CN115427084A - 用于自身免疫调节的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的重组核酸、表达所编码的分子的经修饰的人免疫细胞以及使用其治疗包括自身免疫性疾病在内的疾病的方法。

Description

用于自身免疫调节的组合物和方法
交叉引用
本申请要求2020年1月10日提交的美国临时专利申请第62/959,794号和2020年10月21日提交的美国临时专利申请第63/094,590号的权益，所述临时专利申请的每一个通过引用整体并入本文。
技术背景
调节性T细胞(Treg)可以是免疫系统稳态的核心，并在维持对自身抗原的耐受性和调节对外来抗原的免疫反应中起主要作用。多种自身免疫性和炎性疾病(包括1型糖尿病(T1D)、系统性红斑狼疮(SLE)和移植物抗宿主病(GVHD))已经显示缺乏Treg细胞数量或Treg功能。
Treg的免疫抑制特性使其成为用于细胞疗法，特别是用于在诸如造血干细胞移植(HSCT)、实体器官移植和自身免疫等情况下的应用的有吸引力的候选物。
发明内容
本文认识到需要能够增强调节性T细胞(Treg)数量和功能的自身免疫性疾病疗法。
一方面，本公开提供了药物组合物，其包含(I)来自人受试者的调节性T细胞(Treg)，其中调节性T细胞包含：(a)编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的重组核酸分子，其包含：(i)TCR整合亚基，其包含：(1)胞外结构域，(2)TCR跨膜结构域，和(3)TCR胞内结构域，其包含来自胞内信号传导结构域的刺激结构域；(ii)结合结构域；和(II)药学上可接受的载体；其中TCR整合亚基与结合结构域可操作地连接；并且其中当在T细胞中表达时，所述TFP与内源性TCR功能性相互作用。
在一些实施方案中，结合结构域选自：抗原结合结构域；T细胞受体配体，例如肽-MHC复合物；或T细胞受体模拟物，例如结合肽-MHC复合物的T细胞受体模拟物。
在一些实施方案中，Treg还包含刺激和/或稳定Treg形成的基因。在一些实施方案中，刺激和/或稳定Treg形成的基因由与编码所述TFP的重组核酸分子相同的重组核酸分子编码。在一些实施方案中，刺激和/或稳定Treg形成的基因由与编码所述TFP的重组核酸分子不同的重组核酸分子编码。在一些实施方案中，刺激和/或稳定Treg形成的基因是FOXP3、HELIOS、BACH2或pSTAT5。在一些实施方案中，Treg还包含开关受体。
在一些实施方案中，开关受体由与编码所述TFP的重组核酸分子相同的重组核酸分子编码。在一些实施方案中，开关受体由与编码所述TFP的重组核酸分子不同的重组核酸分子编码。在一些实施方案中，开关受体是IL7-IL2开关受体、IL7-IL10开关受体或TNF-α-IL2开关受体。在一些实施方案中，Treg包含多于一种刺激和/或稳定Treg形成的基因和/或多于一种开关受体。在一些实施方案中，Treg细胞中PKCθ、STUB1和CCAR2中的一种或多种的表达被减少或消除。
在一些实施方案中，CDK8和CDK19中的一种或多种的表达减少、缺失或在药理学上抑制稳定的Treg形成。
在一些实施方案中，肽-MHC复合物的肽是自身抗原或其片段。在一些实施方案中，肽-MHC复合物的肽是外源性抗原或其片段。在一些实施方案中，结合结构域包含抗原结合结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括自身抗原结合结构域或外源性抗原结合结构域。在一些实施方案中，自身抗原结合结构域特异性结合自身抗原。在一些实施方案中，外源性抗原结合结构域特异性结合外源性抗原。在一些实施方案中，自身抗原是胰岛葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白(IGRP)、胰岛素、HLA-A2、髓磷脂或α-麦醇溶蛋白或其片段中的一种或多种。在一些实施方案中，外源性抗原是FVIII或治疗性大分子，例如治疗性多肽或其片段。在一些实施方案中，抗原结合结构域结合细胞膜相关抗原。在一些实施方案中，抗原结合结构域结合循环抗原。在一些实施方案中，抗原结合结构域对胰岛细胞上的抗原具有特异性。在一些实施方案中，抗原结合结构域是抗体。在一些实施方案中，抗体是scFv或单结构域抗体。在一些实施方案中，抗体是人的或人源化的。在一些实施方案中，结合结构域是TCR模拟物，例如特异性结合肽-MHC复合物。
在一些实施方案中，相对于具有不含TFP的Treg的药物组合物，所述药物组合物减少具有抗原、MHC-肽复合物或特异性结合所述MHC-肽复合物的T细胞受体的效应T细胞的细胞因子产生。
在一些实施方案中，Treg是CD4+CD25+FoxP3+ Treg或CD8+调节性T细胞。
在一些实施方案中，胞内信号传导结构域选自CD3γ、CD3δ、CD3ε和CD3ζ。在一些实施方案中，TCR整合亚基包含(i)TCR胞外结构域、(ii)TCR跨膜结构域和(iii)TCR胞内结构域，其中(i)、(ii)和(iii)中的至少两者来自相同的TCR亚基。在一些实施方案中，编码的结合结构域通过接头序列与TCR胞外结构域连接。在一些实施方案中，编码的接头序列包含(G4S)n，其中n＝1至4。
在一些实施方案中，TFP包括TCR亚基的胞外结构域，所述胞外结构域包含选自由以下组成的组的蛋白质的胞外结构域或其部分：TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基，其功能性片段，及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码的TFP包括跨膜结构域，所述跨膜结构域包含选自由以下组成的组的蛋白质的跨膜结构域：TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、CD3ζTCR亚基，其功能性片段，及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。
在一些实施方案中，TFP包括TCR亚基的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)，所述基于免疫受体酪氨酸的激活基序包含选自由以下组成的组的蛋白质的ITAM或其部分：CD3ζTCR亚基、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、Fcε受体1链、Fcε受体2链、Fcγ受体1链、Fcγ受体2a链、Fcγ受体2b1链、Fcγ受体2b2链、Fcγ受体3a链、Fcγ受体3b链、Fcβ受体1链、TYROBP(DAP12)、CD5、CD16a、CD16b、CD22、CD23、CD32、CD64、CD79a、CD79b、CD89、CD278、CD66d，其功能性片段，及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，ITAM替代CD3γ、CD3δ或CD3ε的ITAM。
另一方面，本公开提供了编码本文所述TFP的重组核酸分子。在一些实施方案中，核酸选自由DNA和RNA组成的组。在一些实施方案中，核酸是mRNA。在一些实施方案中，核酸是环状RNA(circRNA)。
在一些实施方案中，重组核酸分子包含核酸类似物，其中核酸类似物不在重组核酸的编码序列中。在一些实施方案中，重组核酸分子还包含前导序列。在一些实施方案中，重组核酸分子还包含启动子序列。在一些实施方案中，重组核酸分子还包含编码poly(A)尾的序列。在一些实施方案中，重组核酸分子还包含3’UTR序列。在一些实施方案中，核酸是分离的核酸或非天然存在的核酸。在一些实施方案中，核酸是体外转录的核酸。
另一方面，本公开提供了包含本文所述重组核酸分子的载体。在一些实施方案中，载体选自由以下组成的组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)载体或逆转录病毒载体。在一些实施方案中，载体是体外转录的载体。
另一方面，本公开提供了包含本文所述重组核酸分子的环状RNA。
另一方面，本公开提供了治疗或预防疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的药物组合物。在一些实施方案中，疾病或病症是自身免疫性疾病。在一些实施方案中，自身免疫性疾病是自身抗体介导的自身免疫性疾病。在一些实施方案中，自身免疫性疾病选自由以下组成的组：多发性硬化、自身免疫性溶血性贫血、乳糜泻和慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病。在一些实施方案中，疾病或病症是炎症，例如炎性疾病或病症、过敏反应或移植排斥。
另一方面，本公开提供了用于治疗或预防有需要的受试者的疾病或病症的组合物，其包括向受试者有效量的本文所述的药物组合物。在一些实施方案中，疾病或病症是自身免疫性疾病。在一些实施方案中，疾病或病症是炎症，例如炎性疾病或病症、过敏反应或移植排斥。在一些实施方案中，受试者患有自身免疫疾病、炎症例如炎性疾病或病症、过敏反应或移植排斥或者有发展自身免疫性疾病、炎症例如炎性疾病或病症、过敏反应或移植排斥的风险。
另一方面，本公开提供了来自人受试者的调节性T细胞(Treg)，其中调节性T细胞包含重组核酸，所述重组核酸包含编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的序列，所述TFP包含：
(i)TCR整合亚基，其包含：(1)TCR胞外结构域的至少一部分，和(2)TCR跨膜结构域，和(ii)结合结构域；其中所述TCR整合亚基与所述结合结构域可操作地连接；并且其中当在T细胞中表达时，所述TFP与内源性TCR功能性相互作用。
在一些实施方案中，TFP还包含TCR胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，结合结构域选自：抗原结合结构域：T细胞受体配体，例如肽-MHC复合物；或T细胞受体模拟物，例如结合所述肽-MHC复合物的T细胞受体模拟物。在一些实施方案中，Treg还包含刺激和/或稳定Treg形成的基因。在一些实施方案中，刺激和/或稳定Treg形成的基因由与编码TFP的重组核酸分子相同的重组核酸分子编码。在一些实施方案中，刺激和/或稳定Treg形成的基因由与编码TFP的重组核酸分子不同的重组核酸分子编码。在一些实施方案中，刺激和/或稳定Treg形成的基因是FOXP3、HELIOS、BACH2或pSTAT5。在一些实施方案中，Treg还包含开关受体。在一些实施方案中，开关受体由与编码所述TFP的重组核酸分子相同的重组核酸分子编码。在一些实施方案中，开关受体由与编码所述TFP的重组核酸分子不同的重组核酸分子编码。在一些实施方案中，开关受体是IL7-IL2开关受体、IL7-IL10开关受体或TNF-α-IL2开关受体。
在一些实施方案中，Treg包含多于一种刺激和/或稳定Treg形成的基因和/或多于一种开关受体。在一些实施方案中，Treg细胞中PKCθ、STUB1和CCAR2中的一种或多种的表达被减少或消除。在一些实施方案中，CDK8和CDK19中的一种或多种的表达减少、缺失或在药理学上抑制稳定的Treg形成。
在一些实施方案中，肽-MHC复合物的肽是自身抗原或其片段。在一些实施方案中，肽-MHC复合物的肽是外源性抗原或其片段。在一些实施方案中，结合结构域包含抗原结合结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括自身抗原结合结构域或外源性抗原结合结构域。在一些实施方案中，自身抗原结合结构域特异性结合自身抗原。
在一些实施方案中，外源性抗原结合结构域特异性结合外源性抗原。在一些实施方案中，自身抗原是胰岛葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白(IGRP)、胰岛素、HLA-A2、髓磷脂或α-麦醇溶蛋白或其片段中的一种或多种。在一些实施方案中，外源性抗原是FVIII或治疗性大分子，例如治疗性多肽或其片段。
在一些实施方案中，抗原结合结构域结合细胞膜相关抗原。在一些实施方案中，抗原结合结构域结合循环抗原。在一些实施方案中，抗原结合结构域对胰岛细胞上的抗原具有特异性。在一些实施方案中，抗原结合结构域是抗体或其功能性片段。在一些实施方案中，抗体或其功能性片段是scFv或单结构域抗体。在一些实施方案中，抗体或其功能性片段是人的或人源化的。在一些实施方案中，结合结构域是TCR模拟物，例如特异性结合肽-MHC复合物。
在一些实施方案中，相对于具有不含TFP的Treg的调节性T细胞，所述调节性T细胞减少具有抗原、MHC-肽复合物或特异性结合MHC-肽复合物的T细胞受体的所述效应T细胞的细胞因子产生。在一些实施方案中，Treg是CD4+CD25+FoxP3+ Treg或CD8+调节性T细胞。
在一些实施方案中，胞内信号传导结构域选自由以下组成的组：CD3γ、CD3δ、CD3ε和CD3ζ。在一些实施方案中，TCR整合亚基包含(i)TCR胞外结构域、(ii)TCR跨膜结构域和(iii)TCR胞内结构域，其中(i)、(ii)和(iii)中的至少两者或三者来自相同的TCR亚基。
在一些实施方案中，结合结构域通过接头序列与所述TCR胞外结构域可操作地连接。在一些实施方案中，接头序列包含(G4S)n，其中n＝1至4。
在一些实施方案中，TFP包含TCR亚基的胞外结构域，所述胞外结构域包含选自由以下组成的组的蛋白质的胞外结构域或其部分：TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基及其功能性片段。
在一些实施方案中，TFP包括跨膜结构域，所述跨膜结构域包含选自由以下组成的组的蛋白质的跨膜结构域：TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基，及其功能性片段。
在一些实施方案中，TFP包括选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基和CD3δTCR亚基组成的组的蛋白质的TCR胞内结构域。
在一些实施方案中，TFP包含TCR亚基的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)，所述基于免疫受体酪氨酸的激活基序包含选自由以下组成的组的蛋白质的ITAM或其部分：CD3ζTCR亚基、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、Fcε受体1链、Fcε受体2链、Fcγ受体1链、Fcγ受体2a链、Fcγ受体2b1链、Fcγ受体2b2链、Fcγ受体3a链、Fcγ受体3b链、Fcβ受体1链、TYROBP(DAP12)、CD5、CD16a、CD16b、CD22、CD23、CD32、CD64、CD79a、CD79b、CD89、CD278、CD66d及其功能性片段。在一些实施方案中，ITAM替代CD3γ、CD3δ或CD3ε的ITAM。在一些实施方案中，Treg是自体的。在一些实施方案中，Treg是同种异体的。
另一方面，本公开提供了包含本文所述的调节性T细胞和药学上可接受的载体的药物组合物。
另一方面，本公开提供了重组核酸，其包含编码本文所述调节性T细胞的TFP的序列。在一些实施方案中，核酸选自由DNA和RNA组成的组。在一些实施方案中，核酸是mRNA。在一些实施方案中，核酸是环状RNA。在一些实施方案中，重组核酸包含核酸类似物，其中所述核酸类似物不在重组核酸的编码序列中。在一些实施方案中，重组核酸还包含前导序列。在一些实施方案中，重组核酸还包含启动子序列。在一些实施方案中，重组核酸还包含编码poly(A)尾的序列。在一些实施方案中，重组核酸还包含3’UTR序列。在一些实施方案中，核酸是分离的核酸或非天然存在的核酸。在一些实施方案中，核酸是体外转录的核酸。
另一方面，本公开提供了包含本文所述重组核酸的载体。在一些实施方案中，载体选自由以下组成的组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体(AAV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)载体或逆转录病毒。在一些实施方案中，载体是体外转录的载体。
另一方面，本公开提供了包含本文所述重组核酸的环状RNA。
另一方面，本公开提供了治疗或预防疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的调节性T细胞。在一些实施方案中，疾病或病症是自身免疫性疾病。在一些实施方案中，自身免疫性疾病是自身抗体介导的自身免疫性疾病。在一些实施方案中，自身免疫性疾病选自由以下组成的组：多发性硬化、自身免疫性溶血性贫血、乳糜泻和慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病。在一些实施方案中，疾病或病症是炎症，例如炎性疾病或病症、过敏反应或移植排斥。
另一方面，本公开提供了用于治疗或预防有需要的受试者的疾病或病症的组合物，其包含本文所述的重组核酸或本文所述的调节性T细胞。在一些实施方案中，疾病或病症是自身免疫性疾病。在一些实施方案中，疾病或病症是炎症，例如炎性疾病或病症、过敏反应或移植排斥。在一些实施方案中，受试者患有自身免疫疾病、炎症例如炎性疾病或病症、过敏反应或移植排斥或者有发展自身免疫性疾病、炎症例如炎性疾病或病症、过敏反应或移植排斥的风险。
通过引用并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，其程度如同每个单独出版物、专利和专利申请具体地和单独地指出通过引用方并入。
附图说明
在所附权利要求中具体地阐述了本发明的新颖特征。通过参考以下阐述说明性实施方案的详细描述和附图(本文中也称为“图(Figure)”和“图(FIG.)”)，将获得对本发明的特征和有利方面的更好理解，在所述说明性实施方案中利用了本发明的原理，其中：
图1显示了识别一种或多种细胞膜相关自身抗原或循环自身抗原后，工程化的调节性T细胞(Treg)介导的T细胞反应的示意图。此处显示的Treg可以表达T细胞受体(TCR)融合蛋白，其包含靶向一种或多种细胞膜相关自身抗原或循环自身抗原的结合结构域。
图2显示了生产表达TFP的Treg的过程的示意图。
图3显示了用于分离Treg的过程的示意图。
图4显示了产生表达TFP的Treg和CD4+细胞的过程的示意图，以及显示当根据所示方案产生时，未经诱导的Treg、HLA-A2 TFP Treg、HLA-A2 TFP-2A-FoxP3 Treg、未经诱导的CD4+ T细胞、HLA-A2TFP CD4+T细胞和HLA-A2 TFP-2A-FoxP3 CD4+T细胞的扩增的图。
图5A和图5B是一系列显示未经诱导的Treg、HLA-A2 TFP Treg、HLA-A2 TFP-2A-FoxP3 Treg、HLA-A2 TFP CD4+T细胞和HLA-A2TFP-2A-FoxP3 CD4+T细胞中FoxP3、CD25、Helios和CD4的表达的曲线图。图5A显示了来自供体1的FoxP3、CD25和Helios细胞。图5B显示来自供体2的细胞中的FoxP3、CD25、Helios、CD4和CD25。
图6显示了不依赖于抗原的抑制测定的示意图。
图7A和图7B显示了一系列图表，所述图表显示了在图6所示的不依赖于抗原的抑制测定中，单独的或与未转导的Treg、HLA-A2TFP Treg、HLA-A2 TFP-2A-FoxP3 Treg或HLA-A2 TFP-2A-FoxP3CD4+T细胞混合的未经刺激的多克隆CD4+ T细胞和CD8+ T细胞、经刺激的多克隆CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的细胞因子表达。图7A显示了来自供体1的数据。图7B显示了来自供体2的数据。
图8A和图8B显示了一系列图表，所述图表显示了在图6所示的不依赖于抗原的抑制测定中，与未转导的Treg、HLA-A2 TFP Treg、HLA-A2 TFP-2A-FoxP3 Treg或HLA-A2 TFP-2A-FoxP3 CD4+ T细胞混合的经刺激的多克隆CD4+ T细胞、CD8+ T细胞CD3+ T细胞的扩增的抑制。图8A显示了来自供体1的数据。图8B显示了来自供体2的数据。
图9是一系列曲线图，所述曲线图显示了未转导的Treg、MH1TFP Treg、MH1 TFP-2A-FoxP3 Treg、未转导的CD4+ T细胞、MH1 TFP CD4+T细胞和MH1 TFP-2A-FoxP3 CD4+T细胞中MH1-TFP和CD4的表达。
图10是一系列曲线图，所述曲线图显示了MH1 TFP Treg、MH1TFP-2A-FoxP3 Treg、MH1 TFP CD4+T细胞和MH1 TFP-2A-FoxP3CD4+T细胞中FoxP3、CD25和Helios的表达。
图11显示了抗原依赖性抑制测定的示意图。
图12是一系列图表，所述图表显示了在图11所示的抗原依赖性抑制测定中，单独的MH1 TFP效应T细胞或仅与MSTO-msln细胞接触的MH1 TFP效应T细胞，或与MSTO-msln接触的并与MH1 TFP Treg、MH1 TFP-2A-FoxP3 Treg或/和MH1 TFP-2A-FoxP3 CD4+T细胞混合的MH1 TFP效应T细胞的细胞因子的表达。
图13是一系列图表，所述图表显示了在图11所示的抗原依赖性抑制测定中，与MSTO-msln细胞接触并与MH1 TFP Treg、MH1TFP-2A-FoxP3 Treg或/或MH1 TFP-2A-FoxP3CD4+T细胞混合的MH1 TFP效应T细胞的扩增的抑制。
图14显示了使用HLA-A2 TFP调节性T细胞的抗原依赖性抑制测定(例如，混合淋巴细胞反应或MLR)的示意图。
图15是一系列图表，所述图表显示了在图14所示的抗原依赖性抑制测定中，单独的效应T细胞，或与HLA匹配的或不匹配的树突细胞一起的效应T细胞，或与不匹配的树突细胞和未转导的Treg、HLA-A2 TFP Treg、HLA-A2 TFP-2A-FoxP3 Treg或HLA-A2TFP-2A-FoxP3CD4+T细胞共培养的效应T细胞的细胞因子的表达。
图16是一系列图表，所述图表显示了在图14所示的抗原依赖性抑制测定中，效应T细胞在与不匹配的树突细胞和未转导的Treg、HLA-A2 TFP Treg、HLA-A2 TFP-2A-FoxP3Treg或HLA-A2TFP-2A-FoxP3 CD4+T细胞共培养时的细胞因子的表达。
图17是一系列曲线图，所述曲线图显示了转导前根据实施例5所述方法分离的Treg中的FoxP3、CD25和Helios的表达。
图18一系列曲线图，所述曲线图显示了根据实施例5所述的方案制备的未转导的Treg、HLA-A2 TFP Treg、HLA-A2 TFP-2A-FoxP3Treg和HLA-A2 TFP CD4+T细胞中的FoxP3、CD25、Helios、CD4和Cd25的表达。
图19是显示当根据实施例5所示的方案制备时，未转导的Treg、HLA-A2 TFP Treg、HLA-A2 TFP-2A-FoxP3 Treg、未转导的CD4+ T细胞、HLA-A2 TFP CD4+T细胞和HLA-A2 TFP-2A-FoxP3 CD4+T细胞的扩增的图表。
具体实施方式
如本文中所用，术语“包含(comprise)”或其变型例如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”应被理解为表示包括任何列举的整体(例如特性、元素、特征、属性、方法/过程步骤或限制)或整体的组(例如特性、元素、特征、属性、方法/过程步骤或限制)，但不排除任何其它整体或整体的组。因此，如本文中所用，术语“包括”是包含性的，并且不排除额外的、未列举的整体或方法/过程步骤。
术语“包括”可以替换为“基本上由......组成”或“由.......组成”。短语“基本上由......组成”在本文中用于要求一个或多个指定的整体或步骤以及那些不会实质上影响所要求保护的发明的特征或功能的整体或步骤。如本文中使用，术语“组成”用于表示所述整体(例如特性、元素、特征、属性、方法/过程步骤或限制)或整体的组(例如特性、元素、特征、属性、方法/过程步骤或限制)单独存在。
术语“一个/种(a)”和“一个/种(an)”是指物品的语法对象中的一个或多个(即，至少一个)。举例来说，“一个/种(an)元素”是指一个/种元素或多于一个/种元素。
如本文中所用，“约”可以表示加或减小于1％或1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％或大于30％，这取决于本领域技术人员已知或可知的情况。
如本文中所用，“受试者(subject)”或“受试者(subjects)”或“个体”可以包括但不限于哺乳动物，诸如人或非人哺乳动物，例如驯养动物、农业动物或野生动物以及鸟类和水生动物。“患者”是患有疾病、病症或疾患或有发展所述疾病、病症或疾患的风险或另外地需要本文提供的组合物和方法的受试者。在一些实施方案中，受试者患有本文所述的自身免疫性疾病。
如本文中所用，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指疾病或疾患的成功治疗或改善的任何征候。治疗可包括例如减轻、延迟或缓解疾病或疾患的一个或多个症状的严重度，或者其可包括降低由患者经历疾病、缺陷、病症或不利状况等的症状的频率。如本文中所用，“治疗或预防”有时在本文中用于指导致疾病或疾患的某种程度的治疗或改善的方法，并考虑了针对该目的的一系列结果，包括但不限于疾患的完全预防。
如本文中所用，“预防”是指对患者中的疾病或疾患，例如肿瘤形成的预防。例如，如果用本公开的方法治疗了有发展自身免疫性疾病的风险的个体，并且所述个体后来没有发展自身免疫性疾病，则在该个体中在至少一段时间内该疾病已被预防。
如本文中所用，“治疗有效量”是足以向施用组合物的个体提供有益效果或以其它方式减少有害的非有益事件的组合物或其活性成分的量。本文中的“治疗有效剂量”是指对于其施用产生一种或多种所需的或期望的(例如，有益的)作用的剂量，这种施用在给定的时间段内发生一次或多次。确切的剂量将取决于治疗的目的，并且将可由本领域技术人员使用已知技术来确定(参见，例如Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷，1992)；Lloyd,The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；以及Pickar,Dosage Calculations(1999))
如本文中所用，“T细胞受体(TCR)融合蛋白”或“TFP”包括源自包括TCR在内的各种多肽的重组多肽，所述重组多肽通常能够i)与靶细胞上的表面抗原结合并且ii)通常在T细胞内或其表面上共同定位时，与完整TCR复合物的其它多肽组分相互作用。
如本文中所用，术语“T细胞受体”和“T细胞受体复合物”可互换使用，是指存在于细胞表面上的分子，所述分子通常负责识别抗原。在95％的T细胞中，TCR包含由α链和β链组成的异二聚体，而5％的T细胞具有由γ链和δ链组成的TCR。TCR还包含CD3复合物的组分的组合。在一些实施方案中，TCR包含CD3ε。在一些实施方案中，TCR包含CD3γ。在一些实施方案中，TCR包含CD3ζ。在一些实施方案中，TCR包含CD3δ。TCR与抗原例如与抗原和MHC的结合，通过一系列由相关酶、共受体和特化辅助分子介导的生化事件导致其T细胞的活化。
术语“刺激”是指通过刺激结构域或刺激性分子(例如，TCR/CD3复合物)与其相关配体的结合(从而介导信号传导事件，诸如但不限于通过TCR/CD3复合物的信号传导)诱导的初级反应。刺激可介导某些分子表达的改变，和/或细胞骨架结构的重组织等。
术语“刺激性分子”或“刺激结构域”是指由T细胞表达的分子或其部分，其提供一个或多个初级细胞质信号传导序列，所述序列对T细胞信号传导途径的至少某些方面以刺激性方式调节TCR复合物的初级激活。一方面，初级信号通过例如TCR/CD3复合物与载有肽的MHC分子的结合启动，并且所述结合导致T细胞反应(包括但不限于增殖、活化、分化等)的介导。以刺激性方式起作用的初级细胞质信号传导序列(也称为“初级信号传导结构域”)可包含被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或“ITAM”的信号传导基序。在本发明中特别使用的包含ITAM的初级细胞质信号传导序列的实例包括但不限于源自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(也称为“ICOS”)和CD66d的那些。
术语“抗原呈递细胞”或“APC”是指在其表面上展示与主要组织相容性复合物(MHC)复合的外来抗原的免疫系统细胞，诸如辅助细胞(例如，B细胞、树突细胞等)。T细胞可使用其T细胞受体(TCR)识别这些复合物。APC加工抗原并将其呈递给T细胞。
“主要组织相容性复合物(MHC)分子通常被TCR结合，作为肽:MHC复合物的一部分。MHC分子可以是MHC I类或II类分子。所述复合物可存在于抗原呈递细胞诸如树突细胞或B细胞或任何其它细胞的表面上，或者其可通过例如包被在珠粒或平板上而被固定。人白细胞抗原系统(HLA)是编码人中的主要组织相容性复合物(MHC)的基因复合体的名称，包括HLA I类抗原(A、B及C)和HLA II类抗原(DP、DQ及DR)。HLA等位基因A、B和C呈递主要源自细胞内蛋白质(例如，细胞内表达的蛋白质)的肽。在体内T细胞发育过程中，T细胞经历正向选择步骤以确保识别自身MHC，然后经历负向步骤以去除与呈现自身抗原的MHC结合太强的T细胞。因此，某些T细胞及其表达的TCR将仅识别由某些类型的MHC分子-即由特定HLA等位基因编码的那些MHC分子呈递的肽。这称为HLA限制。一个HLA等位基因可是HLA-A*0201(HLA-A2)，其在绝大多数(>50％)高加索人群中表达。因此，结合由HLA-A*0201编码的(即为HLA-A*0201限制的)MHC呈递的WT1肽的TCR是有利的，因为使用此类TCR的免疫疗法将适合治疗大部分高加索人群。其它目标HLA-A等位基因可包括HLA-A*0101、HLA-A*2402和HLA-A*0301。广泛表达的目标HLA-B等位基因可包括HLA-B*3501、HLA-B*0702和HLA-B*3502。
如本文中所用，“MHC肽复合物”包含MHC分子或其部分，例如MHC I类或II类分子，和肽，例如表位。在一些实施方案中，肽是抗原，例如自身抗原或外源性抗原，或其在抗原呈递细胞(APC)加工后产生的片段。
如本文中所用，术语“胞内信号传导结构域”是指分子的细胞内部分。胞内信号传导结构域产生促进包含TFP的细胞(例如，经修饰的T-T细胞)的免疫效应子功能的信号。免疫效应子功能(例如，在经修饰的T-T细胞中)的实例包括溶细胞活性和T辅助细胞活性，包括细胞因子的分泌。在实施方案中，胞内信号传导结构域可包含初级胞内信号传导结构域。示例性初级胞内信号传导结构域包括源自负责初级刺激或抗原依赖性模拟的分子的那些。在实施方案中，胞内信号传导域可包含共刺激胞内结构域。示例性共刺激胞内信号传导结构域包括源自负责共刺激信号或不依赖于抗原的刺激的分子的那些。初级胞内信号传导结构域可包含ITAM(“基于免疫受体酪氨酸的激活基序”)。包含ITAM的初级胞质信号传导序列的实例包括但不限于源自CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d DAP10和DAP12的那些。
术语“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，从而介导T细胞的共刺激反应，诸如但不限于增殖。共刺激分子是除抗原受体或其配体外的细胞表面分子，其可能是高效免疫反应所需的。共刺激分子包括但不限于MHC 1类分子、BTLA和一个Toll配体受体，以及OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)和4-1BB(CD137)。共刺激胞内信号传导结构域可以是共刺激分子的细胞内部分。共刺激分子可在以下蛋白质家族中表示：TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)和激活NK细胞受体。此类分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3以及与CD83特异性结合的配体等。细胞内信号传导结构域可包含其所源自的分子的整个细胞内部分或整个天然细胞内信号传导结构域或其功能性片段。术语“4-1BB”指具有作为GenBank登录号AAA62478.2的氨基酸序列或来自非人物种(例如，小鼠、啮齿动物、猴子、猿等)的等效残基的TNFR超家族的成员；并且“4-1BB共刺激结构域”被定义为GenBank登录号AAA62478.2的氨基酸残基214-255，或来自非人物种(例如，小鼠、啮齿动物、猴子、猿等)的等效残基。
如本文中所用，术语“抗体”是指源自免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列，其与抗原特异性结合。抗体可以是寡克隆或单克隆来源的完整免疫球蛋白或其片段，并且可以源自天然或重组来源。
术语“抗体片段”是指抗体或其重组变体的至少一部分，其包含完整抗体的抗原决定性可变区，足以赋予抗体片段对靶标(诸如抗原及其定义的表位)的识别和特异性结合。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段、单链(sc)Fv(“scFv”)抗体片段、线性抗体、单结构域抗体诸如sdAb(VL或VH)、骆驼科VHH结构域和由抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“scFv”是指包含至少一个含有轻链可变区的抗体片段和至少一个含有重链可变区的抗体片段的融合蛋白，其中轻链和重链可变区通过短的柔性多肽接头连续连接，并且能够表达为单个多肽链，并且其中scFv保持其所源自的完整抗体的特异性。
关于抗体的“重链可变区”或“VH”是指包含三个CDR的重链片段，所述三个CDR被插入在称为框架区的侧翼片段之间，这些框架区通常比CDR更加保守并且形成支持CDR的支架。骆驼科“VHH”结构域是包含单个可变抗体结构域的重链。
除非特别说明，否则如本文中所用，scFv可以以任一顺序(例如，相对于多肽的N-末端和C-末端)具有VL和VH可变区，scFv可包含VL-接头-VH或可包含VH-接头-VL。
包含抗体或其抗体片段的本公开的TFP组合物的部分可以以多种形式存在，其中抗原结合结构域表达为连续多肽链(包括例如单结构域抗体片段(sdAb)、源自鼠抗体、人源化抗体或人抗体的单链抗体(scFv))的一部分(Harlow等人，1999,In:Using Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,N.Y.；Harlow等人，1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,N.Y.；Houston等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird等人，1988,Science 242:423-426)。一方面，本公开的TFP组合物的抗原结合结构域包含抗体片段。在另外的方面，TFP包含含有scFv或sdAb的抗体片段。
术语“重组抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，例如由噬菌体或酵母表达系统表达的抗体。所述术语还应解释为意指通过合成编码抗体的DNA分子而产生的抗体，所述DNA分子表达抗体蛋白或指定该抗体的氨基酸序列，其中已使用本领域可用和公知的重组DNA或氨基酸序列技术获得所述DNA或氨基酸序列。
术语“抗原”或“Ag”是指能够被抗体特异性结合或以其它方式激发免疫反应的分子。这种免疫反应可涉及抗体的产生或特定免疫活性细胞的活化，或者两者。
技术人员将理解，任何大分子(包括实际上所有的蛋白质或肽)都可用作抗原。此外，抗原可源自重组DNA或基因组DNA。技术人员将理解，包含编码引发免疫反应的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA因而编码“抗原”，正如该术语在本文使用的含义那样。此外，本领域技术人员将理解抗原不必仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本公开包括但不限于多于一个基因的部分核苷酸序列的使用，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以编码引发所需免疫反应的多肽。此外，技术人员将理解，抗原根本不需要由“基因”编码。显而易见的是，抗原可合成产生或可源自生物样品，或者可以是除了多肽以外的大分子。这样的生物样品可包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或具有其它生物组分的流体。
术语“编码”是指多核苷酸(诸如基因、cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列在具有确定的核苷酸序列(例如，rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列以及由此产生的生物性质的生物过程中，用作合成其它聚合物和大分子的模板的固有性质因此，基因、cDNA或RNA编码蛋白质，如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生蛋白质的话。其核苷酸序列与mRNA序列相同且通常在序列表中提供的编码链，以及用作基因或cDNA的转录模板的非编码链都可被称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其它产物。
除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括为彼此的简并形式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列还可包括内含子，达到编码蛋白质的核苷酸序列在一些形式中可以包含一个或多个内含子的程度。
术语“有效量”或“治疗有效量”在本文可互换使用，并且是指如本文所述的有效实现特定生物或治疗结果的化合物、制剂、材料或组合物的量。
术语“内源的”是指来自生物体、细胞、组织或系统的或在生物体、细胞、组织或系统内部产生的任何材料。
术语“外源的”是指从生物体、细胞、组织或系统外部引入的或在生物体、细胞、组织或系统外部产生的任何材料。
术语“表达”是指由启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
术语“功能性破坏”是指特定(例如，靶)核酸(例如，基因、RNA转录物、由其编码的蛋白质)的物理或生物化学变化，所述变化阻止其在细胞中的正常表达和/或行为。在一个实施方案中，功能性破坏是指通过基因编辑方法对基因的修饰。在一个实施方案中，功能性破坏阻止了靶基因(例如，内源基因)的表达。
术语“转移载体”是指包含分离的核酸并且可以用于将分离的核酸递送至细胞内部的物质的组合物。许多载体是本领域已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲性化合物缔合的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“转移载体”包括自主复制质粒或病毒。所述术语还应解释为进一步包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如多聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒转移载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。
术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含可操作地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含足够的顺式作用元件以用于表达；用于表达的其它元件可由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有载体，包括掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中的)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，能够感染非分裂细胞；它们可将大量遗传信息传递到宿主细胞的DNA中，因此它们是最高效的基因递送载体方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的实例。
术语“慢病毒载体”是指源自慢病毒基因组的至少一部分的载体，尤其包括Milone等人，Mol.Ther.17(8):1453-1464(2009)中提供的自身灭活型慢病毒载体。可在临床中使用的慢病毒载体的其它实例包括但不限于，例如，来自Oxford BioMedica的LENTIVECTORTM基因递送技术、来自Lentigen的LENTIMAXTM载体系统，等等。慢病毒载体的非临床类型也是可用的，并且是本领域技术人员已知的。
非人(例如，鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其它抗原结合子序列)，其包含源自非人免疫球蛋白的最小序列。在很大程度上，人源化抗体及其抗体片段为人免疫球蛋白(受者抗体或抗体片段)，其中来自所述受者的互补决定区(CDR)的残基被具有所需特异性、亲和力和能力的来自非人物种(诸如小鼠、大鼠或兔)(供体抗体)的CDR的残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基由相应的非人残基替代。此外，人源化抗体/抗体片段可包含既不存在于受者抗体中也不存在于输入的CDR或框架序列中的残基。这些修饰还可精修和优化抗体或抗体片段的性能。通常，人源化抗体或其抗体片段将包含基本上所有的至少一个，通常是两个可变结构域，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些CDR区，并且所有或大部分的FR区是人免疫球蛋白序列的那些FR区。人源化抗体或抗体片段还可包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区。关于进一步的细节，参见Jones等人，Nature,321:522-525,1986；Reichmann等人，Nature,332:323-329,1988；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596,1992。
术语“同源的”或“同一性”是指两个聚合物分子之间，例如，两个核酸分子，诸如两个DNA分子或两个RNA分子之间，或两个多肽分子之间的亚基序列同一性。当两个分子中的亚基位置都被相同的单体亚基占据时；例如，如果两个DNA分子中的每一个中的位置都被腺嘌呤占据，那么它们在该位置处是同源或相同的。两个序列之间的同源性是匹配或同源位置数目的直接函数；例如，如果两个序列中一半(例如，长度为十个亚基的多聚体中的五个位置)的位置是同源的，则两个序列是50％同源的；如果90％的位置(例如10个中的9个)是匹配或同源的，则两个序列是90％同源的。
“人”或“完全人”是指免疫球蛋白，诸如抗体或抗体片段，其中整个分子是人来源的或由与抗体或免疫球蛋白的人形式相同的氨基酸序列组成。
术语“分离的”意指从自然状态改变或去除的。例如，天然存在于活动物中的核酸或肽不是“分离的”，但从其天然状态的共存材料部分或完全分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，或可以存在于非天然环境例如宿主细胞中。
在本公开的说明书中，使用以下常见核酸碱基的缩写。“A”是指腺苷，“C”是指胞嘧啶，“G”是指鸟苷，“T”是指胸苷，“U”是尿苷。
术语“保守序列修饰”是指不会显著影响或改变包含所述氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特性的氨基酸修饰。此类保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可通过本领域已知的标准技术(诸如定点诱变和PCR介导的诱变)将修饰引入本公开的抗体或抗体片段中。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代的氨基酸取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族已经在本领域中进行了定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本公开的TFP内的一个或多个氨基酸残基可被来自相同侧链家族的其它氨基酸残基替代，并且改变的TFP可使用本文所述的功能测定法进行测试。
术语“可操作地连接”或“转录控制”是指调控序列与导致后者表达的异源核酸序列之间的功能性键联。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，所述第一核酸序列与所述第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子实现编码序列的转录或表达，则启动子与所述编码序列可操作地连接。可操作地连接的DNA序列可以彼此连续，例如，在需要连接两个蛋白质编码区的情况下，它们处于同一阅读框中。
术语免疫原性组合物的“肠胃外”施用包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌内(i.m.)或胸骨内注射、瘤内或输注技术。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非特别限制，否则该术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述核酸具有与参考核酸相似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸相似的方式被代谢。除非另有说明，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列以及明确指示的序列。具体而言，简并密码子替代可通过产生序列来实现，在所述序列中一个或多个所选(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸，并且对可包含蛋白质或肽的序列的氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括任何包含两个或更多个通过肽键相互连接的氨基酸的肽或蛋白质。如本文中所用，该术语指短链和长链，所述短链在本领域中通常也称为肽、寡肽和寡聚物，所述长链在本领域中通常称为蛋白质，所述蛋白质具有许多类型。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等等。多肽包括天然肽、重组肽或其组合。
术语“启动子”是指由细胞的转录机制识别的DNA序列，或启动多核苷酸序列的特异性转录所需的引入的合成机制。
术语“启动子/调控序列”是指与启动子/调控序列可操作地连接的可用于基因产物的表达的核酸序列。在一些情况下，该序列可以是核心启动子序列，在其它情况下，该序列还可包括增强子序列和基因产物的表达所需的其它调控节元件。启动子/调控序列可以是例如以组织特异性方式表达基因产物的序列。
术语“组成型”启动子是指当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，在细胞的大多数或所有生理条件下导致基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
术语“诱导型”启动子是指当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，基本上仅当细胞中存在对应于该启动子的诱导物时，才在细胞中产生基因产物的核苷酸序列。
术语“组织特异性”启动子是指这样的核苷酸序列，当其与编码基因或由基因指定的多核苷酸可操作地连接时，仅当细胞为对应于所述启动子的组织类型的细胞时，才基本上在细胞中产生基因产物。
如在scFv的情况下所用，术语“接头”和“柔性多肽接头”是指被单独或组合使用以将可变重链与可变轻链区域连接在一起的肽接头，其由氨基酸诸如甘氨酸和/或丝氨酸残基组成。在一个实施方案中，柔性多肽接头是Gly/Ser接头，并包含氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n为等于或大于1的正整数。例如，n＝1、n＝2、n＝3、n＝4、n＝5、n＝6、n＝7、n＝8、n＝9以及n＝10。在一个实施方案中，柔性多肽接头包括但不限于(Gly4Ser)4或(Gly4Ser)3。在另一个实施方案中，接头包括(Gly2Ser)、(GlySer)或(Gly3Ser)的多个重复。在本公开的范围内还包括在WO2012/138475(通过引用并入本文)中描述的接头。在一些情况下，接头序列包含长接头(LL)序列。在一些情况下，长接头序列包含(G4S)n，其中n＝2至4。在一些情况下，接头序列包含短接头(SL)序列。在一些情况下，短接头序列包含(G4S)n，其中n＝1至3。
如本文中所用，5'帽(也称为RNA帽、RNA 7-甲基鸟苷帽或RNA m7G帽)是经修饰的鸟嘌呤核苷酸，其在转录开始后不久被添加到真核信使RNA的“前”或5’末端。5'帽由与第一个转录的核苷酸连接的末端基团组成。其存在对于被核糖体识别和免受RNA酶降解的保护至关重要。帽的添加与转录偶联，并且共转录地发生，使得彼此影响。转录开始后不久，所合成的mRNA的5'末端被与RNA聚合酶缔合的合成帽的复合物结合。这种酶复合物催化用于mRNA封端的化学反应。合成作为多步生化反应进行。可修饰封端部分以调节mRNA的功能性，诸如其稳定性或翻译效率。
如本文中所用，“体外转录的RNA中是指已经在体外合成的RNA，优选mRNA。通常，体外转录的RNA由体外转录载体产生。体外转录载体包含用于产生体外转录的RNA的模板。
如本文中所用，“poly(A)”是通过多腺苷酸化连接至mRNA的一系列腺苷。在用于瞬时表达的构建体的优选实施方案中，polyA为50至5000，优选大于64，更优选大于100，最优选大于300或400。可以化学或酶促修饰Poly(A)序列，以调节mRNA功能性，诸如定位、稳定性或翻译效率。
如本文中所用，“多腺苷酸化”是指聚腺苷酰基部分或其修饰变体与信使RNA分子的共价键联。在真核生物体中，大多数信使RNA(mRNA)分子在3'端被多腺苷酸化。3’poly(A)尾是通过酶多腺苷酸聚合酶的作用添加到前体mRNA中的腺嘌呤核苷酸的长序列(通常为数百个)。在高级真核生物中，将poly(A)尾添加到包含特定序列即多腺苷酸化信号的转录物上。poly(A)尾及与其结合的蛋白质有助于保护mRNA免受外切核酸酶的降解。多腺苷酸化对于转录终止、mRNA从细胞核的输出以及翻译也很重要。DNA转录为RNA后，多腺苷酸化立即在细胞核中发生，但另外地也可在细胞质中稍后发生。转录终止后，通过与RNA聚合酶相关的内切核酸酶复合物的作用切割mRNA链。切割位点的特征通常在于在切割位点附近存在碱基序列AAUAAA。切割mRNA后，将腺苷残基添加到切割位点的3’末端。
如本文中所用，“瞬时”是指非整合的转基因表达数小时、数天或数周的时间，其中如果整合到基因组中或者包含在宿主细胞中的稳定的质粒复制子内，则表达的时间段短于基因表达的时间段。
术语“信号转导途径”是指在信号从细胞的一部分传递到细胞的另一部分中起作用的多种信号传导分子之间的生化关系。短语“细胞表面受体”包括能够接收信号并跨细胞膜传递信号的分子和分子的复合物。
术语“受试者”旨在包括其中可引发免疫反应的活生物体(例如，哺乳动物、人)。
术语“基本上纯化的”细胞是指基本上不含其它细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞也指已经与在其天然存在的状态下通常与其结合的其它细胞类型分离的细胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群是指同质的细胞群。在其它情况下，该术语仅指已与在它们的天然状态下与它们天然结合的细胞分离的细胞。在一些方面，体外培养细胞。在其它方面，不在体外培养细胞。
如本文中所用，术语“治疗的”意指治疗。通过减轻、抑制、缓解或根除疾病状态来获得治疗效果。
如本文中所用，术语“预防”是意指疾病或疾病状态的预防或对疾病或疾病状态的保护性治疗。
术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指籍以将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞。所述细胞包括原代受试者细胞及其后代。
术语“特异性结合”是指这样的抗体、抗体片段或特异性配体，其识别并结合存在于样品中的同源结合配偶体，但不一定和基本上不会识别或结合样品中的其它分子。
范围：贯穿本公开，本公开的各个方面可以以范围格式呈现。应当理解，以范围格式进行的描述仅仅是为了方便和简洁，不应当被解释为对本公开范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为已经具体地公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，诸如1至6的范围的描述应该被认为已经具体地公开了子范围，诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等以及该范围内的单个数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。作为另一个实例，诸如95-99％同一性的范围包括具有95％、96％、97％、98％或99％同一性的东西，以及包括诸如96-99％、96-98％、96-97％、97-99％、97-98％和98-99％同一性的子范围。无论范围有多广，这都适用。
概述
本公开提供了表达T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的调节性T细胞(Treg)。这些细胞可以表达T细胞受体融合构建体，其识别抗原，例如自身抗原、过敏原或移植组织抗原。在一些实施方案中，T细胞受体融合构建体识别外源性抗原，例如治疗剂。在一些情况下，T细胞受体融合构建体识别T细胞受体。在一些实施方案中，T细胞受体融合构建体识别肽-MHC复合物。活化后，表达TFP的Treg可以发挥作用以减少自身免疫反应、过敏反应、移植排斥或对治疗剂的免疫反应。它们可用于治疗许多炎性疾患，不限于自身免疫、过敏、移植和对治疗剂的免疫反应。图1显示了识别一种或多种细胞膜相关自身抗原或循环自身抗原后，工程化的调节性T细胞(Treg)介导的T细胞反应的示意图。
Treg对于维持自身耐受性和抑制感染期间的免疫反应可能是必需的。Treg的一些亚群的特征在于CD25和FOXP3的高表达，它们是表型和抑制功能的主要调节因子。FOXP3在控制Treg发育和功能中的作用可以通过对免疫失调多内分泌病肠病X连锁(IPEX)综合征(immunodysregulation polyendocrinopathy enteropathy X-linked(IPEX)syndrome)患者的Treg的研究来说明。根据具体突变，IPEX患者可以具有或可以不具有循环FOXP3+T细胞，但即使FOXP3+ T细胞可以存在，它们也可能由于FOXP3转录功能不足而存在功能缺陷。
从机理上讲，Treg可以抑制许多免疫细胞的增殖和功能，即使在Treg:效应细胞比率非常低的情况下亦如此。就抑制途径而言，可以发生多种可能性，诸如免疫抑制细胞因子、接触依赖性细胞毒性、代谢破坏和通过共抑制分子表达对抗原呈递细胞的抑制。关注人Treg，CTLA-4和TGF-β可能起主导作用。影响CTLA-4或其途径中的蛋白质的单基因突变可影响Treg功能，阻断人Treg激活TGF-β的抗体可以阻止其控制异种移植物抗宿主病(GVHD)的能力。Treg机制的另一个方面可能是它们具有其它T辅助(TH)细胞的特性，导致对它们所反映的TH细胞亚群的亚特化(sub-specialization)和增强的抑制。这些亚特化的Treg可具有独特的抑制机制，或者能够更高效地运输到炎症的相关部位。
Treg的免疫抑制特性使其成为用于细胞疗法，特别是用于在诸如造血干细胞移植(HSCT)、实体器官移植和自身免疫等情况下的应用的有吸引力的候选物。然而，由于与细胞分离和扩增相关的限制，为此目的利用Treg可能不是微不足道的。可以单独使用低剂量的IL2或与其它剂组合使用来尝试在体内“增强”Treg。然而，这些方法能够导致混合的结果，部分归因于IL2的多效性作用。体内增强的替代方案可以是采用离体富集的、通常扩增的Treg的过继治疗。这种方法可以通过转移大量Treg来重置Treg:Tconv细胞平衡，从而克服缺陷或少量Treg。在临床上使用工程化的Treg细胞仍然存在许多障碍。这些可以包括使用当前技术产生足够的Treg细胞的能力，在扩增后保持Treg功能，以及最终用合适的靶向工具武装Treg。本文描述的工程化的Treg可以克服许多这些障碍。
本文所述的工程化的Treg可以克服获得足够数量Treg的困难。由于需要分离内源性Treg(其可占循环T细胞的不到2％)并随后扩增它们，产生足够Treg的能力可能受到阻碍。本文描述的方法可以在离体过程中将所有T细胞改造成Treg。另外或可选地，本文所述的方法改造Treg以维持其调节状态。这些工程化的细胞可以在体外扩增，并被重新引入患者体内。这可以避免分离内源性Treg的需要。
本文所述的工程化的T细胞可维持Treg功能。工程化的T细胞可包含并表达编码T细胞受体整合(TCR)融合蛋白(TFP)的重组核酸分子。本文所述的工程化的T细胞可被称为TFP-treg。与CAR-Treg疗法不同，本文所述的TFP-Treg可以通过TCR发出信号，这可以用于长期Treg功能。TFP-Treg的这一特征有望支持移植后的长期功能。本文所述的工程化的Treg也可表达Forkhead FOXP3、HELIOS、BACH2或pSTAT5，其可有助于在转移后维持Treg功能。工程化的TFP-Treg可以表达IL7-IL2开关受体、IL7-IL10开关受体或TNF-α-IL2开关受体，这有助于在转移后维持Treg功能。这种开关受体可有助于Treg的体外扩增。
本文所述的工程化的Treg可具有优化的Treg靶向性。TFP-Treg可以靶向细胞表达的(例如，多发性硬化中神经元上的髓磷脂、类风湿性关节炎中关节中的胶原)和循环的自身抗原(例如，乳糜泻中的麦醇溶蛋白)。
本文所述的工程化的Treg可以包含：(a)编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的重组核酸分子，所述TFP包含(i)TCR整合亚基，其包含(1)胞外结构域，(2)TCR跨膜结构域和(3)TCR胞内结构域；和；(ii)结合结构域。胞内结构域可包含来自胞内信号传导结构域的刺激结构域。TCR整合亚基和结合结构域可以可操作地连接。当在T细胞中表达时，TFP可以与内源性性TCR功能性相互作用。
工程化的Treg可制成包含药学上可接受的过载体的药物组合物，并用于治疗疾病，诸如自身免疫性疾病。
T细胞受体(TCR)融合蛋白
本公开提供了编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)及其变体的重组核酸构建体。TFP可包含结合结构域，例如特异性结合自身免疫性疾病相关抗原(自身抗原)、治疗剂、特异性结合自身抗原或治疗剂的TCR、配体(例如，肽-MHC复合物)或配体结合蛋白(例如，T细胞受体模拟物)的抗体或抗体片段，其中结合结构域的序列与编码TCR整合亚基或其部分的核酸序列相邻并在相同的阅读框中。本文提供的TFP能够与一种或多种内源性(或者可选地，一种或多种外源性，或者内源性和外源性的组合)TCR亚基缔合，以形成功能性TCR复合物。本公开还提供了TFP分子或其中掺入了TFP分子的TCR复合物。本公开还提供了包含TFP或编码TFP的重组核酸分子的细胞(例如，T细胞或Treg)。有利地，当在T细胞中表达时，这种TFP可以靶向具有对自身抗原或治疗剂特异的T细胞受体的T细胞。当向受试者施用时，这种表达TFP的细胞可以治疗自身免疫性疾病、炎性疾病或病症、过敏反应、移植排斥或对治疗剂的免疫反应。
TFP可包含TCR整合亚基，其包含(1)胞外结构域、(2)TCR跨膜结构域和(3)TCR胞内结构域。胞内信号传导结构域可选自CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、TCRα、TCRβ、TCRγ和TCRδ。TCR整合亚基可以包含(i)TCR胞外结构域、(ii)TCR跨膜结构域和(iii)TCR胞内结构域。TCR细胞外结构域、TCR跨膜结构域和TCR细胞内结构域中的至少两者可源自相同的TCR亚基(例如，CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、TCRα、TCRβ、TCRγ或TCRδ)。TCR胞外结构域、TCR跨膜结构域和TCR胞内结构域可源自相同的TCR亚基。TCR整合亚基可包含全长CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、TCRα、TCRβ、TCRγ或TCRδ。TCR整合亚基可包含源自CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、TCRα、TCRβ、TCRγ或TCRδ的全长跨膜结构域。TCR整合亚基可包含源自CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、TCRα、TCRβ、TCRγ或TCRδ的全长胞外结构域。TCR整合亚基可包含源自CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、TCRα、TCRβ、TCRγ或TCRδ的全长胞内结构域。编码的结合结构域可以通过接头序列连接至TCR胞外结构域。在一些实施方案中，编码的接头序列包含(G4S)n，其中n＝1至4。
TFP可包括TCR亚基的胞外结构域，其包含选自由以下组成的组的蛋白质的胞外结构域或其部分：TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基，其功能性片段，及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。
编码的TFP可包含跨膜结构域，其包含选自由组成的组的蛋白质的跨膜结构域：TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、CD3ζTCR亚基，其功能性片段，及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。
TFP可包含TCR亚基的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)，所述基于免疫受体酪氨酸的激活基序包含选自由以下组成的组的蛋白质的ITAM或其部分：CD3ζTCR亚基、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、Fcε受体1链、Fcε受体2链、Fcγ受体1链、Fcγ受体2a链、Fcγ受体2b1链、Fcγ受体2b2链、Fcγ受体3a链、Fcγ受体3b链、Fcβ受体1链、TYROBP(DAP12)、CD5、CD16a、CD16b、CD22、CD23、CD32、CD64、CD79a、CD79b、CD89、CD278、CD66d，其功能性片段，以及具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，ITAM替代CD3γ、CD3δ或CD3ε的ITAM。
一方面，本公开的TFP包含原本称为结合结构域的靶特异性结合元件。部分的选择可取决于定义靶细胞表面的靶抗原的类型和数量。例如，可选择结合结构域来识别靶抗原，所述靶抗原充当与特定疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标志物。因此，可充当本公开的TFP中的结合结构域的靶抗原的细胞表面标志物的实例包括与病毒、细菌和寄生虫感染、自身免疫性疾病和癌症疾病(例如，恶性疾病)相关的那些细胞表面标志物。
结合结构域
本文提供了包含含有结合结构域的TFP的组合物，其中所述结合结构域将TFP靶向具有结合自身抗原或治疗剂的TCR的T细胞。结合结构域可以是抗原结合结构域例如自身抗原或外源性抗原结合结构域、T细胞受体配体例如肽-MHC复合物或T细胞受体模拟物例如结合肽-MHC复合物的抗体。在一些实施方案中，自身抗原与自身免疫性疾病或炎症相关。在一些实施方案中，自身抗原与移植排斥相关。
一方面，可通过将抗原结合结构域工程化到特异性结合所需抗原的TFP中来将TFP介导的T细胞反应导向目标抗原。在一些实施方案中，目标抗原是肽-MHC复合物，抗原结合结构域是T细胞受体模拟物。
抗原结合结构域可以是与抗原结合的任何结构域，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、鼠抗体及其功能性片段，包括但不限于单结构域抗体诸如重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)和骆驼科来源的纳米体的可变结构域(VHH)，以及本领域已知的用作抗原结合结构域的替代支架，诸如重组纤连蛋白结构域、抗运载蛋白(anticalin)、DARPIN等。同样地，可将特异性识别并结合靶抗原的天然或合成配体用作TFP的抗原结合结构域。在一些情况下，抗原结合结构域源自最终将在其中使用TFP的相同物种是有益的。例如，在人中使用时，TFP的抗原结合结构域包含抗体或抗体片段的抗原结合结构域的人残基或人源化残基可以是有益的。
人源化抗体或抗体片段可保留与原始抗体相似的抗原特异性，例如，在本公开中，结合人自身抗原的能力。在一些实施方案中，人源化抗体或抗体片段可具有与靶抗原结合的改善的亲和力和/或特异性。
在一些方面，非人抗体是人源化的，其中所述抗体的特定序列或区域被修饰以增加与人天然产生的抗体或其片段的相似性。一方面，所述抗原结合结构域是人源化的。
可使用本领域已知的多种技术(包括但不限于CDR移植(参见，例如，欧洲专利第EP239,400号；国际公开第WO 91/09967号；和美国专利第5,225,539号、第5,530,101号和第5,585,089号，其每一个通过引用整体并入本文)、饰面(veneering)或重修表面(resurfacing)(参见，例如，欧洲专利第EP 592,106号和第EP 519,596号；Padlan,1991,Molecular Immunology,28(4/5):489-498；Studnicka等人，1994,Protein Engineering,7(6):805-814；和Roguska等人，1994,PNAS,91:969-973,其每一个通过引用整体并入本文)、链改组(参见，例如美国专利第5,565,332号，其通过引用整体并入本文))以及在例如以下文献中描述的技术来产生人源化抗体：美国专利申请公开第US2005/0042664号、美国专利申请公开第US2005/0048617号、美国专利第6,407,213号、美国专利第5,766,886号、国际公开第WO 9317105号，Tan等人，J.Immunol.,169:1119-25(2002),Caldas等人，ProteinEng.,13(5):353-60(2000),Morea等人，Methods,20(3):267-79(2000),Baca等人，J.Biol.Chem.,272(16):10678-84(1997),Roguska等人，Protein Eng.,9(10):895-904(1996),Couto等人，Cancer Res.,55(23Supp):5973s-5977s(1995),Couto等人，CancerRes.,55(8):1717-22(1995),Sandhu J S,Gene,150(2):409-10(1994)和Pedersen等人，J.Mol.Biol.,235(3):959-73(1994)，其每一个通过引用整体并入本文。通常，框架区中的框架残基将被来自CDR供体抗体的相应残基取代以改变例如改善抗原结合。这些框架取代通过本领域公知的方法鉴定，例如，通过对CDR和框架残基的相互作用建模以鉴定对抗原结合重要的框架残基，以及通过序列比较以鉴定特定位置处的罕见框架残基(参见，例如，Queen等人，美国专利第5,585,089号；和Riechmann等人，1988,Nature,332:323，所述文献通过引用整体并入本文)。
人源化抗体或抗体片段具有一个或多个保留在其中的来自非人来源的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变结构域。如本文所提供的，人源化抗体或抗体片段包含一个或多个来自非人免疫球蛋白分子的CDR和其中构成框架的氨基酸残基完全或主要源自人种系的框架区。用于抗体或抗体片段的人源化的多种技术是本领域公知的，并且基本上可以按照Winter和同事的方法(Jones等人，Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等人，Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science,239:1534-1536(1988))，通过用啮齿动物的CDR或CDR序列替代人抗体的相应序列(即，CDR移植)(EP 239,400；PCT公开第WO 91/09967号；和美国专利第4,816,567号、第6,331,415号、第5,225,539号、第5,530,101号、第5,585,089号、第6,548,640号，其内容通过引用整体并入本文)来进行。在此类人源化抗体和抗体片段中，基本上少于完整的人可变结构域已被来自非人物种的相应序列取代。人源化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基和可能的一些框架(FR)残基被来自啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。抗体和抗体片段的人源化还可通过饰面或重修表面(EP 592,106；EP 519,596；Padlan,1991,MolecularImmunology,28(4/5):489-498；Studnicka等人，Protein Engineering,7(6):805-814(1994)和Roguska等人，PNAS.91:969-973(1994))或链改组(美国专利第5,565,332号)来实现，所述文献的内容通过引用整体并入本文。
选择人可变结构域(轻和重可变结构域)用于制备人源化抗体是为了降低抗原性。根据所谓的“最佳适配”方法，针对已知的人可变结构域序列的整个文库，筛选啮齿动物抗体可变结构域的序列。然后，将最接近啮齿动物的人序列接受为人源化抗体的人框架(FR)(Sims等人，J.Immunol.,151:2296(1993)；Chothia等人，J.Mol.Biol.,196:901(1987)，其内容通过引用整体并入本文)。另一种方法使用源自特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列的特定框架。相同的框架可用于几种不同的人源化抗体(参见，例如，Nicholson等人Mol.Immun.34(16-17):1157-1165(1997)；Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；Presta等人，J.Immunol.,151:2623(1993)，所述文献的内容通过引用整体并入本文)。在一些实施方案中，重链可变区的框架区，例如，所有四个框架区，源自VH4-4-59种系序列。在一个实施方案中，框架区可以包含一个、两个、三个、四个或五个修饰，例如，取代，例如，来自相应鼠序列的氨基酸。在一个实施方案中，框架区，例如，轻链可变区的所有四个框架区源自VK3-1.25种系序列。在一个实施方案中，框架区可以包含一个、两个、三个、四个或五个修饰，例如，取代，例如，来自相应鼠序列的氨基酸。
在一些方面，包含抗体片段的本公开的TFP组合物的部分被人源化，保留了对靶抗原的高亲和力和其它有利的生物学特性。根据本发明的一个方面，通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体和抗体片段。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，并且是本领域技术人员所熟悉的。说明和显示所选的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序是可获得的。对这些显示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能发挥中的可能作用，例如，分析影响候选免疫球蛋白结合靶抗原的能力的残基。这样，可从受者和输入序列中选择和结合FR残基，从而获得所需抗体或抗体片段特征，诸如对靶抗原的增加的亲和力。一般来说，CDR残基直接且最实质性地参与影响抗原结合。
一方面，本公开设想了对起始抗体或片段(例如，scFv)氨基酸序列的修饰，所述修饰产生功能上等同的分子。例如，可以修饰包含在TFP中的结合结构域的VH或VL(例如，scFv)，以保留至少约70％、71％.72％.73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的与抗原结合结构域(例如，scFv)的起始VH或VL框架区的同一性。本公开内容设想了整个TFP构建体的修饰，例如，TFP构建体的各个结构域的一个或多个氨基酸序列中的修饰，以产生功能上等同的分子。可以修饰TFP构建体以保留至少约70％、71％.72％.73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的与起始TFP构建体的同一性。
示例性自身抗原包括但不限于：麦醇溶蛋白(Gliandin)、胰岛葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白(IGRP)、ChgA、IAPP、外周蛋白tetraspabin-7P4Hb、GRP78、尿皮质素-3、胰岛素基因增强子蛋白isl-1、胰岛素、桥胶蛋白1、桥胶蛋白3、GAD65、IA-2、ZnT8、II型胶原、人软骨细胞糖蛋白39、蛋白聚糖、瓜氨酸化丝聚蛋白、类胰蛋白酶、异质核核糖核蛋白A2/B1、醛缩酶、α-烯醇化酶、钙网蛋白、60kDa热休克蛋白(HSP60)、应激诱导磷蛋白1、磷酸甘油酸激酶1(PGK1)、远上游元件结合蛋白(FUSE-BP)1和2、水通道蛋白(quaporin)-4水通道(AQP4)、Hu、Ma2、崩溃蛋白反应介体蛋白5(collapsin response-mediator protein 5)(CRMP5)和双载蛋白、电压门控钾通道(VGKC)、N-甲基-d-天冬氨酸受体(NMDAR)、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸(AMPAR)、甲状腺过氧化物酶、甲状腺球蛋白、抗N-甲基-D-天冬氨酸受体(NR1亚基)、Rh血型抗原、I抗原、Dsgl/3、BP180、BP230、乙酰胆碱烟碱突触后受体、促甲状腺素受体、血小板整联蛋白、GpIIbTIIa、胶原蛋白α-3(IV)链、类风湿因子、钙蛋白酶抑制蛋白、瓜氨酸化蛋白、髓磷脂碱性蛋白(MBP)、髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)肽、α-β-晶体蛋白、DNA、组蛋白、核糖体、R P、组织转谷氨酰胺酶(TG2)、内在因子(intrinsicfactor)、65-kDa抗原、磷脂酰丝氨酸、核糖体磷蛋白、抗中性粒细胞胞质抗体、Scl-70、Ul-RP、ANA、SSA、抗SSB、抗核抗体(ANA)、抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)、Jo-1、抗线粒体抗体、gp210、p62、splOO、抗磷脂抗体、Ul-70kd snRNP、GQlb神经节苷脂、GM1、无唾液酸基GM1、GDlb、抗平滑肌抗体(ASMA)、抗肝肾微粒体-1抗体(ALKM-1)、抗肝胞质溶胶抗体-1(ALC-1)、IgA抗肌内膜抗体、中性粒细胞颗粒蛋白、链球菌细胞壁抗原、胃壁细胞内在因子、胰岛素(IAA)、谷氨酸脱羧酶(GAA或GAD)、蛋白酪氨酸磷酸酶(IA2或ICA512)、PLA2R1、THSD7A1、HLA-A2、CEA、FVIII、GAD65和瓜氨酸化波形蛋白。结合自身抗原的示例性抗原结合结构域包括例如抗HLA-A2抗体。示例性HLA-A2抗体包括，例如，3PF12，MacDonald等人(J ClinInvest.2016年4月1日；126(4):1413–1424)中描述的BB7.2 scFv，A.Martin等人，Cytotherapy，2020年12月9日中描述的那些以及美国专利申请第20200283530号和第20200283529号中描述的那些，所述每一篇文献通过引用并入本文。
在一些实施方案中，抗原是外源性抗原，例如治疗剂，例如诱导受试者的免疫反应的治疗剂。可诱导免疫反应的示例性治疗剂包括但不限于不溶性治疗蛋白、酶、酶辅因子、激素、凝血因子、细胞因子和干扰素、生长因子、单克隆抗体和多克隆抗体(例如，作为替代疗法向受试者施用的)，以及与庞贝氏病相关的蛋白(例如，阿葡糖苷酶α、rhGAA(例如，Myozyme和Lumizyme(Genzyme))。治疗性蛋白质也包括参与血液凝固级联的蛋白质。治疗性蛋白质包括但不限于因子VIII、因子VII、因子IX、因子V、von Willebrand因子、vonHeldebrant因子、组织纤溶酶原激活剂、胰岛素、生长激素、红细胞生成素α、VEGF、血小板生成素、溶菌酶、抗凝血酶等。治疗性蛋白还包括脂肪因子，诸如瘦素和脂联素。治疗性蛋白的其它实例如下文及本文其它地方所述。还包括作为抗原提供的任何治疗性蛋白的片段或衍生物。
用于患有溶酶体贮积症的受试者的酶替代疗法的治疗性蛋白的实例包括但不限于用于治疗戈谢病的伊米苷酶(例如CEREZYMETM)、用于治疗法布里病的a-半乳糖苷酶A(a-gal A)(例如，阿加糖酶β,FABRYZYMETM)、用于治疗庞贝病的酸性阿葡糖苷酶(GAA)(例如，阿葡糖苷酶α、LUMIZYMETM、MYOZYMETM)、用于治疗粘多糖累积病的芳基硫酸酯酶B(例如，拉罗尼酶、ALDURAZYMETM、艾度硫酸酯酶、ELAPRASETM、芳基硫酸酯酶B、NAGLAZYMETM)。
酶的实例包括氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和连接酶。
激素的实例包括褪黑激素(N-乙酰基-5-甲氧基色胺)、血清素、甲状腺素(或四碘甲状腺原氨酸)(一种甲状腺激素)、三碘甲状腺原氨酸(一种甲状腺激素)、肾上腺素(Epinephrine)(或肾上腺素(adrenaline))、去甲肾上腺素(或正肾上腺素)、多巴胺(或催乳素抑制激素)、抗苗勒管激素(或苗勒管抑制因子或激素)、脂连素、促肾上腺皮质激素(或促皮质素(corticotropin))、血管紧张素原和血管紧张素、抗利尿激素(或加压素、精氨酸加压素)、心房钠尿肽(或心房肽)、降钙素、胆囊收缩素、促肾上腺皮质激素释放激素、红细胞生成素、卵泡刺激素、胃泌素、生长激素释放肽、胰高血糖素、胰高血糖素样肽(GLP-1)、GIP、促性腺激素释放激素、生长激素释放激素、人绒毛膜促性腺激素、人胎盘催乳素、生长激素、抑制素、胰岛素、胰岛素样生长因子(或生长介素)、瘦素、促黄体生成激素、促黑素细胞激素、食欲素、催产素、甲状旁腺激素、催乳素、松弛素、促胰液素、生长抑素、血小板生成素、促甲状腺激素(或促甲状腺素)、促甲状腺素释放激素、皮质醇、醛固酮、睾酮、脱氢表雄酮、雄烯二酮、双氢睾酮、雌二醇、雌酮、雌三醇、孕酮、骨化三醇(1,25-二羟基维生素D3)、骨化二醇(25-羟基维生素D3)、前列腺素类、白三烯类、前列环素、血栓烷、催乳素释放激素、促脂解素、脑钠肽、神经肽Y、组胺、内皮素、胰多肽、肾素和脑啡肽。
血液和凝血因子的实例包括因子I(纤维蛋白原)、因子II(凝血酶原)、组织因子、因子V(促凝血球蛋白原，不稳定因子)、因子VII(稳定因子，转变加速因子)、因子VIII(抗血友病球蛋白)、因子IX(圣克雷司马因子或血浆促凝血酶原激酶组分)、因子X(Stuart-Prower因子)、因子Xa、因子XI、因子XII(哈格曼因子)、因子XIII(纤维蛋白稳定因子)、vonWillebrand因子、前激肽释放酶(Fletcher因子)、高分子量激肽原(HMWK)(Fitzgerald因子)、纤连蛋白、纤维蛋白、凝血酶、抗凝血酶III、肝素辅因子II、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、蛋白Z相关蛋白酶抑制剂(ZPI)、纤溶酶原、α2-抗纤溶酶、组织纤溶酶原激活物(tPA)、尿激酶、纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI1)、纤溶酶原激活物抑制物-2(PAI2)、癌促凝剂和阿法依泊汀(Epogen，Procrit)。
细胞因子的实例包括淋巴因子、白细胞介素和趋化因子，1型细胞因子诸如IFN-γ、TGF-β，和2型细胞因子诸如IL-4、IL-10和IL-13。
生长因子的实例包括肾上腺髓质素(AM)、血管生成素(Ang)、自分泌运动因子、骨形态发生蛋白(BMP)、脑源性神经营养因子(BDNF)、表皮生长因子(EGF)、红细胞生成素(EPO)、成纤维细胞生长因子(FGF)、神经胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、生长分化因子-9(GDF9)、肝细胞生长因子(HGF)、肝癌衍生生长因子(HDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、迁移刺激因子、肌肉生长抑制素(GDF-8)、神经生长因子(NGF)和其它神经营养因子、血小板衍生生长因子(PDGF)、血小板生成素(TPO)、转化生长因子α(TGF-α)、转化生长因子β(TGF-β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、血管内皮生长因子(VEGF)、Wnt信号传导途径、胎盘生长因子(PlGF)、[(胎牛生长激素)](FBS)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6和IL-7。
单克隆抗体的实例包括阿巴伏单抗、阿昔单抗、阿达木单抗、阿德木单抗、阿非莫单抗、阿托珠单抗、培戈-阿拉赛珠单抗、ALD、阿仑单抗、喷替酸阿妥莫单抗(Altumomabpentetate)、麻安莫单抗(Anatumomab mafenatox)、安芦组单抗、抗胸腺细胞珠蛋白、阿泊珠单抗、阿西莫单抗、阿塞珠单抗、阿特利珠单抗(托利珠单抗)、阿托木单抗、巴匹组单抗、巴利昔单抗、巴维昔单抗、贝妥莫单抗、贝利木单抗、贝那利珠单抗、柏替木单抗、贝索单抗、贝伐单抗、比西单抗、莫星比伐珠单抗(Bivatuzumab mertansine)、博纳吐单抗、维布妥昔单抗(Brentuximab vedotin)、布雷奴单抗、卡那单抗、莫坎妥珠单抗(Cantuzumabmertansine)、卡罗单抗喷地肽(Capromab pendetide)、卡妥索单抗、西利珠单抗、培塞利珠单抗(Certolizumab pegol)、西妥昔单抗、泊西他组单抗(Citatuzumab bogatox)、西妥木单抗、克立昔单抗、泰坦-克利妥珠单抗、可那木单抗、达西组单抗、达利珠单抗、达雷妥尤单抗、地诺单抗、地莫单抗、阿托度单抗、多利昔单抗(Dorlixizumab)、依美昔单抗、依库珠单抗、埃巴单抗、依决洛单抗、依法利珠单抗、依芬古单抗、埃罗妥珠单抗、艾西莫单抗、培戈赖莫单抗、西依匹莫单抗、依帕珠单抗、厄利珠单抗、厄妥索单抗、埃达组单抗、艾韦单抗、法索单抗、法拉莫单抗、法妥组单抗、泛维珠单抗、非扎奴单抗、芬妥木单抗、芳妥珠单抗、福拉韦单抗、非苏木单抗、加利昔单抗、更汀芦单抗、加维莫单抗、吉妥珠单抗(Gemtuzumabozogamicin)、GC1008、吉妥昔单抗、维汀-格仑妥木单抗(Glembatumumab vedotin)、戈利木单抗、戈利昔单抗(Gomiliximab)、伊巴组单抗、替伊莫单抗、伊戈伏单抗、英西单抗、英夫利昔单抗、英妥木单抗、伊诺莫单抗、奥英妥珠单抗、伊匹木单抗、伊妥木单抗、凯利昔单抗、拉贝珠单抗、来瑞组单抗、来马索单抗、乐德木单抗、来沙木单抗、利韦单抗、林妥珠单抗、莫星-洛沃妥珠单抗、卢卡木单抗、鲁昔单抗、马帕木单抗、马司莫单抗、马妥珠单抗、美泊利单抗、美替木单抗、米拉组单抗、明瑞莫单抗、米妥莫单抗、莫罗木单抗、莫维组单抗、莫罗单抗-CD3、他那可单抗、埃托-那普妥莫单抗、那他珠单抗、奈巴库单抗、耐昔妥珠单抗、奈瑞莫单抗、尼妥珠单抗、诺非妥莫单抗、奥瑞组单抗、奥度莫单抗、奥法木单抗、奥拉木单抗、奥马珠单抗、莫妥组单抗、奥戈伏单抗、奥昔组单抗、帕昔单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、帕巴库单抗、帕考珠单抗、平妥单抗(Pemtumomab)、帕妥珠单抗、培克珠单抗、平妥莫单抗、普立昔单抗、普林木单抗、雷韦单抗、雷莫芦单抗、雷尼株单抗、雷昔库单抗、瑞加韦单抗瑞利珠单抗、利妥木单抗、利妥昔单抗、罗妥木单抗、隆利组单抗、罗维珠单抗、卢利珠单抗、沙妥莫单抗喷地肽、司韦单抗、西罗珠单抗、西法木单抗、司妥昔单抗、西利珠单抗、茄尼醇单、索奈珠单抗(Sonepcizumab)、索土珠单抗、司他芦单抗、硫索单抗、泰坦-克利妥珠单抗、他度组单抗、他利珠单抗、他尼组单抗、帕他普莫单抗(Taplitumomab paptox)、替非组单抗、阿替莫单抗、替妥莫单抗、替奈昔单抗、替利组单抗、替西木单抗(曲美木单抗)、替加组单抗、托珠单抗(他利珠单抗(atlizumab))、托拉珠单抗(Toralizumab)、托西莫单抗、曲妥珠单抗、替西木单抗、西莫白介素单抗、妥韦单抗、乌珠单抗、乌司奴单抗、伐利昔单抗、维得利珠单抗、维妥珠单抗、维帕莫单抗、维西珠单抗、伏洛昔单抗、伏妥莫单抗、扎芦木单抗、扎木单抗、齐拉木单抗和阿佐莫单抗。
输注疗法或可注射治疗性蛋白质的实例包括，例如，托珠单抗
Figure BDA0003815295380000411
α-1抗胰蛋白酶(Kamada/AAT)、
Figure BDA0003815295380000412
(Affymax和Takeda，合成肽)、白蛋白干扰素α-2b(NOVARTIS/ZALBINTM)、
Figure BDA0003815295380000413
(PharmingGroup,C1抑制剂替代疗法)、替莫瑞林(Theratechnologies/Egrifta，合成生长因子激素释放因子)、奥瑞珠单抗(Genentech,Roche and Biogen)、贝利木单抗
Figure BDA0003815295380000414
聚乙二醇尿酸酶(SAVIENT PHARMACEUTICALS/KRYSTEXXTM)、他利苷酶α(Protalix/Uplyso)、阿加糖酶α
Figure BDA0003815295380000415
维拉西酶α(velaglucerase alfa)(Shire)。
在一些实施方案中，结合结构域包含为TCR模拟物的抗体或其片段，例如结合MHC-肽复合物。
在一些实施方案中，结合结构域包含MHC-肽复合物。
在一些实施方案中，MHC-肽复合物的肽包含本文所述的任何自身抗原或外源性抗原或其片段，例如由APC产生的片段。
胞外结构域
TFP的胞外结构域可源自天然或重组来源。在来源是天然的情况下，所述结构域可源自任何蛋白质，但尤其为膜结合蛋白或跨膜蛋白。一方面，胞外结构域能够与跨膜结构域缔合。在本公开中特别使用的胞外结构域可以至少包括例如T细胞受体的α、β、γ、δ或ζ链或CD3ε、CD3γ或CD3δ的胞外结构域，或在替代实施方案中，CD28、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154的胞外结构域。
在一些实施方案中，胞外结构域是TCR胞外结构域。在一些情况下，TCR胞外结构域包含选自由以下组成的组的蛋白质的胞外结构域或其部分：TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基，其功能性片段，及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。
在一些实施方案中，胞外结构域包含或至少包含TCRα链、TCRβ链、TCRδ链或TCRγ链的胞外结构域的5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个或更多的连续氨基酸残基。在一些实施方案中，胞外结构域包含与编码TCRα链、TCRβ链、TCRδ链或TCRγ的链胞外结构域的序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更多序列同一性的序列。在一些实施方案中，胞外结构域包含编码TCRα链、TCRβ链、TCRδ链或TCRγ链的胞外结构域的序列，所述胞外结构域在N末端或C末端或者N末端和C末端具有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多的氨基酸的截短。
在一些实施方案中，胞外结构域包含或至少包含TCRα、TCRβ、TCRδ或TCRγ的IgC结构域的5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个或更多的连续氨基酸残基。在一些实施方案中，胞外结构域包含与编码TCRα、TCRβ、TCRδ或TCRγ的IgC结构域的序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更多序列同一性的序列。在一些实施方案中，胞外结构域包含编码TCRα、TCRβ、TCRδ或TCRγ的IgC结构域的序列，所述IgC结构域在N末端或C末端或者在N末端和C末端具有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多的个氨基酸的截短。
在一些实施方案中，胞外结构域包含或至少包含CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基或CD3δTCR亚基的胞外结构域的5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个或更多的连续氨基酸残基。在一些实施方案中，胞外结构域包含与编码CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基或CD3δTCR亚基的胞外结构域的序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更多序列同一性的序列。在一些实施方案中，胞外结构域包含编码CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基或CD3δTCR亚基的胞外结构域的序列，所述胞外结构域在N末端或C末端或N末端和C末端具有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多的氨基酸的截短。
胞外结构域可以是TCR胞外结构域。TCR胞外结构域可以源自TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基或CD3δTCR亚基。胞外结构域可以是全长TCR胞外结构域或其片段(例如，功能性片段)。胞外结构域可以包含TCRα链、TCRβ链、TCRγ链或TCRδ链的可变结构域。胞外结构域可以包含TCRα链、TCRβ链、TCRγ链或TCRδ链的可变结构域和恒定结构域。在一些情况下，胞外结构域可以不包含可变结构域。
胞外结构域可以包含TCRα链、TCRβ链、TCRγ链或TCRδ链的恒定结构域。胞外结构域可以包含TCRα链、TCRβ链、TCRγ链或TCRδ链的全长恒定结构域。胞外结构域可以包含TCRα链、TCRβ链、TCRγ链或TCRδ链的全长恒定结构域的片段(例如，功能性片段)。例如，胞外结构域可以包含TCRα链、TCRβ链、TCRγ链或TCRδ链的恒定结构域的至少约5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、150个或更多的氨基酸残基。
本文所述的TCRα链、TCRβ链、TCRγ链或TCRδ链可以源自各种物种。TCR链可以是鼠或人的TCR链。例如，胞外结构域可以包含鼠TCRα链、鼠TCRβ链、人TCRγ链或人TCRδ链的恒定结构域。
跨膜结构域
一般来说，TFP序列可包含由单个基因组序列编码的胞外结构域和跨膜结构域。在替代实施方案中，可将TFP设计为包含与TFP的胞外结构域异源的跨膜结构域。跨膜结构域可包含与跨膜区域相邻的一个或多个另外的氨基酸，例如，与跨膜结构域所源自的蛋白质的细胞外区域相关的一个或多个氨基酸(例如，细胞外区域的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或更多个氨基酸)和/或与跨膜蛋白所源自的蛋白质的细胞内区域相关的一种或多种另外的氨基酸(例如，细胞内区域的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或更多个氨基酸)。在一些情况下，跨膜结构域可包括细胞外区域的至少30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个或更多个氨基酸。在一些情况下，跨膜结构域可包含细胞内区域的至少30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个或更多个氨基酸。一方面，跨膜结构域是与所使用的TFP的另外的结构域之一相关的跨膜结构域。在一些情况下，可通过氨基酸取代选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，例如，以使与受体复合物的其它成员的相互作用最小化。一方面，跨膜结构域能够与TFP-T细胞表面上的另一TFP同源二聚化。在不同的方面，可修饰或取代跨膜结构域的氨基酸序列，以使与存在于同一TFP中的天然结合配偶体的结合结构域的相互作用最小化。
跨膜结构域可源自天然或重组来源。如果来源是天然的，则所述结构域可源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。一方面，每当TFP已与靶标结合时，跨膜结构域就能够向一个或多个胞内结构域传导信号。在本公开中具有特定用途的跨膜结构域可包括以下的至少一个或多个跨膜区：T细胞受体、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154的α链、β链、γ链、δ链或ζ链，其功能性片段，及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。
在一些实施方案中，跨膜结构域包含或至少包含TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基或CD3δTCR亚基的跨膜结构域的5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个或更多的连续氨基酸残基。在一些实施方案中，跨膜结构域包含与编码TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基或CD3δTCR亚基的跨膜结构域的序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更多序列同一性的序列。在一些实施方案中，跨膜结构域包含编码TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基或CD3δTCR亚基的跨膜结构域的序列，所述跨膜结构域在N末端或C末端或者在N末端和C末端具有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个或更多的氨基酸的截短。
在一些情况下，TFP的胞外区可以通过铰链(例如，来自人蛋白质的铰链)连接到TFP的TFP的结合结构域。例如，在一个实施方案中，铰链可以是人免疫球蛋白(Ig)铰链，例如IgG4铰链或CD8a铰链。
任选地，长度在2至10个氨基酸之间的短的寡肽或多肽接头可以形成结合元件与TFP的TCR胞外结构域之间的键联。在一些情况下，接头的长度可以是至少约5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的接头。例如，一个方面，接头包含GGGGSGGGGS的氨基酸序列或序列(GGGGS)x或(G4S)n，其中X或n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多。在一些实施方案中，X或n是1至10的整数。在一些实施方案中，X或n是1至4的整数。在一些实施方案中，X或n是是2。在一些实施方案中，X或n是4。在一些实施方案中，接头由为GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC的核苷酸序列编码。
胞质结构域
TFP的胞质结构域可以包括胞内结构域。在一些实施方案中，胞内结构域来自CD3γ、CD3δ、CD3ε、TCRα、TCRβ、TCRγ或TCRδ。在一些实施方案中，如果TFP包含CD3γ、CD3δ或CD3ε多肽，则胞内结构域包含信号传导结构域；TCRα亚基、TCRβ亚基、TCRγ亚基和TCRδ亚基通常具有短的(例如，长度为1-19个氨基酸)胞内结构域，并且通常缺乏信号传导结构域。胞内信号传导结构域可负责激活其中已经引入了TFP的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。虽然TCRα、TCRβ、TCRγ和TCRδ的胞内结构域没有信号传导结构域，但是它们能够募集具有本文所述的初级胞内信号传导结构域的蛋白质，例如CD3ζ，其作为胞内信号传导结构域发挥作用。术语“效应子功能”是指细胞的专用功能。例如，T细胞的效应子功能可以是溶细胞活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“胞内信号传导结构域”是指转导效应子功能信号并指导细胞执行专用功能的蛋白质的部分。虽然通常可以使用整个胞内信号传导结构域，但在许多情况下，没有必要使用整条链。就使用胞内信号传导结构域的截短部分而言，这种截短的部分可用来代替完整链，只要其传导效应子功能信号。因此，术语胞内信号传导结构域意味着包括足以传导效应子功能信号的胞内信号传导结构域的任何截短部分。
用于本公开的TFP的胞内结构域的实例包括T细胞受体(TCR)和共受体的细胞质序列以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何重组序列，所述T细胞受体(TCR)和共受体能够协同作用以在抗原受体结合后启动信号传导。
用于本公开的TFP的胞内结构域的实例包括T细胞受体(TCR)和共受体的细胞质序列以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何重组序列，所述T细胞受体(TCR)和共受体能够协同作用以在抗原受体结合后启动信号传导。在一些实施方案中，胞内结构域包含TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基或CD3δTCR亚基的胞内结构域。在一些实施方案中，胞内结构域包含或至少包含TCRα链、TCRβ链、TCRγ链或TCRδ链的胞内结构域的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个或19个或更多的连续氨基酸残基。在一些实施方案中，胞内结构域包含与编码TCRα链、TCRβ链、TCRγ链或TCRδ链的胞内结构域的序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更多序列同一性的序列。在一些实施方案中，跨膜结构域包含编码TCRα链、TCRβ链、TCRγ链或TCRδ链的胞内结构域的序列，胞内结构域在N末端或C末端或者N末端和C末端具有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个或更多的氨基酸的截短。
在一些实施方案中，胞内结构域包含或至少包含CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基或CD3δTCR亚基的胞内结构域的5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个或62个或更多个连续氨基酸残基。在一些实施方案中，胞内结构域包含与编码CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基或CD3δTCR亚基的胞内结构域的序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更多序列同一性的序列。在一些实施方案中，胞内结构域包含编码CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基或CD3δTCR亚基的胞内结构域的序列，胞内结构域在N末端或C末端或者N末端和C末端具有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个氨基酸的截短。
次级和/或共刺激信号可被需要来通过TCR产生信号以完全活化初始T细胞。因此，初始T细胞活化可由两类不同的胞质信号传导序列(通过TCR启动抗原依赖性初级激活的那些序列(初级胞内信号传导结构域)和以不依赖于抗原的方式起作用以提供次级或共刺激信号的那些序列(次级胞质结构域，例如，共刺激结构域))介导的。
初级信号传导结构域以刺激方式或抑制方式调节TCR复合物的初级激活。以刺激方式起作用的初级胞内信号传导结构域可包含信号传导基序，所述信号传导基序被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。
在本公开中特别有用的含ITAM的初级胞内信号传导结构域的实例包括CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些初级胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，本公开的TFP包含胞内信号传导结构域，例如，CD3-ε的初级信号传导结构域。在一个实施方案中，初级信号传导结构域包含经修饰的ITAM结构域，例如，突变的ITAM结构域，其与天然ITAM结构域相比具有改变的(例如，增强的或减弱的)活性。在一个实施方案中，初级信号传导结构域包括经修饰的含ITAM的初级胞内信号传导结构域，例如，优化的和/或截短的含ITAM的初级胞内信号传导结构域。在实施方案中，初级信号传导结构域包含一个、两个、三个、四个或更多个ITAM基序。
TFP的胞内信号传导结构域可以自身包含CD3ζ信号传导结构域，或者其可以与在本公开的TFP的情况下有用的一个或多个任何其它所需胞内信号传导结构域组合。例如，TFP的胞内信号传导结构域可包含CD3ε链部分和共刺激信号传导结构域。共刺激信号传导结构域是指包含共刺激分子的胞内结构域的TFP的部分。共刺激分子是除抗原受体或其配体外的细胞表面分子，其是淋巴细胞对抗原的高效反应所必需的。此类分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3以及与CD83特异性结合的配体等。
本公开的TFP的细胞质部分内的胞内信号传导序列可以以随机或指定的顺序相互连接。任选地，例如长度为2至10个氨基酸(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸)的短寡肽或多肽接头可在胞内信号传导序列之间形成键联。
在一个实施方案中，甘氨酸-丝氨酸双联体可用作合适的接头。在一个实施方案中，单个氨基酸，例如，丙氨酸、甘氨酸可用作合适的接头。
一方面，本文所述的表达TFP的细胞还可包含第二TFP，例如，包含例如针对相同靶标或不同靶标的不同抗原结合结构域的第二TFP。在一个实施方案中，当表达TFP的细胞包含两种或多种不同的TFP时，不同TFP的抗原结合结构域可以使得抗原结合结构域不会彼此相互作用。例如，表达第一TFP和第二TFP的细胞可具有第一TFP的抗原结合结构域，例如，如不会与第二TFP的抗原结合结构域形成缔合的片段(例如，scFv)，例如，第二TFP的抗原结合结构域为VHH。
另一方面，本文所述的表达TFP的细胞还可表达另一种剂，例如，增强经修饰的T细胞的活性的剂。例如，在一个实施方案中，剂可以是抑制抑制性分子的剂。在一些实施方案中，抑制性分子，例如PD1，可降低经修饰的T细胞产生免疫效应物反应的能力。抑制性分子的实例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFRβ。在一个实施方案中，抑制抑制性分子的剂包含第一多肽(例如，抑制性分子)，所述第一多肽与向细胞提供阳性信号的第二多肽(例如，本文所述的胞内信号传导结构域)缔合。在一个实施方案中，剂包含例如抑制性分子诸如PD1、LAG3、CTLA4、CD160、BTLA、LAIR1、TIM3、2B4和TIGIT或任何这些多肽的片段(例如，任何这些多肽的胞外结构域的至少一部分)的第一多肽，和第二多肽，其为本文所述的胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域(例如，4-1BB、CD27或CD28，例如，如本文所述的))和/或初级信号传导结构域(例如，本文所述的CD3ζ信号传导结构域)。在一个实施方案中，剂包含PD1或其片段(例如，PD1的胞外结构域的至少一部分)的第一多肽，和本文所述的胞内信号传导结构域(例如，本文所述的CD28信号传导结构域和/或本文所述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。PD1是CD28受体家族的抑制性成员，所述家族还包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD-1在活化的B细胞、T细胞和髓样细胞上表达(Agata等人1996Int.Immunol8:765-75)。PD1的两个配体PD-L1和PD-L2，已被证明在与PD1结合时下调T细胞活化(Freeman等人2000J.Exp.Med.192:1027-34；Latchman等人2001Nat.Immunol.2:261-8；Carter等人2002Eur.J.Immunol.32:634-43)。PD-L1在人癌症中很丰富(Dong等人2003J.Mol.Med.81:281-7；Blank等人2005CancerImmunol.Immunother.54:307-314；Konishi等人2004Clin.Cancer.Res.10:5094)。免疫抑制可以通过抑制PD1与PD-L1的局部相互作用来逆转。
在一个实施方案中，剂包含抑制性分子的胞外结构域(ECD)，例如，程序性死亡1(PD1)可与跨膜结构域和任选的胞内信号传导结构域诸如41BB和CD3ζ融合(在本文也称为PD1 TFP)。在一个实施方案中，当与本文所述的抗自身抗原TFP组合使用时，PD1 TFP延长了T细胞的持久性。在一个实施方案中，TFP是包含PD 1胞外结构域的PD1 TFP。或者，提供了含有与程序性死亡配体1(PD-L1)或程序性死亡配体2(PD-L2)特异性结合的抗体或抗体片段诸如scFv的TFP。
另一方面，本公开提供了表达TFP的T细胞(例如，TFP-T细胞)群。在一些实施方案中，表达TFP的T细胞群包括表达不同TFP的细胞的混合物。例如，在一个实施方案中，TFP-T细胞群可包括第一细胞和第二细胞，所述第一细胞表达具有本文所述的结合结构域的TFP，所述第二细胞表达具有不同的抗自身抗原结合结构域，例如，与由所述第一细胞表达的TFP中的结合结构域相异的本文所述的结合结构域的TFP。作为另一个实例，表达TFP的细胞群可包括第一细胞和第二细胞，所述第一细胞表达包括例如，如本文所述的第一结合结构域的TFP，所述第二细胞表达包括针对除第一细胞的结合结构域外的靶标(例如，另一种自身免疫抗原)的抗原结合结构域的TFP。
另一方面，本公开提供了细胞群，其中所述群中的至少一个细胞表达具有本文所述的结构域的TFP，并且第二细胞表达另一种剂，例如，增强经修饰的T细胞的活性的剂。例如，在一个实施方案中，剂可以是抑制抑制性分子的剂。例如，在一些实施方案中，抑制性分子可以降低经修饰的T细胞产生免疫效应物反应的能力。抑制性分子的实例包括PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFRβ。在一个实施方案中，抑制抑制性分子的剂包含第一多肽，例如，抑制性分子，其与向细胞提供阳性信号的第二多肽(例如，本文所述的胞内信号传导结构域)缔合。
本文公开了用于产生体外转录的编码TFP的RNA的方法。本公开还包括可被直接转染到细胞中的编码TFP的RNA构建体。用于产生用于转染的mRNA的方法可包括用特别设计的引物体外转录(IVT)模板，随后添加polyA，以产生含有3’和5’非翻译序列(“UTR”)、5’帽和/或内部核糖体进入位点(IRES)、待表达的核酸和polyA尾(通常长度为50-2000个碱基)的构建体。如此产生的RNA可高效地转染不同种类的细胞。一方面，模板包括TFP的序列。
一方面，抗自身抗原TFP由信使RNA(mRNA)编码。一个方面，将编码抗自身抗原TFP的mRNA引入T细胞以产生TFP-T细胞。在一个实施方案中，可将体外转录的RNA TFP作为瞬时转染的形式引入细胞。使用聚合酶链式反应(PCR)生成的模板，通过体外转录产生RNA。可使用合适的引物和RNA聚合酶，通过PCR将来自任何来源的目标DNA直接转化为用于体外mRNA合成的模板。DNA的来源可以是，例如，基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、cDNA、合成DNA序列或任何其它合适的DNA来源。用于体外转录的所需模板是本公开TFP。在一个实施方案中，用于PCR的DNA包含开放阅读框。DNA可来自生物体的基因组中天然存在的DNA序列。在一个实施方案中，核酸可包括5’和/或3’非翻译区(UTR)的一些或全部。核酸可包含外显子和内含子。在一个实施方案中，用于PCR的DNA是人核酸序列。在另一个实施方案中，用于PCR的DNA是包括5’和3’UTR的人核酸序列。或者，DNA可以是在天然存在的生物体中不正常表达的人工DNA序列。示例性人工DNA序列是含有基因的部分的人工序列，所述基因的部分被连接在一起形成编码融合蛋白的开放阅读框。连接在一起的DNA的部分可以来自单个生物体，也来自多个生物体。
关于制备和使用TFP T细胞的其它信息，参见美国专利第10,442,849号、第10,358,473号、第10,358,474号和第10,208,285号，所述专利的每一篇均通过引用并入本文。
编码TFP的核酸构建体
本公开提供了编码本文所述的一种或多种TFP构建体的核酸分子。一方面，核酸分子作为信使RNA转录物提供。一方面，核酸分子作为DNA构建体提供。
在一些情况下，核酸选自由DNA和RNA组成的组。在一些情况下，核酸是mRNA。在一些情况下，重组核酸包含核酸类似物，其中所述核酸类似物不在重组核酸的编码序列中。在一些情况下，核酸类似物选自由以下组成的组：2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)、2'-O-氨基丙基、2'-脱氧、T-脱氧-2'-氟、2'-O-氨基丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲基氨基乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲基氨基丙基(2'-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)、2'-O-N-甲基乙酰氨基(2'-O-NMA)修饰的、锁核酸(LNA)、乙烯核酸(ENA)、肽核酸(PNA)、1',5'-脱水己糖醇核酸(HNA)、吗啉代、甲基膦酸酯核苷酸、硫代膦酸酯核苷酸和2'-氟N3-P5'-亚磷酰胺。
在一些情况下，重组核酸还包含前导序列。在一些情况下，重组核酸还包含启动子序列。在一些情况下，重组核酸还包含编码poly(A)尾的序列。在一些情况下，重组核酸还包含3’UTR序列。在一些情况下，核酸是分离的核酸或非天然存在的核酸。在一些情况下，核酸是体外转录的核酸。
在一些情况下，重组核酸还包含编码TCRα跨膜结构域的序列。在一些情况下，重组核酸还包含编码TCRβ跨膜结构域的序列。在一些情况下，重组核酸还包含编码TCRα跨膜结构域的序列和编码TCRβ跨膜结构域的序列。
在一些实施方案中，重组核酸分子还可包含编码TCR恒定结构域的序列，其中TCR恒定结构域是TCRα恒定结构域、TCRβ恒定结构域、TCRα恒定结构域和TCRβ恒定结构域、TCRγ恒定结构域、TCRδ恒定结构域或TCRγ恒定结构域和TCRδ恒定结构域。TCR亚基和抗体可以可操作地连接。当在T细胞中表达时，所述TFP可以功能性掺入TCR复合物(例如，内源TCR复合物)中。
本文所述的TCRα链、TCRβ链、TCRγ链或TCRδ链可以源自各种物种。TCR链可以是鼠或人的TCR链。例如，恒定结构域可以包括鼠或人TCRα链、TCRβ链、TCRγ链或TCRδ链的恒定结构域。
在一些情况下，重组核酸编码TFP，其包含(i)结合结构域和(ii)CD3ε、CD3γ或CD3δ的TCR胞外结构域、TCR跨膜结构域和TCR胞内结构域的至少一部分，并且重组核酸还编码TCRα链、TCRβ链、TCRγ链或TCRδ链的恒定结构域。在一些实施方案中，重组核酸还编码TCRα链和TCRβ链的恒定结构域。在一些实施方案中，重组核酸还编码TCRγ链和TCRδ链的恒定结构域。
在一些情况下，重组核酸编码TFP，其包含TCRα链的(i)结合结构域和(ii)恒定结构域(即，包含TCR胞外结构域、TCR跨膜结构域和TCR胞内结构域的至少一部分)，并且重组核酸还编码TCRβ链的恒定结构域。编码TCRβ恒定结构域的序列还可编码第二结合结构域，其与编码TCRβ恒定结构域的序列可操作地连接。第二结合结构域可以与TFP的结合结构域域相同或不同。
在一些情况下，重组核酸编码TFP，其包含TCRβ链的(i)结合结构域和(ii)恒定结构域(即，包含TCR胞外结构域、TCR跨膜结构域和TCR胞内结构域的至少一部分)，并且重组核酸还编码TCRα链的恒定结构域。编码TCRα恒定结构域的序列还可编码第二结合结构域，其与编码TCRα恒定结构域的序列可操作地连接。第二结合结构域可以与TFP的结合结构域域相同或不同。
在一些情况下，重组核酸编码TFP，其包含TCRγ链的(i)结合结构域和(ii)恒定结构域(即，包含TCR胞外结构域、TCR跨膜结构域和TCR胞内结构域的至少一部分)，并且重组核酸还编码TCRδ链的恒定结构域。编码TCRδ恒定结构域的序列还可编码第二结合结构域，其与编码TCRδ恒定结构域的序列可操作地连接。第二结合结构域可以与TFP的结合结构域域相同或不同。
在一些情况下，重组核酸编码TFP，其包含TCRδ链的(i)结合结构域和(ii)恒定结构域(即，包含TCR胞外结构域、TCR跨膜结构域和TCR胞内结构域的至少一部分)，并且重组核酸还编码TCRγ链的恒定结构域。编码TCRγ恒定结构域的序列还可编码第二结合结构域，其与编码TCRγ恒定结构域的序列可操作地连接。第二结合结构域可以与TFP的结合结构域域相同或不同。
编码所需分子的核酸序列可使用本领域已知的重组方法获得，例如，通过筛选来自表达该基因的细胞的文库，通过从已知包含该基因的载体中获得该基因，或者通过使用标准技术从含有该基因的细胞和组织中直接分离。或者，可通过合成而非克隆来产生目标基因。
本公开还提供了其中插入了本公开的DNA的载体。源自逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期稳定整合及其在子细胞中的繁殖。慢病毒载体相对于源自肿瘤逆转录病毒诸如鼠白血病病毒的载体具有额外的优势，因为它们可以转导非增殖细胞，诸如肝细胞。它们还具有免疫原性低的额外优势。
在另一个实施方案中，包含编码本公开的所需TFP的核酸的载体是腺病毒载体(A5/35)。在另一个实施方案中，编码TFP的核酸的表达可使用转座子诸如sleepingbeauty、crisper、CAS9和锌指核酸酶来完成。(参见，June等人2009Nature ReviewsImmunol.9.10:704-716，通过引用并入本文)。
还可使用标准的基因递送方案将本公开的表达构建体用于核酸免疫和基因疗法。用于基因递送的方法是本领域已知的(参见，例如，美国专利第5,399,346号、第5,580,859号、第5,589,466号，通过引用整体并入本文)。在另一个实施方案中，本公开提供了基因治疗载体。
可将核酸克隆到许多类型的载体中。例如，可将核酸克隆到载体中，载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别吸引人的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。
另外，还可以以病毒载体的形式向细胞提供表达载体。病毒载体技术在本领域中是公知的，并且在例如Sambrook等人，2012，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第1-4卷，Cold Spring Harbor Press,NY)和其它病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。一般而言，合适的载体包含在至少一种生物体中起作用的复制起始位点、启动子序列、方便的限制性内切酶位点以及一个或多个选择标记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利第6,326,193号)。
已经开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了方便的平台。可使用本领域已知的技术将选定的基因插入载体中并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可分离重组病毒并在体内或离体地将其递送至受试者的细胞。许多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体是本领域已知的。在一个实施方案中，使用慢病毒载体。
另外的启动子元件，例如，增强子，调控转录起始的频率。通常，这些启动子位于起始位点上游30-110bp的区域，尽管许多启动子也显示出在起始位点下游含有功能元件。启动子元件之间的间隔通常是灵活的，因此当元件相对于彼此倒置或移动时，启动子功能得以保留。在胸苷激酶(tk)启动子中，可将启动子元件之间的间隔增加至相隔50bp，然后活性开始下降。根据启动子的不同，似乎单个元件可以协同或独立地激活转录。
能够在哺乳动物T细胞中表达TFP转基因的启动子的实例是EF1a启动子。天然EF1a启动子驱动延伸因子-1复合物的α亚基表达，所述亚基负责氨酰基tRNA向核糖体的酶促递送。EF1a启动子已被广泛用于哺乳动物表达质粒中，并已被证明能有效地驱动从克隆到慢病毒载体中的转基因表达TFP(参见，例如，Milone等人，Mol.Ther.17(8):1453-1464(2009))。启动子的另一个实例是早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是强组成型启动子序列，其能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。然而，还可使用其它组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、延伸因子-1a启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。另外，本公开不应限于组成型启动子的使用。诱导型启动子也被认为是本公开的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其在需要这种表达时，能够开启与其有可操作地连接的多核苷酸序列的表达，或者在不需要表达时，关闭该表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素调节的启动子。
为了评估TFP多肽或其部分的表达，待引入细胞的表达载体也可包含选择标记基因或报告基因或这两者，以便于从寻求通过病毒载体转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其它方面，可在单独的DNA片段上携带选择标记并将其用于共转染程序。选择标记基因和报告基因两侧都可具有适当的调控序列，以使其能够在宿主细胞中表达。有用的选择标记包括，例如，抗生素抗性基因，诸如neo等。
报告基因可用于鉴定潜在地转染的细胞和用于评估调控序列的功能性。一般而言，报告基因是受者生物体或组织中不存在或不由其表达的基因，其编码其表达表现为一些可易于检测的性质(例如，酶促活性)的多肽。在将DNA引入受者细胞后的合适时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰基转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因因(例如，Ui-Tei等人，2000FEBSLetters 479:79-82)。合适的表达系统是公知的，并且可使用已知技术制备或商购获得。一般而言，具有显示报告基因最高表达水平的最小5’侧翼区的构建体被鉴定为启动子。此类启动子区域可与报告基因连接，并用于评估剂的调节启动子驱动的转录的能力。
在表达载体的情况下，载体可通过本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，可通过物理、化学或生物手段将表达载体转移到宿主细胞中。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂转染、微粒轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。(参见，例如，Sambrook等人，2012,Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第1-4卷，ColdSpring Harbor Press,NY)。将多核苷酸引入宿主细胞的一种方法可以是磷酸钙转染。
将目标多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括DNA和RNA载体的使用。病毒载体，尤其是逆转录病毒载体，已经成为将基因插入哺乳动物(例如，人细胞)的最广泛使用的方法。其它病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I型、腺病毒和腺相关病毒等(参见，例如，美国专利第5,350,674号和第5,585,362号。
将多核苷酸引入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。现有技术水平的核酸靶向递送的其它方法也是可用的，诸如用靶向纳米颗粒或其它合适的亚微米大小的递送系统递送多核苷酸。
在使用非病毒递送系统的情况下，示例性递送媒介物是脂质体。设想了使用脂质制剂将核酸引入宿主细胞(体外、离体或体内)。另一方面，可将核酸与脂质缔合。与脂质缔合的核酸可被包封在脂质体的含水内部，散布在脂质体的脂质双层内，通过与脂质体和寡核苷酸都缔合的连接分子附接至脂质体上，被包封在脂质体中，与脂质体复合，分散在含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或者以其它方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关的组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以存在于双层结构中，如胶束，或具有“塌陷的”结构。它们也可以简单地分散在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，其可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴，以及含有长链脂肪族烃及其衍生物诸如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛的化合物类。
适合使用的脂质可从商业来源获得。例如，二肉豆蔻基磷脂酰胆碱(“DMPC”)可从Sigma,St.Louis,Mo.获得；磷酸联十六烷基酯(“DCP”)可从K&K Laboratories(Plainview,N.Y.)获得；胆固醇(“Choi”)可从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻基磷脂酰甘油(“DMPG”)和其它脂质可以从Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,Ala.)获得。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的原液可在约-20℃下储存。将氯仿用作唯一的溶剂，因为其比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是通用术语，其涵盖通过生成封闭的脂质双层或聚集体形成的各种单层和多层脂质媒介物。脂质体可被表征为具有拥有磷脂双层膜和内部含水介质的囊泡结构。多层脂质体具有被含水介质分隔的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，它们会自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前经历自我重排，并在脂质双层之间截留水和溶解的溶质(Ghosh等人，1991Glycobiology 5:505-10)。然而，在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物也被涵盖在内。例如，脂质可能呈现胶束结构，或者仅仅作为脂质分子的不均匀聚集体而存在。还设想了lipofectamine-核酸复合物。
无论用于将外源核酸引入宿主细胞或以其它方式将细胞暴露于本公开的抑制剂的方法如何，为了确认宿主细胞中重组DNA序列的存在，可进行多种测定。此类测定包括，例如，本领域技术人员公知的“分子生物学”测定，诸如DNA印迹和RNA印迹、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，诸如检测特定肽的存在或不存在，例如，通过免疫学手段(ELISA和蛋白质印迹法)或通过本文所述的鉴定属于本发明范围内的剂的测定。
本公开还提供了包含编码TFP的核酸分子的载体。一方面，可将TFP载体直接转导到细胞(例如，T细胞)中。一方面，载体是克隆性载体或表达载体，例如包括但不限于一种或多种质粒(例如，表达质粒、克隆性载体、微环、微载体、双微体(double minutechromosomes))、逆转录病毒和慢病毒载体构建体的载体。一方面，载体能够在哺乳动物T细胞中表达TFP构建体。一方面，哺乳动物T细胞是人T细胞。
本文公开了用于体外或体内产生编码TFP的转录RNA的方法。在优选实施方案中，RNA是环状RNA。在一些实施方案中，环状RNA是外源性的。在其它实施方案中，环状RNA是内源性的。在其它实施方案中，具有内部核糖体进入位点(IRES)的环状RNA可被体外或离体翻译。
环状RNA(circRNA)是一类具有连续结构的单链RNA，其具有增强的稳定性，并且缺乏与各种细胞蛋白质相互作用所必需的末端基序。环状RNA是3-5’共价闭合的RNA环，并且环状RNA不显示帽或poly(A)尾。因为环状RNA缺乏核酸外切酶介导的降解所必需的自由端，使它们对几种RNA周转机制具有抗性，并且与它们的线性mRNA对应物相比，赋予它们延长的寿命。由于这个原因，环化可以允许稳定通常半衰期短的mRNA，因此可以提高mRNA在各种应用中的整体功效。环状RNA通过剪接过程产生，并且环化主要在注释的外显子边界使用常规剪接位点发生(Starke等人，2015年；Szabo等人，2015年)。对于环化，反向使用剪接位点：下游剪接供体被“反向剪接(backspliced)”到上游剪接受体(关于综述，参见Jeck和Sharpless，2014年；Barrett和Salzman,2016年；Szabo和Salzman,2016年；Holdt，2018年)。
为了产生可以随后转移到细胞中的环状RNA，可以对具有自动催化剪接内含子的环状RNA的体外生产进行编程。用于产生环状RNA的方法可以包括用专门设计的引物体外转录(IVT)前体线性RNA模板。迄今为止，已报道了三种RNA环化的一般策略：使用溴化氰或类似缩合剂的化学方法，使用RNA或DNA连接酶的酶促法，以及使用自我剪接内含子的核酶法。在优选实施方案中，通过失控转录(run-off transcription)合成前体RNA，然后在镁离子和GTP存在的情况下加热以促进环化。如此产生的RNA可以高效地转染不同种类的细胞。一方面，模板包括TFP的序列。
噬菌体T4胸苷酸合酶(td)基因的I组内含子可以很好地表征为环化，同时外显子线性地剪接在一起(Chandry和Bel-fort，1987年；Ford和Ares,1994；Perriman和Ares，1998年)。当td内含子顺序在任何外显子序列两侧置换时，外显子通过两个自动催化酯交换反应而环化(Ford和Ares，1994年；Puttaraju和Been，1995年)。在优选实施方案中，噬菌体T4胸苷酸合酶(td)基因的I组内含子用于产生外源性环状RNA。
在一些示例性实施方案中，已经使用了利用置换的I组催化内含子的核酶法，因为其更适用于长RNA环化，并且只需要添加GTP和Mg2+作为辅因子。这种置换的内含子-外显子(PIE)剪接策略由两侧为半内含子序列的融合的部分外显子组成。在体外，这些构建体经历了I组催化内含子所特有的双重酯交换反应，但是因为外显子是融合的，所以它们被切割为共价5’和3’连接的环。
一方面，本文公开了含有全长脑心肌炎病毒(诸如EMCV)IRES、编码TFP的基因、对应于外显子片段(E1和E2)的两个短区域和PIE构建体的序列，所述PIE构建体位于T4噬菌体的胸苷酸合酶(Td)基因中置换的I组催化内含子或鱼腥藻属的前tRNA基因中置换的I组催化内含子的3’与5’内含子之间。在更优选实施方案中，所述序列还包含位于前体RNA的5’和3’末端的互补‘同源臂’,目的是使5’和3’剪接位点彼此接近。为了确保主要的剪接产物是环状的，可以用RNA酶R处理剪接反应。
工程化的调节性T细胞
本公开提供了可用于充当调节性T细胞的工程化的(例如，经修饰的)细胞。
炎症可以是身体组织对有害刺激物(诸如病原体、受损细胞或刺激剂)的复杂生物反应的一部分，并且可以是涉及免疫细胞、血管和分子介质的保护性反应。炎症的功能可以消除细胞损伤的最初原因，清除因最初损伤和炎症过程而受损的坏死细胞和组织，并启动组织修复。炎症可由感染引起或作为疾病，例如自身免疫性疾病、动脉粥样硬化、过敏、肌病、HIV、肥胖症或自身免疫性疾病的症状出现。
自身免疫性疾病可以是由对自身抗原的异常免疫反应引起的慢性疾病。可用本文公开的TFP T细胞及其变体治疗的自身免疫性疾病包括但不限于葡萄膜炎、大疱性类天疱疮、狼疮(包括系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮性肾炎(LN)、盘状狼疮、深部红斑狼疮、冻疮样红斑狼疮(Chilbrain lupus erythematosus)、肿胀性红斑狼疮(tumidus lupuserythematosus)、重症系统性红斑狼疮、急性皮肤狼疮、慢性皮肤狼疮)、多发性硬化、视神经脊髓炎(NMO)、自身免疫性边缘脑炎(LE)、桥本氏病、N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)脑炎、自身免疫性溶血性贫血、寻常性天疱疮、重症肌无力、格雷夫斯病、特发性血小板减少性紫癜、古德帕斯彻综合征、类风湿性关节炎、乳糜泻、恶性贫血、白癜风、硬皮病、银屑病、溃疡性结肠炎(UC)、克罗恩病、干燥综合征(Sjogren's syndrome)、韦格纳肉芽肿病、多发性肌炎、皮肌炎、原发性胆汁性肝硬化、抗磷脂综合征、混合性结缔组织病、米勒-费希尔综合征、格林-巴利综合征、急性运动轴索神经病、自身免疫性肝炎、疱疹样皮炎、Churg-Strauss病、显微镜下多血管炎、IgA肾病、由ANCA和其它ANCA相关疾病引起的血管炎、急性风湿热、恶性贫血、1型糖尿病(T1D)、反应性关节炎(Reiter综合征)、膜性肾病、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、血栓性血小板减少性紫癜、单克隆丙种球蛋白病中的高粘血症、溶血性尿毒症综合征(非典型，由于针对因子H的抗体)、威尔逊病、暴发性Lambert-Eaton肌无力综合征、妊娠期红细胞同种异体免疫、蘑菇中毒、急性播散性脑脊髓炎、溶血性尿毒症综合征(非典型，由于补体因子突变)、自身免疫性溶血性贫血(危及生命的冷凝集素病)、骨髓瘤管型肾病、输血后紫癜、自身免疫性溶血性贫血(温热性自身免疫性溶血性贫血)、高甘油三酯血症性胰腺炎、甲状腺风暴、僵人综合征、溶血性尿毒症综合征(典型的腹泻相关)、免疫性血小板减少症、ABO血型不合的实体器官移植(SOT)、冷球蛋白血症、肝素诱导的血小板减少症、甲状腺危象、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病、局灶节段性肾小球硬化和暴发性肝功能衰竭。
调节性T细胞(Treg)在维持免疫细胞稳态中可以是重要的，正如Treg群体的遗传或物理消融的灾难性后果所证明的。具体来说，Treg细胞可以通过对其它免疫细胞实施显性负调控来维持免疫系统的秩序。大致分为天然或适应性(例如，诱导的)Treg；天然Treg是CD4+CD25+ T细胞，其从胸腺发育并迁移，在免疫稳态中发挥关键作用。适应性Treg可以是在胸腺外获得CD25(IL-2Rα)表达的非调节性CD4+ T细胞，并且通常由炎症和疾病过程诸如自身免疫和自身免疫性疾病诱导。
Treg可以通过多种机制表现其功能，所述机制包括分泌免疫抑制性可溶性因子诸如IL-9、IL-10和TGFβ，通过高亲和力TCR和其它共刺激分子诸如CTLA-4、GITR和溶细胞活性进行的细胞接触介导的调节。在TGFβ的影响下，适应性Treg细胞在外周部位(包括粘膜相关淋巴组织(MALT))成熟，来自CD4+ Treg前体，在所述部位它们获得Treg典型标志物(包括CD25、CTLA4和GITR/AITR)的表达。随着转录因子Foxp3的上调，Treg细胞开始发挥其抑制作用。这可包括细胞因子诸如IL-10和TGFβ的分泌，这可诱导效应T细胞的细胞周期停滞或凋亡，并阻断树突细胞的共刺激和成熟。
本文所述的工程化的细胞(例如，工程化的T细胞或工程化的调节性T细胞)最初可以是从人受试者分离的T细胞。工程化的细胞可包含编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的重组核酸分子。TFP可包含(i)TCR整合亚基，其包含(1)胞外结构域，(2)TCR跨膜结构域和(3)TCR胞内结构域，其包含来自胞内信号传导结构域的刺激结构域；和(ii)结合结构域。TCR整合亚基和结合结构域可以可操作地连接。当在T细胞中表达时，TFP可以与内源性性TCR功能性相互作用。结合结构域可选自：抗原结合结构域；T细胞受体配体，例如肽-MHC复合物；或T细胞受体模拟物，例如结合肽-MHC复合物的模拟物。
工程化细胞还可包含刺激和/或稳定Treg形成的基因。刺激和/或稳定Treg形成的基因可由与编码TFP的重组核酸分子相同的重组核酸分子编码。刺激和/或稳定Treg形成的基因可由与编码TFP的重组核酸分子不同的重组核酸分子编码。刺激和/或稳定Treg形成的基因可以是FOXP3、HELIOS、BACH2或pSTAT5。工程化的细胞还可包含开关受体。
开关受体可由与编码TFP的重组核酸分子相同的重组核酸分子编码。开关受体可由与编码TFP的重组核酸分子不同的重组核酸分子编码。开关受体可以是IL7-IL2开关受体、IL7-IL10开关受体或TNF-α-IL2开关受体。Treg可包含多于一种刺激和/或稳定Treg形成的基因和/或多于一种开关受体。Treg细胞中PKCθ、STUB1和CCAR2中的一种或多种的表达可以减少或消除。CDK8和CDK19中的一种或多种的表达减少、缺失或在药理学上抑制稳定的Treg形成。Treg可以是CD4+CD25+FoxP3+ Treg或CD8+调节性T细胞。
用于携带或表达编码TFP的重组核酸的细胞可以从受试者中分离。细胞通常可以是真核细胞，诸如哺乳动物细胞，通常是人细胞。在一些实施方案中，细胞可源自血液、骨髓、淋巴或淋巴样器官，是免疫系统的细胞，诸如先天性或适应性免疫的细胞，例如骨髓样细胞或淋巴样细胞，包括淋巴细胞，通常是T细胞和/或NK细胞。其它示例性细胞包括干细胞，诸如多能和多潜能干细胞，包括诱导多能干细胞(iPSC)。细胞通常是原代细胞，诸如直接从受试者分离的细胞和/或从受试者分离并冷冻的细胞。在一些实施方案中，细胞包括T细胞或其它细胞类型的一个或多个亚群，诸如全T细胞群、CD4+细胞、CD8+细胞、CD4+CD8+细胞及其亚群，诸如由功能、活化状态、成熟度、分化潜能、扩增、再循环、定位和/或持续能力、抗原特异性、抗原受体类型、在特定器官或区室中的存在、标志物或细胞因子分泌谱和/或分化程度所定义的那些。关于待治疗的受试者，细胞可以是同种异体的和/或自体的。这些方法当中包括现成的方法。在一些方面，诸如对于现成的技术，细胞是多潜能和/或多能的，诸如干细胞，诸如诱导多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，所述方法包括从受试者中分离细胞，如本文所述制备、加工、培养和/或改造它们，并在冷冻保存之前或之后将它们重新引入同一患者体内。
在T细胞和/或CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞的亚型和亚群当中，有原初T(TN)细胞、效应T细胞(TEEF)、记忆T细胞及其亚型，诸如干细胞记忆T(TSCMX中枢记忆T(TCM效应记忆T(TEM))细胞或终末分化效应记忆T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关恒定T(MAIT)细胞、天然存在的和适应性调节性T细胞、辅助T细胞，诸如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助T细胞、α/βT细胞和δ/γT细胞。
在一些实施方案中，细胞是天然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，细胞是单核细胞或粒细胞，例如髓样细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。
在一些实施方案中，细胞包括通过遗传工程引入的一种或多种核酸，从而表达此类核酸的重组或遗传工程产物。在一些实施方案中，核酸是异源的，即通常不存在于细胞或获自细胞的样品中，诸如从另一个生物体或细胞获得的核酸，其例如通常不存在于被工程化的细胞和/或衍生这种细胞的生物体中。在一些实施方案中，核酸不是天然存在的，诸如不存在于自然界中的核酸，包括包含编码来自多种不同细胞类型的各种结构域的核酸的嵌合组合的核酸。
在一些实施方案中，工程化的细胞的制备包括一个或多个培养和/或制备步骤。用于引入TFP的细胞可以从样品(诸如生物样品，例如从受试者获得或衍生的样品)中分离。在一些实施方案中，从中分离细胞的受试者是患有疾病或疾患或者需要细胞疗法或将要向其施用细胞疗法的受试者。在一些实施方案中，受试者是需要特定治疗干预(诸如正在分离、加工和/或改造细胞以用于其的过继细胞疗法)的人。
因此，在一些实施方案中，细胞是原代细胞，例如原代人细胞。样品包括直接取自受试者的组织、流体和其它样品，以及由一个或多个处理步骤产生的样品，所述处理步骤是诸如分离、离心、遗传工程(例如，用病毒载体转导)、洗涤和/或孵育。生物样品可以是直接从生物来源获得的样品或经过处理的样品。生物样品包括但不限于体液，诸如血液、血浆、血清、脑脊髓液、滑液、尿液和汗液，组织和器官样品，包括由其衍生的加工样品。
在一些方面，从其衍生或分离细胞的样品是血液或血液衍生样品，或者是或衍生自单采或白细胞分离产品。示例性样品包括全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检物、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴样组织、粘膜相关淋巴样组织、脾、其它淋巴样组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳腺、骨、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其它器官，和/或由其衍生的细胞。在细胞疗法例如过继细胞疗法的情况下，样品包括来自自体和异体来源的样品。
在一些实施方案中，细胞源自细胞系，例如T细胞系。在一些实施方案中，细胞获自异种来源，例如，获自小鼠、大鼠、非人灵长类动物或猪。
在一些实施方案中，细胞的分离包括一个或多个制备和/或基于非亲和力的细胞分离步骤。在一些实例中，在一种或多种试剂存在的情况下洗涤、离心和/或孵育细胞，例如，以去除不想要的组分，富集想要的组分，裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在一些实例中，基于一种或多种特性例如密度、粘附特性、大小、敏感性和/或对特定组分的抗性分离细胞。
在一些实例中，来自受试者循环血液的细胞通过例如单采术或白细胞分离术获得。在一些方面，样品包含淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞和/或血小板，并且在一些方面，包含除红细胞和血小板外的细胞。
在一些实施方案中，洗涤从受试者收集的血细胞，例如，以除去血浆级分，并将细胞置于合适的缓冲液或介质中用于随后的处理步骤。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一些实施方案中，洗涤溶液缺少钙和/或镁和/或许多或所有二价阳离子。在一些方面，按照制造商的说明，在半自动“流通”离心机(例如，Cobe2991细胞处理器，Baxter)中完成洗涤步骤。在一些方面，按照制造商的说明，通过切向流过滤(TFF)完成洗涤步骤。在一些实施方案中，将细胞在洗涤后重悬于各种生物相容性缓冲液例如不含Ca++/Mg++的PBS中。在某些实施方案中，去除血细胞样品的组分，并将细胞直接重悬于培养基中。
在一些实施方案中，所述方法包括基于密度的细胞分离方法，诸如通过裂解红细胞和通过Percoll或Ficoll梯度离心从外周血制备白细胞。
在一些实施方案中，分离方法包括基于一种或多种特定分子(例如表面蛋白、胞内标志物或核酸)在细胞中的表达或存在来分离不同的细胞类型。在一些实施方案中，可以使用任何已知的基于此类标志物的分离方法。在一些实施方案中，分离是基于亲和力或免疫亲和力的分离。例如，在一些方面，分离包括基于一种或多种标志物(通常是细胞表面标志物)的细胞的表达或表达水平来分离细胞和细胞群，例如，通过与特异性结合此类标志物的抗体或结合配偶体一起孵育，随后通常进行洗涤步骤，并将结合了抗体或结合配偶体的细胞与未结合所述抗体或结合配偶体的细胞分离。此类分离步骤可以基于阳性选择和/或阴性选择，在阳性选择中，保留已结合试剂的细胞以供进一步使用，在阴性选择中，保留未结合抗体或结合配偶体的细胞。在一些实例中，两种级分都被保留以供进一步使用。在一些方面，当没有可用于特异性鉴定异质群体中的细胞类型的抗体时，阴性选择可以是特别有用，使得分离最好基于由除所需群体外的细胞表达的标志物来进行。
分离不必导致特定细胞群或表达特定标志物的细胞的100％富集或去除。例如，阳性选择或富集特定类型的细胞，诸如表达标志物的那些细胞，是指增加此类细胞的数量或百分比，但不必导致完全没有不表达所述标孝悌物的细胞。同样，阴性选择，特定类型细胞(诸如表达标志物的那些细胞)的去除或耗尽是指减少此类细胞的数量或百分比，但不必要导致所有此类细胞的完全去除。
在一些实例中，可以进行多轮分离步骤，其中将来自一个步骤的阳性或阴性选择的级分经受另一个分离步骤，诸如随后的阳性或阴性选择。在一些实例中，单个分离步骤可以耗尽同时表达多种标志物的细胞，诸如通过将细胞与多种抗体或结合配偶体一起孵育，所述每种抗体或结合配偶体对阴性选择所针对的标志物具有特异性。同样，通过将细胞与多种抗体或在各种细胞类型上表达的结合配偶体一起孵育，可以同时阳性选择多种细胞类型。例如，在一些方面，通过阳性或阴性选择技术分离T细胞的特定亚群，诸如对于一种或多种标志物呈阳性或表达所述标志物的细胞，例如CD4+、CD25+、CD127、FOXP3+和/或Helios+ T细胞。例如，CD3+、CD28+ T细胞可以使用缀合有抗CD3/抗CD28的磁珠(例如，
Figure BDA0003815295380000701
M-450CD3/CD28 T细胞扩增仪)来进行阳性选择。
在一些实施方案中，可以通过阳性选择富集特定细胞群，或通过阴性选择耗尽特定细胞群来进行分离。在一些实施方案中，阳性或阴性选择通过将细胞与一种或多种抗体或其它结合剂一起孵育来完成，所述抗体或其它结合剂分别与在阳性或阴性选择的细胞上以相对较高水平(标记“l”高)表达的一种或多种表面标志物(标志物“1”)特异性结合。
在一些实施方案中，可通过阴性选择在非T细胞(诸如B细胞、单核细胞或其它白细胞)上表达的标志物诸如CD 14，从PBMC样品中分离T细胞。在一些方面，CD4+或CD8+选择步骤用于分离CD4+辅助细胞和CD8+细胞毒性T细胞。此类CD4+和CD8+群体可通过对在一种或多种原初、记忆和/或效应T细胞亚群上表达或表达程度相对较高的标志物进行阳性或阴性选择而被进一步分选至亚群中。
在一些实施方案中，诸如通过基于与相应亚群相关的表面抗原的阳性或阴性选择，进一步富集或耗尽原初、中枢记忆、效应记忆和/或中枢记忆干细胞的CD8+细胞。在一些实施方案中，进行中枢记忆T(TCM)细胞的富集以提高功效，诸如以在施用后改善长期存活率、扩增和/或移植，这在一些方面在此类亚群中特别强劲。参见Terakura等人，(2012)Blood 1:72-82；Wang等人，(2012)J.Immunother.35(9):689-70l。在一些实施方案中，组合TcM-富集的CD8+T细胞和CD4+ T细胞进一步增强了功效。
在一些实施方案中，中枢记忆T(TCM)细胞的富集基于CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或CD 127的阳性或高表面表达；在一些方面，其基于对表达或高表达CD45RA和/或粒酶B的细胞的阴性选择。
在一些方面，将基于CD4表达的选择步骤用于产生CD4+细胞群或亚群，使得来自基于CD4的分离的阳性和阴性级分都被保留并用于方法的后续步骤，任选地在一个或多个进一步的阳性或阴性选择步骤之后。
在一个实例中，对PBMC的样品或其它白细胞样品进行CD4+细胞的选择，其中保留阴性和阳性级分。然后对阴性级分进行基于例如CD14和CD45RA的表达的阴性选择，以及基于中枢记忆T细胞的特征标志物诸如CD62L或CCR7的阳性选择，其中阳性和阴性选择以任一顺序进行。
通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群，将CD4+ T辅助细胞分选至原初细胞、中枢记忆细胞和效应细胞中。CD4+淋巴细胞可以通过标准方法获得。在一些实施方案中，原初CD4+ T淋巴细胞是CD45RO+、CD45RA+、CD62L+、CD4+ T细胞。在一些实施方案中，中枢记忆CD4+细胞是CD62L+和CD45RO+。
在一个实例中，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD14、CD20、CDllb、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在一些实施方案中，抗体或结合配偶体结合到固体支持物或基质，诸如磁珠或顺磁性珠粒，以允许分离细胞以进行阳性和/或阴性选择。例如，在一些实施方案中，使用免疫磁性(或亲和磁性)分离技术(综述于Methods inMolecular Medicine，第58卷：Metastasis Research Protocols，第2卷:Cell BehaviorIn Vitro and In Vivo,第17-25页，由：S.A.Brooks and U.
Figure BDA0003815295380000721
Humana PressInc.,Totowa,NJ编辑)分开或分离细胞和细胞群。
在一些方面，将待分离的细胞的样品或组合物与小的可磁化或磁响应材料(诸如磁响应颗粒或微粒，诸如顺磁性珠粒(例如，Dynabeads或MACS珠粒))一起孵育。磁响应材料,例如颗粒，通常直接或间接附着于结合配偶体，例如抗体，所述结合配偶体与存在于期望分离，例如期望阴性或阳性选择的一个或多个细胞或细胞群上的分子，例如表面标志物特异性结合。
在一些实施方案中，磁性颗粒或珠粒包括与特定结合成员诸如抗体或其它结合配偶体结合的磁响应材料。在磁分离方法中使用了许多公知的磁响应材料。合适的磁性粒子包括Molday的美国专利第4,452,773号和欧洲专利说明书EP 452342B中描述的那些，所述文献据此通过引用并入本文。胶体大小的颗粒，诸如美国专利第4,795,698号和美国专利第5,200,084号中描述的那些是其它实例。
孵育通常可以在这样的条件下进行，其中抗体或结合配偶体，或分子，诸如二抗或其它试剂，其与附着在磁性颗粒或珠粒上的此类抗体或结合配偶体特异性结合，与细胞表面分子(如果存在于样品中的细胞上的话)特异性结合。
在一些方面，将样品置于磁场中，并且那些附着有磁响应或可磁化颗粒的细胞将被磁体吸引并与未标记的细胞分离。对于阳性选择，被吸引至磁铁的细胞得到保留；对于阴性选择，未被吸引的细胞(未标记的细胞)得到保留。在一些方面，在相同的选择步骤中进行阳性和阴性选择的组合，其中阳性和阴性部分得到保留并被进一步加工或进行进一步的分离步骤。
在某些实施方案中，磁响应颗粒包被有一抗或其它结合配偶体、二抗、凝集素、酶或链霉抗生物素蛋白。在某些实施方案中，磁性颗粒通过对一种或多种标志物特异的一抗的包被而附着至细胞上。在某些实施方案中，用一抗或结合配偶体标记细胞而非珠粒，然后加入包被有细胞类型特异性二抗或其它结合配偶体(例如，链霉抗生物素蛋白)的磁性颗粒。在某些实施方案中，将包被有链霉抗生物素蛋白的磁性颗粒与生物素化的一抗或二抗或生物素化的肽结合使用。
在一些实施方案中，磁响应颗粒附着于细胞，随后将孵育、培养和/或工程化所述细胞；在一些方面，颗粒附着在细胞上，用于向患者施用。在一些实施方案中，从细胞中去除可磁化或磁响应颗粒。从细胞中去除可磁化颗粒的方法是已知的，包括例如使用竞争性非标记抗体、可磁化颗粒或与可裂解接头缀合的抗体等。在一些实施方案中，可磁化颗粒是可生物降解的。
在一些实施方案中，基于亲和力的选择是通过磁激活细胞分选(MACS)(MiltenyiBiotec,Auburn,CA)。磁性激活细胞分选(MACS)系统能够高纯度选择附着有磁化颗粒的细胞。在某些实施方案中，MACS以其中在施加外部磁场之后，非目标种类和目标种类被顺序洗脱的模式运行。也就是说，附着在磁化颗粒上的细胞被保持在原位，而未附着的种类被洗脱。然后，在该第一洗脱步骤完成后，被捕获在磁场中并被阻止洗脱的种类以某种方式得以释放，使得它们可以被洗脱和回收。在某些实施方案中，标记非目标细胞并从异质细胞群中去除其。
在某些实施方案中，使用实施所述方法的分离、细胞制备、分离、加工、孵育、培养和/或配制步骤中的一个或多个的系统、装置或设备来实施所述分离或分开。在一些方面，所述系统用于在封闭或无菌环境中执行这些步骤中的每一个，例如，以最小化错误、用户操作和/或污染。在一个实例中，该系统是如国际专利申请公开第W02009/072003号或第US20110003380 Al号中描述的系统。
在一些实施方案中，系统或设备在集成或自含式系统系统中，和/或以自动或可编程的方式执行分离、处理、工程化和配制步骤中的一个或多个，例如所有步骤。在一些方面，系统或设备包括与系统或设备通信的计算机和/或计算机程序，其允许用户编程、控制、评估处理、分离、工程化和配制步骤的结果和/或调整处理、分离、工程化和配制步骤的各个方面。
在一些方面，分离和/或其它步骤使用CliniMACS系统(Miltenyi Biotec)进行，例如用于在封闭和无菌系统中在临床规模水平上自动分离细胞。组件可包括集成的微型计算机、磁分离单元、蠕动泵和各种夹管阀。在一些方面，集成计算机控制仪器的所有组件，并指导系统以标准化的顺序执行重复的程序。在一些方面，磁分离单元包括可移动的永磁体和用于选择柱的支架。蠕动泵控制整个管道系统的流速，并与夹管阀一起确保缓冲液通过系统的受控流动和细胞的连续悬浮。
在一些方面，CliniMACS系统使用在无菌、无热原溶液中提供的抗体偶联可磁化颗粒。在一些实施方案中，在用磁性颗粒标记细胞后，洗涤细胞以除去多余的颗粒。然后将细胞制备袋与管路套件连接，所述管路套件又与包含缓冲液的袋和细胞收集袋连接。管路套件由预组装的无菌管路组成，包括预柱和分离柱，并仅供一次性使用。分离程序启动后，系统会自动地将细胞样品加到分离柱上。标记的细胞保留在柱内，而未标记的细胞通过一系列洗涤步骤被除去。在一些实施方案中，用于本文所述方法的细胞群未被标记，并且没有保留在柱中。在一些实施方案中，用于本文所述方法的细胞群被标记并保留在柱中。在一些实施方案中，用于本文所述方法的细胞群在去除磁场后从柱上洗脱，并被收集在细胞收集袋中。
在某些实施方案中，使用CliniMACS Prodigy系统(Miltenyi Biotec)进行分离和/或其它步骤。在一些方面，CliniMACS Prodigy系统配备了细胞处理单元，其允许通过离心自动清洗和分离细胞。CliniMACS Prodigy系统还可包括机载摄像头和图像识别软件，其通过识别源细胞产物的宏观层来确定最佳细胞分级分离终点。例如，外周血可被自动分离成红细胞、白细胞和血浆层。CliniMACS Prodigy系统还可包括集成的细胞培养室，其完成细胞培养方案，诸如细胞分化和扩增、抗原加载和长期细胞培养。输入端口可以允许无菌移除和补充培养基，并且可以使用集成显微镜监测细胞。参见，例如，Klebanoff等人(2012)J.Immunother.35(9):651-660,Terakura等人，(2012)Blood.1:72-82和Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-70l。
在一些实施方案中，通过流式细胞术收集和富集(或耗尽)本文所述的细胞群，其中在液流中携带针对多种细胞表面标志物染色的细胞。在一些实施方案中，通过制备规模(FACS)分选来收集和富集(或耗尽)本文所述的细胞群。在某些实施方案中，通过使用微机电系统(MEMS)芯片结合基于FACS的检测系统来收集和富集(或耗尽)本文所述的细胞群(参见，例如WO 2010/033140，Cho等人，(2010)Lab Chip 10,1567-1573；和Godin等人，(2008)J.Biophoton.l(5):355-376.在这两种情况下，细胞可用多种标志物进行标记，从而允许以高纯度分离明确的T细胞亚群。
在一些实施方案中，抗体或结合配偶体用一种或多种可检测的标志物标记，以促进分离以用于阳性和/或阴性选择。例如，分离可以基于与荧光标记的抗体的结合。在一些实例中，诸如通过例如与流式细胞检测系统结合的荧光激活细胞分选(FACS)(包括制备规模(FACS)和/或微机电系统(MEMS)芯片)，在液流中进行基于对一种或多种细胞表面标志物特异的抗体或其它结合配偶体的结合的细胞分离。此类方法允许同时基于多个标志物进行阳性和阴性选择。
在一些实施方案中，制备方法包括在分离、孵育和/或工程化之前或之后冷冻(例如，冷冻保存)细胞的步骤。在一些实施方案中，冷冻和随后的解冻步骤去除了细胞群中的粒细胞，并在一定程度上去除了单核细胞。在一些实施方案中，例如，在除去血浆和血小板洗涤步骤后，将细胞悬浮在冷冻溶液中。在一些方面，可以使用各种已知的冷冻溶液和参数中的任一种。一个实例包括使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白(HSA)的PBS，或其它合适的细胞冷冻介质。然后将其用培养基以1:1稀释，使得DMSO和HSA的终浓度分别为10％和4％。然后以每分钟1°的速度将细胞冷冻至-80℃，并储存在液氮储存罐的气相中。
在一些实施方案中，所提供的方法包括培养、孵育、培养和/或基因工程步骤。例如，在一些实施方案中，提供了用于孵育和/或工程化耗尽的细胞群和培养起始组合物的方法。
因此，在一些实施方案中，在培养起始组合物中孵育细胞群。可以在培养容器，诸如单元、室、孔、柱、管、管路套件、阀、小瓶、培养皿、袋或用于培养或培育细胞的其它容器中进行孵育和/或工程化。
在一些实施方案中，在遗传工程之前或结合遗传工程，对细胞进行孵育和/或培养。孵育步骤可以包括培养、培育、刺激、活化和/或增殖。在一些实施方案中，在刺激条件或刺激剂存在的情况下孵育组合物或细胞。此类条件包括被设计用于诱导群体中细胞的增殖、扩增、活化和/或存活，模拟抗原暴露，和/或为基因工程，诸如为重组抗原受体的引入而引发细胞的那些条件。
所述条件可包括特定的培养基、温度、氧气含量、二氧化碳含量、时间、剂(例如，营养物、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(诸如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体))以及被设计用于活化细胞的任何其它剂中的一种或多种。
在一些实施方案中，刺激条件或剂包括一种或多种剂，例如配体，其能够激活TCR复合物的胞内信号传导结构域。
在一些方面，所述剂开启或启动T细胞中的TCR/CD3胞内信号传导级联。此类剂可包括抗体，诸如对TCR特异的抗体，例如抗CD3抗体。在一些实施方案中，刺激条件包括一种或多种剂，例如配体，其能够刺激共刺激受体，例如抗CD28。在一些实施方案中，此类剂和/或配体可以结合到固体支持物诸如珠粒和/或一种或多种细胞因子上。任选地，扩增方法还可包括向培养基中添加(例如，以至少约0.5ng/ml的浓度)抗CD3和/或抗CD28抗体的步骤。在一些实施方案中，刺激剂包括IL-2、IL-15和/或IL-7。在一些方面，IL-2浓度为至少约10个单位/mL。
在一些方面，根据例如属于Riddell等人的美国专利第6,040,177号；Klebanoff等人，(2012)J Immunother.35(9):651-660,Terakura等人，(2012)Blood.1:72-82和/或Wang等人，(2012)JImmunother.35(9):689-70l中描述的那些技术进行孵育。
在一些实施方案中，通过向培养起始组合物中加入饲养细胞诸如不分裂的外周血单核细胞(PBMC)(例如，使得对于待扩增的初始群体中的每个T淋巴细胞，所得细胞群体包含至少约5个、10个、20个或40个或更多个PBMC饲养细胞)，来扩增T细胞；以及孵育培养物(例如，持续足以扩增T细胞数量的时间)。在一些方面，不分裂的饲养细胞可包括经γ辐照的PBMC饲养细胞。在一些实施方案中，用约3000至3600拉德范围内的γ射线照射PBMC以防止细胞分裂。在一些方面，在添加T细胞群之前，将饲养细胞添加到培养基中。
在一个实施方案中，Treg细胞群的经遗传修饰的Treg细胞可以是同种异体Treg细胞。例如，同种异体Treg细胞可以是缺乏功能性人白细胞抗原(HLA)(例如，HLAI类和/或HLAII类)表达的T细胞。
在一个实施方案中，可对本文所述的Treg细胞(或其变体)进行工程化，使得其在其表面上不表达功能性HLA。例如，可对本文所述的Treg细胞进行工程化，使得HLA，例如HLA1类和/或HLA II类或非经典HLA分子的细胞表面表达被下调。在一些实施方案中，可对本文所述的Treg进行工程化，使得其不表达PKCθ、STUB1、CCAR2、CDK8和CDK19中的一种或多种或或表达降低水平的PKCθ、STUB1、CCAR2、CDK8和CDK19中的一种或多种。
缺乏HLA、PKCθ、STUB1、CCAR2、CDK8和CDK19表达或具有降低的HLA、PKCθ、STUB1、CCAR2、CDK8和CDK19表达的经修饰Treg细胞可通过任何合适的方法包括敲除或敲除获得。例如，Treg细胞可包括使用siRNA、shRNA、成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)、锌指核酸内切酶(ZFN)、大范围核酸酶(也称为归巢内切核酸酶)或megaTAL(将TAL效应子与大范围核酸酶切割结构域组合)敲除HLA、PKCθ、STUB1、CCAR2、CDK8或CDK19。
在一个实施方案中，HLA、PKCθ、STUB1、CCAR2、CDK8或CDK19的表达可以使用靶向T细胞中编码HLA、PKCθ、STUB1、CCAR2、CDK8或CDK19的核酸的siRNA或shRNA来抑制。siRNA和shRNA在T细胞中的表达可以使用任何常规表达系统，例如慢病毒表达系统来实现。例如，在美国专利公布第20070036773号中描述了下调HLA I类和/或HLA II类基因表达的示例性siRNA和shRNA。
目前的基因编辑技术包括大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应子核酸酶(TALEN)和成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关(Cas)系统。这四大类基因编辑技术在结合用户定义的DNA序列和介导双链DNA断裂(DSB)方面具有共同的作用模式。然后，DSB可通过非同源末端连接(NHEJ)或者-当存在供体DNA时-同源重组(HR)来修复，同源重组是从供体DNA片段引入同源序列的事件。另外，切口酶产生单链DNA断裂(SSB)。DSB可通过单链DNA掺入(ssDI)或单链模板修复(ssTR)来修复，单链模板修复是从供体DNA中引入同源序列的事件。
基因组DNA的遗传修饰可使用位点特异性的、稀有切割的内切核酸酶来完成，所述内切核酸酶被工程化来识别目标基因座中的DNA序列。产生工程化的位点特异性内切核酸酶的方法在本领域中是已知的。例如，可对锌指核酸酶(ZFN)进行工程化以识别和切割基因组中的预定位点。ZFN是嵌合蛋白，其包含与Fokl限制性酶的核酸酶结构域融合的锌指DNA结合结构域。锌指结构域可通过合理的或实验性手段重新设计，以生产与预先确定的长度为18个碱基对的DNA序列结合的蛋白质。通过将这种工程化的蛋白质结构域与Fokl核酸酶融合，就有可能以基因组水平特异性来靶向DNA断裂。ZFN已被广泛用于多种真核生物的靶基因添加、去除和取代(综述于Durai等人(2005)Nucleic Acids Res 33,5978中)。同样地，可以产生TAL-效应子核酸酶(TALEN)来切割基因组DNA中的特定位点。与ZFN一样，TALEN包含与Fokl核酸酶结构域融合的工程化的、位点特异性的DNA结合结构域(综述于Mak等人(2013),Curr Opin Struct Biol.23:93-9中)。然而，在这种情况下，DNA结合结构域包括一个串联阵列的TAL效应子结构域，其每一个特异性识别单个DNA碱基对。紧凑型TALEN具有替代的内切核酸酶结构，避免了对二聚化的需要(Beurdeley等人(2013),Nat Commun.4:1762)。紧凑型TALEN包含与I-TevI归巢内切核酸酶的核酸酶结构域融合的工程化的、位点特异性TAL-效应子DNA结合结构域。与Fokl不同，I-TevI不需要二聚化来产生双链DNA断裂，因此紧凑型TALEN作为单体是有功能的。
基于CRISPR/Cas9系统的工程化的内切核酸酶在本领域也是已知的(Ran等人(2013),Nat Protoc.8:2281-2308；Mali等人(2013),Nat Methods 10:957-63)。CRISPR基因编辑技术由其DNA靶向特异性和切割活性可通过短的引导RNA或双链体crRNA/TracrRNA来编程的内切核酸酶蛋白组成。CRISPR内切核酸酶包含两个组分：(1)半胱天冬酶效应子核酸酶，通常为微生物Cas9；和(2)包含18至20个核苷酸靶向序列的短的“引导RNA”或RNA双链体，其将核酸酶导向基因组中的目标位置。通过在同一细胞中表达多种引导RNA，每种引导RNA具有不同的靶向序列，就可能将DNA断裂同时靶向基因组中的多个位点(多重基因组编辑)。
本领域中已知两类CRISPR系统(Adli(2018)Nat.Commun.9:1911)，每个种类都包含多个CRISPR类型。1类包括通常存在于古细菌的I型和III型CRISPR系统。而II类包括II型、IV型、V型和VI型CRISPR系统。尽管最广泛使用的CRISPR/Cas系统是II型CRISPR-Cas9系统，但CRISPR/Cas系统已被研究人员重新用于基因组编辑。在过去的几年里，已改造了10多种不同的CRISPR/Cas蛋白(Adli(2018)Nat.Commun.9:1911)。在这些蛋白中，诸如来自酸性氨基球菌属的某一种(Acid-aminococcus sp)(AsCpf1)和毛螺菌科细菌(Lachnospiraceaebacterium)(LbCpf1)的Cas12a(Cpf1)蛋白是特别令人感兴趣的。
归巢内切核酸酶是一组天然存在的核酸酶，其能识别植物和真菌基因组中常见的15-40个碱基对的切割位点。它们通常与寄生物的DNA元件缔合，诸如组1自我剪接内含子和内含肽(intein)。它们通过在染色体上产生双链断裂(这募集细胞的DNA修复机制(Stoddard(2006),Q.Rev.Biophys.38:49-95))来自然地促进同源重组或在宿主基因组的特定位置插入基因。特定的氨基酸取代可重新编程归巢核酸酶的DNA切割特异性(Niyonzima(2017),Protein Eng Des Sel.30(7):503-522)。大范围核酸酶(MN)是具有天然核酸酶活性的单体蛋白，其源自细菌归巢内切核酸酶，并针对独特的靶位点进行了工程化(Gersbach(2016),Molecular Therapy.24:430-446))。在一些实施方案中，大范围核酸酶是工程化的I-CreI归巢内切核酸酶。在其它实施方案中，大范围核酸酶是工程化的I-SceI归巢内切核酸酶。
除了提及的四种主要的基因编辑技术以外，还已对包含大范围核酸酶、ZFN和TALEN的融合体的嵌合蛋白进行工程化，以产生新型单体酶，该酶利用ZFN和TALEN的结合亲和力和大范围核酸酶的切割特异性(Gersbach(2016),Molecular Therapy.24:430-446)。例如，megaTAL是单一嵌合蛋白，其是来自TALEN的易于定制的DNA结合结构域与大范围核酸酶的高切割效率的组合。
为了执行基因编辑技术，核酸酶，以及在CRISPR/Cas9系统的情况下，gRNA，必须要被高效地递送到目标细胞。诸如物理、化学和病毒方法等的递送方法也是本领域已知的(Mali(2013).Indian J.Hum.Genet.19:3-8.)。在一些情况下，物理递送方法可选自但不限于电穿孔、显微注射或使用弹道粒子的方法。另一方面，化学递送方法需要使用复杂分子，诸如磷酸钙、脂质或蛋白质。在一些实施方案中，使用病毒(诸如但不限于腺病毒、慢病毒和逆转录病毒)将病毒递送方法应用于基因编辑技术。
T细胞的来源
在扩增和遗传修饰之前，从受试者获得T细胞来源。然后，T细胞可用于引入编码本文所述TFP的重组核酸分子，以产生工程化的(或经修饰的)T细胞。所述T细胞可以是调节性T细胞。
术语“受试者”旨在包括其中能够引发免疫反应的活生物体(例如，哺乳动物)。受试者的实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。T细胞可从多种来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在本发明的某些方面，可使用本领域中可用的多种T细胞系。在本发明的某些方面，可使用本领域技术人员已知的多种技术，诸如FicollTM分离，由从受试者收集的血液单位获得T细胞。在一个优选方面，通过单采获得来自个体循环血液的细胞。单采产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞和血小板。一方面，可洗涤通过单采收集的细胞以除去血浆级分，并将细胞置于适当的缓冲液或培养基中，用于随后的处理步骤。在本发明的一个方面，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在另一方面，洗涤溶液缺乏钙，并且可以缺乏镁，或者可以缺乏许多(如果不是全部)二价阳离子。在钙不存在的情况下，初始活化步骤会导致更大的活化。如本领域普通技术人员将容易理解的，洗涤步骤可通过本领域技术人员已知的方法完成，诸如根据制造商的说明使用半自动“流通”离心机(例如，
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2991细胞处理器、Baxter
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或
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Cell
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5)来完成。洗涤后，可将细胞重悬于各种生物相容的缓冲液中，例如，不含钙、不含镁的PBS、
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A或其它含或不含缓冲剂的盐溶液。或者，可以除去单采样品中不需要的组分，并将细胞直接重悬于培养基中。
一方面，通过裂解红细胞和耗竭单核细胞，例如经由通过PERCOLLTM梯度的离心或通过逆流离心淘析，从外周血淋巴细胞中分离出T细胞。可通过阳性或阴性选择技术进一步分离特定的T细胞亚群，诸如CD3+ T细胞、CD28+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD45RA+ T细胞和CD45RO+ T细胞。在一些方面，通过CD4+细胞的阳性选择来分离调节性T细胞。在一些实施方案中，通过CD8+T细胞的阴性选择来分离调节性T细胞。在一些实施方案中，通过CD25+细胞的阳性选择来分离调节性T细胞。在一些实施方案中，CD8+ T细胞的阴性选择或CD4+T细胞的阳性选择之后是CD25+ T细胞的选择。在一些实施方案中，通过CD127+细胞的阴性选择来分离调节性T细胞。在一些实施方案中，CD8+ T细胞的阴性选择或CD4+ T细胞的阳性选择，接着是CD25+ T细胞的选择，然后是CD127+ T细胞的阴性选择。在一些实施方案中，通过CD45RA+细胞的阳性选择来分离调节性T细胞。在一些实施方案中，CD8+ T细胞的阴性选择或CD4+ T细胞的阳性选择，接着是CD25+ T细胞的选择，然后是CD127+ T细胞的阴性选择，接着是CD45RA+ T细胞的阳性选择。在一些实施方案中，选择CD4+CD25+CD45RA+CD127dim/-Treg细胞。
一方面，通过与缀合有抗CD3/抗CD28(例如，3×28)的珠粒，诸如DYNABEADSTM M-450CD3/CD28 T一起孵育足以阳性选择所需的T细胞的一段时间来分离T细胞。一方面，所述时间段约为30分钟。另一方面，所述时间段的范围为30分钟至36小时或更长，以及其间的所有整数值。另一方面，所述时间段为至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时或6小时。在另一个优选方面，所述时间段为10至24小时。一方面，孵育时间段为24小时。在与其它细胞类型相比T细胞较少的任何情况下，例如在从肿瘤组织或免疫受损个体中分离肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)中，可使用更长的孵育时间来分离T细胞。另外，使用更长的孵育时间可以提高CD8+ T细胞的捕获效率。因此，仅通过缩短或延长允许T细胞与CD3/CD28珠粒结合的时间和/或通过增加或减少珠粒与T细胞的比率(如本文进一步描述的)，可以在培养开始时或在培养过程中的其它时间点优先选择或选除T细胞亚群。此外，通过增加或减少珠粒或其它表面上的抗CD3和/或抗CD28抗体的比率，可以在培养开始时或其它期望的时间点优先选择或选除T细胞亚群。本领域技术人员将认识到，在本发明的说明书中也可使用多轮选择。在某些方面，可能希望执行选择程序并在活化和扩增过程中使用“未选中的”细胞。还可将“未选中”的细胞经历进一步轮次的选择。
通过阴性选择富集T细胞群可通过针对阴性选择的细胞所特有的表面标志物的抗体的组合来实现。一种方法是通过阴性磁性免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，所述方法使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在某些方面，可能需要富集或阳性选择调节T细胞，所述调节T细胞通常表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+和FoxP3+。或者，在某些方面，通过缀合有抗C25的珠粒或其它类似的选择方法来耗竭调节T细胞。
在一个实施方案中，可以选择表达IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、粒酶B和穿孔素中的一种或多种或其它合适的分子(例如，其它细胞因子)的T细胞群。筛选细胞表达的方法可以例如通过PCT公开号：WO2013/126712中描述的方法来确定。
为了通过阳性或阴性选择来分离所需的细胞群，可改变细胞和表面(例如，颗粒诸如珠粒)的浓度。在某些方面，可能希望显著减小其中将珠粒和细胞混合在一起的体积(例如，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠粒的最大接触。例如，一方面，使用20亿个细胞/mL的浓度。一方面，使用10亿个细胞/mL的浓度。在另一方面，使用超过1亿个细胞/mL。在另一方面，使用1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万或5000万个细胞/mL的细胞浓度。在又一方面，使用7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿个细胞/mL的细胞浓度。在另一方面，可使用1.25亿个或1.5亿个细胞/mL的浓度。使用高浓度可以增加细胞产率、细胞活化和细胞扩增。另外，高细胞浓度的使用允许更高效地捕获可能微弱表达目标靶抗原的细胞(诸如CD28阴性T细胞)，或来自其中存在许多肿瘤细胞的样品(例如，白血病血液、肿瘤组织等)的细胞。此类细胞群可具有治疗价值，并且是所希望获得的。例如，使用高浓度的细胞允许更高效地选择通常具有较弱的CD28表达的CD8+ T细胞。
在相关方面，可能希望使用较低浓度的细胞。通过显著稀释T细胞和表面(例如，颗粒诸如珠粒)的混合物，使颗粒与细胞之间的相互作用降至最低。这就选择了与颗粒结合的表达大量所需抗原的细胞。例如，CD4+ T细胞表达更高水平的CD28，并且在稀释浓度下比CD8+T细胞更高效地被捕获。一方面，所用细胞的浓度为5x106/mL。在其它方面，所使用的浓度可以是从约1x105/mL至1x106/mL，以及介于两者之间的任何整数值。在其它方面，可将细胞在旋转器上以不同的速度在2-10℃或室温下孵育不同的时间长度。
也可在洗涤步骤后冷冻用于刺激的T细胞。不希望受理论束缚，冷冻和随后的解冻步骤通过去除细胞群中的粒细胞和一定程度上的单核细胞来提供更均一的产物。在去除血浆和血小板的洗涤步骤之后，可将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数在本领域中是已知的，并且在这种情况下是有用的，但一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或者含有10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO或含有31.25％Plasmalyte-A、31.25％葡萄糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基或者其它含有例如羟乙基淀粉溶液
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和
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A的合适的细胞冷冻培养基，然后将细胞以每分钟1的速度冷冻至-80℃，并储存在液氮储罐的汽相(vapor phase)中。可使用其它受控冷冻的方法，以及立即在-20℃或在液氮中进行非受控冷冻。在某些方面，如本文所述解冻和洗涤冷冻保存的细胞，并使其在室温下静置一小时，然后使用本发明的方法进行活化。
在本发明的说明书中还设想了在可能需要本文所述的扩增的细胞之前的一段时间从受试者收集血液样品或单采产物。因此，可在任何必要的时间点收集待扩增的细胞的来源，分离所需的细胞(诸如T细胞)并将其冷冻，以待以后用于许多将受益于T细胞疗法的疾病或疾患(诸如本文所述的那些)的T细胞疗法。一个方面，血液样品或单采产物取自一般健康的受试者。在某些方面，从一般健康的受试者(所述受试者有发展疾病的风险，但尚未发展成疾病)获取血液样品或单采产物，并分离目标细胞，将其冷冻以备后用。在某些方面，可将T细胞扩增、冷冻并在以后使用。在某些方面，在如本文所述的特定疾病诊断后不久，但在任何治疗之前，从患者收集样品。在另外的方面，在进行多种相关治疗模式之前，从受试者的血液样品或单采物中分离细胞，所述治疗模式包括但不限于利用诸如那他珠单抗、依法珠单抗、抗病毒剂、化学疗法等剂、放射、免疫抑制剂诸如环孢霉素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和他克莫司(FK506)、抗体或其它免疫消融剂诸如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷酰胺、氟达拉滨、环孢霉素、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、罗米地新(以前称为FR901228)和辐照等手段的治疗。
在本公开的另外方面，在给受试者留下功能性T细胞的治疗后，直接从患者获取T细胞。在这方面，已经观察到，在某些癌症治疗之后，特别是用损害免疫系统的药物治疗之后，在治疗后不久在患者通常从治疗中恢复期间，所获得的T细胞的质量对于它们离体扩增的能力而言可能是最佳的或得到改善的。同样，在使用本文所述方法进行离体操作后，这些细胞可能处于增强的植入和体内扩增的优选状态。因此，在本发明的说明书中，设想了在该恢复阶段期间收集血细胞，包括T细胞、树突细胞或其它造血谱系的细胞。另外，在某些方面，动员(例如，利用GM-CSF的动员)和条件化方案可用于在受试者中创造条件，在所述条件下，尤其在治疗后的限定时间窗内，有利于特定细胞类型的再增殖、再循环、再生和/或扩增。说明性细胞类型包括T细胞、B细胞、树突细胞和免疫系统的其它细胞。
T细胞的活化和扩增
通常可使用例如美国专利第6,352,694号、第6,534,055号、第6,905,680号、第6,692,964号、第5,858,358号、第6,887,466号、第6,905,681号、第7,144,575号、第7,067,318号、第7,172,869号、第7,232,566号、第7,175,843号、第5,883,223号、第6,905,874号、第6,797,514号、第6,867,041号和美国专利申请公布第20060121005号中描述的方法来活化和扩增T细胞。
通常，可通过与表面接触来扩增本发明的T细胞，所述表面附着有刺激CD3/TCR复合物相关信号的剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体。特别地，可如本文所述，诸如通过与抗CD3抗体或其抗原结合片段或固定在表面上的抗CD2抗体接触，或通过与蛋白激酶C激活剂(例如，苔藓抑素)结合钙离子载体接触来刺激T细胞群。对于辅助分子在T细胞表面的共刺激，使用结合辅助分子的配体。例如，可在适于刺激T细胞增殖的条件下，将T细胞群与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。刺激CD4+ T细胞或CD8+ T细胞的增殖，抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD28抗体的实例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone,Besancon,France)，可如使用本领域公知的其它方法(Berg等人，Transplant Proc.30(8):3975-3977,1998；Haanen等人，J.Exp.Med.190(9):13191328,1999；Garland等人，J.Immunol.Meth.227(1-2):53-63,1999)那样使用。在一些实施方案中，通过用抗CD3抗体和抗CD28抗体与结合共同γ链的细胞因子(例如，IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21等)的组合进行刺激来活化T细胞。在一些实施方案中，通过用抗CD3抗体和抗CD28抗体与10U/mL、20U/mL、30U/mL、40U/mL、50U/mL、60U/mL、70U/mL、80U/mL、90U/mL、100U/mL、200U/mL、300U/mL、400U/mL、500U/mL、600U/mL、700U/mL、800U/mL、900U/mL或100U/mL的IL-2、IL-7和/或IL-15的组合进行刺激来活化T细胞。在一些实施方案中，细胞被活化24小时。在一些实施方案中，在转导后，在抗CD3抗体、抗CD28抗体与相同细胞因子的组合存在的情况下扩增细胞。在一些实施方案中，在转导后，在抗CD3抗体和抗CD28抗体不存在的情况下，在相同细胞因子存在的情况下，扩增在用抗CD3抗体和抗CD28抗体与结合共同γ链的细胞因子的组合进行的刺激存在的情况下被活化的细胞。在一些实施方案中，将细胞扩增4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天或30天。在一些实施方案中，在抗CD3抗体和抗CD28抗体与雷帕霉素的组合存在的情况下活化Treg细胞。在一些实施方案中，在抗CD3抗体、L细胞和IL-2存在的情况下，例如在Immunocult-XF T细胞培养基中，活化Treg细胞。在一些实施方案中，将细胞每1天、每2天、每3天、每4天、每5天或每6天传代培养一次。在一些实施方案中，将细胞扩增4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天或30天。
已暴露于不同刺激时间的T细胞可表现出不同的特征。例如，典型的血液或单采外周血单核细胞产物具有比细胞毒性或抑制性T细胞群(TC，CD8+)更大的辅助性T细胞群(TH，CD4+)。通过刺激CD3和CD28受体离体扩增T细胞产生了T细胞群，所述T细胞群在约8-9天之前主要由TH细胞组成，而在约8-9天之后，T细胞群体包含越来越大的TC细胞群。因此，根据治疗的目的，用主要由TH细胞组成的T细胞群输注受试者可以是有利的。类似地，如果已经分离出抗原特异性的TC细胞亚群，则将该亚群扩增至更大的程度可以是有益的。
另外，除了CD4和CD8标志物以外，其它表型标志物也有显著变化，但在很大程度上，在细胞扩增过程中是可再现的。因此，这种再现性使得能够为特定目的定制活化的T细胞产品。
一旦构建了TFP，就可使用各种测定来评估该分子的活性，诸如但不限于在刺激后扩增T细胞的能力，在再刺激不存在的情况下维持T细胞扩增的能力，以及在适当的体外和动物模型中的免疫抑制活性。
原代T细胞中TFP表达的蛋白质印迹分析可用于检测单体和二聚体的存在(参见，例如，Milone等人，Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009))。简言之，将表达TFP的T细胞(CD4+ T细胞和CD8+T细胞的1:1混合物)体外扩增超过10天，随后进行裂解并在还原条件下进行SDS-PAGE。通过蛋白质印迹法，使用针对TCR链的抗体来检测TFP。将相同的T细胞亚群用于在非还原条件下进行SDS-PAGE分析，以允许评估共价二聚体的形成。
细胞毒性可通过标准51Cr释放测定进行评估(参见，例如，Milone等人，MolecularTherapy 17(8):1453-1464(2009))。简言之，在频繁搅拌的条件下，将靶细胞在37℃下用51Cr(如NaCrO4,New England Nuclear)加载2小时，在完全RPMI中洗涤两次，然后涂铺到微量滴定板中。在孔中，将效应T细胞与靶细胞在完全RPMI中以不同的效应细胞：靶细胞比率(E:T)混合。还准备了仅含培养基(自发释放，SR)或1％triton-X 100去垢剂溶液(总释放，TR)的额外孔。在37℃孵育4小时后，收获每个孔的上清液。然后使用γ粒子计数器(PackardInstrument Co.,Waltham,Mass.)测量释放的51Cr。以至少一式三份执行每种条件，裂解百分比使用以下公式计算：裂解％＝(ER-SR)/(TR-SR)，其中ER表示每种实验条件下释放的平均51Cr。
基因编辑技术
在一些实施方案中，使用基因编辑技术，诸如成簇的规律间隔短回文重复序列(
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参见，例如美国专利第8,697,359号)、转录激活物样效应子(TALE)核酸酶(TALEN，参见，例如美国专利第9,393,257号)、大范围核酸酶(具有包含12至40个碱基对的双链DNA序列的大识别位点的内切脱氧核糖核酸酶)、锌指核酸酶(ZFN，参见，例如，Urnov等人，Nat.Rev.Genetics(2010)第11卷，第636-646页)或megaTAL核酸酶(大范围核酸酶与TAL重复序列的融合蛋白)方法对本文公开的经修饰的T细胞进行工程化。这样，可对嵌合构建体进行工程化以组合每个亚基的所需特征，诸如构象或信号传递能力。另请参见Sander&Joung,Nat.Biotech.(2014)第32卷，第347-55页；和June等人，2009Nature ReviewsImmunol.9.10:704-716，每篇文献均通过引用并入本文。在一些实施方案中，对TFP亚基的胞外结构域、跨膜结构域或胞质结构域中的一种或多种进行工程化以具有超过一个天然TCR亚基结构域(即，是嵌合的)的方面。
永久性改变人基因组以及在疾病相关基因中引入位点特异性基因组修饰的技术的最新发展为治疗应用奠定了基础。这些技术现在通常被称为“基因组编辑”。
可在本文所述的经修饰的细胞(例如，经修饰的T细胞)中使编码TCRα链、TCRβ链或TCRα链和TCRβ链的内源TCR基因失活。失活可以包括基因组基因座的破坏、基因沉默、转录的抑制或减少、或翻译的抑制或减少。内源TCR基因可被例如抑制性核酸诸如siRNA和shRNA沉默。内源TCR基因的翻译可被抑制性核酸诸如微小RNA抑制。在一些实施方案中，采用基因编辑技术来破坏内源TCR基因。在一些实施方案中，所提及的内源TCR基因编码TCRα链、TCRβ链或TCRα链和TCRβ链。在一些实施方案中，基因编辑技术为多重基因组编辑铺平了道路，所述多重基因组编辑允许同时破坏内源TCR基因中的多个基因组基因座。在一些实施方案中，应用多重基因组编辑技术来产生在内源TCR和/或人白细胞抗原(HLA)、和/或程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)和/或其它基因表达方面具有缺陷的基因被破坏的T细胞。
目前的基因编辑技术包括大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应子核酸酶(TALEN)和成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关(Cas)系统。这四大类基因编辑技术在结合用户定义的DNA序列和介导双链DNA断裂(DSB)方面具有共同的作用模式。然后，DSB可通过非同源末端连接(NHEJ)或者-当存在供体DNA时-同源重组(HR)来修复，同源重组是从供体DNA片段引入同源序列的事件。另外，切口酶产生单链DNA断裂(SSB)。DSB可通过单链DNA掺入(ssDI)或单链模板修复(ssTR)来修复，单链模板修复是从供体DNA中引入同源序列的事件。
基因组DNA的遗传修饰可使用位点特异性的、稀有切割的内切核酸酶来完成，所述内切核酸酶被工程化来识别目标基因座中的DNA序列。产生工程化的位点特异性内切核酸酶的方法在本领域中是已知的。例如，可对锌指核酸酶(ZFN)进行工程化以识别和切割基因组中的预定位点。ZFN是嵌合蛋白，其包含与Fokl限制性酶的核酸酶结构域融合的锌指DNA结合结构域。锌指结构域可通过合理的或实验性手段重新设计，以生产与预先确定的长度为18个碱基对的DNA序列结合的蛋白质。通过将这种工程化的蛋白质结构域与Fokl核酸酶融合，就有可能以基因组水平特异性来靶向DNA断裂。ZFN已被广泛用于多种真核生物的靶基因添加、去除和取代(综述于Durai等人(2005),Nucleic Acids Res 33,5978中)。同样地，可以产生TAL-效应子核酸酶(TALEN)来切割基因组DNA中的特定位点。与ZFN一样，TALEN包含与Fokl核酸酶结构域融合的工程化的、位点特异性的DNA结合结构域(综述于Mak等人(2013),Curr Opin Struct Biol.23:93-9)中。然而，在这种情况下，DNA结合结构域包括一个串联阵列的TAL效应子结构域，其每一个特异性识别单个DNA碱基对。紧凑型TALEN具有替代的内切核酸酶结构，避免了对二聚化的需要(Beurdeley等人(2013),Nat Commun.4:1762)。紧凑型TALEN包含与I-TevI归巢内切核酸酶的核酸酶结构域融合的工程化的、位点特异性TAL-效应子DNA结合结构域。与Fokl不同，I-TevI不需要二聚化来产生双链DNA断裂，因此紧凑型TALEN作为单体是有功能的。
基于CRISPR/Cas9系统的工程化的内切核酸酶在本领域也是已知的(Ran等人(2013),Nat Protoc.8:2281-2308；Mali等人(2013),Nat Methods 10:957-63)。CRISPR基因编辑技术由其DNA靶向特异性和切割活性可通过短的引导RNA或双链体crRNA/TracrRNA来编程的内切核酸酶蛋白组成。CRISPR内切核酸酶包含两个组分：(1)半胱天冬酶效应子核酸酶，通常为微生物Cas9；和(2)包含18至20个核苷酸靶向序列的短的“引导RNA”或RNA双链体，其将核酸酶导向基因组中的目标位置。通过在同一细胞中表达多种引导RNA，每种引导RNA具有不同的靶向序列，就可能将DNA断裂同时靶向基因组中的多个位点(多重基因组编辑)。
本领域中已知两类CRISPR系统(Adli(2018)Nat.Commun.9:1911)，每个种类都包含多个CRISPR类型。1类包括通常存在于古细菌的I型和III型CRISPR系统。而II类包括II型、IV型、V型和VI型CRISPR系统。尽管最广泛使用的CRISPR/Cas系统是II型CRISPR-Cas9系统，但CRISPR/Cas系统已被研究人员重新用于基因组编辑。在过去的几年里，已改造了10多种不同的CRISPR/Cas蛋白(Adli(2018)Nat.Commun.9:1911)。在这些蛋白中，诸如来自酸性氨基球菌属的某一种(Acid-aminococcus sp)(AsCpf1)和毛螺菌科细菌(Lachnospiraceaebacterium)(LbCpf1)的Cas12a(Cpf1)蛋白是特别令人感兴趣的。
归巢内切核酸酶是一组天然存在的核酸酶，其能识别植物和真菌基因组中常见的15-40个碱基对的切割位点。它们通常与寄生物的DNA元件缔合，诸如组1自我剪接内含子和内含肽(intein)。它们通过在染色体上产生双链断裂(这募集细胞的DNA修复机制(Stoddard(2006),Q.Rev.Biophys.38:49-95))来自然地促进同源重组或在宿主基因组的特定位置插入基因。特定的氨基酸取代可重新编程归巢核酸酶的DNA切割特异性(Niyonzima(2017),Protein Eng Des Sel.30(7):503–522)。大范围核酸酶(MN)是具有天然核酸酶活性的单体蛋白，其源自细菌归巢内切核酸酶，并针对独特的靶位点进行了工程化(Gersbach(2016),Molecular Therapy.24:430–446)。在一些实施方案中，大范围核酸酶是工程化的I-CreI归巢内切核酸酶。在其它实施方案中，大范围核酸酶是工程化的I-SceI归巢内切核酸酶。
除了提及的四种主要的基因编辑技术以外，还已对包含大范围核酸酶、ZFN和TALEN的融合体的嵌合蛋白进行工程化，以产生新型单体酶，该酶利用ZFN和TALEN的结合亲和力和大范围核酸酶的切割特异性(Gersbach(2016)，Molecular Therapy 24:430–446)。例如，megaTAL是单一嵌合蛋白，其是来自TALEN的易于定制的DNA结合结构域与大范围核酸酶的高切割效率的组合。
为了执行基因编辑技术，核酸酶，以及在CRISPR/Cas9系统的情况下，gRNA，可能需要被高效地递送到目标细胞。诸如物理、化学和病毒方法等的递送方法也是本领域已知的(Mali(2013).Indian J.Hum.Genet.19:3-8.)。在一些情况下，物理递送方法可选自但不限于电穿孔、显微注射或使用弹道粒子的方法。另一方面，化学递送方法需要使用复杂分子，诸如磷酸钙、脂质或蛋白质。在一些实施方案中，使用病毒(诸如但不限于腺病毒、慢病毒和逆转录病毒)将病毒递送方法应用于基因编辑技术。
例如，编码TCRα链、TCRβ链或TCRα链和TCRβ链的内源TCR基因(例如，TRAC基因座或TRBC基因座)可被CRISPR/Cas9系统失活。用于灭活(例如，破坏)TRAC基因座的gRNA可以包含SEQ ID:58的序列。用于破坏TRBC基因座的gRNA可以包含SEQ ID:59的序列。
CTCGACCAGCTTGACATCAC(SEQ ID NO:58)。
ACACTGGTGTGCCTGGCCAC(SEQ ID NO:59)。
药物组合物
本公开的药物组合物可包含如本文所述的表达TFP的细胞，例如多种表达TFP的细胞与一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的组合。此类组合物可包含缓冲液，诸如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。一方面，将本公开的组合物配制用于静脉内施用。
可以以适合于待治疗(或预防)的疾病的方式施用本公开的药物组合物。施用的数量和频率将由诸如患者的状况以及患者的疾病类型和严重程度等因素决定，尽管适当的剂量可由临床试验决定。
在一个实施方案中，药物组合物基本上不含污染物，例如，不存在可检测水平的污染物(例如，选自由以下组成的组：内毒素、支原体、有复制能力的慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIV gag、残留的抗CD3/抗CD28包被的珠粒、小鼠抗体、混合人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培养基组分、载体包装细胞或质粒组分、细菌和真菌)。在一个实施方案中，细菌是选自由以下组成的组的至少一种细菌：粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)、白色念珠菌(Candida albicans)、大肠杆菌(Escherichia coli)、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenza)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumonia)和化脓性链球菌A组(Streptococcus pyogenes group A)。
当指示“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，医生可以在考虑患者(受试者)的年龄、体重、肿瘤尺寸、感染或转移的程度以及状况的个体差异的情况下，确定待施用的本公开的组合物的精确量。通常可以说，包含本文所述的T细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重，在一些情况下为105至106个细胞/kg体重(包括这些范围内的所有整数值)的剂量施用。也可以以这些剂量多次施用T细胞组合物。所述细胞可通过使用免疫疗法中公知的输注技术施用(参见，例如，Rosenberg等人，New Eng.J.ofMed.319:1676,1988)。
在某些方面，可能需要向受试者施用活化的T细胞，随后重新抽取血液(或进行单采)，根据本发明从血液中活化T细胞，并用这些活化和扩增的T细胞再输注给患者。这个过程可以每隔几周进行多次。在某些方面，可从10cc至400cc的取血中活化T细胞。在某些方面，可从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的取血中活化T细胞。
本发明组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过气雾剂吸入、注射、摄入、输注、植入或移植。可经动脉、皮下、皮内、瘤内、结节内、髓内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内途径向患者施用本文所述的组合物。一方面，通过皮内或皮下注射向患者施用本发明的T细胞组合物。一方面，通过静脉内(i.v.)注射施用本公开的T细胞组合物。可将T细胞的组合物直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位。
在一个特定的示例性方面，受试者可进行白细胞去除术，其中离体收集、富集或去除白细胞，以选择和/或分离目标细胞，例如T细胞。这些T细胞分离株可通过本领域已知的方法扩增，并进行处理，使得可以引入本发明的一种或多种TFP构建体，从而产生本公开的表达TFP的T细胞。有需要的受试者可随后进行高剂量化学疗灶的标准治疗，然后进行外周血干细胞移植。在某些方面，在移植之后或移植的同时，受试者接受本发明的扩增的TFP T细胞的输注。另一方面，在手术之前或之后施用扩增的细胞。
对患者进行的上述治疗的剂量可随着所治疗疾病的确切性质和治疗的接受者而变化。用于人施用的剂量缩放(scaling of dosages)可以根据本领域公认的实践进行。例如，对于成年患者，阿仑珠单抗
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的剂量通常在1mg至约100mg的范围内，通常每天施用，持续1至30天的时期。优选日剂量为1至10mg/天，尽管在某些情况下可使用高达40mg/天的较大剂量(描述于美国专利第6,120,766号中)。
在一个实施方案中，例如，使用体外转录将TFP引入T细胞，并且受试者(例如，人)接受本发明的TFP T细胞的初始施用，以及本发明的TFP T细胞的一次或多次后续施用，其中一次或多次后续施用在前一次施用后少于15天，例如，14天、13天、12天、11天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天或2天施用。在一个实施方案中，每周向受试者(例如，人)施用多于一次的本发明的TFP T细胞的施用，例如，每周施用2次、3次或4次本发明的TFP T细胞的施用。在一个实施方案中，受试者(例如，人受试者)每周接受多于一次的TFP T细胞的施用(例如，每周2次、3次或4次施用)(在本文中也称为一个周期)，随后一周不进行TFP T细胞施用，然后向受试者施用一次或多次另外的TFP T细胞的施用(例如，每周超过一次的TFP T细胞施用)。在另一个实施方案中，受试者(例如，人受试者)接受超过一个周期的TFP T细胞，并且每个周期之间的时间少于10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天或3天。在一个实施方案中，每隔一天施用TFP T细胞一次，每周施用3次。在一个实施方案中，施用本发明的TFP T细胞至少2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周或更多周。
一方面，使用慢病毒载体诸如慢病毒产生TFP T细胞。以这种方式产生的TFP T细胞可具有稳定的TFP表达。
一方面，TFP T细胞在转导后瞬时表达TFP载体4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天。TFP的瞬时表达可通过RNA TFP载体递送来实现。一方面，通过电穿孔将TFP RNA转导到T细胞中。
使用瞬时表达TFP的T细胞(尤其是携带鼠scFv的TFP T细胞)治疗的患者中可出现的潜在问题是多次治疗后的过敏反应。
不受这一理论束缚，据信这种过敏反应可能是由患者产生体液性抗TFP反应引起的，即抗TFP抗体具有抗IgE同种型。据认为，患者的抗体产生细胞在对抗原的暴露中中断10至14天时经历从IgG同种型(其不引起过敏反应)至IgE同种型的类别转换。
如果患者在短暂TFP疗法过程中有产生抗TFP抗体反应(诸如由RNA转导产生的那些)的风险，则TFP T细胞输注中断不应持续超过10至14天。
在一个实施方案中，所述组合物包含本发明的分离的和/或基本上纯化的单特异性Treg细胞群、由所述单特异性Treg细胞群组成或基本上由所述单特异性Treg细胞群组成。在一个实施方案中，所述组合物已经被冷冻和解冻。
本发明的另一个目的是药物组合物，其包含至少一种如上所述的单特异性Treg细胞群和至少一种药学上可接受的赋形剂，或由其组成或基本上由其组成。
本发明还提供了药物，其包含至少一种如上所述的单特异性Treg细胞群，或由其组成或基本上由其组成。
在一个实施方案中，所述药物组合物或药物包含至少一种分离的和/或基本上纯化的本发明的单特异性Treg细胞群。
在一个实施方案中，所述药物组合物或药物包含上文所述的单特异性Treg细胞群的组合(即，本发明的单特异性Treg细胞群的至少两个不同群体)。
此类组合物和药物可包含缓冲液，诸如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。组合物的施用可以以任何方便的方式(包括气雾剂吸入、注射、摄入、输血、植入或移植)进行。可经动脉、皮下、皮内、瘤内、结节内、髓内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内途径向患者施用本文所述的组合物。一方面，通过皮内或皮下注射向患者施用本发明的T细胞组合物。
在一个实施方案中，通过静脉内(i.v.)注射施用至少一种本发明的单特异性Treg细胞群。因此，在一个实施方案中，将本发明的组合物配制用于静脉内施用。
在另一个实施方案中，可将至少一种本发明的单特异性Treg细胞群直接注射到自身免疫性疾病的部位。
治疗性应用
本公开还提供了用于治疗有需要的受试者的自身免疫性疾病的方法，其中所述方法包括施用治疗有效量的本文所述的工程化的Treg。
可由本文所述方法治疗的自身免疫性疾病包括但不限于葡萄膜炎、大疱性类天疱疮、狼疮(包括系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮性肾炎(LN)、盘状狼疮、深部红斑狼疮、冻疮样红斑狼疮、肿胀性红斑狼疮、重症系统性红斑狼疮、急性皮肤狼疮、慢性皮肤狼疮)、多发性硬化、视神经脊髓炎(NMO)、自身免疫性边缘脑炎(LE)、桥本氏病、N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)脑炎、自身免疫性溶血性贫血、寻常性天疱疮、重症肌无力、格雷夫斯病、特发性血小板减少性紫癜、古德帕斯彻综合征、类风湿性关节炎、乳糜泻、恶性贫血、白癜风、硬皮病、银屑病、溃疡性结肠炎(UC)、克罗恩病、干燥综合征、韦格纳肉芽肿病、多发性肌炎、皮肌炎、原发性胆汁性肝硬化、抗磷脂综合征、混合性结缔组织病、米勒-费希尔综合征、格林-巴利综合征、急性运动轴索神经病、自身免疫性肝炎、疱疹样皮炎、Churg-Strauss病、显微镜下多血管炎、IgA肾病、由ANCA和其它ANCA相关疾病引起的血管炎、急性风湿热、恶性贫血、1型糖尿病(T1D)、反应性关节炎(Reiter综合征)、膜性肾病、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、血栓性血小板减少性紫癜、单克隆丙种球蛋白病中的高粘血症、溶血性尿毒症综合征(非典型，由于针对因子H的抗体)、威尔逊病、暴发性Lambert-Eaton肌无力综合征、妊娠期红细胞同种异体免疫、蘑菇中毒、急性播散性脑脊髓炎、溶血性尿毒症综合征(非典型，由于补体因子突变)、自身免疫性溶血性贫血(危及生命的冷凝集素病)、骨髓瘤管型肾病、输血后紫癜、自身免疫性溶血性贫血(温热性自身免疫性溶血性贫血)、高甘油三酯血症性胰腺炎、甲状腺风暴、僵人综合征、溶血性尿毒症综合征(典型的腹泻相关)、免疫性血小板减少症、ABO血型不合的实体器官移植(SOT)、冷球蛋白血症、肝素诱导的血小板减少症、甲状腺危象、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病、局灶节段性肾小球硬化和暴发性肝功能衰竭。
本公开还涉及至少一种单特异性Treg细胞群(优选在如上所述的组合物、药物组合物或药物中)，其用于治疗或用于治疗自身免疫性疾病，诸如自身抗体介导的自身免疫性疾病。
在一个实施方案中，本公开的单特异性Treg细胞群的细胞表达包含参与自身免疫性疾病的自身抗原(即识别参与待治疗的自身抗体介导的自身免疫性疾病的自身抗体)的TFP。在另一个实施方案中，TFP包含特异性结合参与自身免疫性疾病的自身抗原的抗体或其片段。在一些实施方案中，TFP包含MHC-肽复合物，其中所述肽包含自身抗原或其片段。在另一个实施方案中，TFP包含特异性结合MHC-肽复合物的抗体或其片段。
自身抗体介导的自身免疫性疾病的实例包括但不限于大疱性类天疱疮、狼疮(包括系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮性肾炎(LN)、盘状狼疮、深部红斑狼疮、冻疮样红斑狼疮、肿胀性红斑狼疮、重症系统性红斑狼疮、急性皮肤狼疮、慢性皮肤狼疮)、多发性硬化、视神经脊髓炎(NMO)、自身免疫性边缘脑炎(LE)、桥本氏病、N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)脑炎、自身免疫性溶血性贫血、寻常性天疱疮、重症肌无力、格雷夫斯病、特发性血小板减少性紫癜、古德帕斯彻综合征、类风湿性关节炎、乳糜泻、恶性贫血、白癜风、硬皮病、银屑病、溃疡性结肠炎(UC)、克罗恩病、干燥综合征、韦格纳肉芽肿病、多发性肌炎、皮肌炎、原发性胆汁性肝硬化、抗磷脂综合征、混合性结缔组织病、米勒-费希尔综合征、格林-巴利综合征、急性运动轴索神经病、自身免疫性肝炎、疱疹样皮炎、Churg-Strauss病、显微镜下多血管炎、IgA肾病、由ANCA和其它ANCA相关疾病引起的血管炎、急性风湿热、恶性贫血、1型糖尿病(T1D)、反应性关节炎(Reiter综合征)、膜性肾病、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、血栓性血小板减少性紫癜、单克隆丙种球蛋白病中的高粘血症、溶血性尿毒症综合征(非典型，由于针对因子H的抗体)、威尔逊病、暴发性Lambert-Eaton肌无力综合征、妊娠期红细胞同种异体免疫、蘑菇中毒、急性播散性脑脊髓炎、溶血性尿毒症综合征(非典型，由于补体因子突变)、自身免疫性溶血性贫血(危及生命的冷凝集素病)、骨髓瘤管型肾病、输血后紫癜、自身免疫性溶血性贫血(温热性自身免疫性溶血性贫血)、高甘油三酯血症性胰腺炎、甲状腺风暴、僵人综合征、溶血性尿毒症综合征(典型的腹泻相关)、免疫性血小板减少症、ABO血型不合的实体器官移植(SOT)、冷球蛋白血症、肝素诱导的血小板减少症、甲状腺危象、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病、局灶节段性肾小球硬化和暴发性肝功能衰竭。优选地，所述自身抗体介导的自身免疫性疾病选自大疱性类天疱疮、狼疮(包括系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮性肾炎(LN)、盘状狼疮、深部红斑狼疮、冻疮样红斑狼疮、肿胀性红斑狼疮、重症系统性红斑狼疮、急性皮肤狼疮、慢性皮肤狼疮)和多发性硬化。自身抗体介导的自身免疫性疾病的实例包括但不限于葡萄膜炎、大疱性类天疱疮、狼疮(包括系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮性肾炎(LN)、盘状狼疮、深部红斑狼疮、冻疮样红斑狼疮、肿胀性红斑狼疮、重症系统性红斑狼疮、急性皮肤狼疮、慢性皮肤狼疮)、多发性硬化、视神经脊髓炎(NMO)、自身免疫性边缘脑炎(LE)、桥本氏病、N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)脑炎、自身免疫性溶血性贫血、寻常性天疱疮、重症肌无力、格雷夫斯病、特发性血小板减少性紫癜、古德帕斯彻综合征、类风湿性关节炎、乳糜泻、恶性贫血、白癜风、硬皮病、银屑病、溃疡性结肠炎(UC)、克罗恩病、干燥综合征、韦格纳肉芽肿病、多发性肌炎、皮肌炎、原发性胆汁性肝硬化、抗磷脂综合征、混合性结缔组织病、米勒-费希尔综合征、格林-巴利综合征、急性运动轴索神经病、自身免疫性肝炎、疱疹样皮炎、Churg-Strauss病、显微镜下多血管炎、IgA肾病、由ANCA和其它ANCA相关疾病引起的血管炎、急性风湿热、恶性贫血、1型糖尿病(TID)、反应性关节炎(Reiter综合征)、膜性肾病、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、血栓性血小板减少性紫癜、单克隆丙种球蛋白病中的高粘血症、溶血性尿毒症综合征(非典型，由于针对因子H的抗体)、威尔逊病、暴发性Lambert-Eaton肌无力综合征、妊娠期红细胞同种异体免疫、蘑菇中毒、急性播散性脑脊髓炎、溶血性尿毒症综合征(非典型，由于补体因子突变)、自身免疫性溶血性贫血(危及生命的冷凝集素病)、骨髓瘤管型肾病、输血后紫癜、自身免疫性溶血性贫血(温热性自身免疫性溶血性贫血)、高甘油三酯血症性胰腺炎、甲状腺风暴、僵人综合征、溶血性尿毒症综合征(典型的腹泻相关)、免疫性血小板减少症、ABO血型不合的实体器官移植(SOT)、冷球蛋白血症、肝素诱导的血小板减少症、甲状腺危象、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病、局灶节段性肾小球硬化和暴发性肝功能衰竭。优选地，所述自身抗体介导的自身免疫性疾病选自大疱性类天疱疮、狼疮(包括系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮性肾炎(LN)、盘状狼疮、深部红斑狼疮、冻疮样红斑狼疮、肿胀性红斑狼疮、重症系统性红斑狼疮、急性皮肤狼疮、慢性皮肤狼疮)和多发性硬化。
在一个实施方案中，自身抗体介导的自身免疫性疾病可以通过单采术治疗。可通过单采治疗的疾病实例包括但不限于系统性红斑狼疮(严重，肾炎)、多发性硬化、格林-巴利综合征、重症肌无力、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、血栓性血小板减少性紫癜、单克隆丙种球蛋白病中的高粘血症、古德帕斯彻综合征、溶血性尿毒症综合征(非典型的，由于针对因子H的抗体)、威尔逊病、暴发性Lambert-Eaton肌无力综合征、妊娠期红细胞同种异体免疫、蘑菇中毒、急性播散性脑脊髓炎、溶血性尿毒症综合征(非典型，由于补体因子突变)、自身免疫性溶血性贫血(危及生命的冷凝集素病)、骨髓瘤管型肾病、输血后紫癜、自身免疫性溶血性贫血(温热性自身免疫性溶血性贫血)、高甘油三酯血症性胰腺炎、甲状腺风暴、僵人综合征、溶血性尿毒症综合征(典型的腹泻相关)和免疫性血小板减少症。
在一个实施方案中，自身抗体介导的自身免疫性疾病可以通过血浆置换法来治疗。可通过血浆置换治疗的疾病的实例包括但不限于系统性红斑狼疮、ABO血型不合的实体器官移植(SOT)、血栓性血小板减少性紫癜、冷球蛋白血症、肝素诱导的血小板减少症、甲状腺危象、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病、ANCA相关疾病、局灶节段性肾小球硬化、暴发性肝功能衰竭、重症肌无力、古德帕斯彻综合征、格林-巴利综合征、自身免疫性溶血性贫血、IgA肾病、溶血性尿毒症综合征。
在一个实施方案中，自身抗体介导的自身免疫性疾病可以用利妥昔单抗治疗。可用利妥昔单抗治疗的自身抗体介导的自身免疫性疾病的实例包括但不限于狼疮性肾炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、韦格纳肉芽肿病、显微镜下多血管炎、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、寻常性天疱疮、干燥综合征(Sjogren)、肾小球肾炎、重症肌无力、肝移植排斥、特发性血小板减少性紫癜(免疫性血小板减少性紫癜)、肾移植排斥、血友病A、视神经脊髓炎(Devic综合征)、寻常性天疱疮和血栓性血小板减少性紫癜。在一个实施方案中，自身免疫性疾病是视神经脊髓炎(NMO)，并且TFP包含与NMO相关的自身抗原(或其变体或片段)。与视神经脊髓炎(NMO)相关的自身抗原的实例包括但不限于水通道蛋白-4水通道(AQP4)。
在一个实施方案中，自身免疫性疾病是LE(红斑狼疮)，并且TFP包含与LE相关的自身抗原。在一些实施方案中，TFP包含MHC-肽复合物，其中所述肽包含自身抗原或其片段，或特异性结合所述自身抗原或MHC-肽复合物的抗体或其片段。与LE相关的自身抗原的实例包括但不限于Hu、Ma2、胶原蛋白反应介质蛋白5(CRMP5)、电压门控钾通道(VGKC)、N-甲基-d-天冬氨酸受体(NMDAR)和a-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸(AMPAR)。在一个实施方案中，自身免疫性疾病是SLE(系统性红斑狼疮)/LN(狼疮性肾炎)，并且TFP包含与SLE/LN相关的自身抗原(或其变体或片段)。与SLE/LN相关的自身抗原的实例包括但不限于DNA、组蛋白、核糖体和RNP。
在一个实施方案中，自身免疫性疾病是急性皮肤红斑狼疮(ACLE)，并且TFP包含与急性皮肤红斑狼疮相关的自身抗原(或其变体或片段)。在一些实施方案中，TFP包含MHC-肽复合物，其中所述肽包含自身抗原或其片段，或特异性结合所述自身抗原或MHC-肽复合物的抗体或其片段。与急性皮肤红斑狼疮相关的自身抗原的实例包括但不限于DNA和RNP。
在一个实施方案中，自身免疫性疾病是慢性皮肤红斑狼疮，并且TFP包含与慢性皮肤红斑狼疮相关的自身抗原(或其变体或片段)。在一些实施方案中，TFP包含MHC-肽复合物，其中所述肽包含自身抗原或其片段，或特异性结合所述自身抗原或MHC-肽复合物的抗体或其片段。与慢性皮肤红斑狼疮相关的自身抗原的实例包括但不限于RNP。
在一个实施方案中，自身免疫性疾病是盘状红斑狼疮/深部红斑狼疮/冻疮样红斑狼疮/肿胀性红斑狼疮肾病，并且TFP包含与盘状红斑狼疮/深部红斑狼疮/冻疮样红斑狼疮/肿胀性红斑狼疮肾病相关的自身抗原(或其变体或片段)。在一些实施方案中，TFP包含MHC-肽复合物，其中所述肽包含自身抗原或其片段，或特异性结合所述自身抗原或MHC-肽复合物的抗体或其片段。与盘状红斑狼疮/深部红斑狼疮/冻疮样红斑狼疮/肿胀性红斑狼疮肾病相关的自身抗原的实例包括但不限于ANA。
在一个实施方案中，自身免疫性疾病是桥本氏病，并且TFP包含与桥本氏病相关的自身抗原。在一些实施方案中，TFP包含MHC-肽复合物，其中所述肽包含自身抗原或其片段，或特异性结合所述自身抗原或MHC-肽复合物的抗体或其片段。与桥本氏病相关的自身抗原的实例包括但不限于甲状腺过氧化物酶和甲状腺球蛋白。
在一个实施方案中，自身免疫性疾病是NMDAR脑炎，并且TFP包含与NMDAR脑炎相关的自身抗原(或其变体或片段)。在一些实施方案中，TFP包含MHC-肽复合物，其中所述肽包含自身抗原或其片段，或特异性结合所述自身抗原或MHC-肽复合物的抗体或其片段。与NMDAR脑炎相关的自身抗原的实例包括但不限于抗N-甲基-D-天冬氨酸受体(NR1亚基)。
在一个实施方案中，自身免疫性疾病是自身免疫性溶血性贫血，并且TFP包含与自身免疫性溶血性贫血相关的自身抗原(或其变体或片段)。在一些实施方案中，TFP包含MHC-肽复合物，其中所述肽包含自身抗原或其片段，或特异性结合所述自身抗原或MHC-肽复合物的抗体或其片段。与自身免疫性溶血性贫血相关的自身抗原的实例包括但不限于Rh血型抗原和I抗原。
在一个实施方案中，自身免疫性疾病是寻常天疱疮，并且TFP包含与寻常天疱疮相关的自身抗原(或其变体或片段)。在一些实施方案中，TFP包含MHC-肽复合物，其中所述肽包含自身抗原或其片段，或特异性结合所述自身抗原或MHC-肽复合物的抗体或其片段。与寻常性天疱疮相关的自身抗原的实例包括但不限于Dsgl/3。
在一个实施方案中，自身免疫性疾病是大疱性类天疱疮，并且TFP包含与大疱性类天疱疮相关的自身抗原(或其变体或片段)。在一些实施方案中，TFP包含MHC-肽复合物，其中所述肽包含自身抗原或其片段，或特异性结合所述自身抗原或MHC-肽复合物的抗体或其片段。与大疱性类天疱疮相关的自身抗原的实例包括但不限于BP 180和BP230。
在一个实施方案中，自身免疫性疾病是重症肌无力，并且TFP包含与重症肌无力相关的自身抗原(或其变体或片段)。在一些实施方案中，TFP包含MHC-肽复合物，其中所述肽包含自身抗原或其片段，或特异性结合所述自身抗原或MHC-肽复合物的抗体或其片段。与重症肌无力相关的自身抗原的实例包括但不限于乙酰胆碱烟碱突触后受体。
在一个实施方案中，自身免疫性疾病是格雷夫斯病，并且TFP包含与格雷夫斯病相关的自身抗原(或其变体或片段)。在一些实施方案中，TFP包含MHC-肽复合物，其中所述肽包含自身抗原或其片段，或特异性结合所述自身抗原或MHC-肽复合物的抗体或其片段。与格雷夫斯病相关的自身抗原的实例包括但不限于促甲状腺素受体。
在一个实施方案中，自身免疫性疾病是特发性血小板减少性紫癜(ITP)，并且TFP包含与特发性血小板减少性紫癜(ITP)相关的自身抗原(或其变体或片段)。在一些实施方案中，TFP包含MHC-肽复合物，其中所述肽包含自身抗原或其片段，或特异性结合所述自身抗原或MHC-肽复合物的抗体或其片段。与特发性血小板减少性紫癜相关的自身抗原的实例包括但不限于血小板整联蛋白和GpIIb:IIIa。
在一个实施方案中，自身免疫性疾病是古德帕斯彻综合征，并且TFP包含与古德帕斯彻综合征相关的自身抗原(或其变体或片段)。在一些实施方案中，TFP包含MHC-肽复合物，其中所述肽包含自身抗原或其片段，或特异性结合所述自身抗原或MHC-肽复合物的抗体或其片段。与古德帕斯彻综合征相关的自身抗原的实例包括但不限于胶原α-3(IV)链。
在一个实施方案中，自身免疫性疾病是类风湿性关节炎，并且TFP包含与类风湿性关节炎相关的自身抗原(或其变体或片段)。在一些实施方案中，TFP包含MHC-肽复合物，其中所述肽包含自身抗原或其片段，或特异性结合所述自身抗原或MHC-肽复合物的抗体或其片段。与类风湿性关节炎相关的自身抗原的实例包括但不限于类风湿性因子和钙蛋白酶抑制蛋白。
在一个实施方案中，自身免疫性疾病是幼年特发性关节炎，并且TFP包含与幼年特发性关节炎相关的自身抗原(或其变体或片段)。在一些实施方案中，TFP包含MHC-肽复合物，其中所述肽包含自身抗原或其片段，或特异性结合所述自身抗原或MHC-肽复合物的抗体或其片段。与幼年特发性关节炎相关的自身抗原的实例包括但不限于RF、瓜氨酸化蛋白。
在一个实施方案中，自身免疫性疾病是多发性硬化，并且TFP包含与多发性硬化相关的自身抗原(或其变体或片段)。在一些实施方案中，TFP包含MHC-肽复合物，其中所述肽包含自身抗原或其片段，或特异性结合所述自身抗原或MHC-肽复合物的抗体或其片段。与多发性硬化相关的自身抗原的实例包括但不限于髓磷脂碱性蛋白(MBP)、髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)肽和α-β-晶状体蛋白。
在一个实施方案中，自身免疫性疾病是乳糜泻，并且TFP包含与乳糜泻相关的自身抗原(或其变体或片段)。在一些实施方案中，TFP包含MHC-肽复合物，其中所述肽包含自身抗原或其片段，或特异性结合所述自身抗原或MHC-肽复合物的抗体或其片段。与乳糜泻相关的自身抗原的实例包括但不限于组织转谷氨酰胺酶(TG2)。
在一个实施方案中，自身免疫性疾病是恶性贫血，并且TFP包含与恶性贫血相关的自身抗原(或其变体或片段)。在一些实施方案中，TFP包含MHC-肽复合物，其中所述肽包含自身抗原或其片段，或特异性结合所述自身抗原或MHC-肽复合物的抗体或其片段。与恶性贫血相关的自身抗原的实例包括但不限于胃壁细胞的内在因子。
在一个实施方案中，自身免疫性疾病是白癜风，并且TFP包含与白癜风相关的自身抗原(或其变体或片段)。在一些实施方案中，TFP包含MHC-肽复合物，其中所述肽包含自身抗原或其片段，或特异性结合所述自身抗原或MHC-肽复合物的抗体或其片段。与白癜风相关的自身抗原的实例包括但不限于65-kDa抗原。
在一个实施方案中，自身免疫性疾病是白塞氏病，并且TFP包含与白塞氏病相关的自身抗原(或其变体或片段)。在一些实施方案中，TFP包含MHC-肽复合物，其中所述肽包含自身抗原或其片段，或特异性结合所述自身抗原或MHC-肽复合物的抗体或其片段。与白塞氏病相关的自身抗原的实例包括但不限于磷脂酰丝氨酸、核糖体磷蛋白和抗中性粒细胞胞质抗体。
在一个实施方案中，自身免疫性疾病是硬皮病，并且TFP包含与硬皮病相关的自身抗原(或其变体或片段)。在一些实施方案中，TFP包含MHC-肽复合物，其中所述肽包含自身抗原或其片段，或特异性结合所述自身抗原或MHC-肽复合物的抗体或其片段。与硬皮病相关的自身抗原的实例包括但不限于Scl-70、U1-RNP。
在一个实施方案中，自身免疫性疾病是银屑病，并且TFP包含与银屑病相关的自身抗原(或其变体或片段)。在一些实施方案中，TFP包含MHC-肽复合物，其中所述肽包含自身抗原或其片段，或特异性结合所述自身抗原或MHC-肽复合物的抗体或其片段。与银屑病相关的自身抗原的实例包括但不限于钙蛋白酶抑制蛋白。
在一个实施方案中，自身免疫性疾病是溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病，并且TFP包含与UC和克罗恩病相关的自身抗原(或其变体或片段)。在一些实施方案中，TFP包含MHC-肽复合物，其中所述肽包含自身抗原或其片段，或特异性结合所述自身抗原或MHC-肽复合物的抗体或其片段。与UC和克罗恩病相关的自身抗原的实例包括但不限于ANA。
在一个实施方案中，自身免疫性疾病是干燥综合征，并且TFP包含与干燥综合征相关的自身抗原(或其变体或片段)。在一些实施方案中，TFP包含MHC-肽复合物，其中所述肽包含自身抗原或其片段，或特异性结合所述自身抗原或MHC-肽复合物的抗体或其片段。与干燥综合征相关的自身抗原的实例包括但不限于SSA和抗SSB。
在一个实施方案中，自身免疫性疾病是韦格纳肉芽肿病，并且TFP包含与韦格纳肉芽肿病相关的自身抗原(或其变体或片段)。在一些实施方案中，TFP包含MHC-肽复合物，其中所述肽包含自身抗原或其片段，或特异性结合所述自身抗原或MHC-肽复合物的抗体或其片段。与韦格纳肉芽肿病相关的自身抗原的实例包括但不限于ANA和ANCA。
在一个实施方案中，自身免疫性疾病是多发性肌炎或皮肌炎，并且TFP包含与多发性肌炎或皮肌炎相关的自身抗原(或其变体或片段)。在一些实施方案中，TFP包含MHC-肽复合物，其中所述肽包含自身抗原或其片段，或特异性结合所述自身抗原或MHC-肽复合物的抗体或其片段。与多发性肌炎或皮肌炎相关的自身抗原的实例包括但不限于Jo-1。
在一个实施方案中，自身免疫性疾病是原发性胆汁性肝硬化，并且TFP包含与原发性胆汁性肝硬化相关的自身抗原(或其变体或片段)。在一些实施方案中，TFP包含MHC-肽复合物，其中所述肽包含自身抗原或其片段，或特异性结合所述自身抗原或MHC-肽复合物的抗体或其片段。与原发性胆汁性肝硬化相关的自身抗原的实例包括但不限于抗线粒体抗体、gp210、p62、sp 100。
在一个实施方案中，自身免疫性疾病是抗磷脂综合征(APS)，并且TFP包含与抗磷脂综合征相关的自身抗原(或其变体或片段)。在一些实施方案中，TFP包含MHC-肽复合物，其中所述肽包含自身抗原或其片段，或特异性结合所述自身抗原或MHC-肽复合物的抗体或其片段。与抗磷脂综合征相关的自身抗原的实例包括但不限于抗磷脂抗体。
在一个实施方案中，自身免疫性疾病是混合性结缔组织病(MCTD)，并且TFP包含与混合性结缔组织病相关的自身抗原(或其变体或片段)。在一些实施方案中，TFP包含MHC-肽复合物，其中所述肽包含自身抗原或其片段，或特异性结合所述自身抗原或MHC-肽复合物的抗体或其片段。与混合性结缔组织病相关的自身抗原的实例包括但不限于Ul-RNP、Ul-70kd snRNP。
在一个实施方案中，自身免疫性疾病是米勒-费希尔综合征，并且TFP包含与米勒-费希尔综合征相关的自身抗原(或其变体或片段)。在一些实施方案中，TFP包含MHC-肽复合物，其中所述肽包含自身抗原或其片段，或特异性结合所述自身抗原或MHC-肽复合物的抗体或其片段。与米勒-费希尔综合征相关的自身抗原的实例包括但不限于GQlb神经节苷脂。
在一个实施方案中，自身免疫疾病是格林-巴利综合征，并且TFP包含与格林-巴利综合征相关的自身抗原(或其变体或片段)。在一些实施方案中，TFP包含MHC-肽复合物，其中所述肽包含自身抗原或其片段，或特异性结合所述自身抗原或MHC-肽复合物的抗体或其片段。与格林-巴利综合征相关的自身抗原的实例包括但不限于GM1、无唾液酸基的GM1和GDlb。
在一个实施方案中，自身免疫性疾病是急性运动轴突神经病，并且TFP包含与急性运动轴突神经病相关的自身抗原(或其变体或片段)。在一些实施方案中，TFP包含MHC-肽复合物，其中所述肽包含自身抗原或其片段，或特异性结合所述自身抗原或MHC-肽复合物的抗体或其片段。与急性运动轴突神经病相关的自身抗原的实例包括但不限于GM1。
在一个实施方案中，自身免疫性疾病是自身免疫性肝炎，并且TFP包含与自身免疫性肝炎相关的自身抗原(或其变体或片段)。在一些实施方案中，TFP包含MHC-肽复合物，其中所述肽包含自身抗原或其片段，或特异性结合所述自身抗原或MHC-肽复合物的抗体或其片段。与自身免疫性肝炎相关的自身抗原的实例包括但不限于抗核抗体(ANA)和抗平滑肌抗体(ASMA)、抗肝肾微粒体-1抗体(ALKM-1)和抗肝胞质溶胶抗体-1(ALC-1)。
在一个实施方案中，自身免疫性疾病是疱疹样皮炎，并且TFP包含与疱疹样皮炎相关的自身抗原(或其变体或片段)。在一些实施方案中，TFP包含MHC-肽复合物，其中所述肽包含自身抗原或其片段，或特异性结合所述自身抗原或MHC-肽复合物的抗体或其片段。与疱疹样皮炎相关的自身抗原的实例包括但不限于IgA抗肌内膜抗体。
在一个实施方案中，自身免疫性疾病是Churg-Strauss综合征，并且TFP包含与Churg-Strauss综合征相关的自身抗原(或其变体或片段)。在一些实施方案中，TFP包含MHC-肽复合物，其中所述肽包含自身抗原或其片段，或特异性结合所述自身抗原或MHC-肽复合物的抗体或其片段。与Churg-Strauss综合征相关的自身抗原的实例包括但不限于抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)。
在一个实施方案中，自身免疫性疾病是显微镜下多血管炎，并且TFP包含与显微镜下多血管炎相关的自身抗原(或其变体或片段)。在一些实施方案中，TFP包含MHC-肽复合物，其中所述肽包含自身抗原或其片段，或特异性结合所述自身抗原或MHC-肽复合物的抗体或其片段。与显微镜下多血管炎相关的自身抗原的实例包括但不限于ANCA。
在一个实施方案中，自身免疫性疾病是ANCA血管炎，并且TFP包含与ANCA血管炎相关的自身抗原(或其变体或片段)。在一些实施方案中，TFP包含MHC-肽复合物，其中所述肽包含自身抗原或其片段，或特异性结合所述自身抗原或MHC-肽复合物的抗体或其片段。与ANCA血管炎相关的自身抗原的实例包括但不限于中性粒细胞颗粒蛋白。
在一个实施方案中，自身免疫性疾病是急性风湿热，并且TFP包含与急性风湿热相关的自身抗原(或其变体或片段)。在一些实施方案中，TFP包含MHC-肽复合物，其中所述肽包含自身抗原或其片段，或特异性结合所述自身抗原或MHC-肽复合物的抗体或其片段。与急性风湿热相关的自身抗原的实例包括但不限于链球菌细胞壁抗原。
在一个实施方案中，自身免疫性疾病是1型糖尿病(TID)，并且TFP包含与TID相关的自身抗原(或其变体或片段)。在一些实施方案中，TFP包含MHC-肽复合物，其中所述肽包含自身抗原或其片段，或特异性结合所述自身抗原或MHC-肽复合物的抗体或其片段。与TID相关的自身抗原的实例包括但不限于胰岛素(IAA)、谷氨酸脱羧酶(GAA或GAD)和蛋白酪氨酸磷酸酶(IA2或ICA512)。
在一个实施方案中，自身免疫性疾病是膜性肾病，并且TFP包含与膜性肾病相关的自身抗原(或其变体或片段)。在一些实施方案中，TFP包含MHC-肽复合物，其中所述肽包含自身抗原或其片段，或特异性结合所述自身抗原或MHC-肽复合物的抗体或其片段。与膜性肾病相关的自身抗原的实例包括但不限于PLA2R1和THSD7A1。
在一个实施方案中，受试者(例如，人)接受本发明的单特异性Treg细胞群的初始施用，以及一次或多次后续施用，其中一次或多次后续施用在前一次施用后不到15天(例如14天、13天、12天、1 1天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天或2天)施用。
在一个实施方案中，向受试者施用的本发明的至少一种单特异性Treg细胞群的Treg细胞的量在约102至约109、约103至约108、约104至约107或约105至约106个细胞的范围内。
在另一个实施方案中，向受试者施用的本发明的至少一种单特异性Treg细胞群的Treg细胞的量在约106至约109、约106至107、约106至108、约107至109、约107至108、约108至109的范围内。在另一个实施方案中，向受试者施用的本发明的至少一种单特异性Treg细胞群的Treg细胞的量为约106、约107、约108或约109。
在一个实施方案中，向受试者施用的本发明的至少一种单特异性Treg细胞群的Treg细胞的量在约104至109个细胞/kg体重或105至108个细胞/kg体重的范围内，包括这些范围内的所有整数值。
在一个实施方案中，将本发明的至少一种单特异性Treg细胞群每周向受试者(例如人)施用多于一次，例如，每周施用本发明的经遗传修饰的CR Treg细胞2次、3次或4次。
本公开的另一个目的是包含用于治疗自身免疫性疾病的材料的制品。
该制品可包括容器和在容器上或与容器相关联的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、小袋等。容器可以由诸如玻璃或塑料等多种材料形成。该容器可容纳可有效治疗自身免疫性疾病诸如自身抗体介导的自身免疫性疾病的组合物，并可具有无菌入口(例如，该容器可以是静脉注射液袋或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂可以是本发明的单特异性Treg细胞群。
标签或包装说明书可以表明所述组合物用于治疗自身免疫性疾病。该制品、标签或包装插页还可包含用于向患者施用本发明的单特异性Treg细胞群的指导材料。另外，该制品还可包括第二容器，所述第二容器包含药学上可接受的缓冲液，诸如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。其还可包括从商业和用户角度来看所希望的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
本公开还提供了包含至少一种本发明的单特异性Treg细胞群的试剂盒。该试剂盒可以是包含至少一种本公开的单特异性Treg细胞群的任何制品(例如包，装或容器)。该试剂盒可以作为用于实施本发明方法的单元进行推广、分发或销售。此外，任何或所有试剂盒试剂可以在保护它们免受外部环境影响的容器中，诸如在密封容器中提供。
试剂盒还可包含描述试剂盒及其使用方法的包装插页。还可提供用于各种目的(例如，用于治疗自身免疫性疾病)的试剂盒。可以提供包含本发明的单特异性Treg细胞群的试剂盒。与制品一样，试剂盒可包括容器和在容器上或与容器相关联的标签或包装插页。所述容器装有包含至少一种本发明的单特异性Treg细胞群的组合物。可以包括含有例如稀释剂和缓冲液的附加容器。标签或包装插页可提供组合物的描述以及预期用途的说明。
治疗方法
本文公开了治疗有需要的受试者的自身免疫性疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本文公开的药物组合物和制剂。在一些实施方案中，本文进一步公开了在有需要的受试者中治疗自身免疫性疾病的方法，所述方法包括给受试者施用药物组合物，该药物组合物包含(a)根据本文公开的方法产生的修饰的人免疫细胞；和(b)药学上可接受的载体。在一些实施方案中，本文还公开了治疗有需要的受试者的自身免疫性疾病的方法，所述方法包括向受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含(a)递送装置(例如，脂质体),其含有包含本文公开的环状RNA分子或载体之一的有效载荷；和(b)药学上可接受的载体。
在一些情况下，经修饰的人免疫细胞是同种异体T细胞。在一些实施方案中，经修饰的人免疫细胞是自体T细胞。在一些实施方案中，经修饰的人免疫细胞是成淋巴细胞。在一些情况下，与施用了有效量的未经修饰的对照T细胞的受试者相比，受试者中释放的细胞因子较少。在一些情况下，与施用了有效量的包含本文公开的重组核酸或本文公开的载体的经修饰的人免疫细胞的受试者相比，受试者中释放的细胞因子较少。
在一些情况下，方法包括将药物制剂与增强药物组合物功效的剂组合施用。在一些情况下，方法包括将药物制剂与改善与所述药物制剂相关的一种或多种副作用的剂组合施用。
一方面，本公开的经修饰的人免疫细胞可以是用于哺乳动物的离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。一方面，所述哺乳动物是人。
关于离体免疫，在向哺乳动物施用细胞之前，在体外发生下列项中的至少一项：i)扩增细胞，ii)将编码TFP或TCR或CAR和TCRα和/或β恒定结构域的核酸引入细胞，或iii)冷冻保存细胞。
可从哺乳动物(例如，人)中分离细胞并用本文公开的载体对其进行遗传修饰(即，体外转导或转染)。可向哺乳动物受者施用经修饰的人免疫细胞以提供治疗益处。所述哺乳动物受者可以是人，经修饰的细胞相对于受者可以是自体的。或者，相对于受者，细胞可以是同种异型的、同系的或异种的。
在美国专利第5,199,942号(通过引用并入本文)中描述了用于造血干细胞和祖细胞离体扩增的程序，其可应用于本公开的细胞。其它合适的方法在本领域中是已知的，因此本公开不限于任何特定的细胞离体扩增方法。简言之，T细胞的离体培养和扩增包括：(1)从外周血收获物或骨髓外植体中收集哺乳动物的CD34+造血干细胞和祖细胞；以及(2)离体扩增此类细胞。除了美国专利第5,199,942号中描述的细胞生长因子以外，还可将其它因子诸如flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit配体用于培养和扩增细胞。
除了在离体免疫方面使用基于细胞的疫苗以外，本公开还提供了用于离体免疫(以在患者体内引发针对抗原的免疫反应)的组合物和方法。
通常，如本文所述活化和扩增的细胞可用于治疗和预防免疫受损的个体中出现的疾病。
本公开的经修饰的人免疫细胞可以单独施用，或者作为药物组合物与稀释剂和/或其它组分(诸如IL-2或其它细胞因子或细胞群)组合施用。
联合治疗
可将本文所述的经修饰的人免疫细胞(例如，调节性T细胞或Treg细胞)与其它已知的剂和疗法组合使用。如本文中所用，“组合”施用意指在受试者患有病症的过程中，向受试者递送两种(或更多种)不同的治疗，例如，在受试者被诊断患有病症后并且在疾病被治愈或消除或治疗因其它原因停止之前，递送两种或更多种治疗。在一些实施方案中，当第二治疗的递送开始时，一种治疗的递送仍在进行，因此在施用方面存在重叠。这在本文中有时被称为“同时”或“同时递送”。在其它实施方案中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前结束。在任一情况的一些实施方案中，由于组合施用，治疗更有效。例如，第二治疗比在没有第一治疗的情况下施用第二治疗或在对于第一治疗看到类似情况的情况下施用第二治疗更有效，例如，用较少的第二治疗可看到等效效果，或者第二治疗可在更大程度上减轻症状。在一些实施方案中，递送使得症状或与病症相关的其它参数的减少大于在没有另一种治疗的情况下递送的一种治疗所观察到的所述减少。两种治疗的效果可以是部分累加、完全累加或大于累加。递送可使得当递送第二治疗时，递送的第一治疗的效果仍然是可检测的。
在一些实施方案中，“至少一种另外的治疗剂”包括经修饰的人免疫细胞。还提供了表达多种与相同或不同的靶抗原或相同靶抗原上相同或不同的表位结合的TFP的T细胞。还提供了T细胞群，其中T细胞的第一亚群表达第一TFP和TCRα和/或β恒定结构域，而T细胞的第二亚群表达第二TFP和TCRα和/或β恒定结构域。
可将本文所述的经修饰的人免疫细胞和所述至少一种另外的治疗剂在同一组合物中或在分开的组合物中施用，或顺序施用。对于顺序施用，可以首先施用本文所述的经修饰的人免疫细胞，然后再施用另外的剂，或者可以颠倒施用顺序。
在另外的方面，可将本文所述的经修饰的人免疫细胞与外科手术、化学疗法、放射、免疫抑制剂诸如环孢霉素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506、抗体或其它免疫消融剂诸如阿仑单抗、抗CD3抗体或其它抗体疗法、细胞毒素、氟达拉滨、环孢霉素、他克莫司、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、罗米地辛、细胞因子和辐照、肽疫苗(诸如Izumoto等人2008J.Neurosurg.108:963-971中描述的肽疫苗)结合用于治疗方案。
在一个实施方案中，可向受试者施用减少或改善与施用经修饰的人免疫细胞相关的副作用的剂。与施用经修饰的人免疫细胞相关的副作用包括但不限于细胞因子释放综合征(CRS)和噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)，也称为巨噬细胞活化综合征(MAS)。CRS的症状包括高烧、恶心、短暂性低血压、缺氧等。因此，本文公开的方法可包括向受试者施用本文所述的经修饰的人免疫细胞，并进一步施用剂以控制用经修饰的人免疫细胞治疗所导致的升高的可溶性因子水平。在一个实施方案中，受试者中升高的可溶性因子是IFN-γ、TNFα、IL-2和IL-6中的一种或多种。因此，被施用来治疗这种副作用的剂可以是中和这些可溶性因子的一种或多种的剂。此类剂包括但不限于类固醇、TNFα抑制剂和IL-6抑制剂。TNFα抑制剂的实例为依那西普。IL-6抑制剂的实例为托珠单抗。
在一个实施方案中，可向受试者施用增强经修饰的人免疫细胞的活性的剂。例如，在一个实施方案中，剂可以是抑制抑制性分子的剂。在一些实施方案中，抑制性分子，例如，程序性死亡1(PD1)，可以降低经修饰的人免疫细胞产生免疫效应子反应的能力。抑制性分子的实例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFRβ。抑制性分子的抑制(例如，通过在DNA、RNA或蛋白质水平上的抑制)可以优化经修饰的人免疫细胞性能。在实施方案中，抑制性核酸，例如抑制性核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA，可用于抑制抑制性分子在表达TFP的细胞中的表达。在实施方案中，抑制剂是shRNA。在实施方案中，抑制性分子在经修饰的人免疫细胞中被抑制。在这些实施方案中，抑制抑制性分子表达的dsRNA分子与编码TFP的组分(例如，所有组分)的核酸连接。在一个实施方案中，抑制性信号的抑制剂可以是例如与抑制性分子结合的抗体或抗体片段。例如，所述剂可以是与PD1、PD-L1、PD-L2或CTLA4结合的抗体或抗体片段(例如，伊匹木单抗(也称为MDX-010和MDX-101，并作为
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来销售；Bristol-Myers Squibb；曲美木单抗(可从Pfizer获得的IgG2单克隆抗体，以前称为替西木单抗，CP-675,206))。在一个实施方案中，剂是与TIM3结合的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，剂是与LAG3结合的抗体或抗体片段。
在一些实施方案中，增强经修饰的人免疫细胞活性的剂可以是例如包含第一结构域和第二结构域的融合蛋白，其中第一结构域是抑制性分子或其片段，第二结构域是与阳性信号相关的多肽，例如包含本文所述的胞内信号传导结构域的多肽。在一些实施方案中，与阳性信号相关的多肽可包括CD28、CD27、ICOS的共刺激结构域，例如CD28、CD27和/或ICOS的胞内信号传导结构域，和/或初级信号传导结构域，例如CD3ζ，例如，本文所述的。在一个实施方案中，融合蛋白由表达TFP的同一细胞表达。在另一个实施方案中，融合蛋白由不表达抗自身抗原TFP的细胞(例如，T细胞)表达。
实施例
通过参考以下实验实施例进一步详细描述本发明。这些实施例仅是为了说明的目的而提供的，除非另有说明，否则并不旨在进行限制。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为涵盖任何和所有的变型，所述变型由于本文提供的教导而变得明显。无需进一步描述，相信本领域普通技术人员可使用前面的描述和下面的说明性实施例，制造和利用本发明的化合物，并实施所要求的方法。以下工作实施例具体指出了本发明的各个方面，并且不应被解释为以任何方式限制本公开的其余部分。
实施例1：TFP构建体
通过使用(G4S)3接头序列(GGGGGTGGAGGCTCTGGAGGGGGCGGTAGTGGTGGCGGAGGAAGC(SEQ ID NO:1))(SL):AAAGGGGSGGGGSGGGGSLE(SEQ ID NO:56)或(LL):AAAIEVMYPPPYLGGGGSGGGGSGGGGSLE(SEQ ID NO:57)，将与CD3εDNA片段连接的抗HLA-A2scFv(3PF12)或抗MLSN(MH1e VHH)DNA片段克隆到慢病毒载体(pLRPO、pLRPC、pLKaUS或pLCUS)中来工程化抗HLA-A2 TFP和MH1-TFP构建体。在一些情况下，载体还包含位于TFP序列下游的编码FoxP3基因的序列，其通过可切割的2A(P2A或T2A)肽与TFP序列分开。在一些情况下，载体还编码位于FoxP3基因下游的截短的EGFR安全开关，其通过可切割的2A(P2A或T2A)肽与FoxP3序列分开。各种其它载体可用于产生融合蛋白构建体。可以使用任何TFP，例如本文描述的任何TFP。
scFv的VH结构域如下：
ACAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGAGTCTCCTGTGCAGCGTCTGGGGTCACCCTCAGTGATTATGGCATGCATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGATGGCTTTTATACGGAATGATGGAAGTGATAAATATTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCCAAGAAAACAGTGTCTCTGCAAATGAGCAGTCTCAGAGCTGAAGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAAATGGCGAATCTGGGCCTTTGGACTACTGGTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACCGTGTCGAGT(SEQ ID NO:2)
scFv的VL结构域如下：
GATGTTGTGATGACTCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATTAGCAACTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTACGATGCATCCAATTTGGAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAGGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAATATAGTAGTTTTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAAGTGGATATCAAACGT(SEQ ID NO:3)
可利用各种接头构型。TCRα和TCRβ链可用于产生TFP，其是全长多肽或仅为它们的恒定结构域。TCRα和TCRβ链的任何可变序列都允许用于制备TFP。
TCR亚基的来源
人T细胞受体(TCR)复合物的亚基都包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。人TCR复合物包含CD3-ε多肽、CD3-γ多肽、CD3-δ多肽、CD3-ζ多肽、TCRα链多肽和TCRβ链多肽。人CD3-ε多肽规范序列是Uniprot登录号P07766。人CD3-γ多肽规范序列是Uniprot登录号P09693。人CD3-δ多肽规范序列是Uniprot登录号P043234。人CD3-ζ多肽规范序列是Uniprot登录号P20963。人TCRα链规范序列是Uniprot登录号Q6ISU1。鼠TCRα链规范序列是Uniprot登录号A0A075B662。人TCRβ链C区规范序列为Uniprot登录号P01850，人TCRβ链V区序列为P04435。鼠TCRβ链恒定区规范序列是Uniprot登录号P01852。
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TFP表达载体
提供的表达载体包括：启动子(EF1α启动子)、使得能够分泌的信号序列、多腺苷酸化信号和转录终止子(牛生长激素(BGH)基因)、允许附加体复制和在原核生物中复制的元件(例如，SV40起始点和ColE1或本领域已知的其它元件)和允许选择的元件(氨苄青霉素抗性基因和zeocin标记)。
将编码TFP的核酸构建体克隆到慢病毒表达载体中。
实施例2：用TFP转导的T细胞的制备
慢病毒的产生
如下制备编码适当构建体的慢病毒。将Expi293F-细胞悬浮在FS培养基中，并在37℃、8％CO2、150rpm下孵育1-3小时。在FS培养基中稀释转移DNA质粒、Gag/Pol质粒、Rev质粒和VSV-G质粒。然后在FS培养基中稀释PEIpro，并加入到DNA和培养基的混合物中。将孵育的细胞加入到此混合物中，并在37℃、8％CO2、150rpm下孵育18-24小时。第二天，用新鲜培养基替换上清液，并补充丁酸钠，在37℃下再孵育24小时。然后将含有慢病毒的上清液收集到50mL无菌、加盖的锥形离心管中，并置于冰上。在4℃下以3000rpm离心30分钟后，用低蛋白结合的0.45μm无菌过滤器过滤澄清的上清液。随后通过Lenti-X浓缩病毒。病毒原液制剂或者立即用于感染，或者等分并在-80℃下储存以备将来使用。
图2显示了生产表达TFP的Treg的过程的示意图。
调节性T细胞的活化、转染和扩增
直接从外周血中或者从在Ficoll梯度上富集的外周血单核细胞(PBMC)中分离调节性T细胞和CD4+ T细胞。用REAlease CD4微珠分离总CD4+ T细胞。取出这些细胞的一部分并在下面的实验中用作CD4+细胞，而剩余的细胞用于进一步分离Treg。为了进行Treg分离，然后使用CD4+CD25+CD127dim/-分离试剂盒(Miltenyi)从CD4+细胞中分离CD4+CD25+CD127dim/-Treg。然后使用CD45微珠试剂盒从CD4+CD25+CD127dim/-Treg中分离CD4+CD25+CD127dim/-CD45RA+，以产生用于下述实验的Treg。Treg分离方案和FoxP3+Helios+细胞在过程的每个步骤中的富集如图3所示。
对于CD4+细胞，在第0天，通过MACS GMP T细胞TransAct(Miltenyi Biotech)在X-Vivo培养基+10％FBS+12.5ng/ml IL7/IL15中活化分离的CD4+ T细胞。在第1天，用编码HLA-A2 TFP或MH1-TFP(具有或没有FoxP3)的慢病毒转导活化的T细胞。在第4天、第7天和第10天，洗涤细胞，在含有细胞因子的新鲜培养基中传代培养，然后扩增直至第14天。
对于Treg细胞，在第0天，从PBMC(前一天已经解冻并静置)中分离Treg，并通过MACS GMP T细胞TransAct(Miltenyi Biotech)在X-Vivo培养基+10％FBS+1000IU/ml IL-2+100nM雷帕霉素中进行活化。在第1天，用编码HLA-A2 TFP或MH1-TFP(具有或没有FoxP3)的慢病毒转导活化的T细胞。在第4天、第7天和第10天，洗涤细胞，在含有细胞因子的新鲜培养基中传代培养，然后扩增直至第14天。在传代培养的每一天，收获细胞，洗涤，并用新鲜的含有细胞因子的培养基重悬。
实施例3：不依赖于抗原的抑制测定
将如实施例2所述制备的具有HLA-A2 TFP(具有或没有FoxP3)的CD4+ T细胞和调节性T细胞用于不依赖于抗原的抑制测定。所有构建体均含有截短的EGFR。具有HLA-A2 TFP(具有或没有FoxP3)的Treg和CD4+ T细胞的扩增过程以及转导和非转导的CD4和Treg细胞的扩增速率如图4所示。从两个独立的供体(供体1和供体2)中分离、转导和扩增Treg和CD4+T 细胞。
TFP表达的验证和TFP T细胞的表型分型
对HLA-A2 TFP转导的T细胞进行表型分型。如上所述产生TFP T细胞或非转导的T细胞。在扩增的第14天，收获T细胞，并通过流式细胞术表征细胞的FoxP3、CD25和Helios表达。通过抗EGFR染色也证实了TFP在细胞中的表达。如图5A和图5B所示，未转导的Treg、添加和未添加FoxP3基因的HLA-A2 TFP Treg以及添加FoxP3基因的HLA-A2 TFP CD4+细胞具有高水平的FoxP3表达(图5A和图5B)。虽然所有Treg群体(未转导的和转导的)都具有显著的Helios(图5A和图5B)和CD25(图5B)表达，但即使添加了FoxP3基因，在HLA-A2 TFP CD4+细胞中几乎看不到Helios或CD25表达。如图5B所示，虽然高比例的HLA-A2 TFP CD4+细胞(具有或没有FoxP3)显示EGFR染色，但较低比例的添加FoxP3基因的HLA-A2 TFP CD4+细胞显示EGFR染色，表明这些细胞中的转导效率较低。
不依赖于抗原的抑制测定
使用Treg抑制检测试剂盒(Miltenyi)进行抑制测定，以测试HLA-A2 TFP调节性T细胞抑制效应T细胞的功效。利用抗CD3和抗CD28抗体珠粒(响应细胞)通过T细胞受体活化用细胞示踪紫(CTV)标记的多克隆CD4+ T细胞和CD8+ T细胞，并将其与不同浓度的具有或没有FoxP3的TFP.抗HLA-A2 Treg、具有FoxP3的TFP.抗HLA-A2CD4+ T细胞或不表达TFP的对照Treg混合。然后取上清液进行细胞因子分析，并进行流量分析以评估孵育72小时后响应细胞的扩增。测定的示意图如图6所示。
对于细胞因子分析，在每个抑制性TFP T细胞:响应细胞比率下测量IFN-γ和IL-2的水平。如图7A(供体1)和图7B(供体2)所示，对于IFN-γ和IL-2，添加或未添加FoxP3基因的HLA-A2 TFP Treg都能够抑制响应细胞的IFN-γ和IL-2产生(相对于未经Treg或CD4+ T细胞处理的活化的响应细胞产生的细胞因子水平)。对于两个供体，所达到的抑制作用超过了未转导的Treg。用添加FoxP3基因的HLA-A2 TFP CD4+细胞处理响应细胞增加了IFN-γ的表达，超过了未处理的水平。这表明HLA-A2 TFP Treg可以以不依赖抗原的方式抑制效应T细胞产生细胞因子。
还通过FACS在每个TFP T细胞:响应细胞比率下通过定量抑制百分比来评估响应细胞的扩增速率，这通过图8A(供体1)和图8B(供体2)所示的公式来计算。如图8所示，对于两个供体，添加或未添加FoxP3的HLA-A2 TFP Treg对CD4+响应T细胞、CD8+响应T细胞和总CD3+响应T细胞的扩增的抑制超过非转导的Treg。添加FoxP3基因的HLA-A2 TFP CD4+ T细胞不能抑制细胞扩增以及任何这些细胞群(包括非转导的T细胞)，并且仅在高抑制性细胞:响应者比率下显示抑制活性。这表明HLA-A2 TFP Treg可以以不依赖于抗原的方式抑制效应T细胞的扩增。
实施例4：抗原依赖性抑制测定
在抗原依赖性抑制测定中使用了具有MH1 TFP(具有或没有FoxP3)的CD4+ T细胞和调节性T细胞。
通过细胞染色验证TFP表达
慢病毒转导后，通过流式细胞术证实MH1TFP的表达。使用抗VHH抗体和抗CD4抗体对细胞进行表面标志物染色。对于死细胞排除，用
Figure BDA0003815295380001291
可固定水性死细胞染色剂(Invitrogen)孵育细胞。使用LSRFortessaTM X20(BD Biosciences)进行流式细胞术，以及使用FACS Diva软件获取数据，并使用
Figure BDA0003815295380001292
(Treestar,Inc.Ashland,OR)分析所述数据。如图9所示，用MH1 TFP或具有FoxP3基因的MH1 TFP转导的CD4+ T细胞和Treg都表达MH1 TFP。
TFP T细胞的表型分型
对MH1 TFP转导的T细胞进行表型分型。如上所述产生TFP T细胞或非转导的T细胞。在扩增的第14天，收获CD4+和Treg细胞，并通过流式细胞术表征细胞的FoxP3、CD25和Helios表达。如图10所示，添加和未添加FoxP3基因的MH1 TFP Treg以及添加FoxP3基因的MH1CD4+细胞具有高水平的FoxP3表达。虽然MH1 TFP Treg(添加和未添加FoxP3)具有显著的Helios表达，但在即使添加了FoxP3基因的情况下，在MH1 TFP CD4+细胞中几乎看不到Helios表达。
MH1抗原依赖性抑制测定
进行抑制测定以测试MH1 TFP调节性T细胞抑制MH1 TFP效应性T细胞(TC-210)的功效。根据先前描述的产生效应TFP+ T细胞的方法产生MH1 TFP效应细胞。将用细胞示踪紫(CTV)标记的MH1 TFP效应T细胞(响应细胞)以50,000个细胞/孔的浓度铺在MSTO-msln细胞层上。将MSTO-msln细胞以6,250个细胞/孔的浓度铺板，导致MH1 TFP效应T细胞:MSTO-msln细胞的比率为8:1。MSTO-msln细胞以抗原特异性方式活化MH1 TFP效应T细胞。然后将具有或不具有FoxP3的MH1 TFP调节性T细胞或者具有Fox P3的CD4+MH1 TFP T细胞以不同的浓度加入到MH1 TFP效应子T中，以测量MH1 TFP Treg或CD4+细胞对MH1 TFP效应子T细胞的抑制作用。取上清液进行细胞因子分析，并对响应细胞进行流量分析，以评估孵育72小时后的扩增。测定的示意图11所示。
对于细胞因子分析，在每个抑制性TFP T细胞:响应细胞比率下测量IFN-γ和IL-2的水平。如图12所示，对于IFN-γ和IL-2，添加或未添加FoxP3基因的MH1 TFP Treg都能够抑制响应细胞的IFN-γ和IL-2产生(相对于未经Treg或CD4+ T细胞处理的活化的响应细胞产生的细胞因子水平)。相比之下，用添加FoxP3基因的MH1 TFP CD4+细胞处理响应细胞对细胞因子产生的抑制作用较小。事实上，MH1 TFP CD4+FoxP3+细胞不能以任何比率抑制IFN-γ的产生。这表明MH1 TFP Treg可以以抗原特异性的方式抑制效应T细胞产生细胞因子。
还通过FACS在每个TFP T细胞:响应细胞比率下通过定量抑制百分比来评估响应细胞的扩增速率，这通过图13所示的公式来计算。如图13所示，添加或未添加FoxP3基因的MH1 TFP Treg能够抑制MH1TFP T CD4+效应T细胞和MH1 TFP T CD8+效应T细胞的扩增，并且抑制水平高于添加FoxP3基因的MH1 TFP CD4+ T细胞所达到的水平。事实上，MH1 TFPCD4+FoxP3+细胞只能在最高的抑制:反应细胞比率下抑制扩增。这表明MH1 TFP Treg可以以抗原依赖的方式抑制效应T细胞的扩增。
HLA-A2抗原依赖性抑制测定在抗原依赖性抑制测定中使用如实施例2中所述制备的具有HLA-A2 TFP(具有或没有FoxP3)的CD4+和调节性T细胞，以确定HLA-A2 TFP Treg是否能抑制与不匹配的树突细胞共培养的效应T细胞的活化。CD3+HLA-A2-CD4+和CD8+效应T细胞由与TFP Treg相同的供体产生。通过分离CD14+单核细胞并在MO-DC培养基中培养7天来产生HLA-A2+树突细胞。将效应T细胞与HLA-A2+树突细胞以2:1的Teff:DC比率共培养(每孔50,000个效应T细胞和25,000个树突细胞)。然后将具有或不具有FoxP3的HLA-A2TFP调节性T细胞或者具有Fox P3的CD4+HLA-A2 TFP T细胞以不同浓度加入到共培养物中，以测量HLA-A2 TFP Treg或CD4+细胞对效应T细胞的抑制作用。在无调节性T细胞作为对照的情况下，还将效应T细胞单独培养或与HLA匹配或不匹配的树突细胞一起培养。取上清液进行细胞因子分析，并对响应细胞进行流量分析，以评估孵育72小时后的扩增。测定的示意图如图14所示。
对于细胞因子分析，在每个抑制性TFP T细胞:效应性T细胞比率下测量IFN-γ和IL-2的水平。如图15所示，对于IFN-γ和IL-2，添加或未添加FoxP3基因的HLA-A2 TFP Treg能够抑制响应细胞的IFN-γ和IL-2产生(相对于未用Treg或CD4+ T细胞处理的效应T细胞产生的细胞因子水平)。此外，HLA-A2 TFP FoxP3 Treg对IFN-γ产生的抑制作用大于未经修饰的Treg的抑制作用，并且具有或不具有FoxP3的HLA-A2 TFP Treg对IL-2产生的抑制作用均大于未经修饰的T细胞的抑制作用，这表明TFP Treg能以抗原特异性的方式抑制效应T细胞产生细胞因子。
还通过FACS在每个TFP T细胞:效应细胞比率下通过定量抑制百分比来评估响应细胞的扩增速率，这通过图16所示的公式来计算。如图16所示，添加或未添加FoxP3基因的HLA-A2 TFP Treg能够抑制效应T细胞的扩增，并且抑制水平高于未经修饰的调节性T细胞所达到的水平。这表明TFP Treg可以以抗原依赖性方式抑制效应T细胞的扩增。
实施例5：改进的TFP Treg扩展方案
开发了TFP Treg的第二扩增方案来增强TFP Treg的扩增。
使用MultiMAC分离PBMC并将其冷冻。将细胞解冻过夜，在AutoMAC上从外周血单核细胞(PBMC)中分离了CD4+ T细胞。用CD4释放珠粒(Miltenyi)分离总CD4+ T细胞。取出这些细胞的一部分，并在下面的实验中用作CD4+细胞。然后使用CD4+CD25+CD127dim/-Treg分离试剂盒II(Miltenyi)分离CD4+CD25+CD127dim/-Treg。在转导前第0天，通过流式细胞术表征分离的Treg的Helios、CD25和FoxP3的表达。如图17所示，分离的Treg显示高水平的Helios和FoxP3表达。
在第0天，在X-Vivo培养基+10％FBS+1000IU/ml IL-2+100nM雷帕霉素中用Treg扩增珠粒(Miltenyi)活化分离的Treg。在第1天，用编码具有有或没有FoxP3的HLA-A2 TFP的慢病毒转导(例如实施例2所述)活化的T细胞。在第4天、第6天、第8天和第11天，洗涤细胞，在含有细胞因子的新鲜培养基中传代培养，然后扩增至第14天。在传代培养的每一天，收获细胞，洗涤，并用新鲜的含有细胞因子的培养基重悬。如实施例2所述活化、转导和扩增CD4+细胞。
TFP表达的验证和TFP T细胞的表型分型
对HLA-A2 TFP转导的T细胞进行表型分型。在扩增的第14天，收获T细胞，并通过流式细胞术表征细胞的FoxP3、CD25和Helios表达。通过抗EGFR染色也证实了TFP在细胞中的表达。如图18所示，添加或未添加FoxP3基因的非转导的Treg和HLA-A2 TFP Treg具有高水平的FoxP3、Helios和CD25表达。所有TFP转导的细胞中有很高比例显示EGFR染色，表明转导效率高。转导和非转导的CD4和Treg细胞的扩增速率如图19所示。对于所有Treg，第10天的扩增大约是实施例2中所用的方案的5倍。
实施例6：TFP.抗HLA-A2 Treg功能的体内测定
确定了TFP.抗HLA-A2 Treg改变宿主对移植细胞排斥的开始或持续时间的能力。使用人源化小鼠模型系统来测试TFP.抗HLA-A2Treg的功能。在人异种移植模型中，确定了TFP Treg的过继转移是否减轻了由转移同种异体外周血单核细胞(PBMC)引起的移植物抗宿主病(GVHD)。缺乏成熟T细胞、B细胞和NK细胞，但可能含有功能障碍的单核细胞的小鼠在植入PBMC前1天接受辐照。在第0天，将HLA-A2+PBMC和TFP抗HLA-A2 Treg(添加或未添加的Foxp3)和CD4+ TFP抗HLA-A2细胞)以1:1的PBMC:TFP细胞比率移植到经辐照的小鼠中。移植后，每天监测小鼠的GVHD的发展。在整个研究中，每周取血以监测PBMC和抑制性细胞移植。对小鼠进行长达49天的跟踪，或者直到它们达到人道终点。
其它实施方案
上面阐述的公开内容可涵盖具有独立用途的多个不同的发明。尽管这些发明中的每一个都以其一个或多个优选形式公开，但是在本文公开和示出的具体实施方案不应被认为是限制性的，因为许多变化都是可能的。本发明的主题包括本文公开的各种元素、特性、功能和/或属性的所有新颖和非显而易见的组合和子组合。下面的权利要求特别指出了被认为是新颖和非显而易见的某些组合和子组合。体现在特性、功能、元素和/或属性的其它组合和子组合中的发明可以在本申请、要求本申请优先权的申请或相关申请中要求保护。此类权利要求，无论是针对不同的发明还是相同的发明，无论与原始权利要求相比在范围上更宽、更窄、相同还是不同，都被认为包括在本公开的发明的主题内。

Claims (129)

1.一种药物组合物，其包含
(I)来自人受试者的调节性T细胞(Treg)，其中所述调节性T细胞包含：
(a)包含编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的序列的重组核酸，所述TFP包含：
(i)TCR整合亚基，其包含：
(1)胞外结构域，
(2)TCR跨膜结构域，和
(3)TCR胞内结构域，其包含来自胞内信号传导结构域的刺激结构域；
(ii)结合结构域；和
(II)药学上可接受的载体；
其中所述TCR整合亚基与所述结合结构域可操作地连接；并且
其中当在T细胞中表达时，所述TFP与内源性TCR功能性相互作用。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述结合结构域选自：
(a)抗原结合结构域：
(b)T细胞受体配体，例如肽-MHC复合物；或
(c)T细胞受体模拟物，例如结合所述肽-MHC复合物的T细胞受体模拟物。
3.如权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述Treg还包含刺激和/或稳定Treg形成的基因。
4.如权利要求3所述的药物组合物，其中刺激和/或稳定Treg形成的所述基因由与编码所述TFP的所述重组核酸分子相同的重组核酸分子编码。
5.如权利要求3所述的药物组合物，其中刺激和/或稳定Treg形成的基因由与编码所述TFP的所述重组核酸分子不同的重组核酸分子编码。
6.如权利要求3-5中任一项所述的药物组合物，其中刺激和/或稳定Treg形成的所述基因是FOXP3、HELIOS、BACH2或pSTAT5。
7.如权利要求1-6中任一项所述的药物组合物，其中所述Treg还包含开关受体。
8.如权利要求7所述的药物组合物，其中所述开关受体由与编码所述TFP的所述重组核酸分子相同的重组核酸分子编码。
9.如权利要求7所述的药物组合物，其中所述开关受体由与编码所述TFP的所述重组核酸分子不同的重组核酸分子编码。
10.如权利要求7-9中任一项所述的药物组合物，其中所述开关受体是IL7-IL2开关受体、IL7-IL10开关受体或TNF-α-IL2开关受体。
11.如权利要求1-10中任一项所述的药物组合物，其中所述Treg包含多于一种刺激和/或稳定Treg形成的基因和/或多于一种开关受体。
12.如权利要求1-11中任一项所述的药物组合物，其中所述Treg细胞中PKCθ、STUB1和CCAR2中的一种或多种的表达被减少或消除。
13.如权利要求1-12中任一项所述的药物组合物，其中CDK8和CDK19中的一种或多种的表达减少、缺失或在药理学上抑制稳定的Treg形成。
14.如权利要求2-13中任一项所述的药物组合物，其中所述肽-MHC复合物的肽是自身抗原或其片段。
15.如权利要求2-13中任一项所述的药物组合物，其中所述肽-MHC复合物的肽是外源性抗原或其片段。
16.如权利要求1-13中任一项所述的药物组合物，其中所述结合结构域包含抗原结合结构域。
17.如权利要求16所述的药物组合物，其中所述抗原结合结构域包括自身抗原结合结构域或外源性抗原结合结构域。
18.如权利要求17所述的药物组合物，其中所述自身抗原结合结构域特异性结合自身抗原。
19.如权利要求17所述的药物组合物，其中所述外源性抗原结合结构域特异性结合外源性抗原。
20.如权利要求14-19中任一项所述的药物组合物，其中所述自身抗原是胰岛葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白(IGRP)、胰岛素、HLA-A2、髓磷脂或α-麦醇溶蛋白或其片段中的一种或多种。
21.如权利要求14-19中任一项所述的药物组合物，其中所述外源性抗原是FVIII或治疗性大分子，例如治疗性多肽或其片段。
22.如权利要求16所述的药物组合物，其中所述抗原结合结构域结合细胞膜相关抗原。
23.如权利要求16所述的药物组合物，其中所述抗原结合结构域结合循环抗原。
24.如权利要求16中任一项所述的药物组合物，其中所述抗原结合结构域对胰岛细胞上的抗原具有特异性。
25.如权利要求2-24中任一项所述的药物组合物，其中所述抗原结合结构域是抗体或其功能性片段。
26.如权利要求25所述的药物组合物，其中所述抗体或其功能性片段是scFv或单结构域抗体。
27.如权利要求25或26所述的药物组合物，其中所述抗体或其功能性片段是人的或人源化的。
28.如权利要求1-15、20或21中任一项所述的药物组合物，其中所述结合结构域是TCR模拟物，例如特异性结合肽-MHC复合物。
29.如权利要求1-28中任一项所述的药物组合物，其中相对于具有不含TFP的Treg的药物组合物，所述药物组合物减少具有所述抗原、所述MHC-肽复合物或特异性结合所述MHC-肽复合物的T细胞受体的效应T细胞的细胞因子产生。
30.如权利要求1-29中任一项所述的药物组合物，其中所述Treg为CD4+CD25+FoxP3+Treg或CD8+调节性T细胞。
31.如权利要求1-30中任一项所述的药物组合物，其中所述胞内信号传导结构域选自CD3γ、CD3δ、CD3ε和CD3ζ。
32.如权利要求1-31中任一项所述的药物组合物，其中所述TCR整合亚基包含(i)TCR胞外结构域、(ii)TCR跨膜结构域和(iii)TCR胞内结构域，其中(i)、(ii)和(iii)中的至少两者或三者来自相同的TCR亚基。
33.如权利要求1-32中任一项所述的药物组合物，其中所述结合结构域通过接头序列与所述TCR胞外结构域可操作地连接。
34.如权利要求32所述的药物组合物，其中所述接头序列包含(G4S)n，其中n＝1至4。
35.如权利要求1-34中任一项所述的药物组合物，其中所述TFP包含TCR亚基的胞外结构域，所述胞外结构域包含选自由以下组成的组的蛋白质的胞外结构域或其部分：TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基及其功能性片段。
36.如权利要求1-35中任一项所述的药物组合物，其中所述TFP包括跨膜结构域，所述跨膜结构域包含选自由以下组成的组的蛋白质的跨膜结构域：TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、CD3ζTCR亚基及其功能性片段。
37.如权利要求1-36中任一项所述的药物组合物，其中所述TFP包含TCR亚基的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)，所述基于免疫受体酪氨酸的激活基序包含选自由以下组成的组的蛋白质的ITAM或其部分：CD3ζTCR亚基、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、Fcε受体1链、Fcε受体2链、Fcγ受体1链、Fcγ受体2a链、Fcγ受体2b1链、Fcγ受体2b2链、Fcγ受体3a链、Fcγ受体3b链、Fcβ受体1链、TYROBP(DAP12)、CD5、CD16a、CD16b、CD22、CD23、CD32、CD64、CD79a、CD79b、CD89、CD278、CD66d及其功能性片段。
38.如权利要求37所述的药物组合物，其中所述ITAM替代CD3γ、CD3δ或CD3ε的ITAM。
39.一种重组核酸，其包含编码权利要求1-38中任一项所述的药物组合物的TFP的序列。
40.如权利要求39所述的重组核酸，其中所述核酸选自由DNA和RNA组成的组。
41.如权利要求39或40所述的重组核酸，其中所述核酸是mRNA。
42.如权利要求39或40所述的重组核酸，其中所述核酸是环状RNA。
43.如权利要求39-42中任一项所述的重组核酸，其中所述重组核酸包含核酸类似物，其中所述核酸类似物不在所述重组核酸的编码序列中。
44.如权利要求39-43中任一项所述的重组核酸，所述重组核酸还包含前导序列。
45.如权利要求39-44中任一项所述的重组核酸，所述重组核酸还包含启动子序列。
46.如权利要求39-45中任一项所述的重组核酸，所述重组核酸还包含编码poly(A)尾的序列。
47.如权利要求39-46中任一项所述的重组核酸，所述重组核酸还包含3’UTR序列。
48.如权利要求39-47中任一项所述的重组核酸，其中所述核酸是分离的核酸或非天然存在的核酸。
49.如权利要求39-48中任一项所述的重组核酸分子，其中所述核酸是体外转录的核酸。
50.一种载体，其包含权利要求1-49中任一项所述的重组核酸。
51.如权利要求50所述的载体，其中所述载体选自由以下组成的组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)载体或逆转录病毒载体。
52.如权利要求50或51所述的载体，其中所述载体是体外转录的载体。
53.一种环状RNA，其包含权利要求39-49中任一项所述的重组核酸。
54.一种治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的权利要求1-38中任一项所述的药物组合物。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述疾病或病症是自身免疫性疾病。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是自身抗体介导的自身免疫性疾病。
57.如权利要求55所述的方法，其中所述自身免疫性疾病选自由以下组成的组：多发性硬化、自身免疫性溶血性贫血、乳糜泻和慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病。
58.如权利要求55所述的方法，其中所述疾病或病症是炎症，例如炎性疾病或病症、过敏反应或移植排斥。
59.一种用于治疗或预防有需要的受试者的疾病或病症的组合物，所述组合物包含权利要求39-49中任一项所述的重组核酸或权利要求1-38中任一项所述的药物组合物的T细胞。
60.如权利要求59所述的组合物，其中所述疾病或病症是自身免疫性疾病。
61.如权利要求59所述的组合物，其中所述疾病或病症是炎症，例如炎性疾病或病症、过敏反应或移植排斥。
62.如权利要求54-61中任一项所述的方法或组合物，其中所述受试者患有自身免疫性疾病、炎症例如炎性疾病或病症、过敏反应或移植排斥或者有发展自身免疫性疾病、炎症例如炎性疾病或病症、过敏反应或移植排斥的风险。
63.一种来自人受试者的调节性T细胞(Treg)，其中所述调节性T细胞包含重组核酸，所述重组核酸包含编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的序列，所述TFP包含：
(i)TCR整合亚基，其包含：
(1)TCR胞外结构域的至少一部分，和
(2)TCR跨膜结构域，和
(ii)结合结构域；
其中所述TCR整合亚基与所述结合结构域可操作地连接；并且
其中当在T细胞中表达时，所述TFP与内源性TCR功能性相互作用。
64.如权利要求63所述的调节性T细胞，其中所述TFP还包含TCR胞内信号传导结构域。
65.如权利要求63或64所述的调节性T细胞，其中所述结合结构域选自：
(a)抗原结合结构域：
(b)T细胞受体配体，例如肽-MHC复合物；或
(c)T细胞受体模拟物，例如结合所述肽-MHC复合物的T细胞受体模拟物。
66.如权利要求63-65中任一项所述的调节性T细胞，其中所述Treg还包含刺激和/或稳定Treg形成的基因。
67.如权利要求66所述的调节性T细胞，其中刺激和/或稳定Treg形成的所述基因由与编码所述TFP的所述重组核酸分子相同的重组核酸分子编码。
68.如权利要求66所述的调节性T细胞，其中刺激和/或稳定Treg形成的所述基因由与编码所述TFP的所述重组核酸分子不同的重组核酸分子编码。
69.如权利要求66-68中任一项所述的调节性T细胞，其中所述刺激和/或稳定Treg形成的所述基因是FOXP3、HELIOS、BACH2或pSTAT5。
70.如权利要求63-69中任一项所述的调节性T细胞，其中所述Treg还包含开关受体。
71.如权利要求70所述的调节性T细胞，其中所述开关受体由与编码所述TFP的所述重组核酸分子相同的重组核酸分子编码。
72.如权利要求70所述的调节性T细胞，其中所述开关受体由与编码所述TFP的所述重组核酸分子不同的重组核酸分子编码。
73.如权利要求70-72中任一项所述的调节性T细胞，其中所述开关受体是IL7-IL2开关受体、IL7-IL10开关受体或TNF-α-IL2开关受体。
74.如权利要求63-73中任一项所述的调节性T细胞，其中所述Treg包含多于一种刺激和/或稳定Treg形成的基因和/或多于一种开关受体。
75.如权利要求63-74中任一项所述的调节性T细胞，其中所述Treg细胞中PKCθ、STUB1和CCAR2中的一种或多种的表达被减少或消除。
76.如权利要求63-75中任一项所述的调节性T细胞，其中CDK8和CDK19中的一种或多种的表达减少、缺失或在药理学上抑制稳定的Treg形成。
77.如权利要求65-76中任一项所述的调节性T细胞，其中所述肽-MHC复合物的肽是自身抗原或其片段。
78.如权利要求65-76中任一项所述的调节性T细胞，其中所述肽-MHC复合物的肽是外源性抗原或其片段。
79.如权利要求63-78中任一项所述的调节性T细胞，其中所述结合结构域包含抗原结合结构域。
80.如权利要求79所述的调节性T细胞，其中所述抗原结合结构域包含自身抗原结合结构域或外源性抗原结合结构域。
81.如权利要求80所述的调节性T细胞，其中所述自身抗原结合结构域特异性结合自身抗原。
82.如权利要求80所述的调节性T细胞，其中所述外源性抗原结合结构域特异性结合外源性抗原。
83.如权利要求77-82中任一项所述的调节性T细胞，其中所述自身抗原是胰岛葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白(IGRP)、胰岛素、HLA-A2、髓磷脂或α-麦醇溶蛋白或其片段中的一种或多种。
84.如权利要求78-82中任一项所述的调节性T细胞，其中所述外源性抗原是FVIII或治疗性大分子，例如治疗性多肽或其片段。
85.如权利要求79所述的调节性T细胞，其中所述抗原结合结构域结合细胞膜相关抗原。
86.如权利要求79所述的调节性T细胞，其中所述抗原结合结构域结合循环抗原。
87.如权利要求79所述的调节性T细胞，其中所述抗原结合结构域对胰岛细胞上的抗原具有特异性。
88.如权利要求79-87中任一项所述的调节性T细胞，其中所述抗原结合结构域是抗体或其功能性片段。
89.如权利要求88所述的调节性T细胞，其中所述抗体或其功能性片段是scFv或单结构域抗体。
90.如权利要求88或89所述的调节性T细胞，其中所述抗体或其功能性片段是人的或人源化的。
91.如权利要求63-78、83或84中任一项所述的调节性T细胞，其中所述结合结构域是TCR模拟物，例如特异性结合肽-MHC复合物。
92.如权利要求63-91中任一项所述的调节性T细胞，其中相对于具有不含TFP的Treg的调节性T细胞，所述调节性T细胞减少具有所述抗原、所述MHC-肽复合物或特异性结合所述MHC-肽复合物的T细胞受体的效应T细胞的细胞因子产生。
93.如权利要求63-92中任一项所述的调节性T细胞，其中所述Treg是CD4+CD25+FoxP3+Treg或CD8+调节T细胞。
94.如权利要求63-93中任一项所述的调节性T细胞，其中所述胞内信号传导结构域选自由以下组成的组：CD3γ、CD3δ、CD3ε和CD3ζ。
95.如权利要求63-94中任一项所述的调节性T细胞，其中所述TCR整合亚基包含(i)TCR胞外结构域、(ii)TCR跨膜结构域和(iii)TCR胞内结构域，其中(i)、(ii)和(iii)中的至少两者或三者来自相同的TCR亚基。
96.如权利要求63-95中任一项所述的调节性T细胞，其中所述结合结构域通过接头序列与所述TCR胞外结构域可操作地连接。
97.如权利要求96所述的调节性T细胞，其中所述接头序列包含(G4S)n，其中n＝1至4。
98.如权利要求63-97中任一项所述的调节性T细胞，其中所述TFP包含TCR亚基的胞外结构域，所述胞外结构域包含选自由以下组成的组的蛋白质的胞外结构域或其部分：TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基及其功能性片段。
99.如权利要求63-98中任一项所述的调节性T细胞，其中所述TFP包括跨膜结构域，所述跨膜结构域包含选自由以下组成的组的蛋白质的跨膜结构域：TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基及其功能性片段。
100.如权利要求63-99中任一项所述的调节性T细胞，其中所述TFP包括选自由TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基和CD3δTCR亚基组成的组的蛋白质的TCR胞内结构域。
101.如权利要求63-100中任一项所述的调节性T细胞，其中所述TFP包含TCR亚基的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)，所述基于免疫受体酪氨酸的激活基序包含选自由以下组成的组的蛋白质的ITAM或其部分：CD3ζTCR亚基、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、Fcε受体1链、Fcε受体2链、Fcγ受体1链、Fcγ受体2a链、Fcγ受体2b1链、Fcγ受体2b2链、Fcγ受体3a链、Fcγ受体3b链、Fcβ受体1链、TYROBP(DAP12)、CD5、CD16a、CD16b、CD22、CD23、CD32、CD64、CD79a、CD79b、CD89、CD278、CD66d及其功能性片段。
102.如权利要求101所述的调节性T细胞，其中所述ITAM替代CD3γ、CD3δ或CD3ε的ITAM。
103.如权利要求63-102中任一项所述的调节性T细胞，其中所述Treg是自体的。
104.如权利要求63-102中任一项所述的调节性T细胞，其中所述Treg是同种异体的。
105.一种药物组合物，其包含权利要求63-104中任一项所述的调节性T细胞和药学上可接受的载体。
106.一种重组核酸，其包含编码权利要求63-104中任一项所述的调节性T细胞的TFP的序列。
107.如权利要求106所述的重组核酸，其中所述核酸选自由DNA和RNA组成的组。
108.如权利要求106或107所述的重组核酸，其中所述核酸是mRNA。
109.如权利要求106或107所述的重组核酸，其中所述核酸是环状RNA。
110.如权利要求106-109中任一项所述的重组核酸，其中所述重组核酸包含核酸类似物，其中所述核酸类似物不在所述重组核酸的编码序列中。
111.如权利要求106-110中任一项所述的重组核酸，所述重组核酸还包含前导序列。
112.如权利要求106-111中任一项所述的重组核酸，所述重组核酸还包含启动子序列。
113.如权利要求106-112中任一项所述的重组核酸，所述重组核酸还包含编码poly(A)尾的序列。
114.如权利要求106-113中任一项所述的重组核酸，所述重组核酸还包含3’UTR序列。
115.如权利要求106-114中任一项所述的重组核酸，其中所述核酸是分离的核酸或非天然存在的核酸。
116.如权利要求106-115中任一项所述的重组核酸，其中所述核酸是体外转录的核酸。
117.一种载体，其包含权利要求106-116中任一项所述的重组核酸。
118.如权利要求117所述的载体，其中所述载体选自由以下组成的组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)载体或逆转录病毒载体。
119.如权利要求117或118所述的载体，其中所述载体是体外转录的载体。
120.一种环状RNA，其包含权利要求106-116中任一项所述的重组核酸。
121.一种治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的权利要求63-104中任一项所述的调节性T细胞。
122.如权利要求121所述的方法，其中所述疾病或病症是自身免疫性疾病。
123.如权利要求122所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是自身抗体介导的自身免疫性疾病。
124.如权利要求122所述的方法，其中所述自身免疫性疾病选自由以下组成的组：多发性硬化、自身免疫性溶血性贫血、乳糜泻和慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病。
125.如权利要求122所述的方法，其中所述疾病或病症是炎症，例如炎性疾病或病症、过敏反应或移植排斥。
126.一种用于治疗或预防有需要的受试者的疾病或病症的组合物，所述组合物包含权利要求106-116中任一项所述的重组核酸或权利要求63-104中任一项所述的调节性T细胞。
127.如权利要求126所述的组合物，其中所述疾病或病症是自身免疫性疾病。
128.如权利要求126所述的组合物，其中所述疾病或病症是炎症，例如炎性疾病或病症、过敏反应或移植排斥。
129.如权利要求121-128中任一项所述的方法或组合物，其中所述受试者患有自身免疫性疾病、炎症例如炎性疾病或病症、过敏反应或移植排斥或者有发展自身免疫性疾病、炎症例如炎性疾病或病症、过敏反应或移植排斥的风险。
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