KR20200067845A - 항-hla-a2 항체 및 그 사용 방법 - Google Patents

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메간 레빙스
폴 오르반
니콜라스 도슨
캐롤라인 라마르셰
얀 피터 베르키스트
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더 유니버시티 오브 브리티쉬 콜롬비아
씨디알디 벤쳐스 인코포레이티드
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Abstract

인간화 항-HLA-A2 항체가 제공된다. 특정 양상에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 키메라 항원 수용체 (CAR)의 항원 결합 도메인을 구성할 수 있고, CAR은 인간 세포에서 발현될 수 있음으로써, CAR은 HLA-A2에 특이적으로 결합한다. 또한 인간화 항-HLA-A2 항체를 포함하는 CAR이 제공된다. 이러한 항체 및 CAR를 포함하는 변형 세포뿐만 아니라, 이러한 변형 세포를 사용하는 방법이 또한 제공된다.

Description

항-HLA-A2 항체 및 그 사용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 9월 19일에 출원된 미국 가특허 출원 제 62/560,574호 및 2018년 6월 29일에 출원된 미국 가특허 출원 제 62/692,386호의 우선권을 주장하며, 상기 출원은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
본 발명은 일부 양상에서 HLA-A2 결합 분자, 특히 인간화 항-HLA-A2 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 항체를 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함하여 이러한 항체를 포함하는 재조합 수용체에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 이러한 수용체 및 항체를 발현하는 유전자 조작된 세포 및 세포 요법에서의 그의 용도에 관한 것이다.
클래스 I HLA 항원은 모든 핵 함유 세포에서 발현되는 다형성 단백질이며, 이식과 관련하여 면역 인식의 주요 표적이다. 실제로, HLA 클래스 I 특이적 T 세포 및/또는 항체의 개발은 급성 및 만성 거부 및 동종이식의 주요 위험 인자이고, 사전 형성된 항-공여체 HLA 클래스 I 항체의 존재는 과급성 거부를 초래할 수 있다 (문헌[Konvalinka et al., 2015]). 따라서 HLA 클래스 I 단백질에 대한 면역 반응을 제어하는 방법을 찾는 것이 이식에 있어 주요한 돌파구가 될 것이다.
통상적 HLA 클래스 I 분자는 다형성이며, 감염으로부터의 변화 압력에 반응하여 변화된 많은 상이한 대립유전자에 의해 인코딩된다. 통상적인 HLA 클래스 I 단백질을 인코딩하는 A, B 및 C 유전자좌로 명명된 3개의 유전자좌가 존재한다. HLA-A 유전자좌 내에서, HLA-A2 대립유전자의 패밀리는 가장 크고 가장 다양한 패밀리이며, 적어도 31개의 상이한 HLA-A2 대립유전자가 인간에 존재하는 것으로 공지되어 있다. 흥미롭게도, 많은 다른 HLA 대립유전자 패밀리와는 달리, HLA-A2는 모든 인종 그룹에서 빈번하며, 백인의 50%와 아프리카계 미국인의 35%에서 발견된다 (문헌[Ellis et al., 2000]). 많은 HLA-A2 대립유전자는 단지 1 내지 9개의 아미노산만이 상이하며, 대부분의 다형성은 펩타이드 결합 홈을 중심으로 한다 (문헌[Hilton et al., 2013]). HLA-A2 대립유전자는 2개의 주요 부분으로 세분되며; 이는 A*0201 또는 A*0205로부터의 대립유전자 유전자 전환 사건을 통해 유도된 것이다 (문헌[Ellis et al., 2000]).
이식 거부를 유발하는 HLA 단백질 및 다른 항원에 대한 부적절한 면역을 제어하는 방법으로서 T 조절 (Treg) 세포에 의한 입양 면역요법은 동종이식 거부 및 이식편대숙주병 (GVHD)에 대한 유망한 치료법이다. 동종이계 조혈 줄기세포 이식 (HSCT)이 보고된 후, 이식편대숙주병 (GVHD) 예방에 다클론 Treg 세포 전달의 사용이 보고되었다 (문헌[Brunstein et al., 2011; Di Ianni et al., 2011; Trzonkowski et al., 2009]). 1형 당뇨병에서 c-펩타이드 수준의 유지에 Treg 세포 전달의 사용이 보고되었다 (문헌[Bluestone et al., 2015; Marek-Trzonkowska et al., 2012]). 특히, 이러한 세포 요법을 위한 다클론 Treg 세포의 사용과 관련된 일반화된 면역억제의 일시적 위험이 존재할 수 있는 것으로 보고되었다 (문헌[Brunstein et al., 2013]).
동물 연구로부터의 데이터는 Treg 세포에 의한 세포 요법의 효능 및 특이성이 항원-특이적 세포의 사용에 의해 유의하게 향상될 수 있음을 시사한다. 예를 들어, 자가면역의 모델에서, 항원-특이적 Treg 세포는 질병 감소에서 다클론 Treg 세포보다 우수하다: 췌장 림프절로부터 단리되거나, 췌도 항원으로 펄싱 (pulsing)된 Treg 세포는 다클론 Treg 세포보다 1형 당뇨병을 예방 또는 치료하는데 상당히 우수하고 (문헌[Green et al., 2002; Masteller et al., 2005; Tang et al., 2004; Tarbell et al., 2007; Tarbell et al., 2004]), 자가항원-특이적 트랜스제닉 T 세포 수용체 (TCR)를 발현하는 Treg 세포는 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE) 모델에서 중추신경계 염증을 억제하는데 있어서 다클론 Treg 세포보다 우수하다 (문헌[Stephens et al., 2009]). 유사하게, 시험관내에서 동종 항원-자극된 확장에 의해 다량화되거나, TCR 전달 유전자를 발현하도록 조작된 동종 항원-특이적 Treg 세포는 장기 및 조직 이식의 거부를 예방하는데 있어서 다클론 Treg 세포보다 더 효과적이다 (문헌[Golshayan et al., 2007; Joffre et al., 2008; Nishimura et al., 2004; Sanchez-Fueyo et al., 2006; Tsang et al., 2008]). 동종 항원으로 확장된 Treg 세포가 GVHD를 효과적으로 예방하고 (문헌[Trenado et al., 2006]), 항원-특이적 Treg 세포의 생체내 유도가 GVHD없이 조혈 동종이식의 수용을 촉진한다는 일부 증거가 존재한다 (문헌[Verginis et al., 2008]). 인간화된 마우스 모델은 유사한 결과를 보여주었다: 동종 항원-확장된 인간 Treg 세포는 다클론 Treg 세포보다 피부 이식 거부의 더 강력한 억제제이다 (문헌[Putnam et al., 2013; Sagoo et al., 2011]).
항원-특이적 T 세포를 다량화하기 위해 과발현 트랜스제닉 TCR 또는 항원-자극된 확장에 대한 다른 접근법은 키메라 항원 수용체 (CAR)의 사용이다. 세포-기반 입양 면역요법에서, 환자로부터 단리된 면역 세포는 추후 환자에게 다시 전달된 후 세포가 새로운 치료 기능을 수행할 수 있게 하는 합성 단백질을 발현하도록 변형될 수 있다. 이러한 합성 단백질의 예는 CAR이다. 현재 사용되는 CAR의 예는 세포외 인식 도메인 (예를 들어, 항원-결합 도메인), 막관통 도메인, 및 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인의 융합이다. 항원 결합시, CAR의 세포내 신호전달 부분은 면역 세포에서 활성화 관련 반응을 개시시킬 수 있다. 예를 들어, T 세포는 세포내 신호전달 도메인에 융합된 세포외 단일 사슬 항체 (scFv) 항원 결합 도메인을 발현하도록 유전자 조작될 수 있다 (문헌[Gill and June, 2015; June et al., 2015]). 특히, 모델 항원에 특이적인 CAR을 발현하는 Treg 세포가 보고되었다 (문헌[Blat et al., 2014; Elinav et al., 2009; Elinav et al., 2008; Fransson et al., 2012; Hombach et al., 2009, Boardman et al., 2016; MacDonald et al., 2016; Noyan et al., 2016]).
본 개시내용의 양상은 항-HLA-A2 항체를 포함한다. 본 개시내용의 임의의 항-HLA-A2 항체를 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)가 또한 제공된다. 본 개시내용의 항-HLA-A2 항체 및 CAR을 인코딩하는 핵산, 이를 포함하는 발현 벡터 및 이러한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포가 또한 제공된다. 본 개시내용의 양상은 또한 인간화 항-HLA-A2 항체를 포함한다. 본 개시내용의 임의의 인간화 항-HLA-A2 항체를 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)가 또한 제공된다. 본 개시내용의 인간화 항-HLA-A2 항체 및 CAR을 인코딩하는 핵산, 이를 포함하는 발현 벡터 및 이러한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포가 또한 제공된다. 면역 세포, 예를 들어, 본 개시내용의 CAR 및/또는 발현 벡터를 포함하는 면역 조절 세포, 이러한 면역 세포를 포함하는 조성물 및 약제학적 조성물, 이러한 면역 세포를 제조하기 위한 것으로 이러한 면역 세포 및/또는 시약 (예를 들어, 본 개시내용의 항-HLA-A 항체 또는 CAR을 인코딩하는 핵산 또는 벡터)를 포함하는 부속물의 키트 및 이러한 면역 세포의 제조 방법이 또한 제공된다. 본 개시내용의 항-HLA-A2 항체, CAR, 면역 세포, 및 약제학적 조성물의 사용 방법이 또한 제공된다. 예를 들어, 대상 항-HLA-A2 항체, CAR, 면역 세포 (예를 들어, 면역 조절 세포), 및 약제학적 조성물은, 예를 들어, 대상체에서의 면역 내성의 촉진, 대상체에서의 이식편대숙주병 (GVHD)의 예방 또는 치료, 대상체에서의 장기 또는 조직 이식 거부의 예방 또는 치료에서의 용도가 발견되었다.
일부 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체로서, 상기 항체는 키메라 항원 수용체 (CAR)의 항원 결합 도메인을 구성할 수 있고, CAR은 인간 세포 (예를 들어, 인간 면역 세포, 예컨대 인간 면역 조절 세포)에서 발현될 수 있음으로써, CAR은 HLA-A2에 특이적으로 결합하는 인간화 항-HLA-A2 항체가 제공된다. 특정 양상에서, 이러한 항체는 HLA-A2와 결합하기 위해, SEQ ID NO: 183의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HCDR1); SEQ ID NO: 185의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HCDR2); SEQ ID NO: 187의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HCDR3); SEQ ID NO: 188의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LCDR1); SEQ ID NO: 189의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LCDR2); 및 SEQ ID NO: 190의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LCDR3)을 포함하는 항체와 경쟁한다.
특정 양상에서, 인간화 항-HLA-A2 항체로서, 상기 항체는 HLA-A2와 결합하기 위해, SEQ ID NO: 183의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HCDR1); SEQ ID NO: 185의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HCDR2); SEQ ID NO: 187의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HCDR3); SEQ ID NO: 188의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LCDR1); SEQ ID NO: 189의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LCDR2); 및 SEQ ID NO: 190의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LCDR3)을 포함하는 항체와 경쟁하는 인간화 항-HLA-A2 항체가 제공된다.
특정 실시형태에 따르면, 상기에 제시된 바와 같은 인간화 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 183의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HCDR1); SEQ ID NO: 185의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HCDR2); SEQ ID NO: 187의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HCDR3); SEQ ID NO: 188의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LCDR1); SEQ ID NO: 189의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LCDR2); 및 SEQ ID NO: 190의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LCDR3)을 포함하는 항체와 동일한 HLA-A2 에피토프에 결합한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 인간화 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68, 및 그의 임의의 조합 중 하나 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 인간화 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, 및 그의 임의의 조합 중 하나 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작다.
특정 양상에서, 본 개시내용의 인간화 항-HLA-A2 항체는 SYHIQ (SEQ ID NO: 1) 및 GYTFTSY (SEQ ID NO: 2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 실시형태에 따르면, 본 개시내용의 인간화 항-HLA-A2 항체는 YPGDGS (SEQ ID NO: 4) 및 WIYPGDGSTX10YX12X13KFX16G (SEQ ID NO: 10) (X10은 Q 또는 K이고, X12는 N 또는 S이고, X13은 E 또는 Q이고, X16은 K 또는 Q임)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 이러한 항체는 예를 들어, WIYPGDGSTQYNEKFKG (SEQ ID NO: 3) 및 YPGDGS (SEQ ID NO: 4)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 또한 예로서, 이러한 항체는 예를 들어, 아미노산 서열 WIYPGDGSTKYSQKFQG (SEQ ID NO: 5)를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 특정 양상에서, 본 개시내용의 인간화 항체는 아미노산 서열 EGTYYAMDY (SEQ ID NO: 6)를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 인간화 항-HLA-A2 항체는 아미노산 서열 RSSQSIVHSNGNTYLE (SEQ ID NO: 7)를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 양상에서, 본 개시내용의 인간화 항체는 아미노산 서열 KVSNRFS (SEQ ID NO: 8)를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 본 개시내용의 인간화 항체는 아미노산 서열 FQGSHVPRT (SEQ ID NO: 9)를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 양상에서, 본 개시내용의 인간화 항-HLA-A2 항체는 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS (SEQ ID NO: 11) 및 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 12)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 1 (VH FR1)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 실시형태에 따르면, 본 개시내용의 인간화 항-HLA-A2 항체는
WVRQAPGQX9LEWMGX15 (SEQ ID NO: 13),
WVRQAPGQX9LEWMGX15WI (SEQ ID NO: 17),
HIQWVRQAPGQX12LEWMGX18WI (SEQ ID NO: 21), 및
HIQWVRQAPGQX12LEWMGX18 (SEQ ID NO: 25),
(SEQ ID NO: 13에서 X9는 R 또는 G이고, X15는 I 또는 부재하고;
SEQ ID NO: 17에서 X9는 R 또는 G이고, X15는 I 또는 부재하고;
SEQ ID NO: 21에서 X12는 R 또는 G이고, X18은 I 또는 부재하고;
SEQ ID NO: 25에서 X12는 R 또는 G이고, X18은 I 또는 부재함)
로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 2 (VH FR2)를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 인간화 항-HLA-A2 항체는
X1VTX4TX6DTSX10STAYMX16LSX19LRSX23DX25AVYYCAR (SEQ ID NO: 29),
TX2YX4X5KFX8GX10VTX13TX15DTSX19STAYMX25LSX28LRSX32DX34
AVYYCAR (SEQ ID NO: 35),
TQYNEKFKGX10VTX13TX15DTSX19STAYMX25LSX28LRSX32DX34
AVYYCAR (SEQ ID NO: 36), 및
TKYSQKFQGX10VTX13TX15DTSX19STAYMX25LSX28LRSX32DX34AVYYCAR (SEQ ID NO: 37)
(SEQ ID NO: 29에서 X1은 R 또는 부재하고, X4는 I 또는 M이고, X6은 R 또는 A이고, X10은 A, T 또는 I이고, X16은 E 또는 L이고, X19는 S 또는 R이고, X23은 E 또는 D이고, X25는 T 또는 M이고;
SEQ ID NO: 35에서 X2는 Q 또는 K이고, X4는 N 또는 S이고, X5는 E 또는 Q이고, X8은 K 또는 Q이고, X10은 R 또는 부재하고, X13은 I 또는 M이고, X15는 R 또는 A이고, X19는 A, T 또는 I이고, X25는 E 또는 L이고, X28은 S 또는 R이고, X32는 E 또는 D이고, X34는 T 또는 M이고;
SEQ ID NO: 36에서 X10은 R 또는 부재하고, X13은 I 또는 M이고, X15는 R 또는 A이고, X19는 A, T 또는 I이고, X25는 E 또는 L이고, X28은 S 또는 R이고, X32는 E 또는 D이고, X34는 T 또는 M이고;
SEQ ID NO: 37에서 X10은 R 또는 부재하고, X13은 I 또는 M이고, X15는 R 또는 A이고, X19는 A, T 또는 I이고, X25는 E 또는 L이고, X28은 S 또는 R이고, X32는 E 또는 D이고, X34는 T 또는 M임)
로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 3 (VH FR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 양상에서, 본 개시내용의 인간화 항-HLA-A2 항체는 아미노산 서열 WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 44)를 포함하는 프레임워크 영역 4 (VH FR4)를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시형태에 따르면, 본 개시내용의 인간화 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 61 내지 66으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 실시형태에 따르면, 본 개시내용의 인간화 항-HLA-A2 항체는 아미노산 서열 DX2VMTQX7PLSX11X12VTX15GQPASISX23 (SEQ ID NO: 46) (X2는 V 또는 I이고, X7은 S 또는 T이고, X11은 L 또는 S이고, X12는 P 또는 S이고, X15는 L 또는 P이고, X23은 C 또는 F임)를 포함하는 프레임워크 영역 1 (VL FR1)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 인간화 항-HLA-A2 항체는 아미노산 서열 WX2X3QX5PGQX9PX11X12LIY (SEQ ID NO: 51) (X2는 F 또는 Y이고, X3은 Q 또는 L이고, X5는 R 또는 K이고, X9는 S 또는 P이고, X11은 R 또는 Q이고, X12는 R 또는 L임)를 포함하는 프레임워크 영역 2 (VL FR2)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 양상에서, 본 개시내용의 인간화 항-HLA-A2 항체는 아미노산 서열 GVPDRFSGSGX11GTDFTLKISRVEAEDVGVYYC (SEQ ID NO: 56) (X11은 S 또는 A임)를 포함하는 프레임워크 영역 3 (VL FR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시형태에 따르면, 본 개시내용의 인간화 항-HLA-A2 항체는 아미노산 서열 FGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 59)를 포함하는 프레임워크 영역 4 (VL FR4)를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 인간화 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 67 내지 71로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 인간화 항-HLA-A2 항체는 전체 항체, 단일 사슬 항체, 2량체 단일 사슬 항체, Fv, scFv, Fab, F(ab)'2, 탈푸코실화된 항체, 이중 특이적 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 유니바디 (unibody), 도메인 항체, 및 나노바디 (nanobody)로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 단편 또는 애피바디 (affibody), 알파바디 (alphabody), 아르마딜로 반복 단백질 기반 스캐폴드 (armadillo repeat protein based scaffold), 노틴 (knottin), 쿠니츠 (kunitz) 도메인 펩타이드, 아필린 (affilin), 아피틴 (affitin), 아넥틴 (adnectin), 아트리머 (atrimer), 에바신 (evasin), DARPin, 안티칼린 (anticalin), 아비머 (avimer), 파이노머 (fynomer), 버사바디 (versabody) 또는 두오칼린 (duocalin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 모방체이다.
특정 실시형태에 따르면, 본 개시내용의 인간화 항-HLA-A2 항체는 scFv이다. 예를 들어, 본 개시내용의 인간화 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 72 내지 91로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 scFv일 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기에 제시된 바와 같은 인간화 항-HLA-A2 항체로서, 상기 항체는 키메라 항원 수용체 (CAR)의 항원 결합 도메인을 구성할 수 있고, CAR은 면역 세포 (예를 들어, T 조절 세포 (Treg))에서 발현될 수 있음으로써, CAR은 HLA-A2에 특이적으로 결합하는 인간화 항-HLA-A2 항체가 제공된다. 특정 양상에서, 상기에 제시된 바와 같은 인간화 항-HLA-A2 항체로서 항체는 키메라 항원 수용체 (CAR)의 항원 결합 도메인을 구성할 수 있고, CAR은 면역 세포 (예를 들어, T 조절 세포 (Treg))에서 발현될 수 있음으로써, 면역 세포는 HLA-A2에 의해 활성화되는 인간화 항-HLA-A2 항체가 제공된다.
특정 양상에서, 상기에 제시된 임의의 인간화 항-HLA-A2 항체를 인코딩하는 핵산이 제공된다. 이러한 핵산을 포함하는 발현 벡터 및 유전자 요법 벡터가 또한 제공된다. 이러한 발현 벡터 또는 유전자 요법 벡터을 포함하는 숙주 세포가 또한 제공된다.
본 개시내용의 양상은 키메라 항원 수용체 (CAR)를 추가로 포함한다. 예를 들어, (i) 상기에 제시된 인간화 항-HLA-A2 항체 중 임의의 것을 포함하는 세포외 도메인; (ii) 막관통 도메인; 및 (iii) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 도메인을 포함하는 CAR이 제공되며; CAR은 면역 세포에서 발현될 수 있음으로써, CAR은 HLA-A2에 특이적으로 결합한다. 이러한 CAR은 BB7.2 항체를 포함하는 CAR과 비교하여, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68, 및 그의 임의의 조합 중 하나 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작을 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 이러한 CAR은 BB7.2 항체를 포함하는 CAR과 비교하여, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, 및 그의 임의의 조합 중 하나 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작다. 본 개시내용의 CAR은 면역 세포 (예를 들어, T 조절 세포 (Treg))에서 발현될 수 있음으로써, 면역 세포는 HLA-A2에 의해 활성화된다. 본 개시내용의 CAR은 힌지 영역을 포함할 수 있다. 특정 양상에서, 힌지 영역은 CD8α의 줄기 영역을 포함한다.
본 개시내용의 CAR은 CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD3 제타, T 세포 수용체의 알파 사슬, T 세포 수용체의 베타 사슬, T 세포 수용체의 감마 사슬, T 세포 수용체의 델타 사슬, CD28, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD28의 막관통 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에 따르면, 본 개시내용의 CAR은 CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD3 제타, FcR 감마, FcR 알파, FcR 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 기능성 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타의 기능성 신호전달 도메인을 포함한다. 특정 양상에서, 세포내 신호전달 도메인은 공자극 도메인을 추가로 포함한다. 이러한 공자극 도메인은 OX40, CD27, CD28, 림프구 기능-관련 항원-1 (LFA-1) (CD11a/CD18), TNFR1 (CD120a/TNFRSF1A), TNFR2 (CD120b/TNFRSF1B), CTLA-4 (CD152), CD95, ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), CD2, CD30, CD40, PD-1, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ICAM-1, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, IL2ra (CD25), IL6Ra (CD126), IL-7Ra (CD127), IL-13RA1, IL-13RA2, IL-33R(IL1RL1), IL-10RA, IL-10RB, IL-4R, IL-5R (CSF2RB), ARHR, BAFF 수용체, IL-21R, TGFbR1, TGFbR2, TGFbR3, 공통 감마 사슬, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 기능성 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에 따르면, 공자극 도메인은 CD28 및 4-1BB로부터 선택되는 단백질의 기능성 신호전달 도메인을 포함한다. 예를 들어, 공자극 도메인은 CD28의 기능성 신호전달 도메인을 포함할 수 있다.
또한 본 개시내용의 CAR 중 임의의 것을 포함하는 변형된 면역 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 세포는 T 조절 세포 (Treg)이다.
본 개시내용은 본 개시내용의 CAR 중 임의의 것을 인코딩하는 핵산을 제공한다. 이러한 핵산을 포함하는 발현 벡터는 또한 이러한 발현 벡터를 포함하는 면역 세포 (예를 들어, T 조절 세포 (Treg))로서 제공된다.
조성물 (예를 들어, 약제학적 조성물)이 또한 제공된다. 특정 양상에서, 본 개시내용의 복수의 변형된 면역 세포 또는 면역 세포를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 부속물 키트가 또한 제공된다. 일부 실시형태에서, 상기 부속물 키트는 제1 부속물에 본 개시내용의 면역 세포, 및 제2 부속물에 다른 치료제, 예를 들어 면역억제제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 부속물 키트는 본 개시내용의 세포를 제조하기 위한 하나 이상의 시약 (예를 들어, 본 개시내용의 항-HLA-A 항체 또는 CAR을 인코딩하는 핵산 또는 발현 벡터)을 포함한다. 본 개시내용의 변형된 면역 세포를 제조하는 방법이 또한 제공된다. 일부 실시형태에서, 이러한 방법은 본 개시내용의 발현 벡터로 면역 세포를 형질도입시켜 변형된 면역 세포를 생성시키는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 항체, CAR, 면역 세포, 변형된 면역 세포, 및 약제학적 조성물을 사용하는 방법이 또한 제공된다. 특정 양상에서, 대상체에서 면역 내성을 촉진시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 대상체에게 본 개시내용의 약제학적 조성물, 예를 들어 본 개시내용의 복수의 변형된 면역 세포 또는 면역 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 내성은 이식된 장기 또는 조직에 대한 내성이다. 특정 실시형태에 따르면, 대상체에서 이식편대숙주병 (GVHD)을 예방 또는 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 대상체에게 본 개시내용의 약제학적 조성물, 예를 들어 본 개시내용의 복수의 변형된 면역 세포 또는 면역 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 특정 양상에서, 대상체는 조혈 줄기세포 이식을 받고 있거나, 받은 적이 있다. 대상체에서 장기 또는 조직 이식 거부를 예방 또는 치료하는 방법이 또한 제공되며, 상기 방법은 대상체에게 본 개시내용의 약제학적 조성물, 예를 들어 본 개시내용의 복수의 변형된 면역 세포 또는 면역 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 면역억제제를 추가로 제공받고 있다. 특정 실시형태에 따르면, 대상체에서 장기 또는 조직 이식 거부 또는 이식편대숙주병 (GVHD)을 예방 또는 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 대상체에게 면역 내성을 유도하기 위한 적어도 하나의 면역억제제와 본 개시내용의 면역 세포의 조합을 투여하는 단계를 포함한다. 본 개시내용의 항체, CAR, 면역 세포, 변형된 면역 세포 및 약제학적 조성물을 사용하는 임의의 방법에서, 대상체는 인간일 수 있다.
도 1. 인간화 항-HLA-A2 CAR의 작제. 렌티바이러스 작제물의 도식적 그래프. 상부: 절단된 NGFR 대조군 작제물 (CAR 없음); 하부: 인간화 항-HLA-A2 CAR 작제물. "SP": 신호 펩타이드; "GS": 글리신-세린 링커; "TM": 막관통 영역; "hs": 인간화.
도 2. 인간화 항-HLA-A2 CAR의 세포 표면 발현 및 특이성. 293T 세포를 소정의 작제물로 일시적으로 형질감염시키고, 48시간 후 발현 및 항원 특이성을 항-ΔNGFR mAb 및 HLA-A2 4량체로 유세포 분석 염색하여 측정하였다. A & B는 각각 HLA-A2에 결합하는 능력을 보유하거나 보유하지 않는 작제물에 대한 점도표를 도시한다. 데이터는 2개의 독립 실험의 대표값이다.
도 3. 인간화 항-HLA-A2 CAR 결합 강도의 비교. 293T 세포를 소정의 인간화 항-HLA-A2 CAR 작제물로 형질감염시키고, 소정의 HLA-A2 4량체의 희석물로 염색하였다. A, B & C는 경쇄 사용에 따라 분류되는 작제물에 의해 유입된 ΔNGFR+ 세포내에서 HLA-A2 4량체 결합의 기하 평균 형광 강도를 나타내는 그래프를 도시한다.
도 4. Treg에서의 인간화 항-HLA-A2 CAR의 발현 및 특이성. CD4+CD25hiCD127lo Treg를 활성화시키고, 1일 후에 소정의 렌티바이러스로 형질도입한 다음 확장시켰다. 활성화 7일 후, ΔNGFR-발현 세포를 자기-비드 기반 분리에 의해 선택하였다. 형질도입 효율 및 HLA-A2 결합을 ΔNGFR+ 세포의 분리 전 및 후의 유세포 분석에 의해 측정하였다 (A, B, C & D). 숫자는 ΔNGFR+ 4량체+ 세포의 비율을 나타낸다. 데이터는 독립 실험의 대표값이다. (E) A*02:01-4량체 결합의 백분율 또는 평균 형광 강도의 데이터를 요약하였다.
도 5. Treg의 HLA-A2 CAR-매개 활성화. CD4+CD25hiCD127lo Treg를 활성화시키고, 소정의 렌티바이러스로 형질도입하고, 확장시켰다. 7일 후, Treg를 100 U/mL IL-2와 함께 밤새 방치한 후, 비자극하거나, 2:1 (Treg:K562 세포) 비율의 항-CD3/28-로딩 CD64-K562 세포 (TCR), 또는 HLA-A2-K562 세포 (CAR)와의 공동 배양에 의해 자극하였다. 24시간 후, CD69, CD154, CTLA-4 및 LAP의 발현을 생존 CD4+ 세포에서 유세포 분석에 의해 측정하였다. (A & B)는 대표적인 히스토그램을 도시하고, (C & D)는 2개의 독립 실험으로부터의 평균 데이터를 도시한다. (E) ΔNGFR 대조군/CAR Treg를 2:1 (Treg:K562) 비율의 HLA-A2-발현 K562 세포와 공동 배양하였다. 16시간 후, CD69, CD71, CTLA-4 및 LAP의 발현을 유세포 분석에 의해 측정하였다. CD69 및 CD71의 기준선 (K562 없음) 발현에 대한 양성 백분율 및 배수 증가. (F) CTLA-4 및 LAP의 기준선 (K562 없음) 발현에 대한 양성 백분율 및 배수 증가. 데이터는 적어도 2개의 독립 실험으로부터의 각각의 작제물에 대한 n=2-4이다. 모든 작제물을 mA2-CAR Treg와 비교한 일원 ANOVA 및 Holm-Sidak의 사후 시험. 평균 SEM. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001.
도 6. 공통 HLA-A 및 HLA-B 대립유전자 변이체를 갖는 인간화 항-HLA-A2 CAR의 교차 반응성의 측정. (A)는 FlowPRT 세포 분석을 위한 실험 설정 및 유입 전략의 개략도를 도시한다. 소정의 인간화된 CAR을 발현하는 ΔNGFR+ Treg를 Flow Panel 반응성 단일 항원 비드 및 고정성 생존율 염료와 함께 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 샘플을 세척하고, 고정시켜, 유세포 분석을 통해 분석하였다. (B) ΔNGFR Treg 대조군의 결합에 대비한 각각의 m/hA2-CAR Treg의 HLA-A*02:01-코팅된 비드에의 결합. (C & D) (C) 유세포 분석에 의해 평가된 HLA-A*02:01-4량체 MFI 또는 (D) HLA-A*02:01과 공동 배양 16시간 후 음성 대조군 HLA-A*24:01 K562 세포에 대비한 CD69+ 세포의 비율의 증가 및 FlowPRT 세포 분석에 의해 측정된 HLA-A*02:01 결합의 평균 사이의 상관관계. E, F, G & H의 데이터는 세포계측기에 의해 수집된 HLA 음성 비드의 수에 대해 정규화된 절단된 것으로, NGFR만을 발현하는 대조군 Treg에 대비한 결합 백분율을 도시한다. 회색 음영 영역 (E, F & G) 또는 가로 점선 (H) 위의 데이터 포인트는 비드 단독 대조군의 평균으로부터의 표준 편차가 2 초과인 값을 나타내므로, 통계적으로 유의한다 (p < 0.05). 데이터는 3개의 독립 실험의 평균이다. (I) ΔNGFR 또는 m/hA2-CAR Treg를 선택된 HLA-A 대립유전자를 발현하도록 형질도입된 소정의 K562 세포와 공동 배양하였다. 16시간 후, CD69, CD71, LAP 및 CTLA-4의 발현을 생존 CD4+ T 세포에서 측정하였다. 적어도 2개의 독립적 실험으로부터의 n=2-6. mA2-CAR과 비교하여 일원 ANOVA 및 Holm-Sidak 사후 시험에 의해 결정된 통계적 유의도. 평균 ± SEM, ** p < 0.01.
도 7. 인간화된 HLA-A2 CAR을 발현하는 Treg는 HLA-A2+ 수지상 세포에 의해 자극된 T 세포 증식을 강력하게 억제한다. (A) 실험 설정의 개략도. 성숙 HLA-A2+ 수지상 세포를 사용하여 세포 증식 염료 (CPD)-e450-표지 HLA-A2neg CD4+ "반응자" T 세포로 자극하였다. 형질도입되지 않았거나, ΔNGFR을 인코딩하는 대조군 렌티바이러스 또는 인간화된 A2 CAR-발현 Treg로 형질도입된 CPD-e660-표지 Treg. (B, C, D & E) 소정의 비율의 세포를 6일 동안 공동 배양한 후, 반응자 CPD-e450-표지 반응자 CD4+ T 세포의 증식량을 유세포 분석으로 측정하였다. B는 대표적인 점도표를 보여주고, C, D 및 E는 다중 세포 비율에 대한 그래프 데이터를 도시한다. C, D 및 E는 적어도 3개의 독립적 실험으로부터 n=3-7에 대한 평균 데이터를 도시한다. ΔNGFR Treg 대조군에 대비한 Holm-Sidak 사후 시험과 이원 ANOVA를 사용하여 통계를 수행하였다. * p < 0.05, 평균 ± SEM.
도 8. 인간화된 HLA-A2 CAR을 발현하는 Treg는 이종 이식편대숙주병을 강력하게 억제한다. 조사된 NSG 마우스에 PBS (n=3), 8 x106 HLA-A2+ PBMC 단독 (n=5) 또는 4 x106 H1k2 CAR-발현 Treg (n=6)를 주사하였다. 혈중 인간 세포 생착을 7일마다 모니터링하였다. 실험 개시에 대비한 (A) 생존 곡선 및 (B) 체중 변화 백분율. (C) 혈중 인간 CD45를 발현하는 총 단핵 세포 (생존 상태)의 비율. (D) 전체 인간 CD45+ 및 CAR Treg (hCD45+hCD4+HLA-A2-) 세포 생착을 구별하기 위한 유입 전략. (E) 시간 경과에 따른 μL 혈액당 PBMC 및 CAR Treg 생착 수의 절대값으로 나타낸 바와 같은 이종 GVHD 마우스 모델에서 입양 전달 후 생체내 세포 생착. PBMC의 수는 D에 유입된 바와 같이 hCD45+로부터 총 CAR Treg 수를 뺀 값으로 계산하였다.
도 9. m/hA2 CAR의 발현은 HLA-A2:01+ 피부 동종이식에 신속하고, 지속적으로 회귀하는 Treg를 부여한다. 루시퍼라제를 인코딩하는 렌티바이러스 및 대조군 HER2-CAR, mA2-CAR 또는 hA2-CAR (H1k2)에 의해 Treg를 공동 형질도입시켰다. 이중 형질도입된 세포를 FACS 분류하고, 5일 동안 확장한 후, NSG 및 NSG-HLA-A*02:01 트랜스제닉 마우스 둘 모두로부터의 병치된 피부 이식에 의해 이전에 이식된 NSG 마우스에 주사하였다. (A) 실험 설정의 도식적 그래프. (B) Treg 주사 72시간 후 (좌측) 또는 21일 후 (우측) 피부 이식의 대표적인 루시퍼라제 이미지. 루시퍼라제 방사능의 양을 광자/초/cm2/스테라디안의 평균 양을 사용하여 정량화하고, (C) Treg 주사 72시간 후 HLA-A*02:01-NSG 및 NSG 피부 이식 또는 (D) 시간 결과에 따른 비율. 3개의 독립 실험으로부터의 그룹당 n=2-3, 평균 ± SEM. ANOVA 측정을 반복하고, Bonferroni 보정한다.
도 10. HLA-A2:01+ 피부 동종이식으로 신속하고, 지속적으로 회귀하는 m/hA2 CAR Treg의 유세포 분석 추적. 도 9에 도시된 바와 같이, 루시퍼라제 및 HER2-CAR, mA2-CAR 또는 hA2-CAR 작제물을 포함하는 렌티바이러스와 Treg를 공동 형질도입시키고, 확장시켜, 이식된 NSG 마우스에 주사하였다. (A) 유세포 분석 플롯에 대한 사전 유입은 대조군 HER2-CAR의 비장으로부터의 세포를 기반으로 하였다. (B) 소정의 작제물에 대한 hCD4/hCD8 유세포 분석 프로파일. (A)에서와 같이 플롯을 FvD-hCD45+에 사전 유입시켰다. (C) 하나의 독립 실험으로부터 그룹당 실험 종료점 n=1일 때 비장 및 배액 림프절에서 m/hA2-CAR Treg에 대한 염색을 나타내는 유세포 분석 플롯. * p < 0.05.
도 11. hA2-CAR-Treg는 인간 피부 동종이식 거부를 감소시킨다. NSG 마우스에 HLA-A*02:01+ 인간 피부를 이식하고, 3주 후에 PBS (n=3); HLA-A*02:01neg PBMC 단독 (n=4) 또는 2:1 비율의 자가 H1k2 CAR Treg (n=6)를 주사하였다. PBMC/hA2-CAR Treg는 하나의 실험에서 시험된 2마리의 개별 공여체로부터 획득된 것이다. (A) 체중을 매주 3회 모니터링하였고, (B) 혈액 (좌측) 및 비장 (우측) 내의 인간 CD45+ 세포의 비율을 실험 종료점에서 측정하였다. (C) H&E 염색에 의해 결정된 바와 같은 이식된 피부 절편의 누적 조직학적 점수. (D) 이식된 피부 이식을 실험 종료점에서 면역 염색하여 표피에서 인볼루크린 (involucrin) 발현량 및 Ki-67+ 세포의 비율을 정량화하였다. (E) 이식된 피부 절편 내에서 소정의 유전자의 mRNA 발현을 qRT-PCR에 의해 결정하였다. (F) 실험 종료점에서 이식된 피부 이식을 면역 염색하여 인간 CD45+ 세포내의 FOXP3+ 세포의 비율을 정량화하였다. (G) 이식된 피부 이식, 장, 폐 및 간 절편을 실험 종료점에서 면역 염색하여 각 조직에서 인간 CD45+ 세포내 FOXP3+ 세포의 비율을 도시하였다. 각 데이터 포인트는 하나의 마우스를 나타낸다. 상자 수염 플롯은 평균 ± 범위를 도시한다. PBMC와 H1k2를 비교한 양측 Mann-Whitney 시험으로 통계적 유의도를 결정하였다. * p < 0.05.
도 12: 인간 피부 이식 모델에서 혈중 hA2 CAR Treg의 유세포 분석 추적. 도 11에 기재된 바와 같이 NSG 마우스에 인간 HLA-A*02+ 피부를 이식하고, 세포를 주사하였다. (A) 전체 인간 CD45+ (PBMC) 및 CAR Treg (hCD45+hCD4+NGFR+) 세포 생착을 구별하기 위한 유입 전략. (B) 시간 경과에 따른 μL 혈액당 PBMC 및 CAR Treg 생착의 수의 절대값. PBMC의 수를 (A)에 유입된 바와 같이 hCD45+로부터 총 CAR Treg 수를 뺀 값으로 계산하였다.
도 13: 인공 항원 제시 세포를 사용한 hA2 CAR Treg의 활성화. ΔNGFR 대조군/CAR Treg를 비자극 또는 항-CD3 및 항-CD28 단일클론 항체가 로딩된 CD64-발현 K562 세포의 2:1 (Treg:K562) 비율 (TCR 자극)로 16시간 동안 공동 배양하였다. (A) 유입 전략의 예. (B) CD69, CD71, CTLA-4 및 LAP의 발현을 유세포 분석으로 측정하였다 (좌측). 기준선 (자극 없음)에 대한 각 활성화 마커의 배수 증가를 계산하였다 (우측). 데이터는 적어도 2개의 독립 실험으로부터의 각각의 작제물에 대한 n=2-4이다. 평균 ± SEM. 일원 ANOVA 및 모든 작제물과 mA2-CAR Treg를 비교한 Holm-Sidak의 다중 비교 시험 * p < 0.05, ** p < 0.01, **** p < 0.0001.
I. 일반 기술
달리 지시되지 않는 한, 본 발명의 실시는 당 업계에게 속하는 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 종래 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술은 예를 들어 문헌["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, and periodic updates); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., ed., 1994); "A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V., 1988); "Phage Display: A Laboratory Manual" (Barbas et al., 2001)]에 전반적으로 설명되어 있다.
본 발명은 기재된 특정 실시형태로 제한되지 않으며, 물론 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어는 단지 특정 실시형태를 기재하기 위한 목적이고, 제한하고자 하는 것이 아니며, 이는 본 발명의 범위가 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문임을 이해해야 한다.
달리 규정되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나, 동일한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 지금부터 기재된다. 당업자는 본 발명의 실시에 사용될 수 있는 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나, 동일한 많은 방법 및 재료를 인식할 것이다. 실제로, 본 발명은 기재된 방법 및 재료에 어떠한 방식으로든 제한되지 않는다. 본 발명의 목적을 위해, 다음의 용어들이 하기에 규정된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물은 간행물이 인용된 방법 및/또는 재료를 개시하고, 기재하기 위해 본 명세서에 참조로 포함된다. 본 명세서에 참조로 포함된 임의의 문헌과 임의의 정의가 상충되는 경우, 아래 제시된 정의가 우선한다.
II. 정의
단수형 ("a" 및 "an") 용어는 항목의 문법적 대상 중 하나 이상을 지칭한다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
양, 시간 기간 등과 같은 측정 가능한 값을 지칭하는 경우, 용어 "약"은 특정 값으로부터 ± 20% 또는 일부 경우 ± 10%, 또는 일부 경우 ± 5%, 또는 일부 경우 ± 1%, 또는 일부 경우 ± 0.1%의 변동을 포함하는 것으로 의도되며, 이러한 변동은 개시된 방법을 수행하기에 적합한 것이다.
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥상 달리 명시되지 않는 한, 하한의 단위의 1/10까지의 각각의 개재 값, 그 범위의 상한 내지 하한 및 언급된 범위 내의 언급되거나 개재된 임의의 다른 값이 본 발명에 포함되는 것으로 이해된다. 이러한 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있고, 또한 언급된 범위에서 임의의 구체적으로 배제된 한계 값에 따라 본 발명에 포함된다. 언급된 범위가 한계 값 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 포함된 이러한 한계 중 하나 또는 둘 모두를 제외한 범위가 또한 본 발명에 포함된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "HLA-A2" 및 "A2"는 각각 HLA 유전자 복합체의 HLA-A 유전자좌의 HLA-A*02 대립유전자 패밀리에 의해 인코딩되는 세포 표면 단백질을 포함하는 인간 백혈구 항원 (HLA) 단백질을 지칭한다. 용어 "HLA-A2" 및 "A2"에 포함되는 HLA 단백질은 혈청학적 시험 또는 유전자형 분석에 의해 HLA-A*02 항원 유형에 속하는 것으로 확인된 HLA 단백질을 포함한다. HLA-A*02 항원 유형에 대한 추가 명칭은 "HLA-A2", HLA-A02" 및 "HLA-A*2"를 포함한다. 2010년 WHO HLA 체계 요인 위원회에서 개발한 HLA 명명 체계를 포함하여, 이 대립유전자 패밀리에 의해 인코딩되는 HLA 단백질을 확인하는 다양한 명명 체계가 개발되었다. 용어 "HLA-A2" 및 "A2"는 다음에 제한되는 것은 아니나 "HLA-A*02:01", "HLA-A*02:02", "HLA-A*02:03", "HLA-A*02:04", "HLA-A*02:05", "HLA-A*02:06", "HLA-A*02:07", "HLA-A*02:08", "HLA-A*02:09", "HLA-A*02:10", 및 "HLA-A*02:11"로 시작하는 명칭을 포함하여, "HLA-A*02:"로 시작하는 명명 체계에 따른 명칭을 갖는 대립유전자에 의해 인코딩되는 HLA 단백질을 지칭한다. "HLA-A*02:" 뒤에 나오는 숫자 외에도 대립유전자 명칭은 또한, 다음에 제한되는 것은 아니나, 대문자 "P" 및 "G" (예를 들어, HLA-A*02:01P 또는 HLA-A*02:01:01G)를 포함하여 대문자를 포함할 수 있다. "HLA-A*02:"로 시작하고, 그 뒤에 2, 3 또는 4의 추가 숫자가 나오는 대립유전자 명칭은 전체 명칭 또는 명칭의 시작 부분을 구성할 수 있다. 대립유전자 명칭은 이탤릭체로 표시될 수 있다. 용어 "HLA-A2" 및 "A2"는 또한 다음에 제한되는 것은 아니나 명칭 "HLA-A*02:01", "HLA-A*02:02", "HLA-A*02:03", "HLA-A*02:04", "HLA-A*02:05", "HLA-A*02:06", "HLA-A*02:07", "HLA-A*02:08", "HLA-A*02:09", "HLA-A*02:10", 및 "HLA-A*02:11"을 포함하여, 이러한 명명 체계에 따라 "HLA-A*02:"로 시작하는 명칭으로 확인되는 HLA 단백질을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "HLA-A 하위유형"은 HLA-A 유전자의 대립유전자에 의해 인코딩되는 단백질을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "HLA-A*03"은 HLA 유전자 복합체의 HLA-A 유전자좌의 HLA-A*03 대립유전자 패밀리에 의해 인코딩되는 세포 표면 단백질을 포함하는 HLA 단백질을 지칭한다. 용어 "HLA-A*03"에 포함되는 HLA 단백질은 혈청학적 시험 또는 유전자형 분석에 의해 HLA-A*03 항원 유형에 속하는 것으로 확인된 HLA 단백질을 포함한다. HLA-A*03 항원 유형에 대한 추가 명칭은 "HLA-A03" 및 "HLA-A3"을 포함한다. 용어 "HLA-A*03"은 다음에 제한되는 것은 아니나 "HLA-A*03:01", "HLA-A*03:02", "HLA-A*03:04", "HLA-A*03:05", "HLA-A*03:06", "HLA-A*03:07", "HLA-A*03:08", "HLA-A*03:09", "HLA-A*03:10", 및 "HLA-A*03:12"로 시작하는 명칭을 포함하여, "HLA-A*03:"로 시작하는 것으로 2010년 WHO HLA 체계 요인 위원회에서 개발한 HLA 명명 체계에 따른 명칭을 갖는 대립유전자에 의해 인코딩되는 HLA 단백질을 지칭한다. "HLA-A*03:" 뒤에 나오는 숫자 외에도 대립유전자 명칭은 또한, 다음에 제한되는 것은 아니나, 대문자 "P" 및 "G" (예를 들어, HLA-A*03:01P 또는 HLA-A*03:01:01G)를 포함하여 대문자를 포함할 수 있다. "HLA-A*03:"으로 시작하고, 그 뒤에 2, 3 또는 4의 추가 숫자가 나오는 대립유전자 명칭은 전체 명칭 또는 명칭의 시작 부분을 구성할 수 있다. 대립유전자 명칭은 이탤릭체로 표시될 수 있다. 용어 "HLA-A*03"은 또한 다음에 제한되는 것은 아니나 명칭 "HLA-A*03:01", "HLA-A*03:02", "HLA-A*03:04", "HLA-A*03:05", "HLA-A*03:06", "HLA-A*03:07", "HLA-A*03:08", "HLA-A*03:09", "HLA-A*03:10", 및 "HLA-A*03:12"을 포함하여, 이러한 명명 체계에 따라 "HLA-A*03:"로 시작하는 명칭으로 확인되는 HLA 단백질을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "HLA-A*25", "HLA-A25" 및 "A25"는 각각 HLA 유전자 복합체의 HLA-A 유전자좌의 HLA-A*25 대립유전자 패밀리에 의해 인코딩되는 세포 표면 단백질을 포함하는 HLA 단백질을 지칭한다. 용어 "HLA-A*25", "HLA-A25" 및 "A25"에 포함되는 HLA 단백질은 혈청학적 시험 또는 유전자형 분석에 의해 HLA-A*25 항원 유형에 속하는 것으로 확인된 HLA 단백질을 포함한다. HLA-A*25 항원 유형에 대한 추가 명칭은 "HLA-A25"를 포함한다. 용어 "HLA-A*25", "HLA-A25" 및 "A25"는 다음에 제한되는 것은 아니나 "HLA-A*25:01", "HLA-A*25:02", "HLA-A*25:03", "HLA-A*25:04", "HLA-A*25:05", "HLA-A*25:06", "HLA-A*25:07", "HLA-A*25:08", "HLA-A*25:09", "HLA-A*25:10", 및 "HLA-A*25:11"로 시작하는 명칭을 포함하여, "HLA-A*25:"로 시작하는 것으로 2010년 WHO HLA 체계 요인 위원회에서 개발한 HLA 명명 체계에 따른 명칭을 갖는 대립유전자에 의해 인코딩되는 HLA 단백질을 지칭한다. "HLA-A*25:" 뒤에 나오는 숫자 외에도 대립유전자 명칭은 또한, 다음에 제한되는 것은 아니나 대문자 "P" 및 "G" (예를 들어, HLA-A*25:01P 또는 HLA-A*25:01:01G)를 포함하여 대문자를 포함할 수 있다. "HLA-A*25:"으로 시작하고, 그 뒤에 2, 3 또는 4의 추가 숫자가 나오는 대립유전자 명칭은 전체 명칭 또는 명칭의 시작 부분을 구성할 수 있다. 대립유전자 명칭은 이탤릭체로 표시될 수 있다. 용어 "HLA-A*25", "HLA-A25" 및 "A25"는 다음에 제한되는 것은 아니나 명칭 "HLA-A*25:01", "HLA-A*25:02", "HLA-A*25:03", "HLA-A*25:04", "HLA-A*25:05", "HLA-A*25:06", "HLA-A*25:07", "HLA-A*25:08", "HLA-A*25:09", "HLA-A*25:10", 및 "HLA-A*25:11"을 포함하여, 이러한 명명 체계에 따라 "HLA-A*25:"로 시작하는 명칭으로 확인되는 HLA 단백질을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "HLA-A*29", "HLA-A29" 및 "A29"는 각각 HLA 유전자 복합체의 HLA-A 유전자좌의 HLA-A*29 대립유전자 패밀리에 의해 인코딩되는 세포 표면 단백질을 포함하는 HLA 단백질을 지칭한다. 용어 "HLA-A*29", "HLA-A29" 및 "A29"에 포함되는 HLA 단백질은 혈청학적 시험 또는 유전자형 분석에 의해 HLA-A*29 항원 유형에 속하는 것으로 확인된 HLA 단백질을 포함한다. HLA-A*29 항원 유형에 대한 추가 명칭은 "HLA-A29"를 포함한다. 용어 "HLA-A*29", "HLA-A29" 및 "A29"는 다음에 제한되는 것은 아니나 "HLA-A*29:01", "HLA-A*29:02", "HLA-A*29:03", "HLA-A*29:04", "HLA-A*29:05", "HLA-A*29:06", "HLA-A*29:07", HLA-A*29:09", "HLA-A*29:10", 및 "HLA-A*29:11"로 시작하는 명칭을 포함하여, "HLA-A*29:"로 시작하는 것으로 2010년 WHO HLA 체계 요인 위원회에서 개발한 HLA 명명 체계에 따른 명칭을 갖는 대립유전자에 의해 인코딩되는 HLA 단백질을 지칭한다. "HLA-A*29:" 뒤에 나오는 숫자 외에도 대립유전자 명칭은 또한, 다음에 제한되는 것은 아니나 대문자 "P" 및 "G" (예를 들어, HLA-A*29:02P 또는 HLA-A*29:02:01G)를 포함하여 대문자를 포함할 수 있다. "HLA-A*29:"으로 시작하고, 그 뒤에 2, 3 또는 4의 추가 숫자가 나오는 대립유전자 명칭은 전체 명칭 또는 명칭의 시작 부분을 구성할 수 있다. 대립유전자 명칭은 이탤릭체로 표시될 수 있다. 용어 "HLA-A*29", "HLA-A29" 및 "A29"는 다음에 제한되는 것은 아니나 명칭 "HLA-A*29:01", "HLA-A*29:02", "HLA-A*29:03", "HLA-A*29:04", "HLA-A*29:05", "HLA-A*29:06", "HLA-A*29:07", "HLA-A*29:09", "HLA-A*29:10", 및 "HLA-A*29:11"을 포함하여, 이러한 명명 체계에 따라 "HLA-A*29:"로 시작하는 명칭으로 확인되는 HLA 단백질을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "HLA-A*30", "HLA-A30" 및 "A30"은 각각 HLA 유전자 복합체의 HLA-A 유전자좌의 HLA-A*30 대립유전자 패밀리에 의해 인코딩되는 세포 표면 단백질을 포함하는 HLA 단백질을 지칭한다. 용어 "HLA-A*30", "HLA-A30" 및 "A30"에 포함되는 HLA 단백질은 혈청학적 시험 또는 유전자형 분석에 의해 HLA-A*30 항원 유형에 속하는 것으로 확인된 HLA 단백질을 포함한다. HLA-A*30 항원 유형에 대한 추가 명칭은 "HLA-A30"을 포함한다. 용어 "HLA-A*30", "HLA-A30" 및 "A30"은 다음에 제한되는 것은 아니나 "HLA-A*30:01", "HLA-A*30:02", "HLA-A*30:03", "HLA-A*30:04", "HLA-A*30:06", "HLA-A*30:07", "HLA-A*30:08", "HLA-A*30:09", "HLA-A*30:10", 및 "HLA-A*30:11"로 시작하는 명칭을 포함하여, "HLA-A*30:"로 시작하는 것으로 2010년 WHO HLA 체계 요인 위원회에서 개발한 HLA 명명 체계에 따른 명칭을 갖는 대립유전자에 의해 인코딩되는 HLA 단백질을 지칭한다. "HLA-A*30:" 뒤에 나오는 숫자 외에도 대립유전자 명칭은 또한, 다음에 제한되는 것은 아니나 대문자 "P" 및 "G" (예를 들어, HLA-A*30:01P, HLA-A*30:02P, HLA-A*30:04P, HLA-A*30:01:01G, HLA-A*30:02:01G 또는 HLA-A*30:04:01G)를 포함하여 대문자를 포함할 수 있다. "HLA-A*30:"으로 시작하고, 그 뒤에 2, 3 또는 4의 추가 숫자가 나오는 대립유전자 명칭은 전체 명칭 또는 명칭의 시작 부분을 구성할 수 있다. 대립유전자 명칭은 이탤릭체로 표시될 수 있다. 용어 "HLA-A*30", "HLA-A30" 및 "A30"은 다음에 제한되는 것은 아니나 명칭 "HLA-A*30:01", "HLA-A*30:02", "HLA-A*30:03", "HLA-A*30:04", "HLA-A*30:06", "HLA-A*30:07", "HLA-A*30:08", "HLA-A*30:09", "HLA-A*30:10", 및 "HLA-A*30:11"을 포함하여, 이러한 명명 체계에 따라 "HLA-A*30:"로 시작하는 명칭으로 확인되는 HLA 단백질을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "HLA-A*31", "HLA-A31" 및 "A31"은 각각 HLA 유전자 복합체의 HLA-A 유전자좌의 HLA-A*31 대립유전자 패밀리에 의해 인코딩되는 세포 표면 단백질을 포함하는 HLA 단백질을 지칭한다. 용어 "HLA-A*31", "HLA-A31" 및 "A31"에 포함되는 HLA 단백질은 혈청학적 시험 또는 유전자형 분석에 의해 HLA-A*31 항원 유형에 속하는 것으로 확인된 HLA 단백질을 포함한다. HLA-A*31 항원 유형에 대한 추가 명칭은 "HLA-A31"을 포함한다. 용어 "HLA-A*31", "HLA-A31" 및 "A31"은 다음에 제한되는 것은 아니나 "HLA-A*31:01", "HLA-A*31:02", "HLA-A*31:03", "HLA-A*31:04", "HLA-A*31:05", "HLA-A*31:06", "HLA-A*31:07", "HLA-A*31:08", "HLA-A*31:09", "HLA-A*31:10", 및 "HLA-A*31:11"로 시작하는 명칭을 포함하여, "HLA-A*31:"로 시작하는 것으로 2010년 WHO HLA 체계 요인 위원회에서 개발한 HLA 명명 체계에 따른 명칭을 갖는 대립유전자에 의해 인코딩되는 HLA 단백질을 지칭한다. "HLA-A*31:" 뒤에 나오는 숫자 외에도 대립유전자 명칭은 또한, 다음에 제한되는 것은 아니나 대문자 "P" 및 "G" (예를 들어, HLA-A*31:01P 또는 HLA-A*31:01:02G)를 포함하여 대문자를 포함할 수 있다. "HLA-A*31:"으로 시작하고, 그 뒤에 2, 3 또는 4의 추가 숫자가 나오는 대립유전자 명칭은 전체 명칭 또는 명칭의 시작 부분을 구성할 수 있다. 대립유전자 명칭은 이탤릭체로 표시될 수 있다. 용어 "HLA-A*31", "HLA-A31" 및 "A31"은 다음에 제한되는 것은 아니나 명칭 "HLA-A*31:01", "HLA-A*31:02", "HLA-A*31:03", "HLA-A*31:04", "HLA-A*31:05", "HLA-A*31:06", "HLA-A*31:07", "HLA-A*31:08", "HLA-A*31:09", "HLA-A*31:10", 및 "HLA-A*31:11"을 포함하여, 이러한 명명 체계에 따라 "HLA-A*31:"로 시작하는 명칭으로 확인되는 HLA 단백질을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "HLA-A*33", "HLA-A33" 및 "A33"은 각각 HLA 유전자 복합체의 HLA-A 유전자좌의 HLA-A*33 대립유전자 패밀리에 의해 인코딩되는 세포 표면 단백질을 포함하는 HLA 단백질을 지칭한다. 용어 "HLA-A*33", "HLA-A33" 및 "A33"에 포함되는 HLA 단백질은 혈청학적 시험 또는 유전자형 분석에 의해 HLA-A*33 항원 유형에 속하는 것으로 확인된 HLA 단백질을 포함한다. HLA-A*33 항원 유형에 대한 추가 명칭은 "HLA-A33"을 포함한다. 용어 "HLA-A*33", "HLA-A33" 및 "A33"은 다음에 제한되는 것은 아니나 "HLA-A*33:01", "HLA-A*33:03", "HLA-A*33:04", "HLA-A*33:05", "HLA-A*33:06", "HLA-A*33:07", "HLA-A*33:08", "HLA-A*33:09", "HLA-A*33:10", 및 "HLA-A*33:11"로 시작하는 명칭을 포함하여, "HLA-A*33:"로 시작하는 것으로 2010년 WHO HLA 체계 요인 위원회에서 개발한 HLA 명명 체계에 따른 명칭을 갖는 대립유전자에 의해 인코딩되는 HLA 단백질을 지칭한다. "HLA-A*33:" 뒤에 나오는 숫자 외에도 대립유전자 명칭은 또한, 다음에 제한되는 것은 아니나 대문자 "P" 및 "G" (예를 들어, HLA-A*33:01P 또는 HLA-A*33:01:01G)를 포함하여 대문자를 포함할 수 있다. "HLA-A*33:"으로 시작하고, 그 뒤에 2, 3 또는 4의 추가 숫자가 나오는 대립유전자 명칭은 전체 명칭 또는 명칭의 시작 부분을 구성할 수 있다. 대립유전자 명칭은 이탤릭체로 표시될 수 있다. 용어 "HLA-A*33", "HLA-A33" 및 "A33"은 다음에 제한되는 것은 아니나 명칭 "HLA-A*33:01", "HLA-A*33:03", "HLA-A*33:04", "HLA-A*33:05", "HLA-A*33:06", "HLA-A*33:07", "HLA-A*33:08", "HLA-A*33:09", "HLA-A*33:10", 및 "HLA-A*33:11"을 포함하여, 이러한 명명 체계에 따라 "HLA-A*33:"로 시작하는 명칭으로 확인되는 HLA 단백질을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "HLA-A*36", "HLA-A36" 및 "A36"은 각각 HLA 유전자 복합체의 HLA-A 유전자좌의 HLA-A*36 대립유전자 패밀리에 의해 인코딩되는 세포 표면 단백질을 포함하는 HLA 단백질을 지칭한다. 용어 "HLA-A*36", "HLA-A36" 및 "A36"에 포함되는 HLA 단백질은 혈청학적 시험 또는 유전자형 분석에 의해 HLA-A*36 항원 유형에 속하는 것으로 확인된 HLA 단백질을 포함한다. HLA-A*36 항원 유형에 대한 추가 명칭은 "HLA-A36"을 포함한다. 용어 "HLA-A*36", "HLA-A36" 및 "A36"은 다음에 제한되는 것은 아니나 "HLA-A*36:01", "HLA-A*36:02", "HLA-A*36:03", "HLA-A*36:04", 및 "HLA-A*36:05"로 시작하는 명칭을 포함하여, "HLA-A*36:"로 시작하는 것으로 2010년 WHO HLA 체계 요인 위원회에서 개발한 HLA 명명 체계에 따른 명칭을 갖는 대립유전자에 의해 인코딩되는 HLA 단백질을 지칭한다. "HLA-A*36:" 뒤에 나오는 숫자 외에도 대립유전자 명칭은 또한, 다음에 제한되는 것은 아니나 대문자 "P" 및 "G"를 포함하여 대문자를 포함할 수 있다. "HLA-A*36:"으로 시작하고, 그 뒤에 2, 3 또는 4의 추가 숫자가 나오는 대립유전자 명칭은 전체 명칭 또는 명칭의 시작 부분을 구성할 수 있다. 대립유전자 명칭은 이탤릭체로 표시될 수 있다. 용어 "HLA-A*36", "HLA-A36" 및 "A36"은 다음에 제한되는 것은 아니나 명칭 "HLA-A*36:01", "HLA-A*36:02", "HLA-A*36:03", "HLA-A*36:04", "HLA-A*36:05", 및 "HLA-A*36:06"을 포함하여, 이러한 명명 체계에 따라 "HLA-A*36:"로 시작하는 명칭으로 확인되는 HLA 단백질을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "HLA-A*68", "HLA-A68" 및 "A68"은 각각 HLA 유전자 복합체의 HLA-A 유전자좌의 HLA-A*68 대립유전자 패밀리에 의해 인코딩되는 세포 표면 단백질을 포함하는 HLA 단백질을 지칭한다. 용어 "HLA-A*68", "HLA-A68" 및 "A68"에 포함되는 HLA 단백질은 혈청학적 시험 또는 유전자형 분석에 의해 HLA-A*68 항원 유형에 속하는 것으로 확인된 HLA 단백질을 포함한다. HLA-A*68 항원 유형에 대한 추가 명칭은 "HLA-A68"을 포함한다. 용어 "HLA-A*68", "HLA-A68" 및 "A68"은 다음에 제한되는 것은 아니나 "HLA-A*68:01", "HLA-A*68:02", "HLA-A*68:03", "HLA-A*68:04", "HLA-A*68:05", "HLA-A*68:06", "HLA-A*68:07", "HLA-A*68:08", "HLA-A*68:09", 및 "HLA-A*68:10"으로 시작하는 명칭을 포함하여, "HLA-A*68:"로 시작하는 것으로 2010년 WHO HLA 체계 요인 위원회에서 개발한 HLA 명명 체계에 따른 명칭을 갖는 대립유전자에 의해 인코딩되는 HLA 단백질을 지칭한다. "HLA-A*68:" 뒤에 나오는 숫자 외에도 대립유전자 명칭은 또한, 다음에 제한되는 것은 아니나 대문자 "P" 및 "G" (예를 들어, HLA-A*68:01P, HLA-A*68:01:01G 또는 HLA-A*68:01:02G)를 포함하여 대문자를 포함할 수 있다. "HLA-A*68:"으로 시작하고, 그 뒤에 2, 3 또는 4의 추가 숫자가 나오는 대립유전자 명칭은 전체 명칭 또는 명칭의 시작 부분을 구성할 수 있다. 대립유전자 명칭은 이탤릭체로 표시될 수 있다. 용어 "HLA-A*68", "HLA-A68" 및 "A68"은 다음에 제한되는 것은 아니나 명칭 "HLA-A*68:01", "HLA-A*68:02", "HLA-A*68:03", "HLA-A*68:04", "HLA-A*68:05", "HLA-A*68:06", "HLA-A*68:07", "HLA-A*68:08", "HLA-A*68:09", 및 "HLA-A*68:10"을 포함하여, 이러한 명명 체계에 따라 "HLA-A*68:"로 시작하는 명칭으로 확인되는 HLA 단백질을 지칭한다.
특이적 HLA 단백질은 2010년 WHO HLA 체계 요인 위원회에서 개발한 HLA 명명 체계에 따른 단백질 명칭을 사용하여 본 명세서에서 지칭될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "HLA-A*02:01"은 이러한 명칭 체계에 따라 명칭 "HLA-A*02:01"을 갖는 HLA 단백질을 지칭한다. 유사하게, 용어 "HLA-A*03:01", "HLA-A*25:01", "HLA-A*29:02", "HLA-A*30:01", "HLA-A*31:01", "HLA-A*33:01", "HLA-A*36:01" 및 "HLA-A*68:01"은 각각 명칭 "HLA-A*03:01", "HLA-A*25:01", "HLA-A*29:02", "HLA-A*30:01", "HLA-A*31:01", "HLA-A*33:01", "HLA-A*36:01" 및 "HLA-A*68:01"을 갖는 HLA 단백질을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "항-HLA-A2 항체"는 HLA-A2에 우선적이거나, 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "BB7.2"는 ATCC 기탁 HB-82로 확인되는 쥣과동물 하이브리도마를 지칭한다. BB7.2 하이브리도마 세포는 문헌[P. et al. and Hilton et al. (Parham, P. et al, 1981; Hilton et al., 2013)]에 특성화된 IgG2b 카파 이소유형의 쥣과동물 단일클론 항체를 분비한다. BB7.2에 의해 분비되는 단일클론 항체의 6개의 상보성 결정 영역 (CDR)의 아미노산 서열은 다음과 같다:
중쇄 CDR1 (HCDR1): SYHIQ (SEQ ID NO: 183);
중쇄 CDR2 (HCDR2): WIYPGDGSTQYNEKFKG (SEQ ID NO: 185);
중쇄 CDR3 (HCDR3): EGTYYAMDY (SEQ ID NO: 187);
경쇄 CDR1 (LCDR1): RSSQSIVHSNGNTYLE (SEQ ID NO: 188);
경쇄 CDR2 (LCDR2): KVSNRFS (SEQ ID NO: 189);
경쇄 CDR3 (LCDR3): FQGSHVPRT (SEQ ID NO: 190).
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "BB7.2 항체"는 BB7.2에 의해 분비되는 단일클론 항체의 VH (SEQ ID NO: 191) 및 VL (SEQ ID NO: 192)을 갖는 항체이다. BB7.2 항체는 BB7.2에 의해 분비되는 단일클론 항체의 VH 및 VL을 갖는 전체 항체 또는 그의 단편, 예를 들어 BB7.2에 의해 분비되는 단일클론 항체의 VH 및 VL을 갖는 scFv일 수 있다.
용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 다음에 제한되는 것은 아니나, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, Fd, 디아바디, 단일 도메인 항체 (sdAbs), 선형 항체, 단일-사슬 항체 분자, 및 항체 단편으로부터 형성되는 다중특이적 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 단일-사슬 항체, 및 항체의 항원 결합 부분 및 비 항체 단백질을 포함하는 융합 단백질을 포함하여, 항체 또는 면역글로불린의 임의의 이소유형, 항원에 대해 특이적인 결합을 보유하는 항체의 단편을 포함한다.
항체는 다클론 또는 단일클론, 다중 또는 단일 사슬, 또는 온전한 면역글로불린일 수 있고, 천연 공급원 또는 재조합 공급원으로부터 유래할 수 있다. 항체는 면역글로불린 분자의 4량체일 수 있다. 기본적인 4-사슬 항체 단위는 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된 이종 4량체 당단백질이다. IgG의 경우, 4-사슬 단위는 일반적으로 약 150,000 달톤이다. 각각의 L 사슬은 하나의 공유 이황화 결합에 의해 H 사슬에 연결되고, 2개의 H 사슬은 H 사슬 이소유형에 따라 하나 이상의 이황화 결합에 의해 서로 연결된다. 각각의 H 및 L 사슬은 또한 규칙적으로 이격된 사슬내 이황화 가교를 갖는다. 각각의 H 사슬은 N-말단에 가변 도메인 (VH) 후에 각각의 α 및 γ 사슬의 3개의 불변 도메인 (CH) 및 μ 및 ε 이소유형의 4개의 CH 도메인을 갖는다. 각각의 L 사슬은 N-말단에 가변 도메인 (VL) 후에 다른 말단에 불변 도메인 (CL)을 갖는다. VL은 VH와 정렬되고, CL은 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성하는 것으로 여겨진다. VH 및 VL의 쌍은 함께 단일 항원-결합 부위를 형성한다. 상이한 클래스의 항체의 구조 및 특성에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 and Chapter 6]을 참조한다. 모든 척추동물 종의 L 사슬은 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 카파 및 람다로 지칭되는 2개의 명확하게 구별되는 유형 중 하나에 배정될 수 있다. 중쇄의 불변 도메인 (CH)의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 클래스 또는 이소유형에 배정될 수 있다. 면역글로불린의 5개의 클래스: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지정된 중쇄를 갖는다. γ 및 α 클래스는 CH 서열 및 기능에서 비교적 작은 차이를 기반으로 하여, 서브클래스로 추가로 분류되며, 예를 들어 인간은 다음 서브클래스: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2를 발현한다.
항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 지칭한다. 중쇄의 가변 도메인은 "VH", "VH" 또는 "H"로 지칭될 수 있다. 경쇄의 가변 도메인은 "VL", "VL" 또는 "L"로 지칭될 수 있다. 이들 도메인은 일반적으로 항체의 가장 가변적인 부분이며, 항원 결합 부위를 포함한다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 절편이 항체마다 서열이 광범위하게 상이하다는 사실을 지칭한다. V 도메인은 항원 결합을 매개하고, 그의 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 규정한다. 그러나, 가변성은 가변 도메인의 110 내지 130개의 아미노산 범위에 걸쳐 균일하게 분포되지 않는다. 대신에, V 영역은 각각 9 내지 12개 아미노산 길이인 "초가변 영역"으로 지칭되는 고도의 가변성의 짧은 영역에 의해 분리된 15 내지 30개의 아미노산의 프레임워크 영역 (FR)으로 지칭되는 비교적 불변의 가닥으로 구성된다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 4개의 FR을 포함하고, 3개의 초가변 영역에 의해 연결된 β-시트 구성을 주로 채택하고, 이는 루프 연결을 형성하고, 일부 경우 β-시트 구조의 일부를 형성한다. 각 사슬의 초가변 영역은 FR에 의해 서로 근접하게 유지되고, 다른 사슬의 초가변 영역과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 관여한다 (문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 참조).
"온전한" 항체는 항원 결합 부위뿐만 아니라, CL 및 적어도 중쇄 불변 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 것이다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인 (예를 들어, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 그의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 일 실시형태에서, 온전한 항체는 하나 이상의 효과기 기능을 가질 수 있다.
용어 "항체 단편"은 온전한 항체 또는 그의 재조합 변이체의 적어도 하나의 일부를 지칭하고, 항원과 같은 표적에 대한 항체 단편의 인식 및 특이적 결합을 부여하기에 충분한 온전한 항체의 항원 결합 도메인, 예를 들어 항원 결정 가변 영역을 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, scFv 단편; 디아바디; 단일 도메인 항체 (sdAbs); 선형 항체 (미국 특허 제 5,641,870호, 실시예 2; 문헌[Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]] 참조); 단일-사슬 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성되는 다중특이적 항체를 포함한다. 일 실시형태에서, 항체 단편은 온전한 항체의 항원 결합 부위를 포함함으로써, 항원에 결합하는 능력을 보유한다. 항-HLA-A2 항체 단편 중에는 CAR-변형된 면역 세포의 키메라 항원 수용체에서 HLA-A2 항원으로 유도되는 표적화 아암으로서 사용될 수 있는 항-HLA-A2 항체의 일부 (및 항-HLA-A2 항체, 예를 들어 scFv의 일부의 조합)가 또한 포함된다. 이러한 단편은 반드시 단백질 분해성 단편일 필요는 없으며, 오히려, 표적에 대해 친화도를 부여할 수 있는 폴리펩타이드 서열의 일부이다. 항-HLA-A2 항체 단편 중에는 단일 도메인 항체 (sdAb)가 추가로 포함된다 (예를 들어, 문헌[Li et al. (2017); Jamnani et al. (2014)] 참조). 이러한 단일 도메인 항체는 본 발명의 CAR-변형된 면역 세포에서 표적화 아암으로서 사용될 수 있다.
항체의 파파인 분해는 "Fab" 단편 및 용이하게 결정화하는 능력을 반영하는 명칭인 잔여 "Fc" 단편으로 지칭되는 2개의 동일한 항원-결합 단편을 생성한다. Fab 단편은 H 사슬의 가변 영역 도메인 (VH) 및 하나의 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)과 함께 전체 L 사슬로 구성된다. 각각의 Fab 단편은 항원 결합과 관련하여 1가이며, 즉 이는 단일 항원 결합 부위를 갖는다. 항체의 펩신 처리는 대략적으로, 2가 항원-결합 활성을 갖는 2개의 이황화 결합된 Fab 단편에 해당하고, 여전히 항원을 교차 연결할 수 있는 대형 단일 F(ab')2 단편을 생성한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하여 CH1 도메인의 카복시 말단에 추가의 소수의 잔기를 가짐으로써 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본 명세서에서 불변 도메인의 시스테인 잔기 (들)이 유리 티올기를 갖는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 연결이 또한 공지되어 있다.
Fc 단편은 이황화물에 의해 함께 유지되는 H 사슬 둘 모두의 카복시-말단 부분을 포함한다. 항체의 효과기 기능은 Fc 영역의 서열에 의해 결정되며, 이 영역은 또한 특정 유형의 세포에 존재하는 Fc 수용체 (FcR)에 의해 인식되는 부분이다.
"Fv"는 완전한 항원 인식 및 항원-결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 이 단편은 비공유 결합에 의해 단단하게 결합된 하나의 중쇄 가변 영역 도메인 및 하나의 경쇄 가변 영역 도메인의 2량체로 구성된다. 단일 사슬 Fv (scFv) 종에서, 하나의 중쇄 가변 도메인 및 하나의 경쇄 가변 도메인은 가요성 펩타이드 링커에 의해 공유 결합 연결될 수 있어, 경쇄 및 중쇄는 2개의 사슬 Fv 종의 구조와 유사한 "2량체" 구조로 결합될 수 있다. 이들 2개의 도메인의 접힘으로부터 항원 결합을 위한 아미노산 잔기를 제공하고, 항체에 대한 항원 결합 특이성을 부여하는 6개의 초가변 루프 (각각 H 및 L 사슬로부터의 3개의 루프)가 방출된다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반) 조차도 전체 결합 부위보다 친화도가 낮더라도 항원을 인식하고, 결합하는 능력을 갖는다.
"sFv" 또는 "scFv"로도 약칭되는 "단일 사슬 Fv"는 단일 폴리펩타이드 사슬에 연결된 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. scFv 폴리펩타이드는 VF 도메인과 VL 도메인 사이의 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함할 수 있으며, 이에 의해 scFv는 항원 결합을 위해 적절한 구조를 형성할 수 있다. 명시되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, scFv는 예를 들어 폴리펩타이드의 N-말단 및 C-말단과 관련하여 임의의 순서로 VL 및 VH 가변 영역을 가질 수 있으며, scFv는 VL-링커-VH를 포함하거나, VH-링커-VL을 포함할 수 있다. scFv와 관련하여, 문헌[Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, Oxford University Press, New York (1995)]을 참조한다. 일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체 유래 scFv는 본 명세서에 개시된 CAR-변형된 면역 세포의 표적화 아암으로서 사용될 수 있다.
모노바디 (monobody)로도 공지된 용어 "아넥틴"은 당 업계에 잘 공지되어 있으며, 항원에 대한 높은 친화도 및 특이성으로 결합하도록 설계된 단백질을 지칭한다. 이는 "항체 모방체"로 총칭되는 분자의 클래스에 속한다.
용어 "알파바디"는 세포-투과 알파 바디로 지칭되며, 다양한 항원에 결합하도록 조작된 소형 10 kDa 단백질로 구성된 항체 모방체의 유형을 지칭한다. 알파바디는 세포내 단백질 표적에 도달하여 이에 결합할 수 있다.
용어 "애피바디"는 당 업계에 널리 공지되어 있으며, 포도상구균 단백질 A의 IgG 결합 도메인 중 하나로부터 유래된 58개의 아미노산 잔기 단백질 도메인을 기반으로 하는 친화도 단백질을 지칭한다.
용어 "안티칼린"은 당 업계에 널리 공지되어 있으며, 항체 모방체 기술을 지칭하며, 결합 특이성은 리포칼린 (lipocalin)으로부터 유래한다. 안티칼린은 또한 두오칼린으로 지칭되는 이중 표적화 단백질로 형성될 수 있다.
용어 "아르마딜로 반복 단백질-기반 스캐폴드"는 아르마딜로 반복 단백질을 기반으로 한 인공 펩타이드 결합 스캐폴드에 해당하는 항체 모방체의 유형을 지칭한다. 아르마딜로 반복 단백질은, 펩타이드 또는 단백질과의 상호작용을 매개하는 대략 42개의 아미노산의 탠덤 아르마딜로 반복으로 구성된 아르마딜로 도메인을 특징으로 한다.
용어 "아비머"는 당 업계에 널리 공지되어 있으며, 항체 모방 기술을 지칭한다. 용어 "DARPin" (설계된 안키린 반복 단백질 (Designed Ankyrin Repeat Protein))은 당 업계에 널리 공지되어 있으며, 비 항체 폴리펩타이드의 결합 능력을 이용하기 위해 개발된 항체 모방체 DRP (설계된 반복 단백질) 기술을 지칭한다.
용어 "디아바디"는 V 도메인의 사슬간에 쌍형성이 이루어지지만 사슬내에는 쌍형성이 이루어지지 않도록 하여, 이가 단편, 즉, 2개의 항원 결합 부위를 갖는 단편을 생성하는 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 짧은 링커 (약 5 내지 10개의 잔기)에 의해 scFv 단편을 작제함으로써 제조된 소형 항체 단편을 지칭한다. 이중특이적 디아바디는 2개의 항체의 VH 및 VL 도메인이 상이한 폴리펩타이드 사슬에 존재하는 2개의 "교차" scFv 단편의 이종이량체이다. 디아바디는, 예를 들어, EP 0404097; WO 93/11161; 및 문헌[Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 더욱 상세히 기재되어 있다.
용어 "에바신"은 당 업계에 널리 공지되어 있으며, 케모카인 결합 단백질 클래스를 지칭한다.
용어 "파이노머"는 당 업계에 널리 공지되어 있으며, 항체 모방체의 클래스에 속하는 단백질을 지칭한다. 이는 높은 열 안정성 및 감소된 면역원성으로 인해 주목되는 결합 분자이다.
용어 "노틴" (억제제 시스틴 노트 (cystine not)로도 지칭될 수 있음)은 3개의 이황화 가교를 포함하는 단백질 구조 모티프를 포함하는 항체 모방체를 지칭한다.
용어 "쿠니츠 도메인 펩타이드"는 항체 모방체의 유형을 지칭하고, 프로테아제의 기능을 억제하는 단백질의 활성 도메인을 기반으로 한다.
용어 "나노바디"는 당 업계에 널리 공지되어 있으며, 천연 발생 중쇄 항체의 고유한 구조적 및 기능성 특성을 포함하는 항체-유래 치료 단백질을 지칭한다. 이들 중쇄 항체는 단일 가변 도메인 (VHH) 및 2개의 불변 도메인 (CH2 및 CH3)을 포함한다.
용어 "유니바디"는 당 업계에 널리 공지되어 있으며, IgG4 항체의 힌지 영역이 부재하는 항체 단편을 지칭한다. 힌지 영역의 결실은, 필수적으로, 통상적인 IgG4 항체의 절반 크기이고, IgG4 항체의 2가 결합 영역이 아닌 1가 결합 영역을 갖는 분자를 생성한다.
용어 "버사바디"는 당 업계에 널리 공지되어 있으며, 다른 항체 모방 기술을 지칭한다. 이는 15% 초과의 시스테인을 갖는 3 내지 5 kDa의 작은 단백질이며, 이는 통상적인 단백질이 갖는 소수성 코어를 대체하여 높은 이황화물 밀도 스캐폴드를 형성한다.
scFv와 관련하여 사용되는 바와 같은 용어 "가요성 폴리펩타이드 링커" 또는 "링커"는 중쇄 가변 및 경쇄 가변 영역을 함께 연결하기 위해 단독으로 또는 조합하여 사용되는 글리신 및/또는 세린 잔기와 같은 아미노산으로 구성된 펩타이드 링커를 지칭한다. 일 실시형태에서, 가요성 폴리펩타이드 링커는 Gly/Ser 링커이며, 아미노산 서열 (Gly-Gly-Gly-Ser)n (n은 1 이상의 양의 정수임)을 포함한다. 예를 들어, n=1, n=2, n=3, n=4, n=5, n=6, n=7, n=8, n=9 및 n=10이다. 또 다른 실시형태에서, 가요성 폴리펩타이드 링커는 Gly/Ser 링커이며, 아미노산 서열 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n (n은 1 이상의 양의 정수임)을 포함한다. 예를 들어, n=1, n=2, n=3, n=4, n=5, n=6, n=7, n=8, n=9 및 n=10이다. 일 실시형태에서, 가요성 폴리펩타이드 링커는 다음에 제한되는 것은 아니나, (Gly4 Ser)4 또는 (Gly4 Ser)3을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 링커는 (Gly2Ser), (GlySer) 또는 (Gly3Ser)의 다중 반복을 포함한다. 또한, 본 명세서에 참조로 포함되는 WO2012/138475에 기재된 링커가 본 발명의 범위 내에 포함된다.
용어 "중쇄"는 천연 발생 입체형태로 항체 분자에 존재하는 2가지 유형의 폴리펩타이드 사슬 중 더 큰 것을 지칭하며, 이는 일반적으로 항체가 속하는 클래스를 결정한다.
용어 "경쇄"는 천연 발생 형태로 항체 분자에 존재하는 2가지 유형의 폴리펩타이드 사슬 중 더 작은 것을 지칭한다. 카파 (K) 및 람다 (λ) 경쇄는 2개의 주요 항체 경쇄 이소유형을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 경우, 용어 "초가변 영역", "HVR" 또는 "HV"는 서열 내에서 초가변성이고/거나, 구조적으로 규정된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 초가변 영역으로서; VH에 3개 (H1, H2, H3) 및 VL에 3개 (L1, L2, L3)을 포함한다. 다수의 초가변 영역 묘사가 사용되고 있으며, 본 명세서에 포함된다. 카밧 (Kabat) 상보성 결정 영역 (CDR)은 서열 가변성을 기반으로 하며, 가장 일반적으로 사용된다 (문헌[Kabat et al., 1991]). 코티아 (Chothia)는 대신 구조 루프의 위치를 지칭한다 (문헌[Chothia et al., 1987]). 카밧 넘버링 규칙을 사용하여 넘버링하는 경우 코티아 CDR-H1 루프의 말단은 루프 길이에 따라 H32 내지 H34가 상이하다 (이는 카밧 넘버링 체계가 삽입을 H35A 및 H35B에 배치하고; 35A 또는 35B가 존재하지 않는 경우, 루프는 32에서 끝나고; 단지 35A만이 존재하는 경우, 루프는 33에서 끝나고, 35A 및 35B가 둘 모두 존재하는 경우, 루프가 34에서 끝나기 때문임). AbM 초가변 영역은 카밧 CDR과 코티아 구조 루프 사이의 상쇄를 나타내며, Oxford Molecular의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에서 사용된다. "접촉" 초가변 영역은 이용 가능한 복잡한 결정 구조의 분석을 기반으로 한다. 이러한 초가변 영역 각각으로부터의 잔기가 아래에 언급되어 있다. 이러한 초가변 영역 각각으로부터의 잔기가 아래에 언급되어 있다.
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용어 "초가변 영역" 및 "상보성 결정 영역" 및 이들의 각각의 약어 (HVR, HV, CDR)는 본 명세서에서 상호 혼용된다. 또한, 하기 용어 쌍이 또한 본 명세서에서 상호 혼용된다:
"VH CDR1" 및 "HCDR1"
"VH CDR2" 및 "HCDR2"
"VH CDR3" 및 "HCDR3"
"VL CDR1" 및 "LCDR1"
"VL CDR2" 및 "LCDR2" 및
"VL CDR3" 및 "LCDR3"
초가변 영역은 다음과 같은 "확장 초가변 영역"을 포함할 수 있다: VL에서의 24 내지 36 또는 24 내지 34 (L1), 46 내지 56 또는 50 내지 56 (L2) 및 89 내지 97 (L3) 및 VH에서의 26 내지 35B (HI), 50 내지 65, 47 내지 65 또는 49 내지 65 (H2) 및 93 내지 102, 94 내지 102 또는 95 내지 102 (H3). 가변 도메인 잔기는 이러한 각 규정에 대해 카밧 등 (문헌[Kabat et al., 1991])에 따라 넘버링된다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본 명세서에 규정된 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
용어 "카밧에서와 같은 가변 도메인 잔기 넘버링" 또는 "카밧에서와 같은 아미노산 위치 넘버링" 및 그의 변용례는 카밧 등 (문헌[Kabat et al., 1991)의 항체 편집의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 사용되는 넘버링 체계를 지칭한다. 이 넘버링 체계를 사용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR의 단축 또는 삽입에 해당하는 더 적거나, 추가적인 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 후 단일 아미노산 삽입 (카밧에 따른 잔기 52a) 및 중쇄 FR 잔기 82 후 삽입된 잔기 (예를 들어, 카밧에 따른 잔기 82a, 82b 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 카밧 넘버링은 "표준" 카밧 넘버링 서열과 항체의 서열의 상동성 영역에서의 정렬에 의해 소정의 항체에 대해 결정될 수 있다.
카밧 넘버링 체계는 가변 도메인의 잔기 (경쇄의 대략 잔기 1 내지 107 및 중쇄의 잔기 1 내지 113) (예를 들어, 문헌[Kabat et al., 1991])를 언급하는 경우, 일반적으로 사용된다. 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 잔기를 지칭하는 경우 "EU 넘버링 체계" 또는 "EU 지표"가 일반적으로 사용된다 (예를 들어, 문헌[Kabat et al., supra]에 보고된 EU 지표). "카밧에서와 같은 EU 지표"는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 지칭한다. 본 명세서에서 달리 언급되지 않는 한, 항체의 가변 도메인에서 잔기 번호에 대한 참조번호는 카밧 넘버링 체계에 의한 잔기 넘버링을 의미한다.
용어 "특이적으로 결합하는"은 샘플에 존재하는 동족 결합 상대 (예를 들어, HLA-A2) 단백질을 인식하여 결합하지만, 리간드는 샘플 중 다른 분자를 실질적으로 인식하거나, 결합하지 않는 리간드 (예를 들어, 인간화 항-HLA-A2 항체)를 지칭한다. 비특이적 결합은 10-7 M 미만의 친화도의 결합, 예를 들어 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M 등의 친화도의 결합을 지칭할 것이다.
대상 항원 또는 에피토프에 "특이적으로 결합"하는 항체는 비특이적 상호작용과는 상당히 다른 충분한 친화도로 항원 또는 에피토프에 결합하는 항체이다. 특이적 결합은 예를 들어 대조군 분자의 결합과 비교하여 분자의 결합을 결정함으로써 측정될 수 있다.
용어 "재조합 항체"는, 예를 들어 박테리오파지 또는 효모 발현 시스템에 의해 발현되는 항체와 같은 재조합 DNA 기술를 사용하여 생성된 항체를 지칭한다. 상기 용어는 또한 항체를 인코딩하는 DNA 분자의 합성에 의해 생성되고, DNA 분자가 항체 단백질 또는 항체를 특정하는 아미노산 서열을 발현하고, DNA 또는 아미노산 서열은 당 업계에서 이용 가능하고, 널리 공지된 재조합 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 사용하여 획득되는 항체를 의미하는 것으로 해석되어야 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 균일한 항체 집합으로부터 획득된 항체, 즉 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생 돌연변이를 제외하고는 상기 집합을 포함하는 개별 항체가 동일하다는 것을 지칭한다. 단일클론 항체는 단일 항원 부위에 대해 매우 특이적이다. 또한, 상이한 결정인자 (에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 다클론 항체 제조물과 달리, 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대한 것이다. 그 특이성에 더하여, 단일클론 항체는 다른 항체에 의해 오염되지 않고 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 변형 "단일클론"은 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생성을 요구하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 유용한 단일클론 항체는 문헌[Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 의해 처음 기재된 하이브리도마 방법론에 의해 제조될 수 있거나, 박테리아, 진핵생물 동물 또는 식물 세포에서의 재조합 DNA 방법을 사용하여 제조될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제 4,816,567호 참조). "단일클론 항체"는 또한 예를 들어 문헌[Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에 기재된 기법을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
용어 "항원"은 면역 반응을 유발하는 분자를 지칭한다. 이 면역 반응은 항체 생성, 또는 특이적 면역 적격 세포의 활성화, 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. 당업자는 사실상 모든 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 임의의 거대 분자가 항원으로서 작용할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 항원은 재조합 또는 게놈 DNA로부터 유래할 수 있다. 당업자는 따라서, 면역 반응을 유발하는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 일부 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 임의의 DNA가 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "항원"을 인코딩한다는 것을 이해할 것이다. 또한, 당업자는 항원이 유전자의 전장 뉴클레오타이드 서열에 의해서만 인코딩되어야 하는 것은 아님을 이해할 것이다. 본 발명은 다음에 제한되는 것은 아니나, 하나 초과의 유전자의 일부 뉴클레오타이드 서열의 사용을 포함하며, 이러한 뉴클레오타이드 서열은 적절한 면역 반응을 유발하는 폴리펩타이드를 인코딩하기 위해 다양한 조합으로 배열된다는 것이 쉽게 명백하다. 또한, 당업자는 항원이 "유전자"에 의해 인코딩될 필요가 전혀 없다는 것을 이해할 것이다. 항원은 생물학적 샘플로부터 생성, 합성 또는 유래할 수 있거나, 폴리펩타이드 이외의 거대 분자일 수 있음이 쉽게 명백하다. 이러한 생물학적 샘플은 다음에 제한되는 것은 아니나 조직 샘플, 종양 샘플, 세포 또는 다른 생물학적 성분을 갖는 유체를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "친화도"는 2개의 제제의 가역적 결합에 대한 평형 상수를 지칭하고, 해리 상수 (Kd)로 표시된다. 친화도는 비관련 아미노산 서열에 대한 항체의 친화도보다 적어도 1배 초과, 적어도 2배 초과, 적어도 3배 초과, 적어도 4배 초과, 적어도 5배 초과, 적어도 6배 초과, 적어도 7배 초과, 적어도 8배 초과, 적어도 9배 초과, 적어도 10배 초과, 적어도 20배 초과, 적어도 30배 초과, 적어도 40배 초과, 적어도 50배 초과, 적어도 60배 초과, 적어도 70배 초과, 적어도 80배 초과, 적어도 90배 초과, 적어도 100배 초과, 또는 적어도 1000배 초과 또는 그 이상일 수 있다. 표적 단백질에 대한 항체의 친화도는 예를 들어, 약 100 나노몰 (nM) 내지 약 0.1 nM, 약 100 nM 내지 약 1 피코몰 (pM), 또는약 100 nM 내지 약 1 펨토몰 (fM) 이상일 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "결합력"은 희석 후 해리에 대한 2개 이상의 제제 복합체의 저항성을 지칭한다. 용어 "면역반응성", "바람직하게 결합한다" 및 "특이적으로 결합한다"는 항체 및 그의 단편과 관련하여 본 명세서에서 상호 혼용된다. 인간화 항-HLA-A2 항체항체뿐만 아니라, 그의 단편을 포함하는 본 발명의 항-HLA-A2 항체는 이러한 용어가 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, HLA-A2에 특이적으로 결합한다.
용어 "결합"은, 예를 들어 염 가교 및 물 가교와 같은 상호작용을 포함하는 공유, 정전기, 소수성 및 이온 및/또는 수소 결합 상호작용으로 인한 2개의 분자 사이의 직접적인 결합을 지칭한다. 비특이적 결합은 10-7 M 미만의 친화도의 결합, 예를 들어 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M 등의 친화도과의 결합 을 지칭할 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "반응성"은 분자와 반응하는 (즉, 분자에 결합하는) (예를 들어, 분자에 특이적으로 결합하는) 항체의 능력을 지칭한다. 제1 항체가 제2 항체와 비교하여 분자에 대한 감소된 결합을 나타내는 경우, 제1 항체는 제2 항체보다 분자 (예를 들어, HLA 분자)에 대한 "반응성이 더 작다". 하나 이상의 특정 HLA 분자에 대한 제1 및 제2 항체의 반응성을 쉽게 비교하기 위한 접근법이 공지되어 있다. FlowPRA® 단일 항원 비드 (One Lambda)를 사용하여 특정 HLA 분자와 반응 (또는 결합)하는 능력에 대해 항체를 조사하는 하나의 예시적인 접근법이 본 명세서의 실시예 섹션에 제공된다. 이러한 유세포 분석 접근법은 고 처리량 항체 반응성 분석에 적합하다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "힌지 영역"은 측접 폴리펩타이드 영역에 구조적 가요성 및 간격을 제공하고, 천연 또는 합성 폴리펩타이드로 구성될 수 있는 가요성 폴리펩타이드 연결 영역 (또한 본 명세서에서 "힌지" 또는 "스페이서"로 지칭됨)을 지칭한다. 힌지 영역은 CAR을 발현하는 면역 세포의 효능에 영향을 미칠 수 있다 (예를 들어, 문헌[Watanabe et al. (2016)] 참조). 면역글로불린 (예를 들어, IgG1)으로부터 유래된 "힌지 영역"은 일반적으로 인간 IgG1의 Glu216 내지 Pro230으로의 연장으로 규정된다 (문헌[Burton (1985) Molec. Immunol., 22:161-206]). 다른 IgG 이소유형의 힌지 영역은 중쇄간 이황화 (S--S) 결합을 형성하는 첫 번째 및 마지막 시스테인 잔기를 동일한 위치에 배치함으로써 IgG1 서열로 정렬될 수 있다. 힌지 영역은 천연 발생 또는 비 천연 발생일 수 있으며, 다음에 제한되는 것은 아니나, 미국 특허 제 5,677,425호에 기재된 바와 같은 변이된 힌지 영역을 포함한다. 힌지 영역은 CH1 도메인과 상이한 클래스 또는 서브클래스의 항체로부터 유래된 완전한 힌지 영역을 포함할 수 있다. 용어 "힌지 영역"은 또한 측접 영역에 가요성 및 간격을 제공하는 유사한 기능을 제공하는 CD8 및 다른 수용체로부터 유래된 영역을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "면역 세포"는 일반적으로 골수에서 생성된 조혈 줄기세포 (HSC)로부터 유래된 백혈구 세포 (백혈구)를 포함한다. "면역 세포"는 예를 들어 림프구 (T 세포, B 세포, 자연 살해 (NK) 세포) 및 골수-유래 세포 (호중구, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포)를 포함한다.
"T 세포"는 T-헬퍼 세포 (CD4+ 세포), CD8+ T 세포 (예를 들어, 세포독성 CD8+ T 세포, 조절 CD8+ T 세포), T-조절 세포 (Treg), 감마-델타 T 세포, 및 이중 음성 T 세포를 포함하는 CD3을 발현하는 모든 유형의 면역 세포를 포함한다.
"세포 독성 세포"는 세포 독성 CD8+ T 세포, 자연 살해 (NK) 세포 및 호중구를 포함하고, 세포는 세포 독성 반응을 매개할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "조절 면역 세포"는 면역 시스템의 활성화를 억제하기 위해 "조절" 방식으로 작용하여, 면역 시스템 항상성 및 자기-항원에 대한 내성을 유지하는 면역 세포를 지칭한다. "조절 면역 세포"는 또한 비 면역 세포에 영향을 미쳐, 조직 복구 또는 재생 촉진과 같은 개선된 임상 상태를 초래할 수 있다. 조절 면역 세포는 조절 T 세포, CD4+ 조절 T 세포, CD8+ 조절 T 세포, 조절 γδ T 세포, 조절 DN T 세포, 조절 B 세포, 조절 NK 세포, 조절 대식세포, 및 조절 수지상 세포를 포함할 수 있다.
본 명세서 및 청구범위에 사용되는 바와 같은 "조절 T 림프구", "조절 T 세포", "T 조절 세포", "Treg 세포" 또는 "Treg"는 동의어이며, 당 업계에 사용되는 바와 같은 표준 정의를 갖는 것으로 의도된다. Treg 세포는 면역 시스템의 활성화를 억제하는 "조절" 방식으로 작용하여, 면역 시스템 항상성 및 자기-항원에 대한 내성을 유지하는 T 세포의 특수한 하위집합이다. Treg는 때때로 억제 T-세포로 지칭되었다. Treg 세포는 항상 그런 것은 아니나, 종종 forkhead 패밀리 전사 인자 Foxp3 (forkhead 박스 p3)의 발현을 특징으로 한다. 이는 또한 CD4 또는 CD8 표면 단백질을 발현할 수 있다. 이는 또한 일반적으로 CD25를 발현한다. 본 명세서 및 청구범위에 사용된 바와 같이, 달리 명시되지 않는 한, Treg는 흉선 외부 (예를 들어, 조직 또는 이차 림프 기관, 또는 규정된 배양 조건 하의 실험실 환경)에서 발생하는 분화 과정을 통해 발생하는 흉선 유도/적응/말초 Treg에서 발생하는 "천연" Treg 및 예를 들어 FOXP3의 조작된 발현에 의해 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성된 Treg를 포함한다. 천연 발생 Treg 세포 (CD4+CD25+Foxp3+)는 흉선의 다른 모든 T 세포와 같이 발생한다. 이와 달리, 유도/적응/말초 Treg 세포 (CD4+CD25+Foxp3+ Treg, Tr1 세포, Th3 세포 및 기타의 것을 포함)는 흉선 외부에서 발생한다. Treg를 유도하는 한 가지 방법은 T 효과기 세포를 IL-10 또는 TGF-β에 노출시키는 것이다. T-세포는 또한 혼합된 T-세포 집합으로의 Foxp3 유전자의 형질감염 또는 형질도입에 의해 Treg 세포로 전환될 수 있다. Foxp3를 발현시키는 T-세포는 Treg 표현형을 채택하고, 이러한 재조합 Treg는 또한 본 명세서에서 "Treg"로 규정된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "면역 효과기 세포"는 특이적 면역 반응을 구축할 수 있는 형태인 면역 시스템의 세포를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "면역 반응"은 T 세포 매개 및/또는 B 세포 매개 면역 반응을 포함한다. 예시적인 면역 반응은 T 세포 반응, 예를 들어 사이토카인 생성 및 세포성 세포독성을 포함한다. 또한, 용어 면역 반응은 T 세포 활성화, 예를 들어 항체 생성 (체액성 반응) 및 사이토카인 반응 세포, 예를 들어 대식세포의 활성화에 의해 간접적으로 영향을 받는 면역 반응을 포함한다. 면역 반응에 관여하는 면역 세포는 림프구, 예컨대 B 세포 및 T 세포 (CD4+, CD8+, Thl 및 Th2 세포); 항원 제시 세포 (예를 들어, 수지상 세포, 대식세포, B 림프구, 랑게르한스 세포와 같은 전문 항원 제시 세포 및 각질세포, 내피 세포, 성상세포, 섬유아세포, 희돌기교세포와 같은 비전문 항원 제시 세포); 자연 살해 세포; 대식세포, 호산구, 비만 세포, 호염기구 및 과립구와 같은 골수 세포를 포함한다.
용어 "거부"는 이식된 장기 또는 조직이 수용체의 신체에 의해 수용되지 않는 상태를 지칭한다. 거부는 이식된 장기 또는 조직을 공격하는 수용체의 면역 시스템로부터 초래된다. 거부는 이식 후 며칠 내지 몇주 (급성) 또는 이식 후 몇개월 내지 몇년 (만성)까지 발생할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "이식편대숙주병" 또는 "GVHD"는 유전적으로 상이한 개체로부터 이식된 조직을 수용한 후의 의학적 합병증을 지칭한다. 공여된 조직 (이식)의 면역 세포는 수용체 (숙주)를 외래의 것으로 인식한다. 이식된 면역 세포는 숙주의 신체 세포를 공격한다. GVHD는 일반적으로 줄기세포 이식과 관련되나, 이 용어는 다른 형태의 조직 이식으로부터 발생하는 GVHD를 포함한다. 수혈 후 GVHD가 발생할 수도 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "면역학적 내성" 또는 "면역 내성"은 다음과 같은 경우 비처리 대상체와 비교하여 처리 대상체의 비율에 대해 수행되는 방법을 지칭한다: a) 감소된 수준의 특이적 면역학적 반응 (적어도 부분적으로 항원-특이적 효과기 T 림프구, B 림프구, 항체, 또는 그의 균등물에 의해 매개될 것으로 여겨짐); b) 특이적 면역학적 반응의 개시 또는 진행 지연; 또는 c) 특이적 면역 반응의 개시 또는 진행 위험 감소. "특이적" 면역학적 또는 면역 내성은 다른 항원과 비교하여 특정 항원에 대해 면역학적 또는 면역 내성이 우선적으로 유발될 때 발생한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "작용 내성"은 감염을 포함한 다른 문제에 반응할 수 있는 면역 적격 숙주에서 적어도 1년 동안 임의의 면역억제 약물 요법의 부재 하의 급성 또는 만성 거부를 포함하여 조직학적 거부 징후가 없는 안정한 이식의 기능이 존재하는 임상 상황을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "면역 조절"은 장기 또는 조직 이식에 특이적인 수용체 내의 항체의 존재에도 불구하고, 장기 또는 조직 이식이 정상적으로 기능하는 이식 수용체의 상태를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "줄기세포"는 일반적으로 전능성 또는 다능성 줄기세포를 포함한다. "줄기세포"는 예를 들어 배아 줄기세포 (ES); 중간엽 줄기세포 (MSC); 유도 전능성 줄기세포 (iPS); 및 전용 전구 세포 (조혈 줄기세포 (HSC); 골수 유래 세포 등)를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "치료", "치료하는" 등은 적절한 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 획득하는 것을 지칭한다. 효과는 질병에 대한 부분적 또는 완전한 치료 및/또는 질병으로 인한 부작용에 대한 치료의 관점에서 치료적인 것일 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이 "치료"는 포유류, 예를 들어 인간에서 질병의 임의의 치료를 포함하고, 질병의 경감, 즉 질병의 퇴행 및/또는 질병의 하나 이상의 증상의 완화의 유발을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "예방, "예방한다", "예방하는" 등은 질병 또는 질병 상태에 대한 예방 또는 보호 치료를 제공하는 것을 의미한다. 이 효과는 질병 또는 그의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방한다는 점에서 예방적인 것일 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이 "예방"은 포유류, 예를 들어 인간에서 질병에 대한 임의의 예방 효과를 포함하고, (a) 질병의 소인이 있지만, 아직 발병한 것으로 진단되지는 않은 대상체에서 질병이 발생하는 것을 예방함; 및 (b) 질병의 억제, 즉 그 진행의 저지.
용어 "환자", "대상체", "개체", "숙주" 등은 본 명세서에서 상호 혼용되며, 시험관내 또는 현장에서, 기재된 방법에 적합한 임의의 동물 또는 그의 세포를 지칭한다. 용어 "환자", "대상체", "개체", "숙주" 등은 면역 반응이 유발될 수 있는 생존 유기체 (예를 들어, 포유류)를 포함하는 것으로 의도된다. "환자", "대상체", "개체", "숙주"의 예는 쥣과동물 (예를 들어, 랫트, 마우스), 토끼목동물 (예를 들어, 토끼), 비인간 영장류, 인간, 개, 고양이, 유제류 (예를 들어, 말, 소, 양, 돼지, 염소) 등 및 그의 트랜스제닉 종을 포함한다. 특정의 비 제한적인 실시형태에서, 환자, 대상체, 숙주 또는 개체는 인간이다.
용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 본 명세서에서 상호 혼용되고, 연구원, 수의사, 의사 또는 기타 임상의가 찾는 조직, 시스템 또는 대상체의 생물학적 또는 의학적 반응을 유발하는 치료제의 양, 또는 하나 이상의 치료제의 조합된 양을 지칭한다. 용어 "치료적 유효량"은 투여될 때 치료되는 장애 또는 질병의 하나 이상의 징후 또는 증상의 발생을 예방하거나, 일정 정도 완화시키기에 충분한 치료제의 양을 포함한다. 치료적 유효량은 치료제, 질병 및 그의 중증도 및 치료될 대상체의 연령, 중량 등에 따라 달라질 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "활성화"는 검출 가능한 세포 반응을 유도하기 위해 충분히 자극된 T 세포 (예를 들어, 조절 T 세포)의 상태를 지칭한다. 활성화는 또한 사이토카인 생성 또는 억제 활성과 같은 검출 가능한 효과기 기능 (들)과 관련될 수 있다. 용어 "활성화된" 조절 T 세포는 특히 면역 반응을 억제할 수 있는 조절 T 세포를 지칭한다.
용어 "키메라 항원 수용체" 또는 대안적으로 "CAR"은 항원 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인; 막관통 도메인; 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 도메인을 포함하는 재조합 폴리펩타이드 작제물을 지칭한다. 일 실시형태에서, CAR은 선택적으로 힌지를 포함한다. 용어 "키메라 수용체" 또는 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 특히, 면역 세포의 경우, 세포에 표적 리간드에 대한 특이성 및 세포내 신호 생성을 제공하는 하나의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 세트, 가장 단순한 실시형태에서 통상적으로 2개의 폴리펩타이드를 지칭할 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드 세트는 서로 인접한다. 일부 실시형태에서, 키메라 수용체는 폴리펩타이드 세트를 포함하는 키메라 융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드 세트는 2량체화 분자의 존재시 폴리펩타이드를 서로 결합시킬 수 있는 것으로, 예를 들어 리간드 결합 도메인을 세포내 신호전달 도메인에 연결할 수 있는 2량체화 스위치를 포함한다. 일 실시형태에서, 키메라 수용체는 키메라 수용체 융합 단백질의 아미노-말단 (N-ter)에서 선택적 선도 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 키메라 수용체는 세포외 리간드 결합 도메인의 N-말단에 선도 서열을 추가로 포함하며, 선도 서열은 세포 가동 및 키메라 수용체의 세포막으로의 위치화 동안 리간드 결합 도메인으로부터 선택적으로 절단된다.
용어 "신호전달 도메인"은 세포내에서 정보를 전송하여 규정된 신호전달 경로를 통해 세포 활성을 조절함으로써 작용하여 제2 메신저를 생성하거나, 이러한 메신저에 반응함으로써 효과기로서 기능하는 단백질의 기능성 부분을 지칭한다.
용어 "자가"는 후에 대상체으로 재도입될 동일한 대상체로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다.
용어 "동종이계"는 물질이 도입된 대상체와 동일한 종의 상이한 대상체로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다. 하나 이상의 유전자좌에서의 유전자가 동일하지 않은 경우, 2개 이상의 대상체는 서로에 대해 동종이계로 지칭된다. 일부 양상에서, 동일한 종의 대상체로부터의 동종이계 물질은 유전적으로 항원과 상호작용하기에 충분히 유사하지 않을 수 있다. 용어 "동종이식"은 동일한 종의 상이한 대상체로부터 유래된 이식을 지칭한다.
용어 "이종성"은 상이한 종의 대상체로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다. 용어 "이종이식"은 상이한 종의 대상체로부터 유래된 이식을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "지침 자료"는 본 발명의 조성물 및 방법의 유용성을 전달하는데 사용될 수 있는 간행물, 기록, 도표 또는 임의의 다른 표현 매체를 포함한다. 본 발명의 키트의 지침 자료는 예를 들어 본 발명의 핵산, 펩타이드, 세포 및/또는 조성물을 포함하는 용기에 부착되거나, 핵산, 펩타이드, 세포 및/또는 조성물을 포함하는 용기와 함께 운송될 수 있다. 대안적으로, 지침 자료는 지침 자료 및 핵산, 펩타이드, 세포 및/또는 조성물이 수용체에 의해 협력적으로 사용되도록 하기 위해 용기와 별도로 운송될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 아미노산 잔기/위치의 "변형"은 개시 아미노산 서열과 비교하여 1차 아미노산 서열의 변화를 지칭하며, 상기 변화는 상기 아미노산 잔기/위치를 포함하는 서열 변이로부터 초래된다. 예를 들어, 통상적인 변형은 잔기 (또는 상기 위치)의 다른 아미노산으로의 치환 (예를 들어, 보존적 또는 비 보존적 치환), 상기 잔기/위치에 인접한 하나 이상의 (일반적으로 5 또는 3 미만의) 아미노산의 삽입 및 상기 잔기/위치의 결실을 포함한다. "아미노산 치환" 또는 그의 변형은 소정의 (개시) 아미노산 서열에서 기존의 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 대체하는 것을 지칭한다. 일반적으로 및 바람직하게는, 변형은 개시 (또는 "야생형") 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드와 비교하여 변이 폴리펩타이드의 적어도 하나의 물리생화학적 활성을 변이시킨다. 예를 들어, 항체의 경우, 변이된 물리 생화학적 활성은 표적 분자에 대한 결합 친화도, 결합 능력 및/또는 결합 효과일 수 있다.
용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 항체 단편의 결합 특성에 유의하게 영향을 미치지 않거나, 이를 변이시키지 않는 아미노산 변형을 지칭한다. 이러한 보존적 변형은 아미노산 치환, 첨가 및 결실을 포함한다. 변형은 부위-지정 돌연변이 유발 및 PCR-매개 돌연변이 유발과 같은 당 업계에 공지된 표준 기술에 의해 본 발명의 항체 또는 항체 단편에 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 당 업계에 규정되어 있다. 이러한 패밀리는 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, 본 발명의 CAR 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고, 변이된 CAR은 본 명세서에 기재된 기능성 분석을 사용하여 시험될 수 있다.
용어 "자극"은 자극 분자 (예를 들어, TCR/CD3 복합체)와 그의 동족 리간드의 결합에 의해 유도되는 1차 반응을 지칭하며, 이는, 다음에 제한되는 것은 아니나, TCR/CD3 복합체를 통한 신호 도입과 같은 신호 도입 사건을 매개한다. 자극은 사이토카인 및 세포 표면 단백질의 상향조절 또는 하향조절, 및/또는 세포 골격 구조의 재구성 등과 같은 특정 분자의 변이된 발현을 매개할 수 있다.
용어 "자극 분자"는 T 세포 신호전달 경로의 적어도 일부 양상에 대해 자극 방식으로 TCR 복합체의 1차 활성화를 조절하는 1차 세포질 신호전달 서열 (들)을 제공하는 T 세포에 의해 발현되는 분자를 지칭한다. 일 양상에서, 1차 신호는 예를 들어 펩타이드가 부가된 MHC 분자와 TCR/CD3 복합체의 결합에 의해 개시되며, 이는 다음에 제한되는 것은 아니나 증식, 활성화, 분화 등을 포함하는 T 세포 반응의 매개를 야기한다. 자극 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호전달 서열 (또한 "1차 신호전달 도메인"으로 지칭됨)은 면역 수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)로 공지된 신호전달 모티프를 포함할 수 있다.
용어 "항원 제시 세포" 또는 "APC"는 T 세포와 같은 특정 림프구에 의한 인식을 위해 표면 상에 주요 조직적합성 복합체 (MHC)와 복합체화된 항원를 디스플레이 수 있는 보조 세포 (예를 들어, B 세포, 수지상 세포, 대식세포, 랑게르한스 세포 등)와 같은 면역 시스템 세포를 지칭한다. T 세포는 그의 T 세포 수용체 (TCR)를 사용하여 이들 복합체를 인식할 수 있다. 항원 제시 세포는 MHC와 함께 디스플레이하기 위해 항원을 처리할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "항원 제시 세포" 또는 "APC"는 APC가 항원을 디스플레이하는 상태 및 APC가 항원을 디스플레이하지 않는 상태를 포함한다. 일부 경우에, APC는 항원을 처리하여 T 세포에 이를 제시한다. 다른 경우에, T 세포는 TCR이 MHC 단백질에 직접 결합하는 항원 제시가 부재하는 경우 APC를 인식할 수 있다. 예를 들어, 이식과 관련하여, APC는 외래 MHC 단백질의 발현을 통해 T 세포를 직접 자극할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "세포내 신호전달 도메인"은 CAR의 세포내 부분을 지칭한다. 세포내 신호전달 도메인은 CAR 포함 세포, 예를 들어 CAR Treg 세포의 면역 효과기 기능을 촉진하는 신호를 생성한다. 예를 들어, CAR Treg 세포에서 면역 효과기 기능의 예는 다른 면역 세포의 효과기 기능의 억제 또는 하향조절을 포함할 수 있다. 다른 면역 세포는 임의의 유형의 백혈구, 예를 들어 (다음에 제한되는 것은 아니나) T 세포, B 세포, NK 세포를 포함한다. 또한, Treg의 면역 효과기 기능은 조직 복구 또는 재생 촉진과 같은 개선된 임상 상태를 초래하는 비 면역 세포에 대한 효과를 포함할 수 있다.
용어 "제타" 또는 대안적으로 "제타 사슬" 또는 "CD3-제타"는 GenBan 수탁번호 BAG36664.1로 제공되는 단백질 또는 비인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터의 균등한 잔기로서 규정되며, "제타 자극 도메인" 또는 "CD3-제타 자극 도메인"은 T 세포 활성화에 필요한 초기 신호를 기능적으로 전달하기에 충분한 제타 사슬의 세포질 도메인으로부터의 아미노산 잔기로 규정된다. 일 양상에서, 제타의 세포질 도메인은 GenBank 수탁번호 BAG36664.1의 잔기 52 내지 164 및 그의 기능성 오르소로그로서, 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 설치류, 원숭이, 유인원 등으로부터 유래된 균등한 잔기를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "공자극 리간드"는 T 세포 상의 동족 공자극 분자에 특이적으로 결합하여, 예를 들어, TCR/CD3 복합체와 펩타이드가 로딩된 MHC 분자와의 결합에 의해 제공되는 1차 신호에 추가하여, 다음에 제한되는 것은 아니나, 증식, 활성화, 분화 등을 포함하는 T 세포 반응을 매개하는 신호를 제공하는 항원 제시 세포 (예를 들어, APC, 수지상 세포, B 세포 등) 상의 분자를 포함한다. 공자극 리간드는 다음에 제한되는 것은 아니나, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, 유도성 공자극 리간드 (ICOS-L), 세포내 부착 분자 (ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, 림포톡신 베타 수용체, 3/TR6, ILT3, ILT4, HVEM, B7-H3과 특이적으로 결합하는 Toll 리간드 수용체 및 리간드에 결합하는 작용제 또는 항체를 포함할 수 있다. 공자극 리간드는 또한 특히, T 세포에 존재하는 공자극 분자, 예컨대, 다음에 제한되는 것은 아니나, MHC 클래스 I 분자, BTLA, Toll 리간드 수용체, OX40, CD27, CD28, 림프구 기능-관련 항원-1 (LFA-1) (CD11a/CD18), TNFR1 (CD120a/TNFRSF1A), TNFR2 (CD120b/TNFRSF1B), CTLA-4 (CD152), CD95, ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), CD2, CD30, CD40, PD-1, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ICAM-1, GITR, HVEM, SLAMF7, NKp80, CD160, IL2ra, IL6Ra, IL-7Ra, IL-13RA1/RA2, IL-33R(IL1RL1), IL-10RA/RB, IL-4R, IL-5R (CSF2RB), ARHR, BAFF 수용체, IL-21R, TGFbR1/2/3, 공통 감마 사슬, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, 및 그의 임의의 조합에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 리간드를 포함한다.
용어 "공자극 분자"는 공자극 리간드와 특이적으로 결합하여, 다음에 제한되는 것은 아니나, 증식과 같은 T 세포에 의한 공자극 반응을 매개하는 T 세포 상의 동족 결합 상대를 지칭한다. 공자극 분자는 효율적인 면역 반응에 필요한 항원 수용체 또는 그의 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. 공자극 분자는 다음 단백질 패밀리: TNF 수용체 단백질, 면역글로불린 유사 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자 (SLAM 단백질) 및 활성화 NK 세포 수용체로 나타낼 수 있다. 공자극 분자는 다음에 제한되는 것은 아니나 MHC 클래스 I 분자, BTLA, Toll 리간드 수용체, OX40, CD27, CD28, 림프구 기능-관련 항원-1 (LFA-1) (CD11a/CD18), TNFR1 (CD120a/TNFRSF1A), TNFR2 (CD120b/TNFRSF1B), CTLA-4 (CD152), CD95, ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), CD2, CD30, CD40, PD-1, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ICAM-1, GITR, HVEM, SLAMF7, NKp80, CD160, IL2ra, IL6Ra, IL-7Ra, IL-13RA1/RA2, IL-33R(IL1RL1), IL-10RA/RB, IL-4R, IL-5R (CSF2RB), ARHR, BAFF 수용체, IL-21R, TGFbR1/2/3, 공통 감마 사슬, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, 및 그의 임의의 조합을 포함한다.
"공자극 세포내 신호전달 도메인" 또는 "공자극 도메인"은 공자극 분자의 세포내 부분일 수 있다. 이러한 분자의 예는 MHC 클래스 I 분자, BTLA, Toll 리간드 수용체, OX40, CD27, CD28, 림프구 기능-관련 항원-1 (LFA-1) (CD11a/CD18), TNFR1 (CD120a/TNFRSF1A), TNFR2 (CD120b/TNFRSF1B), CTLA-4 (CD152), CD95, ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), CD2, CD30, CD40, PD-1, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ICAM-1, GITR, HVEM, SLAMF7, NKp80, CD160, IL2ra, IL6Ra, IL-7Ra, IL-13RA1/RA2, IL-33R(IL1RL1), IL-10RA/RB, IL-4R, IL-5R (CSF2RB), ARHR, BAFF 수용체, IL-21R, TGFbR1/2/3, 공통 감마 사슬, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "공자극 신호"는 1차 신호, 예컨대 TCR/CD3 결찰과 조합하여 T 세포 증식 및/또는 주요 분자의 상향조절 또는 하향조절을 야기하는 신호를 지칭한다.
세포내 신호전달 도메인은 이것이 유래하는 분자의 전체 세포내 부분 또는 전체 고유 세포내 신호전달 도메인, 또는 그의 기능성 단편을 포함할 수 있다.
"질병"은 동물이 항상성을 유지할 수 없고, 질병이 개선되지 않으면 동물의 건강이 계속 악화되는 동물의 건강 상태이다. 이와 달리, 동물의 "장애"는 동물이 항상성을 유지할 수 있지만, 동물의 건강 상태가 장애가 없을 때보다 덜 유리한 건강 상태이다. 치료되지 않은 상태에서 장애가 동물의 건강 상태를 추가로 감소시켜야 하는 것은 아니다.
용어 "인코딩"은 소정의 뉴클레오타이드 서열 (예를 들어, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는 소정의 아미노산 서열 및 이로부터 생성된 생물학적 특성을 갖는 생물학적 과정에서 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서 작용하는 유전자, cDNA 또는 mRNA와 같은 폴리뉴클레오타이드에서 뉴클레오타이드의 특정 서열의 고유한 특성을 지칭한다. 따라서, 유전자, cDNA 또는 RNA는 그 유전자에 해당하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생성하는 경우 단백질을 인코딩한다. 뉴클레오타이드 서열이 mRNA 서열과 동일하고, 일반적으로 서열 목록에 제공되는 코딩 가닥 및 유전자 또는 cDNA의 전사의 주형으로서 사용되는 비-코딩 가닥 둘 모두는 그 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 다른 산물을 인코딩하는 것으로서 지칭될 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 핵산 서열은 서로의 변성 버전이고, 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 모든 뉴클레오타이드 또는 핵산 서열을 포함한다. 단백질 또는 RNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 핵산 서열이라는 어구는 또한 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 또는 핵산 서열이 일부 버전에서 인트론 (들)을 포함할 수 있는 정도로 인트론을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "이식"은 대상체에 도입된 세포, 조직 또는 장기를 지칭한다. 이식된 물질의 공급원은 배양된 세포, 다른 대상체로부터의 세포 또는 동일한 대상체의 세포일 수 있다 (예를 들어, 세포가 시험관내에서 배양된 후). 예시적인 장기 이식은 신장, 간, 심장, 폐 및 췌장이다. 예시적인 조직 이식은 췌도이다. 예시적인 세포 이식은 동종이계 조혈 줄기세포 이식이다.
용어 "외인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템으로부터 도입되거나, 그 외부에서 생성된 임의의 물질을 지칭한다.
용어 "발현"은 프로모터에 의해 유도되는 특정 뉴클레오타이드 서열의 전사 및/또는 번역을 지칭한다.
용어 "발현 벡터"는 발현될 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스-작용 요소를 포함하고; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포에 의하거나, 시험관내 발현 시스템에서 공급될 수 있다. 발현 벡터는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 코스미드, 플라스미드 (예를 들어, 네이키드 (naked) 또는 리포좀에 포함됨) 및 바이러스 (예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 연관 바이러스)를 포함하여 당 업계에 공지된 모든 것을 포함한다.
용어 "렌티바이러스"는 레트로비리다에 (Retroviridae) 패밀리의 속을 지칭한다. 렌티바이러스는 비 분열 세포를 감염시킬 수 있는 레트로바이러스 중에서 고유하며; 이는 상당한 양의 유전자 정보를 숙주 세포의 DNA에 전달할 수 있으므로, 유전자 전달 벡터의 가장 효율적인 방법 중 하나이다. HIV, SIV 및 FIV는 모두 렌티바이러스의 예이다.
용어 "렌티바이러스 벡터"는 문헌[Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)]에 제공되는 바와 같이, 특히 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터를 포함하는 렌티바이러스 게놈의 적어도 일부로부터 유래되는 벡터를 지칭한다. 임상에 사용될 수 있는 렌티바이러스 벡터의 다른 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 Oxford BioMedica의 LENTIVECTOR® 유전자 전달 기술, Lentigen의 LENTIMAX™ 벡터 시스템 등을 포함한다. 비 임상 유형의 렌티바이러스 벡터가 또한 이용 가능하고, 당업자에게 공지되어 있을 것이다.
용어 "상동성" 또는 "동일성"은 2개의 중합체 분자, 예를 들어 2개의 핵산 분자, 예컨대 2개의 DNA 분자 또는 2개의 RNA 분자, 또는 2개의 폴리펩타이드 분자 사이의 하위단위 서열 동일성을 지칭한다. 2개의 분자 모두에서 하위단위 위치가 동일한 단량체 하위단위에 의해 점유될 때; 예를 들어, 2개의 DNA 분자 각각의 위치가 아데닌에 의해 점유되는 경우, 이는 그 위치에서 상동성이거나, 동일하다. 2개의 서열 사이의 상동성은 매칭 또는 상동성 위치의 수의 직접적인 함수이고; 예를 들어, 2개의 서열에서 위치의 절반 (예를 들어, 중합체에서 10개의 하위단위 길이의 5개의 위치)이 상동성인 경우, 2개의 서열은 50% 상동성이고; 위치의 90% (예를 들어, 9/10)가 매칭되거나, 상동성인 경우, 2개의 서열은 90% 상동성이다.
비인간 (예를 들어, 쥣과동물) 항체의 "인간화된" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 포함하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 그의 단편 (예를 들어, 항체의 Fv, scFv, Fab, scFab, sdAb, Fab', F(ab')2 또는 다른 항원 결합 하위서열)이다. 대부분의 경우, 인간화 항체 및 그의 항체 단편은, 수용체의 상보성 결정 영역 (CDR)으로부터의 잔기가 적절한 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비-인간 종 (공여체 항체) 예컨대 마우스, 랫트 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린 (수용체 항체 또는 항체 단편)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 해당 비인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체/항체 단편은 수용체 항체 또는 유입된 CDR 또는 프레임워크 서열에 존재하지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 또는 항체 단편 성능을 추가로 개선하고, 최적화할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체 또는 그의 항체 단편은 실질적으로 모든 적어도 하나의, 통상적으로는 2개의 가변 도메인을 포함할 것이고, 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비인간 면역글로불린의 것이며, 모든 또는 상당한 부분의 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체 또는 항체 단편은 또한 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 통상적으로 인간 면역글로불린의 것을 포함할 수 있다. 자세한 내용은 문헌[Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992을 참조한다.
"인간" 면역글로불린, 항체 또는 항체 단편은 항체 또는 항체 단편과 같은 면역글로불린을 지칭하며, 전체 분자는 인간 유래이거나, 항체 또는 면역글로불린의 인간 형태와 동일한 아미노산 서열로 구성된다.
용어 "단리된"은 자연 상태로부터 변이되거나, 제거된 것을 의미한다. 예를 들어, 생존 동물에 자연적으로 존재하는 핵산 또는 펩타이드는 "단리된" 것이 아니나, 자연 상태의 공존 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 동일한 핵산 또는 펩타이드는 "단리된" 것이다. 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 예를 들어 숙주 세포와 같은 비 천연 환경에 존재할 수 있다. "단리된 항체"는 자연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 것이다. 자연 환경의 오염 성분은 항체의 치료 용도를 방해하는 물질이며, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비 단백질성 용질을 포함할 수 있다.
본 발명과 관련하여, 일반적으로 존재하는 핵산 염기에 대해 다음 약어가 사용된다. "A"는 아데노신을 지칭하고, "C"는 시토신을 지칭하고, "G"는 구아노신을 지칭하고, "T"는 티미딘을 지칭하며, "U"는 우리 딘을 지칭한다.
용어 "작동 가능하게 연결된"은 조절 서열과 이종 핵산 서열 사이의 기능성 연결을 지칭하며, 이는 후자의 발현을 야기한다. 예를 들어, 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능성 관계로 배치될 때 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열과 작동 가능하게 연결된 것이다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우, 프로모터는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 것이다. 작동 가능하게 연결된 DNA 서열은 서로 인접할 수 있으며, 예를 들어, 2개의 단백질 코딩 영역에 결합하기 위해 필요한 경우, 동일한 판독 프레임에 존재한다.
면역원성 조성물의 "비경구" 투여라는 용어는 예를 들어 피하 (s.c.), 피내, 결절내, 골수내, 복강내, 정맥내 (i.v.), 근육내 (i.m.), 또는 흉골내 주사, 종양내 또는 주입 기술을 포함한다.
본 명세서에서 상호 혼용되는 용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태인 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드를 지칭한다. 따라서, 이 용어는 다음에 제한되는 것은 아니나, 퓨린 및 피리미딘 염기 또는 다른 천연의, 화학적 또는 생화학적 변형, 비 천연 또는 유도체화 뉴클레오타이드 염기를 포함하는 단일, 이중 또는 다중 가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 혼성체, 또는 중합체를 포함한다. 따라서, 특별히 제한되지 않는 한, 이 용어는 기준 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고, 천연 발생 뉴클레오타이드와 유사한 방식으로 대사되는 공지된 천연 뉴클레오타이드 유사체를 포함하는 핵산을 포함한다. 달리 지시되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 그의 보존적으로 변형된 변이체 (예를 들어, 변성 코돈 치환), 대립유전자, 오르쏘로그, SNP 및 상보적 서열뿐만 아니라, 명시적으로 지정된 서열을 함축적으로 포함한다. 구체적으로, 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 제 3 위치가 혼합-기재 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 변성 코돈 치환이 달성될 수 있다 (문헌[Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); and Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)]).
용어 "펩타이드", "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 상호 혼용되며, 펩타이드 결합에 의해 공유 결합 연결된 아미노산 잔기로 구성된 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩타이드는 적어도 2개의 아미노산을 포함해야 하며, 단백질 또는 펩타이드의 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 개수는 제한되지 않는다. 폴리펩타이드는 펩타이드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩타이드 또는 단백질을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 상기 용어는 당 업계에서 일반적으로 펩타이드, 올리고 펩타이드 및 올리고머로 지칭되는 단쇄, 예를 들어, 많은 유형이 존재하고, 당 업계에서 일반적으로 단백질로 지칭되는 장쇄 둘 모두를 지칭한다. "폴리펩타이드"는 특히, 예를 들어 생물학적 활성 단편, 실질적으로 상동성 폴리펩타이드, 올리고펩타이드, 동종이량체, 이종이량체, 폴리펩타이드의 변이체, 변형된 폴리펩타이드, 유도체, 유사체, 융합 단백질을 포함한다. 폴리펩타이드는 천연 펩타이드, 재조합 펩타이드 또는 이들의 조합을 포함한다.
용어 "프로모터/조절 서열"은 프로모터/조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자 산물의 발현에 필요한 핵산 서열을 지칭한다. 일부 경우에, 이 서열은 코어 프로모터 서열일 수 있고, 다른 경우에, 이 서열은 또한 인핸서 서열 및 유전자 산물의 발현에 필요한 다른 조절 요소를 포함할 수 있다. 프로모터/조절 서열은 예를 들어 조직 특이적 방식으로 유전자 산물을 발현하는 것일 수 있다.
용어 "항시적" 프로모터는 유전자 산물을 인코딩하거나 특정하는 폴리뉴클레오타이드와 작동 가능하게 연결된 경우, 세포의 대부분 또는 모든 생리적 조건 하에 세포에서 유전자 산물이 생성되도록 하는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다.
용어 "유도성" 프로모터는 유전자 산물을 인코딩하거나 특정하는 폴리뉴클레오타이드와 작동 가능하게 연결된 경우, 실질적으로, 프로모터에 해당하는 유도제가 세포에 존재하는 경우에만 세포에서 유전자 산물이 생성되도록 하는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "일시적"은 수시간, 수일 또는 수주 동안의 비 혼입 전이유전자의 발현을 지칭하며, 게놈 내로 혼입되거나, 숙주 세포에서 안정한 플라스미드 레플리콘 내에 포함된 경우, 발현 기간은 유전자의 발현 기간보다 더 짧다.
용어 "실질적으로 정제된" 세포는 필수적으로 다른 세포 유형이 부재하는 세포를 지칭한다. 실질적으로 정제된 세포는 또한 일반적으로 천연 발생 상태와 관련된 다른 세포 유형으로부터 분리된 세포를 지칭한다. 일부 경우에, 실질적으로 정제된 세포 집합은 동종 세포 집합을 지칭한다. 다른 경우에, 이 용어는 단순히, 자연 상태에서 자연적으로 관련된 세포로부터 분리된 세포를 지칭한다. 일부 양상에서, 세포는 시험관내에서 배양된다. 다른 양상에서, 세포는 시험관내에서 배양되지 않는다.
용어 "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된"은 외인성 핵산이 숙주 세포 내로 전달되거나, 도입되는 과정을 지칭한다. "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된"세포는 외인성 핵산으로 형질감염, 형질전환 또는 형질도입된 세포이다. 세포는 1차 대상 세포 및 그의 자손을 포함한다.
본 발명의 다양한 양상은 본 개시내용 전반에 걸쳐 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 설명은 단지 편의 및 간결성을 위한 것이며, 본 발명의 범위에 대한 가변적이지 않은 제한으로 해석되어서는 안된다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 범위의 설명은 모든 가능한 하위 범위뿐만 아니라, 그 범위 내의 개별 수치를 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 설명은 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 하위 범위뿐만 아니라, 그 범위 내의 개별 수치, 예를 들어, 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, 및 6을 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 다른 예로 95 내지 99% 동일성과 같은 범위에는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 것이며, 96 내지 99%, 96 내지 98%, 96 내지 97%, 97 내지 99%, 97 내지 98% 및 98 내지 99% 동일성과 같은 하위 범위를 포함한다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
III. 항-HLA-A2 항체
일 양상에서, 본 발명은 항-HLA-A2 항체를 제공한다. 예시적 항체는 단일클론 항체, 다클론 항체, 재조합 항체, 키메라 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 및 그의 항원 결합 단편을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 인간화 항-HLA-A2 항체를 제공한다. 본 명세서에서 제공되는 인간화 항-HLA-A2 항체는 HLA-A2에 특이적으로 결합한다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 인간화 항-HLA-A2 항체는 HLA-A*02:01에 특이적으로 결합한다. 당업자가 이해하는 바와 같이, HLA-A2에 결합하는 항체의 능력은 당 업계에 공지된 기법의 사용을 통해 검출될 수 있다. 예를 들어, HLA-A2에 대한 항체의 결합은 본 명세서에 예시된 바와 같은 HLA-A2 4량체의 사용을 통해 검출될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 인간화 항-HLA-A2 항체는 HLA-A2와 결합하기 위해, SEQ ID NO: 183의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HCDR1); SEQ ID NO: 185의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HCDR2); SEQ ID NO: 187의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HCDR3); SEQ ID NO: 188의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LCDR1); SEQ ID NO: 189의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LCDR2); 및 SEQ ID NO: 190의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LCDR3)을 포함하는 항체와 경쟁한다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 인간화 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 183의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HCDR1); SEQ ID NO: 185의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HCDR2); SEQ ID NO: 187의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HCDR3); SEQ ID NO: 188의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LCDR1); SEQ ID NO: 189의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LCDR2); 및 SEQ ID NO: 190의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LCDR3)을 포함하는 항체와 동일한 HLA-A2 에피토프에 결합한다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 인간화 항-HLA-A2 항체는 HLA-A2와 결합하기 위해, BB7.2 항체와 경쟁한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 인간화 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 동일한 HLA-A2 에피토프에 결합한다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 인간화 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68 중 하나 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 인간화 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33,HLA-A*36, HLA-A*68 중 2개 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 인간화 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68 중 3개 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 인간화 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68 중 4개 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 인간화 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68 중 5개 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 인간화 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68 중 6개 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 인간화 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68 중 7개 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 인간화 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68의 각각의 것으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 인간화 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30 중 하나 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 인간화 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30 중 2개 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 인간화 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30의 각각의 것으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 인간화 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, f HLA-A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-A*36:01, 및 HLA-A*68:01 중 적어도 하나에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 인간화 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-A*36:01, 및 HLA-A*68:01 중 적어도 2개에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 인간화 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-A*36:01, 및 HLA-A*68:01 중 적어도 3개에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 인간화 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-A*36:01, 및 HLA-A*68:01 중 적어도 4개에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 인간화 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-A*36:01, 및 HLA-A*68:01 중 적어도 5개에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 인간화 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-A*36:01, 및 HLA-A*68:01 중 적어도 6개에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 인간화 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-A*36:01, 및 HLA-A*68:01 중 적어도 7개에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 인간화 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-A*36:01, 및 HLA-A*68:01에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 인간화 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, f HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, 및 HLA-A*30:01 중 적어도 하나에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 인간화 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, 및 HLA-A*30:01 중 적어도 2개에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 인간화 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, 및 HLA-A*30:01에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 인간화 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*25:01에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 인간화 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*29:02에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 인간화 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*30:01에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 인간화 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*03:01에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 인간화 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*31:01에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 인간화 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*33:01에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 인간화 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*36:01에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 인간화 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*68:01에 대한 반응성이 더 작다. BB7.2 항체는 BB7.2 하이브리도마 (ATCC 수탁 번호 HB-82)로부터 단리될 수 있다.
HLA-A 하위유형에 대한 인간화 항-HLA-A2 항체의 반응성을 결정하기 위한 기법은 당업자에 공지되어 있다. 예를 들어, HLA-A 하위유형에 대한 인간화 항-HLA-A2 항체의 반응성은 단일 항원 비드 분석에 의해 결정될 수 있다. 이러한 단일 항원 비드 분석은 시판되는 것을 사용할 수 있다 (예를 들어, FlowPRA 단일 항원 항체; ONE LAMBDA).
일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 인간화 항-HLA-A2 항체는 시험 A의 조건 하에 측정하는 경우, BB7.2 항체와 비교하여, 예를 들어, BB7.2 scFv와 비교하여, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68, 및 그의 임의의 조합 중 하나 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 인간화 항-HLA-A2 항체는 시험 A의 조건 하에 측정하는 경우, BB7.2 항체와 비교하여, 예를 들어, BB7.2 scFv와 비교하여, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, 및 그의 임의의 조합 중 하나 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작다.
시험 A:
인간화 항-HLA-A2 항체 또는 BB7.2 항체, 예를 들어, BB7.2 scFv (mA2 CAR)를 포함하는 CAR을 발현하는 0.25.106개의 T 세포를 FlowPRA 단일 항원 항체 비드 패널 (FL1HD01, FL1HD02, FL1HD03, FL1HD04, FL1HD06 및 FL1HD08, One Lambda) 및 고정성 생존 염료 (FVD, ThermoFisher, 65-0865-14, eBioscience)와 함께 실온에서 30분 동안 인큐베이션한다. 샘플을 세척하고, 0.5% 포름알데하이드로 고정하고, 유세포 분석을 통해 분석한다. 샘플 당 200개의 음성 대조군 비드가 획득된다. 비드 단독을 음성 대조군으로 사용하였다. 분석을 위해, 고정성 생존 염료를 사용하여 사멸 세포를 먼저 제거한다. 그 후, 사멸 세포 및 이중체를 제외한 후 단일 항원 비드를 유입시킨다. 이어서, HLA당 비드 수를 각각의 PE 강도 피크에 의해 결정한다. 각 HLA-피크에서 대상 비드 수에 200을 곱하고, 샘플 중 음성 비드 수로 나누어 데이터를 정규화한다. 각각의 HLA-피크에 대해, 대조군 샘플의 비드 수로부터 CAR-Treg의 비드 수를 뺀 후, 비-CAR-발현 대조군의 평균 비드 수를 나누고, 100을 곱하여, 대조군 (비-CAR-발현 세포)과 비교한 CAR Treg의 상대 결합 백분율을 결정한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 인간화 항-HLA-A2 항체는 예를 들어, 시험 A의 조건 하에 측정하는 경우, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68을 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 BB7.2 항체보다 통계적으로 더 작다.
일 실시형태에서, 본 발명의 항-HLA-A2 항체는 예를 들어, 시험 A의 조건 하에 측정하는 경우, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30을 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 BB7.2 항체보다 통계적으로 더 작다.
일 실시형태에서, 용어 "통계적으로 더 작은"은 본 발명의 항-HLA-A2 항체에 대해 측정된 반응성 (예를 들어, 시험 A의 조건에서의 상대 결합)이 BB7.2 항체에 대해 측정된 반응성보다 더 작은 것을 의미하며, 특히 2원 ANOVA, Dunnett 사후 시험에 의해 분석한 경우, p 값은 최대한 약 0.05, 바람직하게는 최대한 약 0.01, 더욱 바람직하게는 최대한 약 0.005, 및 훨씬 더욱 바람직하게는 최대한 약 0.001이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 항-HLA-A2 항체는 HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68을 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 BB7.2 항체보다 더 작다. 일부 실시형태에서, 이러한 항-HLA-A2 항체는 시험 A의 조건 하에 측정한 경우, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68을 포함하는 군으로부터 선택되는 에 적어도 하나의 HLA-A 하위유형과의 상대적 결합이 BB7.2 항체보다 더 작다. 특정 양상에서, 이러한 항-HLA-A2 항체에 대해 측정된 상대 결합은 BB7.2 항체의 최대한 약 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 이하이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 항-HLA-A2 항체는 HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30을 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 BB7.2 항체보다 더 작다. 일부 실시형태에서, 이러한 항-HLA-A2 항체는 시험 A의 조건 하에 측정한 경우, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30을 포함하는 군으로부터 선택되는 에 적어도 하나의 HLA-A 하위유형과의 상대적 결합이 BB7.2 항체보다 더 작다. 특정 양상에서, 이러한 항-HLA-A2 항체에 대해 측정된 상대 결합은 BB7.2 항체에 대해 측정된 상대 결합의 최대한 약 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 이하이다.
추가로, 항원 결합 활성을 갖는 본 명세서에 제공되는 인간화 항-HLA-A2 항체는 키메라 항원 수용체 (CAR)의 항원 결합 도메인을 구성할 수 있고, 이러한 CAR은 인간 세포에서 발현될 수 있음으로써, CAR은 HLA-A2에 특이적으로 결합한다. 일 실시형태에서, CAR은 HLA-A*02:01에 특이적으로 결합한다. 당업자가 이해하는 바와 같이, HLA-A2에 결합하는 CAR의 능력은 당 업계에 공지된 기법의 사용을 통해 검출될 수 있다. 예를 들어, HLA-A2에 대한 CAR의 결합은 본 명세서에 예시된 바와 같은 HLA-A2 4량체의 사용을 통해 검출될 수 있다. 일 실시형태에서, 인간 세포는 면역 세포이다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 조절 면역 세포이다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 T 조절 세포 (Treg)이다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 T 세포이다. 일 실시형태에서, T 세포는 Treg이다. 추가로, 항원 결합 활성을 갖는 본 명세서에 제공되는 인간화 항-HLA-A2 항체는 키메라 항원 수용체 (CAR)의 항원 결합 도메인을 구성할 수 있고, 이러한 CAR은 T 조절 세포 (Treg)에서 발현될 수 있음으로써, CAR은 HLA-A2에 특이적으로 결합한다. 일 실시형태에서, CAR은 HLA-A*02:01에 특이적으로 결합한다. 일 실시형태에서, Treg는 인간 Treg이다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 CAR의 항원 결합 도메인을 구성할 수 있고, 이러한 CAR은 면역 세포에서 발현될 수 있음으로써, 면역 세포는 HLA-A2에 의해 활성화된다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 HLA-A*02:01에 의해 활성화된다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 조절 면역 세포이다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 T 조절 세포 (Treg)이다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 T 세포이다. 일 실시형태에서, T 세포는 Treg이다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 인간 면역 세포이다. 일 실시형태에서, 조절 면역 세포는 인간 조절 면역 세포이다. 일 실시형태에서, T 세포는 인간 T 세포이다. 일 실시형태에서, Treg는 인간 Treg이다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 SYHIQ (SEQ ID NO: 1) 및 GYTFTSY (SEQ ID NO: 2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 1 내지 2로부터 선택되는 상보성 결정 영역 1 (VH CDR1)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 1에 제시된 VH CDR1을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 2에 제시된 VH CDR1을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 YPGDGS (SEQ ID NO: 4) 및 WIYPGDGSTX10YX12X13KFX16G (SEQ ID NO: 10) (SEQ ID NO: 10에서, 위치 10의 아미노산 (X10)은 Q 또는 K이고, 위치 12의 아미노산 (X12)은 N 또는 S이고, 위치 13의 아미노산 (X13)은 E 또는 Q이고, 위치 16의 아미노산 (X16)은 K 또는 Q임)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 아미노산 서열 WIYPGDGSTX10YX12X13KFX16G (SEQ ID NO: 10) (위치 10의 아미노산 (X10)은 Q 또는 K이고, 위치 12의 아미노산 (X12)은 N 또는 S이고, 위치 13의 아미노산 (X13)은 E 또는 Q이고, 위치 16의 아미노산 (X16)은 K 또는 Q임)를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 YPGDGS (SEQ ID NO: 4) 및 WIYPGDGSTX10YX12X13KFX16G (SEQ ID NO: 10) (SEQ ID NO: 10에서, 위치 10의 아미노산 (X10)은 Q 또는 K이고, 위치 12의 아미노산 (X12)은 N 또는 S이고, 위치 13의 아미노산 (X13)은 E 또는 Q이고, 위치 16의 아미노산 (X16)은 K 또는 Q임)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정 영역 2 (VH CDR2)를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 아미노산 서열 WIYPGDGSTX10YX12X13KFX16G (SEQ ID NO: 10) (위치 10의 아미노산 (X10)은 Q 또는 K이고, 위치 12의 아미노산 (X12)은 N 또는 S이고, 위치 13의 아미노산 (X13)은 E 또는 Q이고, 위치 16의 아미노산 (X16)은 K 또는 Q임)를 포함하는 상보성 결정 영역 2 (VH CDR2)를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10 (위치 10의 아미노산은 Q 또는 K이고, 위치 12의 아미노산은 S이고, 위치 13의 아미노산은 Q이고, 위치 16의 아미노산은 Q임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2를 포함한다. 일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10 (위치 10의 아미노산은 K이고, 위치 12의 아미노산은 N 또는 S이고, 위치 13의 아미노산은 Q이고, 위치 16의 아미노산은 Q임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2를 포함한다. 일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10 (위치 10의 아미노산은 K이고, 위치 12의 아미노산은 S이고, 위치 13의 아미노산은 E 또는 Q이고, 위치 16의 아미노산은 Q임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2를 포함한다. 일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10 (위치 10의 아미노산은 K이고, 위치 12의 아미노산은 S이고, 위치 13의 아미노산은 Q이고, 위치 16의 아미노산은 K 또는 Q임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2를 포함한다. 일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10 (위치 10의 아미노산은 Q 또는 K이고, 위치 12의 아미노산은 N 또는 S이고, 위치 13의 아미노산은 Q이고, 위치 16의 아미노산은 Q임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2를 포함한다. 일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10 (위치 10의 아미노산은 Q 또는 K이고, 위치 12의 아미노산은 S이고, 위치 13의 아미노산은 E 또는 Q이고, 위치 16의 아미노산은 Q임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2를 포함한다. 일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10 (위치 10의 아미노산은 Q 또는 K이고, 위치 12의 아미노산은 S이고, 위치 13의 아미노산은 Q이고, 위치 16의 아미노산은 K 또는 Q임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2를 포함한다. 일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10 (위치 10의 아미노산은 K이고, 위치 12의 아미노산은 N 또는 S이고, 위치 13의 아미노산은 E 또는 Q이고, 위치 16의 아미노산은 Q임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2를 포함한다. 일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10 (위치 10의 아미노산은 K이고, 위치 12의 아미노산은 N 또는 S이고, 위치 13의 아미노산은 Q이고, 위치 16의 아미노산은 K 또는 Q임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2를 포함한다. 일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10 (위치 10의 아미노산은 K이고, 위치 12의 아미노산은 S이고, 위치 13의 아미노산은 E 또는 Q이고, 위치 16의 아미노산은 K 또는 Q임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2를 포함한다. 일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10 (위치 10의 아미노산은 Q 또는 K이고, 위치 12의 아미노산은 N 또는 S이고, 위치 13의 아미노산은 E 또는 Q이고, 위치 16의 아미노산은 Q임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2를 포함한다. 일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10 (위치 10의 아미노산은 Q 또는 K이고, 위치 12의 아미노산은 N 또는 S이고, 위치 13의 아미노산은 Q이고, 위치 16의 아미노산은 K 또는 Q임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2를 포함한다. 일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10 (위치 10의 아미노산은 Q 또는 K이고, 위치 12의 아미노산은 S이고, 위치 13의 아미노산은 E 또는 Q이고, 위치 16의 아미노산은 K 또는 Q임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2를 포함한다. 일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 10 (위치 10의 아미노산은 K이고, 위치 12의 아미노산은 N 또는 S이고, 위치 13의 아미노산은 E 또는 Q이고, 위치 16의 아미노산은 K 또는 Q임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2를 포함한다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 WIYPGDGSTQYNEKFKG (SEQ ID NO: 3), YPGDGS (SEQ ID NO: 4), 및 WIYPGDGSTKYSQKFQG (SEQ ID NO: 5)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 WIYPGDGSTQYNEKFKG (SEQ ID NO: 3) 및 YPGDGS (SEQ ID NO: 4)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 YPGDGS (SEQ ID NO: 4) 및 WIYPGDGSTKYSQKFQG (SEQ ID NO: 5)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 3 내지 5로부터 선택되는 상보성 결정 영역 2 (VH CDR2)를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 3 내지 4로부터 선택되는 상보성 결정 영역 2 (VH CDR2)를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 4 내지 5로부터 선택되는 상보성 결정 영역 2 (VH CDR2)를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 5에 제시된 상보성 결정 영역 2 (VH CDR2)를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 3에 제시된 VH CDR2를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 4에 제시된 VH CDR2를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 아미노산 서열 EGTYYAMDY (SEQ ID NO: 6)를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 6에 제시된 상보성 결정 영역 3 (VH CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 다음 CDR 중 적어도 하나를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다:
SEQ ID NO: 1에 제시된 VH CDR1; 또는
SEQ ID NO: 10 (위치 10의 아미노산 (X10)은 Q 또는 K이고, 위치 12의 아미노산 (X12)은 N 또는 S이고, 위치 13의 아미노산 (X13)은 E 또는 Q이고, 위치 16의 아미노산 (X16)은 K 또는 Q임)에 제시된 VH CDR2; 또는
SEQ ID NO: 6에 제시된 VH CDR3.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 다음 CDR 중 적어도 하나를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다:
SEQ ID NO: 1에 제시된 VH CDR1; 또는
SEQ ID NO: 3에 제시된 VH CDR2; 또는
SEQ ID NO: 6에 제시된 VH CDR3.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 다음 CDR 중 적어도 하나를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다:
SEQ ID NO: 1에 제시된 VH CDR1; 또는
SEQ ID NO: 5에 제시된 VH CDR2; 또는
SEQ ID NO: 6에 제시된 VH CDR3.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 1에 제시된 하나의 VH CDR1; SEQ ID NO: 10에 제시된 하나의 VH CDR2 (위치 10의 아미노산 (X10)은 Q 또는 K이고, 위치 12의 아미노산 (X12)은 N 또는 S이고, 위치 13의 아미노산 (X13)은 E 또는 Q이고, 위치 16의 아미노산 (X16)은 K 또는 Q임); 및 SEQ ID NO: 6에 제시된 하나의 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 1에 제시된 하나의 VH CDR1; SEQ ID NO: 3에 제시된 하나의 VH CDR2; 및 SEQ ID NO: 6에 제시된 하나의 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 1에 제시된 하나의 VH CDR1; SEQ ID NO: 5에 제시된 하나의 VH CDR2; 및 SEQ ID NO: 6에 제시된 하나의 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명에 따르면, 중쇄의 CDR 1, 2 또는 3 중 임의의 것은 해당 SEQ ID NO: 1, 3, 5, 6 및 10에 열거된 특정 CDR 세트와 적어도 약 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 다음 CDR 중 적어도 하나를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다:
SEQ ID NO: 2에 제시된 VH CDR1; 또는
SEQ ID NO: 4에 제시된 VH CDR2; 또는
SEQ ID NO: 6에 제시된 VH CDR3.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 2에 제시된 하나의 VH CDR1; SEQ ID NO: 4에 제시된 하나의 VH CDR2; 및 SEQ ID NO: 6에 제시된 하나의 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명에 따르면, 중쇄의 CDR 1, 2 또는 3 중 임의의 것은 해당 SEQ ID NO: 2, 4 및 6에 열거된 특정 CDR 세트와 적어도 약 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 아미노산 서열 RSSQSIVHSNGNTYLE (SEQ ID NO: 7)를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 7에 제시된 상보성 결정 영역 1 (VL CDR1)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 아미노산 서열 KVSNRFS (SEQ ID NO: 8)를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 8에 제시된 상보성 결정 영역 2 (VL CDR2)를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 아미노산 서열 FQGSHVPRT (SEQ ID NO: 9)를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 9에 제시된 상보성 결정 영역 3 (VL CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 다음 CDR 중 적어도 하나를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다:
SEQ ID NO: 7에 제시된 VL CDR1; 또는
SEQ ID NO: 8에 제시된 VL CDR2; 또는
SEQ ID NO: 9에 제시된 VL CDR3.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 7에 제시된 하나의 VL CDR1; SEQ ID NO: 8에 제시된 하나의 VL CDR2; 및 SEQ ID NO: 9에 제시된 하나의 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명에 따르면, 경쇄의 CDR 1, 2 또는 3 중 임의의 것은 해당 SEQ ID NO: 7, 8 및 9에 열거된 특정 CDR 세트와 적어도 약 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS (SEQ ID NO: 11) 및 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 12)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 1 (VH FR1)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 아미노산 서열 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS (SEQ ID NO: 11)를 포함하는 프레임워크 영역 1 (VH FR1)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 11에 대해 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 1 (VH FR1)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 아미노산 서열 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 12)를 포함하는 프레임워크 영역 1 (VH FR1)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 12에 대해 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 1 (VH FR1)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는
WVRQAPGQX9LEWMGX15 (SEQ ID NO: 13),
WVRQAPGQX9LEWMGX15WI (SEQ ID NO: 17),
HIQWVRQAPGQX12LEWMGX18WI (SEQ ID NO: 21), 및
HIQWVRQAPGQX12LEWMGX18 (SEQ ID NO: 25)
(SEQ ID NO: 13에서 X9는 R 또는 G이고, X15는 I 또는 부재하고;
SEQ ID NO: 17에서 X9는 R 또는 G이고, X15는 I 또는 부재하고;
SEQ ID NO: 21에서 X12는 R 또는 G이고, X18은 I 또는 부재하고;
SEQ ID NO: 25에서 X12는 R 또는 G이고, X18은 I 또는 부재함)
로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 2 (VH FR2)를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 아미노산 서열 WVRQAPGQX9LEWMGX15 (SEQ ID NO: 13) (위치 9의 아미노산 (X9)은 R 또는 G이고, 위치 15의 아미노산 (X15)은 I 또는 부재함)를 포함하는 프레임워크 영역 2 (VH FR2)를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 13 (위치 9의 아미노산은 R 또는 G이고, 위치 15의 아미노산은 부재함)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 2 (VH FR2)를 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 14, 15, 또는 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 2 (VH FR2)를 포함한다. 일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 14, 15, 또는 16에 대해 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 2 (VH FR2)를 포함한다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 아미노산 서열 HIQWVRQAPGQX12LEWMGX18 (SEQ ID NO: 25) (위치 12의 아미노산 (X12)은 R 또는 G이고, 위치 18의 아미노산은 (X18)은 I 또는 부재함)를 포함하는 프레임워크 영역 2 (VH FR2)를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 25 (위치 12의 아미노산은 R 또는 G이고, 위치 18의 아미노산은 부재함)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 2 (VH FR2)를 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 26, 27, 또는 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 2 (VH FR2)를 포함한다. 일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 26, 27, 또는 28에 대해 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 2 (VH FR2)를 포함한다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 아미노산 서열 WVRQAPGQX9LEWMGX15WI (SEQ ID NO: 17) (위치 9의 아미노산 (X9)은 R 또는 G이고, 위치 15의 아미노산 (X15)은 I 또는 부재함)를 포함하는 프레임워크 영역 2 (VH FR2)를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 17 (위치 9의 아미노산은 R 또는 G이고, 위치 15의 아미노산은 부재함)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 2 (VH FR2)를 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 18, 19, 또는 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 2 (VH FR2)를 포함한다. 일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 18, 19, 또는 20에 대해 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 2 (VH FR2)를 포함한다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 아미노산 서열 HIQWVRQAPGQX12LEWMGX18WI (SEQ ID NO: 21) (위치 12의 아미노산 (X12)은 R 또는 G이고, 위치 18의 아미노산 (X18)은 I 또는 부재함)를 포함하는 프레임워크 영역 2 (VH FR2)를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 21 (위치 12의 아미노산은 R 또는 G이고, 위치 18의 아미노산은 부재함)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 2 (VH FR2)를 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 22, 23, 또는 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 2 (VH FR2)를 포함한다. 일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 22, 23, 또는 24에 대해 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 2 (VH FR2)를 포함한다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는
X1VTX4TX6DTSX10STAYMX16LSX19LRSX23DX25AVYYCAR (SEQ ID NO: 29),
TX2YX4X5KFX8GX10VTX13TX15DTSX19STAYMX25LSX28LRSX32DX34AVYYCAR (SEQ ID NO: 35),
TQYNEKFKGX10VTX13TX15DTSX19STAYMX25LSX28LRSX32DX34AVYYCAR (SEQ ID NO: 36), 및
TKYSQKFQGX10VTX13TX15DTSX19STAYMX25LSX28LRSX32DX34AVYYCAR (SEQ ID NO: 37)
(SEQ ID NO: 29에서 X1은 R 또는 부재하고, X4는 I 또는 M이고, X6은 R 또는 A이고, X10은 A, T 또는 I이고, X16은 E 또는 L이고, X19는 S 또는 R이고, X23은 E 또는 D이고, X25는 T 또는 M이고;
SEQ ID NO: 35에서 X2는 Q 또는 K이고, X4는 N 또는 S이고, X5는 E 또는 Q이고, X8은 K 또는 Q이고, X10은 R 또는 부재하고, X13은 I 또는 M이고, X15는 R 또는 A이고, X19는 A, T 또는 I이고, X25는 E 또는 L이고, X28은 S 또는 R이고, X32는 E 또는 D이고, X34는 T 또는 M이고;
SEQ ID NO: 36에서 X10은 R 또는 부재하고, X13은 I 또는 M이고, X15는 R 또는 A이고, X19는 A, T 또는 I이고, X25는 E 또는 L이고, X28은 S 또는 R이고, X32는 E 또는 D이고, X34는 T 또는 M이고;
SEQ ID NO: 37에서 X10은 R 또는 부재하고, X13은 I 또는 M이고, X15는 R 또는 A이고, X19는 A, T 또는 I이고, X25는 E 또는 L이고, X28은 S 또는 R이고, X32는 E 또는 D이고, X34는 T 또는 M임)
로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 3 (VH FR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 아미노산 서열 X1VTX4TX6DTSX10STAYMX16LSX19LRSX23DX25AVYYCAR (SEQ ID NO: 29) (위치 1의 아미노산 (X1)은 R 또는 부재하고, 위치 4의 아미노산 (X4)은 I 또는 M이고, 위치 6의 아미노산 (X6)은 R 또는 A이고, 위치 10의 아미노산 (X10)은 A, T 또는 I이고, 위치 16의 아미노산 (X16)은 E 또는 L이고, 위치 19의 아미노산 (X19)은 S 또는 R이고, 위치 23의 아미노산 (X23)은 E 또는 D이고, 위치 25의 아미노산 (X25)은 T 또는 M임)를 포함하는 프레임워크 영역 3 (VH FR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 29 (위치 1의 아미노산은 R이고, 위치 4의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 6의 아미노산은 R이고, 위치 10의 아미노산은 A 또는 I이고, 위치 16의 아미노산은 E이고, 위치 19의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 23의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 25의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 3 (VH FR3)을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 29 (위치 1의 아미노산은 R이고, 위치 4의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 6의 아미노산은 R이고, 위치 10의 아미노산은 A 또는 I이고, 위치 16의 아미노산은 E이고, 위치 19의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 23의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 25의 아미노산은 T임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 3 (VH FR3)을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 29 (위치 1의 아미노산은 R이고, 위치 4의 아미노산은 I이고, 위치 6의 아미노산은 R이고, 위치 10의 아미노산은 A이고, 위치 16의 아미노산은 E이고, 위치 19의 아미노산은 S이고, 위치 23의 아미노산은 E이고, 위치 25의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 3 (VH FR3)을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 30, 31, 32, 33, 또는 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 3 (VH FR3)을 포함한다. 일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 30, 31, 32, 33, 또는 34에 대해 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 3 (VH FR3)을 포함한다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 아미노산 서열 TX2YX4X5KFX8GX10VTX13TX15DTSX19STAYMX25LSX28LRSX32DX34
AVYYCAR (SEQ ID NO: 35) (위치 2의 아미노산 (X2)은 Q 또는 K이고, 위치 4의 아미노산 (X4)은 N 또는 S이고, 위치 5의 아미노산 (X5)은 E 또는 Q이고, 위치 8의 아미노산 (X8)은 K 또는 Q이고, 위치 10의 아미노산 (X10)은 R 또는 부재하고, 위치 13의 아미노산 (X13)은 I 또는 M이고, 위치 15의 아미노산 (X15)은 R 또는 A이고, 위치 19의 아미노산 (X19)은 A, T 또는 I이고, 위치 25의 아미노산 (X25)은 E 또는 L이고, 위치 28의 아미노산 (X28)은 S 또는 R이고, 위치 32의 아미노산 (X32)은 E 또는 D이고, 위치 34의 아미노산 (X34)은 T 또는 M임)를 포함하는 프레임워크 영역 3 (VH FR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 35 (위치 2의 아미노산은 Q 또는 K이고, 위치 4의 아미노산은 N 또는 S이고, 위치 5의 아미노산은 E 또는 Q이고, 위치 8의 아미노산은 K 또는 Q이고, 위치 10의 아미노산은 R이고, 위치 13의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 15의 아미노산은 R이고, 위치 19의 아미노산은 A 또는 I이고, 위치 25의 아미노산은 E이고, 위치 28의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 32의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 34의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 3 (VH FR3)을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 35 (위치 2의 아미노산은 Q 또는 K이고, 위치 4의 아미노산은 N 또는 S이고, 위치 5의 아미노산은 E 또는 Q이고, 위치 8의 아미노산은 K 또는 Q이고, 위치 10의 아미노산은 R이고, 위치 13의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 15의 아미노산은 R이고, 위치 19의 아미노산은 A 또는 I이고, 위치 25의 아미노산은 E이고, 위치 28의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 32의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 34의 아미노산은 T임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 3 (VH FR3)을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 35 (위치 2의 아미노산은 Q 또는 K이고, 위치 4의 아미노산은 N 또는 S이고, 위치 5의 아미노산은 E 또는 Q이고, 위치 8의 아미노산은 K 또는 Q이고, 위치 10의 아미노산은 R이고, 위치 13의 아미노산은 I이고, 위치 15의 아미노산은 R이고, 위치 19의 아미노산은 A이고, 위치 25의 아미노산은 E이고, 위치 28의 아미노산은 S이고, 위치 32의 아미노산은 E이고, 위치 34의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 3 (VH FR3)을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 35 (위치 2의 아미노산은 Q 또는 K이고, 위치 4의 아미노산은 N이고, 위치 5의 아미노산은 E이고, 위치 8의 아미노산은 K이고, 위치 10의 아미노산은 R이고, 위치 13의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 15의 아미노산은 R이고, 위치 19의 아미노산은 A 또는 I이고, 위치 25의 아미노산은 E이고, 위치 28의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 32의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 34의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 3 (VH FR3)을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 35 (위치 2의 아미노산은 Q이고, 위치 4의 아미노산은 N 또는 S이고, 위치 5의 아미노산은 E이고, 위치 8의 아미노산은 K이고, 위치 10의 아미노산은 R이고, 위치 13의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 15의 아미노산은 R이고, 위치 19의 아미노산은 A 또는 I이고, 위치 25의 아미노산은 E이고, 위치 28의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 32의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 34의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 3 (VH FR3)을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 35 (위치 2의 아미노산은 Q이고, 위치 4의 아미노산은 N이고, 위치 5의 아미노산은 E 또는 Q이고, 위치 8의 아미노산은 K이고, 위치 10의 아미노산은 R이고, 위치 13의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 15의 아미노산은 R이고, 위치 19의 아미노산은 A 또는 I이고, 위치 25의 아미노산은 E이고, 위치 28의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 32의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 34의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 3 (VH FR3)을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 35 (위치 2의 아미노산은 Q이고, 위치 4의 아미노산은 N이고, 위치 5의 아미노산은 E이고, 위치 8의 아미노산은 K 또는 Q이고, 위치 10의 아미노산은 R이고, 위치 13의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 15의 아미노산은 R이고, 위치 19의 아미노산은 A 또는 I이고, 위치 25의 아미노산은 E이고, 위치 28의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 32의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 34의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 3 (VH FR3)을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 35 (위치 2의 아미노산은 Q 또는 K이고, 위치 4의 아미노산은 N 또는 S이고, 위치 5의 아미노산은 E이고, 위치 8의 아미노산은 K이고, 위치 10의 아미노산은 R이고, 위치 13의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 15의 아미노산은 R이고, 위치 19의 아미노산은 A 또는 I이고, 위치 25의 아미노산은 E이고, 위치 28의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 32의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 34의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 3 (VH FR3)을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 35 (위치 2의 아미노산은 Q 또는 K이고, 위치 4의 아미노산은 N이고, 위치 5의 아미노산은 E 또는 Q이고, 위치 8의 아미노산은 K이고, 위치 10의 아미노산은 R이고, 위치 13의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 15의 아미노산은 R이고, 위치 19의 아미노산은 A 또는 I이고, 위치 25의 아미노산은 E이고, 위치 28의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 32의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 34의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 3 (VH FR3)을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 35 (위치 2의 아미노산은 Q 또는 K이고, 위치 4의 아미노산은 N이고, 위치 5의 아미노산은 E이고, 위치 8의 아미노산은 K 또는 Q이고, 위치 10의 아미노산은 R이고, 위치 13의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 15의 아미노산은 R이고, 위치 19의 아미노산은 A 또는 I이고, 위치 25의 아미노산은 E이고, 위치 28의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 32의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 34의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 3 (VH FR3)을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 35 (위치 2의 아미노산은 Q이고, 위치 4의 아미노산은 N 또는 S이고, 위치 5의 아미노산은 E 또는 Q이고, 위치 8의 아미노산은 K이고, 위치 10의 아미노산은 R이고, 위치 13의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 15의 아미노산은 R이고, 위치 19의 아미노산은 A 또는 I이고, 위치 25의 아미노산은 E이고, 위치 28의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 32의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 34의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 3 (VH FR3)을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 35 (위치 2의 아미노산은 Q이고, 위치 4의 아미노산은 N 또는 S이고, 위치 5의 아미노산은 E이고, 위치 8의 아미노산은 K 또는 Q이고, 위치 10의 아미노산은 R이고, 위치 13의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 15의 아미노산은 R이고, 위치 19의 아미노산은 A 또는 I이고, 위치 25의 아미노산은 E이고, 위치 28의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 32의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 34의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 3 (VH FR3)을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 35 (위치 2의 아미노산은 Q이고, 위치 4의 아미노산은 N이고, 위치 5의 아미노산은 E 또는 Q이고, 위치 8의 아미노산은 K 또는 Q이고, 위치 10의 아미노산은 R이고, 위치 13의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 15의 아미노산은 R이고, 위치 19의 아미노산은 A 또는 I이고, 위치 25의 아미노산은 E이고, 위치 28의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 32의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 34의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 3 (VH FR3)을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 35 (위치 2의 아미노산은 Q 또는 K이고, 위치 4의 아미노산은 N 또는 S이고, 위치 5의 아미노산은 E 또는 Q이고, 위치 8의 아미노산은 K이고, 위치 10의 아미노산은 R이고, 위치 13의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 15의 아미노산은 R이고, 위치 19의 아미노산은 A 또는 I이고, 위치 25의 아미노산은 E이고, 위치 28의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 32의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 34의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 3 (VH FR3)을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 35 (위치 2의 아미노산은 Q 또는 K이고, 위치 4의 아미노산은 N 또는 S이고, 위치 5의 아미노산은 E이고, 위치 8의 아미노산은 K 또는 Q이고, 위치 10의 아미노산은 R이고, 위치 13의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 15의 아미노산은 R이고, 위치 19의 아미노산은 A 또는 I이고, 위치 25의 아미노산은 E이고, 위치 28의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 32의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 34의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 3 (VH FR3)을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 35 (위치 2의 아미노산은 Q 또는 K이고, 위치 4의 아미노산은 N이고, 위치 5의 아미노산은 E 또는 Q이고, 위치 8의 아미노산은 K 또는 Q이고, 위치 10의 아미노산은 R이고, 위치 13의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 15의 아미노산은 R이고, 위치 19의 아미노산은 A 또는 I이고, 위치 25의 아미노산은 E이고, 위치 28의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 32의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 34의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 3 (VH FR3)을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 35 (위치 2의 아미노산은 Q이고, 위치 4의 아미노산은 N 또는 S이고, 위치 5의 아미노산은 E 또는 Q이고, 위치 8의 아미노산은 K 또는 Q이고, 위치 10의 아미노산은 R이고, 위치 13의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 15의 아미노산은 R이고, 위치 19의 아미노산은 A 또는 I이고, 위치 25의 아미노산은 E이고, 위치 28의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 32의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 34의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 3 (VH FR3)을 포함한다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 아미노산 서열 TQYNEKFKGX10VTX13TX15DTSX19STAYMX25LSX28LRSX32DX34
AVYYCAR (SEQ ID NO: 36) (위치 10의 아미노산 (X10)은 R 또는 부재하고, 위치 13의 아미노산 (X13)은 I 또는 M이고, 위치 15의 아미노산 (X15)은 R 또는 A이고, 위치 19의 아미노산 (X19)은 A, T 또는 I이고, 위치 25의 아미노산 (X25)은 E 또는 L이고, 위치 28의 아미노산 (X28)은 S 또는 R이고, 위치 32의 아미노산 (X32)은 E 또는 D이고, 위치 34의 아미노산 (X34)은 T 또는 M임)를 포함하는 프레임워크 영역 3 (VH FR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 36 (위치 10의 아미노산은 R이고, 위치 13의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 15의 아미노산은 R이고, 위치 19의 아미노산은 A 또는 I이고, 위치 25의 아미노산은 E이고, 위치 28의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 32의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 34의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 3 (VH FR3)을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 36 (위치 10의 아미노산은 R이고, 위치 13의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 15의 아미노산은 R이고, 위치 19의 아미노산은 A 또는 I이고, 위치 25의 아미노산은 E이고, 위치 28의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 32의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 34의 아미노산은 T임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 3 (VH FR3)을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 36 (위치 10의 아미노산은 R이고, 위치 13의 아미노산은 I이고, 위치 15의 아미노산은 R이고, 위치 19의 아미노산은 A이고, 위치 25의 아미노산은 E이고, 위치 28의 아미노산은 S이고, 위치 32의 아미노산은 E이고, 위치 34의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 3 (VH FR3)을 포함한다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 아미노산 서열 TKYSQKFQGX10VTX13TX15DTSX19STAYMX25LSX28LRSX32DX34AVYYCAR (SEQ ID NO: 37) (위치 10의 아미노산 (X10)은 R 또는 부재하고, 위치 13의 아미노산 (X13)은 I 또는 M이고, 위치 15의 아미노산 (X15)은 R 또는 A이고, 위치 19의 아미노산 (X19)은 A, T 또는 I이고, 위치 25의 아미노산 (X25)은 E 또는 L이고, 위치 28의 아미노산 (X28)은 S 또는 R이고, 위치 32의 아미노산 (X32)은 E 또는 D이고, 위치 34의 아미노산 (X34)은 T 또는 M임)를 포함하는 프레임워크 영역 3 (VH FR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 37 (위치 10의 아미노산은 R이고, 위치 13의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 15의 아미노산은 R이고, 위치 19의 아미노산은 A 또는 I이고, 위치 25의 아미노산은 E이고, 위치 28의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 32의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 34의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 3 (VH FR3)을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 37 (위치 10의 아미노산은 R이고, 위치 13의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 15의 아미노산은 R이고, 위치 19의 아미노산은 A 또는 I이고, 위치 25의 아미노산은 E이고, 위치 28의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 32의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 34의 아미노산은 T임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 3 (VH FR3)을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 37 (위치 10의 아미노산은 R이고, 위치 13의 아미노산은 I이고, 위치 15의 아미노산은 R이고, 위치 19의 아미노산은 A이고, 위치 25의 아미노산은 E이고, 위치 28의 아미노산은 S이고, 위치 32의 아미노산은 E이고, 위치 34의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 3 (VH FR3)을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 38, 39, 40, 41, 42, 또는 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 3 (VH FR3)을 포함한다. 일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 38, 39, 40, 41, 42, 또는 43에 대해 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 3 (VH FR3)을 포함한다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 아미노산 서열 WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 44)를 포함하는 프레임워크 영역 4 (VH FR4)를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 44에 대해 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 4 (VH FR4)를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 다음을 포함한다:
SEQ ID NO: 1에 제시된 VH CDR1;
SEQ ID NO: 10 (위치 10의 아미노산 (X10)은 Q 또는 K이고, 위치 12의 아미노산 (X12)은 N 또는 S이고, 위치 13의 아미노산 (X13)은 E 또는 Q이고, 위치 16의 아미노산 (X16)은 K 또는 Q임)에 제시된 VH CDR2;
SEQ ID NO: 6에 제시된 VH CDR3;
SEQ ID NO: 12에 제시된 VH FR1;
SEQ ID NO: 13에 제시된 VH FR2 (위치 9의 아미노산 (X9)은 R 또는 G이고, 위치 15의 아미노산 (X15)은 I 또는 부재함);
SEQ ID NO: 29에 제시된 VH FR3 (위치 1의 아미노산 (X1)은 R 또는 부재하고, 위치 4의 아미노산 (X4)은 I 또는 M이고, 위치 6의 아미노산 (X6)은 R 또는 A이고, 위치 10의 아미노산 (X10)은 A, T 또는 I이고, 위치 16의 아미노산 (X16)은 E 또는 L이고, 위치 19의 아미노산 (X19)은 S 또는 R이고, 위치 23의 아미노산 (X23)은 E 또는 D이고, 위치 25의 아미노산 (X25)은 T 또는 M임); 및
SEQ ID NO: 44에 제시된 VH FR4.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 다음을 포함한다:
SEQ ID NO: 2에 제시된 VH CDR1;
SEQ ID NO: 10 (위치 10의 아미노산 (X10)은 Q 또는 K이고, 위치 12의 아미노산 (X12)은 N 또는 S이고, 위치 13의 아미노산 (X13)은 E 또는 Q이고, 위치 16의 아미노산 (X16)은 K 또는 Q임)에 제시된 VH CDR2;
SEQ ID NO: 6에 제시된 VH CDR3;
SEQ ID NO: 11에 제시된 VH FR1;
SEQ ID NO: 25에 제시된 VH FR2 (위치 12의 아미노산 (X12)은 R 또는 G이고, 위치 18의 아미노산은 (X18)은 I 또는 부재함);
SEQ ID NO: 29에 제시된 VH FR3 (위치 1의 아미노산 (X1)은 R 또는 부재하고, 위치 4의 아미노산 (X4)은 I 또는 M이고, 위치 6의 아미노산 (X6)은 R 또는 A이고, 위치 10의 아미노산 (X10)은 A, T 또는 I이고, 위치 16의 아미노산 (X16)은 E 또는 L이고, 위치 19의 아미노산 (X19)은 S 또는 R이고, 위치 23의 아미노산 (X23)은 E 또는 D이고, 위치 25의 아미노산 (X25)은 T 또는 M임); 및
SEQ ID NO: 44에 제시된 VH FR4.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 다음을 포함한다:
SEQ ID NO: 2에 제시된 VH CDR1;
SEQ ID NO:4에 제시된 VH CDR2;
SEQ ID NO: 6에 제시된 VH CDR3;
SEQ ID NO: 11에 제시된 VH FR1;
SEQ ID NO: 21에 제시된 VH FR2 (위치 12의 아미노산 (X12)은 R 또는 G이고, 위치 18의 아미노산은 (X18)은 I 또는 부재함);
SEQ ID NO: 35에 제시된 VH FR3 (위치 2의 아미노산 (X2)은 Q 또는 K이고, 위치 4의 아미노산 (X4)은 N 또는 S이고, 위치 5의 아미노산 (X5)은 E 또는 Q이고, 위치 8의 아미노산 (X8)은 K 또는 Q이고, 위치 10의 아미노산 (X10)은 R 또는 부재하고, 위치 13의 아미노산 (X13)은 I 또는 M이고, 위치 15의 아미노산 (X15)은 R 또는 A이고, 위치 19의 아미노산 (X19)은 A, T 또는 I이고, 위치 25의 아미노산 (X25)은 E 또는 L이고, 위치 28의 아미노산 (X28)은 S 또는 R이고, 위치 32의 아미노산 (X32)은 E 또는 D이고, 위치 34의 아미노산 (X34)은 T 또는 M임); 및
SEQ ID NO: 44에 제시된 VH FR4.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 다음을 포함한다:
SEQ ID NO: 1에 제시된 VH CDR1;
SEQ ID NO:4에 제시된 VH CDR2;
SEQ ID NO: 6에 제시된 VH CDR3;
SEQ ID NO: 12에 제시된 VH FR1;
SEQ ID NO: 17에 제시된 VH FR2 (위치 9의 아미노산 (X9)은 R 또는 G이고, 위치 15의 아미노산 (X15)은 I 또는 부재함);
SEQ ID NO: 35에 제시된 VH FR3 (위치 2의 아미노산 (X2)은 Q 또는 K이고, 위치 4의 아미노산 (X4)은 N 또는 S이고, 위치 5의 아미노산 (X5)은 E 또는 Q이고, 위치 8의 아미노산 (X8)은 K 또는 Q이고, 위치 10의 아미노산 (X10)은 R 또는 부재하고, 위치 13의 아미노산 (X13)은 I 또는 M이고, 위치 15의 아미노산 (X15)은 R 또는 A이고, 위치 19의 아미노산 (X19)은 A, T 또는 I이고, 위치 25의 아미노산 (X25)은 E 또는 L이고, 위치 28의 아미노산 (X28)은 S 또는 R이고, 위치 32의 아미노산 (X32)은 E 또는 D이고, 위치 34의 아미노산 (X34)은 T 또는 M임); 및
SEQ ID NO: 44에 제시된 VH FR4.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 아미노산 서열 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQX44LEWMGX50WIYPGDGSTX60YX62X63KFX66GX68VTX71TX73DTSX77STAYMX83LSX86LRSX90DX92AVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 45) (위치 44의 아미노산 (X44)은 R 또는 G이고, 위치 50의 아미노산 (X50)은 I 또는 부재하고, 위치 60의 아미노산 (X60)은 Q 또는 K이고, 위치 62의 아미노산 (X62)은 N 또는 S이고, 위치 63의 아미노산 (X63)은 E 또는 Q이고, 위치 66의 아미노산 (X66)은 K 또는 Q이고, 위치 68의 아미노산 (X68)은 R 또는 부재하고, 위치 71의 아미노산 (X71)은 I 또는 M이고, 위치 73의 아미노산 (X73)은 R 또는 A이고, 위치 77의 아미노산 (X77)은 A, T 또는 I이고, 위치 83의 아미노산 (X83)은 E 또는 L이고, 위치 86의 아미노산 (X86)은 S 또는 R이고, 위치 90의 아미노산 (X90)은 E 또는 D이고, 위치 92의 아미노산 (X92)은 T 또는 M임)를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 45 (위치 44의 아미노산은 R 또는 G이고; 위치 50의 아미노산은 부재하고; 위치 60의 아미노산은 Q 또는 K이고; 위치 62의 아미노산은 N 또는 S이고; 위치 63의 아미노산은 E 또는 Q이고; 위치 66의 아미노산은 K 또는 Q이고; 위치 68의 아미노산은 R이고; 위치 71의 아미노산은 I 또는 M이고; 위치 73의 아미노산은 R이고; 위치 77의 아미노산은 A 또는 I이고; 위치 83의 아미노산은 E이고; 위치 86의 아미노산은 S 또는 R이고; 위치 90의 아미노산은 E 또는 D이고; 위치 92의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 45 (위치 44의 아미노산은 R 또는 G이고, 위치 50의 아미노산은 부재하고, 위치 60의 아미노산은 Q 또는 K이고; 위치 62의 아미노산은 N 또는 S이고; 위치 63의 아미노산은 E 또는 Q이고; 위치 66의 아미노산은 K 또는 Q이고; 위치 68의 아미노산은 R이고, 위치 71의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 73의 아미노산은 R이고, 위치 77의 아미노산은 A 또는 I이고, 위치 83의 아미노산은 E이고, 위치 86의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 90의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 92의 아미노산은 T임)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 45 (위치 44의 아미노산은 R이고, 위치 50의 아미노산은 부재하고, 위치 60의 아미노산은 Q 또는 K이고; 위치 62의 아미노산은 N 또는 S이고; 위치 63의 아미노산은 E 또는 Q이고; 위치 66의 아미노산은 K 또는 Q이고; 위치 68의 아미노산은 R이고, 위치 71의 아미노산은 I이고, 위치 73의 아미노산은 R이고, 위치 77의 아미노산은 A이고, 위치 83의 아미노산은 E이고, 위치 86의 아미노산은 S이고, 위치 90의 아미노산은 E이고, 위치 92의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 45 (위치 44의 아미노산은 R 또는 G이고, 위치 50의 아미노산은 부재하고, 위치 60의 아미노산은 Q이고; 위치 62의 아미노산은 N이고; 위치 63의 아미노산은 E이고; 위치 66의 아미노산은 K이고; 위치 68의 아미노산은 R이고, 위치 71의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 73의 아미노산은 R이고, 위치 77의 아미노산은 A 또는 I이고, 위치 83의 아미노산은 E이고, 위치 86의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 90의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 92의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 45 (위치 44의 아미노산은 R 또는 G이고, 위치 50의 아미노산은 부재하고, 위치 60의 아미노산은 Q이고; 위치 62의 아미노산은 N이고; 위치 63의 아미노산은 E이고; 위치 66의 아미노산은 K이고; 위치 68의 아미노산은 R이고, 위치 71의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 73의 아미노산은 R이고, 위치 77의 아미노산은 A 또는 I이고, 위치 83의 아미노산은 E이고, 위치 86의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 90의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 92의 아미노산은 T임)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 45 (위치 44의 아미노산은 R이고, 위치 50의 아미노산은 부재하고, 위치 60의 아미노산은 Q이고; 위치 62의 아미노산은 N이고; 위치 63의 아미노산은 E이고; 위치 66의 아미노산은 K이고; 위치 68의 아미노산은 R이고, 위치 71의 아미노산은 I이고, 위치 73의 아미노산은 R이고, 위치 77의 아미노산은 A이고, 위치 83의 아미노산은 E이고, 위치 86의 아미노산은 S이고, 위치 90의 아미노산은 E이고, 위치 92의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 45 (위치 44의 아미노산은 R 또는 G이고, 위치 50의 아미노산은 부재하고, 위치 60의 아미노산은 K이고; 위치 62의 아미노산은 S이고; 위치 63의 아미노산은 Q이고; 위치 66의 아미노산은 Q이고; 위치 68의 아미노산은 R이고, 위치 71의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 73의 아미노산은 R이고, 위치 77의 아미노산은 A 또는 I이고, 위치 83의 아미노산은 E이고, 위치 86의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 90의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 92의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 45 (위치 44의 아미노산은 R 또는 G이고, 위치 50의 아미노산은 부재하고, 위치 60의 아미노산은 K이고; 위치 62의 아미노산은 S이고; 위치 63의 아미노산은 Q이고; 위치 66의 아미노산은 Q이고; 위치 68의 아미노산은 R이고, 위치 71의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 73의 아미노산은 R이고, 위치 77의 아미노산은 A 또는 I이고, 위치 83의 아미노산은 E이고, 위치 86의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 90의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 92의 아미노산은 T임)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 45 (위치 44의 아미노산은 R이고, 위치 50의 아미노산은 부재하고, 위치 60의 아미노산은 K이고; 위치 62의 아미노산은 S이고; 위치 63의 아미노산은 Q이고; 위치 66의 아미노산은 Q이고; 위치 68의 아미노산은 R이고, 위치 71의 아미노산은 I이고, 위치 73의 아미노산은 R이고, 위치 77의 아미노산은 A이고, 위치 83의 아미노산은 E이고, 위치 86의 아미노산은 S이고, 위치 90의 아미노산은 E이고, 위치 92의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 45 (위치 44의 아미노산은 R 또는 G이고, 위치 50의 아미노산은 부재하고, 위치 60의 아미노산은 Q 또는 K이고; 위치 62의 아미노산은 S이고; 위치 63의 아미노산은 Q이고; 위치 66의 아미노산은 Q이고; 위치 68의 아미노산은 R이고, 위치 71의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 73의 아미노산은 R이고, 위치 77의 아미노산은 A 또는 I이고, 위치 83의 아미노산은 E이고, 위치 86의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 90의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 92의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 45 (위치 44의 아미노산은 R 또는 G이고, 위치 50의 아미노산은 부재하고, 위치 60의 아미노산은 K이고; 위치 62의 아미노산은 N 또는 S이고; 위치 63의 아미노산은 Q이고; 위치 66의 아미노산은 Q이고; 위치 68의 아미노산은 R이고, 위치 71의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 73의 아미노산은 R이고, 위치 77의 아미노산은 A 또는 I이고, 위치 83의 아미노산은 E이고, 위치 86의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 90의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 92의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 45 (위치 44의 아미노산은 R 또는 G이고, 위치 50의 아미노산은 부재하고, 위치 60의 아미노산은 K이고; 위치 62의 아미노산은 S이고; 위치 63의 아미노산은 E 또는 Q이고; 위치 66의 아미노산은 Q이고; 위치 68의 아미노산은 R이고, 위치 71의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 73의 아미노산은 R이고, 위치 77의 아미노산은 A 또는 I이고, 위치 83의 아미노산은 E이고, 위치 86의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 90의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 92의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 45 (위치 44의 아미노산은 R 또는 G이고, 위치 50의 아미노산은 부재하고, 위치 60의 아미노산은 K이고; 위치 62의 아미노산은 S이고; 위치 63의 아미노산은 Q이고; 위치 66의 아미노산은 K 또는 Q이고; 위치 68의 아미노산은 R이고, 위치 71의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 73의 아미노산은 R이고, 위치 77의 아미노산은 A 또는 I이고, 위치 83의 아미노산은 E이고, 위치 86의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 90의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 92의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 45 (위치 44의 아미노산은 R 또는 G이고, 위치 50의 아미노산은 부재하고, 위치 60의 아미노산은 Q 또는 K이고; 위치 62의 아미노산은 N 또는 S이고; 위치 63의 아미노산은 Q이고; 위치 66의 아미노산은 Q이고; 위치 68의 아미노산은 R이고, 위치 71의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 73의 아미노산은 R이고, 위치 77의 아미노산은 A 또는 I이고, 위치 83의 아미노산은 E이고, 위치 86의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 90의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 92의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 45 (위치 44의 아미노산은 R 또는 G이고, 위치 50의 아미노산은 부재하고, 위치 60의 아미노산은 Q 또는 K이고; 위치 62의 아미노산은 S이고; 위치 63의 아미노산은 E 또는 Q이고; 위치 66의 아미노산은 Q이고; 위치 68의 아미노산은 R이고, 위치 71의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 73의 아미노산은 R이고, 위치 77의 아미노산은 A 또는 I이고, 위치 83의 아미노산은 E이고, 위치 86의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 90의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 92의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 45 (위치 44의 아미노산은 R 또는 G이고, 위치 50의 아미노산은 부재하고, 위치 60의 아미노산은 Q 또는 K이고; 위치 62의 아미노산은 S이고; 위치 63의 아미노산은 Q이고; 위치 66의 아미노산은 K 또는 Q이고; 위치 68의 아미노산은 R이고, 위치 71의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 73의 아미노산은 R이고, 위치 77의 아미노산은 A 또는 I이고, 위치 83의 아미노산은 E이고, 위치 86의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 90의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 92의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 45 (위치 44의 아미노산은 R 또는 G이고, 위치 50의 아미노산은 부재하고, 위치 60의 아미노산은 K이고; 위치 62의 아미노산은 N 또는 S이고; 위치 63의 아미노산은 E 또는 Q이고; 위치 66의 아미노산은 Q이고; 위치 68의 아미노산은 R이고, 위치 71의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 73의 아미노산은 R이고, 위치 77의 아미노산은 A 또는 I이고, 위치 83의 아미노산은 E이고, 위치 86의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 90의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 92의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 45 (위치 44의 아미노산은 R 또는 G이고, 위치 50의 아미노산은 부재하고, 위치 60의 아미노산은 K이고; 위치 62의 아미노산은 N 또는 S이고; 위치 63의 아미노산은 Q이고; 위치 66의 아미노산은 K 또는 Q이고; 위치 68의 아미노산은 R이고, 위치 71의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 73의 아미노산은 R이고, 위치 77의 아미노산은 A 또는 I이고, 위치 83의 아미노산은 E이고, 위치 86의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 90의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 92의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 45 (위치 44의 아미노산은 R 또는 G이고, 위치 50의 아미노산은 부재하고, 위치 60의 아미노산은 K이고; 위치 62의 아미노산은 S이고; 위치 63의 아미노산은 E 또는 Q이고; 위치 66의 아미노산은 K 또는 Q이고; 위치 68의 아미노산은 R이고, 위치 71의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 73의 아미노산은 R이고, 위치 77의 아미노산은 A 또는 I이고, 위치 83의 아미노산은 E이고, 위치 86의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 90의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 92의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 45 (위치 44의 아미노산은 R 또는 G이고, 위치 50의 아미노산은 부재하고, 위치 60의 아미노산은 Q 또는 K이고; 위치 62의 아미노산은 N 또는 S이고; 위치 63의 아미노산은 E 또는 Q이고; 위치 66의 아미노산은 Q이고; 위치 68의 아미노산은 R이고, 위치 71의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 73의 아미노산은 R이고, 위치 77의 아미노산은 A 또는 I이고, 위치 83의 아미노산은 E이고, 위치 86의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 90의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 92의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 45 (위치 44의 아미노산은 R 또는 G이고, 위치 50의 아미노산은 부재하고, 위치 60의 아미노산은 Q 또는 K이고; 위치 62의 아미노산은 N 또는 S이고; 위치 63의 아미노산은 Q이고; 위치 66의 아미노산은 K 또는 Q이고; 위치 68의 아미노산은 R이고, 위치 71의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 73의 아미노산은 R이고, 위치 77의 아미노산은 A 또는 I이고, 위치 83의 아미노산은 E이고, 위치 86의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 90의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 92의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 45 (위치 44의 아미노산은 R 또는 G이고, 위치 50의 아미노산은 부재하고, 위치 60의 아미노산은 Q 또는 K이고; 위치 62의 아미노산은 S이고; 위치 63의 아미노산은 E 또는 Q이고; 위치 66의 아미노산은 K 또는 Q이고; 위치 68의 아미노산은 R이고, 위치 71의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 73의 아미노산은 R이고, 위치 77의 아미노산은 A 또는 I이고, 위치 83의 아미노산은 E이고, 위치 86의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 90의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 92의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 45 (위치 44의 아미노산은 R 또는 G이고, 위치 50의 아미노산은 부재하고, 위치 60의 아미노산은 K이고; 위치 62의 아미노산은 N 또는 S이고; 위치 63의 아미노산은 E 또는 Q이고; 위치 66의 아미노산은 K 또는 Q이고; 위치 68의 아미노산은 R이고, 위치 71의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 73의 아미노산은 R이고, 위치 77의 아미노산은 A 또는 I이고, 위치 83의 아미노산은 E이고, 위치 86의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 90의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 92의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 61, 62, 63, 64, 65, 또는 66에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 61, 62, 63, 64, 65, 또는 66에 대해 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 아미노산 서열 DX2VMTQX7PLSX11X12VTX15GQPASISX23 (SEQ ID NO: 46) (위치 2의 아미노산 (X2)은 V 또는 I이고, 위치 7의 아미노산 (X7)은 S 또는 T이고, 위치 11의 아미노산 (X11)은 L 또는 S이고; 위치 12의 아미노산 (X12)은 P 또는 S이고; 위치 15의 아미노산 (X15)은 L 또는 P이고, 위치 23의 아미노산 (X23)은 C 또는 F임)를 포함하는 프레임워크 영역 1 (VL FR1)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 46 (위치 2의 아미노산은 V 또는 I이고; 위치 7의 아미노산은 S 또는 T이고; 위치 11의 아미노산은 L 또는 S이고; 위치 12의 아미노산은 P 또는 S이고; 위치 15의 아미노산은 L 또는 P이고; 위치 23의 아미노산은 C임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 1 (VL FR1)을 포함한다.
일 실시형태에서, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 46 (위치 2의 아미노산은 I이고; 위치 7의 아미노산은 T이고; 위치 11의 아미노산은 L 또는 S이고; 위치 12의 아미노산은 P 또는 S이고; 위치 15의 아미노산은 L 또는 P이고; 위치 23의 아미노산은 C임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 1 (VL FR1)을 포함한다.
일 실시형태에서, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 46 (위치 2의 아미노산은 V 또는 I이고; 위치 7의 아미노산은 S 또는 T이고; 위치 11의 아미노산은 L이고; 위치 12의 아미노산은 P 또는 S이고; 위치 15의 아미노산은 L 또는 P이고; 위치 23의 아미노산은 C임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 1 (VL FR1)을 포함한다.
일 실시형태에서, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 46 (위치 2의 아미노산은 V 또는 I이고; 위치 7의 아미노산은 S 또는 T이고; 위치 11의 아미노산은 L 또는 S이고; 위치 12의 아미노산은 P이고; 위치 15의 아미노산은 L이고; 위치 23의 아미노산은 C임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 1 (VL FR1)을 포함한다.
일 실시형태에서, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 47, 48, 49, 또는 50에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 1 (VL FR1)을 포함한다. 일 실시형태에서, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 47, 48, 49, 또는 50에 대해 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 1 (VL FR1)을 포함한다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 아미노산 서열 WX2X3QX5PGQX9PX11X12LIY (SEQ ID NO: 51) (위치 2의 아미노산 (X2)은 F 또는 Y이고, 위치 3의 아미노산 (X3)은 Q 또는 L이고, 위치 5의 아미노산 (X5)은 R 또는 K이고, 위치 9의 아미노산 (X9)은 S 또는 P이고, 위치 11의 아미노산 (X11)은 R 또는 Q이고, 위치 12의 아미노산 (X12)은 R 또는 L임)를 포함하는 프레임워크 영역 2 (VL FR2)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 51 (위치 2의 아미노산은 Y이고, 위치 3의 아미노산은 Q 또는 L이고, 위치 5의 아미노산은 R 또는 K이고, 위치 9의 아미노산은 S 또는 P이고, 위치 11의 아미노산은 R 또는 Q이고, 위치 12의 아미노산은 L임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 2 (VL FR2)를 포함한다.
일 실시형태에서, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 51 (위치 2의 아미노산은 Y이고, 위치 3의 아미노산은 Q 또는 L이고, 위치 5의 아미노산은 R 또는 K이고, 위치 9의 아미노산은 S이고, 위치 11의 아미노산은 R 또는 Q이고, 위치 12의 아미노산은 L임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 2 (VL FR2)를 포함한다.
일 실시형태에서, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 51 (위치 2의 아미노산은 Y이고, 위치 3의 아미노산은 Q이고, 위치 5의 아미노산은 R이고, 위치 9의 아미노산은 S 또는 P이고, 위치 11의 아미노산은 R이고, 위치 12의 아미노산은 L임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 2 (VL FR2)를 포함한다.
일 실시형태에서, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 51 (위치 2의 아미노산은 F 또는 Y이고, 위치 3의 아미노산은 Q 또는 L이고, 위치 5의 아미노산은 R 또는 K이고, 위치 9의 아미노산은 S이고, 위치 11의 아미노산은 R 또는 Q이고, 위치 12의 아미노산은 R 또는 L임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 2 (VL FR2)을 포함한다.
일 실시형태에서, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 51 (위치 2의 아미노산은 F 또는 Y이고, 위치 3의 아미노산은 Q이고, 위치 5의 아미노산은 R이고, 위치 9의 아미노산은 S 또는 P이고, 위치 11의 아미노산은 R이고, 위치 12의 아미노산은 R 또는 L임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 2 (VL FR2)을 포함한다.
일 실시형태에서, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 52, 53, 54, 또는 55에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 2 (VL FR2)를 포함한다. 일 실시형태에서, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 52, 53, 54, 또는 55에 대해 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 2 (VL FR2)를 포함한다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 아미노산 서열 GVPDRFSGSGX11GTDFTLKISRVEAEDVGVYYC (SEQ ID NO: 56) (위치 11의 아미노산 (X11)은 S 또는 A임)를 포함하는 프레임워크 영역 3 (VL FR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 57 또는 58에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 3 (VL FR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 57 또는 58에 대해 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 3 (VL FR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 아미노산 서열 FGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 59)를 포함하는 프레임워크 영역 4 (VL FR4)를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 59에 대해 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열를 포함하는 프레임워크 영역 4 (VL FR4)를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 아미노산 서열 DX2VMTQX7PLSX11X12VTX15GQPASISX23RSSQSIVHSNGNTYLEWX41X42QX44PGQX48PX50X51LIYKVSNRFSGVPDRFSGSGX72GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 60) (위치 2의 아미노산 (X2)은 V 또는 I이고, 위치 7의 아미노산 (X7)은 S 또는 T이고, 위치 11의 아미노산 (X11)은 L 또는 S이고, 위치 12의 아미노산 (X12)은 P 또는 S이고, 위치 15의 아미노산 (X15)은 L 또는 P이고, 위치 23의 아미노산 (X23)은 C 또는 F이고, 위치 41의 아미노산 (X41)은 F 또는 Y이고, 위치 42의 아미노산 (X42)은 Q 또는 L이고, 위치 44의 아미노산 (X44)은 R 또는 K이고, 위치 48의 아미노산 (X48)은 S 또는 P이고, 위치 50의 아미노산 (X50)은 R 또는 Q이고, 위치 51의 아미노산 (X51)은 R 또는 L이고, 위치 72의 아미노산 (X72)은 S 또는 A임)를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 60 (위치 2의 아미노산은 V 또는 I이고, 위치 7의 아미노산은 S 또는 T이고, 위치 11의 아미노산은 L 또는 S이고, 위치 12의 아미노산은 P 또는 S이고, 위치 15의 아미노산은 L 또는 P이고, 위치 23의 아미노산은 C이고, 위치 41의 아미노산은 Y이고, 위치 42의 아미노산은 Q 또는 L이고, 위치 44의 아미노산은 R 또는 K이고, 위치 48의 아미노산은 S 또는 P이고, 위치 50의 아미노산은 R 또는 Q이고, 위치 51의 아미노산은 L이고, 위치 72의 아미노산은 S 또는 A임)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 60 (위치 2의 아미노산은 I이고, 위치 7의 아미노산은 T이고, 위치 11의 아미노산은 L 또는 S이고, 위치 12의 아미노산은 P 또는 S이고, 위치 15의 아미노산은 L 또는 P이고, 위치 23의 아미노산은 C이고, 위치 41의 아미노산은 Y이고, 위치 42의 아미노산은 Q 또는 L이고, 위치 44의 아미노산은 R 또는 K이고, 위치 48의 아미노산은 S 또는 P이고, 위치 50의 아미노산은 R 또는 Q이고, 위치 51의 아미노산은 L이고, 위치 72의 아미노산은 S 또는 A임)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 60 (위치 2의 아미노산은 V 또는 I이고, 위치 7의 아미노산은 S 또는 T이고, 위치 11의 아미노산은 L이고, 위치 12의 아미노산은 P 또는 S이고, 위치 15의 아미노산은 L 또는 P이고, 위치 23의 아미노산은 C이고, 위치 41의 아미노산은 Y이고, 위치 42의 아미노산은 Q 또는 L이고, 위치 44의 아미노산은 R 또는 K이고, 위치 48의 아미노산은 S이고, 위치 50의 아미노산은 R 또는 Q이고, 위치 51의 아미노산은 L이고, 위치 72의 아미노산은 S임)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 60 (위치 2의 아미노산은 V 또는 I이고, 위치 7의 아미노산은 S 또는 T이고, 위치 11의 아미노산은 L 또는 S이고, 위치 12의 아미노산은 P이고, 위치 15의 아미노산은 L이고, 위치 23의 아미노산은 C이고, 위치 41의 아미노산은 Y이고, 위치 42의 아미노산은 Q이고, 위치 44의 아미노산은 R이고, 위치 48의 아미노산은 S 또는 P이고, 위치 50의 아미노산은 R이고, 위치 51의 아미노산은 L이고, 위치 72의 아미노산은 S 또는 A임)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 60 (위치 2의 아미노산은 V 또는 I이고, 위치 7의 아미노산은 S 또는 T이고, 위치 11의 아미노산은 L 또는 S이고, 위치 12의 아미노산은 P 또는 S이고, 위치 15의 아미노산은 L 또는 P이고, 위치 23의 아미노산은 C이고, 위치 41의 아미노산은 F 또는 Y이고, 위치 42의 아미노산은 Q 또는 L이고, 위치 44의 아미노산은 R 또는 K이고, 위치 48의 아미노산은 S 또는 P이고, 위치 50의 아미노산은 R 또는 Q이고, 위치 51의 아미노산은 R 또는 L이고, 위치 72의 아미노산은 S 또는 A임)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 67, 68, 69, 70, 또는 71에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 67, 68, 69, 70, 또는 71에 대해 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 scFv, scFab 또는 sdAb이다. 일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 scFv 또는 scFab이다. 일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 sdAb이다. 일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 scFab이다. 일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 scFv이다. 일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 또는 91에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 scFv이다. 일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 또는 91에 대해 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 scFv이다.
일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 상기 열거된 서열번호에 대해 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 인간화 항-HLA-A2 항체는 상기 열거된 서열번호에 대해 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 scFv 또는 scFab이다.
일 양상에서, 본 발명은 아미노산 서열 WIYPGDGSTKYSQKFQG (SEQ ID NO: 5)를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항-HLA 항체를 제공한다.
일 실시형태에서, 상기 항체는 애피바디, 알파바디, 아르마딜로 반복 단백질-기반 스캐폴드, 노틴, 쿠니츠 도메인 펩타이드, 아필린, 아피틴, 아넥틴, 아트리머, 에바신, DARPin, 안티칼린, 아비머, 파이노머, 버사바디 및 두오칼린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 모방체이다.
본 명세서에서 제공되는 항-HLA-A2 항체는 HLA-A2에 특이적으로 결합한다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 항-HLA-A2 항체는 HLA-A*02:01에 특이적으로 결합한다. 당업자가 이해하는 바와 같이, HLA-A2에 결합하는 항체의 능력은 당 업계에 공지된 기법의 사용을 통해 검출될 수 있다. 예를 들어, HLA-A2에 대한 항체의 결합은 본 명세서에 예시된 바와 같은 HLA-A2 4량체의 사용을 통해 검출될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 항-HLA-A2 항체는 HLA-A2와 결합하기 위해, SEQ ID NO: 183의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HCDR1); SEQ ID NO: 185의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HCDR2); SEQ ID NO: 187의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HCDR3); SEQ ID NO: 188의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LCDR1); SEQ ID NO: 189의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LCDR2); 및 SEQ ID NO: 190의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LCDR3)을 포함하는 항체와 경쟁한다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 183의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HCDR1); SEQ ID NO: 185의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HCDR2); SEQ ID NO: 187의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HCDR3); SEQ ID NO: 188의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LCDR1); SEQ ID NO: 189의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LCDR2); 및 SEQ ID NO: 190의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LCDR3)을 포함하는 항체와 동일한 HLA-A2 에피토프에 결합한다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 항-HLA-A2 항체는 HLA-A2와 결합하기 위해, BB7.2 항체와 경쟁한다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 동일한 HLA-A2 에피토프에 결합한다. 일 실시형태에서, 항-HLA 항체는 SEQ ID NO: 5에 제시된 상보성 결정 영역 2 (VH CDR2)를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68 중 하나 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68 중 2개 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68 중 3개 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68 중 4개 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68 중 5개 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68 중 6개 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68 중 7개 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68의 각각의 것으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30 중 하나 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30 중 2개 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30의 각각의 것으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, f HLA-A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-A*36:01, 및 HLA-A*68:01 중 적어도 하나에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-A*36:01, 및 HLA-A*68:01 중 적어도 2개에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-A*36:01, 및 HLA-A*68:01 중 적어도 3개에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-A*36:01, 및 HLA-A*68:01 중 적어도 4개에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-A*36:01, 및 HLA-A*68:01 중 적어도 5개에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-A*36:01, 및 HLA-A*68:01 중 적어도 6개에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-A*36:01, 및 HLA-A*68:01 중 적어도 7개에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-A*36:01, 및 HLA-A*68:01에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, f HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, 및 HLA-A*30:01 중 적어도 하나에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, 및 HLA-A*30:01 중 적어도 2개에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, 및 HLA-A*30:01에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*25:01에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*29:02에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*30:01에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*03:01에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*31:01에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*33:01에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*36:01에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 항-HLA-A2 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*68:01에 대한 반응성이 더 작다. BB7.2 항체는 BB7.2 하이브리도마 (ATCC 수탁 번호 HB-82)로부터 단리될 수 있다. HLA-A 하위유형에 대한 항-HLA-A2 항체의 반응성을 결정하기 위한 기법은 당업자에 공지되어 있다. 예를 들어, HLA-A 하위유형에 대한 항-HLA-A2 항체의 반응성은 단일 항원 비드 분석에 의해 결정될 수 있다. 이러한 단일 항원 비드 분석은 시판되는 것을 사용할 수 있다 (예를 들어, FlowPRA 단일 항원 항체; ONE LAMBDA).
일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 항-HLA-A2 항체는 시험 A의 조건 하에 측정하는 경우, BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68, 및 그의 임의의 조합 중 하나 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 항-HLA-A2 항체는 시험 A의 조건 하에 측정하는 경우, BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A* 25, HLA-A* 29, HLA-A* 30 및 그의 임의의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작다.
시험 A:
항-HLA-A2 항체 또는 BB7.2 항체 (예를 들어, BB7.2 scFv (mA2 CAR))를 포함하는 CAR을 발현하는 0.25.106개의 T 세포를 FlowPRA 단일 항원 항체 비드 패널 (FL1HD01, FL1HD02, FL1HD03, FL1HD04, FL1HD06 및 FL1HD08, One Lambda) 및 고정성 생존 염료 (FVD, ThermoFisher, 65-0865-14, eBioscience)와 함께 실온에서 30분 동안 인큐베이션한다. 샘플을 세척하고, 0.5% 포름알데하이드로 고정하고, 유세포 분석을 통해 분석한다. 샘플 당 200개의 음성 대조군 비드가 획득된다. 비드 단독을 음성 대조군으로 사용하였다. 분석을 위해, 고정성 생존 염료를 사용하여 사멸 세포를 먼저 제거한다. 그 후, 사멸 세포 및 이중체를 제외한 후 단일 항원 비드를 유입시킨다. 이어서, HLA당 비드 수를 각각의 PE 강도 피크에 의해 결정한다. 각 HLA-피크에서 대상 비드 수에 200을 곱하고, 샘플 중 음성 비드 수로 나누어 데이터를 정규화한다. 각각의 HLA-피크에 대해, 대조군 샘플의 비드 수로부터 CAR-Treg의 비드 수를 뺀 후, 비-CAR-발현 대조군의 평균 비드 수를 나누고, 100을 곱하여, 대조군 (비-CAR-발현 세포)과 비교한 CAR Treg의 상대 결합 백분율을 결정한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 항-HLA-A2 항체는 예를 들어, 시험 A의 조건 하에 측정하는 경우, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68을 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 BB7.2 항체보다 통계적으로 더 작다.
일 실시형태에서, 본 발명의 항-HLA-A2 항체는 예를 들어, 시험 A의 조건 하에 측정하는 경우, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30을 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 BB7.2 항체보다 통계적으로 더 작다.
일 실시형태에서, 용어 "통계적으로 더 작은"은 본 발명의 항-HLA-A2 항체에 대해 측정된 반응성 (예를 들어, 시험 A의 조건에서의 상대 결합)이 BB7.2 항체에 대해 측정된 반응성보다 더 작은 것을 의미하며, 특히 2원 ANOVA, Dunnett 사후 시험에 의해 분석한 경우, p 값은 최대한 약 0.05, 바람직하게는 최대한 약 0.01, 더욱 바람직하게는 최대한 약 0.005, 및 훨씬 더욱 바람직하게는 최대한 약 0.001이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 항-HLA-A2 항체는 HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68을 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 BB7.2 항체보다 더 작다. 일부 실시형태에서, 이러한 항-HLA-A2 항체는 시험 A의 조건 하에 측정한 경우, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68을 포함하는 군으로부터 선택되는 에 적어도 하나의 HLA-A 하위유형과의 상대적 결합이 BB7.2 항체보다 더 작다. 특정 양상에서, 이러한 항-HLA-A2 항체에 대해 측정된 상대 결합은 BB7.2 항체에 대해 측정된 상대 결합의 최대한 약 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 이하이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 항-HLA-A2 항체는 HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30을 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 BB7.2 항체보다 더 작다. 일부 실시형태에서, 이러한 항-HLA-A2 항체는 시험 A의 조건 하에 측정한 경우, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30을 포함하는 군으로부터 선택되는 에 적어도 하나의 HLA-A 하위유형과의 상대적 결합이 BB7.2 항체보다 더 작다. 특정 양상에서, 이러한 항-HLA-A2 항체에 대해 측정된 상대 결합은 BB7.2 항체에 대해 측정된 상대 결합의 최대한 약 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 이하이다.
추가로, 항원 결합 활성을 갖는 본 명세서에서 제공되는 항-HLA-A2 항체는 CAR의 항원 결합 도메인을 구성할 수 있고, 이러한 CAR은 인간 세포에서 발현될 수 있음으로써, CAR은 HLA-A2에 특이적으로 결합한다. 일 실시형태에서, CAR은 HLA-A*02:01에 특이적으로 결합한다. 당업자가 이해하는 바와 같이, HLA-A2에 결합하는 CAR의 능력은 당 업계에 공지된 기법의 사용을 통해 검출될 수 있다. 예를 들어, HLA-A2에 대한 CAR의 결합은 본 명세서에 예시된 바와 같은 HLA-A2 4량체의 사용을 통해 검출될 수 있다. 일 실시형태에서, 인간 세포는 면역 세포이다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 조절 면역 세포이다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 T 조절 세포 (Treg)이다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 T 세포이다. 일 실시형태에서, T 세포는 Treg이다.
추가로, 항원 결합 활성을 갖는 본 명세서에 제공되는 항-HLA-A2 항체는 키메라 항원 수용체 (CAR)의 항원 결합 도메인을 구성할 수 있고, 이러한 CAR은 T 조절 세포 (Treg)에서 발현될 수 있음으로써, CAR은 HLA-A2에 특이적으로 결합한다. 일 실시형태에서, CAR은 HLA-A*02:01에 특이적으로 결합한다. 일 실시형태에서, Treg는 인간 Treg이다.
일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 CAR의 항원 결합 도메인을 구성할 수 있고, 이러한 CAR은 면역 세포에서 발현될 수 있음으로써, 면역 세포는 HLA-A2에 의해 활성화된다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 HLA-A*02:01에 의해 활성화된다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 조절 면역 세포이다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 T 조절 세포 (Treg)이다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 T 세포이다. 일 실시형태에서, T 세포는 Treg이다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 인간 면역 세포이다. 일 실시형태에서, 조절 면역 세포는 인간 조절 면역 세포이다. 일 실시형태에서, T 세포는 인간 T 세포이다. 일 실시형태에서, Treg는 인간 Treg이다.
일 실시형태에서, 이러한 항-HLA-A2 항체는 SYHIQ (SEQ ID NO: 1) 및 GYTFTSY (SEQ ID NO: 2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 1 내지 2으로부터 선택되는 상보성 결정 영역 1 (VH CDR1)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 1에 제시된 VH CDR1을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 2에 제시된 VH CDR1을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 아미노산 서열 EGTYYAMDY (SEQ ID NO: 6)를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 6에 제시된 상보성 결정 영역 3 (VH CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 5에 제시된 하나의 VH CDR2 및 다음 CDR 중 적어도 하나를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다:
SEQ ID NO: 1에 제시된 VH CDR1; 또는
SEQ ID NO: 6에 제시된 VH CDR3.
일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 1에 제시된 하나의 VH CDR1; SEQ ID NO: 5에 제시된 하나의 VH CDR2; 및 SEQ ID NO: 6에 제시된 하나의 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명에 따르면, 중쇄의 CDR 1, 2 또는 3 중 임의의 것은 해당 SEQ ID NO: 1, 5 및 6에 열거된 특정 CDR 세트와 적어도 약 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 5에 제시된 하나의 VH CDR2 및 다음 CDR 중 적어도 하나를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다:
SEQ ID NO: 2에 제시된 VH CDR1; 또는
SEQ ID NO: 6에 제시된 VH CDR3.
일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 2에 제시된 하나의 VH CDR1; SEQ ID NO: 5에 제시된 하나의 VH CDR2; 및 SEQ ID NO: 6에 제시된 하나의 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명에 따르면, 중쇄의 CDR 1, 2 또는 3 중 임의의 것은 해당 SEQ ID NO: 2, 5 및 6에 열거된 특정 CDR 세트와 적어도 약 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 아미노산 서열 RSSQSIVHSNGNTYLE (SEQ ID NO: 7)를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 7에 제시된 상보성 결정 영역 1 (VL CDR1)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 아미노산 서열 KVSNRFS (SEQ ID NO: 8)를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 8에 제시된 상보성 결정 영역 2 (VL CDR2)를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 아미노산 서열 FQGSHVPRT (SEQ ID NO: 9)를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 9에 제시된 상보성 결정 영역 3 (VL CDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 다음 CDR 중 적어도 하나를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다:
SEQ ID NO: 7에 제시된 VL CDR1; 또는
SEQ ID NO: 8에 제시된 VL CDR2; 또는
SEQ ID NO: 9에 제시된 VL CDR3.
일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 7에 제시된 하나의 VL CDR1; SEQ ID NO: 8에 제시된 하나의 VL CDR2; 및 SEQ ID NO: 9에 제시된 하나의 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명에 따르면, 경쇄의 CDR 1, 2 또는 3 중 임의의 것은 해당 SEQ ID NO: 7, 8 및 9에 열거된 특정 CDR 세트와 적어도 약 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS (SEQ ID NO: 11) 및 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 12)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 1 (VH FR1)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 그의 항-HLA-A2 항체는 아미노산 서열 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS (SEQ ID NO: 11)를 포함하는 프레임워크 영역 1 (VH FR1)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 11에 대해 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 1 (VH FR1)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 아미노산 서열 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 12)를 포함하는 프레임워크 영역 1 (VH FR1)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 12에 대해 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 1 (VH FR1)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 WVRQAPGQX9LEWMGX15 (SEQ ID NO: 13), 및 HIQWVRQAPGQX12LEWMGX18 (SEQ ID NO: 25) (SEQ ID NO: 13에서 X9는 R 또는 G이고, X15는 I 또는 부재하고; SEQ ID NO: 25에서 X12는 R 또는 G이고, X18은 I 또는 부재함)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 2 (VH FR2)를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 아미노산 서열 WVRQAPGQX9LEWMGX15 (SEQ ID NO: 13) (위치 9의 아미노산 (X9)은 R 또는 G이고, 위치 15의 아미노산 (X15)은 I 또는 부재함)를 포함하는 프레임워크 영역 2 (VH FR2)를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 13 (위치 9의 아미노산은 R 또는 G이고, 위치 15의 아미노산은 부재함)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 2 (VH FR2)를 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 14, 15, 또는 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 2 (VH FR2)를 포함한다. 일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 14, 15, 또는 16에 대해 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 2 (VH FR2)를 포함한다.
일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 아미노산 서열 HIQWVRQAPGQX12LEWMGX18 (SEQ ID NO: 25) (위치 12의 아미노산 (X12)은 R 또는 G이고, 위치 18의 아미노산은 (X18)은 I 또는 부재함)를 포함하는 프레임워크 영역 2 (VH FR2)를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 25 (위치 12의 아미노산은 R 또는 G이고, 위치 18의 아미노산은 부재함)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 2 (VH FR2)를 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 26, 27, 또는 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 2 (VH FR2)를 포함한다. 일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 26, 27, 또는 28에 대해 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 2 (VH FR2)를 포함한다.
일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 아미노산 서열 X1VTX4TX6DTSX10STAYMX16LSX19LRSX23DX25AVYYCAR (SEQ ID NO: 29) (위치 1의 아미노산 (X1)은 R 또는 부재하고, 위치 4의 아미노산 (X4)은 I 또는 M이고, 위치 6의 아미노산 (X6)은 R 또는 A이고, 위치 10의 아미노산 (X10)은 A, T 또는 I이고, 위치 16의 아미노산 (X16)은 E 또는 L이고, 위치 19의 아미노산 (X19)은 S 또는 R이고, 위치 23의 아미노산 (X23)은 E 또는 D이고, 위치 25의 아미노산 (X25)은 T 또는 M임)를 포함하는 프레임워크 영역 3 (VH FR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 29 (위치 1의 아미노산은 R이고, 위치 4의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 6의 아미노산은 R이고, 위치 10의 아미노산은 A 또는 I이고, 위치 16의 아미노산은 E이고, 위치 19의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 23의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 25의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 3 (VH FR3)을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 29 (위치 1의 아미노산은 R이고, 위치 4의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 6의 아미노산은 R이고, 위치 10의 아미노산은 A 또는 I이고, 위치 16의 아미노산은 E이고, 위치 19의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 23의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 25의 아미노산은 T임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 3 (VH FR3)을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 29 (위치 1의 아미노산은 R이고, 위치 4의 아미노산은 I이고, 위치 6의 아미노산은 R이고, 위치 10의 아미노산은 A이고, 위치 16의 아미노산은 E이고, 위치 19의 아미노산은 S이고, 위치 23의 아미노산은 E이고, 위치 25의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 3 (VH FR3)을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 30, 31, 32, 33, 또는 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 3 (VH FR3)을 포함한다. 일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 30, 31, 32, 33, 또는 34에 대해 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 3 (VH FR3)을 포함한다.
일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 아미노산 서열 WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 44)를 포함하는 프레임워크 영역 4 (VH FR4)를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 44에 대해 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 4 (VH FR4)를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 다음을 포함한다:
SEQ ID NO: 1에 제시된 VH CDR1;
SEQ ID NO: 5에 제시된 VH CDR2;
SEQ ID NO: 6에 제시된 VH CDR3;
SEQ ID NO: 12에 제시된 VH FR1;
SEQ ID NO: 13에 제시된 VH FR2 (위치 9의 아미노산 (X9)은 R 또는 G이고, 위치 15의 아미노산 (X15)은 I 또는 부재함);
SEQ ID NO: 29에 제시된 VH FR3 (위치 1의 아미노산 (X1)은 R 또는 부재하고, 위치 4의 아미노산 (X4)은 I 또는 M이고, 위치 6의 아미노산 (X6)은 R 또는 A이고, 위치 10의 아미노산 (X10)은 A, T 또는 I이고, 위치 16의 아미노산 (X16)은 E 또는 L이고, 위치 19의 아미노산 (X19)은 S 또는 R이고, 위치 23의 아미노산 (X23)은 E 또는 D이고, 위치 25의 아미노산 (X25)은 T 또는 M임); 및
SEQ ID NO: 44에 제시된 VH FR4.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 다음을 포함한다:
SEQ ID NO: 2에 제시된 VH CDR1;
SEQ ID NO: 5에 제시된 VH CDR2;
SEQ ID NO: 6에 제시된 VH CDR3;
SEQ ID NO: 11에 제시된 VH FR1;
SEQ ID NO: 25에 제시된 VH FR2 (위치 12의 아미노산 (X12)은 R 또는 G이고, 위치 18의 아미노산은 (X18)은 I 또는 부재함);
SEQ ID NO: 29에 제시된 VH FR3 (위치 1의 아미노산 (X1)은 R 또는 부재하고, 위치 4의 아미노산 (X4)은 I 또는 M이고, 위치 6의 아미노산 (X6)은 R 또는 A이고, 위치 10의 아미노산 (X10)은 A, T 또는 I이고, 위치 16의 아미노산 (X16)은 E 또는 L이고, 위치 19의 아미노산 (X19)은 S 또는 R이고, 위치 23의 아미노산 (X23)은 E 또는 D이고, 위치 25의 아미노산 (X25)은 T 또는 M임); 및
SEQ ID NO: 44에 제시된 VH FR4.
일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 아미노산 서열 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQX44LEWMGX50WIYPGDGSTKYSQKFQGX68VTX71TX73DTSX77STAYMX83LSX86LRSX90DX92AVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 92) (위치 44의 아미노산은 R 또는 G이고, 위치 50의 아미노산은 I 또는 부재하고, 위치 68의 아미노산은 R 또는 부재하고, 위치 71의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 73의 아미노산은 R 또는 A이고, 위치 77의 아미노산은 A, T 또는 I이고, 위치 83의 아미노산은 E 또는 L이고, 위치 86의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 90의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 92의 아미노산은 T 또는 M임)를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 92 (위치 44의 아미노산은 R 또는 G이고, 위치 50의 아미노산은 부재하고, 위치 68의 아미노산은 R이고, 위치 71의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 73의 아미노산은 R이고, 위치 77의 아미노산은 A 또는 I이고, 위치 83의 아미노산은 E이고, 위치 86의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 90의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 92의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 92 (위치 44의 아미노산은 R 또는 G이고, 위치 50의 아미노산은 부재하고, 위치 68의 아미노산은 R이고, 위치 71의 아미노산은 I 또는 M이고, 위치 73의 아미노산은 R이고, 위치 77의 아미노산은 A 또는 I이고, 위치 83의 아미노산은 E이고, 위치 86의 아미노산은 S 또는 R이고, 위치 90의 아미노산은 E 또는 D이고, 위치 92의 아미노산은 T임)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 92 (위치 44의 아미노산은 R이고, 위치 50의 아미노산은 부재하고, 위치 68의 아미노산은 R이고, 위치 71의 아미노산은 I이고, 위치 73의 아미노산은 R이고, 위치 77의 아미노산은 A이고, 위치 83의 아미노산은 E이고, 위치 86의 아미노산은 S이고, 위치 90의 아미노산은 E이고, 위치 92의 아미노산은 T 또는 M임)에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 66에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 66에 대해 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 본 명세서의 임의의 부분에서 규정된 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 본 명세서의 임의의 부분에서 인간화 항-HLA-A2 항체에 대해 규정된 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 scFv, scFab 또는 sdAb이다. 일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 scFv 또는 scFab이다. 일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 sdAb이다. 일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 scFab이다. 일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 scFv이다. 일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 91에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 scFv이다. 일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 SEQ ID NO: 91에 대해 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 scFv이다.
일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 인간화 항-HLA-A2 항체이다. 일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 인간 항체이다. 일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 비-인간화 항체이다. 일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 비-인간 항체이다.
일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 상기 열거된 서열번호에 대해 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 상기 열거된 서열번호에 대해 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 scFv 또는 scFab이다.
또한 본 발명의 적어도 하나의 항-HLA-A2 항체를 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어 지거나, 이로 이루어진 조성물이 제공된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 조성물과 관련하여 "필수적으로 이루어진"은 본 명세서의 상기에 기재된 바와 같은 본 발명의 적어도 하나의 항-HLA-A2 항체가 상기 조성물 내에서 생물학적 활성을 갖는 유일한 하나의 치료제 또는 제제라는 것을 의미한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 적어도 하나의 항-HLA-A2 항체, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 인간화 항-HLA-A2 항체이다.
약제학적으로 허용 가능한 담체의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 매질, 용매, 코팅, 등장성 및 흡수 지연제, 첨가제, 안정화제, 보존제, 계면활성제, 효소 분해를 억제하는 물질, 알코올, pH 조절제, 산화방지제; 킬레이트제, 예컨대 EDTA 또는 글루타티온; 애주번트 (예를 들어, 수산화알루미늄); 보존제 및 추진제를 포함한다.
약제학적으로 허용 가능한 매질의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 물, 중성 완충 식염수, 인산염 완충 식염수, 정상 식염수 또는 다른 생리학적 완충 식염수, 또는 다른 용매, 예컨대 글리콜, 글리세롤 및 올리브 오일과 같은 오일 또는 주사 가능한 유기 에스테르를 포함한다. 약제학적으로 허용 가능한 매질은 또한 리포좀 또는 미셀을 포함할 수 있다.
코팅 물질의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 레시틴을 포함한다.
등장성제의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 당류, 염화나트륨 등을 포함한다.
흡수를 지연시키는 제제의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함한다.
첨가제의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 만니톨, 덱스트란, 탄수화물 (예를 들어, 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란); 글리신, 락토스 또는 폴리비닐피롤리돈 또는 생체내 투여에 적합한 산화방지제 또는 불활성 기체, 안정화제 또는 재조합 단백질 (예를 들어, 인간 혈청 알부민)과 같은 다른 첨가제를 포함한다.
적합한 안정화제의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 수크로스, 젤라틴, 펩톤, 분해 단백질 추출물, 예컨대 NZ-아민 또는 NZ-아민 AS를 포함한다.
이들 조성물에 사용될 수 있는 약제학적으로 허용 가능한 담체는 다음에 제한되는 것은 아니나, 이온 교환기, 알루미나, 스테아르산알루미늄, 레시틴, 인간 혈청 알부민과 같은 혈청 단백질, 포스페이트와 같은 완충 물질, 글리신, 소르브산, 소르브산칼륨, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세리드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예를 들어 프로타민 술페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨, 아연 염, 콜로이드성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스-기재 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 카복시메틸셀룰로스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌폴리옥시프로필렌-블록 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 울 지방을 추가로 포함한다.
또한, 본 명세서의 상기에 기재된 바와 같이 본 발명의 적어도 하나의 항-HLA-A2 항체를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 필수적으로 이루어진 약제가 제공된다. 일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 인간화 항-HLA-A2 항체이다.
IV. 키메라 항원 수용체 (CAR)
일 양상에서, 본 발명은 키메라 항원 수용체 (CAR)를 제공한다. CAR은 면역 세포 수용체-활성화 세포내 도메인과 표적 항원에 대한 항체-기반 특이성을 조합하는 키메라 단백질 분자이다.
본 발명의 CAR은 HLA-A2에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인을 포함한다. 세포외 도메인은 본 발명의 항-HLA-A2 항체을 포함한다. 일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 인간화 항-HLA-A2 항체이다. 본 발명의 CAR은 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 도메인을 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 인간 세포에서 발현될 수 있음으로써, CAR은 HLA-A2에 특이적으로 결합한다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 면역 세포에서 발현될 수 있음으로써, CAR은 HLA-A2에 특이적으로 결합한다. 일 실시형태에서, CAR은 HLA-A*02:01에 특이적으로 결합한다. 당업자가 이해하는 바와 같이, HLA-A2에 결합하는 CAR의 능력은 당 업계에 공지된 기법의 사용을 통해 검출될 수 있다. 예를 들어, HLA-A2에 대한 CAR의 결합은 본 명세서에 예시된 바와 같은 HLA-A2 4량체의 사용을 통해 검출될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 CAR은 BB7.2 항체를 포함하는 CAR과 비교하여, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68 중 하나 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 CAR은 BB7.2 항체를 포함하는 CAR과 비교하여, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68 중 2개 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 CAR은 BB7.2 항체를 포함하는 CAR과 비교하여, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68 중 3개 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 CAR은 BB7.2 항체를 포함하는 CAR과 비교하여, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68 중 4개 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 CAR은 BB7.2 항체를 포함하는 CAR과 비교하여, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68 중 5개 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 CAR은 BB7.2 항체를 포함하는 CAR과 비교하여, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68 중 6개 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 CAR은 BB7.2 항체를 포함하는 CAR과 비교하여, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68 중 7개 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 CAR은 BB7.2 항체를 포함하는 CAR과 비교하여, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68의 각각의 것으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 CAR은 BB7.2 항체를 포함하는 CAR과 비교하여, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30 중 하나 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 CAR은 BB7.2 항체를 포함하는 CAR과 비교하여, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30 중 2개 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 CAR은 BB7.2 항체를 포함하는 CAR과 비교하여, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30의 각각의 것으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 CAR은 BB7.2 항체를 포함하는 CAR과 비교하여, f HLA-A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-A*36:01, 및 HLA-A*68:01 중 적어도 하나에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 CAR은 BB7.2 항체를 포함하는 CAR과 비교하여, HLA-A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-A*36:01, 및 HLA-A*68:01 중 적어도 2개에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 CAR은 BB7.2 항체를 포함하는 CAR과 비교하여, HLA-A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-A*36:01, 및 HLA-A*68:01 중 적어도 3개에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 CAR은 BB7.2 항체를 포함하는 CAR과 비교하여, HLA-A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-A*36:01, 및 HLA-A*68:01 중 적어도 4개에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 CAR은 BB7.2 항체를 포함하는 CAR과 비교하여, HLA-A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-A*36:01, 및 HLA-A*68:01 중 적어도 5개에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 CAR은 BB7.2 항체를 포함하는 CAR과 비교하여, HLA-A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-A*36:01, 및 HLA-A*68:01 중 적어도 6개에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 CAR은 BB7.2 항체를 포함하는 CAR과 비교하여, HLA-A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-A*36:01, 및 HLA-A*68:01 중 적어도 7개에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 CAR은 BB7.2 항체를 포함하는 CAR과 비교하여, HLA-A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-A*36:01, 및 HLA-A*68:01에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 CAR은 BB7.2 항체를 포함하는 CAR과 비교하여, f HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, 및 HLA-A*30:01 중 적어도 하나에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 CAR은 BB7.2 항체를 포함하는 CAR과 비교하여, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, 및 HLA-A*30:01 중 적어도 2개에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 CAR은 BB7.2 항체를 포함하는 CAR과 비교하여, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, 및 HLA-A*30:01에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 CAR은 BB7.2 항체를 포함하는 CAR과 비교하여, HLA-A*25:01에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 CAR은 BB7.2 항체를 포함하는 CAR과 비교하여, HLA-A*29:02에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 CAR은 BB7.2 항체를 포함하는 CAR과 비교하여, HLA-A*30:01에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 CAR은 BB7.2 항체를 포함하는 CAR과 비교하여, HLA-A*03:01에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 CAR은 BB7.2 항체를 포함하는 CAR과 비교하여, HLA-A*31:01에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 CAR은 BB7.2 항체를 포함하는 CAR과 비교하여, HLA-A*33:01에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 CAR은 BB7.2 항체를 포함하는 CAR과 비교하여, HLA-A*36:01에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 CAR은 BB7.2 항체를 포함하는 CAR과 비교하여, HLA-A*68:01에 대한 반응성이 더 작다. 일 실시형태에서, 인간 세포는 면역 세포이다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 조절 면역 세포이다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 T 조절 세포 (Treg)이다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 T 세포이다. 일 실시형태에서, T 세포는 Treg이다.
HLA-A 하위유형에 대한 본 발명의 CAR의 반응성을 결정하기 위한 기법은 당업자에 공지되어 있다. 예를 들어, HLA-A 하위유형에 대한 본 발명의 CAR의 반응성은 단일 항원 비드 분석에 의해 결정될 수 있다. 이러한 단일 항원 비드 분석은 시판되는 것을 사용할 수 있다 (예를 들어, FlowPRA 단일 항원 항체; ONE LAMBDA).
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 본 명세서의 상기에 기재된 바와 같이, 시험 A의 조건 하에 측정하는 경우, BB7.2 항체를 포함하는 CAR과 비교하여, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68, 및 그의 임의의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 본 명세서의 상기에 기재된 바와 같이, 시험 A의 조건 하에 측정하는 경우, BB7.2 항체를 포함하는 CAR과 비교하여, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, 및 그의 임의의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 예를 들어, 시험 A의 조건 하에 측정하는 경우, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68을 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 BB7.2 항체를 포함하는 CAR 중 하나보다 통계적으로 더 작다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 예를 들어, 시험 A의 조건 하에 측정하는 경우, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30을 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 BB7.2 항체를 포함하는 CAR 중 하나보다 통계적으로 더 작다.
일 실시형태에서, 용어 "통계적으로 더 작은"은 본 발명의 CAR에 대해 측정된 반응성 (예를 들어, 시험 A의 조건에서의 상대 결합)이 BB7.2 항체를 포함하는 CAR에 대해 측정된 반응성보다 더 작은 것을 의미하며, 특히 2원 ANOVA, Dunnett 사후 시험에 의해 분석한 경우, p 값은 최대한 약 0.05, 바람직하게는 최대한 약 0.01, 더욱 바람직하게는 최대한 약 0.005, 및 훨씬 더욱 바람직하게는 최대한 약 0.001이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68을 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 BB7.2 항체를 포함하는 CAR보다 더 작다. 일부 실시형태에서, 이러한 CAR은 시험 A의 조건 하에 측정한 경우, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68을 포함하는 군으로부터 선택되는 에 적어도 하나의 HLA-A 하위유형과의 상대적 결합이 BB7.2 항체를 포함하는 CAR보다 더 작다. 특정 양상에서, 이러한 CAR에 대한 상대적 결합은 BB7.2 항체를 포함하는 CAR에 대해 측정된 상대적 결합의 최대한 약 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 이하이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30을 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 BB7.2 항체를 포함하는 CAR보다 더 작다. 일부 실시형태에서, 이러한 CAR은 시험 A의 조건 하에 측정한 경우, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30을 포함하는 군으로부터 선택되는 에 적어도 하나의 HLA-A 하위유형과의 상대적 결합이 BB7.2 항체를 포함하는 CAR보다 더 작다. 특정 양상에서, 이러한 CAR에 대해 측정된 상대적 결합은 BB7.2 항체를 포함하는 CAR의 결합의 최대한 약 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 이하이다.
일 실시형태에서, CAR은 면역 세포에서 발현될 수 있음으로써, 면역 세포는 HLA-A2에 의해 활성화된다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 HLA-A*02:01에 의해 활성화된다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 조절 면역 세포이다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 T 조절 세포 (Treg)이다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 T 세포이다. 일 실시형태에서, T 세포는 Treg이다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 인간 면역 세포이다. 일 실시형태에서, 조절 면역 세포는 인간 조절 면역 세포이다. 일 실시형태에서, T 세포는 인간 T 세포이다. 일 실시형태에서, Treg는 인간 Treg이다.
일 실시형태에서, CAR은 HLA-A2와 결합하기 위해, SEQ ID NO: 183의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HCDR1); SEQ ID NO: 185의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HCDR2); SEQ ID NO: 187의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HCDR3); SEQ ID NO: 188의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LCDR1); SEQ ID NO: 189의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LCDR2); 및 SEQ ID NO: 190의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LCDR3)을 포함하는 항체와 경쟁한다. 일 실시형태에서, CAR은 SEQ ID NO: 183의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HCDR1); SEQ ID NO: 185의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HCDR2); SEQ ID NO: 187의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HCDR3); SEQ ID NO: 188의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LCDR1); SEQ ID NO: 189의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LCDR2); 및 SEQ ID NO: 190의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LCDR3)을 포함하는 항체와 동일한 HLA-A2 에피토프에 결합한다. 일 실시형태에서, CAR은 HLA-A2와 결합하기 위해, BB7.2 항체와 경쟁한다. 일 실시형태에서, CAR은 BB7.2 항체와 동일한 HLA-A2 에피토프에 결합한다. BB7.2 항체는 BB7.2 하이브리도마 (ATCC 수탁 번호 HB-82)로부터 단리될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 항-HLA-A2 항체를 포함하는 세포외 도메인; 막관통 도메인; 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 인간화 항-HLA-A2 항체이다.
일 실시형태에서, 키메라 수용체는 Tag 및/또는 선도 서열을 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 키메라 수용체는 태그, 예를 들어 특질 제어, 다량화, 생체내 추적 등을 위한 태그를 추가로 포함한다. 상기 태그는 N-말단, C-말단 및/또는 내부에 위치할 수 있다. 본 발명의 키메라 수용체에 사용될 수 있는 태그의 예는 당업자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 본 발명에서 사용되는 태그는 제한 없이, 헤마글루티닌 태그, 폴리아르기닌 태그, 폴리히스티딘 태그, Myc 태그, 스트렙 태그, S-태그, HAT 태그, 3x 플래그 태그, 칼모둘린-결합 펩타이드 태그, SBP 태그, 키틴 결합 도메인 태그, GST 태그, 말토스-결합 단백질 태그, 형광 단백질 태그 (예를 들어, eGFP), T7 태그, V5 태그 및 Xpress 태그를 포함하거나, 이로 이루어진 군으로부터 선택된 태그일 수 있다.
세포외 도메인은 또한 때때로 CAR의 표적화 아암으로 지칭되는 표적-특이적 결합 요소이다. 세포외 도메인은 특정 질병 상태와 관련된 표적 세포에서 세포 표면 마커로서 작용하는 리간드를 인식하는 것으로 선택된다. 본 발명의 CAR은 HLA-A2 에피토프에 특이적으로 결합하는 적절한 세포외 도메인을 조작함으로써 HLA-A2를 디스플레이하는 세포를 표적화하도록 조작된다. 본 발명의 CAR의 표적-특이적 결합 요소 또는 항원 결합 도메인은 본 명세서에서 항-HLA-A2 결합 도메인으로 지칭될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항-HLA-A2 결합 도메인은 인간화 항-HLA-A2 결합 도메인일 수 있다.
막관통 도메인은 CAR의 세포외 도메인 및 세포질 도메인에 부착된다. CAR의 세포외 도메인이 표적에 결합한 경우마다, 막관통 도메인은 세포질 도메인의 세포내 신호전달 도메인 (들)에 신호전달할 수 있다.
CAR의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 도메인은 CAR이 위치된 면역 세포 (예를 들어, 조절 T 세포)의 생리적 효과기 기능 중 적어도 하나의 활성화에 관여한다. "효과기 기능"은 면역 세포의 특수 기능을 지칭한다. 예를 들어, 조절 T 세포의 효과기 기능은 다른 면역 세포의 유도 및/또는 증식을 억제 또는 하향조절하는 것을 포함할 수 있다. 또한, Treg의 효과기 기능은 조직 복구 또는 재생 촉진과 같은 개선된 임상 상태를 초래하는 비 면역 세포에 대한 효과를 포함할 수 있다. 따라서, 용어 "세포내 신호전달 도메인"은 효과기 기능 신호를 도입하고, 면역 세포가 그의 특수화된 기능을 수행하도록 유도하는 단백질의 일부분을 지칭한다. 일반적으로 전체 세포내 신호전달 도메인이 사용될 수 있지만, 많은 경우 전체 사슬을 사용할 필요는 없다. 세포내 신호전달 도메인의 절단 부분이 사용되는 경우, 효과기 기능 신호를 도입시키는 한 이러한 절단 부분이 온전한 사슬 대신에 사용될 수 있다. 따라서, 용어 세포내 신호전달 도메인은 효과기 기능 신호를 도입시키기에 충분한 세포내 신호전달 도메인의 임의의 절단 부분을 포함하는 것을 의미한다.
일 실시형태에서, 스페이서 도메인 (또는 링커 또는 힌지)이 CAR의 막관통 도메인 및 항원 결합 도메인 사이 또는 CAR의 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인 사이에 혼입될 수 있다. 본 명세서의 상기에 규정된 바와 같이, 스페이서 도메인, 링커 및 힌지는 폴리펩타이드 사슬의 항원 결합 도메인 또는 세포내 신호전달 도메인에 막관통 도메인을 연결하는 기능을 하는 올리고- 또는 폴리펩타이드이다. 스페이서 도메인은, 예를 들어, 최대 300개의 아미노산, 10 내지 100개의 아미노산, 25 내지 75개의 아미노산, 또는 25 내지 50개의 아미노산, 또는 임의의 하위범위 또는 이 범위 내의 개별 개수의 아미노산을 포함할 수 있다.
세포외 도메인
세포외 도메인은 본 발명의 항-HLA-A2 항체를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포외 도메인은 본 발명의 인간화 항-HLA-A2 항체를 포함한다.
일 실시형태에서, 세포외 도메인은 scFv, scFab 또는 sdAb인 본 발명의 항-HLA-A2 항체를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포외 도메인은 scFv 또는 scFab인 본 발명의 항-HLA-A2 항체를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포외 도메인은 sdAb인 본 발명의 항-HLA-A2 항체를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포외 도메인은 scFv인 본 발명의 항-HLA-A2 항체를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포외 도메인은 scFab인 본 발명의 항-HLA-A2 항체를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포외 도메인은 임의의 본 발명의 인간화 항-HLA-A2 항체를 포함하고, 인간화 항-HLA-A2 항체는 scFv, scFab 또는 sdAb이다. 일 실시형태에서, 세포외 도메인은 임의의 본 발명의 인간화 항-HLA-A2 항체를 포함하고, 인간화 항-HLA-A2 항체는 scFv 또는 scFab이다. 일 실시형태에서, 세포외 도메인은 sdAb인 본 발명의 인간화 항-HLA-A2 항체를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포외 도메인은 scFv인 본 발명의 인간화 항-HLA-A2 항체를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포외 도메인은 scFab인 본 발명의 인간화 항-HLA-A2 항체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포외 도메인은 힌지를 포함할 수 있고, 막관통 도메인은 힌지를 통해 CAR의 세포외 영역, 예를 들어, CAR의 항원 결합 도메인에 부착된다. 일 실시형태에서, 힌지는 인간 단백질 유래일 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 힌지는 인간 Ig (면역글로불린) 힌지, 예를 들어, IgG4 힌지, 또는 CD8α 힌지일 수 있다. 일부 경우, 본 발명의 CAR의 세포외 도메인은 CD8α 힌지를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 힌지 영역은 CD8α의 줄기 영역을 포함한다. 일 실시형태에서, CD8 힌지는 미국 특허 제 9,102,760호의 SEQ ID NO: 15의 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있다. 일 실시형태에서, CD8 힌지는 미국 특허 제 9,102,760호의 SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, CD8 힌지는 미국 특허 제 9,102,760호의 SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 힌지 또는 스페이서는 표 3의 SEQ ID NO: 115 또는 219의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 힌지 또는 스페이서는 표 4의 SEQ ID NO: 159 또는 220의 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있다.
막관통 도메인
막관통 도메인은 천연 공급원 또는 합성 공급원으로부터 유래할 수 있다. 일 실시형태에서, 막관통 도메인은 천연 공급원, 예를 들어 막-결합 또는 막관통 단백질로부터 유래할 수 있다.
일 실시형태에서, CAR의 막관통 도메인은 CAR의 도메인 중 하나와 자연적으로 연관된 막관통 도메인으로부터 유래할 수 있다. 다른 실시형태에서, 막관통 도메인은 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하기 위해 동일하거나, 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인에의 이러한 도메인의 결합을 방지하기 위해 아미노산 치환에 의해 변형되거나, 선택될 수 있다.
일 실시형태에서, 막관통 도메인은 막관통 영역에 인접한 하나 이상의 추가 아미노산, 예를 들어 막관통이 유래된 단백질의 세포외 영역과 관련된 하나 이상의 아미노산 (예를 들어, 세포외 영역의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 아미노산) 및/또는 막관통 단백질이 유래된 단백질의 세포질 영역과 관련된 하나 이상의 추가의 아미노산 (예를 들어, 세포질 영역의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산)을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD3 제타, T 세포 수용체의 알파 사슬, T 세포 수용체의 베타 사슬, T 세포 수용체의 감마 사슬, T 세포 수용체의 델타 사슬, CD28, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CDl la, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRFl), CD160, CD19, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, PD1, ITGAX, CDl1c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CDIOO (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, 및/또는 NKG2C 및 CD154, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 막관통 도메인을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD28의 막관통 도메인을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, CD28 막관통 도메인은 표 4의 SEQ ID NO: 160의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 일 실시형태에서, CD28 막관통 도메인은 표 3의 SEQ ID NO: 116의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, CD28 막관통 도메인은 표 3의 SEQ ID NO: 116의 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD8의 막관통 도메인을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, CD8 막관통 도메인은 미국 특허 제 9,102,760호의 SEQ ID NO: 16의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 일 실시형태에서, CD8 막관통 도메인은 미국 특허 제 9,102,760호의 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, CD8 막관통 도메인은 미국 특허 제 9,102,760호의 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, CD8 막관통 도메인은 표 4의 SEQ ID NO: 224의 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 일 실시형태에서, CD8 막관통 도메인은 표 3의 SEQ ID NO: 223의 아미노산 서열을 포함한다.
다른 실시형태에서, 막관통 도메인은 합성일 수 있으며, 이 경우에는 류신 및 발린을 포함하여 주로 소수성 잔기를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중체가 합성 막관통 도메인의 각 말단에 존재할 수 있다.
일 실시형태에서, 짧은 올리고- 또는 폴리펩타이드 링커는 CAR의 막관통 도메인과 세포질 도메인 사이의 연결을 형성할 수 있다. 일 실시형태에서, 링커는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 길이를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 링커는 글리신-세린 이중체를 포함할 수 있다.
세포질 도메인
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR에 사용하기 위한 세포내 신호전달 도메인은 항원 수용체 결합 후 신호 도입을 개시하기 위해 함께 작용하는 T 세포 수용체 (TCR) 및 공동 수용체의 세포질 서열뿐만 아니라, 이들 서열의 임의의 유도체 또는 변이체 및 동일한 기능성 능력을 갖는 임의의 합성 서열을 포함할 수 있다.
1차 세포질 신호전달 서열은 자극 방식 또는 억제 방식으로 TCR 복합체의 1차 활성화를 조절한다. 자극 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호전달 서열은 면역 수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 공지된 신호전달 모티프를 포함할 수 있다. 본 발명에서 특히 사용되는 1차 세포질 신호전달 서열을 포함하는 ITAM의 예는 CD3 제타, FcR 감마, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d로부터 유래한 것을 포함한다. 일 실시형태에서, 1차 신호전달 도메인은 변형된 ITAM 도메인, 예를 들어 천연 ITAM 도메인과 비교하여 활성이 변경된 (예를 들어, 증가 또는 감소된) 변형된 ITAM 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 1차 신호전달 도메인은 변형된 ITAM-포함 1차 세포내 신호전달 도메인, 예를 들어, 최적화되고/거나, 절단된 ITAM-포함 1차 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 1차 신호전달 도메인은 1, 2, 3, 4개 이상의 ITAM 모티프를 포함한다.
일 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD3 제타, FcR 감마 (예를 들어, FCγRI, RCγRIIA, FcγRIIB1, FcγRIIB2, FcγRIIIA, 또는 FcγRIIIB), FcR 알파 (예를 들어, FcαRI), FcR 엡실론 (예를 들어, FcεRI 또는 FcεRII), CD5, CD22, CD79a, CD79b, DAP10, DAP12 및 CD66d, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 기능성 신호전달 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타의 1차 신호전달 도메인을 포함하거나, 이로 이루어진다.
TCR 단독을 통해 생성된 신호는 T 세포의 완전한 활성화에 불충분할 수 있고, 2차 또는 또한 공자극 신호가 필요할 수 있음이 공지되어 있다. 따라서, 특정 실시형태에서, T 세포 활성화는 2개의 클래스의 세포질 신호전달 서열, 즉 TCR을 통해 항원-의존적 1차 활성화를 개시하는 것 (1차 세포질 신호전달 서열) 및 항원-비의존적 방식으로 작용하여, 2차 또는 공자극 신호를 제공하는 것 (2차 세포질 신호전달 서열)에 의해 매개될 수 있다. 일 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 공자극 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 CD3-제타 신호전달 도메인을 자체적으로 포함할 수 있거나, 이는 본 발명의 CAR과 관련하여 유용한 임의의 다른 적절한 세포내 신호전달 도메인 (들)과 조합될 수 있다. 예를 들어, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타 사슬 부분 및 공자극 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 공자극 신호전달 도메인은 공자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는 CAR의 일부분을 지칭한다. 공자극 분자는 항원에 대한 림프구의 효과적인 반응에 필요한 항원 수용체 또는 그의 리간드 외에 세포 표면 분자이다. 이러한 분자의 예는 OX40, CD27, CD28, 림프구 기능-관련 항원-1 (LFA-1) (CD11a/CD18), TNFR1 (CD120a/TNFRSF1A), TNFR2 (CD120b/TNFRSF1B), CTLA-4 (CD152), CD95, ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), CD2, CD30, CD40, PD-1, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ICAM-1, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, IL2ra (CD25), IL6Ra (CD126), IL-7Ra (CD127), IL-13RA1, IL-13RA2, IL-33R(IL1RL1), IL-10RA, IL-10RB, IL-4R, IL-5R (CSF2RB), ARHR, BAFF 수용체, IL-21R, TGFbR1, TGFbR2, TGFbR3, 공통 감마 사슬, MHC 클래스 I 분자, BTLA 및 Toll 리간드 수용체, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, CDS, ICAM-1, GITR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160 (BY55), CD19, CD19a, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CitgbD18, ITGB7, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKG2D ㄷ등을 포함한다.
본 발명의 CAR의 세포질 부분 내 세포내 신호전달 서열은 무작위 또는 특정 순서로 서로 연결될 수 있다. 선택적으로, 예를 들어 1 내지 10개의 아미노산 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산)의 짧은 올리고 뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 링커가 세포내 신호전달 서열 사이의 연결을 형성할 수 있다. 일 실시형태에서, 글리신-세린 이중체가 적합한 링커로서 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 단일 아미노산, 예를 들어 알라닌, 글리신이 적합한 링커로서 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 2개 이상, 예를 들어, 2, 3, 4, 5개 이상의 공자극 신호전달 도메인을 포함하도록 설계된다. 일 실시형태에서, 2개 이상, 예를 들어, 2, 3, 4, 5개 이상의 공자극 신호전달 도메인은 링커 분자, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 링커 분자에 의해 분리된다. 일 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 2개의 공자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커 분자는 글리신 잔기이다. 일부 실시형태에서, 링커는 알라닌 잔기이다.
일 실시형태에서, 세포질 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 CD28의 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 세포질 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 4-IBB의 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 세포질 도메인은 CD3-제타의 신호전달 도메인 및 CD28 및 4-1BB의 신호전달 도메인을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 세포질 도메인은 CD28의 신호전달 도메인 및 CD3-제타의 신호전달 도메인을 포함할 수 있고, CD28의 신호전달 도메인은 표 4의 SEQ ID NO: 161에 제시된 핵산 서열에 의해 인코딩되고, CD3-제타의 신호전달 도메인은 표 4의 SEQ ID NO: 162에 제시된 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
일 실시형태에서, 세포질 도메인은 CD28의 신호전달 도메인 및 CD3-제타의 신호전달 도메인을 포함할 수 있고, CD28의 신호전달 도메인은 표 3의 SEQ ID NO: 117의 아미노산 서열을 포함하고, CD3-제타의 신호전달 도메인은 표 3의 SEQ ID NO: 118의 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 세포질 도메인은 CD28의 신호전달 도메인 및 CD3-제타의 신호전달 도메인을 포함할 수 있고, CD28의 신호전달 도메인은 표 3의 SEQ ID NO: 117에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CD3-제타의 신호전달 도메인은 표 3의 SEQ ID NO: 118에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 세포질 도메인은 4-1BB의 신호전달 도메인 및 CD3-제타의 신호전달 도메인을 포함할 수 있고, 4-1BB의 신호전달 도메인은 미국 특허 제 9,102,760호의 SEQ ID NO: 17에 제시된 핵산 서열에 의해 인코딩되고, CD3-제타의 신호전달 도메인은 표 4의 SEQ ID NO: 162에 제시된 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
일 실시형태에서, 세포질 도메인은 4-1BB의 신호전달 도메인 및 CD3-제타의 신호전달 도메인을 포함할 수 있고, 4-1BB의 신호전달 도메인은 미국 특허 제 9,102,760호의 SEQ ID NO: 23의 아미노산 서열을 포함하고 및 CD3-제타의 신호전달 도메인은 표 3의 SEQ ID NO: 118의 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 세포질 도메인은 4-1BB의 신호전달 도메인 및 CD3-제타의 신호전달 도메인을 포함할 수 있고, 4-1BB의 신호전달 도메인은 미국 특허 제 9,102,760호의 SEQ ID NO: 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, CD3-제타의 신호전달 도메인은 표 3의 SEQ ID NO: 118에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, CAR은 SEQ ID NO: 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138 또는 213에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, CAR은 SEQ ID NO: 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138 또는 213에 대해 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
V. 핵산 및 벡터
일부 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 항-HLA-A2 항체를 인코딩하는 핵산을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 인간화 항-HLA-A2 항체를 인코딩하는 핵산을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 또는 91에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 또는 112에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 또는 91에 대해 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 또는 112에 대해 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 또는 158에 제시된 핵산 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 또는 158에 대해 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 또는 158에 제시된 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의해 인코딩되는 단백질을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 또는 158에 대해 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의해 인코딩되는 단백질을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 또는 71에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 또는 71에 대해 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 키메라 항원 수용체 (CAR)를 인코딩하는 핵산을 제공한다. 본 발명의 CAR-인코딩 핵산 서열은 본 명세서의 임의의 부분에 기재된 바와 같은 세포외 도메인을 포함하는 CAR을 인코딩할 수 있다.
세포외 도메인은 본 발명의 항-HLA-A2 항체를 포함할 수 있다. 세포외 도메인은 본 발명의 인간화 항-HLA-A2 항체를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 세포외 도메인은 선도 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 선도 서열은 SEQ ID NO: 113에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 세포외 도메인은 힌지 영역을 포함하고, 항-HLA-A2 결합 도메인은 힌지 영역에 의해 막관통 도메인에 연결된다. 일 실시형태에서, 힌지 영역은 CD8α의 줄기 영역을 포함한다.
본 발명의 핵산 서열은 본 명세서의 임의의 부분에 기재된 바와 같은 막관통 도메인을 포함하는 CAR을 인코딩할 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD3 제타, T 세포 수용체의 알파 사슬, T 세포 수용체의 베타 사슬, T 세포 수용체의 감마 사슬, T 세포 수용체의 델타 사슬, CD28, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CDl la, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRFl), CD160, CD19, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, PD1, ITGAX, CDl1c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CDIOO (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, 및/또는 NKG2C 및 CD154, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 막관통 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 막관통 도메인은 CD28의 막관통 도메인을 포함한다.
본 발명의 핵산 서열은 본 명세서의 임의의 부분에 기재된 바와 같은 세포질 도메인을 포함하는 CAR을 인코딩할 수 있다. 추가로, 세포질 도메인은 본 명세서의 임의의 부분에 기재된 바와 같은 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD3 제타, FcR 감마 (예를 들어, FCγRI, RCγRIIA, FcγRIIB1, FcγRIIB2, FcγRIIIA, 또는 FcγRIIIB), FcR 알파 (예를 들어, FcαRI), FcR 엡실론 (예를 들어, FcεRI 또는 FcεRII), CD5, CD22, CD79a, CD79b, DAP10, DAP12 및 CD66d, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 기능성 신호전달 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타의 기능성 신호전달 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 공자극 도메인을 추가로 포함한다. 본 발명의 핵산 서열에 의해 인코딩되는 CAR의 공자극 도메인은 본 명세서의 임의의 부분에 기재된 바와 같은 공자극 도메인일 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 공자극 도메인은 OX40, CD27, CD28, 림프구 기능-관련 항원-1 (LFA-1) (CD11a/CD18), TNFR1 (CD120a/TNFRSF1A), TNFR2 (CD120b/TNFRSF1B), CTLA-4 (CD152), CD95, ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), CD2, CD30, CD40, PD-1, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ICAM-1, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, IL2ra (CD25), IL6Ra (CD126), IL-7Ra (CD127), IL-13RA1, IL-13RA2, IL-33R(IL1RL1), IL-10RA, IL-10RB, IL-4R, IL-5R (CSF2RB), ARHR, BAFF 수용체, IL-21R, TGFbR1, TGFbR2, TGFbR3, 공통 감마 사슬, MHC 클래스 I 분자, BTLA 및 Toll 리간드 수용체, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, CDS, ICAM-1, GITR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160 (BY55), CD19, CD19a, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CitgbD18, ITGB7, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKG2D 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 기능성 신호전달 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 공자극 도메인은 CD28, 4-1BB 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 기능성 신호전달 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 공자극 도메인은 CD28의 기능성 신호전달 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 공자극 도메인은 4-1BB의 기능성 신호전달 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 서열은 동일한 프레임 내에서단일 폴리펩타이드 사슬로서 발현된다.
본 발명의 핵산 서열은 단리된 핵산 서열일 수 있다.
일 실시형태에서, 핵산은 메신저 RNA 전사체로서 제공된다. 일 실시형태에서, 핵산은 DNA 작제물로서 제공된다.
일 실시형태에서, CAR을 인코딩하는 서열을 포함하는 재조합 DNA 작제물이 제공되고, CAR은 (i) 항-HLA-A2 항체를 포함하는 세포외 도메인; (ii) 막관통 도메인; 및 (iii) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 도메인을 포함하고, 인코딩되는 CAR은 인간 세포에서 발현될 수 있음으로써, CAR은 HLA-A2에 특이적으로 결합할 수 있다. 일 실시형태에서, CAR은 HLA-A*02:01에 특이적으로 결합할 수 있다. 일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 인간화 항-HLA-A2 항체이다. 일 실시형태에서, 인간 세포는 면역 세포이다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 조절 면역 세포이다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 T 조절 세포 (Treg)이다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 T 세포이다. 일 실시형태에서, T 세포는 Treg이다.
일 실시형태에서, CAR을 인코딩하는 서열을 포함하는 재조합 DNA 작제물이 제공되고, CAR은 (i) 항-HLA-A2 항체를 포함하는 세포외 도메인; (ii) 막관통 도메인; 및 (iii) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 도메인을 포함하고, 인코딩되는 CAR은 T 조절 세포 (Treg)에서 발현될 수 있음으로써, CAR은 HLA-A2에 특이적으로 결합할 수 있다. 일 실시형태에서, CAR은 HLA-A*02:01에 특이적으로 결합할 수 있다. 일 실시형태에서, HLA-A2에 대한 CAR의 결합은 본 명세서에 예시된 바와 같은 HLA-A2 4량체의 사용을 통해 검출될 수 있다. 일 실시형태에서, 항-HLA-A2 항체는 인간화 항-HLA-A2 항체이다. 일 실시형태에서, Treg는 인간 Treg이다.
일 실시형태에서, 인코딩되는 CAR은 면역 세포에서 발현될 수 있음으로써, 면역 세포는 HLA-A2에 의해 활성화된다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 HLA-A*02:01에 의해 활성화된다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 조절 면역 세포이다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 T 조절 세포 (Treg)이다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 T 세포이다. 일 실시형태에서, T 세포는 Treg이다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 인간 면역 세포이다. 일 실시형태에서, 조절 면역 세포는 인간 조절 면역 세포이다. 일 실시형태에서, T 세포는 인간 T 세포이다. 일 실시형태에서, Treg는 인간 Treg이다.
일 실시형태에서, 인코딩되는 CAR은 HLA-A2와 결합하기 위해, SEQ ID NO: 183의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HCDR1); SEQ ID NO: 185의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HCDR2); SEQ ID NO: 187의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HCDR3); SEQ ID NO: 188의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LCDR1); SEQ ID NO: 189의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LCDR2); 및 SEQ ID NO: 190의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LCDR3)을 포함하는 항체와 경쟁한다. 일 실시형태에서, 인코딩되는 CAR은 SEQ ID NO: 183의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HCDR1); SEQ ID NO: 185의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HCDR2); SEQ ID NO: 187의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HCDR3); SEQ ID NO: 188의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LCDR1); SEQ ID NO: 189의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LCDR2); 및 SEQ ID NO: 190의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LCDR3)을 포함하는 항체와 동일한 HLA-A2 에피토프에 결합한다. 일 실시형태에서, 인코딩되는 CAR은 HLA-A2와 결합하기 위해, BB7.2 항체와 경쟁한다. 일 실시형태에서, 인코딩되는 CAR은 BB7.2 항체와 동일한 HLA-A2 에피토프에 결합한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138 또는 213에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138 또는 213에 대해 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182 또는 214에 제시된 핵산 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182 또는 214에 대해 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182 또는 214에 제시된 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의해 인코딩되는 단백질을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182 또는 214에 대해 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의해 인코딩되는 단백질을 제공한다.
적절한 분자를 코딩하는 핵산 서열은, 예를 들어, 유전자를 발현하는 세포로부터의 라이브러리를 스크리닝하거나, 이를 포함하는 것으로 공지된 벡터로부터 유전자를 유도하거나, 표준 기법을 사용하여 이를 포함하는 세포 및 조직으로부터 직접 단리함과 같이, 당 업계에 공지된 재조합 방법을 사용하여 획득될 수 있다. 대안적으로, 대상 핵산은 클로닝 이외에 합성 방법에 의해 생성될 수 있다.
본 발명은 추가로 항-HLA-A2 항체-인코딩 핵산 분자 또는 CAR-인코딩 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 일 실시형태에서, 본 발명은 인간화 항-HLA-A2 항체-인코딩 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 일 실시형태에서, 본 발명은 이러한 핵산 분자가 삽입된 벡터를 제공한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서의 임의의 부분에 기재된 바와 같은 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 항-HLA-A2 항체 중 임의의 것을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 인간화 항-HLA-A2 항체 중 임의의 것을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 또는 158에 제시된 핵산 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 또는 158에 대해 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 특정 양상에서, 이러한 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다.
일 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 CAR-인코딩 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182 또는 214에 제시된 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182 또는 214에 대해 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 벡터는 세포내에 형질도입될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 벡터는 비 바이러스 벡터 방법을 통해 인간 세포내에 형질도입되거나, 조작될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 벡터는 면역 세포내에 형질도입될 수 있다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 조절 면역 세포이다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 T 조절 세포 (Treg)이다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 T 세포이다. 일 실시형태에서, T 세포는 Treg일 수 있다. 일 실시형태에서, 벡터는 포유류 면역 세포에서 CAR을 발현시킬 수 있다. 일 실시형태에서, 포유류 면역 세포는 인간 면역 세포이다. 일 실시형태에서, 벡터는 포유류 조절 면역 세포에서 CAR을 발현시킬 수 있다. 일 실시형태에서, 포유류 조절 면역 세포는 인간 조절 면역 세포이다. 일 실시형태에서, 벡터는 포유류 T 세포에서 CAR을 발현시킬 수 있다. 일 실시형태에서, 포유류 T 세포는 포유류 T 조절 세포이다. 일 실시형태에서, 포유류 T 세포는 인간 T 세포이다. 일 실시형태에서, 포유류 T 세포는 인간 T 조절 세포이다.
일 실시형태에서, 벡터는 클로닝 또는 발현 벡터, 예를 들어 다음에 제한되는 것은 아니나, 하나 이상의 플라스미드 (예를 들어, 발현 플라스미드, 클로닝 벡터, 미니서클, 미니벡터, 2분 염색체), 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터 작제물을 포함하는 벡터이다.
본 발명은 세포내로 직접 형질도입될 수 있는 CAR을 발현하는 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터 작제물을 포함한다. 렌티바이러스와 같은 레트로바이러스로부터 유래된 벡터는 전이유전자의 장기적이고, 안정적인 혼입 및 딸 세포에서의 그의 증식을 가능하게 하기 때문에 장기 유전자 전달을 달성하기에 적합한 도구이다. 렌티바이러스 벡터는 간세포와 같은 비 증식 세포를 형질도입할 수 있다는 점에서 쥣과동물 백혈병 바이러스와 같은 온코-레트로바이러스로부터 유래된 벡터에 비해 추가적인 이점을 갖는다. 또한 면역원성이 낮다는 추가의 이점이 있다.
간단히 요약하면, CAR을 인코딩하는 천연 또는 합성 핵산의 발현은 통상적으로 CAR 폴리펩타이드 또는 그의 일부를 인코딩하는 핵산을 프로모터에 작동 가능하게 연결하고, 작제물을 발현 벡터에 혼입함으로써 달성된다. 벡터는 진핵생물 복제 및 혼입에 적합할 수 있다. 통상적인 클로닝 벡터는 적절한 핵산 서열의 발현 조절에 유용한 전사 및 번역 종결인자, 개시 서열 및프로모터를 포함한다.
상기에 기재된 방법 이외에도, 다음과 같은 방법이 사용될 수 있다.
본 발명의 발현 작제물은 또한 표준 유전자 전달 프로토콜을 사용하여 핵산 면역화 및 유전자 요법에 사용될 수 있다. 유전자 전달 방법은 당 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 그 전문이 참조로 포함되는 미국 특허 제 5,399,346호, 제 5,580,859호, 제 5,589,466호를 참조한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 유전자 요법 벡터를 제공한다. 다른 실시형태에서, CRISPR-Cas9 또는 TALEN-기반 기술과 같은 게놈 편집 기술을 사용하여 본 발명의 CAR을 인코딩하는 핵산을 수용체 면역 세포의 게놈에 도입할 수 있다 (문헌[Delhove, J. M. K. M., et al., 2017; Eyquem, J. et al., 2017]).
핵산은 많은 유형의 벡터로 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 다음에 제한되는 것은 아니나 플라스미드, 파지미드, 파지 유도체, 동물 바이러스 및 코스미드를 포함하는 벡터로 클로닝될 수 있다. 특히 중요한 벡터는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터 및 시퀀싱 (sequencing) 벡터를 포함한다.
또한, 발현 벡터는 바이러스 벡터 형태의 세포에 제공될 수 있다. 바이러스 벡터 기술은 당 업계에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York] 및 기타 바이러스 및 분자 생물학 매뉴얼에 기재되어 있다. 벡터로서 유용한 바이러스는 다음에 제한되는 것은 아니나, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스, 헤르페스바이러스, 폭스바이러스 및 렌티바이러스를 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 제 5,350,674호 및 제 5,585,362호 참조). 일반적으로, 적합한 벡터는 적어도 하나의 유기체에서 기능성인 복제 기점, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위 및 하나 이상의 선택 가능한 마커를 포함한다 (예를 들어, WO 01/96584; WO 01/29058; 및 미국 특허 제 6,326,193호).
포유류 세포내로의 유전자 전달을 위해 다수의 바이러스 기반 시스템이 개발되었다. 예를 들어, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 선택된 유전자를 벡터에 삽입하고, 당 업계에 공지된 기술을 사용하여 레트로바이러스 입자로 패키징할 수 있다. 이어서 재조합 바이러스를 단리하여 생체내 또는 생체외에서 대상체의 세포로 전달할 수 있다. 다수의 레트로바이러스 시스템이 당 업계에 공지되어 있다. 일부 실시형태에서, 아데노바이러스 벡터가 사용된다. 다수의 아데노바이러스 벡터가 당 업계에 공지되어 있다. 일 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터가 사용된다.
추가의 전사 활성 요소, 예를 들어 프로모터 및 인핸서는 전사 개시 빈도를 조절할 수 있다. 통상적으로, 코어 프로모터와 관련하여, 다수의 프로모터가 최근에 개시 부위의 하류에 기능성 요소를 포함하는 것으로 나타났으며, 인핸서 요소는 일반적으로 개시 부위의 500 내지 2000 bp 상류에 위치하지만, 이는 개시 부위의 30 내지 110 bp 상류 영역에 위치한다. 프로모터 요소들 사이의 간격은 종종 가변적이어서, 요소들이 서로에 대해 역방향이거나, 이동되는 경우, 프로모터 기능이 유지된다. 티미딘 키나제 (tk) 프로모터에서, 프로모터 요소 사이의 간격은 활성의 감소 전에 50 bp 간격으로 증가될 수 있다. 프로모터에 따라, 개별 요소가 전사적 활성화를 위해 합동하여 또는 독립적으로 기능할 수 있는 것으로 보인다.
적합한 프로모터의 일 예는 즉시 초기 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 서열이다. 이 프로모터 서열은 작동 가능하게 연결된 임의의 폴리뉴클레오타이드 서열의 높은 수준의 발현을 유도할 수 있는 강력한 항시적 프로모터 서열이다. 적합한 프로모터의 다른 예는 신장 성장 인자-1α (EF-1α)이다. 적합한 프로모터의 다른 예는 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 프로모터이다. 그러나, 다음에 제한되는 것은 아니나, 시미안 바이러스 40 (SV40) 초기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 긴 말단 반복 (LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스타인-바르 (Epstein-Barr) 바이러스 즉시 초기 프로모터, 라우스 육종 (Rous sarcoma) 바이러스 프로모터뿐만 아니라, 인간 유전자 프로모터, 예컨대, 다음에 제한되는 것은 아니나, 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터 및 크레아틴 키나제 프로모터를 포함하는 다른 항시적 프로모터 서열이 또한 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 항시적 프로모터의 사용으로 제한되지 않아야 한다. 유도성 프로모터도 본 발명의 일부로서 고려된다. 유도성 프로모터의 사용은 이러한 발현이 필요한 경우, 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현을 켤 수 있거나, 발현이 적절하지 않은 경우에는 발현을 끌 수 있는 분자 스위치를 제공한다. 유도성 프로모터의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터 및 테트라사이클린 프로모터를 포함한다.
CAR 폴리펩타이드 또는 그의 일부의 발현을 평가하기 위해, 세포내로 도입될 발현 벡터는 또한 바이러스 벡터를 통해 형질감염 또는 감염시키려는 세포 집합으로부터 발현 세포의 확인 및 선택을 용이하게 하기 위해 선택 가능한 마커 유전자 또는 리포터 유전자 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. 다른 양상에서, 선택 가능한 마커는 별도의 DNA 조각 상에 운반되고, 공동-형질감염 과정에 사용될 수 있다. 선택 가능한 마커 및 리포터 유전자 둘 모두 숙주 세포에서의 발현을 가능하게 하기 위해 적절한 조절 서열에 측접될 수 있다. 유용한 선택 가능한 마커는 예를 들어, neo 등과 같은 항생제 내성 유전자를 포함한다.
리포터 유전자는 잠재적으로 형질감염된 세포를 확인하고, 조절 서열의 기능성을 평가하기 위해 사용된다. 일반적으로, 리포터 유전자는 수용체 유기체 또는 조직에 존재하지 않거나, 발현되지 않고, 발현이 쉽게 검출 가능한 특성, 예를 들어 효소 활성에 의해 확인되는 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수용체 세포로 도입된 후 적절한 시간에 분석된다. 적합한 리포터 유전자는 루시페라제, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 분비된 알칼리성 포스파타제 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 인코딩하는 유전자를 포함할 수 있다 (예를 들어, 문헌[Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82]). 적합한 발현 시스템은 공지되어 있고, 공지된 기술을 사용하여 이를 제조하거나, 시판되는 것을 구입할 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자의 최고 발현 수준을 나타내는 최소 5' 측접 영역을 갖는 작제물은 프로모터로 확인된다. 이러한 프로모터 영역은 리포터 유전자에 연결될 수 있고, 프로모터 유도 전사를 조절하는 능력에 대해 제제를 평가하는데 사용될 수 있다.
유전자를 세포내로 도입 및 발현시키는 방법은 당 업계에 공지되어 있다. 발현 벡터와 관련하여, 벡터는 당 업계의 임의의 방법에 의해 숙주 세포, 예를 들어 포유류, 박테리아, 효모 또는 곤충 세포에 용이하게 도입될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 물리적, 화학적 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포로 전달될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포에 도입하는 물리적 방법은 인산칼슘 침전, 리포펙tus(lipofection), 입자 충격, 미세주입, 전기천공 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생성하는 방법은 당 업계에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌[Sambrook et al., 2001] 참조). 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는 인산칼슘 형질감염에 의해 숙주 세포내로 도입될 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 전기천공에 의해 RNA와 같은 폴리뉴클레오타이드로 형질감염될 수 있다 (예를 들어, WO 2007/065957 참조).
폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포에 도입하기 위한 화학적 수단은 콜로이드 분산 시스템, 예컨대 거대 분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로스피어, 비드 및 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합 미셀 및 리포좀을 포함하는 지질 기반 시스템을 포함한다. 시험관내 및 생체내 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시적인 콜로이드 시스템은 리포좀 (예를 들어, 인공 막 소포)이다. 표적화된 나노 입자 또는 다른 적합한 서브 마이크론 크기의 전달 시스템에 의한 폴리뉴클레오타이드의 전달과 같이, 다른 최신 표적화 핵산 전달 방법이 이용 가능하다.
비 바이러스성 전달 시스템이 사용되는 경우, 예시적인 전달 비히클은 리포좀이다. 숙주 세포 내로 핵산의 도입 (시험관내, 생체외 또는 생체내)을 위해 지질 제형의 사용이 고려된다. 다른 양상에서, 핵산은 지질과 결합될 수 있다. 지질과 결합된 핵산은 리포좀의 수성 내부에 캡슐화되거나, 리포좀의 지질 이중층 내에 분산되거나, 리포좀 및 리포좀에 포획된 올리고뉴클레오타이드 둘 모두와 결합된 연결 분자를 통해 리포좀에 부착되거나, 리포좀과 복합체를 형성하거나, 지질을 포함한 용액에 분산되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 조합되거나, 지질 중의 현탁액으로서 포함되거나, 미셀과 함께 포함되거나, 복합체를 형성하거나, 그 외에는 지질과 결합될 수 있다. 지질, 지질/DNA 또는 지질/발현 벡터 관련 조성물은 용액 중 임의의 특정 구조로 제한되지 않는다. 예를 들어, 이는 이중층 구조 내에, 미셀로서 또는 "붕괴된" 구조로 존재할 수 있다. 이는 또한 용액 중에 단순히 분산되어, 크기 또는 형태가 균일하지 않은 응집체를 형성할 수 있다. 지질은 천연 발생 또는 합성 지질일 수 있는 지방 물질이다. 예를 들어, 지질은 세포질 내의 천연 발생 지방 액적뿐만 아니라, 지방산, 알코올, 아민, 아미노 알코올 및 알데하이드와 같은 장쇄 지방족 탄화수소 및 그의 유도체를 포함하는 화합물 종류를 포함한다.
사용하기에 적합한 지질은 상업적 공급원으로부터 입수할 수 있다. 예를 들어, 디미리스틸 포스파티딜콜린 ("DMPC")은 Sigma, St. Louis, Mo.로부터 입수할 수 있고; 디세틸 포스페이트 ("DCP")는 K & K Laboratories (Plainview, N.Y.)로부터 입수할 수 있고; 콜레스테롤 ("Choi")은 Calbiochem-Behring으로부터 입수할 수 있으며; 디미리스틸 포스파티딜글리세롤 ("DMPG") 및 다른 지질은 Avanti Polar Lipids, Inc. (Blamingham, Ala.)로부터 입수할 수 있다. 클로로포름 또는 클로로포름/메탄올 중의 지질의 스톡 용액은 약 -20℃에 저장될 수 있다. 클로로포름은 메탄올보다 증발이 더 용이하기 때문에 단독 용매로 사용된다. "리포좀"은 밀폐된 지질 이중층 또는 응집체의 생성에 의해 형성된 다양한 단일 및 다중 라멜라 지질 비히클을 포함하는 일반 용어이다. 리포좀은 인지질 이중층 막 및 내부 수성 매질을 갖는 수포 구조를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 다중 라멜라 리포좀은 수성 매질에 의해 분리된 다중 지질 층을 갖는다. 이는, 인지질이 과량의 수용액에 현탁되는 경우, 자발적으로 형성된다. 지질 성분은 자가 재배열이 진행된 후, 밀폐된 구조를 형성하고, 지질 이중층 사이에 물 및 용해된 용질을 포획한다 (문헌[Ghosh et al., 1991]). 그러나, 정상 소포 구조와 상이한 용액 중 구조를 갖는 조성물이 또한 포함된다. 예를 들어, 지질은 미셀 구조를 가정하거나, 단순히 지질 분자의 불균일한 응집체로서 존재할 수 있다. 리포펙타민-핵산 복합체가 또한 고려된다.
외인성 핵산을 숙주 세포내로 도입하기 위해 사용되는 방법에 관계없이, 숙주 세포에서 재조합 DNA 서열의 존재를 확인하기 위해 다양한 분석이 수행될 수 있다. 이러한 분석은 예를 들어, 당업자에게 널리 공지된 "분자 생물학적" 분석, 예컨대 서던 및 노던 블로팅, RT-PCR 및 PCR; "생화학적" 분석, 예를 들어 면역학적 수단 (ELISA 및 웨스턴 블롯) 또는 본 발명의 범위 내에 속하는 제제를 확인하기 위한 본 명세서에 기재된 분석에 의한 특정 펩타이드의 존재 또는 부재의 검출을 포함한다.
VI. CAR-변형된 면역 세포
본 발명의 CAR-인코딩 핵산은 본 발명의 CAR을 발현하는 CAR-변형된 면역 세포를 생성하기 위해, 면역 세포 내로 도입될 수 있으며, 변형된 면역 세포는 본 명세서에 개시된 바와 같은 용도가 발견되었다. CAR-변형된 면역 세포는 또한 본 명세서에서 "CAR-조작 면역 세포"로 지칭될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 명세서의 임의의 부분에 기재된 바와 같은 CAR을 포함하는 변형된 면역 세포가 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서의 임의의 부분에 기재된 바와 같은 발현 벡터를 포함하는 면역 세포가 제공된다. 면역 세포는 세포 요법에 사용하기에 적합한 임의의 면역 세포일 수 있다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 인간 면역 세포일 수 있다.
일 실시형태에서, 면역 세포는 림프구, 골수 유래 세포, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 림프구는 T 세포, B 세포, 자연 살해 (NK) 세포, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 T 세포이다. 일 실시형태에서, T 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, γδ T 세포, 이중 음성 (DN) T 세포, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, CD4+ T 세포는 T 헬퍼 세포, 조절 T 세포, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 조절 T 세포이다. 일 실시형태에서, Treg는 흉선 유래 Treg 또는 적응 또는 유도 Treg이다. 일 실시형태에서, Treg는 CD4+FOXP3+ 조절 T 세포 또는 CD4+FOXP3- 조절 T 세포 (TR1 세포)이다. 일 실시형태에서, Treg는 CD4+FOXP3+ 조절 T 세포이다. 일 실시형태에서, Treg는 CD4+FOXP3- 조절 T 세포 (TR1 세포)이다. 일 실시형태에서, CD8+ T 세포는 세포독성 CD8+ T 세포 또는 CD8+ 조절 T 세포이다. 일 실시형태에서, CD8+ T 세포는 CD8+ 조절 T 세포이다. 일 실시형태에서, CD8+ 조절 T 세포는 CD8+CD28- 조절 T 세포, CD8+CD103+ 조절 T 세포, CD8+FoxP3+ 조절 T 세포, CD8+CD122+ 조절 T 세포 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, CD8+ 조절 T 세포는 INFγ+IL10+IL34+ CD8+CD45RClow 조절 T 세포이다. 일 실시형태에서, γδ T 세포는 조절 γδ T 세포이다. 일 실시형태에서, DN T 세포는 조절 DN T 세포이다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 B 세포이다. 일 실시형태에서, B 세포는 조절 B 세포이다. 일 실시형태에서, 조절 B 세포는 CD19+CD24hiCD38hi B 세포이다. 일 실시형태에서, NK 세포는 조절 NK 세포이다. 일 실시형태에서, 골수 유래 세포는 호중구, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 또는 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 대식세포는 조절 대식세포이다. 일 실시형태에서, 수지상 세포는 조절 수지상 세포이다.
일 실시형태에서, 면역 세포는 조절 면역 세포이다. 면역 세포는 세포 요법에 사용하기에 적합한 임의의 조절 면역 세포일 수 있다 (예를 들어, 문헌[Wood, K.J. et al., 2012; Papp, G. et al., 2017] 참조). 일 실시형태에서, 조절 면역 세포는 인간 조절 면역 세포일 수 있다. 일 실시형태에서, 조절 면역 세포는 조절 T 세포, CD4+ 조절 T 세포, CD8+ 조절 T 세포, 조절 γδ T 세포, 조절 DN T 세포, 조절 B 세포, 조절 NK 세포, 조절 대식세포, 조절 수지상 세포, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 조절 면역 세포는 CD8+ 조절 T 세포이다 (예를 들어, 문헌[Guillonneau, C. et al., 2010] 참조). 일 실시형태에서, CD8+ 조절 T 세포는 CD8+CD28- 조절 T 세포, CD8+CD103+ 조절 T 세포, CD8+FoxP3+ 조절 T 세포, CD8+CD122+ 조절 T 세포, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, CD8+ 조절 T 세포는 INFγ+IL10+IL34+ CD8+CD45RClow 조절 T 세포이다. 일 실시형태에서, 조절 면역 세포는 조절 γδ T 세포이다 (예를 들어, 문헌[Wesch, D., et al., 2014] 참조). 일 실시형태에서, 면역 세포는 조절 DN T 세포이다 (예를 들어, 문헌[Juvet, S. C., et al., 2012] 참조). 일 실시형태에서, 조절 면역 세포는 조절 B 세포이다 (예를 들어, 문헌[Chong, A.S., et al., 2017] 참조). 일 실시형태에서, 조절 B 세포는 CD19+CD24hiCD38hi B 세포이다. 일 실시형태에서, 조절 면역 세포는 조절 NK 세포이다 (예를 들어, 문헌[Fu, B. et al., 2013; Crome, S. Q., et al., 2013; Crome, S. Q., et al., 2017] 참조). 일 실시형태에서, 조절 면역 세포는 조절 대식세포이다 (예를 들어, 문헌[Hutchinson, J. A., et al., 2017] 참조). 일 실시형태에서, 조절 면역 세포는 조절 수지상 세포이다. 일 실시형태에서, 조절 면역 세포는 조절 T 세포이다. 일 실시형태에서, Treg는 흉선 유래 Treg 또는 적응 또는 유도 Treg이다. 일 실시형태에서, Treg는 CD4+FOXP3+ 조절 T 세포 또는 CD4+FOXP3- 조절 T 세포 (TR1 세포)이다. 일 실시형태에서, Treg는 CD4+FOXP3+ 조절 T 세포이다. 일 실시형태에서, Treg는 CD4+FOXP3- 조절 T 세포 (TR1 세포)이다.
일 실시형태에서, 조절 면역 세포는 다음 표현형을 갖는다: CD4+CD25+, 예컨대, 예를 들어, CD4+CD25+CD127-, 예컨대, 예를 들어, CD4+CD25+CD127-CD45RA+. 추가의 실시형태에서, 조절 면역 세포는 다음 표현형을 갖는다: FoxP3+CD4+CD25+, 예컨대, 예를 들어, FoxP3+CD4+CD25+CD127-, 예컨대, 예를 들어, FoxP3+CD4+CD25+CD127-CD45RA+.
일 실시형태에서, 면역 조절 세포는 다음 표현형 중 적어도 하나를 나타낸다: CD4+CD25+, FoxP3+, CD127lo/-, CTLA-4+, CD39+, Helios+, CD62L+/hi, VLA4+, LFA1+, CD49bint, ITGb7int, PSGL-1+, ICOS+, GITR+, PD-1int, Perflo/-, CCR7+. 일 실시형태에서, 면역 조절 세포는 그랜자임 A 및/또는 그랜자임 B를 발현하지 않는다.
일 실시형태에서, 분자의 발현 수준의 결정을 유세포 분석, 면역형광 또는 이미지 분석, 예를 들어 고 함량 분석에 의해 수행한다. 바람직하게는, 분자의 발현 수준의 결정을 유세포 분석에 의해 수행한다. 일 실시형태에서, 유세포 분석을 수행하기 전에, 세포를 고정 및 투과시켜 세포내 단백질을 검출할 수 있다.
일 실시형태에서, 세포 집합에서 분자의 발현 수준의 결정은 분자를 발현하는 세포 집합의 세포의 백분율 (즉, 분자에 대한 세포 "+")을 결정하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 상기 분자를 발현하는 세포의 백분율을 FACS에 의해 측정한다.
용어 "발현 (또는 +)" 및 "발현하지 않는 (또는 -)"은 당 업계에 널리 공지되어 있고, "+"에 해당하는 세포 마커의 발현 수준은 높거나 중간 정도이고, 또한 "+/-"로 지칭되며, "-"에 해당하는 세포 마커의 발현 수준은 0인 경우의 대상 세포 마커의 발현 수준을 지칭한다.
용어 "낮은" 또는 "lo" 또는 "lo/-"는 당 업계에 널리 공지되어 있고, 전체적으로 분석되는 세포 집합에서 그 세포 마커의 발현 수준과 비교하여, 세포 마커의 발현 수준이 낮은 경우의 대상 세포 마커의 발현 수준을 지칭한다. 더욱 구체적으로, 용어 "lo"는 하나 이상의 다른 별개의 세포 집합보다 더 낮은 수준에서 세포 마커를 발현하는 별개의 세포 집합을 지칭한다.
용어 "높은" 또는 "hi" 또는 "밝은"은 당 업계에 공지되어 있고, 전체적으로 분석되는 세포 집합 그 세포 마커의 발현 수준과 비교하여, 세포 마커의 발현 수준이 높은 경우의 대상 세포 마커의 발현 수준을 지칭한다.
일반적으로, 염색 강도의 상위 2, 3, 4 또는 5%의 세포는 "hi"로 표시되며, 집합의 상반부에 존재하는 세포는 "+"로 분류된다. 형광 강도가 50% 미만인 세포는 "lo" 세포로, 5% 미만은 "-" 세포로 지정된다.
이러한 마커에 특이적인 형광 표지된 항체로 염색된 세포 집합으로부터의 세포의 중앙값 형광 강도 (MFI)와 비관련 특이성을 가지나, 동일한 이소유형, 동일한 형광 프로브로 형광 표지된 항체로 염색되고, 동일한 종으로부터 유래한 동일한 세포 집합으로부터 세포 (이소유형 대조군으로 지칭됨)의 형광 강도 (FI)를 비교함으로써, 대상 세포 마커의 발현 수준을 결정한다. 이 마커에 특이적인 형광 표지된 항체로 염색되고, 이소유형 대조군으로 염색된 세포와 동일한 MFI 또는 더 낮은 MFI를 나타내는 집합으로부터의 세포는 이 마커를 발현하지 않고, 이후에 (-) 또는 음성으로 지정된다. 이 마커에 특이적인 형광 표지된 항체로 염색되고, 이소유형 대조군으로 염색된 세포보다 더 높은 MFI 값을 나타내는 집합으로부터의 세포는 이 마커를 발현하며, 이후에 (+) 또는 양성으로 지정된다.
일 실시형태에서, 본 발명의 면역 세포는 그의 세포 표면에 본 발명의 CAR 및 또 HLA-A2 이외의 또 다른 리간드에 결합하는 다른 수용체 (본 명세서에서 "제2 수용체"로 지칭됨)를 발현한다. 본 발명에 따르면, 이러한 제2 수용체는 이전에 기재된 바와 같은 세포외 리간드 결합 도메인, 선택적으로 힌지, 선택적으로 막관통 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, 제2 수용체는 (예컨대, 내인성 TCR과 같이) 내인성이다. 또 다른 실시형태에서, 제2 수용체는 외인성이며, 그 발현은 이를 인코딩하는 핵산의 형질전환 또는 형질도입에 의해 본 발명의 면역 세포 내에 유도된다. 상기 외인성 수용체는 외인성 TCR 또는 키메라 항원 수용체일 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 발명의 면역 세포는 2개의 키메라 항원 수용체를 발현하며, 첫 번째 것은 HLA-A2를 인식하고, 두 번째는 별개의 리간드를 인식한다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 면역 세포는 그의 세포 표면에서 본 발명의 CAR 및 HLA-A2 내의 다른 에피토프에 결합하는 다른 수용체 (본 명세서에서 "제2 수용체"로 지칭됨)를 발현한다. 본 발명에 따르면, 이러한 제2 수용체는 이전에 기재된 바와 같이 세포외 리간드 결합 도메인, 선택적으로 힌지, 선택적으로 막관통 도메인, 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 면역 세포는 2개의 CAR을 발현하며, 첫 번째 것은 HLA-A2의 제1 에피토프를 인식하고, 두 번째는 HLA-A2 내의 별개의 에피토프를 인식한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 제1 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 제2 수용체는 별개의 제2 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 제1 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 T 세포 1차 신호전달 도메인 (예컨대, 예를 들어, CD3제타)을 포함하고, 제2 수용체는 (예컨대, 4-1BB, CD28 또는 4-1BB 및 CD28의 공자극 신호전달 도메인의 조합과 같은) 공자극 신호전달 도메인을 포함한다. 제2 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 (예컨대, 예를 들어, 4-1BB, CD28 또는 4-1BB 및 CD28의 공자극 신호전달 도메인의 조합과 같은) 공자극 신호전달 도메인을 포함하고, 제2 수용체는 (예컨대, CD3제타와 같은) T 세포 1차 신호전달 도메인을 포함한다.
결과적으로, 이러한 실시형태에 따르면, 본 발명의 면역 세포의 완전한 활성화에는 본 발명의 CAR과 HLA-A2의 결합, 및 제2 수용체와 이것이 유도되는 리간드의 결합 둘 모두가 필요하다.
일 실시형태에서, 제2 수용체에 의해 인식되는 리간드는 발병 조직 또는 장기, 또는 자가면역 반응의 부위에서 발현되거나, 존재한다.
제2 수용체에 의해 인식될 수 있는 리간드의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 일반적인 인간 식이로부터의 식품 항원, 자가항원, 흡입된 알레르겐, 섭취된 알레르겐 또는 접촉 알레르겐을 포함한다.
용어 "일반적인 인간 식이로부터의 식품 항원"은 면역원성 펩타이드를 지칭하며, 이는 다음의 비 제한적 목록의 식품 항원과 같이 인간에게 일반적인 식품으로부터 유래된다: 소 항원, 예컨대 리포칼린, Ca-결합 S100, 알파-락탈부민, 락토글로불린, 예컨대 베타-락토글로불린, 소 혈청 알부민, 카제인. 식품-항원은 또한 대서양 연어 항원, 예컨대 파발부민 (parvalbumin); 닭 항원, 예를 들어 오보뮤코이드 (ovomucoid), 오발부민 (ovalbumin), Ag22, 콘알부민 (conalbumin), 리소자임 (lysozyme) 또는 닭 혈청 알부민; 땅콩 항원; 새우 항원, 예컨대 트로포미오신 (tropomyosin); 밀 항원, 예컨대 아글루티닌 (agglutinin) 또는 글리아딘 (gliadin); 셀러리 항원, 예컨대 셀러리 프로필린 (profilin); 당근 항원, 예컨대 당근 프로필린; 사과 항원, 예컨대 타우마틴 (thaumatin), 사과 지질 전달 단백질 또는 사과 프로필린; 배 항원, 예컨대 배 프로필린 또는 이소플라본 환원효소 (isoflavone reductase); 아보카도 항원, 예컨대 엔도키티나제 (endochitinase); 살구 항원, 예컨대 살구 지질 전달 단백질; 복숭아 항원, 예컨대 복숭아 지질 전달 단백질 또는 복숭아 프로필린; 대두 항원, 예컨대 HPS, 대두 프로필린 또는 (SAM22) PR-I0 prot; 이들의 단편, 변이체 및 혼합물일 수 있다.
일 실시형태에서, 상기 자가항원은 다발성 경화증 관련 항원, 관절 관련 항원, 안구 관련 항원, 인간 HSP 항원, 피부 관련 항원 또는 이식 거부 또는 GVHD에 관여하는 항원이다.
용어 "다발성 경화증 관련 항원"은 수초 염기성 단백질 (MBP), 수초 관련 당단백질 (MAG), 수초 희돌기교세포 당단백질 (MOG), 프로테오리피드 단백질 (PLP), 희돌기교세포 수초 올리고단백질 (OMGP), 수초 관련 희돌기교세포 기본 단백질 (MOBP), 희돌기교세포 특이적 단백질 (OSP/Claudinl 1), 열 충격 단백질, 희돌기교세포 특이적 단백질 (OSP), NOGO A, 당단백질 Po, 말초 수초 단백질 22 (PMP22), 2'3'-사이클릭 뉴클레오타이드 3'-포스포디에스테라제 (CNPase), 이들의 단편, 변이체 및 혼합물을 지칭한다.
용어 "관절-관련 항원"은 시트룰린-치환 사이클릭 및 선형 필라그린 펩타이드, 유형 II 콜라겐 펩타이드, 인간 연골 당단백질 39 (HCgp39) 펩타이드, HSP, 이종 핵 리보핵단백질 (hnRNP) A2 펩타이드, hnRNP B1, hnRNP D, Ro60/52, HSP60, HSP65, HSP70 및 HSP90, BiP, 케라틴, 비멘틴, 피브리노겐, 유형 I, III, IV 및 V 콜라겐 펩타이드, 아넥신 V, 글루코스 6 인산염 이성질화 효소 (GPI), 아세틸-칼파스타틴, 피루베이트 탈수소효소 (PDH), 알돌라제, 토포이소머라제 I, snRNP, PARP, Scl-70, Scl-100, 음이온성 카디오리핀 및 포스파티딜세린을 포함하는 인지질 항원, 중성 하전 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티딜콜린, 매트릭스 금속 단백질 분해효소, 피브릴린, 아그레칸, 이들의 단편, 변이체 및 혼합물을 지칭한다.
용어 "안구 관련 항원"은 유형 II 콜라겐, 망막 아레스틴, S-아레스틴, 광수용체간 망막 결합 단백질 (IRBP1), 베타-크리스탈린 B1, 망막 단백질, 맥락막 단백질 및 이들의 단편, 변이체 및 혼합물을 지칭한다.
용어 "인간 HSP 항원"은 인간 HSP60, HSP70, HSP90, 이들의 단편, 변이체 및 혼합물을 지칭한다.
피부-관련 항원의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 각질세포 항원, 진피 또는 표피에 존재하는 항원, (예를 들어, 멜라닌 또는 티로시나제와 같은) 멜라닌 세포 항원, 데스모글레인 (예를 들어, 데스모글레인 1 또는 3, 또한 Dsg1/3으로 지칭될 수 있음), BP180, BP230, 플렉틴, 인테그린 (예를 들어, 인테그린 α4β6), 콜라겐 (예를 들어, 콜라겐 유형 VII), 라미닌 (예를 들어, 라미닌 332 또는 라미닌 γ1), 플라킨 (예를 들어, 엔보플라킨, 페리플라킨 또는 데스모플라킨), 케라틴 (예를 들어, KRT5, KRT8, KRT15, KRT17 및 KRT31), 케라틴 필라멘트 관련 단백질, 필라그린, 코네오데모신 및 엘라스틴을 포함한다.
일 실시형태에서, 리간드는 이식 거부 또는 GVHD에 관여하는 항원이다. 이러한 항원의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 이식된 조직 또는 숙주에 특이적인 MHC, β2-마이크로글로불린, ABO 시스템의 항원, 붉은털원숭이 시스템의 항원 (특히 C, c, E et e 및 D 시스템의 항원) 및 이소해마글루티닌을 포함한다. 이식 거부 또는 GVHD에 관여할 수 있는 항원의 다른 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, HLA-DR (특히 이식 후 첫 6개월 동안), HLA-B (특히 이식 후 첫 2년 동안), 조직적합성 부 항원 (miHA, 예를 들어, HLA-E, HLA-F 및 HLA-G), MHC 클래스 I에 해당하는 HLA (B 및 C), MHC 클래스 II에 해당하는 HLA (DP, DM, DOA, DOB, DQ, 및 DR) 및 MHC 클래스 III에 해당하는 HLA (예를 들어, 보체 시스템의 성분)를 포함한다.
자가항원의 다른 예는 제한 없이, (예를 들어, 아쿠아포린-4 물관 (AQP4)와 같은) 아쿠아포린 물관, Hu, Ma2, 콜라핀 반응 매개체 단백질 5 (CRMP5), 및 암피피신, 전압 개폐 칼륨 채널 (VGKC), N-메틸-d-아스파르테이트 수용체 (NMDAR), α-아미노-3-하이드록시-5-메틸-4-이속사졸프로피온산 (AMPAR), 갑상선 퍼옥시다제, 티로글로불린, 항-N-메틸-D-아스파르테이트 수용체 (NR1 하위단위), Rh 혈액형 항원, I 항원, 데스모글레인 1 또는 3 (Dsg1/3), BP180, BP230, 아세틸콜린 니코틴성 시냅스 후 수용체, 갑상선 자극 호르몬 수용체, 혈소판 인테그린, GpIIb:IIIa, (예를 들어, 콜라겐 알파-3 (IV) 사슬과 같은) 콜라겐, 류머티스 인자, 칼파스타틴, 시트룰린 단백질, 수초 염기성 단백질 (MBP), 수초 희돌기교세포 당단백질 (MOG) 펩타이드, 알파-베타-크리스탈린, DNA, 히스톤, 리보솜, RNP, 조직 트랜스글루타미나제 (TG2), 내인자, 65-kDa 항원, 포스파티딜세린, 리보솜 인단백질, 항-호중구 세포질 항체, Scl-70, U1-RNP, ANA, SSA, 항-SSB, 항핵 항체 (ANA), 항호중구 세포질 항체 (ANCA), Jo-1, 항미토콘드리아 항체, gp210, p62, sp100, 항인지질 항체, U1-70 kd snRNP, GQ1b 강글리오사이드, GM1, 아시알로 GM1, GD1b, 항평활근 항체 (ASMA), 항-간-신장 마이크로솜-1 항체 (ALKM-1), 항-간-시토졸 항체-1 (ALC-1), IgA 항엔도미지얼 (antiendomysial) 항체, 호중구 과립 단백질, 연쇄상구균 세포벽 항원, 위벽세포의 내인자, 인슐린 (IAA), 글루탐산 데카복실라제 (GAA 또는 GAD) 및 (예를 들어, IA2 또는 ICA512와 같은) 단백질 티로신 포스파타제, PLA2R1 및 THSD7A1을 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 리간드는 오발부민, MOG, 유형 II 콜라겐 이들의 단편, 변이체 및 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 상기 리간드는 오발부민, 이들의 단편, 변이체 및 혼합물이다.
또 다른 실시형태에서, 상기 리간드는 MOG, 이들의 단편, 변이체 및 혼합물이다.
또 다른 실시형태에서, 상기 리간드는 유형 II 콜라겐, 이들의 단편, 변이체 및 혼합물이다.
또 다른 실시형태에서, 상기 리간드는 IL23R, 이들의 단편, 변이체 및 혼합물이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 HLA-A2와는 별개의 리간드를 인식하는 세포외 리간드 결합 도메인을 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 리간드 결합 도메인은 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR의 리간드 결합 도메인은 HLA-A2 상의 다수의 별개의 에피토프를 인식하는 다기능성 항체이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 CAR의 리간드 결합 도메인은 HLA-A2 상의 2개의 별개의 에피토프를 인식하는 이중 기능성 항체이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 HLA-A2 결합 도메인을 포함하는 세포외 리간드 결합 도메인 및 HLA-A2와는 별개의 리간드를 인식하는 또 다른 리간드 결합 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 리간드 결합 도메인은 HLA-A2 및 별개의 리간드 둘 모두를 인식하는 이중 기능성 항체이다.
본 발명의 CAR에 의해 인식될 수 있는 HLA-A2와는 별개의 리간드의 예는 본 명세서의 상기에 열거되어 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR-변형된 면역 세포는 적절한 CAR을 포함하는 렌티바이러스 벡터를 세포 내에 도입시킴으로써 생성될 수 있다. 일 실시형태에서, CAR을 발현하도록 변형된 면역 세포를 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 본 명세서의 임의의 부분에 기재된 바와 같은 벡터로 면역 세포를 형질도입하여 상기 변형된 면역 세포를 생성하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 유전자 변형된 면역 세포는 RNA의 도입을 통해 변형된다. 일 실시형태에서, 시험관내 전사된 RNA CAR은 일시적 형질감염의 형태로서 세포에 도입될 수 있다. RNA는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)-생성된 주형을 사용하여 시험관내 전사에 의해 생성될 수 있다. 임의의 공급원으로부터 대상 DNA는 적절한 프라이머 및 RNA 중합효소를 사용하여 시험관내 mRNA 합성을 위한 주형으로 PCR에 의해 직접 전환될 수 있다. DNA의 공급원은 예를 들어 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 파지 DNA, cDNA, 합성 DNA 서열 또는 임의의 다른 적절한 DNA 공급원일 수 있다. 시험관내 전사를 위한 바람직한 주형은 본 발명의 CAR이다.
일 실시형태에서, PCR에 사용되는 DNA는 오픈 리딩 프레임을 포함한다. DNA는 유기체의 게놈으로부터 천연 발생 DNA 서열로부터 유래할 수 있다. 일 실시형태에서, DNA는 전장 대상 유전자 또는 유전자의 일부이다. 유전자는 5' 및/또는 3' 비번역 영역 (UTR)의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다. 유전자는 엑손 및 인트론을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, PCR에 사용되는 DNA는 인간 유전자이다. 다른 실시형태에서, PCR에 사용되는 DNA는 5' 및 3' UTR을 포함하는 인간 유전자이다. DNA는 대안적으로 천연 발생 유기체에서 정상적으로 발현되지 않는 인공 DNA 서열일 수 있다. 예시적인 인공 DNA 서열은 융합 단백질을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임을 형성하기 위해 함께 결찰되는 유전자의 일부를 포함하는 것이다. 함께 결찰된 DNA 부분은 단일 유기체 또는 하나 초과의 유기체로부터 유래할 수 있다.
형질감염에 사용되는 mRNA의 시험관내 전사를 위한 주형을 생성하기 위해 PCR이 사용될 수 있다. PCR을 수행하는 방법은 당 업계에 잘 공지되어 있다. PCR에 사용하기 위한 프라이머는 PCR의 주형으로서 사용될 DNA의 영역에 실질적으로 상보적인 영역을 갖도록 설계된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이 "실질적으로 상보적"은 프라이머 서열에서 염기의 대부분 또는 전부가 상보적이거나, 하나 이상의 염기가 상보적이지 않거나, 미스매칭되는 뉴클레오타이드의 서열을 지칭한다. 실질적으로 상보적인 서열은 PCR에 사용된 어닐링 조건 하에서 의도된 DNA 표적과 어닐링 또는 혼성화될 수 있다. 프라이머는 DNA 주형의 임의의 부분에 실질적으로 상보적이 되도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 프라이머는 5' 및 3' UTR을 포함하여 세포에서 정상적으로 전사되는 유전자의 일부분 (오픈 리딩 프레임)을 증폭시키도록 설계될 수 있다. 프라이머는 또한 특정 대상 도메인을 인코딩하는 유전자의 일부를 증폭시키도록 설계될 수 있다. 일 실시형태에서, 프라이머는 5' 및 3' UTR의 전부 또는 일부를 포함하는 인간 cDNA의 코딩 영역을 증폭시키도록 설계된다. PCR에 유용한 프라이머는 당 업계에 공지된 합성 방법에 의해 생성된다.
"정방향 프라이머"는 증폭될 DNA 서열의 상류에 있는 DNA 주형 상의 뉴클레오타이드에 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 영역을 포함하는 프라이머이다. "상류"는 본 명세서에서 코딩 가닥에 대해 증폭될 DNA 서열에 대해 위치 5'을 지칭하는 것으로 사용된다. "역방향 프라이머"는 증폭될 DNA 서열의 하류에 있는 이중 가닥 DNA 주형에 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 영역을 포함하는 프라이머이다. "하류"는 본 명세서에서 코딩 가닥에 대해 증폭될 DNA 서열에 대해 위치 3'을 지칭하기 위해 사용된다.
PCR에 유용한 임의의 DNA 중합효소가 본 명세서에 개시된 방법에 사용될 수 있다. 시약 및 중합효소는 다수의 공급원으로부터 시판되는 것을 구입할 수 있다.
안정성 및/또는 번역 효율을 증진시키는 능력을 갖는 화학 구조가 또한 사용될 수 있다. RNA는 바람직하게는 5' 및 3' UTR을 갖는다. 일 실시형태에서, 5' UTR은 0 내지 3000개의 뉴클레오타이드 길이이다. 코딩 영역에 첨가될 5' 및 3' UTR 서열의 길이는 다음에 제한되는 것은 아니나, UTR의 상이한 영역에 어닐링되는 PCR의 프라이머를 설계하는 단계를 포함하는 상이한 방법에 의해 변경될 수 있다. 이 접근법을 사용하여, 당업자는 전사된 RNA의 형질감염 후 최적의 번역 효율을 달성하는데 필요한 5' 및 3' UTR 길이를 변형시킬 수 있다. 5' 및 3' UTR은 대상 유전자에 대한 천연 발생 내인성 5' 및 3' UTR일 수 있다. 대안적으로, 정방향 및 역방향 프라이머에 UTR 서열을 혼입시키거나, 주형의 임의의 다른 변형에 의해 대상 유전자에 대해 내인성이 아닌 UTR 서열을 첨가할 수 있다. 대상 유전자에 내인성이 아닌 UTR 서열의 사용은 RNA의 안정성 및/또는 번역 효율을 변형하는데 유용할 수 있다. 예를 들어, 3' UTR 서열의 AU-풍부 요소는 mRNA의 안정성을 감소시킬 수 있는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 3' UTR은 당 업계에 널리 공지된 UTR의 특성을 기반으로 하여 전사된 RNA의 안정성을 증가시키도록 선택되거나, 설계될 수 있다.
일 실시형태에서, 5' UTR은 내인성 유전자의 Kozak 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 대상 유전자에 내인성이 아닌 5' UTR이 상기 기재된 바와 같이 PCR에 의해 첨가되는 경우, 5' UTR 서열을 첨가함으로써 공통 Kozak 서열을 재설계할 수 있다. Kozak 서열은 일부 RNA 전사체의 번역 효율을 증가시킬 수 있지만, 효율적인 번역을 가능하게 하기 위해 모든 RNA에 필요한 것은 아닌 것으로 보인다. 많은 mRNA에 대한 Kozak 서열에 대한 필요성은 당 업계에 공지되어 있다. 다른 실시형태에서, 5' UTR은 RNA 게놈이 세포에서 안정한 RNA 바이러스로부터 유래할 수 있다. 다른 실시형태에서, mRNA의 엑소뉴클레아제 분해를 방해하기 위해 다양한 뉴클레오타이드 유사체가 3' 또는 5' UTR에 사용될 수 있다.
유전자 클로닝의 필요없이 DNA 주형으로부터 RNA의 합성을 가능하게 하기 위해, 전사 프로모터가 전사될 서열의 상류에서 DNA 주형에 부착되어야 한다. RNA 중합효소에 대한 프로모터로서 기능하는 서열이 정방향 프라이머의 5' 말단에 첨가되는 경우, RNA 중합효소 프로모터는 전사될 오픈 리딩 프레임의 상류에서 PCR 산물에 혼입된다. 바람직한 일 실시형태에서, 프로모터는 본 명세서의 다른 부분에 기재된 바와 같이 T7 중합효소 프로모터이다. 다른 유용한 프로모터는 다음에 제한되는 것은 아니나, T3 및 SP6 RNA 중합효소 프로모터를 포함한다. T7, T3 및 SP6 프로모터에 대한 공통 뉴클레오타이드 서열은 당 업계에 공지되어 있다.
바람직한 실시형태에서, mRNA는 세포에서 리보솜 결합, 번역의 개시 및 안정성 mRNA를 결정하는 5' 말단의 캡 및 3' 폴리(A) 꼬리 둘 모두를 갖는다. 원형 DNA 주형, 예를 들어 플라스미드 DNA에서, RNA 중합효소는 진핵 세포에서의 발현에 적합하지 않은 긴 콘카테머 (concatemer) 산물을 생성한다. 3' UTR의 말단에서 선형화된 플라스미드 DNA의 전사는 전사 후 폴리아데닐화된 경우에도 진핵생물 형질감염에 효과적이지 않은 정상 크기의 mRNA를 초래한다.
선형 DNA 주형에서, 파지 T7 RNA 중합효소는 주형의 마지막 염기 이후 전사체의 3' 말단을 연장할 수 있다 (문헌[Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva 및 Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270: 1485-65 (2003)]).
폴리A/T 길이를 DNA 주형 내로 혼입시키는 통상적인 방법은 분자 클로닝이다. 그러나, 플라스미드 DNA에 혼입된 폴리A/T 서열은 플라스미드 불안정성을 야기할 수 있으며, 이는 박테리아 세포로부터 획득된 플라스미드 DNA 주형이 결실 및 다른 결함으로 종종 고도로 오염되기 때문이다. 이로 인해 클로닝 절차에 많은 작업량 및 시간이 소요될뿐만 아니라, 종종 신뢰할 수 없는 경우가 발생한다. 이는 클로닝 없이 폴리A/T 3' 길이가 있는 DNA 주형을 작제할 수 있는 방법이 매우 적절하기 때문이다.
전사 DNA 주형의 폴리A/T 절편은 100 T 꼬리 (크기는 50 내지 5000 T일 수 있음)와 같은 폴리T 꼬리를 포함하는 역방향 프라이머를 사용하여 PCR 동안 또는 다음에 제한되는 것은 아니나, DNA 결찰 또는 시험관내 재조합을 포함하는 임의의 다른 방법에 의해 PCR 후에 생성될 수 있다. 폴리(A) 꼬리는 또한 RNA에 안정성을 제공하고, 그 분해를 감소시킨다. 일반적으로, 폴리(A) 꼬리의 길이는 전사된 RNA의 안정성과 양의 상관관계가 있다. 일 실시형태에서, 폴리(A) 꼬리는 100 내지 5000개의 아데노신이다.
RNA의 폴리(A) 꼬리는 E. 콜라이 폴리A 중합효소 (E-PAP)와 같은 폴리(A) 중합효소를 사용하여 시험관내 전사 후에 추가로 연장될 수 있다. 일 실시형태에서, 폴리(A) 꼬리의 길이를 100개의 뉴클레오타이드에서 300 내지 400개의 뉴클레오타이드로 증가시키면, RNA의 번역 효율이 약 2배 증가한다. 또한, 3' 말단에 상이한 화학물질 기의 부착은 mRNA 안정성을 증가시킬 수 있다. 이러한 부착은 변형/인공 뉴클레오타이드, 앱타머 및 다른 화합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, ATP 유사체는 폴리(A) 중합효소를 사용하여 폴리(A) 꼬리에 혼입될 수 있다. ATP 유사체는 RNA의 안정성을 추가로 증가시킬 수 있다.
RNA 상의 5' 캡은 또한 RNA 분자에 안정성을 제공한다. 바람직한 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법에 의해 생성된 RNA는 5' 캡을 포함한다. 5' 캡은 당 업계에 공지되어 있고 본 명세서에 기재된 기술을 사용하여 제공된다 (문헌[Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, et al., RNA, 7: 1468-95 (2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)]).
본 명세서에 개시된 방법에 의해 생성된 RNA는 또한 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 서열을 포함할 수 있다. IRES 서열은 mRNA에 대한 캡-비의존성 리보솜 결합을 개시하고, 번역의 개시를 촉진하는 임의의 바이러스 염색체 또는 인공적으로 설계된 서열일 수 있다. 당, 펩타이드, 지질, 단백질, 항산화제 및 계면활성제와 같은 세포 투과성 및 생존성을 촉진하는 인자를 포함할 수 있는 세포 전기천공에 적합한 임의의 용질이 포함될 수 있다.
RNA는 다수의 상이한 임의의 방법, 예를 들어 다음에 제한되는 것은 아니나, 전기천공법 (Amaxa Nucleofector-II (Amaxa Biosystems, Cologne, Germany)), (ECM 830 (BTX) (Harvard Instruments, Boston, Mass.) 또는 Gene Pulser II (BioRad, Denver, Colo.), Multiporator (Eppendort, Hamburg Germany), 리포펙션을 이용한 양이온성 리포좀 매개 형질감염, 중합체 캡슐화, 펩타이드 매개 형질감염 또는 "유전자 건"과 같은 생물학적 입자 전달 시스템을 사용하여 표적 세포 내로 도입될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)] 참조).
일 실시형태에서, CAR 서열은 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 세포내로 전달된다. CAR-발현 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터는 캡슐화, 결합 또는 네이키드 mRNA의 담체 또는 무세포 국소 또는 전신 전달로서 형질도입된 세포를 사용하여 상이한 유형의 진핵 세포뿐만 아니라, 조직 및 전체 유기체로 전달될 수 있다. 사용된 방법은 안정한 발현이 필요하거나, 충분한 임의의 목적을 위한 것일 수 있다.
다른 실시형태에서, CAR 서열은 시험관내 전사된 mRNA를 사용하여 세포내로 전달된다. 시험관내 전사된 mRNA CAR은 캡슐화, 결합 또는 네이키드 mRNA의 담체 또는 무세포 국소 또는 전신 전달로서 형질감염된 세포를 사용하여 상이한 유형의 진핵 세포뿐만 아니라, 조직 및 전체 유기체로 전달될 수 있다. 사용된 방법은 일시적인 발현이 필요하거나, 충분한 임의의 목적을 위한 것일 수 있다.
다른 실시형태에서, 적절한 CAR은 트랜스포손 (transposon)에 의해 세포에서 발현될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 면역 세포는 T 세포이다. 본 발명의 T 세포의 확장 및 유전자 변형 전에, T 세포의 공급원을 대상체로부터 획득한다. T 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위의 조직, 복수, 흉막 삼출액, 비장 조직 및 종양을 포함하는 다수의 공급원으로부터 획득될 수 있다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 당 업계에서 이용 가능한 임의의 수의 T 세포주가 사용될 수 있다. 본 발명의 특정 실시형태에서, T 세포는 당업자에게 공지된 임의의 수의 기술, 예컨대 Ficoll™ 분리 또는 Sepax 분리 시스템을 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 단위로부터 획득될 수 있다. 바람직한 일 실시형태에서, 개체의 순환 혈액으로부터의 세포를 성분채집술에 의해 획득한다. 성분채집 산물은 통상적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 포함하여 림프구를 포함한다. 일 실시형태에서, 성분채집술에 의해 수집된 세포를 세척하여, 혈장 분획을 제거하고, 세포를 후속 처리 단계에 적합한 완충액 또는 배지에 적용할 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 세포를 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세척한다. 대안적인 실시형태에서, 세척액에는 칼슘이 부재하거나, 마그네슘이 부재하거나, 모든 2가 양이온은 아니더라도 대부분이 부재할 수 있다. 세척 후, 세포를 다양한 생체적합성 완충액, 예를 들어 Ca2+-무함유, Mg2+-무함유 PBS, PlasmaLyte A, 또는 완충액의 존재 또는 부재 하의 다른 식염수 용액에 재현탁할 수 있다. 대안적으로, 성분채집 샘플의 부적절한 성분을 제거할 수 있고, 세포를 배양 배지에 직접 재현탁할 수 있다.
T 세포의 공급원, 활성화 및 확장
일 실시형태에서, 면역 세포는 T 세포일 수 있다. 본 발명의 T 세포의 확장 및 유전자 변형 전에, T 세포가 제조될 수 있는 T 세포 또는 전구 세포의 공급원을 대상체로부터 획득한다. T 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 배중심, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출, 비장, 종양, 이식된 장기/조직을 포함하여, 이러한 세포가 존재하는 임의의 공급원으로부터 획득될 수 있다. 본 발명의 특정 실시형태에서, T 세포는 당업자에게 공지된 임의의 수의 기술, 예컨대 Ficoll™ 분리를 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 단위로부터 획득될 수 있다. 일 실시형태에서, 대상체의 순환 혈액으로부터의 세포를 성분채집술에 의해 획득한다. 성분채집 산물은 통상적으로 T 세포, Treg, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 포함하여 림프구를 포함한다. 일 실시형태에서, 성분채집술에 의해 수집된 세포를 세척하여 혈장 분획을 제거하고, 세포를 후속 처리 단계에 적합한 완충액 또는 배지에 적용할 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 세포를 세척 용액 (예를 들어, 인산염 완충 식염수 (PBS))으로 세척할 수 있다. 당업자는 세척 단계가 당 업계에 공지된 방법, 예컨대 반자동 "유체 통과" 원심분리기 (예를 들어, Cobe 2991 세포 처리기, the Baxter CytoMate, 또는 the Haemonetics Cell Saver 5)를 제조사의 지침에 따라 사용함으로써 달성될 수 있음을 용이하게 이해할 것이다. 세척 후, 세포를 다양한생체 적합성 완충액, 예를 들어 Ca2+-무함유, Mg2+-무함유 PBS, PlasmaLyte A, 또는 완충액의 존재 또는 부재 하의 다른 식염수 용액에 재현탁할 수 있다. 대안적으로, 성분채집 샘플의 부적절한 성분을 제거할 수 있고, 세포를 배양 배지에 직접 재현탁할 수 있다.
다른 실시형태에서, 적혈구를 용해시키고, 예를 들어 PERCOLL™ 구배를 통한 원심분리 또는 역류 원심분리 용리에 의해 단핵구를 고갈시킴으로써 T 세포를 말초 혈액 림프구로부터 단리한다. T 세포, 예컨대 CD3+, CD25+, CD127neg, HLA-DR+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및/또는 CD45RO+ T 세포의 특정 하위집합을 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 추가로 단리할 수 있다. 당업자는 다수의 선택 라운드가 본 발명과 관련하여 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 특정 실시형태에서, 선택 절차를 수행하고, 활성화 및 확장 과정에서 "선택되지 않은" 세포를 사용하는 것이 적절할 수 있다. "선택되지 않은" 세포를 또한 추가 선택 라운드에 적용할 수 있다.
음성 선택에 의한 T 세포 집합의 다량화를 음성 선택 세포에 고유한 표면 마커에 대한 항체의 조합에 의해 달성할 수 있다. 하나의 방법은 음성 선택 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커에 대한 단일클론 항체의 칵테일을 사용하는 음성 자기 면역부착 또는 유세포 분석을 통한 세포 분류 및/또는 선택이다. 예를 들어, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 다량화하기 위해, 단일클론 항체 칵테일은 통상적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 통상적으로 CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+, 및 FoxP3+를 발현하는 조절 T 세포를 다량화하거나, 양성적으로 선택하는 것이 적절할 수 있다.
양성 또는 음성 선택에 의해 적절한 세포 집합을 단리하기 위해, 세포 및 표면의 농도 (예를 들어, 비드와 같은 입자)를 변화시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, 세포 및 비드의 최대 접촉을 보장하기 위해, 비드 및 세포를 함께 혼합한 부피를 유의하게 감소시키는 것 (즉, 세포의 농도를 증가시키는 것)이 적절할 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 20억 세포/ml의 농도가 사용된다. 일 실시형태에서, 10억 세포/ml의 농도가 사용된다. 추가의 실시형태에서, 1억개 초과의 세포/ml가 사용된다. 추가의 실시형태에서, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50x106 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100x106 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 추가의 실시형태에서, 125 또는 150x106 세포/ml의 농도가 사용될 수 있다. 높은 농도를 사용하면 세포 수율, 세포 활성화 및 세포 확장이 증가할 수 있다. 또한, 높은 세포 농도의 사용에 의해 많은 종양 세포가 존재하는 샘플 (즉, 백혈병 혈액, 종양 조직 등) 또는 대상 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는 세포의 더욱 효율적인 포획이 가능하다. 이러한 세포 집합은 치료적 가치를 가질 수 있고, 그 획득이 적절할 것이다.
관련 실시형태에서, 더 낮은 농도의 세포를 사용하는 것이 적절할 수 있다. T 세포 및 표면 (예를 들어, 비드와 같은 입자)의 혼합물을 유의하게 희석함으로써 입자와 세포 사이의 상호작용을 최소화한다. 이에 의해 입자에 결합될 다량의 적절한 항원을 발현하는 세포를 선택한다. 예를 들어, CD4+ T 세포는 더 높은 수준의 CD28을 발현하고, 희석 농도의 CD8+ T 세포보다 더 효율적으로 포획된다. 일 실시형태에서, 사용된 세포의 농도는 5x106/ml이다. 다른 실시형태에서, 사용되는 농도는 약 1x105/ml 내지 1x106/ml 및 그 사이의 임의의 정수 값일 수 있다.
다른 실시형태에서, 세포를 2 내지 10℃ 또는 실온에서 다양한 속도로 다양한 시간 동안 교반기에서 인큐베이션할 수 있다.
자극을 위한 T 세포를 또한 세척 단계 후에 동결시킬 수 있다. 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 동결 및 후속 해동 단계는 세포 집합에서 과립구 및 일정 정도의 단핵구를 제거함으로써보다 균일한 산물을 제공한다. 혈장 및 혈소판을 제거하는 세척 단계 후, 세포를 동결 용액에 현탁시킬 수 있다. 많은 동결 용액 및 매개변수가 당 업계에 공지되어 있고, 이와 관련하여 유용할 것이지만, 하나의 방법은 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민을 포함하는 PBS 또는 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민 및 7.5% DMSO, 또는 31.25% Plasmalyte-A, 31.25% 덱스트로스 5%, 0.45% NaCl, 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민, 및 7.5% DMSO를 포함하는 배양 배지 또는 예를 들어, Hespan 및 PlasmaLyte A를 포함하는 다른 적합한 세포 동결 배지를 사용하는 단계를 포함하고, 그 후, 세포를 분당 1˚의 속도로 -80℃로 동결시키고, 액체 질소 저장 탱크의 기상에 저장한다. -20℃에서 또는 액체 질소에서 즉시 제어되지 않는 동결뿐만 아니라, 제어된 동결의 다른 방법을 사용할 수 있다.
특정 실시형태에서, 동결 보존된 세포를 본 명세서에 기재된 바와 같이 해동 및 세척하고, 실온에서 1시간 동안 방치한 후, 본 발명의 방법을 사용하여 활성화시킨다.
본 발명과 관련하여, 본 명세서에 기재된 바와 같이 확장된 세포가 필요할 수 있는시간 이전에 대상체로부터 혈액 샘플 또는 성분채집 산물의 수집이 고려된다. 이와 같이, 확장될 세포의 공급원을 필요한 임의의 시점에 수집할 수 있고, T 세포와 같은 적절한 세포를 단리하고, 본 명세서에 기재된 것과 같은 T 세포 요법이 유리할 것인 임의의 수의 질병 또는 병태를 위한 T 세포 요법에서 추후 사용하기 위해 동결한다. 특정 실시형태에서, 질병이 발병할 위험이 있지만 아직 질병이 발병하지 않은 대상체로부터 혈액 샘플 또는 성분채집을 채취하고, 대상 세포를 추후 사용을 위해 단리 및 동결한다. 특정 실시형태에서, T 세포를 확장, 동결하여, 추후에 사용할 수 있다. 특정 실시형태에서, 샘플을 본 명세서에 기재된 바와 같은 특정 질병의 진단 직후 및 임의의 치료 전에 대상체로부터 수집한다. 추가의 실시형태에서, 다음에 제한되는 것은 아니나, 제제, 예컨대 나탈리주맙, 에팔리주맙, 항바이러스제, 화학요법, 방사선, 면역억제제, 예컨대 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트 및 FK506, 항체 또는 다른 면역제거제, 예컨대 CAMPATH, 항-CD3 항체, 사이톡산, 플루다라빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 미코페놀산, 스테로이드, FR901228 및 방사선 조사에 의한 치료를 포함하여, 임의의 수의 적절한 치료 방식 전에 대상체로부터의 혈액 샘플 또는 성분채집으로부터 세포를 단리한다. 이들 약물은 칼슘 의존성 포스파타제 칼시뉴린 (calcineurin)을 억제하거나 (사이클로스포린 및 FK506), 성장 인자 유도 신호전달에 중요한 p70S6 키나제를 억제한다 (라파마이신) (문헌[Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun 5:763-773, 1993]). 추가의 실시형태에서, 환자의 세포를 단리하고, (예를 들어, 동시에 또는 후에) 골수 또는 줄기세포 이식, 세포요법제, 예컨대 플루다라빈, 외부 빔 조사 요법 (XRT), 사이클로포스파미드 또는 OKT3 또는 CAMPATH와 같은 항체를 사용한 T 세포 제거 요법과 함께 추후 사용을 위해 동결한다. 다른 실시형태에서, CD20과 반응하는 제제, 예를 들어 리툭산 (Rituxan)과 같은 B-세포 제거 요법 후의 치료를 위해 그 전에 세포를 단리하여, 추후 사용을 위해 동결할 수 있다.
본 발명의 추가 실시형태에서, T 세포를 치료 직후 환자로부터 획득한다. 이와 관련하여, 특정 면역억제 치료, 특히 면역 시스템을 손상시키는 약물에 의한 치료 후, 환자가 치료로부터 정상적으로 회복되는 기간 동안 치료 직후, 획득된 T 세포의 특질이 생체외에서 확장하는 능력을 위해 최적이거나 개선될 수 있음이 관찰되었다. 마찬가지로, 본 명세서에 기재된 방법을 사용한 생체외 조작 후, 이들 세포는 향상된 생착 및 생체내 확장을 위해 바람직한 상태일 수 있다. 따라서, 이러한 회복 단계 동안 면역 세포를 수집하는 단계가 본 발명과 관련하여 고려된다. 또한, 특정 실시형태에서, 동원 (예를 들어, GM-CSF에 의한 동원) 및 컨디셔닝 용법은 치료 후 소정의 시간대 동안 특정 세포 유형의 재집합, 재순환, 재생 및/또는 확장이 선호되는 대상체에서 조건을 생성하는데 사용될 수 있다.
적절한 CAR을 발현시키기 위한 T 세포의 유전자 변형 이전 또는 이후에, 일반적으로, 예를 들어 미국 특허 제 6,352,694호; 제 6,534,055호; 제 6,905,680호; 제 6,692,964호; 제 5,858,358호; 제 6,887,466호; 제 6,905,681호; 제 7,144,575호; 제 7,067,318호; 제 7,172,869호; 제 7,232,566호; 제 7,175,843호; 제 5,883,223호; 제 6,905,874호; 제 6,797,514호; 제 6,867,041호; 제 및 미국 특허 출원 공보 제 20060121005호에 기재된 방법을 사용하여 T 세포를 활성화하고, 확장할 수 있다.
일반적으로, CD3/TCR 복합체 관련 신호를 자극하는 제제 및 T 세포 표면의 공자극 분자를 자극하는 리간드가 부착된 표면과의 접촉에 의해 본 발명의 T 세포를 확장시킨다. 특히, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 예를 들어 항-CD3 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 표면에 고정된 항-CD2 항체와의 접촉 또는 칼슘 이온 투과 담체와 함께 단백질 키나제 C 활성화제 (예를 들어, 브리오스타틴 (bryostatin))와의 접촉에 의해 T 세포 집합을 자극시킬 수 있다. T 세포의 표면에서 보조 분자의 공자극을 위해, 보조 분자에 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들어, CD4+ T 세포, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체의 증식을 자극하기 위해, T 세포의 증식을 자극하기에 적합한 조건 하에서 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 T 세포 집합을 접촉시킬 수 있다. 항-CD28 항체의 예는 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Besancon, France)을 포함하고, 이는 당 업계에 통상적으로 공지된 다른 방법으로 사용될 수 바와 같이 사용될 수 있다 (문헌[Diaclone, Besancon, France) can be used as can other methods commonly known in the art (Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999]).
특정 실시형태에서, T 세포에 대한 1차 자극 신호 및 공자극 신호는 상이한 프로토콜에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 각각의 신호를 제공하는 제제는 용액이거나, 표면에 결합될 수 있다. 표면에 결합되는 경우, 제제는 동일한 표면 (즉, "시스" 형태)에 또는 별개의 표면 (즉, "트랜스" 형태)에 결합될 수 있다. 대안적으로, 하나의 제제는 표면에 결합되고, 다른 제제는 용액으로 결합될 수 있다. 일 실시형태에서, 공자극 신호를 제공하는 제제는 세포 표면에 결합되고, 1차 활성화 신호를 제공하는 제제는 용액이거나, 표면에 결합된다. 특정 실시형태에서, 두 제제는 모두 용액일 수 있다. 다른 실시형태에서, 제제는 가용성 형태일 수 있고, 그 후 예를 들어 항체 또는 Fc 수용체를 발현하는 세포 또는 제제에 결합할 다른 결합제와 같이, 표면에 교차연결될 수 있다. 이와 관련하여, 예를 들어, 본 발명에서 T 세포의 활성화 및 확장에 사용하기 위해 고려되는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)에 대한 미국 특허 출원 공개 제 20040101519호 및 제 20060034810호를 참조한다.
일 실시형태에서, 두 제제는 비드 상, 동일한 비드, 즉 "시스" 또는 별개의 비드, 즉 "트랜스" 상에 고정된다. 예를 들어, 1차 활성화 신호를 제공하는 제제는 항-CD3 항체 또는 그의 항원 결합 단편이고, 공자극 신호를 제공하는 제제는 항-CD28 항체 또는 그의 항원 결합 단편이며; 두 제제는 모두 동일한 분자량으로 동일한 비드에 공동 고정된다. 일 실시형태에서, CD4+ T 세포 확장 및 T 세포 성장을 위해 비드에 결합된 각각의 항체의 1:1 비율이 사용된다. 본 발명의 특정 양상에서, 비드에 결합된 항 CD3:CD28 항체의 비율은 1:1의 비율을 사용하여 관찰된 확장과 비교하여 T 세포 확장의 증가가 관찰되는 것으로 사용된다. 특정한 일 실시형태에서, 1:1의 비율을 사용하여 관찰된 확장과 비교하여 약 1 내지 약 3배의 증가가 관찰된다. 일 실시형태에서, 비드에 결합된 CD3:CD28 항체의 비율은 100:1 내지 1:100의 범위이고, 그 사이의 모든 정수 값이다. 본 발명의 일 양상에서, 항-CD3 항체보다 더 많은 항-CD28 항체가 입자에 결합되며, 즉 CD3:CD28의 비율이 1 미만이다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 비드에 결합하는 항 CD28 항체 대 항 CD3 항체의 비율은 2:1을 초과한다. 특정한 일 실시형태에서, 비드에 결합하는 항체의 1:100 CD3:CD28 비율이 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 비드에 결합하는 항체의 1:75 CD3:CD28 비율이 사용된다. 추가의 실시형태에서, 비드에 결합하는 항체의 1:50 CD3:CD28 비율이 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 비드에 결합하는 항체의 1:30 CD3:CD28 비율이 사용된다. 바람직한 일 실시형태에서, 비드에 결합하는 항체의 1:10 CD3:CD28 비율이 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 비드에 결합하는 항체의 1:3 CD3:CD28 비율이 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 비드에 결합하는 항체의 3:1 CD3:CD28 비율이 사용된다.
1:500 내지 500:1의 입자 대 세포의 비율 및 그 사이의 임의의 정수 값이 T 세포 또는 다른 표적 세포를 자극하는데 사용될 수 있다. 당업자가 쉽게 이해할 수 있는 바와 같이, 입자 대 세포의 비율은 표적 세포에 대비한 입자 크기에 따라 다를 수 있다. 예를 들어, 작은 크기의 비드는 소수의 세포에만 결합할 수 있고, 더 큰 비드는 많은 세포에 결합할 수 있다. 특정 실시형태에서, 세포 대 입자의 비율은 1:100 내지 100:1의 범위이고, 그 사이의 임의의 정수 값이며, 추가의 실시형태에서, T 세포를 자극하기 위한 비율은 1:9 내지 9:1을 포함하고, 그 사이의 임의의 정수 값이 또한 사용될 수 있다. T 세포 자극을 야기하는 항-CD3- 및 항-CD28-결합 입자 대 T 세포의 비율은 상기한 바와 같이 다양할 수 있다. 예를 들어, 이 값은 T 세포당 1:100, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 15:1, 및 1:1 입자를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 1:1 이하의 입자 대 세포의 비율이 사용된다. 특정한 일 실시형태에서, 입자:세포 비율은 1:5일 수 있다. 추가의 실시형태에서, 입자 대 세포의 비율은 자극 일에 따라 다를 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 입자 대 세포의 비율은 첫날에 1:1 내지 10:1이고, 추가의 입자가 매일 또는 격일로 그 이후 최대 10일 동안 1:1 내지 1:10 (첨가 일의 세포 수 기준)의 최종 비율로 첨가된다. 특정한 일 실시형태에서, 입자 대 세포의 비율은 자극 첫날에 1:1이고, 자극 셋째날 및 다섯째 날에 1:5로 조정된다. 다른 실시형태에서, 입자는 매일 또는 격일 기준으로 자극 첫날에 1:1의 최종 비율로, 셋째날 및 다섯째날에 1:5로 첨가된다. 다른 실시형태에서, 입자 대 세포의 비율은 자극 첫날에 2:1이고, 자극 셋째날 및 다섯째날에는 1:10으로 조정된다. 다른 실시형태에서, 입자는 매일 또는 격일 기준으로 자극 첫날에 1:1의 최종 비율로, 셋째날 및 다섯째날에 1:10으로 첨가된다. 당업자는 다양한 다른 비율이 본 발명에 사용하기에 적합할 수 있음을 이해할 것이다. 특히, 비율은 입자 크기 및 세포 크기 및 유형에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 추가의 실시형태에서, T 세포 (예를 들어, Treg 세포)와 같은 세포를 제제-코팅된 비드와 조합하고, 이어서 비드 및 세포를 분리한 후, 세포를 배양한다. 대안적인 실시형태에서, 배양 전에, 제제-코팅된 비드 및 세포를 분리하지 않고 함께 배양한다. 추가의 실시형태에서, 비드 및 세포를 우선 자기력과 같은 힘의 적용에 의해 집중시키고, 세포 표면 마커의 결찰을 증가시켜, 세포 자극을 유도한다.
예로서, 항-CD3 및 항-CD28이 부착된 상자성 비드 (3x28 비드)를 T 세포와 접촉시킴으로써 세포 표면 단백질을 결찰시킬 수 있다. 일 실시형태에서, 세포 (예를 들어, 104 내지 109개의 T 세포) 및 비드 (예를 들어, 1:1의 비율의 DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T 상자성 비드)를 완충액, 바람직하게는 PBS (칼슘 및 마그네슘과 같은 2가 양이온의 부재 하) 중에 조합시킨다. 다시 말하면, 당업자는 임의의 세포 농도가 사용될 수 있음을 쉽게 이해할 수 있다.
예를 들어, 표적 세포는 샘플 내에 매우 드물고, 샘플의 0.01%만을 차지할 수 있거나, 전체 샘플 (즉, 100%)이 대상 표적 세포를 포함할 수 있다. 따라서, 임의의 세포 수는 본 발명의 맥락 내에 있다. 특정 실시형태에서, 세포및 입자의 최대 접촉을 보장하기 위해 입자 및 세포를 함께 혼합한 부피를 유의하게 감소시키는 것 (즉, 세포의 농도를 증가시키는 것)이 적절할 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 약 20억 세포/ml의 농도가 사용된다. 다른 실시형태에서, 1억개 초과의 세포/ml가 사용된다. 추가의 실시형태에서, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50x106 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100x106 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 추가의 실시형태에서, 125 내지 150x106 세포/ml의 농도가 사용될 수 있다. 높은 농도를 사용하면 세포 수율, 세포 활성화 및 세포 확장이 증가할 수 있다. 또한, 높은 세포 농도의 사용에 의해 대상 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는 세포를 더욱 효과적으로 포획할 수 있다. 이러한 세포 집합은 치료적 가치를 가질 수 있으며, 특정 실시형태에서 획득하는 것이 적절할 것이다.
본 발명의 일 실시형태에서, 수 시간 (약 3시간) 내지 약 14일 또는 그 사이의 임의의 정수 값의 시간 동안 혼합물을 배양할 수 있다. 다른 실시형태에서, 혼합물을 21일 동안 배양할 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 비드 및 T 세포를 약 8일 동안 함께 배양한다. 다른 실시형태에서, 비드 및 T 세포를 2 내지 3일 동안 함께 배양한다. T 세포의 배양 시간이 60일 이상일 수 있도록 수 주기의 자극이 또한 적절할 수 있다. T 세포 배양에 적합한 조건은 혈청 (예를 들어, 태아 소 또는 인간 혈청), 인터루킨-2 (IL-2), 인슐린, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ 및 TNF-α 또는 당업자에게 공지된 세포의 성장을 위한 임의의 다른 첨가제를 포함하여, 증식 및 생존에 필요한 인자를 포함할 수 있는 적절한 배지 (예를 들어, Minimal Essential Media 또는 RPMI Media 1640 또는 X-vivo 15, (Lonza))를 포함한다. 세포의 성장을 위한 다른 첨가제는 다음에 제한되는 것은 아니나, 계면활성제, 플라스마네이트 (plasmanate) 및 환원제, 예컨대 N-아세틸-시스테인 및 2-머캅토에탄올을 포함한다. 배지는 아미노산, 피루브산나트륨 및 비타민이 첨가되고, 무혈청이거나, 적절한 양의 혈청 (또는 혈장) 또는 소정의 호르몬 세트 및/또는 T 세포의 성장 및 확장에 충분한 양의 사이토카인 (들)이 보충된 것으로, RPMI 1640, Immunocult (StemCell), AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15, 및 X-Vivo 20, Optimizer를 포함할 수 있다. 항생제, 예를 들어 페니실린 및 스트렙토마이신은 실험 배양물에만 포함되며, 대상체에 주입될 세포 배양 물에는 포함되지 않는다. 표적 세포는 성장 지원에 필요한 조건, 예를 들어 적절한 온도 (예를 들어, 37℃) 및 대기 (예를 들어, 공기 + 5% CO2) 하에 유지된다.
다양한 자극 시간에 노출된 T 세포는 상이한 특성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 통상적인 혈액 또는 비구면 말초 혈액 단핵 세포 산물은 세포 독성 또는 억제제 T 세포 집합 (TC, CD8+)보다 더 큰 헬퍼 T 세포 집합 (TH, CD4+)을 갖는다. CD3 및 CD28 수용체의 자극에 의한 T 세포의 생체외 확장은 약 8 내지 9일 전에 TH 세포로 구성되는 T 세포 집합을 생성하며, 약 8 내지 9일 후에 T 세포 집합은 점점 더 큰 TC 세포 집합을 포함한다.
또한, CD4 및 CD8 마커 이외에도, 다른 표현형 마커는 세포 확장 과정 동안 유의하지만 대부분 재현성있게 다양하다. 따라서, 이러한 재현성은 특정 목적을 위해 활성화된 T 세포 산물을 조정하는 능력을 가능하게 한다.
일 실시형태에서, RosetteSep (Stemcell)을 통해 HLA-A2- 공여체로부터 CD4+ T 세포를 단리하고, CD25+ 세포 (Miltenyi)를 다량화한 후, FACSAria II (BD Biosciences)를 사용하여, 생존 CD4+CD127loCD25hi Treg를 분류함으로써, 조절 T 세포를 획득할 수 있다. 분류된 Treg를 1000 U/ml의 IL-2 중에서 L 세포 및 αCD3 mAb (OKT3; 200 ng/mL)로 자극할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 예를 들어 본 명세서에 참조로 포함되는 WO2007110785에 기재된 바와 같이 조절 T 세포를 얻기 위해 T 세포를 라파마이신의 존재 하에서 배양할 수 있다. 조절 T 세포를 생성하는 다른 방법은 본 명세서에 참조로 포함되는 US2016024470에 기재되어 있으며, 여기서 T 세포 수용체 (TCR)/CD3 활성화제, 예를 들어 TCR/CD3 항체, TCR 공자극 활성화제, 예를 들어 CD28, CD137 (4-1 BB), GITR, B7-1/2, CD5, ICOS, OX40, CD40 또는 CD137 항체, 및 라파마이신과 함께 T 세포를 배양한다.
본 발명의 일 실시형태에서, CAR의 발현에 의해 유전자 변형된 T 세포를 또한 적어도 하나의 세포내 인자, 예컨대 ROR-C, Foxo1, T-bet, 또는 Gata 3, c-Maf, AhR의 발현에 의해 유전자 변형시킬 수 있었다. 일 실시형태에서, 본 발명의 유전자 변형된 면역 세포는 Foxo1을 발현한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 유전자 변형 세포는 예를 들어, 동종이계 T 또는 Treg 세포와 같은 동종이계 면역 세포일 수 있다. 예를 들어, 동종이계 면역 세포는 기능성 인간 백혈구 항원 (HLA), 예를 들어, HLA 클래스 I 및/또는 HLA 클래스 II의 발현이 부재하거나, 기능성 T 세포 수용체 (TCR)의 발현이 부재하는 면역 세포일 수 있다.
일 실시형태에서, 기능성 TCR이 부재하는 T 세포를 그 표면 상에 임의의 기능성 TCR을 발현하지 않도록 조작하거나, 기능성 TCR을 포함하는 하나 이상의 하위단위를 발현하지 않도록 조작하거나, 그 표면 상에 매우 소량의 기능성 TCR을 생성하도록 조작할 수 있다. 대안적으로, T 세포는 예를 들어 TCR의 하나 이상의 하위단위의 돌연변이 또는 절단된 형태의 발현에 의해 실질적으로 손상된 TCR을 발현할 수 있다. 용어 "실질적으로 손상된 TCR"은 이 TCR이 숙주에서 유해한 면역 반응을 유발하지 않을 것을 의미한다.
다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 유전자 변형 세포는 그 표면에 기능성 HLA를 발현하지 않도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 면역 세포는 세포 표면 발현 HLA, 예를 들어, HLA 클래스 1 및/또는 HLA 클래스 II 또는 비통상적 HLA 분자가 하향조절되도록 조작될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, T 세포는 기능성 TCR 및 기능성 HLA 예컨대 HLA 클래스 I 및/또는 HLA 클래스 II가 부재할 수 있다.
기능성 TCR 및 HLA의 발현이 부재하는 (예컨대, 변형된 T 또는 Treg 세포와 같은) 변형된 면역 세포는 TCR 및/또는 HLA의 하나 이상의 하위단위의 녹아웃 (knock out) 또는 녹다운 (knock down)을 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 획득될 수 있다. 예를 들어, 면역 세포는 siRNA, shRNA, 일정한 간격으로 분포하는 짧은 회문 반복 (clustered regularly interspaced short palindromic repeat) (CRISPR)전사 활성화제 유사 효과기 뉴클레아제 (TALEN), 아연 핑거 엔도뉴클레아제 (ZFN), 메가뉴클레아제 (mn, 또한 회귀 엔도뉴클레아제로 지칭됨) 또는 메가TAL (mn 절단 도메인과 TAL 효과기의 조합)을 사용한 TCR 및/또는 HLA의 녹다운을 포함할 수 있다 (문헌[Osborn et al, "Evaluation of TCR Gene Editing Achieved by TALENs, CRISPR/Cas9, and megaTAL Nucleases" Mol Ther. 2016 Mar;24(3):570-81]).
일 실시형태에서, TCR 발현 및/또는 HLA 발현은 T 세포에서 TCR 및/또는 HLA를 인코딩하는 핵산을 표적화하는 siRNA 또는 shRNA를 사용하여 억제될 수 있다. T 세포에서 siRNA 및 shRNA의 발현은 예를 들어 렌티바이러스 발현 시스템과 같은 임의의 통상적인 발현 시스템을 사용하여 달성될 수 있다. HLA 클래스 I 및/또는 HLA 클래스 II 유전자의 발현을 하향조절하는 예시적인 siRNA 및 shRNA는 예를 들어 US2007/0036773에 기재되어 있다. TCR의 성분의 발현을 하향조절하는 예시적인 shRNA는 예를 들어 US2012/0321667에 기재되어 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "CRISPR" 또는 "TCR 및/또는 HLA에 대한 CRISPR" 또는 "TCR 및/또는 HLA를 억제하는 CRISPR"은 일련의 일정한 간격으로 분포되는 짧은 회문 반복 또는 이러한 일련의 반복을 포함하는 시스템을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이 "Cas"는 CRISPR 관련 단백질을 지칭한다. "CRISPR/Cas"시스템은 TCR 및/또는 HLA 유전자를 침묵화시키거나, 돌연변이시키는데 사용될 수 있는 CRISPR 및 Cas로부터 유래된 시스템을 지칭한다.
천연 발생 CRISPR/Cas 시스템은 대략 40%의 시퀀싱된 박테리아 게놈 및 90%의 시퀀싱된 고세균에 존재한다. 문헌[Grissa et al. (2007) BMC Bioinformatics 8: 172]. 이 시스템은 플라스미드 및 파지와 같은 외래 유전자 요소에 대한 내성을 부여하고, 획득된 면역의 형태를 제공하는 일 유형의 원핵생물 면역 시스템이다. 문헌[Barrangou et al. (2007) Science 315: 1709-1712; Marragini et al. (2008) Science 322: 1843-1845]. CRISPR/Cas 시스템은 마우스 또는 영장류와 같은 진핵생물에서 유전자 편집 (특정 유전자의 침묵화, 강화 또는 변경)에 사용하도록 변형되었다. 문헌[Wiedenheft et al. (2012) Nature 482: 331-8]. 이는 특이적으로 설계된 CRISPR 및 하나 이상의 적절한 Cas를 포함하는 플라스미드를 진핵 세포내로 도입함으로써 달성된다. 때때로 CRISPR 유전자좌로 지칭되는 CRISPR 서열은 교번 반복 및 스페이서를 포함한다. 천연 발생 CRISPR에서, 스페이서는 일반적으로 플라스미드 또는 파지 서열과 같은 박테리아 외부의 서열을 포함하고; TCR 및/또는 HLA CRISPR/Cas 시스템에서, 스페이서는 TCR 또는 HLA 유전자 서열로부터 유래된다. CRISPR 유전자좌로부터의 RNA는 Cas 단백질에 의해 항시적으로 발현되고, 소형 RNA로 가공된다. 이는 반복 서열에 측접된 스페이서를 포함한다. RNA는 RNA 또는 DNA 수준에서 외인성 유전적 요소를 침묵화시키기 위해 다른 Cas 단백질을 유도한다. 문헌[Horvath et al. (2010) Science 327: 167-170; Makarova et al. (2006) Biology Direct 1: 7]. 스페이서는 siRNA와 유사하게 RNA 분자의 주형으로 작용한다. 문헌[Pennisi (2013) Science 341: 833-836]. 따라서 CRISPR/Cas 시스템은 TCR 및/또는 HLA 유전자를 편집하거나 (염기 쌍의 첨가 또는 결실), 조기 종결을 도입함으로써, TCR 및/또는 HLA의 발현을 감소시키는데 사용될 수 있다. CRISPR/Cas 시스템을 대안적으로 사용하여, RNA 간섭과 같이 가역적인 방식으로 HLA 유전자를 끌 수 있다. 포유류 세포에서, 예를 들어, RNA는 Cas 단백질을 TCR 및/또는 HLA 프로모터로 유도하여 RNA 중합효소를 입체적으로 차단할 수 있다.
당 업계에 공지된 기술, 예를 들어 US20140068797 및 문헌[Cong (2013) Science 339:819-823]에 기재된 기술을 사용하여 TCR 및/또는 HLA를 억제하는 인공 CRISPR/Cas 시스템을 생성할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Tsai (2014) Nature Biotechnol., 32:6 569-576], 제 US8,871,445호; 제 8,865,406호; 제 8,795,965호; 제 8,771,945호; 및 제 8,697,359호]에 기재되고, TCR 및/또는 HLA를 억제하는, 다른 인공 CRISPR/Cas 시스템을 또한 생성할 수 있다.
"TALEN" 또는 "TCR 및/또는 HLA에 대한 TALEN" 또는 "TCR 및/또는 HLA를 억제하는 TALEN"은 TCR 및/또는 HLA를 편집하는데 사용될 수 있는 인공 뉴클레아제인 전사 활성화제 유사 효과기 뉴클레아제를 지칭한다. TALEN은 TAL 효과기 DNA 결합 도메인과 DNA 절단 도메인의 융합에 의해 인공적으로 생성된다. 전사 활성화제-유사 효과기 (TALE)는 TCR 및/또는 HLA 유전자의 일부를 포함하는 임의의 적절한 DNA 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. 조작된 TALE을 DNA 절단 도메인과 조합함으로써, TCR 및/또는 HLA 서열을 포함하는 임의의 적절한 DNA 서열에 특이적인 제한 효소를 생성할 수 있다. 그 후 이를 세포내로 도입하여, 게놈 편집에 사용할 수 있다. 문헌[Boch (2011) Nature Biotech. 29: 135-6; 및 Boch et al. (2009) Science 326: 1509-12; Moscou et al. (2009) Science 326: 3501].
TALE은 크산토모나스 박테리아 (Xanthomonas bacteria)에 의해 분비되는 단백질이다. DNA 결합 도메인은 12번째 및 13번째 아미노산을 제외하고, 반복되는 고도로 보존된 33 내지 34개의 아미노산 서열을 포함한다. 이들 2개의 위치는 매우 가변적이며, 특정 뉴클레오타이드 인식과 강한 상관관계를 나타낸다. 따라서 이는 적절한 DNA 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. TALEN을 생성하기 위해, TALE 단백질을 야생형 또는 돌연변이된 Fokl 엔도뉴클레아제인 뉴클레아제 (N)에 융합한다. TALEN에 사용하기 위해 Fokl에 대해 수 개의 돌연변이를 유발하였다; 이는 예를 들어 절단 특이성 또는 활성을 개선시킨다. 문헌[Cermak et al. (2011) Nucl. Acids Res. 39: e82; Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8; Hockemeyer et al. (2011) Nature Biotech. 29: 731-734; Wood et al. (2011) Science 333: 307; Doyon et al. (2010) Nature Methods 8: 74-79; Szczepek et al. (2007) Nature Biotech. 25: 786-793; 및 Guo et al. (2010) /. Mol. Biol. 200: 96]. Fokl 도메인은 2량체로서 기능하며, 여기에는 적절한 배향 및 간격을 갖는 표적 게놈의 부위에 대해 고유한 DNA 결합 도메인을 갖는 2개의 작제물이 필요하다. TALE DNA 결합 도메인과 Fokl 절단 도메인 사이의 아미노산 잔기의 수 및 2개의 개별 TALEN 결합 부위 사이의 염기의 수는 둘 모두 높은 수준의 활성을 달성하기 위한 중요한 매개변수인 것으로 보인다. 문헌[Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8]. TCR 및/또는 HLA TALEN을 세포 내부에서 사용하여 이중 가닥 파손 (DSB)를 생성할 수 있다. 수선 메커니즘이 비 동종 말단 결합을 통해 파손을 부적절하게 수선하는 경우, 돌연변이가 파손 부위에 도입될 수 있다. 예를 들어, 부적절한 수선은 프레임 시프트 돌연변이를 도입할 수 있다. 대안적으로, 외래 DNA는 TALEN과 함께 세포 내로 도입될 수 있으며; 외래 DNA의 서열 및 염색체 서열에 따라, 이 과정은 TCR 및/또는 HLA 유전자의 결함을 교정하거나, 이러한 결함을 wt TCR 및/또는 HLA 유전자에 도입하여 TCR 및/또는 HLA의 발현을 감소시키는데 사용될 수 있다. TCR 및/또는 HLA 내의 서열에 특이적인 TALEN은 모듈식 성분을 사용하는 다양한 방식을 포함하여 당 업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 작제될 수 있다. 문헌[Zhang et al. (2011) Nature Biotech. 29: 149-53; Geibler et al. (2011) PLoS ONE 6: el9509].
"ZFN" 또는 "아연 핑거 뉴클레아제" 또는 "TCR 및/또는 HLA에 대한 ZFN" 또는 "TCR 및/또는 HLA를 억제하는 ZFN"은 TCR 및/또는 HLA 유전자를 편집하는데 사용될 수 있는 인공 뉴클레아제인 아연 핑거 뉴클레아제를 지칭한다. TALEN과 같이, ZFN은 DNA-결합 도메인에 융합된 Fokl 뉴클레아제 도메인 (또는 그의 유도체)을 포함한다. ZFN의 경우, DNA-결합 도메인은 하나 이상의 아연 핑거를 포함한다. 문헌[Carroll et al. (2011) Genetics Society of America 188: 773-782; 및 Kim et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1156-1160]. 아연 핑거는 하나 이상의 아연 이온에 의해 안정화된 소형 단백질 구조 모티프이다. 아연 핑거는 예를 들어 Cys2His2를 포함할 수 있고, 대략 3 bp 서열을 인식할 수 있다. 공지된 특이성의 다양한 아연 핑거를 조합하여 약 6, 9, 12, 15 또는 18 bp 서열을 인식하는 다중 핑거 폴리펩타이드를 생성할 수 있다. 파지 디스플레이, 효모 1-혼성체 시스템, 박테리아 1-혼성체 및 2-혼성체 시스템 및 포유류 세포를 포함하여, 특정 서열을 인식하는 아연 핑거 (및 그의 조합)를 생성하기 위해 다양한 선택 및 모듈식 조립 기술을 이용할 수 있다.
TALEN과 같이, ZFN은 2량체화되어 DNA를 절단해야 한다. 따라서, 한 쌍의 ZFN이 비-회문 DNA 부위를 표적화하기 위해 필요하다. 2개의 개별 ZFN은 그의 뉴클레아제가 적절히 이격되어 있는 DNA의 반대 가닥에 결합해야 한다. 문헌[Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10570-5]. 또한, TALEN과 같이, ZFN은 DNA에서 이중 가닥 파손을 생성할 수 있으며, 이는 부적절하게 수선되는 경우, 프레임-시프트 돌연변이를 생성하여, 세포에서 TCR 및/또는 HLA의 발현 및 양을 감소시킬 수 있다. ZFN을 또한 상동성 재조합과 함께 사용하여 TCR 및/또는 HLA 유전자에 돌연변이를 유발시킬 수 있다. TCR 및/또는 HLA 내의 서열에 특이적인 ZFN은 당 업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 작제될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Provasi (2011) Nature Med. 18: 807-815; Torikai (2013) Blood 122: 1341-1349; Cathomen et al. (2008) Mol. Ther. 16: 1200-7; Quo et al. (2010) /. Mol. Biol. 400: 96]; 제 US2011/0158957호; 및 제 US2012/0060230호를 참조한다.
"메가뉴클레아제" 또는 "TCR 및/또는 HLA에 대한 메가뉴클레아제" 또는 "TCR 및/또는 HLA를 억제하는 메가뉴클레아제"는 큰 (14개 초과의 염기쌍) 인식 부위를 갖는 단량체성 엔도뉴클레아제를 지칭하며, 이는 TCR 및/또는 HLA 유전자를 편집하는데 사용될 수 있다. 메가뉴클레아제 (mn)는 박테리아 회귀 엔도뉴클레아제로부터 유래되고, 고유한 표적 부위에 대해 조작된 본래의 뉴클레아제 활성을 갖는 단량체 단백질이다. 회귀 엔도뉴클레아제는 숙주 게놈에서 개별 유전자좌의 이중 가닥 파손을 생성하여 부위-특이적 유전자 전환 사건을 유도할 수 있는 DNA-절단 효소이다. (문헌[Stoddard, Structure. 2011 Jan 12;19(1):7-15]). 소형 크기에도 불구하고, 회귀 엔도뉴클레아제는 긴 DNA 서열 (일반적으로 20 내지 30개의 염기쌍)을 인식한다. 회귀 엔도뉴클레아제는 매우 광범위하며, 파지 및 바이러스뿐만 아니라, 미생물에도 존재한다. LAGLIDADG 및 His-Cys 박스 효소 (이들 효소 중 가장 서열 특이적임)는 DNA 표적 부위의 주요 홈에 결합하는 역 병렬 β-시트에 따라 달라진다 (문헌[Flick et al., 1998; Jurica et al., 1998]). 상기 문헌의 경우, 일련의 서열-특이적 및 비특이적 접촉이 확립되어 있으며, 이는 다중 연속 염기쌍에 불균일하게 분포한다 (문헌[Chevalier et al., 2003; Scalley-Kim et al., 2007]).
LAGLIDADG 회귀 엔도뉴클레아제 (LHE) 패밀리는 유전자 표적화 용도에 사용되는 조작된 효소의 주요 공급원이다. LHE 패밀리는 주로 고세균 내 및 조류 및 진균의 엽록체 및 미토콘드리아 게놈에서 인코딩된다 (문헌[Chevalier et al., 2005; Dalgaard et al., 1997; Sethuraman et al., 2009]). 단백질 사슬당 단일 보존 LAGLIDADG 모티프 (SEQ ID NO: 85)를 갖는 메가뉴클레아제는 회문 및 회문 근사 DNA 표적 서열을 절단하는 동종이량체 단백질을 형성하며, 단백질 사슬당 2개의 이러한 모티프를 포함하는 것은 완전히 비대칭적인 DNA 서열을 표적화할 수 있는 더 큰 유사-대칭 단량체를 형성한다.
메가뉴클레아제는 TCR 및/또는 HLA를 표적화하도록 조작될 수 있고, 따라서 DNA 내의 이중 가닥 파손을 생성하고, 이는 잘못 수선되는 경우 프레임-시프트 돌연변이를 생성하여 세포 내의 TCR 및/또는 HLA의 발현 및 양을 감소시킬 수 있다.
"메가TAL" 또는 "TCR 및/또는 HLA에 대한 메가TAL" 또는 "TCR 및/또는 HLA를 억제하는 메가TAL"은 TCR 및/또는 HLA 유전자를 편집하는데 사용될 수 있는 인공 뉴클레아제를 지칭한다. 메가TAL은 LAGLIDADG 회귀 엔도뉴클레아제 패밀리로부터 유래된 메가뉴클레아제의 N-말단에 최소 TAL (전사 활성화제-유사) 효과기 도메인의 융합을 통해 획득되는 혼성체 단량체 뉴클레아제이다 (문헌[Nucleic Acids Res. 2014 Feb;42(4):2591-601; Takeuchi et al, Methods Mol Biol. 2015;1239:105-32. doi: 10.1007/978-1-4939-1862-1_6]). 따라서 메가TAL은 TAL 효과기 DNA 결합 도메인에 의해 제공되는 추가적인 친화도 및 특이성을 갖는 부위-특이적 메가뉴클레아제 절단 헤드 (head)로 구성된다. 메가TAL은 TCR 및/또는 HLA를 표적화하도록 조작될 수 있고, 따라서 DNA에서 이중 가닥 파괴를 생성하고, 이는 잘못 수선되는 경우 프레임 시프트 돌연변이를 생성하여 세포에서 HLA의 발현 및 양을 감소시킬 수 있다. I-OnuI 메가뉴클레아제 (mn)의 변이체를 사용하여 T-세포 수용체 알파 (TCRα) 유전자를 녹아웃시키기 위한 TCRα-메가TAL을 설계하였다. TCRα mn 결합 부위 상류의 DNA 서열에 결합하도록 설계된 10.5 반복 TALE 어레이에 TCRα mn을 융합시켰다. TCRα를 표적화하는 메가TAL은 인간 1차 T-세포에서 검출 가능한 표적외 절단없이 매우 높은 유전자 파괴를 달성하는 것으로 밝혀졌다 (문헌[Boissel et al, Nucleic Acids Res. 2014 Feb;42(4):2591-601]).
임의의 특정 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 일부 실시형태에서, 치료 T 세포는 T 세포의 짧은 텔로미어로 인해 환자에서 단기 지속성을 가지며; 따라서, 텔로머라 제 유전자에 의한 형질감염은 T 세포의 텔로미어를 연장시키고, 환자에서 T 세포의 지속성을 개선시킬 수 있다. 문헌[Carl June, "Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic", Journal of Clinical Investigation, 117: 1466-1476 (2007)]을 참조한다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 발명의 유전자 변형된 면역 세포는 텔로머라제 하위단위, 예를 들어 텔로머라제의 촉매 하위단위, 예를 들어 TERT, 예를 들어 hTERT를 이소성으로 발현한다. 일부 양상에서, 본 개시내용은 CAR-발현 면역 세포의 제조 방법으로서, 텔로머라제 하위단위, 예를 들어 텔로머라제의 촉매 하위단위, 예를 들어 TERT, 예를 들어, hTERT를 인코딩하는 핵산과 면역 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. CAR을 인코딩하는 작제물과의 접촉 전, 그와 동시 또는 그 후에 세포를 핵산과 접촉시킬 수 있다.
VII. 치료 용도
본 발명은 상기 면역 세포를 특이적 면역 또는 염증 반응 부위로 동원하고, 면역 세포를 활성화시켜 이 부위에서 면역 효과기 세포의 면역학적 활성을 억제하는 수단으로서 HLA-A2 항원을 표적화하는 CAR을 발현하도록 변형된 면역 세포를 제공한다. 면역 세포의 CAR-매개 동원 및 활성화는 이러한 면역억제 활성이 유리한 다수의 면역학적 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
일 실시형태에서, 면역 세포는 조절 면역 세포이다. 면역 세포는 세포 요법에 사용하기에 적합한 임의의 조절 면역 세포일 수 있다 (예를 들어, 문헌[Wood, K.J. et al., 2012; Papp, G. et al., 2017] 참조). 일 실시형태에서, 조절 면역 세포는 조절 T 세포, CD4+ 조절 T 세포, CD8+ 조절 T 세포, 조절 γδ T 세포, 조절 DN T 세포, 조절 B 세포, 조절 NK 세포, 조절 대식세포, 조절 수지상 세포, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 인간 면역 세포이다. 또 다른 실시형태에서, 조절 면역 세포는 인간 조절 면역 세포이다. 일 실시형태에서, 인간 조절 면역 세포는 조절 T 세포, CD4+ 조절 T 세포, CD8+ 조절 T 세포, 조절 γδ T 세포, 조절 DN T 세포, 조절 B 세포, 조절 NK 세포, 조절 대식세포, 조절 수지상 세포, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 면역 세포는 조절 T 세포일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 조절 T 세포는 인간 조절 T 세포일 수 있다. 조절 T 세포의 활성화는 항원-의존적이지만, 이들 세포의 억제 작용은 항원-, TCR- 및 MHC-비의존적이다. 따라서, 조절 T 세포에서 CAR의 발현은 이러한 세포 및 그의 활성화를 적절한 표적 조직으로 방향을 전환시켜 이들이 항원-특이적 방식으로 활성화되도록 하나; 그의 억제 효과는 질병 관련 항원의 추가 인식의 부재 하에 발생한다. 따라서, 면역 효과기 세포가 위치하고, 부적절한 효과를 매개하는 정확한 부근에 조절 T 세포가 존재하는 한, 방향 전환된 조절 T 세포는 그 위치에서 촉발되거나, 활성화되어 그 억제 효과를 제공할 수 있다.
일 실시형태에서, 표적 HLA-A2 항원은 면역 효과기 세포에 의해 매개되는 부적절한 면역 또는 염증 반응의 부위 또는 표적 조직에 존재하거나, 발현될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR-변형된 면역 세포는 장기 또는 조직 이식과 관련된 하나 이상의 질병, 장애, 증상 또는 병태 (예를 들어, 장기 또는 조직 거부/기능 장애, GVHD 및/또는 이와 관련된 병태)의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 이식 거부는 면역 반응을 통해 수용체의 면역 세포에 의한 공여체 이식 조직의 파괴를 포함한다. 면역 반응은 또한 GVHD에 관여하나; 이 경우, 이식 조직을 통해 수용체에게 전달되는 공여체의 면역 세포에 의해 수용체의 조직이 파괴된다. 따라서, 면역 세포의 CAR-매개된 방향 전환 및 활성화는 이식 수용체에서 면역 효과기 세포에 의한 미스매칭 세포 및/또는 조직의 거부를 억제하거나, GVHD의 경우에 이식된 면역 적격 세포의 병원성 작용을 억제하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 미스매칭 세포 및/또는 조직은 HLA-A2 미스매칭 세포 및/또는 조직을 포함한다.
따라서 본 발명의 다른 실시형태는 대상체에서 장기 또는 조직 이식과 관련된 하나 이상의 질병, 장애, 증상 또는 병태 (예를 들어, 장기 또는 조직 거부/기능 장애, GVHD 및/또는 이와 관련된 병태)를 치료하는 방법이며, 상기 방법은 대상체에게 본 명세서에 기재된 CAR-조작 면역 세포 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 방법은 세포 요법 방법이다. 일 실시형태에서, 세포 요법은자가 유래이다. 일 실시형태에서, 세포 요법은 이종성이다. 일 실시형태에서, 세포 요법은 동종이계이다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 유전자 요법 방법이다.
따라서, 본 발명의 다른 실시형태는 대상체에서 장기 또는 조직 이식과 관련된 하나 이상의 질병, 장애, 증상 또는 병태 (예를 들어, 장기 또는 조직 거부/기능 장애, GVHD 및/또는 이와 관련된 병태)를 치료하는데 사용하기 위해 본 명세서에 기재된 CAR-조작 면역 세포 또는 조성물이다.
본 발명의 CAR-변형된 면역 세포는 대상체에서 면역 내성, 작용 내성 및/또는 면역 조절을 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 CAR-변형된 면역 세포는 장기 또는 조직 이식 후 대상체에서 면역 내성, 작용 내성 및/또는 면역 조절을 촉진하는데 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 대상체에서 면역 내성, 작용 내성 및/또는 면역 조절을 촉진하는 방법이 제공되며, 본 방법은 본 명세서의 임의의 부분에 기재된 바와 같은 CAR-변형된 면역 세포를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 대상체에서 면역 내성, 작용 내성 및/또는 면역 조절을 촉진하는 방법이 제공되며, 본 방법은 본 명세서의 임의의 부분에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 용도는 대상체에서 이식된 장기 또는 조직에 대한 면역 내성, 작용 내성 및/또는 면역 조절을 촉진하기 위한 것일 수 있다. 일 실시형태에서, CAR-변형된 면역 세포는 장기 또는 조직의 이식과 동시에, 그 전에 또는 그 후에 투여된다. 일 실시형태에서, CAR-변형된 면역 세포는 장기 또는 조직의 이식과 동시에 투여된다. 또 다른 실시형태에서, CAR-변형된 면역 세포는 장기 또는 조직의 이식 전에 투여된다. 일 실시형태에서, CAR-변형된 면역 세포는 장기 또는 조직의 이식 후에 투여된다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 조절 면역 세포이다. 일 실시형태에서, 조절 면역 세포는 조절 T 세포, CD4+ 조절 T 세포, CD8+ 조절 T 세포, 조절 γδ T 세포, 조절 DN T 세포, 조절 B 세포, 조절 NK 세포, 조절 대식세포, 조절 수지상 세포, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 조절 T 세포이다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 CD4+ 조절 T 세포이다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 인간 면역 세포이다. 또 다른 실시형태에서, 조절 면역 세포는 인간 조절 면역 세포이다. 일 실시형태에서, 인간 조절 면역 세포는 조절 T 세포, CD4+ 조절 T 세포, CD8+ 조절 T 세포, 조절 γδ T 세포, 조절 DN T 세포, 조절 B 세포, 조절 NK 세포, 조절 대식세포, 조절 수지상 세포, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 면역 세포는 인간 조절 T 세포이다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 인간 CD4+ 조절 T 세포이다.
본 발명의 CAR-변형된 면역 세포는 이식된 장기 또는 조직의 거부를 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 CAR-변형된 면역 (예를 들어, CAR-조작 Treg 세포) 세포는 이식된 장기 또는 조직의 과급성 거부를 예방 또는 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 CAR-변형된 면역 세포 (예를 들어, CAR-조작 Treg 세포)는 이식된 장기 또는 조직의 항체-매개 거부를 예방 또는 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 본 발명의 CAR-변형된 면역 세포 (예를 들어, CAR-조작 Treg 세포)를 이식된 장기 또는 조직에 노출된 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 이식된 장기 또는 조직은 골수 이식, 장기 이식, 수혈 또는 의도적으로 대상체에 도입된 임의의 다른 외부 조직 또는 세포를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 CAR-변형된 면역 세포 (예를 들어, CAR-조작 Treg 세포)는 이식 후 이식 거부를 억제하는 요법으로서 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 이식 거부는 동종이식 거부일 수 있다. 일 실시형태에서, 이식 거부는 이종이식 거부일 수 있다. 일 실시형태에서, 대상체에서 장기 또는 조직 이식 거부를 예방 또는 치료하는 방법이 제공되며, 본 방법은 본 명세서의 임의의 부분에 기재된 바와 같은 CAR-변형된 면역 세포를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 대상체에서 장기 또는 조직 이식 거부를 예방 또는 치료하는 방법이 제공되며, 본 방법은 본 명세서의 임의의 부분에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 따라서, 본 발명의 다른 실시형태는 대상체에서 장기 또는 조직 이식 거부를 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한 본 발명의 CAR-조작 면역 세포 (예를 들어, CAR-조작 Treg 세포), 또는 상기 면역 세포를 포함하는 약제학적 조성물이다. 일 실시형태에서, 본 발명은 대상체에서 이식 생존 기간을 증가시키는 방법을 제공하며, 본 방법은 본 명세서의 임의의 부분에 기재된 바와 같은 CAR-변형된 면역 세포 (예를 들어, CAR-조작 Treg 세포)를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명은 대상체에서 이식 생존 기간을 증가시키는 방법을 제공하며, 본 방법은 본 명세서의 임의의 부분에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년, 20년, 30년, 40년, 50년, 60년, 70년, 80년, 90년, 100년, 또는 대상체의 일생 동안의 이식 생존 기간을 제공한다. 일 실시형태에서, 대상체에서 임의의 면역억제제 요법이 진행되지 않고 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 면역 세포 또는 조성물의 투여는 대상체에 제공되는 면역억제제 요법의 양을 감소시킨다. 일 실시형태에서, 이식은 동종이식일 수 있다. 일 실시형태에서, 이식은 수용체에의 이식과 동시에, 그 전에 또는 그 후에 본 발명의 CAR-변형된 면역 세포에 노출될 수 있다. 일 실시형태에서, 장기 또는 조직 이식은 심장, 심장 판막, 폐, 신장, 간, 췌장, 장, 피부, 혈관, 골수, 줄기세포, 뼈 또는 췌도 세포일 수 있다. 그러나, 본 발명은 특정 유형의 이식으로 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, 공여체 이식은 수용체에 대한 이식의 면역원성을 감소시키기 위해 본 발명의 CAR-변형된 면역 세포를 수용체에 이식하기 전에 장기 또는 조직 이식을 치료함으로써, 이식 거부를 감소시키거나 예방할 수 있음으로써, "사전 컨디셔닝"되거나, "전처리"될 수 있다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68 중 하나 또는 2개로부터 선택되는 하나 또는 2개의 상이한 HLA-A 하위유형에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68 중 하나로부터 선택되는 하나의 HLA-A 하위유형에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68 중 하나 또는 2개로부터 선택되는 2개의 상이한 HLA-A 하위유형에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68 중 하나로부터 선택되는 2개의 상이한 HLA-A 하위유형에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68 중 2개로부터 선택되는 2개의 상이한 HLA-A 하위유형에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30 중 하나 또는 2개로부터 선택되는 하나 또는 2개의 상이한 HLA-A 하위유형에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30 중 하나로부터 선택되는 하나의 HLA-A 하위유형에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30 중 하나 또는 2개로부터 선택되는 2개의 상이한 HLA-A 하위유형에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30 중 하나로부터 선택되는 2개의 상이한 HLA-A 하위유형에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30 중 2개로부터 선택되는 2개의 상이한 HLA-A 하위유형에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*03의 HLA-A 하위유형에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*25의 HLA-A 하위유형에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*29의 HLA-A 하위유형에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*30의 HLA-A 하위유형에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*31의 HLA-A 하위유형에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*33의 HLA-A 하위유형에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*36의 HLA-A 하위유형에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*68의 HLA-A 하위유형에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-A*36:01, 및 HLA-A*68:01 중 하나 또는 2개에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-A*36:01, 및 HLA-A*68:01 중 하나에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-A*36:01, 및 HLA-A*68:01 중 2개에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, 및 HLA-A*30:01 중 하나 또는 2개에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, 및 HLA-A*30:01 중 하나에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, 2개의 HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, 및 HLA-A*30:01에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*25:01에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*29:02에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*30:01에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*03:01에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*31:01에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*33:01에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*36:01에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*68:01에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식은 HLA-A2 양성이다.
일 실시형태에서, 면역 세포는 조절 면역 세포이다. 일 실시형태에서, 조절 면역 세포는 조절 T 세포, CD4+ 조절 T 세포, CD8+ 조절 T 세포, 조절 γδ T 세포, 조절 DN T 세포, 조절 B 세포, 조절 NK 세포, 조절 대식세포, 조절 수지상 세포, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 조절 T 세포이다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 CD4+ 조절 T 세포이다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 인간 면역 세포이다. 또 다른 실시형태에서, 조절 면역 세포는 인간 조절 면역 세포이다. 일 실시형태에서, 인간 조절 면역 세포는 조절 T 세포, CD4+ 조절 T 세포, CD8+ 조절 T 세포, 조절 γδ T 세포, 조절 DN T 세포, 조절 B 세포, 조절 NK 세포, 조절 대식세포, 조절 수지상 세포, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 면역 세포는 인간 조절 T 세포이다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 인간 CD4+ 조절 T 세포이다.
본 발명의 CAR-변형된 면역 세포 (예를 들어, CAR-조작 Treg 세포)는 이식편대숙주병 (GVHD)을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 본 발명의 CAR-변형된 면역 세포 (예를 들어, CAR-조작 Treg 세포)를 이식된 장기 또는 조직에 노출된 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 이식된 장기 또는 조직은 골수 이식, 장기 이식, 수혈, 또는 대상체에 의도적으로 도입된 임의의 다른 외부 조직 또는 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, GVHD는 심장, 심장 판막, 폐, 신장, 간, 췌장, 내장, 피부, 혈관, 골수, 줄기세포, 뼈 또는 췌도 세포 이식 후에 발생할 수 있다. 그러나, 본 발명은 특정 유형의 이식으로 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, GVHD는 조혈 줄기세포 이식 후 발생할 수 있다. 일 실시형태에서, 대상체에서 이식편대숙주병 (GVHD)을 예방 또는 치료하는 방법이 제공되며, 본 방법은 본 명세서의 임의의 부분에 기재된 바와 같은 CAR-변형된 면역 세포를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 대상체에서 이식편대숙주병 (GVHD)을 예방 또는 치료하는 방법이 제공되며, 본 방법은 본 명세서의 임의의 부분에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명은 수용체에의 이식의 이식과 동시에, 그 전에 또는 그 후에 공여체 이식, 예를 들어 생체적합성 격자 또는 공여체 조직, 장기 또는 세포를 본 발명의 CAR-변형된 면역 세포와 접촉시키는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 CAR-변형된 면역 세포를 사용하여, 수용체에 대한 공여체 이식에 의한 부작용을 개선, 억제 또는 감소시킴으로써, GVHD를 예방 또는 치료할 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명은 대상체에서 GVHD의 발병을 예방 또는 지연시키는 방법을 제공하며, 본 방법은 본 명세서의 임의의 부분에 기재된 바와 같은 CAR-변형된 면역 세포를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명은 대상체에서 GVHD의 발병을 예방 또는 지연시키는 방법을 제공하며, 본 방법은 본 명세서의 임의의 부분에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, GVHD의 발병은 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년, 20년, 30년, 40년, 50년, 60년, 70년, 80년, 90년, 100년, 또는 또는 대상체의 일생 동안 지연된다. 일 실시형태에서, 대상체에서 임의의 면역억제제 요법이 진행되지 않고 있다. 일 실시형태에서, 대상체에서 면역억제 요법이 진행되고 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 면역 세포는 상기 면역억제 요법의 치료적 유효량을 감소시키기 위해 대상체에 투여된다. 일 실시형태에서, GVHD는 급성 GVHD 또는 만성 GVHD일 수 있다. 일 실시형태에서, 공여체 이식은 수용체에 대한 이식의 면역원성을 감소시켜, GVHD를 감소 또는 예방하기 위해, 본 발명의 CAR-변형된 면역 세포 (예를 들어, CAR-조작 Treg 세포)를 수용체에 이식하기 전에 이식을 처리하여, "전컨디셔닝"되거나, "전처리"될 수 있다. 일 실시형태에서, 이식은 이식과 관련될 수 있는 T 세포를 활성화시키기 위해 이식 전에 수용체로부터의 세포 또는 조직과 접촉될 수 있다. 수용체의 세포 또는 조직으로 이식을 처리한 후, 세포 또는 조직을 이식으로부터 제거할 수 있다. 이어서, 수용체로부터의 세포 또는 조직의 처리에 의해 활성화된 면역 효과기 세포의 활성을 감소, 억제 또는 제거하기 위해, 처리된 이식을 본 발명의 CAR-변형된 면역 세포 (예를 들어, CAR-조작 Treg 세포)와 추가로 접촉시킬 수 있다. 본 발명의 CAR-변형된 면역 세포로 이식을 처리한 후, CAR-변형된 면역 세포를 수용체에 이식하기 전에 이식으로부터 제거할 수 있다. 그러나, 일부 CAR-변형된 면역 세포는 이식에 부착될 수 있고, 따라서 이식과 함께 수용체에 도입될 수 있다. 이 상황에서, 수용체에게 도입되는 CAR-변형된 면역 세포는 이식과 관련된 세포에 의해 야기되는 수용체에 대한 면역 반응을 억제할 수 있다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68 중 하나 또는 2개로부터 선택되는 하나 또는 2개의 상이한 HLA-A 하위유형에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68 중 하나로부터 선택되는 하나의 HLA-A 하위유형에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68 중 하나 또는 2개로부터 선택되는 2개의 상이한 HLA-A 하위유형에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68 중 하나로부터 선택되는 2개의 상이한 HLA-A 하위유형에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*03, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30, HLA-A*31, HLA-A*33, HLA-A*36, HLA-A*68 중 2개로부터 선택되는 2개의 상이한 HLA-A 하위유형에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30 중 하나 또는 2개로부터 선택되는 하나 또는 2개의 상이한 HLA-A 하위유형에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30 중 하나로부터 선택되는 하나의 HLA-A 하위유형에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30 중 하나 또는 2개로부터 선택되는 2개의 상이한 HLA-A 하위유형에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30 중 하나로부터 선택되는 2개의 상이한 HLA-A 하위유형에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30 중 2개로부터 선택되는 2개의 상이한 HLA-A 하위유형에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*03의 HLA-A 하위유형에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*25의 HLA-A 하위유형에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*29의 HLA-A 하위유형에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*30의 HLA-A 하위유형에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*31의 HLA-A 하위유형에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*33의 HLA-A 하위유형에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*36의 HLA-A 하위유형에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*68의 HLA-A 하위유형에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-A*36:01, 및 HLA-A*68:01 중 하나 또는 2개에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-A*36:01, 및 HLA-A*68:01 중 하나에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*03:01, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, HLA-A*30:01, HLA-A*31:01, HLA-A*33:01, HLA-A*36:01, 및 HLA-A*68:01 중 2개에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, 및 HLA-A*30:01 중 하나 또는 2개에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, 및 HLA-A*30:01 중 하나에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*25:01, HLA-A*29:02, 및 HLA-A*30:01 중 2개에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*25:01에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*29:02에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*30:01에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*03:01에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*31:01에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*33:01에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*36:01에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식 숙주 또는 수용체는 HLA-A2 음성이고, HLA-A*68:01에 대해 양성이다. 일 실시형태에서, 이식은 HLA-A2 양성이다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 조절 면역 세포이다. 일 실시형태에서, 조절 면역 세포는 조절 T 세포, CD4+ 조절 T 세포, CD8+ 조절 T 세포, 조절 γδ T 세포, 조절 DN T 세포, 조절 B 세포, 조절 NK 세포, 조절 대식세포, 조절 수지상 세포, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 조절 T 세포이다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 CD4+ 조절 T 세포이다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 인간 면역 세포이다. 또 다른 실시형태에서, 조절 면역 세포는 인간 조절 면역 세포이다. 일 실시형태에서, 인간 조절 면역 세포는 조절 T 세포, CD4+ 조절 T 세포, CD8+ 조절 T 세포, 조절 γδ T 세포, 조절 DN T 세포, 조절 B 세포, 조절 NK 세포, 조절 대식세포, 조절 수지상 세포, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 면역 세포는 인간 조절 T 세포이다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 인간 CD4+ 조절 T 세포이다.
일 실시형태에서, 본 발명은 대상체에서 면역 세포 집합을 확장시키는 방법을 제공하고, 면역 세포는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 변형되고, 본 방법은 본 명세서의 임의의 부분에 기재된 바와 같은 면역 세포를 대상체에 투여하는 단계를 포함하고, 투여된 변형된 면역 세포는 대상체에서 자손 면역 세포 집합을 생성한다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 조절 면역 세포이다. 일 실시형태에서, 조절 면역 세포는 조절 T 세포, CD4+ 조절 T 세포, CD8+ 조절 T 세포, 조절 γδ T 세포, 조절 DN T 세포, 조절 B 세포, 조절 NK 세포, 조절 대식세포, 조절 수지상 세포, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 조절 T 세포일 수 있다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 CD4+ 조절 T 세포일 수 있다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 인간 면역 세포이다. 또 다른 실시형태에서, 조절 면역 세포는 인간 조절 면역 세포이다. 일 실시형태에서, 인간 조절 면역 세포는 조절 T 세포, CD4+ 조절 T 세포, CD8+ 조절 T 세포, 조절 γδ T 세포, 조절 DN T 세포, 조절 B 세포, 조절 NK 세포, 조절 대식세포, 조절 수지상 세포, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 면역 세포는 인간 조절 T 세포이다. 일 실시형태에서, 면역 세포는 인간 CD4+ 조절 T 세포이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 CAR-변형 Treg 세포는 생체내에서 복제하여 표적화된 세포의 면역 반응의 지속적인 억제 및 면역 내성을 초래할 수 있는 장기 지속성을 초래할 수 있다. 일 실시형태에서, 대상체에서 지속적인 조절 T 세포 집합을 생성하는 방법이 제공되고, 조절 T 세포는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 변형되고, 본 방법은 본 명세서의 임의의 부분에 기재된 바와 같은 조절 T 세포를 대상체에 투여하는 단계를 포함하고, 지속적인 변형된 조절 T 세포 집합은 대상체에서 투여 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 30일, 40일, 50일, 60일, 70일, 80일, 90일, 100일, 200일, 300일, 400일, 500일, 600일, 700일, 800일, 900일, 또는 1000일 동안 지속된다. 일 실시형태에서, CAR-Treg 세포는 표적화된 세포의 면역 반응을 억제하기 위해 생체내에서 자가 재생 및 재활성화될 수 있다. 일 실시형태에서, CAR-Treg 세포는 표적화된 세포의 면역 반응을 억제하기 위해 재활성화될 수 있는 기억 CAR-Treg 세포일 수 있다.
면역 세포는 임의의 공급원으로부터 획득될 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 면역 세포는 본 발명의 CAR-변형된 면역 세포의 생성을 위해 조직 공여체, 이식 수용체 또는 다른 비관련 공급원 (상이한 대상체 또는 종 모두)으로부터 획득될 수 있다. 따라서, 본 발명의 CAR-변형된 면역 세포는 이식 수용체 또는 다른 비관련 공급원에게 자가유래, 동종이계 또는 이종성일 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 CAR-Treg 세포는 이식 수용체에게 자가유래, 동종이계 또는 이종성일 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 CAR-Treg 세포는 이식 수용체에게 자가유래일 수 있다.
일 실시형태에서, 대상체는 포유류일 수 있다. 일 실시형태에서, 대상체는 인간일 수 있다.
일 실시형태에서, 활성화된 T 세포를 대상체에 투여한 다음, 후속하여 혈액을 다시 채혈하고 (또는 성분채집술을 수행함), 본 발명에 따라 T 세포를 활성화시키고, 활성화 및 확장된 T 세포를 대상체에 재 주입하는 것이 바람직할 수 있다. 이 과정은 수 주마다 수회 수행될 수 있다. 특정 실시형태에서, T 세포는 10 cc 내지 400 cc의 혈액 채혈로부터 활성화될 수 있다. 특정 실시형태에서, T 세포는 20 cc, 30 cc, 40 cc, 50 cc, 60 cc, 70 cc, 80 cc, 90 cc, 또는 100 cc의 혈액 채혈로부터 활성화된다. 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 이러한 다회 채혈/다회 재주입 프로토콜을 사용하면 특정 T 세포 집합을 선택하는 데 도움이 될 수 있다.
본 발명의 CAR-변형된 면역 세포는 희석제 및/또는 IL-2 또는 다른 사이토카인 또는 세포 집합과 같은 다른 성분과 조합하여 약제학적 조성물로 또는 단독으로 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서의 임의의 부분에 기재된 바와 같은 복수의 변형된 면역 세포를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적 또는 생리학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 본 명세서의 임의의 부분에 기재된 바와 같은 CAR-변형된 면역 세포 또는 세포 집합을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 완충액, 예컨대 중성 완충 식염수, 인산염 완충 식염수 등; 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨과 같은 탄수화물; 단백질; 폴리펩타이드 또는 아미노산, 예컨대 글리신; 항산화제; 킬레이트제, 예컨대 EDTA 또는 글루타티온; 애주번트 (예를 들어, 수산화알루미늄); 보존제를 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 삽입 또는 이식을 포함하여 임의의 적합한 방식으로 대상체에 투여될 수 있다. 본 명세서의 임의의 부분에 기재된 약제학적 조성물은 비경구 투여에 의해 대상체에 투여될 수 있다. 본 명세서의 임의의 부분에 기재된 약제학적 조성물은 피하, 피내, 종양내, 결절내, 골수내, 근육내, 흉골내, 정맥내 (i.v.) 주사, 주입 기술 또는 복강내로 대상체에 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 CAR-변형된 면역 세포 조성물은 피내 또는 피하 주사에 의해 대상체에 투여될 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 CAR-변형된 면역 세포 조성물은 i.v. 주사에 의해 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, CAR-변형된 면역 세포의 조성물은 림프절, 감염 부위, 염증 부위 또는 조직 또는 장기 배출 부위에 직접 주사될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 예방 또는 치료될 질병에 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 투여량 및 빈도는 대상체의 상태, 및 대상체 질병의 유형 및 중증도와 같은 인자에 의해 결정될 것이나, 적절한 투여량은 임상 시험에 의해 결정될 수 있다.
"유효량" 또는 "치료량"이 지정된 경우, 투여될 본 발명의 조성물의 양은 대상체의 연령, 중량, 항체 역가 및 상태에서의 개인차를 고려하여 결정될 수 있다. 본 명세서의 임의의 부분에 기재된 바와 같은 CAR-변형된 면역 세포를 포함하는 약제학적 조성물은 1 x 104 내지 1 x 109 세포/kg 체중의 투여량으로 투여될 수 있다고 일반적으로 언급될 수 있다. 일 실시형태에서, CAR-변형된 면역 세포는 다음 범위 내의 모든 정수 값을 포함하여 1 x 105 내지 100 x 105 세포/kg 체중의 투여량으로 투여될 수 있다. CAR-변형된 면역 세포 조성물은 또한 이러한 투여량으로 수회 투여될 수 있다. CAR-변형된 면역 세포는 면역요법에 일반적으로 공지된 주입 기술을 사용하여 투여될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Rosenberg et al, 1988] 참조). 특정 대상체에 대한 최적 투여량 및 치료 용법은 대상체의 질병 징후를 모니터링하고, 그에 따라 처리를 조정함으로써 용이하게 결정될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 적어도 하나의 CAR-조작 면역 세포는 다른 활성제와 조합하여 필요한 대상체에 투여된다. 일 실시형태에 따르면, 적어도 하나의 면역 세포 집합은 다른 활성제의 투여 전, 그와 동시에 또는 그 후에 투여된다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR-변형된 면역 세포는 다음에 제한되는 것은 아니나 항바이러스 요법, 화학요법, 방사선, 면역억제제, 항체, 면역제거제, 사이토카인 및 조사와 같은 제제의 처리를 포함하여, 임의의 수의 적절한 치료 방식과 함께 (예를 들어, 이전, 동시에 또는 이후) 대상체에 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 CAR-변형된 면역 세포는 면역억제제와 함께 투여될 수 있다. 당 업계에 공지된 임의의 면역억제제가 사용될 수 있다. 예를 들어, 면역억제제는 칼시뉴린 억제제, 예컨대 사이클로스포린, 타크롤리무스, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 메톡살렌, 라파마이신, 미코페놀레이트 모페틸, 미코페놀산, 미코페놀레이트 나트륨, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 리툭시맙, mTOR 억제제, 시롤리무스, 에베롤리무스, 바실릭시맙, 다클리주맙, 벨라타셉트, 알렘투주맙, 무로모납-CD3, 항-흉선세포 글로불린, 글루코티코스테로이드 또는 부신피질 스테로이드, 예컨대 프레드니손 및 프레드니솔론, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 본 발명의 CAR-변형된 면역 세포는 면역억제제 전, 그 후 또는 그와 함께 대상체에 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 CAR-변형된 면역 세포는 면역억제제가 대상체에 투여된 후에 투여될 수 있거나, 본 발명의 CAR-변형된 면역 세포는 면역억제제가 대상체에 투여되기 전에 투여될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 본 발명의 CAR-변형된 면역 세포는 면역억제제가 대상체에 투여되는 때와 동시에 투여될 수 있다. 본 발명의 CAR-변형된 면역 세포 및/또는 면역억제제는 이식 후 대상체에 투여될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 본 발명의 CAR-변형된 면역 세포 및/또는 면역억제제는 이식 전에 대상체에 투여될 수 있다. 본 발명의 CAR-변형된 면역 세포 및/또는 면역억제제는 이식 수술 동안 대상체에 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, CAR 변형된 면역 세포를 대상체에 투여하는 본 발명의 방법은 면역억제 요법이 개시되면 수행된다. 일부 실시형태에서, 본 방법은, 예를 들어 시간 경과에 따라, 적용 가능한 경우, 상이한 면역억제 요법 용법에서 이식 수용체를 모니터링하기 위해 1회 초과하여 수행된다. 일부 실시형태에서, 이식 수용체가 이식에 대해 내성이 있는 것으로 예측되는 경우, 면역억제 요법이 감소된다. 일부 실시형태에서, 이식 수용체가 이식에 대해 내성이 있는 것으로 예측되는 경우, 면역억제 요법이 처방되지 않으며, 예를 들어 면역억제 요법이 중단된다.
또한 대상체에서 장기 또는 조직 이식 거부의 예방 또는 치료 방법이 제공되며, 본 방법은 (i) 적어도 하나의 면역억제제 및 (ii) 본 발명의 CAR-조작 면역 세포 (예를 들어, CAR-조작 Treg 세포) 또는 상기 면역 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
따라서, 본 발명의 다른 실시형태는 대상체에서 장기 또는 조직 이식 거부를 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한 본 발명의 CAR-조작 면역 세포 (예를 들어, CAR-조작 Treg 세포) 또는 상기 면역 세포를 포함하는 약제학적 조성물 및 적어도 하나의 면역억제제의 조합이다.
또한 대상체에서 이식 생존 기간을 증가시키는 방법이 제공되며, 본 방법은 적어도 하나의 면역억제제 및 본 발명의 CAR-조작 면역 세포 (예를 들어, CAR-조작 Treg 세포) 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR-조작 면역 세포 (예를 들어, CAR-조작 Treg 세포)와 적어도 하나의 면역억제제의 조합은 이식편대숙주병 (GVHD)을 예방 또는 치료하기 위해 사용된다. 일 실시형태에서, GVHD는 조혈 줄기세포 이식 후 발생할 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 실시형태는 대상체에서 이식편대숙주병 (GVHD)을 예방 또는 치료하는 방법으로서, 본 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 면역억제제 및 CAR-조작 면역 세포 (예를 들어, CAR-조작 Treg 세포) 또는 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 수용체에의 이식의 이식과 동시에, 그 전에 도는 그 후에 적어도 하나의 면역억제제 및 본 발명의 CAR-조작 면역 세포 (예를 들어, CAR-조작 Treg 세포)와 공여체 이식, 예를 들어 생체적합성 격자 또는 공여체 조직, 장기 또는 세포를 접촉시키는 방법을 제공한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR-조작 면역 세포 (예를 들어, CAR-조작 Treg 세포)와 적어도 하나의 면역억제제의 조합은 수용체에 대한 공여체 이식에 의한 부작용을 개선, 억제 또는 감소시켜, GVHD를 예방 또는 치료하기 위해 사용될 수 있다
본 발명의 다른 실시형태는 따라서 대상체에서 GVHD의 발병을 예방 또는 지연시키는 방법으로서, 본 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같이, 적어도 하나의 면역억제제 및 CAR-조작 면역 세포 (예를 들어, CAR-조작 Treg 세포) 또는 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR-조작 면역 세포 및 적어도 하나의 면역억제제는 동시에 또는 순차적으로 투여된다.
일 실시형태에서, 본 발명의 CAR-조작 면역 세포, 및 선택적으로 적어도 하나의 다른 활성제, 예를 들어 면역억제제는 이식과 함께 (예를 들어, 그 전, 그와 동시에 또는 그 후에) 투여된다.
이식 장기 또는 조직 거부 진단 후 본 발명의 CAR-변형된 면역 세포를 투여한 다음, 장기 또는 조직 거부 증상이 감소할 때까지 본 발명의 CAR-변형된 면역 세포 및 면역억제제 둘 모두를 투여할 수 있다. 추가의 실시형태에서, 본 발명의 CAR-변형된 면역 세포 조성물을 골수 이식과 함께 (예를 들어, 동시에, 또는 그 후에) 대상체에 투여할 수 있다. 다른 실시형태에서, CD20과 반응하는 제제, 예를 들어 리툭시맙과 같은 B-세포 제거 요법 후에 본 발명의 CAR-변형된 면역 세포를 투여할 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 대상체에 고 투여량 화학요법에 의한 표준 치료 후 말초 혈액 줄기세포 이식이 제공될 수 있다. 특정 실시형태에서, 이식 후, 대상체에 본 발명의 확장된 CAR-변형된 면역 세포의 주입을 제공할 수 있다. 추가의 실시형태에서, 확장된 CAR-변형된 면역 세포를 수술 전 또는 후에 투여할 수 있다.
일 실시형태에서, 대상체 (예를 들어, 인간)에 본 발명의 적어도 하나의 면역 세포 또는 집합의 초기 투여, 및 1회 이상의 후속 투여를 제공하고, 하나 이상의 후속 투여를 이전 투여 후 15일 미만, 예를 들어, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2일째에 투여한다. 일 실시형태에서, 치료적 유효량의 본 발명의 면역 세포가 대상체에 투여되거나, 투여될 것이다. 일 실시형태에서, 대상체에 투여되는 본 발명의 적어도 하나의 면역 세포 집합의 면역 세포의 양은 적어도 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 또는 109 세포이다. 일 실시형태에서, 대상체에 투여되는 본 발명의 면역 세포의 양은 약 102 내지 약 109, 약 103 내지 약 108, 약 104 내지 약 107, 또는 약 105 내지 약 106 세포의 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체에 투여되는 본 발명의 면역 세포의 양은 약 106 내지 약 109, 약 106 내지 107, 약 106 내지 108, 약 107 내지 109, 약 107 내지 108, 약 108 내지 109의 범위이다. 또 다른 실시형태에서 대상체에 투여되는 본 발명의 면역 세포의 양은 약 106, 약 107, 약 108이거나, 약 109이다. 일 실시형태에서, 대상체에 투여되는 본 발명의 적어도 하나의 면역 세포 집합의 면역 세포의 양은 적어도 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 또는 109 세포/kg 신체이다. 일 실시형태에서, 대상체에 투여되는 본 발명의 면역 세포의 양은 다음 범위 내의 모든 정수 값을 포함하여, 약 104 내지 109 세포/kg 체중 또는 105 내지 108 세포/kg 체중의 범위이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 적어도 하나의 면역 세포 또는 집합의 1회 초과의 투여는 대상체 (예를 들어, 인간)에 1주마다 투여되고, 예를 들어, 본 발명의 유전자 변형된 면역 세포 또는 집합의 2, 3, 또는 4회 투여가 1주마다 투여된다.
일부 실시형태에서, 생체내에서 CAR-변형된 면역 세포의 선택적 파괴를 가능하게 하기 위해 자살 유전자를 본 발명의 CAR-변형된 면역 세포에 혼입시키는 것이 바람직할 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 CAR-변형된 면역 세포는 자살 유전자 시스템을 추가로 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 CAR-변형된 면역 세포는 자살 유전자 시스템을 인코딩하는 핵산을 추가로 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 "자살 유전자 요법", "자살 유전자" 및 "자살 유전자 시스템"은 아폽토시스를 통해 세포를 선택적으로 파괴하는 방법을 지칭한다. 이러한 방법은 세포가 아폽토시스에 의해 자살하도록 하는 자살 유전자를 사용한다. 자살 유전자는 그 자체로 또는 다른 화합물의 존재 하에서 세포 사멸을 유발하는 산물을 인코딩한다. 자살 유전자는 세포 요법에 사용하기에 적합한 임의의 자살 유전자 시스템으로부터 유래할 수 있다 (예를 들어, 문헌[Jones et al., 2014; Wang et al., 2017; Zhang et al., 2017; Casucci et al., 2011; Gargett et al., 2014; Khaleghi, 2012; Philip et al., 2014] 참조).
일 실시형태에서, 자살 유전자 시스템은 비 독성 약물 (즉, 자살 유전자 전구약물)이 자살 유전자 변형 세포에서 독성 화합물로 전환되는 유전자 유도 효소 전구약물 요법 (GDEPT)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 자살 유전자 시스템은 전구약물 간시클로비르 (ganciclovir)와 조합하여, 단순 포진 바이러스로부터의 티미딘 키나제 유전자를 사용하는 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 (HSV-TK)/간시클로비르 (GCV) 자살 유전자 시스템일 수 있다. 다른 실시형태에서, 자살 유전자 시스템은 시토신 데아미나제/5-플루오로시토신 자살 유전자 시스템일 수 있다. CAR-변형된 면역 세포가 자살 유전자 시스템을 포함하는 본 명세서에 제공된 방법의 일부 대안에서, 본 방법은 대상체에 자살 유전자 전구약물를 투여하는 단계를 포함한다.
다른 실시형태에서, 자살 유전자 시스템은 카스파제와 같은 아폽토시스 유전자가 아폽토시스를 유도함으로써 세포를 파괴하는 2량체화 유도 메커니즘을 포함할 수 있다. 2량체화 유도 자살 유전자 시스템은 2량체화의 화학적 유도제 (CID)의 투여 후 변형된 면역 세포의 조건부 2량체화 및 아폽토시스를 가능하게 하는 아폽토시스 경로의 성분과 연결된 약물 결합 도메인으로 구성된 키메라 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 자살 유전자 시스템은 카스파제 기반 자살 유전자 시스템일 수 있다. 유도성 카스파제 자살 유전자 시스템의 비 제한적인 예는 유도성 카스파제-9 자살 유전자 시스템 (iCasp9) 및 카스파제-8 자살 유전자 시스템 (iCasp8)을 포함할 수 있으며, 카스파제는 CID, FK506 또는 그의 유사체에 의해 활성화된다. CAR-변형된 면역 세포가 자살 유전자 시스템을 포함하는 본 명세서에 제공된 방법의 일부 대안에서, 본 방법은 대상체에 2량체화의 화학적 유도제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 실시형태에서, 자살 유전자 시스템은 치료 단일클론 항체에 의해 매개될 수 있다. 치료 mAb-매개 자살 유전자 시스템은 세포 표면에, 변형된 면역 세포를 치료 mAb에 감응성이 되도록 하는 단백질의 발현을 수반한다. 특이적 치료 mAb의 투여 후 변형된 면역 세포는 선택적으로 파괴될 수 있다. 치료 mAb-매개 자살 유전자 시스템의 비 제한적 예는 CD20 자살 유전자 시스템 및 RQR8 자살 유전자 시스템을 포함할 수 있으며, 치료 mAb는 항-CD20 mAb이다. 일부 실시형태에서, 항-CD20 mAb는 리툭시맙일 수 있다. CAR-변형된 면역 세포가 자살 유전자 시스템을 포함하는 본 명세서에 제공된 방법의 일부 대안에서, 본 방법은 대상체에 치료 단일클론 항체를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
VIII. 제조 물품 및 키트
다른 실시형태에서, 본 발명은 이식 거부 또는 GVHD의 예방 및/또는 치료에 유용한 물질을 포함하는 제조 물품을 제공한다. 제조 물품은 용기 및 용기 상에 또는 용기에 부착된 표지 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 주사기 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로 형성될 수 있다. 용기는 이식 거부 또는 GVHD와 같은 면역학적 상태를 예방 및/또는 치료하기에 효과적인 조성물을 보유하고, 멸균 접속부를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개가 있는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 조성물 중 적어도 하나의 활성제는 본 발명의 CAR-변형된 면역 세포이다. 일 실시형태에서, CAR-변형된 면역 세포는 CAR-변형된 Treg이다. 일 실시형태에서, CAR-변형된 Treg는 CAR-변형된 인간 Treg이다. 표지 또는 패키지 삽입물은 조성물이 이식 거부 또는 GVHD의 예방 또는 치료에 사용됨을 나타낸다. 제조 물품, 표지 또는 패키지 삽입물은 CAR-변형된 면역 세포 조성물을 환자에 투여하기 위한 지시 물질을 추가로 포함할 수 있다. 추가로, 제조 물품은 약제학적으로 허용 가능한 완충액, 예컨대 주사용 정균수 (BWFI), 인산염 완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하여 상업적 및 사용자 관점에서 적절한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
다양한 목적 (예를 들어, 이식 거부 또는 GVHD 예방 또는 치료)에 유용한 키트가 또한 제공된다. CAR-변형된 면역 세포를 포함하는 키트가 제공될 수 있다. 제조 물품과 마찬가지로, 키트는 용기 및 용기 상에 또는 용기와 부착된 표지 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 용기는 본 발명의 적어도 하나의 CAR-변형된 면역 세포를 포함하는 조성물을 보유한다. 예를 들어, 희석제 및 완충액를 포함하는 추가 용기가 포함될 수 있다. 표지 또는 패키지 삽입물은 조성물에 대한 설명 및 의도된 사용 지침을 제공할 수 있다. 일 실시형태에서, CAR-변형된 면역 세포는 CAR-변형된 Treg이다. 일 실시형태에서, CAR-변형된 Treg는 CAR-변형된 인간 Treg이다.
따라서, 본 발명은 추가로, 제1 부속물에 본 발명의 면역 세포 또는 면역 세포 집합을, 제2 부속물에 제한 없이, 항 바이러스 요법, 화학요법, 방사선, 면역억제제, 항체, 면역제거제, 사이토카인 및 조사를 포함하는 또 다른 활성제를 포함하는 부속물 키트에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 부속물 키트는 제1 부속물에 본 발명의 면역 세포 또는 면역 세포 집합을, 제2 부속물에 하나 이상의 면역억제제를 포함한다. 본 발명의 키트에 존재할 수 있는 면역억제제의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 칼시뉴린 억제제, 예컨대 사이클로스포린, 타크롤리무스, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 메톡살렌, 라파마이신, 미코페놀레이트 모페틸, 미코페놀산, 미코페놀레이트 나트륨, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 리툭시맙, mTOR 억제제, 예컨대 시롤리무스, 에버롤리무스, 바실릭시맙, 다클리주맙, 벨라타셉트, 알렘투주맙, 무로모납-CD3, 항-흉선세포 글로불린, 글루코티코스테로이드, 또는 부신피질 스테로이드, 예컨대 프레드니손 또는 프레드니솔론 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
카밧 코티아
VH CDR1 SYHIQ (SEQ ID NO: 1) GYTFTSY (SEQ ID NO: 2)
VH CDR2 WIYPGDGSTQYNEKFKG (SEQ ID NO: 3) YPGDGS (SEQ ID NO: 4)
VH CDR2 WIYPGDGSTKYSQKFQG (SEQ ID NO: 5) YPGDGS (SEQ ID NO: 4)
VH CDR3 EGTYYAMDY (SEQ ID NO: 6) EGTYYAMDY (SEQ ID NO: 6)
카밧 코티아
VL CDR1 RSSQSIVHSNGNTYLE (SEQ ID NO: 7) RSSQSIVHSNGNTYLE (SEQ ID NO: 7)
VL CDR2 KVSNRFS (SEQ ID NO: 8) KVSNRFS (SEQ ID NO: 8)
VL CDR3 FQGSHVPRT (SEQ ID NO: 9) FQGSHVPRT (SEQ ID NO: 9)
서열명 SEQ ID AA
VH CDR2 (카밧) 10 WIYPGDGSTX10YX12X13KFX16G
VH FR1 (코티아) 11 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS
VH FR1 (카밧) 12 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT
VH FR2 (카밧/카밧가변) 13 WVRQAPGQX9LEWMGX15
VH1/2/5/6 FR2 (카밧/카밧) 14 WVRQAPGQRLEWMG
VH3 FR2 (카밧/카밧) 15 WVRQAPGQGLEWMGI
VH4 FR2 (카밧/카밧) 16 WVRQAPGQGLEWMG
VH FR2 (카밧/코티아 가변) 17 WVRQAPGQX9LEWMGX15WI
VH1/2/5/6 FR2 (카밧/코티아) 18 WVRQAPGQRLEWMGWI
VH3 FR2 (카밧/코티아) 19 WVRQAPGQGLEWMGIWI
VH4 FR2 (카밧/코티아) 20 WVRQAPGQGLEWMGWI
VH FR2 (코티아/코티아 가변) 21 HIQWVRQAPGQX12LEWMGX18WI
VH1/2/5/6 FR2 (코티아/코티아) 22 HIQWVRQAPGQRLEWMGWI
VH3 FR2 (코티아/코티아) 23 HIQWVRQAPGQGLEWMGIWI
VH4 FR2 (코티아/코티아) 24 HIQWVRQAPGQGLEWMGWI
VH FR2 (코티아/카밧 가변) 25 HIQWVRQAPGQX12LEWMGX18
VH1/2/5/6 FR2 (코티아/카밧) 26 HIQWVRQAPGQRLEWMG
VH3 FR2 (코티아/카밧) 27 HIQWVRQAPGQGLEWMGI
VH4 FR2 (코티아/카밧) 28 HIQWVRQAPGQGLEWMG
VH FR3 (카밧 가변) 29 X1VTX4TX6DTSX10STAYMX16LSX19LRSX23DX25AVYYCAR
VH1/6 FR3 (카밧) 30 RVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR
VH2 FR3 (카밧) 31 RVTITADTSASTAYMLLSSLRSEDTAVYYCAR
VH3 FR3 (카밧) 32 VTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR
VH4 FR3 (카밧) 33 RVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR
VH5 FR3 (카밧) 34 RVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDMAVYYCAR
VH FR3 (코티아 가변) 35 TX2YX4X5KFX8GX10VTX13TX15DTSX19STAYMX25LSX28LRSX32DX34AVYYCAR
VH1/2/3/4/5 FR3 (코티아 가변) 36 TQYNEKFKGX10VTX13TX15DTSX19STAYMX25LSX28LRSX32DX34AVYYCAR
VH6 FR3 (코티아 가변) 37 TKYSQKFQGX10VTX13TX15DTSX19STAYMX25LSX28LRSX32DX34AVYYCAR
VH 1 FR3 (코티아) 38 TQYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR
VH 2 FR3 (코티아) 39 TQYNEKFKGRVTITADTSASTAYMLLSSLRSEDTAVYYCAR
VH 3 FR3 (코티아) 40 TQYNEKFKGVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR
VH 4 FR3 (코티아) 41 TQYNEKFKGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR
VH 5 FR3 (코티아) 42 TQYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDMAVYYCAR
VH 6 FR3 (코티아) 43 TKYSQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR
VH FR4 44 WGQGTTVTVSS
VH 45 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQX44LEWMGX50WIYPGDGSTX60YX62X63KFX66GX68VTX71TX73DTSX77STAYMX83LSX86LRSX90DX92AVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSS
VL FR1 46 DX2VMTQX7PLSX11X12VTX15GQPASISX23
VL1/4 47 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISC
VL2 FR1 48 DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISC
VL3 FR1 49 DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISC
VL5 FR1 50 DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISF
VL FR2 51 WX2X3QX5PGQX9PX11X12LIY
VL1 FR2 52 WFQQRPGQSPRRLIY
VL2 FR2 53 WYLQKPGQSPQLLIY
VL3/5 FR2 54 WYQQRPGQPPRLLIY
VL4 FR2 55 WYQQRPGQSPRLLIY
VL FR3 56 GVPDRFSGSGX11GTDFTLKISRVEAEDVGVYYC
VL1/2/4 FR3 57 GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC
VL3/5 FR3 58 GVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC
VL FR4 59 FGGGTKVEIK
VL 60 DX2VMTQX7PLSX11X12VTX15GQPASISX23RSSQSIVHSNGNTYLEWX41X42QX44PGQX48PX50X51LIYKVSNRFSGVPDRFSGSGX72GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
H1 (선도 서열 부재) 61 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSS
H2(선도 서열 부재) 62 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITADTSASTAYMLLSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSS
H3(선도 서열 부재) 63 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWMGIWIYPGDGSTQYNEKFKGVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSS
H4 (선도 서열 부재) 64 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSS
H5 (선도 서열 부재) 65 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDMAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSS
H6 (선도 서열 부재) 66 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGDGSTKYSQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSS
K1 67 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
K2 68 DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
K3 69 DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
K4 70 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
K5 71 DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISFRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
H1_k1_AA (선도 서열 부재) 72 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
H1_k2_AA (선도 서열 부재) 73 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
H1_k3_AA (선도 서열 부재) 74 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
H1_k4_AA (선도 서열 부재) 75 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
H1_k5_AA (선도 서열 부재) 76 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQPASISFRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
H2_k1_AA (선도 서열 부재) 77 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITADTSASTAYMLLSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
H2_k2_AA (선도 서열 부재) 78 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITADTSASTAYMLLSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
H3_k2_AA (선도 서열 부재) 79 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWMGIWIYPGDGSTQYNEKFKGVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
H3_k3_AA (선도 서열 부재) 80 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWMGIWIYPGDGSTQYNEKFKGVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
H3_k4_AA (선도 서열 부재) 81 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWMGIWIYPGDGSTQYNEKFKGVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
H3_k5_AA (선도 서열 부재) 82 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWMGIWIYPGDGSTQYNEKFKGVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQPASISFRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
H4_k2_AA (선도 서열 부재) 83 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
H4_k3_AA (선도 서열 부재) 84 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
H4_k4_AA (선도 서열 부재) 85 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
H4_k5_AA (선도 서열 부재) 86 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQPASISFRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
H5_k2_AA (선도 서열 부재) 87 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDMAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
H5_k3_AA (선도 서열 부재) 88 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDMAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
H5_k4_AA (선도 서열 부재) 89 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDMAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
H5_k5_AA (선도 서열 부재) 90 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDMAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQPASISFRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
H6_k2_AA (선도 서열 부재) 91 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGDGSTKYSQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
H6 92 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQX44LEWMGX50WIYPGDGSTKYSQKFQGX68VTX71TX73DTSX77STAYMX83LSX86LRSX90DX92AVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSS
H1_k1_AA (선도 서열 존재) 93 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRASQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
H1_k2_AA (선도 서열 존재) 94 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRASQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
H1_k3_AA (선도 서열 존재) 95 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRASQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
H1_k4_AA (선도 서열 존재) 96 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRASQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
H1_k5_AA (선도 서열 존재) 97 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRASQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQPASISFRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
H2_k1_AA (선도 서열 존재) 98 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRASQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITADTSASTAYMLLSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
H2_k2_AA (선도 서열 존재) 99 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRASQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITADTSASTAYMLLSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
H3_k2_AA (선도 서열 존재) 100 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRASQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWMGIWIYPGDGSTQYNEKFKGVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
H3_k3_AA (선도 서열 존재) 101 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRASQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWMGIWIYPGDGSTQYNEKFKGVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
H3_k4_AA (선도 서열 존재) 102 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRASQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWMGIWIYPGDGSTQYNEKFKGVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
H3_k5_AA (선도 서열 존재) 103 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRASQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWMGIWIYPGDGSTQYNEKFKGVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQPASISFRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
H4_k2_AA (선도 서열 존재) 104 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRASQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
H4_k3_AA (선도 서열 존재) 105 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRASQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
H4_k4_AA (선도 서열 존재) 106 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRASQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
H4_k5_AA (선도 서열 존재) 107 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRASQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQPASISFRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
H5_k2_AA (선도 서열 존재) 108 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRASQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDMAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
H5_k3_AA (선도 서열 존재) 109 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRASQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDMAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
H5_k4_AA (선도 서열 존재) 110 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRASQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDMAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
H5_k5_AA (선도 서열 존재) 111 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRASQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDMAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQPASISFRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
H6_k2_AA (선도 서열 존재) 112 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRASQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGDGSTKYSQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIK
선도 서열 113 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRAS
링커 114 VDSSGGGGSGGGGSGGGGSTS
CD8 힌지 115 SALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLD
CD28 TM 116 FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
CD28 IC 117 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
CD3z 118 RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
CAR_H1_k1_AA (선도 서열 부재) 119 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIKNRIRGVTVSSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDPFGFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSLERVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
CAR_H1_k2_AA (선도 서열 부재) 120 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIKNRIRGVTVSSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDPFGFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSLERVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
CAR_H1_k3_AA (선도 서열 부재) 121 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIKNRIRGVTVSSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDPFGFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSLERVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
CAR_H1_k4_AA (선도 서열 부재) 122 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIKNRIRGVTVSSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDPFGFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSLERVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
CAR_H1_k5_AA (선도 서열 부재) 123 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQPASISFRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIKNRIRGVTVSSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDPFGFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSLERVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
CAR_H2_k1_AA (선도 서열 부재) 124 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITADTSASTAYMLLSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIKNRIRGVTVSSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDPFGFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSLERVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
CAR_H2_k2_AA (선도 서열 부재) 125 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITADTSASTAYMLLSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIKNRIRGVTVSSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDPFGFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSLERVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
CAR_H3_k2_AA (선도 서열 부재) 126 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWMGIWIYPGDGSTQYNEKFKGVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIKNRIRGVTVSSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDPFGFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSLERVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
CAR_H3_k3_AA (선도 서열 부재) 127 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWMGIWIYPGDGSTQYNEKFKGVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIKNRIRGVTVSSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDPFGFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSLERVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
CAR_H3_k4_AA (선도 서열 부재) 128 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWMGIWIYPGDGSTQYNEKFKGVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIKNRIRGVTVSSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDPFGFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSLERVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
CAR_H3_k5_AA (선도 서열 부재) 129 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWMGIWIYPGDGSTQYNEKFKGVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQPASISFRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIKNRIRGVTVSSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDPFGFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSLERVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
CAR_H4_k2_AA (선도 서열 부재) 130 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIKNRIRGVTVSSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDPFGFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSLERVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
CAR_H4_k3_AA (선도 서열 부재) 131 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIKNRIRGVTVSSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDPFGFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSLERVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
CAR_H4_k4_AA (선도 서열 부재) 132 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIKNRIRGVTVSSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDPFGFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSLERVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
CAR_H4_k5_AA (선도 서열 부재) 133 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQGLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQPASISFRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIKNRIRGVTVSSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDPFGFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSLERVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
CAR_H5_k2_AA (선도 서열 부재) 134 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDMAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIKNRIRGVTVSSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDPFGFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSLERVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
CAR_H5_k3_AA (선도 서열 부재) 135 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDMAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYQQRPGQPPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIKNRIRGVTVSSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDPFGFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSLERVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
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CAR_H1_k2_AA 213 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYHIQWVRQAPGQRLEWMGWIYPGDGSTQYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGTYYAMDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIKRTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
4-1BB_AA (US 9,102,760의 SEQ ID NO: 23) 216 KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
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CD8 힌지 AA 219 TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
CD8 막관통 _AA (US 9,102,760의 SEQ ID NO:22) 221 IWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
CD8_막관통 AA 223 IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
서열명 SEQ ID NT
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CAR_H5_k3_NT 179 ATGGATTTCCAGGTGCAAATCTTCTCATTTCTTTTGATAAGTGCGTCAGTGATAATGTCTCGGGCCAGTCAAGTACAGCTTGTCCAAAGTGGCGCTGAAGTCAAGAAGCCGGGAGCCTCAGTTAAGGTTAGCTGCAAGGCCTCAGGGTATACTTTTACCTCCTATCATATACAGTGGGTACGACAAGCACCGGGACAGCGACTGGAGTGGATGGGTTGGATATATCCGGGAGATGGTTCAACCCAGTATAATGAGAAGTTCAAGGGGCGAGTTACGATAACCCGCGATACGAGTGCATCAACAGCGTACATGGAGTTGAGTTCCCTCCGCAGCGAGGACATGGCGGTATACTATTGTGCCAGGGAGGGGACTTATTATGCCATGGACTACTGGGGGCAGGGCACAACCGTAACAGTCTCTTCTGTAGACAGTTCAGGAGGGGGCGGAAGTGGAGGTGGCGGATCTGGTGGAGGTGGATCTACTTCCGACATCGTTATGACCCAAACACCACTTTCATCTCCCGTTACTCTCGGGCAACCTGCTAGTATTTCCTGTAGATCCTCACAATCTATAGTACATAGCAATGGCAATACCTACCTGGAGTGGTATCAACAACGCCCAGGCCAACCACCTCGCCTGCTTATCTATAAAGTAAGCAATAGATTCAGTGGTGTACCGGATAGGTTCTCTGGTTCCGGAGCAGGAACTGACTTTACACTCAAAATCAGTAGGGTGGAGGCGGAAGACGTGGGAGTATATTATTGCTTTCAAGGTTCACATGTACCTCGAACATTTGGCGGAGGAACTAAGGTTGAGATTAAAAACCGGATCCGTGGGGTCACCGTCTCTTCAGCGCTGAGCAACTCCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACCCCTTTGGGTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCCTCGAGAGAGTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
CAR_H5_k4_NT 180 ATGGATTTCCAAGTCCAGATATTCAGTTTTCTTTTGATAAGCGCTTCTGTAATCATGTCTCGGGCGTCCCAAGTACAACTGGTGCAATCAGGGGCAGAAGTGAAAAAACCAGGTGCATCCGTTAAGGTGAGTTGCAAGGCTTCCGGCTATACCTTTACATCATATCATATTCAATGGGTCAGGCAAGCACCTGGTCAGCGATTGGAATGGATGGGTTGGATATATCCTGGTGATGGGTCTACACAATATAACGAAAAATTCAAGGGGCGAGTGACCATCACAAGAGATACATCAGCGTCAACAGCGTATATGGAACTGTCATCCCTTAGATCAGAGGACATGGCGGTCTATTACTGTGCCAGAGAAGGCACTTATTATGCAATGGATTATTGGGGACAAGGAACCACTGTCACTGTTTCCAGCGTAGACTCCTCCGGTGGTGGTGGAAGTGGCGGCGGTGGGTCAGGAGGGGGTGGGTCAACTTCTGATGTAGTGATGACACAGAGCCCTCTGAGCTTGCCTGTGACCTTGGGTCAGCCGGCCTCAATAAGTTGTCGATCTAGTCAGTCAATCGTCCATAGTAATGGGAACACATACCTTGAATGGTATCAGCAAAGACCTGGACAATCTCCACGACTCCTTATATACAAAGTTAGCAACCGATTTAGCGGAGTGCCAGACCGCTTTTCTGGTTCCGGGTCTGGCACAGATTTTACCCTTAAGATCTCCCGCGTGGAGGCGGAAGACGTTGGTGTTTACTATTGCTTCCAGGGGTCACACGTTCCACGCACCTTTGGAGGAGGTACGAAGGTCGAGATTAAGAACCGGATCCGTGGGGTCACCGTCTCTTCAGCGCTGAGCAACTCCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACCCCTTTGGGTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCCTCGAGAGAGTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
CAR_H5_k5_NT 181 ATGGATTTTCAAGTACAGATCTTCTCTTTCTTGCTTATTTCAGCGAGCGTAATCATGAGTAGGGCATCTCAAGTTCAACTCGTTCAGTCAGGTGCTGAGGTAAAAAAACCAGGGGCTTCCGTTAAAGTTAGCTGTAAGGCATCTGGGTACACATTTACTAGCTACCATATCCAGTGGGTGCGACAAGCCCCGGGGCAGCGCTTGGAATGGATGGGCTGGATTTACCCAGGTGACGGCTCCACGCAATATAATGAGAAATTTAAGGGTAGAGTTACTATTACCAGGGACACAAGTGCTTCAACTGCCTATATGGAACTGAGCAGCCTTCGGAGTGAAGATATGGCCGTATATTACTGCGCAAGGGAGGGGACTTACTATGCAATGGACTACTGGGGTCAGGGAACGACTGTGACCGTGTCCTCAGTTGACTCCAGCGGTGGTGGCGGCTCTGGAGGTGGGGGTTCCGGCGGAGGCGGAAGCACATCTGATATAGTGATGACGCAAACGCCTCTTTCTTCCCCGGTAACTCTGGGACAGCCAGCGTCAATTTCATTTAGGTCCTCCCAGTCAATCGTACATAGTAATGGAAATACTTACCTGGAATGGTATCAACAACGACCAGGGCAACCGCCCCGATTGTTGATCTATAAAGTGAGCAATCGCTTTTCTGGCGTGCCCGATCGGTTCTCAGGGTCTGGAGCTGGGACTGACTTCACATTGAAAATTTCCAGGGTTGAGGCCGAGGATGTGGGGGTTTATTACTGCTTCCAAGGCTCCCACGTCCCCCGCACCTTCGGAGGGGGAACCAAAGTCGAAATAAAGAACCGGATCCGTGGGGTCACCGTCTCTTCAGCGCTGAGCAACTCCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACCCCTTTGGGTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCCTCGAGAGAGTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
CAR_H6_k2_NT 182 ATGGATTTTCAAGTTCAGATATTCTCATTTTTGCTTATATCAGCCTCCGTAATTATGTCACGGGCAAGTCAAGTTCAGTTGGTGCAGTCCGGAGCAGAAGTTAAGAAGCCCGGTGCTTCTGTGAAAGTCTCCTGCAAAGCGTCTGGGTACACCTTCACGAGCTACCATATACAGTGGGTCCGGCAAGCGCCTGGGCAGAGGCTGGAGTGGATGGGCTGGATTTACCCAGGAGATGGGAGTACAAAGTATAGTCAGAAGTTTCAAGGGCGAGTGACGATAACCAGAGATACGAGTGCAAGTACTGCATACATGGAACTGAGCTCCTTGAGGTCCGAGGATACAGCGGTGTACTATTGCGCTCGGGAAGGGACATATTATGCTATGGACTATTGGGGACAAGGGACAACGGTAACGGTGAGTTCCGTCGATTCCTCAGGTGGCGGAGGCAGTGGGGGCGGGGGTTCCGGCGGTGGCGGGTCCACGAGTGATATAGTTATGACACAGACCCCCCTCAGCCTTTCTGTGACCCCAGGACAACCCGCTAGTATCTCTTGCCGCAGTTCTCAGTCCATAGTACACAGTAACGGAAATACCTATCTTGAGTGGTATCTTCAAAAGCCCGGCCAGAGCCCTCAACTCTTGATATATAAAGTGTCAAATCGATTTTCAGGTGTGCCTGATCGATTCTCAGGGTCTGGTTCAGGGACAGATTTCACGCTTAAGATAAGCAGAGTAGAGGCTGAAGACGTGGGAGTCTACTATTGTTTTCAGGGGTCACACGTTCCCCGCACTTTTGGTGGGGGAACCAAGGTGGAAATCAAAAACCGGATCCGTGGGGTCACCGTCTCTTCAGCGCTGAGCAACTCCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACCCCTTTGGGTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCCTCGAGAGAGTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
CAR_H1_K2_NT 214 ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTTCATGCCGCCAGACCATCTCAGGTCCAGCTAGTACAAAGCGGCGCCGAAGTAAAGAAACCTGGTGCCTCTGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACCACATCCAGTGGGTTCGACAGGCCCCTGGACAGAGACTAGAGTGGATGGGCTGGATCTATCCTGGCGACGGCAGCACCCAGTACAACGAGAAGTTCAAGGGCAGAGTTACCATCACCCGAGACACCAGCGCCAGCACAGCCTATATGGAGCTGAGCAGCCTGCGAAGCGAGGACACAGCTGTTTACTATTGTGCCAGAGAGGGCACCTACTACGCAATGGATTATTGGGGCCAGGGGACCACCGTGACCGTTTCTTCTGGAGGCGGAGGTTCTGGCGGCGGAGGAAGTGGTGGCGGAGGCTCAGATATTGTAATGACCCAGACACCTCTGTCCCTGTCTGTGACACCTGGACAGCCTGCAAGCATCAGCTGTCGGAGCAGCCAGAGCATCGTTCACAGCAACGGCAACACCTACCTGGAATGGTATCTGCAGAAGCCCGGACAGTCCCCCCAGCTGCTGATCTACAAGGTGTCCAACCGCTTCAGTGGAGTACCCGATAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCTCCAGAGTAGAAGCAGAGGACGTTGGAGTGTACTACTGCTTCCAAGGCAGCCATGTGCCAAGAACCTTTGGTGGAGGCACAAAGGTGGAAATCAAGCGGACAACAACACCTGCTCCTCGGCCTCCTACACCAGCTCCTACAATTGCCAGCCAGCCACTGTCTCTGAGGCCCGAAGCTTGCAGGCCTGCTGCTGGCGGAGCCGTGCATACAAGAGGACTGGATTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCACCTCTGGCTGGAACCTGTGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTCATCACCCTGTATTGCCGGAGCAAGAGAAGCAGACTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCTAGACGGCCCGGACCTACCAGAAAGCACTACCAGCCTTACGCTCCTCCTAGAGACTTCGCCGCCTACAGATCCAGAGTGAAGTTCAGCAGATCCGCCGACGCTCCTGCCTATCAGCAGGGCCAAAACCAGCTCTACAACGAGCTGAACCTGGGGAGAAGAGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCAGAGATCCTGAAATGGGCGGCAAGCCCAGACGGAAGAATCCTCAAGAGGGCCTGTATAATGAGCTACAGAAAGACAAGATGGCAGAGGCCTACAGCGAGATCGGAATGAAGGGCGAGCGCAGAAGAGGCAAGGGACACGATGGACTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTATGATGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA
4-1BB NT (US9,102,760의 SEQ ID NO: 17) 215 AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
CD8 힌지 NT (US9,102,760의 SEQ ID NO: 15) 217 ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT
CD8_힌지 NT 220 ACAACAACACCTGCTCCTCGGCCTCCTACACCAGCTCCTACAATTGCCAGCCAGCCACTGTCTCTGAGGCCCGAAGCTTGCAGGCCTGCTGCTGGCGGAGCCGTGCATACAAGAGGACTGGATTTCGCCTGCGAC
CD8 막관통 _NT (US9,102,760의 SEQ ID NO: 16) 222 ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC
CD8 막관통_NT 224 ATCTACATCTGGGCACCTCTGGCTGGAACCTGTGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTCATCACCCTGTATTGC
카밧 코티아
BB7.2 VH CDR1 SYHIQ (SEQ ID NO: 183) GYTFTSY (SEQ ID NO: 184)
BB7.2 VH CDR2 WIYPGDGSTQYNEKFKG (SEQ ID NO: 185) YPGDGS (SEQ ID NO: 186)
BB7.2 VH CDR3 EGTYYAMDY (SEQ ID NO: 187) EGTYYAMDY (SEQ ID NO: 187)
카밧 코티아
BB7.2 VL CDR1 RSSQSIVHSNGNTYLE (SEQ ID NO: 188) RSSQSIVHSNGNTYLE (SEQ ID NO: 188)
BB7.2 VL CDR2 KVSNRFS (SEQ ID NO: 189) KVSNRFS (SEQ ID NO:189)
BB7.2 VL CDR3 FQGSHVPRT (SEQ ID NO: 190) FQGSHVPRT (SEQ ID NO: 190)
서열명 SEQ ID AA
BB7.2_AAVH 191 QVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYHIQWVKQRPGQGLEWIGWIYPGDGSTQYNEKFKGKTTLTADKSSSTAYMLLSSLTSEDSAIYFCAREGTYYAMDYWGQGTSVTVSS
BB7.2_AA VL 192 DVLMTQTPLSLPVSLGDQVSISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKLEIK
BB7.2_AAscFv
(선도 서열 부재)		 193 QVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYHIQWVKQRPGQGLEWIGWIYPGDGSTQYNEKFKGKTTLTADKSSSTAYMLLSSLTSEDSAIYFCAREGTYYAMDYWGQGTSVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDVLMTQTPLSLPVSLGDQVSISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKLEIK
BB7.2CAR(선도 서열 부재) 194 QVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYHIQWVKQRPGQGLEWIGWIYPGDGSTQYNEKFKGKTTLTADKSSSTAYMLLSSLTSEDSAIYFCAREGTYYAMDYWGQGTSVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDVLMTQTPLSLPVSLGDQVSISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKLEIKLEQKLISEEDLNRIRGVTVSSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDPFGFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSLERVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
BB7.2CAR(선도 서열 존재) 195 MDFQVQIFSFLLISASVIMSRASQVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYHIQWVKQRPGQGLEWIGWIYPGDGSTQYNEKFKGKTTLTADKSSSTAYMLLSSLTSEDSAIYFCAREGTYYAMDYWGQGTSVTVSSVDSSGGGGSGGGGSGGGGSTSDVLMTQTPLSLPVSLGDQVSISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKLEIKLEQKLISEEDLNRIRGVTVSSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDPFGFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSLERVRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
서열명 SEQ ID NT
BB7.2CAR(선도 서열 존재) 196 ATGGACTTCCAGGTGCAGATCTTCAGCTTCCTGCTGATCAGCGCCAGCGTGATCATGAGCCGCGCTAGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCCCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACCACATCCAGTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTGGATCTACCCCGGCGACGGCAGCACCCAGTACAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGACCACCCTGACCGCCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCTGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCATCTACTTCTGCGCCCGCGAGGGCACCTACTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGAGCAGCGTCGACAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCACTAGTGACGTGCTGATGACCCAGACCCCCCTGAGCCTGCCCGTGAGCCTGGGCGACCAGGTGAGCATCAGCTGCCGCAGCAGCCAGAGCATCGTGCACAGCAACGGCAACACCTACCTGGAGTGGTACCTGCAGAAGCCCGGCCAGAGCCCCAAGCTGCTGATCTACAAGGTGAGCAACCGCTTCAGCGGCGTGCCCGACCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCCGCGTGGAGGCCGAGGACCTGGGCGTGTACTACTGCTTCCAGGGCAGCCACGTGCCCCGCACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCTCGAGCAGAAGCTGATCAGCGAGGAGGACCTGAACCGGATCCGTGGGGTCACCGTCTCTTCAGCGCTGAGCAACTCCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACCCCTTTGGGTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCCTCGAGAGAGTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA
실시예
방법
인간화된 HLA-A*02-특이적 scFv의 생성. 호모 사피엔스에 대한 설정을 사용하여 Invitrogen GeneArt Gene Synthesis 서비스의 코돈 최적화기를 사용하여 인간화된 유전자를 코돈 최적화하였다. 키메라 항원 수용체의 5' 영역이 Kozak 서열 및 pcDNA3 플라스미드와 36개의 NT 중첩부를 포함하도록 gBlocks® 유전자 단편을 Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)로부터 주문하였다. 3' 말단은 키메라 항원 수용체의 세포내 신호전달 도메인 및 CD8 힌지와 프레임 내 플라스미드로의 Gibson 어셈블리를 용이하게 하기 위해 CD8 힌지 서열과의 중첩부 및 BamHI 부위를 포함한다.
hA2-CAR의 생성. scFv 변이체를 (문헌[Sadelain et al., 2013])에 기재된 바와 같이 인간 CD8α의 줄기 영역, 인간 CD28 및 인간 CD3ζ의 막관통 및 세포내 도메인에 융합시켰다. 생성된 cDNA를 마커로서 절단된 신경-성장 인자 (TrkA) 수용체 (ΔNGFR)의 세포-표면 발현을 인코딩하는 렌티바이러스 벡터 내로 클로닝하였다 (도 1). 일시적으로 형질감염된 HEK 293T 세포 (jetPRIME®, Polyplus Transfection)의 유세포 분석에 의해 표면 발현을 결정하였다. 바이러스 입자를 (문헌[Allan et al., 2008])에 기재된 바와 같이 생성하였다.
HLA-발현 K562 세포주의 생성. CD64-발현 K562 세포 (K562.64)는 미국 필라델피아주 펜실베이니아 대학교 제임스 라일리 (James Riley)에 의해 제공되었다. 프라이머 서열: 5'-TTTTCTAGACGCGTGCCACCATGGCCGTCATGGCGCC-3' (정방향) (SEQ ID NO: 197) 및 5'-AAGTCGACGCTAGCTCACACTTTACAAGCTGTGAGAGACA-3' (역방향) (SEQ ID NO: 198)을 사용하여, HLA-A*02:01 및 A*24:02에 대한 cDNA를 HLA-A 유전자좌에서 각각 A*02:01 또는 A*24:02에 대한 동형접합 공여체로부터의 말초 혈액 단핵 세포의 mRNA로부터 단리하였다. 생성된 서열을 Sanger 시퀀싱에 의해 확인하고, IPD 및 IMGT/HLA 데이터베이스 (문헌[Robinson et al., 2015])로부터 예측되는 서열에 정렬하고, 렌티바이러스 발현 벡터를 사용하여 각각 K562 세포로 형질도입하였다. A25- 및 A68-K562 세포를 생성하기 위해, IPD 및 IMGT/HLA 데이터베이스 (문헌[Robinson et al., 2015])로부터 A*25:01, A*68:01에 대한 HLA 서열을 스크랩하고, ThermoFisher Invitrogen GeneArt Gene Synthesis 서비스로부터의 코돈 최적화 도구 (호모 사피엔스로 설정됨)를 사용하여 코돈 최적화한 후, 렌티바이러스 발현 벡터로 클로닝하고, K562 세포로 형질도입하였다. 이어서, 형질도입된 HLA 및 항-HLA-A2 (BB7.2) (ThermoFisher, 17-9876-42)의 균등한 표면 발현을 보장하기 위해, 생성된 K562 세포주를 항-HLA-ABC (ThermoFisher, 12-9983-41)를 사용하여 FACSAria II (BD Biosciences)에서 분류하였다.
Treg 분류, 형질도입 및 확장. CD4+ T 세포를 RosetteSep (Stemcell)를 통해 HLA-A2- 공여체로부터 단리하고, CD25+ 세포 (Miltenyi)를 다량화하고, 각각 MoFlo® Astrios (Beckman Coulter) 또는 FACSAria II (BD Biosciences)를 사용하여, 생존 CD4+CD25hiCD127loTreg (시험관내 및 루시퍼라제 실험) 또는 CD4+CD127loCD25hi CD45RA+ Treg (이종성 GvHD 및 피부 이식 실험)를 분류하였다. 분류된 Treg를 1000 U/ml의 IL-2 (Proleukin)에 의해 면역배양-XF T 세포 확장 배지 (STEMCELL Technologies)에서 L 세포 및 αCD3 mAb (OKT3; 100 ng/mL)로 자극하였다. 하루 후, 10개의 바이러스 입자:1개의 세포의 다회 감염으로 세포를 렌티바이러스로 형질도입하였다. 7일째에, ΔNGFR+ 세포를 자기 선택 (Miltenyi)으로 정제한 다음, 분석에 사용하거나, 상기와 같이 L 세포로 재 자극하고, 생체내 실험을 위해 5일 동안 확장시켰다. HLA-A2-매개 자극의 효과를 시험하기 위해, Treg를 제한 IL-2 (100 U/mL)로 24시간 동안 배양한 다음, 다시 계수하고, 24시간 동안 1:2 (K562:T 세포) 비율로 조사된 항-CD3/항-CD28 로딩된 K562.64 세포 또는 HLA-A*02:01, A*24:02, A*25:01 또는 A*68:01-발현 K562.64 세포와 공동-배양하였다.
유세포 분석. 표현형 분석을 위해, 고정성 생존 염료 (FVD, 65-0865-14, ThermoFisher; 423102, Biolegend)에 의해, eBioscience FOXP3/전사 인자 염색 완충액 세트 (ThermoFisher)에 의한 고정 및 투과 전에 표면 마커에 대해 세포를 염색하고, 세포내 단백질에 대해 염색하였다. 샘플을 Cytoflex (Beckman-Coulter)에서 판독하고, FlowJo 소프트웨어 버전 9.9.4 및 10.3 (Tree Star)을 사용하여 결과를 분석하였다.
ΔNGFR (130-091-885, Miltenyi), CD3 (564465, BD Biosciences), CD4 (317410, Biolegend), CD25 (130-091-024, Miltenyi), LAP (25-9829-42, ThermoFisher), CD69 (310946, Biolegend), CD154 (555702, BD Biosciences), CD71 (BD Biosciences, 563768), 및 CD127 (48-1278-42, ThermoFisher)에 대해 표면 염색을 수행하였다. 스트렙타비딘-알로피코시아닌 (PJ27S, Prozyme)에 의해 4량체로 제조된 HLA-A*02:01 단량체로 4량체 염색을 수행하였다. CTLA-4 (369606, Biolegend)에 대해 세포내 염색을 수행하였다.
생체내 실험을 위해, 50 uL의 혈액을 매주 및 종료점에서 수집하였다. 염화암모늄을 적혈구 용해에 사용하였다. 세포를 항-마우스 CD16/32 (ThermoFisher, 14-0161-82)로 PBS에 재현탁시키고, 고정성 생존 염료 (FVD; ThermoFisher, 65-0865-14), 항-마우스 CD45 (ThermoFisher, 25-0451-82), 및 항-인간 CD45 (BD Biosciences, 560777), CD4 (Biolegend, 300554, 317434), CD8 (ThermoFisher, 48-0087-42), 항-인간 CD271 (NGFR; BD Biosciences, 557196) HLA-A2 (BD Biosciences, 551285)를 사용하여 세포외 마커에 대해 염색하였다. FOXP3 (ThermoFisher, 12-4777-42)에 대한 세포내 염색을 eBioscience FOXP3/전사 인자 염색 완충액 세트 (ThermoFisher, 00-5523-00)로 수행하였다. 모든 샘플에 10,000개의 계수 비드를 첨가하였다 (ThermoFisher, 01-1234-42). 이종성 GvHD, 루시퍼라제 및 피부 이식 실험에 대한 유입 전략은 각각 도 8d, 도 10a 및 도 12a에 도시되어 있다.
HLA 대립유전자 교차 반응성 분석. 0.25 x 106개의 CAR Treg (7일 배양 후 상기와 같이 제조함)를 개별 FlowPRA 단일 항원 항체 비드 패널 (FL1HD01, FL1HD02, FL1HD03, FL1HD04, FL1HD06 및 FL1HD08, One Lambda) 및 고정성 생존 염료 (FVD, 65-0865-14, ThermoFisher)와 함께 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 세척하고, 0.5% 포름알데하이드로 고정시키고, 유세포 분석을 통해 분석하였다. 샘플당 200개의 음성 대조군 비드를 획득하였다. 분석을 위해, 고정성 생존 염료를 사용하여 사멸 세포를 먼저 제거하였다. 이어서, 사멸 세포 및 이중체를 제외한 후 단일 비드를 유입시켰다. 이어서, 각각의 HLA 항원에 대한 비드의 수를 각각의 PE 강도에 의해 결정하였다. 샘플의 음성 비드의 수를 Treg-NGFR 샘플의 음성 비드의 수로 나누고, Treg-NGFR 표본의 음성 비드의 수를 곱하여 데이터를 정규화하였다. 상대 결합 백분율은 하나의 특정 HLA에 대한 NGFR 표본의 비드 수에서 HLA에 대한 표본의 정규화된 비드 수를 빼고, NGFR 표본의 비드 수로 나누고, 100을 곱한 값이다.
혼합 림프구 반응 억제. HLA-A2+ 건강한 공여체로부터의 PBMC로부터의 부착 세포를 (문헌[Dijke et al., 2015])에 기재된 바와 같이 단핵구 유래 수지상 세포로 분화시켰다. 혼합 림프구 반응의 경우, HLA-A2- PBMC 반응 세포를 세포 증식 염료 eF450 (65-0842-85, ThermoFisher)으로 표지한 다음, 5x104개의 HLA-A2+ 단핵구 유래 수지상 세포로 플레이팅하고, 세포 증식 염료 e670 (65-0840-90, ThermoFisher)으로 표지된 확장된 ΔNGFR- 또는 hA2-CAR-발현 Treg의 비율을 증가시켰다. 6일 후, HLA-A2- CD4+ 반응 T 세포의 분열을 유세포 분석에 의해 측정하였다. (문헌[McMurchy and Levings, 2012])에 기재된 바와 같이, 소정의 세포 조합의 증식 지표 및 비율 대 양성 대조군 (HLA-A2- CD4+ 반응 T 세포만을 갖는 HLA-A2+ 단핵구-유래 수지상 세포)을 기반으로 하여, 억제 백분율을 계산하였다.
Figure pct00002
와 같이 먼저 억제 백분율을 계산하여 데이터를 정규화한 다음, 각각의 독립 실험에 대한 공식:
Figure pct00003
에 따라 생성 값을 0 내지 100%로 정규화하였다.
생체내 이종성 이식편대숙주병의 억제. 8주 내지 12주령의 암컷 NSG 마우스 (The Jackson Laboratory, 자체 사육)에 4 x 106개의 hA2-CAR Treg의 존재 또는 부재 하에 8 x 106개의 HLA-A2+ PBMC를 꼬리 정맥으로 정맥내 주사하기 1일 전에 전신 방사선 조사 (150 cGy, RS-2000 Pro Biological System)를 진행하였다. 식염수 주사 마우스를 대조군으로 사용하였다. hA2-CAR Treg를 4개의 상이한 건강한 공여체로부터 생성하였다. (문헌[Cooke, et al. 1996; Hill et al. 1997])에 기재된 바와 같이, GVHD를 체중, 모 조직, 자세, 활동 수준 및 피부 무결성을 기준으로 범주당 0 내지 2점으로 점수화하였다. GVHD 점수화를 2명의 맹검 조사관에 의해 수행하였다. 복재 정맥으로부터 말초 혈액을 원심분리한 후; 적혈구를 용해시키고, 백혈구를 유세포 분석으로 측정하였다.
연구 승인. 인간 PBMC의 경우, 건강한 지원자는 브리티시 컬럼비아 대학교 임상 연구 윤리위원회 및 캐나다 혈액 서비스에서 승인한 프로토콜에 따라 정보에 입각한 서면 동의서를 제공하였다. 브리티시 컬럼비아 대학교 임상 연구 윤리위원회-승인 프로토콜에 따라 Harvard Skin Resource Centre, Skin Works 또는 Cambie Surgery Clinic으로부터 성형 수술로부터 폐기된 인간 피부 샘플을 획득하였다. 동물 프로토콜은 UBC 동물 관리위원회에 의해 승인되었다.
피부 이식. A2-CAR Treg 회귀 및 피부 거부 억제 능력을 평가하기 위해, 8주 내지 12주령 암컷 NSG 마우스 (The Jackson Laboratory, 자체 사육)에 트랜스제닉 HLA-A2+ NSG 마우스 (The Jackson Laboratory, 자체 사육)로부터의 피부 및 NSG 피부 (HLA-A2 음성)를 이식하였다. 마우스 피부 이식의 경우, 피부를 8 mm 생검 펀치를 사용하여 원형 조각으로 절단하고, 피부를 PBS와 함께 새로운 플레이트에 배치하고, 이식될 때까지 (약 1 내지 4시간) 저온 (4 내지 8℃)으로 유지하였다. 인간 피부의 HLA-A2 발현을 유세포 분석 및 qPCR에 의해 평가하였다. 표본으로부터 지방을 잘라내어 분할 두께 외식편을 생성하였다. 외식편을 멸균 PBS로 세정하고, RPMI에 저장하였다. 양질의 피부 외식편을 1 cm2 조각으로 절단하고, PBS와 함께 새로운 플레이트에 배치하고, 이식될 때까지 (약 1 내지 4시간) 저온 (4 내지 8℃)으로 유지하였다. 마우스 및 인간 피부 이식 둘 모두의 경우, 사전 면도된 마우스를 마취시키고, 등쪽 피부를 어깨 근처에서 절단하고, 유사한 크기의 마우스 피부를 제거한 다음, 이식을 노출된 부위에 배치하고, 스테리-스트립 (steri-strip) (3M, Nexcare)으로 안정화시켰다. 이식을 바셀린 거즈로 도포하고, 2 cm 폭의 CoFlex 붕대 (3M, Nexcare)로 감싸서, 세포 주입 전 최대 14일 동안 이식을 보호하였다.
조직학
인간 피부 이식 및 주변 마우스 피부를 세포 주사 27일 후에 수확하고, 10% 포르말린 (조직 대 포르말린의 1:10 v/v 비율)에서 4℃에서 밤새 고정시키고, 파라핀-포매 전에 70% 에탄올에 저장하였다. 파라핀 절편 (5 μm 두께) 및 H&E 염색을 BC 어린이 병원 연구소 조직학 서비스 (Vancouver, British Columbia, Canada)에서 제조하였다. 면역염색을 위해, 일련의 자일렌 세척 (x3), 등급 알코올 용액 (2x 100% 에탄올, 1x 95% 에탄올 및 1x 70% 에탄올) 및 1x PBS를 사용하여 절편을 파라핀 제거하고, 재수화시켰다. 10 mM 시트르산나트륨 완충액 (0.5% Tween-20, pH 6.0)에서 93 내지 95℃에 도달하기 위해 전자레인지 (5분, 고전력, 20분, 저전력)를 사용하여 열 유도 에피토프 검색 (HIER)을 슬라이드에서 수행하였다. HIER 후에, 흐르는 수돗물, 탈이온수 및 PBS를 사용하여 슬라이드를 세척하였다. 비특이적 항체 염색을 제한하기 위해 절편을 무혈청 DAKO® 단백질 블록 (Dako, Burlington, Canada, X0909)과 인큐베이션하였다. 이어서, 다음 1차 항체: FOXP3 (Invitrogen, clone PCH101, 14-4776-82), CD45 (eBioscience, clone H130, 17-0459), Ki67 (eBioscience, clone 20Raji, 17-5699), 인볼루크린 (Abcam, ab53112)과 함께 절편을 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날, 절편을 PBS로 수 차례 부드럽게 세정하고, 다음 2차 항체: 당나귀 항-랫트 488 (Life Tech, A11006), 염소 항-마우스 APC (Invitrogen, 1834696), 당나귀 항-토끼 488 (Life Tech, A21206)에 의해 1시간 동안 RT에서 염색하였다:. 마지막으로, 세포 핵을 확인하기 위해 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)로 절편을 염색하고, DECT의 VECTASHIELD® 장착 배지 (Vector Laboratories, Burlingame, California, USA, H-1200)를 사용하여 장착하였다. 모든 항체를 항체 희석제 (Dako, Burlington, Canada, S3022)로 희석하였다. QImaging Retiga Exi 카메라 및 Olympus DP71 컬러 카메라가 장착된 Olympus BX61 형광 및 명시야 자동 수직 현미경을 사용하여 이미지를 캡처하였다. Olympus viewer Plugin이 장착된 Fiji를 사용하여 형광 이미지의 정량 분석을 수행하였다 (문헌[Schneider et al., 2012; Eliceiri et al., 2012]).
H&E-염색된 슬라이드를 맹검 임상 병리학자에 의해 각각 0 내지 3-4 등급의 8개의 인자에 의해 규정된 점수화 시스템을 사용하여 평가하였다; Lerner 등급 (0, 1 - 국소 또는 확산 진공 변성, 2 - 골다공증, 3 - 기저 또는 표면층의 갈라진 틈, 4 - 표피의 측부 손실), 해면화 (0, 1 - 기저층 단독, 2 - 최대 절반), 3 - 전 두께), 괴사 각질세포 (0, 1 - 극소량 (1/hpf), 2 - 일정량 (2 내지 3/hpf), 3 - 다량 (4 초과/hpf)), 괴사 각질세포 위치 (0, 1 - 기저층 단독, 2 - 최대 절반, 3 - 전 두께), 신경교세포집합 (0, 1 - 1 단독, 2 - 2 내지 3/hpf, 3 - 4 초과/hpf), 세포외 이입 (0, 1 - 국소, 2 - 50% 미만 생검, 3 - 50% 초과 생검), 부속기 관여 (0, 1 - 임의의 부속기의 경미한 관여, 2 - 50% 미만 부속기의 현저한 관여, 3 - 50% 초과 부속기의 현저한 관여) 및 진피의 림프 하단 (0, 1 - 소수, 2 - 다수, 3 - 밴드형) (문헌[Massi et al., 1999; Fischer et al., 2015, Kanitakis et al., 2008]).
qPCR. RNA를 제조사의 지침 (RNeasy Plus Mini Kit; Qiagen)에 따라 인간 피부 샘플로부터 수확하고, 상보적 DNA (cDNA)로 전환하였다. IL17, IL6, IL1B, DEFB4, IFNg, TNFa, 18S 리보솜 RNA에 대한 프라이머 및 SYBR-green (Biorad)을 사용하여 qPCR을 수행하였다 (표 8). 용융 곡선 및 SYBR-green 방출 데이터를 수집하였다. 표준 곡선을 사용하여 상대 농도를 계산하고, 값을 18S 리보솜 RNA의 증폭 산물로 정규화하였다. 각 샘플에 대한 Log2 (RQ) 값을 이중 델타 Ct (△△Ct) 방법 (문헌[Schmittgen et al., 2008])을 사용하여 획득하였다. 평균 Ct (대상 유전자) - Ct (하우스키핑 유전자)를 계산하여 각 샘플의 △Ct 값을 획득하였다. △△Ct를 획득기 위해, 처리된 샘플의 △Ct로부터 대조군 샘플의 △Ct를 뺀다. 이어서 유전자 발현 배수를 2-(△△Ct)에 의해 계산하였다.
qPCR 분석에 사용된 프라이머
올리고 명칭 방향
정방향 (FWD) 또는 역방향 (RVS)		 올리고 서열 (5'에서 3')
인간 IL17 FWD TCA ACC CGA TTG TCC ACC AT (SEQ ID NO: 199)
인간 IL17 RVS GAG TTT AGT CCG AAA TGA GGC TG (SEQ ID NO: 200)
인간 IL6 FWD TCC AAA GAT GTA GCC GCC CCA (SEQ ID NO: 201)
인간 IL6 RVS CCA GTG CCT CTT TGC TGC TTT CA (SEQ ID NO: 202)
인간 IL1B FWD CTG AGC TCG CCA GTG AAA TGA TG (SEQ ID NO: 203)
인간 IL1B RVS TGC TGT AGT GGT GGT CGG AGA (SEQ ID NO: 204)
인간 DEFB4 FWD ACC TGC CTT AAG AGT GGA GCC A (SEQ ID NO: 205)
인간 DEFB4 RVS ACA TGT CGC ACG TCT CTG ATG A (SEQ ID NO: 206)
인간 IFNG FWD TGC CCA GAG CAT CCA AAA GA (SEQ ID NO:207)
인간 IFNG RVS TGT ATT GCT TTG CGT TGG AC (SEQ ID NO: 208)
인간 TNFA FWD AGG CGC TCC CCA AGA AGA CA (SEQ ID NO: 209)
인간 TNFA RVS GGG CTG ATT AGA GAG AGG TCC CT (SEQ ID NO: 210)
18S 리보솜 RNA FWD CAA GAC GGA CCA GAG CGA AA (SEQ ID NO: 211)
18S 리보솜 RNA RVS GGC GGG TCA TGG GAA TAA C (SEQ ID NO: 212)
루시퍼라제. 생체내에서 HLA-A2-발현 마우스 피부 이식을 향한 Treg 회귀를 평가하기 위해, 분류된 Treg (CD4+CD25hiCD127lo)를 상기 기재된 바와 같이 L-세포로 자극하였다. 다음날, 세포를 10의 MOI에서 HER2-CAR, mA2-CAR 또는 H1k2 hA2-CAR 렌티바이러스로 형질도입시키고, 8시간 후에 5의 MOI에서 루시퍼라제-GFP-렌티바이러스로 형질도입시켰다. 곤충 루시퍼라제-GFP-융합 단백질 (pELNS.CBG-T2A-GFP (CBR))을 인코딩하는 렌티바이러스 플라스미드를 전술한 바와 같이 사용하였다 (문헌[Barrett et al., 2014]). 배양 7일 후, CAR 및 루시퍼라제를 발현하는 이중 형질도입된 GFP+ΔNGFR+ Treg를 분류한 후, 상기 기재된 바와 같이 L-세포로 재 자극하였다. 배양 12일째에, 1 내지 3 x106개의 루시퍼라제-CAR Treg 및 6x106개의 인간 동종이계 HLA-A2-PBMC를 피부 이식된 NSG 마우스에 정맥내 주사하였다. 생물발광 이미지를 위해, D-루시페린 칼륨 염 (150 mg/kg, Gold Bio)을 이소플루란에 의한 마취 직전에 i.p. 주사하고, 이미지를 Ami-X (Spectral Instruments Imaging) 상에서 15 내지 20분 내에 획득하였다. 데이터를 AmiView 소프트웨어 (Spectral Instruments Imaging, 버전 1.7.06)로 분석하고, HLA-A2- 피부 이식에 대한 HLA-A2+의 광자/초/cm2/스테라디안 비율로 발광 신호를 정량화하였다. 실험 종료점에, 피부-배액 액와 림프절 및 비장을 수확하고, 70 μm 세포 스트레이너 (strainer) (BD Falcon) 상에 배치한 다음, 1 cc 주사기의 플런저 (plunger)를 사용하여 단편화하여, 여과하였다. 이어서 세포를 유세포 분석을 위해 염색하였다.
통계 분석. 모든 통계를 Prism 7.0b를 사용하여 수행하였다. IBM*SPSS Statistics 버전 24.0.0.0을 도 9에 사용하였다.
결과
인간화된 HLA-A2-특이적 CAR의 작제
마우스 BB7.2 mAb로부터의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열을 국립 생명 공학 정보 센터 (NCBI)로부터 입수 가능한 IgBLAST 툴을 사용하여, 국제 ImMunoGeneTics information system® (IMGT®) 데이터베이스로부터 획득된 인간 면역글로불린 서열에 정렬시켰다. V-유전자 한정 시스템을 카밧 서열로 설정하여 카밧 규정 CDR을 획득하였다 (문헌[Kabat et al., 1991). 또한, 코티아 규정 (문헌[Chothia et al., 1987])을 확인하였다.
CDR 이식을 위한 프레임워크 서열로서 다수의 상이한 인간 생식계열 유전자를 시험하였다. 마우스 서열과 가장 유사한 인간 생식계열 서열을 확인하는 것 외에도, CDR 길이를 또한 가능한한 구조를 유지하는 것으로 고려하였다. 인간 CDR (카밧 넘버링)을 BB7.2 항체로부터의 대응 마우스 CDR로 대체하였다. 또한, 코티아 및 카밧 넘버링을 조합하여 중쇄의 추가 CDR 아미노산을 대체하였다. 결과적으로 6개의 상이한 인간화된 중쇄 및 5개의 상이한 인간화된 경쇄를 생성하고, 인간화된 중쇄 및 경쇄를 조합함으로써 총 20개의 상이한 키메라 항원 수용체를 생성하였다.
인간화된 HLA-A2-특이적 CAR의 발현 및 항원 특이성
항원 특이성을 시험하기 위해, 다양한 hA2-CAR 작제물을 293T 세포에 일시적으로 형질감염시키고, HLA-A*02:01 4량체로 염색하고, 유세포 분석에 의해 분석하였다. 11개의 hA2-CAR 작제물이 발현되어 A*02:01 4량체에 결합되었다 (도 2).
다음에, 본 발명자들은 다양한 hA2-CAR 작제물의 결합 강도를 비교하였다. 일시적으로 형질감염된 293T 세포를 A*02:01 4량체의 희석을 증가시켜 염색한 후, 유세포 분석으로 분석하였다. 도 3a, 도 3b 및 도 3c에 도시된 바와 같이, 11개의 hA2-CAR 작제물은 4량체 농도-의존적 방식으로 높은 정도로 A*02:01 4량체에 결합한다.
hA2-CAR-매개 자극은 Treg를 활성화시킨다
Treg에서 A2-CAR의 기능을 시험하기 위해, 말초 혈액으로부터 CD4+CD25hiCD127lo 세포를 분류하였다. 도 4a, 도 4b 및 도 4c에 도시된 바와 같이, Treg를 자극시키고, 형질도입시켜, 추가로 6 내지 7일 동안 배양하였다. 배양 7 내지 8일의 종료시, 세포를 NGFR+ 세포로 정제하고, hA2-CAR 변이체의 세포 표면 발현을 유세포 분석으로 시험하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, hA2-CAR 작제물로 형질도입된 Treg는 ΔNGFR 대조군 작제물로 형질도입된 Treg와 비교하여 HLA-A2 4량체에 의해 양성 염색된 것으로 나타났으며, 이는 hA2-CAR을 발현하는 Treg에 대한 항원 특이성의 보존을 시사한다. (H1k3)에 대한 고역가 렌티바이러스를 생성하는데 기술적인 어려움이 있었고, 이 CAR은 이 실험에서 Treg에서 시험되지 않았다. CAR 세포 표면 발현 및 특이성을 A*02:01 4량체로 염색함으로써 시험하였고, H2k2, H4k4 및 H5k4는 Treg에서 이봉형의 패턴의 발현을 나타내었으며, A2-4량체+ 세포의 평균 형광 강도 (MFI)는 더 낮았다 (도 4d 및 도 4e)
다음으로 본 발명자들은 절단된 NGFR 형질도입 마커 (NGFR Treg)만을 발현하는 Treg와 비교하여 hA2-CAR을 통한 자극이 Treg (hA2-CAR Treg)를 활성화시켰는지를 조사하였다. NGFR 및 hA2-CAR Treg는 자극시키지 않고, HLA-A*02:01을 발현하는 K562 세포로 CAR을 통해 자극시키거나, 높은 친화도 Fc 수용체인 CD64를 발현하는 K562 세포로 TCR을 통해 자극시켰으며, 이를 항-CD3/항-CD28 항체로 사전 로딩하였다. NGFR Treg와 hA2-CAR Treg의 비교에 의해, 다수의 시점에 걸쳐 대부분의 hA2-CAR Treg에서 CD69 및 CD71의 CAR-자극 발현이 훨씬 더 높은 것으로 나타났다. 이와 달리, TCR을 통해 자극한 경우, NGFR 및 hA2-CAR Treg는 둘 모두 CD69를 상향조절할 수 있었고, 이는 이들이 CAR DNA의 형질도입 후 TCR을 통해 신호전달하는 능력을 보유함을 나타낸다 (도 13에 도시된 바와 같음). Treg의 hA2-CAR-매개 자극은 또한 Treg 기능과 관련된 단백질의 유의하게 더 큰 상향조절을 야기하여, hA2-CAR을 통한 자극이 CTLA-4 및 LAP의 예상되는 높은 발현을 유지한다는 것을 나타낸다 (도 5a 내지 도 5f).
다른 클래스 I HLA 대립유전자 상의 hA2-CAR 작제물의 교차 반응성
더 적은 수의 조상 대립유전자로부터 시간 경과에 따라 발생한 많은 HLA의 대립유전자가 존재한다. 결과적으로, 소수의 아미노산만이 상이할 수 있는 대립유전자 패밀리가 존재하며, 단일 항-HLA 항체는 발생 연관 패밀리 내에서 다수의 대립유전자를 인식할 수 있다. 마우스 단일클론 항체 (BB7.2)는 추가적인 HLA-A 대립유전자에 대한 교차 반응성을 갖는 것으로 공지되어 있다 (문헌[Hilton & Parham, 2013.]). 구체적으로, 고상 분석에서 시험하는 경우, BB7.2 항체는 5개의 하위유형의 HLA-A2 (*02:01, *02:02, *02:03, *02:05, *02:06)를 인식하고, HLA-A*69:01과 교차 반응하며, 고농도로 시험하는 경우, HLA-A*23:01, A*24:02, A*24:03, A*68:01, 및 A*68:02를 인식하는 것으로 나타났다 (문헌[Hilton & Parham, 2013.]). 이식과 관련하여, 동종이계 세포, 조직 및/또는 장기에 대한 특이적 표적화를 보장하기 위해 동종 Ag 특이성에 대한 정보가 필요하다. T 세포 동종 반응성을 측정하는 통상적인 방법은 대형 바탕의 일배체형 PBMC를 갖는 기능성 MLR을 포함하기 때문에 부정확하고, 비정량적이다. 본 발명의 인간화 항-HLA-A2 항체의 교차 반응성을 평가하고, BB7.2 항체와 비교하기 위해, 본 발명자들은 혈청 중 항-HLA-항체를 측정하기 위해 설계된 ONE Lambda 고상 분석을 적용하여 대상 인간화 CAR에 결합된 HLA-코팅된 비드를 측정하였다. BB7.2 CAR을 문헌[MacDonald, K.G. (2016)]에 기재된 바와 같이 생성하였다. 소정의 인간화 CAR을 발현하는 NGFR+ Treg를 유동 패널 반응성 단일 항원 비드와 함께 인큐베이션하고, 단일 종류의 비드에 대한 결합을 전방/측 산점도에서의 비드 유입의 신호 손실로 정량화하였다 (세부 방법 참조). 데이터를 샘플의 음성 대조군 비드의 수로 정규화하고, NGFR 표본의 음성 비드의 수에 대한 NGFR-제어 Treg에 의한 결합량의 관계에 NGFR 표본의 음성 비드의 수를 곱하여, hCAR-발현 Treg에 대한 상대 결합량을 계산하였다. 방법을 검증하기 위해, FlowPRT 세포 분석에 의해 결정된 바와 같이, 각각의 m/hA2-CAR 작제물의 HLA-A*02:01에 대한 상대 결합 (도 6b)을 4량체 결합의 MFI와 비교하였다 (도 6c). 이 분석에 의해 A*02:01 결합을 검출하는 2개의 방법 사이에 강한 직접적인 상관관계가 밝혀졌다. 또한 본 발명자들은 FlowPRT 세포 분석에 의해 결정된 바와 같은 A*02:01 결합의 양이 A*02:01에 대한 노출의 생물학적 효과와 상관관계가 있는지 여부를 조사하였다. 실제로, 본 발명자들은 A*02:01-발현 APC에 대한 노출 후 CD69 상향조절에 의해 판단된 바와 같이, FlowPRT 세포 분석에 의해 정량화된 A*02:01 결합량과 Treg 활성화 자극 사이에 직접적인 상관관계가 있음을 발견하였다 (도 6d). 이러한 데이터는 상이한 HLA 대립유전자에 결합하는 동종Ag-특이적 CAR의 능력을 측정하기 위한 FlowPRT 세포 방법의 유용성을 시사한다.
도 6 및 표 9에 제시된 바와 같이, 모든 hA2-CAR 작제물은 HLA-A*02:01에 유의하게 결합하였으므로, 4량체 결합 분석을 확인하였다. 본 발명자들이 단일 항원 FlowPRA 분석에서 BB7.2 항체 결합을 시험한 경우, 본 발명자들은 A*69:01에 대한 높은 결합을 확인했지만, A*23:01 또는 A*24:02에 대한 교차 반응성을 확인할 수 없었다 (도 6). 다양한 HLA-A 대립유전자에 결합하는 m/hA2-CAR Treg의 상대적인 능력을 시험한 경우, 본 발명자들은 mA2-CAR-Treg가 HLA-A*03:01, A*25:01, A*29:02, A*30:01, A*31:01, A*33:01, A*36:01, A*68:01 및 A*69:01에 유의하게 결합하였음을 발견하였다 (도 6, 표 9). 이와 달리, hA2-CAR Treg의 모든 변이체는 놀랍게도 mA2-CAR Treg와 비교하여, 감소된 교차 반응성을 나타냈다 (도 6, 표 9). 예상한 바와 같이, 모든 CAR 작제물은 단지 6개의 아미노산만이 상이한 A*02:01의 변이체인 HLA-A*69:01에 결합하였다. CAR-작제물 중 어느 것도 HLA-B에 대한 임의의 유의한 결합을 나타내지 않았다 (도 6).
CAR-Treg Ag 결합 정도와 생물학적 활성 사이의 관계는 알려져 있지 않다. HLA 교차 반응성의 생물학적 유의도를 규정하기 위해, 본 발명자들은 HLA-A*24:02, A*25:01 또는 A*68:01을 발현하는 APC를 생성하였으며; 모든 세포는 유사한 수준의 HLA-A 발현을 나타내었다 (데이터 미제시). 본 발명자들은 HLA-A*02:01-발현 세포와의 공동 배양만이 CD69, CD71, LAP, CTLA-4 (도 6i) 또는 CD40L의 상향조절된 발현에 의해 판단되는 바와 같이 m/hCAR-Treg의 유의한 활성화를 야기한다는 것을 발견하였다 (데이터 미제시). 이들 데이터는 Treg의 효과적인 CAR-매개 활성화에 높은 친화도 및/또는 결합력 상호작용이 요구된다는 것을 시사한다. 따라서, 일부 hA2-CAR은 FlowPRT 분석에서 A*25:01 및 A*68:01과 결합하는 것으로 나타나지만, 결합 강도는 세포 활성화에 불충분하다.
통계적으로 유의한 것으로 나타난 m/hA2-CAR 및 HLA-A/B 단백질 사이의 결합 상호작용 (2원 ANOVA, Dunnett 사후 시험).
HLA-대립유전자 CAR p 값



A*02:01 		mA2-CAR 0.0001
H1k2 0.0001
H2K2 0.0001
H4k2 0.0001
H5k2 0.0001
H6k2 0.0001
H4k3 0.0001
H5k3 0.0001
H3k4 0.0001
H4k4 0.0006
H5k4 0.0001
A*25:01 mA2-CAR 0.0001
H1K2 0.0061
A*69:01 mA2-CAR 0.0001
H4k2 0.0001
H5k2 0.0001
H1k2 0.0001
H3k4 0.0013
H2k2 0.0084
H5k3 0.0001
H4k3 0.0001
H6k2 0.0060
A*03:01 mA2-CAR 0.0315
A*29:02 mA2-CAR 0.0001
A*30:01 mA2-CAR 0.0001
A*31:01 mA2-CAR 0.0001
H1k2 0.0077
A*33:01 mA2-CAR 0.0019
A*36:01 mA2-CAR 0.0035
H1k2 0.0082
A*68:01 mA2-CAR 0.0001
H1k2 0.0001
H5k2 0.0337
H6k2 0.0009
본 발명자들은 동종 항원에 대한 CAR의 특이성을 체계적으로 시험하는 신규한 방법을 개발하여, 소정의 대립유전자 특이성을 갖는 작제물을 포괄적으로 확인하기 위한 신규한 플랫폼을 생성하였다. 놀랍게도, 본 발명자들은 mA2-CAR과 비교하여, CAR 인간화가 일부 HLA-A 대립유전자 변이체에 대한 교차-반응성을 감소시킨다는 것을 발견하였다.
hA2-CAR Treg는 시험관내에서 HLA-A2-특이적 억제를 매개한다 .
Treg에서 항원-특이적 억제 활성을 자극하는 hA2-CAR의 능력을 시험하기 위해, 본 발명자들은 도 7a에 도시된 실험 설계에 따른 혼합 림프구 반응 (MLR)을 사용하였다. 구체적으로, 형질도입시키지 않았거나, 대조군 NGFR 렌티바이러스 또는 H1k2 hA2-CAR을 인코딩하는 렌티바이러스로 형질도입시킨 Treg의 증가 비율의 부재 또는 존재 하에 성숙 HLA-A*02:01-양성 수지상 세포와의 공동 배양에 의해 HLA-A*02:01 음성 T 세포의 증식을 자극하였다. 도 7b 내지 도 7e에 도시된 바와 같이, hA2-CAR-발현 Treg는 NGFR 대조군 렌티바이러스 작제물로 형질도입된 대조군 Treg와 비교하여, CD4+ T 세포의 동종 항원-자극 증식을 유의하게 더 잘 억제할 수 있었다.
hA2-CAR Treg는 생체내에서 이종성 GVHD의 HLA-A2-특이적 억제를 매개한다
생체내에서 hA2-CAR Treg의 기능성 능력을 시험하기 위해, 본 발명자들은 면역결핍 NSG 마우스에 생착된 인간 PBMC가 이종성 GVHD를 유발하는 마우스 모델을 사용하였다. HLA-A2+ 공여체로부터의 8 x 106개의 PBMC를 H1k2 hA2-CAR을 발현하는 Treg의 존재 또는 부재 하에 조사된 NSG 마우스에 주사하였다. 시험된 PBMC 대 hA2-CAR Treg의 비율은 1:2 (즉, 8 x 106 PBMC 대 4 x 106 Treg)였다. 방법에 기재된 바와 같이 임상 점수에 대해 마우스를 7주 동안 모니터링하였다. 도 7의 시험관내 데이터로 정렬하여, hA2-CAR-발현 Treg가 제공된 마우스는 hA2-CAR Treg가 제공되지 않은 마우스 (회색 실선)와 비교하여 생존율이 개선되고, 체중이 감소하며, xenoGVHD의 발병이 지연되었다 (도 8a, 도 8b 및 도 8c). Treg의 생물학적 효과를 관찰하는 동안, 본 발명자들은 주사 14일 후 측정된 순환 m/hA2-CAR Treg를 검출하지 못했다 (도 8d 및 도 8e).
생체내에서의 HLA-A2 + 피부 이식으로의 hA2-CAR Treg 이동
CAR-유도 특이성이 Treg 이동에 어떻게 영향을 미치는지를 시험하기 위해, NSG 또는 NSG-A*02:01-트랜스제닉 마우스로부터 NSG 마우스로 병행 피부 이식을 수행하였다 (도 9a). 이식 회복 후, 비특이적 다클론 Treg 대조군으로서 HER2-CAR Treg의 존재 하에 또는 m/hA2-CAR Treg의 부재 또는 존재 하에 PBMC를 주사하였다 (문헌[MacDonald et al., 2016]). CAR에 더하여, Treg를 루시퍼라제-GFP 융합 단백질을 인코딩하는 렌티바이러스와 공동 형질도입시켰다. 생체발광 이미지화를 Treg 주사 후 21일째까지 D-루시페린 주사 후 수행하였다 (문헌[Barrett et al., 2014]). 다클론 HER2-CAR Treg는 동종이식으로의 유도된 이동 패턴을 나타내었지만, A2 양성 및 음성 이식 사이에 동일하게 분포하였다. 조작되지 않은 면역결핍 마우스에서 인간 T 세포가 통상적으로 폐로 이동하기 때문에 이러한 다클론 Treg는 수술후 피부로부터 방출되는 염증 신호에 반응하여 이동할 수 있다 (문헌[Nervi et al. 2007]). A2-음성 및 양성 피부에 동일하게 이동한 다클론 HER2-CAR Treg와 달리, m/hA2-CAR Treg는 둘 모두 A2-발현 피부로 빠르게 이동하였다. 또한, m/hA2-CAR Treg는 비특이적 HER2-CAR Treg보다 더 장기간 지속되었다. 21일째에는 HER2-CAR Treg를 검출할 수 없었으나, 강한 m/hA2-CAR Treg 신호는 유지되었다 (도 9b). A2 양성 대 A2 음성 이식에서 발광 비율의 정량화는 A2 발현 이식으로의 H1k2 및 mA2-CAR Treg 둘 모두의 유의한 Ag-유도 이동을 나타냈다 (도 9c 및 도 9d).
이식-국소화 m/hA2-CAR Treg에 추가하여, 본 발명자들은 21일째에 국소 배액 림프절의 위치와 일치하는 인접 신호에 주목하였다. 희생시, 이식 배수 림프절을 수집하고, 유세포 분석 결과 hCD4+FOXP3+ΔNGFR+A2-4량체+ CAR Treg의 유의한 비율이 나타났다. 달리, 이들 세포 중 극소수 만이 비장에서 검출되었다 (도 10b 및 도 10c). 이식에서 림프절까지 이 2단계 이동 과정은 내성 유도에 필요한 것으로 종래에 보고된 바 있다 (문헌[Zhang et al. 2009]). 중요하게도, 림프절-회귀 CAR Treg는 FOXP3 및 CAR의 발현을 유지하였으며, 이는 안정한 표현형을 나타낸다.
hA2-CAR Treg는 인간 피부 동종이식 거부를 예방한다
고형 장기 이식 모델에서 hA2-CAR Treg의 면역 조절 가능성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 NSG 마우스에 인간 HLA-A2pos 피부 이식을 이식한 인간화된 피부 이식 모델을 사용하였다. 6주 후, 마우스에 자가 H1k2 hA2-CAR Treg의 존재 또는 부재 하에 HLA-A2neg PBMC를 주사하였다. 세포 주사 4주 후, 마우스를 희생시키고, 병리 및 염증성 사이토카인 발현의 평가를 위해 피부 이식을 수집하였다. 모든 마우스는 안정된 체중을 유지하여, 이종성 GvHD의 부재를 나타내었으며 (도 11a), 혈액 및 비장에서 인간 백혈구 생착 수준은 유사하였다 (도 11b). 25 점 척도를 사용하여 H&E 절편을 평가하였으며, H1k2 hA2-CAR Treg 대 PBMC가 제공된 마우스에서 누적 병리학적 거부 점수의 유의한 감소가 나타났다 (도 11c). 면역 염색에 의해 PBMC가 단독으로 제공된 마우스와 비교하여, PBMC 및 H1k2 hA2-CAR Treg가 제공된 마우스는 Ki67+ 각질세포가 유의하게 감소하였으며, 인볼루크린 파괴가 감소한 것으로 나타났다 (도 11d). qPCR 정량화에 의하면 또한 H1k2 hA2-CAR Treg-처리된 마우스의 이식에서 염증성 사이토카인이 일반적으로 감소한 것으로 나타났다 (도 11e).
이종성 GVHD 모델에서와 같이, 혈액 중 PBMC가 검출었지만, CAR Treg는 검출되지 않았다 (도 12). 그러나, 면역염색에 의해 PBMC가 단독으로 제공된 마우스와 비교하여, PBMC 및 H1k2 hA2-CAR Treg가 제공된 마우스는 이식에서 FOXP3+ 세포의 비율이 유의하게 더 높은 것으로 나타났다 (도 11f). FOXP3+ 세포의 존재는 이것이 장, 간 또는 폐에서 검출되지 않았기 때문에 이식된 피부 이식에 유일하였다 (도 11g). 이러한 데이터는 A2-트랜스제닉 NSG 피부 모델에서와 같이, H1k2 hA2-CAR Treg는 이것이 무한정 지속되는 인간 A2+ 피부 동종이식으로 특이적으로 이동함을 보여준다.
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SEQUENCE LISTING <110> LEVINGS, Megan ORBAN, Paul DAWSON, Nicholas LAMARCHE, Caroline BERGQVIST, Jan P <120> ANTI-HLA-A2 ANTIBODIES AND METHODS OF USING THE SAME <130> CDRD-003WO <150> US 62/560,574 <151> 2017-09-19 <150> US 62/692,386 <151> 2018-06-29 <160> 224 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 1 Ser Tyr His Ile Gln 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 2 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 1 5 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 3 Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 4 Tyr Pro Gly Asp Gly Ser 1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 5 Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 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(34)..(34) <223> Xaa is T or M <400> 37 Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe Gln Gly Xaa Val Thr Xaa Thr Xaa Asp 1 5 10 15 Thr Ser Xaa Ser Thr Ala Tyr Met Xaa Leu Ser Xaa Leu Arg Ser Xaa 20 25 30 Asp Xaa Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 35 40 <210> 38 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 38 Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp 1 5 10 15 Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu 20 25 30 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 35 40 <210> 39 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 39 Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp 1 5 10 15 Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Leu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu 20 25 30 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 35 40 <210> 40 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 40 Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Val Thr Met Thr Arg Asp Thr 1 5 10 15 Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu 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<222> (92)..(92) <223> Xaa is T or M <400> 45 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Xaa Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Xaa Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Xaa Tyr Xaa Xaa Lys 50 55 60 Phe Xaa Gly Xaa Val Thr Xaa Thr Xaa Asp Thr Ser Xaa Ser Thr Ala 65 70 75 80 Tyr Met Xaa Leu Ser Xaa Leu Arg Ser Xaa Asp Xaa Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 46 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is V or I <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa is S or T <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa is L or S <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa is P or S <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa is L or P <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> Xaa is C or F <400> 46 Asp Xaa Val Met Thr Gln Xaa Pro Leu Ser Xaa Xaa Val Thr Xaa Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Xaa 20 <210> 47 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 47 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys 20 <210> 48 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 48 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys 20 <210> 49 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 49 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys 20 <210> 50 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 50 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Phe 20 <210> 51 <211> 15 <212> PRT <213> 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cttggagtgg atggggtgga tttaccctgg cgacggcagc 240 acacagtaca atgagaaatt taaaggccgg gtgactatca ctcgggacac ctccgccagc 300 acggcttata tggagcttag cagtttgaga tccgaagata cagcggtata ttactgcgcg 360 agagaaggaa cgtactacgc tatggactat tggggtcagg gcacaaccgt tacagtctcc 420 tctgtggaca gctccggagg tgggggttca ggagggggtg gaagcggtgg tggtggcagt 480 acaagcgata tagtaatgac ccaaaccccg ctctctctga gcgtcacgcc aggacaacca 540 gcatcaatct cttgccgcag tagtcaatcc atcgttcact ctaatggaaa cacatacctt 600 gagtggtatc ttcagaaacc aggtcagagc cctcagctcc tcatctataa agtctctaac 660 cggttctcag gtgttccgga ccggttcagt ggttccggct caggaacaga cttcaccttg 720 aagatcagtc gagtagaagc cgaagacgtg ggtgtatatt attgctttca gggttcccac 780 gttccgcgca ccttcggcgg cgggaccaaa gttgagatca aa 822 <210> 141 <211> 822 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 141 atggactttc aagtccaaat cttctcattc ctcctgatct ctgcgtcagt aatcatgtcc 60 agagcgtcac aagtgcaact cgttcaatcc ggagctgagg taaagaagcc cggcgccagc 120 gtgaaagtct cctgcaaagc gagcggctac 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tgaaaaagcc gggcgcgagt 120 gtgaaagtct catgcaaggc gagtggatac acctttacct cttaccacat tcaatgggtg 180 cggcaggcgc ctgggcagcg cttggaatgg atgggctgga tatatcctgg cgacggaagt 240 acccagtaca acgaaaaatt caaaggtagg gttaccatca ctgctgatac ctccgcgtcc 300 actgcttata tgcttcttag ctccttgcga agcgaggata cagccgtgta ttattgtgcc 360 agagagggga cttattatgc catggactat tggggtcagg gtacaacggt cactgtctca 420 tctgttgaca gtagcggggg aggggggtct ggaggagggg gttccggggg gggaggttcc 480 acgagcgata tagttatgac gcaaacgccc ttgagcctca gtgttacacc cggtcaacct 540 gcctctatta gctgtcgctc ctcccaatca attgtgcata gcaatggaaa tacctacctt 600 gaatggtatc tccaaaagcc cgggcagagt cctcaacttc tcatctacaa agtatccaat 660 cgattcagtg gcgttcctga caggttcagc ggaagtgggt cagggaccga ttttaccctc 720 aaaattagtc gcgtcgaagc tgaggatgtt ggggtgtatt actgcttcca agggtcacac 780 gtaccacgca cattcggggg aggcacgaag gttgaaatta ag 822 <210> 143 <211> 822 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 143 atggatttcc aagtccaaat attcagtttc cttttgataa gtgcttcagt 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110 Ser Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Asp Val Leu Met Thr 130 135 140 Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Val Ser Ile 145 150 155 160 Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr 165 170 175 Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 180 185 190 Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 195 200 205 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala 210 215 220 Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg 225 230 235 240 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Leu Glu Gln Lys Leu 245 250 255 Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Arg Ile Arg Gly Val Thr Val Ser Ser 260 265 270 Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val Phe 275 280 285 Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro 290 295 300 Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys 305 310 315 320 Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Pro Phe 325 330 335 Gly Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser 340 345 350 Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg 355 360 365 Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro 370 375 380 Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe 385 390 395 400 Ala Ala Tyr Arg Ser Leu Glu Arg Val Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser 405 410 415 Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu 420 425 430 Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg 435 440 445 Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln 450 455 460 Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr 465 470 475 480 Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp 485 490 495 Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala 500 505 510 Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 515 520 <210> 195 <211> 544 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 195 Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Ile Met Ser Arg Ala Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro 20 25 30 Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser 35 40 45 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr His Ile Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro 50 55 60 Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser 65 70 75 80 Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp 85 90 95 Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Leu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu 100 105 110 Asp Ser Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met 115 120 125 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Val Asp Ser 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 145 150 155 160 Thr Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser 165 170 175 Leu Gly Asp Gln Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val 180 185 190 His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly 195 200 205 Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly 210 215 220 Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 225 230 235 240 Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe 245 250 255 Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 260 265 270 Ile Lys Leu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Arg Ile 275 280 285 Arg Gly Val Thr Val Ser Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe 290 295 300 Ser His Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro 305 310 315 320 Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu 325 330 335 Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His 340 345 350 Thr Arg Gly Leu Asp Pro Phe Gly Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly 355 360 365 Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile 370 375 380 Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met 385 390 395 400 Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro 405 410 415 Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Leu Glu Arg Val 420 425 430 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 435 440 445 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 450 455 460 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 465 470 475 480 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 485 490 495 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 500 505 510 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 515 520 525 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 530 535 540 <210> 196 <211> 1635 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 196 atggacttcc aggtgcagat cttcagcttc ctgctgatca gcgccagcgt gatcatgagc 60 cgcgctagcc aggtgcagct gcagcagagc ggccccgagc tggtgaagcc cggcgccagc 120 gtgaagatga gctgcaaggc cagcggctac accttcacca gctaccacat ccagtgggtg 180 aagcagcgcc ccggccaggg cctggagtgg atcggctgga tctaccccgg cgacggcagc 240 acccagtaca acgagaagtt caagggcaag accaccctga ccgccgacaa gagcagcagc 300 accgcctaca tgctgctgag cagcctgacc agcgaggaca gcgccatcta cttctgcgcc 360 cgcgagggca cctactacgc catggactac tggggccagg gcaccagcgt gaccgtgagc 420 agcgtcgaca gcagcggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc 480 actagtgacg tgctgatgac ccagaccccc ctgagcctgc ccgtgagcct gggcgaccag 540 gtgagcatca gctgccgcag cagccagagc atcgtgcaca gcaacggcaa cacctacctg 600 gagtggtacc tgcagaagcc cggccagagc cccaagctgc tgatctacaa ggtgagcaac 660 cgcttcagcg gcgtgcccga ccgcttcagc ggcagcggca gcggcaccga cttcaccctg 720 aagatcagcc gcgtggaggc cgaggacctg ggcgtgtact actgcttcca gggcagccac 780 gtgccccgca ccttcggcgg cggcaccaag ctggagatca agctcgagca gaagctgatc 840 agcgaggagg acctgaaccg gatccgtggg gtcaccgtct cttcagcgct gagcaactcc 900 atcatgtact tcagccactt cgtgccggtc ttcctgccag cgaagcccac cacgacgcca 960 gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca 1020 gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca gtgcacacga gggggctgga cccctttggg 1080 ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 1140 gcctttatta ttttctgggt gaggagtaag aggagcaggc tcctgcacag tgactacatg 1200 aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc cgcaagcatt accagcccta tgccccacca 1260 cgcgacttcg cagcctatcg ctccctcgag agagtgagag tgaagttcag caggagcgca 1320 gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac cagctctata acgagctcaa tctaggacga 1380 agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga cgtggccggg accctgagat ggggggaaag 1440 ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg 1500 gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc 1560 ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag gacacctacg acgcccttca catgcaggcc 1620 ctgccccctc gctaa 1635 <210> 197 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 197 ttttctagac gcgtgccacc atggccgtca tggcgcc 37 <210> 198 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 198 aagtcgacgc tagctcacac tttacaagct gtgagagaca 40 <210> 199 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 199 tcaacccgat tgtccaccat 20 <210> 200 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 200 gagtttagtc cgaaatgagg ctg 23 <210> 201 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 201 tccaaagatg tagccgcccc a 21 <210> 202 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 202 ccagtgcctc tttgctgctt tca 23 <210> 203 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 203 ctgagctcgc cagtgaaatg atg 23 <210> 204 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 204 tgctgtagtg gtggtcggag a 21 <210> 205 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 205 acctgcctta agagtggagc ca 22 <210> 206 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 206 acatgtcgca cgtctctgat ga 22 <210> 207 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 207 tgcccagagc atccaaaaga 20 <210> 208 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 208 tgtattgctt tgcgttggac 20 <210> 209 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 209 aggcgctccc caagaagaca 20 <210> 210 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 210 gggctgatta gagagaggtc cct 23 <210> 211 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 211 caagacggac cagagcgaaa 20 <210> 212 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 212 ggcgggtcat gggaataac 19 <210> 213 <211> 468 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 213 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 His Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu 130 135 140 Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln 145 150 155 160 Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln 165 170 175 Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg 180 185 190 Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 195 200 205 Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr 210 215 220 Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr 225 230 235 240 Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr 245 250 255 Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala 260 265 270 Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe 275 280 285 Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val 290 295 300 Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Ser Lys Arg Ser 305 310 315 320 Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly 325 330 335 Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala 340 345 350 Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala 355 360 365 Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg 370 375 380 Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu 385 390 395 400 Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn 405 410 415 Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met 420 425 430 Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly 435 440 445 Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala 450 455 460 Leu Pro Pro Arg 465 <210> 214 <211> 1470 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 214 atggctctgc ctgtgacagc tctgctgctg cctctggctc tgcttcttca tgccgccaga 60 ccatctcagg tccagctagt acaaagcggc gccgaagtaa agaaacctgg tgcctctgtg 120 aaggtgagct gcaaggccag cggctacacc ttcaccagct accacatcca gtgggttcga 180 caggcccctg gacagagact agagtggatg ggctggatct atcctggcga cggcagcacc 240 cagtacaacg agaagttcaa gggcagagtt accatcaccc gagacaccag cgccagcaca 300 gcctatatgg agctgagcag cctgcgaagc gaggacacag ctgtttacta ttgtgccaga 360 gagggcacct actacgcaat ggattattgg ggccagggga ccaccgtgac cgtttcttct 420 ggaggcggag gttctggcgg cggaggaagt ggtggcggag gctcagatat tgtaatgacc 480 cagacacctc tgtccctgtc tgtgacacct ggacagcctg caagcatcag ctgtcggagc 540 agccagagca tcgttcacag caacggcaac acctacctgg aatggtatct gcagaagccc 600 ggacagtccc cccagctgct gatctacaag gtgtccaacc gcttcagtgg agtacccgat 660 agattttctg gcagcggctc tggcaccgac ttcaccctga agatctccag agtagaagca 720 gaggacgttg gagtgtacta ctgcttccaa ggcagccatg tgccaagaac ctttggtgga 780 ggcacaaagg tggaaatcaa gcggacaaca acacctgctc ctcggcctcc tacaccagct 840 cctacaattg ccagccagcc actgtctctg aggcccgaag cttgcaggcc tgctgctggc 900 ggagccgtgc atacaagagg actggatttc gcctgcgaca tctacatctg ggcacctctg 960 gctggaacct gtggcgtgct gctgctgagc ctggtcatca ccctgtattg ccggagcaag 1020 agaagcagac tgctgcacag cgactacatg aacatgaccc ctagacggcc cggacctacc 1080 agaaagcact accagcctta cgctcctcct agagacttcg ccgcctacag atccagagtg 1140 aagttcagca gatccgccga cgctcctgcc tatcagcagg gccaaaacca gctctacaac 1200 gagctgaacc tggggagaag agaagagtac gacgtgctgg acaagcggag aggcagagat 1260 cctgaaatgg gcggcaagcc cagacggaag aatcctcaag agggcctgta taatgagcta 1320 cagaaagaca agatggcaga ggcctacagc gagatcggaa tgaagggcga gcgcagaaga 1380 ggcaagggac acgatggact gtaccagggc ctgagcaccg ccaccaagga tacctatgat 1440 gccctgcaca tgcaggccct gcctccaaga 1470 <210> 215 <211> 126 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 215 aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60 actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120 gaactg 126 <210> 216 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 216 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 <210> 217 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 217 accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60 tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120 gacttcgcct gtgat 135 <210> 218 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 218 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 15 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr 35 40 45 <210> 219 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 219 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 15 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 35 40 45 <210> 220 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 220 acaacaacac ctgctcctcg gcctcctaca ccagctccta caattgccag ccagccactg 60 tctctgaggc ccgaagcttg caggcctgct gctggcggag ccgtgcatac aagaggactg 120 gatttcgcct gcgac 135 <210> 221 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 221 Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Val Ile Thr Leu Tyr Cys 20 <210> 222 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 222 atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60 accctttact gc 72 <210> 223 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 223 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys 20 <210> 224 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 224 atctacatct gggcacctct ggctggaacc tgtggcgtgc tgctgctgag cctggtcatc 60 accctgtatt gc 72

Claims (62)

  1. 인간화 항-HLA-A2 항체로서, 상기 항체는 키메라 항원 수용체 (CAR)의 항원 결합 도메인을 구성할 수 있고, 상기 CAR은 인간 세포에서 발현될 수 있음으로써, 상기 CAR이 HLA-A2에 특이적으로 결합하는 인간화 항-HLA-A2 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체는 HLA-A2와 결합하기 위해,
    SEQ ID NO: 183의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HCDR1);
    SEQ ID NO: 185의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HCDR2);
    SEQ ID NO: 187의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HCDR3);
    SEQ ID NO: 188의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LCDR1);
    SEQ ID NO: 189의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LCDR2); 및
    SEQ ID NO: 190의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LCDR3),
    을 포함하는 항체와 경쟁하는, 인간화 항-HLA-A2 항체.
  3. 인간화 항-HLA-A2 항체로서, 상기 항체는 HLA-A2와 결합하기 위해,
    SEQ ID NO: 183의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HCDR1);
    SEQ ID NO: 185의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HCDR2);
    SEQ ID NO: 187의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HCDR3);
    SEQ ID NO: 188의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LCDR1);
    SEQ ID NO: 189의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LCDR2); 및
    SEQ ID NO: 190의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LCDR3),
    을 포함하는 항체와 경쟁하는, 인간화 항-HLA-A2 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는
    SEQ ID NO: 183의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HCDR1);
    SEQ ID NO: 185의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (HCDR2);
    SEQ ID NO: 187의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (HCDR3);
    SEQ ID NO: 188의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LCDR1);
    SEQ ID NO: 189의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (LCDR2); 및
    SEQ ID NO: 190의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (LCDR3),
    을 포함하는 항체와 동일한 HLA-A2 에피토프에 결합하는, 인간화 항-HLA-A2 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30 중 하나 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작은, 인간화 항-HLA-A2 항체.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 BB7.2 scFv와 비교하여, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30 중 하나 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작은, 인간화 항-HLA-A2 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 SYHIQ (SEQ ID NO: 1) 및 GYTFTSY (SEQ ID NO: 2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 인간화 항-HLA-A2 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 YPGDGS (SEQ ID NO: 4) 및 WIYPGDGSTX10YX12X13KFX16G (SEQ ID NO: 10) (여기서 X10은 Q 또는 K이고, X12는 N 또는 S이고, X13은 E 또는 Q이고, X16은 K 또는 Q임)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 인간화 항-HLA-A2 항체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 항체는 WIYPGDGSTQYNEKFKG (SEQ ID NO: 3) 및 YPGDGS (SEQ ID NO: 4)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 인간화 항-HLA-A2 항체.
  10. 제8항에 있어서, 상기 항체는 아미노산 서열 WIYPGDGSTKYSQKFQG (SEQ ID NO: 5)를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 인간화 항-HLA-A2 항체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 아미노산 서열 EGTYYAMDY (SEQ ID NO: 6)를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 인간화 항-HLA-A2 항체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 아미노산 서열 RSSQSIVHSNGNTYLE (SEQ ID NO: 7)를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간화 항-HLA-A2 항체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 아미노산 서열 KVSNRFS (SEQ ID NO: 8)를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간화 항-HLA-A2 항체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 아미노산 서열 FQGSHVPRT (SEQ ID NO: 9)를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간화 항-HLA-A2 항체.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는
    QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS (SEQ ID NO: 11) 및
    QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 12)
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 1 (VH FR1)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 인간화 항-HLA-A2 항체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는
    WVRQAPGQX9LEWMGX15 (SEQ ID NO: 13),
    WVRQAPGQX9LEWMGX15WI (SEQ ID NO: 17),
    HIQWVRQAPGQX12LEWMGX18WI (SEQ ID NO: 21), 및
    HIQWVRQAPGQX12LEWMGX18 (SEQ ID NO: 25)
    (SEQ ID NO: 13에서 X9는 R 또는 G이고, X15는 I 또는 부재하고;
    SEQ ID NO: 17에서 X9는 R 또는 G이고, X15는 I 또는 부재하고;
    SEQ ID NO: 21에서 X12는 R 또는 G이고, X18은 I 또는 부재하고;
    SEQ ID NO: 25에서 X12는 R 또는 G이고, X18은 I 또는 부재함)
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 2 (VH FR2)를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 인간화 항-HLA-A2 항체.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는
    X1VTX4TX6DTSX10STAYMX16LSX19LRSX23DX25AVYYCAR (SEQ ID NO: 29),
    TX2YX4X5KFX8GX10VTX13TX15DTSX19STAYMX25LSX28LRSX32DX34AVYYCAR (SEQ ID NO: 35),
    TQYNEKFKGX10VTX13TX15DTSX19STAYMX25LSX28LRSX32DX34AVYYCAR (SEQ ID NO: 36), 및
    TKYSQKFQGX10VTX13TX15DTSX19STAYMX25LSX28LRSX32DX34AVYYCAR (SEQ ID NO: 37),
    (SEQ ID NO: 29에서 X1은 R 또는 부재하고, X4는 I 또는 M이고, X6은 R 또는 A이고, X10은 A, T 또는 I이고, X16은 E 또는 L이고, X19는 S 또는 R이고, X23은 E 또는 D이고, X25는 T 또는 M이고;
    SEQ ID NO: 35에서 X2는 Q 또는 K이고, X4는 N 또는 S이고, X5는 E 또는 Q이고, X8은 K 또는 Q이고, X10은 R 또는 부재하고, X13은 I 또는 M이고, X15는 R 또는 A이고, X19는 A, T 또는 I이고, X25는 E 또는 L이고, X28은 S 또는 R이고, X32는 E 또는 D이고, X34는 T 또는 M이고;
    SEQ ID NO: 36에서 X10은 R 또는 부재하고, X13은 I 또는 M이고, X15는 R 또는 A이고, X19는 A, T 또는 I이고, X25는 E 또는 L이고, X28은 S 또는 R이고, X32는 E 또는 D이고, X34는 T 또는 M이고;
    SEQ ID NO: 37에서 X10은 R 또는 부재하고, X13은 I 또는 M이고, X15는 R 또는 A이고, X19는 A, T 또는 I이고, X25는 E 또는 L이고, X28은 S 또는 R이고, X32는 E 또는 D이고, X34는 T 또는 M임)
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크 영역 3 (VH FR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 인간화 항-HLA-A2 항체.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 아미노산 서열 WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 44)를 포함하는 프레임워크 영역 4 (VH FR4)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 인간화 항-HLA-A2 항체.
  19. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 SEQ ID NO: 61 내지 66으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 인간화 항-HLA-A2 항체.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 아미노산 서열 DX2VMTQX7PLSX11X12VTX15GQPASISX23 (SEQ ID NO: 46) (X2는 V 또는 I이고, X7은 S 또는 T이고, X11은 L 또는 S이고, X12는 P 또는 S이고, X15는 L 또는 P이고, X23은 C 또는 F임)를 포함하는 프레임워크 영역 1 (VL FR1)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간화 항-HLA-A2 항체.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 아미노산 서열 WX2X3QX5PGQX9PX11X12LIY (SEQ ID NO: 51) (X2는 F 또는 Y이고, X3은 Q 또는 L이고, X5는 R 또는 K이고, X9는 S 또는 P이고, X11은 R 또는 Q이고, X12는 R 또는 L임)를 포함하는 프레임워크 영역 2 (VL FR2)를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간화 항-HLA-A2 항체.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 아미노산 서열 GVPDRFSGSGX11GTDFTLKISRVEAEDVGVYYC (SEQ ID NO: 56) (X11은 S 또는 A임)를 포함하는 프레임워크 영역 3 (VL FR3)을 포함하는 프레임워크 영역 2 (VL FR2)를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간화 항-HLA-A2 항체.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 아미노산 서열 FGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 59)를 포함하는 프레임워크 영역 4 (VL FR4)를 포함하는 프레임워크 영역 2 (VL FR2)를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간화 항-HLA-A2 항체.
  24. 제1항 내지 제6항 및 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 SEQ ID NO: 67 내지 71로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간화 항-HLA-A2 항체.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 scFv인, 인간화 항-HLA-A2 항체.
  26. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 SEQ ID NO: 72 내지 91로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 scFv인, 인간화 항-HLA-A2 항체.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 세포는 면역 세포인, 인간화 항-HLA-A2 항체.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 키메라 항원 수용체 (CAR)의 항원 결합 도메인을 구성할 수 있고, 상기 CAR은 T 조절 세포 (Treg)에서 발현될 수 있음으로써, 상기 CAR이 HLA-A2에 특이적으로 결합하는, 인간화 항-HLA-A2 항체.
  29. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 키메라 항원 수용체 (CAR)의 항원 결합 도메인을 구성할 수 있고, 상기 CAR은 면역 세포에서 발현될 수 있음으로써, 상기 면역 세포가 HLA-A2에 의해 활성화되는, 인간화 항-HLA-A2 항체.
  30. 제29항에 있어서, 상기 면역 세포는 T 조절 세포 (Treg)인, 인간화 항-HLA-A2 항체.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항의 인간화 항-HLA-A2 항체를 인코딩하는 핵산.
  32. 제31항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  33. 제32항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  34. 키메라 항원 수용체 (CAR)로서,
    (i) 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 인간화 항-HLA-A2 항체를 포함하는 세포외 도메인;
    (ii) 막관통 도메인; 및
    (iii) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 도메인
    을 포함하고;
    상기 CAR이 면역 세포에서 발현될 수 있음으로써, 상기 CAR이 HLA-A2에 특이적으로 결합하는, 키메라 항원 수용체 (CAR).
  35. 제34항에 있어서, 상기 CAR은 BB7.2 항체와 비교하여, HLA-A*25, HLA-A*29, HLA-A*30 중 하나 이상으로부터 선택되는 적어도 하나의 HLA-A 하위유형에 대한 반응성이 더 작은, CAR.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 CAR은 면역 세포에서 발현될 수 있음으로써, 상기 면역 세포가 HLA-A2에 의해 활성화되는, CAR.
  37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포는 T 조절 세포 (Treg)인, CAR.
  38. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 힌지 영역을 추가로 포함하는, CAR.
  39. 제38항에 있어서, 상기 힌지 영역은 CD8α의 줄기 영역을 포함하는, CAR.
  40. 제34항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막관통 도메인은 CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD3 제타, T 세포 수용체의 알파 사슬, T 세포 수용체의 베타 사슬, T 세포 수용체의 감마 사슬, T 세포 수용체의 델타 사슬, CD28, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 막관통 도메인을 포함하는, CAR.
  41. 제40항에 있어서, 상기 막관통 도메인은 CD28의 막관통 도메인을 포함하는, CAR.
  42. 제34항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD3 제타, FcR 감마, FcR 알파, FcR 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 기능성 신호전달 도메인을 포함하는, CAR.
  43. 제42항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타의 기능성 신호전달 도메인을 포함하는, CAR.
  44. 제34항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 공자극 도메인을 추가로 포함하는, CAR.
  45. 제44항에 있어서, 상기 공자극 도메인은 OX40, CD27, CD28, 림프구 기능-관련 항원-1 (LFA-1) (CD11a/CD18), TNFR1 (CD120a/TNFRSF1A), TNFR2 (CD120b/TNFRSF1B), CTLA-4 (CD152), CD95, ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), CD2, CD30, CD40, PD-1, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, ICAM-1, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, IL2ra (CD25), IL6Ra (CD126), IL-7Ra (CD127), IL-13RA1, IL-13RA2, IL-33R(IL1RL1), IL-10RA, IL-10RB, IL-4R, IL-5R (CSF2RB), ARHR, BAFF 수용체, IL-21R, TGFbR1, TGFbR2, TGFbR3, 공통 감마 사슬, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 기능성 신호전달 도메인을 포함하는, CAR.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, 상기 공자극 도메인은 CD28 및 4-1BB로부터 선택되는 단백질의 기능성 신호전달 도메인을 포함하는, CAR.
  47. 제46항에 있어서, 상기 공자극 도메인은 CD28의 기능성 신호전달 도메인을 포함하는, CAR.
  48. 제34항 내지 제47항 중 어느 한 항에 따른 CAR을 포함하는 변형된 면역 세포.
  49. 제48항에 있어서, 상기 변형된 면역 세포는 T 조절 세포 (Treg)인, 변형된 면역 세포.
  50. 제34항 내지 제47항 중 어느 한 항에 따른 CAR을 인코딩하는 핵산.
  51. 제50항에 따른 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  52. 제51항에 따른 발현 벡터를 포함하는 면역 세포.
  53. 제52항에 있어서, 상기 면역 세포는 T 조절 세포 (Treg)인, 면역 세포.
  54. 제48항 또는 제49항에 따른 복수의 변형된 면역 세포를 포함하는 약제학적 조성물.
  55. 제52항 또는 제53항에 따른 복수의 면역 세포를 포함하는 약제학적 조성물.
  56. 제48항 또는 제49항에 따른 변형된 면역 세포를 제조하는 방법으로서, 제51항에 따른 발현 벡터로 면역 세포를 형질도입시킴으로써, 상기 변형된 면역 세포를 생성하는 단계를 포함하는 방법.
  57. 대상체에서 면역 내성을 촉진하는 방법으로서, 상기 방법은 제54항 또는 제55항에 따른 약제학적 조성물을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 면역 내성은 이식된 장기 또는 조직에 대한 내성인, 방법.
  59. 대상체에서 이식편대숙주병 (GVHD)을 예방 또는 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 제54항 또는 제55항에 따른 약제학적 조성물을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  60. 제59항에 있어서, 상기 대상체는 조혈 줄기세포 이식이 진행 중이거나, 진행된 적이 있는, 방법.
  61. 대상체에서 장기 또는 조직 이식 거부를 예방 또는 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 제54항 또는 제55항에 따른 약제학적 조성물을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  62. 제57항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 인간인, 방법.
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