CN111448215A - 抗-hla-a2抗体及其使用方法 - Google Patents

抗-hla-a2抗体及其使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111448215A
CN111448215A CN201880074705.4A CN201880074705A CN111448215A CN 111448215 A CN111448215 A CN 111448215A CN 201880074705 A CN201880074705 A CN 201880074705A CN 111448215 A CN111448215 A CN 111448215A
Authority
CN
China
Prior art keywords
amino acid
seq
antibody
chain variable
car
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201880074705.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111448215B (zh
Inventor
M·利文斯
P·奥尔班
N·道森
C·拉马切
J·P·贝里奎斯特
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of British Columbia
CDRD Ventures Inc
Original Assignee
University of British Columbia
CDRD Ventures Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of British Columbia, CDRD Ventures Inc filed Critical University of British Columbia
Publication of CN111448215A publication Critical patent/CN111448215A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111448215B publication Critical patent/CN111448215B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2833—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/001—Preparations to induce tolerance to non-self, e.g. prior to transplantation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4621—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells immunosuppressive or immunotolerising
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/46434—Antigens related to induction of tolerance to non-self
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464403—Receptors for growth factors
    • A61K39/464406—Her-2/neu/ErbB2, Her-3/ErbB3 or Her 4/ ErbB4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/464838—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

提供了人源化的抗HLA‑A2抗体。在某些方面，人源化的抗HLA‑A2抗体能够构成嵌合抗原受体(CAR)的抗原结合结构域，其中CAR能够在人细胞中表达，使得CAR特异性结合HLA‑A2。还提供了包含人源化抗HLA‑A2抗体的CAR。还提供了包含所述抗体和CAR的修饰细胞，以及使用此类修饰细胞的方法。

Description

抗-HLA-A2抗体及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求保护2017年9月19日提交的美国临时专利申请序列号62/560,574以及2018年6月29日提交的美国临时专利申请序列号62/692,386的权益，这些申请通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明在一些方面涉及HLA-A2结合分子，特别是人源化的抗HLA-A2抗体。本发明还涉及含有这类抗体的重组受体，包括含有这类抗体的嵌合抗原受体(CAR)。本公开还涉及表达此类受体和抗体的基因工程化的细胞，及其在细胞疗法中的用途。
背景技术
I类HLA抗原是在所有有核细胞上表达的多态性蛋白，并且是移植环境下免疫识别的关键靶标。事实上，I类HLA特异性T细胞和/或抗体的形成是急性和慢性排斥以及同种异体移植物的主要风险因素，并且预形成的抗供体I类HLA抗体的存在可导致超急性排斥(Konvalinka等人,2015)。因此，寻找对HLA I类蛋白的免疫应答的控制方法将是移植中的重大突破。
典型的HLA I类分子是多态性的，并由许多不同的等位基因编码，这些等位基因响应于感染的进化压力而进化。有三个基因座编码经典的I类HLA蛋白，命名为A、B和C基因座。在HLA-A基因座内，等位基因的HLA-A2家族是最大且最多变化的家族，已知人类中存在至少有31种不同的HLA-A2等位基因。有趣的是，与许多其它HLA等位基因家族相反，HLA-A2在所有人种群中都是常见的，并且发现于50％的高加索人和35％的非裔美国人中(Ellis等人,2000)。许多HLA-A2等位基因仅有1-9个氨基酸不同，大多数多态性集中在肽结合槽周围(Hilton等人,2013)。HLA-A2等位基因被进一步分组为两个主要分支：通过等位基因间转换事件衍生自A*0201或A*0205的那些(Ellis等人,2000)。
利用调节性T(Treg)细胞的过继性(adoptive)免疫疗法是作为控制对HLA蛋白和驱动移植排斥的其它抗原的不利免疫的方式是用于同种异体移植排斥和移植物抗宿主病(GVHD)的有希望的疗法。已有报道在同种异体造血干细胞移植(HSCT)后使用多克隆Treg细胞转移预防了移植物抗宿主病(GVHD)(Brunstein等人,2011；Di Ianni等人,2011；Trzonkowski等人,2009)。还有报道使用Treg细胞转移维持了1型糖尿病中的c-肽水平(Bluestone等人,2015；Marek-Trzonkowska等人,2012)。值得注意的是，已经报道了可能存在与使用多克隆Treg细胞用于这种细胞疗法相关的全身免疫抑制的短暂风险(Brunstein等人,2013)。
来自动物研究的数据表明，使用Treg细胞的细胞疗法的效力和特异性可以通过使用抗原特异性细胞而显著增强。例如，在自身免疫模型中，抗原特异性Treg细胞在减少疾病方面优于多克隆Treg细胞：从胰腺淋巴结分离的或用胰岛抗原脉冲的Treg细胞在预防或治疗1型糖尿病方面明显优于多克隆Treg细胞，并且在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型中(Green等人,2002；Masteller等人,2005；Tang等人,2004；Tarbell等人,2007；Tarbell等人,2004)，表达自身抗原特异性转基因T细胞受体(TCR)的Treg细胞在抑制中枢神经系统炎症方面优于多克隆Treg细胞(Stephens等人,2009)。类似地，通过同种异体抗原刺激的体外扩增富集的或工程化以表达TCR转基因的同种异体抗原特异性Treg细胞在预防器官和组织移植物排斥方面比多克隆Treg细胞更有效(Golshayan等人,2007；Joffre等人,2008；Nishimura等人,2004；Sanchez-Fueyo等人,2006；Tsang等人,2008)。有一些证据表明，用同种异体抗原扩增的Treg细胞有效地预防GVHD(Trenado等人,2006)，并且抗原特异性Treg细胞的体内诱导促进了对造血同种异体移植物的接受而没有GVHD(Verginis等人,2008)。人源化小鼠模型显示了相似的结果：同种异体抗原扩增的人Treg细胞是比多克隆Treg细胞更有效的皮肤移植排斥的抑制剂(Putnam等人,2013；Sagoo等人,2011)。
过表达转基因TCR或抗原刺激的扩增以富集抗原特异性T细胞的替代方法是使用嵌合抗原受体(CAR)。在基于细胞的过继免疫疗法中，可以修饰从患者分离的免疫细胞以表达合成蛋白，所述合成蛋白使得细胞能够在随后转移回患者体内之后执行新的治疗功能。这种合成蛋白的一个实例是CAR。目前使用的CAR的实例是胞外识别结构域(例如，抗原结合结构域)、跨膜结构域和一个或多个胞内信号传导结构域的融合。在抗原接合时，CAR的胞内信号传导部分可以在免疫细胞中启动活化相关的应答。例如，T细胞可以被遗传工程化以表达与胞内信号传导结构域融合的胞外单链抗体(scFv)抗原结合结构域(Gill和June,2015；June等人,2015)。特别地，表达对模型抗原特异性的CAR的Treg细胞已经被报道(Blat等人,2014；Elinav等人,2009；Elinav等人,2008；Fransson等人,2012；Hombach等人,2009,Boardman等人,2016；MacDonald等人,2016；Noyan等人,2016)。
发明概述
本公开的方面包括抗HLA-A2抗体。还提供了包含胞外结构域的嵌合抗原受体(CAR)，该胞外结构域包含本公开的任何抗HLA-A2抗体。还提供了编码本公开的抗HLA-A2抗体和CAR的核酸、包含其的表达载体以及包含此类表达载体的宿主细胞。本公开的方面还包括人源化的抗HLA-A2抗体。还提供了包含一个胞外结构域的嵌合抗原受体(CAR)，该胞外结构域包含本公开的任何人源化的抗HLA-A2抗体。还提供了编码本公开的人源化的抗HLA-A2抗体和CAR的核酸、包含其的表达载体、以及包含此类表达载体的宿主细胞。还提供了免疫细胞，例如免疫调节细胞，其包含本公开的CAR和/或表达载体，包含此类免疫细胞的组合物和药物组合物，包含此类免疫细胞和/或用于制备此类免疫细胞的试剂(例如，编码本公开的抗HLA-A抗体或CAR的核酸或载体)的部件的试剂盒，以及制备此类免疫细胞的方法。还提供了使用本公开的抗HLA-A2抗体、CAR、免疫细胞以及药物组合物的方法。例如，该抗HLA-A2抗体、CAR、免疫细胞(例如，免疫调节细胞)及药物组合物可用于例如促进受试者的免疫耐受、预防或治疗受试者的移植物抗宿主病(GVHD)、预防或治疗受试者的器官或组织移植排斥等。
在一些实施方案中，提供了一种人源化的抗HLA-A2抗体，其中该抗体能够构成嵌合抗原受体(CAR)的抗原结合结构域，其中该CAR能够在人细胞(例如，人免疫细胞，如人免疫调节细胞)中表达，使得该CAR特异性结合HLA-A2。在某些方面，这些抗体与包含以下的抗体竞争结合HLA-A2：具有SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)；具有SEQ ID NO：185的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)；具有SEQ ID NO：187氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)；具有SEQ ID NO：188的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)；具有SEQ ID NO：189的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)；和具有SEQ IDNO：190的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)。
在某些方面，提供了一种人源化的抗HLA-A2抗体，其中该抗体与包含以下的抗体竞争结合HLA-A2：具有SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)；具有SEQID NO：185的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)；具有SEQ ID NO：187氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)；具有SEQ ID NO：188的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)；具有SEQ ID NO：189的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)；和具有SEQ ID NO：190的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)。
根据某些实施方案，如上所述的人源化的抗HLA-A2抗体与包含以下的抗体结合相同的HLA-A2表位：具有SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)；具有SEQID NO：185的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)；具有SEQ ID NO：187氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)；具有SEQ ID NO：188的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)；具有SEQ ID NO：189的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)；和具有SEQ ID NO：190的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)。
在一些实施方案中，与BB7.2抗体相比，本公开的人源化的抗HLA-A2抗体对选自HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A**29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68及其任意组合中的一种或多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。例如，在一些实施方案中，与BB7.2抗体相比，本公开的人源化的抗HLA-A2抗体对选自HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30以及它们的任意组合中的一种或多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。
在某些方面，本公开的人源化的抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含选自下组的氨基酸序列：SYHIQ(SEQ ID NO：1)和GYTFTSY(SEQ ID NO：2)。
根据某些实施方案，本公开的人源化的抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含选自下组的氨基酸序列：YPGDGS(SEQ ID NO：4)和WIYPGDGSTX10YX12X13KFX16G(SEQID NO:10)，其中X10是Q或K，X12是N或S，X13是E或Q，X16是K或Q。这样的抗体可以包含，例如，重链可变区，其包含选自下组的氨基酸序列：WIYPGDGSTQYNEKFKG(SEQ ID NO:3)和YPGDGS(SEQ ID NO:4)。还例如，这样的抗体可以包含例如重链可变区，其包含氨基酸序列WIYPGDGSTKYSQKFQG(SEQ ID NO：5)。在某些方面，本公开的人源化的抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含氨基酸序列EGTYYAMDY(SEQ ID NO：6)。
在一些实施方案中，本公开的人源化的抗HLA-A2抗体包含含有氨基酸序列RSSQSIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO：7)的轻链可变区。在某些方面，本公开的人源化的抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含氨基酸序列KVSNRFS(SEQ ID NO：8)。根据一些实施方案，本公开的人源化的抗体包含含有氨基酸序列FQGSHVPRT(SEQ ID NO：9)的轻链可变区。
在某些方面，本公开的人源化的抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含框架区1(VH FR1)，该框架区包含选自下组的氨基酸序列：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS(SEQ ID NO:11)和
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT(SEQ ID NO:12)。
根据某些实施方案，本公开的人源化的抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含框架区2(VH FR2)，该框架区包含选自下组的氨基酸序列：
WVRQAPGQX9LEWMGX15(SEQ ID NO:13)，
WVRQAPGQX9LEWMGX15WI(SEQ ID NO:17)，
HIQWVRQAPGQX12LEWMGX18WI(SEQ ID NO:21)，和
HIQWVRQAPGQX12LEWMGX18(SEQ ID NO:25)，其中：
在SEQ ID NO：13中，X9是R或G，并且X15是I或不存在；
在SEQ ID NO：17中，X9是R或G，并且X15是I或不存在；
在SEQ ID NO：21中，X12是R或G，并且X18是I或不存在；以及
在SEQ ID NO：25中，X12是R或G，并且X18是I或不存在。
在一些实施方案中，本公开的人源化的抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含框架区3(VH FR3)，该框架区包含选自下组的氨基酸序列：
X1VTX4TX6DTSX10STAYMX16LSX19LRSX23DX25AVYYCAR(SEQ ID NO:29)，
TX2YX4X5KFX8GX10VTX13TX15DTSX19STAYMX25LSX28LRSX32DX34AVYYCAR(SEQ ID NO:35)，
TQYNEKFKGX10VTX13TX15DTSX19STAYMX25LSX28LRSX32DX34AVYYCAR(SEQ ID NO:36)，和
TKYSQKFQGX10VTX13TX15DTSX19STAYMX25LSX28LRSX32DX34AVYYCAR(SEQ ID NO:37)，其中：
在SEQ ID NO：29中，X1是R或不存在，X4是I或M，X6是R或A，X10是A、T或I，X16是E或L，X19是S或R，X23是E或D，并且X25是T或M；
在SEQ ID NO：35中，X2是Q或K，X4是N或S，X5是E或Q，X8是K或Q，X10是R或不存在，X13是I或M，X15是R或A，X19是A、T或I，X25是E或L，X28是S或R，X32是E或D，并且X34是T或M；
在SEQ ID NO：36中，X10是R或不存在，X13是I或M，X15是R或A，X19是A，T或I，X25是E或L，X28是S或R，X32是E或D，并且X34是T或M；以及
在SEQ ID NO：37中，X10是R或不存在，X13是I或M，X15是R或A，X19是A、T或I，X25是E或L，X28是S或R，X32是E或D，并且X34是T或M。
在某些方面，本公开的人源化的抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含含有氨基酸序列WGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：44)的框架区4(VH FR4)。根据某些实施方案，本公开的人源化的抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：61-66。
根据某些实施方案，本公开的人源化的抗HLA-A2抗体包含轻链可变区，该轻链可变区包含框架区1(VL FR1)，该框架区包含氨基酸序列DX2VMTQX7PLSX11X12VTX15GQPASISX23(SEQ ID NO:46)，其中X2是V或I，X7是S或T，X11是L或S，X12是P或S，X15是L或P，并且X23是C或F。
在一些实施方案中，本公开的人源化的抗HLA-A2抗体包含轻链可变区，该轻链可变区包含含有氨基酸序列WX2X3QX5PGQX9PX11X12LIY(SEQ ID NO:51)的框架区2(VL FR2)，其中X2是F或Y，X3是Q或L，X5是R或K，X9是S或P，X11是R或Q，并且X12是R或L。
在某些方面，本公开的人源化的抗HLA-A2抗体包含轻链可变区，该轻链可变区包含含有氨基酸序列GVPDRFSGSGX11GTDFTLKISRVEAEDVGVYYC(SEQ ID NO:56)的框架区3(VLFR3)，其中X11是S或A。根据某些实施方案，本公开的人源化的抗HLA-A2抗体包含轻链可变区，该轻链可变区包含含有氨基酸序列FGGGTKVEIK(SEQ ID NO：59)的框架区4(VL FR4)。在一些实施方案中，本公开的人源化的抗HLA-A2抗体包含轻链可变区，该轻链可变区包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：67-71。在一些实施方案中，本公开的人源化的抗HLA-A2抗体是完整抗体、单链抗体、二聚体单链抗体、Fv、scFv、Fab、F(ab)'2、去岩藻糖基化抗体、双特异性抗体、双抗体(diabody)、三抗体(triabody)、四抗体(tetrabody)，选自由unibody、结构域抗体和纳米抗体组成的组的抗体片段，或选自由亲合体(affibody)、alphabody、基于armadillo重复蛋白的支架、knottin、kunitz结构域肽、affilin、affitin、adnectin、trimer、evasin、DARPin、抗运载蛋白(anticalin)、avimer、fynomer、versabody或duocalin组成的组的抗体模拟物。
根据某些实施方案，本公开的人源化的抗HLA-A2抗体是scFv。例如，本公开的人源化的抗HLA-A2抗体可以是包含选自下组的氨基酸序列的scFv：SEQ ID NO：72-91。
在一些实施方案中，提供了如上所述的人源化的抗HLA-A2抗体，其中该抗体能够构成嵌合抗原受体(CAR)的抗原结合结构域，其中该CAR能够在免疫细胞(例如，调节性T细胞(Treg))中表达，使得该CAR特异性结合HLA-A2。在某些方面，提供了如上所述的人源化的抗HLA-A2抗体，其中该抗体能够构成嵌合抗原受体(CAR)的抗原结合结构域，其中该CAR能够在免疫细胞(例如，调节性T细胞(Treg))中表达，使得该免疫细胞被HLA-A2活化。
在某些方面，提供了编码以上所列的任何人源化的抗HLA-A2抗体的核酸。还提供了包含这种核酸的表达载体和基因治疗载体。还提供了包含这种表达载体或基因治疗载体的宿主细胞。
本公开的方面还包括嵌合抗原受体(CAR)。例如，提供一种CAR，其包含：(i)包含上述任何人源化的抗HLA-A2抗体的胞外域；(ii)跨膜结构域；和(iii)包含胞内信号传导结构域的胞质结构域；其中CAR能够在免疫细胞中表达，使得CAR特异性结合HLA-A2。与含有BB7.2抗体的CAR相比，这种CAR对于选自HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68以及它们的任意组合中的一种或多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。例如，在一些实施方案中，与包含BB7.2抗体的CAR相比，这样的CAR对选自HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30及其任意组合中的一种或多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。本公开的CAR可能能够在免疫细胞(例如，调节性T细胞(Treg))中表达，使得免疫细胞被HLA-A2活化。本公开的CAR可以包含铰链区。在某些方面，铰链区包含CD8α的茎区。
本公开的CAR可以包含跨膜结构域，其包含选自下组的蛋白的跨膜结构域：CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、T细胞受体的α链、T细胞受体的β链、T细胞受体的γ链、T细胞受体的δ链、CD28、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154，及其任意组合。在一些实施方案中，跨膜结构域包含CD28的跨膜结构域。
根据某些实施方案，本公开的CAR包含胞内信号传导结构域，其包含选自下组的蛋白的功能性信号传导结构域：CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、FcRγ、FcRα、FcRε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d，及其任意组合。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含CD3ζ的功能性信号传导结构域。在某些方面，胞内信号传导结构域还包含共刺激结构域。这样的共刺激结构域可以包含选自下组的蛋白的功能性信号传导结构域：OX40、CD27、CD28、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)(CD11a/CD18)、TNFR1(CD120a/TNFRSF1A)、TNFR2(CD120b/TNFRSF1B)、CTLA-4(CD152)、CD95、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、CD2、CD30、CD40、PD-1、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、ICAM-1、与CD83特异性结合的配体、IL2Ra(CD25)、IL6Ra(CD126)、IL-7Ra(CD127)、IL-13RA1、IL-13RA2、IL-33R(IL1RL1)、IL-10RA、IL-10RB、IL-4R、IL-5R(CSF2RB)、ARHF、BAFF受体、IL-21R、TGFbR1、TGGbR2、TGFbR3、共有γ链及其任意组合。根据某些实施方案，共刺激结构域包含选自CD28和4-1BB的蛋白的功能性信号传导结构域。例如，共刺激结构域可以包含CD28的功能性信号传导结构域。
还提供了修饰的免疫细胞，其包含本公开的任何CAR。在一些实施方案中，修饰的免疫细胞是调节性T细胞(Treg)。
本公开提供编码本公开的任何CAR的核酸。还提供了包含此类核酸的表达载体，以及包含此类表达载体的免疫细胞(例如，调节性T细胞(Treg))。
还提供了组合物(例如，药物组合物)。在某些方面，提供了包含本公开的多个修饰的免疫细胞或免疫细胞的药物组合物。还提供了部件的试剂盒。在一些实施方案中，所述部件的试剂盒在第一部件中包含本公开的免疫细胞，并且在第二部件中包含另一种治疗剂，例如，免疫抑制剂。在一些实施方案中，所述部件的试剂盒包括用于制备本公开的细胞的一种或多种试剂(例如，编码本公开的抗HLA-A抗体或CAR的核酸或表达载体)。还提供了制备本公开的修饰的免疫细胞的方法。在一些实施方案中，此类方法包括用本公开的表达载体转导免疫细胞，从而产生修饰的免疫细胞。
还提供了使用本公开的抗体、CAR、免疫细胞、修饰的免疫细胞和药物组合物的方法。在某些方面，提供了促进受试者中的免疫耐受的方法，所述方法包括向受试者施用本公开的药物组合物，例如，包含多个本公开的修饰的免疫细胞或免疫细胞的药物组合物。在一些实施方案中，免疫耐受是对移植的器官或组织的耐受。根据某些实施方案，提供了预防或治疗受试者中的移植物抗宿主病(GVHD)的方法，所述方法包括向受试者施用本公开的药物组合物，例如，包含多个本公开的修饰的免疫细胞或免疫细胞的药物组合物。在某些方面，受试者正在经历或已经经历造血干细胞移植。还提供了预防或治疗受试者中的器官或组织移植排斥的方法，所述方法包括向受试者施用本公开的药物组合物，例如，包含多个本公开的修饰的免疫细胞或免疫细胞的药物组合物。在一些实施方案中，受试者还接受免疫抑制剂。根据某些实施方案，提供了预防或治疗受试者中的器官或组织移植排斥或移植物抗宿主病(GVHD)的方法，所述方法包括向受试者施用本公开的免疫细胞与至少一种用于诱导免疫耐受的免疫抑制剂的组合。在使用本公开的抗体、CAR、免疫细胞、修饰的免疫细胞和药物组合物的任何方法中，受试者可以是人。
附图简要说明
图1.人源化的抗HLA-A2 CAR的构建。慢病毒构建体的图示。顶部：截短的NGFR对照构建体(无CAR)；底部：人源化的抗HLA-A2 CAR构建体。"SP"：信号肽；"GS"：甘氨酸-丝氨酸连接子；"TM"：跨膜区；"HS"：人源化的。
图2.人源化的抗HLA-A2 CAR的细胞表面表达和特异性。用所示构建体瞬时转染293T细胞，表达48小时后，通过用抗ΔNGFR mAb和HLA-A2四聚体进行流式细胞术染色测量抗原特异性。A&B分别显示了保留或不保留其结合HLA-A2的能力的构建体的点图。数据代表两个独立实验。
图3.人源化的抗HLA-A2 CAR结合强度的比较。用所示的人源化的抗HLA-A2 CAR构建体转染293T细胞，并用所示的HLA-A2四聚体稀释液染色。A、B&C显示了描述门控的ΔNGFR+胞内HLA-A2四聚体结合的几何平均荧光强度的图，其中构建体根据轻链使用分组。
图4.人源化的抗HLA-A2 CAR在Treg上的表达和特异性。将CD4+CD25hiCD127lo Treg活化，一天后用所示慢病毒转导，然后使其扩增。在活化后七天，ΔNGFR表达细胞通过基于磁珠的分离来选择。ΔNGFR+细胞(A、B、C&D)分离之前和之后通过流式细胞术测定转导效率和HLA-A2结合。数字代表ΔNGFR+四聚体+细胞的比例。数据代表独立实验。(E)A*02:01-四聚体结合的百分比或平均荧光强度的总结数据。
图5.HLA-A2 CAR介导的Treg的活化。活化CD4+CD25hiCD127lo Treg，用指定的慢病毒转导，并允许扩增。7天后，将Treg与100U/mL IL-2静置过夜，然后保持未刺激或通过与2:1(Treg：K562细胞)比例的抗CD3/28负载的CD64-K562细胞(TCR)或HLA-A2-K562细胞(CAR)共培养来刺激。24小时后，通过流式细胞术在活CD4+细胞上测量CD69、CD154、CTLA-4和LAP的表达。(A&B)显示代表性直方图和(C&D)显示来自两个独立实验的平均数据。(E)ΔNGFR对照/CAR Treg与表达HLA-A2的K562细胞以2:1(Treg：K562)比例共培养。16小时后，通过流式细胞术测量CD69、CD71、CTLA-4和LAP的表达。CD69和CD71的阳性百分比和超过基线(无K562)表达的倍数增加。(F)CTLA-4和LAP的阳性百分比和超过基线(无K562)表达的倍数增加。来自至少两个独立实验的每个构建体的数据为n＝2-4。单向ANOVA和Holm-Sidak后检验，将所有构建体与mA2-CAR Treg进行比较。平均值±SEM。此外，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
图6.人源化的抗HLA-A2 CAR与共有HLA-A和HLA-B等位变体的交叉反应性的测定。(A)显示了FlowPRT细胞测定的实验设置和门控策略的示意图。将表达所示人源化的CAR的ΔNGFR+ Treg与Flow Panel反应性单抗原珠和可固定的活性染料在室温下孵育30分钟。然后洗涤样品，固定并通过流式细胞术分析。(B)相对于ΔNGFR Treg对照的结合，每个m/hA2-CAR Treg与HLA-A*02:01包被的珠的结合。(C&D)通过FlowPRT细胞测定测定的HLA-A*02:01结合的平均值与(C)通过流式细胞仪评价的HLA-A*02:01-四聚体MFI或(D)与HLA-A*02:01共培养16h后与阴性对照HLA-A*24:01K562细胞相比CD69+细胞的比例增加的相关性。E、F、G&H中的数据显示相对于仅表达截短的NGFR的对照Treg的结合百分比，其针对通过细胞仪收集的HLA阴性珠的数量进行标准化。灰色阴影区域(E、F和G)或水平虚线(H)上方的数据点代表与仅珠子的对照的平均值的两个以上标准偏差的值，因此是统计学上显著的(p＜0.05)。数据是三次独立实验的平均值。(I)将ΔNGFR或m/hA2-CAR Treg与转导以表达所选HLA-A等位基因的所示K562细胞共培养。16小时后，在活的CD4+ T细胞上测量CD69、CD71、LAP和CTLA-4的表达。n＝2-6，来自至少2个独立实验。通过单向ANOVA和Holm-Sidak后检验确定的与mA2-CAR相比的统计学显著性。平均值±SEM，**p＜0.01。
图7.表达人源化的HLA-A2 CAR的Treg有效地抑制由HLA-A2+树突细胞刺激的T细胞增殖。(A)实验设置的示意图。成熟的HLA-A2+树突细胞用于刺激用细胞增殖染料(CPD)-e450标记的HLA-A2negCD4+"应答者"T细胞。CPD-e660标记的Treg未转导，或用编码ΔNGFR的对照慢病毒或表达人源化A2 CAR的Treg转导。(B、C、D&E)将所示比例的细胞共培养六天，然后通过流式细胞术测量应答者CPD-E450-标记的应答者CD4+ T细胞的增殖量。B表示代表性的点图，C、D和E表示多个细胞比的绘图数据。C、D和E显示来自至少3个独立实验的n＝3-7的平均数据。使用双向ANOVA与Holm-Sidak后检验与ΔNGFR Treg对照进行统计分析。*P＜0.05，平均值±SEM。
图8.表达人源化的HLA-A2 CAR的Treg有效地抑制异种移植物抗宿主病。用PBS(n＝3)、单独的8×106HLA-A2+PBMC(n＝5)或用4×106表达H1k2CAR的Treg(n＝6)注射照射的NSG小鼠。每7天监测血液中的人细胞移植物。(A)存活曲线和(B)相对于实验开始时的重量变化百分比。(C)血液中表达人CD45的总单核细胞(活的单个细胞)的比例。(D)区分总体人CD45+和CAR Treg(hCD45+hCD4+HLA-A2-)细胞移植物的门控策略。(E)在异种GVHD小鼠模型中过继转移后的体内细胞移植物，其通过每μL血液随时间推移的PBMC和CAR Treg移植物的绝对数量所显示。PBMC的数量计算为hCD45+减去在D中门控的总CAR Treg数。
图9.m/hA2 CAR的表达使Treg快速和持续地归巢至HLA-A2:01+皮肤同种移植物。用编码萤光素酶和对照HER2-CAR、mA2-CAR或hA2-CAR(H1k2)的慢病毒共同转导Treg。将双转导的细胞进行FACS分选，扩增5天，然后注射到NSG小鼠中，所述NSG小鼠先前移植了来自NSG和NSG-HLA-A*02:01转基因小鼠的并置的皮肤移植物。(A)实验设置的示意图。(B)Treg注射后72小时(左)或21天(右)的皮肤移植物的代表性萤光素酶成像。萤光素酶辐射量使用平均光子量/秒/cm2/球面度来量化，并且绘制为Treg注射后72小时的HLA-A*02:01-NSG与NSG皮肤移植物之间的比率(C)或随时间的比率(D)。n＝2-3/组，来自三个独立实验，平均值±SEM。用Bonferroni校正重复测量ANOVA。
图10.具有快速和持续归巢至HLA-A2:01+皮肤同种异体移植物的m/hA2CAR Treg的流式细胞术追踪。用含有萤光素酶和HER2-CAR、mA2-CAR或hA2-CAR构建体的慢病毒共转导Treg，扩增并注射到移植的NSG小鼠中，如图9所示。(A)流式细胞术的预门控图是基于来自对照HER2-CAR的脾的细胞。(B)所示构建体的hCD4/hCD8流式细胞术图谱。如(A)中一样，在FvD-hCD45+上预门控图。(C)流式细胞术图，其显示在实验终点每组n＝1时，来自一个独立实验的脾和引流淋巴结中m/hA2-CAR Treg的染色。*P＜0.05。
图11.hA2-CAR-Treg减少人皮肤同种异体移植物排斥。NSG小鼠移植HLA-A*02:01+人皮肤，三周后注射PBS(n＝3)、仅HLA-A*02:01neg PBMC(n＝4)或与2:1比率的自体H1k2CAR Treg(n＝6)。PBMC/hA2-CAR Treg来自在一个实验中测试的两个单独的供体。(A)每周监测体重三次，并且(B)在实验终点时测量血液(左)和脾脏(右)中人CD45+细胞的比例。(C)通过H&E染色测定的移植的皮肤切片的累积组织学评分。(D)移植的皮肤移植物在实验终点进行免疫染色，以定量外皮蛋白(involucrin)表达的量和Ki-67+细胞在表皮中的比例。(E)通过qRT-PCR测定移植的皮肤切片中所示基因的mRNA表达。(F)移植的皮肤移植物在实验终点进行免疫染色，以量化FOXP3+细胞在人CD45+细胞中的比例。(G)移植的皮肤移植物、肠、肺和肝脏切片在实验终点进行免疫染色，以显示在每个组织中人CD45+胞内FOXP3+细胞的比例。每个数据点代表一只小鼠。箱线图显示平均值±范围。通过比较PBMC和H1k2的双尾Mann-Whitney检验确定统计学显著性。*P＜0.05。
图12.在人皮肤移植模型中对血液中hA2 CAR Treg的流式细胞术追踪。如图11所示，NSG小鼠被移植人类HLA-A*02+皮肤并注射细胞。(A)区分总体人CD45+(PBMC)和CARTreg(hCD45+hCD4+NGFR+)细胞移植物的门控策略。(B)随时间推移每μL血液的PBMC和CARTreg移植物的绝对数量。PBMC的数量计算为hCD45+减去总CAR Treg计数，如(A)中门控的。
图13.使用人工抗原呈递细胞活化hA2 CAR Treg。在没有刺激或用2:1(Treg：K562)比例的负载有抗-CD3和抗-CD28单克隆抗体的表达CD64的K562细胞(TCR刺激)刺激下，将ΔNGFR对照/CAR Treg共培养16小时。(A)示例门控策略。(B)通过流式细胞术测量CD69、CD71、CTLA-4和LAP的表达(左)。计算每种活化标记物超过基线(没有刺激)的倍数增加(右)。来自至少两个独立实验的每个构建体的数据为n＝2-4。平均值±SEM。单向ANOVA和Holm-Sidak的多重比较检验将所有构建体与mA2-CAR Treg进行比较。*P＜0.05，**P＜0.01，****P＜0.0001。
发明详述
I.一般技术
除非另有说明，本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。这些技术在文献中有充分的解释，例如“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”，第二版(Sambrook等人,1989)；“Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait,ed.,1984)；“Animal Cell Culture”(R.I.Freshney,ed.,1987)；“Methods in Enzymology”(Academic Press,Inc.)；“CurrentProtocols in Molecular Biology”(F.M.Ausubel等人,eds.,1987,和定期更新)；“PCR:The Polymerase Chain Reaction”,(Mullis等人,ed.,1994)；“A Practical Guide toMolecular Cloning”(Perbal Bernard V.,1988)；“Phage Display:A LaboratoryManual”(Barbas等人,2001)。
应当理解，本发明不限于所描述的特定实施例，因为这些实施例当然可以变化。还应理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不是旨在限制，因为本发明的范围仅由所附权利要求书限制。
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料也可用于本发明的实践或测试，但现在描述优选的方法和材料。本领域技术人员将认识到许多与本文所述的那些类似或等同的方法和材料，它们可用于本发明的实践中。实际上，本发明决不限于所述的方法和材料。为了本发明的目的，下文定义了以下术语。本文提及的所有出版物均通过引用并入本文以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。在所阐述的任何定义与通过引用并入本文的任何文献冲突的情况下，以下面所阐述的定义为准。
II.定义
术语“一”("a")和“一个”("an")是指该冠词的一个或多于一个语法对象。例如，"一个元件"是指一个元件或多于一个元件。
术语"约"在指向可测量值例如量、持续时间等时，意指包含指定值的±20％或在一些情况下±10％，或在一些情况下±5％，或在一些情况下±1％，或在一些情况下±0.1％的变化，只要这样的变化适于进行所公开的方法。
在提供数值范围的情况下，应当理解，除非上下文另外明确指出，否则在该范围的上限和下限之间的每个中间值，至下限单位的十分之一，以及在该规定范围内的任何其它规定值或中间值，都包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也包括在本发明内，服从于在所述范围内的任何具体排除的限制。当所述范围包括一个或两个限值时，排除那些包括的限值中的一个或两个的范围也包括在本发明中。
本文所用的术语"HLA-A2"和"A2"各自指由HLA基因复合体的HLA-A基因座处的HLA-A*02等位基因家族编码的，包括细胞表面蛋白的人白细胞抗原(HLA)蛋白。术语"HLA-A2"和"A2"所涵盖的HLA蛋白包括通过血清学测试或基因分型鉴定为属于HLA-A*02抗原类型的HLA蛋白。HLA-A*02抗原类型的其他名称包括"HLA-A2"、HLA-A02"、"HLA-A*2"。已经形成了不同的命名系统来鉴定由该等位基因家族编码的HLA蛋白，包括WHO HLA系统因子委员会于2010年形成的HLA命名系统。术语"HLA-A2"和"A2"是指由具有根据该命名系统名称以"HLA-A*02："开头的等位基因编码的HLA蛋白，包括但不限于以"HLA-A*02:01"、"HLA-A*02:02"、"HLA-A*02:03"、"HLA-A*02:04"、"HLA-A*02:05"、"HLA-A*02:06"、"HLA-A*02:07"、"HLA-A*02:08"、"HLA-A*02:09"、"HLA-A*02:10"和"HLA-A*02:11"开头的名称。除了在"HLA-A*02："之后的数字，等位基因命名也可以包含大写字母，包括但不限于大写字母"P"和"G"(例如，HLA-A*02:01P或HLA-A*02:01:01G)。以"HLA-A*02："开头后面跟着2、3或4个附加数字的”等位基因命名可以构成完整的名称或名称的开始部分。等位基因名称可以是斜体的。术语"HLA-A2"和"A2"也指根据该命名系统以"HLA-A*02"开头的命名所鉴定的HLA蛋白，包括但不限于命名"HLA-A*02:01"、"HLA-A*02:02"、"HLA-A*02:03"、"HLA-A*02:04"、"HLA-A*02:05"、"HLA-A*02:06"、"HLA-A*02:07"、"HLA-A*02:08"、"HLA-A*02:09"、"HLA-A*02:10"和"HLA-A*02:11"。
如本文所用的"HLA-A亚型"指由HLA-A基因的等位基因编码的蛋白。
本文中使用的术语"HLA-A*03"是指由HLA基因复合体的HLA-A基因座上的HLA-A*03等位基因家族编码的，包括细胞表面蛋白的HLA蛋白。术语"HLA-A*03"所涵盖的HLA蛋白包括通过血清学测试或基因分型鉴定为属于HLA-A*03抗原类型的HLA蛋白。HLA-A*03抗原类型的其他名称包括"HLA-A03"和"HLA-A3"。术语"HLA-A*03"是指由具有根据WHO HLA系统因子委员会2010年形成的HLA命名系统名称以"HLA-A*03："开头的等位基因编码的HLA蛋白，包括但不限于以下列开头的名称："HLA-A*03:01"、"HLA-A*03:02"、"HLA-A*03:04"、"HLA-A*03:05"、"HLA-A*03:06"、"HLA-A*03:07"、"HLA-A*03:08"、"HLA-A*03:09"、"HLA-A*03:10"以及"HLA-A*03:12"。除了在"HLA-A*03："后的数字外，等位基因名称也可以包含大写字母，包括但不限于大写字母"P"和"G"(例如，HLA-A*03:01P或HLA-A*03:01:01G)。以"HLA-A*03："开头后面跟着2、3或4个附加数字的等位基因命名可以构成完整的名称或名称的开始部分。等位基因名称可以是斜体的。术语"HLA-A*03"也指根据该命名系统以"HLA-A*03："开头的名称鉴定的HLA蛋白，包括但不限于名称"HLA-A*03:01"、"HLA-A*03:02"、"HLA-A*03:04"、"HLA-A*03:05"、"HLA-A*03:06"、"HLA-A*03:07"、"HLA-A*03:08"、"HLA-A*03:09"、"HLA-A*03:10"和"HLA-A*03:12"。
本文中使用的术语"HLA-A*25"、"HLA-A25"和"A25"是指由HLA基因复合体的HLA-A基因座上的HLA-A*25等位基因家族编码的，包含细胞表面蛋白的HLA蛋白。术语"HLA-A*25"、"HLA-A25"和"A25"所涵盖的HLA蛋白包括通过血清学测试或基因分型鉴定为属于HLA-A*25抗原类型的HLA蛋白。HLA-A*25抗原类型的其他名称包括"HLA-A25"。术语"HLA-A*25"、"HLA-A25"和"A25"是指由具有根据WHO HLA系统因子委员会于2010年形成的HLA命名系统名称以"HLA-A*25："开头的等位基因编码的HLA蛋白，包括但不限于以以下列开头的名称："HLA-A*25:01"、"HLA-A*25:02"、"HLA-A*25:03"、"HLA-A*25:04"、"HLA-A*25:05"、"HLA-A*25:06"、"HLA-A*25:07"、"HLA-A*25:08"、"HLA-A*25:09"、"HLA-A*25:10"和"HLA-A*25:11"。除了"HLA-A*25："后面的数字外，等位基因名称也可以包含大写字母，包括但不限于大写字母"P"和"G"(例如，HLA-A*25:01P或HLA-A*25:01:01G)。以"HLA-A*25"开头后面跟着2、3或4个附加数字的等位基因命名可以构成完整的名称或名称的开始部分。等位基因名称可以是斜体的。术语"HLA-A*25"、"HLA-A25"和"A25"也指根据该命名系统以"HLA-A*25："开头的名称鉴定的HLA蛋白，包括但不限于名称"HLA-A*25:01"、"HLA-A*25:02"、"HLA-A*25:03"、"HLA-A*25:04"、"HLA-A*25:05"、"HLA-A*25:06"、"HLA-A*25:07"、"HLA-A*25:08"、"HLA-A*25:09"、"HLA-A*25:10"和"HLA-A*25:11"。
本文所用的术语"HLA-A*29"、"HLA-A29"、"A29"是指由HLA基因复合体的HLA-A基因座上的HLA-A*29等位基因家族编码的，包含细胞表面蛋白的HLA蛋白。术语"HLA-A*29"、"HLA-A29"和"A29"所涵盖的HLA蛋白包括通过血清学测试或基因分型鉴定为属于HLA-A*29抗原类型的HLA蛋白。HLA-A*29抗原类型的其他名称包括"HLA-A29"。术语"HLA-A*29"、"HLA-A29"和"A29"是指由具有根据WHO HLA系统因子委员会于2010年形成的HLA命名系统名称以"HLA-A*29："开头的等位基因编码的HLA蛋白，包括但不限于以以下开头的名称："HLA-A*29:01"、"HLA-A*29:02"、"HLA-A*29:03"、"HLA-A*29:04"、"HLA-A*29:05"、"HLA-A*29:06"、"HLA-A*29:07"、"HLA-A*29:09"、"HLA-A*29:10"和"HLA-A29:11"。除了"HLA-A*29："后面的数字外，等位基因名称也可以包含大写字母，包括但不限于大写字母"P"和"G"(例如，HLA-A*29:02P或HLA-A*29:02:01G)。以"HLA-A*29"开头后面跟着2、3或4个附加数字的等位基因命名可以构成完整的名称或名称的开始部分。等位基因名称可以是斜体的。术语"HLA-A*29"、"HLA-A29"和"A29"也指根据该命名系统以"HLA-A*29："开头的名称鉴定的HLA蛋白，包括但不限于名称"HLA-A*29:01"、"HLA-A*29:02"、"HLA-A*29:03"、"HLA-A*29:04"、"HLA-A*29:05"、"HLA-A*29:06"、"HLA-A*29:07"、"HLA-A*29:09"、"HLA-A*29:10"和"HLA-A*29:11"。
本文中使用的术语"HLA-A*30"、"HLA-A30"和"A30"是指由HLA基因复合体的HLA-A基因座上的HLA-A*30等位基因家族编码的，包含细胞表面蛋白的HLA蛋白。术语"HLA-A*30"、"HLA-A30"和"A30"所涵盖的HLA蛋白包括通过血清学测试或基因分型鉴定为属于HLA-A*30抗原类型的HLA蛋白。HLA-A*30抗原类型的其他名称包括"HLA-A30"。术语"HLA-A*30"、"HLA-A30"和"A30"是指由根据WHO HLA系统因子委员会于2010年形成的HLA命名系统名称以"HLA-A*30："开头的等位基因编码的HLA蛋白，包括但不限于以以下开头的名称"HLA-A*30:01"、"HLA-A*30:02"、"HLA-A*30:03"、"HLA-A*30:04"、"HLA-A*30:06"、"HLA-A*30:07"、"HLA-A*30:08"、"HLA-A*30:09"、"HLA-A*30:10"和"HLA-A*30:11"。除了"HLA-A*30："后面的数字外，等位基因名称也可以包含大写字母，包括但不限于大写字母"P"和"G"(例如，HLA-A*30:01P、HLA-A*30:02P、HLA-A*30:04P、HLA-A*30:01:01G、HLA-A*30:02:01G或HLA-A*30:04:01G)。以"HLA-A*30"开头后面跟着2、3或4个附加数字的等位基因命名可以构成完整的名称或名称的开始部分。等位基因名称可以是斜体的。术语"HLA-A*30"、"HLA-A30"和"A30"也指根据该命名系统以"HLA-A*30："开头的名称鉴定的HLA蛋白，包括但不限于名称"HLA-A*30:01"、"HLA-A*30:02"、"HLA-A*30:03"、"HLA-A*30:04"、"HLA-A30:06"、"HLA-A*30:07"、"HLA-A*30:08"、"HLA-A*30:09"、"HLA-A*30:10"和"HLA-A*30:11"。
本文中使用的术语"HLA-A*31"、"HLA-A31"和"A31"是指由HLA基因复合体的HLA-A基因座上的HLA-A*31等位基因家族编码的，包含细胞表面蛋白的HLA蛋白。术语"HLA-A*31"、"HLA-A31"和"A31"所涵盖的HLA蛋白包括通过血清学测试或基因分型鉴定为属于HLA-A*31抗原类型的HLA蛋白。HLA-A*31抗原类型的其他名称包括"HLA-A31"。术语"HLA-A*31"、"HLA-A31"和"A31"是指由具有根据WHO HLA系统因子委员会于2010年形成的HLA命名系统名称以"HLA-A*31："开头的等位基因编码的HLA蛋白，包括但不限于以以下开头的名称："HLA-A*31:01"、"HLA-A*31:02"、"HLA-A*31:03"、"HLA-A*31:04"、"HLA-A*31:05"、"HLA-A*31:06"、"HLA-A*31:07"、"HLA-A*31:08"、"HLA-A*31:09"、"HLA-A*31:10"和"HLA-A*31:11"。除了"HLA-A*31："后面的数字外，等位基因名称也可以包含大写字母，包括但不限于大写字母"P"和"G"(例如，HLA-A*31:01P或HLA-A*31:01:02G)。以"HLA-A*31"开头后面跟着2、3或4个附加数字的等位基因命名可以构成完整的名称或名称的开始部分。等位基因名称可以是斜体的。术语"HLA-A*31"、"HLA-A31"和"A31"也指根据该命名系统以"HLA-A*31："开头的名称鉴定的HLA蛋白，包括但不限于名称"HLA-A*31:01"、"HLA-A*31:02"、"HLA-A*31:03"、"HLA-A*31:04"、"HLA-A*31:05"、"HLA-A*31:06"、"HLA-A*31:07"、"HLA-A*31:08"、"HLA-A*31:09"、"HLA-A*31:10"和"HLA-A*31:11"。
本文中使用的术语"HLA-A*33"、"HLA-A33"和"A33"是指由HLA基因复合体的HLA-A基因座上的HLA-A*33等位基因家族编码的，包括细胞表面蛋白的HLA蛋白。术语"HLA-A*33"、"HLA-A33"和"A33"所涵盖的HLA蛋白包括通过血清学测试或基因分型鉴定为属于HLA-A*33抗原类型的HLA蛋白。HLA-A*33抗原类型的其他名称包括"HLA-A33"。术语"HLA-A*33"、"HLA-A33"和"A33"是指由具有根据WHO HLA系统因子委员会于2010年形成的HLA命名系统名称以"HLA-A*33："开头的等位基因编码的HLA蛋白，包括但不限于以以下开头的名称："HLA-A33:01"、"HLA-A33:03"、"HLA-A33:04"、"HLA-A33:05"、"HLA-A33:06"、"HLA-A33:07"、"HLA-A33:08"、"HLA-A33:09"、"HLA-A33:10"以及"HLA-A33:11"。除了"HLA-A*33："后面的数字外，等位基因名称也可以包含大写字母，包括但不限于大写字母"P"和"G"(例如，HLA-A*33:01P或HLA-A*33:01:01G)。以"HLA-A*33"开头后面跟着2、3或4个附加数字的等位基因命名可以构成完整的名称或名称的开始部分。等位基因名称可以是斜体的。术语"HLA-A*33"、"HLA-A33"和"A33"也指根据该命名系统以"HLA-A*33："开头的名称鉴定的HLA蛋白，包括但不限于名称："HLA-A*33:01"、"HLA-A*33:03"、"HLA-A*33:04"、"HLA-A*33:05"、"HLA-A*33:06"、"HLA-A*33:07"、"HLA-A*33:08"、"HLA-A*33:09"、"HLA-A*33:10"和"HLA-A*33:11"。
本文中使用的术语"HLA-A*36"、"HLA-A36"和"A36"是指由HLA基因复合体的HLA-A基因座上的HLA-A*36等位基因家族编码的，包括细胞表面蛋白的HLA蛋白。术语"HLA-A*36"、"HLA-A36"和"A36"所涵盖的HLA蛋白包括通过血清学测试或基因分型鉴定为属于HLA-A*36抗原类型的HLA蛋白。HLA-A*36抗原类型的其他名称包括"HLA-A36"。术语"HLA-A*36"、"HLA-A36"和"A36"是指由具有根据WHO HLA系统因子委员会于2010年形成的HLA命名系统名称以"HLA-A*36："开头的等位基因编码的HLA蛋白，包括但不限于以以下开头的名称："HLA-A*36:01"、"HLA-A*36:02"、"HLA-A*36:03"、"HLA-A*36:04"和"HLA-A*36:05"。除了"HLA-A*36："后面的数字外，等位基因名称也可以包含大写字母，包括但不限于大写字母"P"和"G"。以"HLA-A*36"开头后面跟着2、3或4个附加数字的等位基因命名可以构成完整的名称或名称的开始部分。等位基因名称可以是斜体的。术语"HLA-A*36"、"HLA-A36"和"A36"也指根据该命名系统以"HLA-A*36："开头的名称鉴定的HLA蛋白，包括但不限于名称："HLA-A*36:01"、"HLA-A*36:02"、"HLA-A*36:03"、"HLA-A*36:04"、"HLA-A*36:05"和"HLA-A*36:06"。
本文中使用的术语"HLA-A*68"、"HLA-A68"和"A68"是指由HLA基因复合体的HLA-A基因座上的HLA-A*68等位基因家族编码的，包括细胞表面蛋白的HLA蛋白。术语"HLA-A*68"、"HLA-A68"和"A68"所涵盖的HLA蛋白包括通过血清学测试或基因分型鉴定为属于HLA-A*68抗原类型的HLA蛋白。HLA-A*68抗原类型的其他名称包括"HLA-A68"。术语"HLA-A*68"、"HLA-A68"和"A68"是指由具有根据WHO HLA系统因子委员会于2010年形成的HLA命名系统名称以"HLA-A*68："开头的等位基因编码的HLA蛋白，包括但不限于以以下开头的名称："HLA-A*68:01"、"HLA-A*68:02"、"HLA-A*68:03"、"HLA-A*68:04"、"HLA-A*68:05"、"HLA-A*68:06"、"HLA-A*68:07"、"HLA-A*68:08"、"HLA-A*68:09"和"HLA-A*68:10"。除了"HLA-A*68："后面的数字外，等位基因名称也可以包含大写字母，包括但不限于大写字母"P"和"G"(例如，HLA-A*68:01P、HLA-A*68:01:01G或HLA-A*68:01:02G)。以"HLA-A*68"开头后面跟着2、3或4个附加数字的等位基因命名可以构成完整的名称或名称的开始部分。等位基因名称可以是斜体的。术语"HLA-A*68"、"HLA-A68"和"A68"也指根据该命名系统以"HLA-A*68："开头的名称鉴定的HLA蛋白，包括但不限于名称："HLA-A*68:01"、"HLA-A*68:02"、"HLA-A*68:03"、"HLA-A*68:04"、"HLA-A*68:05"、"HLA-A*68:06"、"HLA-A*68:07"、"HLA-A*68:08"、"HLA-A*68:09"和"HLA-A*68:10"。
在本文中具体的HLA蛋白可使用根据WHO HLA系统因子委员会(WHO Committeefor Factors of the HLA System)于2010年形成的HLA命名系统的蛋白名称指明。例如，本文所使用的术语"HLA-A*02:01"是指根据该命名系统名称为"HLA-A*02:01"的HLA蛋白。类似地，"HLA-A*03:01"、"HLA-A*25:01"、"HLA-A*29:02"、"HLA-A*30:01"、"HLA-A*31:01"、"HLA-A*33:01"、"HLA-A*36:01"和"HLA-A*68:01"分别是指名称为"HLA-A*03:01"、"HLA-A*25:01"、"HLA-A*29:02"、"HLA-A*30:01"、"HLA-A*31:01"、"HLA-A*33:01"、"HLA-A*36:01"和"HLA-A*68:01"的HLA蛋白。
本文所用的术语"抗HLA-A2抗体"指优先或特异性结合HLA-A2的抗体。
本文所用的术语"BB7.2"是指鉴定为ATCC保藏号HB-82的鼠杂交瘤。BB7.2杂交瘤细胞分泌IgG2bκ同种型的鼠单克隆抗体，其已经由Parham,P.等人和Hilton等人表征(Parham,P.等人,1981；Hilton等人,2013)。BB7.2分泌的单克隆抗体的六个互补决定区(CDR)的氨基酸序列如下：
重链CDR1(HCDR1):SYHIQ(SEQ ID NO:183)；
重链CDR2(HCDR2):WIYPGDGSTQYNEKFKG(SEQ ID NO:185)；
重链CDR3(HCDR3):EGTYYAMDY(SEQ ID NO:187)；
轻链CDR1(LCDR1):RSSQSIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO:188)；
轻链CDR2(LCDR2):KVSNRFS(SEQ ID NO:189)；
轻链CDR3(LCDR3):FQGSHVPRT(SEQ ID NO:190)。
如本文所用，"BB7.2抗体"是具有BB7.2分泌的单克隆抗体的VH(SEQ ID NO：191)和VL(SEQ ID NO：192)的抗体。BB7.2抗体可以是具有BB7.2分泌的单克隆抗体的VH和VL的完整抗体或其片段，例如具有BB7.2分泌的单克隆抗体的VH和VL的scFv。
术语"抗体"和"免疫球蛋白"包括任何同种型的抗体或免疫球蛋白，保持与抗原特异性结合的抗体片段，包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、双抗体(diabody)、单结构域抗体(sdAb)、线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体、嵌合抗体、人源化的抗体、单链抗体和包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白的融合蛋白。
抗体可以是多克隆或单克隆的、多链或单链的，或完整的免疫球蛋白，并且可以源自天然来源或重组来源。抗体可以是免疫球蛋白分子的四聚体。基本的4链抗体单元是由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成的异四聚体糖蛋白。在IgG的情况下，4链单元通常为约150,000道尔顿。每条L链通过一个共价二硫键与H链连接，而两个H链根据H链同种型通过一个或多个二硫键彼此连接。每条H和L链还具有规则间隔的链内二硫键。每条H链在N末端具有可变域(VH)，随后对于α和γ链中的每一条则是三个恒定域(CH)而对于μ和ε同种型则是四个CH域。每条L链在N末端具有可变结构域(VL)，随后在其另一端是恒定结构域(CL)。VL与VH对齐，CL与重链的第一个恒定区(CH1)对齐。认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。VH和VL的配对一起形成单个抗原结合位点。对于不同类型抗体的结构和性质，参见例如Basic and Clinical Immunology，第8版，Daniel P.Stites，Abba I.Terr和Tristram G.Parslow(编辑)，Appleton&Lange，Norwalk，Conn.，1994，第71页，第6章。来自任何脊椎动物物种的L链可以根据它们的恒定结构域的氨基酸序列，被归类至两种明显不同的类型之一，称为κ和λ。根据免疫球蛋白重链恒定区(CH)的氨基酸序列，可以将其分为不同的种类或同种型。有五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其具有分别命名为α、δ、ε、γ和μ的重链。γ和α类基于CH序列和功能的相对较小差异进一步分成亚类，例如，人表达以下亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
抗体的"可变区"或"可变结构域"是指抗体的重链或轻链的氨基末端结构域。重链的可变结构域可以称为"VH"、"VH"或"H"。轻链的可变结构域可以称为"VL"、"VL"或"L"。这些结构域通常是抗体的最可变部分，并且含有抗原结合位点。
术语"可变"指可变结构域的某些区段在抗体之间序列差异非常大的事实。V结构域介导抗原结合，并定义特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，变异性在可变区的110至130个氨基酸跨度上不是均匀分布的。实际上，V区由相对不变的称为框架区(FR)的15-30个氨基酸的区段以及分割所述区段的被称为"高变区"的极端可变且均为9-12个氨基酸长的较短区域组成。天然重链和轻链的可变区均包含主要采取β-折叠构型的、通过三个高变区连接的四个FR，其形成环连接并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的高变区通过FR保持紧密靠近在一起，并且与来自另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5thEd.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))。
"完整"抗体是包含抗原结合位点以及CL和至少重链恒定结构域CH1、CH2和CH3的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。在一个实施方案中，完整抗体可具有一种或多种效应子功能。
术语"抗体片段"指完整抗体或其重组变体的至少一部分，并且指抗原结合结构域，例如完整抗体的抗原决定可变区，其足以赋予抗体片段对靶标如抗原的识别和特异性结合。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv片段；双抗体；单结构域抗体(sdAb)；线性抗体(参见美国专利号5,641,870，实施例2；Zapata等，Protein Eng.8(10)：1057-1062[1995])；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。在一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的抗原结合位点，因此保留结合抗原的能力。抗HLA-A2抗体片段中还包含抗HLA-A2抗体的部分(以及抗HLA-A2抗体的部分的组合，例如scFv)，其可以用作CAR修饰的免疫细胞的嵌合抗原受体中的针对HLA-A2抗原的靶向臂。这些片段不一定是蛋白水解片段，而是可以赋予对靶标的亲和力的多肽序列的部分。抗HLA-A2抗体片段中还包含单结构域抗体(sdAb)(参见，例如，Li等人(2017)；Jamnani等人(2014))。这样的单结构域抗体可以用作本发明的CAR修饰的免疫细胞中的靶向臂。
木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为"Fab"片段，和残留的"Fc"片段，该名称反映了容易结晶的能力。Fab片段由完整的L链以及H链的可变区结构域(VH)和一条重链的第一个恒定结构域(CH1)组成。每个Fab片段就抗原结合而言是单价的，即它具有单个抗原结合位点。抗体的胃蛋白酶处理产生单个大F(ab')2片段，其大致相当于两个二硫键连接的Fab片段，具有二价抗原结合活性，并且仍然能够交联抗原。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在CH1结构域的羧基末端具有额外的几个残基，包含来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH在本文中是指恒定区的半胱氨酸残基带有游离巯基的Fab'。F(ab')2抗体片段最初是作为中间具有铰链半胱氨酸的Fab'片段对产生的。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。
Fc片段包含通过二硫键连接在一起的两条H链的羧基末端部分。抗体的效应子功能由Fc区中的序列决定，该区也是在某些类型的细胞上发现的Fc受体(FcR)识别的部分。
"Fv"是含有完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密、非共价结合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。在单链Fv(scFv)种类中，一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域可以通过柔性肽连接子共价连接，使得轻链和重链可以以类似于双链Fv种类的"二聚体"结构结合。从这两个结构域的折叠中产生六个高变环(H和L链各3个环)，其为抗原结合贡献氨基酸残基并赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或只包含特异于抗原的三个CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于完整的结合位点。
"单链Fv"也缩写为"sFv"或"scFv"，是包含连接成单个多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。scFv多肽还可以在VH和VL结构域之间包含多肽连接子，其使得scFv能够形成用于抗原结合的期望结构。除非特别说明，如本文所用，scFv可以具有任一顺序的VL和VH可变区，例如，相对于多肽的N-末端和C-末端，scFv可以包含VL-连接子-VH或可以包含VH-连接子-VL。scFv的综述参见Pluckthun in The Pharmacology of MonoclonalAntibodies,vol.113,Rosenburg和Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)；Antibody Engineering,ed.Borrebaeck,Oxford University Press,New York(1995)。在一个实施方案中，抗HLA-A2抗体衍生的scFv可以用作本文公开的CAR修饰的免疫细胞的靶向臂。
"Adnectin"，也称为monobody，是本领域公知的，并且是指设计用于以高亲和力和特异性结合抗原的蛋白。它们属于统称为"抗体模拟物"的分子类型。
术语"Alphabody"是指细胞穿透性Alphabody，是指由经工程化以结合多种抗原的10kDa小蛋白组成的一类抗体模拟物。Alphabody能够到达并结合胞内蛋白靶标。
术语"亲合体"是本领域熟知的，并且指基于58个氨基酸残基的蛋白结构域的亲和蛋白，其衍生自葡萄球菌蛋白A的IgG结合结构域之一。。
术语"抗运载蛋白(anticalin)"是本领域熟知的，指抗体模拟技术，其中结合特异性来自脂质运载蛋白。抗运载蛋白也可为双靶向蛋白的形式，称为Duocalin。
术语"基于armadillo重复蛋白的支架"是指对应于基于armadillo重复蛋白的人工肽结合支架的一类抗体模拟物。armadillo重复蛋白的特征在于由约42个氨基酸的串联armadillo重复组成的armadillo结构域，其介导与肽或蛋白的相互作用。
术语"avimer"是本领域熟知的，并且是指抗体模拟技术。术语"DARPin"(设计的锚蛋白重复蛋白)是本领域公知的，并且是指开发用于利用非抗体多肽的结合能力的抗体模拟DRP(设计的重复蛋白)技术。
术语"双抗体"指通过构建在VH和VL结构域之间具有短连接子(约5-10个残基)的scFv片段，从而实现V结构域的链间而非链内配对，产生二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段，而制备的小抗体片段。双特异性双抗体是两个"交叉"scFv片段的异二聚体，其中两个抗体的VH和VL结构域存在于不同的多肽链上。双抗体更充分地描述于例如EP0404097；Holliger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:6444-6448(1993)。
术语"Evasin"是本领域公知的，并且指一类趋化因子结合蛋白。
术语"fynomer"是本领域众所周知的，并且指属于抗体模拟物类别的蛋白。由于它们的高热稳定性和降低的免疫原性，它们是有吸引力的结合分子。
术语"knottin"(也可称为胱氨酸-knot抑制剂)是指包含含有三个二硫键的蛋白结构基序的抗体模拟物。
术语"Kunitz结构域肽"是指一种类型的抗体模拟物，并且是基于抑制蛋白酶功能的蛋白的活性结构域。
术语"纳米抗体"是本领域熟知的，并且是指衍生自抗体的治疗性蛋白，其含有天然存在的重链抗体的独特结构和功能特性。这些重链抗体含有单个可变结构域(VHH)和两个恒定结构域(CH2和CH3)。
术语"unibody"是本领域公知的，并且指缺少IgG4抗体铰链区的抗体片段。铰链区的缺失产生的分子基本上是传统IgG4抗体一半大小，并且具有IgG4抗体的单价结合区而不是二价结合区。
术语"versabody"是本领域众所周知的，并且是指另一种抗体模拟技术。它们是3-5kDa的小蛋白，具有＞15％的半胱氨酸，其形成高二硫键密度支架，替代传统蛋白所具有的疏水性核心。
如在scFv的上下文中使用的，术语"柔性多肽连接子"或"连接子"是指由单独或组合使用的氨基酸如甘氨酸和/或丝氨酸残基组成的肽连接子，以将重链可变区和轻链可变区连接在一起。在一个实施方案中，柔性多肽连接子是Gly/Ser连接子，并包含氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数。例如，N＝1，N＝2，N＝3，N＝4，N＝5，N＝6，N＝7，N＝8，N＝9和N＝10。在另一个实施方案中，柔性多肽连接子是Gly/Ser连接子，并包含氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数。例如，N＝1，N＝2，N＝3，N＝4，N＝5，N＝6，N＝7，N＝8，N＝9和N＝10。在一个实施方案中，柔性多肽连接子包括但不限于(Gly4Ser)4或(Gly4Ser)3。在另一个实施方案中，连接子包含(Gly2Ser)、(GlySer)或(Gly3Ser)的多个重复。WO2012/138475中描述的连接子也包括在本发明的范围内，其通过引用并入本文。
术语"重链"是指以其天然存在的构象存在于抗体分子中的两种类型多肽链中的较大者，且其通常决定抗体所属的类别。
术语"轻链"是指以其天然存在的构象存在于抗体分子中的两种类型多肽链中较小的一种。κ(K)和λ(λ)轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
术语"高变区"、"HVR"或"HV"在用于本文时指抗体可变结构域的序列上高度可变和/或形成结构上确定的环的区域。通常，抗体包含六个高变区；三个在VH中(H1，H2，H3)，并且三个在VL中(L1，L2，L3)。许多高变区描绘都可使用并且包括在本文中。Kabat互补决定区(CDR)是基于序列变异性的，并且是最常用的(Kabat等，1991)。Chothia是指结构环的位置(Chothia等，1987)。当使用Kabat编号惯例编号时，Chothia CDR-H1环的末端在H32和H34之间变化，这取决于环的长度(这是因为Kabat编号方案将插入置于H35A和H35B；如果35A和35B都不存在，则环在32处终止；如果35A存在，则环在33处终止；如果35A和35B都存在，则环在34处终止)。AbM高变区代表Kabat CDR和Chothia结构环之间的折衷，并且被OxfordMolecular的AbM抗体建模软件使用。"接触"高变区是基于对可获得的复杂晶体结构的分析。来自这些高变区中每一个的残基如下所述。来自这些高变区中每一个的残基如下所述。
Figure BDA0002497695580000261
术语"高变区"和"互补决定区"以及它们各自的缩写(HVR、HV、CDR)在本文中可互换使用。此外，以下术语对在本文中也可互换地使用：
"VH CDR1"和"HCDR1"；
"VH CDR2"和"HCDR2"；
"VH CDR3"和"HCDR3"；
"VL CDR1"和"LCDR1"；
"VL CDR2"和"LCDR2"；以及
"VL CDR3"和"LCDR3"。
高变区可以包含如下的"延伸的高变区"：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97(L3)，和VH中的26-35B(HI)、50-65、47-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。可变结构域残基根据Kabat等人(Kabat等人，1991)对这些定义中的每一个进行编号。
"框架"或"FR"残基是除本文定义的高变区残基以外的可变区残基。
术语"如Kabat中的可变结构域残基编号"或"如Kabat中的氨基酸位置编号"及其变体是指Kabat等人(Kabat等人，1991)中用于抗体编译的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用这种编号系统，实际的线性氨基酸序列可以含有更少或更多的氨基酸，其对应于可变结构域的FR或CDR的缩短或插入。例如，重链可变结构域可包含H2的残基52之后的单氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)和重链FR残基82之后的插入残基(例如根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。通过在抗体序列的同源区与"标准"Kabat编号序列比对，可以确定给定抗体的Kabat残基编号。
当提及可变结构域中的残基(大约轻链的残基1-107和重链的残基1-113)时，通常使用Kabat编号系统(例如，Kabat等人，1991)。当涉及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时，通常使用"EU编号系统"或"EU索引"(例如，Kabat等人报道的EU索引，见上文)。"Kabat中的EU索引"指人IgGl EU抗体的残基编号。除非本文另有说明，抗体可变区中的残基编号是指Kabat编号系统的残基编号。
术语"特异性结合"是指识别并结合样品中存在的同源结合配偶体(例如HLA-A2)蛋白的配体(例如人源化的抗HLA-A2抗体)，但该配体基本上不识别或结合样品中的其他分子。非特异性结合是指亲和力小于10-7M的结合，例如亲和力为10-6M、10-5M、10-4M等。
"特异性结合"目的抗原或表位的抗体是以足够的亲和力结合抗原或表位的抗体，所述亲和力与非特异性相互作用显著不同。特异性结合可以例如通过与对照分子的结合相比确定分子结合来测量。
术语"重组抗体"指使用重组DNA技术产生的抗体，例如由噬菌体或酵母表达系统表达的抗体。该术语还应该解释为指通过合成编码抗体的DNA分子而产生的抗体，并且该DNA分子表达抗体蛋白，或指明所述抗体的氨基酸序列，其中该DNA或氨基酸序列是使用本领域可获得的和公知的重组DNA或氨基酸序列技术获得的。
如本文所用的术语"单克隆抗体"指从基本上同质的抗体群获得的抗体，即包含在所述群的各个抗体是相同的，除了可能以微量存在的可能天然存在的突变。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原位点。此外，与包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点在于它们可以在不被其它抗体污染的情况下合成。修饰语"单克隆"不应被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，可用于本发明的单克隆抗体可通过首先由Kohler等人，Nature，256:495(1975)描述的杂交瘤方法制备，或可使用重组DNA方法在细菌、真核动物或植物细胞中制备(参见，例如，美国专利号4,816,567)。"单克隆抗体"也可以使用例如Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)和Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离。
术语"抗原"是指激发免疫应答的分子。这种免疫应答可涉及抗体产生或特异性免疫活性细胞的活化或两者。技术人员将理解，任何大分子，包括几乎所有的蛋白或肽，都可以作为抗原。此外，抗原可衍生自重组或基因组DNA。技术人员将理解，包含编码引发免疫应答的蛋白的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA因此编码本文所用的术语"抗原"。此外，本领域技术人员将理解，抗原不一定必然仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本发明包括但不限于使用多于一个基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以编码引发所需免疫应答的多肽。此外，技术人员将理解抗原根本不必由"基因"编码。显而易见的是，抗原可以产生、合成或可以来源于生物样品，或者可以是除多肽之外的大分子。这样的生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或具有其他生物组分的液体。
如本文所用，术语"亲和力"是指两种试剂可逆结合的平衡常数，并表示为解离常数(Kd)。亲和力可以比抗体对不相关氨基酸序列的亲和力高至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍或至少1000倍或更大。抗体对靶蛋白的亲和力可以是例如从约100纳摩尔(nM)至约0.1nM、从约100nM至约1皮摩尔(pM)、或从约100nM至约1飞摩尔(fM)或更大。如本文所用，术语"亲合力(avidity)"是指稀释后两种或更多种试剂的复合物对解离的抗性。术语"免疫反应性"、"优先结合"和"特异性结合"在本文中针对抗体及其片段可互换使用。如此术语在本文中使用的，本发明的抗HLA-A2抗体，包括人源化的抗HLA-A2抗体以及其片段，特异性结合HLA-A2。
术语"结合"是指两个分子之间的直接缔合，例如由于共价、静电、疏水和离子和/或氢键相互作用，包括相互作用如盐桥和水桥。非特异性结合是指亲和力小于10-7M的结合，例如亲和力为10-6M、10-5M、10-4M等。
如本文所用，术语"反应性"是指抗体与分子反应(即结合)的能力(例如，特异性结合分子)。当第一抗体与第二抗体相比对分子(例如HLA分子)表现出降低的结合性时，第一抗体与第二抗体相比对分子具有"更低的反应性"。用于容易地比较第一和第二抗体对一种或多种特定HLA分子的反应性的方法是已知的。本文实施例部分提供了一种示例性方法，其中使用
Figure BDA0002497695580000291
单抗原珠(
Figure BDA0002497695580000292
Single Antigen beads，One Lambda)来确定抗体与特定HLA分子反应(或结合)的能力。这种流式细胞术方法可用于高通量抗体反应性分析。
如本文所用，术语"铰链区"是指柔性多肽连接区(本文也称为"铰链"或"间隔区")，其提供结构柔性和与侧翼多肽区的间隔，并且可由天然或合成多肽组成。铰链区可以影响表达CAR的免疫细胞的效力(参见例如Watanabe等人(2016))。来源于免疫球蛋白(例如IgG1)的"铰链区"通常定义为从人IgG1的Glu216延伸到Pro230(Burton(1985)Molec.Immunol.,22:161-206)。通过将形成重链间二硫键(S--S)的第一个和最后一个半胱氨酸残基置于相同位置，可以将其它IgG同种型的铰链区与IgG1序列比对。铰链区可以是天然存在的或非天然存在的，包括但不限于如美国专利号5,677,425中所述的改变的铰链区。铰链区可以包含来源于与CH1结构域的抗体不同类别或亚类的抗体的完整铰链区。术语"铰链区"也可以包含源自CD8和其它受体的区域，其在提供柔性和间隔侧翼区中提供类似的功能。
如本文所用，术语"免疫细胞"通常包括源自骨髓中产生的造血干细胞(HSC)的白血细胞(白细胞)。"免疫细胞"包括例如淋巴细胞(T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞)和衍生自骨髓的细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞)。
"T细胞"包括表达CD3的所有类型的免疫细胞，包括T辅助细胞(CD4+细胞)、CD8+ T细胞(例如，细胞毒性CD8+ T细胞、调节性CD8+ T细胞)、调节性T细胞(Treg)、γ-δT细胞和双阴性T细胞。
"细胞毒性细胞"包括细胞毒性CD8+ T细胞、自然杀伤(NK)细胞和嗜中性粒细胞，这些细胞能够介导细胞毒性反应。
如本文所用，术语"调节性免疫细胞"是指以"调节性"方式起作用以抑制免疫系统的活化并由此维持免疫系统稳态和对自身抗原的耐受性的免疫细胞。"调节性免疫细胞"也可对非免疫细胞具有作用，其导致改善的临床状态，例如促进组织修复或再生。调节性免疫细胞可以包括但不限于调节性T细胞、CD4+调节性T细胞、CD8+调节性T细胞、调节性γδT细胞、调节性DN T细胞、调节性B细胞、调节性NK细胞、调节性巨噬细胞和调节性树突细胞。
如本说明书和权利要求书中所用的"调节性T淋巴细胞"、"调节性T细胞"、"T调节性细胞"、"Treg细胞"或"Treg"是同义的，并且意在具有其在本领域中使用的标准定义。Treg细胞是一种特化的T细胞亚群，其以"调节"方式起作用以抑制免疫系统的活化，从而维持免疫系统的稳态和对自身抗原的耐受性。Treg有时被称为抑制性T细胞。Treg细胞通常但不总是表征为叉头(forkhead)家族转录因子Foxp3(叉头盒p3)的表达。它们还可以表达CD4或CD8表面蛋白。它们通常也可表达CD25。如本说明书和权利要求书中所用，除非另有说明，Treg包括在胸腺中发育的"天然"Treg，通过在胸腺外发生的分化过程(例如，在组织或次级淋巴器官中，或在实验室环境中在确定的培养条件下)产生的诱导的/适应性/外周Treg，和使用重组DNA技术例如通过FOXP3的工程化表达产生的Treg。天然存在的Treg细胞(CD4+CD25+Foxp3+)的出现与胸腺中所有其它T细胞相似。相比之下，诱导的/适应性/外周Treg细胞(其包括CD4+CD25+Foxp3+Treg、Tr1细胞、Th3细胞和其它)在胸腺外产生。诱导Treg的一种方式是通过将效应T细胞暴露于IL-10或TGF-β。还可以通过将Foxp3基因转染或转导到混合的T细胞群体中，使T细胞转化为Treg细胞。引起Foxp3表达的T细胞采用Treg表型，并且这样的重组Treg在本文中也被定义为"Treg"。
如本文所用，术语"免疫效应细胞"是指处于能够发动特异性免疫应答的形式的免疫系统的细胞。
如本文所用，术语"免疫应答"包括T细胞介导的和/或B细胞介导的免疫应答。示例性的免疫应答包括T细胞应答，例如细胞因子产生和细胞毒性。此外，术语免疫应答包括间接受T细胞活化影响的免疫应答，例如抗体产生(体液应答)和细胞因子应答性细胞例如巨噬细胞的活化。参与免疫应答的免疫细胞包括淋巴细胞，例如B细胞和T细胞(CD4+、CD8+、Thl和Th2细胞)；抗原呈递细胞(例如，专职性抗原呈递细胞，如树突细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞、朗格汉斯细胞，和非专职性抗原呈递细胞，如角质形成细胞、内皮细胞、星形胶质细胞、成纤维细胞、少突胶质细胞)；自然杀伤细胞；骨髓细胞，例如巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞。
术语"排斥"是指移植的器官或组织不被受体的身体接受的状态。排斥是由于受体免疫系统攻击移植器官或组织而引起的。排斥可以在移植后数天至数周(急性)或在移植后数月至数年(慢性)发生。
本文所用的术语"移植物抗宿主病"或"GVHD"指接受来自遗传学上不同的人的移植组织后的医学并发症。捐献组织(移植物)中的免疫细胞将受体(宿主)识别为外来物。然后，移植的免疫细胞攻击宿主的体细胞。GVHD通常与干细胞移植相关；然而，该术语包括由其它形式的组织移植物产生的GVHD。GVHD也可在输血后发生。
如本文所用，术语"免疫学耐受"或"免疫耐受"是指对一定比例的受治疗受试者进行的方法，其中与未受治疗的受试者相比，a)特异性免疫应答水平降低(认为至少部分由抗原特异性效应T淋巴细胞、B淋巴细胞、抗体或其等价物介导)；b)特异性免疫应答的发作或进展延迟；或c)特异性免疫应答的发作或进展的风险降低。当与其它抗原相比，相对于某些抗原优先引起免疫学或免疫耐受时，发生"特异性"免疫学或免疫耐受。
如本文所用，术语"手术耐受性"是指在能够对包括感染在内的其它攻击作出反应的免疫活性宿主中，在至少1年内没有任何免疫抑制药物治疗的情况下，存在稳定的移植功能且缺乏组织学排斥(包括急性或慢性排斥)现象的临床情况。
如本文所用，术语"免疫适应"是指移植受体的一种状况，其中尽管受体中存在对器官或组织移植物特异的抗体，但器官或组织移植物仍正常发挥功能。
如本文所用，术语"干细胞"通常包括亚全能(pluripotent)或多能(multipotent)干细胞。"干细胞"包括，例如胚胎干细胞(ES)；间充质干细胞(MSC)；诱导亚全能干细胞(iPS)；和定向祖细胞(造血干细胞(HSC)；骨髓衍生细胞等)。
如本文所用，术语"治疗"等是指获得所需的药理学和/或生理学作用。该作用可以对部分或完全治愈疾病和/或由该疾病引起的副作用而言是治疗性的。本文所用的"治疗"涵盖哺乳动物例如人中疾病的任何治疗，并且包括缓解疾病，即引起疾病消退和/或改善疾病的一种或多种症状。
如本文所用，术语"预防"、"防止"等意指提供对疾病或疾病状态的预防性或保护性治疗。就完全或部分预防疾病或其症状而言，该作用可以是预防性的。如本文所用，"预防"涵盖对哺乳动物例如人的疾病的任何预防效果，并且包括：(a)预防所述疾病在可能易患所述疾病但尚未诊断为患有所述疾病的受试者中发生；和(b)抑制该疾病，即阻止其发展。
术语"患者"、"受试者"、"个体"、"宿主"等在本文中可互换使用，并且是指服从本文所述方法的任何动物或其细胞，无论是体外还是原位。术语"患者"、"受试者"、"个体"、"宿主"等旨在包括其中可以引发免疫应答的活生物体(例如哺乳动物)。"患者"、"受试者"、"个体"、"宿主"的实例包括鼠类(例如大鼠、小鼠)、兔类(例如兔)、非人灵长类、人、犬、猫、有蹄类动物(例如马、牛、绵羊、猪、山羊)等及其转基因物种。在某些非限制性实施方案中，患者、受试者、宿主或个体是人。
术语"有效量"或"治疗有效量"在本文中可互换使用，并且是指治疗剂的量，或多于一种治疗剂的组合量，其将引起研究者、兽医、医生或其他临床医师所寻求的组织、系统或受试者的生物学或医学反应。术语"治疗有效量"包括当给药时足以防止所治疗的病症或疾病的一种或多种体征或症状的发展或减轻至一定程度的治疗剂的量。治疗有效量将根据治疗剂、疾病及其严重性和待治疗的受试者的年龄、体重等而变化。
本文所用的术语"活化"是指T细胞(例如调节性T细胞)的状态，其已被充分刺激以诱导可检测的细胞应答。活化也可以与可检测的效应子功能(例如细胞因子产生或抑制活性)相关。术语"活化的"调节性T细胞尤其是指能够抑制免疫应答的调节性T细胞。
术语"嵌合抗原受体"或可选地"CAR"指包含以下的重组多肽构建体：包含抗原结合结构域的胞外结构域；跨膜结构域；和包含胞内信号传导结构域的胞质结构域。在一个实施方案中，CAR任选地包含铰链。术语"嵌合受体"或"嵌合抗原受体"或"CAR"可以特别指一种多肽或一组多肽，在最简单的实施方案中通常为两种，当在免疫细胞中时，其为细胞提供对靶配体的特异性和胞内信号产生。在一些实施方案中，所述一组多肽彼此邻接。在一些实施方案中，嵌合受体是包含该组多肽的嵌合融合蛋白。在一些实施方案中，该组多肽包括二聚化开关，其在二聚化分子存在时可以将多肽彼此偶联，例如可以将配体结合结构域偶联至胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，嵌合受体在嵌合受体融合蛋白的氨基末端(N-ter)包含任选的前导序列。在一个实施方案中，嵌合受体还包含在胞外配体结合结构域的N-末端的前导序列，其中在嵌合受体的细胞加工和定位到细胞膜的过程中，前导序列任选地从配体结合结构域切割。
术语"信号传导结构域"是指蛋白的功能部分，其通过在细胞内传递信息来起作用，以通过产生第二信使经由限定的信号传导途径调节细胞活性，或通过响应于此类信使而起效应物的作用。
术语"自体的"是指源自相同受试者的任何材料，所述材料随后将被再引入所述受试者。
术语"同种异体的"是指源自与引入材料的受试者具有相同物种的不同受试者的任何材料。当在一个或多个基因座的基因不相同时，两个或更多个受试者被称为彼此是同种异体的。在一些方面，来自相同物种的受试者的同种异体材料可能在遗传上充分不同从而抗原性地相互作用。术语"同种异体移植物"是指源自相同物种的不同受试者的移植物。
术语"异种的"是指源自不同物种的受试者的任何材料。术语"异种移植物"是指衍生自不同物种的受试者的移植物。
如本文所用，"指导材料"包括出版物、记录、图表或任何其它表达介质，其可用于传达本发明的组合物和方法的使用。本发明的试剂盒的指导材料可以例如附着于含有本发明的核酸、肽、细胞和/或组合物的容器，或与含有本发明的核酸、肽、细胞和/或组合物的容器一起运送。或者，指导材料可以与容器分开运输，目的是指导材料核酸、肽、细胞和/或组合物由接受者合作使用。
如本文所用，氨基酸残基/位置的"修饰"是指一级氨基酸序列与起始氨基酸序列相比的改变，其中所述改变由涉及所述氨基酸残基/位置的序列改变引起。例如，典型的修饰包括用另一氨基酸取代残基(或在所述位置上)(例如保守或非保守取代)，在所述残基/位置附近插入一个或多个(通常少于5或3个)氨基酸，和缺失所述残基/位置。"氨基酸取代"或其变体是指用不同的氨基酸残基取代预定(起始)氨基酸序列中的现有氨基酸残基。通常且优选地，与包含起始(或"野生型")氨基酸序列的多肽相比，修饰导致变体多肽的至少一种物理生化活性的改变。例如，在抗体的情况下，被改变的物理生化活性可以是对靶分子的结合亲和力、结合能力和/或结合效应。
术语"保守序列修饰"指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特性的氨基酸修饰。这种保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。修饰可以通过本领域已知的标准技术，例如定点诱变和PCR介导的诱变引入本发明的抗体或抗体片段。保守氨基酸取代是其中的氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代的取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中已经定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本发明的CAR内的一个或多个氨基酸残基可以用来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替换，并且可以使用本文所述的功能测定法测试改变的CAR。
术语"刺激"是指由刺激分子(例如TCR/CD3复合物)与其同源配体结合诱导的基本反应，从而介导信号转导事件，例如但不限于通过TCR/CD3复合物的信号转导。刺激可以介导某些分子的改变的表达，例如细胞因子和细胞表面蛋白的上调或下调，和/或细胞骨架结构的重组等。
术语"刺激分子"是指由T细胞表达的分子，其提供细胞质信号传导序列，该序列以刺激方式调节TCR复合物的主要活化，用于T细胞信号传导途径的至少某些方面。一方面，该初级信号是由例如TCR/CD3复合物与负载肽的MHC分子结合而起始，并且其导致T细胞应答的介导，包括但不限于增殖、活化、分化等。以刺激方式起作用的初级(primary)胞质信号传导序列(也称为"初级信号传导结构域")可以含有称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM的信号传导基序。
术语"抗原呈递细胞"或"APC"指免疫系统细胞，例如辅助细胞(例如B细胞、树突细胞、巨噬细胞、朗格汉斯细胞等)，其可以展示在其表面与主要组织相容性复合物(MHCs)复合的抗原，以便被某些淋巴细胞例如T细胞识别。T细胞可以使用它们的T细胞受体(TCR)识别这些复合物。抗原呈递细胞可以加工抗原以与MHC一起展示。本文所用的术语"抗原呈递细胞"或"APC"包括其中APC展示抗原的状态和其中APC不展示抗原的状态。在一些情况下，APC加工抗原并将它们呈递给T细胞。在其它情况下，T细胞可以在不存在抗原呈递时识别APC，其中TCR直接结合MHC蛋白。例如，在移植的情况下，APC可以通过表达外源MHC蛋白直接刺激T细胞。
如本文所用的术语"胞内信号传导结构域"是指CAR的胞内部分。胞内信号传导结构域产生促进含CAR的细胞例如CAR Treg细胞的免疫效应子功能的信号。例如，在CAR Treg细胞中的免疫效应子功能的实例可以包括抑制或下调其他免疫细胞的效应子功能。其它免疫细胞包括任何类型的白细胞，例如(但不限于)T细胞、B细胞、NK细胞。此外，Treg的免疫效应子功能可包括对非免疫细胞的作用，其导致改善的临床状态，例如促进组织修复或再生。
术语"ζ"或可选地"ζ链"或"CD3-ζ"定义为以GenBank登录号BAG36664.1提供的蛋白，或来自非人类物种(例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等效残基，并且"ζ刺激结构域"或"CD3-ζ刺激结构域"定义为来自ζ链胞质结构域的氨基酸残基，其功能上足以传递T细胞活化所需的起始信号。在一个方面，ζ的胞质结构域包含GenBank登录号BAG36664.1的残基52至164，或来自非人物种例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等的等价残基，它们是其功能直系同源物。
本文所用的术语"共刺激配体"包括抗原呈递细胞(例如APC、树突状细胞、B细胞等)上的分子，其特异性结合T细胞上的同源共刺激分子，从而提供信号，该信号除了由例如TCR/CD3复合物与负载肽的MHC分子结合所提供的主要信号之外，还介导T细胞应答，包括但不限于增殖、活化、分化等。共刺激配体可包括但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、诱导型共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、结合Toll配体受体的激动剂或抗体和特异性结合B7-H3的配体。共刺激配体还尤其包括与T细胞上存在的共刺激分子特异性结合的配体，包括抗体，所述共刺激分子例如，但不限于，MHC I类分子、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD27、CD28、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)(CD11A/CD18)、TNFR1(CD120a/TNFRSF1A)、TNFR2(CD120b/TNFRSF1B)、CTLA-4(CD152)、CD95、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、CD2、CD30、CD40、PD-1、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、ICAM-1、GITR、HVEM、SLAMF7、NKp80、CD160、IL2ra、IL6Ra、IL-7Ra、IL-13RA1/RA2、IL-33R(IL1RL1)、IL-10RA/RB、IL-4R、IL-5R(CSF2RB)、ARHR、BAFF受体、IL-21R、TGFbR1/2/3、共有γ链和特异性结合CD83的配体及其任意组合。
术语"共刺激分子"指T细胞上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，从而介导T细胞的共刺激应答，例如但不限于增殖。共刺激分子是除抗原受体或其配体之外的有助于有效免疫应答的细胞表面分子。共刺激分子可以由下列蛋白家族代表：TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)和活化NK细胞受体。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD27、CD28、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)(CD11A/CD18)、TNFR1(CD11a/CD18)、TNFR1(CD120a/TNFRSF1A)、TNFR2(CD120b/TNFRSF1B)、CTLA-4(CD152)、CD95、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、CD2、CD30、CD40、PD-1、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、ICAM-1、GITR、HVEM、SLAMF7、NKp80、CD160、IL2ra、IL6Ra、IL-7Ra、IL-13RA1/RA2、IL-33R(IL1RL1)、IL-10RA/RB、IL-4R、IL-5R(CSF2RB)、ARHR、BAFF受体、IL-21R、TGFbR1/2/3、共有γ链、特异性结合CD83的配体及其任意组合。
"共刺激胞内信号传导结构域"或"共刺激结构域"可以是共刺激分子的胞内部分。此类分子的实例包括MHC I类分子、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD27、CD28、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)(CD11a/CD18)、TNFR1(CD120a/TNFRSF1A)、TNFR2(CD120b/TNFRSF1B)、CTLA-4(CD152)、CD95、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、CD2、CD30、CD40、PD-1、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、ICAM-1、GITR、HVEM、SLAMF7、NKp80、CD160、IL2ra、IL6Ra、IL-7Ra、IL-13RA1/RA2、IL-33R(IL1RL1)、IL-10RA/RB、IL-4R、IL-5R(CSF2RB)、ARHR、BAFF受体、IL-21R、TGFbR1/2/3、共有γ链和特异性结合CD83的配体等。
本文所用的"共刺激信号"是指与初级信号如TCR/CD3连接组合导致T细胞增殖和/或关键分子的上调或下调的信号。
胞内信号传导结构域可以包含其所来源的分子的整个胞内部分或整个天然胞内信号传导结构域，或其功能片段。
"疾病"是动物的健康状态，其中动物不能保持稳态，并且其中如果疾病没有改善，那么动物的健康继续恶化。相反，动物中的"失调"是其中动物能够维持稳态但其中动物的健康状态不如没有失调时的健康状态有利的健康状态。在未治疗的情况下，失调不一定引起动物健康状态的进一步降低。
术语"编码"是指多核苷酸(例如基因、cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列的固有性质，以在生物过程中作为合成其它聚合物和大分子的模板，所述多核苷酸具有确定的核苷酸序列(例如rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列和由此产生的生物学性质。因此，如果对应于所述基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生蛋白，则该基因、cDNA或RNA编码蛋白。当编码基因或cDNA的蛋白或其它产物时，可以指编码链(与mRNA序列相同且通常在序列表中提供的核苷酸序列)和非编码链(用作基因转录或cDNA的模板)两者。
除非另有说明，编码氨基酸序列的核苷酸序列包括彼此是简并形式的并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白或RNA的核苷酸序列也可以包含内含子，其程度为编码蛋白的核苷酸序列在某些形式中可以含有内含子。
如本文所用，"移植物"是指被引入受试者的细胞、组织或器官。移植材料的来源可以是培养的细胞、来自另一受试者的细胞或来自同一受试者的细胞(例如，在体外培养细胞之后)。示例性的器官移植是肾、肝、心脏、肺和胰腺。示例性组织移植物是胰岛。示例性的细胞移植是同种异体造血干细胞移植。
术语"外源性"是指从生物体、细胞、组织或系统中引入或在生物体、细胞、组织或系统外产生的任何物质。
术语"表达"是指由启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
术语"表达载体"指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列有效地连接的表达控制序列。表达载体包含足够的顺式作用元件用于表达；用于表达的其它元件可由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有那些，包括粘粒、质粒(例如裸露的或包含在脂质体中的)和病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，其并入重组多核苷酸中。
术语"慢病毒"指逆转录病毒科的属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，因为能够感染非分裂细胞；它们可以将显著量的遗传信息传递到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因传递载体的最有效方法之一。慢病毒的实例包括但不限于HIV、SIV和FIV。
术语"慢病毒载体"指来源于慢病毒基因组的至少一部分的载体，尤其包括如Milone等人，Mol.Ther.17(8)：1453-1464(2009)中提供的自失活慢病毒载体。可用于临床的慢病毒载体的其它实例包括但不限于，例如，来自Oxford BioMedica的
Figure BDA0002497695580000381
基因递送技术、来自Leantigen的LENTIMAXTM载体系统等。非临床类型的慢病毒载体也是可获得的，并且是本领域技术人员已知的。
术语"同源的"或"同一性"是指两个聚合分子之间，例如两个核酸分子之间，如两个DNA分子或两个RNA分子之间，或两个多肽分子之间的亚单位序列同一性。当两个分子中的亚单位位置被相同的单体亚单位占据时；例如，如果两个DNA分子中的每一个中的位置被腺嘌呤占据，那么它们在该位置是同源的或相同的。两个序列之间的同源性是匹配或同源位置数量的正函数；例如，如果两个序列中一半(例如，长度为十个亚单位的聚合物中五个位置)的位置是同源的，则两个序列是50％同源的；如果90％的位置(例如10个中的9个)是匹配的或同源的，则两个序列是90％同源的。
非人(例如鼠)抗体的"人源化"形式是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、scFv、Fab'、F(ab')2或抗体的其它抗原结合子序列)，其含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列。人源化的抗体及其抗体片段大部分是人免疫球蛋白(受体抗体或抗体片段)，其中受体互补决定区(CDR)的残基被具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基所取代。在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基取代。此外，人源化的抗体/抗体片段可以包含既未在受体抗体中发现也未在引入的CDR或框架序列中发现的残基。这些修饰可以进一步细化和优化抗体或抗体片段的性能。一般而言，人源化的抗体或其抗体片段将包含基本上全部的至少一个且通常为两个的可变结构域，其中全部或基本上全部的CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区，并且FR区的全部或重要部分是人免疫球蛋白序列的FR区。人源化的抗体或抗体片段也可包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区。进一步的细节，参见Jones等人，Nature，321:522-525，1986；Reichmann等人，Nature，332:323-329，1988；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2:593-596，1992。
"人"免疫球蛋白、抗体或抗体片段指免疫球蛋白，例如抗体或抗体片段，其中整个分子是人源的或由与人形式的抗体或免疫球蛋白相同的氨基酸序列组成。
术语"分离的"是指从天然状态改变或去除。例如，在活体动物中天然存在的核酸或肽不是"分离的"，但与其天然状态的共存物质部分或完全分离的相同核酸或肽是"分离的"。分离的核酸或肽可以以基本纯化的形式存在，或可以存在于非天然环境中，例如宿主细胞。"分离的抗体"是已经从其天然环境的组分中鉴定和分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染成分是干扰抗体治疗用途的物质，并且可以包括酶、激素和其它蛋白或非蛋白溶质。
在本发明的上下文中，使用下列常见核酸碱基的缩写。"A"指腺苷，"C"指胞嘧啶，"G"指鸟苷，"T"指胸苷，和"U"指尿苷。
术语"有效地连接"是指调节序列和异源核酸序列之间的功能性连接，导致后者表达。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列有效地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列有效地连接。有效地连接的DNA序列可以彼此邻接，并且例如，在需要连接两个蛋白编码区的情况下，位于相同的阅读框中。
术语免疫原性组合物的"肠胃外"施用包括例如皮下(s.c.)、皮内、结节内、髓内、腹膜内、静脉内(i.v.)、肌内(i.m.)或胸骨内注射、肿瘤内或输注技术。
术语"核酸"或"多核苷酸"在本文中可互换使用，是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。因此，该术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交体或包含嘌呤和嘧啶碱基或其它天然、化学或生物化学修饰的、非天然或衍生的核苷酸碱基的聚合物。因此，除非特别限定，该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有与参考核酸相似的结合性质，并且以与天然存在的核苷酸相似的方式代谢。除非另有说明，特定核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列以及明确指出的序列。具体地，简并密码子取代可以通过产生其中一个或多个选择的(或所有)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Rossolini等人,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。
术语"肽"、"多肽"和"蛋白"可互换使用，并且是指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可以构成蛋白或肽的序列的氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括任何包含两个或多个通过肽键彼此连接的氨基酸的肽或蛋白。如本文所用，该术语指短链，其在本领域中通常也被称为例如肽、寡肽和寡聚体，和指长链，其在本领域中通常被称为蛋白，其存在许多类型。"多肽"包括例如生物活性片段、基本同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽或其组合。
术语"启动子/调控序列"是指与启动子/调控序列有效地连接的基因产物表达所需的核酸序列。在一些情况下，该序列可以是核心启动子序列，而在其它情况下，该序列也可以包含增强子序列和基因产物表达所需的其它调控元件。启动子/调控序列可以是例如以组织特异性方式表达基因产物的序列。
术语"组成型"启动子是指当与编码或指定基因产物的多核苷酸有效地连接时，在细胞的大多数或所有生理条件下，在细胞中引起基因产物产生的核苷酸序列。
术语"诱导型"启动子是指当与编码或指定基因产物的多核苷酸有效地连接时，基本上仅当细胞中存在对应于启动子的诱导物时，才引起细胞中产生基因产物的核苷酸序列。
如本文所用，"瞬时"是指非整合转基因表达数小时、数天或数周的时间，其中表达时间小于基因整合到基因组中或包含在宿主细胞中的稳定质粒复制子内时表达的时间。
术语"基本上纯化的"细胞指基本上不含其它细胞类型的细胞。基本纯化的细胞也指已经与其它细胞类型分离的细胞，所述细胞通常以其天然存在的状态与所述其它细胞类型相关联。在一些情况下，基本上纯化的细胞群是指同质细胞群。在其它情况下，该术语简单地指已经与在其天然状态下与其天然关联的细胞分离的细胞。在一些方面，体外培养细胞。在其它方面，细胞不在体外培养。
术语"转染的"或"转化的"或"转导的"是指将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。"转染的"或"转化的"或"转导的"细胞是已经转染、转化或转导有外源核酸的细胞。细胞包括原代受试者细胞及其后代。
本发明的各个方面可以以范围的形式在整个本公开中呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应当被解释为对本发明范围的硬性限制。因此，范围的描述应被认为具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，对范围如1至6的描述应被认为具体公开了子范围如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单个数值，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。作为另一个实例，例如95-99％同一性的范围包括具有95％、96％、97％、98％或99％同一性的某物，并且包括子范围例如96-99％、96-98％、96-97％、97-99％、97-98％和98-99％同一性。这与范围的宽度无关。
III.抗HLA-A2抗体
一方面，本发明提供了抗HLA-A2抗体。示例性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、嵌合抗体、人抗体、人源化的抗体及其抗原结合片段。
在一个实施方案中，本发明提供了人源化的抗HLA-A2抗体。本文提供的人源化的抗HLA-A2抗体特异性结合HLA-A2。在一个实施方案中，本文提供的人源化的抗HLA-A2抗体特异性结合HLA-A*02:01。如本领域技术人员所理解的，抗体结合HLA-A2的能力可以通过使用本领域已知的技术来检测。例如，抗体与HLA-A2的结合可通过使用本文所举例的HLA-A2四聚体来检测。在一个实施方案中，本文提供的人源化的抗HLA-A2抗体与包含以下的抗体竞争结合HLA-A2：具有SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)；具有SEQID NO：185的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)；具有SEQ ID NO：187氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)；具有SEQ ID NO：188的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)；具有SEQ ID NO：189的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)；和具有SEQ ID NO：190的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)。在一个实施方案中，本文提供的人源化的抗HLA-A2抗体与包含以下的抗体结合相同的HLA-A2表位：具有SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)；具有SEQ ID NO：185的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)；具有SEQ ID NO：187氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)；具有SEQ ID NO：188的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)；具有SEQ ID NO：189的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)；和具有SEQ ID NO：190的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)。在一个实施方案中，本文提供的人源化的抗HLA-A2抗体与BB7.2抗体竞争结合HLA-A2。
在一个实施方案中，本文提供的人源化的抗HLA-A2抗体与BB7.2抗体结合相同的HLA-A2表位。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的人源化的抗HLA-A2抗体对选自HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68中的一种或多种的至少一种HLA-A亚型的反应性较低。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的人源化的抗HLA-A2抗体对选自HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68中的两种或更多种的至少一种HLA-A亚型的反应性较低。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的人源化的抗HLA-A2抗体对选自HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68中的三种或更多种的至少一种HLA-A亚型的反应性较低。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的人源化的抗HLA-A2抗体对选自HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68中的四种或更多种的至少一种HLA-A亚型的反应性较低。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的人源化的抗HLA-A2抗体对选自HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68中的五种或更多种的至少一种HLA-A亚型的反应性较低。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的人源化的抗HLA-A2抗体对选自HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68中的六种或更多种的至少一种HLA-A亚型的反应性较低。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的人源化的抗HLA-A2抗体对选自HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68中的七种或更多种的至少一种HLA-A亚型的反应性较低。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的人源化的抗HLA-A2抗体对选自HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68中的每一种的至少一种HLA-A亚型的反应性较低。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的人源化的抗HLA-A2抗体对选自HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30中的一种或多种的至少一种HLA-A亚型的反应性较低。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的人源化的抗HLA-A2抗体对选自HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30中的两种或更多种的至少一种HLA-A亚型的反应性较低。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的人源化的抗HLA-A2抗体对选自HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30中的每一种的至少一种HLA-A亚型的反应性较低。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的人源化的抗HLA-A2抗体对HLA-A*03:01、HLA-A*25:01、HLA-A*29:02、HLA-A*30:01、HLA-A*31:01、HLA-A*33:01、HLA-A*36:01、HLA-A*68:01中的至少一种的反应性较低。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的人源化的抗HLA-A2抗体对HLA-A*03:01、HLA-A*25:01、HLA-A*29:02、HLA-A*30:01、HLA-A*31:01、HLA-A*33:01、HLA-A*36:01、HLA-A*68:01中的至少两种的反应性较低。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的人源化的抗HLA-A2抗体对HLA-A*03:01、HLA-A*25:01、HLA-A*29:02、HLA-A*30:01、HLA-A*31:01、HLA-A*33:01、HLA-A*36:01、HLA-A*68:01中的至少三种的反应性较低。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的人源化的抗HLA-A2抗体对HLA-A*03:01、HLA-A*25:01、HLA-A*29:02、HLA-A*30:01、HLA-A*31:01、HLA-A*33:01、HLA-A*36:01、HLA-A*68:01中的至少四种的反应性较低。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的人源化的抗HLA-A2抗体对HLA-A*03:01、HLA-A*25:01、HLA-A*29:02、HLA-A*30:01、HLA-A*31:01、HLA-A*33:01、HLA-A*36:01、HLA-A*68:01中的至少五种的反应性较低。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的人源化的抗HLA-A2抗体对HLA-A*03:01、HLA-A*25:01、HLA-A*29:02、HLA-A*30:01、HLA-A*31:01、HLA-A*33:01、HLA-A*36:01、HLA-A*68:01中的至少六种的反应性较低。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的人源化的抗HLA-A2抗体对HLA-A*03:01、HLA-A*25:01、HLA-A*29:02、HLA-A*30:01、HLA-A*31:01、HLA-A*33:01、HLA-A*36:01、HLA-A*68:01中的至少七种的反应性较低。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的人源化的抗HLA-A2抗体对HLA-A*03:01、HLA-A*25:01、HLA-A*29:02、HLA-A*30:01、HLA-A*31:01、HLA-A*33:01、HLA-A*36:01、和HLA-A*68:01的反应性较低。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的人源化的抗HLA-A2抗体对HLA-A*25:01、HLA-A*29:02和HLA-A*30:01中的至少一种的反应性较低。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的人源化的抗HLA-A2抗体对HLA-A*25:01、HLA-A*29:02和HLA-A*30:01中的至少两种的反应性较低。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的人源化的抗HLA-A2抗体对HLA-A*25:01、HLA-A*29:02和HLA-A*30:01的反应性较低。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的人源化的抗HLA-A2抗体对HLA-A*25:01的反应性较低。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的人源化的抗HLA-A2抗体对HLA-A*29:02的反应性较低。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的人源化的抗HLA-A2抗体对HLA-A*30:01的反应性较低。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的人源化的抗HLA-A2抗体对HLA-A*03:01的反应性较低。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的人源化的抗HLA-A2抗体对HLA-A*31:01的反应性较低。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的人源化的抗HLA-A2抗体对HLA-A*33:01的反应性较低。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的人源化的抗HLA-A2抗体对HLA-A*36:01的反应性较低。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的人源化的抗HLA-A2抗体对HLA-A*68:01的反应性较低。BB7.2抗体可以从BB7.2杂交瘤(ATCC保藏号HB-82)中分离得到。
用于确定人源化的抗HLA-A2抗体对HLA-A亚型的反应性的技术是本领域普通技术人员已知的。例如，人源化的抗HLA-A2抗体对HLA-A亚型的反应性可以通过单抗原珠测定来确定。这种单抗原珠测定是可商购的(例如FlowPRA单抗原抗体；ONE LAMBDA)。
在一个实施方案中，当在测试A的条件下测量时，与BB7.2抗体相比，例如与BB7.2scFv相比，本文提供的人源化的抗HLA-A2抗体对选自HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68及其任意组合中的一种或多种的至少一种HLA-A亚型的反应性较低。例如，在一些实施方案中，当在测试A的条件下测量时，与BB7.2抗体相比，例如与BB7.2 scFv相比，本文提供的人源化的抗HLA-A2抗体对选自HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30及其任意组合中的一种或多种的至少一种HLA-A亚型的反应性较低。
测试A：
将表达包含人源化的抗HLA-A2抗体或BB7.2抗体例如BB7.2 scFv(mA2 CAR)的CAR的0.25.106个T细胞与FlowPRA单抗原抗体珠板(FL1HD01、FL1HD02、FL1HD03、FL1HD04、FL1HD06和FL1HD08，One Lambda)和可固定的活性染料(FVD，ThermoFisher，65-0865-14，eBioscience)在室温下孵育30分钟。洗涤样品，用0.5％甲醛固定，并通过流式细胞术分析。每个样品获得两百个阴性对照珠。单独的珠子用作阴性对照。为了分析，首先使用可固定的活性染料消除死细胞。然后在排除死细胞和成对物(doublet)后门控单个抗原珠。然后，通过它们各自的PE强度峰确定每HLA的珠数量。通过将每个HLA峰中目的珠的数量乘以200，除以样品中阴性珠的数量，将数据标准化。对于每个HLA峰，通过对照样品中的珠数量减去CAR-Treg中的珠数量，然后除以非CAR表达对照中的平均珠数量，乘以100，确定与对照(非CAR表达细胞)相比时CAR Treg的相对结合百分比。
在一个实施方案中，本发明的人源化的抗HLA-A2抗体对选自包括HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68的组中的至少一种HLA-A亚型的反应性在统计学上劣于BB7.2抗体，例如，当在测试A的条件下测量时。
在一个实施方案中，本发明的抗HLA-A2抗体对选自包括HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30的组中的至少一种HLA-A亚型的反应性在统计学上劣于BB7.2抗体，例如，当在测试A的条件下测量时。
在一个实施方案中，术语"统计学上劣"是指对本发明的抗HLA-A2抗体所测定的反应性(即，例如，在测试A的条件下的相对结合)劣于对BB7.2抗体所测定的反应性，p值至多约0.05，优选至多约0.01，更优选至多约0.005，甚至更优选至多约0.001，特别是当通过双向ANOVA、Dunnett后检验分析时。
在一个实施方案中，本发明的抗HLA-A2抗体对选自包括HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68的组中的至少一种HLA-A亚型具有劣于BB7.2抗体的反应性。在一些实施方案中，当在测试A的条件下测量时，这种抗HLA-A2抗体对选自包括HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68的组中的至少一种HLA-A亚型的相对结合劣于BB7.2抗体。在某些方面，针对此类抗HLA-A2抗体所测量的相对结合是针对BB7.2抗体所测量的相对结合的至多约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或更少。
在一个实施方案中，本发明的抗HLA-A2抗体对选自包括HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30的组的至少一种HLA-A亚型具有劣于BB7.2抗体的反应性。在一些实施方案中，当在测试A的条件下测量时，这种抗HLA-A2抗体对选自包括HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30的组的至少一种HLA-A亚型具有劣于BB7.2抗体的相对结合。在某些方面，针对此类抗HLA-A2抗体所测量的相对结合是针对BB7.2抗体所测量的相对结合的至多约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或更少。
此外，本文提供的具有抗原结合活性的人源化的抗HLA-A2抗体能够构成嵌合抗原受体(CAR)的抗原结合结构域，其中这样的CAR能够在人细胞中表达，使得CAR特异性结合HLA-A2。在一个实施方案中，CAR特异性地结合至HLA-A*02:01。如本领域技术人员将理解的，CAR结合HLA-A2的能力可以通过使用本领域已知的技术来检测。例如，CAR与HLA-A2的结合可通过使用如本文所示例的HLA-A2四聚体来检测。在一个实施方案中，人细胞是免疫细胞。在一个实施方案中，免疫细胞是调节性免疫细胞。在一个实施方案中，免疫细胞是调节性T细胞(Treg)。在一个实施方案中，免疫细胞是T细胞。在一个实施方案中，T细胞是Treg。此外，本文提供的具有抗原结合活性的人源化的抗HLA-A2抗体能够构成嵌合抗原受体(CAR)的抗原结合结构域，其中此类CAR能够在调节性T细胞(Treg)中表达，使得CAR特异性结合HLA-A2。在一个实施方案中，CAR特异性地结合至HLA-A*02:01。在一个实施方案中，Treg是人Treg。
在一个实施方案中，人源化的抗HLA-A2抗体能够构成CAR的抗原结合结构域，其中这种CAR能够在免疫细胞中表达，使得免疫细胞被HLA-A2活化。在一个实施方案中，免疫细胞被HLA-A*02:01活化。在一个实施方案中，免疫细胞是调节性免疫细胞。在一个实施方案中，免疫细胞是调节性T细胞(Treg)。在一个实施方案中，免疫细胞是T细胞。在一个实施方案中，T细胞是Treg。在一个实施方案中，免疫细胞是人免疫细胞。在一个实施方案中，调节性免疫细胞是人调节性免疫细胞。在一个实施方案中，T细胞是人T细胞。在一个实施方案中，Treg是人Treg。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含选自下组的氨基酸序列：SYHIQ(SEQ ID NO：1)和GYTFTSY(SEQ ID NO：2)。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含选自SEQ ID NO：1-2的互补决定区1(VH CDR1)。在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含含有SEQ ID NO：1所示的VH CDR1的重链可变区。在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含含有SEQ ID NO：2所示的VH CDR1的重链可变区。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含选自下组的氨基酸序列：YPGDGS(SEQ ID NO：4)和WIYPGDGSTX10YX12X13KFX16G(SEQ ID NO：10)，其中在SEQ ID NO：10中，10位(X10)的氨基酸是Q或K，12位(X12)的氨基酸是N或S，13位(X13)的氨基酸是E或Q，并且16位(X16)的氨基酸是K或Q。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含氨基酸序列WIYPGDGSTX10YX12X13KFX16G(SEQ ID NO：10)，其中10位(X10)的氨基酸是Q或K，12位(X12)的氨基酸是N或S，13位(X13)的氨基酸是E或Q，并且16位(X16)的氨基酸是K或Q。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含互补决定区2(VH CDR2)，该互补决定区包含选自下组的氨基酸序列：YPGDGS(SEQ ID NO：4)和WIYPGDGSTX10YX12X13KFX16G(SEQ ID NO：10)，其中在SEQ ID NO：10中，10位(X10)的氨基酸是Q或K，12位(X12)的氨基酸是N或S，13位(X13)的氨基酸是E或Q，并且16位(X16)的氨基酸是K或Q。在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含含有氨基酸序列WIYPGDGSTX10YX12X13KFX16G(SEQ ID NO：10)的互补决定区2(VH CDR2)，其中10位(X10)的氨基酸是Q或K，12位(X12)的氨基酸是N或S，13位(X13)的氨基酸是E或Q，并且16位(X16)的氨基酸是K或Q。在一个实施方案中，重链可变区包含含有SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列的VH CDR2，其中第10位的氨基酸是Q或K，12位的氨基酸是S，第13位的氨基酸是Q，并且第16位的氨基酸是Q。在一个实施方案中，重链可变区包含含有SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列的VH CDR2，其中第10位的氨基酸是K，12位的氨基酸是N或S，第13位的氨基酸是Q，并且第16位的氨基酸是Q。在一个实施方案中，重链可变区包含含有SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列的VH CDR2，其中第10位的氨基酸是K，12位的氨基酸是S，第13位的氨基酸是E或Q，并且第16位的氨基酸是Q。在一个实施方案中，重链可变区包含含有SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列的VH CDR2，其中第10位的氨基酸是K，12位的氨基酸是S，第13位的氨基酸是Q，并且第16位的氨基酸是K或Q。在一个实施方案中，重链可变区包含含有SEQ IDNO：10中所示的氨基酸序列的VH CDR2，其中第10位的氨基酸是Q或K，12位的氨基酸是N或S，第13位的氨基酸是Q，并且第16位的氨基酸是Q。在一个实施方案中，重链可变区包含含有SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列的VH CDR2，其中第10位的氨基酸是Q或K，12位的氨基酸是S，第13位的氨基酸是E或Q，并且第16位的氨基酸是Q。在一个实施方案中，重链可变区包含含有SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列的VH CDR2，其中第10位的氨基酸是Q或K，12位的氨基酸是S，第13位的氨基酸是Q，并且第16位的氨基酸是K或Q。在一个实施方案中，重链可变区包含含有SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列的VH CDR2，其中第10位的氨基酸是K，12位的氨基酸是N或S，第13位的氨基酸是E或Q，并且第16位的氨基酸是Q。在一个实施方案中，重链可变区包含含有SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列的VH CDR2，其中第10位的氨基酸是K，12位的氨基酸是N或S，第13位的氨基酸是Q，并且第16位的氨基酸是K或Q。在一个实施方案中，重链可变区包含含有SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列的VH CDR2，其中第10位的氨基酸是K，12位的氨基酸是S，第13位的氨基酸是E或Q，并且第16位的氨基酸是K或Q。在一个实施方案中，重链可变区包含含有SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列的VH CDR2，其中第10位的氨基酸是Q或K，12位的氨基酸是N或S，第13位的氨基酸是E或Q，并且第16位的氨基酸是Q。在一个实施方案中，重链可变区包含含有SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列的VHCDR2，其中第10位的氨基酸是Q或K，12位的氨基酸是N或S，第13位的氨基酸是Q，并且第16位的氨基酸是K或Q。在一个实施方案中，重链可变区包含含有SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列的VH CDR2，其中第10位的氨基酸是Q或K，12位的氨基酸是S，第13位的氨基酸是E或Q，并且第16位的氨基酸是K或Q。在一个实施方案中，重链可变区包含含有SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列的VH CDR2，其中第10位的氨基酸是K，12位的氨基酸是N或S，第13位的氨基酸是E或Q，并且第16位的氨基酸是K或Q。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含选自下组的氨基酸序列：WIYPGDGSTQYNEKFKG(SEQ ID NO:3)、YPGDGS(SEQ ID NO:4)和WIYPGDGSTKYSQKFQG(SEQ ID NO:5)。在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含选自下组的氨基酸序列：WIYPGDGSTQYNEKFKG(SEQ ID NO:3)和YPGDGS(SEQ ID NO:4)。在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含选自下组的氨基酸序列：YPGDGS(SEQ ID NO:4)和WIYPGDGSTKYSQKFQG(SEQ ID NO:5)。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含含有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的重链可变区。在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含含有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的重链可变区。在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含含有SEQID NO：5所示氨基酸序列的重链可变区。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含选自SEQ ID NO：3-5的互补决定区2(VH CDR2)。在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含选自SEQ ID NO：3-4的互补决定区2(VH CDR2)。在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含选自SEQID NO：4-5的互补决定区2(VH CDR2)。在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含含有SEQ ID NO：5所示的互补决定区2(VH CDR2)的重链可变区。在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含含有SEQ ID NO：3所示的VH CDR2的重链可变区。在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含含有SEQ ID NO：4所示的VH CDR2的重链可变区。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含含有氨基酸序列EGTYYAMDY(SEQ ID NO：6)的重链可变区。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含含有SEQ ID NO：6所示的互补决定区3(VH CDR3)的重链可变区。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含含有至少一个以下CDR的重链可变区：
SEQ ID NO：1所示的VH CDR1；或
SEQ ID NO：10所示的VH CDR2，其中10位的氨基酸(X10)是Q或K，12位的氨基酸(X12)是N或S，13位的氨基酸(X13)是E或Q，并且16位的氨基酸(X16)是K或Q；或
SEQ ID NO：6所示的VH CDR3。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含含有至少一个以下CDR的重链可变区：
SEQ ID NO：1所示的VH CDR1；或
SEQ ID NO：3所示的VH CDR2；或
SEQ ID NO：6所示的VH CDR3。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含含有至少一个以下CDR的重链可变区：
SEQ ID NO：1所示的VH CDR1；或
SEQ ID NO：5所示的VH CDR2；或
SEQ ID NO：6所示的VH CDR3。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含一个SEQ ID NO：1所示的VH CDR1；一个SEQ ID NO：10所示的VH CDR2，其中第10位的氨基酸(X10)为Q或K，12位的氨基酸(X12)为N或S，第13位的氨基酸(X13)为E或Q，第16位的氨基酸(X16)为K或Q；和一个SEQ ID NO：6所示的VH CDR3。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含一个SEQ ID NO：1所示的VH CDR1；一个SEQ ID NO：3所示的VH CDR2；和一个SEQ ID NO：6所示的VH CDR3。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含一个SEQ ID NO：1所示的VH CDR1；一个SEQ ID NO：5所示的VH CDR2；和一个SEQ ID NO：6所示的VH CDR3。
根据本发明，重链的CDR1、2或3中的任一个可表征为具有的氨基酸序列与相应SEQID NO：1、3、5、6和10中所列的CDR的特定组具有至少约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含含有至少一个以下CDR的重链可变区：
SEQ ID NO：2所示的VH CDR1；或
SEQ ID NO：4所示的VH CDR2；或
SEQ ID NO：6所示的VH CDR3。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含一个SEQ ID NO：2所示的VH CDR1；一个SEQ ID NO：4所示的VH CDR2；和一个SEQ ID NO：6所示的VH CDR3。
根据本发明，重链的CDR1、2或3中的任一个可表征为具有的氨基酸序列与相应SEQID NO：2、4和6中所列的CDR的特定组具有至少约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含含有氨基酸序列RSSQSIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO：7)的轻链可变区。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含含有SEQ ID NO：7所示的互补决定区1(VL CDR1)的轻链可变区。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含含有氨基酸序列KVSNRFS(SEQID NO：8)的轻链可变区。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含含有SEQ ID NO：8所示的互补决定区2(VL CDR2)的轻链可变区。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含含有氨基酸序列FQGSHVPRT(SEQ ID NO：9)的轻链可变区。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含含有SEQ ID NO：9所示的互补决定区3(VL CDR3)的轻链可变区。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含含有至少一个以下CDR的轻链可变区：
SEQ ID NO：7所示的VL CDR1；或
SEQ ID NO：8所示的VL CDR2；或
SEQ ID NO：9所示的VL CDR3。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含一个轻链可变区，该轻链可变区包含一个SEQ ID NO：7所示的VL CDR1；一个SEQ ID NO：8所示的VL CDR2；和一个SEQ IDNO：9所示的VL CDR3。
根据本发明，轻链的CDR1、2或3中的任一个可表征为具有的氨基酸序列与相应SEQID NO：7、8和9中所列的CDR的特定组具有至少约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含含有选自下组的氨基酸序列的框架区1(VH FR1)：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS(SEQ IDNO:11)和QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT(SEQ ID NO:12)。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含含有氨基酸序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS(SEQ ID NO:11)的框架区1(VH FR1)。在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含含有与SEQID NO：11具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的框架区1(VH FR1)。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含含有氨基酸序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT(SEQ ID NO:12)的框架区1(VHFR1)。在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含含有与SEQ ID NO：12具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的框架区1(VHFR1)。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含含有选自下组的氨基酸序列的框架区2(VH FR2)：
WVRQAPGQX9LEWMGX15(SEQ ID NO:13)，
WVRQAPGQX9LEWMGX15WI(SEQ ID NO:17)，
HIQWVRQAPGQX12LEWMGX18WI(SEQ ID NO:21)，和
HIQWVRQAPGQX12LEWMGX18(SEQ ID NO:25)，其中：
在SEQ ID NO：13中，X9是R或G，并且X15是I或不存在；
在SEQ ID NO：17中，X9是R或G，并且X15是I或不存在；
在SEQ ID NO：21中，X12是R或G，并且X18是I或不存在；以及
在SEQ ID NO：25中，X12是R或G，并且X18是I或不存在。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含含有氨基酸序列WVRQAPGQX9LEWMGX15(SEQ ID NO:13)的框架区2(VH FR2)，其中9位(X9)的氨基酸是R或G，并且15位(X15)的氨基酸是I或不存在。
在一个实施方案中，重链可变区包含含有SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列的框架区2(VH FR2)，其中9位的氨基酸是R或G，并且15位的氨基酸不存在。
在一个实施方案中，重链可变区包含含有SEQ ID NO：14、15或16中所示的氨基酸序列的框架区2(VH FR2)。在一个实施方案中，重链可变区包含框架区2(VH FR2)，其包含与SEQ ID NO：14、15或16具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含含有氨基酸序列HIQWVRQAPGQX12LEWMGX18(SEQ ID NO:25)的框架区2(VH FR2)，其中12位(X12)的氨基酸是R或G，并且18位(X18)的氨基酸是I或不存在。
在一个实施方案中，重链可变区包含含有SEQ ID NO：25中所示的氨基酸序列的框架区2(VH FR2)，其中12位的氨基酸是R或G，并且18位的氨基酸不存在。
在一个实施方案中，重链可变区包含含有SEQ ID NO：26、27或28中所示的氨基酸序列的框架区2(VH FR2)。在一个实施方案中，重链可变区包含框架区2(VH FR2)，其包含与SEQ ID NO：26、27或28具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含框架区2(VH FR2)，该框架区2包含氨基酸序列WVRQAPGQX9LEWMGX15WI(SEQ ID NO:17)，其中9位(X9)的氨基酸是R或G，且15位(X15)的氨基酸是I或不存在。
在一个实施方案中，重链可变区包含框架区2(VH FR2)，其包含SEQ ID NO：17中所示的氨基酸序列，其中9位的氨基酸是R或G，并且15位的氨基酸不存在。
在一个实施方案中，重链可变区包含框架区2(VH FR2)，其包含SEQ ID NO：18、19或20中所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，重链可变区包含框架区2(VH FR2)，其包含与SEQ ID NO：18、19或20具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含框架区2(VH FR2)，该框架区2包含氨基酸序列HIQWVRQAPGQX12LEWMGX18WI(SEQ ID NO:21)，其中12位的氨基酸(X12)为R或G，且18位的氨基酸(X18)为I或不存在。
在一个实施方案中，重链可变区包含框架区2(VH FR2)，其包含SEQ ID NO：21中所示的氨基酸序列，其中12位的氨基酸是R或G，并且18位的氨基酸不存在。
在一个实施方案中，重链可变区包含框架区2(VH FR2)，其包含SEQ ID NO：22、23或24中所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，重链可变区包含框架区2(VH FR2)，其包含与SEQ ID NO：22、23或24具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含框架区3(VH FR3)，该框架区包含选自下组的氨基酸序列：
X1VTX4TX6DTSX10STAYMX16LSX19LRSX23DX25AVYYCAR(SEQ ID NO:29)，
TX2YX4X5KFX8GX10VTX13TX15DTSX19STAYMX25LSX28LRSX32DX34AVYYCAR(SEQ ID NO:35)，
TQYNEKFKGX10VTX13TX15DTSX19STAYMX25LSX28LRSX32DX34AVYYCAR(SEQ ID NO:36)，和
TKYSQKFQGX10VTX13TX15DTSX19STAYMX25LSX28LRSX32DX34AVYYCAR(SEQ ID NO:37)，其中
在SEQ ID NO:29中，X1是R或不存在，X4是I或M，X6是R或A，X10是A、T或I，X16是E或L，X19是S或R，X23是E或D，并且X25是T或M；
在SEQ ID NO:35中，X2是Q或K，X4是N或S，X5是E或Q，X8是K或Q，X10是R或不存在，X13是I或M，X15是R或A，X19是A、T或I，X25是E或L，X28是S或R，X32是E或D，并且X34是T或M；
在SEQ ID NO:36中，X10是R或不存在，X13是I或M，X15是R或A，X19是A、T或I，X25是E或L，X28是S或R，X32是E或D，并且X34是T或M；并且
在SEQ ID NO:37中，X10是R或不存在，X13是I或M，X15是R或A，X19是A、T或I，X25是E或L，X28是S或R，X32是E或D，并且X34是T或M。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含框架区3(VH FR3)，该框架区包含氨基酸序列X1VTX4TX6DTSX10STAYMX16LSX19LRSX23DX25AVYYCAR(SEQ ID NO:29)，其中1位的氨基酸(X1)是R或不存在，4位的氨基酸(X4)是I或M，6位的氨基酸(X6)是R或A，10位的氨基酸(X10)是A、T或I，16位的氨基酸(X16)是E或L，19位的氨基酸(X19)是S或R，23位的氨基酸(X23)是E或D，并且25位的氨基酸(X25)是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含含有SEQ ID NO：29中所示的氨基酸序列的框架区3(VH FR3)，其中1位的氨基酸是R，4位的氨基酸是I或M，6位的氨基酸是R，10位的氨基酸是A或I，16位的氨基酸是E，19位的氨基酸是S或R，23位的氨基酸是E或D，并且25位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含框架区3(VH FR3)，其包含SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列，其中1位的氨基酸是R，4位的氨基酸是I或M，6位的氨基酸是R，10位的氨基酸是A或I，16位的氨基酸是E，19位的氨基酸是S或R，23位的氨基酸是E或D，并且25位的氨基酸是T。
在一个实施方案中，重链可变区包含框架区3(VH FR3)，其包含SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列，其中1位的氨基酸是R，4位的氨基酸是I，6位的氨基酸是R，10位的氨基酸是A，16位的氨基酸是E，19位的氨基酸是S，23位的氨基酸是E，并且25位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含框架区3(VH FR3)，其包含SEQ ID NO：30、31、32、33或34中所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，重链可变区包含框架区3(VH FR3)，其包含与SEQ ID NO：30、31、32、33或34具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含框架区3(VH FR3)，该框架区包含氨基酸序列TX2YX4X5KFX8GX10VTX13TX15DTSX19STAYMX25LSX28LRSX32DX34AVYYCA R(SEQ ID NO:35)，其中2位(X2)的氨基酸是Q或K，4位(X4)的氨基酸是N或S，5位(X5)的氨基酸是E或Q，8位(X8)的氨基酸是K或Q，10位(X10)的氨基酸是R或不存在，13位(X13)的氨基酸是I或M，15位(X15)的氨基酸是R或A，19位(X19)的氨基酸是A、T或I，25位(X25)的氨基酸是E或L，28位(X28)的氨基酸是S或R，32位(X32)的氨基酸是E或D，并且34位(X34)的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含含有SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列的框架区3(VH FR3)，其中2位的氨基酸是Q或K，4位的氨基酸是N或S，5位的氨基酸是E或Q，8位的氨基酸是K或Q，10位的氨基酸是R，13位的氨基酸是I或M，15位的氨基酸是R，19位的氨基酸是A或I，25位的氨基酸是E，28位的氨基酸是S或R，32位的氨基酸是E或D，并且34位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含含有SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列的框架区3(VH FR3)，其中2位的氨基酸是Q或K，4位的氨基酸是N或S，5位的氨基酸是E或Q，8位的氨基酸是K或Q，10位的氨基酸是R，13位的氨基酸是I或M，15位的氨基酸是R，19位的氨基酸是A或I，25位的氨基酸是E，28位的氨基酸是S或R，32位的氨基酸是E或D，并且34位的氨基酸是T。
在一个实施方案中，重链可变区包含含有SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列的框架区3(VH FR3)，其中2位的氨基酸是Q或K，4位的氨基酸是N或S，5位的氨基酸是E或Q，8位的氨基酸是K或Q，10位的氨基酸是R，13位的氨基酸是I，15位的氨基酸是R，19位的氨基酸是A，25位的氨基酸是E，28位的氨基酸是S，32位的氨基酸是E，并且34位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含含有SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列的框架区3(VH FR3)，其中2位的氨基酸是Q或K，4位的氨基酸是N，5位的氨基酸是E，8位的氨基酸是K，10位的氨基酸是R，13位的氨基酸是I或M，15位的氨基酸是R，19位的氨基酸是A或I，25位的氨基酸是E，28位的氨基酸是S或R，32位的氨基酸是E或D，并且34位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含含有SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列的框架区3(VH FR3)，其中2位的氨基酸是Q，4位的氨基酸是N或S，5位的氨基酸是E，8位的氨基酸是K，10位的氨基酸是R，13位的氨基酸是I或M，15位的氨基酸是R，19位的氨基酸是A或I，25位的氨基酸是E，28位的氨基酸是S或R，32位的氨基酸是E或D，并且34位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含含有SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列的框架区3(VH FR3)，其中2位的氨基酸是Q，4位的氨基酸是N，5位的氨基酸是E或Q，8位的氨基酸是K，10位的氨基酸是R，13位的氨基酸是I或M，15位的氨基酸是R，19位的氨基酸是A或I，25位的氨基酸是E，28位的氨基酸是S或R，32位的氨基酸是E或D，并且34位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含含有SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列的框架区3(VH FR3)，其中2位的氨基酸是Q，4位的氨基酸是N，5位的氨基酸是E，8位的氨基酸是K或Q，10位的氨基酸是R，13位的氨基酸是I或M，15位的氨基酸是R，19位的氨基酸是A或I，25位的氨基酸是E，28位的氨基酸是S或R，32位的氨基酸是E或D，并且34位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含含有SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列的框架区3(VH FR3)，其中2位的氨基酸是Q或K，4位的氨基酸是N或S，5位的氨基酸是E，8位的氨基酸是K，10位的氨基酸是R，13位的氨基酸是I或M，15位的氨基酸是R，19位的氨基酸是A或I，25位的氨基酸是E，28位的氨基酸是S或R，32位的氨基酸是E或D，并且34位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含含有SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列的框架区3(VH FR3)，其中2位的氨基酸是Q或K，4位的氨基酸是N，5位的氨基酸是E或Q，8位的氨基酸是K，10位的氨基酸是R，13位的氨基酸是I或M，15位的氨基酸是R，19位的氨基酸是A或I，25位的氨基酸是E，28位的氨基酸是S或R，32位的氨基酸是E或D，并且34位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含含有SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列的框架区3(VH FR3)，其中2位的氨基酸是Q或K，4位的氨基酸是N，5位的氨基酸是E，8位的氨基酸是K或Q，10位的氨基酸是R，13位的氨基酸是I或M，15位的氨基酸是R，19位的氨基酸是A或I，25位的氨基酸是E，28位的氨基酸是S或R，32位的氨基酸是E或D，并且34位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含含有SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列的框架区3(VH FR3)，其中2位的氨基酸是Q，4位的氨基酸是N或S，5位的氨基酸是E或Q，8位的氨基酸是K，10位的氨基酸是R，13位的氨基酸是I或M，15位的氨基酸是R，19位的氨基酸是A或I，25位的氨基酸是E，28位的氨基酸是S或R，32位的氨基酸是E或D，并且34位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含含有SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列的框架区3(VH FR3)，其中2位的氨基酸是Q，4位的氨基酸是N或S，5位的氨基酸是E，8位的氨基酸是K或Q，10位的氨基酸是R，13位的氨基酸是I或M，15位的氨基酸是R，19位的氨基酸是A或I，25位的氨基酸是E，28位的氨基酸是S或R，32位的氨基酸是E或D，并且34位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含含有SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列的框架区3(VH FR3)，其中2位的氨基酸是Q，4位的氨基酸是N，5位的氨基酸是E或Q，8位的氨基酸是K或Q，10位的氨基酸是R，13位的氨基酸是I或M，15位的氨基酸是R，19位的氨基酸是A或I，25位的氨基酸是E，28位的氨基酸是S或R，32位的氨基酸是E或D，并且34位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含含有SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列的框架区3(VH FR3)，其中2位的氨基酸是Q或K，4位的氨基酸是N或S，5位的氨基酸是E或Q，8位的氨基酸是K，10位的氨基酸是R，13位的氨基酸是I或M，15位的氨基酸是R，19位的氨基酸是A或I，25位的氨基酸是E，28位的氨基酸是S或R，32位的氨基酸是E或D，并且34位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含含有SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列的框架区3(VH FR3)，其中2位的氨基酸是Q或K，4位的氨基酸是N或S，5位的氨基酸是E，8位的氨基酸是K或Q，10位的氨基酸是R，13位的氨基酸是I或M，15位的氨基酸是R，19位的氨基酸是A或I，25位的氨基酸是E，28位的氨基酸是S或R，32位的氨基酸是E或D，并且34位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含含有SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列的框架区3(VH FR3)，其中2位的氨基酸是Q或K，4位的氨基酸是N，5位的氨基酸是E或Q，8位的氨基酸是K或Q，10位的氨基酸是R，13位的氨基酸是I或M，15位的氨基酸是R，19位的氨基酸是A或I，25位的氨基酸是E，28位的氨基酸是S或R，32位的氨基酸是E或D，并且34位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含含有SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列的框架区3(VH FR3)，其中2位的氨基酸是Q，4位的氨基酸是N或S，5位的氨基酸是E或Q，8位的氨基酸是K或Q，10位的氨基酸是R，13位的氨基酸是I或M，15位的氨基酸是R，19位的氨基酸是A或I，25位的氨基酸是E，28位的氨基酸是S或R，32位的氨基酸是E或D，并且34位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，人源化的抗HLA-A2抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含框架区3(VH FR3)，所述框架区包含氨基酸序列TQYNEKFKGX10VTX13TX15DTSX19STAYMX25LSX28LRSX32DX34AVYYCAR(SEQ ID NO:36)，其中10位的氨基酸(X10)是R或不存在，13位的氨基酸(X13)是I或M，15位的氨基酸(X15)是R或A，19位的氨基酸(X19)是A、T或I，25位的氨基酸(X25)是E或L，28位的氨基酸(X28)是S或R，32位的氨基酸(X32)是E或D，并且34位的氨基酸(X34)是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含含有SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列的框架区3(VH FR3)，其中10位的氨基酸是R，13位的氨基酸是I或M，15位的氨基酸是R，19位的氨基酸是A或I，25位的氨基酸是E，28位的氨基酸是S或R，32位的氨基酸是E或D，并且34位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含含有SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列的框架区3(VH FR3)，其中10位的氨基酸是R，13位的氨基酸是I或M，15位的氨基酸是R，19位的氨基酸是A或I，25位的氨基酸是E，28位的氨基酸是S或R，32位的氨基酸是E或D，并且34位的氨基酸是T。
在一个实施方案中，重链可变区包含含有SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列的框架区3(VH FR3)，其中10位的氨基酸是R，13位的氨基酸是I，15位的氨基酸是R，19位的氨基酸是A，25位的氨基酸是E，28位的氨基酸是S，32位的氨基酸是E，并且34位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含框架区3(VH FR3)，该框架区包含氨基酸序列TKYSQKFQGX10VTX13TX15DTSX19STAYMX25LSX28LRSX32DX34AVYYCAR(SEQ ID NO:37)，其中10位(X10)的氨基酸是R或不存在，13位(X13)的氨基酸是I或M，15位(X15)的氨基酸是R或A，19位(X19)的氨基酸是A、T或I，25位(X25)的氨基酸是E或L，28位(X28)的氨基酸是S或R，32位(X32)的氨基酸是E或D，并且34位(X34)的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含含有SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列的框架区3(VH FR3)，其中10位的氨基酸是R，13位的氨基酸是I或M，15位的氨基酸是R，19位的氨基酸是A或I，25位的氨基酸是E，28位的氨基酸是S或R，32位的氨基酸是E或D，并且34位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含含有SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列的框架区3(VH FR3)，其中10位的氨基酸是R，13位的氨基酸是I或M，15位的氨基酸是R，19位的氨基酸是A或I，25位的氨基酸是E，28位的氨基酸是S或R，32位的氨基酸是E或D，并且34位的氨基酸是T。
在一个实施方案中，重链可变区包含含有SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列的框架区3(VH FR3)，其中10位的氨基酸是R，13位的氨基酸是I，15位的氨基酸是R，19位的氨基酸是A，25位的氨基酸是E，28位的氨基酸是S，32位的氨基酸是E，并且34位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含框架区3(VH FR3)，其包含SEQ ID NO：38、39、40、41、42或43中所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，重链可变区包含框架区3(VHFR3)，其包含与SEQ ID NO：38、39、40、41、42或43具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含框架区4(VH FR4)，该框架区包含氨基酸序列WGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：44)。在一个实施方案中，人源化的抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含框架区4(VH FR4)，该框架区包含与SEQ ID NO：44具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，重链可变区包含：
SEQ ID NO：1所示的VH CDR1；
SEQ ID NO：10所示的VH CDR2，其中10位的氨基酸(X10)是Q或K，12位的氨基酸(X12)是N或S，13位的氨基酸(X13)是E或Q，并且16位的氨基酸(X16)是K或Q；
SEQ ID NO：6所示的VH CDR3；
SEQ ID NO：12所示的VH FR1；
SEQ ID NO：13所示的VH FR2，其中9位的氨基酸(X9)是R或G，并且15位的氨基酸(X15)是I或不存在；
SEQ ID NO：29所示的VH FR3，其中1位的氨基酸(X1)是R或不存在，4位的氨基酸(X4)是I或M，6位的氨基酸(X6)是R或A，10位的氨基酸(X10)是A、T或I，16位的氨基酸(X16)是E或L，19位的氨基酸(X19)是S或R，23位的氨基酸(X23)是E或D，并且25位的氨基酸(X25)是T或M；以及
SEQ ID NO：44所示的VH FR4。
在一个实施方案中，重链可变区包含：
SEQ ID NO：2所示的VH CDR1；
SEQ ID NO：10所示的VH CDR2，其中10位的氨基酸(X10)是Q或K，12位的氨基酸(X12)是N或S，13位的氨基酸(X13)是E或Q，并且16位的氨基酸(X16)是K或Q；
SEQ ID NO：6所示的VH CDR3；
SEQ ID NO：11所示的VH FR1；
SEQ ID NO：25所示的VH FR2，其中12位的氨基酸(X12)是R或G，并且18位的氨基酸(X18)是I或不存在；
SEQ ID NO：29所示的VH FR3，其中1位的氨基酸(X1)是R或不存在，4位的氨基酸(X4)是I或M，6位的氨基酸(X6)是R或A，10位的氨基酸(X10)是A、T或I，16位的氨基酸(X16)是E或L，19位的氨基酸(X19)是S或R，23位的氨基酸(X23)是E或D，并且25位的氨基酸(X25)是T或M；以及
SEQ ID NO：44所示的VH FR4。
在一个实施方案中，重链可变区包含：
SEQ ID NO：2所示的VH CDR1；
SEQ ID NO：4所示的VH CDR2；
SEQ ID NO：6所示的VH CDR3；
SEQ ID NO：11所示的VH FR1；
SEQ ID NO：21所示的VH FR2，其中12位的氨基酸(X12)是R或G，且18位的氨基酸(X18)是I或不存在；
SEQ ID NO：35所示的VH FR3，其中2位的氨基酸(X2)是Q或K，4位的氨基酸(X4)是N或S，5位的氨基酸(X5)是E或Q，8位的氨基酸(X8)是K或Q，10位的氨基酸(X10)是R或不存在，13位的氨基酸(X13)是I或M，15位的氨基酸(X15)是R或A，19位的氨基酸(X19)是A、T或I，25位的氨基酸(X25)是E或L，28位的氨基酸(X28)是S或R，32位的氨基酸(X32)是E或D，并且34位的氨基酸(X34)是T或M；以及
SEQ ID NO：44所示的VH FR4。
在一个实施方案中，重链可变区包含：
SEQ ID NO：1所示的VH CDR1；
SEQ ID NO：4所示的VH CDR2；
SEQ ID NO：6所示的VH CDR3；
SEQ ID NO：12所示的VH FR1；
SEQ ID NO：17所示的VH FR2，其中9位的氨基酸(X9)是R或G，并且15位的氨基酸(X15)是I或不存在；
SEQ ID NO：35所示的VH FR3，其中2位的氨基酸(X2)是Q或K，4位的氨基酸(X4)是N或S，5位的氨基酸(X5)是E或Q，8位的氨基酸(X8)是K或Q，10位的氨基酸(X10)是R或不存在，13位的氨基酸(X13)是I或M，15位的氨基酸(X15)是R或A，19位的氨基酸(X19)是A、T或I，25位的氨基酸(X25)是E或L，28位的氨基酸(X28)是S或R，32位的氨基酸(X32)是E或D，并且34位的氨基酸(X34)是T或M；以及
SEQ ID NO：44所示的VH FR4。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含含有以下氨基酸序列的重链可变区QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQX44LEWMGX50WIYPGDGSTX60YX62X63KFX66GX68VTX71TX73DTSX77STAYMX83LSX86LRSX90DX92AVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:45),其中44位(X44)的氨基酸是R或G，50位(X50)的氨基酸是I或不存在，60位(X60)的氨基酸是Q或K，62位(X62)的氨基酸是N或S，63位(X63)的氨基酸是E或Q，66位(X66)的氨基酸是K或Q，68位(X68)的氨基酸是R或不存在，71位(X71)的氨基酸是I或M，73位(X73)的氨基酸是R或A，77位(X77)的氨基酸是A、T或I，83位(X83)的氨基酸是E或L，86位(X86)的氨基酸是S或R，90位(X90)的氨基酸是E或D，并且92位(X92)的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO：45中所示的氨基酸序列，其中44位的氨基酸是R或G；50位的氨基酸不存在；60位的氨基酸是Q或K；62位的氨基酸是N或S；63位的氨基酸是E或Q；66位的氨基酸是K或Q；68位的氨基酸是R；71位的氨基酸是I或M；73位的氨基酸是R；77位的氨基酸是A或I；83位的氨基酸是E；86位的氨基酸是S或R；90位的氨基酸是E或D；并且92位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO：45中所示的氨基酸序列，其中44位的氨基酸是R或G，50位的氨基酸不存在，60位的氨基酸是Q或K；62位的氨基酸是N或S；63位的氨基酸是E或Q；66位的氨基酸是K或Q；68位的氨基酸是R，71位的氨基酸是I或M，73位的氨基酸是R，77位的氨基酸是A或I，83位的氨基酸是E，86位的氨基酸是S或R，90位的氨基酸是E或D，并且92位的氨基酸是T。
在一个实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO：45中所示的氨基酸序列，其中44位的氨基酸是R，50位的氨基酸不存在，60位的氨基酸是Q或K；62位的氨基酸是N或S；63位的氨基酸是E或Q；66位的氨基酸是K或Q；68位的氨基酸是R，71位的氨基酸是I，73位的氨基酸是R，77位的氨基酸是A，83位的氨基酸是E，86位的氨基酸是S，90位的氨基酸是E，并且92位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO：45中所示的氨基酸序列，其中44位的氨基酸是R或G，50位的氨基酸不存在，60位的氨基酸是Q；62位的氨基酸是N；63位的氨基酸是E；66位的氨基酸是K；68位的氨基酸是R，71位的氨基酸是I或M，73位的氨基酸是R，77位的氨基酸是A或I，83位的氨基酸是E，86位的氨基酸是S或R，90位的氨基酸是E或D，并且92位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO：45中所示的氨基酸序列，其中44位的氨基酸是R或G，50位的氨基酸不存在，60位的氨基酸是Q；62位的氨基酸是N；63位的氨基酸是E；66位的氨基酸是K；68位的氨基酸是R，71位的氨基酸是I或M，73位的氨基酸是R，77位的氨基酸是A或I，83位的氨基酸是E，86位的氨基酸是S或R，90位的氨基酸是E或D，并且92位的氨基酸是T。
在一个实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO：45中所示的氨基酸序列，其中44位的氨基酸是R，50位的氨基酸不存在，60位的氨基酸是Q；62位的氨基酸是N；63位的氨基酸是E；66位的氨基酸是K；68位的氨基酸是R，71位的氨基酸是I，73位的氨基酸是R，77位的氨基酸是A，83位的氨基酸是E，86位的氨基酸是S，90位的氨基酸是E，并且92位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO：45中所示的氨基酸序列，其中44位的氨基酸是R或G，50位的氨基酸不存在，60位的氨基酸是K；62位的氨基酸是S；63位的氨基酸是Q；66位的氨基酸是Q；68位的氨基酸是R，71位的氨基酸是I或M，73位的氨基酸是R，77位的氨基酸是A或I，83位的氨基酸是E，86位的氨基酸是S或R，90位的氨基酸是E或D，并且92位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO：45中所示的氨基酸序列，其中44位的氨基酸是R或G，50位的氨基酸不存在，60位的氨基酸是K；62位的氨基酸是S；63位的氨基酸是Q；66位的氨基酸是Q；68位的氨基酸是R，71位的氨基酸是I或M，73位的氨基酸是R，77位的氨基酸是A或I，83位的氨基酸是E，86位的氨基酸是S或R，90位的氨基酸是E或D，并且92位的氨基酸是T。
在一个实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO：45中所示的氨基酸序列，其中44位的氨基酸是R，50位的氨基酸不存在，60位的氨基酸是K；62位的氨基酸是S；63位的氨基酸是Q；66位的氨基酸是Q；68位的氨基酸是R，71位的氨基酸是I，73位的氨基酸是R，77位的氨基酸是A，83位的氨基酸是E，86位的氨基酸是S，90位的氨基酸是E，并且92位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO：45中所示的氨基酸序列，其中44位的氨基酸是R或G，50位的氨基酸不存在，60位的氨基酸是Q或K；62位的氨基酸是S；63位的氨基酸是Q；66位的氨基酸是Q；68位的氨基酸是R，71位的氨基酸是I或M，73位的氨基酸是R，77位的氨基酸是A或I，83位的氨基酸是E，86位的氨基酸是S或R，90位的氨基酸是E或D，并且92位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO：45中所示的氨基酸序列，其中44位的氨基酸是R或G，50位的氨基酸不存在，60位的氨基酸是K；62位的氨基酸是N或S；63位的氨基酸是Q；66位的氨基酸是Q；68位的氨基酸是R，71位的氨基酸是I或M，73位的氨基酸是R，77位的氨基酸是A或I，83位的氨基酸是E，86位的氨基酸是S或R，90位的氨基酸是E或D，并且92位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO：45中所示的氨基酸序列，其中44位的氨基酸是R或G，50位的氨基酸不存在，60位的氨基酸是K；62位的氨基酸是S；63位的氨基酸是E或Q；66位的氨基酸是Q；68位的氨基酸是R，71位的氨基酸是I或M，73位的氨基酸是R，77位的氨基酸是A或I，83位的氨基酸是E，86位的氨基酸是S或R，90位的氨基酸是E或D，并且92位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO：45中所示的氨基酸序列，其中44位的氨基酸是R或G，50位的氨基酸不存在，60位的氨基酸是K；62位的氨基酸是S；63位的氨基酸是Q；66位的氨基酸是K或Q；68位的氨基酸是R，71位的氨基酸是I或M，73位的氨基酸是R，77位的氨基酸是A或I，83位的氨基酸是E，86位的氨基酸是S或R，90位的氨基酸是E或D，并且92位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO：45中所示的氨基酸序列，其中44位的氨基酸是R或G，50位的氨基酸不存在，60位的氨基酸是Q或K；62位的氨基酸是N或S；63位的氨基酸是Q；66位的氨基酸是Q；68位的氨基酸是R，71位的氨基酸是I或M，73位的氨基酸是R，77位的氨基酸是A或I，83位的氨基酸是E，86位的氨基酸是S或R，90位的氨基酸是E或D，并且92位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO：45中所示的氨基酸序列，其中44位的氨基酸是R或G，50位的氨基酸不存在，60位的氨基酸是Q或K；62位的氨基酸是S；63位的氨基酸是E或Q；66位的氨基酸是Q；68位的氨基酸是R，71位的氨基酸是I或M，73位的氨基酸是R，77位的氨基酸是A或I，83位的氨基酸是E，86位的氨基酸是S或R，90位的氨基酸是E或D，并且92位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO：45中所示的氨基酸序列，其中44位的氨基酸是R或G，50位的氨基酸不存在，60位的氨基酸是Q或K；62位的氨基酸是S；63位的氨基酸是Q；66位的氨基酸是K或Q；68位的氨基酸是R，71位的氨基酸是I或M，73位的氨基酸是R，77位的氨基酸是A或I，83位的氨基酸是E，86位的氨基酸是S或R，90位的氨基酸是E或D，并且92位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO：45中所示的氨基酸序列，其中44位的氨基酸是R或G，50位的氨基酸不存在，60位的氨基酸是K；62位的氨基酸是N或S；63位的氨基酸是E或Q；66位的氨基酸是Q；68位的氨基酸是R，71位的氨基酸是I或M，73位的氨基酸是R，77位的氨基酸是A或I，83位的氨基酸是E，86位的氨基酸是S或R，90位的氨基酸是E或D，并且92位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO：45中所示的氨基酸序列，其中44位的氨基酸是R或G，50位的氨基酸不存在，60位的氨基酸是K；62位的氨基酸是N或S；63位的氨基酸是Q；66位的氨基酸是K或Q；68位的氨基酸是R，71位的氨基酸是I或M，73位的氨基酸是R，77位的氨基酸是A或I，83位的氨基酸是E，86位的氨基酸是S或R，90位的氨基酸是E或D，并且92位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO：45中所示的氨基酸序列，其中44位的氨基酸是R或G，50位的氨基酸不存在，60位的氨基酸是K；62位的氨基酸是S；63位的氨基酸是E或Q；66位的氨基酸是K或Q；68位的氨基酸是R，71位的氨基酸是I或M，73位的氨基酸是R，77位的氨基酸是A或I，83位的氨基酸是E，86位的氨基酸是S或R，90位的氨基酸是E或D，并且92位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO：45中所示的氨基酸序列，其中44位的氨基酸是R或G，50位的氨基酸不存在，60位的氨基酸是Q或K；62位的氨基酸是N或S；63位的氨基酸是E或Q；66位的氨基酸是Q；68位的氨基酸是R，71位的氨基酸是I或M，73位的氨基酸是R，77位的氨基酸是A或I，83位的氨基酸是E，86位的氨基酸是S或R，90位的氨基酸是E或D，并且92位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO：45中所示的氨基酸序列，其中44位的氨基酸是R或G，50位的氨基酸不存在，60位的氨基酸是Q或K；62位的氨基酸是N或S；63位的氨基酸是Q；66位的氨基酸是K或Q；68位的氨基酸是R，71位的氨基酸是I或M，73位的氨基酸是R，77位的氨基酸是A或I，83位的氨基酸是E，86位的氨基酸是S或R，90位的氨基酸是E或D，并且92位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO：45中所示的氨基酸序列，其中44位的氨基酸是R或G，50位的氨基酸不存在，60位的氨基酸是Q或K；62位的氨基酸是S；63位的氨基酸是E或Q；66位的氨基酸是K或Q；68位的氨基酸是R，71位的氨基酸是I或M，73位的氨基酸是R，77位的氨基酸是A或I，83位的氨基酸是E，86位的氨基酸是S或R，90位的氨基酸是E或D，并且92位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO：45中所示的氨基酸序列，其中44位的氨基酸是R或G，50位的氨基酸不存在，60位的氨基酸是K；62位的氨基酸是N或S；63位的氨基酸是E或Q；66位的氨基酸是K或Q；68位的氨基酸是R，71位的氨基酸是I或M，73位的氨基酸是R，77位的氨基酸是A或I，83位的氨基酸是E，86位的氨基酸是S或R，90位的氨基酸是E或D，并且92位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含重链可变区，其包含SEQ IDNO：61、62、63、64、65或66中所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含重链可变区，其包含与SEQ ID NO：61、62、63、64、65或66具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含轻链可变区，该轻链可变区包含框架区1(VL FR1)，该框架区包含氨基酸序列DX2VMTQX7PLSX11X12VTX15GQPASISX23(SEQ IDNO:46)，其中2位(X2)的氨基酸是V或I，7位(X7)的氨基酸是S或T，11位(X11)的氨基酸是L或S；12位(X12)的氨基酸是P或S；15位(X15)的氨基酸是L或P，并且23位(X23)的氨基酸是C或F。
在一个实施方案中，轻链可变区包含含有SEQ ID NO：46中所示氨基酸序列的框架区1(VL FR1)，其中2位的氨基酸是V或I；7位的氨基酸是S或T；11位的氨基酸是L或S；12位的氨基酸是P或S；15位的氨基酸是L或P；并且23位的氨基酸是C。
在一个实施方案中，轻链可变区包含含有SEQ ID NO：46中所示氨基酸序列的框架区1(VL FR1)，其中2位的氨基酸是I；7位的氨基酸是T；11位的氨基酸是L或S；12位的氨基酸是P或S；15位的氨基酸是L或P；并且23位的氨基酸是C。
在一个实施方案中，轻链可变区包含含有SEQ ID NO：46中所示氨基酸序列的框架区1(VL FR1)，其中2位的氨基酸是V或I；7位的氨基酸是S或T；11位的氨基酸是L；12位的氨基酸是P或S；15位的氨基酸是L或P；并且23位的氨基酸是C。
在一个实施方案中，轻链可变区包含含有SEQ ID NO：46中所示氨基酸序列的框架区1(VL FR1)，其中2位的氨基酸是V或I；7位的氨基酸是S或T；11位的氨基酸是L或S；12位的氨基酸是P；15位的氨基酸是L；并且23位的氨基酸是C。
在一个实施方案中，轻链可变区包含含有SEQ ID NO：47、48、49或50中所示氨基酸序列的框架区1(VL FR1)。在一个实施方案中，轻链可变区包含含有与SEQ ID NO：47、48、49或50具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的框架区1(VL FR1)。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含轻链可变区，该轻链可变区包含框架区2(VL FR2)，该框架区2包含氨基酸序列WX2X3QX5PGQX9PX11X12LIY(SEQ ID NO:51)，其中2位(X2)的氨基酸是F或Y，3位(X3)的氨基酸是Q或L，5位(X5)的氨基酸是R或K，9位(X9)的氨基酸是S或P，11位(X11)的氨基酸是R或Q，并且12位(X12)的氨基酸是R或L。
在一个实施方案中，轻链可变区包含框架区2(VL FR2)，该框架区2包含SEQ IDNO：51中所示的氨基酸序列，其中2位的氨基酸是Y，3位的氨基酸是Q或L，5位的氨基酸是R或K，9位的氨基酸是S或P，11位的氨基酸是R或Q，并且12位的氨基酸是L。
在一个实施方案中，轻链可变区包含框架区2(VL FR2)，该框架区2包含SEQ IDNO：51中所示的氨基酸序列，其中2位的氨基酸是Y，3位的氨基酸是Q或L，5位的氨基酸是R或K，9位的氨基酸是S，11位的氨基酸是R或Q，并且12位的氨基酸是L。
在一个实施方案中，轻链可变区包含框架区2(VL FR2)，该框架区2包含SEQ IDNO：51中所示的氨基酸序列，其中2位的氨基酸是Y，3位的氨基酸是Q，5位的氨基酸是R，9位的氨基酸是S或P，11位的氨基酸是R，并且12位的氨基酸是L。
在一个实施方案中，轻链可变区包含框架区2(VL FR2)，该框架区2包含SEQ IDNO：51中所示的氨基酸序列，其中2位的氨基酸是F或Y，3位的氨基酸是Q或L，5位的氨基酸是R或K，9位的氨基酸是S，11位的氨基酸是R或Q，并且12位的氨基酸是R或L。
在一个实施方案中，轻链可变区包含框架区2(VL FR2)，该框架区2包含SEQ IDNO：51中所示的氨基酸序列，其中2位的氨基酸是F或Y，3位的氨基酸是Q，5位的氨基酸是R，9位的氨基酸是S或P，11位的氨基酸是R，并且12位的氨基酸是R或L。
在一个实施方案中，轻链可变区包含框架区2(VL FR2)，该框架区2包含SEQ IDNO：52、53、54或55中所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，轻链可变区包含框架区2(VLFR2)，该框架区2包含与SEQ ID NO：52、53、54或55具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含轻链可变区，该轻链可变区包含框架区3(VL FR3)，该框架区3包含氨基酸序列GVPDRFSGSGX11GTDFTLKISRVEAEDVGVYYC(SEQ ID NO:56)，其中11位(X11)的氨基酸为S或A。
在一个实施方案中，人源化的抗HLA-A2抗体包含轻链可变区，该轻链可变区包含含有SEQ ID NO：57或58中所示氨基酸序列的框架区3(VL FR3)。在一个实施方案中，人源化的抗HLA-A2抗体包含轻链可变区，该轻链可变区包含含有与SEQ ID NO：57或58具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的框架区3(VL FR3)。
在一个实施方案中，人源化的抗HLA-A2抗体包含轻链可变区，该轻链可变区包含含有氨基酸序列FGGGTKVEIK(SEQ ID NO：59)的框架区4(VL FR4)。在一个实施方案中，人源化的抗HLA-A2抗体包含轻链可变区，该轻链可变区包含框架区4(VL FR4)，该框架区4包含与SEQ ID NO：59具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，人源化的抗HLA-A2抗体包含轻链可变区，该轻链可变区包含氨基酸序列DX2VMTQX7PLSX11X12VTX15GQPASISX23RSSQSIVHSNGNTYLEWX41X42QX44PGQX48PX50X51LIYKVSNRFSGVPDRFSGSGX72GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:60)，其中2位(X2)的氨基酸是V或I，7位(X7)的氨基酸为S或T，11位(X11)的氨基酸为L或S，12位(X12)的氨基酸为P或S，15位(X15)的氨基酸为L或P，23位(X23)的氨基酸为C或F，41位(X41)的氨基酸为F或Y，42位(X42)的氨基酸为Q或L，44位(X44)的氨基酸为R或K，48位(X48)的氨基酸为S或P，50位(X50)的氨基酸为R或Q，51位(X51)的氨基酸为R或L，并且72位(X72)的氨基酸为S或A。
在一个实施方案中，轻链可变区包含SEQ ID NO：60中所示的氨基酸序列，其中2位的氨基酸是V或I，7位的氨基酸是S或T，11位的氨基酸是L或S，12位的氨基酸是P或S，15位的氨基酸是L或P，23位的氨基酸是C，41位的氨基酸是Y，42位的氨基酸是Q或L，44位的氨基酸是R或K，48位的氨基酸是S或P，50位的氨基酸是R或Q，51位的氨基酸是L，并且72位的氨基酸是S或A。
在一个实施方案中，轻链可变区包含SEQ ID NO：60中所示的氨基酸序列，其中2位的氨基酸是I，7位的氨基酸是T，11位的氨基酸是L或S，12位的氨基酸是P或S，15位的氨基酸是L或P，23位的氨基酸是C，41位的氨基酸是Y，42位的氨基酸是Q或L，44位的氨基酸是R或K，48位的氨基酸是S或P，50位的氨基酸是R或Q，51位的氨基酸是L，并且72位的氨基酸是S或A。
在一个实施方案中，轻链可变区包含SEQ ID NO：60中所示的氨基酸序列，其中2位的氨基酸是V或I，7位的氨基酸是S或T，11位的氨基酸是L，12位的氨基酸是P或S，15位的氨基酸是L或P，23位的氨基酸是C，41位的氨基酸是Y，42位的氨基酸是Q或L，44位的氨基酸是R或K，48位的氨基酸是S，50位的氨基酸是R或Q，51位的氨基酸是L，并且72位的氨基酸是S。
在一个实施方案中，轻链可变区包含SEQ ID NO：60中所示的氨基酸序列，其中2位的氨基酸是V或I，7位的氨基酸是S或T，11位的氨基酸是L或S，12位的氨基酸是P，15位的氨基酸是L，23位的氨基酸是C，41位的氨基酸是Y，42位的氨基酸是Q，44位的氨基酸是R，48位的氨基酸是S或P，50位的氨基酸是R，51位的氨基酸是L，并且72位的氨基酸是S或A。
在一个实施方案中，轻链可变区包含SEQ ID NO：60中所示的氨基酸序列，其中2位的氨基酸是V或I，7位的氨基酸是S或T，11位的氨基酸是L或S，12位的氨基酸是P或S，15位的氨基酸是L或P，23位的氨基酸是C，41位的氨基酸是F或Y，42位的氨基酸是Q或L，44位的氨基酸是R或K，48位的氨基酸是S或P，50位的氨基酸是R或Q，51位的氨基酸是R或L，并且72位的氨基酸是S或A。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含含有SEQ ID NO：67、68、69、70或71中所示氨基酸序列的轻链可变区。在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含轻链可变区，该轻链可变区包含与SEQ ID NO：67、68、69、70或71具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体是scFv、scFab或sdAb。在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体是scFv或scFab。在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体是sdAb。在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体是scFab。在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体是scFv。在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体是包含SEQID NO：72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90或91中所示氨基酸序列的scFv。在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体是包含与SEQ ID NO：72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90或91具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的scFv。
在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体包含与上述SEQ ID NO具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，该人源化的抗HLA-A2抗体是包含与上述SEQ ID NO具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的scFv或scFab。
一方面，本发明提供了一种抗HLA抗体，其包含含有氨基酸序列WIYPGDGSTKYSQKFQG(SEQ ID NO:5)的重链可变区。
在一个实施方案中，所述抗体是选自由亲合体、Alphabody、基于armadillo重复蛋白的支架、knottin、Kunitz结构域肽、affilin、affitin、adnectin、atrimer、evasin、DARPin、抗运载蛋白、avimer、fynomer、versabody和duocalin组成的组的抗体模拟物。
本文提供的抗HLA-A2抗体特异性结合HLA-A2。在一个实施方案中，本文提供的抗HLA-A2抗体特异性地结合至HLA-A*02:01。如本领域技术人员所理解的，抗体结合HLA-A2的能力可以通过使用本领域已知的技术来检测。例如，抗体与HLA-A2的结合可通过使用本文所举例的HLA-A2四聚体来检测。在一个实施方案中，本文提供的抗HLA-A2抗体与包含以下的抗体竞争结合HLA-A2：具有SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)；具有SEQ ID NO：185的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)；具有SEQ ID NO：187氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)；具有SEQ ID NO：188的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)；具有SEQ ID NO：189的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)；和具有SEQ IDNO：190的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)。在一个实施方案中，本文提供的抗HLA-A2抗体与包含以下的抗体结合相同的HLA-A2表位：具有SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)；具有SEQ ID NO：185的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)；具有SEQ ID NO：187氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)；具有SEQ ID NO：188的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)；具有SEQ ID NO：189的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)；和具有SEQ ID NO：190的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)。在一个实施方案中，本文提供的抗HLA-A2抗体与BB7.2抗体竞争结合HLA-A2。在一个实施方案中，本文提供的抗HLA-A2抗体与BB7.2抗体结合相同的HLA-A2表位。在一个实施方案中，该抗HLA抗体包含含有SEQ ID NO：5所示的互补决定区2(VH CDR2)的重链可变区。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的抗HLA-A2抗体对选自HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68中的一种或多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的抗HLA-A2抗体对选自HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68中的两种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的抗HLA-A2抗体对选自HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68中的三种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的抗HLA-A2抗体对选自HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68中的四种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的抗HLA-A2抗体对选自HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68中的五种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的抗HLA-A2抗体对选自HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68中的六种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的抗HLA-A2抗体对选自HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68中的七种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的抗HLA-A2抗体对选自HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68中的每一种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的抗HLA-A2抗体对选自HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30中的一种或多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的抗HLA-A2抗体对选自HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30中的两种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的抗HLA-A2抗体对选自HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30中的每一种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的抗HLA-A2抗体对HLA-A*03:01、HLA-A*25:01、HLA-A*29:02、HLA-A*30:01、HLA-A*31:01、HLA-A*33:01、HLA-A*36:01、HLA-A*68:01中的至少一种具有较低的反应性。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的抗HLA-A2抗体对HLA-A*03:01、HLA-A*25:01、HLA-A*29:02、HLA-A*30:01、HLA-A*31:01、HLA-A*33:01、HLA-A*36:01、HLA-A*68:01中的至少两种具有较低的反应性。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的抗HLA-A2抗体对HLA-A*03:01、HLA-A*25:01、HLA-A*29:02、HLA-A*30:01、HLA-A*31:01、HLA-A*33:01、HLA-A*36:01、HLA-A*68:01中的至少三种具有较低的反应性。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的抗HLA-A2抗体对HLA-A*03:01、HLA-A*25:01、HLA-A*29:02、HLA-A*30:01、HLA-A*31:01、HLA-A*33:01、HLA-A*36:01、HLA-A*68:01中的至少四种具有较低的反应性。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的抗HLA-A2抗体对HLA-A*03:01、HLA-A*25:01、HLA-A*29:02、HLA-A*30:01、HLA-A*31:01、HLA-A*33:01、HLA-A*36:01、HLA-A*68:01中的至少五种具有较低的反应性。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的抗HLA-A2抗体对HLA-A*03:01、HLA-A*25:01、HLA-A*29:02、HLA-A*30:01、HLA-A*31:01、HLA-A*33:01、HLA-A*36:01、HLA-A*68:01中的至少六种具有较低的反应性。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的抗HLA-A2抗体对HLA-A*03:01、HLA-A*25:01、HLA-A*29:02、HLA-A*30:01、HLA-A*31:01、HLA-A*33:01、HLA-A*36:01、HLA-A*68:01中的至少七种具有较低的反应性。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的抗HLA-A2抗体对HLA-A*03:01、HLA-A*25:01、HLA-A*29:02、HLA-A*30:01、HLA-A*31:01、HLA-A*33:01、HLA-A*36:01、HLA-A*68:01的反应性较低。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的抗HLA-A2抗体对HLA-A*25:01、HLA-A*29:02和HLA-A*30:01中的至少一种具有较低的反应性。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的抗HLA-A2抗体对HLA-A*25:01、HLA-A*29:02和HLA-A*30:01中的至少两种具有较低的反应性。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的抗HLA-A2抗体对HLA-A*25:01、HLA-A*29:02、和HLA-A*30:01具有较低的反应性。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的抗HLA-A2抗体对HLA-A*25:01具有较低的反应性。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的抗HLA-A2抗体对HLA-A*29:02具有较低的反应性。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的抗HLA-A2抗体对HLA-A*30:01具有较低的反应性。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的抗HLA-A2抗体对HLA-A*03:01具有较低的反应性。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的抗HLA-A2抗体对HLA-A*31:01具有较低的反应性。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的抗HLA-A2抗体对HLA-A*33:01具有较低的反应性。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的抗HLA-A2抗体对HLA-A*36:01具有较低的反应性。在一个实施方案中，与BB7.2抗体相比，本文提供的抗HLA-A2抗体对HLA-A*68:01具有较低的反应性。BB7.2抗体可以从BB7.2杂交瘤(ATCC保藏号HB-82)中分离得到。用于确定抗HLA-A2抗体对HLA-A亚型的反应性的技术是本领域普通技术人员已知的。例如，抗HLA-A2抗体对HLA-A亚型的反应性可以通过单抗原珠测定来确定。这种单抗原珠测定是可商购的(例如FlowPRA单抗原抗体；ONE LAMBDA)。
在一个实施方案中，当在测试A的条件下测量时，与BB7.2抗体相比，本文提供的抗HLA-A2抗体对选自HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68及其任何组合中的一种或多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。例如，在一些实施方案中，当在测试A的条件下测量时，与BB7.2抗体相比，本文提供的抗HLA-A2抗体对选自包括HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30及其任意组合的组的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。
测试A:
将表达包含抗HLA-A2抗体或BB7.2抗体(例如，BB7.2 scFv(mA2 CAR))的CAR的0.25.106个T细胞与FlowPRA单抗原抗体珠板(FL1HD01、FL1HD02、FL1HD03、FL1HD04、FL1HD06和FL1HD08，One Lambda)和可固定的活性染料(FVD，ThermoFisher，65-0865-14，eBioscience)在室温下孵育30分钟。洗涤样品，用0.5％甲醛固定，并通过流式细胞术分析。每个样品获得两百个阴性对照珠。单独的珠子用作阴性对照。为了分析，首先使用可固定的活性染料消除死细胞。然后在排除死细胞和成对物后门控单个抗原珠。然后，通过它们各自的PE强度峰确定每HLA的珠数量。通过将每个HLA峰中目的珠的数量乘以200，除以样品中阴性珠的数量，将数据标准化。对于每个HLA峰，通过从对照样品中的珠数量减去CAR-Treg中的珠数量，然后除以非CAR表达对照中的平均珠数量，乘以100，确定与对照(非CAR表达细胞)相比时CAR Treg的相对结合百分比。在一个实施方案中，本发明的抗HLA-A2抗体对选自包括HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68的组中的至少一种HLA-A亚型的反应性在统计学上劣于BB7.2抗体，例如，当在测试A的条件下测量时。
在一个实施方案中，本发明的抗HLA-A2抗体对选自包括HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30的组中的至少一种HLA-A亚型的反应性在统计学上劣于BB7.2抗体，例如，当在测试A的条件下测量时。
在一个实施方案中，术语"统计学劣"是指对本发明抗HLA-A2抗体所测量的反应性(即，例如，在测试A的条件下的相对结合)劣于对BB7.2抗体所测定的反应性，p值至多约0.05，优选至多约0.01，更优选至多约0.005，并且更优选至多约0.001，特别是当通过双向ANOVA、Dunnett后检验分析时。
在一个实施方案中，本发明的抗HLA-A2抗体对选自包括HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、BB7.2抗体的组中的至少一种HLA-A亚型具有的反应性劣于BB7.2抗体。在一些实施方案中，当在测试A条件下测量时，这种抗HLA-A2抗体对选自包括HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68的组中的至少一种HLA-A亚型具有的相对结合性劣于BB7.2抗体。在某些方面，针对此类抗HLA-A2抗体所测量的相对结合性是针对BB7.2抗体所测量的相对结合性的至多约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或更少。
在一个实施方案中，本发明的抗HLA-A2抗体对选自包括HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30的组的至少一种HLA-A亚型具有劣于BB7.2抗体的反应性。在一些实施方案中，当在测试A的条件下测量时，这种抗HLA-A2抗体对选自包括HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30的组的至少一种HLA-A亚型具有劣于BB7.2抗体的相对结合性。在某些方面，针对此类抗HLA-A2抗体所测量的相对结合性是针对BB7.2抗体所测量的相对结合性的至多约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或更少。
此外，本文提供的具有抗原结合活性的抗HLA-A2抗体能够构成CAR的抗原结合结构域，其中这样的CAR能够在人细胞中表达，使得CAR特异性结合HLA-A2。在一个实施方案中，CAR特异性地结合至HLA-A*02:01。如本领域技术人员将理解的，CAR结合HLA-A2的能力可以通过使用本领域已知的技术来检测。例如，CAR与HLA-A2的结合可通过使用如本文所示例的HLA-A2四聚体来检测。在一个实施方案中，人细胞是免疫细胞。在一个实施方案中，免疫细胞是调节性免疫细胞。在一个实施方案中，免疫细胞是调节性T细胞(Treg)。在一个实施方案中，免疫细胞是T细胞。在一个实施方案中，T细胞是Treg。
此外，本文提供的具有抗原结合活性的抗HLA-A2抗体能够构成嵌合抗原受体(CAR)的抗原结合结构域，其中此类CAR能够在调节性T细胞(Treg)中表达，使得CAR特异性结合HLA-A2。在一个实施方案中，CAR特异性地结合至HLA-A*02:01。在一个实施方案中，Treg是人Treg。
在一个实施方案中，抗HLA-A2抗体能够构成CAR的抗原结合结构域，其中该CAR能够在免疫细胞中表达，使得免疫细胞被HLA-A2活化。在一个实施方案中，免疫细胞被HLA-A*02:01活化。在一个实施方案中，免疫细胞是调节性免疫细胞。在一个实施方案中，免疫细胞是调节性T细胞(Treg)。在一个实施方案中，免疫细胞是T细胞。在一个实施方案中，T细胞是Treg。在一个实施方案中，免疫细胞是人免疫细胞。在一个实施方案中，调节性免疫细胞是人调节性免疫细胞。在一个实施方案中，T细胞是人T细胞。在一个实施方案中，Treg是人Treg。
在一个实施方案中，这种抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含选自下组的氨基酸序列：SYHIQ(SEQ ID NO：1)和GYTFTSY(SEQ ID NO：2)。
在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含选自SEQID NO：1-2的互补决定区1(VH CDR1)。在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体包含一个重链可变区，该重链可变区包含由SEQ ID NO：1所列的VH CDR1。在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体包含一个重链可变区，该重链可变区包含由SEQ ID NO：2所列的VH CDR1。
在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体包含含有氨基酸序列EGTYYAMDY(SEQ ID NO：6)的重链可变区。
在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含SEQ IDNO：6所示的互补决定区3(VH CDR3)。
在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含一个SEQID NO：5所示的VH CDR2和至少一个以下CDR：
SEQ ID NO：1所示的VH CDR1；或
SEQ ID NO：6所示的VH CDR3。
在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含一个SEQID NO：1所示的VH CDR1；一个SEQ ID NO：5所示的VH CDR2；和一个SEQ ID NO：6所示的VHCDR3。
根据本发明，重链的CDR1、2或3中的任一个可表征为具有与相应SEQ ID NO：1、5和6中列出的CDR的特定组具有至少约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含一个SEQID NO：5所示的VH CDR2和至少一个以下CDR：
SEQ ID NO：2所示的VH CDR1；或
SEQ ID NO：6所示的VH CDR3。
在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含一个SEQID NO：2所示的VH CDR1；一个SEQ ID NO：5所示的VH CDR2；和一个SEQ ID NO：6所示的VHCDR3。
根据本发明，重链的CDR1、2或3中的任一个可表征为具有与相应SEQ ID NO：2、5和6中列出的CDR的特定组具有至少约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体包含含有氨基酸序列RSSQSIVHSNGNTYLE(SEQID NO：7)的轻链可变区。
在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ IDNO：7所示的互补决定区1(VL CDR1)。
在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体包含含有氨基酸序列KVSNRFS(SEQ ID NO：8)的轻链可变区。
在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ IDNO：8所示的互补决定区2(VL CDR2)。
在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体包含含有氨基酸序列FQGSHVPRT(SEQ ID NO：9)的轻链可变区。
在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体包含轻链可变区，该轻链可变区包含SEQ IDNO：9所示的互补决定区3(VL CDR3)。
在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体包含含有至少一个下列CDR的轻链可变区：
SEQ ID NO：7所示的VL CDR1；或
SEQ ID NO：8所示的VL CDR2；或
SEQ ID NO：9所示的VL CDR3。
在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体包含轻链可变区，该轻链可变区包含一个由SEQ ID NO：7所示的VL CDR1；一个由SEQ ID NO：8所示的VL CDR2；和一个由SEQ ID NO：9所示的VL CDR3。
根据本发明，轻链的CDR1、2或3中的任一个可表征为具有与相应SEQ ID NO：7、8和9中列出的CDR的特定组具有至少约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含含有选自下组的氨基酸序列的框架区1(VH FR1)：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS(SEQ ID NO:11)和QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT(SEQ ID NO:12)。
在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含含有氨基酸序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS(SEQ ID NO：11)的框架区1(VH FR1)。在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含框架区1(VH FR1)，该框架区包含与SEQ ID NO：11具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含含有氨基酸序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT(SEQ ID NO：12)的框架区1(VH FR1)。在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含框架区1(VH FR1)，该框架区包含与SEQ ID NO：12具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含框架区2(VH FR2)，该框架区包含选自下组的氨基酸序列：WVRQAPGQX9LEWMGX15(SEQ ID NO:13)和HIQWVRQAPGQX12LEWMGX18(SEQ ID NO:25)，其中：在SEQ ID NO：13中X9为R或G且X15为I或不存在；在SEQ ID NO：25中X12为R或G，且X18为I或不存在。
在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含框架区2(VH FR2)，该框架区包含氨基酸序列WVRQAPGQX9LEWMGX15(SEQ ID NO:13)，其中9位(X9)的氨基酸是R或G，且15位(X15)的氨基酸是I或不存在。
在一个实施方案中，重链可变区包含框架区2(VH FR2)，其包含SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列，其中9位的氨基酸是R或G，并且15位的氨基酸不存在。
在一个实施方案中，重链可变区包含框架区2(VH FR2)，其包含SEQ ID NO：14、15或16中所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，重链可变区包含框架区2(VH FR2)，其包含与SEQ ID NO：14、15或16具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含框架区2(VH FR2)，该框架区包含氨基酸序列HIQWVRQAPGQX12LEWMGX18(SEQ ID NO：25)，其中12位(X12)的氨基酸是R或G，且18位(X18)的氨基酸是I或不存在。
在一个实施方案中，重链可变区包含框架区2(VH FR2)，其包含SEQ ID NO：25中所示的氨基酸序列，其中12位的氨基酸是R或G，并且18位的氨基酸不存在。
在一个实施方案中，重链可变区包含框架区2(VH FR2)，其包含SEQ ID NO：26、27或28中所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，重链可变区包含框架区2(VH FR2)，其包含与SEQ ID NO：26、27或28具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含框架区3(VH FR3)，该框架区包含氨基酸序列X1VTX4TX6DTSX10STAYMX16LSX19LRSX23DX25AVYYCAR(SEQID NO:29)，其中1位的氨基酸(X1)是R或不存在，4位的氨基酸(X4)是I或M，6位的氨基酸(X6)是R或A，10位的氨基酸(X10)是A、T或I，16位的氨基酸(X16)是E或L，19位的氨基酸(X19)是S或R，23位的氨基酸(X23)是E或D，并且25位的氨基酸(X25)是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含框架区3(VH FR3)，其包含SEQ ID NO：29中所示的氨基酸序列，其中1位的氨基酸是R，4位的氨基酸是I或M，6位的氨基酸是R，10位的氨基酸是A或I，16位的氨基酸是E，19位的氨基酸是S或R，23位的氨基酸是E或D，并且25位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含框架区3(VH FR3)，其包含SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列，其中1位的氨基酸是R，4位的氨基酸是I或M，6位的氨基酸是R，10位的氨基酸是A或I，16位的氨基酸是E，19位的氨基酸是S或R，23位的氨基酸是E或D，并且25位的氨基酸是T。
在一个实施方案中，重链可变区包含框架区3(VH FR3)，其包含SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列，其中1位的氨基酸是R，4位的氨基酸是I，6位的氨基酸是R，10位的氨基酸是A，16位的氨基酸是E，19位的氨基酸是S，23位的氨基酸是E，并且25位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含框架区3(VH FR3)，其包含SEQ ID NO：30、31、32、33或34中所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，重链可变区包含框架区3(VH FR3)，其包含与SEQ ID NO：30、31、32、33或34具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含框架区4(VH FR4)，该框架区包含氨基酸序列WGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：44)。在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含框架区4(VH FR4)，该框架区包含与SEQID NO：44具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，重链可变区包含：
SEQ ID NO：1所示的VH CDR1；
SEQ ID NO：5所示的VH CDR2；
SEQ ID NO：6所示的VH CDR3；
SEQ ID NO：12所示的VH FR1；
SEQ ID NO：13所示的VH FR2，其中9位的氨基酸(X9)是R或G，且15位的氨基酸(X15)是I或不存在；
SEQ ID NO：29所示的VH FR3，其中1位的氨基酸(X1)是R或不存在，4位的氨基酸(X4)是I或M，6位的氨基酸(X6)是R或A，10位的氨基酸(X10)是A、T或I，16位的氨基酸(X16)是E或L，19位的氨基酸(X19)是S或R，23位的氨基酸(X23)是E或D，且25位的氨基酸(X25)是T或M；以及
SEQ ID NO：44所示的VH FR4。
在一个实施方案中，重链可变区包含：
SEQ ID NO：2所示的VH CDR1；
SEQ ID NO：5所示的VH CDR2；
SEQ ID NO：6所示的VH CDR3；
SEQ ID NO：11所示的VH FR1；
SEQ ID NO：25所示的VH FR2，其中12位的氨基酸(X12)是R或G，且18位的氨基酸(X18)是I或不存在；
SEQ ID NO：29所示的VH FR3，其中1位的氨基酸(X1)是R或不存在，4位的氨基酸(X4)是I或M，6位的氨基酸(X6)是R或A，10位的氨基酸(X10)是A、T或I，16位的氨基酸(X16)是E或L，19位的氨基酸(X19)是S或R，23位的氨基酸(X23)是E或D，且25位的氨基酸(X25)是T或M；以及
SEQ ID NO：44所示的VH FR4。
在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体包含含有以下氨基酸序列的重链可变区QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQX44LEWMGX50WIYPGDGSTKYSQKFQGX68VTX71TX7 3DTSX77STAYMX83LSX86LRSX90DX92AVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:92),其中44位的氨基酸是R或G，50位的氨基酸是I或不存在，68位的氨基酸是R或不存在，71位的氨基酸是I或M，73位的氨基酸是R或A，77位的氨基酸是A、T或I，83位的氨基酸是E或L，86位的氨基酸是S或R，90位的氨基酸是E或D，并且92位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO：92中所示的氨基酸序列，其中44位的氨基酸是R或G，50位的氨基酸不存在，68位的氨基酸是R，71位的氨基酸是I或M，73位的氨基酸是R，77位的氨基酸是A或I，83位的氨基酸是E，86位的氨基酸是S或R，90位的氨基酸是E或D，并且92位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO：92中所示的氨基酸序列，其中44位的氨基酸是R或G，50位的氨基酸不存在，68位的氨基酸是R，71位的氨基酸是I或M，73位的氨基酸是R，77位的氨基酸是A或I，83位的氨基酸是E，86位的氨基酸是S或R，90位的氨基酸是E或D，并且92位的氨基酸是T。
在一个实施方案中，重链可变区包含SEQ ID NO：92中所示的氨基酸序列，其中44位的氨基酸是R，50位的氨基酸不存在，68位的氨基酸是R，71位的氨基酸是I，73位的氨基酸是R，77位的氨基酸是A，83位的氨基酸是E，86位的氨基酸是S，90位的氨基酸是E，并且92位的氨基酸是T或M。
在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体包含含有SEQ ID NO：66所示氨基酸序列的重链可变区。在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体包含重链可变区，该重链可变区包含与SEQID NO：66具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体包含如本文任何地方所定义的轻链可变区。例如，在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体可包含如本文任何地方所定义的人源化的抗HLA-A2抗体的轻链可变区。
在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体是scFv、scFab或sdAb。在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体是scFv或scFab。在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体为sdAb。在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体为scFab。在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体是scFv。在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体是包含SEQ ID NO：91所示氨基酸序列的scFv。在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体是包含与SEQ ID NO：91具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的scFv。
在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体为人源化的抗HLA-A2抗体。在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体为人抗体。在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体是非人源化的抗体。在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体为非人抗体。
在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体包含与上述SEQ ID NO具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体是包含与上述SEQ ID NO具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的scFv或scFab。
还提供了一种组合物，该组合物包含至少一种本发明的抗HLA-A2抗体，基本上由其组成，或由其组成。
如本文所用，关于组合物的"基本上由组成"是指如上所述的本发明的至少一种抗HLA-A2抗体是所述组合物中唯一的一种治疗剂或具有生物活性的试剂。
在另一个实施方案中，提供了一种药物组合物，其包含至少一种本发明的抗HLA-A2抗体和药学上可接受的载体。
在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体为人源化的抗HLA-A2抗体。
药学上可接受的载体的实例包括但不限于介质、溶剂、包衣、等渗剂和吸收延迟剂、添加剂、稳定剂、防腐剂、表面活性剂、抑制酶降解的物质、醇、pH控制剂、抗氧化剂；螯合剂，例如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；防腐剂和推进剂。
药学上可接受的介质的实例包括但不限于水、中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水、生理盐水或其它生理缓冲盐水，或其它溶剂如乙二醇、甘油，和油如橄榄油或可注射有机酯。药学上可接受的介质还可以包含脂质体或胶束。
包衣材料的实例包括但不限于卵磷脂。
等渗剂的实例包括但不限于糖、氯化钠等。
延迟吸收的试剂的实例包括但不限于单硬脂酸铝和明胶。
添加剂的实例包括但不限于甘露醇、葡聚糖、碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)；甘氨酸、乳糖或聚乙烯吡咯烷酮或其它添加剂，例如抗氧化剂或惰性气体、稳定剂或适于体内给药的重组蛋白(例如人血清白蛋白)。
合适的稳定剂的实例包括但不限于蔗糖、明胶、蛋白胨、消化的蛋白质提取物如NZ-胺或NZ-胺AS。
可用于这些组合物的药学上可接受的载体进一步包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白如人血清白蛋白、缓冲物质如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶态二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
还提供了一种药物，该药物包含、由或基本上由至少一种如上文所述的本发明的抗HLA-A2抗体组成。在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体为人源化的抗HLA-A2抗体。
IV.嵌合抗原受体(CAR)
一方面，本发明提供嵌合抗原受体(CAR)。CAR是嵌合蛋白分子，其将对靶抗原的基于抗体的特异性与活化免疫细胞受体的胞内结构域组合。
本发明的CAR包含特异性结合HLA-A2的胞外结构域。该胞外结构域包含本发明的抗HLA-A2抗体。在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体为人源化的抗HLA-A2抗体。本发明的CAR进一步包含跨膜结构域和包含胞内信号传导结构域的胞质结构域。在一个实施方案中，本发明的CAR能够在人细胞中表达，使得CAR特异性结合HLA-A2。在其它实施方案中，本发明的CAR能够在免疫细胞中表达，使得CAR特异性结合HLA-A2。在一个实施方案中，CAR特异性地结合至HLA-A*02:01。如本领域技术人员将理解的，CAR结合HLA-A2的能力可以通过使用本领域已知的技术来检测。例如，CAR与HLA-A2的结合可通过使用如本文所示例的HLA-A2四聚体来检测。在一个实施方案中，与包含BB7.2抗体的CAR相比，本文提供的CAR对选自HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68中的一种或多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2抗体的CAR相比，本文提供的CAR对选自HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68中的两种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2抗体的CAR相比，本文提供的CAR对选自HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68中的三种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2抗体的CAR相比，本文提供的CAR对选自HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68中的四种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2抗体的CAR相比，本文提供的CAR对选自HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68中的五种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2抗体的CAR相比，本文提供的CAR对选自HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68中的六种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2抗体的CAR相比，本文提供的CAR对选自HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68中的七种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2抗体的CAR相比，本文提供的CAR对选自HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68中的每一种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2抗体的CAR相比，本文提供的CAR对选自HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30中的一种或多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2抗体的CAR相比，本文提供的CAR对选自HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30中的两种或更多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2抗体的CAR相比，本文提供的CAR对选自HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30中的每一种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2抗体的CAR相比，本文提供的CAR对HLA-A*03:01、HLA-A*25:01、HLA-A*29:02、HLA-A*30:01、HLA-A*31:01、HLA-A*33:01、HLA-A*36:01、HLA-A*68:01中的至少一种具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2抗体的CAR相比，本文提供的CAR对HLA-A*03:01、HLA-A*25:01、HLA-A*29:02、HLA-A*30:01、HLA-A*31:01、HLA-A*33:01、HLA-A*36:01、HLA-A*68:01中的至少两种具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2抗体的CAR相比，本文提供的CAR对HLA-A*03:01、HLA-A*25:01、HLA-A*29:02、HLA-A*30:01、HLA-A*31:01、HLA-A*33:01、HLA-A*36:01、HLA-A*68:01中的至少三种具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2抗体的CAR相比，本文提供的CAR对HLA-A*03:01、HLA-A*25:01、HLA-A*29:02、HLA-A*30:01、HLA-A*31:01、HLA-A*33:01、HLA-A*36:01、HLA-A*68:01中的至少四种具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2抗体的CAR相比，本文提供的CAR对HLA-A*03:01、HLA-A*25:01、HLA-A*29:02、HLA-A*30:01、HLA-A*31:01、HLA-A*33:01、HLA-A*36:01、HLA-A*68:01中的至少五种具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2抗体的CAR相比，本文提供的CAR对HLA-A*03:01、HLA-A*25:01、HLA-A*29:02、HLA-A*30:01、HLA-A*31:01、HLA-A*33:01、HLA-A*36:01、HLA-A*68:01中的至少六种具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2抗体的CAR相比，本文提供的CAR对HLA-A*03:01、HLA-A*25:01、HLA-A*29:02、HLA-A*30:01、HLA-A*31:01、HLA-A*33:01、HLA-A*36:01、HLA-A*68:01中的至少七种具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2抗体的CAR相比，本文提供的CAR对HLA-A*03:01、HLA-A*25:01、HLA-A*29:02、HLA-A*30:01、HLA-A*31:01、HLA-A*33:01、HLA-A*36:01和HLA-A*68:01具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2抗体的CAR相比，本文提供的CAR对HLA-A*25:01、HLA-A*29:02和HLA-A*30:01中的至少一种具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2抗体的CAR相比，本文提供的CAR对HLA-A*25:01、HLA-A*29:02和HLA-A*30:01中的至少两种具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2抗体的CAR相比，本文提供的CAR对HLA-A*25:01、HLA-A*29:02和HLA-A*30:01具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2抗体的CAR相比，本文提供的CAR对HLA-A*25:01具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2抗体的CAR相比，本文提供的CAR对HLA-A*29:02具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2抗体的CAR相比，本文提供的CAR对HLA-A*30:01具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2抗体的CAR相比，本文提供的CAR对HLA-A*03:01具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2抗体的CAR相比，本文提供的CAR对HLA-A*31:01具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2抗体的CAR相比，本文提供的CAR具有对HLA-A*33:01的更低反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2抗体的CAR相比，本文提供的CAR对HLA-A*36:01具有较低的反应性。在一个实施方案中，与包含BB7.2抗体的CAR相比，本文提供的CAR对HLA-A*68:01具有较低的反应性。在一个实施方案中，人细胞是免疫细胞。在一个实施方案中，免疫细胞是调节性免疫细胞。在一个实施方案中，免疫细胞是调节性T细胞(Treg)。在一个实施方案中，免疫细胞是T细胞。在一个实施方案中，T细胞是Treg。
用于测定本发明的CAR对HLA-A亚型的反应性的技术是本领域普通技术人员已知的。例如，本发明的CAR对HLA-A亚型的反应性可以通过单抗原珠测定来确定。这种单抗原珠测定是可商购的(例如FlowPRA单抗原抗体；ONE LAMBDA)。
在一个实施方案中，如上所述，在测试A的条件下进行测定时，与含有BB7.2抗体的CAR相比，本发明的CAR对选自包含HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68及其任意组合的组的HLA-A亚型的反应性较低。
在一个实施方案中，如上所述，在测试A的条件下测量时，与包含BB7.2抗体的CAR相比，本发明的CAR对选自包含HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30及其任意组合的组的HLA-A亚型的反应性较低。
在一个实施方案中，本发明的CAR对选自包含HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68的组中的至少一种HLA-A亚型具有的反应性在统计学上劣于含有BB7.2抗体的CAR的反应性，例如在测试A的条件下进行测定时。
在一个实施方案中，例如，当在测试A的条件下测量时，本发明的CAR对选自包括HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30的组的至少一种HLA-A亚型的反应性在统计学上劣于包含BB7.2抗体的CAR的反应性，例如在测试A的条件下进行测定时。
在一个实施方案中，术语"统计学上劣"是指对本发明的CAR测量的反应性(即，例如，在测试A的条件下的相对结合)劣于对包含BB7.2抗体的CAR测量的反应性，p值至多约0.05，优选至多约0.01，更优选至多约0.005，并且更优选至多约0.001，特别是当通过双向ANOVA、Dunnett后检验分析时。
在一个实施方案中，本发明的CAR对选自包含HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68的组的至少一种HLA-A亚型具有的反应性劣于包含BB7.2抗体的CAR。在一些实施方案中，当在测试A的条件下测量时，这种CAR对选自包含HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68的组中的至少一种HLA-A亚型具有的相对结合劣于包含BB7.2抗体的CAR。在某些方面，此类CAR的相对结合是包含BB7.2抗体的CAR所测量的相对结合的至多约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或更少。
在一个实施方案中，本发明的CAR与选自包含HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30的组中的至少一种HLA-A亚型的反应性劣于包含BB7.2抗体的CAR。在一些实施方案中，当在测试A的条件下测量时，这种CAR与选自包含HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30的组中的至少一种HLA-A亚型的相对结合劣于包含BB7.2抗体的CAR。在某些方面，测量的此类CAR的相对结合是包含BB7.2抗体的CAR的结合的至多约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或更少。
在一个实施方案中，CAR能够在免疫细胞中表达，使得免疫细胞被HLA-A2活化。在一个实施方案中，免疫细胞被HLA-A*02:01活化。在一个实施方案中，免疫细胞是调节性免疫细胞。在一个实施方案中，免疫细胞是调节性T细胞(Treg)。在一个实施方案中，免疫细胞是T细胞。在一个实施方案中，T细胞是Treg。在一个实施方案中，免疫细胞是人免疫细胞。在一个实施方案中，调节性免疫细胞是人调节性免疫细胞。在一个实施方案中，T细胞是人T细胞。在一个实施方案中，Treg是人Treg。
在一个实施方案中，CAR与包含以下的抗体竞争结合HLA-A2：具有SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)；具有SEQ ID NO：185的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)；具有SEQ ID NO：187氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)；具有SEQ IDNO：188的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)；具有SEQ ID NO：189的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)；和具有SEQ ID NO：190的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)。在一个实施方案中，CAR与抗体结合相同的HLA-A2表位，所述抗体包含：具有SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)；具有SEQ ID NO：185的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)；具有SEQ ID NO：187氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)；具有SEQ IDNO：188的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)；具有SEQ ID NO：189的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)；和具有SEQ ID NO：190的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)。在一个实施方案中，CAR与BB7.2抗体竞争结合HLA-A2。在一个实施方案中，CAR与BB7.2抗体结合相同的HLA-A2表位。BB7.2抗体可以从BB7.2杂交瘤(ATCC保藏号HB-82)中分离得到。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含：包含抗HLA-A2抗体的胞外结构域；跨膜结构域；和包含胞内信号传导结构域的胞质结构域。在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体为人源化的抗HLA-A2抗体。
在一个实施方案中，嵌合受体还包含标签和/或前导序列。
在一个实施方案中，嵌合受体还包含标签，例如用于质量控制、富集、体内追踪等的标签。所述标签可以位于N末端、C末端和/或内部。可用于本发明的嵌合受体的标签的实例是技术人员熟知的。例如，但不限于，本发明中使用的标签可以是选自包含以下的组或选自由以下组成的组的标签：血凝素标签、聚精氨酸标签、聚组氨酸标签、Myc标签、Strep标签、S-标签、HAT标签、3x Flag标签、钙调蛋白结合肽标签、SBP标签、壳多糖结合域标签、GST标签、麦芽糖结合蛋白标签、荧光蛋白标签(例如eGFP)、T7标签、V5标签和Xpress标签。
胞外结构域是靶特异性结合元件，有时也称为CAR的靶向臂。选择胞外结构域以识别配体，该配体作为与特定疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标记。本发明的CAR被工程化以通过工程化特异性结合HLA-A2表位的合适的胞外结构域来靶向展示HLA-A2的细胞。本发明的CAR的靶特异性结合元件或抗原结合结构域在本文中可以被称为抗HLA-A2结合结构域。在一些实施方案中，该抗HLA-A2结合结构域可以是人源化的抗HLA-A2结合结构域。
跨膜结构域与CAR的胞外结构域和胞质结构域连接。每当CAR的胞外结构域与靶结合时，跨膜结构域能够向胞质结构域的胞内信号传导结构域发出信号。
CAR的包含胞内信号传导结构域的胞质结构域负责活化已将CAR置于其中的免疫细胞(例如，调节性T细胞)的至少一种生理效应子功能。术语"效应子功能"是指免疫细胞的特定功能。例如，调节性T细胞的效应子功能可以包括抑制或下调其他免疫细胞的诱导和/或增殖。此外，Treg的效应子功能可以包括对非免疫细胞的导致临床状态改善的作用，例如促进组织修复或再生。因此，术语"胞内信号传导结构域"是指转导效应子功能信号并且指导免疫细胞执行其专门功能的蛋白的部分。虽然通常可以使用整个胞内信号传导结构域，但是在许多情况下，不必使用整个链。就使用胞内信号传导结构域的截短部分而言，只要此类截短部分转导了效应子功能信号，就可以使用其代替完整链。因此，术语胞内信号传导结构域意在包括足以转导效应子功能信号的胞内信号传导结构域的任何截短部分。
在一个实施方案中，在CAR的抗原结合结构域和跨膜结构域之间或在CAR的胞内信号传导结构域和跨膜结构域之间可以引入间隔结构域(或连接子或铰链)。如上文所定义，间隔结构域、连接子和铰链是寡肽或多肽，其功能是将跨膜结构域连接到多肽链中的抗原结合结构域或胞内信号传导结构域。间隔结构域可以包含例如多达300个氨基酸、10至100个氨基酸、25至75个氨基酸或25至50个氨基酸，或这些范围内的任何子范围或单个数值的氨基酸。
胞外结构域
该胞外结构域包含本发明的抗HLA-A2抗体。在一个实施方案中，该胞外结构域包含本发明的人源化的抗HLA-A2抗体。
在一个实施方案中，该胞外结构域包含本发明的抗HLA-A2抗体，其是scFv、scFab或sdAb。在一个实施方案中，该胞外结构域包含本发明的抗HLA-A2抗体，其为scFv或scFab。在一个实施方案中，该胞外结构域包含本发明的抗HLA-A2抗体，其为sdAb。在一个实施方案中，该胞外结构域包含本发明的抗HLA-A2抗体，其为scFv。在一个实施方案中，该胞外结构域包含本发明的抗HLA-A2抗体，其为scFab。在一个实施方案中，该胞外结构域包含本发明的任何人源化的抗HLA-A2抗体，其中该人源化的抗HLA-A2抗体是scFv、scFab或sdAb。在一个实施方案中，该胞外结构域包含本发明的任何人源化的抗HLA-A2抗体，其中该人源化的抗HLA-A2抗体是scFv或scFab。在一个实施方案中，该胞外结构域包含本发明的人源化的抗HLA-A2抗体，其为sdAb。在一个实施方案中，该胞外结构域包含本发明的人源化的抗HLA-A2抗体，其为scFv。在一个实施方案中，该胞外结构域包含本发明的人源化的抗HLA-A2抗体，其为scFab。
在一些实施方案中，胞外结构域可以包含铰链，其中跨膜结构域通过铰链与CAR的胞外区，例如CAR的抗原结合结构域连接。在一个实施方案中，铰链可以来自人蛋白。例如，在一个实施方案中，铰链可以是人Ig(免疫球蛋白)铰链，例如IgG4铰链或CD8α铰链。在一些情况下，本发明的CAR的胞外结构域可以包含CD8α铰链。在一个实施方案中，铰链区包含CD8α的茎区。在一个实施方案中，CD8铰链可由美国专利号9,102,760的SEQ ID NO：15的核酸序列编码。在一个实施方案中，CD8铰链可包含美国专利号9,102,760的SEQ ID NO：21的氨基酸序列。在另一个实施方案中，CD8铰链可包含美国专利号9,102,760的SEQ ID NO：21的氨基酸序列。在一个实施方案中，铰链或间隔子可以包含表3中SEQ ID NO：115或219的氨基酸序列。在一个实施方案中，铰链或间隔子可由表4中SEQ ID NO：159或220的核酸序列编码。
跨膜结构域
跨膜结构域可以衍生自天然来源或合成来源。在一个实施方案中，跨膜结构域可以源自天然来源，例如，源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。
在一个实施方案中，CAR的跨膜结构域可以源自与CAR的结构域之一天然相关的跨膜结构域。在其它实施方案中，跨膜结构域可以通过氨基酸取代来选择或修饰，以避免这样的结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以最小化与受体复合物的其它成员的相互作用。
在一个实施方案中，跨膜结构域可以包含与跨膜区相邻的一个或多个另外的氨基酸，例如，与跨膜蛋白所源自的蛋白的胞外区相关的一个或多个氨基酸(例如，胞外区的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸)和/或与跨膜蛋白所源自的蛋白的胞质区相关的一个或多个另外的氨基酸(例如，胞质区的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸)。
在一个实施方案中，跨膜结构域可包含选自以下组成的组的蛋白的跨膜结构域：CD3γ，CD3δ，CD3ε，CD3ζ，T细胞受体的α链，T细胞受体的β链，T细胞受体的γ链，T细胞受体的δ链，CD28、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CDl la、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRFl)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7R a、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、PD1、ITGAX、CDl1c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CDIOO(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D和/或NKG2C和CD154，及其任意组合。在一个实施方案中，跨膜结构域可包含CD28的跨膜结构域。在一个实施方案中，CD28跨膜结构域由表4中SEQ ID NO：160的核酸序列编码，在一个实施方案中，CD28跨膜结构域包含表3中SEQ ID NO：116的氨基酸序列。在另一个实施方案中，CD28跨膜结构域包含表3中的SEQ ID NO：116的氨基酸序列。
在一个实施方案中，跨膜结构域可包含CD8的跨膜结构域。在一个实施方案中，CD8跨膜结构域由美国专利号9,102,760的SEQ ID NO：16的核酸序列编码。在一个实施方案中，CD8跨膜结构域包含美国专利号9,102,760的SEQ ID NO：22的氨基酸序列。在另一个实施方案中，CD8跨膜结构域包含美国专利号9,102,760的SEQ ID NO：22的氨基酸序列。
在一个实施方案中，CD8跨膜结构域由表4中SEQ ID NO：224的核酸序列编码。在一个实施方案中，CD8跨膜结构域包含表3中的SEQ ID NO：223的氨基酸序列。
在其它实施方案中，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，它可以主要包含疏水残基，包含亮氨酸和缬氨酸。在一个实施方案中，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸三联体可出现在合成跨膜结构域的每个末端。
在一个实施方案中，短的寡肽或多肽连接子可以在CAR的跨膜结构域和胞质结构域之间形成连接。在一个实施方案中，连接子可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的长度。在一个实施方案中，连接子可包含甘氨酸-丝氨酸成对物。
胞质结构域
在一个实施方案中，用于本发明CAR的胞内信号传导结构域可以包含T细胞受体(TCR)和共同受体(它们在抗原受体参与后共同作用启动信号转导)的胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何合成序列。
初级胞质信号序列以刺激方式或抑制方式调节TCR复合物的初级活化。以刺激方式起作用的初级胞质信号传导序列可以含有已知为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。在本发明中特别有用的包含初级胞质信号传导序列的ITAM的实例包括那些衍生自CD3ζ、FcRγ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的ITAM。在一个实施方案中，初级信号传导结构域包含经修饰的ITAM结构域，例如突变的ITAM结构域，其与天然ITA结构域相比具有改变的(例如增加或降低的)活性。在一个实施方案中，初级信号传导结构域包含含有修饰的ITAM的初级胞内信号传导结构域，例如含优化和/或截短的ITAM的初级胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，初级信号传导结构域包含一个、两个、三个、四个或更多个ITAM基序。
在一个实施方案中，胞内信号传导结构域包含选自由以下组成的组的蛋白的功能性信号传导结构域：CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、FcRγ(例如FcγRI、RCγRIIA、FcγRIIB1、FcγRIIB2、FcγRIIIA或FcγRIIIB)、FcRα(例如FcαRI)、FcRε(例如FcεRI或FcεRII)、CD5、CD22、CD79a、CD79b、DAP10、DAP12和CD66d及其任何组合。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域包含CD3-ζ的初级信号传导结构域或由其组成。
已知仅通过TCR产生的信号可能不足以完全活化T细胞，且可能还需要次级或共刺激信号。因此，在某些实施方案中，T细胞活化可以由两类胞质信号传导序列介导：通过TCR引发抗原依赖性初级活化的那些(初级胞质信号传导序列)和以抗原非依赖性方式作用以提供次级或共刺激信号的那些(次级胞质信号传导序列)。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域可以进一步包含共刺激结构域。
在一个实施方案中，CAR的胞内信号传导结构域可以包含CD3-ζ信号传导结构域本身，或者它可以与在本发明的CAR的背景中有用的任何其他期望的胞内信号传导结构域组合。例如，CAR的胞内信号传导结构域可以包含CD3ζ链部分和共刺激信号传导结构域。共刺激信号传导结构域是指CAR的包含共刺激分子的胞内结构域的部分。共刺激分子是淋巴细胞对抗原有效应答所需的除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子。这样的分子的实例包括：OX40、CD27、CD28、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)(CD11a/CD18)、TNFR1(CD120a/TNFRSF1A)、TNFR2(CD120b/TNFRSF1B)、CTLA-4(CD152)、CD95、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、CD2、CD30、CD40、PD-1、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、ICAM-1、与CD83特异性结合的配体、IL2ra(CD25)、IL6Ra(CD126)、IL-7Ra(CD127)、IL-13RA1、IL-13RA2、IL-33R(IL1RL1)、IL-10RA、IL-10RB、IL-4R、IL-5R(CSF2RB)、ARHR、BAFF受体、IL-21R、TGFbR1、TGFbR2、TGFbR3、共同γ链、I类MHC分子、BTLA和Toll配体受体、特异结合CD83的配体、CDS、ICAM-1、GITR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160(BY55)、CD19、CD19a、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CitgbD18、ITGB7、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKG2D等。
本发明CAR胞质部分中的胞内信号传导序列可以以随机或特定顺序彼此连接。任选地，短的寡肽或多肽连接子，例如长度在1至10个氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)之间的短的寡肽或多肽连接子，可以形成胞内信号传导序列之间的连接。在一个实施方案中，甘氨酸-丝氨酸成对物可用作合适的连接子。在一个实施方案中，单个氨基酸，例如丙氨酸、甘氨酸，可以用作合适的连接子。
在一个实施方案中，将胞内信号传导结构域设计为包含两个或更多个，例如2、3、4、5或更多个共刺激信号传导结构域。在一个实施方案中，两个或更多个，例如2、3、4、5或更多个共刺激信号传导结构域被连接子分子，例如本文所述的连接子分子分开。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域包含两个共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，连接子分子是甘氨酸残基。在一些实施方案中，连接子是丙氨酸残基。
在一个实施方案中，胞质结构域可包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在另一个实施方案中，胞质结构域可包含CD3-ζ的信号传导结构域和4-IBB的信号传导结构域。在另一个实施方案中，胞质结构域可包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD28和4-1BB的信号传导结构域。
在一个实施方案中，胞质结构域可包含CD28的信号传导结构域和CD3-ζ的信号传导结构域，其中CD28的信号传导结构域由表4中SEQ ID NO：161所示核酸序列编码，CD3-ζ的信号传导结构域由表4中SEQ ID NO：162所示核酸序列编码。
在一个实施方案中，胞质结构域可包含CD28的信号传导结构域和CD3-ζ的信号传导结构域，其中CD28的信号传导结构域包含表3中SEQ ID NO：117的氨基酸序列，CD3-ζ的信号传导结构域包含表3中SEQ ID NO：118的氨基酸序列。
在一个实施方案中，胞质结构域可包含CD28的信号传导结构域和CD3-ζ的信号传导结构域，其中CD28的信号传导结构域包含表3中SEQ ID NO：117所示的氨基酸序列，CD3-ζ的信号传导结构域包含表3中SEQ ID NO：118所示的氨基酸序列。
在一个实施方案中，胞质结构域可包含4-1BB的信号传导结构域和CD3-ζ的信号传导结构域，其中4-1BB的信号传导结构域由美国专利号9,102,760的SEQ ID NO：17所示的核酸序列编码，CD3-ζ的信号传导结构域由表4的SEQ ID NO：162所示的核酸序列编码。
在一个实施方案中，胞质结构域可包含4-1BB的信号传导结构域和CD3-ζ的信号传导结构域，其中4-1BB的信号传导结构域包含美国专利号9,102,760的SEQ ID NO：23的氨基酸序列，CD3-ζ的信号传导结构域包含表3中SEQ ID NO：118的氨基酸序列。
在一个实施方案中，胞质结构域可包含4-1BB的信号传导结构域和CD3-ζ的信号传导结构域，其中4-1BB的信号传导结构域包含美国专利号9,102,760的SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列，CD3-ζ的信号传导结构域包含表3中的SEQ ID NO：118所示的氨基酸序列。
在一个实施方案中，CAR包含SEQ ID NO：119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138或213中所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，CAR包含与SEQ ID NO：119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138或213具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
V.核酸和载体
在一些实施方案中，本发明提供编码本发明的抗HLA-A2抗体的核酸。在一些实施方案中，本发明提供了编码本发明的人源化的抗HLA-A2抗体的核酸。在一些实施方案中，本发明提供了编码包含SEQ ID NO：72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90或91中所示的氨基酸序列的蛋白的核酸。在一些实施方案中，本发明提供了编码包含SEQ ID NO：93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111或112中所示的氨基酸序列的蛋白的核酸。在一些实施方案中，本发明提供了编码包含与SEQ ID NO：72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90或91具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的蛋白的核酸。在一些实施方案中，本发明提供了编码包含与SEQ ID NO：93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111或112具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的蛋白的核酸。在一些实施方案中，本发明提供了包含SEQ ID NO：139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157或158中所示的核酸序列的核酸。在一些实施方案中，本发明提供了包含与SEQ ID NO：139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157或158具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列的核酸。在一些实施方案中、本发明提供了由包含SEQ ID NO：139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157或158中所示核酸序列的核酸编码的蛋白。在一些实施方案中、本发明提供了由包含与SEQ ID NO：139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157或158具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列的核酸编码的蛋白。在一些实施方案中、本发明提供了编码包含SEQ ID NO：61、62、63、64、65、66、67、68、69、70或71中所示氨基酸序列的蛋白的核酸。在一些实施方案中、本发明提供了编码包含与SEQ ID NO：61、62、63、64、65、66、67、68、69、70或71具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的蛋白的核酸。
在一些实施方案中，本发明提供编码本发明的嵌合抗原受体(CAR)的核酸。本发明的编码CAR的核酸序列可编码包含如本文任何地方所述的胞外结构域的CAR。
该胞外结构域可包含本发明的抗HLA-A2抗体。胞外结构域可以包含本发明的人源化的抗HLA-A2抗体。在一个实施方案中，胞外结构域可进一步包含前导序列。在一个实施方案中，前导序列包含SEQ ID NO：113中所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，该胞外结构域包含铰链区，其中该抗HLA-A2结合结构域通过该铰链区连接至该跨膜结构域。在一个实施方案中，铰链区包含CD8α的茎区。
本发明的核酸序列可编码包含本文任何地方所述的跨膜结构域的CAR。例如，在一个实施方案中，跨膜结构域包含选自由以下组成的组的蛋白的跨膜结构域：CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、T细胞受体的α链、T细胞受体的β链、T细胞受体的γ链、T细胞受体的δ链、CD28、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CDl la、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRFl)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7R a、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、PD1、ITGAX、CDl1c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CDIOO(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D和/或NKG2C和CD154，以及它们的任意组合。在一个实施方案中，跨膜结构域包含CD28的跨膜结构域。
本发明的核酸序列可编码包含本文任何地方所述的胞质结构域的CAR。此外，胞质结构域可以包含如本文任何地方所述的胞内信号传导结构域。例如，在一个实施方案中，胞内信号传导结构域包含选自由以下组成的组的蛋白的功能性信号传导结构域：CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、FcRγ(例如，FcγRI、RCγRIIA、FcγRIIB1、FcγRIIB2、FcγRIIIA或FcγRIIIB)、FcRα(例如，FcαRI)、FcRε(例如，FcεRI或FcεRII)、CD5、CD22、CD79a、CD79b、DAP10、DAP12和CD66d及其任何组合。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域包含CD3ζ的功能性信号传导结构域。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域还包含共刺激结构域。由本发明的核酸序列编码的CAR的共刺激结构域可以是如本文任何地方所述的共刺激结构域。例如，在一个实施方案中，共刺激结构域包含选自由以下组成的组的蛋白的功能性信号传导结构域：OX40、CD27、CD28、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)(CD11A/CD18)、TNFR1(CD120a/TNFRSF1A)、TNFR2(CD120b/TNFRSF1B)、CTLA-4(CD152)、CD95、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、CD2、CD30、CD40、PD-1、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、ICAM-1、与CD83特异性结合的配体、IL2ra(CD25)、IL6Ra(CD126)、IL-7Ra(CD127)、IL-13RA1、IL-13RA2、IL-33R(IL1RL1)、IL-10RA、IL-10RB、IL-4R、IL-5R(CSF2RB)、ARHR、BAFF受体、IL-21R、TGFbR1、TGFbR2、TGFbR3、共有γ链、I类MHC分子、BTLA和Toll配体受体、特异性结合CD83的配体、CDS、ICAM-1、GITR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160(BY55)、CD19、CD19a、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CitgbD18、ITGB7、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKG2D及其任何组合。在一个实施方案中，共刺激结构域包含选自由CD28、4-1BB及其组合组成的组的蛋白的功能性信号传导结构域。在一个实施方案中，共刺激结构域包含CD28的功能性信号传导结构域。在一个实施方案中，共刺激结构域包含4-1BB的功能性信号传导结构域。在一个实施方案中，包含胞内信号传导结构域的序列在相同的框中表达并且表达为单个多肽链。
本发明的核酸序列可以是分离的核酸序列。
在一个实施方案中，核酸作为信使RNA转录物提供。在一个实施方案中，核酸以DNA构建体提供。
在一个实施方案中，提供了包含编码CAR的序列的重组DNA构建体，其中CAR包含：(i)包含抗HLA-A2抗体的胞外结构域；(ii)跨膜结构域；和(iii)包含胞内信号传导结构域的胞质结构域，其中编码的CAR能够在人细胞中表达，使得CAR能够特异性结合HLA-A2。在一个实施方案中，CAR能够特异性地结合至HLA-A*02:01。在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体为人源化的抗HLA-A2抗体。在一个实施方案中，人细胞是免疫细胞。在一个实施方案中，免疫细胞是调节性免疫细胞。在一个实施方案中，免疫细胞是调节性T细胞(Treg)。在一个实施方案中，免疫细胞是T细胞。在一个实施方案中，T细胞是Treg。
在一个实施方案中，提供了包含编码CAR的序列的重组DNA构建体，其中CAR包含：(i)包含抗HLA-A2抗体的胞外结构域；(ii)跨膜结构域；和(iii)包含胞内信号传导结构域的胞质结构域，其中编码的CAR能够在调节性T细胞(Treg)中表达，使得CAR能够特异性结合HLA-A2。在一个实施方案中，CAR能够特异性地结合至HLA-A*02:01。在一个实施方案中，CAR与HLA-A2的结合可通过使用如本文所示例的HLA-A2四聚体来检测。在一个实施方案中，该抗HLA-A2抗体为人源化的抗HLA-A2抗体。在一个实施方案中，Treg是人Treg。
在一个实施方案中，编码的CAR能够在免疫细胞中表达，使得免疫细胞被HLA-A2活化。在一个实施方案中，免疫细胞被HLA-A*02:01活化。在一个实施方案中，免疫细胞是调节性免疫细胞。在一个实施方案中，免疫细胞是调节性T细胞(Treg)。在一个实施方案中，免疫细胞是T细胞。在一个实施方案中，T细胞是Treg。在一个实施方案中，免疫细胞是人免疫细胞。在一个实施方案中，调节性免疫细胞是人调节性免疫细胞。在一个实施方案中，T细胞是人T细胞。在一个实施方案中，Treg是人Treg。
在一个实施方案中，编码的CAR与包含以下的抗体竞争结合HLA-A2：具有SEQ IDNO：183的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)；具有SEQ ID NO：185的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)；具有SEQ ID NO：187氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)；具有SEQ ID NO：188的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)；具有SEQ ID NO：189的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)；和具有SEQ ID NO：190的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)。在一个实施方案中，编码的CAR与抗体结合相同的HLA-A2表位，所述抗体包含：具有SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)；具有SEQ ID NO：185的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)；具有SEQ ID NO：187氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)；具有SEQ ID NO：188的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)；具有SEQ ID NO：189的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)；和具有SEQ ID NO：190的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)。在一个实施方案中，编码的CAR与BB7.2抗体竞争结合HLA-A2。在一个实施方案中，编码的CAR与BB7.2抗体结合相同的HLA-A2表位。
在一些实施方案中，本发明提供了编码包含SEQ ID NO：119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138或213中所示氨基酸序列的蛋白的核酸。在一些实施方案中，本发明提供了编码包含与SEQ ID NO：119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138或213具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的蛋白的核酸。在一些实施方案中，本发明提供了包含SEQ ID NO：163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182或214中所示的核酸序列的核酸。在一些实施方案中，本发明提供了包含与SEQ ID NO：163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182或214具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列的核酸。在一些实施方案中，本发明提供了由包含SEQ ID NO：163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182或214中所示核酸序列的核酸编码的蛋白。在一些实施方案中，本发明提供了由包含与SEQ ID NO：163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182或214具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列的核酸编码的蛋白。
编码所需分子的核酸序列可以使用本领域已知的重组方法获得，例如通过从表达基因的细胞筛选文库，通过从已知包含相同基因的载体衍生基因，或通过使用标准技术直接从含有相同基因的细胞和组织分离。或者，目的核酸可以合成产生，而不是克隆。
本发明进一步提供了包含编码抗HLA-A2抗体的核酸分子或编码CAR的核酸分子的载体。在一个实施方案中，本发明提供了一种包含编码人源化的抗HLA-A2抗体的核酸分子的载体。在一个实施方案中，本发明提供了其中插入了这种核酸分子的载体。
在一个实施方案中，本发明提供了包含本文任何地方所述的核酸序列的载体。
在一些实施方案中，本发明提供了一种包含编码本文描述的任何抗HLA-A2抗体的核酸的载体。在其他实施方案中，本发明提供了一种包含编码本文所述的任何人源化的抗HLA-A2抗体的核酸的载体。在一些实施方案中，本发明提供了包含核酸的载体，所述核酸包含SEQ ID NO：139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157或158中所示的核酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了包含核酸的载体，所述核酸包含与SEQ ID NO：139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157或158具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。在某些方面，提供了包含这种载体的宿主细胞。
在一个实施方案中，本发明提供了包含本发明的编码CAR的核酸的载体。在一些实施方案中，本发明提供了包含SEQ ID NO：163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182或214中所示的核酸序列的载体。在一些实施方案中，本发明提供了包含核酸的载体，所述核酸包含具有与SEQ ID NO：163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182或214具有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
在一个实施方案中，本发明的载体可以转导到细胞中。在一个实施方案中，本发明的载体可以通过非病毒载体方法转导或工程化到人细胞中。在一个实施方案中，本发明的载体可以转导到免疫细胞中。在一个实施方案中，免疫细胞是调节性免疫细胞。在一个实施方案中，免疫细胞是调节性T细胞(Treg)。在一个实施方案中，免疫细胞是T细胞。在一个实施方案中，T细胞可以是Treg。在一个实施方案中，载体能够在哺乳动物免疫细胞中表达CAR。在一个实施方案中，哺乳动物免疫细胞是人免疫细胞。在一个实施方案中，载体能够在哺乳动物调节性免疫细胞中表达CAR。在一个实施方案中，哺乳动物调节免疫细胞是人调节免疫细胞。在一个实施方案中，载体能够在哺乳动物T细胞中表达CAR。在一个实施方案中，哺乳动物T细胞是哺乳动物调节性T细胞。在一个实施方案中，哺乳动物T细胞是人T细胞。在一个实施方案中，哺乳动物T细胞是人调节性T细胞。
在一个实施方案中，载体是克隆载体或表达载体，例如包括但不限于一个或多个质粒(例如表达质粒、克隆载体、迷你环、迷你载体、双微染色体)、逆转录病毒和慢病毒载体构建体的载体。
本发明包括表达CAR的逆转录病毒和慢病毒载体构建体，其可直接转导至细胞中。来源于逆转录病毒如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期稳定整合及其在子细胞中的增殖。慢病毒载体比衍生自致癌逆转录病毒如鼠白血病病毒的载体具有额外的优点，因为它们可以转导非增殖细胞如肝细胞。它们还具有低免疫原性的额外优点。
简而言之，编码CAR的天然或合成核酸的表达通常通过将编码CAR多肽或其部分的核酸与启动子有效连接，并将构建体引入表达载体中来实现。所述载体可适于复制和整合真核生物。典型的克隆载体含有转录和翻译终止子、起始序列和可用于调节所需核酸序列表达的启动子。
除了上述方法之外，还可以使用以下方法。
使用标准的基因递送方案，本发明的表达构建体也可以用于核酸免疫和基因治疗。基因递送的方法是本领域已知的。参见例如美国专利5,399,346、5,580,859、5,589,466，其全部内容通过引用并入本文。在另一个实施方案中，本发明提供了基因治疗载体。在另一个实施方案中，可以使用基因组编辑技术如CRISPR-Cas9或基于TALEN的技术将编码本发明CAR的核酸引入接受者免疫细胞的基因组中(Delhove，J.M.K.M.等，2017；Eyquem，J等，2017)。
核酸可以克隆到多种类型的载体中。例如，核酸可被克隆到载体中，包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
此外，表达载体可以以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术是本领域公知的，并且描述于例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)和其它病毒学和分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘病毒和慢病毒(参见例如美国专利5,350,674和5,585,362)。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中有功能的复制起点、启动子序列、方便的限制性内切核酸酶位点和一个或多个选择标记(例如WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。
已经开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了方便的平台。可以使用本领域已知的技术将选择的基因插入载体并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可分离重组病毒并将其体内或离体递送到受试者的细胞中。许多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体是本领域已知的。在一个实施方案中，使用慢病毒载体。
另外的转录活性元件，例如启动子和增强子，可以调节转录起始的频率。通常，对于核心启动子，它们位于起始位点上游30-110bp的区域，尽管最近已经显示许多启动子也含有起始位点下游的功能元件，并且增强子元件通常位于起始位点上游500-2000bp。启动子元件之间的间隔通常是灵活的，以便当元件相对于彼此倒置或移动时，启动子功能得以保持。在胸苷激酶(TK)启动子中，启动子元件之间的间隔可以在活性开始下降之前增加到50bp。取决于启动子，似乎单个元件可以协同或独立地发挥作用以活化转录。
合适的启动子的一个实例是即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是强组成型启动子序列，其能够驱动与其有效连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。合适的启动子的另一个实例是延伸生长因子-1α(EF-1α)。合适启动子的另一个实例是磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。然而，也可以使用其它组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、Epstein-Barr病毒即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子，以及人基因启动子，例如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，本发明不应限于使用组成型启动子。诱导型启动子也被考虑作为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了一种分子开关，当需要表达时，该开关能够开启与其有效地连接的多核苷酸序列的表达，或者当不需要表达时，关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，待引入细胞的表达载体还可以含有选择标记基因或报告基因或两者，以促进从寻求通过病毒载体转染或感染的细胞群体中鉴定和选择表达细胞。在其它方面，选择性标记可以携带在单独的DNA片段上并用于共转染方法中。选择标记和报告基因的侧翼都可以有合适的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的选择标记包括例如抗生素抗性基因，如neo等。
报道基因用于鉴定潜在转染的细胞和用于评价调节序列的功能性。通常，报告基因是不存在于或表达于受体生物体或组织中的基因，并且其所编码多肽的表达通过一些容易检测的性质例如酶活性来显示。报道基因的表达在DNA导入受体细胞后的合适时间来测定。合适的报道基因可包括编码萤光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白基因的基因(例如Ui-Tei等人，2000FEBS Letters 479:79-82)。合适的表达系统是公知的，可以使用已知技术制备或商业获得。通常，将具有最小5'侧翼区且显示报告基因表达最高水平的构建体鉴定为启动子。这种启动子区可与报道基因连接，并用于评价试剂调节启动子驱动的转录的能力。
将基因导入细胞并在细胞中表达的方法是本领域已知的。在表达载体的情况下，载体可通过本领域的任何方法容易地引入宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，可通过物理、化学或生物方法将表达载体转移到宿主细胞中。
将多核苷酸导入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域众所周知的(参见，例如，Sambrook等人，2001)。例如，多核苷酸可通过磷酸钙转染被引入宿主细胞。或者，可以通过电穿孔用多核苷酸如RNA转染宿主细胞(参见，例如，WO2007/065957)。
将多核苷酸引入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，例如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送载体的示例性胶体系统是脂质体(例如人工膜囊)。现有技术中核酸靶向递送的其它方法是可用的，例如用靶向纳米颗粒或其它合适的亚微米尺寸的递送系统递送多核苷酸。
在使用非病毒递送系统的情况下，示例性递送载体是脂质体。考虑使用脂质制剂将核酸引入宿主细胞(体外、离体或体内)。在另一个方面，核酸可以与脂质结合。与脂质结合的核酸可以包封在脂质体的水性内部，散布在脂质体的脂质双层内，通过与脂质体和寡核苷酸都结合的连接分子附着于脂质体，包裹在脂质体中，与脂质体复合，分散在含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，作为悬浮液包含在脂质中，包含或复合有胶束，或者以其它方式与脂质结合。与脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关的组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双层结构、胶束形式存在，或具有"坍塌"结构。它们也可以简单地分散在溶液中，可能形成尺寸或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，其可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂族烃及其衍生物例如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛的化合物。
适合使用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻基磷脂酰胆碱("DMPC")可以从Sigma,St.Louis,MO获得；双十六烷基磷酸酯("DCP")可以从K&K Laboratories(Plainview，NY)获得；胆固醇("Choi")可从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻基磷脂酰甘油("DMPG")和其它脂质可以从Avanti Polar Lipids，Inc.(Birmingham，AL)获得。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液可以储存在约-20℃。氯仿用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。"脂质体"是包含通过产生封闭的脂质双层或聚集体而形成的各种单层和多层脂质媒介物的通称。脂质体的特征在于具有带有磷脂双层膜和内部水性介质的囊泡结构。多层脂质体具有被水性介质分开的多个脂质层。它们在磷脂悬浮于过量的水性溶液中时自发形成。脂质成分在形成闭合结构之前经历自我重排，并在脂质双层之间截留水和溶解的溶质(Ghosh等人，1991Glycobiology 5:505-10)。然而，在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物也包含在其中。例如，脂质可以呈现胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑了lipofectamine-核酸复合物。
不管用于将外源核酸导入宿主细胞的方法如何，为了证实重组DNA序列在宿主细胞中的存在，可以进行多种测定。这些测定包括例如本领域技术人员熟知的"分子生物学"测定，例如Southern和Northern印迹、RT-PCR和PCR；"生物化学"测定，例如检测特定肽的存在或不存在，例如通过免疫学方法(ELISA和Western印迹)或通过本文所述的鉴定落入本发明范围内的试剂的测定。
VI.CAR修饰的免疫细胞
可以将本发明的编码CAR的核酸引入免疫细胞中以产生表达本发明的CAR的CAR修饰的免疫细胞，所述修饰的免疫细胞如本文所公开的那样使用。CAR修饰的免疫细胞在本文中也可称为"CAR工程化的免疫细胞"。在一个实施方案中，提供了包含如本文任何地方所述的CAR的修饰的免疫细胞。在另一个实施方案中，提供了包含如本文任何地方所述的表达载体的免疫细胞。免疫细胞可以是适用于细胞疗法的任何免疫细胞。在一个实施方案中，免疫细胞可以是人免疫细胞。
在一个实施方案中，免疫细胞选自由淋巴细胞、骨髓来源的细胞及其任何组合组成的组。在一个实施方案中，淋巴细胞选自由T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞及其任何组合组成的组。在一个实施方案中，免疫细胞是T细胞。在一个实施方案中，T细胞选自由CD4+T细胞、CD8+ T细胞、γδT细胞、双阴性(DN)T细胞及其任何组合组成的组。在一个实施方案中，CD4+ T细胞选自由T辅助细胞、调节性T细胞及其任何组合组成的组。在一个实施方案中，免疫细胞是调节性T细胞。在一个实施方案中，Treg是胸腺来源的Treg或适应性或诱导的Treg。在一个实施方案中，Treg是CD4+FOXP3+调节性T细胞或CD4+FOXP3-调节性T细胞(TR1细胞)。在一个实施方案中，Treg是CD4+FOXP3+调节性T细胞。在一个实施方案中，Treg是CD4+FOXP3-调节性T细胞(TR1细胞)。在一个实施方案中，CD8+ T细胞是细胞毒性CD8+ T细胞或CD8+调节性T细胞。在一个实施方案中，CD8+ T细胞是CD8+调节性T细胞。在一个实施方案中，CD8+调节性T细胞选自由CD8+CD28-调节性T细胞、CD8+CD103+调节性T细胞、CD8+FoxP3+调节性T细胞、CD8+CD122+调节性T细胞及其任何组合的组。在一个实施方案中，CD8+调节性T细胞是INFγ+IL10+IL34+CD8+CD45RC低调节性T细胞。在一个实施方案中，γδT细胞是调节性γδT细胞。在一个实施方案中，DN T细胞是调节性DN T细胞。在一个实施方案中，免疫细胞是B细胞。在一个实施方案中，B细胞是调节性B细胞。在一个实施方案中，调节性B细胞是CD19+CD24hiCD38 hi B细胞。在一个实施方案中，NK细胞是调节性NK细胞。在一个实施方案中，骨髓衍生的细胞优选选自由以下组成的组：嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞或其任何组合的组。在一个实施方案中，巨噬细胞是调节性巨噬细胞。在一个实施方案中，树突细胞是调节性树突细胞。
在一个实施方案中，免疫细胞是调节性免疫细胞。免疫细胞可以是适用于细胞疗法的任何调节性免疫细胞(参见，例如，Wood,K.J.等人,2012；Papp,G.等人,2017)。在一个实施方案中，调节性免疫细胞可以是人调节性免疫细胞。在一个实施方案中，调节性免疫细胞选自由以下组成的组：调节性T细胞、CD4+调节性T细胞、CD8+调节性T细胞、调节性γδT细胞、调节性DN T细胞、调节性B细胞、调节性NK细胞、调节性巨噬细胞、调节性树突细胞及其任何组合。在一个实施方案中，调节性免疫细胞是CD8+调节性T细胞(参见，例如，Guillonneau,C.等人,2010)。在一个实施方案中，CD8+调节性T细胞选自由以下组成的组：CD8+CD28-调节性T细胞、CD8+CD103+调节性T细胞、CD8+FoxP3+调节性T细胞、CD8+CD122+调节性T细胞及其任何组合。在一个实施方案中，CD8+调节性T细胞是INFγ+IL10+IL34+CD8+CD45R低调节性T细胞。在一个实施方案中，调节性免疫细胞是调节性γδT细胞(参见，例如Wesch,D.,等人,2014)。在一个实施方案中，免疫细胞是调节性DN T细胞(参见，例如，Juvet,S.C.，等人,2012)。在一个实施方案中，调节性免疫细胞是调节性B细胞(参见，例如Chong,A.S.等人,2017)。在一个实施方案中，调节性B细胞是CD19+CD24hiCD38hi B细胞。在一个实施方案中，调节性免疫细胞是调节性NK细胞(参见，例如Fu,B.等人,2013；Crome,S.Q.,等人,2017)。在一个实施方案中，调节性免疫细胞是调节性巨噬细胞(参见，例如Hutchinson,J.A.,等人,2017)。在一个实施方案中，调节性免疫细胞是调节性树突细胞。在一个实施方案中，调节性免疫细胞是调节性T细胞。在一个实施方案中，Treg是胸腺来源的Treg或适应性或诱导的Treg。在一个实施方案中，Treg是CD4+FOXP3+调节性T细胞或CD4+FOXP3-调节性T细胞(TR1细胞)。在一个实施方案中，Treg是CD4+FOXP3+调节性T细胞。在一个实施方案中，Treg是CD4+FOXP3-调节性T细胞(TR1细胞)。
在一个实施方案中，调节性免疫细胞具有以下表型：CD4+CD25+，例如，如CD4+CD25+CD127-，例如，如CD4+CD25+CD127-CD45RA+。在进一步的实施方案中，调节性免疫细胞具有以下表型：FoxP3+CD4+CD25+，例如，如FoxP3+CD4+CD25+CD127-，例如，如FoxP3+CD4+CD25+CD127-CD45RA+。
在一个实施方案中，免疫调节细胞呈现至少一种以下表型：CD4+CD25+，FoxP3+，CD127lo/-，CTLA-4+，CD39+，Helios+，CD62L+/hi，VLA4+，LFA1+，CD49bint，ITGb7int，PSGL-1+，ICOS+，GITR+，PD-1int，Perflo/-，CCR7+。在一个实施方案中，免疫调节细胞不表达颗粒酶A和/或颗粒酶B。
在一个实施方案中，通过流式细胞术、免疫荧光或图像分析，例如高含量分析，进行分子表达水平的测定。优选地，通过流式细胞术进行分子表达水平的测定。在一个实施方案中，在进行流式细胞术分析之前，将细胞固定并透化，从而允许检测胞内蛋白。
在一个实施方案中，测定细胞群中分子的表达水平包括测定细胞群中表达分子的细胞(即，细胞对于分子"+")的百分比。优选地，所述表达分子的细胞的百分比通过FACS测量。
术语"表达(或+)"和"不表达(或-)"是本领域熟知的，并且是指目的细胞标记的表达水平，其中对应于"+"的细胞标记的表达水平是高的或中等的，也称为"+/-"，并且对应于"-"的细胞标记的表达水平是没有的。
术语"低"或"lo"或"lo/-"是本领域公知的，指目的细胞标记的表达水平，其中与作为整体分析的细胞群中该细胞标记的表达水平相比，该细胞标记的表达水平低。更特别地，术语"lo"是指以比一种或多种其他不同细胞群低的水平表达细胞标志物的不同细胞群。
术语"高"或"hi"或"鲜明(bright)"是本领域公知的，并且是指目的细胞标记的表达水平，其中与作为整体分析的细胞群中该细胞标记的表达水平相比，该细胞标记的表达水平高。
通常，染色强度的前2、3、4或5％的细胞被归为"hi"，而落入群体的前半部分的那些被归类为"+"。将落入荧光强度后50％的那些细胞归为"lo"细胞，后5％的细胞归为"-"细胞。
通过比较用对目的细胞标记物特异的荧光标记的抗体染色的细胞群的细胞的中值荧光强度(MFI)和用具有不相关特异性但具有相同同种型、相同荧光探针且来源于相同物种的荧光标记的抗体(称为同种型对照)染色的相同细胞群的细胞的荧光强度(FI)，确定该标记物的表达水平。用对该标记物特异的荧光标记的抗体染色的细胞群中的，显示与用同种型对照染色的细胞相当的MFI或更低的MFI的细胞不表达该标记物，然后被归为(-)或阴性。用对该标记物特异的荧光标记的抗体染色的群体中的，MFI值优于用同种型对照染色的细胞的细胞表达该标记物，然后归为(+)或阳性。
在一个实施方案中，本发明的免疫细胞在其细胞表面表达本发明的CAR，和结合至除HLA-A2之外的另一配体的另一受体(本文称为"第二受体")。根据本发明，该第二受体包含胞外配体结合结构域、任选的铰链、任选的跨膜结构域和胞内信号传导结构域，如前所述。
在一个实施方案中，所述第二受体是内源性的(例如，内源性TCR)。在另一个实施方案中，第二受体是外源的，并且其表达通过转化或转导编码它的核酸在本发明的免疫细胞中诱导。所述外源受体可以是外源TCR或嵌合抗原受体。因此，在一个实施方案中，本发明的免疫细胞表达两种嵌合抗原受体，其中第一种识别HLA-A2，第二种识别不同的配体。
在另一个实施方案中，本发明的免疫细胞在其细胞表面表达本发明的CAR，和结合HLA-A2中的另一个表位的另一个受体(本文称为"第二受体")。根据本发明，该第二受体包含胞外配体结合结构域、任选的铰链、任选的跨膜结构域和胞内信号传导结构域，如前所述。
在另一个实施方案中，本发明的免疫细胞表达两种CAR，其中第一种识别HLA-A2的第一表位，第二种识别HLA-A2上的不同表位。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含第一胞内信号传导结构域，并且第二受体包含不同的第二胞内信号传导结构域。在第一个实施方案中，本发明的CAR包含T细胞初级信号传导结构域(例如，CD3ζ)，并且第二受体包含共刺激信号传导结构域(例如，4-1BB的共刺激信号传导结构域、CD28的共刺激信号传导结构域或4-1BB和CD28的共刺激信号传导结构域的组合)。在第二个实施方案中，本发明的CAR包含共刺激信号传导结构域(例如，4-1BB的共刺激信号传导结构域、CD28的共刺激信号传导结构域或4-1BB和CD28的共刺激信号传导结构域的组合)，并且第二受体包含T细胞初级信号传导结构域(例如，CD3ζ)。
因此，根据这些实施方案，本发明的免疫细胞的完全活化需要本发明的CAR与HLA-A2的结合，以及第二受体与其所针对的配体的结合两者。
在一个实施方案中，由第二受体识别的配体在患病组织或器官中或在自身免疫应答的位点表达或存在。
可被第二受体识别的配体的实例包括但不限于来自普通人饮食的食物抗原、自身抗原、吸入的变应原、摄入的变应原或接触变应原。
术语"来自普通人类饮食的食物抗原"是指免疫原性肽，其来自人类普通的食物，例如以下非限制性列表的食物抗原：牛抗原例如脂质运载蛋白、Ca结合S100、α-乳白蛋白、乳球蛋白例如β-乳球蛋白、牛血清白蛋白、酪蛋白。食物抗原也可以是大西洋鲑鱼抗原，例如小清蛋白；鸡抗原，例如卵类粘蛋白、卵清蛋白、Ag22、伴清蛋白、溶菌酶或鸡血清白蛋白；花生抗原；虾抗原，例如原肌球蛋白；小麦抗原，例如凝集素或醇溶蛋白；芹菜抗原，例如芹菜前纤维蛋白；胡萝卜抗原，如胡萝卜前纤维蛋白；苹果抗原，例如索马甜、苹果脂质转移蛋白或苹果前纤维蛋白；梨抗原，如梨前纤维蛋白或异黄酮还原酶；鳄梨抗原，如内切壳多糖酶；杏抗原，例如杏脂质转移蛋白；桃抗原，如桃脂质转移蛋白或桃前纤维蛋白；大豆抗原，例如HPS、大豆前纤维蛋白或(SAM22)PR-I0 prot；其片段、变体和混合物。
在一个实施方案中，所述自身抗原是多发性硬化相关抗原、关节相关抗原、眼相关抗原、人HSP抗原、皮肤相关抗原或涉及移植物排斥或GVHD的抗原。
术语"多发性硬化相关抗原"是指髓鞘碱性蛋白(MBP)、髓鞘相关糖蛋白(MAG)、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、蛋白脂质蛋白(PLP)、少突胶质细胞髓鞘寡聚蛋白(OMGP)、髓鞘相关少突胶质细胞碱性蛋白(MOBP)、少突胶质细胞特异性蛋白(OSP/Claudinl1)、热休克蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白(OSP)、NOGO A、糖蛋白Po、外周髓鞘蛋白22(PMP22)、2'3'-环核苷酸3'-磷酸二酯酶(CNPase)、其片段、变体和混合物。
术语"关节相关抗原"是指瓜氨酸取代的环状和线性丝聚蛋白肽、II型胶原蛋白肽、人软骨糖蛋白39(HCgp39)肽、HSP、异质核内核糖核蛋白(hnRNP)A2肽、hnRNP B1、hnRNPD、Ro60/52、HSP60、HSP65、HSP70和HSP90、BiP、角蛋白、波形蛋白、纤维蛋白原、I型、III型、IV型和V型胶原蛋白肽、膜联蛋白V、葡萄糖6磷酸异构酶(GPI)、乙酰钙蛋白酶抑制蛋白、丙酮酸脱氢酶(PDH)、醛缩酶、拓扑异构酶I、snRNP、PARP、Scl-70、Scl-100、磷脂抗原包括阴离子心磷脂和磷脂酰丝氨酸、电荷中性的磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱、基质金属蛋白酶、原纤维蛋白、聚集蛋白聚糖(aggreccan)、其片段、变体和混合物。
术语"眼睛相关抗原"是指II型胶原、视网膜抑制蛋白(arrestin)、S-抑制蛋白、光感受器间维生素A类结合蛋白(IRBP1)、β-晶体蛋白B1、视网膜蛋白、脉络膜蛋白及其片段、变体和混合物。
术语"人HSP抗原"指人HSP60、HSP70、HSP90、其片段、变体和混合物。
皮肤相关抗原的实例包括但不限于角质形成细胞抗原、存在于真皮或表皮中的抗原、黑素细胞抗原(例如黑色素或酪氨酸酶)、桥粒芯蛋白(例如桥粒芯蛋白1或3，也可称为Dsg1/3)、BP180、BP230、网蛋白、整联蛋白(例如整联蛋白α4β6)、胶原蛋白(例如胶原蛋白VII型)、层粘连蛋白(例如层粘连蛋白332或层粘连蛋白γ1)、斑蛋白(Plakin)(例如包斑蛋白(envoplakin)、周斑蛋白(periplakin)或桥斑蛋白(desmoplakin))、角蛋白(例如KRT5、KRT8、KRT15、KRT17和KRT31)、角蛋白纤丝相关蛋白、丝聚蛋白、角膜锁链蛋白(corneodesmosin)和弹性蛋白。
在一个实施方案中，配体是参与移植排斥或GVHD的抗原。此类抗原的实例包括但不限于对移植组织或宿主特异的MHC、β2-微球蛋白、来自ABO系统的抗原、来自恒河猴血型系统的抗原(特别是来自C、c、E和e和D系统的抗原)和异血凝素。可能涉及移植排斥或GVHD的抗原的其它实例包括但不限于HLA-DR(特别是在移植后的前六个月期间)、HLA-B(特别是在移植后的前两年期间)、次要组织相容性抗原(miHA，例如HLA-E、HLA-F和HLA-G)、对应于MHC I类(B和C)的HLA、对应于MHC II类(DP、DM、DOA、DOB、DQ和DR)的HLA和对应于MHC III类(例如补体系统的组分)的HLA。
自身抗原的其它例子包括但不限于水通道蛋白水通道(例如，水通道蛋白-4水通道(AQP4))、Hu、Ma2、脑衰反应调节蛋白5(CRMP5)和两载蛋白(amphiphysin)、电压门控钾通道(VGKC)、N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸(AMPAR)、甲状腺过氧化物酶、甲状腺球蛋白、抗-N-甲基-D-天冬氨酸受体(NR1亚基)、Rh血型抗原、I抗原、桥粒芯蛋白1或3(Dsg1/3)、BP180、BP230、乙酰胆碱烟碱突触后受体、促甲状腺素受体、血小板整联蛋白、GpIIb:IIIa、胶原(例如胶原α-3(IV)链)、类风湿因子、钙蛋白酶抑制蛋白、瓜氨酸化蛋白、髓磷脂碱性蛋白(MBP)、髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)肽、α-β-晶体蛋白、DNA、组蛋白、核糖体、RNP、组织转谷氨酰胺酶(TG2)、内因子、65-kDa抗原、磷脂酰丝氨酸、核糖体磷蛋白、抗嗜中性粒细胞胞质抗体、Scl-70、U1-RNP、ANA、SSA、抗-SSB、抗核抗体(ANA)、抗嗜中性粒细胞胞质抗体(ANCA)、Jo-1、抗线粒体抗体、gp210、p62、sp100、抗磷脂抗体、U1-70 kd snRNP、GQ1b神经节苷脂、GM1、去唾液酸GM1、GD1b、抗平滑肌抗体(ASMA)、抗肝肾微粒体-1抗体(ALKM-1)、抗肝细胞溶胶抗体-1(ALC-1)、IgA抗肌内膜抗体、中性粒细胞颗粒蛋白、链球菌细胞壁抗原、胃壁胞内因子、胰岛素(IAA)、谷氨酸脱羧酶(GAA或GAD)和蛋白酪氨酸磷酸酶(如IA2或ICA512)、PLA2R1和THSD7A1。
在一个实施方案中，所述配体选自包括卵清蛋白、MOG、II型胶原蛋白片段、其变体和混合物的组。
在一个实施方案中，所述配体是卵清蛋白、其片段、变体和混合物。
在另一个实施方案中，所述配体是MOG、其片段、变体和混合物。
在另一个实施方案中，所述配体是II型胶原、其片段、变体和混合物。
在另一个实施方案中，所述配体是IL23R、其片段、变体和混合物。
在一个实施方案中，本发明的CAR进一步包含识别与HLA-A2不同的配体的胞外配体结合结构域。在一个实施方案中，所述配体结合结构域是抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方案中，本发明的CAR的配体结合结构域是识别HLA-A2上的多个不同表位的多功能抗体。在一个实施方案中，本发明的CAR的配体结合结构域是识别HLA-A2上的两个不同表位的双功能抗体。
在一个实施方案中，本发明的CAR包含胞外配体结合结构域，其包含HLA-A2结合结构域和识别与HLA-A2不同的配体的另一配体结合结构域。在一个实施方案中，所述配体结合结构域是识别HLA-A2和不同配体两者的双功能抗体。
可被本发明的CAR识别的不同于HLA-A2的配体的实例在上文中列出。
在一个实施方案中，本发明的CAR修饰的免疫细胞可以通过将包含期望的CAR的慢病毒载体引入细胞来产生。在一个实施方案中，提供了制备经修饰以表达CAR的免疫细胞的方法，其中所述方法包括用本文任何地方描述的载体转导免疫细胞，从而产生所述经修饰的免疫细胞。
在一个实施方案中，本发明的遗传修饰的免疫细胞通过引入RNA来修饰。在一个实施方案中，体外转录的RNA CAR可以以瞬时转染的形式引入细胞中。RNA可以通过使用聚合酶链式反应(PCR)产生的模板的体外转录来产生。使用合适的引物和RNA聚合酶，通过PCR可将来自任何来源的目的DNA直接转化为体外mRNA合成的模板。DNA的来源可以是，例如，基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、cDNA、合成DNA序列或任何其它合适的DNA来源。体外转录的所需模板是本发明的CAR。
在一个实施方案中，用于PCR的DNA含有开放阅读框。DNA可以来自生物体基因组的天然存在的DNA序列。在一个实施方案中，DNA是全长的目的基因或基因的一部分。该基因可以包含一些或全部5'和/或3'非翻译区(UTR)。基因可以包含外显子和内含子。在一个实施方案中，用于PCR的DNA是人基因。在另一个实施方案中，用于PCR的DNA是包含5'和3'UTR的人基因。DNA或者可以是在天然存在的生物体中正常不表达的人工DNA序列。示例性的人工DNA序列是含有连接在一起形成编码融合蛋白的开放阅读框的基因部分的序列。连接在一起的DNA部分可以来自单个生物体或来自多于一个生物体。
PCR可用于产生用于mRNA体外转录的模板用于转染。进行PCR的方法是本领域公知的。用于PCR的引物被设计成具有与用作PCR模板的DNA区域基本互补的区域。如本文所用，"基本互补"是指其中引物序列中的大多数或所有碱基互补，或一个或多个碱基非互补或错配的核苷酸序列。基本互补的序列能够在PCR的退火条件下与预期的DNA靶退火或杂交。引物可设计成与DNA模板的任何部分基本互补。例如，引物可设计成扩增在细胞中正常转录的基因部分(开放阅读框)，包含5'和3'UTR。引物也可设计成扩增基因的编码特定目的结构域的一部分。在一个实施方案中，设计引物以扩增人cDNA的编码区，包含5'和3'UTR的全部或部分。用于PCR的引物通过本领域熟知的合成方法产生。
"正向引物"是含有与待扩增DNA序列上游的DNA模板上的核苷酸基本互补的核苷酸区域的引物。"上游"在此用于指相对于编码链而言待扩增的DNA序列的5'位置。"反向引物"是含有与双链DNA模板基本互补的核苷酸区域的引物，所述双链DNA模板位于待扩增的DNA序列的下游。"下游"在此用于指相对于编码链而言待扩增DNA序列的3'位置。
任何用于PCR的DNA聚合酶都可以用于本文公开的方法中。试剂和聚合酶可从许多来源商购获得。
也可使用能够促进稳定性和/或翻译效率的化学结构。RNA优选具有5'和3'UTR。在一个实施方案中，5'UTR的长度在零与3000个核苷酸之间。待添加至编码区的5'和3'UTR序列的长度可以通过不同的方法改变，包括但不限于设计与UTR的不同区域退火的PCR引物。使用该方法，本领域普通技术人员可以修饰在转染转录的RNA后实现最佳翻译效率所需的5'和3'UTR长度。5'和3'UTR可以是天然存在的、目的基因的内源5'和3'UTR。或者，可通过将UTR序列引入正向和反向引物或通过模板的任何其它修饰来添加非目的基因内源的UTR序列。使用对于目的基因不是内源的UTR序列可以改变RNA的稳定性和/或翻译效率。例如，已知3'UTR序列中富含AU的元件可以降低mRNA的稳定性。因此，可以基于本领域熟知的UTR的性质选择或设计3'UTR以增加转录的RNA的稳定性。
在一个实施方案中，5'UTR可以包含内源基因的Kozak序列。或者，当通过如上所述的PCR添加不是目的基因内源的5'UTR时，可以通过添加5'UTR序列来重新设计共有Kozak序列。Kozak序列可以提高一些RNA转录本的翻译效率，但似乎不是所有RNA都需要Kozak序列才能进行有效翻译。本领域已知许多mRNA对Kozak序列的要求。在其他实施方案中，5'UTR可源自其RNA基因组在细胞中稳定的RNA病毒。在其它实施方案中，可以在3'或5'UTR中使用各种核苷酸类似物以阻止mRNA的外切核酸酶降解。
为了能够从DNA模板合成RNA而不需要基因克隆，应该在待转录序列上游的DNA模板上连接转录启动子。当起RNA聚合酶启动子作用的序列加到正向引物的5'末端时，RNA聚合酶启动子被引入到待转录的开放阅读框上游的PCR产物中。在一个优选的实施方案中，启动子是T7聚合酶启动子，如本文别处所述。其它有用的启动子包括但不限于T3和SP6 RNA聚合酶启动子。T7、T3和SP6启动子的共有核苷酸序列是本领域已知的。
在优选的实施方案中，mRNA在5'端具有帽结构并具有3'(poly)A尾，其决定了核糖体结合、翻译的起始和mRNA在细胞中的稳定性。在环状DNA模板例如质粒DNA上，RNA聚合酶产生不适合在真核细胞中表达的长串联产物。在3'UTR末端线性化的质粒DNA的转录产生正常大小的mRNA，其在真核转染中无效，即使其在转录后被聚腺苷酸化。
在线性DNA模板上，噬菌体T7 RNA聚合酶可以将转录物的3'末端延伸超过模板的最后一个碱基(Schenborn和Mierendorf,Nuc Acids Res.,13:6223-36(1985)；Nacheva和Berzal-Herranz,Eur.J.Biochem.,270:1485-65(2003)。
将polyA/T延伸片段整合到DNA模板中的常规方法是分子克隆。然而，整合到质粒DNA中的polyA/T序列可引起质粒不稳定，这就是为什么从细菌细胞获得的质粒DNA模板经常被缺失和其它畸变高度污染的原因。这使得克隆过程不仅费力费时，而且通常不可靠。这就是为什么非常需要一种不进行克隆就可以用polyA/T3'延伸片段构建DNA模板的方法。
转录DNA模板的polyA/T片段可通过使用含有polyT尾如100T尾(大小可以为50-5000T)的反向引物在PCR过程中产生，或在PCR之后通过任何其它方法，包括但不限于DNA连接或体外重组而产生。poly(A)尾还提供RNA稳定性并减少其降解。通常，poly(A)尾的长度与转录的RNA的稳定性正相关。在一个实施方案中，poly(A)尾是100-5000个腺苷。
RNA的poly(A)尾可在体外转录后用poly(A)聚合酶如大肠杆菌polyA聚合酶(E-PAP)进行进一步延伸。在一个实施方案中，将poly(A)尾的长度从100个核苷酸增加到300-400个核苷酸导致RNA翻译效率增加约两倍。另外，3'末端连接不同化学基团可以增加mRNA稳定性。这种连接可以包含修饰的/人工的核苷酸、适体和其它化合物。例如，可以使用poly(A)聚合酶将ATP类似物引入poly(A)尾。ATP类似物可以进一步增加RNA的稳定性。
RNA上的5'帽还为RNA分子提供稳定性。在一个优选的实施方案中，通过本文公开的方法产生的RNA包含5'帽。5'帽使用本领域已知的和本文描述的技术提供(Cougot,等人,Trends in Biochem.Sci.,29:436-444(2001)；Stepinski,等人,RNA,7:1468-95(2001)；Elango,等人,Biochim.Biophys.Res.Commun.,330:958-966(2005))。
通过本文公开的方法产生的RNA还可以含有内部核糖体进入位点(IRES)序列。IRES序列可以是任何病毒、染色体或人工设计的序列，其起始核糖体与mRNA的非帽依赖性结合，并促进翻译起始。可以包含任何适于细胞电穿孔的溶质，其可以含有促进细胞渗透性和存活力的因素，例如糖、肽、脂质、蛋白、抗氧化剂和表面活性剂。
可以使用许多不同方法中的任何一种将RNA导入靶细胞，例如，商业上可获得的方法包括但不限于电穿孔(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems，Cologne，Germany))、(ECM830(BTX)(Harvard Instruments，Boston，Massachusets))或Gene PulserII(BioRad，Denver，Colo)、Multiporator(Eppendert，Hamburg Germany)、使用lipofection的阳离子脂质体介导的转染、聚合物包封、肽介导的转染、或生物射弹颗粒递送系统如"基因枪"(参见，例如Nishikawa等，Hum Gene Ther，12(8)：861-70(2001)。
在一个实施方案中，使用逆转录病毒或慢病毒载体将CAR序列递送至细胞中。使用转导的细胞作为载体或包封的、结合的或裸的载体的无细胞局部或全身递送，可以将表达CAR的逆转录病毒和慢病毒载体递送到不同类型的真核细胞中，以及组织和完整生物体中。所用方法可以用于需要稳定表达或稳定表达足以的任何目的。
在另一个实施方案中，使用体外转录的mRNA将CAR序列递送至细胞中。使用转染的细胞作为载体或包封的、结合的或裸mRNA的无细胞局部或全身递送，可以将体外转录的mRNA CAR递送到不同类型的真核细胞中，以及组织和完整生物体中。所用方法可以用于需要瞬时表达或瞬时表达足以的任何目的。
在另一个实施方案中，所需CAR可以通过转座子在细胞中表达。
在一个实施方案中，本发明的免疫细胞是T细胞。在本发明的T细胞的扩增和遗传修饰之前，从受试者获得T细胞的来源。T细胞可以从许多来源获得，包含外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在本发明的某些实施方案中，可以使用本领域可获得的任何数量的T细胞系。在本发明的某些实施方案中，T细胞可以使用本领域技术人员已知的任何技术从收集自受试者的血液单位中获得，例如FicollTM分离或Sepax分离系统。在一个优选的实施方案中，来自个体循环血液的细胞通过单采术获得。单采术产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它具核白细胞、红细胞和血小板。在一个实施方案中，可以洗涤通过单采术收集的细胞以除去血浆级分并将细胞置于合适的缓冲液或介质中以用于随后的处理步骤。在本发明的一个实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一个替代实施方案中，洗涤溶液缺少钙，并且可能缺少镁，或者可能缺少许多(如果不是全部)二价阳离子。洗涤后，可将细胞重悬于各种生物相容性缓冲液中，例如无Ca2+、无Mg2+的PBS、PlasmaLyte A或其它含有或不含缓冲液的盐水溶液。或者，可以除去单采术样品中不需要的成分，并将细胞直接重悬于培养基中。
T细胞的来源、活化和扩增
在一个实施方案中，免疫细胞可以是T细胞。在本发明的T细胞的扩增和遗传修饰之前，从受试者中获得T细胞或祖细胞的来源，由此可以制备T细胞。T细胞可以从这些细胞存在的任何来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、生发中心、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾、肿瘤和移植器官/组织。在本发明的某些实施方案中，T细胞可以使用本领域技术人员已知的任何技术，例如FicollTM分离，从收集自受试者的血液单位中获得。在一个实施方案中，来自受试者的循环血液的细胞通过单采术获得。单采术产品通常含有淋巴细胞，包括T细胞、Treg细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它具核白细胞、红细胞和血小板。在一个实施方案中，可以洗涤通过单采术收集的细胞以除去血浆级分并将细胞置于合适的缓冲液或介质中以用于随后的处理步骤。在本发明的一个实施方案中，细胞可用洗涤溶液(例如磷酸盐缓冲盐水(PBS))洗涤。本领域普通技术人员容易理解，洗涤步骤可通过本领域已知的方法来完成，例如根据制造商的说明书使用半自动"流过"离心机(例如Cobe 2991细胞处理器,Baxter CytoMate或Haemonetics Cell Saver 5)。洗涤后，可将细胞重悬于各种生物相容性缓冲液中，例如无Ca2+、无Mg2+的PBS、PlasmaLyteA或其它含有或不含缓冲液的盐水溶液。或者，可以除去单采术样品中不需要的成分，并将细胞直接重悬于培养基中。
在另一个实施方案中，通过裂解红血细胞和消耗单核细胞，例如通过PERCOLLTM梯度离心或通过逆流离心淘析，从外周血淋巴细胞中分离T细胞。T细胞的特定亚群，例如CD3+、CD25+、CD127neg、HLA-DR+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+ T细胞，可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离。本领域技术人员认识到，在本发明的上下文中也可以使用多轮选择。在某些实施方案中，可能需要进行选择程序并在活化和扩增过程中使用"未选择的"细胞。"未选择的"细胞也可进行更多轮的选择。
通过阴性选择富集T细胞群可以用针对负选择细胞特有的表面标记的抗体组合来完成。一种方法是通过负磁性免疫粘附或流式细胞术，其使用针对存在于负选择的细胞上的细胞表面标记物的单克隆抗体的混合物，进行细胞分选和/或选择。例如，为了通过负选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包含针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在某些实施方案中，可能需要富集或正选择通常表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+和FoxP3+的调节性T细胞。
为了通过正选择或负选择分离所需的细胞群，可以改变细胞和表面(例如，颗粒，如珠)的浓度。在某些实施方案中，可能需要显著减小珠子和细胞在其中混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠子的最大接触。例如，在一个实施方案中，使用20亿细胞/ml的浓度。在一个实施方案中，使用10亿细胞/ml的浓度。在另一个实施方案中，使用大于1亿个细胞/ml。在进一步的实施方案中，使用1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000万细胞/ml的细胞浓度。在另一个实施方案中，使用7500、8000、8500、9000、9500万细胞/ml或1亿细胞/ml的细胞浓度。在进一步的实施方案中，可以使用1.25或1.5亿细胞/ml的浓度。使用高浓度可以导致增加的细胞产量、细胞活化和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能弱表达目的靶抗原的细胞，或捕获来自存在许多肿瘤细胞的样品(即白血病血液、肿瘤组织等)的细胞。这样的细胞群可能具有治疗价值，并且将是期望获得的。
在相关的实施方案中，可能需要使用较低浓度的细胞。通过显著稀释T细胞和表面(例如，颗粒，如珠)的混合物，使颗粒和细胞之间的相互作用最小化。这选择了表达大量待结合至颗粒的期望抗原的细胞。例如，在稀释浓度下，与CD8+ T细胞相比，CD4+ T细胞表达更高水平的CD28，并且更有效地被捕获。在一个实施方案中，所用细胞的浓度为5×106/ml。在其它实施方案中，所用的浓度可以是约1×105/ml至1×106/ml，以及其间的任何整数值。
在其他实施方案中，细胞可以在2-10℃或室温下以不同速度在旋转器上孵育不同长度的时间。
用于刺激的T细胞也可以在洗涤步骤后冷冻。不希望受理论的束缚，冷冻和随后的解冻步骤通过除去细胞群中的粒细胞和某种程度上除去单核细胞提供了更均一的产物。在除去血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数是本领域已知的并且在此背景下是有用的，但是一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或含有31.25％Plasmalyte-A、31.25％右旋糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或含有例如Hespan和PlasmaLyte A的其它合适细胞冷冻介质，然后以1°/分钟的速率将细胞冷冻至-80℃并且储存在液氮储存罐的气相中。可以使用其它受控冷冻方法以及在-20℃或液氮中的不受控即冻法。
在某些实施方案中，将冷冻保存的细胞解冻并如本文所述洗涤，并允许使用本发明的方法在活化之前在室温下静置一小时。
本发明还涉及在可能需要本文所述的扩增细胞之前的时间或在可能需要本文所述的扩增细胞时，从受试者收集血样或单采术产物。如此，待扩增的细胞来源可以在任何必要的时间点收集，并且可以分离和冷冻所需的细胞，例如T细胞，以便随后用于将受益于T细胞治疗的任何数量的疾病或病症(例如本文所述的那些)的T细胞治疗中。在某些实施方案中，从处于发展疾病的风险中但尚未发展疾病的受试者采集血液样品或单采术，并且分离和冷冻目的细胞以供后续使用。在某些实施方案中，T细胞可以被扩增、冷冻并在以后使用。在某些实施方案中，在如本文所述诊断特定疾病之后不久但在任何治疗之前从受试者收集样品。在另一个实施方案中，在进行任何数量的相关治疗方式之前，从受试者的血液样品或从单采术分离细胞，所述相关治疗方式包括但不限于用试剂如那他珠单抗、依法珠单抗、抗病毒剂、化疗、放射、免疫抑制剂如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506、抗体或其它免疫清除剂(immunoablative agent)如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷酰胺(cytoxan)、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸、类固醇、FR901228和辐照进行治疗。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调神经磷酸酶(calcineurin)(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(Liu等人,Cell 66:807-815,1991；Henderson等人,Immun 73:316-321,1991；Bierer等人,Curr.Opin.Immun 5:763-773,1993)。在另一个实施方案中，针对患者分离细胞并冷冻，以便以后与骨髓或干细胞移植、使用化疗剂如氟达拉滨、外束放射疗法(XRT)、环磷酰胺或抗体如OKT3或CAMPATH的T细胞消融疗法联合使用(例如在此之前、同时或之后)。在另一个实施方案中，细胞在B细胞消融疗法(例如与CD20反应的试剂，例如利妥昔(Rituxan))之前分离并可冷冻以便以后用于治疗。
在本发明的另一个实施方案中，T细胞是治疗后直接从患者获得的。在这方面，已经观察到在某些免疫抑制治疗后，特别是用损伤免疫系统的药物治疗后，在患者正常从治疗恢复期间的治疗后不久，获得的T细胞的质量对于它们离体扩增的能力可以是最佳的或改善的。同样，在使用本文所述方法离体操作后，这些细胞可以处于增强植入和体内扩增的优选状态。因此，在本发明的上下文中，预期在该恢复期收集免疫细胞。此外，在某些实施方案中，动员(例如，用GM-CSF动员)和调理方案可用于在受试者中产生其中有利于特定细胞类型的再增殖、再循环、再生和/或扩增的条件，特别是在治疗后的限定时间窗期间。
无论在遗传修饰T细胞以表达所需CAR之前或之后，T细胞都可以通常使用如下中所述的方法活化和扩增：美国专利号6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公开号20060121005。
通常，本发明的T细胞通过与表面接触而扩增，所述表面附着有刺激CD3/TCR复合物相关信号的试剂和刺激T细胞细胞表面上的共刺激分子的配体。具体而言，T细胞群可以如本文所述进行刺激，例如通过与抗CD3抗体或其抗原结合片段，或固定在表面上的抗CD2抗体接触，或通过与蛋白激酶C激活剂(例如苔藓抑素)连同钙离子载体(calciumionophore)接触。为了共刺激T细胞表面上的辅助分子，使用结合辅助分子的配体。例如，在适于刺激T细胞增殖的条件下，T细胞群可以与抗-CD3抗体和抗-CD28抗体接触。为了刺激CD4+ T细胞的增殖，抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD28抗体的实例包括但不限于9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone，Besancon，法国)，可以使用如同本领域公知的其它方法(Berg等人,Transplant Proc.30(8):3975-3977,1998；Haanen等人,J.Exp.Med.190(9):13191328,1999；Garland等人,J.Immunol Meth.227(l-2):53-63,1999)。
在某些实施方案中，T细胞的初级刺激信号和共刺激信号可以通过不同的方案提供。例如，提供每个信号的试剂可以在溶液中或与表面偶联。当偶联至表面时，所述试剂可以偶联至相同的表面(即，以"顺式"形式)或单独的表面(即，以"反式"形式)。或者，一种试剂可以偶联到表面上，而另一种试剂在溶液中。在一个实施方案中，提供共刺激信号的试剂结合至细胞表面，并且提供初级活化信号的试剂在溶液中或偶联至表面。在某些实施方案中，两种试剂都可以在溶液中。在另一个实施方案中，所述试剂可以是可溶形式，然后交联到表面，例如表达Fc受体的细胞或将与所述试剂结合的抗体或其它结合剂。在这方面，参见例如美国专利申请公开号20040101519和20060034810，用于人工抗原呈递细胞(aAPC)，该细胞被考虑用于在本发明中激活和扩增T细胞。
在一个实施方案中，两种试剂固定在珠子上，在相同的珠子上，即"顺式"，或固定至单独的珠子上，即"反式"。例如，提供初级活化信号的试剂是抗CD3抗体或其抗原结合片段，而提供共刺激信号的试剂是抗CD28抗体或其抗原结合片段；并且两种试剂以相等的分子量共同固定到相同的珠上。在一个实施方案中，使用以1:1比例结合至珠上的各抗体用于CD4+ T细胞扩增和T细胞生长。在本发明的某些方面，使用与珠子结合的抗CD3：CD28抗体的比例，其使得与使用1:1的比例观察到的扩增相比，观察到T细胞扩增的增加。在一个特定的实施方案中，与使用1:1的比率观察到的扩增相比，观察到约1至约3倍的增加。在一个实施方案中，与珠结合的CD3：CD28抗体比例的范围为100:1至1:100以及其间的所有整数值。在本发明的一个方面，与抗CD3抗体相比，更多的抗CD28抗体与颗粒结合，即CD3：CD28的比例小于1。在本发明的某些实施方案中，与珠结合的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比例大于2:1。在一个实施方案中，使用了1:100的与珠结合的抗CD3抗体：抗CD28抗体比例。在另一个实施方案中，使用了1:75的与珠结合的抗CD3抗体：抗CD28抗体比例。在进一步的实施方案中，使用了1:50的与珠结合的抗CD3抗体：抗CD28抗体比例。在另一个实施方案中，使用了1:30的与珠结合的抗CD3抗体：抗CD28抗体比例。在一个优选的实施方案中，使用了1:10的与珠结合的抗CD3抗体：抗CD28抗体比例。在另一个实施方案中，使用了1:3的与珠结合的抗CD3抗体：抗CD28抗体比例。在又一个实施方案中，使用了3:1的与珠结合的抗CD3抗体：抗CD28抗体比例。
1:500至500:1以及其间的任何整数值的颗粒与细胞的比例都可用于刺激T细胞或其它靶细胞。如本领域普通技术人员可以容易地理解的，颗粒与细胞的比例可以取决于相对于靶细胞的颗粒尺寸。例如，小尺寸的珠仅能结合少数细胞，而较大的珠能结合许多细胞。在某些实施方案中，细胞与颗粒的比例范围为1:100至100:1以及其间为任何整数值，并且在进一步的实施方案中，比例包括1:9至9:1以及其间的任何整数值，也可以用于刺激T细胞。导致T细胞刺激的抗CD3-和抗CD28-偶联颗粒与T细胞的比例可以如上所述变化。例如，此类数值可以包括1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、1:1颗粒/T细胞。在一个实施方案中，使用1:1或更小的颗粒与细胞的比例。在一个特定实施方案中，颗粒：细胞比例可以为1:5。在进一步的实施方案中，颗粒与细胞的比例可以根据刺激的天数而变化。例如，在一个实施方案中，在第一天，颗粒与细胞的比例为1:1至10:1，并且在最多10天内，每天或每隔一天将另外的颗粒加入细胞中，最终比例为1:1至1:10(基于加入当天的细胞计数)。在一个特定的实施方案中，在刺激的第一天，颗粒与细胞的比例为1:1，在刺激的第三天和第五天，调节至1:5。在另一个实施方案中，颗粒以每天或每隔一天的方式加入，在刺激的第一天最终比例为1:1，在刺激的第三天和第五天为1:5。在另一个实施方案中，在刺激的第一天，颗粒与细胞的比例为2:1，在刺激的第三天和第五天，调节至1:10。在另一个实施方案中，颗粒以每天或每隔一天的方式加入，在刺激的第一天最终比例为1:1，在刺激的第三天和第五天为1:10。本领域技术人员将理解，多种其它比例可适用于本发明。特别地，比例将根据颗粒尺寸以及细胞尺寸和类型而变化。
在本发明的进一步实施方案中，将细胞，例如T细胞(如Treg细胞)与试剂包被的珠子混合，随后将珠子和细胞分离，然后培养细胞。在一个替代实施方案中，在培养之前，不分离试剂包被的珠和细胞，而是将它们一起培养。在另一个实施方案中，首先通过施加力如磁力来浓缩珠子和细胞，导致细胞表面标记物的连接增加，从而诱导细胞刺激。
例如，可以通过使附着有抗CD3和抗CD28的顺磁珠(3×28珠)接触Treg细胞群体的细胞来连接细胞表面蛋白。在一个实施方案中，将细胞(例如，104至109T细胞)和珠(例如，比例为1:1的
Figure BDA0002497695580001281
M-450 CD3/CD28T顺磁珠)在缓冲液中合并，优选PBS(不含二价阳离子如钙和镁)。同样，本领域普通技术人员可以容易地理解，可以使用任何细胞浓度。
例如，靶细胞在样品中可能非常稀少，并且仅占样品的0.01％，或者整个样品都是目的靶细胞(即100％)。因此，任何细胞数量都在本发明的范围内。在某些实施方案中，可能需要显著减小颗粒和细胞在其中混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，在一个实施方案中，使用约20亿细胞/ml的浓度。在另一个实施方案中，使用大于1亿细胞/ml。在进一步的实施方案中，使用1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000万细胞/ml的细胞浓度。在另一个实施方案中，使用7500、8000、8500、9000、9500万细胞/ml或1亿细胞/ml的细胞浓度。在进一步的实施方案中，可以使用1.25或1.5亿细胞/ml的浓度。使用高浓度可以导致增加的细胞产量、细胞活化和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能弱表达目的靶抗原的细胞。这样的细胞群可以具有治疗价值，并且在某些实施方案中是期望获得的。
在本发明的一个实施方案中，混合物可以培养数小时(约3小时)至约14天或其间的任何小时整数值。在另一个实施方案中，混合物可以培养21天。在本发明的一个实施方案中，将珠子和T细胞一起培养大约8天。在另一个实施方案中，将珠子和T细胞一起培养2-3天。也可能需要几个循环的刺激，以使T细胞的培养时间可以是60天或更长。适于T细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，极限必需培养基或RPMI培养基1640或X-Vivo 15(Lonza))，其可以含有增殖和存活必需的因子，包括血清(例如，胎牛或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或本领域技术人员已知的用于细胞生长的任何其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括但不限于表面活性剂、Plasmanate和还原剂如N-乙酰-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括RPMI1640、Immunocult(StemCell)、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-vivo 15和X-vivo20、优化因子(Optimizer)，具有添加的氨基酸、丙酮酸钠和维生素，是无血清的或补充有适量的血清(或血浆)或确定的激素组，和/或足以使T细胞生长和扩增的量的细胞因子。抗生素，例如青霉素和链霉素，仅包括在实验培养物中，而不包括在要输注到受试者中的细胞培养物中。靶细胞维持在支持生长所必需的条件下，例如，适当的温度(例如，37℃)和气氛(例如，空气加5％CO2)。
已经暴露于不同刺激时间的T细胞可以表现出不同的特征。例如，典型的血液或单采外周血单核细胞产品具有的辅助T细胞群(TH，CD4+)大于细胞毒性或抑制性T细胞群(TC，CD8+)。通过刺激CD3和CD28受体进行T细胞的离体扩增产生了T细胞群，该T细胞群在约8-9天之前主要由Th细胞组成，而在约8-9天之后，该T细胞群则包含越来越多的Tc细胞群。
此外，除了CD4和CD8标记以外，其它表型标记也有显著变化，但在细胞扩增过程中大部分是可重现的。因此，这种再现性使得能够针对特定目的定制活化的T细胞产品。
在一个实施方案中，调节性T细胞可以通过经RosetteSep(Stemcell)从HLA-A2-供者分离CD4+ T细胞获得，并且富集CD25+细胞(Miltenyi)，然后使用FACSAria II(BDBiosciences)分选活的CD4+CD127loCD25hi Treg。分选的Treg可以用L细胞和在1000U/mlIL-2中的αCD3 mAb(OKT3；200ng/mL)刺激。
在本发明的一个实施方案中，T细胞可以在雷帕霉素存在下培养以获得调节性T细胞，如例如在WO2007110785中所述，该文献通过引用并入本文中。US2016024470中描述了另一种产生调节性T细胞的方法，其通过引用并入本文，其中将T细胞与T细胞受体(TCR)/CD3激活剂例如TCR/CD3抗体、TCR共刺激激活剂例如CD28、CD137(4-1BB)、GITR、B7-1/2、CD5、ICOS、OX40、CD40或CD137抗体和雷帕霉素一起培养。
在本发明的一个实施方案中，通过CAR的表达而遗传修饰的T细胞也可以通过至少一种胞内因子如ROR-C、Foxo1、T-bet或Gata 3、C-Maf、AhR的表达而遗传修饰。在一个实施方案中，本发明的遗传修饰的免疫细胞表达Foxo1。
在一个实施方案中，本发明的遗传修饰的细胞可以是同种异体免疫细胞，例如，同种异体T或Treg细胞。例如，同种异体免疫细胞可以是缺乏功能性人白细胞抗原(HLA)例如I类HLA和/或II类HLA的表达或缺乏功能性T细胞受体(TCR)的表达的免疫细胞。
在一个实施方案中，可将缺乏功能性TCR的T细胞工程化，以使其在其表面不表达任何功能性TCR，工程化以使其不表达一个或多个包含功能性TCR的亚基，或工程化以使其在其表面产生非常少的功能性TCR。或者，该T细胞可表达实质上受损的TCR，例如通过表达该TCR的一个或多个亚基的突变或截短形式。术语"实质上受损的TCR"是指该TCR不会在宿主中引起不利的免疫反应。
在另一个实施方案中，可以工程化改造本文所述的遗传修饰的细胞，使得它不在其表面上表达功能性HLA。例如，本文所述的免疫细胞可被工程化，使得细胞表面HLA表达，例如I类HLA和/或II类HLA或非经典HLA分子表达被下调。
在另一实施方案中，该T细胞可缺乏功能性TCR及功能性HLA，诸如I类HLA及/或II类HLA。
缺乏功能性TCR和/或HLA表达的修饰的免疫细胞(例如，修饰的T或Treg细胞)可通过任何合适的方法获得，包括敲除或敲低TCR和/或HLA的一个或多个亚基。例如，免疫细胞可包括使用siRNA、shRNA、成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、锌指内切核酸酶(ZFN)、大型核酸酶(meganuclease或mn，也称为归巢内切核酸酶)或megaTAL(将TAL效应物与mn切割结构域组合)敲减TCR和/或HLA(Osborn等人,“Evaluation of TCR Gene Editing Achieved by TALENs,CRISPR/Cas9,and megaTALNucleases”Mol Ther.2016Mar；24(3):570-81)。
在一个实施方案中，TCR表达和/或HLA表达可以使用靶向T细胞中编码TCR和/或HLA的核酸的siRNA或shRNA抑制。T细胞中siRNA和shRNA的表达可以使用任何常规表达系统，例如慢病毒表达系统来实现。下调I类HLA和/或II类HLA基因表达的示例性siRNA和shRNA描述于例如US2007/0036773中。下调TCR组分表达的示例性shRNA描述于例如US2012/0321667中。
本文中使用的"CRISPR"或"针对TCR和/或HLA的CRISPR"或"抑制TCR和/或HLA的CRISPR"是指一组成簇的规律间隔的短回文重复序列，或包含重复序列组的系统。如本文所用，"Cas"是指CRISPR相关蛋白。"CRISPR/Cas"系统是指衍生自CRISPR和Cas的系统，其可以用于沉默或突变TCR和/或HLA基因。
在大约40％的经测序真细菌基因组和90％的经测序古细菌中发现了天然存在的CRISPR/Cas系统。Grissa等人(2007)BMC Bioinformatics 8:172。该系统是一种原核免疫系统，其赋予对诸如质粒和噬菌体的外源遗传元件的抗性，并提供获得性免疫的形式。Barrangou等人(2007)Science 315:1709-1712；Marragini等人(2008)Science 322:1843-1845。CRISPR/Cas系统已经被修饰用于真核生物(例如小鼠或灵长类)中的基因编辑(沉默、增强或改变特定基因)。Wiedenheft等人(2012)Nature 482：331-8。这通过将含有特别设计的CRISPR和一种或多种合适的Cas的质粒引入真核细胞中来实现。CRISPR序列，有时称为CRISPR基因座，包含交替的重复序列和间隔区。在天然存在的CRISPR中，间隔区通常包含对于细菌而言外源的序列，例如质粒或噬菌体序列；在TCR和/或HLA CRISPR/Cas系统中，间隔区源自TCR或HLA基因序列。来自CRISPR基因座的RNA被组成型表达，并由Cas蛋白加工成小RNA。这些序列包含侧翼为重复序列的间隔区。RNA引导其它Cas蛋白以在RNA或DNA水平上沉默外源遗传元件。Horvath等人(2010)Science 327:167-170；Makarova等人(2006)BiologyDirect 1:7。因此，间隔区作为RNA分子的模板，类似于siRNA。Penisis(2013)Science 341：833-836。因此，CRISPR/Cas系统可以用于编辑TCR和/或HLA基因(添加或缺失碱基对)，或引入提前终止，从而减少TCR和/或HLA的表达。备选地，CRISPR/Cas系统可以像RNA干扰一样使用，以可逆的方式关闭HLA基因。例如，在哺乳动物细胞中，RNA可以将Cas蛋白前导至TCR和/或HLA启动子，空间阻断RNA聚合酶。
可以使用本领域已知的技术，例如US20140068797和Cong(2013)Science 339：819-823中所述的技术，产生抑制TCR和/或HLA的人工CRISPR/Cas系统。也可产生本领域已知的抑制TCR和/或HLA的其它人工CRISPR/Cas系统，例如以下中所述：Tsai(2014)NatureBiotechnol 32:6 569-576，US8,871,445；8,865,406；8,795,965；8,771,945；和8,697,359。
"TALEN"或"针对TCR和/或HLA的TALEN"或"抑制TCR和/或HLA的TALEN"是指转录激活子样效应核酸酶，一种可用于编辑TCR和/或HLA的人工核酸酶。TALEN通过将TAL效应DNA结合结构域融合至DNA切割结构域人工产生。转录激活子样效应物(TALE)可经工程化以结合任何所需DNA序列，包括TCR和/或HLA基因的一部分。通过将工程化TALE与DNA切割结构域组合，可以产生对任何期望的DNA序列(包括TCR和/或HLA序列)特异的限制酶。然后可将这些导入细胞，其中它们可用于基因组编辑。Boch(2011)Nature Biotech.29:135-6；和Boch等人(2009)Science 326:1509-12；Moscou等人(2009)Science 326:3501。
TALE是由黄单胞菌分泌的蛋白。DNA结合结构域含有重复的、高度保守的33-34个氨基酸的序列，除了第12和第13个氨基酸。这两个位置是高度可变的，显示与特异核苷酸识别的强相关性。因此，它们可以被工程化以结合到所需的DNA序列。为了产生TALEN，将TALE蛋白与核酸酶(N)融合，所述核酸酶是野生型或突变的Fokl内切核酸酶。已经对Fokl进行了几种突变以用于TALEN；例如，这些提高了切割特异性或活性。Cermak等人(2011)Nucl.Acids Res.39:e82；Miller等人(2011)Nature Biotech.29:143-8；Hockemeyer等人(2011)Nature Biotech.29:731-734；Wood等人(2011)Science 333:307；Doyon等人(2010)Nature Methods 8:74-79；Szczepek等人(2007)Nature Biotech.25:786-793；和Guo等人(2010)/.Mol.Biol.200:96。Fokl结构域作为二聚体起作用，这需要两个构建体，所述构建体具有针对目标基因组中的位点的具有适当方向和间隔的独特DNA结合结构域。TALE DNA结合结构域和Fokl切割结构域之间的氨基酸残基的数量和两个单独TALEN结合位点之间的碱基的数量似乎是实现高水平活性的重要参数。Miller等人(2011)Nature Biotech.29:143-8。TCR和/或HLA TALEN可以在细胞内用于产生双链断裂(DSB)。如果修复机制通过非同源末端接合不正确地修复断裂，则可以在断裂位点引入突变。例如，不正确的修复可能引入移码突变。或者，外源DNA可以与TALEN一起导入细胞；根据外源DNA的序列和染色体序列，该方法可用于纠正TCR和/或HLA基因中的缺陷或将这样的缺陷引入wt TCR和/或HLA基因中，从而降低TCR和/或HLA的表达。TCR和/或HLA中序列特异性的TALEN可以使用本领域已知的任何方法构建，包括使用模块组件的各种方案。Zhang等人(2011)Nature Biotech.29:149-53；Geibler等人(2011)PLoS ONE 6:el9509。
"ZFN"或"锌指核酸酶"或"针对TCR和/或HLA的ZFN"或"抑制TCR和/或HLA的ZFN"是指锌指核酸酶，一种可用于编辑TCR和/或HLA基因的人工核酸酶。与TALEN一样，ZFN包含融合到DNA结合结构域的Fokl核酸酶结构域(或其衍生物)。在ZFN的情况下，DNA结合结构域包含一个或多个锌指。Carroll等人(2011)Genetics Society of America 188:773-782；和Kim等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:1156-1160。锌指是由一个或多个锌离子稳定的小蛋白结构基序。锌指可包含例如Cys2His2，并可识别约3-bp序列。可以组合已知特异性的各种锌指来产生识别约6、9、12、15或18-bp序列的多指多肽。各种选择和模块组装技术可用于产生识别特定序列的锌指(及其组合)，包括噬菌体展示、酵母单杂交系统、细菌单杂交和双杂交系统以及哺乳动物细胞。
与TALEN一样，ZFN必须二聚化才能切割DNA。因此，需要ZFN对来靶向非回文DNA位点。两个单独的ZFN必须结合DNA的相对链，从而它们的核酸酶被正确地间隔开。Bitinaite等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:10570-5。还像TALEN一样，ZFN可以在DNA中产生双链断裂，如果被不正确地修复，则其可以产生移码突变，导致细胞中TCR和/或HLA的表达和数量降低。ZFN也可以与同源重组一起用以在TCR和/或HLA基因中产生突变。TCR和/或HLA中序列特异性的ZFN可以使用本领域已知的任何方法构建。参见，例如，Provasi(2011)Nature Med.18:807-815；Torikai(2013)Blood 122:1341-1349；Cathomen等人(2008)Mol.Ther.16:1200-7；Quo等人(2010)/.Mol.Biol.400:96；US2011/0158957；和US2012/0060230。
"大型核酸酶"或"针对TCR和/或HLA的大型核酸酶"或"抑制TCR和/或HLA的大型核酸酶"是指具有大的(＞14个碱基对)识别位点的单体内切核酸酶，其可用于编辑TCR和/或HLA基因。大型核酸酶(MN)是具有固有核酸酶活性的单体蛋白，其源自细菌归巢核酸内切酶并且针对独特的靶位点进行了工程化。归巢内切核酸酶是DNA切割酶，其可以在它们的宿主基因组中的单独基因座处产生双链断裂，从而驱动位点特异性基因转化事件。(Stoddard，Structure.2011Jan 12；19(1)：7-15)。尽管归巢核酸内切酶的大小较小，但它们能识别长的DNA序列(通常为20-30个碱基对)。归巢核酸内切酶非常广泛，并且在微生物以及噬菌体和病毒中发现。LAGLIDADG和His-Cys盒酶(其是这些酶的最特异性的序列)依赖于对接到它们的DNA靶位点的大沟中的反平行β-片(Flick等人,1998；Jurica等人,1998)。在那里它们建立了在多个连续碱基对上不均匀分布的序列特异性和非特异性的接触的集合(Chevalier等人,2003；Scalley-Kim等人,2007)。
LAGLIDADG归巢核酸内切酶(LHE)家族是用于基因靶向应用的工程酶的主要来源。LHE家族主要在古细菌内以及在藻类和真菌的叶绿体和线粒体基因组中编码(Chevalier等人,2005；Dalgaard等人,1997；Sethuraman等人,2009)。每个蛋白链具有单个保守LAGLIDADG基序(SEQ ID NO：85)的大型核酸酶形成切割回文和几乎回文的DNA靶序列的同型二聚体蛋白，而每个蛋白链含有两个此基序的那些形成可靶向完全不对称DNA序列的更大的假对称单体。
大型核酸酶可以被工程化以靶向TCR和/或HLA，并因此在DNA中产生双链断裂，如果被不正确地修复，其可以产生移码突变，导致细胞中TCR和/或HLA的表达和量的降低。
"MegaTAL"或"针对TCR和/或HLA的MegaTAL"或"抑制TCR和/或HLA的MegaTAL"是指人工核酸酶，其可用于编辑TCR和/或HLA基因。MegaTAL是通过将最小TAL(转录激活子样)效应结构域融合到来源于LAGLIDADG归巢核酸内切酶家族的大型核酸酶的N-末端而获得的杂合单体核酸酶(Nucleic Acids Res.2014Feb；42(4):2591-601；Takeuchi等人,MethodsMol Biol.2015；1239:105-32.doi:10.1007/978-1-4939-1862-1_6)。
因此，MegaTAL由位点特异性大型核酸酶切割头部组成，所述切割头部具有TAL效应子DNA结合结构域提供的额外亲和力和特异性。可将MegaTAL工程化以靶向TCR和/或HLA，从而在DNA中产生双链断裂，如果不正确地修复，则其可产生移码突变，导致细胞中HLA的表达和量的降低。使用I-OnuI大型核酸酶(mn)的变体设计TCRα-MegaTAL以敲除T细胞受体α(TCRα)基因。将TCRαmn融合到10.5重复的TALE阵列上，所述阵列设计用于结合TCRαmn结合位点上游的DNA序列。发现靶向TCRα的megaTAL在人原代T细胞中实现了极高的基因破坏，没有可检测的脱靶切割(Boissel等人,Nucleic Acids Res.2014Feb；42(4):2591-601)。
尽管不希望受任何特定理论的束缚，但在一些实施方案中，治疗性T细胞在患者中具有短期持久性，这是由于T细胞中的端粒缩短；因此，用端粒酶基因转染可以延长T细胞的端粒并改善T细胞在患者体内的持久性。参见Carl June,"Adoptive T cell therapy forcancer in the clinic",Journal of Clinical Investigation,117:1466-1476(2007)。因此，在一个实施方案中，本发明的遗传修饰的免疫细胞异位表达端粒酶亚基，例如端粒酶的催化亚基，例如TERT，例如hTERT。在一些方面，本公开提供了产生表达CAR的免疫细胞的方法，包括使免疫细胞与编码端粒酶亚基(例如端粒酶的催化亚基，例如TERT，例如hTERT)的核酸接触。可以在与编码CAR的构建体接触之前、同时或之后使细胞与核酸接触。
VII.治疗应用
本发明提供了被修饰以表达靶向HLA-A2抗原的CAR的免疫细胞，作为将所述免疫细胞募集至特异性免疫或炎性应答的位点，并且活化所述免疫细胞以抑制这些位点处免疫效应细胞的免疫活性的手段。CAR介导的免疫细胞的募集和活化提供了预防或治疗许多可从此类免疫抑制活性受益的免疫疾病或病症的方法。
在一个实施方案中，免疫细胞是调节性免疫细胞。免疫细胞可以是适用于细胞疗法的任何调节性免疫细胞(参见，例如，Wood,K.J.等人,2012；Papp,G.等人,2017)。在一个实施方案中，调节性免疫细胞选自由以下组成的组：调节性T细胞、CD4+调节性T细胞、CD8+调节性T细胞、调节性γδT细胞、调节性DN T细胞、调节性B细胞、调节性NK细胞、调节性巨噬细胞、调节性树突细胞及其任何组合。在一个实施方案中，免疫细胞是人免疫细胞。在另一个实施方案中，调节性免疫细胞是人调节性免疫细胞。在一个实施方案中，人调节性免疫细胞选自由以下组成的组：调节性T细胞、CD4+调节性T细胞、CD8+调节性T细胞、调节性γδT细胞、调节性DN T细胞、调节性B细胞、调节性NK细胞、调节性巨噬细胞、调节性树突细胞及其任何组合。
在一个实施方案中，免疫细胞可以是调节性T细胞。在另一个实施方案中，调节性T细胞可以是人调节性T细胞。尽管调节性T细胞的活化是抗原依赖性的，但是这些细胞的抑制作用是抗原-、TCR-和MHC-非依赖性的。因此，调节性T细胞中CAR的表达将这些细胞及其活化重新导向合适的靶组织，以便它们以抗原特异性方式活化；然而，它们的抑制作用的发生不需要进一步识别疾病相关抗原。因此，只要调节性T细胞位于免疫效应细胞位置的准确附近并介导它们的不期望的效应，则重定向的调节性T细胞就可以在该位置被触发或活化以产生它们的抑制效应。
在一个实施方案中，靶HLA-A2抗原可以在免疫效应细胞介导的不期望的免疫或炎症反应的部位或靶组织处存在或表达。
在一个实施方案中，本发明的CAR修饰的免疫细胞可用于预防或治疗一种或多种与器官或组织移植相关的疾病、病症、症状或状况(例如，器官或组织排斥/功能障碍、GVHD和/或与其相关的状况)。移植排斥涉及供体的移植组织通过免疫应答被受体的免疫细胞破坏。GVHD中也涉及免疫应答；然而，在这种情况下，受体的组织通过移植物被转移到受体的供体的免疫细胞破坏。因此，CAR介导的免疫细胞的重定向和活化提供了在GVHD的情况下抑制免疫效应细胞对错配细胞和/或组织的排斥或抑制移植的免疫活性细胞的致病作用的方法。在一个实施方案中，错配的细胞和/或组织包括HLA-A2错配的细胞和/或组织。
因此，本发明的另一个实施方案是用于治疗受试者中与器官或组织移植相关的一种或多种疾病、病症、症状或病况(例如，器官或组织排斥/功能障碍、GVHD和/或与其相关的病况)的方法，其中所述方法包括向受试者施用如本文所述的CAR工程化的免疫细胞或组合物。
在一个实施方案中，所述方法是细胞治疗方法。在一个实施方案中，细胞治疗是自体的。在一个实施方案中，细胞治疗是异源的。在一个实施方案中，细胞治疗是同种异体的。在一个实施方案中，所述方法是基因治疗方法。
因此，本发明的另一个实施方案是如本文所述的CAR工程化的免疫细胞或组合物，其用于治疗受试者中与器官或组织移植相关的一种或多种疾病、病症、症状或病况(例如，器官或组织排斥/功能障碍、GVHD和/或与其相关的病况)。
本发明的CAR修饰的免疫细胞可用于促进受试者中的免疫耐受、手术耐受和/或免疫适应。本发明的CAR修饰的免疫细胞可以用于促进器官或组织移植后受试者中的免疫耐受、手术耐受和/或免疫适应。在一个实施方案中，提供了在受试者中促进免疫耐受、手术耐受和/或免疫适应的方法，该方法包括向受试者施用如本文任何地方描述的CAR修饰的免疫细胞。在另一个实施方案中，提供了促进受试者中的免疫耐受、手术耐受和/或免疫适应的方法，所述方法包括向受试者施用如本文任何地方所述的药物组合物。在一个实施方案中，所述用途可以用于促进受试者对移植的器官或组织的免疫耐受、手术耐受和/或免疫适应。在一个实施方案中，在移植器官或组织的同时、之前或之后施用CAR修饰的免疫细胞。在一个实施方案中，CAR修饰的免疫细胞与器官或组织的移植同时施用。在另一个实施方案中，CAR修饰的免疫细胞在器官或组织移植之前施用。在一个实施方案中，CAR修饰的免疫细胞在器官或组织移植后施用。在一个实施方案中，免疫细胞是调节性免疫细胞。在一个实施方案中，调节性免疫细胞选自由以下组成的组：调节性T细胞、CD4+调节性T细胞、CD8+调节性T细胞、调节性γδT细胞、调节性DN T细胞、调节性B细胞、调节性NK细胞、调节性巨噬细胞、调节性树突细胞及其任何组合。在一个实施方案中，免疫细胞是调节性T细胞。在一个实施方案中，免疫细胞是CD4+调节性T细胞。在一个实施方案中，免疫细胞是人免疫细胞。在另一个实施方案中，调节性免疫细胞是人调节性免疫细胞。在一个实施方案中，人调节性免疫细胞选自由以下组成的组：调节性T细胞、CD4+调节性T细胞、CD8+调节性T细胞、调节性γδT细胞、调节性DN T细胞、调节性B细胞、调节性NK细胞、调节性巨噬细胞、调节性树突细胞及其任何组合。在另一个实施方案中，免疫细胞是人调节性T细胞。在一个实施方案中，免疫细胞是人CD4+调节性T细胞。
本发明的CAR修饰的免疫细胞可用于预防或治疗移植器官或组织的排斥。在一个实施方案中，本发明的CAR修饰的免疫(例如，CAR工程化的Treg细胞)细胞可用于预防或治疗移植器官或组织的超急性排斥。在一个实施方案中，本发明的CAR修饰的免疫细胞(例如，CAR工程化的Treg细胞)可用于预防或治疗移植器官或组织的抗体介导的排斥。在一个实施方案中，该方法包括将本发明的CAR修饰的免疫细胞(例如，CAR工程化的Treg细胞)施用于暴露于移植器官或组织的受试者。在一个实施方案中，移植的器官或组织可以包括骨髓移植、器官移植、输血或有目的地引入受试者的任何其它外来组织或细胞。在一个实施方案中，本发明的CAR修饰的免疫细胞(例如，CAR工程化的Treg细胞)可用作抑制移植后的移植排斥的疗法。在一个实施方案中，移植排斥可以是同种异体移植排斥。在一个实施方案中，移植排斥可以是异种移植排斥。在一个实施方案中，提供了预防或治疗受试者中的器官或组织移植排斥的方法，该方法包括向受试者施用如本文任何地方所述的CAR修饰的免疫细胞。在一个实施方案中，提供了预防或治疗受试者中器官或组织移植排斥的方法，所述方法包括向受试者施用如本文任何地方所述的药物组合物。因此，本发明的另一个实施方案是本发明的CAR工程化的免疫细胞(例如，CAR工程化的Treg细胞)，或包含所述免疫细胞的药物组合物，其用于在受试者中预防或治疗器官或组织移植排斥。在一个实施方案中，本发明提供了增加受试者中移植物存活的时间的方法，该方法包括向受试者施用如本文任何地方所述的CAR修饰的免疫细胞(例如，CAR工程化的Treg细胞)。在一个实施方案中，本发明提供了增加受试者中移植物存活时间的方法，所述方法包括向受试者施用如本文任何地方所述的药物组合物。在一个实施方案中，所述方法提供1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、20年、30年、40年、50年、60年、70年、80年、90年、100年或受试者终生的移植物存活时间段。在一个实施方案中，受试者没有经历任何免疫抑制剂治疗。在一个实施方案中，施用本发明的免疫细胞或组合物允许减少由受试者接受的免疫抑制剂治疗的量。在一个实施方案中，移植物可以是同种异体移植物。在一个实施方案中，在将移植物移植到受体中的同时、之前或之后，可将移植物暴露于本发明的CAR修饰的免疫细胞。在一个实施方案中，器官或组织移植物可以是心脏、心脏瓣膜、肺、肾、肝、胰腺、肠、皮肤、血管、骨髓、干细胞、骨或胰岛细胞。然而，本发明不限于特定类型的移植。在一个实施方案中，供体移植物可以在移植到受体中之前通过用本发明的CAR工程化的免疫细胞处理器官或组织移植物来"预处理"或"预先准备"，以降低移植物对抗受体的免疫原性，从而降低或预防移植物排斥。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于选自以下的一种或两种不同的HLA-A亚型是阳性的：HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68中的一种或两种。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的并且对于选自以下的一种HLA-A亚型是阳性的：HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68中的一种。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于选自以下的两种不同的HLA-A亚型是阳性的：HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68中的一种或两种。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的并且对于选自以下的两种不同的HLA-A亚型是阳性的：HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68中的一种。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的并且对于选自以下的两种不同的HLA-A亚型是阳性的：HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68中的两种。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于选自以下的一种或两种不同的HLA-A亚型是阳性的：HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30中的一种或两种。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的并且对于选自下的一种HLA-A亚型是阳性的：HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30中的一种。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的并且对于选自以下的两种不同的HLA-A亚型是阳性的：HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30中的一种或两种。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的并且对于选自以下的两种不同HLA-A亚型是阳性的：HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30中的一种。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的并且对于选自以下的两种不同的HLA-A亚型是阳性的：HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30中的两种。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于HLA-A*03的HLA-A亚型是阳性的。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于HLA-A*25的HLA-A亚型是阳性的。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于HLA-A*29的HLA-A亚型是阳性的。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于HLA-A*30的HLA-A亚型是阳性的。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于HLA-A*31的HLA-A亚型是阳性的。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于HLA-A*33的HLA-A亚型是阳性的。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于HLA-A*36的HLA-A亚型是阳性的。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于HLA-A*68的HLA-A亚型是阳性的。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于HLA-A*03:01、HLA-A*25:01、HLA-A*29:02、HLA-A*30:01、HLA-A*31:01、HLA-A*33:01、HLA-A*36:01、HLA-A*68:01中的一种或两种是阳性的。在一个实施方案中，所述移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于HLA-A*03:01、HLA-A*25:01、HLA-A*29:02、HLA-A*30:01、HLA-A*31:01、HLA-A*33:01、HLA-A*36:01、HLA-A*68:01中的一种是阳性的。在一个实施方案中，所述移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于HLA-A*03:01、HLA-A*25:01、HLA-A*29:02、HLA-A*30:01、HLA-A*31:01、HLA-A*33:01、HLA-A*36:01、HLA-A*68:01中的两种是阳性的。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于HLA-A*25:01、HLA-A*29:02和HLA-A*30:01中的一种或两种是阳性的。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于HLA-A*25:01、HLA-A*29:02和HLA-A*30:01中的一种是阳性的。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于HLA-A*25:01、HLA-A*29:02和HLA-A*30:01的两种是阳性的。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于HLA-A*25:01是阳性的。在一个实施方案中，移植宿主或受体为HLA-A2阴性，并且对于HLA-A*29:02为阳性。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于HLA-A*30:01为阳性。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于HLA-A*03:01是阳性的。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于HLA-A*31:01为阳性。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于HLA-A*33:01为阳性。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于HLA-A*36:01是阳性的。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于HLA-A*68:01为阳性。在一个实施方案中，移植物为HLA-A2阳性。
在一个实施方案中，免疫细胞是调节性免疫细胞。在一个实施方案中，调节性免疫细胞选自由以下组成的组：调节性T细胞、CD4+调节性T细胞、CD8+调节性T细胞、调节性γδT细胞、调节性DN T细胞、调节性B细胞、调节性NK细胞、调节性巨噬细胞、调节性树突细胞及其任何组合。在一个实施方案中，免疫细胞是调节性T细胞。在一个实施方案中，免疫细胞是CD4+调节性T细胞。在一个实施方案中，免疫细胞是人免疫细胞。在另一个实施方案中，调节性免疫细胞是人调节性免疫细胞。在一个实施方案中，人调节性免疫细胞选自由以下组成的组：调节性T细胞、CD4+调节性T细胞、CD8+调节性T细胞、调节性γδT细胞、调节性DN T细胞、调节性B细胞、调节性NK细胞、调节性巨噬细胞、调节性树突细胞及其任何组合。在另一个实施方案中，免疫细胞是人调节性T细胞。在一个实施方案中，免疫细胞是人CD4+调节性T细胞。
本发明的CAR修饰的免疫细胞(例如，CAR工程化的Treg细胞)可用于预防或治疗移植物抗宿主病(GVHD)。在一个实施方案中，该方法包括向暴露于移植器官或组织的受试者施用本发明的CAR修饰的免疫细胞(例如，CAR工程化的Treg细胞)。在一个实施方案中，移植的器官或组织可以包括骨髓移植、器官移植、输血或有目的地引入受试者的任何其它外来组织或细胞。例如，GVHD可发生在心脏、心脏瓣膜、肺、肾、肝、胰腺、肠、皮肤、血管、骨髓、干细胞、骨或胰岛细胞移植之后。然而，本发明不限于特定类型的移植。在一个实施方案中，GVHD可在造血干细胞移植后发生。在一个实施方案中，提供了预防或治疗受试者中的移植物抗宿主病(GVHD)的方法，所述方法包括向受试者施用如本文任何地方描述的CAR修饰的免疫细胞。在一个实施方案中，提供了预防或治疗受试者中的移植物抗宿主病(GVHD)的方法，所述方法包括向受试者施用如本文任何地方所述的药物组合物。在一个实施方案中，本发明提供了在将移植物移植到受体中的同时、之前或之后，使供体移植物(例如，生物相容性格架或供体组织、器官或细胞)与本发明的CAR修饰的免疫细胞接触的方法。在一个实施方案中，本发明的CAR修饰的免疫细胞可以用于改善、抑制或减少供体移植物对抗受体的不利反应，从而预防或治疗GVHD。在一个实施方案中，本发明提供了在受试者中预防或延迟GVHD发作的方法，所述方法包括向受试者施用如本文任何地方所述的CAR修饰的免疫细胞。在一个实施方案中，本发明提供了预防或延迟受试者中GVHD发作的方法，所述方法包括向受试者施用如本文任何地方所述的药物组合物。在一个实施方案中，GVHD的发作延迟1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、20年、30年、40年、50年、60年、70年、80年、90年、100年或受试者终生。在一个实施方案中，所述受试者没有经历任何免疫抑制剂治疗。在一个实施方案中，所述受试者正在经历免疫抑制疗法。在一个实施方案中，将本发明的免疫细胞施用于受试者，目的是降低所述免疫抑制疗法的治疗有效量。在一个实施方案中，GVHD可以是急性GVHD或慢性GVHD。在一个实施方案中，供体移植物可以通过在移植到受体中之前用本发明的CAR修饰的免疫细胞(例如，CAR工程化的Treg细胞)处理移植物来"预处理"或"预先准备"，以便降低移植物对抗受体的免疫原性，从而降低或预防GVHD。在一个实施方案中，移植前可将移植物与受体的细胞或组织接触以活化与移植物相关的T细胞。在用来自受体的细胞或组织处理移植物后，可从移植物取出细胞或组织。然后，可以使经处理的移植物进一步与本发明的CAR修饰的免疫细胞(例如，CAR工程化的Treg细胞)接触，以降低、抑制或消除通过处理来自受体的细胞或组织而活化的免疫效应细胞的活性。在用本发明的CAR修饰的免疫细胞处理移植物之后，在移植到受体中之前，可以从移植物中去除CAR修饰的免疫细胞。然而，一些CAR修饰的免疫细胞可以贴附于移植物，并且因此可以随移植物引入至受体。在这种情况下，引入到受体中的CAR修饰的免疫细胞可抑制由与移植相关的细胞引起的针对受体的免疫应答。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于选自以下的一种或两种不同的HLA-A亚型是阳性的：HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68中的一种或两种。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的并且对于选自以下的一种HLA-A亚型是阳性的：HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68中的一种。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于选自以下的两种不同的HLA-A亚型是阳性的：HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68中的一种或两种。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的并且对于选自以下的两种不同的HLA-A亚型是阳性的：HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68中的一种。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的并且对于选自以下的两种不同的HLA-A亚型是阳性的：HLA-A*03、HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30、HLA-A*31、HLA-A*33、HLA-A*36、HLA-A*68中的两种。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于选自以下的一种或两种不同的HLA-A亚型是阳性的：HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30中的一种或两种。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的并且对于选自下的一种HLA-A亚型是阳性的：HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30中的一种。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的并且对于选自以下的两种不同的HLA-A亚型是阳性的：HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30中的一种或两种。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的并且对于选自以下的两种不同HLA-A亚型是阳性的：HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30中的一种。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的并且对于选自以下的两种不同的HLA-A亚型是阳性的：HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30中的两种。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于HLA-A*03的HLA-A亚型是阳性的。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于HLA-A*25的HLA-A亚型是阳性的。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于HLA-A*29的HLA-A亚型是阳性的。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于HLA-A*30的HLA-A亚型是阳性的。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于HLA-A*31的HLA-A亚型是阳性的。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于HLA-A*33的HLA-A亚型是阳性的。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于HLA-A*36的HLA-A亚型是阳性的。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于HLA-A*68的HLA-A亚型是阳性的。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于HLA-A*03:01、HLA-A*25:01、HLA-A*29:02、HLA-A*30:01、HLA-A*31:01、HLA-A*33:01、HLA-A*36:01、HLA-A*68:01中的一种或两种是阳性的。在一个实施方案中，所述移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于HLA-A*03:01、HLA-A*25:01、HLA-A*29:02、HLA-A*30:01、HLA-A*31:01、HLA-A*33:01、HLA-A*36:01、HLA-A*68:01中的一种是阳性的。在一个实施方案中，所述移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于HLA-A*03:01、HLA-A*25:01、HLA-A*29:02、HLA-A*30:01、HLA-A*31:01、HLA-A*33:01、HLA-A*36:01、HLA-A*68:01中的两种是阳性的。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于HLA-A*25:01、HLA-A*29:02和HLA-A*30:01中的一种或两种是阳性的。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于HLA-A*25:01、HLA-A*29:02和HLA-A*30:01中的一种是阳性的。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于HLA-A*25:01、HLA-A*29:02和HLA-A*30:01中的两种是阳性的。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于HLA-A*25:01是阳性的。在一个实施方案中，移植宿主或受体为HLA-A2阴性，并且对于HLA-A*29:02是阳性的。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于HLA-A*30:01是阳性的。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于HLA-A*03:01是阳性的。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于HLA-A*31:01是阳性的。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于HLA-A*33:01的阳性的。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于HLA-A*36:01是阳性的。在一个实施方案中，移植宿主或受体是HLA-A2阴性的，并且对于HLA-A*68:01是阳性的。在一个实施方案中，移植物为HLA-A2阳性。在一个实施方案中，免疫细胞是调节性免疫细胞。在一个实施方案中，调节性免疫细胞选自由以下组成的组：调节性T细胞、CD4+调节性T细胞、CD8+调节性T细胞、调节性γδT细胞、调节性DN T细胞、调节性B细胞、调节性NK细胞、调节性巨噬细胞、调节性树突细胞及其任何组合。在一个实施方案中，免疫细胞是调节性T细胞。在一个实施方案中，免疫细胞是CD4+调节性T细胞。在一个实施方案中，免疫细胞是人免疫细胞。在另一个实施方案中，调节性免疫细胞是人调节性免疫细胞。在一个实施方案中，人调节性免疫细胞选自由以下组成的组：调节性T细胞、CD4+调节性T细胞、CD8+调节性T细胞、调节性γδT细胞、调节性DN T细胞、调节性B细胞、调节性NK细胞、调节性巨噬细胞、调节性树突细胞及其任何组合。在另一个实施方案中，免疫细胞是人调节性T细胞。在一个实施方案中，免疫细胞是人CD4+调节性T细胞。
在一个实施方案中，本发明提供了在受试者中扩增免疫细胞群的方法，其中免疫细胞被修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)，所述方法包括向受试者施用如本文任何地方所述的免疫细胞，其中施用的修饰的免疫细胞在受试者中产生子代免疫细胞群。在一个实施方案中，免疫细胞是调节性免疫细胞。在一个实施方案中，调节性免疫细胞选自由以下组成的组：调节性T细胞、CD4+调节性T细胞、CD8+调节性T细胞、调节性γδT细胞、调节性DN T细胞、调节性B细胞、调节性NK细胞、调节性巨噬细胞、调节性树突细胞及其任何组合。在一个实施方案中，免疫细胞可以是调节性T细胞。在一个实施方案中，免疫细胞可以是CD4+调节性T细胞。在一个实施方案中，免疫细胞是人免疫细胞。在另一个实施方案中，调节性免疫细胞是人调节性免疫细胞。在一个实施方案中，所述人调节性免疫细胞选自由以下组成的组：调节性T细胞、CD4+调节性T细胞、CD8+调节性T细胞、调节性γδT细胞、调节性DN T细胞、调节性B细胞、调节性NK细胞、调节性巨噬细胞、调节性树突细胞及其任何组合。在另一个实施方案中，免疫细胞是人调节性T细胞。在一个实施方案中，免疫细胞是人CD4+调节性T细胞。在一个实施方案中，本发明的CAR修饰的Treg细胞能够在体内复制，产生长期持久性，这可以导致对靶细胞的免疫应答的持续抑制和免疫耐受。在一个实施方案中，提供了在受试者中产生调节性T细胞的持久群的方法，其中所述调节性T细胞被修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)，所述方法包括向所述受试者施用如本文任何地方所述的调节性T细胞，其中所述修饰的调节性T细胞的持久群在所述受试者中在施用后持续至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、30天、40天、50天、60天、70天、80天、90天、100天、200天、300天、400天、500天、600天、700天、800天、900天或1000天。在一个实施方案中，CAR-Treg细胞可能能够在体内自我更新并被再活化以抑制靶细胞的免疫应答。在一个实施方案中，CAR-Treg细胞可以是记忆CAR-Treg细胞，其可被再活化以抑制靶细胞的免疫应答。
免疫细胞可以从任何来源获得。例如，在一个实施方案中，免疫细胞可以从组织供体、移植受体或其他无关来源(完全不同的受试者或物种)获得，用于产生本发明的CAR修饰的免疫细胞。因此，本发明的CAR修饰的免疫细胞对于移植受体可以是自体的、同种异体的或异种的，或者是其它不相关的来源。在一个实施方案中，本发明的CAR-Treg细胞对于移植受体可以是自体的、同种异体的或异种的。在一个实施方案中，本发明的CAR-Treg细胞对于移植受体可以是自体的。
在一个实施方案中，受试者可以是哺乳动物。在一个实施方案中，受试者可以是人。
在一个实施方案中，可能需要给受试者施用活化的T细胞，然后再抽血(或进行单采术)，根据本发明活化其中的T细胞，并用这些活化和扩增的T细胞再输注到受试者体内。该过程可以每几个星期进行多次。在某些实施方案中，T细胞可以从10cc至400cc的抽血中活化。在某些实施方案中，T细胞从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的抽血中活化。不受理论束缚，使用这种多次抽血/多次再输注方案可以用于选出某些T细胞群。
本发明的CAR修饰的免疫细胞可单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分组合施用，所述其他组分包括例如IL-2或其他细胞因子或细胞群。在一个实施方案中，本发明的药物组合物可以包含多种如本文任何地方描述的修饰的免疫细胞。在一个实施方案中，本发明的药物组合物可以包含与一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合的如本文任何地方描述的CAR修饰的免疫细胞或细胞群。这样的组合物可以包含缓冲剂，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的药物组合物可以以任何合适的方式施用于受试者，包括通过气雾剂吸入、注射、摄取、输注、植入或移植。本文任何地方描述的药物组合物可以通过肠胃外施用施用于受试者。本文任何地方描述的药物组合物可以皮下、皮内、肿瘤内、结节内、髓内、肌内、胸骨内注射、静脉内注射、输注技术或腹膜内施用于受试者。在一个实施方案中，本发明的CAR修饰的免疫细胞组合物可以通过皮内或皮下注射施用给受试者。在另一个实施方案中，本发明的CAR修饰的免疫细胞组合物可以通过静脉内注射施用。在一个实施方案中，CAR修饰的免疫细胞的组合物可以直接注射到淋巴结、感染部位、炎症部位或组织或器官排斥部位。
本发明的药物组合物可以以适合于待预防或治疗的疾病的方式施用。施用的量和频率将由诸如受试者的状况、受试者疾病的类型和严重程度等因素决定，尽管适当的剂量可通过临床试验来确定。
当指示"有效量"或"治疗量"时，待施用的本发明组合物的量可考虑受试者的年龄、体重、抗体滴度和状况的个体差异来确定。通常可以说，包含如本文任何地方所述的CAR修饰的免疫细胞的药物组合物可以以1x104至1x109个细胞/kg体重的剂量施用。在一个实施方案中，CAR修饰的免疫细胞可以以1x105至100x105个细胞/kg体重的剂量施用，包括那些范围内的所有整数值。CAR修饰的免疫细胞组合物也可以以这些剂量施用多次。CAR修饰的免疫细胞可以通过使用免疫疗法中通常已知的输注技术施用(参见，例如Rosenberg等人,1988)。通过监测受试者的疾病征象并相应地调整治疗，可以容易地确定特定受试者的最佳剂量和治疗方案。
在一个实施方案中，将本发明的至少一种CAR工程化的免疫细胞与另一种活性剂组合施用至有需要的受试者。根据一个实施方案，所述至少一种免疫细胞群在施用另一种活性剂之前、同时或之后施用。
在一个实施方案中，本发明的CAR修饰的免疫细胞可与任何数量的相关治疗方式联合(例如，之前、同时或之后)施用给受试者，所述治疗方式包括但不限于用试剂如抗病毒疗法、化学疗法、放射、免疫抑制剂、抗体、免疫清除剂、细胞因子和辐射治疗。在一个实施方案中，本发明的CAR修饰的免疫细胞可与免疫抑制剂联合施用。可以使用本领域已知的任何免疫抑制剂。例如，免疫抑制剂可以是钙调磷酸酶抑制剂例如环孢菌素、他克莫司(tacrolimus)、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、甲氧沙林(methoxsalen)、雷帕霉素、霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)、霉酚酸、霉酚酸钠、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、利妥昔单抗、mTOR抑制剂如西罗莫司、依维莫司、巴利昔单抗、达克珠单抗、贝洛西普、阿仑单抗、莫罗单抗-CD3、抗胸腺细胞球蛋白、糖皮质类固醇或肾上腺皮质类固醇例如泼尼松和泼尼松龙，或其任意组合。本发明的CAR修饰的免疫细胞可在免疫抑制剂之前、之后或与免疫抑制剂同时施用给受试者。例如，本发明的CAR修饰的免疫细胞可以在免疫抑制剂施用给对象之后施用，或者本发明的CAR修饰的免疫细胞可以在免疫抑制剂施用给对象之前施用。可选地，或另外，本发明的CAR修饰的免疫细胞可以在免疫抑制剂施用给受试者的同时施用。本发明的CAR修饰的免疫细胞和/或免疫抑制剂可以在移植后施用于受试者。可选地，或另外，本发明的CAR修饰的免疫细胞和/或免疫抑制剂可以在移植之前施用于受试者。本发明的CAR修饰的免疫细胞和/或免疫抑制剂可以在移植手术期间施用于受试者。在一个实施方案中，一旦免疫抑制疗法已经开始，就进行本发明的将CAR修饰的免疫细胞施用至受试者的方法。在一些实施方案中，所述方法进行多于一次，例如，以随时间监测移植受体，并且如果适用，用在不同的免疫抑制治疗方案中。在一些实施方案中，如果预测移植物受体对移植物耐受，则减少免疫抑制疗法。在一些实施方案中，如果预测移植物受体对移植物耐受，则不开具免疫抑制疗法，例如停止免疫抑制疗法。
还提供了预防或治疗受试者中的器官或组织移植排斥的方法，该方法包括向受试者施用(i)至少一种免疫抑制剂和(ii)本发明的CAR工程化的免疫细胞(例如，CAR工程化的Treg细胞)，或包含所述免疫细胞的药物组合物。
因此，本发明的另一个实施方案是本发明的CAR工程化的免疫细胞(例如，CAR工程化的Treg细胞)或包含所述免疫细胞的药物组合物与至少一种免疫抑制剂的组合，其用于预防或治疗受试者中的器官或组织移植排斥。
还提供了增加受试者中的移植物存活时间段的方法，该方法包括向受试者施用至少一种免疫抑制剂和本发明的CAR工程化的免疫细胞(例如，CAR工程化的Treg细胞)，或包含其的药物组合物。
在一个实施方案中，至少一种免疫抑制剂与本发明的CAR工程化的免疫细胞(例如，CAR工程化的Treg细胞)的组合用于预防或治疗移植物抗宿主病(GVHD)。在一个实施方案中，GVHD可在造血干细胞移植后发生。
因此，本发明的另一个实施方案是预防或治疗受试者中的移植物抗宿主病(GVHD)的方法，所述方法包括向受试者施用如本文所述的至少一种免疫抑制剂和CAR工程化的免疫细胞(例如，CAR工程化的Treg细胞)或药物组合物。
在一个实施方案中，本发明提供了在将移植物移植到受体中的同时、之前或之后，使供体移植物(例如，生物相容的格架或供体组织、器官或细胞)与至少一种免疫抑制剂和本发明的CAR工程化的免疫细胞(例如CAR工程化的Treg细胞)接触的方法。
在一个实施方案中，至少一种免疫抑制剂与本发明的CAR工程化的免疫细胞(例如CAR工程化的Treg细胞)的组合可用于改善、抑制或减少供体移植物对抗针对受体的不利反应，从而预防或治疗GVHD。
因此，本发明的另一个实施方案是在受试者中预防或延迟GVHD发作的方法，所述方法包括向受试者施用如本文所述的至少一种免疫抑制剂和CAR工程化的免疫细胞(例如CAR工程化的Treg细胞)或药物组合物。
在一个实施方案中，本发明的CAR工程化的免疫细胞和至少一种免疫抑制剂同时或顺序施用。
在一个实施方案中，本发明的CAR工程化的免疫细胞和任选的至少一种其他活性剂，例如免疫抑制剂，与移植物联合施用(例如，在移植之前、同时或之后)。
本发明的CAR修饰的免疫细胞可以在诊断移植器官或组织排斥之后施用，随后施用本发明的CAR修饰的免疫细胞和免疫抑制剂两者，直到器官或组织排斥的症状消退。在另一个实施方案中，本发明的CAR修饰的免疫细胞组合物可以与骨髓移植联合(例如，之前、同时或之后)施用于受试者。在另一个实施方案中，本发明的CAR修饰的免疫细胞可在B细胞消融疗法(例如与CD20反应的试剂，例如利妥昔单抗)后施用。例如，在一个实施方案中，受试者可经历高剂量化疗的标准治疗，随后进行外周血干细胞移植。在某些实施方案中，在移植后，受试者可以接受本发明的扩增的CAR修饰的免疫细胞的输注。在另外的实施方案中，可以在手术之前或之后施用扩增的CAR修饰的免疫细胞。
在一个实施方案中，受试者(例如人)接受本发明的至少一种免疫细胞或免疫细胞群的初始施用，和一次或多次后续施用，其中一次或多次后续施用是在前次施用后少于15天，例如14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2天施用。在一个实施方案中，将治疗有效量的本发明的免疫细胞施用或将要施用给受试者。在一个实施方案中，向受试者施用的本发明的至少一种免疫细胞群的免疫细胞的量是至少102、103、104、105、106、107、108或109个细胞。在一个实施方案中，向受试者施用的本发明的免疫细胞的量在约102至约109、约103至约108、约104至约107或约105至约106个细胞的范围内。在另一个实施方案中，向受试者施用的本发明的免疫细胞的量在约106至约109、约106至107、约106至108、约107至109、约107至108、约108至109的范围内。在另一个实施方案中，向受试者施用的本发明的免疫细胞的量为约106、约107、约108或约109。在一个实施方案中，向受试者施用的本发明的至少一种免疫细胞群的免疫细胞的量为至少102、103、104、105、106、107、108或109个细胞/kg身体。在一个实施方案中，向受试者施用的本发明的免疫细胞的量在约104至109个细胞/kg体重或105至108个细胞/kg体重的范围内，包括在那些范围内的所有整数值。在一个实施方案中，每周向受试者(例如人)施用本发明的至少一种免疫细胞或免疫细胞群多于一次，例如每周施用本发明的遗传修饰的免疫细胞或免疫细胞群2、3或4次。
在一些实施方案中，可能期望将自杀基因引入本发明的CAR修饰的免疫细胞中，以便能够在体内选择性破坏CAR修饰的免疫细胞。在一个实施方案中，本发明的CAR修饰的免疫细胞可进一步包含自杀基因系统。在一个实施方案中，本发明的CAR修饰的免疫细胞可进一步包含编码自杀基因系统的核酸。如本文所述的"自杀基因治疗"、"自杀基因"和"自杀基因系统"是指通过凋亡选择性破坏细胞的方法。这些方法使用自杀基因，其将引起细胞通过凋亡杀死自身。自杀基因编码一种产物，该产物通过其自身或在其它化合物存在下引起细胞死亡。自杀基因可以来自适用于细胞疗法的任何自杀基因系统(参见，例如，Jones等人,2014；Wang等人,2017；Zhang等人,2017；Casucci等人,2011；Gargett等人,2014；Khaleghi,2012；Philip等人,2014)。
在一个实施方案中，自杀基因系统可涉及基因指导的酶前药疗法(GDEPT)，其中无毒药物(即自杀基因前药)在自杀基因修饰的细胞中被转化为毒性化合物。例如，在一个实施方案中，自杀基因系统可以是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统，其使用来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因与前药更昔洛韦的组合。在其他实施方案中，自杀基因系统可以是胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶自杀基因系统。在本文提供的方法的一些供选择的方案中，其中CAR修饰的免疫细胞包含自杀基因系统，所述方法还包括向受试者施用自杀基因前药。
在其它实施方案中，自杀基因系统可涉及二聚化诱导机制，其中凋亡基因如半胱天冬酶通过诱导凋亡来破坏细胞。二聚化诱导自杀基因系统可涉及包含由与凋亡途径的组分连接的药物结合结构域的嵌合蛋白，其在施用二聚化化学诱导剂(CID)后允许被修饰的免疫细胞的条件性二聚化和凋亡。例如，在一个实施方案中，自杀基因系统可以是基于半胱天冬酶的自杀基因系统。可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统的非限制性实例可以包括可诱导的半胱天冬酶-9自杀基因系统(iCasp9)和半胱天冬酶-8自杀基因系统(iCasp8)，其中半胱天冬酶被CID、FK506或其类似物活化。在本文提供的方法的一些供选择的方案中，其中CAR修饰的免疫细胞包含自杀基因系统，所述方法还包含向受试者施用二聚化的化学诱导物。
在其它实施方案中，自杀基因系统可由治疗性单克隆抗体介导。治疗性mAb介导的自杀基因系统涉及在细胞表面表达蛋白，其使得修饰的免疫细胞对治疗性mAb敏感。在施用特异性治疗性mAb后，修饰的免疫细胞可以被选择性破坏。治疗性mAb介导的自杀基因系统的非限制性实例可包括CD20自杀基因系统和RQR8自杀基因系统，其中治疗性mAb是抗CD20mAb。在一些实施方案中，抗CD20 mAb可以是利妥昔单抗。在本文提供的方法的一些供选择的方案中，其中CAR修饰的免疫细胞包含自杀基因系统，则所述方法还包括向受试者施用治疗性单克隆抗体。
VIII.制品和试剂盒
在另一个实施方案中，本发明提供了含有可用于预防和/或治疗移植排斥或GVHD的材料的制品。该制品包括容器和在容器上或与容器相关联的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可以由各种材料形成，例如玻璃或塑料。该容器装有能有效预防和/或治疗免疫疾病如移植排斥或GVHD的组合物，并可具有无菌入口(例如该容器可以是静脉注射液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的CAR修饰的免疫细胞。在一个实施方案中，CAR修饰的免疫细胞是CAR修饰的Treg。在一个实施方案中，CAR修饰的Treg是CAR修饰的人Treg。标签或包装插页指出该组合物可用于预防或治疗移植排斥或GVHD。制品、标签或包装插页还可以包括用于向患者施用CAR修饰的免疫细胞组合物的指导材料。另外，制品还可以包括第二容器，其包含药学上可接受的缓冲剂，例如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。它还可以包括从商业和用户观点来看所希望的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针和注射器。
还提供了用于各种目的(例如，用于预防或治疗移植排斥或GVHD)的试剂盒。可以提供含有CAR修饰的免疫细胞的试剂盒。与制品一样，试剂盒包括容器和在容器上或与容器关联的标签或包装插页。容器容纳包含至少一种本发明的CAR修饰的免疫细胞的组合物。可以包括另外的容器，其包含例如稀释剂和缓冲剂。标签或包装插页可以提供组合物的说明以及预期用途的说明。在一个实施方案中，CAR修饰的免疫细胞是CAR修饰的Treg。在一个实施方案中，CAR修饰的Treg是CAR修饰的人Treg。
因此，本发明还涉及部件的试剂盒，其在第一部件中包括本发明的免疫细胞或免疫细胞群，在第二部件中包括另一种活性剂，包括但不限于抗病毒疗法、化学疗法、放射、免疫抑制剂、抗体、免疫清除剂、细胞因子和辐射。在一些实施方案中，本发明的部件的试剂盒在第一部件中包括本发明的免疫细胞或免疫细胞群，并且在第二部件中包括一种或多种免疫抑制剂。可存在于本发明的试剂盒中的免疫抑制剂的实例包括但不限于钙调磷酸酶抑制剂例如环孢菌素、他克莫司(tacrolimus)、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、甲氧沙林(methoxsalen)、雷帕霉素、霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)、霉酚酸、霉酚酸钠、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、利妥昔单抗、mTOR抑制剂如西罗莫司、依维莫司、巴利昔单抗、达克珠单抗、贝洛西普、阿仑单抗、莫罗单抗-CD3、抗胸腺细胞球蛋白、糖皮质类固醇或肾上腺皮质类固醇例如泼尼松和泼尼松龙，或其任意组合。
表1
Figure BDA0002497695580001531
表2
Figure BDA0002497695580001532
表3
Figure BDA0002497695580001533
Figure BDA0002497695580001541
Figure BDA0002497695580001551
Figure BDA0002497695580001561
Figure BDA0002497695580001571
Figure BDA0002497695580001581
Figure BDA0002497695580001591
Figure BDA0002497695580001601
Figure BDA0002497695580001611
Figure BDA0002497695580001621
Figure BDA0002497695580001631
Figure BDA0002497695580001641
Figure BDA0002497695580001651
Figure BDA0002497695580001661
Figure BDA0002497695580001671
Figure BDA0002497695580001681
Figure BDA0002497695580001691
Figure BDA0002497695580001701
Figure BDA0002497695580001711
Figure BDA0002497695580001721
Figure BDA0002497695580001731
Figure BDA0002497695580001741
Figure BDA0002497695580001751
Figure BDA0002497695580001761
表4
Figure BDA0002497695580001762
Figure BDA0002497695580001771
Figure BDA0002497695580001781
Figure BDA0002497695580001791
Figure BDA0002497695580001801
Figure BDA0002497695580001811
Figure BDA0002497695580001821
Figure BDA0002497695580001831
Figure BDA0002497695580001841
Figure BDA0002497695580001851
Figure BDA0002497695580001861
Figure BDA0002497695580001871
Figure BDA0002497695580001881
Figure BDA0002497695580001891
Figure BDA0002497695580001901
Figure BDA0002497695580001911
Figure BDA0002497695580001921
Figure BDA0002497695580001931
Figure BDA0002497695580001941
Figure BDA0002497695580001951
Figure BDA0002497695580001961
Figure BDA0002497695580001971
Figure BDA0002497695580001981
Figure BDA0002497695580001991
Figure BDA0002497695580002001
Figure BDA0002497695580002011
Figure BDA0002497695580002021
Figure BDA0002497695580002031
Figure BDA0002497695580002041
Figure BDA0002497695580002051
Figure BDA0002497695580002061
Figure BDA0002497695580002071
Figure BDA0002497695580002081
Figure BDA0002497695580002091
Figure BDA0002497695580002101
Figure BDA0002497695580002111
Figure BDA0002497695580002121
Figure BDA0002497695580002131
Figure BDA0002497695580002141
Figure BDA0002497695580002151
Figure BDA0002497695580002161
Figure BDA0002497695580002171
Figure BDA0002497695580002181
Figure BDA0002497695580002191
Figure BDA0002497695580002201
Figure BDA0002497695580002211
Figure BDA0002497695580002221
Figure BDA0002497695580002231
Figure BDA0002497695580002241
Figure BDA0002497695580002251
Figure BDA0002497695580002261
表5
Figure BDA0002497695580002262
表6
Figure BDA0002497695580002263
Figure BDA0002497695580002271
表7
Figure BDA0002497695580002272
Figure BDA0002497695580002281
Figure BDA0002497695580002291
Figure BDA0002497695580002301
实施例
方法
人源化HLA-A*02特异性scFv的产生。使用Invitrogen GeneArt Gene Synthesis服务的密码子优化器，使用利用针对智人的设置对人源化基因进行密码子优化。
Figure BDA0002497695580002302
基因片段从Integrated DNA Technologies(Coralville，Iowa)订购，使得嵌合抗原受体的5'区含有Kozak序列，和与pcDNA3质粒的36NT重叠。3'端含有BamHI位点和与CD8铰链序列的重叠，以促进Gibson与CD8铰链和嵌合抗原受体的胞内信号传导结构域在框内装配到质粒中。
hA2-CAR的产生。如所述(Sadelain等人，2013)，scFv变体与来自人CD8α的茎区、来自人CD28和人CD3ζ的跨膜和胞内结构域融合。将所得cDNA克隆到编码作为标记的细胞表面表达的截短的神经生长因子(TrkA)受体(ΔNGFR)的慢病毒载体中(图1)。通过流式细胞术用瞬时转染的HEK 293T细胞(
Figure BDA0002497695580002311
Polyplus Transfection)测定表面表达。病毒颗粒如所述(Allan等人，2008)产生。
表达HLA的K562细胞系的产生。表达CD64的K562细胞(K562.64)是美国费城宾夕法尼亚大学James Riley赠送的。使用引物序列5’-TTTTCTAGACGCGTGCCACCATGGCCGTCATGGCGCC-3’(正向)(SEQ ID NO：197)和5'-AAGTCGACGCTAGCTCACACTTTACAAGCTGTGAGAGACA-3’(反向)(SEQ ID NO：198)，从分别来自A*02:01或A*24:02的纯合供体的外周血单核细胞的mRNA分离HLA-A*02:01或A*24:02的cDNA。所得序列通过Sanger测序法确认，与IPD和IMGT/HLA数据库(Robinson等人，2015)的预期序列比对，并使用慢病毒表达载体分别转导入K562细胞。为了产生A25-K562细胞和A68-K562细胞，从IPD和IMGT/HLA数据库(Robinson等人，2015)中提取A*25:01、A*68:01的HLA序列，使用来自ThermoFisher Invitrogen GeneArt GeneSynthesis服务的密码子优化工具(设定为智人)进行密码子优化，然后克隆到慢病毒表达载体中并转导到K562细胞中。然后在FACSAria II(BD Biosciences)上使用抗HLA-ABC(ThermoFisher，12-9983-41)分选所得K562细胞系，以确保转导的HLA和抗HLA-A2(BB7.2)(ThermoFisher，17-9876-42)的等同表面表达，从而确保纯度。
Treg分选、转导和扩增。CD4+ T细胞通过RosetteSep(Stemcell)从HLA-A2-供体分离，并富集CD25+细胞(Miltenyi)，然后分别使用
Figure BDA0002497695580002312
Astrios(Beckman Coulter)或FACSAria II(BD Biosciences)分选活的CD4+ CD25hiCD127loTreg(用于体外和萤光素酶实验)或CD4+CD127loCD25hi CD45RA+ Treg(用于异种GvHD和皮肤移植实验)。在含1000U/mLIL-2(Proleukin)的immunocult-XF T细胞扩增培养基(STEMCELL Technologies)中，用L细胞和αCD3 mAb(OKT3；100ng/mL)刺激分选的Treg。一天后，以10个病毒颗粒：1个细胞的感染复数，用慢病毒转导细胞。在第7天，用磁选择(Miltenyi)纯化ΔNGFR+细胞，然后用于测定中或用如上所述的L细胞再刺激并扩增5天，用于体内实验。为了测试HLA-A2介导的刺激的效果，将Treg与限制性IL-2(100U/mL)一起培养24小时，然后再计数并与辐照的负载抗CD3/抗CD28的K562.64细胞或表达HLA-A*02:01、A*24:02、A*25:01或A*68:01的K562.64细胞以1:2(K562：T细胞)比率一起共培养24小时。
流式细胞术。对于表型分析，用可固定的活性染料(FVD，65-0865-14，ThermoFisher；423102，Biolegend)针对表面标记对细胞进行染色，然后用eBioscienceFOXP3/转录因子染色缓冲液组(Transcription Factor Staining Buffer Set)(ThermoFisher)固定和透化并针对胞内蛋白染色。样品在Cytoflex(Beckman-Coulter)上读取，并使用FlowJo软件版本9.9.4和10.3(Tree Star)分析结果。
针对以下进行表面染色：ΔNGFR(130-091-885,Miltenyi),CD3(564465,BDBiosciences),CD4(317410,Biolegend),CD25(130-091-024,Miltenyi),LAP(25-9829-42,ThermoFisher),CD69(310946,Biolegend),CD154(555702,BD Biosciences),CD71(BDBiosciences,563768),和CD127(48-1278-42,ThermoFisher)。四聚体染色是通过用链霉亲和素-别藻蓝蛋白(PJ27S，Prozyme)将HLA-A*02:01单体制成的四聚体进行的。对CTLA-4(369606，Biolegend)进行细胞内染色。
对于体内实验，每周和终点时收集50μL血液。氯化铵用于红血细胞裂解。将细胞重悬于含有抗小鼠CD16/32(ThermoFisher，14-0161-82)的PBS中，并使用可固定的活性染料(FVD；ThermoFisher，65-0865-14)、抗小鼠CD45(ThermoFisher，25-0451-82)和抗人CD45(BD Biosciences，560777)、CD4(Biolegend，300554，317434)、CD8(ThermoFisher，48-0087-42)、抗人CD271(NGFR；BD Biosciences，557196)、HLA-A2(BD Biosciences，551285)针对细胞外标记物进行染色。针对FOXP3(ThermoFisher，12-4777-42)的细胞内染色用eBioscience FOXP3/转录因子染色缓冲液组(ThermoFisher，00-5523-00)进行。将10,000个计数珠加入每个样品(ThermoFisher，01-1234-42)。针对异种GvHD、萤光素酶和皮肤移植实验的门控策略分别如图8D、10A和12A所示。
HLA等位基因交叉反应性测定。将0.25×106个CAR Treg(如上制备，培养7天后)与单独的FlowPRA单抗原抗体珠组(FL1HD01、FL1HD02、FL1HD03、FL1HD04、FL1HD06和FL1HD08，One Lambda)和可固定的活性染料(FVD，65-0865-14，ThermoFisher)在室温下温育30分钟，然后洗涤，用0.5％甲醛固定并通过流式细胞术分析。每个样品获得两百个阴性对照珠。为了分析，首先使用可固定的活性染料消除死细胞。然后在排除死细胞和成对物后对单个珠子进行门控。然后，通过它们各自的PE强度确定每种HLA抗原的珠数量。通过将样品中的阴性珠子的数量除以Treg-NGFR样品中的阴性珠子的数量，乘以Treg-NGFR样品中阴性珠子的数量，对数据进行标准化。相对结合百分比是NGFR样品中针对特定HLA的珠子数量减去样品中针对该HLA的标准化珠子数量，除以NGFR样品中的珠子数量再乘以100。
混合淋巴细胞反应的抑制。如所述(Dijke等人，2015)，将来自HLA-A2+健康供体的PBMC的贴壁细胞分化成单核细胞来源的树突细胞。对于混合淋巴细胞反应，HLA-A2-PBMC应答细胞用细胞增殖染料eF450(65-0842-85，ThermoFisher)标记，然后与5×104HLA-A2+单核细胞衍生的树突细胞和用细胞增殖染料e670(65-0840-90，ThermoFisher)标记的增加比例的表达ΔNGFR-或hA2-CAR的扩增Treg一起铺板。6天后，通过流式细胞术测量HLA-A2-CD4+应答T细胞的分裂。基于给定细胞组合的增殖指数和与阳性对照(HLA-A2+单核细胞衍生的树突细胞与仅HLA-A2-CD4+应答T细胞)的比率，计算抑制百分比，如所述(McMurchy和Levies，2012)。通过首先如下计算抑制百分比将数据标准化：
Figure BDA0002497695580002331
然后根据每个独立实验的公式将0-100％的结果值标准化：
Figure BDA0002497695580002332
异种移植物抗宿主病的体内抑制。8至12周龄雌性NSG小鼠(Jackson Laboratory，室内饲养)接受全身辐照(150cGy，RS-2000Pro Biological System)，1天后在有或者没有4×106hA2-CAR Treg的情况下静脉注射8×106HLA-A2+PBMC至尾静脉。盐水注射的小鼠用作对照。hA2-CAR Treg产生自四个不同的健康供体。GVHD根据体重、皮毛质地、姿势、活动水平和皮肤完整性来评分，如所述每类0-2分(Cooke等，1996；Hill等，1997)。GVHD评分由两个不知情的研究者进行。离心来自隐静脉的外周血；然后裂解红细胞，并通过流式细胞术测量白细胞。
研究批准。对于人PBMC，健康志愿者根据英属哥伦比亚大学临床研究伦理委员会(University of British Columbia Clinical Research Ethics Board)和加拿大血液服务(Canadian Blood Services)批准的方案给出书面知情同意书。从Harvard皮肤资源中心(Skin Resource Centre)、皮肤工作组(Skin Works)或Cambie外科诊所(Surgery Clinic)按照英属哥伦比亚大学临床研究伦理委员会批准的方案获得整形外科废弃的人皮肤样品。动物方案得到UBC动物管理委员会(UBC Animal Care Committee)的批准。
皮肤移植。为了评价A2-CAR Treg归巢和抑制皮肤排斥的能力，将8至12周龄雌性NSG小鼠(Jackson实验室，室内饲养)移植来自转基因HLA-A2+NSG小鼠(Jackson实验室，室内饲养)的皮肤和NSG皮肤(HLA-A2阴性)。对于小鼠皮肤移植，利用8mm活检穿孔器将皮肤切成圆形片，并将皮肤置于含有PBS的新鲜平板上，并保持在低温(4-8℃)下直至移植(约1-4小时)。通过流式细胞术和qPCR评估人类皮肤的HLA-A2表达。通过从样本去除脂肪产生刀刃厚度的外植体。外植体用无菌PBS冲洗并储存在RPMI中。将优质皮肤外植体切成1cm2片，置于含PBS的新鲜平板上并保持低温(4-8℃)直至移植(～1-4小时)。对于小鼠和人皮肤移植，将先前剃毛的小鼠麻醉，在肩部附近切开背部皮肤并除去相似大小的小鼠皮肤，然后将移植物置于暴露区域上并用无菌条(3M，Nexcare)稳定。移植物用凡士林纱布覆盖，并用2cm宽的CoFlex绷带(3M，Nexcare)包裹，以在细胞注射前固定移植物长达14天。
组织学
在细胞注射后27天收获人皮肤移植物和周围的小鼠皮肤，在4℃下在10％福尔马林(组织与福尔马林的比例为1:10v/v)中固定过夜，并在石蜡包埋前储存在70％乙醇中。通过BC儿童医院研究所组织学服务(BC Children’s Hospital Research InstituteHistology Services)(Vancouver，英属哥伦比亚，加拿大)制备石蜡切片(5-μm厚)和H&E染色。对于免疫染色，使用一系列二甲苯洗涤(×3)、梯度醇溶液(2×100％乙醇、1×95％乙醇和1×70％乙醇)和1×PBS对切片进行脱蜡和再水合。在载玻片上使用微波(5分钟高功率，接着20分钟低功率)在10mM柠檬酸钠缓冲液(0.5％Tween-20，pH6.0)中达到93-95℃进行热诱导表位修复(HIER)。HIER后，用流动的自来水、去离子水和PBS洗涤载玻片。切片与无血清的
Figure BDA0002497695580002351
蛋白块(Protein Block)(Dako，Burlington，加拿大，X0909)一起孵育以限制非特异性抗体染色。然后将切片与以下一抗在4℃下孵育过夜：FOXP3(Invitrogen，克隆PCH101，14-4776-82)，CD45(eBioscience，克隆H130，17-0459)，Ki67(eBioscience，克隆20Raji，17-5699)，Involucrin(Abcam，ab53112)。第二天，用PBS轻轻冲洗切片几次，然后用下列二抗RT染色1小时：驴抗大鼠488(Life Tech，A11006)、山羊抗小鼠APC(Invitrogen，1834696)、驴抗兔488(Life Tech，A21206)。最后，切片用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)复染以鉴定细胞核，并使用
Figure BDA0002497695580002352
封固剂(Mounting Medium)与DAPI(VectorLaboratories，Burlingame，加利福尼亚，美国，H-1200)封固。所有抗体在抗体稀释剂(Dako，Burlington，加拿大，S3022)中稀释。使用Olympus BX61荧光和明视野自动立式显微镜，用QImaging Retiga Exi照相机和Olympus DP71彩色照相机捕获图像。使用具有Olympus Viewer Plugin的Fiji进行荧光图像的定量分析(Schneider等，2012；Eliceiri等，2012)。
H&E染色的载玻片由不知情的临床病理学家使用由8个因子定义的评分系统进行评价，每个因子从0到3-4分级；Lerner级(0、1-病灶或弥漫性液泡变性，2-角化异常，3-基底层或浅层裂隙，4-表皮明显丧失)，毛细血管病(0、1-仅基底层，2-多至一半，3-整个厚度)，坏死性角质形成细胞(0、1-罕见(1/hpf)，2-偶发(2-3/hpf)，3-众多(＞4/hpf))，坏死性角质形成细胞位置(0、1-仅基底层，2-高至上半部分，3-整个厚度)，卫星病(satellitetosis)(0、1-仅1，2-2-3/hpf，3-＞4/hpf)，胞吐(0、1-病灶，2-＜50％活检，3-＞50％活检)，附件受累(0、1-任何附件的微小受累，2-＜50％附件的明显受累，3-＞50％附件明显受累)和真皮中的淋巴套(0、1-轻微，2-大量，3-带状)(Massi等人,1999；Fischer等人,2015,Kanitakis等人,2008)。
qPCR。根据制造商的说明书(RNeasy Plus Mini试剂盒；Qiagen)从人皮肤样品中收获RNA，并转化为互补DNA(cDNA)。使用SYBR-Green(Biorad)和针对IL17、IL6、IL1B、DEFB4、IFNg、TNFa、18S核糖体RNA的引物进行qPCR(表8)。收集解链曲线和SYBR-绿发射数据。使用标准曲线计算相对浓度，并将数值标准化为18S核糖体RNA的扩增产物。每个样品的Log2(RQ)值使用双ΔCt(ΔΔCt)方法(Schmittgen等，2008)获得。每个样品的ΔCt值通过计算平均Ct(目的基因)-Ct(管家基因)获得。为了获得ΔΔCt，从处理的样本的ΔCt中减去对照样本的ΔCt。然后通过2-(ΔΔCt)计算基因表达倍数。
表8：qPCR分析中使用的引物
Figure BDA0002497695580002361
Figure BDA0002497695580002371
萤光素酶。为了评价Treg在体内向表达HLA-A2的小鼠皮肤移植物的归巢，用如上所述的L细胞刺激分选的Treg(CD4+CD25hiCD127lo)。第二天，用MOI为10的HER2-CAR、mA2-CAR或H1k2 hA2-CAR慢病毒并在8小时后用MOI为5的萤光素酶-GFP-慢病毒转导细胞。如先前所述(Barrett等，2014)，使用编码甲虫萤光素酶-GFP-融合蛋白的慢病毒质粒(pELNS.CBG-T2A-GFP(CBR))。在培养7天后，在如上所述用L细胞再刺激之前，对表达CAR和萤光素酶的双重转导的GFP+ΔNGFR+Treg进行分选。在培养的第12天，将1-3×106萤光素酶-CAR Treg和6×106人同种异型HLA-A2-PBMC静脉内注射到移植皮肤的NSG小鼠中。对于生物发光成像，在即将用异氟烷麻醉前腹膜内注射D-萤光素钾盐(150mg/kg，Gold Bio)，并在Ami-X(Spectral Instruments Imaging)上在15-20分钟内获得图像。用AmiView软件(SpectraInstruments Imaging，1.7.06版)分析数据，并且发光信号被定量为HLA-A2+中的光子/秒/cm2/球面度与HLA-A2-皮肤移植物的比值。在实验终点，收集引流皮肤的腋窝淋巴结和脾，置于70μm细胞滤过器(BD Falcon)上，然后破碎并使用1cc注射器的活塞过滤。然后将细胞染色用于流式细胞术。
统计分析。所有统计使用Prism 7.0B进行。图9使用IBM*SPSS统计版本24.0.0.0。
结果
人源化的HLA-A2特异性CAR的构建
使用可从国家生物技术信息中心(NCBI)获得的IgBLAST工具，将来自小鼠BB7.2mAb的重链和轻链可变区的氨基酸序列与从国际ImMunoGeneTics信息系统
Figure BDA0002497695580002381
数据库获得的人免疫球蛋白序列进行比对。将V基因分界系统设置到Kabat序列中，以获得Kabat定义的CDR(Kabat等，1991)。此外，还确定了Chothia的定义(Chothia等，1987)也被确定。
测试了许多不同的人种系基因作为CDR移植的框架序列。除了鉴定与小鼠序列最相当的人种系序列之外，还考虑CDR长度以尽可能多地保持结构。用BB7.2抗体的小鼠对应CDR替换人CDR(Kabat编号)。同样，通过将Chothia和Kabat编号组合，取代了重链的其它CDR氨基酸。最终产生6种不同的人源化重链和5种不同的人源化轻链，并且通过组合人源化重链和轻链产生总共20种不同的嵌合抗原受体。
人源化HLA-A2特异性CAR的表达和抗原特异性
为了测试抗原特异性，将各种hA2-CAR构建体瞬时转染到293T细胞中，用HLA-A*02:01四聚体染色，并通过流式细胞术分析。表达11个hA2-CAR构建体，并与A*02:01四聚体结合(图2)。
接下来，我们比较了各种hA2-CAR构建体的结合强度。用递增稀释的A*02:01四聚体对瞬时转染的293T细胞进行染色，然后通过流式细胞术进行分析。如图3(A、B和C)所示，11个hA2-CAR构建体以四聚体浓度依赖性方式高度结合A*02:01四聚体。
hA2-CAR介导的刺激活化Treg
为了测试A2-CAR在Treg中的功能，从外周血中分选CD4+ CD25hiCD127lo细胞。如图4(A、B和C)所示，刺激Treg，转导并培养另外的6-7天。在培养7-8天结束时，将细胞纯化为NGFR+细胞，并用流式细胞术测试hA2-CAR变体的细胞表面表达。如图4所示，与用ΔNGFR对照构建体转导的Treg相比，用hA2-CAR构建体转导的Treg显示被HLA-A2四聚体阳性染色，表明对表达hA2-CAR的Treg的抗原特异性的保留。在生产高滴度慢病毒(H1k3)时遇到了技术困难，并且在本实验中在Treg中没有测试该CAR。通过用A*02:01四聚体染色测试CAR细胞表面表达和特异性，揭示H2k2、H4k4和H5k4在Treg中具有双峰表达模式，具有A2-四聚体+细胞的较低平均荧光强度(MFI)(图4D和4E)。
我们接着研究了通过hA2-CAR活化的Treg(hA2-CAR Treg)刺激是否与仅表达截短的NGFR转导标志物的Treg(NGFR Treg)可比。NGFR和hA2-CAR Treg不受刺激，用表达HLA-A*02:01的K562细胞通过CAR得以刺激，或用表达CD64(一种高亲和力Fc受体)的K562细胞通过TCR得以刺激，其预先负载抗CD3/抗CD28抗体。NGFR Treg和hA2-CAR Treg之间的比较显示，在多个时间点上，在大多数hA2-CAR Treg中高得多的CAR刺激的CD69和CD71的表达。相比之下，当通过TCR刺激时，NGFR和hA2-CAR Treg都能够上调CD69，表明它们在CAR DNA转导后保留了通过TCR发信号的能力(如图13所示)。hA2-CAR介导的Treg刺激也引起与Treg功能相关的蛋白的显著更大的上调，证明通过hA2-CAR的刺激保持了预期的CTLA-4和LAP的高表达(图5A-F)。
hA2-CAR构建体对其他I类HLA等位基因的交叉反应性
HLA有许多不同的等位基因，其是随着时间的推移由少数的祖先等位基因进化而来的。因此，存在仅有几个氨基酸不同的等位基因家族，并且单个抗HLA抗体可识别进化相关家族内的多个等位基因。已知小鼠单克隆抗体(BB7.2)对其它HLA-A等位基因具有交叉反应性(Hilton&Parham，2013)。具体地，在固相测定中进行检测时，发现BB7.2抗体识别HLA-A2的五种亚型(*02:01、*02:02、*02:03、*02:05、*02:06)，并与HLA-A*69:01交叉反应，并且在高浓度下进行检测时，也与HLA-A*23:01、A*24:02、A*24:03、A*68:01、A*68:02交叉反应(Hilton&Parham，2013)。在移植的情况下，需要AlloAg特异性信息以确保特异性靶向同种异型细胞、组织和/或器官。测量T细胞同种异型反应性的传统方法不精确且是非定量的，因为它涉及功能性MLR与大量单倍型PBMC。为了评估本发明的人源化的抗HLA-A2抗体的交叉反应性并与BB7.2抗体比较，我们采用了设计用于测量血清中的抗HLA抗体的ONE Lambda固相测定，以测量HLA包被的珠与目的人源化CAR的结合。BB7.2 CAR如MacDonald，K.G.(2016)中所述产生。将表达所示人源化CAR的NGFR+Treg与Flow Panel反应性单抗原珠孵育，将与单一类别的珠的结合定量为在前向/侧向散射图中珠子门中的信号损失(详细参见方法)。将数据相对于样品中阴性对照珠的数量标准化，并且相对于与NGFR对照Treg的结合量，通过NGFR样品中阴性珠的数量乘以NGFR样品中阴性珠的数量，计算与表达hCAR的Treg的相对结合量。为了验证该方法，将如通过FlowPRT细胞测定确定的每个m/hA2-CAR构建体与HLA-A*02:01的相对结合(图6B)与四聚体结合的MFI(图6C)进行比较。该分析揭示了检测A*02:01结合的两种方法之间的强的直接相关性。我们进一步的疑问是，通过FlowPRT细胞测定确定的A*02:01结合的量是否与暴露于A*02:01的生物学效应相关。实际上，我们发现通过FlowPRT细胞测定定量的A*02:01结合的量和Treg活化的刺激之间存在直接相关性，这通过暴露于表达A*02:01的APC后CD69上调而得以判断(图6D)。这些数据证明了FlowPRT细胞方法可用于测量AlloAg特异性CAR结合不同HLA等位基因的能力。
如图6和表9所示，所有hA2-CAR构建体都显著结合HLA-A*02:01，这确证了四聚体结合测定。当我们在单一抗原FlowPRA测定中测试BB7.2抗体结合时，我们证实了与A*69:01的高结合，但不能证实与A*23:01或A*24:02的交叉反应性(图6)。在测试m/hA2-CAR Treg与各HLA-A等位基因结合的相对能力时，我们发现mA2-CAR-Treg与HLA-A*03:01、A*25:01、A*29:02、A*30:01、A*31:01、A*33:01、A*36:01、A*68:01和A*69:01显著结合(图6，表9)。相比之下，hA2-CAR Treg的所有变体均令人惊讶地显示与mA2-CAR Treg相比降低的交叉反应性(图6，表9)。如所预期的，所有CAR构建体均结合于HLA-A*69:01(A*02:01的一个变体，仅相差6个氨基酸)。CAR-构建体均不显示与HLA-B的任何显著结合(图6)。
CAR-Treg Ag结合程度与生物活性之间的关系是未知的。为了定义HLA交叉反应性的生物学意义，我们产生了表达HLA-A*24:02、A*25:01或A*68:01的APC；所有细胞均具有相当的HLA-A表达水平(数据未显示)。我们发现，仅与表达HLA-A*02:01的细胞共培养导致m/hCAR-Treg的显著活化，如通过CD69、CD71、LAP、CTLA-4(图6I)或CD40L(数据未显示)的上调表达所断定的。这些数据表明有效的CAR介导的Treg活化需要高亲和力和/或亲合力相互作用。因此，虽然在FlowPRT测定中一些hA2-CAR显示结合A*25:01和A*68:01，但结合强度不足以活化细胞。
表9.发现m/hA2-CAR和HLA-A/B蛋白之间的结合相互作用具有统计学显著性(双向ANOVA，Dunnett后检验)。
Figure BDA0002497695580002401
Figure BDA0002497695580002411
Figure BDA0002497695580002421
我们开发了一种新的方法来系统地测试CAR对同种异体抗原的特异性，由此建立了一个新平台，利用该平台全面鉴定具有确定的等位基因特异性的构建体。令人惊讶地，我们发现与mA2-CAR相比，CAR人源化降低了与几种HLA-A等位基因变体的交叉反应性。
hA2-CAR Treg在体外介导HLA-A2特异性抑制
为了测试hA2-CAR刺激Treg中抗原特异性抑制活性的能力，我们使用根据图7A中所示实验设计的混合淋巴细胞反应(MLR)。具体地，在不存在或存在增加比率的Treg的情况下(所述Treg或者未转导，或用对照NGFR慢病毒或编码H1k2 hA2-CAR的慢病毒转导)，通过与成熟HLA-A*02:01阳性树突细胞共培养来刺激HLA-A*02:01阴性T细胞的增殖。如图7B-E所示，与用NGFR对照慢病毒构建体转导的对照Treg相比，表达hA2-CAR的Treg能够显著更好地抑制同种异体抗原刺激的CD4+ T细胞的增殖。
hA2-CAR Treg在体内介导异种GVHD的HLA-A2特异性抑制
为了测试hA2-CAR Treg的体内功能能力，我们使用了小鼠模型，在该模型中将人PBMC移植入免疫缺陷NSG小鼠，引起异种GVHD。将8×106个来自HLA-A2+供体的PBMC注射到接受辐照的NSG小鼠中，所述NSG小鼠具有或不具有表达H1k2 hA2-CAR的Treg。测试的PBMC与hA2-CAR Treg的比例为1:2(即8×106PBMC比4×106Treg)。如方法中所述，通过临床评分监测小鼠7周。与图7中的体外数据相比，与未接受hA2-CAR Treg(实灰线)的小鼠相比，接受表达hA2-CAR的Treg的小鼠存活提高、体重减轻并且xenoGVHD发作延迟(图8A、B和C)。虽然观察到Treg的生物学效应，但从注射后14天测量，我们没有检测到循环的m/hA2-CAR Treg(图8D和8E)。
hA2-CAR Treg在体内运输到HLA-A2+皮肤移植物
为了测试CAR定向的特异性如何影响Treg运输，我们进行了从NSG或NSG-A*02:01转基因小鼠到NSG小鼠的并排皮肤移植(图9A)。在移植物恢复后，在不存在或存在m/hA2-CAR Treg的情况下注射PBMC，或用HER2-CAR Treg(作为非特异性多克隆Treg对照)注射PBMC(MacDonald等，2016)。除了CAR外，Treg与编码萤光素酶-GFP融合蛋白的慢病毒共转导。Treg注射后和注射D-萤光素后，进行生物发光成像达21天(Barrett等，2014)。多克隆HER2-CAR Treg显示了定向的向同种异体移植物运输的模式，但在A2阳性和阴性移植物之间是平等分布的。这些多克隆Treg可响应于从术后皮肤发出的炎症信号而迁移，因为在未操作的免疫缺陷小鼠中，人T细胞通常运输到肺(Nervi等人2007)。与平等地运输至A2阴性和阳性皮肤的多克隆HER2-CAR Treg相反，两种m/hA2-CAR Treg均快速运输至表达A2的皮肤。此外，m/hA2-CAR Treg与非特异性HER2-CAR Treg相比持续时间更长。尽管在第21天检测不到HER2-CAR Treg，但仍然存在强的m/hA2-CAR Treg信号(图9B)。A2阳性与A2阴性移植物中的发光比率的定量结果揭示，H1k2和mA2-CAR Treg两者均存在显著的Ag驱动的向表达A2的移植物的运输(图9C和9D)。
除了移植定位的m/hA2-CAR Treg外，在第21天我们注意到与局部引流淋巴结的位置一致的邻近信号。在处死时，收集移植物引流淋巴结，并且流式细胞分析揭示显著比例的hCD4+FOXP3+ΔNGFR+A2-四聚体+CAR Treg。相比之下，在脾中检测到的这些细胞非常少(图10B和C)。这种从移植物到淋巴结的两步迁移过程以前已被报道为耐受诱导所必需的(Zhang等2009)。重要的是，淋巴结归巢的CAR Treg维持了FOXP3和CAR的表达，这说明了它们的稳定表型。
hA2-CAR Treg预防人皮肤同种异体移植排斥
为了评估hA2-CAR Treg在实体器官移植模型中的免疫调节潜能，我们使用了人源化的皮肤移植模型，在该模型中NSG小鼠移植了人类HLA-A2pos皮肤移植物。6周后，在有或没有自体H1k2 hA2-CAR Treg的情况下，给小鼠注射HLA-A2neg PBMC。细胞注射后四周，处死小鼠，并收集皮肤移植物用于病理学和炎性细胞因子表达的评价。所有小鼠均维持稳定的体重，这表明缺乏异种GvHD(图11A)，在血液和脾脏中具有相似水平的人白细胞植入(图11B)。使用25分的量表来评价H&E切片，揭示了相对于接受PBMC的小鼠，接受H1k2 hA2-CAR Treg的小鼠中累积病理学排斥评分显著降低(图11C)。免疫染色显示，与仅接受PBMC的小鼠相比，接受PBMC和H1k2 hA2-CAR Treg的小鼠具有Ki67+角质形成细胞的显著减少，和减少的外皮蛋白破坏(图11D)。qPCR定量也显示H1k2 hA2-CAR Treg处理的小鼠的移植物内炎性细胞因子的总体减少(图11E)。
对该异种GVHD模型，虽然在血液中可以检测到PBMC，但是没有检测到CAR Treg(图12)。然而，免疫染色显示，与只接受PBMC的小鼠相比，接受PBMC和H1k2 hA2-CAR Treg的小鼠在移植物中具有显著更高比例的FOXP3+细胞(图11F)。FOXP3+细胞的存在是移植的皮肤移植物所特有的，因为它们在肠、肝或肺中检测不到(图11G)。这些数据显示，对于具有A2转基因NSG皮肤的模型，H1k2 hA2-CAR Treg特异性地运输至人A2+皮肤同种异体移植物，在此它们无限期地保持。
本申请包含电子形式的文本文件的序列表"CDRD-003WO_SEQ LISTING_ST25"，其在2018年9月18日创建，大小为320KB。文本文件的内容通过引用整体结合于此。
参考文件
Allan,S.E.,A.N.Alstad,N.Merindol,N.K.Crellin,M.Amendola,R.Bacchetta,L.Naldini,M.G.Roncarolo,H.Soudeyns,and M.K.Levings.2008.Generation of potentand stable human CD4+ T regulatory cells by activation-independent expressionof FOXP3.Molecular therapy:the journal of the American Society of GeneTherapy 16:194-202.
Barrett,D.M.,Singh,N.,Liu,X.,Jiang,S.,June,C.H.,Grupp,S.A.,and Zhao,Y..2014.Relation of clinical culture method to T-cell memory status andefficacy in xenograft models of adoptive immunotherapy.Cytotherapy 16:619-630.
Blat,D.,E.Zigmond,Z.Alteber,T.Waks,and Z.Eshhar.2014.Suppression ofmurine colitis and its associated cancer by carcinoembryonic antigen-specificregulatory T cells.Molecular therapy:the journal of the American Society ofGene Therapy 22:1018-1028.
Bluestone,J.A.,J.H.Buckner,M.Fitch,S.E.Gitelman,S.Gupta,M.K.Hellerstein,K.C.Herold,A.Lares,M.R.Lee,K.Li,W.Liu,S.A.Long,L.M.Masiello,V.Nguyen,A.L.Putnam,M.Rieck,P.H.Sayre,and Q.Tang.2015.Type1 diabetesimmunotherapy using polyclonal regulatory T cells.Science translationalmedicine 7:315ra189.
Boardman,D.A.,C.Philippeos,G.O.Fruhwirth,M.A.Ibrahim,R.F.Hannen,D.Cooper,F.M.Marelli-Berg,F.M.Watt,R.I.Lechler,J.Maher,L.A.Smyth,andG.Lombardi.2016.Expression of a Chimeric Antigen Receptor Specific for DonorHLA Class I Enhances the Potency of Human Regulatory T Cells in PreventingHuman Skin Transplant Rejection.American journal of transplantation:officialjournal of the American Society of Transplantation and the American Societyof Transplant Surgeons
Brunstein,C.G.,B.R.Blazar,J.S.Miller,Q.Cao,K.L.Hippen,D.H.McKenna,J.Curtsinger,P.B.McGlave,and J.E.Wagner.2013.Adoptive transfer of umbilicalcord blood-derived regulatory T cells and early viral reactivation.Biology ofblood and marrow transplantation:journal of the American Society for Bloodand Marrow Transplantation 19:1271-1273.
Brunstein,C.G.,J.S.Miller,Q.Cao,D.H.McKenna,K.L.Hippen,J.Curtsinger,T.Defor,B.L.Levine,C.H.June,P.Rubinstein,P.B.McGlave,B.R.Blazar,andJ.E.Wagner.2011.Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adultstransplanted with umbilical cord blood:safety profile and detectionkinetics.Blood 117:1061-1070.
Casucci M,Bondanza A.2011.Suicide Gene Therapy to Increase the Safetyof Chimeric Antigen Receptor-Redirected T Lymphocytes.Journal of Cancer,2:378-382.
Chong,A.S.and S.H.Khiew.Transplantation tolerance:don't forget aboutthe B cells.Clin Exp Immunol.2017,189(2):171-180.
Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987).
Cooke KR,et al.An experimental model of idiopathic pneumonia syndromeafter bone marrow transplantation:I.The roles of minor H antigens andendotoxin.Blood.1996；88(8):3230–3239.
Crome,S.Q.,Lang,P.A.,Lang,K.S.,and P.S.Ohashi.Natural killer cellsregulate diverse T cell responses.Trends Immunol.2013 Jul；34(7):342-9.
Crome,S.Q.,Nguyen,L.T.,Lopez-Verges,S.,Yang,S.Y.,Martin,B.,Yam,J.Y.,Johnson,D.J.,Nie,J.,Pniak,M.,Yen,P.H.,Milea,A.,Sowamber,R.,Katz,S.R.,Bernardini,M.Q.,Clarke,B.A.,Shaw,P.A.,Lang,P.A.,Berman,H.K.,Pugh,T.J.,Lanier,L.L.,and P.S.Ohashi.A distinct innate lymphoid cell population regulatestumor-associated T cells.Nat Med.2017 Mar；23(3):368-375.
Delhove,J.M.K.M.et al.,Genome-Edited T Cell Therapies,Curr Stem CellRep.2017；3(2):124–136.
Di Ianni,M.,F.Falzetti,A.Carotti,A.Terenzi,F.Castellino,E.Bonifacio,B.Del Papa,T.Zei,R.I.Ostini,D.Cecchini,T.Aloisi,K.Perruccio,L.Ruggeri,C.Balucani,A.Pierini,P.Sportoletti,C.Aristei,B.Falini,Y.Reisner,A.Velardi,F.Aversa,and M.F.Martelli.2011.Tregs prevent GVHD and promote immunereconstitution in HLA-haploidentical transplantation.Blood 117:3921-3928.
Dijke,I.E.,R.E.Hoeppli,T.Ellis,J.Pearcey,Q.Huang,A.N.McMurchy,K.Boer,A.M.Peeters,G.Aubert,I.Larsen,D.B.Ross,I.Rebeyka,A.Campbell,C.C.Baan,M.K.Levings,and L.J.West.2016.Discarded Human Thymus Is a Novel Source ofStable and Long-Lived Therapeutic Regulatory T Cells.American journal oftransplantation.16(1):58-71
Eliceiri,K.W.,Berthold,M.R.,Goldberg,I.G.,Ibanez,L.Manjunath,B.S.,Martone,M.E.,Murphy,R.F.,Peng,H.,Plant,A.L.,Roysam,B.,Stuurman,N.,Swedlow,J.R.,Tomancak,P.,Carpenter,A.E.2012.Biological imaging software tools.NatureMethods 9:697-710.
Elinav,E.,N.Adam,T.Waks,and Z.Eshhar.2009.Amelioration of colitis bygenetically engineered murine regulatory T cells redirected by antigen-specific chimeric receptor.Gastroenterology 136:1721-1731.
Elinav,E.,T.Waks,and Z.Eshhar.2008.Redirection of regulatory T cellswith predetermined specificity for the treatment of experimental colitis inmice.Gastroenterology 134:2014-2024.
Ellis,J.M.,Henson,V.,Slack,R.,Ng,J.,Hartzman,R.J.,and C.KatovichHurley.Frequencies of HLA-A2 alleles in five U.S.populationgroups.Predominance Of A*02011 and identification of HLA-A*0231.HumImmunol.61(3):334-40(2000).
Eyquem,J.et al.Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9enhances tumour rejection,Nature 543,113–117(2017).
Fischer,A.,Jakubowski,A.A.,Lacouture,M.E.,Hollman,T.J.,Drucker,A.M.,Maloy,M.,Prockop,S.,Querfeld,C.,Busam,K.J.,Pulitzer,M.P2015.HistopathologicFeatures of Cutaneous Acute Graft-Versus-Host Disease in T-Cell-DepletedPeripheral Blood Stem Cell Transplant Recipients.The American JournalofDdermatopathology 37:523-529.
Fransson,M.,E.Piras,J.Burman,B.Nilsson,M.Essand,B.Lu,R.A.Harris,P.U.Magnusson,E.Brittebo,and A.S.Loskog.2012.CAR/FoxP3-engineered Tregulatory cells target the CNS and suppress EAE upon intranasaldelivery.Journal of neuroinflammation 9:112.
Fu,B.,Tian,Z.,and H.Wei.Subsets of human natural killer cells andtheir regulatory effects.Immunology.2014 Apr；141(4):483-9.
Gargett T,Brown MP.2014.The inducible caspase-9 suicide gene systemas a“safety switch”to limit on-target,off-tumor toxicities of chimericantigen receptor T cells.Frontiers in Pharmacology,5:235.
Ghosh et al.,1991 Glycobiology 5:505-10.
Gill,S.,and C.H.June.2015.Going viral:chimeric antigen receptor T-cell therapy for hematological malignancies.Immunological reviews 263:68-89.
Golshayan,D.,S.Jiang,J.Tsang,M.I.Garin,C.Mottet,andR.I.Lechler.2007.In vitro-expanded donor alloantigen-specific CD4+CD25+regulatory T cells promote experimental transplantation tolerance.Blood 109:827-835.
Green,E.A.,Y.W.Choi,and R.A.Flavell.2002.Pancreatic lymph node-derived CD4(+)CD25(+)Treg cells:Highly potent regulators of diabetes thatrequire TRANCE-RANK signals.Immunity 16:183-191.
Guillonneau,C.,Picarda,E.,and I.Anegon.CD8+regulatory T cells insolid organ transplantation.Curr Opin Organ Transplant.2010；15(6):751-6.
Hill GR,Crawford JM,Cooke KR,Brinson YS,Pan L,Ferrara JL.Total bodyirradiation and acute graft-versus-host disease:the role of gastrointestinaldamage and inflammatory cytokines.Blood.1997；90(8):3204–3213.
Hilton,H.G.&Parham,P.Direct binding to antigen-coated beads refinesthe specificity and cross-reactivity of four monoclonal antibodies thatrecognize polymorphic epitopes of HLA class I molecules.Tissue Antigens 81,212–220(2013).
Himmel,M.E.,K.G.MacDonald,R.V.Garcia,T.S.Steiner,andM.K.Levings.2013.Helios+and Helios-cells coexist within the natural FOXP3+ Tregulatory cell subset in humans.Journal of immunology 190:2001-2008.
Hombach,A.A.,D.Kofler,G.Rappl,and H.Abken.2009.Redirecting human CD4+CD25+regulatory T cells from the peripheral blood with pre-defined targetspecificity.Gene therapy 16:1088-1096.
Hutchinson,J.A.,Ahrens,N.,and E.K.Geissler.MITAP-compliantcharacterization of human regulatory macrophages.Transpl Int.2017 Aug；30(8):765-775.
Jamnani,F.,R.,Fatemeh Rahbarizadeh,Mohammad Ali Shokrgozar,FereidounMahboudi,Davoud Ahmadvand,Zahra Sharifzadeh,Ladan Parhamifar,S.MoeinMoghimi.2014.T cells expressing VHH-directed oligoclonal chimeric HER2antigenreceptors:Towards tumor-directed oligoclonal T cell therapy.Biochimica etBiophysica Acta,1840(1):378-386.
Joffre,O.,T.Santolaria,D.Calise,T.Al Saati,D.Hudrisier,P.Romagnoli,and J.P.van Meerwijk.2008.Prevention of acute and chronic allograft rejectionwith CD4+CD25+Foxp3+regulatory T lymphocytes.Nature medicine 14:88-92.
Jones,B.S.,Lamb,L.S.,Goldman,F.,and A.Di Stasi.2014.Improving thesafety of cell therapy products by suicide gene transfer.FrontPharmacol.Volume 5,254.
June,C.H.,S.R.Riddell,and T.N.Schumacher.2015.Adoptive cellulartherapy:A race to the finish line.Science translational medicine 7:280-287.
Juvet,S.C.and L.Zhang.Double negative regulatory T cells intransplantation and autoimmunity:recent progress and future directions.J MolCell Biol.2012Feb；4(1):48-58.
Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991).
Kanitakis,J.2008.The challenge of dermatopathological diagnosis ofcomposite tissue allograft rejection:a review.Journal of cutaneous pathology35:738-744.
Khaleghi S.2012.A caspase 8-based suicide switch induces apoptosis innanobody-directed chimeric receptor expressing T cells.International journalof hematology,95(4):434.
Konvalinka,A.and K.Tinckam.Utility of HLA Antibody Testing in KidneyTransplantation.J Am Soc Nephrol.26(7):1489-502(2015).
Levings,M.K.,R.Sangregorio,and M.G.Roncarolo.2001.Human cd25(+)cd4(+)t regulatory cells suppress naive and memory T cell proliferation and can beexpanded in vitro without loss of function.The Journal of experimentalmedicine 193:1295-1302.
Li,N.,Haiying Fu,Stephen M.Hewitt,Dimiter S.Dimitrov,and MitchellHo.2017.Therapeutically targeting glypican-2 via single-domain antibody-basedchimeric antigen receptors and immunotoxins in neuroblastoma.PNAS,114(32)；E6623-E6631.
MacDonald,K.G.,R.E.Hoeppli,Q.Huang,J.Gillies,D.S.Luciani,P.C.Orban,R.Broady,and M.K.Levings.2016.Alloantigen-specific regulatory T cellsgenerated with a chimeric antigen receptor.The Journal of clinicalinvestigation126:1413-1424.
Marek-Trzonkowska,N.,M.Mysliwiec,A.Dobyszuk,M.Grabowska,I.Techmanska,J.Juscinska,M.A.Wujtewicz,P.Witkowski,W.Mlynarski,A.Balcerska,J.Mysliwska,andP.Trzonkowski.2012.Administration of CD4+CD25highCD127-regulatory T cellspreserves beta-cell function in type 1diabetes in children.Diabetes care 35:1817-1820.
Massi,D.,Franchi,A.,Pimpinelli,N.,Laszlo,D.,Bosi,A.,Santucci,M.1999.Areappraisal of the histopathologic criteria for the diagnosis of cutaneousallogeneic acute graft-vs-host disease.American Journal of Clinical Pathology112:791-800.
Masteller,E.L.,M.R.Warner,Q.Tang,K.V.Tarbell,H.McDevitt,andJ.A.Bluestone.2005.Expansion of functional endogenous antigen-specific CD4+CD25+regulatory T cells from nonobese diabetic mice.Journal of immunology175:3053-3059.
McMurchy,A.N.&Levings,M.K.Suppression assays with human T regulatorycells:a technical guide.Eur.J.Immunol.42,27–34(2012).
Nervi,B.,Rettig,M.P.,Ritchey,J.K.,Wang,H.L.,Bauer,G.,Walker,J.,Bonyhadi,M.L.,Berenson,R.J.,Prior,J.L.,Piwnica-Worms,D.,Nolta,J.A.,DiPersio,J.F.2007.Factors affecting human T cell engraftment,trafficking,andassociated xenogeneic graft-vs-host disease in NOD/SCID beta2mnull mice.ExpHematol 35:1823-1838.
Nishimura,E.,T.Sakihama,R.Setoguchi,K.Tanaka,andS.Sakaguchi.2004.Induction of antigen-specific immunologic tolerance by invivo and in vitro antigen-specific expansion of naturally arising Foxp3+CD25+CD4+regulatory T cells.International immunology 16:1189-1201.
Noyan,F.,K.Zimmermann,M.Hardtke-Wolenski,A.Knoefel,E.Schulde,R.Geffers,M.Hust,J.Huehn,M.Galla,M.Morgan,A.Jokuszies,M.P.Manns,andE.Jaeckel.2016.Prevention of Allograft Rejection by Use of Regulatory T CellsWith an MHC-Specific Chimeric Antigen Receptor.American journal oftransplantation:official journal of the American Society of Transplantationand the American Society of Transplant Surgeons
Papp,G.,Boros,P.,Nakken,B.,Szodoray,P.and M.Zeher.Regulatory immunecells and functions in autoimmunity and transplantationimmunology.Autoimmunity Reviews.Volume 16,Issue 5,2017,Pages 435-444.
Parham,P.and Brodsky,FM(1981)Hum Immunol 3(4):277-99.
Brian Philip,Evangelia Kokalaki,Leila Mekkaoui,Simon Thomas,KarinStraathof,Barry Flutter,Virna Marin,Teresa Marafioti,Ronjon Chakraverty,DavidLinch,Sergio A.Quezada,Karl S.Peggs,and Martin Pule.2014.A highly compactepitope-based marker/suicide gene for easier and safer T-cell therapy.Blood,124:1277-1287.
Putnam,A.L.,N.Safinia,A.Medvec,M.Laszkowska,M.Wray,M.A.Mintz,E.Trotta,G.L.Szot,W.Liu,A.Lares,K.Lee,A.Laing,R.I.Lechler,J.L.Riley,J.A.Bluestone,G.Lombardi,and Q.Tang.2013.Clinical grade manufacturing ofhuman alloantigen-reactive regulatory T cells for use intransplantation.American journal of transplantation:official journal of theAmerican Society of Transplantation and the American Society of TransplantSurgeons 13:3010-3020.
Robinson,J.et al.The IPD and IMGT/HLA database:allele variantdatabases.Nucleic Acids Res 43,D423-431,doi:10.1093/nar/gku1161(2015).
Rosenberg et al,New Eng.J.of Med.319:1676,1988.
Sadelain,M.,R.Brentjens,and I.Riviere.2013.The basic principles ofchimeric antigen receptor design.Cancer discovery 3:388-398.
Sagoo,P.,N.Ali,G.Garg,F.O.Nestle,R.I.Lechler,andG.Lombardi.2011.Human regulatory T cells with alloantigen specificity aremore potent inhibitors of alloimmune skin graft damage than polyclonalregulatory T cells.Science translational medicine 3:83ra42.
Sambrook et al.,2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York.
Sanchez-Fueyo,A.,S.Sandner,A.Habicht,C.Mariat,J.Kenny,N.Degauque,X.X.Zheng,T.B.Strom,L.A.Turka,and M.H.Sayegh.2006.Specificity of CD4+CD25+regulatory T cell function in alloimmunity.Journal of immunology176:329-334.
Schneider,C.A.,Rasband,W.S.&Eliceiri,K.W.2012.NIH Image to ImageJ:25years of image analysis.Nature Methods 9:671-675.
Schmittgen,T.D.&Livak,K.J.2008.Analyzing real-time PCR data by thecomparative C(T)method.Nature Protocols 3:1101-1108.
Stephens,L.A.,K.H.Malpass,and S.M.Anderton.2009.Curing CNS autoimmunedisease with myelin-reactive Foxp3+ Treg.European journal of immunology 39:1108-1117.
Tang,Q.,K.J.Henriksen,M.Bi,E.B.Finger,G.Szot,J.Ye,E.L.Masteller,H.McDevitt,M.Bonyhadi,and J.A.Bluestone.2004.In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes.The Journal ofexperimental medicine 199:1455-1465.
Tarbell,K.V.,L.Petit,X.Zuo,P.Toy,X.Luo,A.Mqadmi,H.Yang,M.Suthanthiran,S.Mojsov,and R.M.Steinman.2007.Dendritic cell-expanded,islet-specific CD4+CD25+CD62L+regulatory T cells restore normoglycemia in diabeticNOD mice.The Journal of experimental medicine 204:191-201.
Tarbell,K.V.,S.Yamazaki,K.Olson,P.Toy,and R.M.Steinman.2004.CD25+CD4+T cells,expanded with dendritic cells presenting a single autoantigenicpeptide,suppress autoimmune diabetes.The Journal of experimental medicine199:1467-1477.
Trenado,A.,M.Sudres,Q.Tang,S.Maury,F.Charlotte,S.Gregoire,M.Bonyhadi,D.Klatzmann,B.L.Salomon,and J.L.Cohen.2006.Ex vivo-expanded CD4+CD25+immunoregulatory T cells prevent graft-versus-host-disease by inhibitingactivation/differentiation of pathogenic T cells.Journal of immunology176:1266-1273.
Trzonkowski,P.,M.Bieniaszewska,J.Juscinska,A.Dobyszuk,A.Krzystyniak,N.Marek,J.Mysliwska,and A.Hellmann.2009.First-in-man clinical results of thetreatment of patients with graft versus host disease with human ex vivoexpanded CD4+CD25+CD127-T regulatory cells.Clinical immunology 133:22-26.
Tsang,J.Y.,Y.Tanriver,S.Jiang,S.A.Xue,K.Ratnasothy,D.Chen,H.J.Stauss,R.P.Bucy,G.Lombardi,and R.Lechler.2008.Conferring indirect allospecificity onCD4+CD25+ Tregs by TCR gene transfer favors transplantation tolerance inmice.The Journal of clinical investigation 118:3619-3628.
Verginis,P.,K.A.McLaughlin,K.W.Wucherpfennig,H.von Boehmer,andI.Apostolou.2008.Induction of antigen-specific regulatory T cells in wild-type mice:visualization and targets of suppression.Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America 105:3479-3484.
Zhenguang Wang,Zhiqiang Wu,Yang Liu and Weidong Han.2017.Newdevelopment in CAR-T cell therapy.Journal of Hematology&Oncology,10:53.
Watanabe,N.,Bajgain,P.,Sukumaran,S.,Ansari,S.,Heslop,H.E.,Rooney,C.M.,Brenner,M.K.,Leen,A.M.,Vera,J.F.Fine-tuning the CAR spacer improves T-cell potency.OncoImmunology.2016,5(12):e1253656.
Wesch,D.,Peters,C.,and G.M.Siegers.Human gamma delta T regulatorycells in cancer:fact or fiction？Front Immunol.2014Nov 20；5:598.
Wood,K.J.,Bushell,A.,and J.Hester.Regulatory immune cells intransplantation.Nat Rev Immunol.2012,12(6):417-30.
Zhang,E.and Xu,H.J.2017.A new insight in chimeric antigen receptor-engineered T cells for cancer immunotherapy.Hematol Oncol,10:1.
Zhang,N.,Schroppel,B.,Lal,G.,Jakubzick,C.,Mao,X.,Chen,D.,Yin,N.,Jessberger,R.,Ochando,J.C.,Ding,Y.,Bromberg,J.S.2009.Regulatory T cellssequentially migrate from inflamed tissues to draining lymph nodes tosuppress the alloimmune response.Immunity.30:458-469.
虽然为了清楚和理解的目的已经相当详细地描述了前述发明，但是本领域技术人员通过阅读本公开将清楚，在不脱离本发明的真实范围的情况下，可以进行形式和细节上的各种改变。例如，上述所有技术和装置可以以各种组合使用。本申请中引用的所有出版物、专利申请和/或其它文献出于所有目的通过引用整体并入，其程度如同每个单独的出版物、专利申请和/或其它文献出于所有目的被单独地指示通过引用并入。
序列表
<110> M·利文斯（LEVINGS, Megan）
P·奥尔班（ORBAN, Paul）
N·道森（DAWSON, Nicholas）
C·拉马切（LAMARCHE, Caroline）
J·P·贝里奎斯特（BERGQVIST, Jan P）
<120> 抗-HLA-A2抗体及其使用方法
<130> CDRD-003WO
<150> US 62/560,574
<151> 2017-09-19
<150> US 62/692,386
<151> 2018-06-29
<160> 224
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 1
Ser Tyr His Ile Gln
1 5
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 2
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
1 5
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 3
Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 4
Tyr Pro Gly Asp Gly Ser
1 5
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 5
Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 6
Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 7
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 7
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 8
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 9
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr
1 5
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa是Q或K
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa是N或S
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> Xaa是E或Q
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> Xaa是K或Q
<400> 10
Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Xaa Tyr Xaa Xaa Lys Phe Xaa
1 5 10 15
Gly
<210> 11
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 11
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 12
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
<210> 13
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa是R或G
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa是I或不存在
<400> 13
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Xaa Leu Glu Trp Met Gly Xaa
1 5 10 15
<210> 14
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 14
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10
<210> 15
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 15
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile
1 5 10 15
<210> 16
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 16
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10
<210> 17
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa是R或G
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa是I或不存在
<400> 17
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Xaa Leu Glu Trp Met Gly Xaa Trp
1 5 10 15
Ile
<210> 18
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 18
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile
1 5 10 15
<210> 19
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 19
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Trp
1 5 10 15
Ile
<210> 20
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 20
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile
1 5 10 15
<210> 21
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa是R或G
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> Xaa是I或不存在
<400> 21
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Xaa Leu Glu Trp Met
1 5 10 15
Gly Xaa Trp Ile
20
<210> 22
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 22
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
1 5 10 15
Gly Trp Ile
<210> 23
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 23
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
1 5 10 15
Gly Ile Trp Ile
20
<210> 24
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 24
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
1 5 10 15
Gly Trp Ile
<210> 25
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa是R或G
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> Xaa是I或不存在
<400> 25
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Xaa Leu Glu Trp Met
1 5 10 15
Gly Xaa
<210> 26
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 26
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
1 5 10 15
Gly
<210> 27
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 27
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
1 5 10 15
Gly Ile
<210> 28
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 28
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
1 5 10 15
Gly
<210> 29
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是R或不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是I或M
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是R或A
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa是A、T或I
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> Xaa是E或L
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> Xaa是S或R
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> Xaa是E或D
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> Xaa是T或M
<400> 29
Xaa Val Thr Xaa Thr Xaa Asp Thr Ser Xaa Ser Thr Ala Tyr Met Xaa
1 5 10 15
Leu Ser Xaa Leu Arg Ser Xaa Asp Xaa Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 30
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 30
Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 31
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 31
Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Leu
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 32
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 32
Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu
1 5 10 15
Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 33
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 33
Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 34
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 34
Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 35
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是Q或K
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是N或S
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是E或Q
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa是K或Q
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa是R或不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> Xaa是I或M
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa是R或A
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> Xaa是A、T或I
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> Xaa是E或L
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> Xaa是S或R
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> Xaa是E或D
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(34)
<223> Xaa是T或M
<400> 35
Thr Xaa Tyr Xaa Xaa Lys Phe Xaa Gly Xaa Val Thr Xaa Thr Xaa Asp
1 5 10 15
Thr Ser Xaa Ser Thr Ala Tyr Met Xaa Leu Ser Xaa Leu Arg Ser Xaa
20 25 30
Asp Xaa Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
35 40
<210> 36
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa是R或不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> Xaa是I或M
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa是R或A
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> Xaa是A、T或I
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> Xaa是E或L
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> Xaa是S或R
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> Xaa是E或D
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(34)
<223> Xaa是T或M
<400> 36
Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Xaa Val Thr Xaa Thr Xaa Asp
1 5 10 15
Thr Ser Xaa Ser Thr Ala Tyr Met Xaa Leu Ser Xaa Leu Arg Ser Xaa
20 25 30
Asp Xaa Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
35 40
<210> 37
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa是R或不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> Xaa是I或M
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa是R或A
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> Xaa是A、T或I
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> Xaa是E或L
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> Xaa是S或R
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> Xaa是E或D
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(34)
<223> Xaa是T或M
<400> 37
Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe Gln Gly Xaa Val Thr Xaa Thr Xaa Asp
1 5 10 15
Thr Ser Xaa Ser Thr Ala Tyr Met Xaa Leu Ser Xaa Leu Arg Ser Xaa
20 25 30
Asp Xaa Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
35 40
<210> 38
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 38
Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
20 25 30
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
35 40
<210> 39
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 39
Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Leu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
20 25 30
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
35 40
<210> 40
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 40
Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Val Thr Met Thr Arg Asp Thr
1 5 10 15
Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
35 40
<210> 41
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 41
Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp
1 5 10 15
Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp
20 25 30
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
35 40
<210> 42
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 42
Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
20 25 30
Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
35 40
<210> 43
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 43
Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp
1 5 10 15
Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
20 25 30
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
35 40
<210> 44
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 44
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 45
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (44)..(44)
<223> Xaa是R或G
<220>
<221> misc_feature
<222> (50)..(50)
<223> Xaa是I或不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (60)..(60)
<223> Xaa是Q或K
<220>
<221> misc_feature
<222> (62)..(62)
<223> Xaa是N或S
<220>
<221> misc_feature
<222> (63)..(63)
<223> Xaa是E或Q
<220>
<221> misc_feature
<222> (66)..(66)
<223> Xaa是K或Q
<220>
<221> misc_feature
<222> (68)..(68)
<223> Xaa是R或不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (71)..(71)
<223> Xaa是I或M
<220>
<221> misc_feature
<222> (73)..(73)
<223> Xaa是R或A
<220>
<221> misc_feature
<222> (77)..(77)
<223> Xaa是A、T或I
<220>
<221> misc_feature
<222> (83)..(83)
<223> Xaa是E或L
<220>
<221> misc_feature
<222> (86)..(86)
<223> Xaa是S或R
<220>
<221> misc_feature
<222> (90)..(90)
<223> Xaa是E或D
<220>
<221> misc_feature
<222> (92)..(92)
<223> Xaa是T或M
<400> 45
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Xaa Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Xaa Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Xaa Tyr Xaa Xaa Lys
50 55 60
Phe Xaa Gly Xaa Val Thr Xaa Thr Xaa Asp Thr Ser Xaa Ser Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Met Xaa Leu Ser Xaa Leu Arg Ser Xaa Asp Xaa Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 46
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是V或I
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是S或T
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa是L或S
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa是P或S
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa是L或P
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> Xaa是C或F
<400> 46
Asp Xaa Val Met Thr Gln Xaa Pro Leu Ser Xaa Xaa Val Thr Xaa Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Xaa
20
<210> 47
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 47
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys
20
<210> 48
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 48
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys
20
<210> 49
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 49
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys
20
<210> 50
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 50
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Phe
20
<210> 51
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是F或Y
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是Q或L
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是R或K
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa是S或P
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa是R或Q
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa是R或L
<400> 51
Trp Xaa Xaa Gln Xaa Pro Gly Gln Xaa Pro Xaa Xaa Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 52
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 52
Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 53
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 53
Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 54
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 54
Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 55
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 55
Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 56
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa是S或A
<400> 56
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Xaa Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 57
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 57
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 58
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 58
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 59
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 59
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 60
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是V或I
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa是S或T
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa是L或S
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa是P或S
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa是L或P
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> Xaa是C或F
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(41)
<223> Xaa是F或Y
<220>
<221> misc_feature
<222> (42)..(42)
<223> Xaa是Q或L
<220>
<221> misc_feature
<222> (44)..(44)
<223> Xaa是R或K
<220>
<221> misc_feature
<222> (48)..(48)
<223> Xaa是S或P
<220>
<221> misc_feature
<222> (50)..(50)
<223> Xaa是R或Q
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)..(51)
<223> Xaa是R或L
<220>
<221> misc_feature
<222> (72)..(72)
<223> Xaa是S或A
<400> 60
Asp Xaa Val Met Thr Gln Xaa Pro Leu Ser Xaa Xaa Val Thr Xaa Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Xaa Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Xaa Xaa Gln Xaa Pro Gly Gln Xaa
35 40 45
Pro Xaa Xaa Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Xaa Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 61
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 61
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 62
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 62
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Leu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 63
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 63
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys
50 55 60
Phe Lys Gly Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 64
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 64
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 65
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 65
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 66
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 66
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 67
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 67
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 68
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 68
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 69
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 69
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 70
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 70
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 71
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 71
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Phe Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 72
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 72
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Asp Val Val Met Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Glu Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile
180 185 190
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245 250
<210> 73
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 73
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Asp Ile Val Met Thr
130 135 140
Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245 250
<210> 74
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 74
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Asp Ile Val Met Thr
130 135 140
Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245 250
<210> 75
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 75
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Asp Val Val Met Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245 250
<210> 76
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 76
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Asp Ile Val Met Thr
130 135 140
Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile
145 150 155 160
Ser Phe Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245 250
<210> 77
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 77
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Leu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Asp Val Val Met Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Glu Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile
180 185 190
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245 250
<210> 78
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 78
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Leu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Asp Ile Val Met Thr
130 135 140
Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245 250
<210> 79
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 79
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys
50 55 60
Phe Lys Gly Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Asp Ile Val Met Thr
130 135 140
Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245 250
<210> 80
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 80
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys
50 55 60
Phe Lys Gly Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Asp Ile Val Met Thr
130 135 140
Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245 250
<210> 81
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 81
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys
50 55 60
Phe Lys Gly Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Asp Val Val Met Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245 250
<210> 82
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 82
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys
50 55 60
Phe Lys Gly Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Asp Ile Val Met Thr
130 135 140
Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile
145 150 155 160
Ser Phe Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245 250
<210> 83
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 83
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Asp Ile Val Met Thr
130 135 140
Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245 250
<210> 84
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 84
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Asp Ile Val Met Thr
130 135 140
Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245 250
<210> 85
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 85
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Asp Val Val Met Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245 250
<210> 86
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 86
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Asp Ile Val Met Thr
130 135 140
Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile
145 150 155 160
Ser Phe Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245 250
<210> 87
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 87
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Asp Ile Val Met Thr
130 135 140
Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245 250
<210> 88
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 88
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Asp Ile Val Met Thr
130 135 140
Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245 250
<210> 89
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 89
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Asp Val Val Met Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245 250
<210> 90
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 90
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Asp Ile Val Met Thr
130 135 140
Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile
145 150 155 160
Ser Phe Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245 250
<210> 91
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 91
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Asp Ile Val Met Thr
130 135 140
Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245 250
<210> 92
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (44)..(44)
<223> Xaa是R或G
<220>
<221> misc_feature
<222> (50)..(50)
<223> Xaa是I或不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (68)..(68)
<223> Xaa是R或不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (71)..(71)
<223> Xaa是I或M
<220>
<221> misc_feature
<222> (73)..(73)
<223> Xaa是R或A
<220>
<221> misc_feature
<222> (77)..(77)
<223> Xaa是A、T或I
<220>
<221> misc_feature
<222> (83)..(83)
<223> Xaa是E或L
<220>
<221> misc_feature
<222> (86)..(86)
<223> Xaa是S或R
<220>
<221> misc_feature
<222> (90)..(90)
<223> Xaa是E或D
<220>
<221> misc_feature
<222> (92)..(92)
<223> Xaa是T或M
<400> 92
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Xaa Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Xaa Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys
50 55 60
Phe Gln Gly Xaa Val Thr Xaa Thr Xaa Asp Thr Ser Xaa Ser Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Met Xaa Leu Ser Xaa Leu Arg Ser Xaa Asp Xaa Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 93
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 93
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Ala Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
20 25 30
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
35 40 45
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser
65 70 75 80
Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp
85 90 95
Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
100 105 110
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
Thr Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr
165 170 175
Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val
180 185 190
His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly
195 200 205
Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly
210 215 220
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
225 230 235 240
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe
245 250 255
Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
260 265 270
Ile Lys
<210> 94
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 94
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Ala Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
20 25 30
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
35 40 45
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser
65 70 75 80
Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp
85 90 95
Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
100 105 110
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
Thr Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr
165 170 175
Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val
180 185 190
His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly
195 200 205
Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly
210 215 220
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
225 230 235 240
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe
245 250 255
Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
260 265 270
Ile Lys
<210> 95
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 95
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Ala Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
20 25 30
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
35 40 45
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser
65 70 75 80
Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp
85 90 95
Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
100 105 110
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
Thr Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr
165 170 175
Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val
180 185 190
His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly
195 200 205
Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly
210 215 220
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu
225 230 235 240
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe
245 250 255
Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
260 265 270
Ile Lys
<210> 96
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 96
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Ala Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
20 25 30
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
35 40 45
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser
65 70 75 80
Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp
85 90 95
Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
100 105 110
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
Thr Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr
165 170 175
Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val
180 185 190
His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly
195 200 205
Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly
210 215 220
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
225 230 235 240
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe
245 250 255
Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
260 265 270
Ile Lys
<210> 97
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 97
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Ala Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
20 25 30
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
35 40 45
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser
65 70 75 80
Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp
85 90 95
Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
100 105 110
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
Thr Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr
165 170 175
Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Phe Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val
180 185 190
His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly
195 200 205
Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly
210 215 220
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu
225 230 235 240
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe
245 250 255
Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
260 265 270
Ile Lys
<210> 98
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 98
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Ala Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
20 25 30
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
35 40 45
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser
65 70 75 80
Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp
85 90 95
Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Leu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
100 105 110
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
Thr Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr
165 170 175
Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val
180 185 190
His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly
195 200 205
Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly
210 215 220
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
225 230 235 240
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe
245 250 255
Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
260 265 270
Ile Lys
<210> 99
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 99
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Ala Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
20 25 30
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
35 40 45
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser
65 70 75 80
Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp
85 90 95
Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Leu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
100 105 110
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
Thr Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr
165 170 175
Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val
180 185 190
His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly
195 200 205
Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly
210 215 220
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
225 230 235 240
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe
245 250 255
Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
260 265 270
Ile Lys
<210> 100
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 100
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Ala Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
20 25 30
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
35 40 45
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly
65 70 75 80
Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Val Thr Met Thr Arg Asp
85 90 95
Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
100 105 110
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
Thr Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr
165 170 175
Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val
180 185 190
His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly
195 200 205
Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly
210 215 220
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
225 230 235 240
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe
245 250 255
Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
260 265 270
Ile Lys
<210> 101
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 101
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Ala Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
20 25 30
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
35 40 45
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly
65 70 75 80
Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Val Thr Met Thr Arg Asp
85 90 95
Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
100 105 110
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
Thr Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr
165 170 175
Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val
180 185 190
His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly
195 200 205
Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly
210 215 220
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu
225 230 235 240
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe
245 250 255
Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
260 265 270
Ile Lys
<210> 102
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 102
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Ala Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
20 25 30
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
35 40 45
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly
65 70 75 80
Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Val Thr Met Thr Arg Asp
85 90 95
Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
100 105 110
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
Thr Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr
165 170 175
Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val
180 185 190
His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly
195 200 205
Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly
210 215 220
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
225 230 235 240
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe
245 250 255
Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
260 265 270
Ile Lys
<210> 103
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 103
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Ala Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
20 25 30
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
35 40 45
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly
65 70 75 80
Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Val Thr Met Thr Arg Asp
85 90 95
Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
100 105 110
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
Thr Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr
165 170 175
Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Phe Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val
180 185 190
His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly
195 200 205
Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly
210 215 220
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu
225 230 235 240
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe
245 250 255
Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
260 265 270
Ile Lys
<210> 104
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 104
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Ala Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
20 25 30
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
35 40 45
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser
65 70 75 80
Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp
85 90 95
Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp
100 105 110
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
Thr Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr
165 170 175
Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val
180 185 190
His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly
195 200 205
Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly
210 215 220
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
225 230 235 240
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe
245 250 255
Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
260 265 270
Ile Lys
<210> 105
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 105
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Ala Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
20 25 30
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
35 40 45
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser
65 70 75 80
Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp
85 90 95
Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp
100 105 110
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
Thr Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr
165 170 175
Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val
180 185 190
His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly
195 200 205
Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly
210 215 220
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu
225 230 235 240
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe
245 250 255
Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
260 265 270
Ile Lys
<210> 106
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 106
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Ala Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
20 25 30
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
35 40 45
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser
65 70 75 80
Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp
85 90 95
Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp
100 105 110
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
Thr Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr
165 170 175
Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val
180 185 190
His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly
195 200 205
Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly
210 215 220
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
225 230 235 240
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe
245 250 255
Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
260 265 270
Ile Lys
<210> 107
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 107
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Ala Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
20 25 30
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
35 40 45
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser
65 70 75 80
Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp
85 90 95
Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp
100 105 110
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
Thr Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr
165 170 175
Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Phe Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val
180 185 190
His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly
195 200 205
Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly
210 215 220
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu
225 230 235 240
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe
245 250 255
Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
260 265 270
Ile Lys
<210> 108
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 108
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Ala Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
20 25 30
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
35 40 45
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser
65 70 75 80
Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp
85 90 95
Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
100 105 110
Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
Thr Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr
165 170 175
Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val
180 185 190
His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly
195 200 205
Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly
210 215 220
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
225 230 235 240
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe
245 250 255
Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
260 265 270
Ile Lys
<210> 109
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 109
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Ala Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
20 25 30
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
35 40 45
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser
65 70 75 80
Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp
85 90 95
Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
100 105 110
Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
Thr Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr
165 170 175
Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val
180 185 190
His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly
195 200 205
Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly
210 215 220
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu
225 230 235 240
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe
245 250 255
Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
260 265 270
Ile Lys
<210> 110
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 110
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Ala Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
20 25 30
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
35 40 45
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser
65 70 75 80
Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp
85 90 95
Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
100 105 110
Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
Thr Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr
165 170 175
Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val
180 185 190
His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly
195 200 205
Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly
210 215 220
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
225 230 235 240
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe
245 250 255
Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
260 265 270
Ile Lys
<210> 111
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 111
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Ala Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
20 25 30
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
35 40 45
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser
65 70 75 80
Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp
85 90 95
Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
100 105 110
Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
Thr Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr
165 170 175
Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Phe Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val
180 185 190
His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly
195 200 205
Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly
210 215 220
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu
225 230 235 240
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe
245 250 255
Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
260 265 270
Ile Lys
<210> 112
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 112
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Ala Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala
20 25 30
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
35 40 45
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser
65 70 75 80
Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp
85 90 95
Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
100 105 110
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
Thr Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr
165 170 175
Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val
180 185 190
His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly
195 200 205
Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly
210 215 220
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
225 230 235 240
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe
245 250 255
Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
260 265 270
Ile Lys
<210> 113
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 113
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Ala Ser
20
<210> 114
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 114
Val Asp Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Thr Ser
20
<210> 115
<211> 63
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 115
Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val
1 5 10 15
Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
20 25 30
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
35 40 45
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
50 55 60
<210> 116
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 116
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 117
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 117
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 118
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 118
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 119
<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 119
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Asp Val Val Met Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Glu Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile
180 185 190
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asn Arg Ile Arg Gly
245 250 255
Val Thr Val Ser Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His
260 265 270
Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
275 280 285
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
290 295 300
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
305 310 315 320
Gly Leu Asp Pro Phe Gly Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val
325 330 335
Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp
340 345 350
Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met
355 360 365
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala
370 375 380
Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Leu Glu Arg Val Arg Val
385 390 395 400
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
405 410 415
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
420 425 430
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
435 440 445
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
450 455 460
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
465 470 475 480
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
485 490 495
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505 510
<210> 120
<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 120
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Asp Ile Val Met Thr
130 135 140
Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asn Arg Ile Arg Gly
245 250 255
Val Thr Val Ser Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His
260 265 270
Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
275 280 285
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
290 295 300
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
305 310 315 320
Gly Leu Asp Pro Phe Gly Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val
325 330 335
Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp
340 345 350
Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met
355 360 365
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala
370 375 380
Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Leu Glu Arg Val Arg Val
385 390 395 400
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
405 410 415
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
420 425 430
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
435 440 445
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
450 455 460
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
465 470 475 480
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
485 490 495
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505 510
<210> 121
<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 121
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Asp Ile Val Met Thr
130 135 140
Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asn Arg Ile Arg Gly
245 250 255
Val Thr Val Ser Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His
260 265 270
Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
275 280 285
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
290 295 300
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
305 310 315 320
Gly Leu Asp Pro Phe Gly Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val
325 330 335
Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp
340 345 350
Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met
355 360 365
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala
370 375 380
Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Leu Glu Arg Val Arg Val
385 390 395 400
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
405 410 415
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
420 425 430
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
435 440 445
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
450 455 460
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
465 470 475 480
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
485 490 495
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505 510
<210> 122
<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 122
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Asp Val Val Met Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asn Arg Ile Arg Gly
245 250 255
Val Thr Val Ser Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His
260 265 270
Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
275 280 285
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
290 295 300
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
305 310 315 320
Gly Leu Asp Pro Phe Gly Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val
325 330 335
Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp
340 345 350
Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met
355 360 365
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala
370 375 380
Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Leu Glu Arg Val Arg Val
385 390 395 400
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
405 410 415
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
420 425 430
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
435 440 445
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
450 455 460
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
465 470 475 480
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
485 490 495
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505 510
<210> 123
<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 123
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Asp Ile Val Met Thr
130 135 140
Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile
145 150 155 160
Ser Phe Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asn Arg Ile Arg Gly
245 250 255
Val Thr Val Ser Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His
260 265 270
Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
275 280 285
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
290 295 300
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
305 310 315 320
Gly Leu Asp Pro Phe Gly Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val
325 330 335
Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp
340 345 350
Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met
355 360 365
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala
370 375 380
Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Leu Glu Arg Val Arg Val
385 390 395 400
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
405 410 415
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
420 425 430
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
435 440 445
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
450 455 460
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
465 470 475 480
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
485 490 495
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505 510
<210> 124
<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 124
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Leu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Asp Val Val Met Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Glu Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile
180 185 190
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asn Arg Ile Arg Gly
245 250 255
Val Thr Val Ser Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His
260 265 270
Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
275 280 285
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
290 295 300
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
305 310 315 320
Gly Leu Asp Pro Phe Gly Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val
325 330 335
Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp
340 345 350
Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met
355 360 365
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala
370 375 380
Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Leu Glu Arg Val Arg Val
385 390 395 400
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
405 410 415
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
420 425 430
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
435 440 445
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
450 455 460
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
465 470 475 480
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
485 490 495
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505 510
<210> 125
<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 125
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Leu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Asp Ile Val Met Thr
130 135 140
Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asn Arg Ile Arg Gly
245 250 255
Val Thr Val Ser Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His
260 265 270
Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
275 280 285
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
290 295 300
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
305 310 315 320
Gly Leu Asp Pro Phe Gly Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val
325 330 335
Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp
340 345 350
Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met
355 360 365
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala
370 375 380
Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Leu Glu Arg Val Arg Val
385 390 395 400
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
405 410 415
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
420 425 430
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
435 440 445
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
450 455 460
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
465 470 475 480
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
485 490 495
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505 510
<210> 126
<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 126
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys
50 55 60
Phe Lys Gly Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Asp Ile Val Met Thr
130 135 140
Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asn Arg Ile Arg Gly
245 250 255
Val Thr Val Ser Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His
260 265 270
Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
275 280 285
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
290 295 300
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
305 310 315 320
Gly Leu Asp Pro Phe Gly Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val
325 330 335
Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp
340 345 350
Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met
355 360 365
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala
370 375 380
Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Leu Glu Arg Val Arg Val
385 390 395 400
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
405 410 415
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
420 425 430
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
435 440 445
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
450 455 460
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
465 470 475 480
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
485 490 495
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505 510
<210> 127
<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 127
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys
50 55 60
Phe Lys Gly Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Asp Ile Val Met Thr
130 135 140
Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asn Arg Ile Arg Gly
245 250 255
Val Thr Val Ser Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His
260 265 270
Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
275 280 285
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
290 295 300
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
305 310 315 320
Gly Leu Asp Pro Phe Gly Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val
325 330 335
Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp
340 345 350
Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met
355 360 365
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala
370 375 380
Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Leu Glu Arg Val Arg Val
385 390 395 400
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
405 410 415
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
420 425 430
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
435 440 445
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
450 455 460
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
465 470 475 480
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
485 490 495
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505 510
<210> 128
<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 128
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys
50 55 60
Phe Lys Gly Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Asp Val Val Met Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asn Arg Ile Arg Gly
245 250 255
Val Thr Val Ser Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His
260 265 270
Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
275 280 285
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
290 295 300
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
305 310 315 320
Gly Leu Asp Pro Phe Gly Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val
325 330 335
Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp
340 345 350
Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met
355 360 365
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala
370 375 380
Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Leu Glu Arg Val Arg Val
385 390 395 400
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
405 410 415
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
420 425 430
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
435 440 445
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
450 455 460
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
465 470 475 480
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
485 490 495
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505 510
<210> 129
<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 129
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys
50 55 60
Phe Lys Gly Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Asp Ile Val Met Thr
130 135 140
Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile
145 150 155 160
Ser Phe Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asn Arg Ile Arg Gly
245 250 255
Val Thr Val Ser Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His
260 265 270
Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
275 280 285
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
290 295 300
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
305 310 315 320
Gly Leu Asp Pro Phe Gly Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val
325 330 335
Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp
340 345 350
Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met
355 360 365
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala
370 375 380
Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Leu Glu Arg Val Arg Val
385 390 395 400
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
405 410 415
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
420 425 430
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
435 440 445
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
450 455 460
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
465 470 475 480
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
485 490 495
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505 510
<210> 130
<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 130
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Asp Ile Val Met Thr
130 135 140
Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asn Arg Ile Arg Gly
245 250 255
Val Thr Val Ser Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His
260 265 270
Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
275 280 285
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
290 295 300
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
305 310 315 320
Gly Leu Asp Pro Phe Gly Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val
325 330 335
Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp
340 345 350
Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met
355 360 365
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala
370 375 380
Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Leu Glu Arg Val Arg Val
385 390 395 400
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
405 410 415
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
420 425 430
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
435 440 445
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
450 455 460
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
465 470 475 480
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
485 490 495
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505 510
<210> 131
<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 131
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Asp Ile Val Met Thr
130 135 140
Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asn Arg Ile Arg Gly
245 250 255
Val Thr Val Ser Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His
260 265 270
Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
275 280 285
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
290 295 300
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
305 310 315 320
Gly Leu Asp Pro Phe Gly Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val
325 330 335
Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp
340 345 350
Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met
355 360 365
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala
370 375 380
Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Leu Glu Arg Val Arg Val
385 390 395 400
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
405 410 415
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
420 425 430
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
435 440 445
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
450 455 460
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
465 470 475 480
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
485 490 495
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505 510
<210> 132
<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 132
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Asp Val Val Met Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asn Arg Ile Arg Gly
245 250 255
Val Thr Val Ser Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His
260 265 270
Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
275 280 285
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
290 295 300
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
305 310 315 320
Gly Leu Asp Pro Phe Gly Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val
325 330 335
Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp
340 345 350
Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met
355 360 365
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala
370 375 380
Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Leu Glu Arg Val Arg Val
385 390 395 400
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
405 410 415
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
420 425 430
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
435 440 445
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
450 455 460
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
465 470 475 480
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
485 490 495
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505 510
<210> 133
<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 133
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Asp Ile Val Met Thr
130 135 140
Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile
145 150 155 160
Ser Phe Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asn Arg Ile Arg Gly
245 250 255
Val Thr Val Ser Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His
260 265 270
Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
275 280 285
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
290 295 300
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
305 310 315 320
Gly Leu Asp Pro Phe Gly Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val
325 330 335
Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp
340 345 350
Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met
355 360 365
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala
370 375 380
Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Leu Glu Arg Val Arg Val
385 390 395 400
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
405 410 415
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
420 425 430
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
435 440 445
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
450 455 460
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
465 470 475 480
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
485 490 495
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505 510
<210> 134
<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 134
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Asp Ile Val Met Thr
130 135 140
Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asn Arg Ile Arg Gly
245 250 255
Val Thr Val Ser Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His
260 265 270
Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
275 280 285
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
290 295 300
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
305 310 315 320
Gly Leu Asp Pro Phe Gly Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val
325 330 335
Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp
340 345 350
Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met
355 360 365
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala
370 375 380
Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Leu Glu Arg Val Arg Val
385 390 395 400
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
405 410 415
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
420 425 430
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
435 440 445
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
450 455 460
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
465 470 475 480
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
485 490 495
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505 510
<210> 135
<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 135
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Asp Ile Val Met Thr
130 135 140
Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asn Arg Ile Arg Gly
245 250 255
Val Thr Val Ser Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His
260 265 270
Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
275 280 285
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
290 295 300
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
305 310 315 320
Gly Leu Asp Pro Phe Gly Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val
325 330 335
Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp
340 345 350
Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met
355 360 365
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala
370 375 380
Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Leu Glu Arg Val Arg Val
385 390 395 400
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
405 410 415
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
420 425 430
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
435 440 445
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
450 455 460
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
465 470 475 480
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
485 490 495
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505 510
<210> 136
<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 136
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Asp Val Val Met Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asn Arg Ile Arg Gly
245 250 255
Val Thr Val Ser Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His
260 265 270
Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
275 280 285
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
290 295 300
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
305 310 315 320
Gly Leu Asp Pro Phe Gly Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val
325 330 335
Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp
340 345 350
Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met
355 360 365
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala
370 375 380
Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Leu Glu Arg Val Arg Val
385 390 395 400
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
405 410 415
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
420 425 430
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
435 440 445
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
450 455 460
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
465 470 475 480
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
485 490 495
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505 510
<210> 137
<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 137
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Asp Ile Val Met Thr
130 135 140
Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile
145 150 155 160
Ser Phe Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asn Arg Ile Arg Gly
245 250 255
Val Thr Val Ser Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His
260 265 270
Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
275 280 285
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
290 295 300
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
305 310 315 320
Gly Leu Asp Pro Phe Gly Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val
325 330 335
Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp
340 345 350
Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met
355 360 365
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala
370 375 380
Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Leu Glu Arg Val Arg Val
385 390 395 400
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
405 410 415
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
420 425 430
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
435 440 445
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
450 455 460
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
465 470 475 480
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
485 490 495
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505 510
<210> 138
<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 138
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Asp Ile Val Met Thr
130 135 140
Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asn Arg Ile Arg Gly
245 250 255
Val Thr Val Ser Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His
260 265 270
Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
275 280 285
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
290 295 300
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
305 310 315 320
Gly Leu Asp Pro Phe Gly Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val
325 330 335
Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp
340 345 350
Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met
355 360 365
Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala
370 375 380
Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Leu Glu Arg Val Arg Val
385 390 395 400
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
405 410 415
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
420 425 430
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
435 440 445
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
450 455 460
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
465 470 475 480
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
485 490 495
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505 510
<210> 139
<211> 822
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 139
atggatttcc aagttcaaat cttcagtttc ttgcttatca gtgcttctgt tattatgtca 60
cgagcaagtc aagttcaact cgtacagtct ggagccgagg tgaaaaaacc gggagcgtcc 120
gtgaaagtga gttgcaaggc gagtggatac accttcactt cataccatat acaatgggtt 180
cggcaggcgc ctggtcaacg gctggaatgg atgggctgga tttatcccgg agatggttcc 240
acgcagtaca atgagaaatt caaagggaga gtgacaatca cccgagatac cagtgcctct 300
acggcatata tggaactgag tagtctgcgg tctgaagata cggcggtgta ttattgtgcg 360
agagaaggga cgtactacgc catggattat tggggacaag gaacaacagt cacagtctcc 420
agcgttgatt cctcaggcgg gggcggaagt gggggcggcg gatctggcgg cggcgggtct 480
acgtctgacg tggtcatgac ccaatctcca ttgtctttgc cagttactct gggacagcct 540
gcaagtatca gttgccgatc ctcccaatct atcgtccatt caaacgggaa cacttatttg 600
gaatggtttc aacagagacc tgggcaaagt ccgcgccgac tgatatataa ggtcagtaac 660
cgcttttcag gcgtccccga tcgattcagt ggatctgggt cagggactga cttcactctg 720
aaaatatcaa gagtcgaagc tgaagatgtc ggagtatatt actgtttcca ggggtctcac 780
gtccctcgga cgtttggagg cggaactaag gttgagataa aa 822
<210> 140
<211> 822
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 140
atggattttc aggttcaaat ctttagcttt ctcttgattt ccgcctccgt aataatgagt 60
cgggccagtc aggtacagct cgttcaatct ggggctgaag taaaaaagcc tggagcgtct 120
gtaaaggtat cttgcaaagc gagcggctac acattcacaa gttatcacat ccaatgggtg 180
agacaggccc caggacaacg cttggagtgg atggggtgga tttaccctgg cgacggcagc 240
acacagtaca atgagaaatt taaaggccgg gtgactatca ctcgggacac ctccgccagc 300
acggcttata tggagcttag cagtttgaga tccgaagata cagcggtata ttactgcgcg 360
agagaaggaa cgtactacgc tatggactat tggggtcagg gcacaaccgt tacagtctcc 420
tctgtggaca gctccggagg tgggggttca ggagggggtg gaagcggtgg tggtggcagt 480
acaagcgata tagtaatgac ccaaaccccg ctctctctga gcgtcacgcc aggacaacca 540
gcatcaatct cttgccgcag tagtcaatcc atcgttcact ctaatggaaa cacatacctt 600
gagtggtatc ttcagaaacc aggtcagagc cctcagctcc tcatctataa agtctctaac 660
cggttctcag gtgttccgga ccggttcagt ggttccggct caggaacaga cttcaccttg 720
aagatcagtc gagtagaagc cgaagacgtg ggtgtatatt attgctttca gggttcccac 780
gttccgcgca ccttcggcgg cgggaccaaa gttgagatca aa 822
<210> 141
<211> 822
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 141
atggactttc aagtccaaat cttctcattc ctcctgatct ctgcgtcagt aatcatgtcc 60
agagcgtcac aagtgcaact cgttcaatcc ggagctgagg taaagaagcc cggcgccagc 120
gtgaaagtct cctgcaaagc gagcggctac acgttcacct catatcacat tcaatgggta 180
agacaagcac ctgggcaacg actcgagtgg atggggtgga tctaccctgg ggacgggagc 240
acgcagtata atgagaaatt caaaggcagg gttacaatta cagccgatac cagtgcatct 300
acggcttata tgctcctctc ctcactccgg tctgaggaca cagcggttta ttattgcgca 360
cgggagggaa cgtactacgc gatggactat tgggggcaag gcaccacagt tacagtgagc 420
tcagttgact catcaggagg cggaggatca gggggaggtg gtagtggggg cggtgggagc 480
acatcagatg ttgtcatgac tcagagccca ctttctttgc cggtgacgct ggggcagccc 540
gcttcaatct cttgccgctc atcacagtct atcgttcata gcaatggtaa cacttacttg 600
gaatggttcc aacaaagacc gggtcaaagt ccacggcgct tgatatataa agtatcaaat 660
agattttcag gggtgcctga tcggttcagc ggttctggat ctggcaccga cttcacgctt 720
aaaataagta gggtagaagc cgaagacgtg ggagtgtatt attgtttcca ggggtcacac 780
gtccctcgca cgttcggcgg aggcactaaa gtggagatca aa 822
<210> 142
<211> 822
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 142
atggactttc aagtccaaat cttcagcttt ctccttatat ctgcgtctgt cattatgagt 60
agagcaagtc aagtccagct cgtacaaagt ggagctgagg tgaaaaagcc gggcgcgagt 120
gtgaaagtct catgcaaggc gagtggatac acctttacct cttaccacat tcaatgggtg 180
cggcaggcgc ctgggcagcg cttggaatgg atgggctgga tatatcctgg cgacggaagt 240
acccagtaca acgaaaaatt caaaggtagg gttaccatca ctgctgatac ctccgcgtcc 300
actgcttata tgcttcttag ctccttgcga agcgaggata cagccgtgta ttattgtgcc 360
agagagggga cttattatgc catggactat tggggtcagg gtacaacggt cactgtctca 420
tctgttgaca gtagcggggg aggggggtct ggaggagggg gttccggggg gggaggttcc 480
acgagcgata tagttatgac gcaaacgccc ttgagcctca gtgttacacc cggtcaacct 540
gcctctatta gctgtcgctc ctcccaatca attgtgcata gcaatggaaa tacctacctt 600
gaatggtatc tccaaaagcc cgggcagagt cctcaacttc tcatctacaa agtatccaat 660
cgattcagtg gcgttcctga caggttcagc ggaagtgggt cagggaccga ttttaccctc 720
aaaattagtc gcgtcgaagc tgaggatgtt ggggtgtatt actgcttcca agggtcacac 780
gtaccacgca cattcggggg aggcacgaag gttgaaatta ag 822
<210> 143
<211> 822
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 143
atggatttcc aagtccaaat attcagtttc cttttgataa gtgcttcagt tatcatgtcc 60
cgagcaagcc aggtacagct tgtgcaaagc ggggcggaag ttaagaaacc gggagcctca 120
gttaaagtat cttgcaaagc cagcggttat acattcactt cataccacat acagtgggtg 180
cgccaagcac cggggcagag actggaatgg atgggatgga tttatcccgg tgatggtagt 240
acgcaataca atgaaaaatt caaaggaagg gtgactatca cgcgagacac aagcgcgtcc 300
acggcctata tggaactgag cagtctgaga tccgaggaca ccgctgtgta ttattgcgcc 360
cgagagggga cctactacgc catggattat tggggtcaag ggaccactgt gacagtctct 420
tctgtcgatt ccagcggcgg aggagggagt ggagggggtg ggtccggggg gggagggtct 480
acgagcgaca ttgtcatgac acagacgccg cttagctccc cagttacact cggacagccc 540
gcaagtatta gttgcagaag tagccagtct atcgtacatt caaatggaaa cacctatttg 600
gaatggtatc aacaacggcc tggacagccg cccaggctgc tcatatacaa agtctccaac 660
cgcttcagcg gagtacccga ccgcttttcc ggctccggag caggaactga ctttaccttg 720
aaaattagta gggtcgaagc agaggatgtc ggggtatatt attgtttcca aggtagtcat 780
gtcccacgga cgtttggtgg tgggacgaag gttgagatca aa 822
<210> 144
<211> 822
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 144
atggacttcc aggtgcagat attttccttt cttctcatat ctgcatctgt aataatgtca 60
agggccagcc aggtccagct cgttcaaagc ggagccgagg taaaaaaacc aggcgcttcc 120
gtcaaggtat catgcaaagc gtccggctat accttcacaa gttaccatat ccaatgggtt 180
cgacaggcac ccggacaaag acttgaatgg atgggttgga tataccccgg agacggctcc 240
actcagtata acgaaaagtt taaggggaga gtcacgatca ctagggacac atcagcttct 300
acggcgtata tggaactcag ttctttgcga tccgaggata ctgccgtata ttactgcgcc 360
agagaaggca cgtactacgc aatggattac tgggggcaag ggacaactgt taccgtctca 420
agcgtcgatt catcaggagg cggagggtcc ggaggtgggg gatctggcgg tgggggttct 480
acgtccgatg ttgtgatgac acagtcccca ctctctcttc cagtgacgct gggacagccc 540
gcgagcatct cctgtcgcag ctctcagtcc atagtacaca gtaatggtaa cacctatctt 600
gagtggtatc agcaacgacc cggtcagtct cccaggttgc ttatttataa ggttagtaac 660
cgcttttcag gtgttccaga cagatttagc gggagtggtt ccggtacgga tttcacattg 720
aaaatcagcc gcgtcgaagc cgaggacgtg ggtgtttact actgcttcca gggatctcac 780
gtaccgagga ccttcggcgg aggaacgaaa gtagaaatta ag 822
<210> 145
<211> 822
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 145
atggattttc aagtacaaat cttttccttc ctgcttattt ccgcaagcgt tattatgagt 60
agagccagcc aagtacaact ggtacagtcc ggcgcggagg tgaagaagcc cggagcaagt 120
gtgaaggtat cttgcaaggc gtcaggctat acctttactt cataccatat acagtgggtg 180
cgacaggctc ccggccagcg actcgaatgg atgggctgga tttatcccgg agatggatct 240
acgcagtata atgagaaatt caagggtcgg gtcacgatta cacgagacac gagtgcttcc 300
acagcttata tggaactttc tagcctgagg tctgaggata ctgccgttta ctattgtgca 360
cgagaaggga catactatgc gatggattac tggggacagg gcaccactgt cacagtttcc 420
agcgtggact caagtggagg cggtggatct ggtggtggcg ggtccggggg gggaggcagc 480
accagtgaca ttgtaatgac tcaaacacct ctcagtagcc cagtcactct cggtcagccg 540
gcgagtatct cttttaggtc ctcacaatct atagtgcact ctaacggcaa tacttatctt 600
gaatggtatc aacaaagacc ggggcagcca cctcgccttc tcatctacaa agtaagcaat 660
cgcttctccg gtgtccccga tcgcttctcc ggttcaggag caggaactga cttcacattg 720
aagatttcca gagtggaggc cgaagacgta ggggtatatt attgctttca agggtcccat 780
gtgcccagaa cctttggggg aggaacgaaa gttgagatta aa 822
<210> 146
<211> 822
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 146
atggatttcc aagtgcagat tttctctttt ctcctcataa gcgcctccgt aattatgtct 60
agagctagtc aagtccaatt ggtgcaatcc ggtgccgagg ttaaaaagcc cggcgcaagt 120
gtaaaagtct cctgtaaggc cagtggctac actttcacca gctaccatat acagtgggtg 180
cggcaggcgc ctggtcaggg tctggagtgg atgggtattt ggatttatcc cggagatgga 240
agtactcaat acaatgagaa attcaagggt gtcactatga caagggatac gagcacttct 300
accgtatata tggagttgtc atctttgcga tcagaggata ccgctgtata ttattgcgca 360
cgggaaggta catattatgc catggactac tggggccaag gaaccaccgt gacggtaagc 420
tctgtcgatt ctagcggtgg cgggggctct ggcggtgggg gtagcggggg tggcggatct 480
acatcagata ttgtaatgac acagacccct ctttcacttt ccgtaacgcc aggacagccg 540
gcatcaataa gttgccgatc aagccagtct atcgtacact ccaatggtaa cacatacttg 600
gaatggtatc ttcaaaagcc cggccagagc ccgcagcttt tgatatataa agtgtccaac 660
agattcagtg gggtgccgga ccgctttagt ggatctggtt caggaacgga cttcacattg 720
aaaattagta gagttgaagc ggaagacgtg ggagtctact actgtttcca gggttcacat 780
gtgcctcgga cctttggggg aggcaccaag gttgagataa aa 822
<210> 147
<211> 822
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 147
atggacttcc aagtccaaat cttttctttt ttgttgataa gcgcatcagt tattatgtct 60
cgcgccagtc aagtacaact ggtgcagtcc ggagctgaag tgaaaaaacc aggagcaagc 120
gtgaaagtaa gttgtaaggc aagtggttac actttcacaa gctaccatat tcaatgggtc 180
cgacaggctc ctggacaggg cttggagtgg atgggcatat ggatttaccc tggtgacggg 240
tccacccagt ataatgaaaa gttcaaggga gtcacgatga ccagggacac ctctacatct 300
accgtgtata tggagctctc tagtttgcga tccgaagaca ctgccgttta ttactgtgca 360
agagaaggaa cttattacgc gatggactac tggggtcagg ggacaacagt caccgttagc 420
tccgtcgatt ccagcggggg aggtggctca ggcgggggtg gttctggggg gggcgggagc 480
acttcagata ttgtaatgac ccaaacccca ctgagtagtc cagtcacgct tggtcaaccg 540
gcaagcattt cttgcaggag ctctcagagt attgtccact ctaacgggaa tacatatttg 600
gagtggtatc agcaaagacc gggccaacca ccacgcctct tgatttataa ggtgagcaat 660
aggttttcag gcgtgccaga taggttctca ggctccggag cgggaaccga cttcaccctc 720
aagataagtc gggtggaagc cgaagacgta ggagtttact actgctttca aggatctcat 780
gttccacgaa cgtttggagg aggaaccaag gtggaaataa aa 822
<210> 148
<211> 822
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 148
atggactttc aggtccaaat tttttccttc ttgctcatat ccgcgagtgt catcatgtca 60
agagcaagtc aagttcaact cgttcaatca ggagctgagg tgaaaaaacc aggggcgtct 120
gtcaaagtaa gctgcaaagc atcagggtat acgttcacga gttatcatat ccagtgggtt 180
aggcaggcgc cagggcaggg attggaatgg atgggtatct ggatttaccc gggtgacggc 240
agcactcaat acaatgagaa attcaaaggc gtaacaatga caagggacac gagcacaagc 300
acagtgtaca tggagcttag ctctttgagg tcagaggata ccgctgttta ctattgtgct 360
cgggagggta cttactatgc aatggactac tgggggcaag gcacgaccgt tacagtgagt 420
agcgtagatt cctccggggg tggcggttca ggcggcggag gctcaggcgg aggagggtca 480
acatccgatg tcgtaatgac tcagtcccct ctgtcattgc cggtgacttt gggacagcca 540
gcgtctatat cttgtaggtc ctctcaatca atagtgcatt ccaacggtaa cacctatctg 600
gaatggtatc agcaaaggcc aggacaaagt ccacgcctgc ttatatataa ggtgtctaat 660
cgattcagtg gggttcccga taggttttcc ggctctggta gcgggactga tttcacgttg 720
aaaatatcac gcgtggaagc ggaagatgtt ggggtctatt actgctttca gggtagtcat 780
gtccctcgaa cttttggcgg tggtacaaag gtagaaatca aa 822
<210> 149
<211> 822
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 149
atggattttc aggtacagat attctcattt ctccttatct cagctagtgt cataatgtcc 60
agggcgagtc aagtacaact tgtccagtca ggcgcagagg tcaagaagcc gggcgcaagc 120
gttaaggttt cctgcaaagc atccggctat acattcacgt cctatcacat ccaatgggtc 180
aggcaagcac ccggtcaagg acttgagtgg atgggcatct ggatttaccc tggagatggc 240
agtactcagt acaacgaaaa attcaaaggt gtaaccatga cccgcgacac atctacttcc 300
acagtttata tggaactcag cagtttgcgg agcgaagata ccgctgttta ctactgtgcc 360
cgagagggaa cttactacgc catggactat tggggtcaag gaacgacagt aacagttagt 420
tctgtagatt ccagtggcgg cggtgggagc gggggtgggg gatctggcgg aggcggaagt 480
acaagtgaca tcgttatgac tcagacaccc cttagtagtc ccgttacgtt gggccaaccc 540
gcgagcattt cctttcgatc ctctcagtct atagttcact caaatgggaa tacttatttg 600
gagtggtatc aacagcgccc cggacaacca ccaaggctcc tgatatacaa ggtgtccaat 660
cgattctctg gggtgcctga tagatttagc ggaagtggag ccggtacaga ttttaccctg 720
aaaatatcac gggtagaagc cgaagatgtc ggcgtctact actgtttcca gggttcccat 780
gtaccgcgaa cgttcggggg cggaacaaaa gttgagatca ag 822
<210> 150
<211> 822
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 150
atggatttcc aggttcagat atttagtttc ctcttgattt ctgccagtgt catcatgagc 60
agggcttccc aagttcagtt ggtgcaaagt ggcgctgaag tcaaaaaacc tggggcttcc 120
gttaaagtat cttgcaaggc gtccggctac actttcacat cctaccacat tcaatgggtc 180
cggcaagcgc ccggtcaggg gctcgaatgg atggggtgga tatacccagg agatggatct 240
actcagtaca acgagaaatt taaaggacgg gtgacgatga cgcgcgacac ttcaataagc 300
actgcataca tggaactgtc ccggcttagg tcagatgaca ccgcggtcta ctattgtgcg 360
agagagggta cttactatgc tatggactac tgggggcaag gcacgacggt tacagtttcc 420
tcagtcgata gttcaggcgg aggcggctcc gggggcggtg gtagtggagg gggtggatct 480
acttccgaca ttgtcatgac ccagaccccg ttgagccttt cagtgacgcc cggtcaaccc 540
gccagcataa gttgtcgatc aagccagtct attgtacact ccaatggaaa cacatatttg 600
gagtggtatc tccaaaaacc cggccaaagc cctcaactgc tcatctacaa ggtctcaaac 660
aggtttagcg gggtcccgga tcgcttctca gggtcaggat ctggtacgga ctttacactg 720
aaaatttccc gagtcgaagc ggaagacgtg ggtgtatatt actgcttcca ggggagtcat 780
gttccaagaa cctttggggg aggtacaaag gtcgaaataa aa 822
<210> 151
<211> 822
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 151
atggattttc aggtccaaat tttttccttc ttgcttatca gcgcaagtgt aatcatgtcc 60
cgcgcgtccc aagtacaact tgtgcaatct ggcgcggagg tgaaaaaacc tggagcttcc 120
gtcaaggttt cttgtaaggc ctctggctac accttcacgt cctaccacat tcagtgggtt 180
cgacaggcgc cgggccaagg actggagtgg atgggatgga tatatccagg agatggttct 240
actcagtata atgagaaatt caagggtcgc gtaacaatga cgagggatac atcaatctcc 300
accgcgtaca tggaactttc aagactccgg tcagatgaca cggcggttta ctactgtgct 360
cgggagggca cttactatgc tatggactac tgggggcaag ggacaacggt aacggtatct 420
agtgtggatt ctagtggcgg cggcggttca ggaggaggtg gttcaggcgg ggggggtagt 480
acaagtgata ttgtgatgac ccaaacaccc ctttctagcc ctgttactct gggtcaaccc 540
gcgtccataa gttgtcgaag tagtcaatcc atcgtgcata gcaacggcaa cacttacctt 600
gaatggtatc aacaacgacc cggacagccc ccgcgactgc ttatctataa agtatcaaac 660
aggttcagtg gcgtgccaga tcgattctcc ggctctgggg caggcacaga tttcacgttg 720
aaaatttctc gggtcgaggc cgaggacgtg ggcgtttatt actgtttcca ggggagtcac 780
gtccccagga cgttcggagg aggaactaaa gtcgaaataa ag 822
<210> 152
<211> 822
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 152
atggacttcc aggtccaaat attcagcttc ctcctcattt ccgccagtgt aataatgtcc 60
agagcctcac aagtacagtt ggttcagagc ggggctgagg ttaagaaacc aggcgcgagc 120
gtcaaggtat cctgcaaggc gagtggttat actttcacta gttatcacat tcagtgggtc 180
cgacaggccc ccggtcaagg cctggagtgg atggggtgga tatatccggg agatggttct 240
acccaatata atgagaagtt taaggggaga gtcacaatga caagggacac cagtattagc 300
accgcgtata tggagctttc ccgcctgcga tcagatgaca cggccgtgta ctactgtgct 360
agggagggaa cctattatgc gatggattac tggggacagg gtactacagt cacggtctct 420
agcgtggaca gttccggggg cggtggaagc ggtggtggcg gttcaggtgg aggaggctct 480
acgagtgatg ttgtgatgac tcagtccccg ctttcacttc ccgtcaccct tgggcaaccc 540
gcaagcatct catgccgatc ctcccagtct atagtacata gtaatggcaa cacatatctt 600
gaatggtatc agcagaggcc gggtcagtct ccccgactcc ttatatataa agtgagcaac 660
agattctccg gagtaccgga tagattttcc ggctctggga gcggcaccga ctttacactg 720
aaaatttcac gggttgaagc tgaagatgtt ggggtatact attgtttcca gggttctcac 780
gtcccgagga cattcggggg aggaacgaaa gtcgaaataa ag 822
<210> 153
<211> 822
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 153
atggattttc aggtacaaat cttcagcttc ctgctcatct ccgcgagcgt aatcatgtct 60
agggcgtccc aggtgcagtt ggtgcaatca ggtgcagagg tgaagaagcc tggtgcatcc 120
gttaaagtaa gttgtaaggc aagcggatat acttttacat cctatcatat tcaatgggtc 180
agacaagcac ctggacaggg tcttgagtgg atgggctgga tctatccagg cgatggctca 240
actcaatata acgagaagtt caaggggagg gttactatga ccagggatac gtctatttcc 300
actgcgtaca tggaactctc caggttgaga agtgatgata ccgcggttta ctactgcgct 360
agagaaggaa cgtactacgc tatggattac tgggggcagg gtacaactgt caccgtctca 420
agtgtggatt cttctggggg tgggggatca ggagggggag gctccggtgg gggcgggtca 480
accagcgaca ttgtcatgac tcaaaccccc ctgagcagcc ctgtcaccct gggtcagcct 540
gcctcaatat cctttagaag ctcccaaagc atcgtccatt caaatggtaa tacctatctg 600
gagtggtatc agcaaaggcc tggtcaaccc ccgcgccttc tcatttacaa ggtgtcaaac 660
aggttctccg gcgtaccgga taggttttcc ggaagcggtg ctggaaccga ctttactctc 720
aaaatctcta gggtggaagc tgaggacgtc ggtgtatact attgttttca aggctcccat 780
gttcccagga catttggtgg gggaacgaag gtagaaatca ag 822
<210> 154
<211> 822
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 154
atggactttc aggttcagat tttctctttc ttgttgatct ccgctagtgt cataatgtca 60
cgggcaagtc aggtacaact cgttcagagt ggtgccgaag tgaagaaacc gggtgcctcc 120
gtaaaggtgt catgtaaagc tagtggctat acattcacaa gttatcatat ccaatgggta 180
cgacaagcac cgggacagcg actggaatgg atgggatgga tctatcctgg ggacggatct 240
acacagtaca atgagaaatt taagggacgg gtcacgataa ccagggacac atctgcttcc 300
acggcttaca tggagctttc ctccctgcgg agcgaggaca tggctgttta ctattgcgct 360
cgcgaaggga catactacgc aatggattat tggggccaag gcactaccgt gacggtctct 420
tctgtcgata gttccggagg aggtggttca gggggaggcg gttcaggtgg gggtggatct 480
acctcagata ttgtcatgac acagacacct ttgtccttga gtgtgacacc gggtcaaccg 540
gcgagtataa gctgtcgcag ctcacaatct attgtgcata gcaacgggaa tacatatctc 600
gaatggtatc tccaaaagcc gggccaatcc ccccaacttc tcatttacaa agtttctaat 660
cgattttcag gtgtaccaga tcggttttcc gggtctggct caggtactga cttcaccttg 720
aaaatatcaa gggttgaagc tgaggatgta ggtgtgtact attgcttcca ggggtctcac 780
gttcctcgga cttttggggg gggcacaaaa gtagagatta aa 822
<210> 155
<211> 822
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 155
atggatttcc aggtgcaaat cttctcattt cttttgataa gtgcgtcagt gataatgtct 60
cgggccagtc aagtacagct tgtccaaagt ggcgctgaag tcaagaagcc gggagcctca 120
gttaaggtta gctgcaaggc ctcagggtat acttttacct cctatcatat acagtgggta 180
cgacaagcac cgggacagcg actggagtgg atgggttgga tatatccggg agatggttca 240
acccagtata atgagaagtt caaggggcga gttacgataa cccgcgatac gagtgcatca 300
acagcgtaca tggagttgag ttccctccgc agcgaggaca tggcggtata ctattgtgcc 360
agggagggga cttattatgc catggactac tgggggcagg gcacaaccgt aacagtctct 420
tctgtagaca gttcaggagg gggcggaagt ggaggtggcg gatctggtgg aggtggatct 480
acttccgaca tcgttatgac ccaaacacca ctttcatctc ccgttactct cgggcaacct 540
gctagtattt cctgtagatc ctcacaatct atagtacata gcaatggcaa tacctacctg 600
gagtggtatc aacaacgccc aggccaacca cctcgcctgc ttatctataa agtaagcaat 660
agattcagtg gtgtaccgga taggttctct ggttccggag caggaactga ctttacactc 720
aaaatcagta gggtggaggc ggaagacgtg ggagtatatt attgctttca aggttcacat 780
gtacctcgaa catttggcgg aggaactaag gttgagatta aa 822
<210> 156
<211> 822
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 156
atggatttcc aagtccagat attcagtttt cttttgataa gcgcttctgt aatcatgtct 60
cgggcgtccc aagtacaact ggtgcaatca ggggcagaag tgaaaaaacc aggtgcatcc 120
gttaaggtga gttgcaaggc ttccggctat acctttacat catatcatat tcaatgggtc 180
aggcaagcac ctggtcagcg attggaatgg atgggttgga tatatcctgg tgatgggtct 240
acacaatata acgaaaaatt caaggggcga gtgaccatca caagagatac atcagcgtca 300
acagcgtata tggaactgtc atcccttaga tcagaggaca tggcggtcta ttactgtgcc 360
agagaaggca cttattatgc aatggattat tggggacaag gaaccactgt cactgtttcc 420
agcgtagact cctccggtgg tggtggaagt ggcggcggtg ggtcaggagg gggtgggtca 480
acttctgatg tagtgatgac acagagccct ctgagcttgc ctgtgacctt gggtcagccg 540
gcctcaataa gttgtcgatc tagtcagtca atcgtccata gtaatgggaa cacatacctt 600
gaatggtatc agcaaagacc tggacaatct ccacgactcc ttatatacaa agttagcaac 660
cgatttagcg gagtgccaga ccgcttttct ggttccgggt ctggcacaga ttttaccctt 720
aagatctccc gcgtggaggc ggaagacgtt ggtgtttact attgcttcca ggggtcacac 780
gttccacgca cctttggagg aggtacgaag gtcgagatta ag 822
<210> 157
<211> 822
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 157
atggattttc aagtacagat cttctctttc ttgcttattt cagcgagcgt aatcatgagt 60
agggcatctc aagttcaact cgttcagtca ggtgctgagg taaaaaaacc aggggcttcc 120
gttaaagtta gctgtaaggc atctgggtac acatttacta gctaccatat ccagtgggtg 180
cgacaagccc cggggcagcg cttggaatgg atgggctgga tttacccagg tgacggctcc 240
acgcaatata atgagaaatt taagggtaga gttactatta ccagggacac aagtgcttca 300
actgcctata tggaactgag cagccttcgg agtgaagata tggccgtata ttactgcgca 360
agggagggga cttactatgc aatggactac tggggtcagg gaacgactgt gaccgtgtcc 420
tcagttgact ccagcggtgg tggcggctct ggaggtgggg gttccggcgg aggcggaagc 480
acatctgata tagtgatgac gcaaacgcct ctttcttccc cggtaactct gggacagcca 540
gcgtcaattt catttaggtc ctcccagtca atcgtacata gtaatggaaa tacttacctg 600
gaatggtatc aacaacgacc agggcaaccg ccccgattgt tgatctataa agtgagcaat 660
cgcttttctg gcgtgcccga tcggttctca gggtctggag ctgggactga cttcacattg 720
aaaatttcca gggttgaggc cgaggatgtg ggggtttatt actgcttcca aggctcccac 780
gtcccccgca ccttcggagg gggaaccaaa gtcgaaataa ag 822
<210> 158
<211> 822
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 158
atggattttc aagttcagat attctcattt ttgcttatat cagcctccgt aattatgtca 60
cgggcaagtc aagttcagtt ggtgcagtcc ggagcagaag ttaagaagcc cggtgcttct 120
gtgaaagtct cctgcaaagc gtctgggtac accttcacga gctaccatat acagtgggtc 180
cggcaagcgc ctgggcagag gctggagtgg atgggctgga tttacccagg agatgggagt 240
acaaagtata gtcagaagtt tcaagggcga gtgacgataa ccagagatac gagtgcaagt 300
actgcataca tggaactgag ctccttgagg tccgaggata cagcggtgta ctattgcgct 360
cgggaaggga catattatgc tatggactat tggggacaag ggacaacggt aacggtgagt 420
tccgtcgatt cctcaggtgg cggaggcagt gggggcgggg gttccggcgg tggcgggtcc 480
acgagtgata tagttatgac acagaccccc ctcagccttt ctgtgacccc aggacaaccc 540
gctagtatct cttgccgcag ttctcagtcc atagtacaca gtaacggaaa tacctatctt 600
gagtggtatc ttcaaaagcc cggccagagc cctcaactct tgatatataa agtgtcaaat 660
cgattttcag gtgtgcctga tcgattctca gggtctggtt cagggacaga tttcacgctt 720
aagataagca gagtagaggc tgaagacgtg ggagtctact attgttttca ggggtcacac 780
gttccccgca cttttggtgg gggaaccaag gtggaaatca aa 822
<210> 159
<211> 192
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 159
tcttcagcgc tgagcaactc catcatgtac ttcagccact tcgtgccggt cttcctgcca 60
gcgaagccca ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 120
cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 180
agggggctgg ac 192
<210> 160
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 160
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt g 81
<210> 161
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 161
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120
tcc 123
<210> 162
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 162
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 163
<211> 1599
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 163
atggatttcc aagttcaaat cttcagtttc ttgcttatca gtgcttctgt tattatgtca 60
cgagcaagtc aagttcaact cgtacagtct ggagccgagg tgaaaaaacc gggagcgtcc 120
gtgaaagtga gttgcaaggc gagtggatac accttcactt cataccatat acaatgggtt 180
cggcaggcgc ctggtcaacg gctggaatgg atgggctgga tttatcccgg agatggttcc 240
acgcagtaca atgagaaatt caaagggaga gtgacaatca cccgagatac cagtgcctct 300
acggcatata tggaactgag tagtctgcgg tctgaagata cggcggtgta ttattgtgcg 360
agagaaggga cgtactacgc catggattat tggggacaag gaacaacagt cacagtctcc 420
agcgttgatt cctcaggcgg gggcggaagt gggggcggcg gatctggcgg cggcgggtct 480
acgtctgacg tggtcatgac ccaatctcca ttgtctttgc cagttactct gggacagcct 540
gcaagtatca gttgccgatc ctcccaatct atcgtccatt caaacgggaa cacttatttg 600
gaatggtttc aacagagacc tgggcaaagt ccgcgccgac tgatatataa ggtcagtaac 660
cgcttttcag gcgtccccga tcgattcagt ggatctgggt cagggactga cttcactctg 720
aaaatatcaa gagtcgaagc tgaagatgtc ggagtatatt actgtttcca ggggtctcac 780
gtccctcgga cgtttggagg cggaactaag gttgagataa aaaaccggat ccgtggggtc 840
accgtctctt cagcgctgag caactccatc atgtacttca gccacttcgt gccggtcttc 900
ctgccagcga agcccaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc 960
gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg 1020
cacacgaggg ggctggaccc ctttgggttt tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg 1080
gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg 1140
agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc 1200
aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc cctcgagaga 1260
gtgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 1320
ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 1380
ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 1440
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 1500
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 1560
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 1599
<210> 164
<211> 1599
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 164
atggattttc aggttcaaat ctttagcttt ctcttgattt ccgcctccgt aataatgagt 60
cgggccagtc aggtacagct cgttcaatct ggggctgaag taaaaaagcc tggagcgtct 120
gtaaaggtat cttgcaaagc gagcggctac acattcacaa gttatcacat ccaatgggtg 180
agacaggccc caggacaacg cttggagtgg atggggtgga tttaccctgg cgacggcagc 240
acacagtaca atgagaaatt taaaggccgg gtgactatca ctcgggacac ctccgccagc 300
acggcttata tggagcttag cagtttgaga tccgaagata cagcggtata ttactgcgcg 360
agagaaggaa cgtactacgc tatggactat tggggtcagg gcacaaccgt tacagtctcc 420
tctgtggaca gctccggagg tgggggttca ggagggggtg gaagcggtgg tggtggcagt 480
acaagcgata tagtaatgac ccaaaccccg ctctctctga gcgtcacgcc aggacaacca 540
gcatcaatct cttgccgcag tagtcaatcc atcgttcact ctaatggaaa cacatacctt 600
gagtggtatc ttcagaaacc aggtcagagc cctcagctcc tcatctataa agtctctaac 660
cggttctcag gtgttccgga ccggttcagt ggttccggct caggaacaga cttcaccttg 720
aagatcagtc gagtagaagc cgaagacgtg ggtgtatatt attgctttca gggttcccac 780
gttccgcgca ccttcggcgg cgggaccaaa gttgagatca aaaaccggat ccgtggggtc 840
accgtctctt cagcgctgag caactccatc atgtacttca gccacttcgt gccggtcttc 900
ctgccagcga agcccaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc 960
gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg 1020
cacacgaggg ggctggaccc ctttgggttt tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg 1080
gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg 1140
agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc 1200
aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc cctcgagaga 1260
gtgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 1320
ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 1380
ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 1440
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 1500
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 1560
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 1599
<210> 165
<211> 1599
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 165
atggactttc aagtccaaat cttctcattc ctcctgatct ctgcgtcagt aatcatgtcc 60
agagcgtcac aagtgcaact cgttcaatcc ggagctgagg taaagaagcc cggcgccagc 120
gtgaaagtct cctgcaaagc gagcggctac acgttcacct catatcacat tcaatgggta 180
agacaagcac ctgggcaacg actcgagtgg atggggtgga tctaccctgg ggacgggagc 240
acgcagtata atgagaaatt caaaggcagg gttacaatta cagccgatac cagtgcatct 300
acggcttata tgctcctctc ctcactccgg tctgaggaca cagcggttta ttattgcgca 360
cgggagggaa cgtactacgc gatggactat tgggggcaag gcaccacagt tacagtgagc 420
tcagttgact catcaggagg cggaggatca gggggaggtg gtagtggggg cggtgggagc 480
acatcagatg ttgtcatgac tcagagccca ctttctttgc cggtgacgct ggggcagccc 540
gcttcaatct cttgccgctc atcacagtct atcgttcata gcaatggtaa cacttacttg 600
gaatggttcc aacaaagacc gggtcaaagt ccacggcgct tgatatataa agtatcaaat 660
agattttcag gggtgcctga tcggttcagc ggttctggat ctggcaccga cttcacgctt 720
aaaataagta gggtagaagc cgaagacgtg ggagtgtatt attgtttcca ggggtcacac 780
gtccctcgca cgttcggcgg aggcactaaa gtggagatca aaaaccggat ccgtggggtc 840
accgtctctt cagcgctgag caactccatc atgtacttca gccacttcgt gccggtcttc 900
ctgccagcga agcccaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc 960
gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg 1020
cacacgaggg ggctggaccc ctttgggttt tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg 1080
gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg 1140
agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc 1200
aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc cctcgagaga 1260
gtgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 1320
ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 1380
ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 1440
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 1500
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 1560
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 1599
<210> 166
<211> 1599
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 166
atggactttc aagtccaaat cttcagcttt ctccttatat ctgcgtctgt cattatgagt 60
agagcaagtc aagtccagct cgtacaaagt ggagctgagg tgaaaaagcc gggcgcgagt 120
gtgaaagtct catgcaaggc gagtggatac acctttacct cttaccacat tcaatgggtg 180
cggcaggcgc ctgggcagcg cttggaatgg atgggctgga tatatcctgg cgacggaagt 240
acccagtaca acgaaaaatt caaaggtagg gttaccatca ctgctgatac ctccgcgtcc 300
actgcttata tgcttcttag ctccttgcga agcgaggata cagccgtgta ttattgtgcc 360
agagagggga cttattatgc catggactat tggggtcagg gtacaacggt cactgtctca 420
tctgttgaca gtagcggggg aggggggtct ggaggagggg gttccggggg gggaggttcc 480
acgagcgata tagttatgac gcaaacgccc ttgagcctca gtgttacacc cggtcaacct 540
gcctctatta gctgtcgctc ctcccaatca attgtgcata gcaatggaaa tacctacctt 600
gaatggtatc tccaaaagcc cgggcagagt cctcaacttc tcatctacaa agtatccaat 660
cgattcagtg gcgttcctga caggttcagc ggaagtgggt cagggaccga ttttaccctc 720
aaaattagtc gcgtcgaagc tgaggatgtt ggggtgtatt actgcttcca agggtcacac 780
gtaccacgca cattcggggg aggcacgaag gttgaaatta agaaccggat ccgtggggtc 840
accgtctctt cagcgctgag caactccatc atgtacttca gccacttcgt gccggtcttc 900
ctgccagcga agcccaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc 960
gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg 1020
cacacgaggg ggctggaccc ctttgggttt tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg 1080
gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg 1140
agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc 1200
aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc cctcgagaga 1260
gtgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 1320
ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 1380
ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 1440
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 1500
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 1560
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 1599
<210> 167
<211> 1599
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 167
atggatttcc aagtccaaat attcagtttc cttttgataa gtgcttcagt tatcatgtcc 60
cgagcaagcc aggtacagct tgtgcaaagc ggggcggaag ttaagaaacc gggagcctca 120
gttaaagtat cttgcaaagc cagcggttat acattcactt cataccacat acagtgggtg 180
cgccaagcac cggggcagag actggaatgg atgggatgga tttatcccgg tgatggtagt 240
acgcaataca atgaaaaatt caaaggaagg gtgactatca cgcgagacac aagcgcgtcc 300
acggcctata tggaactgag cagtctgaga tccgaggaca ccgctgtgta ttattgcgcc 360
cgagagggga cctactacgc catggattat tggggtcaag ggaccactgt gacagtctct 420
tctgtcgatt ccagcggcgg aggagggagt ggagggggtg ggtccggggg gggagggtct 480
acgagcgaca ttgtcatgac acagacgccg cttagctccc cagttacact cggacagccc 540
gcaagtatta gttgcagaag tagccagtct atcgtacatt caaatggaaa cacctatttg 600
gaatggtatc aacaacggcc tggacagccg cccaggctgc tcatatacaa agtctccaac 660
cgcttcagcg gagtacccga ccgcttttcc ggctccggag caggaactga ctttaccttg 720
aaaattagta gggtcgaagc agaggatgtc ggggtatatt attgtttcca aggtagtcat 780
gtcccacgga cgtttggtgg tgggacgaag gttgagatca aaaaccggat ccgtggggtc 840
accgtctctt cagcgctgag caactccatc atgtacttca gccacttcgt gccggtcttc 900
ctgccagcga agcccaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc 960
gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg 1020
cacacgaggg ggctggaccc ctttgggttt tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg 1080
gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg 1140
agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc 1200
aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc cctcgagaga 1260
gtgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 1320
ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 1380
ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 1440
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 1500
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 1560
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 1599
<210> 168
<211> 1599
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 168
atggacttcc aggtgcagat attttccttt cttctcatat ctgcatctgt aataatgtca 60
agggccagcc aggtccagct cgttcaaagc ggagccgagg taaaaaaacc aggcgcttcc 120
gtcaaggtat catgcaaagc gtccggctat accttcacaa gttaccatat ccaatgggtt 180
cgacaggcac ccggacaaag acttgaatgg atgggttgga tataccccgg agacggctcc 240
actcagtata acgaaaagtt taaggggaga gtcacgatca ctagggacac atcagcttct 300
acggcgtata tggaactcag ttctttgcga tccgaggata ctgccgtata ttactgcgcc 360
agagaaggca cgtactacgc aatggattac tgggggcaag ggacaactgt taccgtctca 420
agcgtcgatt catcaggagg cggagggtcc ggaggtgggg gatctggcgg tgggggttct 480
acgtccgatg ttgtgatgac acagtcccca ctctctcttc cagtgacgct gggacagccc 540
gcgagcatct cctgtcgcag ctctcagtcc atagtacaca gtaatggtaa cacctatctt 600
gagtggtatc agcaacgacc cggtcagtct cccaggttgc ttatttataa ggttagtaac 660
cgcttttcag gtgttccaga cagatttagc gggagtggtt ccggtacgga tttcacattg 720
aaaatcagcc gcgtcgaagc cgaggacgtg ggtgtttact actgcttcca gggatctcac 780
gtaccgagga ccttcggcgg aggaacgaaa gtagaaatta agaaccggat ccgtggggtc 840
accgtctctt cagcgctgag caactccatc atgtacttca gccacttcgt gccggtcttc 900
ctgccagcga agcccaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc 960
gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg 1020
cacacgaggg ggctggaccc ctttgggttt tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg 1080
gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg 1140
agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc 1200
aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc cctcgagaga 1260
gtgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 1320
ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 1380
ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 1440
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 1500
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 1560
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 1599
<210> 169
<211> 1599
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 169
atggattttc aagtacaaat cttttccttc ctgcttattt ccgcaagcgt tattatgagt 60
agagccagcc aagtacaact ggtacagtcc ggcgcggagg tgaagaagcc cggagcaagt 120
gtgaaggtat cttgcaaggc gtcaggctat acctttactt cataccatat acagtgggtg 180
cgacaggctc ccggccagcg actcgaatgg atgggctgga tttatcccgg agatggatct 240
acgcagtata atgagaaatt caagggtcgg gtcacgatta cacgagacac gagtgcttcc 300
acagcttata tggaactttc tagcctgagg tctgaggata ctgccgttta ctattgtgca 360
cgagaaggga catactatgc gatggattac tggggacagg gcaccactgt cacagtttcc 420
agcgtggact caagtggagg cggtggatct ggtggtggcg ggtccggggg gggaggcagc 480
accagtgaca ttgtaatgac tcaaacacct ctcagtagcc cagtcactct cggtcagccg 540
gcgagtatct cttttaggtc ctcacaatct atagtgcact ctaacggcaa tacttatctt 600
gaatggtatc aacaaagacc ggggcagcca cctcgccttc tcatctacaa agtaagcaat 660
cgcttctccg gtgtccccga tcgcttctcc ggttcaggag caggaactga cttcacattg 720
aagatttcca gagtggaggc cgaagacgta ggggtatatt attgctttca agggtcccat 780
gtgcccagaa cctttggggg aggaacgaaa gttgagatta aaaaccggat ccgtggggtc 840
accgtctctt cagcgctgag caactccatc atgtacttca gccacttcgt gccggtcttc 900
ctgccagcga agcccaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc 960
gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg 1020
cacacgaggg ggctggaccc ctttgggttt tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg 1080
gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg 1140
agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc 1200
aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc cctcgagaga 1260
gtgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 1320
ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 1380
ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 1440
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 1500
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 1560
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 1599
<210> 170
<211> 1599
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 170
atggatttcc aagtgcagat tttctctttt ctcctcataa gcgcctccgt aattatgtct 60
agagctagtc aagtccaatt ggtgcaatcc ggtgccgagg ttaaaaagcc cggcgcaagt 120
gtaaaagtct cctgtaaggc cagtggctac actttcacca gctaccatat acagtgggtg 180
cggcaggcgc ctggtcaggg tctggagtgg atgggtattt ggatttatcc cggagatgga 240
agtactcaat acaatgagaa attcaagggt gtcactatga caagggatac gagcacttct 300
accgtatata tggagttgtc atctttgcga tcagaggata ccgctgtata ttattgcgca 360
cgggaaggta catattatgc catggactac tggggccaag gaaccaccgt gacggtaagc 420
tctgtcgatt ctagcggtgg cgggggctct ggcggtgggg gtagcggggg tggcggatct 480
acatcagata ttgtaatgac acagacccct ctttcacttt ccgtaacgcc aggacagccg 540
gcatcaataa gttgccgatc aagccagtct atcgtacact ccaatggtaa cacatacttg 600
gaatggtatc ttcaaaagcc cggccagagc ccgcagcttt tgatatataa agtgtccaac 660
agattcagtg gggtgccgga ccgctttagt ggatctggtt caggaacgga cttcacattg 720
aaaattagta gagttgaagc ggaagacgtg ggagtctact actgtttcca gggttcacat 780
gtgcctcgga cctttggggg aggcaccaag gttgagataa aaaaccggat ccgtggggtc 840
accgtctctt cagcgctgag caactccatc atgtacttca gccacttcgt gccggtcttc 900
ctgccagcga agcccaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc 960
gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg 1020
cacacgaggg ggctggaccc ctttgggttt tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg 1080
gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg 1140
agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc 1200
aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc cctcgagaga 1260
gtgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 1320
ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 1380
ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 1440
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 1500
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 1560
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 1599
<210> 171
<211> 1599
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 171
atggacttcc aagtccaaat cttttctttt ttgttgataa gcgcatcagt tattatgtct 60
cgcgccagtc aagtacaact ggtgcagtcc ggagctgaag tgaaaaaacc aggagcaagc 120
gtgaaagtaa gttgtaaggc aagtggttac actttcacaa gctaccatat tcaatgggtc 180
cgacaggctc ctggacaggg cttggagtgg atgggcatat ggatttaccc tggtgacggg 240
tccacccagt ataatgaaaa gttcaaggga gtcacgatga ccagggacac ctctacatct 300
accgtgtata tggagctctc tagtttgcga tccgaagaca ctgccgttta ttactgtgca 360
agagaaggaa cttattacgc gatggactac tggggtcagg ggacaacagt caccgttagc 420
tccgtcgatt ccagcggggg aggtggctca ggcgggggtg gttctggggg gggcgggagc 480
acttcagata ttgtaatgac ccaaacccca ctgagtagtc cagtcacgct tggtcaaccg 540
gcaagcattt cttgcaggag ctctcagagt attgtccact ctaacgggaa tacatatttg 600
gagtggtatc agcaaagacc gggccaacca ccacgcctct tgatttataa ggtgagcaat 660
aggttttcag gcgtgccaga taggttctca ggctccggag cgggaaccga cttcaccctc 720
aagataagtc gggtggaagc cgaagacgta ggagtttact actgctttca aggatctcat 780
gttccacgaa cgtttggagg aggaaccaag gtggaaataa aaaaccggat ccgtggggtc 840
accgtctctt cagcgctgag caactccatc atgtacttca gccacttcgt gccggtcttc 900
ctgccagcga agcccaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc 960
gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg 1020
cacacgaggg ggctggaccc ctttgggttt tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg 1080
gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg 1140
agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc 1200
aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc cctcgagaga 1260
gtgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 1320
ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 1380
ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 1440
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 1500
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 1560
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 1599
<210> 172
<211> 1599
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 172
atggactttc aggtccaaat tttttccttc ttgctcatat ccgcgagtgt catcatgtca 60
agagcaagtc aagttcaact cgttcaatca ggagctgagg tgaaaaaacc aggggcgtct 120
gtcaaagtaa gctgcaaagc atcagggtat acgttcacga gttatcatat ccagtgggtt 180
aggcaggcgc cagggcaggg attggaatgg atgggtatct ggatttaccc gggtgacggc 240
agcactcaat acaatgagaa attcaaaggc gtaacaatga caagggacac gagcacaagc 300
acagtgtaca tggagcttag ctctttgagg tcagaggata ccgctgttta ctattgtgct 360
cgggagggta cttactatgc aatggactac tgggggcaag gcacgaccgt tacagtgagt 420
agcgtagatt cctccggggg tggcggttca ggcggcggag gctcaggcgg aggagggtca 480
acatccgatg tcgtaatgac tcagtcccct ctgtcattgc cggtgacttt gggacagcca 540
gcgtctatat cttgtaggtc ctctcaatca atagtgcatt ccaacggtaa cacctatctg 600
gaatggtatc agcaaaggcc aggacaaagt ccacgcctgc ttatatataa ggtgtctaat 660
cgattcagtg gggttcccga taggttttcc ggctctggta gcgggactga tttcacgttg 720
aaaatatcac gcgtggaagc ggaagatgtt ggggtctatt actgctttca gggtagtcat 780
gtccctcgaa cttttggcgg tggtacaaag gtagaaatca aaaaccggat ccgtggggtc 840
accgtctctt cagcgctgag caactccatc atgtacttca gccacttcgt gccggtcttc 900
ctgccagcga agcccaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc 960
gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg 1020
cacacgaggg ggctggaccc ctttgggttt tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg 1080
gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg 1140
agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc 1200
aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc cctcgagaga 1260
gtgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 1320
ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 1380
ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 1440
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 1500
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 1560
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 1599
<210> 173
<211> 1599
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 173
atggattttc aggtacagat attctcattt ctccttatct cagctagtgt cataatgtcc 60
agggcgagtc aagtacaact tgtccagtca ggcgcagagg tcaagaagcc gggcgcaagc 120
gttaaggttt cctgcaaagc atccggctat acattcacgt cctatcacat ccaatgggtc 180
aggcaagcac ccggtcaagg acttgagtgg atgggcatct ggatttaccc tggagatggc 240
agtactcagt acaacgaaaa attcaaaggt gtaaccatga cccgcgacac atctacttcc 300
acagtttata tggaactcag cagtttgcgg agcgaagata ccgctgttta ctactgtgcc 360
cgagagggaa cttactacgc catggactat tggggtcaag gaacgacagt aacagttagt 420
tctgtagatt ccagtggcgg cggtgggagc gggggtgggg gatctggcgg aggcggaagt 480
acaagtgaca tcgttatgac tcagacaccc cttagtagtc ccgttacgtt gggccaaccc 540
gcgagcattt cctttcgatc ctctcagtct atagttcact caaatgggaa tacttatttg 600
gagtggtatc aacagcgccc cggacaacca ccaaggctcc tgatatacaa ggtgtccaat 660
cgattctctg gggtgcctga tagatttagc ggaagtggag ccggtacaga ttttaccctg 720
aaaatatcac gggtagaagc cgaagatgtc ggcgtctact actgtttcca gggttcccat 780
gtaccgcgaa cgttcggggg cggaacaaaa gttgagatca agaaccggat ccgtggggtc 840
accgtctctt cagcgctgag caactccatc atgtacttca gccacttcgt gccggtcttc 900
ctgccagcga agcccaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc 960
gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg 1020
cacacgaggg ggctggaccc ctttgggttt tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg 1080
gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg 1140
agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc 1200
aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc cctcgagaga 1260
gtgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 1320
ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 1380
ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 1440
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 1500
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 1560
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 1599
<210> 174
<211> 1599
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 174
atggatttcc aggttcagat atttagtttc ctcttgattt ctgccagtgt catcatgagc 60
agggcttccc aagttcagtt ggtgcaaagt ggcgctgaag tcaaaaaacc tggggcttcc 120
gttaaagtat cttgcaaggc gtccggctac actttcacat cctaccacat tcaatgggtc 180
cggcaagcgc ccggtcaggg gctcgaatgg atggggtgga tatacccagg agatggatct 240
actcagtaca acgagaaatt taaaggacgg gtgacgatga cgcgcgacac ttcaataagc 300
actgcataca tggaactgtc ccggcttagg tcagatgaca ccgcggtcta ctattgtgcg 360
agagagggta cttactatgc tatggactac tgggggcaag gcacgacggt tacagtttcc 420
tcagtcgata gttcaggcgg aggcggctcc gggggcggtg gtagtggagg gggtggatct 480
acttccgaca ttgtcatgac ccagaccccg ttgagccttt cagtgacgcc cggtcaaccc 540
gccagcataa gttgtcgatc aagccagtct attgtacact ccaatggaaa cacatatttg 600
gagtggtatc tccaaaaacc cggccaaagc cctcaactgc tcatctacaa ggtctcaaac 660
aggtttagcg gggtcccgga tcgcttctca gggtcaggat ctggtacgga ctttacactg 720
aaaatttccc gagtcgaagc ggaagacgtg ggtgtatatt actgcttcca ggggagtcat 780
gttccaagaa cctttggggg aggtacaaag gtcgaaataa aaaaccggat ccgtggggtc 840
accgtctctt cagcgctgag caactccatc atgtacttca gccacttcgt gccggtcttc 900
ctgccagcga agcccaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc 960
gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg 1020
cacacgaggg ggctggaccc ctttgggttt tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg 1080
gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg 1140
agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc 1200
aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc cctcgagaga 1260
gtgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 1320
ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 1380
ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 1440
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 1500
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 1560
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 1599
<210> 175
<211> 1599
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 175
atggattttc aggtccaaat tttttccttc ttgcttatca gcgcaagtgt aatcatgtcc 60
cgcgcgtccc aagtacaact tgtgcaatct ggcgcggagg tgaaaaaacc tggagcttcc 120
gtcaaggttt cttgtaaggc ctctggctac accttcacgt cctaccacat tcagtgggtt 180
cgacaggcgc cgggccaagg actggagtgg atgggatgga tatatccagg agatggttct 240
actcagtata atgagaaatt caagggtcgc gtaacaatga cgagggatac atcaatctcc 300
accgcgtaca tggaactttc aagactccgg tcagatgaca cggcggttta ctactgtgct 360
cgggagggca cttactatgc tatggactac tgggggcaag ggacaacggt aacggtatct 420
agtgtggatt ctagtggcgg cggcggttca ggaggaggtg gttcaggcgg ggggggtagt 480
acaagtgata ttgtgatgac ccaaacaccc ctttctagcc ctgttactct gggtcaaccc 540
gcgtccataa gttgtcgaag tagtcaatcc atcgtgcata gcaacggcaa cacttacctt 600
gaatggtatc aacaacgacc cggacagccc ccgcgactgc ttatctataa agtatcaaac 660
aggttcagtg gcgtgccaga tcgattctcc ggctctgggg caggcacaga tttcacgttg 720
aaaatttctc gggtcgaggc cgaggacgtg ggcgtttatt actgtttcca ggggagtcac 780
gtccccagga cgttcggagg aggaactaaa gtcgaaataa agaaccggat ccgtggggtc 840
accgtctctt cagcgctgag caactccatc atgtacttca gccacttcgt gccggtcttc 900
ctgccagcga agcccaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc 960
gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg 1020
cacacgaggg ggctggaccc ctttgggttt tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg 1080
gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg 1140
agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc 1200
aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc cctcgagaga 1260
gtgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 1320
ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 1380
ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 1440
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 1500
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 1560
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 1599
<210> 176
<211> 1599
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 176
atggacttcc aggtccaaat attcagcttc ctcctcattt ccgccagtgt aataatgtcc 60
agagcctcac aagtacagtt ggttcagagc ggggctgagg ttaagaaacc aggcgcgagc 120
gtcaaggtat cctgcaaggc gagtggttat actttcacta gttatcacat tcagtgggtc 180
cgacaggccc ccggtcaagg cctggagtgg atggggtgga tatatccggg agatggttct 240
acccaatata atgagaagtt taaggggaga gtcacaatga caagggacac cagtattagc 300
accgcgtata tggagctttc ccgcctgcga tcagatgaca cggccgtgta ctactgtgct 360
agggagggaa cctattatgc gatggattac tggggacagg gtactacagt cacggtctct 420
agcgtggaca gttccggggg cggtggaagc ggtggtggcg gttcaggtgg aggaggctct 480
acgagtgatg ttgtgatgac tcagtccccg ctttcacttc ccgtcaccct tgggcaaccc 540
gcaagcatct catgccgatc ctcccagtct atagtacata gtaatggcaa cacatatctt 600
gaatggtatc agcagaggcc gggtcagtct ccccgactcc ttatatataa agtgagcaac 660
agattctccg gagtaccgga tagattttcc ggctctggga gcggcaccga ctttacactg 720
aaaatttcac gggttgaagc tgaagatgtt ggggtatact attgtttcca gggttctcac 780
gtcccgagga cattcggggg aggaacgaaa gtcgaaataa agaaccggat ccgtggggtc 840
accgtctctt cagcgctgag caactccatc atgtacttca gccacttcgt gccggtcttc 900
ctgccagcga agcccaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc 960
gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg 1020
cacacgaggg ggctggaccc ctttgggttt tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg 1080
gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg 1140
agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc 1200
aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc cctcgagaga 1260
gtgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 1320
ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 1380
ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 1440
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 1500
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 1560
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 1599
<210> 177
<211> 1599
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 177
atggattttc aggtacaaat cttcagcttc ctgctcatct ccgcgagcgt aatcatgtct 60
agggcgtccc aggtgcagtt ggtgcaatca ggtgcagagg tgaagaagcc tggtgcatcc 120
gttaaagtaa gttgtaaggc aagcggatat acttttacat cctatcatat tcaatgggtc 180
agacaagcac ctggacaggg tcttgagtgg atgggctgga tctatccagg cgatggctca 240
actcaatata acgagaagtt caaggggagg gttactatga ccagggatac gtctatttcc 300
actgcgtaca tggaactctc caggttgaga agtgatgata ccgcggttta ctactgcgct 360
agagaaggaa cgtactacgc tatggattac tgggggcagg gtacaactgt caccgtctca 420
agtgtggatt cttctggggg tgggggatca ggagggggag gctccggtgg gggcgggtca 480
accagcgaca ttgtcatgac tcaaaccccc ctgagcagcc ctgtcaccct gggtcagcct 540
gcctcaatat cctttagaag ctcccaaagc atcgtccatt caaatggtaa tacctatctg 600
gagtggtatc agcaaaggcc tggtcaaccc ccgcgccttc tcatttacaa ggtgtcaaac 660
aggttctccg gcgtaccgga taggttttcc ggaagcggtg ctggaaccga ctttactctc 720
aaaatctcta gggtggaagc tgaggacgtc ggtgtatact attgttttca aggctcccat 780
gttcccagga catttggtgg gggaacgaag gtagaaatca agaaccggat ccgtggggtc 840
accgtctctt cagcgctgag caactccatc atgtacttca gccacttcgt gccggtcttc 900
ctgccagcga agcccaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc 960
gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg 1020
cacacgaggg ggctggaccc ctttgggttt tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg 1080
gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg 1140
agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc 1200
aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc cctcgagaga 1260
gtgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 1320
ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 1380
ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 1440
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 1500
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 1560
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 1599
<210> 178
<211> 1599
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 178
atggactttc aggttcagat tttctctttc ttgttgatct ccgctagtgt cataatgtca 60
cgggcaagtc aggtacaact cgttcagagt ggtgccgaag tgaagaaacc gggtgcctcc 120
gtaaaggtgt catgtaaagc tagtggctat acattcacaa gttatcatat ccaatgggta 180
cgacaagcac cgggacagcg actggaatgg atgggatgga tctatcctgg ggacggatct 240
acacagtaca atgagaaatt taagggacgg gtcacgataa ccagggacac atctgcttcc 300
acggcttaca tggagctttc ctccctgcgg agcgaggaca tggctgttta ctattgcgct 360
cgcgaaggga catactacgc aatggattat tggggccaag gcactaccgt gacggtctct 420
tctgtcgata gttccggagg aggtggttca gggggaggcg gttcaggtgg gggtggatct 480
acctcagata ttgtcatgac acagacacct ttgtccttga gtgtgacacc gggtcaaccg 540
gcgagtataa gctgtcgcag ctcacaatct attgtgcata gcaacgggaa tacatatctc 600
gaatggtatc tccaaaagcc gggccaatcc ccccaacttc tcatttacaa agtttctaat 660
cgattttcag gtgtaccaga tcggttttcc gggtctggct caggtactga cttcaccttg 720
aaaatatcaa gggttgaagc tgaggatgta ggtgtgtact attgcttcca ggggtctcac 780
gttcctcgga cttttggggg gggcacaaaa gtagagatta aaaaccggat ccgtggggtc 840
accgtctctt cagcgctgag caactccatc atgtacttca gccacttcgt gccggtcttc 900
ctgccagcga agcccaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc 960
gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg 1020
cacacgaggg ggctggaccc ctttgggttt tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg 1080
gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg 1140
agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc 1200
aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc cctcgagaga 1260
gtgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 1320
ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 1380
ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 1440
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 1500
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 1560
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 1599
<210> 179
<211> 1599
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 179
atggatttcc aggtgcaaat cttctcattt cttttgataa gtgcgtcagt gataatgtct 60
cgggccagtc aagtacagct tgtccaaagt ggcgctgaag tcaagaagcc gggagcctca 120
gttaaggtta gctgcaaggc ctcagggtat acttttacct cctatcatat acagtgggta 180
cgacaagcac cgggacagcg actggagtgg atgggttgga tatatccggg agatggttca 240
acccagtata atgagaagtt caaggggcga gttacgataa cccgcgatac gagtgcatca 300
acagcgtaca tggagttgag ttccctccgc agcgaggaca tggcggtata ctattgtgcc 360
agggagggga cttattatgc catggactac tgggggcagg gcacaaccgt aacagtctct 420
tctgtagaca gttcaggagg gggcggaagt ggaggtggcg gatctggtgg aggtggatct 480
acttccgaca tcgttatgac ccaaacacca ctttcatctc ccgttactct cgggcaacct 540
gctagtattt cctgtagatc ctcacaatct atagtacata gcaatggcaa tacctacctg 600
gagtggtatc aacaacgccc aggccaacca cctcgcctgc ttatctataa agtaagcaat 660
agattcagtg gtgtaccgga taggttctct ggttccggag caggaactga ctttacactc 720
aaaatcagta gggtggaggc ggaagacgtg ggagtatatt attgctttca aggttcacat 780
gtacctcgaa catttggcgg aggaactaag gttgagatta aaaaccggat ccgtggggtc 840
accgtctctt cagcgctgag caactccatc atgtacttca gccacttcgt gccggtcttc 900
ctgccagcga agcccaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc 960
gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg 1020
cacacgaggg ggctggaccc ctttgggttt tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg 1080
gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg 1140
agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc 1200
aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc cctcgagaga 1260
gtgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 1320
ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 1380
ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 1440
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 1500
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 1560
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 1599
<210> 180
<211> 1599
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 180
atggatttcc aagtccagat attcagtttt cttttgataa gcgcttctgt aatcatgtct 60
cgggcgtccc aagtacaact ggtgcaatca ggggcagaag tgaaaaaacc aggtgcatcc 120
gttaaggtga gttgcaaggc ttccggctat acctttacat catatcatat tcaatgggtc 180
aggcaagcac ctggtcagcg attggaatgg atgggttgga tatatcctgg tgatgggtct 240
acacaatata acgaaaaatt caaggggcga gtgaccatca caagagatac atcagcgtca 300
acagcgtata tggaactgtc atcccttaga tcagaggaca tggcggtcta ttactgtgcc 360
agagaaggca cttattatgc aatggattat tggggacaag gaaccactgt cactgtttcc 420
agcgtagact cctccggtgg tggtggaagt ggcggcggtg ggtcaggagg gggtgggtca 480
acttctgatg tagtgatgac acagagccct ctgagcttgc ctgtgacctt gggtcagccg 540
gcctcaataa gttgtcgatc tagtcagtca atcgtccata gtaatgggaa cacatacctt 600
gaatggtatc agcaaagacc tggacaatct ccacgactcc ttatatacaa agttagcaac 660
cgatttagcg gagtgccaga ccgcttttct ggttccgggt ctggcacaga ttttaccctt 720
aagatctccc gcgtggaggc ggaagacgtt ggtgtttact attgcttcca ggggtcacac 780
gttccacgca cctttggagg aggtacgaag gtcgagatta agaaccggat ccgtggggtc 840
accgtctctt cagcgctgag caactccatc atgtacttca gccacttcgt gccggtcttc 900
ctgccagcga agcccaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc 960
gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg 1020
cacacgaggg ggctggaccc ctttgggttt tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg 1080
gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg 1140
agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc 1200
aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc cctcgagaga 1260
gtgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 1320
ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 1380
ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 1440
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 1500
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 1560
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 1599
<210> 181
<211> 1599
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 181
atggattttc aagtacagat cttctctttc ttgcttattt cagcgagcgt aatcatgagt 60
agggcatctc aagttcaact cgttcagtca ggtgctgagg taaaaaaacc aggggcttcc 120
gttaaagtta gctgtaaggc atctgggtac acatttacta gctaccatat ccagtgggtg 180
cgacaagccc cggggcagcg cttggaatgg atgggctgga tttacccagg tgacggctcc 240
acgcaatata atgagaaatt taagggtaga gttactatta ccagggacac aagtgcttca 300
actgcctata tggaactgag cagccttcgg agtgaagata tggccgtata ttactgcgca 360
agggagggga cttactatgc aatggactac tggggtcagg gaacgactgt gaccgtgtcc 420
tcagttgact ccagcggtgg tggcggctct ggaggtgggg gttccggcgg aggcggaagc 480
acatctgata tagtgatgac gcaaacgcct ctttcttccc cggtaactct gggacagcca 540
gcgtcaattt catttaggtc ctcccagtca atcgtacata gtaatggaaa tacttacctg 600
gaatggtatc aacaacgacc agggcaaccg ccccgattgt tgatctataa agtgagcaat 660
cgcttttctg gcgtgcccga tcggttctca gggtctggag ctgggactga cttcacattg 720
aaaatttcca gggttgaggc cgaggatgtg ggggtttatt actgcttcca aggctcccac 780
gtcccccgca ccttcggagg gggaaccaaa gtcgaaataa agaaccggat ccgtggggtc 840
accgtctctt cagcgctgag caactccatc atgtacttca gccacttcgt gccggtcttc 900
ctgccagcga agcccaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc 960
gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg 1020
cacacgaggg ggctggaccc ctttgggttt tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg 1080
gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg 1140
agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc 1200
aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc cctcgagaga 1260
gtgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 1320
ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 1380
ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 1440
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 1500
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 1560
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 1599
<210> 182
<211> 1599
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 182
atggattttc aagttcagat attctcattt ttgcttatat cagcctccgt aattatgtca 60
cgggcaagtc aagttcagtt ggtgcagtcc ggagcagaag ttaagaagcc cggtgcttct 120
gtgaaagtct cctgcaaagc gtctgggtac accttcacga gctaccatat acagtgggtc 180
cggcaagcgc ctgggcagag gctggagtgg atgggctgga tttacccagg agatgggagt 240
acaaagtata gtcagaagtt tcaagggcga gtgacgataa ccagagatac gagtgcaagt 300
actgcataca tggaactgag ctccttgagg tccgaggata cagcggtgta ctattgcgct 360
cgggaaggga catattatgc tatggactat tggggacaag ggacaacggt aacggtgagt 420
tccgtcgatt cctcaggtgg cggaggcagt gggggcgggg gttccggcgg tggcgggtcc 480
acgagtgata tagttatgac acagaccccc ctcagccttt ctgtgacccc aggacaaccc 540
gctagtatct cttgccgcag ttctcagtcc atagtacaca gtaacggaaa tacctatctt 600
gagtggtatc ttcaaaagcc cggccagagc cctcaactct tgatatataa agtgtcaaat 660
cgattttcag gtgtgcctga tcgattctca gggtctggtt cagggacaga tttcacgctt 720
aagataagca gagtagaggc tgaagacgtg ggagtctact attgttttca ggggtcacac 780
gttccccgca cttttggtgg gggaaccaag gtggaaatca aaaaccggat ccgtggggtc 840
accgtctctt cagcgctgag caactccatc atgtacttca gccacttcgt gccggtcttc 900
ctgccagcga agcccaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc 960
gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg 1020
cacacgaggg ggctggaccc ctttgggttt tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg 1080
gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg 1140
agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc 1200
aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc cctcgagaga 1260
gtgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 1320
ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 1380
ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 1440
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 1500
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 1560
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 1599
<210> 183
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 183
Ser Tyr His Ile Gln
1 5
<210> 184
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 184
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
1 5
<210> 185
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 185
Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 186
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 186
Tyr Pro Gly Asp Gly Ser
1 5
<210> 187
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 187
Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 188
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 188
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 189
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 189
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 190
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 190
Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr
1 5
<210> 191
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 191
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Leu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 192
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 192
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 193
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 193
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Leu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Asp Val Leu Met Thr
130 135 140
Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Val Ser Ile
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245 250
<210> 194
<211> 521
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 194
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Leu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Asp Val Leu Met Thr
130 135 140
Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Val Ser Ile
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
165 170 175
Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Leu Glu Gln Lys Leu
245 250 255
Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Arg Ile Arg Gly Val Thr Val Ser Ser
260 265 270
Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val Phe
275 280 285
Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro
290 295 300
Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys
305 310 315 320
Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Pro Phe
325 330 335
Gly Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser
340 345 350
Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg
355 360 365
Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro
370 375 380
Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe
385 390 395 400
Ala Ala Tyr Arg Ser Leu Glu Arg Val Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
405 410 415
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
420 425 430
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
435 440 445
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
450 455 460
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
465 470 475 480
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
485 490 495
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
500 505 510
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
515 520
<210> 195
<211> 544
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 195
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Ala Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro
20 25 30
Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser
35 40 45
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr His Ile Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro
50 55 60
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser
65 70 75 80
Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp
85 90 95
Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Leu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu
100 105 110
Asp Ser Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
Thr Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser
165 170 175
Leu Gly Asp Gln Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val
180 185 190
His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly
195 200 205
Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly
210 215 220
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
225 230 235 240
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe
245 250 255
Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
260 265 270
Ile Lys Leu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Arg Ile
275 280 285
Arg Gly Val Thr Val Ser Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe
290 295 300
Ser His Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro
305 310 315 320
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
325 330 335
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
340 345 350
Thr Arg Gly Leu Asp Pro Phe Gly Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly
355 360 365
Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile
370 375 380
Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met
385 390 395 400
Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro
405 410 415
Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Leu Glu Arg Val
420 425 430
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
435 440 445
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
450 455 460
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
465 470 475 480
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
485 490 495
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
500 505 510
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
515 520 525
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
530 535 540
<210> 196
<211> 1635
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 196
atggacttcc aggtgcagat cttcagcttc ctgctgatca gcgccagcgt gatcatgagc 60
cgcgctagcc aggtgcagct gcagcagagc ggccccgagc tggtgaagcc cggcgccagc 120
gtgaagatga gctgcaaggc cagcggctac accttcacca gctaccacat ccagtgggtg 180
aagcagcgcc ccggccaggg cctggagtgg atcggctgga tctaccccgg cgacggcagc 240
acccagtaca acgagaagtt caagggcaag accaccctga ccgccgacaa gagcagcagc 300
accgcctaca tgctgctgag cagcctgacc agcgaggaca gcgccatcta cttctgcgcc 360
cgcgagggca cctactacgc catggactac tggggccagg gcaccagcgt gaccgtgagc 420
agcgtcgaca gcagcggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc 480
actagtgacg tgctgatgac ccagaccccc ctgagcctgc ccgtgagcct gggcgaccag 540
gtgagcatca gctgccgcag cagccagagc atcgtgcaca gcaacggcaa cacctacctg 600
gagtggtacc tgcagaagcc cggccagagc cccaagctgc tgatctacaa ggtgagcaac 660
cgcttcagcg gcgtgcccga ccgcttcagc ggcagcggca gcggcaccga cttcaccctg 720
aagatcagcc gcgtggaggc cgaggacctg ggcgtgtact actgcttcca gggcagccac 780
gtgccccgca ccttcggcgg cggcaccaag ctggagatca agctcgagca gaagctgatc 840
agcgaggagg acctgaaccg gatccgtggg gtcaccgtct cttcagcgct gagcaactcc 900
atcatgtact tcagccactt cgtgccggtc ttcctgccag cgaagcccac cacgacgcca 960
gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca 1020
gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca gtgcacacga gggggctgga cccctttggg 1080
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 1140
gcctttatta ttttctgggt gaggagtaag aggagcaggc tcctgcacag tgactacatg 1200
aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc cgcaagcatt accagcccta tgccccacca 1260
cgcgacttcg cagcctatcg ctccctcgag agagtgagag tgaagttcag caggagcgca 1320
gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac cagctctata acgagctcaa tctaggacga 1380
agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga cgtggccggg accctgagat ggggggaaag 1440
ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg 1500
gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc 1560
ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag gacacctacg acgcccttca catgcaggcc 1620
ctgccccctc gctaa 1635
<210> 197
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 197
ttttctagac gcgtgccacc atggccgtca tggcgcc 37
<210> 198
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 198
aagtcgacgc tagctcacac tttacaagct gtgagagaca 40
<210> 199
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 199
tcaacccgat tgtccaccat 20
<210> 200
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 200
gagtttagtc cgaaatgagg ctg 23
<210> 201
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 201
tccaaagatg tagccgcccc a 21
<210> 202
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 202
ccagtgcctc tttgctgctt tca 23
<210> 203
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 203
ctgagctcgc cagtgaaatg atg 23
<210> 204
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 204
tgctgtagtg gtggtcggag a 21
<210> 205
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 205
acctgcctta agagtggagc ca 22
<210> 206
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 206
acatgtcgca cgtctctgat ga 22
<210> 207
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 207
tgcccagagc atccaaaaga 20
<210> 208
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 208
tgtattgctt tgcgttggac 20
<210> 209
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 209
aggcgctccc caagaagaca 20
<210> 210
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 210
gggctgatta gagagaggtc cct 23
<210> 211
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 211
caagacggac cagagcgaaa 20
<210> 212
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 212
ggcgggtcat gggaataac 19
<210> 213
<211> 468
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 213
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu
130 135 140
Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln
145 150 155 160
Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln
165 170 175
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg
180 185 190
Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
195 200 205
Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr
210 215 220
Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr
225 230 235 240
Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
245 250 255
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
260 265 270
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
275 280 285
Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val
290 295 300
Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Ser Lys Arg Ser
305 310 315 320
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
325 330 335
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
340 345 350
Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
355 360 365
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
370 375 380
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
385 390 395 400
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
405 410 415
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
420 425 430
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
435 440 445
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
450 455 460
Leu Pro Pro Arg
465
<210> 214
<211> 1470
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 214
atggctctgc ctgtgacagc tctgctgctg cctctggctc tgcttcttca tgccgccaga 60
ccatctcagg tccagctagt acaaagcggc gccgaagtaa agaaacctgg tgcctctgtg 120
aaggtgagct gcaaggccag cggctacacc ttcaccagct accacatcca gtgggttcga 180
caggcccctg gacagagact agagtggatg ggctggatct atcctggcga cggcagcacc 240
cagtacaacg agaagttcaa gggcagagtt accatcaccc gagacaccag cgccagcaca 300
gcctatatgg agctgagcag cctgcgaagc gaggacacag ctgtttacta ttgtgccaga 360
gagggcacct actacgcaat ggattattgg ggccagggga ccaccgtgac cgtttcttct 420
ggaggcggag gttctggcgg cggaggaagt ggtggcggag gctcagatat tgtaatgacc 480
cagacacctc tgtccctgtc tgtgacacct ggacagcctg caagcatcag ctgtcggagc 540
agccagagca tcgttcacag caacggcaac acctacctgg aatggtatct gcagaagccc 600
ggacagtccc cccagctgct gatctacaag gtgtccaacc gcttcagtgg agtacccgat 660
agattttctg gcagcggctc tggcaccgac ttcaccctga agatctccag agtagaagca 720
gaggacgttg gagtgtacta ctgcttccaa ggcagccatg tgccaagaac ctttggtgga 780
ggcacaaagg tggaaatcaa gcggacaaca acacctgctc ctcggcctcc tacaccagct 840
cctacaattg ccagccagcc actgtctctg aggcccgaag cttgcaggcc tgctgctggc 900
ggagccgtgc atacaagagg actggatttc gcctgcgaca tctacatctg ggcacctctg 960
gctggaacct gtggcgtgct gctgctgagc ctggtcatca ccctgtattg ccggagcaag 1020
agaagcagac tgctgcacag cgactacatg aacatgaccc ctagacggcc cggacctacc 1080
agaaagcact accagcctta cgctcctcct agagacttcg ccgcctacag atccagagtg 1140
aagttcagca gatccgccga cgctcctgcc tatcagcagg gccaaaacca gctctacaac 1200
gagctgaacc tggggagaag agaagagtac gacgtgctgg acaagcggag aggcagagat 1260
cctgaaatgg gcggcaagcc cagacggaag aatcctcaag agggcctgta taatgagcta 1320
cagaaagaca agatggcaga ggcctacagc gagatcggaa tgaagggcga gcgcagaaga 1380
ggcaagggac acgatggact gtaccagggc ctgagcaccg ccaccaagga tacctatgat 1440
gccctgcaca tgcaggccct gcctccaaga 1470
<210> 215
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 215
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 216
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 216
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 217
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 217
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
<210> 218
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 218
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
35 40 45
<210> 219
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 219
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 220
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 220
acaacaacac ctgctcctcg gcctcctaca ccagctccta caattgccag ccagccactg 60
tctctgaggc ccgaagcttg caggcctgct gctggcggag ccgtgcatac aagaggactg 120
gatttcgcct gcgac 135
<210> 221
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 221
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 222
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 222
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60
accctttact gc 72
<210> 223
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 223
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 224
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的序列
<400> 224
atctacatct gggcacctct ggctggaacc tgtggcgtgc tgctgctgag cctggtcatc 60
accctgtatt gc 72

Claims (62)

1.一种人源化的抗HLA-A2抗体，其中所述抗体能够构成嵌合抗原受体(CAR)的抗原结合结构域，其中所述CAR能够在人细胞中表达，使得所述CAR特异性结合HLA-A2。
2.如权利要求1所述的人源化的抗HLA-A2抗体，其中所述抗体与包含以下的抗体竞争结合HLA-A2：
具有SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)；
具有SEQ ID NO：185的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)；
具有SEQ ID NO：187的氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)；
具有SEQ ID NO：188的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)；
具有SEQ ID NO：189的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)；以及
具有SEQ ID NO：190的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)。
3.一种人源化的抗HLA-A2抗体，其中所述抗体与包含以下的抗体竞争结合HLA-A2：
具有SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)；
具有SEQ ID NO：185的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)；
具有SEQ ID NO：187的氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)；
具有SEQ ID NO：188的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)；
具有SEQ ID NO：189的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)；以及
具有SEQ ID NO：190的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)。
4.如权利要求1至3中任一项所述的人源化的抗HLA-A2抗体，其中所述抗体与包含以下的抗体结合相同的HLA-A2表位：
具有SEQ ID NO：183的氨基酸序列的重链互补决定区1(HCDR1)；
具有SEQ ID NO：185的氨基酸序列的重链互补决定区2(HCDR2)；
具有SEQ ID NO：187的氨基酸序列的重链互补决定区3(HCDR3)；
具有SEQ ID NO：188的氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCDR1)；
具有SEQ ID NO：189的氨基酸序列的轻链互补决定区2(LCDR2)；以及
具有SEQ ID NO：190的氨基酸序列的轻链互补决定区3(LCDR3)。
5.如权利要求1至4中任一项所述的人源化的抗HLA-A2抗体，其中与BB7.2抗体相比，所述抗体对选自HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30中的一种或多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。
6.如权利要求1至4中任一项所述的人源化的抗HLA-A2抗体，其中与BB7.2 scFv相比，所述抗体对选自HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30中的一种或多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。
7.如权利要求1至6中任一项所述的人源化的抗HLA-A2抗体，其中所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含选自下组的氨基酸序列：SYHIQ(SEQ ID NO：1)和GYTFTSY(SEQID NO：2)。
8.如权利要求1至7中任一项所述的人源化的抗HLA-A2抗体，其中所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含选自下组的氨基酸序列：YPGDGS(SEQ ID NO:4)和WIYPGDGSTX10YX12X13KFX16G(SEQ ID NO:10)，其中X10是Q或K，X12是N或S，X13是E或Q，并且X16是K或Q。
9.如权利要求8所述的人源化的抗HLA-A2抗体，其中所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含选自下组的氨基酸序列：WIYPGDGSTQYNEKFKG(SEQ ID NO:3)和YPGDGS(SEQID NO:4)。
10.如权利要求8所述的人源化的抗HLA-A2抗体，其中所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含以下氨基酸序列：WIYPGDGSTKYSQKFQG(SEQ ID NO:5)。
11.如权利要求1至10中任一项所述的人源化的抗HLA-A2抗体，其中所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含以下氨基酸序列：EGTYYAMDY(SEQ ID NO:6)。
12.如权利要求1至11中任一项所述的人源化的抗HLA-A2抗体，其中所述抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含以下氨基酸序列：RSSQSIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO:7)。
13.如权利要求1至12中任一项所述的人源化的抗HLA-A2抗体，其中所述抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含以下氨基酸序列：KVSNRFS(SEQ ID NO:8)。
14.如权利要求1至13中任一项所述的人源化的抗HLA-A2抗体，其中所述抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含以下氨基酸序列：FQGSHVPRT(SEQ ID NO:9)。
15.如权利要求1至14中任一项所述的人源化的抗HLA-A2抗体，其中所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含含有选自下组的氨基酸序列的框架区1(VH FR1)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS(SEQ ID NO:11)和
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT(SEQ ID NO:12)。
16.如权利要求1至15中任一项所述的人源化的抗HLA-A2抗体，其中所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含含有选自下组的氨基酸序列的框架区2(VH FR2)：
WVRQAPGQX9LEWMGX15(SEQ ID NO:13)，
WVRQAPGQX9LEWMGX15WI(SEQ ID NO:17)，
HIQWVRQAPGQX12LEWMGX18WI(SEQ ID NO:21)，和
HIQWVRQAPGQX12LEWMGX18(SEQ ID NO:25)，其中：
在SEQ ID NO:13中，X9是R或G并且X15是I或不存在；
在SEQ ID NO:17中，X9是R或G并且X15是I或不存在；
在SEQ ID NO:21中，X12是R或G并且X18是I或不存在；并且
在SEQ ID NO:25中，X12是R或G并且X18是I或不存在。
17.如权利要求1至16中任一项所述的人源化的抗HLA-A2抗体，其中所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含含有选自下组的氨基酸序列的框架区3(VH FR3)：
X1VTX4TX6DTSX10STAYMX16LSX19LRSX23DX25AVYYCAR(SEQ ID NO:29)，
TX2YX4X5KFX8GX10VTX13TX15DTSX19STAYMX25LSX28LRSX32DX34AVY YCAR(SEQ ID NO:35)，
TQYNEKFKGX10VTX13TX15DTSX19STAYMX25LSX28LRSX32DX34AVYYC AR(SEQ ID NO:36)，和
TKYSQKFQGX10VTX13TX15DTSX19STAYMX25LSX28LRSX32DX34AVYYC AR(SEQ ID NO:37)，其中：
在SEQ ID NO:29中，X1是R或不存在，X4是I或M，X6是R或A，X10是A、T或I，X16是E或L，X19是S或R，X23是E或D，并且X25是T或M；
在SEQ ID NO:35中，X2是Q或K，X4是N或S，X5是E或Q，X8是K或Q，X10是R或不存在，X13是I或M，X15是R或A，X19是A、T或I，X25是E或L，X28是S或R，X32是E或D，并且X34是T或M；
在SEQ ID NO:36中，X10是R或不存在，X13是I或M，X15是R或A，X19是A、T或I，X25是E或L，X28是S或R，X32是E或D，并且X34是T或M；并且
在SEQ ID NO:37中，X10是R或不存在，X13是I或M，X15是R或A，X19是A、T或I，X25是E或L，X28是S或R，X32是E或D，并且X34是T或M。
18.如权利要求1至17中任一项所述的人源化的抗HLA-A2抗体，其中所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含含有以下氨基酸序列的框架区4(VH FR4)：WGQGTTVTVSS(SEQID NO:44)。
19.如权利要求1至6中任一项所述的人源化的抗HLA-A2抗体，其中所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：61-66。
20.如权利要求1至19中任一项所述的人源化的抗HLA-A2抗体，其中所述抗体包含含有框架区1(VL FR1)的轻链可变区，所述框架区1包含以下氨基酸序列：DX2VMTQX7PLSX11X12VTX15GQPASISX23(SEQ ID NO:46)，其中X2是V或I，X7是S或T，X11是L或S，X12是P或S，X15是L或P，并且X23是C或F。
21.如权利要求1至20中任一项所述的人源化的抗HLA-A2抗体，其中所述抗体包含含有框架区2(VL FR2)的轻链可变区，所述框架区2包含以下氨基酸序列：WX2X3QX5PGQX9PX11X12LIY(SEQ ID NO:51)，其中X2是F或Y，X3是Q或L，X5是R或K，X9是S或P，X11是R或Q，并且X12是R或L。
22.如权利要求1至21中任一项所述的人源化的抗HLA-A2抗体，其中所述抗体包含含有框架区3(VL FR3)的轻链可变区，所述框架区3包含以下氨基酸序列：GVPDRFSGSGX11GTDFTLKISRVEAEDVGVYYC(SEQ ID NO:56)，其中X11是S或A。
23.如权利要求1至22中任一项所述的人源化的抗HLA-A2抗体，其中所述抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含含有以下氨基酸序列的框架区4(VL FR4)：FGGGTKVEIK(SEQID NO:59)。
24.如权利要求1至6及19中任一项所述的人源化的抗HLA-A2抗体，其中所述抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:67-71。
25.如权利要求1至24中任一项所述的人源化的抗HLA-A2抗体，其中所述抗体是scFv。
26.如权利要求1至6中任一项所述的人源化的抗HLA-A2抗体，其中所述抗体是包含选自下组的氨基酸序列的scFv：SEQ ID NO:72-91。
27.如权利要求1至26中任一项所述的人源化的抗HLA-A2抗体，其中所述人细胞是免疫细胞。
28.如权利要求1至27中任一项所述的人源化的抗HLA-A2抗体，其中所述抗体能够构成嵌合抗原受体(CAR)的抗原结合结构域，其中所述CAR能够在调节性T细胞(Treg)中表达，使得所述CAR特异性结合HLA-A2。
29.如权利要求1至27中任一项所述的人源化的抗HLA-A2抗体，其中所述抗体能够构成嵌合抗原受体(CAR)的抗原结合结构域，其中所述CAR能够在免疫细胞中表达，使得所述免疫细胞被HLA-A2活化。
30.如权利要求29所述的人源化的抗HLA-A2抗体，其中所述免疫细胞是调节性T细胞(Treg)。
31.一种核酸，其编码如权利要求1至30中任一项所述的人源化的抗HLA-A2抗体。
32.一种表达载体，其包含权利要求31所述的核酸。
33.一种宿主细胞，其包含权利要求32所述的表达载体。
34.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含：
(i)胞外结构域，其包含权利要求1至30中任一项所述的人源化的抗HLA-A2抗体；
(ii)跨膜结构域；以及
(iii)包含胞内信号传导结构域的胞质结构域；
其中所述CAR能够在免疫细胞中表达，使得所述CAR特异性结合HLA-A2。
35.如权利要求34所述的CAR，其中与包含BB7.2抗体的CAR相比，所述CAR对选自HLA-A*25、HLA-A*29、HLA-A*30中的一种或多种的至少一种HLA-A亚型具有较低的反应性。
36.如权利要求34或35所述的CAR，其中所述CAR能够在免疫细胞中表达，使得所述免疫细胞被HLA-A2活化。
37.如权利要求34至36中任一项所述的CAR，其中所述免疫细胞是调节性T细胞(Treg)。
38.如权利要求34到37中任一项所述的CAR，其进一步包含铰链区。
39.如权利要求38所述的CAR，其中所述铰链区包含CD8α的茎区。
40.如权利要求34至39中任一项所述的CAR，其中所述跨膜结构域包含选自下组的蛋白的跨膜结构域：CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、T细胞受体的α链、T细胞受体的β链、T细胞受体的γ链、T细胞受体的δ链、CD28、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154，及其任意组合。
41.如权利要求40所述的CAR，其中所述跨膜结构域包含CD28的跨膜结构域。
42.如权利要求34至41中任一项所述的CAR，其中所述胞内信号传导结构域包含选自下组的蛋白的功能性信号传导结构域：CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、FcRγ、FcRα、FcRε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d，及其任意组合。
43.如权利要求42所述的CAR，其中所述胞内信号传导结构域包含CD3ζ的功能性信号传导结构域。
44.如权利要求34至43中任一项所述的CAR，其中所述胞内信号传导结构域还包含共刺激结构域。
45.如权利要求44所述的CAR，其中所述共刺激结构域包含选下组的蛋白的功能性信号传导结构域：OX40、CD27、CD28、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)(CD11a/CD18)、TNFR1(CD120a/TNFRSF1A)、TNFR2(CD120b/TNFRSF1B)、CTLA-4(CD152)、CD95、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、CD2、CD30、CD40、PD-1、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、ICAM-1、与CD83特异性结合的配体、IL2ra(CD25)、IL6Ra(CD126)、IL-7Ra(CD127)、IL-13RA1、IL-13RA2、IL-33R(IL1RL1)、IL-10RA、IL-10RB、IL-4R、IL-5R(CSF2RB)、ARHR、BAFF受体、IL-21R、TGFbR1、TGFbR2、TGFbR3、共用γ链，及其任意组合。
46.如权利要求44或45所述的CAR，其中所述共刺激结构域包含选自CD28和4-1BB的蛋白的功能性信号传导结构域。
47.如权利要求46所述的CAR，其中所述共刺激结构域包含CD28的功能性信号传导结构域。
48.一种修饰的免疫细胞，其包含权利要求34至47中任一项所述的CAR。
49.如权利要求48所述的修饰的免疫细胞，其中所述修饰的免疫细胞是调节性T细胞(Treg)。
50.一种核酸，其编码权利要求34至47中任一项所述的CAR。
51.一种表达载体，其包含权利要求50所述的核酸。
52.一种免疫细胞，其包含权利要求51所述的表达载体。
53.如权利要求52所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是调节性T细胞(Treg)。
54.一种药物组合物，其包含多个权利要求48或49所述的修饰的免疫细胞。
55.一种药物组合物，其包含多个权利要求52或53所述的免疫细胞。
56.一种制备权利要求48或49所述的修饰的免疫细胞的方法，其包括用权利要求51所述的表达载体转导免疫细胞，从而产生所述修饰的免疫细胞。
57.一种促进受试者的免疫耐受的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求54或55所述的药物组合物。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述免疫耐受是对移植的器官或组织的耐受。
59.一种预防或治疗受试者的移植物抗宿主病(GVHD)的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求54或55所述的药物组合物。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述受试者正在经历或已经经历造血干细胞移植。
61.一种预防或治疗受试者的器官或组织移植排斥的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求54或55所述的药物组合物。
62.如权利要求57至61中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
CN201880074705.4A 2017-09-19 2018-09-19 抗-hla-a2抗体及其使用方法 Active CN111448215B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762560574P 2017-09-19 2017-09-19
US62/560,574 2017-09-19
US201862692386P 2018-06-29 2018-06-29
US62/692,386 2018-06-29
PCT/CA2018/051167 WO2019056099A1 (en) 2017-09-19 2018-09-19 ANTI-HLA-A2 ANTIBODIES AND METHODS OF USE

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111448215A true CN111448215A (zh) 2020-07-24
CN111448215B CN111448215B (zh) 2024-01-16

Family

ID=65809516

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880074705.4A Active CN111448215B (zh) 2017-09-19 2018-09-19 抗-hla-a2抗体及其使用方法

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20200283529A1 (zh)
EP (1) EP3684821A4 (zh)
JP (2) JP7281774B2 (zh)
KR (1) KR20200067845A (zh)
CN (1) CN111448215B (zh)
AU (1) AU2018338418A1 (zh)
BR (1) BR112020005361A2 (zh)
CA (1) CA3076261A1 (zh)
IL (1) IL273402A (zh)
MX (1) MX2020003046A (zh)
SG (1) SG11202002520UA (zh)
WO (1) WO2019056099A1 (zh)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3600355A4 (en) 2017-03-28 2020-12-16 The Trustees of the University of Pennsylvania METHODS OF PROTECTING GRAFT TISSUE AGAINST REJECTION
JP7317023B2 (ja) 2017-09-20 2023-07-28 ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア 新規抗ｈｌａ－ａ２抗体、およびその使用
AU2019250692A1 (en) * 2018-04-13 2020-11-05 Sangamo Therapeutics France Chimeric antigen receptor specific for Interleukin-23 receptor
BR112021002579A2 (pt) 2018-08-10 2021-05-11 Sangamo Therapeutics France novas construções de car compreendendo os domínios de tnfr2
WO2021028359A1 (en) 2019-08-09 2021-02-18 Sangamo Therapeutics France Controlled expression of chimeric antigen receptors in t cells
WO2021030149A1 (en) * 2019-08-09 2021-02-18 A2 Biotherapeutics, Inc. Cell-surface receptors responsive to loss of heterozygosity
EP4073103A1 (en) 2019-12-11 2022-10-19 A2 Biotherapeutics, Inc. Lilrb1-based chimeric antigen receptor
CN112852748B (zh) * 2020-04-16 2023-11-21 成都仕康美生物科技有限公司 靶向HLA-A的嵌合抗原受体、编码基因、CAR-Tregs细胞及其制备方法、用途
CA3188862A1 (en) 2020-08-20 2022-02-24 Carl Alexander Kamb Compositions and methods for treating mesothelin positive cancers
JP2023538116A (ja) 2020-08-20 2023-09-06 エー２ バイオセラピューティクス， インコーポレイテッド Ｅｇｆｒ陽性がんを治療するための組成物及び方法
JP2023538115A (ja) 2020-08-20 2023-09-06 エー２ バイオセラピューティクス， インコーポレイテッド Ｃｅａｃａｍ陽性がんを治療するための組成物及び方法
WO2023076912A2 (en) * 2021-10-26 2023-05-04 ImmPACT Bio USA Inc. Cd4+ and/or cd8+ cell populations comprising icars for use in treatment therapies
WO2023156587A1 (en) * 2022-02-18 2023-08-24 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of tcr-deficient car-tregs in combination with anti-tcr complex monoclonal antibodies for inducing durable tolerance
WO2023172991A2 (en) * 2022-03-09 2023-09-14 Immpact Bio Usa, Inc. Bicistronic inhibitory chimeric antigen receptor (icar)/activating chimeric antigen receptor (acar) constructs for use in cancer therapies

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130078243A1 (en) * 2009-11-11 2013-03-28 King's College Hospital Nhs Foundation Trust Conjugate molecule

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
DK2649086T3 (en) * 2010-12-09 2017-09-18 Univ Pennsylvania USING CHEMICAL ANTIGEN RECEPTOR-MODIFIED T-CELLS TO TREAT CANCER
JP2015180607A (ja) 2012-08-01 2015-10-15 国立大学法人 東京大学 移植片対宿主病などの造血幹細胞移植に伴う疾患を治療することのできる抗体およびその機能断片並びにこれらを含んでなる医薬組成物

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130078243A1 (en) * 2009-11-11 2013-03-28 King's College Hospital Nhs Foundation Trust Conjugate molecule

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KATHERINE G. MACDONALD ET AL.: "Alloantigen-specific regulatory T cells generated with a chimeric antigen receptor", 《THE JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION》 *
NICHOLAS A.J. DAWSON ET AL.: "Systematic testing and specificity mapping of alloantigen-specific chimeric antigen receptors in regulatory T cells", 《JCI INSIGHT》 *
SATOSHI YAMAZAKI ET AL.: "A rapid and efficient strategy to generate allele-specific anti-HLA monoclonal antibodies", 《JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS》 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2019056099A1 (en) 2019-03-28
RU2020112261A3 (zh) 2022-03-02
BR112020005361A2 (pt) 2020-09-24
EP3684821A1 (en) 2020-07-29
EP3684821A4 (en) 2021-06-16
CN111448215B (zh) 2024-01-16
JP7281774B2 (ja) 2023-05-26
CA3076261A1 (en) 2019-03-28
US20200283529A1 (en) 2020-09-10
AU2018338418A1 (en) 2020-04-09
KR20200067845A (ko) 2020-06-12
SG11202002520UA (en) 2020-04-29
MX2020003046A (es) 2020-10-12
JP2020537537A (ja) 2020-12-24
RU2020112261A (ru) 2021-10-20
JP2023100800A (ja) 2023-07-19
IL273402A (en) 2020-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111448215B (zh) 抗-hla-a2抗体及其使用方法
JP7047172B2 (ja) 融合タンパク質を用いたｔｃｒの再プログラミングのための組成物及び方法
US11028177B2 (en) Effective targeting of primary human leukemia using anti-CD123 chimeric antigen receptor engineered T cells
JP2022043043A (ja) 免疫細胞の有効性および増大を改善する方法
JP2019106995A (ja) ヒト化抗ｃｄ１９キメラ抗原受容体を使用するがんの処置
US20240067732A1 (en) Anti-hla-a2 antibodies and uses thereof
CN112888481A (zh) 包含tnfr2结构域的新型car构建体
JP2022533092A (ja) アセチルコリン受容体キメラ自己抗体受容体細胞の組成物および方法
KR20230146132A (ko) 항-bcma 키메라 항원 수용체
CA3200770A1 (en) Methods and reagents for characterizing car t cells for therapies
CN115916823A (zh) 人cd45rc特异的嵌合抗原受体及其用途
RU2782276C2 (ru) Анти-hla-a2 антитела и способы их применения
RU2805674C2 (ru) Новые анти-hla-а2 антитела и их применение
RU2808254C2 (ru) Новые конструкции химерного антигенного рецептора, содержащие домены tnfr2

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant