，因为它们的疾病不是足够严重而未全身治疗的那些患者将会大幅受益于具有生物功效的药物的局部施用。
已经证实抗体本身是用于治疗大量不同疾病适应症的极有效的治疗剂。尤其是，已经存在开发超过各种备选方案的用于治疗用途的完全人抗体的清楚的趋势。然而，由于它们的尺寸和其他物理性质，目前情况是，单克隆抗体需要静脉内(iv)或皮下(sc)施用并且因此具有高系统性暴露(systemic exposure)。因此，尽管抗体可以是高度有效的，它们的递送途径可能会通常是非最佳的，导致抗体与靶抗原在非疾病位置处结合(潜在地损害正常、非疾病组织的健康功能)或导致非最佳的PK/PD特征。由于非最佳的给药途径，每一种结果都可能会造成功效的丧失和/或受损害的安全性概况。
由于它们的尺寸和其他有利的生物物理特征，抗体片段是用于备选给药途径的潜在的吸引人的候选物。尤其是，VH片段是保持靶标特异性和效力的免疫球蛋白分子的最小、最稳健的部分。因此将会有利的是，在皮肤上局部递送VH结构域，以使得它们穿透至皮肤内治疗上有益的位置以局部治疗疾病。可以进入血流的任何VH都将会被迅速清除并且因此具有很少或没有系统性暴露，从而使潜在的机制相关的系统性毒性最小化。
本发明目标在于提供与IL-17通路有关的病况的安全和有效的疗法，尤其是用于银屑病的局部治疗。
发明概述
在第一方面中，本发明涉及能够结合人IL-17A的结合分子，所述结合分子包含含有CDR3序列的人重链可变免疫球蛋白结构域(VH)，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.3或与SEQID NO.3具有至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同源性的序列。
在第二方面中，本发明涉及包含针对IL-17A的至少一种免疫球蛋白单结构域抗体的结合分子，其中所述结构域是人重链可变免疫球蛋白结构域(VH)，并且其中所述IL-17A结合分子包含含有CDR3序列的至少一个抗原结合位点，所述CDR3序列具有SEQ ID NO.3或与SEQ ID NO.3具有至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同源性的序列。
在第三方面中，本发明涉及能够结合人IL-17A的结合分子，所述结合分子包含含有CDR3序列的人重链可变免疫球蛋白结构域(VH)，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.251或与其具有至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同源性的序列。
在另一个方面中，本发明涉及包含针对IL-17的至少一种免疫球蛋白单结构域抗体的结合分子，其中所述结构域是人重链可变免疫球蛋白结构域(VH)，并且其中所述IL-17结合分子包含含有CDR3序列的至少一个抗原结合位点，所述CDR3序列具有SEQ ID NO.251或与SEQ ID NO.251具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％同源性的序列。
在另一个方面中，本发明涉及能够结合人IL-17A的结合分子，所述结合分子包含含有CDR3序列的VH结构域，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.285或与SEQ ID NO.285具有至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同源性的序列。
在另一个方面中，本发明涉及包含针对IL-17的至少一种免疫球蛋白单结构域抗体的结合分子，其中所述结构域是人VH结构域，并且其中所述IL-17A结合分子包含含有CDR3序列的至少一个抗原结合位点，所述CDR3序列具有SEQ ID NO.287或与SEQ ID NO.287具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％同源性的序列。
在另一个方面中，本发明涉及能够结合人IL-17A的结合分子，所述结合分子包含含有CDR3序列的人VH结构域，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.343或与SEQ ID NO.343具有至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同源性的序列。
在另一个方面中，本发明涉及包含针对IL-17A的至少一种免疫球蛋白单结构域抗体的结合分子，其中所述结构域是人VH结构域，并且其中所述IL-17A结合分子包含含有CDR3序列的至少一个抗原结合位点，所述CDR3序列具有SEQ ID NO.343或与SEQ ID NO.343具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％同源性的序列。
在另一个方面中，本发明涉及能够结合人IL-17A的结合分子，所述结合分子包含含有CDR3序列的人VH结构域，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.347或与SEQ ID NO.347具有至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同源性的序列。
在另一个方面中，本发明涉及包含针对IL-17的至少一种免疫球蛋白单结构域抗体的结合分子，其中所述结构域是人VH结构域，并且其中所述IL-17结合分子包含含有CDR3序列的至少一个抗原结合位点，所述CDR3序列具有SEQ ID NO.347或与SEQ ID NO.347具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％同源性的序列。
在另一个方面中，本发明涉及根据前述权利要求所述的结合分子，其中当根据实施例中所述(即通过测量IL-17结合VH抑制IL-17诱导的从细胞系HT1080中的IL-6释放的能力)进行测试时，具有约0.2至约1000nM的针对IL-6产生的抑制的IC50。
在另一个方面中，本发明涉及根据前述权利要求所述的结合分子，其中所述结合分子具有5x10-9至1x10-11，例如5x10-9至2x10-10的KD(M)值。在另一个方面中，本发明涉及根据前述权利要求所述的结合分子，其中所述结合分子具有如在实施例中给出的KD(M)值。
在另一个方面中，本发明涉及根据前述权利要求所述的结合分子，其中所述结合分子包含针对IL-17A的两种以上免疫球蛋白单结构域抗体，其中所述结构域是VH结构域。
在另一个方面中，本发明涉及包含如以上所定义的结合分子和任选的药物载体的药物组合物。
在另一个方面中，本发明涉及用于治疗自身免疫疾病、炎性病况、过敏和过敏病况、超敏反应、严重感染、和器官或组织移植排斥的方法，所述方法包括施用有效量的如以上所定义的结合分子或药物组合物。
在另一个方面中，本发明涉及用于治疗自身免疫疾病、炎性病况、过敏和过敏病况、超敏反应、严重感染、和器官或组织移植排斥的如以上所定义的结合分子或药物组合物。
在另一个方面中，本发明涉及如以上所定义的结合分子或药物组合物在制造药物中的用途，所述药物用于治疗自身免疫疾病、炎性病况、过敏和过敏病况、超敏反应、严重感染、和器官或组织移植排斥。
在另一个方面中，本发明涉及用于降低人IL-17A活性的体内或体外方法，所述方法包括使人IL-17A与如以上所定义的结合分子接触。
在另一个方面中，本发明涉及用于通过免疫测定来确定试验样品中IL-17A的存在的方法，所述方法包括使所述样品与如以上所定义的结合分子和至少一种可检测标记物接触。
在另一个方面中，本发明涉及分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含编码如以上所定义的结合分子的核苷酸序列。
在另一个方面中，本发明涉及分离的核酸构建体，所述分离的核酸构建体包含如以上所定义的核酸。
在另一个方面中，本发明涉及分离的宿主细胞，所述分离的宿主细胞包含如以上所定义的核酸或构建体。
在另一个方面中，本发明涉及用于制备如以上所定义的结合分子的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达编码所述结合分子的核酸并且将所述结合分子与所述宿主细胞培养物分离。
在另一个方面中，本发明涉及包含如上所述的结合分子的试剂盒。
在另一个方面中，本发明涉及用于制备能够结合人IL-17A的包含至少一种人免疫球蛋白单结构域抗体的结合分子的方法，其中所述结构域是人VH结构域，所述方法包括
a)用IL-17A抗原使转基因小鼠免疫，其中所述小鼠表达包含人重链V基因的核酸构建体并且不能制造功能性内源性轻链或重链，
b)生成包含来自所述小鼠的VH结构域序列的序列的文库和
c)分离包含来自所述文库的VH结构域序列的序列。
在另一个方面中，本发明涉及双互补位、二价或多特异性结合分子，所述结合分子包含如上所述的结合分子。
在另一个方面中，本发明涉及分离的结合分子，所述分离的结合分子包含SEQ IDNo.430、432、434或436。
附图
图1.第1家族氨基酸序列。该图示出了第1家族中的克隆的全长VH序列。标记了构架(FR)和互补决定区(CDR)。CDR1、CDR2和CDR3序列以粗体突出显示。在表1中示出了SEQ IDNO。
图2.第2家族氨基酸序列。该图示出了第2家族中的克隆的全长VH序列。标记了构架(FR)和互补决定区(CDR)。CDR1、CDR2和CDR3序列以粗体突出显示。在表2中示出了SEQ IDNO。
图3.第3家族氨基酸序列。该图示出了第3家族中的克隆的全长VH序列。标记了构架(FR)和互补决定区(CDR)。CDR1、CDR2和CDR3序列以粗体突出显示。在表3中示出了SEQ IDNO。
图4.第4家族氨基酸序列。该图示出了第4家族中的克隆的全长VH序列。标记了构架(FR)和互补决定区(CDR)。CDR1、CDR2和CDR3序列以粗体突出显示。在表4中示出了SEQ IDNO。
图5.第5家族氨基酸序列。该图示出了第5家族中的克隆的全长VH序列。标记了构架(FR)和互补决定区(CDR)。CDR1、CDR2和CDR3序列以粗体突出显示。在表5中示出了SEQ IDNO。
图6.6A.VH 1-02支架(scaffold)的PCR扩增，其中M道：Generuler 1kb DNA梯(Fermentas SM0311)，1道：VH 1-02支架，2道：用于PCR的无模板对照；箭头示出了大约300bp的PCR产物。M：Generuler 1kb DNA梯(Fermentas SM0311)。6B.从cDNA PCR扩增人CDR3结构域，其中M：Generuler 1kb DNA梯(Fermentas SM0311)，1道：从人淋巴结cDNA扩增的CDR3结构域；2道：从人骨髓cDNA扩增的CDR3结构域，3道：从人脾cDNA扩增的CDR3结构域；4道：从人外周血白细胞cDNA扩增的CDR3结构域，5道：用于PCR的无模板对照。箭头示出了在50-100bp范围内的PCR扩增产物。M：Generuler 1kb DNA梯(Fermentas SM0311)。6C.VH 1-02支架加人CDR3结构域的装配和拼接(pull-through)PCR扩增，M道：Generuler 1kb DNA梯(Fermentas SM0311)，1和2道：VH 1-02支架+人CDR3结构域，和3道：用于PCR的无模板对照。箭头示出了大约400bp的PCR产物。M：Generuler 1kb DNA梯(Fermentas SM0311)。
图7示出了确认免疫原诱导的仅有重链的抗体应答的血清ELISA。
图8示出了A：与IL-17A结合的噬菌体ELISA和B：与不相关抗原结合的噬菌体ELISA。
图9示出了来自生物化学抑制测定的数据：A：x轴log10M浓度，y轴％最大信号；对于VH 1.1.1(●)来说，IC50(nM)是53，对于VH 1.6.1(■)来说，IC50(nM)是5，对于VH 1.10.1(▲)来说，IC50(nM)是4；对于VH1.7.1(▼)来说，IC50(nM)是7(●)，对于VH 77G9来说，IC50(nM)是6。B：x轴浓度(M)，y轴％最大信号；对于VH 37E4(●)来说，IC50(nM)是56，对于VH53E11(■)来说，IC50(nM)是195，对于VH 1.1.1(▲)来说，IC50(nM)是29；对于VH 54D5(▼)来说，IC50(nM)是124(●)，对于VH37B5(◆)来说，IC50(nM)未确定。
图10示出了来自基于细胞的测定的数据：A：A：对于VH8E10(■)、VH 2.1.1(●)和VH86A5(○)，x轴示出了浓度M(log)10，y轴示出了光密度OD 450nm。B：对于MAB317(■)、VH1.3.1(▲)、VH 3.2.1(◆)和VH KLH86A5(○)，x轴示出了VH浓度M(log)10，y轴示出了光密度OD450nm。
图11示出了对于A：VH 1.1.1(5nM)、VH 1.10.1(1nM)、VH 1.6.1(630pM)、VH 1.3.1(230pM)的结合测定的结果。
图12VH克隆1.1的优化。在顶部行中示出了克隆1.1的氨基酸序列。
图13A和B示出了特异性ELISA的结果。
图14示出了表位竞争的结果，1.3.1和VH 3.1.1与相同的表位结合，3.2.1与不同的表位结合。
图15示出了A.VH 1.10.1、B.VH 1.17.1、C.VH 1.3.1、D.VH 186D2、E.VH 1.16.1、F.VH 1.22.1、G.VH 1.18.1、H.VH 1.17.1、I.VH 1.21.1、J.VH 1.20.1的HPLC的结果。
图16示出了A：VH 1.3.2(KD 630pM)和VH 1.3.3的结果，B：VH 1.2.2和VH 1.3.3(KD 550pM)的结果和C：VH 1.3.2(●)EC50 5.710e-010；VH 1.2.3(■)EC50 3.998e-010的基于细胞的测定，IL-17A诱导的IL6释放的抑制(18小时)。
图17A.借助SDS-PAGE和SEC-HPLC的最终纯化的VH级分克隆1.10.2的分析。通过4-20％凝胶在还原条件下分析级分。1道，蛋白质标准品(各500ng)；2道，纯化的克隆1.10.2(5μg)。B.通过SEC-HPLC进一步分析纯化的克隆1.10.2以确认蛋白质是单体。
图18.免疫荧光。将完整的和胶带剥离的(tape stripped)人皮肤置于Bronaugh细胞中并且利用具有IgG的PBS温育24小时。在这些实验中的和可以在原始彩色图像中看到的染色如下：红色＝IgG，绿色＝细胞膜中的钙粘着蛋白(cadherin)。顶部一排仅示出了在较亮区域中的IgG检测(IHC图像中的红色)。中间一排仅示出了在较亮区域中的钙粘着蛋白(IHC图像中的绿色)。底部一排示出了合并为一个图像的IgG和钙粘着蛋白检测。
图19.来自对具有克隆1.10.2的完整的正常皮肤的穿透研究的接收液体(纯净)的ELISA结果。对每个样品从左到右以6、12、18和24小时的间隔取样。
图20.来自对具有克隆1.10.2的胶带剥离的皮肤的穿透研究的接收液体(纯净)的ELISA结果。对每个样品从左到右以6、12、18和24小时的间隔取样。
图21.在皮肤中(在原型制剂C1；PBS中)的克隆1.10.2和IgG的IHC图像。在这些实验中的染色如下：红色＝VH(抗His标签)或IgG(抗小鼠IgG)；绿色＝钙粘着蛋白(细胞膜)；蓝色＝细胞核(DNA)。除了最后一栏示出了IgG检测(较亮区域，IHC图像中的红色)，顶部一排仅示出了红色的VH检测。底部一排具有与钙粘着蛋白(较亮区域，IHC图像中的绿色)和细胞核(较亮区域，IHC图像中的蓝色)检测合并的VH/IgG检测(较亮区域，IHC图像中的红色)。
图22.在皮肤中的克隆1.10.2(在原型制剂C2；μ-乳液中)的IHC图像。在这些实验中的染色如下：红色＝VH(抗His标签)；绿色＝钙粘着蛋白(细胞膜)；蓝色＝细胞核(DNA)。从左开始；第1个图像，仅VH检测(较亮区域，红色)，第2个，与钙粘着蛋白(较亮区域，IHC图像中的绿色)和细胞核(较亮区域，IHC图像中的蓝色)检测合并的VH检测(较亮区域，红色)，第3个，仅VH检测(红色)，第4个，与钙粘着蛋白(较亮区域，IHC图像中的绿色)和细胞核(较亮区域，IHC图像中的蓝色)合并的VH检测(较亮区域，IHC图像中的红色)。
图23.在皮肤中的克隆1.10.2(在原型制剂C3；35％DMSO中)的IHC图像。在这些实验中的染色如下：红色＝VH(抗His标签)；绿色＝钙粘着蛋白(细胞膜)；蓝色＝细胞核(DNA)。从左开始；第1个图像，仅VH检测(较亮区域，IHC图像中的红色)，第2个，与钙粘着蛋白(较亮区域，IHC图像中的绿色)和细胞核(较亮区域，IHC图像中的蓝色)检测合并的VH检测(较亮区域，IHC图像中的红色)，第3个，仅VH检测(较亮区域，IHC图像中的红色)，第4个，与钙粘着蛋白(较亮区域，IHC图像中的绿色)和细胞核(较亮区域，IHC图像中的蓝色)合并的VH检测(较亮区域，IHC图像中的红色)。
图24.在皮肤中的克隆1.10.2(在原型制剂1；35％丙二醇中)的IHC图像。在这些实验中的染色如下：红色＝VH(抗His标签)；绿色＝钙粘着蛋白(细胞膜)；蓝色＝细胞核(DNA)。从左开始；第1个图像，仅VH检测(较亮区域，IHC图像中的红色)，第2个，与钙粘着蛋白(较亮区域，IHC图像中的绿色)和细胞核(较亮区域，蓝色)检测合并的VH检测(较亮区域，IHC图像中的红色)，第3个，仅VH检测(较亮区域，IHC图像中的红色)，第4个，与钙粘着蛋白(较亮区域，IHC图像中的绿色)和细胞核(较亮区域，蓝色)合并的VH检测(较亮区域，IHC图像中的红色)。
图25.在皮肤中的克隆1.10.2(在原型制剂2；24％中)的IHC图像。在这些实验中的染色如下：红色＝VH(抗His标签)；绿色＝钙粘着蛋白(细胞膜)；蓝色＝细胞核(DNA)。从左开始；第1个图像，仅VH检测(较亮区域，IHC图像中的红色绿色)，第2个，与钙粘着蛋白(较亮区域，IHC图像中的绿色)和细胞核较亮区域，(较亮区域，IHC图像中的蓝色)检测合并的VH检测(较亮区域，IHC图像中的红色)，第3个，仅VH检测(较亮区域，IHC图像中的红色)，第4个，与钙粘着蛋白(较亮区域，IHC图像中的绿色)和细胞核(较亮区域，IHC图像中的蓝色)合并的VH检测(较亮区域，IHC图像中的红色)。
图26.在皮肤中的克隆1.10.2(在原型制剂3；25％丙二醇和10％EtOH中)的IHC图像。在这些实验中的染色如下：红色＝VH(抗His标签)；绿色＝钙粘着蛋白(细胞膜)；蓝色＝细胞核(DNA)。从左开始；第1个图像，仅VH检测(较亮区域，IHC图像中的红色)，第2个，与钙粘着蛋白(较亮区域，IHC图像中的绿色)和细胞核(较亮区域，IHC图像中的蓝色)检测合并的VH检测(较亮区域，IHC图像中的红色)，第3个，仅VH检测较亮区域，(较亮区域，IHC图像中的红色)，第4个，与钙粘着蛋白(较亮区域，IHC图像中的绿色)和细胞核(较亮区域，IHC图像中的蓝色)合并的VH检测(较亮区域，IHC图像中的红色)。
图27.在皮肤中的克隆1.10.2(在原型制剂4；20％丙二醇、10％肉豆蔻酸异丙酯、3％721和2％72中)的IHC图像。在这些实验中的染色如下：红色＝VH(抗His标签)；绿色＝钙粘着蛋白(细胞膜)；蓝色＝细胞核(DNA)。从左开始；第1个图像，仅VH检测(较亮区域，IHC图像中的红色)，第2个，与钙粘着蛋白(较亮区域，IHC图像中的绿色)和细胞核(较亮区域，IHC图像中的蓝色)检测合并的VH检测较亮区域，(较亮区域，IHC图像中的红色)，第3个，仅VH检测较亮区域，(较亮区域，IHC图像中的红色)，第4个，与钙粘着蛋白(较亮区域，IHC图像中的绿色)和细胞核(较亮区域，IHC图像中的蓝色)合并的VH检测(较亮区域，IHC图像中的红色)。
图28.在皮肤中的克隆1.10.2(在原型制剂5；10％氮酮(Azone)(月桂氮酮(laurocapram))、3％721和2％72中)的IHC图像。在这些实验中的染色如下：红色＝VH(抗His标签)；绿色＝钙粘着蛋白(细胞膜)；蓝色＝细胞核(DNA)。从左开始；第1个图像，仅VH检测(较亮区域，IHC图像中的红色)，第2个，与钙粘着蛋白(较亮区域，IHC图像中的绿色)和细胞核(较亮区域，IHC图像中的蓝色)检测合并的VH检测(较亮区域，IHC图像中的红色)，第3个，仅VH检测(较亮区域，IHC图像中的红色)，第4个，与钙粘着蛋白(较亮区域，绿色)和细胞核(较亮区域，IHC图像中的蓝色)合并的VH检测(较亮区域，IHC图像中的红色)。
图29.示出了结合测定的结果。A：1.1 B.1.10 C.1.1-1.10。
图30.示出了1.3.2-2(G4S)-1.2 2.3.2-6(G4S)-1.2 3.1.2的八隅体分析(Octetanalysis)的结果。
图31.示出了结合测定的结果。1：3.2 2：1.2 3：3.2-2(G4S)-1.2 4：3.2-6(G4S)-1.2；n＝1
图32.示出了关于结合测定的KD测定。1：3.2 2：1.2 3：3.2-2(G4S)-1.2 4：3.2-6(G4S)-1.2n＝2
图33.示出了IL-6释放测定的结果。EC50值在B中示出1■(上曲线)：3.2 2●：1.23▲：3.2-2(G4S)-1.2 4■：3.2-6(G4S)-1.2
详细描述
现在将进一步描述本发明。在以下途径中，更详细地定义了本发明的不同方面。除非明确地相反指出，如此定义的每个方面均可以与任何其他一个方面或多个方面组合。具体地，指出作为优选的或有利的任何特点均可以与指出作为优选的或有利的任何其他一个特征或多个特征组合。
通常，与在本文中所述的细胞和组织培养、病理学、肿瘤学、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交结合使用的命名以及它们的技术是在本领域中公知和常用的那些。除非另外指出，本公开的方法和技术通常根据在本领域中公知的和如在整个说明书中引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中描述的常规方法进行。参见，例如，Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A LaboratoryManual)(第2版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约(1989))。如在本领域中通常完成的或如在本文中所描述的，酶反应和纯化技术根据制造商说明书进行。在本文中所述的与分析化学、合成有机化学、药物和制药化学结合使用的命名以及它们的实验室操作和技术是在本领域中公知和常用的那些。标准技术用于化学合成，化学分析，药物制备、配制、和运输，以及患者的治疗。
细胞因子的IL-17家族包括六个成员，IL-17/IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E/IL-25、和IL-17F，他们由多种细胞类型产生。这个家族的成员具有含有半胱氨酸结折叠结构的高度保守的C端。除作为非共价同型二聚体分泌的IL-17B外，大多数IL-17蛋白作为二硫键连接的二聚物分泌。
借助IL-17家族细胞因子的信号传导通过IL-17受体家族的成员IL-17R/IL-17RA、IL-17B R/IL-17RB、IL-17RC、IL-17RD、和IL-17RE介导。这些受体的激活引发诱导促炎性细胞因子和抗微生物肽的产生的细胞内通路。IL-17A、IL-17F、和IL-17A/F主要通过由IL-17RA和IL-17RC组成的低聚受体复合物由激活的T细胞和信号产生。与该复合物结合的配体导致细胞内衔接蛋白(adaptor protein)Act1和TRAF-6的募集(recruitment)，以及转录因子NFκB、AP-1、和C/EBP的下游激活。IL-17E通过由IL-17RA和IL-17B R/IL-17RB形成的受体复合物激活类似的信号传导通路。借助IL-17E的信号传导诱导Th2型免疫应答并且可以参与促进哮喘的发病。关于由其他IL-17家族细胞因子激活的信号传导通路知道得较少。近期的研究表明，IL-17C主要由上皮细胞产生并且与由IL-17RA和IL-17RE组成的受体复合物结合。借助上皮细胞中的IL-17C的自分泌信号传导刺激抗微生物肽和促炎性细胞因子的产生，但是与IL-17A一样，IL-17C的过度表达可能会促使自身免疫疾病的形成。与IL-17E相似，IL-17B与IL-17B R/IL-17RB结合，但是尚未报道主要的靶细胞和IL-17B信号传导的作用。此外，IL-17D的受体和IL-17RD的配体目前是未知的。
本发明提供了均能够结合人IL-17A的分离的IL-17A结合分子，包含这样的结合分子的、尤其是用于局部施用的药物组合物和制剂，以及编码这样的结合分子的分离的核酸，用于制造这样的结合分子的包含这样的核酸的重组表达载体和宿主细胞。本发明还提供了使用在本文中所公开的结合分子检测人IL-17A、体外或体内抑制人IL-17A的方法，以及治疗疾病的方法。本发明的一个方面提供分离的人抗人IL-17A结合分子，尤其是包含以高亲和力、缓慢解离速率和高中和能力与人IL-17A结合的至少一种单结构域抗体或由所述单结构域抗体组成的那些。
在本发明的优选的实施方案中，结合分子能够与人IL-17A特异性结合并且不与人IL-17家族的成员交叉反应或者不显示出与人IL-17家族的成员的实质结合。由本发明的结合分子展现出的与人IL-17A同系物的这种有限的交叉反应性为它们的治疗和/或诊断用途提供了优势，因为降低了不希望的交叉反应性的副作用。这还提供了在针对治疗施用进行给药方面的优势。因此，本发明的结合分子能够结合/针对人IL-17A。
本发明的IL-17A结合分子与人IL-17A(登录号Q16552(Swiss-Prot)，显示出包含信号肽的全长前体IL-17A，SEQ ID NO.465)和/或食蟹猴IL-17(Uniprot G7P4U9)结合。人IL-17A是由两条155个氨基酸的链组成的同型二聚体。每条多肽链包含23个氨基酸的N端肽，其被切除以产生132个残基的成熟多肽。IL-17A与IL-17受体A和C结合并且通过IL-17受体A和C的激活发挥其作用。
SEQ ID No.465
MTPGKTSLVSLLLLLSLEAIVKAGITIPRNPGCPNSEDKNFPRTVMVNLNIHNRNTNTNPKRSSDYYNRSTSPWNLHRNEDPERYPSVIWEAKCRHLGCINADGNVDYHMNSVPIQQEILVLRREPPHCPNSFRLEKILVSVGCTCVTPIVHHVA
术语“IL-17结合分子”、“IL-17结合蛋白”、“抗IL-17单结构域抗体”或“抗IL-17抗体”都是指能够与人IL-17A抗原结合的分子。因此，如在本文中所使用的，除非另外说明或除非上下文另外指出，IL-17通常是指IL-17A。结合反应可以通过标准方法(定性测定)示出，包括，例如，结合测定、竞争测定或用于确定IL-17与其受体结合的抑制的生物测定或参照其中使用非相关特异性的抗体的阴性对照试验的任何类型的结合测定。术语“IL-17结合分子”包括IL-17结合蛋白或其能够结合人IL-17A的部分。
本发明涉及能够与人IL-17A结合的分离的结合分子，其包含含有参照表1至5如在图1至5中任一个中所示的CDR3序列的重链可变免疫球蛋白结构域(VH)或与其具有至少60％、70％、80％、90％、95％或更高的序列同一性的序列。在一个实施方案中，结合分子包含选自参照表1至5如对于图1至5中的任一个的克隆中的任一个所示出的多组CDR1、2和3序列中的一组CDR1、2和3序列。在一个实施方案中，结合分子包含具有选自参照表1至5如对于图1至5中的任一个的克隆中的任一个所示出的多组CDR1、2和3序列中的一组CDR1、2和3序列的VH结构域。在一个实施方案中，结合分子是仅有重链的抗体。
在另一个方面中，本发明涉及包含针对人IL-17A的至少一种免疫球蛋白单结构域抗体的分离的结合分子，其中所述结构域是VH结构域，并且其中所述IL-17A结合分子包含至少一个抗原结合位点。
在一个实施方案中，结合分子可以包含针对人IL-17A的至少一种免疫球蛋白单结构域抗体，其中所述结构域是包含参照表1至5如在图1至5中任一个中所示的CDR3序列或包含与所述CDR序列具有至少60％、70％、80％、90％、95％或更高的序列同一性的CDR3序列的VH结构域。
在一个实施方案中，所述至少一种免疫球蛋白单结构域抗体包含一组CDR1、2和3或具有选自参照表1至5如对于图1至5中的任一个的克隆中的任一个所示出的多组CDR1、2和3序列中的一组CDR1、2和3序列的VH结构域。在另一个实施方案中，结合分子包含如对于选自克隆1.1至1.69、2.1至2.9、3.1至3.14、4.1或5.1的克隆所示出的VH结构域或者由其组成。
在一个实施方案中，所述序列同源性或同一性是至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
“同源性”通常是指，在对序列进行比对并且在一些实施方案中引入空位(如果需要)以实现最大百分同源性并且不认为任何保守性置换是序列同一性的一部分之后，在候选序列中与同其进行比较的多肽的残基相同的氨基酸残基的百分比。无论是N端或C端延伸、标签或插入，都不应被解释为降低同一性或同源性。用于比对的方法和计算机程序是公知的。
术语“抗体”广义上是指由四个多肽链(两个重(H)链和两个轻(L)链)组成的任何免疫球蛋白(Ig)分子或其抗原结合部分，或保持Ig分子的必需的表位结合特征的任何功能片段、突变体、变体、或其衍生物。这样的突变体、变体、或衍生物抗体形式是在本领域中已知的。在全长抗体中，每个重链由重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每个轻链由轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步分为被称为互补决定区(CDR)的高变区，夹杂有被称为构架区(FR)的更保守的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，其从氨基端到羧基端以下列顺序设置：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、种类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或子类的。
在某些实施方案中，本发明的分离的结合分子包含至少一种单结构域抗体或者由其组成，其中所述结构域是VH结构域。因此，在一个方面中，本发明的结合分子包含具有VH结构域但是没有VL结构域的至少一种免疫球蛋白单一可变重链结构域抗体(sVD、sdAb或ISV)。
已经在本领域中描述了单结构域抗体；它们是其互补决定区是单一结构域多肽、例如VH结构域多肽的一部分的抗体。
如在本文中进一步描述的，结合分子可以包含两个以上VH结构域。如进一步详细解释的，这样的结合分子可以是单特异性的或多特异性的，单价的或多价的。
包含其中所述结构域是VH结构域的单结构域抗体的结合分子也被称为VH。
因此，在本发明的一些实施方案中，结合分子不包含轻链。在一些实施方案中，结合分子不包含重链结构域CH2和CH3。在一些实施方案中，结合分子不包含铰链区和重链结构域CH2和CH3。在一些实施方案中，结合分子不包含重链结构域CH1、CH2、和CH3。在一些实施方案中，结合分子不包含重链结构域CH1、铰链区重链结构域CH2和重链结构域CH3。在一些实施方案中，结合分子不包含轻链、重链结构域CH1、铰链区重链结构域CH2和重链结构域CH3。
每个VH结构域包含从氨基端到羧基端以下列顺序排列的三个CDR和四个FR：FR1、CDR1、FR2，CDR2、FR3、CDR3、FR4。可以对VH构架进行修饰以提高结合性能。例如，VH结构域可以包含C端或N端延伸。在本发明的结合分子的一个实施方案中，VH结构域包含1至10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个额外氨基酸的C端延伸。在一个实施方案中，VH结构域包含CH1结构域的1至12个氨基酸残基，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个额外氨基酸的C端延伸。在一个实施方案中，所述延伸包含至少1个丙氨酸残基，例如单一丙氨酸残基、一对丙氨酸残基或三个丙氨酸残基。这样延伸的VH结构域在本发明的范围内。还在本发明的范围内的是包含额外C端或N端残基，例如接头残基和/或His标签，例如六His的VH结构域。
优选地，一个或多个VH结构域是人VH结构域。如在本文中所使用的，人VH结构域包括来源于或基于人VH结构域氨基酸或核酸序列的VH结构域。因此，术语包括来源于人种系免疫球蛋白序列的可变重链区。如在本文中所使用的，术语人VH结构域包括从表达人免疫球蛋白V基因的转基因小鼠(尤其是相应于利用抗原目标的免疫)中分离的VH结构域。本发明的人VH结构域可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，体外引入的突变，例如，通过随机或定点诱变(site-specificmutagenesis)，或者通过体内体细胞突变引入的)。因此术语“人VH结构域”还包括修饰的人VH序列。
因此，本发明提供了包含能够结合/针对IL-17A的至少一种免疫球蛋白单结构域抗体的结合分子，其中所述结构域是人VH结构域，并且其中所述IL-17A结合分子包含至少一个抗原结合位点。单结构域抗体特异性针对人IL-17A。
如在本文中所使用的，术语VH或“可变结构域”是指由Kabat等人，免疫学目的序列(Sequences of Immunological Interest)，第5版，美国卫生与公众服务部(U.S.Dept.Health&Human Services)，华盛顿特区(1991)所定义的免疫球蛋白可变结构域。在可变结构域内的CDR氨基酸残基的编号和定位是根据公知的Kabat编号习惯。
更具体地，本发明提供了可以以如在本文中进一步描述的亲和力、Kon速率、Koff速率、KD和/或KA与人IL-17结合的VH免疫球蛋白结构域。
本发明的结合分子包含如在本文中示出的氨基酸序列或者由其组成，并且其优选的序列和/或部分如CDR是在本文中定义的。
术语“CDR”是指在抗体可变序列内的互补决定区。在重链和轻链的可变区中的每一个中存在三个CDR，其对于可变区中的每一个来说表示为CDR1、CDR2和CDR3。术语“CDR组”是指在能够结合抗原的单一可变区中出现的一组三个CDR。已经根据不同的系统不同地限定了这些CDR的确切边界。由Kabat描述的系统是在本文中使用的。术语“Kabat编号”、“Kabat定义”和“Kabat标记”在本文中可互换使用。在本领域中接受的这些术语是指对与抗体或其抗原结合部分的重和轻链可变区中的其他氨基酸残基相比更可变(即高变)的氨基酸残基进行编号的系统(Kabat等人，(1971)Ann.NY Acad.Sci.190:382-391和Kabat等人，(1991)免疫学目的蛋白质的序列(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)，第五版，美国卫生与公众服务部(U.S.Department of Health and HumanServices)，NIH出版号91-3242)。
如在实验部分中更详细描述的，分离了五个亲本结合分子(得到5个家族的克隆：克隆1.1是如在图1中所示的第1家族的亲本克隆，克隆2.1是如在图2中所示的第2家族的亲本克隆，克隆3.1是如在图3中所示的第3家族的亲本克隆，克隆4.1是如在图4中所示的第4家族的亲本克隆，并且克隆5.1是如在图5中所示的第5家族的亲本克隆)；如在图1、2、3、4和5中所示，每个亲本分子具有一组CDR序列(CDR1、2和3)。通过优化的过程，针对第1、2、3、4和5家族中的每一个生成具有来源于亲本CDR3序列的CDR3序列的一组克隆。如在实施例中所示，与亲本分子相比，优化的VH结构域序列在基于IL-17细胞的测定中显示出提高的与IL-17A的亲和力和提高的效力。
在一个方面中，本发明涉及能够结合人IL-17A的结合分子，所述结合分子包含含有第1家族或类似第1家族的序列的人VH结构域。
在一个实施方案中，结合分子包含能够结合/针对IL-17A、优选人IL-17A的至少一种免疫球蛋白单结构域抗体或者由其组成，其中所述结构域是人VH结构域，并且其中所述IL-17A结合分子包含第1家族或类似第1家族的序列。这些包括亲本克隆(克隆1.1，SEQ IDNO.4)的序列或其部分，例如CDR3序列，以及通过优化过程来源于亲本克隆1.1的克隆的序列，例如如在图1中所示的序列。根据如下所示的表1对第1家族中的克隆的CDR序列或其部分和全长VH序列进行编号。
表1.这示出了在本发明的范围内的第1家族CDR氨基酸序列和第1家族全长VH序列的SEQ ID NO。相应的序列在图1中示出。
在一个方面中，本发明涉及第1家族或类似第1家族的结合分子，所述结合分子包含含有CDR3序列的人VH结构域，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.3或与SEQ ID NO.3具有至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％同源性的序列。
在一个实施方案中，第1家族或类似第1家族的结合分子包含针对IL-17A的至少一种免疫球蛋白单结构域抗体，其中所述结构域是人VH结构域，并且其中所述人VH结构域包含含有CDR3序列的至少一个抗原结合位点，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.3或与SEQ ID NO.3具有至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％同源性的序列。
在这些方面的一个实施方案中，同源性为与SEQ ID NO.3至少90％的同源性。
在一个实施方案中，VH结构域包含含有选自下列各项的氨基酸序列或者由其组成的CDR3序列：SEQ ID NO.3、7、11、15、19、23、27、31、35、39、43、47、51、55、59、63、67、71、75、79、83、87、91、95、99、103、107、111、115、119、123、127、131、135、139、143、147、151、155、159、163、167、171、175、179、183、187、191、195、199、203、207、211、215、219、223、227、231、235、239、243或247、440、444、448、452、456、460或464。
在一个实施方案中，第1家族或类似第1家族的结合分子包含含有CDR1、CDR2和CDR3的至少一个抗原结合位点，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.1或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％同源性的序列，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ IDNO.2或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％同源性的序列，并且所述CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.3或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％同源性的序列。例如，CDR序列可以是选自图1中所示的序列中的一个的CDR序列。
在一个实施方案中，所述CDR1包含如在SEQ ID NO.1或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的序列中所示的氨基酸序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR2包含如在SEQ ID NO.2或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的序列中所示的氨基酸序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR3包含如在SEQ ID NO.3或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列中所示的氨基酸序列或者由其组成。
在一个实施方案中，VH结构域的CDR序列是在图1中如对于克隆1.1至1.69所示出的或它们的组合。在一个实施方案中，CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、53、57、61、65、69、73、77、81、85、89、93、97、101、105、109、113、117、121、125、129、133、137、141、145、149、153、157、161、165、169、173、177、181、185、189、193、197、201、205、209、213、217、221、225、229、233、237、241、245、438、442、446、450、454、458或462或者由其组成，CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、122、126、130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226、230、234、238、242、246、439、443、447、451、455、459或463或者由其组成，并且CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.3、7、11、15、19、23、27、31、35、39、43、47、51、55、59、63、67、71、75、79、83、87、91、95、99、103、107、111、115、119、123、127、131、135、139、143、147、151、155、159、163、167、171、175、179、183、187、191、195、199、203、207、211、215、219、223、227、231、235、239、243、247 440、444、448、452、456、460或464或者由其组成。
在一个实施方案中，CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.1或者由其组成，CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.2或者由其组成，并且CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.3或者由其组成。
在一个方面中，本发明还涉及具有如图1中对于克隆1.1至1.69所示出的CDR1、CDR2和CDR3的组合的VH结构域。在一个实施方案中，结合分子具有如图1中对于克隆1.1至1.22所示出的CDR1、CDR2和CDR3的组合。因此，在一个实施方案中，结合分子包含CDR1、2和3序列，其中CDR1是SEQ ID NO.1，CDR2是SEQ ID NO.2并且CDR3是SEQ ID NO.3。在另一个实施方案中，结合分子包含CDR1、2和3序列，其中CDR1是SEQ ID NO.5，CDR2是SEQ ID NO.6并且CDR3是SEQ ID NO.7。在另一个实施方案中，结合分子包含CDR1、2和3序列，其中CDR1是SEQ ID NO.9，CDR2是SEQ ID NO.10并且CDR3是SEQ ID NO.11。在另一个实施方案中，结合分子包含CDR1、2和3序列，其中CDR1是SEQ ID NO.13，CDR2是SEQ ID NO.14并且CDR3是SEQID NO.15。在另一个实施方案中，结合分子包含CDR1、2和3序列，其中CDR1是SEQ ID NO.17，CDR2是SEQ ID NO.18并且CDR3是SEQ ID NO.19。在另一个实施方案中，结合分子包含CDR1、2和3序列，其中CDR1是SEQ ID NO.21，CDR2是SEQ ID NO.22并且CDR3是SEQ ID NO.23。在另一个实施方案中，结合分子包含CDR1、2和3序列，其中CDR1是SEQ ID NO.25，CDR2是SEQ IDNO.26并且CDR3是SEQ ID NO.27。在另一个实施方案中，结合分子包含CDR1、2和3序列，其中CDR1是SEQ ID NO.29，CDR2是SEQ ID NO.30并且CDR3是SEQ ID NO.31。在另一个实施方案中，结合分子包含CDR1、2和3序列，其中CDR1是SEQ ID NO.33，CDR2是SEQ ID NO.34并且CDR3是SEQ ID NO.35。在另一个实施方案中，结合分子包含CDR1、2和3序列，其中CDR1是SEQID NO.37，CDR2是SEQ ID NO.38并且CDR3是SEQ ID NO.39。在另一个实施方案中，CDR1是SEQ ID NO.41，CDR2是SEQ ID NO.42并且CDR3是SEQ ID NO.43。在另一个实施方案中，结合分子包含CDR1、2和3序列，其中CDR1是SEQ ID NO.45，CDR2是SEQ ID NO.46并且CDR3是SEQID NO.47。在另一个实施方案中，结合分子包含CDR1、2和3序列，其中CDR1是SEQ ID NO.49，CDR2是SEQ ID NO.50并且CDR3是SEQ ID NO.51。在另一个实施方案中，结合分子包含CDR1、2和3序列，其中CDR1是SEQ ID NO.53，CDR2是SEQ ID NO.54并且CDR3是SEQ ID NO.55。在另一个实施方案中，结合分子包含CDR1、2和3序列，其中CDR1是SEQ ID NO.57，CDR2是SEQ IDNO.58并且CDR3是SEQ ID NO.59。在另一个实施方案中，结合分子包含CDR1、2和3序列，其中CDR1是SEQ ID NO.61，CDR2是SEQ ID NO.62并且CDR3是SEQ ID NO.63。在另一个实施方案中，结合分子包含CDR1、2和3序列，其中CDR1是SEQ ID NO.65，CDR2是SEQ ID NO.66并且CDR3是SEQ ID NO.67。在另一个实施方案中，结合分子包含CDR1、2和3序列，其中CDR1是SEQID NO.69，CDR2是SEQ ID NO.70并且CDR3是SEQ ID NO.71。在另一个实施方案中，结合分子包含CDR1、2和3序列，其中CDR1是SEQ ID NO.73，CDR2是SEQ ID NO.74并且CDR3是SEQ IDNO.75。在另一个实施方案中，结合分子包含CDR1、2和3序列，其中CDR1是SEQ ID NO.77，CDR2是SEQ ID NO.78并且CDR3是SEQ ID NO.79。在另一个实施方案中，结合分子包含CDR1、2和3序列，其中CDR1是SEQ ID NO.81，CDR2是SEQ ID NO.82并且CDR3是SEQ ID NO.83。在另一个实施方案中，结合分子包含CDR1、2和3序列，其中CDR1是SEQ ID NO.85，CDR2是SEQ IDNO.86并且CDR3是SEQ ID NO.87。
在一个实施方案中，第1家族或类似第1家族的序列具有包含SEQ ID NO.4或与其具有至少40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、96％、97％、98％、99％同源性的序列或者由其组成的VH结构域。在一个实施方案中，同源性为至少70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。这样的VH序列的CDR序列在图1中示出。例如，VH结构域包含SEQ ID NO.4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228、232、236、240、244或248、441、445、449、453、457、461或466或者由其组成。
在另一个实施方案中，VH结构域选自以上序列中的一个，但是包含一个或多个氨基酸置换，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸置换是在构架区中的一个或多个中。在另一个实施方案中，一个或多个氨基酸置换是在CDR中的一个或多个中。在一个实施方案中，氨基酸置换是构架和CDR序列中。在一个实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO.4或8或包含一个或多个氨基酸置换、例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换的序列，或者由其组成。
在另一个方面中，本发明涉及包含针对IL-17A的至少一种免疫球蛋白单结构域抗体或者由其组成的结合分子，其中所述结构域是人VH结构域，并且其中所述VH结构域包含SEQ ID NO.4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228、232、236、240、244、248、441、445、449、453、457、461或466或与其具有至少40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、96％、97％、98％或99％同源性的序列，或者由其组成。
在另一个方面中，本发明涉及结合分子，其包含如在SEQ ID NO.4或与SEQ IDNO.4相比具有以下置换的其变体中所示的VH结构域或者由其组成：残基1是Q，残基11是M或W，残基13是L或R，残基24是T，残基33是G、R、N或Q，残基50是E、K、S、N、G或R，残基52是K、E、G、D或R，残基53是P，残基54是T，残基57是Q、E或K，残基61是A，残基62是S或G，残基77是K，和/或残基13是Y。
第1家族或类似第1家族的结合分子优选具有如在本文中进一步描述的并且如在实施例中所示的并且以下进一步给出的KD、Koff、KA、Kd和IC50值。
术语“KD”是指“平衡解离常数”并且是指在滴定测量中在平衡时得到的值，或通过解离速率常数(Koff)除以结合速率常数(Kon)得到的值。“KA”是指亲和力常数。结合速率常数、解离速率常数和平衡解离常数用于表示抗体与抗原的结合亲和力。用于确定结合和解离速率常数的方法是在本领域内公知的。使用基于荧光的技术提供高灵敏度和在平衡时检查生理缓冲液中的样品的能力。可以使用其他实验方法和仪器如(生物分子相互作用分析)。
在一个方面中，本发明涉及能够结合人IL-17A的结合分子，所述结合分子包含含有第2家族或类似第2家族的序列的人VH结构域。
在一个实施方案中，结合分子包含针对IL-17A、优选人IL-17A的至少一种免疫球蛋白单结构域抗体或者由其组成，其中所述结构域是人VH结构域，并且其中所述IL-17A结合分子包含第2家族或类似第2家族的序列。这些包括亲本序列(克隆2.1；SEQ ID NO.252)或其部分以及来源于亲本克隆(克隆2.1)的克隆的序列或其部分，例如CDR3序列，以及通过优化过程来源于亲本克隆2.1的克隆的VH序列或其部分，例如如在图2中所示。根据如下所示的表2对第2家族中的克隆的CDR序列和全长序列进行编号。
表2.这示出了在本发明的范围内的第2家族CDR序列和第2家族全长VH序列的SEQID NO。相应的序列在图2中示出。
在一个方面中，本发明涉及第2家族或类似第2家族的结合分子，所述结合分子包含含有CDR3序列的人VH结构域，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.251或与SEQ ID NO.251具有至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％同源性的序列。
在一个实施方案中，第2家族或类似第2家族的结合分子包含针对IL-17A的至少一种免疫球蛋白单结构域抗体，其中所述结构域是人VH结构域，并且其中所述人VH结构域包含含有CDR3序列的至少一个抗原结合位点，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.251或与SEQ IDNO.251具有至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％同源性的序列。
在这些方面的一个实施方案中，同源性为至少90％。
在一个实施方案中，VH结构域包含选自SEQ ID NO.251、255、259、263、267、271、275、279或283的CDR3或者由其组成。
在一个实施方案中，第2家族或类似第2家族的序列包含含有针对IL-17的至少一种免疫球蛋白单结构域抗体或者由其组成的结合分子，其中所述结构域是人VH结构域，并且其中所述IL-17结合分子包含含有CDR1、CDR2和CDR3的至少一个抗原结合位点，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.249或与其具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％同源性的序列或者由其组成，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.250或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％同源性的序列或者由其组成，并且所述CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.251或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.249或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、96％、97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.250或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.251或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，VH结构域的CDR序列是如对于如在图2中的克隆2.1至2.9所示出的或它们的组合。在一个实施方案中，CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.249、253、257、261、265、269、273、277或281或者由其组成，CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.250、254、258、262、266、270、274、278或282或者由其组成，并且CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.251、255、259、263、267、271、275、279或283或者由其组成。
在一个方面中，本发明涉及具有如对于图2中的2.1至2.9所示出的CDR1、CDR2和CDR3的组合的VH结构域。因此，在一个实施方案中，结合分子包含CDR1、2和3序列，其中CDR1是SEQ ID NO.249，CDR2是SEQ ID NO.250并且CDR3是SEQ ID NO.251。在一个实施方案中，结合分子包含CDR1、2和3序列，其中CDR1是SEQ ID NO.253，CDR2是SEQ ID NO.254并且CDR3是SEQ ID NO.255。因此，在一个实施方案中，结合分子包含CDR1、2和3序列，其中CDR1是SEQID NO.257，CDR2是SEQ ID NO.258并且CDR3是SEQ ID NO.259。在一个实施方案中，结合分子包含CDR1、2和3序列，其中CDR1是SEQ ID NO.261，CDR2是SEQ ID NO.262并且CDR3是SEQID NO.263。在一个实施方案中，结合分子包含CDR1、2和3序列，其中CDR1是SEQ ID NO.265，CDR2是SEQ ID NO.266并且CDR3是SEQ ID NO.267。在一个实施方案中，结合分子包含CDR1、2和3序列，其中CDR1是SEQ ID NO.269，CDR2是SEQ ID NO.270并且CDR3是SEQ ID NO.271。在一个实施方案中，结合分子包含CDR1、2和3序列，其中CDR1是SEQ ID NO.273，CDR2是SEQID NO.274并且CDR3是SEQ ID NO.275。在一个实施方案中，结合分子包含CDR1、2和3序列，其中CDR1是SEQ ID NO.277，CDR2是SEQ ID NO.278并且CDR3是SEQ ID NO.279。在一个实施方案中，结合分子包含CDR1、2和3序列，其中CDR1是SEQ ID NO.281，CDR2是SEQ ID NO.282并且CDR3是SEQ ID NO.283。
在一个实施方案中，第2家族或类似第2家族的序列具有包含SEQ ID NO.252或与其具有至少40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、87％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、96％、97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成的VH结构域。在一个实施方案中，同源性为至少70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。这样的序列的CDR序列在图2中示出。例如，VH结构域包含SEQ ID NO.252、256、260、264、268、272、276、280或284或者由其组成。
在一个实施方案中，第2家族或类似第2家族的序列具有包含SEQ ID NO.252、256、260、264、268、272、276、280或284或与其具有至少70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、96％、97％、98％、99％同源性的序列或者由其组成的VH结构域。以下列出了这样的序列的CDR序列。
在另一个实施方案中，VH结构域选自以上序列中的一个，但是包含一个或多个氨基酸置换，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸置换是在构架区中的一个或多个中。在另一个实施方案中，一个或多个氨基酸置换是在CDR中的一个或多个中。在一个实施方案中，氨基酸置换是构架和CDR序列中。在一个实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO.252或包含一个或多个氨基酸置换、例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换的序列，或者由其组成。
在另一个方面中，本发明涉及结合分子包含如在SEQ ID NO.252或与SEQ IDNO.252相比具有以下置换的其变体中所示的VH结构域或者由其组成：残基1是Q，31是A或G，残基是W，残基43是A，残基50是N，残基77是N和/或残基78是A。
第2家族或类似第2家族的结合分子具有如在本文中进一步描述的并且如在实施例中所示的并且以下进一步讨论的KD、Koff、KA、Kd和IC50值。
在一个方面中，本发明涉及能够结合人IL-17A的结合分子，所述结合分子包含含有第3家族或类似第3家族的序列的人VH结构域。
在一个实施方案中，结合分子包含针对IL-17、优选人IL-17的至少一种免疫球蛋白单结构域抗体或者由其组成，其中所述结构域是人VH结构域，并且其中所述IL-17结合分子包含第3家族或类似第3家族的序列。这些包括亲本克隆序列(SEQ ID NO.288)或其部分以及来源于亲本克隆3.1的克隆的序列或其部分，例如CDR3序列，以及通过优化过程来源于亲本克隆3.1的克隆的VH序列或其部分，例如如在图3中所示。根据如下所示的表3对第3家族中的克隆的CDR序列和全长序列进行编号。
表3.这示出了在本发明的范围内的第3家族CDR序列和第3家族全长VH序列的SEQID NO。相应的序列在图3中示出。
在一个方面中，本发明涉及第3家族或类似第3家族的结合分子，所述结合分子包含含有CDR3序列的人VH结构域，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.287或与SEQ ID NO.287具有至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％同源性的序列。
在一个实施方案中，第3家族或类似第3家族的结合分子包含针对IL-17A的至少一种免疫球蛋白单结构域抗体，其中所述结构域是人VH结构域，并且其中所述人VH结构域包含含有CDR3序列的至少一个抗原结合位点，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.287或与SEQ IDNO.287具有至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％同源性的序列。
在这些方面的一个实施方案中，同源性为至少90％。
在一个方面中，CDR3序列包含选自SEQ ID NO.287、291、295、299、303、307、311、315、319、323、327、335或339的氨基酸序列或者由其组成。
在一个实施方案中，第3家族或类似第3家族的序列包含含有针对IL-17A的至少一种免疫球蛋白单结构域抗体或者由其组成的结合分子，其中所述结构域是人VH结构域，并且其中所述IL-17A结合分子包含含有CDR1、CDR2和CDR3的至少一个抗原结合位点，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.285或与其具有至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％同源性的序列或者由其组成，所述CDR2包含氨基酸序列SEQID NO.286或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％同源性的序列或者由其组成，并且所述CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.287或与其具有至少70、至少80％、至少90％、至少95％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.285或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、96％、97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.286或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.287或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，VH结构域的CDR序列是如对于如在图3中的克隆3.1至3.14所示出的或它们的组合。
在一个方面中，本发明涉及具有如对于图3中的克隆3.1至3.14所示出的CDR1、CDR2和CDR3的组合的VH结构域。
在一个实施方案中，CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.285、289、293、297、301、305、309、313、317、321、325、329、333或337或者由其组成，CDR2包含氨基酸序列286、290、294、298、302、306、310、314、318、322、326、330、334或338或者由其组成，并且CDR3包含氨基酸序列287、291、295、299、303、307、311、315、319、323、327、335或339或者由其组成。
在一个方面中，本发明涉及具有如对于图3中的3.1至3.14所示出的CDR1、CDR2和CDR3的组合的VH结构域。因此，在一个实施方案中，结合分子包含CDR1、2和3序列，其中CDR1是SEQ ID NO.285，CDR2是SEQ ID NO.286并且CDR3是SEQ ID NO.287。在一个实施方案中，结合分子包含CDR1、2和3序列，其中CDR1是SEQ ID NO.289，CDR2是SEQ ID NO.290并且CDR3是SEQ ID NO.291。因此，在一个实施方案中，结合分子包含CDR1、2和3序列，其中CDR1是SEQID NO.293，CDR2是SEQ ID NO.294并且CDR3是SEQ ID NO.295。在一个实施方案中，结合分子包含CDR1、2和3序列，其中CDR1是SEQ ID NO.297，CDR2是SEQ ID NO.298并且CDR3是SEQID NO.299。在一个实施方案中，结合分子包含CDR1、2和3序列，其中CDR1是SEQ ID NO.301，CDR2是SEQ ID NO.302并且CDR3是SEQ ID NO.303。在一个实施方案中，结合分子包含CDR1、2和3序列，其中CDR1是SEQ ID NO.305，CDR2是SEQ ID NO.306并且CDR3是SEQ ID NO.307。在一个实施方案中，结合分子包含CDR1、2和3序列，其中CDR1是SEQ ID NO.309，CDR2是SEQID NO.310并且CDR3是SEQ ID NO.311。在一个实施方案中，结合分子包含CDR1、2和3序列，其中CDR1是SEQ ID NO.313，CDR2是SEQ ID NO.314并且CDR3是SEQ ID NO.315。在一个实施方案中，结合分子包含CDR1、2和3序列，其中CDR1是SEQ ID NO.317，CDR2是SEQ ID NO.318并且CDR3是SEQ ID NO.319。在一个实施方案中，结合分子包含CDR1、2和3序列，其中CDR1是SEQ ID NO.321，CDR2是SEQ ID NO.322并且CDR3是SEQ ID NO.323。在一个实施方案中，结合分子包含CDR1、2和3序列，其中CDR1是SEQ ID NO.325，CDR2是SEQ ID NO.326并且CDR3是SEQ ID NO.327。在一个实施方案中，结合分子包含CDR1、2和3序列，其中CDR1是SEQ IDNO.329，CDR2是SEQ ID NO.330并且CDR3是SEQ ID NO.331。在一个实施方案中，结合分子包含CDR1、2和3序列，其中CDR1是SEQ ID NO.333，CDR2是SEQ ID NO.334并且CDR3是SEQ IDNO.335。在一个实施方案中，结合分子包含CDR1、2和3序列，其中CDR1是SEQ ID NO.337，CDR2是SEQ ID NO.338并且CDR3是SEQ ID NO.339。
在一个实施方案中，第3家族或类似第3家族的序列具有包含SEQ ID NO.288或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、96％、97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成的VH结构域。这样的序列的CDR序列在图3中示出。例如，VH结构域包含SEQ ID NO.292、296、300、304、308、312、316、320、324、328、332、336或340或者由其组成。
在一个实施方案中，第3家族或类似第3家族的序列具有包含SEQID NO.288、292、296、300、304、308、312、316、320、324、328、332、336或340或与其具有至少至少40％、50％、60％、70％、80％或90％同源性的序列或者由其组成的VH结构域。在一个实施方案中，同源性为至少70％、80％、81％、82％、83％、84％、86％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、96％、97％、98％或99％。以下列出了这样的序列的CDR序列。
在另一个实施方案中，VH结构域选自以上序列中的一个，但是包含一个或多个氨基酸置换，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸置换是在构架区中的一个或多个中。在另一个实施方案中，一个或多个氨基酸置换是在CDR区中的一个或多个中。在一个实施方案中，氨基酸置换是构架和CDR序列中。在一个实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO.288或包含一个或多个氨基酸置换、例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换的序列，或者由其组成。
在另一个方面中，本发明涉及结合分子，其包含如在SEQ ID NO.288或与SEQ IDNO.288相比具有以下置换的其变体中所示的VH结构域或者由其组成：残基23是A，残基28是N，残基29是A或L，残基31是A或D，残基33是H，残基34是I或L，残基35是N，残基50是S，残基52是K，残基55是T，残基57是A或T，残基58是K，残基62是R，残基63是E，残基65是E，残基50是I或T，残基99是L，残基103是T、Q，残基104是R、F或W，残基105是Y、S、或D，残基106是P或F，残基107是H、N或G，残基108是D或S和/或残基110是Y或A或W。
第3家族或类似第3家族的结合分子具有如在本文中进一步描述的并且如在实施例中所示的KD、Koff、KA、Kd和IC50值。
在一个方面中，本发明涉及能够结合人IL-17A的结合分子，所述结合分子包含含有第4家族或类似第4家族的序列的人VH结构域。
在一个实施方案中，结合分子包含针对IL-17A、优选人IL-17A的至少一种免疫球蛋白单结构域抗体或者由其组成，其中所述结构域是人VH结构域，并且其中所述IL-17A结合分子包含第4家族或类似第4家族的序列。这些包括如在图4中所示的亲本克隆序列(4.1；SEQ ID NO.288)或其部分，例如CDR3序列，以及通过优化过程来源于亲本克隆4的克隆的VH序列或其部分，例如如在图4中所示。根据如下所示的表4对第4家族中的克隆的CDR序列和全长序列进行编号。
表4在本发明的范围内的第4家族CDR序列和VH序列。相应的序列在图4中示出。
在一个方面中，本发明涉及第4家族或类似第4家族的结合分子，所述结合分子包含含有CDR3序列的人VH结构域，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.343或与SEQ ID NO.343具有至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％同源性的序列。
在一个实施方案中，第4家族或类似第4家族的结合分子包含针对IL-17A的至少一种免疫球蛋白单结构域抗体，其中所述结构域是人VH结构域，并且其中所述人VH结构域包含含有CDR3序列的至少一个抗原结合位点，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.343或与SEQ IDNO.343具有至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％同源性的序列。
在一个实施方案中，第4家族或类似第4家族的序列包含含有针对IL-17A的至少一种免疫球蛋白单结构域抗体或者由其组成的结合分子，其中所述结构域是人VH结构域，并且其中所述IL-17A结合分子包含含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的至少一个抗原结合位点，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.341或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％同源性的序列或者由其组成，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.342或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％同源性的序列或者由其组成，并且所述CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.343或与其具有至少80％、至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.341或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.342或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.343或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，第4家族或类似第4家族的序列具有包含SEQ ID NO.344或与其具有至少40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成的VH结构域。以下列出了这样的序列的CDR序列。在一个实施方案中，同源性为至少70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在另一个实施方案中，VH结构域包含如以上所示的序列，但是包含一个或多个氨基酸置换，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸置换是在构架区中的一个或多个中。在另一个实施方案中，一个或多个氨基酸置换是在CDR中的一个或多个中。在一个实施方案中，氨基酸置换是构架和CDR序列中。在一个实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO.344或包含一个或多个氨基酸置换、例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换的序列，或者由其组成。
第4家族或类似第4家族的结合分子具有如在本文中进一步描述的并且如在实施例中所示的KD、Koff、KA、Kd和IC50值。
在一个方面中，本发明涉及能够结合人IL-17A的结合分子，所述结合分子包含含有第5家族或类似第5家族的序列的人VH结构域。
在一个方面中，本发明涉及包含针对IL-17A、优选人IL-17A的至少一种免疫球蛋白单结构域抗体或者由其组成的结合分子，其中所述结构域是人VH结构域，并且其中所述IL-17结合分子包含第5家族或类似第5家族的序列。这些包括如在图5中所示的亲本克隆序列(5.1；SEQ ID NO.348)或其部分以及可以来源于亲本克隆5的克隆的序列或其部分，例如CDR3序列，以及通过优化过程来源于亲本克隆5的克隆的VH序列或其部分，例如如在图5中所示。根据如下所示的表5对第5家族中的克隆的CDR序列和全长序列进行编号。
表5：在本发明的范围内的第5家族CDR序列和VH序列。相应的序列在图5中示出。
在一个实施方案中，第5家族或类似第5家族的结合分子包含含有CDR3序列的人VH结构域，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.287或与SEQ ID NO.347具有至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％同源性的序列。
在一个实施方案中，第5家族或类似第5家族的结合分子包含针对IL-17A的至少一种免疫球蛋白单结构域抗体，其中所述结构域是人VH结构域，并且其中所述人VH结构域包含含有CDR3序列的至少一个抗原结合位点，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.347或与SEQ IDNO.287具有至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％同源性的序列。
在一个实施方案中，第5家族或类似第5家族的序列包含含有针对IL-17A的至少一种免疫球蛋白单结构域抗体或者由其组成的结合分子，其中所述结构域是人VH结构域，并且其中所述IL-17A结合分子包含含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的至少一个抗原结合位点，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.345或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％同源性的序列或者由其组成，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.345或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％同源性的序列或者由其组成，并且所述CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.347或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.345或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、86％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、96％、97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.346或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.347或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，第5家族或类似第5家族的序列具有包含SEQ ID NO.348或与其具有至少40％、50％、60％、70％、80％或90％同源性的序列或者由其组成的VH结构域。在一个实施方案中，同源性为至少70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、96％、97％、98％或99％。以下列出了这样的序列的CDR序列。在另一个实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO.348，但是包含一个或多个氨基酸置换，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸置换是在构架区中的一个或多个中。在另一个实施方案中，一个或多个氨基酸置换是在CDR中的一个或多个中。
第5家族或类似第5家族的结合分子具有如在本文中进一步描述的并且如在实施例中所示的KD、Koff、KA、Kd和IC50值。
在一个方面中，根据本发明的结合分子包含选自与来自本文中列出的另一个家族的CDR1和/或CDR2序列组合的第1家族或类似第1家族的、第2家族或类似第2家族的、第3家族或类似第3家族的、第4家族或类似第4家族的或第5家族或类似第5家族的CDR3序列中的CDR3序列。
例如，根据本发明的结合分子包含与来自如在表2、3、4或5中所示的一个或两个其他家族的CDR1和/或CDR2序列组合的例如如在图1中所示的第1家族或类似第1家族的CDR3序列。
在另一个方面中，根据本发明的结合分子包含与来自如在表1、3、4或5中所示的一个或两个其他家族的CDR1和/或CDR2序列组合的例如如在图2中所示的第2家族或类似第2家族的CDR3序列。如技术人员将会理解的，各种组合都是可能的。
在另一个方面中，根据本发明的结合分子包含与来自如在表1、2、4或5中所示的一个或两个其他家族的CDR1和/或CDR2序列组合的例如如在图3中所示的第3家族或类似第3家族的CDR3序列。如技术人员将会理解的，各种组合都是可能的。
在另一个方面中，根据本发明的结合分子包含与来自如在表1、2、3或5中所示的一个或两个其他家族的CDR1和/或CDR2序列组合的例如如在图4中所示的第4家族或类似第4家族的CDR3序列。如技术人员将会理解的，各种组合都是可能的。
在另一个方面中，根据本发明的结合分子包含与来自如在表1、2、3或4中所示的一个或两个其他家族的CDR1和/或CDR2序列组合的例如如在图5中所示的第5家族或类似第5家族的CDR3序列。如技术人员将会理解的，各种组合都是可能的。
在本文中所述的结合分子可以作为具有一个或多个额外蛋白部分的融合蛋白提供。例如，在本文中所述的结合分子可以作为与第二部分的融合物提供。
第二部分可以包含也对人IL-17A特异性的VH结构域，因此提供二价结合分子。在一个实施方案中，结合分子是双互补位的。双互补位结合分子与不同的表位结合。可以使用本领域中已知的方法构建本发明的双互补位结合分子。
例如，为了生成二价结合分子，第1家族或类似第1家族的结合分子可以与第2、3、4或5家族或类似第2、3、4或5家族的结合分子连接。这在实施例中和在图29-33中进一步说明。在本发明的一个实施方案中，如对于克隆1.2所定义的VH与来自第2家族或第3家族的另一个VH连接，例如与如对于克隆3.2所定义的VH连接。两个以上VH通过接头，例如多肽接头连接。例如，适合的接头包括包含GS残基如(Gly4Ser)n的接头，其中n＝1至10，例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在一个实施方案中，本发明涉及以下双互补位结合分子3.2-2(G4S)-1.2、3.2-6(G4S)-1.2、3.2-4(G4S)-1.2中的一种。因此，本发明还涉及包含SEQ ID No.430、432、434或436的结合分子以及编码这样的结合分子的核酸。
在另一个实施方案中，第二部分包含VH结构域或对不同抗原特异性的另一种抗体片段以提供双特异性结合分子。如在本文中所使用的，术语“双特异性结合分子”因此是指包含含有对IL-17A具有结合特异性的结合位点的如在本文中所描述的结合分子以及含有对第二靶标具有结合特异性的结合位点的第二多肽结构域的多肽，即该试剂对两种靶向具有特异性。首先靶标和第二靶标是不相同的，即不同的靶标，例如蛋白质，但是二者均存在于细胞上。因此，如在本文中所描述的双特异性多肽试剂可以与表达(或在其细胞表面上展示)第一靶标和第二靶标的细胞选择性地并且特异性地结合。在另一个实施方案中，结合分子包含多于两个蛋白部分。
在另一个实施方案中，多于两个部分连接一起，提供多特异性结合分子。如在本文中所描述的多特异性多肽试剂还可以结合一个或多个额外的靶标，即多特异性多肽可以结合至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、或更多个靶标，其中多特异性多肽试剂分别具有至少两个、至少、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、或更多个靶标结合位点。
如在本文中所使用的，术语“靶标”是指具有结合位点的多肽结构域可以与其选择性结合的生物分子(例如，肽、多肽、蛋白质、脂质、碳水化合物)。靶标可以是，例如细胞内靶标(例如，细胞内蛋白靶标)或细胞表面靶标(例如，膜蛋白、受体蛋白)。优选地，靶标是细胞表面靶标，如细胞表面蛋白。优选地，第一细胞表面靶标和第二细胞表面靶标二者均存在于细胞上。
可以使用本领域中已知的方法构建本发明的多特异性抗体。
在双互补位或多特异性结合分子中，多个部分通常通过接头，例如多肽接头连接。适合的接头是本领域中已知的，例如包括包含GS残基如(Gly4Ser)n的接头，其中n＝1至10，例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10。
如果需要，双特异性或多特异性结合分子可以与包含CH2和CH3结构域之一或二者和任选的铰链区的抗体Fc区或其片段连接。例如，可以使用作为单一核苷酸序列与Fc区或其片段连接的编码双特异性或多特异性结合分子的载体以制备这样的多肽。
示例性的第二抗原靶标包括白细胞受体，例如，MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD28、CD4、CD45、CD58、CD80、CD86或它们的配体；TNF、IL-1IL-15、IL-23、IL-6或CD20。该清单不限于所提及的试剂。
在一个实施方案中，第二(或第三、第四、第五等)部分可以用于延长结合分子的半衰期。第二或第三部分可以包含蛋白质，例如结合血清白蛋白、例如人血清白蛋白(HSA)的抗体或其部分。第二部分可以包含结合血清白蛋白、例如人血清白蛋白(HSA)的VH结构域。
第二部分可以包含血清白蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)或其变体如C34S。进一步提供了包含VH结构域和Fc结构域或其片段的如在本文中所描述的结合分子，例如，其中VH结构域与Fc结构域或其片段连接。进一步提供了包含特异性结合第二抗原的第二可变结构域的结合分子，其中第二抗原是除人IL-17A外的抗原。第二抗原可以是分化簇(CD)分子或主要组织相容性复合物(MHC)II类分子。
本发明进一步提供了编码本发明的结合成员的分离的核酸。核酸可以包括DNA和/或RNA。在一个方面中，本发明提供了编码CDR、一组CDR、VH结构域或如以上所限定的结合分子的分离的核酸。在一个方面中，本发明还涉及包含编码第1家族的VH结构域的SEQ ID NO349至410或者由其组成的核酸序列，其中所述VH结构域分别包含SEQ ID NO.4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228、232、236、240、244或248 440、444、448、452、456、460或464或者由其组成。
以下示出了这样的核酸的实例。
SEQ ID No.349编码VH1.1的核酸
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGTTATTCGATGTACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAAGCAAGATGGAAGTGAGAAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTTTCTGCAAATGAATAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGGGGAAATACTACCCCTCCACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACTGTCTCCTCA
SEQ ID No.350编码VH1.2的核酸
GAGGTTCAGTTGGTGGAAAGCGGCGGTGGCCTGGTCCAGCCGGGTGGTAGCCTGCGCCTGTCCTGCGCGGCTAGCGGTTTCACGTTTAGCAGCTACAGCATGTACTGGGTGCGTCAAGCGCCAGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTGCCGAGATTAAGCAAGACGGTTCTGTTCAGTATTATGTCAGCGACGTGAAGGGTCGTTTTACCATCAGCCGTGACAACGCGAAAAACAGCCTGTATTTGCAGATGAATTCCCTGCGCGCTGAAGATACCGCGGTGTATTACTGTGCGAAAGGTGAGATTCTGCCGCTGTACTTCGATTACTGGGGCCAAGGCACCCTGGTTACTGTCTCGAGC
SEQ ID No.351编码VH1.3的核酸
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGTTATAGCATGTACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCGAGATAAAGCAAGATGGAAGTGTGCAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAATAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGGGGAAATACTACCCCTCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACTGTCTCTTCA
SEQ ID No.352编码VH1.4的核酸
GAGGTTCAGTTGGTGGAAAGCGGCGGTGGCCTGGTCCAGCCGGGTGGTAGCCTGCGCCTGTCCTGCGCGGCTAGCGGTTTCACGTTTAGCAGCTACAGCATGTACTGGGTGCGTCAAGCGCCAGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTGCCGAGATTAAGCAAACCGGTTCTGTTCAGTATTATGTCGACAGCGTGAAGGGTCGTTTTACCATCAGCCGTGACAACGCGAAAAACAGCCTGTATTTGCAGATGAATTCCCTGCGCGCTGAAGATACCGCGGTGTATTACTGTGCGAAAGGTGAGATTCTGCCGCTGTACTTCGATTACTGGGGCCAAGGCACCCTGGTTACTGTCTCGAGC
SEQ ID No.353编码VH1.5的核酸
GAGGTTCAGTTGGTGGAAAGCGGCGGTGGCCTGGTCCAGCCGGGTGGTAGCCTGCGCCTGTCCTGCGCGGCTAGCGGTTTCACGTTTAGCAGCTACAGCATGTACTGGGTGCGTCAAGCGCCAGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTGCCGAGATTAAGCCGACCGGTTCTGTTCAGTATTATGTCGACAGCGTGAAGGGTCGTTTTACCATCAGCCGTGACAACGCGAAAAACAGCCTGTATTTGCAGATGAATTCCCTGCGCGCTGAAGATACCGCGGTGTATTACTGTGCGAAAGGTGAGATTCTGCCGCTGTACTTCGATTACTGGGGCCAAGGCACCCTGGTTACTGTCTCGAGC
SEQ ID No.354编码VH1.6的核酸
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGTTATAGCATGTACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCGAGATAAAGCAAGATGGAAGTGAGCAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAATAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGGGGAAATACTACCCCTCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID No.355编码VH1.7的核酸
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGTTATGGGATGTACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAAGATAGAGCAAGATGGAAGTGAGGAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAAGTCACTGTATCTGCAAATGAATAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGGGGAAATACTACCCCTCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID No.356编码VH1.8的核酸
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGTTATGGTATGTACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAAGATAGAGCAAGATGGAAGTGAGAAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTTTCTGCAAATGAATAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGGGGAAATACTACCCCTCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID No.357编码VH1.9的核酸
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGTTATGGAATGTACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCGAGATAAAACAAGATGGAAGTGAGAAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAATAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGGGGAAATACTACCCCTCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACTGTCTCTTCA
SEQ ID No.358编码VH1.10的核酸
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGTTATCGCATGTACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAGCATAGAACAAGATGGAAGTGAGGAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAAGTCACTGTTTCTGCAAATGAATAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGGGGAAATACTACCCCTCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACTGTCTCTTCA
SEQ ID No.359编码VH1.11的核酸
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGTTATCAGATGTACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAGCATAAAACAAGATGGAAGTGAGGAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTTTCTGCAAATGAATAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGGGGAAATACTACCCCTCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACTGTCTCTTCA
SEQ ID No.360编码VH1.12的核酸
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGTTATGGGATGTACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAAGATAGAGCAAGATGGAAGTGAGGAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAATAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGGGGAAATACTACCCCTCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACTGTCTCCTCA
SEQ ID No.361编码VH1.13的核酸
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGTTATGGGATGTACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAGCATAGAACAAGATGGAAGTGAGAAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAATAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGGGGAAATACTACCCCTCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID No.362编码VH1.14的核酸
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCGTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGTTATCGGATGTACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAGCATAGAACAAGATGGAAGTGAGGAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAAGTCACTGTTTCTGCAAATGAATAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGGGGAAATACTACCCCTCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACTGTCTCTTCA
SEQ ID No.363编码VH1.15的核酸
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGTTATAGCATGTACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCGAGATAAGGCAAGATGGAAGTGAGCAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAATAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGGGGAAATACTACCCCTCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACTGTCTCTTCA
SEQ ID No.364编码VH1.16的核酸
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGTTATAGCATGTACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCGAGATAAAGCAAGATGGAAGTGAGCAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAATGGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGGGGAAATACTGCCCCTCTACTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACTGTCTCTTCA
SEQ ID No.365编码VH1.17的核酸
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGTTATAGCATGTACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCGAGATAAAGCCAACCGGGAGTGTGCAATACTATGTGTCCGACGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAATAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGGGGAAATACTACCCCTCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACTGTCTCTTCA
SEQ ID No.366编码VH1.18的核酸
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGTTATAGCATGTACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCGAGATAAAGCAAGACGGCAGTGTGCAATACTATGTGGGGGGCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAATAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGGGGAAATACTACCCCTCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACTGTCTCTTCA
SEQ ID No.367编码VH1.19的核酸
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAACCTCTGGATTCACCTTTAGTAGTTATGGAATGTACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCGAGATAAAACAAGATGGAAGTGAGAAATACTATGTGGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAATAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGGGGAAATACTACCCCTCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACTGTCTCTTCA
SEQ ID No.368编码VH1.20的核酸
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGTTATGGGATGTACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAAGATAGAGCAAGATGGAAGTGAGGAATACTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAAGTCACTGTATCTGCAAATGAATAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGGGGAAATACTACCCCTCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACTGTCTCTTCA
SEQ ID No.369编码VH1.21的核酸
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCTGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCGGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGTTATAGCATGTACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCGAGATAAAGCAAGATGGAAGTGAGCAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAATAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGGGGAAATACTACCCCTCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACTGTCTCTTCA
SEQ ID No.370编码VH1.22的核酸
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCGGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGTTATGGGATGTACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAAGATAGAGCAAGATGGAAGTGAGGAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAAGTCACTGTATCTGCAAATGAATAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAAGGGGAAATACTACCCCTCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACTGTCTCTTCA
在一个方面中，本发明还涉及包含编码第2家族的VH结构域的序列、例如SEQ IDNO.371的核酸序列，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO.252、256、260、264、268、272、276、280或284或者由其组成。
SEQ ID No.371编码VH2.1的核酸
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGCTATGGGATGGGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAAAATAAAACAAGATGGAAGTGAGAAAGACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAAGTCACTGTTTCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTATTGTGCGAGAGAGAGTATATTTGGAATCCCCGAGGACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
在一个方面中，本发明还涉及例如包含选自编码第3家族的VH结构域的SEQ IDNO.372至381的序列的核酸序列，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO.288、292、296、300、304、308、312、316、320、324、328、332、336或340或者由其组成。
SEQ ID No.372编码VH3.1的核酸
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCGGCTACTATATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACCCTAACAGTGGTGGCACAAACTATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGTATGGATCGGGATTATTATGATACTAGTGGTTACTTTGGCTGGTTCGACTCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCTTCA
SEQ ID No.373编码VH3.2的核酸
CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTAAAGAAGCCTGGGGCCTCGGTGAAGGTCTCCTGTAAGGCTTCCGGATATAACGCGGACGCCTATTATATAAATTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGTCTTGAGTGGATGGGAAGTATCAAGCCTAATACCGGTGCCACAAAATATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGAGTCACCATAACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGTCTGGATCGGGATACGTGGTACCCGCACTCCTACGCGGGGTGGTTCGACGCGTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCTTCA
SEQ ID No.374编码VH3.3的酸
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCGCAGCTTCCGGATACACCTTCACCGACTACTATCTGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGGTGGATCAACCCTAACACTGGCACCACAAAGTATGCACGGGAGTTTGAGGGCAGAGTCACCATGACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGTATGGATCGGGATTATTATGATACTAGTGGTTACTTTGGCTGGTTCGACTCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCTTCA
SEQ ID No.375编码VH3.5的核酸
CAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCGCAGCTTCCGGATACACCTTCACCGACTACTATCTGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGGTGGATCAACCCTAACACTGGCACCACAAAGTATGCACGGGAGTTTGAGGGCAGAGTCACCATGACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGTCTGGATCGGGATTGGCGCTCGCCCAACGACTACTTTGGCTGGTTCGACTCGTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCTTCA
SEQ ID No.376编码VH3.6的核酸
CAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCGCAGCTTCCGGATACACCTTCACCGACTACTATCTGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGGTGGATCAACCCTAACACTGGCACCACAAAGTATGCACGGGAGTTTGAGGGCAGAGTCACCATGACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGTCTGGATCGGGATTGGCGCTCGCCCAACGACTACTACGGGTGGTTCGACTCGTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCTTCA
SEQ ID No.377编码VH3.9的核酸
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGTAAGGCTTCCGGATATAACTTCGACGCCTATCATATAAATTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGTATCAAGCCTAATAGTGGTGCCACAAAATATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGAGTCACCATAACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGTATGGATCGGGATTACTATGATACTAGTGGTTACTTTGGCTGGTTCGACTCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID No.378编码VH3.11的核酸
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGTAAGGCTTCCGGATATAACTTCGACGCCTATCATATAAATTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGTCTTGAGTGGATGGGAAGTATCAAGCCTAATAGTGGTGCCACAAAATATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGAGTCACCATAACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGTCTGGATCGGGATACGTGGTACCCGCACTCCTACTTTGGCTGGTTCGACTCGTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCTTCA
SEQ ID No.379编码VH3.13的核酸
CAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGTAAGGCTTCCGGATATAACTTCGACGCCTATCATATAAATTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGTCTTGAGTGGATGGGAAGTATCAAGCCTAATAGTGGTGCCACAAAATATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGAGTCACCATAACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGTCTGGATCGGGATACGTGGTACCCGCACTCCTACGCGGGGTGGTTCGACTCGTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCTTCA
在一个方面中，本发明还涉及例如包含编码第4家族的VH结构域的序列SEQ IDNO.380的核酸序列，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO.344或者由其组成。
SEQ ID No.380编码VH4.1的核酸
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGCTATTGGATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGGTGGCCACCATAAAACAAGATGGAAGTGAGAAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCACGAACTCACTGTTTCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGGGGAGATACGATTTTCGACGGTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACTGTCTCCTCA
在一个方面中，本发明还涉及例如包含编码第5家族VH结构域的序列SEQ IDNO.381的核酸序列，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO.348或者由其组成。
SEQ ID No.381编码VH5.1的核酸
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGCTATTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAAGCAAGATGGAAGTGAGAAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGCATCAGTGGCCCTTCTTTGACTACTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACTGTCTCCTCA
根据本发明的核酸可以包含DNA或RNA并且可以是全部或部分合成的或重组制备的。除非上下文另外需要，提及如在本文中给出的核苷酸序列包括具有指定序列的DNA分子，并且包括其中U代替T的具有指定序列的RNA分子。
此外，本发明涉及包含以上定义的至少一种核酸的核酸构建体。构建体可以是质粒、载体、转录或表达盒的形式的。
本发明还涉及包含如以上的一种或多种核酸构建体的分离的重组宿主细胞。
本发明还涉及能够与IL-17A结合的结合试剂，其在竞争性测定中与如上所述的本发明的结合分子竞争与IL-17A的结合。
本发明的结合分子具有如以下所述的某些功能特性。
尤其是，本发明的结合分子阻断IL-17A对其靶细胞的作用，并且因此适用于例如如在本文中所描述的IL-17A介导的疾病的治疗。可以在例如如在本领域中描述的标准试验方法中证明本发明的结合分子的这些和其他药理学活性。IL-17A的中和取决于借助原始人成纤维细胞的白介素-6的产生。在原始人(皮肤)成纤维细胞中的IL-6的产生取决于IL-17(Hwang SY等人，(2004)Arthritis Res Ther；6:R120-128)并且在本文中的实施例中。因此，如在实施例中更详细描述的，根据本发明的结合成员高效地中和IL-17A。术语“中和”因此是指当结合蛋白特异性地结合IL-17时IL-17的生物活性的中和。通过测量如在实施例中描述的、在本领域内公知的IL-17生物活性的一种或多种指示物，可以评估通过将结合蛋白中和对IL-17的生物活性的抑制。
例如，IL-17A与其受体的结合的中和可以在生物测定中作为生物分子例如MMP13、PGE2或细胞因子如IL-6或IL-8的细胞释放而测量，因为IL-17A与其受体的结合诱导这些分子的细胞释放，其可以使用适当的测定，例如在HT1080细胞、软骨细胞或其他适合的细胞或组织类型中而确定。
生物活性的抑制可以是部分的或完全的。在具体的实施方案中，提供了结合成员，其将IL-17A生物活性抑制在不存在结合成员的情况下的活性的至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、或至少50％的。结合成员中和IL-17A的程度被称为其中和效力。可以使用对于技术人员来说已知的和/或如在本文中描述或提及的一种或多种测定来确定或测量效力。例如，可以在下列各项中测定效力：
-HTRF(R)(均相时间分辨荧光)受体-配体结合测定
-使用响应于IL-17和TNFα的协同的IL-6释放的HT1080细胞测定
-软骨细胞IL-6/IL-8/MMP13/PGE2-释放测定-软骨外植体中的IL-6释放测定
-滑膜成纤维细胞(例如，来自RA或OA患者)中的IL-6释放测定，例如利用对IL-17和TNFα的协同IL-6响应。
测定方法在实施例中详细描述。
可以将如在使用来自第一物种(例如，人)的IL-17A的测定中计算的结合成员的中和效力与在使用来自第二物种(例如，食蟹猴)的IL-17的相同测定中的结合成员的中和效力进行比较，从而评估针对两个物种的IL-17的结合成员的交叉反应性的程度。
除非另外说明，效力通常表示为以nM为单位的IC50值。在功能性测定中，IC50是将生物应答降低其最大值的50％的结合成员的浓度。通过对作为结合成员浓度的log的函数的最大生物应答的％作图，并且使用软件程序以为数据拟合S型函数以产生IC50值，可以计算IC50。
在另一个方面中，本发明因此涉及包含针对人IL-17A的至少一种VH结构域或者包含至少一种免疫球蛋白单VH结构域抗体或者由其组成的结合分子，其中当根据实施例中描述的进行测试时，即通过测量IL-17结合VH抑制IL-17诱导的从细胞系HT1080中的IL-6释放的能力，所述VH结构域具有约0.2至约1000nM以上，例如0.2至900、0.2至800、0.2至700、0.2至600、0.2至500、0.2至400、0.2至300、0.2至200、0.2至100、0.2至50、0.2至40、0.2至30、0.2至20、0.2至10、0.2至9、0.2至8、0.2至7、0.2至6、0.2至5、0.2至4.0、0.2至3、0.2至2或0.2至1的对于抑制IL-6产生的IC50。例如，本发明的结合分子通常具有约0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9或4.0nM的对于抑制IL-6产生的IC50。本发明的结合分子可以具有小于约4nM、优选小于约2nM的对于抑制IL-6产生的IC50，其通过测量IL-17结合VH抑制IL-17诱导的从细胞系HT1080中的IL-6释放的能力评估。该测定测量响应于的IL-6释放并且在实施例中给出了详细的方法。具有这些结合特征的结合分子，例如VH结构域可以选自在本文中所公开的序列中的一个。在另一个实施方案中，VH结构域包含如在本文中所描述的CDR3序列或VH序列。
例如，在一个实施方案中，所述IL-17A结合分子包含类似第1家族的序列，当根据实施例中描述的进行测试时，即通过测量IL-17结合VH抑制IL-17诱导的从细胞系HT1080中的IL-6释放的能力，所述类似第1家族的序列具有约0.2至约13、例如0.2至4.0nM的对于抑制IL-6产生的IC50。本发明的结合分子可以具有小于约13，优选小于约10、9、8、7、6、或4nM，优选小于约2nM的对于抑制IL-6产生的IC50。在一个实施方案中，IC50是0.2-2.0nM，例如0.2-1.0nM，例如约0.4nM。在一个实施方案中，IC50是如在实施例中所示的。
在一个实施方案中，第1家族或类似第1家族的序列包含CDR3序列SEQ ID NO.3或与其具有至少80％、85％、90％、95％同源性的序列。在一个实施方案中，所述CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.3或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、96％、97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、53、57、61、65、69、73、77、81、85、89、93、97、101、105、109、113、117、121、125、129、133、137、141、145、149、153、157、161、165 169、173、177、181、185、189、193、197、201、205、209、213、217、221、225、229、233、237、241,245、438、442、446、450、454、458或462或者由其组成，CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、122、126、130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226、230、234、238、242、246、439、443、447、451、455、459、463或者由其组成，并且CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.3、7、11、15、19、23、27、31、35、39、43、47、51、55、59、63、67、71、75、79、83、87、91、95、99、103、107、111、115、119、123、127、131、135、139、143、147、151、155、159、163、167、171、175、179、183、187、191、195、199、203、207、211、215、219、223、227、231、235、239、243、247 440、444、448、452、456、460或464或者由其组成。
在一个实施方案中，结合分子具有如对于图1中的克隆1.1至1.69所示出的CDR1、CDR2和CDR3的组合。在一个实施方案中，结合分子具有如对于图1中的克隆1.1至1.22所示出的CDR1、CDR2和CDR3的组合。
在一个实施方案中，第1家族或类似第1家族的序列具有包含SEQ ID NO.4或与其具有至少40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、86％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、96％、97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成的VH结构域。实例在图1中示出。在一个实施方案中，VH结构域包含SEQ ID NO.8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228、232、236、240、244、248、441、445、449、453、457、461或466或者由其组成。
在另一个实施方案中，所述IL-17结合分子包含第2家族或类似第2家族的序列。在一个实施方案中，当根据实施例中描述的进行测试时，即通过测量包含VH的IL-17结合分子抑制IL-17诱导的从细胞系HT1080中的IL-6释放的能力，所述类似第2家族具有约9nM以下的对于抑制IL-6产生的IC50。
在一个实施方案中，第2家族或类似第2家族的序列包含CDR3序列SEQ ID NO.SEQID NO.251或与其具有至少80％、85％、90％、95％同源性的序列。在一个实施方案中，所述CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.251或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.249或与其具有至少60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.SEQ ID NO.250或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.249、253、257、261、265、269、273、277或281或者由其组成，CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.250、254、258、262、266、270、274、278或282或者由其组成，并且CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.251、255、259、263、267、271、275、279或283或者由其组成。
在一个实施方案中，结合分子具有如对于图2中的克隆2.1至2.9所示出的CDR1、CDR2和CDR3的组合。
在一个实施方案中，第2家族或类似第2家族的序列具有包含SEQ ID NO.252或与其具有至少40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成的VH结构域。实例在表2中示出。在一个实施方案中，第2家族的序列具有包含SEQ IDNO.256、260、264、268、272、276、280或284或者由其组成的VH结构域。
在另一个实施方案中，所述IL-17A结合分子包含类似第3家族的序列，当根据实施例中描述的进行测试时，即通过测量包含VH的IL-17结合分子抑制IL-17诱导的从细胞系HT1080中的IL-6释放的能力，所述类似第3家族的序列具有约0.2至约1000nM、例如0.2至200的对于抑制IL-6产生的IC50。本发明的结合分子可以具有小于约200nM、优选小于约100nM、优选小于约10nM的对于抑制IL-6产生的IC50，其通过测量IL-17结合VH抑制IL-17诱导的从细胞系HT1080中的IL-6释放的能力评估。在一个实施方案中，IC50是0.2-2.5nM。
在一个实施方案中，第3家族或类似第3家族的序列包含CDR3序列SEQ ID NO.287或与其具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％同源性的序列。在一个实施方案中，所述CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.287或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.285或与其具有至少40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.286或与其具有至少70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.285、289、293、297、301、305、309、313、317、321、325、329、333或337或者由其组成，CDR2包含氨基酸序列286、290、294、298、302、306、310、314、318、322、326、330、334或338或者由其组成，并且CDR3包含氨基酸序列287、291、295、299、303、307、311、315、319、323、327、335或339或者由其组成。
在一个实施方案中，所述结合分子具有如对于图3中克隆3.1至3.14所示出的CDR1、CDR2和CDR3的组合。
在一个实施方案中，第3家族或类似第3家族的序列具有包含SEQ ID NO.288或与其具有至少40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、86％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的序列或者由其组成的VH结构域。这样的序列的CDR序列在图3中示出。例如，VH结构域包含SEQ ID NO.292、296、300、304、308、312、316、320、324、328、332、336或340或者由其组成。
在另一个实施方案中，本发明还涉及包含针对IL-17A的至少一种免疫球蛋白单结构域抗体的结合分子，其中所述结构域是人VH结构域，并且其中所述IL-17A结合分子包含第4家族或类似第4家族的序列。
在一个实施方案中，第4家族或类似第4家族的序列包含CDR3序列SEQ ID NO.343或与其具有至少70％、80％、85％、90％、95％同源性的序列。在一个实施方案中，所述CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.343或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.341或与其具有至少70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.342或与其具有至少70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，第4家族或类似第4家族的序列具有包含SEQ ID NO.344或与其具有至少40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成的VH结构域。实例在图4中示出。
在另一个实施方案中，所述IL-17A结合分子包含第5家族或类似第5家族的序列。
在一个实施方案中，第5家族或类似第5家族的序列包含CDR3序列SEQ ID NO.347或与其具有至少80％、85％、90％、95％同源性的序列。在一个实施方案中，所述CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.347或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.345或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、95％、94％、96％、97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.346或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，第5家族或类似第5家族的序列具有包含SEQID NO.348或与其具有至少40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成的VH结构域。实例在图5中示出。
此外，例如，使用表面等离子共振如可以确定本发明的IL-17A结合分子结合IL-17A的结合动力学和亲和力(表示为平衡解离常数，KD)，或者可以由pA2分析来估算KD。
在另一个方面中，本发明涉及具有5x10-9至1x10-11、例如5x10-9至2x10-10的KD(M)值的结合分子，其中使用计算所述KD。术语“KD”是指“平衡解离常数”并且是指在滴定测量中在平衡时得到的值，或通过解离速率常数(Koff)除以结合速率常数(Kon)得到的值。在一个实施方案中，KD可以是如在实施例中所示的。
在一个实施方案中，结合分子是第1家族或类似第1家族的序列。在一个实施方案中，第1家族或类似第1家族的序列包含CDR3序列SEQ ID NO.3或与其具有至少80％、85％、90％、95％同源性的序列。在一个实施方案中，所述CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.3或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、53、57、61、65、69、73、77、81、85、89、93、97、101、105、109、113、117、121、125、129、133、137、141、145、149、153、157、161、165 169、173、177,181、185、189、193、197、201、205、209、213、217、221、225、229、233、237、241、245 438、442、446、450、454、458或462或者由其组成，CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、122、126、130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226、230、234、238、242、246 439、443、447、451、455、459、463或者由其组成，并且CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.3、7、11、15、19、23、27、31、35、39、43、47、51、55、59、63、67、71、75、79、83、87、91、95、99、103、107、111、115、119、123、127、131、135、139、143、147、151、155、159、163、167、171、175、179、183、187、191、195、199、203、207、211、215、219、223、227、231、235、239、243、247 440、444、448、452、456、460或464或者由其组成。
在一个实施方案中，结合分子具有如对于图1中的克隆1.1至1.62所示出的CDR1、CDR2和CDR3的组合。在一个实施方案中，结合分子具有如对于图1中的克隆1.1至1.22所示出的CDR1、CDR2和CDR3的组合。
在一个实施方案中，第1家族或类似第1家族的序列具有包含SEQ ID NO.4或与其具有至少40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成的VH结构域。实例在图1中示出。例如，VH结构域包含SEQ ID NO.8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228、232、236、240、244或248或者由其组成。
在一个实施方案中，结合分子是第2家族或类似第2家族的序列。在一个实施方案中，类似第2家族的序列包含CDR3序列SEQ ID NO.251或与其具有至少80％、85％、90％、95％同源性的序列。在一个实施方案中，所述CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.251或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.249或与其具有至少60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.250或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.249、253、257、261、265、269、273、277或281或者由其组成，CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.250、254、258、262、266、270、274、278或282或者由其组成，并且CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.251、255、259、263、267、271、275、279或283或者由其组成。
在一个实施方案中，结合分子具有如对于图2中的克隆2.1至2.9所示出的CDR1、CDR2和CDR3的组合。
在一个实施方案中，第2家族或类似第2家族的序列具有包含SEQ ID NO.252或与其具有至少40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、96％、95％、97％、98％、99％同源性的序列或者由其组成的VH结构域。实例在表2中示出。在一个实施方案中，第2家族的序列具有包含SEQ IDNO.256、260、264、268、272、276、280或284或者由其组成的VH结构域。
在一个实施方案中，结合分子是类似第3家族的序列。在一个实施方案中，第3家族或类似第3家族的序列包含CDR3序列SEQ ID NO.287或与其具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％同源性的序列。在一个实施方案中，所述CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.:SEQ ID NO.287或与其具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.285或与其具有至少40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.286或与其具有至少70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.285、289、293、297、301、305、309、313、317、321、325、329、333或337或者由其组成，CDR2包含氨基酸序列286、290、294、298、302、306、310、314、318、322、326、330、334或338或者由其组成，并且CDR3包含氨基酸序列287、291、295、299、303、307、311、315、319、323、327、335或339或者由其组成。
在一个实施方案中，结合分子具有如对于图3中的克隆3.1至3.14所示出的CDR1、CDR2和CDR3的组合。
在一个实施方案中，第3家族或类似第3家族的序列具有包含SEQ ID NO.288或与其具有至少40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成的VH结构域。这样的序列的CDR序列在图3中示出。例如，VH结构域包含SEQ ID NO.292、296、300、304、308、312、316、320、324、328、332、336或340或者由其组成。
在一个实施方案中，结合分子是第4家族或类似第4家族的序列。在一个实施方案中，这包含CDR3序列SEQ ID NO.343或与其具有至少80％、85％、90％、95％同源性的序列。在一个实施方案中，所述CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.343或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.341或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、96％、97％、98％、99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.342或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、96％、97％、98％、99％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，第4家族的序列具有包含SEQ ID NO.344或与其具有至少40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、96％、97％、98％、99％同源性的序列或者由其组成的VH结构域。实例在图4中示出。
在另一个实施方案中，所述IL-17结合分子包含第5家族或类似第5家族的序列。
在一个实施方案中，第5家族或类似第5家族的序列包含CDR3序列SEQ ID NO.347或与其具有至少80％、85％、90％、95％同源性的序列。在一个实施方案中，所述CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.347或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.345或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成。在一个实施方案中，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.346或与其具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列或者由其组成。
在一个实施方案中，第5家族的序列具有包含SEQ ID NO.348或与其具有至少40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、96％、97％、98％、99％同源性的序列或者由其组成的VH结构域。实例在图5中示出。
在一个实施方案中，结合分子具有如以上所限定的KD和如以上所限定的对于抑制IL-6产生的IC50。
本发明还涉及分离的VH结构域，其包含人VH种系序列(例如人VH3-07或VH 1-02种系序列)的或来源于其的氨基酸产物。
技术人员将会知晓，存在不同的鉴别并且获得如在本文中所描述的抗原结合分子的方式，包括体外和体内表达文库。这在实施例中进一步描述。可以使用本领域中已知的优化技术，如展示(例如，核糖体和/或噬菌体展示)和/或诱变(例如，易错诱变(error-pronemutagenesis))。
用于使用体外表达文库制备或生成在本文中所描述的多肽、核酸、宿主细胞、产物和组合物的方法可以包括下列步骤：
a)提供编码氨基酸序列的核酸序列的组、集合或文库；和
b)针对能够与IL-17A结合/对IL-17A具有亲和力的氨基酸序列筛选所述组、集合或文库；和
c)分离能够与IL-17A结合/对IL-17A具有亲和力的氨基酸序列。
在以上方法中，可以在噬菌体、噬菌粒、核糖体或适合的微生物(如酵母)上展示序列的组、集合或文库，如促进筛选。用于展示和筛选序列(的组、集合或文库)的适合的方法、技术和宿主生物将会是对于本领域技术人员来说清楚的(参见例如，肽和蛋白质的噬菌体展示：实验室手册(Phage Display of Peptides and Proteins:A Laboratory Manual)，学术出版社(Academic Press)；第1版(1996年10月28日)Brian K.Kay,Jill Winter,JohnMcCafferty)。
可以在转基因啮齿类动物中表达本文中所述的包含VH结构域的结合分子。转基因啮齿类动物，例如小鼠，具有降低的表达内源性抗体基因的能力。因此，在一个实施方案中，啮齿类动物具有降低的表达内源性轻和/或重链抗体基因的能力。因此啮齿类动物可以包含额外修饰以干扰内源性轻和/或重链抗体基因的表达，从而不制备功能性轻和/或重链。
本发明还涉及用于制备能够结合人IL-17A的包含至少一种人免疫球蛋白单结构域抗体的结合分子的方法，其中所述结构域是人VH结构域，所述方法包括
d)用IL-17A抗原使转基因小鼠免疫，其中所述小鼠表达包含人重链V基因的核酸构建体并且不能制造功能性内源性轻链或重链，
e)生成包含来自所述小鼠的VH结构域序列的序列的文库和
f)分离包含来自所述文库的VH结构域序列的序列。
本发明还涉及例如通过上述方法获得自或者可获得自不能产生功能性内源性轻链或重链的小鼠的包含VH结构域的结合分子。
在一个实施方案中，啮齿类动物是小鼠。小鼠可以包含非功能性λ轻链基因座。因此，小鼠不产生功能性内源性λ轻链。在一个实施方案中，λ轻链基因座是部分或完全缺失的或者通过插入、倒置、重组事件、基因编辑或基因沉默使其成为非功能性的。例如，可以使至少恒定区基因C1、C2和C3成为非功能性的。在一个实施方案中，将基因座功能上沉默从而小鼠不产生功能性内源性λ轻链。
此外，小鼠可以包含非功能性κ轻链基因座。因此，小鼠不产生功能性内源性κ轻链。在一个实施方案中，κ轻链基因座是部分或完全缺失的或者通过插入倒置、重组事件、基因编辑或基因沉默使其成为非功能性的。在一个实施方案中，将基因座功能上沉默从而小鼠不产生功能性内源性κ轻链。
例如，具有功能上沉默的内源性λ和κL链基因座的小鼠可以根据在WO 2003/000737中公开的做出，其通过整体引用结合于此。
此外，小鼠可以包含非功能性重链基因座。因此，小鼠不产生功能性内源性重链。在一个实施方案中，重链基因座是部分或完全缺失的或者通过插入倒置、重组事件、基因编辑或基因沉默使其成为非功能性的。
例如，如在WO 2004/076618(通过整体引用结合于此)中描述的，所有8个内源性重链恒定区免疫球蛋白基因(μ、δ、γ3、γ1、γ2a、γ2b、ε和α)均不存于小鼠中或者部分不存在达到它们为非功能性的程度，或者基因δ、γ3、γ1、γ2a、γ2b和ε不存在并且侧翼基因(flanking gene)μ和α部分不存在达到使它们成为非功能性的程度，或者基因μ、δ、γ3、γ1、γ2a、γ2b和ε不存在并且α部分不存在达到使其成为非功能性的程度，或者δ、γ3、γ1、γ2a、γ2b、ε和α不存在并且μ部分不存在达到使其成为非功能性的程度。在一个实施方案中，将基因座功能上沉默从而小鼠不产生功能性内源性重轻链。
部分缺失意指，例如通过插入，内源性基因座基因序列已经缺失或破坏至没有由基因座编码功能性内源性基因产物的程度，即没有由基因座表达功能性产物。在另一个实施方案中，基因座是功能上沉默的。
在一个实施方案中，小鼠包含非功能性内源性重链基因座、非功能性内源性λ轻链基因座和非功能性内源性κ轻链基因座。因此小鼠不产生任何功能性内源性轻或重链。因此，小鼠是三敲除(triple knockout,TKO)小鼠。
转基因小鼠包含用于表达异源重链基因座的载体，例如酵母人工染色体(YAC)。YAC是可以用于酵母中非常大的DNA插入物的克隆的载体。除了包含具有与天然酵母染色体一样的行为所必需的所有三个顺式作用结构元件(自主复制序列(ARS)、着丝粒(CEN)和两个端粒(TEL))之外，它们接受大DNA插入物的能力使得它们能够达到类似染色体的稳定性和在酵母细胞中的运输的保真性(fidelity)所需的最小尺寸(150kb)。YAC的构建和使用是在本领域内公知的(例如，Bruschi,C.V.和Gjuracic,K.酵母人工染色体(YeastArtificial Chromosomes)，生命科学百科(Encyclopaedia of Life Sciences)2002Macmillan Publishers Ltd,Nature Publishing Group/www.els.net)。
例如，YAC可以包含与缺少CH1结构域的小鼠免疫球蛋白恒定区基因、小鼠增强子和调节区结合的多种人VH、D和J基因。在实施例部分中提供了这样的YAC的实例。
本领域中已知的备选方法可以用于内源性小鼠或大鼠免疫球蛋白基因的缺失或失活以及与缺少CH1结构域的小鼠免疫球蛋白恒定区基因、小鼠增强子和调节区结合的人VH、D和J基因的引入。
可以根据如在实施例中所示的标准技术构建转基因小鼠。用于构建转基因小鼠的两个最具有特点的途径是通过遗传物质向新受精的卵母细胞中的原核显微注射或者通过稳定转染的胚胎干细胞向桑葚胚(morula)或胚泡(blastocyst)阶段胚胎中的引入。无论如何引入遗传物质，都将被处理的胚胎转移至其中怀孕继续并且候选转基因幼崽出生的假怀孕的雌性接受者。
这些广泛方法之间的主要差异是可以在它们用于构建转基因动物之前对ES克隆进行大规模筛选。相比之下，原核显微注射依赖于在其引入之后整合至宿主基因组的遗传物质，并且一般来说，直到幼崽出生之后才能确认转基因的成功结合。
在本领域中已知存在许多既辅助又确定转基因的成功整合是否发生的方法。可以通过多种手段产生转基因动物，包括构建体向基因组中的随机整合、位点特异性整合、或同源重组。存在多种可以用于既驱动又选择转基因整合和后续修饰的工具和技术，包括抗药性标记物的使用(阳性选择)、重组酶、重组介导的表达盒(cassette)交换、阴性选择技术、和提高重组效率的核酸酶。这些方法中的大多数常用于ES细胞的修饰中。然而，这些技术中的一些可以具有增强通过原核注射介导的转基因的效用。
进一步的改进可以用于得到在所需背景中转基因品系的更有效的产生。如上所述，在优选的实施方案中，将内源性小鼠免疫球蛋白表达沉默以允许将引入的转基因仅用于表达可以用于药物发现的仅有重链的组成成分。可以如上所述使用基因处理的小鼠，例如针对所有内源性免疫球蛋白基因座(小鼠重链、小鼠κ链和小鼠λ链)沉默的TKO小鼠。可以通过繁殖实现任何引入的转基因向这种TKO背景的转移(常规的或者包括IVF步骤以给出该过程的有效测量)。然而，也可以在转基因操作期间包括TKO背景。例如，对于显微注射来说，卵母细胞可以来源于TKO供体。类似地，可以得到来自TKO胚胎的ES细胞以用于转基因。
本发明的结合分子可以与另一个部分缀合。这可以选自毒素、酶、放射性同位素、其他可检测标记物、肽、蛋白质和目标化学部分。
例如，可以用可检测或功能性标记物来标记本发明的结合分子。标记物可以是产生或者可以被诱导而产生信号的任何分子，包括但不限于荧光剂、放射性标记物、酶、化学发光剂或光敏剂。因此，可以通过检测荧光或发光、放射性、酶活性或吸光度来对结合进行检测和/或测量。
通过化学修饰，尤其是通过聚乙二醇化或与血清白蛋白例如HAS或抗HAS结合分子连接，或者通过在脂质体中结合，可以增加本发明的结合分子的半衰期。
在一个实施方案中，本发明的结合分子是共价修饰的。术语“共价修饰的/共价修饰”包括利用有机蛋白质性或非蛋白质性衍生化试剂的例如指定序列的根据本发明的抗体和结合分子的修饰，与异源多肽序列的融合，和翻译后修饰。例如指定序列的共价修饰的多肽仍然具有在本文中所述的功能特性，例如与人IL-17结合或例如通过交联来中和IL-17诱导的人皮肤成纤维细胞的IL-6产生的能力。通常，通过使靶标氨基酸残基与能够与所选择的侧或端残基反应的有机衍生化试剂反应或者通过利用在所选择的重组宿主细胞中发挥功能的翻译后修饰的机制，引入共价修饰。某些翻译后修饰是重组宿主细胞对所表达的多肽的作用的结果。谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基通常被翻译后脱酰胺为相应的谷氨酰和天冬氨酰残基。备选地，这些残基在弱酸性条件下脱氨基。其他翻译后修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰、酪氨酸或苏氨酰残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸、和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化。例如，共价修饰包括包含例如指定序列的根据本发明的结合分子和它们的氨基酸序列变体如免疫粘附素(immunoadhesin)的融合蛋白，以及与异源信号序列的N端融合。
在本发明的另一个方面中，提供了包含根据本发明的IL-17A结合分子和任选的药用载体的药物组合物。本发明的结合分子或组合物可以通过任何方便的途径施用并且本发明的结合分子或组合物的施用形式的实例包括但不限于局部，尤其是皮肤、肠胃外、和鼻内。肠胃外施用包括皮下注射、静脉内、肌内、胸骨内注射或输注技术。组合物可以采取一个或多个剂量单位的形式。
本发明的组合物可以是液体的形式的，例如溶液、乳液或悬浮液。液体可以用于通过注射来递送。本发明的液体组合物，无论它们是溶液、悬浮液还是其他类似形式，还可以包含以下中的一种或多种：无菌稀释剂如水，盐水溶液优选生理盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)、等渗氯化钠，非发挥性油如合成的甘油单酯或甘油二酯、聚乙二醇、甘油、或其他溶剂；抗菌剂如苄醇或对羟苯甲酸甲酯；和用于调节张力的试剂如氯化钠或葡萄糖。可以将组合物封装在安瓿瓶、一次性注射器或由玻璃、塑料或其他材料制成的多剂量小药瓶中。
在具体的实施方案中，可能希望的是向需要治疗的区域局部施用本发明的一种或多种结合分子或组合物。
因此，在本发明的所有方面的优选的实施方案中，本发明的组合物或结合分子的施用通过向健康的或患病的皮肤局部施用来进行。结合分子能够至少穿透皮肤的外层并且可以因此皮肤递送或经皮递送。因此，在本发明的各个方面的一个实施方案中，本发明的组合物或结合分子向皮肤的局部递送是向用于局部非系统性暴露的皮肤中的直接递送。在另一个实施方案中，本发明的组合物或结合分子向皮肤的局部递送是向皮肤的直接递送以在穿透皮肤的所有层之后提供系统性暴露。
被治疗的皮肤可以是患病的或健康的皮肤。在优选的实施方案中，皮肤病是银屑病或特应性皮炎。
优选地，其施用的表面积是体表面积的1％-30％，例如1％-10％或1-20％。因此可以施用至体表面积的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、27％、26％、28％、29％或30％。在一个实施方案中，疾病状态是轻度的。在另一个实施方案中，疾病状态是中度的。在另一个实施方案中，疾病状态是重度的。为了治疗银屑病，施用至受感染的区域，通常为选自肘部、膝盖、手掌、头皮、足底、生殖道、大腿、腹股沟、臀部、脸部和躯干中的一个或多个区域。为了治疗特应性皮炎，施用至受感染的区域，通常为选自脸部、前臂和手腕中的一个或多个区域。
结合分子可以以乳膏、洗剂、喷雾、溶液、凝胶、软膏、糊状物、膏药、贴剂、生物粘合剂、悬浮液等的形式直接施用至患病的或健康的皮肤，和/或可以被制备为含有脂质体、胶束、和/或微球。在一个实施方案中，结合分子以液体(例如，喷雾)、膏药、贴剂或生物粘合剂的形式直接施用至患病的皮肤。在一个实施方案中，结合分子以微乳液的形式直接施用至患病的皮肤。
微乳液通常被定义为具有在2-500nm范围内的液滴直径，因此允许活性物向皮肤中的有效递送。已经提出微乳液用于增强一系列化合物的经皮递送。这在整体结合在本文中的US2007/0243132中描述。
具体地，如在本文中所使用的，术语微乳液是指包含油相、水相和表面活性剂的制剂，其中微乳液能够经皮递送例如包含如在本文中所描述的人VH结构域的结合分子。优选地，本发明的微乳液具有在2-500nm范围内的液滴直径。在一个实施方案中，微乳液还包含助表面活性剂、助溶剂、或其组合。
本发明的微乳液可以是水包油微乳液，其中表面活性剂优先是可溶于水的；油包水微乳液，其中表面活性剂主要在油相中；三相微乳液，其中富含表面活性剂的中间相与水相和油相共存；双连续单相；在加入足够量的两亲性物质(表面活性剂加酒精)时形成的单相胶束溶液；或溶胀的胶束溶液。
本发明的微乳液可以通过本领域中已知的方法制造。通常，通过在通常包括足够的力或所需的温度的条件下使组分乳化以产生所需的分散水平、传导性、粘度、渗透性或其他分散特征来制备微乳液。
可以使用散射和光谱学技术如中子散射、时间平均散射、准电子光散射，即高分辨率超声光谱法或光子相关光谱法评估微乳液形成。也可以通过色谱法测量微乳液的分配系数。根据所需的应用，具体制剂的选择基于许多不同的范例。说明性的范例包括亲水-亲脂平衡、相转化温度、或内聚能比率。可以使用大范围的不可溶混液体和其他另外的试剂配制微乳液。
本发明的微乳液可以包含在50至99重量％、最优选50至90重量％的范围内的油相；在2至50重量％、最优选1至50重量的范围内的水相；0.1至90重量％的表面活性剂，优选1至90重量％的表面活性剂。微乳液还可以包含0.1至90重量％的助表面活性剂或助溶剂；优选1至90重量％的助表面活性剂或助溶剂。
油相可以包含来源于植物或动物的天然油，如植物油、葵花油、椰油、杏仁油；纯化的合成或天然的甘油二酯或甘油三酯(如Crodamol和Capmul)；磷脂及其衍生物(如卵磷脂或溶血卵磷脂)；脂肪酸酯(如肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、油酸乙酯、油酸乙酯)；烃(如己烷、正癸烷至正十八烷系列)；和/或甘油化的脂肪和油(如单油酸甘油酯、单辛酸甘油酯、单癸酸甘油酯、单辛酸丙二醇酯、单月桂酸丙二醇酯)。
其他油相成分包括，但不限于，Labrafil M 1944苯、四氢呋喃、和正甲基吡咯烷酮、或卤代烃，如二氯甲烷、或氯仿。在具体的实施方案中，油相以3:1的比率包含Crodamol和Capmul油组分单独使用或者与另外一种或多种油组分组合使用。如通常可以由本领域技术人员确定的，每种油或油的独特混合物可能需要不同的表面活性剂或者表面活性剂或表面活性剂和共表面活性剂的混合物，以形成具有水相的微乳液。水相成分可以包含水和在水中的任何水溶性组分，包括一种或多种药物试剂。
本发明的微乳液还可以包含溶剂或其他试剂以增强乳液形成或稳定性。可以引入其他试剂以提供功能如pH、离子含量、聚合、味道、香精、无菌性、颜色、粘度等。
也可以使用任何适合的合成塑料或聚合物、单体或混合物胶体材料来产生本发明的微乳液。
根据以上给出的方法和用途，结合分子可以连同一种或多种化学皮肤穿透增强剂一起施用。以下给出了皮肤穿透增强剂的实例。
在另一个实施方案中，利用包含体(occlusion)来施用结合分子。在一个实施方案中，将结合分子连同化学皮肤穿透增强剂一起并且利用包含体施用至健康的或患病的皮肤。在一个实施方案中，将结合分子作为微乳液并且利用包含体施用至健康的或患病的皮肤。
在本发明的各个方面的另一个实施方案中，可以使用非化学皮肤穿透增强剂，例如超声透入(phonophoresis)、超声促渗(sonophoresis)、电穿孔或使用微针技术来改善施用。这使用与药物贮存器连接的小针(10-200μm高和10-50μm宽)。微针递送装置在不达到真皮上部的神经末梢的情况下被施用至皮肤表面。
如以上给出的施用的结合分子能够至少穿透皮肤的外层，并且因此递送有效治疗量的结合分子以治疗疾病。如在本文中给出的施用的结合分子能够在优选6小时以下、例如1小时以下之内穿透皮肤。
在一个方面中，本发明涉及包含本发明的结合分子和有助于或提高皮肤穿透的皮肤穿透增强剂的药物组合物。除非另外指出，如在本文中所使用的术语皮肤穿透增强剂是指化学皮肤穿透增强剂。许多化学穿透增强剂是在本领域中已知的并且可以在本发明的组合物中使用。这些包括，但不限于：水，醇，优选具有高达六个碳原子的醇，例如乙醇，二醇，例如醇二甘醇N,N-二取代氨基乙酸烷基酯，例如N,N-二甲基-氨基乙酸十二烷基酯酯，例如乙酸乙酯，氮酮和衍生物，表面活性剂，例如十二烷基硫酸钠，萜和类萜，例如d-柠檬烯，脂肪酸，例如油酸，脲和衍生物，例如1,3-二苯基脲，吡咯烷酮，例如N-甲基-2-吡咯烷酮，和2-吡咯烷酮-5-羧酸，环糊精，例如β-环糊精，亚砜，例如二甲亚砜。其他皮肤穿透增强剂对于技术人员来说是已知的。在一个实施方案中，增强剂不是水。在一个实施方案中，皮肤穿透增强剂选自丙二醇、肉豆蔻酸异丙酯和氮酮中的一种或多种。优选的穿透增强剂是DMSO、氮酮、肉豆蔻酸异丙酯、油酸或它们的组合，例如如在表13和14中和在实施例中给出的。
在一个实施方案中，穿透增强剂不是下列各项中的一种或多种：水、乙醇、聚乙二醇衍生物、聚氧乙烯衍生物如聚山梨醇酯、脂肪醇如鲸蜡醇、硬脂醇、或鲸蜡硬脂醇(cerostearyl alcohol)、甘油和丙二醇。
本发明的结合分子在特定病症或病况的治疗中有效/活性的量将会取决于病症或病况的性质，并且可以通过标准临床技术确定。此外，可以任选采用体外或体内测定以帮助鉴别最佳的剂量范围。在组合物中采用的精确剂量还将会取决于给药途径和疾病或病症的严重性，并且应当根据从业人员的判断和每位患者的情况确定。
本发明的组合物包含有效量的本发明的结合分子，从而将会获得适合的剂量。化合物的正确的剂量将会根据特定的配制物、应用方式、以及其特定的位置、宿主和被治疗的疾病而变化。应当考虑其他因素，比如年龄、体重、性别、饮食、施用时间、排泄率、宿主的情况、药物组合、反应灵敏度和疾病的严重程度。可以在最大耐受剂量内连续地或周期地进行施用。
典型地，这种量是以组合物的重量计至少约0.01％的本发明的结合分子。
制备本发明的优选的组合物，从而肠胃外剂量单位含有约0.01％至约2重量％的本发明的结合分子。
对于静脉内施用来说，组合物通常可以包含约0.1mg/kg至约250mg/kg动物体重，优选约0.1mg/kg至约20mg/kg动物体重之间，并且更优选约1mg/kg至约10mg/kg动物体重。
本发明的组合物可以采取适合的载体的形式，如气雾剂、喷雾、悬浮液、或任何其他适合使用的形式。适合的药物载体的其他实例描述于E.W.Martin的“雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)”中。
还可以根据本发明使用脂质体和胶束。
脂质体是具有包含脂质双分子层的脂质壁的显微囊泡，并且在本发明的上下文中，封装仅有重链的抗体或本发明的组合物。在本文中的脂质体制剂包括阳离子(带正电的)、阴离子(带负电的)、和中性制剂。阳离子脂质体是容易获得的。例如，N[1-2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三乙基-铵(DOTMA)脂质体可以以商品名Lipofectin(GIBCO BRL,GrandIsland,NY)获得。类似地，阴离子和中性脂质体也是容易获得的或者可以使用容易获得材料容易地制备。这样的材料包括磷脂酰胆碱、胆固醇、磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)等。这些材料还可以与DOTMA以适当比率混合。用于使用这些材料制造脂质体的方法是在本领域内公知的。
胶束是本领域中已知的，由使得它们的极性首基形式外部球体壳而疏水性、烃链朝向球体的中心形成核心的方式排列的表面活性剂分子组成。胶束在含有表面活性剂的水溶液中以足够高的浓度形成，从而胶束自然产生。可用于形成胶束的表面活性剂包括，但不限于，月桂酸钾、辛烷磺酸钠、癸烷磺酸钠、十二烷磺酸钠、月桂基硫酸钠、多库酯钠、癸基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基氯化铵、十二烷基氯化铵、聚氧乙烯(polyoxyl)-8十二烷基醚、聚氧乙烯-12十二烷基醚、壬苯醇醚(nonoxynol)10、和壬苯醇醚30。
类似地，可以将微球结合至本发明的制剂中。与脂质体和胶束一样，微球基本上封装本发明的制剂的一种或多种组分。尽管并非必须，它们通常由脂质、优选带电脂质如磷脂形成。脂质微球的制备是在本领域内公知的并且在相关文章和文献中描述。
药物组合物可以使用在药物领域中公知的方法制备。例如，可以通过将本发明的结合分子与水组合从而形成溶液来制备预期通过注射施用的组合物。可以加入表面活性剂以促进均匀溶液或悬浮液的形成。
本发明此外涉及用于预防和/或治疗疾病的方法，所述方法包括向患者包含施用本发明的结合分子，所述方法包括向需要其的受试者施用药物活性量的本发明的结合分子和/或药物组合物。更具体地，本发明涉及用于预防和/或治疗选自由在本文中列出的疾病和病症组成的非限制性组中的疾病的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用药物活性量的本发明的结合分子或药物组合物。基于在本文中的公开内容，可以根据本发明治疗的免疫相关疾病的实例对于技术人员来说将会是清楚的，并且例如包括自身免疫疾病、炎性病况、过敏和过敏病况、超敏反应、严重感染、和器官或组织移植排斥。
本发明还涉及用于在疾病的治疗中使用的本发明的结合分子。在另一个方面中，本发明涉及用于在疾病的治疗中使用的本发明的结合分子，例如自身免疫疾病、炎性病况、过敏和过敏病况、超敏反应、严重感染、和器官或组织移植排斥。
在另一个方面中，本发明涉及本发明的结合分子在制造用于疾病的治疗的药物中的用途，例如自身免疫疾病、炎性病况、过敏和过敏病况、超敏反应、严重感染、和器官或组织移植排斥。根据以上不同的方面，疾病可以选自以下非限制性清单：银屑病(psoriasis)，系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosis)，类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis)，骨关节炎(osteoarthritis)，青少年慢性关节炎(juvenile chronicarthritis)，脊椎关节病(spondyloarthropathies)，系统性硬化症(systemicsclerosis)，特发性炎性肌病(idiopathic inflammatory myopathies)，干燥综合征(Sjogren's syndrome)，系统性血管炎(systemic vasculitis)，结节病(sarcoidosis)，自身免疫性溶血性贫血(autoimmune hemolytic anemia)，自身免疫性血小板减少症(autoimmune thrombocytopenia)，甲状腺炎(thyroiditis)，糖尿病(diabetesmellitus)，免疫介导的肾病(immune-mediated renal disease)，中枢和周围神经系统的脱髓鞘病(demyelinating diseases)如多发性硬化症(multiple sclerosis)、特发性脱髓鞘多神经病(idiopathic demyelinating polyneuropathy)或古兰-巴雷综合征(GuillainBarre syndrome)、和慢性炎性脱髓鞘多神经病(chronic inflammatory demyelinatingpolyneuropathy)，肝胆病如传染性、自身免疫性慢性活动性肝炎(autoimmune chronicactive hepatitis)、原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis)、肉芽肿性肝炎(granulomatous hepatitis)、和硬化性胆管炎(sclerosing cholangitis)，炎性肠病(inflammatory bowel disease)、麸质敏感性肠病(gluten-sensitive enteropathy)、和惠普尔病(Whipple's disease)，包括大疱性皮肤病(bullous skin diseases)、多形红斑(erythema multiforme)和接触性皮炎(contact dermatitis)的自身免疫性或免疫介导的皮肤病，过敏性疾病如哮喘(asthma)、过敏性鼻炎(rhinitis)、特应性皮炎(atopicdermatitis)、食物超敏反应(food hypersensitivity)和荨麻疹(urticaria)，肺的免疫性疾病如嗜酸细胞性肺炎(eosinophilic pneumonia)、特发性肺纤维化(idiopathicpulmonary fibrosis)和超敏性肺炎(hypersensitivity pneumonitis)，自身免疫性血液病(包括例如，溶血性贫血(hemolytic anaemia)、再生障碍性贫血(aplastic anaemia)、纯红细胞贫血(pure red cell anaemia)和特发性血小板减少症(idiopathicthrombocytopenia))，自身免疫性炎性肠病(包括例如，溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis)、克罗恩病(Crohn's disease)和肠易激综合征(Irritable Bowel Syndrome))，包括移植排斥(graft rejection)和移植物抗宿主病(graft-versus-host-disease)的移植相关疾病。
本发明的结合分子还可用于治疗、预防、或改善哮喘(asthma)、支气管炎(bronchitis)、尘肺病(pneumoconiosis)、肺气肿(pulmonary emphysema)、和其他呼吸道的阻塞或炎性疾病(obstructive or inflammatory disease)。
在优选的实施方案中，疾病选自银屑病(psoriasis)、脊椎关节病(spondyloarthropathies)、葡萄膜炎(uveitis)、特应性皮炎(atopic dermatitis)和哮喘(asthma)。
本发明的抗体可用于治疗由IL-17介导的、或者涉及IL-17产生或由IL-17的导致的TNF释放的促进的不希望的急性和超急性炎性反应，例如急性感染，例如感染性休克(septic shock)(例如，内毒素性休克(endotoxic shock)和成年呼吸窘迫综合征(adultrespiratory distress syndrome))、脑膜炎、肺炎；和重度烧伤；和用于治疗与病态TNF释放有关的、由感染、癌症、或器官功能障碍引起的恶病质(cachexia)或消耗综合征(wastingsyndrome)，尤其是例如与HIV感染有关或由HIV感染引起的AIDS相关的恶病质。
本发明的结合分子尤其可用于治疗骨代谢疾病，包括骨关节炎(osteoarthritis)、骨质疏松(osteoporosis)和其他炎性关节炎，以及一般性骨丧失(boneloss in general)，包括年龄相关的骨丧失，并且尤其是牙周病(periodontal disease)。
本发明的结合分子可以作为唯一活性成分施用或者与一种或多种其他药物组合施用，例如免疫抑制剂或免疫调节剂或其他抗炎药，例如用于治疗或预防上述疾病。例如，本发明的结合分子可以与下列各项组合使用：免疫抑制单克隆抗体，例如白细胞受体例如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD28、CD40。CD45、CD58、CD80、CD86的单克隆抗体或其配体；其他免疫调节化合物，例如具有CTLA4的细胞外结构域的至少一部分或其突变体的重组结合分子，例如与非CTLA4蛋白序列连接的CTLA4的至少细胞外部分或其突变体，例如CTLA4Ig(例如，指定为ATCC 68629)或其突变体，例如LEA29Y；粘附分子抑制剂，例如LFA-I拮抗剂、ICAM-I或-3拮抗剂、VCAM-4拮抗剂或VLA-4拮抗剂；或化疗药，例如紫杉醇(paclitaxel)、吉西他滨(gemcitabine)、顺铂(cisplatinum)、多柔比星(doxorubicin)或5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)；抗TNF试剂，例如TNF的单克隆抗体，例如英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、CDP870、或TNF-RI或TNF-RII的受体构建体，例如依那西普PEG-TNF-RI；促炎性细胞因子的阻断剂、IL-I阻断剂，例如阿那白滞素(Anakinra)或IL-I捕获剂、AAL160、ACZ885、IL-6阻断剂；趋化因子阻断剂，例如蛋白酶例如金属蛋白酶的抑制剂或活化剂、抗IL-15抗体、抗IL-6抗体、抗CD20抗体、NSAID如阿司匹林或抗感染剂。该清单不限于所提及的试剂。
本发明的结合分子可以与其他药物在相同时间或不同时间施用，例如同时、单独或依次。
本发明还涉及用于诊断疾病的方法。示例性的疾病是以上列出的。在一个实施方案中，疾病是银屑病。所述方法包括通过检测在本文中所述的结合分子在样品中的结合来确定IL-17A表达水平并且将IL-17A在试验样品中的表达水平与在来自非银屑病受试者的对照样品中的表达水平或与针对非银屑病受试者的标准值或标准值范围进行比较。相对于对照或标准的在试验样品中的IL-17A表达的升高表示疾病的存在。
在另一个方面中，本发明提供了含有可用于治疗上述疾病的本发明的结合分子和任选的使用说明书的试剂盒。
本发明还涉及使用本发明的结合分子的检测方法。考虑到它们与人IL-17A结合的能力，在本文中所公开的人IL-17A结合分子可以用于使用常规免疫测定如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或组织免疫组织化学来检测IL-17A(例如，在生物样品如血清或血浆中)。提供了用于检测生物样品中的IL-17A的方法，所述方法包括使生物样品与在本文中所公开的结合分子接触并且检测与IL-17A结合的结合分子或未结合的结合分子，从而检测生物样品中的IL-17A。结合分子用可检测物质直接或间接标记，以促进结合或未结合的抗体的检测。适合的可检测物质包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性材料。
作为将结合蛋白标记的备选方案，可以通过使用被可检测物质标记的IL-17标准品和未标记的人IL-17结合分子的竞争免疫测定而在生物液体中测定人IL-17A。在这种测定中，将生物样品、标记的IL-17标准品和人IL-17A结合分子组合并且确定与未标记的结合分子结合的标记的IL-17标准品的量。在生物样品中的人IL-17A的量与结合IL-17结合分子的标记的IL-17标准品的量成反比。类似地，还可以通过使用被可检测物质标记的IL-17标准品和未标记的人IL-17结合分子的竞争免疫测定而在生物液体中测定人IL-17。
如在本文中解释的，本发明的结合分子能够在体外和体内中和IL-17活性，例如人IL-17活性。
因此，在本文中所公开的这样的结合分子可以用于抑制IL-17活性，例如在含有IL-17的细胞培养物中，在人受试者中或在具有与在本文中所公开的结合分子交叉反应的IL-17的其他哺乳动物受试者中。在一个实施方案中，提供了用于抑制或增加IL-17活性的方法，所述方法包括使IL-17与在本文中所公开的结合分子接触，从而抑制或增加IL-17活性。例如，在含有、或疑似含有IL-17的细胞培养物中，可以将在本文中所公开的结合分子加入至培养基中以抑制培养物中的IL-17活性。
除非在本文中另外定义，与本公开结合使用的科学和技术术语应当具有本领域普通技术人员通常理解的含义。尽管前述公开内容提供了在本发明的范围内包括的主题的一般说明，包括制造和使用本发明的方法以及其最佳方式，提供以下实施例以进一步使得本领域技术人员能够实施本发明并且提供其全部书面说明。然而，本领域技术人员将会理解的是，这些实施例的细节不应被解释为限制本发明，其范围应当应当根据本公开所附的权利要求及其等价物理解。考虑到本公开，本发明的各种另外的方面和实施方案对本领域技术人员来说将会是显而易见的。
在本说明书中提及的全部文献通过通过整体引用结合在本文中，包括对基因登录号的引用。
在本文中使用的情况下，“和/或”应理解为具体公开了具有或不具有其他特征或组分的两个指定特征或组分中的每一种。例如。“A和/或B”应理解为具体公开了(i)A、(ii)B和(iii)A和B中的每一种，如同各自在本文中单独给出一样。除非上下文另外指出，以上给出的特点的描述和定义不限于本发明的任何具体方面或实施方案并且等同地应用于全部所描述的方面和实施方案。
在非限制性实施例中进一步描述本发明。
实施例
实施例1.Tg/TKO小鼠的构建
根据之前描述的(WO2004/076618和WO2003/000737,Ren等，Genomics,84,686,2004；Zou等,J.Immunol.,170,1354,2003)，构建携带在针对内源性重链和轻链抗体表达沉默的背景下的种系构型中的重链抗体转基因基因座的小鼠(三敲除，或TKO)。简而言之，在具有包含与缺少CH1结构域的小鼠免疫球蛋白恒定区基因、小鼠增强子和调节区结合的多种人VH、D和J基因的酵母人工染色体(YAC)的新受精卵母细胞的原核显微注射之后，得到转基因小鼠。酵母人工染色体(YAC)是可以用于酵母中非常大的DNA插入物的克隆的载体。除了包含具有与天然酵母染色体一样的行为所必需的所有三个顺式作用结构元件(自主复制序列(ARS)、着丝粒(CEN)和两个端粒(TEL))之外，它们接受大DNA插入物的能力使得它们能够达到类似染色体的稳定性和在酵母细胞中的运输的保真性所需的最小尺寸(150kb)。YAC的构建和使用是在本领域内公知的(例如，Bruschi,C.V.和Gjuracic,K.酵母人工染色体(Yeast Artificial Chromosomes)，生命科学百科(ENCYCLOPEDIA OF LIFE SCIENCES)2002Macmillan Publishers Ltd,Nature Publishing Group/www.els.net)。
所使用的YAC为约340kb，包含其天然构型中的10个人重链V基因、人重链D和J基因、鼠Cγ1基因和鼠3’增强子基因。其缺乏CH1外显子。具体地，YAC包含(从5’到3’)：端粒-酵母TRP1标记基因-着丝粒-10个人V基因-人D基因-人J基因-小鼠μ增强子和转换(switch)-小鼠Cγ1(CH1Δ)基因-小鼠3’增强子-潮霉素(hygromycin)抗性基因-酵母标记基因HIS3-端粒。
将转基因祖先小鼠与缺少内源性免疫球蛋白表达的动物回交以构建在所描述的免疫研究中使用的Tg/TKO品系。
实施例2.用于免疫的抗原
免疫使用重组的纯化蛋白。重组人IL-17A购自Peprotech(Peprotech,目录号AF-200-17)。
实施例3.免疫方案
在本情况中，向Tg/TKO施用重组蛋白。简而言之，8-12周龄的小鼠各自接受在完全弗氏佐剂(Complete Freund’s Adjuvant)中乳化并且皮下递送的总计10ug的重组蛋白，接着进行在不完全弗氏佐剂中乳化、也皮下施用、在初始启动以各种间隔提供的1-10ug的重组蛋白的强化免疫。在磷酸盐缓冲盐水中，在不存在佐剂的情况下，腹膜内施用最后剂量的抗原。
也可以采用备选的免疫途径和操作。例如，可以使用不同的佐剂或免疫增强操作代替弗氏佐剂。DNA免疫通常肌内递送或通过基因枪递送。尽管并非专门地，通常腹膜内施用转染细胞或来自这样的细胞的膜制剂。
实施例4.血清ELISA
在免疫期间和之后，从小鼠中收集血清并且通过ELISA检查对免疫原的重链抗体应答的存在。用50μl/孔的5μg重组抗原/ml PBS溶液将Nunc Maxisorp平板(Nunc目录号443404)在4℃涂布过夜。在将抗原溶液倾析之后，使用补充有0.05％20(sigmaP1379)的PBS(由PBS片剂制备，Oxoid目录号BR0014G)，接着用未加入的PBS洗涤。为了阻断非特异性蛋白相互作用，将在PBS中的3％脱脂奶粉(Marvel)溶液加入至孔中并且将板在室温下温育至少一小时。在聚丙烯管或平板中制备血清在3％脱脂奶粉/PBS中的稀释液并且在室温下温育至少一小时，之后转移至封闭的ELISA板中，在那里进行至少一小时的进一步温育。之后利用借助和随后的PBS的重复洗涤将未结合的蛋白洗掉。之后将在PBS/3％μ中制备的生物素缀合的山羊抗小鼠IgG、Fcγ亚型1特异性抗体(Jackson 115-065-205)的溶液加入至每个孔中并且在室温下进行进一步温育至少一小时。通过使用和PBS重复洗涤来移除未结合的检测抗体。之后将在3％Marvel/PBS中的中性亲和素-HRP溶液(Pierce 31030)加入至ELISA平板中并且使其结合至少30分钟。在进一步洗涤之后，使用TMB底物(Sigma目录号T0440)将ELISA显色并且在10分钟之后通过加入0.5M H2SO4溶液(Sigma目录号320501)将反应停止。通过在450nm读数来确定吸光度。血清ELISA数据的实例在图7中示出。也可以使用备选的测定，如ELISPOT测定以检验免疫诱发的重链抗体应答。
实施例5.来自免疫小鼠的文库的生成
a.处理组织、RNA提取和cDNA制备
将脾、腹股沟和肱淋巴结从免疫的动物中收集至RNAlater中。对于每只动物，单独处理1/3的脾和4个淋巴结。首先，将组织均化；在将组织转移至裂解基质D珠管(Lysingmatrix D bead tube)(MP Bio目录号116913100)之后，加入600μl的含有β-巯基乙醇的RLT缓冲液(来自Qiagen试剂盒，目录号74104)，之后使用6m/s 40秒的周期在MP BioFastprep均化器(目录号116004500)中均化。将含有均化组织的管转移至冰上，并且通过以10g微量离心5分钟将碎片沉淀。将400μl的上清液移出并且用于RT-PCR。
首先，遵循制造商规程使用Qiagen试剂盒目录号74104提取RNA。之后将每个RNA样品用于使用Superscript III RT-PCR高保真试剂盒(Invitrogen目录号12574-035)来制备cDNA。对于每个脾和LNRNA样品来说，进行5次RT-PCR反应，各自使用与用于VH1、VH2、VH3、VH4或VH6家族的引物结合的VH_J/F(长)引物。引物的详情如下；
表6引物
粗体的残基与pUCG3具有同源性
基于以下管反应组分，为RT-PCR反应准备主混合物(mastermix)。
12.5μl 2x反应混合物
0.5μl正向引物(10uM)
0.5μl反向引物(10uM)
0.5μl酶混合物
500ng-1μg RNA
用水达到25μl
在热循环器中使用以下条件进行RT-PCR反应；
50℃ 20分钟
94℃ 2分钟
35个循环：94℃ 15秒
58℃ 30秒
68℃ 30秒
68℃ 5分钟
保持在4℃
通过凝胶电泳确认在370bp范围内的产物。
对于每个小鼠，针对来自1/3脾的给定家族和4个淋巴结中的每一个对VH产物进行扩增，并且之后集中以利用根据厂商说明书使用的Thermo/Fermentas GeneJet PCR纯化试剂盒(目录号K0702)纯化，并且将产物在50μl的水中洗脱。
b.克隆至噬菌粒载体中
在这些研究中采用噬菌粒载体pUCG3。如所指出的，可以使用包括用NcoI和XhoI进行限制性酶消化、连接和转化的常规方法将VH克隆至pUCG3中。备选地，可以使用基于PCR的方法构建VH噬菌粒文库。这两种操作都用于由扩增的VH序列生成文库。在本领域中广泛使用前一种方法。对于基于PCR的方法来说，使用以下操作：
使用PCR构建pUCG3的线性化形式；利用以下引物：
pUCG3-F3CTCGAGGGTGGCGGTAGCCATCACCACCATC SEQ ID No.388
pUCG3-R3TCCATGGCCATCGCCGGCTGGGCCGCGAG SEQ ID No.389
将具有GC缓冲液的Phusion高保真PCR主混合物(目录号F532L，NEB)用于包含以下试剂的PCR反应；
所使用的循环条件是
98℃ 30秒
10个循环：
98℃ 10秒
58℃ 20秒
68℃ 2分30秒
20个循环：
98℃ 10秒
58℃ 20秒
68℃ 3分钟
68℃ 5分钟
4℃保持
使用Fermentas GeneJet凝胶纯化试剂盒(目录号K0691)，根据厂商说明书，利用在40μl的洗脱缓冲液中的最终洗脱，将PCR产物(3152bp)凝胶纯化。基于以下反应，采用纯化的VH RT-PCR产物作为具有线性化pUCG3的大引物(megaprimer)，得到噬菌粒产物以用于转化和文库创建；
PCR如下进行；
在1％琼脂糖凝胶上分析PCR的产物。
使用Fermentas PCR纯化试剂盒(目录号K0702)，根据厂商说明书，并且最终洗脱在25μl H2O中的情况下，将各种家族VH/噬菌粒产物纯化，并且用于使用BioRad 10×1mm比色杯(目录号165-2089)、Eporator和预热的恢复培养基(Lucigen，专用混合物)通过电穿孔将TG1大肠杆菌(Lucigen，目录号：60502-2)转化。将2μl的纯化产物加入至25ul的细胞中以用于电穿孔，并且以1800v对每个VH/噬菌粒产物进行高达10次电穿孔。将电穿孔的细胞集中并且回收在50ml Falcon管中，在以150rpm振荡的情况下在37℃温育1小时。进行10倍稀释系列的试样量的转化，并且接种在含有补充有2％(w/v)葡萄糖和100ug/ml氨苄青霉素(ampicillin)的2xTY琼脂的佩特里培养皿(petri dish)中。使用在这些培养皿上的所得克隆估算文库大小。将其余部分的转化接种在含有补充有2％(w/v)葡萄糖和100ug/ml氨苄青霉素的2xTY琼脂的大号生物测定培养皿上。将所有琼脂平板在30℃下温育过夜。将10ml的2xTY培养基加入至大号生物测定培养皿中，并且刮取菌落，并且测量OD600(1.0的OD＝5×108个细胞/ml)。将试样在加入50％v/v甘油溶液(50％)之后在-80℃下储存在冷冻小瓶(cryovial)中或者直接在噬菌体选择过程中使用。
在一些实例中，直接挑取克隆并且确定序列，得到文库的多样性的预估。典型地，对于每个小鼠，构建具有大于1e8个重组体的噬菌体展示文库以完全捕获在该小鼠中的VH多样性。
实施例6.天然VH文库
天然体外人VH1文库的构建
如下通过PCR(Finnzymes F-531L)扩增人VH1-02支架：25ul 2xPhusion PCR混合物；2.5μl V1a/B(10uM)；2.5ul VH3-93/F/C-(10uM)；10ng的编码VH1-02的质粒和dH2O至50ml的最终体积。之后将反应加热至95℃达1分钟，接着进行30个PCR循环：98℃10秒、54℃30秒、72℃30秒。之后通过在1％(w/v)琼脂糖凝胶上的电泳来分析PCR的产物并且用溴化乙锭染色。在大约300bp的正确尺寸观察到PCR扩增产物(图6A)。
来自脾、淋巴结、骨髓和外周血淋巴细胞的人cDNA购自商业来源(Invitrogen,Clontech)。合成寡核苷酸引物VHCDR3/B/G和VHJ/F以促进如下的VH-CDR3加来自B细胞的VH构架4序列的PCR扩增：25μl 2xPhusion PCR混合物(Finnzymes F-531L)；2.5μl VHCDR3/B/G-(10uM)；2.5ul VHJ/F(10uM)；3ng cDNA和dH2O至最终50ul。之后将反应加热至95℃达1分钟，接着进行30个PCR循环：98℃10秒、54℃30秒、72℃30秒。在30个循环之后，然后将PCR反应在72℃加热8分钟，接着保持在10℃。之后通过在1％(w/v)琼脂糖凝胶上的电泳来分析PCR的产物并且用溴化乙锭染色。在大约50-100bp的正确尺寸观察到PCR扩增产物(图6B)。
之后将人VH-CDR3PCR产物与VH1-02支架装配以生成编码全长VH结合分子的DNA产物。通过加入以下各项将VH1-02支架与扩增的人VH-CDR3序列装配：12.5ul 2x Phusion PCR混合物(Finnzymes F-531L)；40ng的VH1-02PCR产物；10ng的每种VH-CDR3PCR产物和dH2O至最终25ul。之后将反应加热至95℃达1分钟，接着进行8个PCR循环：98℃10秒、54℃30秒、72℃30秒。在8个循环之后，然后将PCR反应在72℃加热8分钟，接着保持在10℃。之后通过拼接(pull-through)PCR由装配产物扩增全长VH产物：100ul 2x Phusion PCR混合物(Finnzymes F-531L)；10ul的寡核苷酸V1a/B(10uM)；10ul的寡核苷酸VHJ/F(10uM)；10ul的VH1-02装配产物和dH2O至200ul的最终体积。之后将反应加热至95℃达1分钟，接着进行30个PCR循环：98℃10秒、54℃30秒、72℃30秒。在30个循环之后，然后将PCR反应在72℃加热8分钟，接着保持在10℃。之后通过在1％(w/v)琼脂糖凝胶上的电泳来分析PCR的产物并且用溴化乙锭染色。在大约400bp的预期尺寸观察到全长VH产物(图6C)。将PCR产物使用FermentasPCR纯化柱(K0701)纯化并且在dH2O中重悬。
为了制备用于噬菌体展示的文库，通过限制性消化和连接将全长VH产物克隆至噬菌粒载体pUCG3中。用NcoI(Fermentas FD0574)和XhoI(Fermentas FD0694)限制性酶将pUCG3DNA和VH1-02拼接PCR产物在37℃过夜消化。将所有消化物加热至80℃达5分钟并且之后将每个产物使用Fermentas PCR纯化柱(K0701)纯化并且最终在dH2O中重悬。
使用NEB T4DNA连接酶(M0202M)按照厂商说明书将消化VH产物与类似消化的pUCG3连接。简而言之，将NcoI/XhoI双消化的pUCG3DNA和VH产物以1:2的摩尔比混合并且用T4连接酶在16℃温育过夜。在70℃温育30分钟之后，将连接的产物使用Fermentas PCR纯化柱纯化并且最终在dH2O中重悬。之后，使用比色杯(165-2089)和Micropulser，按照厂商说明书将2ul的纯化连接产物电穿孔至25μl的电感受态TG1细胞(Lucigen 60502-1)中。将电穿孔的TG1细胞接种至补充有100ug/ml的氨苄青霉素和20％(w/v)的葡萄糖的2xTY琼脂平板上并且在30℃温育过夜。还接种电穿孔的TG1细胞的稀释系列以确定计算为7.7e9个重组体的文库尺寸。
序列
表7-寡核苷酸引物(从5’到3’)
支架序列
VH 1-02氨基酸序列SEQ ID No.394
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR
VH 1-02核酸序列SEQ ID No.395
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCGGCTACTATATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACCCTAACAGTGGTGGCACAAACTATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGA
实施例7.对IL-17A结合VH的分离的选择策略
根据公开的方法(抗体改造(Antibody Engineering)，Benny Lo编，第8章，161-176页，2004年)进行文库噬菌体储备物的制备和噬菌体展示选择。在大多数情况中，使用与淘选(panning)方法组合的噬菌体展示将结合VH结构域分离。然而，可以采用各种不同的选择方法，包括：(a)可溶性选择；(b)在应力下进行的选择，其中在选择之前将噬菌体在70℃加热2小时；和(c)竞争性选择，其中作为竞争加入过量的抗原或抗原反应性VH结构域以促进高亲和力VH结构域的恢复或者使选择偏离特定的表位。对于来自免疫小鼠的文库，进行一轮选择。然而，对于天然文库来说，进行2-3轮选择。
实施例8.对靶标结合的测定
在以下测定中的一个或多个中筛选来自不同选择的VH以鉴别具有中和性质的特异性VH。
a)结合ELISA
在文库选择之后，通过噬菌体ELISA按照公开的方法(抗体改造(AntibodyEngineering)，Benny Lo编，第8章，161-176页，2004年)鉴别特异性VH抗体。针对靶蛋白和作为对照的非相关抗原进行噬菌体ELISA。在一些情况下，通过ELISA代替使用噬菌体ELISA测定VH结构域的纯化或粗提取物。在这些情况中，使用细菌周质提取物或纯化的VH。
由在深孔板中生长的1ml培养物制备小规模的细菌周质提取物。在37℃在250rpm振荡的情况下，使用起子培养物接种含有补充有0.1％(w/v)葡萄糖+100ug/ml氨苄青霉素的2XTY培养基(Melford，M2130)的96孔深孔板(Fisher，目录号MPA-600-030X)。当OD600达到0.6-1时，通过加入补充有IPTG(最终浓度1mM)和氨苄青霉素的100ul的2XTY来诱导VH产生并且将培养物在30℃在250rpm振荡的情况下过夜生长。通过以3200rpm离心10分钟将大肠杆菌沉淀并且将上清液丢弃。通过轻轻地移液(pipetting)将细胞沉淀在30-100μl的冰冷提取缓冲液(20％(w/v)蔗糖、1mM EDTA&50mM Tris-HCl pH 8.0)中重悬。将细胞在冰上温育30分钟并且之后以4500rpm在4℃离心15分钟。将上清液转移至聚丙烯板，并且在脱脂奶粉/PBS封闭溶液中温育之后在ELISA中使用。
通过使用用于周质提取物的镍-琼脂糖亲和层析纯化的VH C端6xHIS标签获得纯化的VH。在补充有2％(w/v)葡萄糖+100ug/ml氨苄青霉素的5ml 2XTY培养基(Melford,M2103)中在30℃在250rpm振荡的情况下，将每个VH的起子培养物过夜生长。之后使用50μl的这种过夜培养物接种补充有2％(w/v)葡萄糖+100μg/ml氨苄青霉素的50ml 2XTY并且在37℃在250rpm振荡的情况下温育大约6-8小时(直到OD600＝0.6-1.0)。之后将培养物以3200rpm离心10分钟并且将细胞沉淀在含有100ug/ml氨苄青霉素+1mM IPTG的50ml新鲜2XTY培养基中重悬。之后将摇瓶在30℃和250rpm下温育过夜。将培养物以3200rpm再次离心10分钟并且将上清液丢弃。通过轻轻地移液(pipetting)将细胞沉淀在1ml冰冷提取缓冲液(20％(w/v)蔗糖、1mM EDTA&50mM Tris-HCl pH 8.0)中重悬，并且之后加入另外1.5ml的1:5稀释的冰冷提取缓冲液。将细胞在冰上温育30分钟并且之后以4500rpm在4℃离心15分钟。将上清液转移至含有咪唑(Sigma,I2399–终浓度10mM)和用PBS缓冲液预平衡的0.5ml的镍琼脂糖珠(Qiagen,Ni-NTA 50％soln,30210)的50ml Falcon管中。在4℃在轻轻振荡的情况下使VH与镍琼脂糖珠的结合进行2小时。之后将镍琼脂糖珠转移至polyprep柱(731-1550)并且通过重力流将上清液丢弃。之后用5ml的PBS+0.05％将柱洗涤3次，接着用含有20mM的浓度的咪唑的5ml的PBS洗涤3次。之后通过加入含有250mM的浓度的咪唑的250ul的PBS将VH从柱中洗脱。之后通过缓冲液交换利用NAP-5柱(GE Healthcare,17-0853-01)将咪唑从纯化的VH制剂中移除并且之后用1ml的PBS洗脱。通过分光光度法估算纯化VH的收率并且使用SDS PAGE评估纯度。
对粗或纯化VH的结合ELISA与之前描述的血清ELISA和噬菌体ELISA相似，主要是最后的检测步骤不同。简而言之，通过加入以在PBS中0.1-1ug/ml的50ul体积并且在4℃温育过夜，将抗原固定在maxisorb平板(Nunc 443404)上。在涂布之后，将抗原溶液吸出并且使用补充有0.05％20(sigma P1379)的PBS(由PBS片剂制备，Oxoid目录号BR0014G)，接着用未加入的PBS洗涤。为了阻断非特异性蛋白相互作用，将3％脱脂奶粉(Marvel)在PBS中的溶液加入至孔中并且将板在室温下温育至少一小时。在聚丙烯管或平板中制备周质提取物或纯化VH在3％脱脂奶粉/PBS中的稀释液并且在室温下温育至少一小时，之后转移至封闭ELISA板中，在那里进行至少一小时的进一步温育。之后利用借助和随后的PBS的重复洗涤将未结合的蛋白洗掉。之后将以1:1000稀释度在PBS/3％脱脂奶粉中制备的HRP缀合的抗His Ab(Miltenyi Biotec,130-092-785)的溶液加入至每个孔中并且在室温下进行进一步温育至少一小时。通过使用和PBS重复洗涤来移除未结合的检测抗体。之后使用TMB底物(Sigma目录号T0440)将ELISA显色并且在10分钟之后通过加入0.5M H2SO4溶液(Sigma目录号320501)将反应停止。通过在450nm读数来确定吸光度。实例ELISA数据在图8中示出。
b)R/L生物化学抑制测定
还测试了VH、纯化和粗周质提取物二者其抑制IL-17A与重组IL-17RA-Fc的相互作用的能力。将Maxisorb 96F孔微量滴定板用2nM IL-17-RA(R&D systems，目录号177-IR-100)的50μl溶液温育并且在4℃温育过夜。在如上所述的过量涂布抗原的洗涤之后，将板的孔用3％脱脂奶粉/PBS温育以阻断非特异性蛋白相互作用。在聚丙烯板或管中用在3％marvel/PBS溶液中的1nM重组IL-17A(Peprotech，目录号AF-200-17)将VH制剂、粗周质提取物或纯化VH、或适合的对照在室温下温育至少1小时。之后将混合物转移至测定板并且在室温下温育1小时。通过洗涤移除过量蛋白，并且通过用生物素化抗IL-17A Mab(R&DSystems,目录号BAF317)温育接着加入中性亲和素-HRP(Pierce，目录号31030)和TMB底物(Sigma，目录号T0440)来检测结合的IL-17A。通过加入0.5MH2SO4将TMB反应停止并且在450nm在平板读数器中测量吸光度。
在适当时，使用在PRISM中的曲线拟合确定抑制VH的EC50。示出了在生物化学测定中的IL-17A应答的抑制的实例数据在图9中示出。VH由噬菌粒载体表达并且具有以下C端延伸LEGGGS HHHHHH(SEQ ID No.396)。
c)基于R/L细胞的抑制测定
对测定进行显色以测量IL-17A结合VH抑制IL-17A诱发的从细胞系HT1080(ECACC目录号85111505)中的IL6释放的能力。将细胞系在补充有非必需氨基酸、10％FBS、2mM L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素的具有Earles盐的MEM中维持在指数生长中，并且在加湿温育器中在37℃、5％CO2下温育。为了测定，将50,000个细胞/孔接种至96平底组织培养板中并且过夜培养。制备纯化VH的连续稀释液并且用补充有10ng/ml IL-17A(Peprotech目录号AF200-17)的培养基/PBS在37℃温育1小时。在温育之后，将VH/IL-17A混合物(或适合的对照)转移至HT1080细胞(已经将培养基从中吸出)并且在CO2温育器中温育另外5小时。收集细胞培养物上清液并且按照厂商说明书使用IL-6Duoset(R&D Systems，目录号DY206)测定IL6。示出了在基于细胞的测定中的IL-17A应答的抑制的实例数据在图10中示出。VH由噬菌粒载体表达并且具有以下C端延伸LEGGGS HHHHHH(SEQ ID No.396)。
d)
在T200仪器上测量抗IL-17A的VH抗体的结合动力学。将重组IL-17A(Peprotech AF-200-17)在pH 5.5的乙酸盐缓冲液(目录号BR-100-52)中稀释至1ug/ml并且使用胺偶联化学(NHS-EDC胺偶联试剂盒，目录号BR-1000-50)和固定软件与CM5系列S芯片(目录号BR-1006-68)偶联。以这种方式，将100RU的IL-17A固定，并且还制备空白表面(无IL-17A)以用于参比差减(reference subtraction)。
通过单循环动力学确定抗IL-17A的VH抗体的结合动力学。在稀释系列(通常为以在最高浓度的100nM VH开始的1:3稀释系列)中制备VH抗体，并且之后在涂布有抗原的表面以及空白表面上注射，以VH的最低浓度开始并且之后逐步工作多至最高浓度。之后根据(减去空白的)传感图描记图使用1:1结合模型和BIAevaluation软件确定VH结合动力学。实例结合描记图在图11中示出。VH由噬菌粒载体表达并且具有以下C端延伸LEGGGSHHHHHH(SEQ ID No.396)。
在以上筛选级联(screening cascade)之后，鉴别了显示对IL-17A的抑制性质的多种VH。这些总结在以下表8中。克隆是用于优化的亲本克隆。
表8
实施例9.VH的前导优化
a.从免疫小鼠中分离的VH的优化
在适当时，使用新型优化策略以增加从免疫的小鼠分离的VH的结合亲和力。将前导VH与相同谱系的其他成员进行比对以鉴别在免疫应答期间靶向的体细胞超突变热点(图9)。在这些位置处的氨基酸的选择构成了新的重组文库方法的基础，并且导致了以选择在每个突变热点处具有最佳氨基酸的较高亲和力的VH为目标的新的文库的设计。
作为IL-17A的实例，将克隆1.1直接从免疫小鼠中分离。显示这种VH以高亲和力与IL-17A结合(图11)并且显示其阻断IL-17A与受体结合。克隆1.1与相同谱系的其他成员的比对鉴别了许多在免疫应答期间突变的氨基酸位置，并且VH-CDR和VH构架区二者均受影响(图12)。之后使用该信息设计旨在鉴别克隆1.1的较高亲和力的变体的新的克隆1.1重组文库。
表9
将具有HF缓冲液的Phusion高保真PCR主混合物(目录号F531L，NEB)用于针对每个引物配对如下设置的PCR反应：
PCR如下进行；
在1％琼脂糖凝胶上分析每个PCR的产物。之后使用Fermentas PCR纯化试剂盒(K0701)将每个产物纯化至40ul洗脱缓冲液中。之后设置装配(assembly)PCR以重建完整VH序列：
PCR如下进行；
将0.5ul的引物V3/pelB(长)和VH_J/F(长)(二者均为10uM)加入至反应中，并且之后在以上条件下继续额外10个PCR循环。将PCR产物在1％琼脂糖凝胶上分析并且使用Fermentas PCR纯化试剂盒纯化至40ul洗脱缓冲液中。之后使用PCR产物作为大引物以用于如在以上实施例5的b部分中描述的文库构建。之后进行如在实施例7和8中描述的噬菌体展示选择和VH筛选，之后以高达10倍的提高的亲和力分离克隆1.1的多种新型变体(克隆1.10、1.6、1.7)。
b.从天然体外文库中分离的VH的优化
对于从天然体外噬菌体展示文库中分离的抗IL-17A VH来说，采用许多不同的策略增加对抗原的VH亲和力，以及由所讨论的VH的起始效力驱动的选择和组合。所使用的多种优化策略已经在本领域中描述并且包括：
a)改组(shuffling)(抗体改造(Antibody Engineering)，Benny Lo编，第19章，327-343页，2004年)，尽管在我们的情况中，将CDR1和CDR2结构域改组而保持VH CDR3序列。VH CDR1和CDR2结构域通过PCR从人cDNA(Clontech)扩增，并且之后与VH序列装配以产生具有相同CDR3结构域但是多样的CDR1和CDR2区的VH的文库。之后通常按照与在以上第7节中描述的相同的选择过程使用噬菌体展示技术分离较高亲和力的VH。
b)使用随机寡核苷酸和噬菌体展示技术的CDR3区的靶向随机化(Main等人，JPharmacol Exp Ther.2006Dec；319(3):1395-404)。
c.通过易错诱变和核糖体展示的VH优化
使用易错诱变和核糖体展示来优化从天然体外噬菌体展示文库中分离的VH、在适当时来自免疫小鼠的VH的亲和力。如之前所描述的，进行易错PCR反应、与cK片段的装配和用于核糖体展示的RNA模板的制备(Edwards BM,He M,Methods Mol.Biol.2012；907:281-92)。之后将方法调整为有利于溶液选择并且在选择期间提供对抗原浓度的更高的控制。
表10引物
利用如下预封闭的链霉抗生物素蛋白(streptavidin)磁珠(Dynabeads M280,Invitrogen)进行基于溶液的核糖体展示选择。将所需体积的珠(通常每次选择100ul)转移至硅化的1.5ml管(Sigma T3406)并且之后在洗涤缓冲液(在4℃储存的含有0.05％20和5mM MgAc的PBS)中洗涤，然后再次在PBS中洗涤，之后最终在PBS中的100ul1％BSA+2ul酿酒酵母RNA(Sigma 83847，以在无RNA酶的水中10mg/ml制备，在-20℃储存)+20ul肝素(Sigma，目录号H3393，250mg/ml储备溶液，在-20℃储存)中重悬并且通过在转盘上在4℃混合>1小时来温育。
使用每次选择5ug mRNA模板，如描述的(Edwards BM,He M,MethodsMol.Biol.2012；907:281-92)，进行文库RNA模板的体外翻译以制备核糖体复合物。在体外翻译步骤完成之后，将反应稀释至封闭缓冲液中以帮助在选择之前将核糖体复合物稳定。通过将100ul 10×BPM(在10xPBST中10％BSA、10mM MgAc)加入至含有10ul肝素储备溶液和1ul酿酒酵母(S.cerevisae)RNA储备溶液的400ul稀释缓冲液(5mM还原的谷胱甘肽、5mM氧化的谷胱甘肽和13mM MgAc)中。
在用封闭缓冲液在冰上温育5分钟之后，之后在4℃将反应以14000g离心5分钟并且将上清液转移至预冷却的0.5ml硅化管以用于选择。对于第一轮选择来说，将生物素化抗原加入至混合物中以使最终浓度为200mM并且通过在转盘上在4℃混合2小时来温育。
通过加入预封闭的链霉抗生物素蛋白珠而从选择混合物中回收被抗原结合的复合物，通过在4℃旋转15分钟来温育，并且之后使用磁体将结合的复合物拉下。之后将磁珠用洗涤缓冲液(每次洗涤400ul)洗涤5次，在4℃温育多至30分钟。进行400ul冰冷5mM MgAc的最后快速洗涤，之后将珠在100ul 5mM MgAc中重悬。使用Minelute试剂盒(Qiagen 74204)，将350ul缓冲液RLT加入至珠中，将孔混合，然后加入100％乙醇并且通过移液将孔混合，进行RNA从珠中的洗脱和纯化。之后用磁体将珠拉至一侧并且将其余上清液加入至在2ml集合管中的minielute柱中，并且立刻以8000g离心15秒。将柱放置在新的集合管中并且根据厂商说明书进行从将缓冲液RPE加入柱中向前的其余步骤。
使用Revertaid H Minus反转录酶(Fermentas EP0451)将洗脱的RNA转化为cDNA：
将反应在65℃温育5分钟，之后转移至冰上达3分钟。之后将8ul的以下混合物加入至混合物中：
将反应混合并且短暂旋转沉降，之后在42℃温育60分钟，接着在70℃温育10分钟。之后使用Taq聚合酶PCR试剂盒(Qiagen 201203)如下进行cDNA的PCR回收：
将反应分为各自50μl的16个PCR管，并且反应循环如下：
通过凝胶电泳确认在700bp范围内的产物，并且将PCR反应集中并且使用SV PCR纯化柱(Promega A9281)纯化。直接使用PCR产物制备RNA模板以用于如上所述的后续各轮选择。
以逐渐增加的严格性，例如通过降低抗原浓度和缩短时间长度，进行后续各轮选择，将复合物用生物素化抗原温育。此外，洗涤步骤在持续时间或数量、或二者方面增加。在洗涤步骤之后还使用解离速率选择，其中用100至1000倍摩尔过量的未生物素化抗原将复合物和珠在4℃温育>2小时。
对后续各轮选择的方案的其他修改包括消除与链霉抗生物素蛋白珠非特异性结合的核糖体复合物的预选择步骤。这通过在选择之前用链霉抗生物素蛋白珠(如以上制备的珠，在4℃结合1小时)将体外翻译混合物温育而实现。之后将珠捕获并且将翻译混合物转移至洁净的1.5ml硅化管并且加入生物素化抗原以用于选择。
在前导优化步骤之后，改进的VH的效力如下：
a)表11在抗IL-17A VH第3家族(来源于体外天然文库的亲本克隆3.1)的优化之后制备的VH
b)表12在抗IL-17A VH第1家族(来源于如上所述的免疫TKO小鼠的亲本)的优化之后制备的VH
归因于慢的解离速率，优化的VH序列在基于IL-17细胞的测定中显示出提高的与IL-17的亲和力和提高的效力(图11)。VH由噬菌粒载体表达并且具有以下C端延伸LEGGGSHHHHHH(SEQ ID No.396)。
实施例10-VH的表征
a.抗IL-17A的特异性
按照实施例8(a)中描述的方法，通过ELISA确认个体VH对靶抗原的特异性。测试VH的与IL-17A的结合并且显示其不与接近的相关物如IL-17C和IL-17F交叉反应。此外，还证明了与同源物种(鼠IL-17A)的结合(图13)。VH由噬菌粒载体表达并且具有以下C端延伸LEGGGSHHHHHH(SEQ ID No.396)。
b.表位定位
使用T200仪器，显示VH与IL-17A的独特表位结合。手工传感图以30ul/分钟在HBS缓冲液中开始，并且在IL-17A偶联的CM5芯片上适当注射VH，外加用于参比差减的空白表面(图14)。VH由噬菌粒载体表达并且具有以下C端延伸LEGGGS HHHHHH(SEQ IDNo.396)。
对于IL-17A来说，以4ug/ml在HBS缓冲液中制备VH样品并且之后在120秒内在IL-17A偶联的表面上注射第一VH。在第一VH结合之后，在60秒内在表面上仅注射HBS缓冲液，之后在120秒内注射第二VH。如果VH竞争相同的表位，则关于第二v抗体将观察不到结合。非竞争性VH将能够同时与IL-17A偶联的表面结合。示出了表位竞争数据(图14)。通过在10秒内注射甘氨酸pH 1.5将表面再生，并且之后针对不同的抗体对重复该过程。
c.HPLC尺寸排阻层析
对纯化的VH进行尺寸排阻层析。简而言之，使用具有2487双λ#吸光度检测器(在280nM检测)和TSKgel G2000SWXL(TOSOH)柱的2795分离组件来对纯化的VH进行分析。样品以10-50ul体积注射并且在10％异丙醇/90％PBS或100mM磷酸盐缓冲液、pH 6.8、150mM NaCl的流动相中以0.5ml/分钟-0.7ml/分钟的流速流动。将数据收集多至35分钟并且将VH级分的尺寸与已知的标准品进行比较(参见图15)。分析的VH由噬菌粒载体表达并且具有以下C端延伸LEGGGSHHHHHH(SEQ ID No.396)。
实施例11
皮肤穿透研究
在实验中使用的VH结构域是克隆1.10.2。克隆1.10.2具有如在图1中所示的VH序列，但是包括另外的C端残基(SEQ ID No.409)。使用标准大肠杆菌重组表达载体，在标准间歇方式条件下在丰富培养基中在25L发酵罐中进行蛋白表达。表达通过IPTG诱导的启动子驱动并且通过OmpA信号序列分泌至培养基中。将VH修饰以携带C端His-标签(6xHis)，其用于在后续IHC成像和蛋白质印迹(western blot)中的纯化和检测。
将在发酵培养基中的VH通过离心澄清，并且使用Ni2+-亲和层析纯化，接着进行蛋白浓缩和在75上的最后的SEC纯化步骤。将VH缓冲液交换为PBS、pH 7.4，并且浓缩至20mg/ml。
在预研究中，评估将要在后续研究中使用的(尤其是，评价冷冻过程的任何潜在影响)皮肤盘(skin disk)。将两种潜在载体制剂(PBS和35％DMSO)中的每一种在完整和摩擦(胶带剥离)的皮肤盘上在32℃温育24小时，之后固定在10％福尔马林中并且在室温下储存在70％乙醇中。此外，在不使用具有任何载体的前温育的情况下，将完整的和胶带剥离的皮肤中的每一种的一个样品固定(如以上)。随后通过IHC评估固定的皮肤样品的结构。
方案：
组织的福尔马林固定
为了制备1L 10％福尔马林(v/v)：
100ml 37％甲醛
900ml PBSc
为了制备1L PBSc(PBS、0.5mM MgCl2、0.9mM CaCl2)：
1L PBS
0.5ml 1M MgCl2
0.9ml 1M CaCl2
固定方案：
1)将每个样品放置到小药瓶中并且覆盖至高于具有10％福尔马林的样本至少1cm的高度。
2)之后使样品在室温下固定取决于其尺寸的设定的时间段(参见以下)。
<1cm3 18小时
1-3cm3 48小时
3)在刚刚固定之后，将固定剂用相同体积的70％乙醇替换。在这个阶段，如果不需要立即处理，可以将组织无限期地储存。
免疫组织化学(IHC)
为了使皮肤盘的被温育的区域暴露，将每个盘切成两半并且将两半放入包埋盒(Cell Path，#EAD-0107-03A和#EAD-0102-03A)中。通过使其经过一系列醇(70％和100％乙醇(VWR#20821.330)、100％丙-2-醇(Fisher#P/7500/PB17))和二甲苯(100％二甲苯(Fisher#X/0250/PB17))将样品脱水，并且随后用石蜡渗透。将样品包埋在石蜡中，以使得每一半的切割边将会是第一暴露组织的方式进行定位。将每个方块的5μm切片切割至载玻片上。还切割商业供应的正常人皮肤(AMSBio#500041022)的5μm切片。在固定之前不将这种样品冷冻。将之前冷冻的试验样品的组织结构与这种对照皮肤进行比较。使用以下方案将切片用苏木精和曙红(H&E)染色以使组织可见。以两倍放大选取皮肤样品的图像。
苏木精和曙红染色方案
如下在一系列二甲苯和乙醇洗涤中将载玻片切片脱蜡并且再水合：
将载玻片在流动的自来水中洗涤1分钟，之后在2分钟内转移至Mayer苏木精，并且在流动的自来水中洗涤1分钟。通过将它们放置在Scott水中1分钟将载玻片“蓝化(blued)”，并且在流动的自来水中洗涤1分钟。随后将载玻片在30秒内转移至曙红(RaymondA Lamb；LAMB/100-D)中，并且在流动的自来水中洗涤1分钟，之后如下通过一系列乙醇和二甲苯洗涤将它们脱水并且清除：
将载玻片浸渍在Histoclear(Fisher Scientific；H/0468/17)中并且立刻固定在封固基质(mounting medium)(Cell Path；SEA-0304-00A)中。
Mayer苏木精：
溶液1：在20ml的无水乙醇中的3g苏木精(BDH；340374T)
溶液2：0.3g碘酸钠(Sigma S-4007)、1g柠檬酸(Fisher Scientific C/6200/53)、50g水合氯醛(Fisher Scientific C/4280/53)、50g硫酸铝钾(Sigma 237086)、850mldH2O。将试剂依次加入，充分混合以确保全部溶解。将溶液1加入至溶液2中并且充分混合。加入最终120ml的甘油(Fisher Scientific G/0650/17)，充分混合，并且储存在暗瓶中。最后的混合物总是在即将使用前过滤。Scotts自来水：具有2％MgSO4(Sigma M7506)和0.35％NaHCO3(Sigma S-6297)的自来水。
结果：
样品1完整的对照
样品2胶带剥离的对照
样品3完整的PBS
样品4胶带剥离的PBS
样品5完整的DMSO
样品6胶带剥离的DMSO
在低功率和高功率二者下，表皮和真皮的结构未出现在之前冷冻的样品和非冷冻的对照样品之间的明显不同。不存在表皮与真皮的分离，并且与在非冷冻对照中一样，观察到胶原蛋白密集地填充在冷冻样品的真皮内。
当与非冷冻对照样品相比时，未用载体温育的皮肤样品和用PBS或DMSO温育的那些(样品3至6)全部显示出正常的结构。与完整的样品相比，胶带剥离的皮肤的IHC明确地确定了角质层的程度的预期的降低。
以上结果表明，将要在皮肤穿透研究中使用的治疗适用于保持完整的组织结构。
穿透实验使用Bronaugh流通式扩散池系统(flow-through diffusion cellsystem)。在这个系统中，被取皮的(dermatomed)人皮肤的小盘被夹在上(“供体”)腔室和下(“受体”)腔室(后者含有保持与皮肤样品的下部接触的受体液)之间。如果施用至皮肤的上(角质层)表面的含有VH的试验制剂首先进入并且之后穿越皮肤样品的全部厚度，则其仅能够从供体腔室向受体腔室中移动。使用Bronaugh系统超过其他类似装置(例如，Franz池)的益处是，当评价穿透皮肤的药物时，其提供用新鲜受体液连续灌注皮肤样品的下部以保持漏漕条件(sink condition)的优势。
各种原型制剂促进VH向皮肤样品(完整的和胶带剥离的)中的穿透的能力的评估。本研究的主要成果是显示出在皮肤中的VH的IHC图像。
全部人皮肤在可选的手术之后获得并且在切除24小时内制备。随后将制备的组织在使用前在密封真空包装中冷冻(负20℃)储存。在与微米卡规一起使用时测量并且记录被取皮的皮肤的实际厚度。针对局部施用的VH的一个潜在的目标临床指标是患有银屑病的患者的治疗。作为单一疗法或与其他疗法如局部类固醇配合，患有银屑病的患者通常用角质溶解剂(例如，水杨酸)治疗它们的斑块。角质溶解剂有助于移除鳞屑或角化过度并且可以促进其他局部药剂的穿透。模拟用角质溶解剂预治疗的银屑病皮肤的最佳方式是轻轻摩擦(胶带剥离)皮肤从而移除部分角质层。这种通过向皮肤反复施加和移除多块玻璃纸胶带(20-30次)从而损害角质层屏障功能而实现。
体外皮肤穿透研究使用Bronaugh流通池评估在以下表中的制剂中的每一个促进VH向完整的或胶带剥离的皮肤中穿透的相对能力。
用来自单一供体的被取皮的人皮肤进行研究。如以下详述的获得并且制备皮肤。在即将在研究中使用之前制备每种制剂的样品。
表13在体外皮肤穿透研究中使用的原型制剂的组合物
研究设计/制剂
组织类型：来自单一供体的被取皮的人皮肤
池类型：54个流通扩散池(具有0.9cm直径或0.64cm2面积的Bronaugh设计)
池温度：32℃
受体相(RP)：具有0.1％(w/v)叠氮化钠的PBS，pH 7.4
RP收集点：0-6、6-12、12-18、和18-24小时
RP流速：0.25mL/小时。
剂量水平：无限剂量：500mg的制剂/池
表14
组织制备
正常皮肤：人皮肤在可选的手术之后获得并且在切除24小时内制备。随后将制备的组织在使用前在密封真空包装中冷冻(在负20℃)储存。在多个随机部位与微米卡规一起使用时测量并且记录被取皮的皮肤的实际厚度，从而确定皮肤厚度的范围。
胶带剥离的皮肤：将如以上制备的正常皮肤的样品用多块单独的玻璃纸胶带反复胶带剥离(三十次)以损害角质层屏障功能。
在即将使用前，将皮肤样品切成正确尺寸的盘并且在Bronaugh池中与最上面的角质层装配。
实验详情
试验材料的配料：
在即将在研究中使用之前制备每种试验制剂的样品和对照(在表13中详述)。原型制剂的配料在整个扩散池集流管系统中交错。将大约500mg的每种制剂分配至皮肤上，以重量确定确切的质量。在配料之后，将池用封口膜(Parafilm)堵塞并且在32℃在24小时的暴露时间段内保持不受打扰。
样品制备和分析：
维持在每个Bronaugh池中的皮肤样品使其下表面与由pH 7.4的PBS以及0.1％(w/v)叠氮化钠组成的受体液接触。受体液被泵送从而以0.25ml/小时流经每个受体腔室。利用六小时间隔的连续收集来自动收集受体相样品。每6小时，自动级分收集器旋转以对齐在收集接下来六个小时的样品的池以下的新的20mL闪烁瓶。将全部样品收集在预称重的闪烁瓶中，读取收集后的重量并且将差记录为收集的受体相的重量。
在24小时的暴露时间段之后，在将供体溶液移除之后将Bronaugh腔室拆卸而使受体液不被供体液污染，皮肤样品从它的相应的Bronaugh腔室中移除并且如在预研究中所描述的各自固定在福尔马林中。
将全部受体相样品包装在塑料闪烁瓶中并且在-80℃冷冻，直到后续ELISA分析。
ELISA：
所使用的ELISA方法与在预配制研究中使用的相同，不同之处在于以2种浓度制备受体液的每个样品：(a)纯净的(50μl的受体液加10μl的18％Marvel、6xPBS)，和(b)1:100稀释(2μl的受体液加198μl的3％Marvel/PBS)。
受体液分析的结果
在穿透研究期间，在四个时间点从每个Bronaugh池中对受体液进行取样(在6小时、12小时、18小时和24小时)。全部通过ELISA测试以确定施用至皮肤的上表面(角质层)的VH是否已经进入并且经过皮肤样品。对于完整的皮肤来说，ELISA的结果在图17中示出，并且对于胶带剥离的皮肤来说，ELISA的结果在图18中示出。在记录阳性ELISA信号的情况下，来源于在不同制剂中含有VH的池的ELISA信号的大小的变化表明，在每个原型制剂中的不同的穿透增强剂促进VH横跨角质层并且进一步向表皮和真皮中的穿透的能力是变化的。
在皮肤样品中的VH的IHC成像的结果
来自用在原型制剂中的VH治疗的皮肤的IHC图像的实例在图19至图28中示出。可以看到在整个皮肤样品的深度的VH的标记。此外，在IHC图像上观察到的VH标记的规模和在来源于相应Bronaugh池的接收液体中测量的ELISA信号之间存在一般正相关。重要的是，在正常完整的或胶带剥离的皮肤中，尺寸对照IgG均不横跨角质层并且进一步穿透至皮肤中，支持了仅仅少得多的VH结构域能够横跨角质层穿透至表皮中的事实。
实施例12
两个相同的或两个不同的抗IL-17A的VH可以直接串联或通过蛋白接头连接一起。如果两个连接的VH分别作用于IL17A的相同的表位，则连接的VH-VH被称为二价。如果连接的两个VH分别作用于IL-1A7的不同的表位，则连接的VH-VH被称为双互补位。
使用标准分子生物学克隆技术将两个VH以及在VH-接头-VH形式中的接头和C端HIS6标签的编码DNA序列克隆至大肠杆菌或酵母(巴斯德毕赤酵母(Pichia Pastoris))表达载体中。HIS6标记的VH-VH产物的表达和纯化遵循标准蛋白表达和纯化方法。
制备了许多构建体并且结果在附图中示出。构建体使用克隆1.1、1.10、1.2和3.2。
二价：1.10-3(G4S)-1.1
接头序列：GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO.426)
DNA序列：
双互补位：3.2-2(G4S)-1.2；3.2-4(G4S)-1.2；3.2-6(G4S)-1.2；
接头序列：AAGGGGSGGGGS(SEQ ID NO.427)
AAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
(SEQ ID NO.428)
AAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO.429)
已经在上测试了纯化的VH-VH的IL1A7结合亲和力。已经在IL6释放测定上分析了功能。
序列信息
SEQ ID No.409 1.10.2(具有C端延伸和His标签的克隆1.10)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYRMYWVRQAPGKGLEWVASIEQDGSEEYYVDSVKGRFTISRDNAKKSLFLQMNSLRAEDTAVYYCAK GEILPLYFDY WGQGTLVTVSSAAA HHHHHH
SEQ ID No.410 1.2.2(具有C端延伸和His标签的克隆1.2)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMYWVRQAPGKGLEWVAEIKQDGSVQYYVSDVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGEILPLYFDYWGQGTLVTVSSAAA HHHHHH
SEQ ID No.411 1.2.3(具有C端延伸的克隆1.2)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMYWVRQAPGKGLEWVAEIKQDGSVQYYVSDVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGEILPLYFDYWGQGTLVTVSSA
SEQ ID No.412 1.3.2(具有C端延伸和His标签的克隆1.3)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMYWVRQAPGKGLEWVAEIKQDGSVQYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGEILPLYFDYWGQGTLVTVSS AAA HHHHHH
SEQ ID No.413 1.3.3(具有C端延伸的克隆1.3)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMYWVRQAPGKGLEWVAEIKQDGSVQYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGEILPLYFDYWGQGTLVTVSSA
SEQ ID No.414 1.6.1(由噬菌粒载体表达的克隆1.6：具有接头残基和His标签)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMYWVRQAPGKGLEWVAEIKQDGSEQYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGEILPLYFDYWGQGTLVTVSSLEGGGS HHHHHH
SEQ ID No.415 1.7.1(由噬菌粒载体表达的克隆1.7：具有接头残基和His标签)
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMYWVRQAPGKGLEWVAKIEQDGSEEYYVDSVKGRFTISRDNAKKSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGEILPLYFDYWGQGTLVTVSS LEGGGS HHHHHH
SEQ ID No.416 1.10.1(由噬菌粒载体表达的克隆1.10：具有接头残基和His标签)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYRMYWVRQAPGKGLEWVASIEQDGSEEYYVDSVKGRFTISRDNAKKSLFLQMNSLRAEDTAVYYCAKGEILPLYFDYWGQGTLVTVSS LEGGGS HHHHHH
SEQ ID No.417 1.3.1(由噬菌粒载体表达的克隆1.3：具有接头残基和His标签)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMYWVRQAPGKGLEWVAEIKQDGSVQYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGEILPLYFDYWGQGTLVTVSS LEGGGS HHHHHH
SEQ ID No.418 3.2.1(由噬菌粒载体表达的克隆3.2：具有接头残基和His标签)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYNADAYYINWVRQAPGQGLEWMGSIKPNTGATKYAQKFQGRVTITRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCASLDRDTWYPHSYAGWFDAWGQGTLVTVSS LEGGGSHHHHHH
SEQ ID No.419 1.1.1(由噬菌粒载体表达的克隆1.1：具有接头残基和His标签)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMYWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCAKGEILPLHFDYWGQGTLVTVSS LEGGGS HHHHHH
SEQ ID No.420 1.16.1(由噬菌粒载体表达的克隆1.16：具有接头残基和His标签)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMYWVRQAPGKGLEWVAEIKQDGSEQYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNGLRAEDTAVYYCAKGEILPLYFDYWGQGTLVTVSS LEGGGS HHHHHH
SEQ ID No.421 1.20.1(由噬菌粒载体表达的克隆1.20：具有接头残基和His标签)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMYWVRQAPGKGLEWVAKIEQDGSEEYYADSVKGRFTISRDNAKKSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGEILPLYFDYWGQGTLVTVSS LEGGGS HHHHHH
SEQ ID No.422 1.19.1(由噬菌粒载体表达的克隆1.19：具有接头残基和His标签)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFSSYGMYWVRQAPGKGLEWVAEIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGEILPLYFDYWGQGTLVTVSS LEGGGS HHHHHH
SEQ ID No.423 1.17.1(由噬菌粒载体表达的克隆1.17：具有接头残基和His标签)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMYWVRQAPGKGLEWVAEIKPTGSVQYYVSDVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGEILPLYFDYWGQGTLVTVSS LEGGGS HHHHHH
SEQ ID No.424 1.18.1(由噬菌粒载体表达的克隆1.18：具有接头残基和His标签)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMYWVRQAPGKGLEWVAEIKQDGSVQYYVGGVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGEILPLYFDYWGQGTLVTVSSLEGGGS HHHHHH
SEQ ID No.425 1.21.1(由噬菌粒载体表达的克隆1.21：具有接头残基和His标签)
EVQLVESGGGLVLPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMYWVRQAPGKGLEWVAEIKQDGSEQYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGEILPLYFDYWGQGTLVTVSS LEGGGS HHHHHH
二价：1.10-3(G4S)-1.1(E1/6Q)
SEQ ID No.430
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYRMYWVRQAPGKGLEWVASIEQDGSEEYYVDSVKGRFTISRDNAKKSLFLQMNSLRAEDTAVYYCAKGEILPLYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMYWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCAKGEILPLHFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID No.431
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGTTATCGCATGTACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAGCATAGAACAAGATGGAAGTGAGGAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAAGTCACTGTTTCTGCAAATGAATAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGGGGAAATACTACCCCTCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGAGGTAGTGGTGGAGGAGGTAGTGGTGGAGGAGGTAGTCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGTTATTCGATGTACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAAGCAAGATGGAAGTGAGAAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTTTCTGCAAATGAATAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGGGGAAATACTACCCCTCCACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCTTCA
双互补位：3.2-2(G4S)-1.2
SEQ ID No.432
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYNADAYYINWVRQAPGQGLEWMGSIKPNTGATKYAQKFQGRVTITRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCASLDRDTWYPHSYAGWFDAWGQGTLVTVSSAAGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMYWVRQAPGKGLEWVAEIKQDGSVQYYVSDVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGEILPLYFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID No.433
CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTAAAGAAGCCTGGGGCCTCGGTGAAGGTCTCCTGTAAGGCTTCCGGATATAACGCGGACGCCTATTATATAAATTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGTCTTGAGTGGATGGGAAGTATCAAGCCTAATACCGGTGCCACAAAATATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGAGTCACCATAACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGTCTGGATCGGGATACGTGGTACCCGCACTCCTACGCGGGGTGGTTCGACGCGTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCTTCAGCGGCCGGTGGTGGCGGTTCAGGTGGAGGTGGTAGTGAGGTTCAGTTGGTGGAAAGCGGCGGTGGCCTGGTCCAGCCGGGTGGTAGCCTGCGCCTGTCCTGCGCGGCTAGCGGTTTCACGTTTAGCAGCTACAGCATGTACTGGGTGCGTCAAGCGCCAGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTGCCGAGATTAAGCAAGACGGTTCTGTTCAGTATTATGTCAGCGACGTGAAGGGTCGTTTTACCATCAGCCGTGACAACGCGAAAAACAGCCTGTATTTGCAGATGAATTCCCTGCGCGCTGAAGATACCGCGGTGTATTACTGTGCGAAAGGTGAGATTCTGCCGCTGTACTTCGATTACTGGGGCCAAGGCACCCTGGTTACTGTCTCGAGC
双互补位：3.2-4(G4S)-1.2
SEQ ID No.434
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYNADAYYINWVRQAPGQGLEWMGSIKPNTGATKYAQKFQGRVTITRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCASLDRDTWYPHSYAGWFDAWGQGTLVTVSSAAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMYWVRQAPGKGLEWVAEIKQDGSVQYYVSDVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGEILPLYFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID No.435
CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTAAAGAAGCCTGGGGCCTCGGTGAAGGTCTCCTGTAAGGCTTCCGGATATAACGCGGACGCCTATTATATAAATTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGTCTTGAGTGGATGGGAAGTATCAAGCCTAATACCGGTGCCACAAAATATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGAGTCACCATAACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGTCTGGATCGGGATACGTGGTACCCGCACTCCTACGCGGGGTGGTTCGACGCGTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCTTCAGCGGCCGGTGGTGGCGGTTCAGGAGGTGGAGGTTCAGGAGGTGGTGGTTCTGGTGGAGGTGGTAGTGAGGTTCAGTTGGTGGAAAGCGGCGGTGGCCTGGTCCAGCCGGGTGGTAGCCTGCGCCTGTCCTGCGCGGCTAGCGGTTTCACGTTTAGCAGCTACAGCATGTACTGGGTGCGTCAAGCGCCAGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTGCCGAGATTAAGCAAGACGGTTCTGTTCAGTATTATGTCAGCGACGTGAAGGGTCGTTTTACCATCAGCCGTGACAACGCGAAAAACAGCCTGTATTTGCAGATGAATTCCCTGCGCGCTGAAGATACCGCGGTGTATTACTGTGCGAAAGGTGAGATTCTGCCGCTGTACTTCGATTACTGGGGCCAAGGCACCCTGGTTACTGTCTCGAGC
双互补位：3.2-6(G4S)-1.2
SEQ ID No.436
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYNADAYYINWVRQAPGQGLEWMGSIKPNTGATKYAQKFQGRVTITRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCASLDRDTWYPHSYAGWFDAWGQGTLVTVSSAAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMYWVRQAPGKGLEWVAEIKQDGSVQYYVSDVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGEILPLYFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID No.437
CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTAAAGAAGCCTGGGGCCTCGGTGAAGGTCTCCTGTAAGGCTTCCGGATATAACGCGGACGCCTATTATATAAATTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGTCTTGAGTGGATGGGAAGTATCAAGCCTAATACCGGTGCCACAAAATATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGAGTCACCATAACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGTCTGGATCGGGATACGTGGTACCCGCACTCCTACGCGGGGTGGTTCGACGCGTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCTTCAGCGGCCGGTGGTGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGAGGTGGAGGTTCAGGAGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGTGGATCGGGTGGAGGTGGTAGTGAGGTTCAGTTGGTGGAAAGCGGCGGTGGCCTGGTCCAGCCGGGTGGTAGCCTGCGCCTGTCCTGCGCGGCTAGCGGTTTCACGTTTAGCAGCTACAGCATGTACTGGGTGCGTCAAGCGCCAGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTGCCGAGATTAAGCAAGACGGTTCTGTTCAGTATTATGTCAGCGACGTGAAGGGTCGTTTTACCATCAGCCGTGACAACGCGAAAAACAGCCTGTATTTGCAGATGAATTCCCTGCGCGCTGAAGATACCGCGGTGTATTACTGTGCGAAAGGTGAGATTCTGCCGCTGTACTTCGATTACTGGGGCCAAGGCACCCTGGTTACTGTCTCGAGC
序列表
<110> 克雷森多生物制剂有限公司
<120> 治疗分子
<130> FAMILY 13
<150> GB1500463.3
<151> 2015-01-12
<160> 466
<170> BiSSAP 1.3
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 1
Ser Tyr Ser Met Tyr
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 2
Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 3
Gly Glu Ile Leu Pro Leu His Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 4
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Glu Ile Leu Pro Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 5
Ser Tyr Ser Met Tyr
1 5
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 6
Glu Ile Lys Gln Asp Gly Ser Val Gln Tyr Tyr Val Ser Asp Val Lys
1 5 10 15
Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 7
Gly Glu Ile Leu Pro Leu Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 8
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 8
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Lys Gln Asp Gly Ser Val Gln Tyr Tyr Val Ser Asp Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Glu Ile Leu Pro Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 9
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
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Ser Tyr Ser Met Tyr
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<220>
<223> 克隆
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Glu Ile Lys Gln Asp Gly Ser Val Gln Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
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<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
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Gly Glu Ile Leu Pro Leu Tyr Phe Asp Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 12
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Lys Gln Asp Gly Ser Val Gln Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Glu Ile Leu Pro Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<220>
<223> 克隆
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Ser Tyr Ser Met Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 14
Glu Ile Lys Gln Thr Gly Ser Val Gln Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys
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Gly
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<212> PRT
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Gly Glu Ile Leu Pro Leu Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 16
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Lys Gln Thr Gly Ser Val Gln Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Glu Ile Leu Pro Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 17
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<220>
<223> 克隆
<400> 17
Ser Tyr Ser Met Tyr
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 18
Glu Ile Lys Pro Thr Gly Ser Val Gln Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 19
<211> 10
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<220>
<223> 克隆
<400> 19
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<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 20
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<213> 人工序列
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<223> 克隆
<400> 77
Ser Tyr Gly Met Tyr
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<211> 17
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<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 78
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Gly Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Lys Ile Glu Gln Asp Gly Ser Glu Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr
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Gly
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<220>
<223> 克隆
<400> 140
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<400> 188
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<223> 克隆
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<213> 人工序列
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<400> 191
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<220>
<223> 克隆
<400> 193
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1 5
<210> 194
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 194
Glu Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Gln Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 195
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<212> PRT
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<220>
<223> 克隆
<400> 195
Gly Glu Ile Leu Pro Leu Tyr Phe Asp His
1 5 10
<210> 196
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<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 196
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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1 5
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<223> 克隆
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Gly
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<223> 克隆
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1 5 10 15
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 251
Lys Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Asp Tyr Val Asp Ser Val Lys
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100 105 110
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Ala Tyr Trp Met Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 254
Lys Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Asp Tyr Val Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 255
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 255
Glu Ser Ile Phe Gly Ile Pro Glu Asp
1 5
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 256
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ser Gly Gly
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 314
Trp Ile Asn Pro Asn Thr Gly Thr Thr Lys Tyr Ala Arg Glu Phe Glu
1 5 10 15
Gly
<210> 315
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 315
Leu Asp Arg Asp Trp Arg Ser Pro Asn Asp Tyr Phe Gly Trp Phe Asp
1 5 10 15
Ser
<210> 316
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 316
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
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<220>
<223> 克隆
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 318
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Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 319
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1 5 10 15
Ser
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<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 320
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1 5 10 15
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<223> 克隆
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<212> PRT
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<223> 克隆
<400> 322
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Gly
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<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 323
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<220>
<223> 克隆
<400> 324
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<223> 克隆
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 克隆
<400> 326
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Gly
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<223> 克隆
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<223> 克隆
<400> 328
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<223> 克隆
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<223> 克隆
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<223> 克隆
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<223> 克隆
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<223> 克隆
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<223> 克隆
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<223> 克隆
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<223> 克隆
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<400> 342
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<220>
<223> 克隆
<400> 344
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<223> 克隆
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<220>
<223> 克隆
<400> 346
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<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 348
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<400> 354
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<212> DNA
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<220>
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<211> 357
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<220>
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<400> 356
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<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH 1.9
<400> 357
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<210> 358
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH 1.10
<400> 358
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agttatcgca tgtactgggt ccgccaggct 120
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ctgcaaatga atagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gaaaggggaa 300
atactacccc tctactttga ctactggggc cagggaaccc tggtcactgt ctcttca 357
<210> 359
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH 1.11
<400> 359
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agttatcaga tgtactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccagc ataaaacaag atggaagtga ggaatactat 180
gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgttt 240
ctgcaaatga atagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gaaaggggaa 300
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<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH 1.12
<400> 360
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agttatggga tgtactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaag atagagcaag atggaagtga ggaatactat 180
gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga atagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gaaaggggaa 300
atactacccc tctactttga ctactggggc cagggaaccc tggtcactgt ctcctca 357
<210> 361
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH 1.13
<400> 361
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agttatggga tgtactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccagc atagaacaag atggaagtga gaaatactat 180
gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga atagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gaaaggggaa 300
atactacccc tctactttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 362
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH 1.14
<400> 362
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc gtggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agttatcgga tgtactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccagc atagaacaag atggaagtga ggaatactat 180
gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa gtcactgttt 240
ctgcaaatga atagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gaaaggggaa 300
atactacccc tctactttga ctactggggc cagggaaccc tggtcactgt ctcttca 357
<210> 363
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH 1.15
<400> 363
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agttatagca tgtactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccgag ataaggcaag atggaagtga gcaatactat 180
gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga atagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gaaaggggaa 300
atactacccc tctactttga ctactggggc cagggaaccc tggtcactgt ctcttca 357
<210> 364
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH 1.16
<400> 364
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agttatagca tgtactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccgag ataaagcaag atggaagtga gcaatactat 180
gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga atggcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gaaaggggaa 300
atactgcccc tctacttcga ctactggggc cagggaaccc tggtcactgt ctcttca 357
<210> 365
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH 1.17
<400> 365
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agttatagca tgtactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccgag ataaagccaa ccgggagtgt gcaatactat 180
gtgtccgacg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga atagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gaaaggggaa 300
atactacccc tctactttga ctactggggc cagggaaccc tggtcactgt ctcttca 357
<210> 366
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH 1.18
<400> 366
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agttatagca tgtactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccgag ataaagcaag acggcagtgt gcaatactat 180
gtggggggcg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga atagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gaaaggggaa 300
atactacccc tctactttga ctactggggc cagggaaccc tggtcactgt ctcttca 357
<210> 367
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH 1.19
<400> 367
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcaa cctctggatt cacctttagt agttatggaa tgtactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccgag ataaaacaag atggaagtga gaaatactat 180
gtggactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga atagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gaaaggggaa 300
atactacccc tctactttga ctactggggc cagggaaccc tggtcactgt ctcttca 357
<210> 368
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH 1.20
<400> 368
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agttatggga tgtactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaag atagagcaag atggaagtga ggaatactat 180
gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa gtcactgtat 240
ctgcaaatga atagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gaaaggggaa 300
atactacccc tctactttga ctactggggc cagggaaccc tggtcactgt ctcttca 357
<210> 369
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH 1.21
<400> 369
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcctgc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcgg cctctggatt cacctttagt agttatagca tgtactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccgag ataaagcaag atggaagtga gcaatactat 180
gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga atagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gaaaggggaa 300
atactacccc tctactttga ctactggggc cagggaaccc tggtcactgt ctcttca 357
<210> 370
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH 1.22
<400> 370
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccggc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agttatggga tgtactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaag atagagcaag atggaagtga ggaatactat 180
gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa gtcactgtat 240
ctgcaaatga atagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaaggggaa 300
atactacccc tctactttga ctactggggc cagggaaccc tggtcactgt ctcttca 357
<210> 371
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH 2.1
<400> 371
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agctatggga tgggctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaaa ataaaacaag atggaagtga gaaagactat 180
gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa gtcactgttt 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attattgtgc gagagagagt 300
atatttggaa tccccgagga ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 372
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> nucleic acid encoding VH 3.1
<400> 372
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggata caccttcacc ggctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaacccta acagtggtgg cacaaactat 180
gcacagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccatcag cacagcctac 240
atggagctga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagtatggat 300
cgggattatt atgatactag tggttacttt ggctggttcg actcctgggg ccagggaacc 360
ctggtcaccg tctcttca 378
<210> 373
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> nucleic acid encoding VH 3.2
<400> 373
caggttcagc tggtgcagtc tggagctgag gtaaagaagc ctggggcctc ggtgaaggtc 60
tcctgtaagg cttccggata taacgcggac gcctattata taaattgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag gtcttgagtg gatgggaagt atcaagccta ataccggtgc cacaaaatat 180
gcacagaagt ttcagggcag agtcaccata accagggaca cgtccatcag cacagcctac 240
atggagctga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagtctggat 300
cgggatacgt ggtacccgca ctcctacgcg gggtggttcg acgcgtgggg ccagggaacc 360
ctggtcaccg tctcttca 378
<210> 374
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> nucleic acid encoding VH 3.3
<400> 374
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcgcag cttccggata caccttcacc gactactatc tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatggggtgg atcaacccta acactggcac cacaaagtat 180
gcacgggagt ttgagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccatcag cacagcctac 240
atggagctga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagtatggat 300
cgggattatt atgatactag tggttacttt ggctggttcg actcctgggg ccagggaacc 360
ctggtcaccg tctcttca 378
<210> 375
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> nucleic acid encoding VH 3.5
<400> 375
caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcgcag cttccggata caccttcacc gactactatc tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatggggtgg atcaacccta acactggcac cacaaagtat 180
gcacgggagt ttgagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccatcag cacagcctac 240
atggagctga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagtctggat 300
cgggattggc gctcgcccaa cgactacttt ggctggttcg actcgtgggg ccagggaacc 360
ctggtcaccg tctcttca 378
<210> 376
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> nucleic acid encoding VH 3.6
<400> 376
caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcgcag cttccggata caccttcacc gactactatc tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatggggtgg atcaacccta acactggcac cacaaagtat 180
gcacgggagt ttgagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccatcag cacagcctac 240
atggagctga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagtctggat 300
cgggattggc gctcgcccaa cgactactac gggtggttcg actcgtgggg ccagggaacc 360
ctggtcaccg tctcttca 378
<210> 377
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> nucleic acid encoding VH 3.9
<400> 377
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgtaagg cttccggata taacttcgac gcctatcata taaattgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagt atcaagccta atagtggtgc cacaaaatat 180
gcacagaagt ttcagggcag agtcaccata accagggaca cgtccatcag cacagcctac 240
atggagctga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagtatggat 300
cgggattact atgatactag tggttacttt ggctggttcg actcctgggg ccagggaacc 360
ctggtcaccg tctcctca 378
<210> 378
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> nucleic acid encoding VH 3.11
<400> 378
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgtaagg cttccggata taacttcgac gcctatcata taaattgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag gtcttgagtg gatgggaagt atcaagccta atagtggtgc cacaaaatat 180
gcacagaagt ttcagggcag agtcaccata accagggaca cgtccatcag cacagcctac 240
atggagctga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagtctggat 300
cgggatacgt ggtacccgca ctcctacttt ggctggttcg actcgtgggg ccagggaacc 360
ctggtcaccg tctcttca 378
<210> 379
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> nucleic acid encoding VH 3.13
<400> 379
caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgtaagg cttccggata taacttcgac gcctatcata taaattgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag gtcttgagtg gatgggaagt atcaagccta atagtggtgc cacaaaatat 180
gcacagaagt ttcagggcag agtcaccata accagggaca cgtccatcag cacagcctac 240
atggagctga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagtctggat 300
cgggatacgt ggtacccgca ctcctacgcg gggtggttcg actcgtgggg ccagggaacc 360
ctggtcaccg tctcttca 378
<210> 380
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> nucleic acid encoding VH 4.1
<400> 380
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agctattgga tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggaatg ggtggccacc ataaaacaag atggaagtga gaaatactat 180
gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccacgaa ctcactgttt 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gaggggagat 300
acgattttcg acggtgcttt tgatatctgg ggccaaggga caatggtcac tgtctcctca 360
<210> 381
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> nucleic acid encoding VH 5.1
<400> 381
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agctattgga tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaagcaag atggaagtga gaaatactat 180
gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gcatcagtgg 300
cccttctttg actactgggg ccaagggaca atggtcactg tctcctca 348
<210> 382
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 382
gccgctggat tgttattact cgcggcccag ccggccatgg cccaggtbca gctggtgcag 60
tctggggctg agg 73
<210> 383
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 383
gccgctggat tgttattact cgcggcccag ccggccatgg cccagatcac cttgaaggag 60
tctgg 65
<210> 384
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 384
gccgctggat tgttattact cgcggcccag ccggccatgg ccsaggtgca gctggtggag 60
tctgggggag g 71
<210> 385
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 385
gccgctggat tgttattact cgcggcccag ccggccatgg cccaggtgca gctgcaggag 60
tcggg 65
<210> 386
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 386
gccgctggat tgttattact cgcggcccag ccggccatgg cccaggtaca gctgcagcag 60
tcagg 65
<210> 387
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 387
ccgtggtgat ggtggtgatg gctaccgcca ccctcgagtg argagacrgt gacc 54
<210> 388
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 388
ctcgagggtg gcggtagcca tcaccaccat c 31
<210> 389
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 389
tccatggcca tcgccggctg ggccgcgag 29
<210> 390
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 390
gctaccgcca ccctcgagtg argagacrgt gacc 34
<210> 391
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 391
ggaacagacc accatggccc aggtbcagct ggtgcagtct ggggctgagg 50
<210> 392
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 392
gacacggccg tgtattactg tgc 23
<210> 393
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 393
gcacagtaat acacggccgt gtc 23
<210> 394
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 支架序列
<400> 394
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 395
<211> 294
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 支架序列
<400> 395
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggata caccttcacc ggctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaacccta acagtggtgg cacaaactat 180
gcacagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccatcag cacagcctac 240
atggagctga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gaga 294
<210> 396
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C端延伸
<400> 396
Leu Glu Gly Gly Gly Ser His His His His His His
1 5 10
<210> 397
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 397
gccgctggat tgttattact cgcggcccag ccggccatgg ccsaggtgca gctggtggag 60
tctgggggag g 71
<210> 398
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 398
tggcggaccc agtacatnyb ataactacta aaggtg 36
<210> 399
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 399
cacatagtat tbctcacttc catcttgnty tatsyyggcc acccactcca g 51
<210> 400
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 400
caagatggaa gtgagvaata ctatgtggac tctgtga 37
<210> 401
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 401
aggctattca tttgcagawa cagtgasttc ttggcgttgt ctctg 45
<210> 402
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 402
cagagacaac gccaagaast cactgtwtct gcaaatgaat agcct 45
<210> 403
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 403
agtatttccc ctttcgcaca gtaatacaca gccgtg 36
<210> 404
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 404
cacggctgtg tattactgtg cgaaagggga aatactaccc ctcyastttg acyactgggg 60
ccaggga 67
<210> 405
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 405
ccgtggtgat ggtggtgatg gctaccgcca ccctcgagtg argagacrgt gacc 54
<210> 406
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 406
gcactctccc ctgttgaagc tctttgtgac gggcgagctc aggccctgat gggtgacttc 60
gcaggcgtag ac 72
<210> 407
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 407
gcagctaata cgactcacta tagggagaca gaccaccatg g 41
<210> 408
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 408
gcactctccc ctgttgaagc t 21
<210> 409
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 409
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Arg Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Glu Gln Asp Gly Ser Glu Glu Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Glu Ile Leu Pro Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala His His His His His His
115 120 125
<210> 410
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 410
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Lys Gln Asp Gly Ser Val Gln Tyr Tyr Val Ser Asp Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Glu Ile Leu Pro Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala His His His His His His
115 120 125
<210> 411
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 411
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Lys Gln Asp Gly Ser Val Gln Tyr Tyr Val Ser Asp Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Glu Ile Leu Pro Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120
<210> 412
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 412
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Lys Gln Asp Gly Ser Val Gln Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Glu Ile Leu Pro Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala His His His His His His
115 120 125
<210> 413
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 413
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Lys Gln Asp Gly Ser Val Gln Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Glu Ile Leu Pro Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120
<210> 414
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 414
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Gln Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Glu Ile Leu Pro Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Leu Glu Gly Gly Gly Ser His His His
115 120 125
His His His
130
<210> 415
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 415
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Lys Ile Glu Gln Asp Gly Ser Glu Glu Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Glu Ile Leu Pro Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Leu Glu Gly Gly Gly Ser His His His
115 120 125
His His His
130
<210> 416
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 416
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Arg Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Glu Gln Asp Gly Ser Glu Glu Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Glu Ile Leu Pro Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Leu Glu Gly Gly Gly Ser His His His
115 120 125
His His His
130
<210> 417
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 417
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Lys Gln Asp Gly Ser Val Gln Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Glu Ile Leu Pro Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Leu Glu Gly Gly Gly Ser His His His
115 120 125
His His His
130
<210> 418
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 418
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Ala Asp Ala Tyr
20 25 30
Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ser Ile Lys Pro Asn Thr Gly Ala Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Leu Asp Arg Asp Thr Trp Tyr Pro His Ser Tyr Ala Gly Trp
100 105 110
Phe Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Leu Glu
115 120 125
Gly Gly Gly Ser His His His His His His
130 135
<210> 419
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 419
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Glu Ile Leu Pro Leu His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Leu Glu Gly Gly Gly Ser His His His
115 120 125
His His His
130
<210> 420
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 420
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Gln Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Glu Ile Leu Pro Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Leu Glu Gly Gly Gly Ser His His His
115 120 125
His His His
130
<210> 421
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 421
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Lys Ile Glu Gln Asp Gly Ser Glu Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Glu Ile Leu Pro Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Leu Glu Gly Gly Gly Ser His His His
115 120 125
His His His
130
<210> 422
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 422
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Glu Ile Leu Pro Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Leu Glu Gly Gly Gly Ser His His His
115 120 125
His His His
130
<210> 423
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 423
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Lys Pro Thr Gly Ser Val Gln Tyr Tyr Val Ser Asp Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Glu Ile Leu Pro Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Leu Glu Gly Gly Gly Ser His His His
115 120 125
His His His
130
<210> 424
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 424
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Lys Gln Asp Gly Ser Val Gln Tyr Tyr Val Gly Gly Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Glu Ile Leu Pro Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Leu Glu Gly Gly Gly Ser His His His
115 120 125
His His His
130
<210> 425
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 425
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Leu Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Gln Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Glu Ile Leu Pro Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Leu Glu Gly Gly Gly Ser His His His
115 120 125
His His His
130
<210> 426
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 426
ggggsggggs ggggs 15
<210> 427
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 427
aaggggsggg gs 12
<210> 428
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 428
aaggggsggg gsggggsggg gs 22
<210> 429
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 429
aaggggsggg gsggggsggg ggsggggsgg ggs 33
<210> 430
<211> 253
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1.10-3(G4S)-1.1(E1/6Q)
<400> 430
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Arg Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Glu Gln Asp Gly Ser Glu Glu Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Glu Ile Leu Pro Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
145 150 155 160
Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
165 170 175
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys
180 185 190
Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
195 200 205
Ala Lys Asn Ser Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
210 215 220
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Glu Ile Leu Pro Leu His Phe
225 230 235 240
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 431
<211> 759
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 431
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agttatcgca tgtactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccagc atagaacaag atggaagtga ggaatactat 180
gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa gtcactgttt 240
ctgcaaatga atagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gaaaggggaa 300
atactacccc tctactttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcaggt 360
ggaggaggta gtggtggagg aggtagtggt ggaggaggta gtcaggtgca gctggtgcag 420
tctgggggag gcttggtcca gcctgggggg tccctgagac tctcctgtgc agcctctgga 480
ttcaccttta gtagttattc gatgtactgg gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag 540
tgggtggcca acataaagca agatggaagt gagaaatact atgtggactc tgtgaagggc 600
cgattcacca tctccagaga caacgccaag aactcactgt ttctgcaaat gaatagcctg 660
agagccgagg acacggctgt gtattactgt gcgaaagggg aaatactacc cctccacttt 720
gactactggg gccagggaac cctggtcacc gtctcttca 759
<210> 432
<211> 267
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3.2-4(G4S)-1.2
<400> 432
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Ala Asp Ala Tyr
20 25 30
Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ser Ile Lys Pro Asn Thr Gly Ala Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Leu Asp Arg Asp Thr Trp Tyr Pro His Ser Tyr Ala Gly Trp
100 105 110
Phe Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
145 150 155 160
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
165 170 175
Phe Ser Ser Tyr Ser Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
180 185 190
Leu Glu Trp Val Ala Glu Ile Lys Gln Asp Gly Ser Val Gln Tyr Tyr
195 200 205
Val Ser Asp Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
210 215 220
Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
225 230 235 240
Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Glu Ile Leu Pro Leu Tyr Phe Asp Tyr
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
260 265
<210> 433
<211> 771
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 433
caggttcagc tggtgcagtc tggagctgag gtaaagaagc ctggggcctc ggtgaaggtc 60
tcctgtaagg cttccggata taacgcggac gcctattata taaattgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag gtcttgagtg gatgggaagt atcaagccta ataccggtgc cacaaaatat 180
gcacagaagt ttcagggcag agtcaccata accagggaca cgtccatcag cacagcctac 240
atggagctga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagtctggat 300
cgggatacgt ggtacccgca ctcctacgcg gggtggttcg acgcgtgggg ccagggaacc 360
ctggtcaccg tctcttcagc ggccggtggt ggcggttcag gtggaggtgg tagtgaggtt 420
cagttggtgg aaagcggcgg tggcctggtc cagccgggtg gtagcctgcg cctgtcctgc 480
gcggctagcg gtttcacgtt tagcagctac agcatgtact gggtgcgtca agcgccaggc 540
aaaggtctgg aatgggttgc cgagattaag caagacggtt ctgttcagta ttatgtcagc 600
gacgtgaagg gtcgttttac catcagccgt gacaacgcga aaaacagcct gtatttgcag 660
atgaattccc tgcgcgctga agataccgcg gtgtattact gtgcgaaagg tgagattctg 720
ccgctgtact tcgattactg gggccaaggc accctggtta ctgtctcgag c 771
<210> 434
<211> 267
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 434
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Ala Asp Ala Tyr
20 25 30
Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ser Ile Lys Pro Asn Thr Gly Ala Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Leu Asp Arg Asp Thr Trp Tyr Pro His Ser Tyr Ala Gly Trp
100 105 110
Phe Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
145 150 155 160
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
165 170 175
Phe Ser Ser Tyr Ser Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
180 185 190
Leu Glu Trp Val Ala Glu Ile Lys Gln Asp Gly Ser Val Gln Tyr Tyr
195 200 205
Val Ser Asp Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
210 215 220
Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
225 230 235 240
Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Glu Ile Leu Pro Leu Tyr Phe Asp Tyr
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
260 265
<210> 435
<211> 801
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 435
caggttcagc tggtgcagtc tggagctgag gtaaagaagc ctggggcctc ggtgaaggtc 60
tcctgtaagg cttccggata taacgcggac gcctattata taaattgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag gtcttgagtg gatgggaagt atcaagccta ataccggtgc cacaaaatat 180
gcacagaagt ttcagggcag agtcaccata accagggaca cgtccatcag cacagcctac 240
atggagctga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagtctggat 300
cgggatacgt ggtacccgca ctcctacgcg gggtggttcg acgcgtgggg ccagggaacc 360
ctggtcaccg tctcttcagc ggccggtggt ggcggttcag gaggtggagg ttcaggaggt 420
ggtggttctg gtggaggtgg tagtgaggtt cagttggtgg aaagcggcgg tggcctggtc 480
cagccgggtg gtagcctgcg cctgtcctgc gcggctagcg gtttcacgtt tagcagctac 540
agcatgtact gggtgcgtca agcgccaggc aaaggtctgg aatgggttgc cgagattaag 600
caagacggtt ctgttcagta ttatgtcagc gacgtgaagg gtcgttttac catcagccgt 660
gacaacgcga aaaacagcct gtatttgcag atgaattccc tgcgcgctga agataccgcg 720
gtgtattact gtgcgaaagg tgagattctg ccgctgtact tcgattactg gggccaaggc 780
accctggtta ctgtctcgag c 801
<210> 436
<211> 277
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 436
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Ala Asp Ala Tyr
20 25 30
Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ser Ile Lys Pro Asn Thr Gly Ala Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Leu Asp Arg Asp Thr Trp Tyr Pro His Ser Tyr Ala Gly Trp
100 105 110
Phe Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
145 150 155 160
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
165 170 175
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met
180 185 190
Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Glu
195 200 205
Ile Lys Gln Asp Gly Ser Val Gln Tyr Tyr Val Ser Asp Val Lys Gly
210 215 220
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln
225 230 235 240
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys
245 250 255
Gly Glu Ile Leu Pro Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
260 265 270
Val Thr Val Ser Ser
275
<210> 437
<211> 831
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 437
caggttcagc tggtgcagtc tggagctgag gtaaagaagc ctggggcctc ggtgaaggtc 60
tcctgtaagg cttccggata taacgcggac gcctattata taaattgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag gtcttgagtg gatgggaagt atcaagccta ataccggtgc cacaaaatat 180
gcacagaagt ttcagggcag agtcaccata accagggaca cgtccatcag cacagcctac 240
atggagctga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagtctggat 300
cgggatacgt ggtacccgca ctcctacgcg gggtggttcg acgcgtgggg ccagggaacc 360
ctggtcaccg tctcttcagc ggccggtggt ggcggttcag gcggaggtgg ctctggaggt 420
ggaggttcag gaggtggtgg ttctggcggc ggtggatcgg gtggaggtgg tagtgaggtt 480
cagttggtgg aaagcggcgg tggcctggtc cagccgggtg gtagcctgcg cctgtcctgc 540
gcggctagcg gtttcacgtt tagcagctac agcatgtact gggtgcgtca agcgccaggc 600
aaaggtctgg aatgggttgc cgagattaag caagacggtt ctgttcagta ttatgtcagc 660
gacgtgaagg gtcgttttac catcagccgt gacaacgcga aaaacagcct gtatttgcag 720
atgaattccc tgcgcgctga agataccgcg gtgtattact gtgcgaaagg tgagattctg 780
ccgctgtact tcgattactg gggccaaggc accctggtta ctgtctcgag c 831
<210> 438
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 438
Ser Tyr Gly Met Tyr
1 5
<210> 439
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 439
Lys Ile Glu Gln Asp Gly Ser Glu Glu Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 440
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 440
Gly Glu Ile Leu Pro Leu Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 441
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 441
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Lys Ile Glu Gln Asp Gly Ser Glu Glu Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Glu Ile Leu Pro Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 442
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 442
Ser Tyr Gly Met Tyr
1 5
<210> 443
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 443
Lys Ile Glu Gln Asp Gly Ser Val Glu Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 444
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 444
Gly Glu Ile Leu Pro Leu Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 445
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 445
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Lys Ile Glu Gln Asp Gly Ser Val Glu Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Glu Ile Leu Pro Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 446
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 446
Ser Tyr Gln Met Tyr
1 5
<210> 447
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 447
Gly Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Gln Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 448
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 448
Gly Glu Ile Leu Pro Leu Tyr Phe Asp His
1 5 10
<210> 449
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 449
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gln Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gly Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Gln Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Glu Ile Leu Pro Leu Tyr Phe Asp His Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 450
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 450
Ser Tyr Gly Met Tyr
1 5
<210> 451
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 451
Glu Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Glu Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 452
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 452
Gly Glu Ile Leu Pro Leu Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 453
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 453
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Glu Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Glu Ile Leu Pro Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 454
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 454
Ser Tyr Ser Met Tyr
1 5
<210> 455
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 455
Gly Ile Glu Gln Asp Gly Ser Glu Glu Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 456
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 456
Gly Glu Ile Leu Pro Leu Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 457
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 457
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gly Ile Glu Gln Asp Gly Ser Glu Glu Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Glu Ile Leu Pro Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 458
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 458
Ser Tyr Arg Met Tyr
1 5
<210> 459
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 459
Glu Ile Glu Gln Asp Gly Ser Glu Gln Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 460
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 460
Gly Glu Ile Leu Pro Leu Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 461
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 461
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Met Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Arg Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Glu Gln Asp Gly Ser Glu Gln Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Glu Ile Leu Pro Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 462
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 462
Ser Tyr Gly Met Tyr
1 5
<210> 463
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 463
Glu Ile Asn Gln Asp Gly Ser Glu Gln Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 464
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 464
Gly Glu Ile Leu Pro Leu Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 465
<211> 155
<212> PRT
<213> 智人
<400> 465
Met Thr Pro Gly Lys Thr Ser Leu Val Ser Leu Leu Leu Leu Leu Ser
1 5 10 15
Leu Glu Ala Ile Val Lys Ala Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn Pro Gly
20 25 30
Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn
35 40 45
Leu Asn Ile His Asn Arg Asn Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser
50 55 60
Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser Thr Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu
65 70 75 80
Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His
85 90 95
Leu Gly Cys Ile Asn Ala Asp Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser
100 105 110
Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His
115 120 125
Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys
130 135 140
Thr Cys Val Thr Pro Ile Val His His Val Ala
145 150 155
<210> 466
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆
<400> 466
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Asn Gln Asp Gly Ser Glu Gln Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Glu Ile Leu Pro Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115

Claims (61)

1.一种能够结合人IL-17A的结合分子，所述结合分子包含含有CDR3序列的人重链可变免疫球蛋白结构域(VH)，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.3或与SEQ ID NO.3具有至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同源性的序列。
2.根据权利要求1所述的结合分子，所述结合分子包含至少一种免疫球蛋白单结构域抗体。
3.根据权利要求1或2所述的结合分子，其中所述CDR1序列包含SEQ ID NO.1或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％同源性的序列并且所述CDR2序列包含SEQ IDNO.2或与SEQ ID NO.1具有至少70％、80％、至少90％、或至少95％同源性的序列。
4.根据一个前述权利要求所述的结合分子，其中所述CDR1包含氨基酸序列SEQ IDNO.1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、53、57、61、65、69、73、77、81、85、89、93、97、101、105、109、113、117、121、125、129、133、137、141、145、149、153、157、161、165 169、173、177、181、185、189、193、197、201、205、209、213、217、221、225、229、233、237、241、245、438、442、446、450、454、458或462或者由其组成，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86、90、94、98、102、106、110、114、118、122、126、130、134、138、142、146、150、154、158、162、166、170、174、178、182、186、190、194、198、202、206、210、214、218、222、226、230、234、238、242、246、439、443、447、451、455、459或463或者由其组成，并且所述CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.3、7、11、15、19、23、27、31、35、39、43、47、51、55、59、63、67、71、75、79、83、87、91、95、99、103、107、111、115、119、123、127、131、135、139、143、147、151、155、159、163、167、171、175、179、183、187、191、195、199、203、207、211、215、219、223、227、231、235、239、243247、440、444、448、452、456、460或464或者由其组成。
5.根据一个前述权利要求所述的结合分子，其中所述结合分子具有如图1中对于克隆1.1至1.69中的任一个所示出的CDR1、CDR2和CDR3序列的组合。
6.根据权利要求5所述的结合分子，其中在所述结合分子中，所述CDR1是SEQ ID NO.1，所述CDR2是SEQ ID NO.2并且所述CDR3是SEQ ID NO.3，或者其中所述CDR1是SEQ ID NO.5，所述CDR2是SEQ ID NO.6并且所述CDR3是SEQ ID NO.7，或者其中所述CDR1是SEQ ID NO.9，所述CDR2是SEQ ID NO.10并且所述CDR3是SEQ ID NO.11，或者其中所述CDR1是SEQ IDNO.13，所述CDR2是SEQ ID NO.14并且所述CDR3是SEQ ID NO.15，或者其中所述CDR1是SEQID NO.17，所述CDR2是SEQ ID NO.18并且所述CDR3是SEQ ID NO.19，或者其中所述CDR1是SEQ ID NO.21，所述CDR2是SEQ ID NO.22并且所述CDR3是SEQ ID NO.23，或者其中所述CDR1是SEQ ID NO.25，所述CDR2是SEQ ID NO.26并且所述CDR3是SEQ ID NO.27，或者其中所述CDR1是SEQ ID NO.29，所述CDR2是SEQ ID NO.30并且所述CDR3是SEQ ID NO.31，或者其中所述CDR1是SEQ ID NO.33，所述CDR2是SEQ ID NO.34并且所述CDR3是SEQ ID NO.35，或者其中所述CDR1是SEQ ID NO.37，所述CDR2是SEQ ID NO.38并且所述CDR3是SEQ IDNO.39，或者其中所述CDR1是SEQ ID NO.41，所述CDR2是SEQ ID NO.42并且所述CDR3是SEQID NO.43，或者其中所述CDR1是SEQ ID NO.45，所述CDR2是SEQ ID NO.46并且所述CDR3是SEQ ID NO.47，或者其中所述CDR1是SEQ ID NO.49，所述CDR2是SEQ ID NO.50并且所述CDR3是SEQ ID NO.51，或者其中所述CDR1是SEQ ID NO.53，所述CDR2是SEQ ID NO.54并且所述CDR3是SEQ ID NO.55，或者其中所述CDR1是SEQ ID NO.57，所述CDR2是SEQ ID NO.58并且所述CDR3是SEQ ID NO.59，或者其中所述CDR1是SEQ ID NO.61，所述CDR2是SEQ IDNO.62并且所述CDR3是SEQ ID NO.63，或者其中所述CDR1是SEQ ID NO.65，所述CDR2是SEQID NO.66并且所述CDR3是SEQ ID NO.67，或者其中所述CDR1是SEQ ID NO.69，所述CDR2是SEQ ID NO.70并且所述CDR3是SEQ ID NO.71，或者其中所述CDR1是SEQ ID NO.73，所述CDR2是SEQ ID NO.74并且所述CDR3是SEQ ID NO.75，或者其中所述CDR1是SEQ ID NO.77，所述CDR2是SEQ ID NO.78并且所述CDR3是SEQ ID NO.79，或者其中所述CDR1是SEQ IDNO.81，所述CDR2是SEQ ID NO.82并且所述CDR3是SEQ ID NO.83，或者其中所述CDR1是SEQID NO.85，所述CDR2是SEQ ID NO.86并且所述CDR3是SEQ ID NO.87。
7.根据一个前述权利要求所述的结合分子，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO.4或与SEQ ID NO.4具有至少70％、至少75％、至少80％、至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成。
8.根据权利要求7所述的结合分子，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO.4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、220、224、228、232、236、240、244或248、441、445、449、453、457、461或466或者由其组成。
9.一种能够结合人IL-17A的结合分子，所述结合分子包含含有CDR3序列的人VH结构域，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.251或与SEQ ID NO.251具有至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同源性的序列。
10.根据权利要求9所述的结合分子，所述结合分子包含至少一种免疫球蛋白单结构域抗体。
11.根据权利要求9或10所述的结合分子，其中所述CDR1序列包含SEQ ID NO.249或与其具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同源性的序列并且CDR2序列具有SEQ ID NO.250或与其具有至少70％、80％、至少90％、或至少95％同源性的序列。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的结合分子，其中所述CDR1包含氨基酸序列SEQID NO.249、253、257、261、265、269、273、277或281，所述CDR2包含氨基酸序列SEQ IDNO.250、254、258、262、266、270、274、278或282，并且所述CDR3包含氨基酸序列SEQ IDNO.251、255、259、263、267、271、275、279或283。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的结合分子，其中在所述结合分子中，所述CDR1是SEQ ID NO.249，CDR2是SEQ ID NO.250并且CDR3是SEQ ID NO.251，或者CDR1是SEQ IDNO.253，CDR2是SEQ ID NO.254并且CDR3是SEQ ID NO.255，或者CDR1是SEQ ID NO.257，CDR2是SEQ ID NO.258并且CDR3是SEQ ID NO.259，或者CDR1是SEQ ID NO.261，CDR2是SEQID NO.262并且CDR3是SEQ ID NO.263，或者CDR1是SEQ ID NO.265，CDR2是SEQ ID NO.266并且CDR3是SEQ ID NO.267，或者CDR1是SEQ ID NO.269，CDR2是SEQ ID NO.270并且CDR3是SEQ ID NO.271，或者CDR1是SEQ ID NO.273，CDR2是SEQ ID NO.274并且CDR3是SEQ IDNO.275，或者CDR1是SEQ ID NO.277，CDR2是SEQ ID NO.278并且CDR3是SEQ ID NO.279，或者CDR1是SEQ ID NO.281，CDR2是SEQ ID NO.282并且CDR3是SEQ ID NO.283。
14.根据权利要求9至13中任一项所述的结合分子，其中所述VH结构域包含SEQ IDNO.252或与SEQ ID NO.252具有至少70％、至少75％、至少80％、至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成。
15.根据权利要求14所述的结合分子，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO.252、256、260、264、268、272、276、280或284或者由其组成。
16.一种能够结合人IL-17A的结合分子，所述结合分子包含含有CDR3序列的人VH结构域，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.287或与SEQ ID NO.287具有至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同源性的序列。
17.根据权利要求16所述的结合分子，所述结合分子包含至少一种免疫球蛋白单结构域抗体。
18.根据权利要求16或17所述的结合分子，其中所述CDR1序列包含SEQ ID NO.285或与其具有至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％同源性的序列并且所述CDR2序列包含SEQ ID NO.286或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％同源性的序列。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的结合分子，其中在所述结合分子中，所述CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO.289、293、297、301、305、309、313、317、321、325、329、333或337或者由其组成，CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO.290、294、298、302、306、310、314、318、322、326、330、334或338或者由其组成，并且CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO.291、295、299、303、307、311、315、319、323、327、335或339或者由其组成。
20.根据权利要求16至19中任一项所述的结合分子，其中所述结合分子具有如图3中对于克隆3.1至3.14所示出的CDR1、CDR2和CDR3序列的组合。
21.根据权利要求16至20中任一项所述的结合分子，其中所述VH结构域包含SEQ IDNO.288或与SEQ ID NO.288具有至少70％、至少75％、至少80％、至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成。
22.根据权利要求21所述的结合分子，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO.292、296、300、304、308、312、316、320、324、328、332、336或340或者由其组成。
23.一种能够结合人IL-17A的结合分子，所述结合分子包含含有CDR3序列的人VH结构域，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.343或与SEQ ID NO.343具有至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同源性的序列。
24.根据权利要求23所述的结合分子，所述结合分子包含针对IL-17A的免疫球蛋白单结构域抗体，其中所述结构域是人VH结构域，并且其中所述VH包含含有CDR3序列的至少一个抗原结合位点，所述CDR3序列具有SEQ ID NO.343或与SEQ ID NO.343具有至少70％、80％、至少90％、至少95％同源性的序列。
25.根据权利要求23至25中任一项所述的结合分子，所述结合分子包含具有SEQ IDNO.341或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％同源性的序列的CDR1序列以及具有SEQ ID NO.342或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％同源性的序列的CDR2序列。
26.根据权利要求23至25中任一项所述的结合分子，其中所述VH结构域包含SEQ IDNO.344或与SEQ ID NO.344具有至少70％、至少75％、至少80％、至少90％或至少95％同源性的序列或者由其组成。
27.一种能够结合人IL-17A的结合分子，所述结合分子包含含有CDR3序列的人VH结构域，所述CDR3序列包含SEQ ID NO.347或与SEQ ID NO.347具有至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同源性的序列。
28.根据权利要求27所述的结合分子，所述结合分子包含至少一种免疫球蛋白单结构域抗体。
29.根据权利要求27或28所述的结合分子，所述结合分子包含具有SEQ ID NO.345或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％同源性的序列的CDR1序列以及具有SEQID NO.346或与其具有至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％同源性的序列的CDR2序列。
30.根据权利要求27至29中任一项所述的结合分子，其中所述VH结构域包含SEQ IDNO.348或与SEQ ID NO.348具有至少70％、75％、80％、90％或95％同源性的序列或者由其组成。
31.根据一个前述权利要求所述的结合分子，其中当如实施例中所述，即通过测量包含VH的IL-17结合分子抑制IL-17诱导的从细胞系HT1080中的IL-6释放的能力，进行测试时，具有约0.2至约1000nM的针对IL-6产生抑制的IC50。
32.根据一个前述权利要求所述的结合分子，其中，优选地当通过评估时，所述结合分子具有5x10-9至1x10-11，例如5x10-9至2x10-10的KD(M)值。
33.根据前述权利要求中任一项所述的结合分子，其中所述结合分子包含两个以上VH结构域，其中所述VH结构域中的至少一个与IL-17A特异性结合。
34.根据一个前述权利要求所述的结合分子，其中所述结合分子与人IL-17A特异性结合。
35.根据一个前述权利要求所述的结合分子，其中所述结合分子与毒素、酶、放射性同位素或其他化学部分缀合。
36.根据一个前述权利要求所述的结合分子，所述结合分子获得自或者能够获得自不产生任何功能性内源性轻链或重链的小鼠。
37.一种与根据权利要求1至36中任一项所述的结合分子竞争结合人IL-17A的结合分子。
38.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据任一项前述权利要求所述的结合分子和药物载体。
39.根据权利要求38所述的药物组合物，所述药物组合物包含化学皮肤穿透增强剂。
40.一种用于治疗自身免疫疾病、炎性病况、过敏和过敏病况、超敏反应、严重感染、和器官或组织移植排斥的方法，所述方法包括施用有效量的根据权利要求1至37中任一项所述的结合分子或根据权利要求38或39所述的药物组合物。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述疾病选自银屑病、脊椎关节病、葡萄膜炎和特应性皮炎。
42.根据权利要求40或41所述的方法，其中所述结合分子被配制成用于局部施用至皮肤。
43.根据权利要求1至37中任一项所述的结合分子或根据权利要求38或39所述的药物组合物，所述结合分子或药物组合物用作药物。
44.根据权利要求1至37中任一项所述的结合分子或根据权利要求38或39所述的药物组合物，所述结合分子或药物组合物用于治疗自身免疫疾病、炎性病况、过敏和过敏病况、超敏反应、严重感染、和器官或组织移植排斥。
45.根据权利要求44所述的结合分子或药物组合物，其中所述疾病选自银屑病、脊椎关节病、葡萄膜炎和特应性皮炎。
46.根据权利要求44或45所述的结合分子或药物组合物，其中所述结合分子被配制成用于局部施用至皮肤。
47.根据权利要求1至37中任一项所述的结合分子或根据权利要求38或39所述的药物组合物在制造药物中的用途，所述药物用于治疗自身免疫疾病、炎性病况、过敏和过敏病况、超敏反应、严重感染、和器官或组织移植排斥。
48.根据权利要求47所述的用途，其中所述疾病选自银屑病、脊椎关节病、葡萄膜炎和特应性皮炎。
49.根据权利要求47或48所述的用途，其中所述结合分子或药物组合物被配制成用于局部施用至皮肤。
50.根据权利要求40至42所述的方法，根据权利要求44至46所述的结合分子或根据权利要求47至49所述的用途，其中所述疾病选自银屑病，系统性红斑狼疮，类风湿性关节炎，骨关节炎，青少年慢性关节炎，脊椎关节病，系统性硬化症，特发性炎性肌病，干燥综合征，系统性血管炎，结节病，自身免疫性溶血性贫血，自身免疫性血小板减少症，甲状腺炎，糖尿病，免疫介导的肾病，中枢和周围神经系统的脱髓鞘病如多发性硬化症、特发性脱髓鞘多神经病或古兰-巴雷综合征、和慢性炎性脱髓鞘多神经病，肝胆病如传染性、自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎、和硬化性胆管炎，炎性肠病、麸质敏感性肠病、和惠普尔病，包括大疱性皮肤病、多形红斑和接触性皮炎的自身免疫性或免疫介导的皮肤病，过敏性疾病如哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、食物超敏反应和荨麻疹，肺的免疫性疾病如嗜酸细胞性肺炎、特发性肺纤维化和超敏性肺炎，自身免疫性血液病(包括例如，溶血性贫血、再生障碍性贫血、纯红细胞贫血和特发性血小板减少症)，自身免疫性炎性肠病(包括例如，溃疡性结肠炎、克罗恩病和肠易激综合征)，包括移植排斥和移植物抗宿主病的移植相关疾病。
51.一种用于降低人IL-17A活性的体内或体外方法，所述方法包括使人IL-17A与根据权利要求1至37中任一项所述的结合分子接触。
52.一种用于通过免疫测定来确定试验样品中IL-17A的存在的方法，所述方法包括使所述样品与根据权利要求1至37中任一项所述的结合分子和至少一种可检测标记物接触。
53.权利要求52所述的方法，其中所述方法包括诊断或评估患者的预防性或治疗性治疗的功效。
54.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含编码根据权利要求1至37中任一项所述的结合分子的核苷酸序列。
55.一种核酸构建体，所述核酸构建体包含根据权利要求54所述的核酸。
56.一种分离的宿主细胞，所述分离的宿主细胞包含根据权利要求54所述的核酸或根据权利要求55所述的构建体。
57.一种用于制备根据权利要求1至36中任一项所述的结合分子的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达编码所述结合分子的核酸并且从宿主细胞培养物分离所述结合分子。
58.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1至37中任一项所述的结合分子根据权利要求38或39所述的药物组合物。
59.一种用于制备能够结合人IL-17A的包含至少一种人免疫球蛋白单结构域抗体的结合分子的方法，其中所述结构域是人VH结构域，所述方法包括
a)用IL-17A抗原使转基因小鼠免疫，其中所述小鼠表达包含人重链V基因的核酸构建体并且不能制造功能性内源性轻链或重链，
b)生成包含来自所述小鼠的VH结构域序列的序列的文库，和
c)从所述文库分离包含VH结构域序列的序列。
60.一种双互补位、二价或多特异性结合分子，所述结合分子包含如权利要求1至36中任一项中定义的结合分子。
61.根据权利要求60所述的结合分子，所述结合分子包含SEQ ID No.430、432、434或436。
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