JP2011500703A - 最適化されたｈｅｒ１及びｈｅｒ３多量体を含む組成物、及びそれらの使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、改善された結合親和性を有する、遺伝子操作されたＨｅｒ３多量体を含む組成物を提供する。かかる多量体は、限定されないが、Ｈｅｒ３リガンド結合ドメインが、Ｈｅｒ３への結合を増大させるために最適化されている、Ｈｅｒ１／Ｈｅｒ３ヘテロ二量体を含む。当該組成物はまた、Ｈｅｒ１ホモ二量体、Ｈｅｒ３ホモ二量体、及びＨｅｒ１／Ｈｅｒ３ヘテロ二量体の混合物を含み得る。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２００７年１０月１６日に出願された米国仮出願第６０／９８０，４２４号、及び２００８年４月８日に出願された米国仮出願第６１／０４３，３０８号からの優先権の利益を主張し、そしてそれらの両方は完全に本明細書において参照により援用される。

発明の技術分野
本発明は、遺伝子操作されたＨｅｒ１及びＨｅｒ３リガンド結合ドメインを含む組成物に関し、そしてかかる組成物の製造方法及び使用方法に関する。

背景
受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は、多くのシグナル伝達経路に関与するポリペプチドに含まれる、細胞シグナル分子のファミリーである。ＲＴＫは、胚形成、細胞分裂、増殖、分化、遊走及び代謝を含む、種々の細胞過程において役割を果たす。ＲＴＫは、リガンドによって活性化され得る。かかる活性化は同様に、続いて起こるシグナル経路の活性化のための要求として、通常、受容体の二量化又はオリゴマー化をもたらす。例えばオートクリン又はパラクリン細胞シグナル経路を引き起こすことによる、例えばセカンドメッセンジャーの活性化によるシグナル経路の活性化は、特定の生物学的効果をもたらす。ＲＴＫのためのリガンドは、同族（ｃｏｇｎａｔｅ）受容体と特異的に結合する。ＲＴＫの調節不全が、幾つかの癌において見られた。例えば乳癌は、ｐ１８−５−ＨＥＲ２の発現増幅に関連し得る。ＲＴＫはまた、生理学的及び腫瘍における血管形成を含む、血管形成に関与する調節経路に関わりがある。ＲＴＫはまた、細胞増殖、遊走、及び生存の調節に関与する。

疾患関連性ＲＴＫのなかに、受容体のＨＥＲ（ヒトＥＧＦＲファミリー、または、ＥｒｂＢ若しくはＥＧＦＲとも呼ばれる）ファミリーがある（例えば、Ｈｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ ５：３４１−３５４，ｆｏｒ ａ ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｒｏｌｅ ｃａｎｃｅｒを参照）。クラスＩ受容体と呼ばれるこれらの受容体は、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及びＨＥＲ４を含む。これらの受容体は代替名を有する。ＨＥＲ１は時折ＥＧＦＲ及びＥｒｂＢ１と呼ばれ；ＨＥＲ２は、時折ＥｒｂＢ２及びＮＥＵと呼ばれ；ＨＥＲ３は時折ＥｒｂＢ３と呼ばれ；そしてＨＥＲ４は時折ＥｒｂＢ４と呼ばれる。これらのファミリーの全てのメンバーは、細胞外リガンド結合領域、単一膜貫通領域、及び細胞質内チロシンキナーゼ含有ドメインを有する。ＨＥＲ１及びＨＥＲ４のみが、リガンド結合及びキナーゼ活性に関して完全に機能的である。ＨＥＲ３は、キナーゼ活性を損なっており、そして活性化のためのヘテロ二量化パートナーのキナーゼ活性に依存している。

ｐ１８５（Ｈｅｒ２）に関連する癌を標的とするための一つの手法が、ＥｒｂＢ２タンパク質二量体を標的とするペプチドを使用することであった（例えば、Ｇｒｅｅｎｅ ａｔ ａｌ．，米国特許第６，４１７，１６８号を参照）。ＥｒｂＢ２、Ｅｒｂ３、及びＥｒｂＢ４のためのリガンド結合ドメインを含む、種々のタイプのキメラ多量体分子が記述されている。例えば、米国特許第６，６９６，２９０号明細書、国際公開第９８／０２５４０号を参照。しかし、これらの手法は、Ｈｅｒ１及び／又はＨｅｒ３の発現を有する癌に特異的ではなく、Ｈｅｒ１及び／又はＨｅｒ３の発現の調節不全と関連するより幅広い疾患に影響が及び得ることもない。同様に、Ｈｅｒ１の調節不全を有する癌、又はＨｅｒ３の調節不全を有する癌、又はその２つの組み合わせの癌にとって、既存の技術は、十分な特異性を有さないという問題を克服するために十分ではない。さらに、これらのクラスＩ受容体のリガンドに対する結合親和性は、受容体並びにその固有の生物学及び構造に依存して変化する。したがって、ＥｒｂＢ２と結合する分子は、Ｈｅｒ１又はＨｅｒ３とは必ずしも結合せず、そしてＥｒｂＢ２リガンドに関する任意の最適化研究は、Ｈｅｒ１又はＨｅｒ３に、それらが異なる生物学的特性及び構造を有する異なる受容体であるため、予想通り適用可能ではないだろう。

この点で、必要とされるものは、Ｈｅｒ１及びＨｅｒ３と改善された親和性で結合することができる組成物である。本明細書に記載された発明は、この目的に対する解決方法を提供し、そして同様に追加の利益を提供する。

本発明は、その同族リガンドとの結合を改善するために最適化されたＨｅｒ１及び／又はＨｅｒ３変異体を含む組成物を提供する。したがって一つの態様において、本発明は、その同族リガンドとの結合を改善するために最適化された、Ｈｅｒ３由来の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み、Ｈｅｒ１ ＥＣＤと連結された多量体を提供する。一つの実施形態において、当該最適化は、Ｙ２４６Ａの変異である。別の実施形態において、当該最適化されたＨｅｒ３は、１３２番目にリシンを任意に含む。一つの実施形態において、Ｈｅｒ３変異体は、Ｋ１３２Ｅの変異を有する。別の実施形態において、Ｈｅｒ３変異体は、Ｙ２４６変異と共に、１３２番目にリシンを有する。別の実施形態において、Ｈｅｒ３変異体は、Ｙ２４６Ａ変異無しで、１３２番目にリシンを有する。別の実施形態において、Ｈｅｒ３変異体は切断される（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）。別の実施形態において、切断されたＨｅｒ３変異体はまた、１３２番目にリシンを有する。

別の態様において、本発明は、その同族リガンドとの結合を改善するために最適化された、Ｈｅｒ１由来の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み、Ｈｅｒ３ ＥＣＤと連結された多量体を提供する。一つの実施形態において、Ｈｅｒ１ ＥＣＤは、Ｔ１５Ｓ変異を（又はシグナル配列ペプチドを有する残基を含む場合にはＴ３９Ｓ変異を）有する。別の実施形態において、Ｈｅｒ１ ＥＣＤは、Ｔ１５Ｓ及びＧ５６４Ｓ変異を有する。

本発明はまた、ホモ二量体として互いに関連している、Ｈｅｒ１及びＨｅｒ３変異体の組成物を提供する。一つの実施形態において、Ｈｅｒ１ホモ二量体は、Ｔ１５Ｓ及びＧ５６４Ｓ変異を有して形成される。別の実施形態において、Ｈｅｒ３ホモ二量体は、Ｙ２４６Ａ変異を有して形成される。別の態様において、本発明は、ヘテロ二量体としてＨｅｒ１ ＥＣＤと関連しているＨｅｒ３変異体の組成物を提供する。幾つかの実施形態において、Ｈｅｒ１ ＥＣＤはまた、その同族リガンドとの結合を改善するために最適化されている（例えば、Ｔ１５Ｓ、又はＴ１５Ｓ／Ｇ５６４Ｓ変異）。最適化は、ドメイン４の欠失、Ｔ３９Ｓ（又はシグナル配列無しでのＴ１５Ｓ）、Ｓ１９３Ｎ／Ｅ３３０Ｄ／Ｇ５８８Ｓ、及びＴ３９Ｓ／Ｇ５６４Ｓからなる群から選択される。

本発明はさらに、Ｈｅｒ１及び／又はＨｅｒ３成分がリガンド結合を改善するために最適化されている、Ｈｅｒ１／Ｈｅｒ１ホモ二量体、Ｈｅｒ１／Ｈｅｒ３ヘテロ二量体、及びＨｅｒ３／Ｈｅｒ３ホモ二量体の混合物を含む組成物を提供する。幾つかの態様において、ホモ二量体又はヘテロ二量体の任意の多量体は、ユニバーサルリンカーのようなリンカーを使用することによってＦｃ受容体と連結する。

本発明はまた、最適化されたＨｅｒ１変異体及び／又は最適化されたＨｅｒ３変異体を含む、医薬組成物及び／又は医薬を提供する。本発明はまた、癌細胞増殖を阻害するための医薬の製造における、最適化されたＨｅｒ１変異体及び／又は最適化されたＨｅｒ３変異体の使用を提供する。別の実施形態において、最適化されたＨｅｒ１変異体及び／又は最適化されたＨｅｒ３変異体は、Ｈｅｒ１及び／又はＨｅｒ３を発現する細胞の異常増殖を処置するための医薬の製造において使用される。

本発明はまた、癌細胞の増殖を阻害するためのかかる組成物の使用方法を提供する。幾つかの実施形態において、癌細胞増殖の阻害は、インビボにおいて治療用組成物として使用される。他の実施形態において、癌細胞増殖の阻害は、インビトロにおいて使用される。さらに別の実施形態において、最適化されたＨｅｒ１変異体及び／又は最適化されたＨｅｒ３変異体を含む組成物は、エクスビボ処置のために使用される。

図１は、ＨＥＲファミリー及びそのリガンドを示す。 図２は、ハーモジュリン（Ｈｅｒｍｏｄｕｌｉｎ）の命名を要約する表を示す。 図３は、一定のリンカー及びＦｃを有する幾つかのハーモジュリン分子を示す。 図４は、Ｈｅｒ１及びＨｅｒ３ ＥＣＤの最適化のための実験からの結果を示す。 図５は、ＨＦＤ３００及びＨＦＤ３００．１に関する、そのリガンドへの結合親和性を測定する実験からの結果を示す。 図６は、ＲＢ２４２．１Ｂに関する結合の結果を示す（命名の一部の「Ｂ」は、ユニバーサルリンカーの使用を示す）。 図７は、Ｈｅｒ３リン酸化のハーモジュリンホモ二量体による阻害に関して試験する実験の結果を示す。 図８は、ハーモジュリンヘテロ二量体による受容体リン酸化の相対的阻害に関して試験する実験の結果を示す。 図９は、リガンド結合部位の数に関して正規化されたとき、ヘテロ二量体がホモ二量体と比較される、受容体リン酸化の相対的阻害に関して試験する実験の結果を示す。 図１０は、対形成がヘテロ二量体の活性に影響し得ることを示す、種々のＥＣＤ対形成に関する平均倍数改善の結果を示す。 図１１は、ＮＲＧ誘導性ＭＣＦ７増殖のハーモジュリン阻害に関して試験する実験の結果を示す。 図１２は、ハーモジュリンによるＮＲＧ誘導性Ｔ４７Ｄ増殖の阻害に関して試験する実験の結果を示す。 図１３は、ＲＢ２００のリガンド結合親和性が、ハイスループットの合理的変異誘発工程を通じて最適化されることを示す。 図１４は、ハーモジュリンがリガンド誘導性細胞増殖を阻害し得ることを示す。 図１５は、ラットにおけるＲＢ２００の薬物動態を示す。正常なラットに、１５ｍｇ／ｋｇの用量で、静脈内（ＩＶ）又は腹腔内（ＩＰ）にＲＢ２００を単回投与し、血漿試料を種々の時点で回収した。抗ＨＥＲ１及び抗ＨＥＲ３を捕獲抗体として、抗ヒトＦｃ−ＨＲＰを検出抗体として使用する、ハーモジュリン特異的ＥＬＩＳＡによって、ＲＢ２００の血漿濃度を分析した。データは一つの時点あたり、２〜３匹のラットの平均±ＳＥＭである。薬物動態パラメータを、Ｓｉｇｍａ Ｐｌｏｔ １０．０．１を使用して計算した。 図１６は、ヌードマウス中におけるＲＢ２００及びＲＢ２４２の血漿濃度を示す。ＣＤ−１ヌードマウスに、３０ｍｇ／ｋｇの用量で、ｉｐで、ＲＢ２００及びＲＢ２４２を単回投与し、血漿試料を２４時間、及び７日目の時点で回収した。ＲＢ２００及びＲＢ２４２の血漿濃度をハーモジュリン特異的ＥＬＩＳＡによって決定した。一つの時点あたり４匹のマウスの平均血漿濃度（±ＳＤ）のデータをプロットした。 図１７は、最適化された二重特異的リガンドトラップＲＢ２４２．１が、設計された三重変異体であることを示す。ＲＢ２４２．１は、より高いリガンド結合親和性を示し（上部のパネル）、そして増殖因子誘導性ＨＥＲリン酸化における阻害活性の増大を示し（中央部のパネル）、そして腫瘍細胞増殖における阻害活性の増大を示す（下部のパネル）。ＫＤ及びＥＣ５０を測定し、そして示唆される元の／中間の形態を超える倍数改善を示す。 図１８は、高親和性ＥＧＦＲリガンド結合が、Ｆｃ媒介性ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３ヘテロ二量体において抑制されることを示す。¹²⁵Ｉリガンド結合は、抗Ｆｃコートされた９６ウェルプレート中で、当該表面上に固定化された、所定の精製ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３ヘテロ二量体を用いて行われた。¹²⁵Ｉ−ＴＧＦ−ａ結合（上部）及び¹²⁵Ｉ−ＮＲＧ１−β結合（下部）を示す。結果は、３つ組のウェルの平均±ＳＥＭである。 図１９は、ＲＢ２４２がＥＧＦＲリガンドに関して高い親和性を回復したことを示す。リガンド結合は、抗Ｆｃコートされた９６ウェルプレート中で、実施例中で詳述された、最適化されたリガンド結合条件を使用して行われた。パネルＡ及びＢは、Ｅｕ−ＥＧＦ及びＥｕ−ＮＲＧ１−βの飽和結合を示す。パネルＣ及びＤは、Ｅｕ−ＥＧＦの、非標識化ＴＧＦ−ａ又はＨＢ−ＥＧＦとの置換を示す。結果は、３つの独立した実験の見本であり、そしてリガンドと結合した受容体の画分へと正規化された。 図２０は、培養された腫瘍細胞の増殖阻害において、ＲＢ２４２がＲＢ２００よりも強力であることをパネルＡで示す。上部パネルは、ＲＢ２００又はＲＢ２４２の増加する濃度条件下、３日間、３ｎＭのＴＧＦ−ａ（上部左）又はＮＲＧ１−β（上部右）のいずれかで処置された血清飢餓ＢｘＰＣ３膵臓癌細胞を使用した結果を示す。左下部のパネルは、ＲＢ２００又はＲＢ２４２の増加する濃度条件下、３日間、３ｎＭのＮＲＧ１−βで処置された血清飢餓ＭＣＦ７細胞からの結果を示す。右下部のパネルは、ＲＢ２００又はＲＢ２４２の増加する濃度条件下、５日間、増殖培地（ＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＢＳ）中におけるＨ１４３７ＮＳＣＬＣ細胞の増殖を示す。細胞増殖は、標準的な技術を使用して定量化され、そして実施例中において議論された。当該結果は、８個又は１６個の複製物における平均±ＳＥＭである。ＢｘＰＣ３に関する概算のＥＣ₅₀値を、一番高い定数が１００に等しいと設定されている、制限タイプを使用して決定された。パネルＢは、ＲＢ２４２が、マウス腫瘍異種移植片モデルにおいて、改善された抗腫瘍活性を有することを示す。ヌードマウスは、実施例に記載された通りに、皮下にＨ１４３７ＮＳＣＬＣ細胞を用いて移植された。腫瘍量が約１００ｍｍ³に達したとき、ＰＢＳビヒクル（○）、又はＲＢ２００（黒塗り下向き三角）、又はＲＢ２４２（黒塗り上向き三角）のいずれかを用いて、一週間に３回で３週間、１ｋｇあたり１２ｍｇで、腹腔内投与でマウスを処置した。各々の処置群あたり９匹のマウスを用いた。データを平均腫瘍量±ＳＥＭとして表現した。＊＊は、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’ｓ ｐｏｓｔ ｔｅｓｔを用いた二元分散分析（ｔｗｏ ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）により、Ｐ＜０．０１である。

詳細な説明
本発明は、その同族リガンドとの改善された結合のために最適化された、Ｈｅｒ１及び／又はＨｅｒ３リガンド結合ドメインを含む組成物を提供する。これらの組成物は、複数のＨＥＲリガンド（増殖因子）の捕獲を通じて、細胞の活性化を阻害するために有用である。本明細書において使用されるこれらのタイプの組成物は、汎特異的（ｐａｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）ＨＥＲリガンドトラップ（ｐａｎ−ＨＥＲ）であり得、又は本明細書において「ハーモジュリン（Ｈｅｒｍｏｄｕｌｉｎ）」とも呼ばれる。

他に示されない限り、本明細書において使用される全ての技術的及び科学的用語は、当該発明（単数又は複数）が属する技術分野における当業者によって通常理解されるものと同一の意味を有する。本明細書における全ての開示を通じて参照される、全ての特許、特許出願、刊行された出願及び刊行物、ＧＥＮＢＡＮＫの配列、ウェブサイト及び他の刊行物は、他に記載のない限り、それら全体で参照により援用される。

一般的説明
本発明の実施は、他に示されない限り、（組み換え技術を含む）分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来技術を使用し、そしてそれらは当技術分野の範囲内である。かかる技術は、文献中に、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ＆Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ＆Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）、及びＳｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）中に完全に説明されている。

定義
本明細書において使用される、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、受容体表面上に生じる、細胞表面受容体の一部であり、そしてリガンド結合部位（単数又は複数）を含む。本明細書における目的のために、ＥＣＤへの言及は、別のドメイン（すなわち、膜貫通ドメイン、タンパク質キナーゼドメイン又はその他）と関連する任意の隣接配列をＥＣＤポリペプチドが含まない限り、任意のＥＣＤ含有分子、又はその部分を含む。したがって例えば、ＥＣＤポリペプチドは、細胞表面受容体（ＣＳＲ）の選択的スプライシングがなされたアイソフォームを含み、ここで当該アイソフォームは、ＥＣＤ含有部分を有するが、同族ＣＳＲの任意の他のドメインを欠如しており、そして同様に同族ＣＳＲの別のドメイン配列と関連しない、又は整列されない任意の配列を有する。これらの追加的配列は、イントロン融合タンパク質アイソフォーム中で生じるような、イントロンをコードした配列であり得る。通常、当該追加的配列は、ＣＳＲ ＥＣＤポリペプチドのリガンド結合活性及び／又は受容体二量化活性を阻害又は妨害しない。ＥＣＤポリペプチドはまた、ハイブリッドＥＣＤを含む。

本明細書において使用される、多量化ドメインは、あるポリペプチド分子と、相補的多量化ドメインを含む別のポリペプチド分子との安定な相互作用を促進するアミノ酸配列のことであり、そしてそれは、当該第一のドメインと安定な多量体を形成する、同一の又は異なる多量化ドメインであり得る。一般的にポリペプチドは、多量化ドメインへと直接的に、又は間接的に結合される。例示的な多量化ドメインは、免疫グロブリン配列又はその一部、ロイシンジッパー、疎水性領域、親水性領域、相溶性タンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、例えば、限定されないが、ＰＫＡ及びアンカードメイン（ＡＤ）のＲサブユニット、２つの分子の間に分子間ジスルフィド結合を形成する遊離のチオール、並びに腔内突起（ｐｒｏｔｕｂｅｒａｎｃｅ−ｉｎｔｏ−ｃａｖｉｔｙ）（すなわち、ｋｎｏｂ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅ）、及び安定な多量体を形成する同一の、又は類似のサイズの補償的空洞（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ ｃａｖｉｔｙ）を含む。多量体ドメインは、例えば、免疫グロブリン定常領域を含む。免疫グロブリン配列は、免疫グロブリン定常領域、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ及びＩｇＭ由来のＦｃドメイン又はその一部分であり得る。

最適化されたＨｅｒ１及び／又はＨｅｒ３を含む組成物
本発明は，遺伝子操作されていないＨｅｒ１及び／又はＨｅｒ３と比較した場合における、改善された結合のために遺伝子操作された（又は最適化された）Ｈｅｒ１及び／又はＨｅｒ３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む組成物を提供する。かかる組成物は、例えば、その同族リガンドへの結合アッセイのための構成要素としての有用性を有する。幾つかの態様において、当該組成物は、Ｈｅｒ３ ＥＣＤホモ二量体の多量体を含む。Ｈｅｒ３ ＥＣＤは、以下に、及び図中により詳細に開示されている変異を含み得、そしてそれは、そのリガンドへの結合の改善のために有用である。他の態様において、当該組成物は、Ｈｅｒ３及びＨｅｒ１ヘテロ二量体の多量体を含む。Ｈｅｒ３若しくはＨｅｒ１のいずれか一つ、又はその両方に関して、最適化は、それらのリガンドへの結合親和性を改善するために、又は追加的に、限定されないが、受容体型チロシンキナーゼのリン酸化阻害、動物中におけるバイオアベイラビリティの増大、インビボにおけるより優れた薬物動態、細胞遊走の阻害、腫瘍量の減少、又は腫瘍増殖の停止を含む他の生物学的特性を改善するために使用され得る。さらに別の態様において、当該組成物は、Ｈｅｒ１／Ｈｅｒ１ホモ二量体（例えば、Ｔ１５Ｓ、Ｇ５６４Ｓ変異を有するＨＥＲ１のホモ二量体）、Ｈｅｒ１／Ｈｅｒ３ヘテロ二量体、及びＨｅｒ３／Ｈｅｒ３ホモ二量体の混合物を含み、ここでＨｅｒ３成分は、そのリガンドへの改善された結合のために遺伝子操作されている。図１は、ＨＥＲファミリー及びそのリガンドを示す。Ｈｅｒ１、Ｈｅｒ２、及びＨｅｒ３の調節不全は、癌事例の５０％超を占める。実施例は、最適なＨｅｒ３リガンド結合のために製造されかつ試験された多くの変異体について詳述する。

本発明はまた、多量体（ホモ二量体又はヘテロ二量体のいずれか一方）を形成する、最適化されたＨｅｒ３及び最適化されたＨｅｒ１の組み合わせ、並びにＨｅｒ１／Ｈｅｒ１ホモ二量体、Ｈｅｒ１／Ｈｅｒ３ヘテロ二量体、及びＨｅｒ３／Ｈｅｒ３ホモ二量体の混合物を含むことが理解され得る。

ＨＥＲ１ ＥＣＤ構造及びドメイン組織
ＨＥＲ１の細胞外部分は、成熟ＨＥＲ１受容体の１〜６２１番残基を含み、並びにサブドメインＩ（１〜１６５番アミノ酸残基）、II（１６６〜３１３番アミノ酸残基）、III（３１４〜４８１番アミノ酸残基）、及びIV（４８２〜６２１番アミノ酸残基）を含む。ＨＥＲ１のＩ、II、及びIIIドメインは、Ｉ型インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦ−ＩＲ、例えばＧａｒｒｅｔ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｃｅｌｌ，１１０：７６３−７７３）の最初の３つのドメインと構造的及び配列的相同性を有する。ＩＧＦ−１Ｒと同様に、Ｌドメイン（すなわち、ドメインＩ及びIII）は、各々の末端を一つのへリックス及び一つのジスルフィド結合でキャップされた６つのターンβへリックスの構造を有する。ＩＧＦ−１Ｒと比較して、ＨＥＲ１配列は、ＨＥＲ１によるリガンド結合を媒介するために重要な生物化学的構造に寄与するアミノ酸の挿入を含む。これらは、Ｖ形可動域（８〜１８番残基）を含み、そしてそれはリガンド結合界面の大部分を形成するドメインＩの広いβシート上に位置する。ドメインIIIにおいて、対応する領域は、リガンド結合に同様に関与するループ（３１６〜３２６番残基）を形成する。ドメインIIIに存在する第三の挿入領域（３５１〜３６９番残基）は、ドメインIIIの第二ターン中の追加のループである。このループは、リガンド結合を防止する種々の抗体のためのエピトープである（すなわち、ＬＡ２２、ＬＡ５８、及びＬＡ９０、例えばＷｕ ｅｔ ａｌ，（１９８９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２６４：１７４６９−１７４７５を参照）。さらに、βへリックスソレノイドの第四ターンにおける他のループは、リガンド結合に関与する。

ＨＥＲ１のリガンドであるＴＧＦ−αは、一つの受容体分子のＬドメインＩ及びIIIの両方の大きなβシートと相互作用する。同様に、リガンドＥＧＦはまた、ＨＥＲ１のドメインＩ及びIIIの両方と相互作用し、ここでドメインIIIとのＥＧＦの相互作用は、ＥＧＦに対する主要な結合部位で起こると考えられる（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ，（２００２）ＦＥＢＳ，２６９：２３２３−２３２９）。架橋試験は、ＥＧＦリガンドのＮ末端及びＣ末端部位が、ＨＥＲ１受容体のドメインＩ及びIIIの各々と相互作用することを決定した。成熟完全長ＨＥＲ１に対応する、ドメインIII中のアミノ酸Ｇｌｙ４４１は、ヒトＥＧＦのＡｒｇ４５との相互作用を通じて、ＥＧＦへの結合の媒介に関与する。（成熟ＨＥＲ１ポリペプチドの３０２〜５０３番アミノ酸に対応する）２０２個のアミノ酸の、ＨＥＲ１の４０ｋＤａ断片は、ＥＧＦへのＨＥＲ１の完全なリガンド結合能力を保持するために十分である。この２０２個のアミノ酸部分は、ドメインIIIの全て、及びドメインII及びドメインIVの各々の幾つかの残基のみを含む（Ｋｏｈｄａ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）ＪＢＣ ２６８：１９７６）。

ＥＧＦＲのドメインIIは、８つのジスルフィド結合したモジュールを含む。ドメインIIは、ドメインI及びIIIの両方と相互作用する。ドメインIIIとの接触は、モジュール６及び７を経由して生じ、一方でモジュール７及び８は、ＥＧＦＲ分子のリガンド・フリー形態におけるヒンジを形成するために機能する柔軟度を有する。大きく、秩序化されたループは、ドメインIIのモジュール５から形成され、そしてリガンド結合部位から離れて直接的に突き出している。このループは、２４０番〜２６０番残基（同様に、２４２番〜２５９番残基として記載されている）に対応し、そしてアンチパラレルなβリボンを含有する。（二量化アームとも呼ばれる）当該ループは、分子内相互作用を媒介するときに、及び受容体−受容体接触を媒介するために重要である。ＨＥＲ１の不活性又は「連結された」高次構造において、当該ループは、成熟完全長ＥＣＤの５６１番〜５６９番アミノ酸、及び５７２番〜５８５番アミノ酸にそれぞれ対応する、モジュール５及び６中の類似のループ構造間における挿入によって、分子内相互作用に寄与する。

ドメインIIループの欠失は、二量化し、その結果分子間相互作用を促進するときにその重要性を示すＨｅｒ１ ＥＣＤの能力を無効にする。二量化は、ドメインＩ、II、及びIII間の空間中における第二のＨＥＲ分子のドメインIIを横切ったループの突き出しによって媒介される。例えば接触は、第二のＨＥＲ分子におけるドメインIIの凹面における２２９番〜２３９番残基、２６２番〜２７８番及び２８２番〜２８８番残基と共に、二量化アームの２４４番〜２５３番残基によってなされる。ドメインII中におけるＴｙｒ２４６は、第二のＨＥＲ分子中にあるＧｌｙ２６４及びＣｙｓ２８３残基と水素結合を形成し、そしてＴｙｒ２４６のフェニル環はまた、隣接分子のＳｅｒ２６２及びＳｅｒ２８２と相互作用する。ＥＧＦＲのドメインＩＩ、及び別のＨＥＲ分子との間の他のアミノ酸の接触は、Ｔｙｒ２５１とＰｈｅ２６３、Ｇｌｙ２６４、Ｔｙｒ２７５、及びＡｒｇ２８５；Ｐｒｏ２４８とＰｈｅ２３０及びＡｌａ２６５；Ｍｅｔ２５３とＴｈｒ２７８；並びにＴｙｒ２５１とＡｒｇ２８５を含む。さらに、Ａｓｎ２４７及びＡｓｎ２５６は、好適な高次構造におけるループを維持するために重要である。ほぼ全てのこれらの残基は、ＨＥＲファミリーメンバー中で保存されており、そしてＨＥＲファミリー受容体間で同様に機能する。さらに、ＨＥＲ３が３つのプロリンを含みつつ、プロリン残基が、ＨＥＲファミリー受容体のループ中における、２４３、２４８、２５５、及び２５７番目の任意の一つにおいて生じる。プロリン残基は、ループ高次構造をさらに安定化する。例えばＨＥＲ１は、２４８番と２５７番においてプロリンを含む。

不活性ＨＥＲ１分子の連結におけるドメインIV（モジュール５及び６）の関与に加えて、ＨＥＲ１のドメインIVのモジュール１の少なくとも一部はまた、活性ＨＥＲ１分子の構造的統一性を維持するために必要であるように思われる。例えば、上で言及されたとおり、ドメインIIIの全て、並びにドメインII及びIVの一部を含有するＨＥＲ１の４０ｋＤａのタンパク質分解性断片は、完全なリガンド結合能力を保持している。この分子中に存在するドメインIVの一部は、モジュール１の全てを含む４８２番〜５０３番アミノ酸に対応する。成熟ＨＥＲ１分子におけるＴｒｐ４９２に対応するアミノ酸は、ドメインIII中における疎水性ポケットとの相互作用による、ＨＥＲ１分子の安定性を維持する役割を果たす。ドメインＩ、II及びIIIの全てを含むが、ドメインIVの全てを欠如しているＨＥＲ１の組み換え分子は、（成熟ＨＥＲ１の１番〜４７６番アミノ酸に対応する（例えば、Ｅｌｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ，（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０：８９３０−８９３９を参照））リガンドと結合することができない。したがって、ドメインIVのモジュール１の少なくとも全て又は一部は、ＨＥＲ１のリガンド結合性能力に必要であると思われる。ドメインIVの残部は、リガンド結合及びシグナリングに使用される。例えば、ＨＥＲ１の正常リガンド結合及びシグナリング特性は、成熟ＨＥＲ１ポリペプチドの５２１番〜６０３番残基を欠如するＨＥＲ１分子に存在する。

ＨＥＲ３ ＥＣＤ構造及びドメイン組織
ＨＥＲ３の細胞外部分は、成熟ＨＥＲ３受容体の１番〜６２１番残基を含み、そしてサブドメインＩ（１番〜１６６番アミノ酸残基）、II（１６７番〜３１１番アミノ酸残基）、III（３１２番〜４８０番アミノ酸残基）、及びIV（４８１番〜６２１番アミン酸残基）を含む。他のＨＥＲファミリー受容体のように、ＨＥＲ３のドメインＩ、II、及びIIIは、ＩＧＦ−１Ｒで重ね合わされ得、そして他のＨＥＲ受容体のように多くの同一の構造的特徴を示す。例えば、ＨＥＲ３のドメインＩ及びIIIは、ジスルフィド含有モジュールの延長された反復によって阻害されるβ−へリックス構造を示す。ドメイン間の高い柔軟性が、ドメインIIとIIIとの間に存在し、そしてそれはＩＧＦ−ＩＲによって示されない。さらにＨＥＲ３は、（ＨＥＲ３の２４２番〜２５９番アミノ酸に対応する）ドメインII中において特徴的なβ−ヘアピンループ又は二量化アームを示す。β−ヘアピンループは、閉じた又は不活性なＨＥＲ３構造をもたらすドメインIVにおける保存残基との分子内接触を提供する。この連結相互作用において重要な残基は、Ｙ２４６とＤ５６２及びＫ５８３との相互作用、Ｆ２５１とＧ５６３との相互作用、並びにＱ２５２とＨ５６５との相互作用を含む。リガンドの結合時、高次構造変化は、受容体の二量化を可能とする連結構造由来の二量化アームをさらす、ドメインＩ及びIIIを再配置する。

他のＨＥＲファミリー受容体とは異なり、ＨＥＲ３は、機能的キナーゼドメインを有さない。全てのタンパク質チロシンキナーゼ中で保存されているキナーゼ領域における４つのアミノ酸残基の変化により、ＨＥＲ３キナーゼは機能不全となる。しかし、ＨＥＲ３は、そのカルボキシ末端ドメイン中にチロシン残基を保持しており、そして好適な活性化及びトランスリン酸化における細胞シグナリングを誘導することができる。したがって、ＨＥＲ３のホモ二量体は、直線的なシグナリングを支持することができない。ＨＥＲ３のための好ましい二量化パートナーはＨＥＲ２である。したがって、本明細書において提供される発明は、この二量化特性の観点において予測され得ない。Ｈｅｒ３のためのリガンドは、ニューレグリン−１（ＮＲＧ−１）及びニューレグリン−２（ＮＲＧ−２）を含む。

ＥＣＤ多量体の構成成分及びＥＣＤ多量体の形成
ＥＣＤヘテロ多量体は、リガンドへの結合及び／又は二量化のために、少なくとも２つの異なるＥＣＤ、又はその一部を含む。本明細書における例示的実施形態において、少なくとも一つの構成成分ＥＣＤは、ＨＥＲ３ ＥＣＤである。ヘテロ多量体又はホモ多量体におけるＥＣＤは、連結され、それにより多量体形態であり、少なくともヘテロ二量体又はホモ二量体形態である。ヘテロ多量体又はホモ多量体を形成するために、ＥＣＤの相互作用を可能とする又はもたらす任意の連結が意図される。

ＥＣＤポリペプチド
本明細書において提供されるＥＣＤ多量体の製造における使用のためのＥＣＤポリペプチドは、Ｈｅｒ３及び／又はＨｅｒ１のＥＣＤの全て又は一部分であり得る。以下においてより詳細に議論される通り、そのリガンド（単数又は複数）への改善された結合を示す、これらのＥＣＤポリペプチドの変異体を製造するために、種々の方法が使用され得る。使用されるＨｅｒ３及び／又はＨｅｒ１のＥＣＤは、完全長であるか、又は切断されたものであり得、そしてまた、対立遺伝子変異体の使用を含む。

ＥＣＤ多量体の形成
ＨＥＲ ＥＣＤ多量体を含むＥＣＤ多量体は、共有結合した、共有結合していない、又は化学的に結合した、受容体ＥＣＤの多量体であり得、その結果、二量体、三量体、又はより大きな多量体を形成する。幾つかの例において、多量体は、２つ以上のＥＣＤポリペプチドの二量化により形成され得る。２つのＥＣＤポリペプチド間における多量化は、自発的であり得るか、又は２つ以上のポリペプチドの強制的な結合により生じ得る。一つの例において、多量体は、異なるＥＣＤポリペプチドにおけるシステイン残基間に形成されるジスルフィド結合により連結され得る。別の例において、多量体は、共有結合性又は非共有結合性相互作用を介して、溶解性ポリペプチドと融合したペプチド部分と結合したＥＣＤポリペプチドを含み得る。かかるペプチドは、ペプチドリンカー（スペーサー）、又は多量化を促進する特性を有するペプチドであり得る。さらなる例において、多量体は、化学的連結を通じて、例えば、ヘテロ二官能性リンカーを使用することによって、２つのポリペプチド間で形成され得る。

ペプチドリンカー
ペプチドリンカーは、ポリペプチド多量体、例えば一つの多量化パートナーが、ＨＥＲファミリー受容体のＥＣＤの全部又は一部である多量体を製造するために使用され得る。一つの例において、ペプチドリンカーは、第一のポリペプチドのＣ末端、及び第二のポリペプチドのＮ末端と結合され得る。この構造は、少なくとも１個の、好ましくは２個、３個、４個、又はそれ以上の可溶性ポリペプチドが、それらの各々の末端におけるペプチドリンカー経由で互いに連結されるように、複数回繰り返され得る。例えば、多量体ポリペプチドは、Ｚ₁−Ｘ−Ｚ₂配列を有し得、ここでＺ₁及びＺ₂は、各々細胞表面ポリペプチドのＥＣＤの全部又は一部の配列であり、そしてＸは、ペプチドリンカーの配列である。幾つかの例において、Ｚ₁及び／又はＺ₂は、ＨＥＲファミリー受容体のＥＣＤの全部又は一部である。別の例において、Ｚ₁及びＺ₂は同一であるか、又は異なる。別の例において、ポリペプチドは、Ｚ₁−Ｘ−Ｚ₂（−Ｘ−Ｚ）_nの配列であり、ここで「ｎ」は任意の整数であり、すなわち一般的に１又は２である。

通常、ペプチドリンカーは、溶解性ＥＣＤポリペプチドが隣接する溶解性ＥＣＤポリペプチドとの結合を形成することを可能とするために十分な長さである。ペプチドリンカーの例は、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、ＧＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＳ若しくは（ＧＧＧＧＳ）_n、ＳＳＳＳＧ若しくは（ＳＳＳＳＧ）_n、ＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳ、ＧＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＳＥＧＳＧＳＴＫＧ、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＥＦ、又はＡｌａＡｌａＰｒｏＡｌａ若しくは（ＡｌａＡｌａＰｒｏＡｌａ）_nを含み、ここでｎは１〜６、例えば１、２、３又は４である。好ましい実施形態において、リンカーは、（本明細書において「ユニバーサルリンカー」とも呼ばれ、そしてこのリンカーを有するコンストラクトは、その名前の最後に「Ｂ」表示を有する）ＧＧＧＧＧである。

連結部位は、例えば、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）ＰＮＡＳ ８５：５８７９−５８８３，Ｗｈｉｔｌｏｗ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６：９８９−９９５、及びＮｅｗｔｏｎ ｅｔ ａｌ，（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：５４５−５５３に記載されている。他の好適なペプチドリンカーは、米国特許第４，７５１，１８０号、及び第４，９３５，２３３号明細書に記載されているもののいずれかを含み、そしてそれらは、参照により本明細書に援用される。所望のペプチドリンカーをコードするポリペプチドは、任意の好適な従来技術を使用して、可溶性ＥＣＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと同一のリーディングフレームの間に及びその中に挿入され得る。一つの例において、融合ポリペプチドは、ペプチドリンカーによって分離された、ＨＥＲ ＥＣＤポリペプチドの全て又は一部であるものを含む、２〜４個の可溶性ＥＣＤポリペプチドを有する。

通常、ＥＣＤキメラタンパク質の免疫グロブリン部分は、免疫グロブリンポリペプチドの重鎖を、最も一般的には重鎖の定常ドメインを含む。一つの例において、免疫グロブリンポリペプチドキメラタンパク質は、免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域を含み得る。通常かかる融合は、免疫グロブリンの重鎖定常領域の少なくとも機能的に活性なヒンジ、Ｃ_H２及びＣ_H３を保持する。別の例示的なＦｃポリペプチドは、ＰＣＴ出願公開第９３／１０１５１号に説明されており、そして、Ｎ末端ヒンジ領域からヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域の天然のＣ末端へと伸びている一本鎖ポリペプチドである。結合が形成される正確な部位は重要ではない：特定の部位は周知であり、そしてＥＣＤポリペプチドの生物学的活性、分泌、又は結合特性を最適化するために選択され得る。例えば、他の例示的なＦｃポリペプチド配列は、配列中のＣ１０９又はＰ１１３アミノ酸で開始する（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２４２９８号明細書参照）。

ｈＩｇＧ１ Ｆｃに加え、他のＦｃ領域はまた、ＥＣＤキメラポリペプチド中に含まれ得る。例えば、Ｆｃ／ＦｃγＲ相互作用によって媒介されるエフェクター機能が最小化され得る場合において、補体又はエフェクター細胞をあまり救援しないＩｇＧアイソタイプ、例えばＩｇＧ２又はＩｇＧ４のＦｃとの融合が意図される。さらに、Ｆｃ融合は、限定されないが、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４ヒトサブクラスを含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２ヒトサブクラスを含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、及びＩｇＭ抗体クラスを含む、任意の抗体クラスに属する免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされている免疫グロブリン配列を含み得る。さらにリンカーは、Ｆｃキメラを生じるために、Ｆｃと別のポリペプチドとを共有結合で連結するために使用され得る。

修飾Ｆｃドメインはまた、ＥＣＤポリペプチドとのキメラにおける使用のために、本明細書において意図される。例示的修飾に関しては、例えば、米国特許出願公開第２００６／００２４２９８号明細書、及び国際公開第２００５／０６３８１６号を参照。幾つかの例において、Ｆｃ領域は、野生型免疫グロブリン重鎖Ｆｃ領域のエフェクター機能よりも変化した（すなわち、より多くの又はより少ない）エフェクター機能を有するものである。抗体のＦｃ領域は、多くのＦｃ受容体と相互作用し、そしてエフェクター機能と呼ばれる多くの重要な機能的能力を付与する。

したがって、修飾Ｆｃドメインは、限定されないが、Ｆｃ受容体に対する増加した親和性、又は低い親和性若しくは親和性のないことを含む、変化した親和性を有し得る。例えば、異なるＩｇＧサブクラスは、ＦｃγＲに関して異なる親和性を有し、ここでＩｇＧ１及びＩｇＧ３はＩｇＧ２及びＩｇＧ４よりも受容体へ実質的に強く結合する。さらに、異なるＦｃγＲは、異なるエフェクター機能を媒介する。ＦｃγＲｌ、ＦｃγＲIIａ／ｃ、及びＦｃγＲIIIａは、免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する細胞内ドメインを有することによって特徴付けられる活性化を引き起こす免疫複合体の正の調節因子である。しかし、ＦｃγＲIIｂは、免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有し、したがって、抑制性である。したがって、受容体に関するＦｃ領域の親和性を変化させることは、Ｆｃドメインによって誘導されるエフェクター機能を調節し得る。

一つの例において、Ｆｃ領域は、例えばＡＤＣＣのようなエフェクター機能をより良く媒介するために、特定のＦｃγＲとの最適化された結合のために修飾される。別の例において、ＦｃγＲとの結合を減少させる又は除去する置換を有する種々のＦｃ変異体が既知である。かかる変異タンパク質は、例えば、Ｆｃによって媒介されるエフェクター機能の減少又は排除に関する必要性が存在する場合に有用である。これは通常、標的抗原を産生する細胞を殺さないが、拮抗作用が望ましい場合である。かかるＦｃの例は、米国特許第５，４５７，０３５号明細書に記載されているＦｃ変異タンパク質である。幾つかの場合において、本明細書において提供されるＥＣＤポリペプチドＦｃキメラタンパク質は、補体タンパク質Ｃ１ｑとの結合を向上させるために修飾され得る。更なる例において、ＦｃＲｎへの結合のために修飾され、それによりＥＣＤ−Ｆｃキメラポリペプチドの薬物動態を改善するＦｃ領域が利用され得る。ＦｃＲｎは、新生児のＦｃＲであって、血流へと戻るエンドソーム由来の取り込まれた抗体を再循環する。大きなサイズの完全長分子による腎臓濾過の除外と結びついたこの工程は、１〜３週間の好ましい抗体血清半減期をもたらす。ＦｃＲｎへのＦｃの結合はまた、抗体輸送において役割を果たす。ＦｃＲｎへの結合向上のための、Ｆｃタンパク質における例示的修飾は、Ｔ３４Ｑ、Ｔ３４Ｅ、Ｍ２１２Ｌ、及びＭ２１２Ｆに相当するアミノ酸の修飾を含む。

一般的に、ポリペプチド多量体は、２つの、同一の又は異なるＥＣＤポリペプチドの、Ｆｃポリペプチドへの直接的又は間接的な結合によって作られる、２つのキメラタンパク質の二量体である。幾つかの例において、ＥＣＤ−Ｆｃキメラタンパク質をコードする遺伝子融合は、好適な発現ベクターへと挿入される。結果的なＥＣＤ−Ｆｃキメラタンパク質は、組み換え発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞中で発現され得、そして抗体分子のように凝集することができ、ここで鎖間ジスルフィド結合は、Ｆｃ部位間で形成され、二価のＥＣＤポリペプチドを産生する。通常、宿主細胞及び発現系は、好適なアミノ酸のグリコシル化を可能とするために、哺乳動物発現系が使用され得る。

Ｆｃ部位を含有する、得られるキメラポリペプチド、及びそれから形成される多量体は、プロテインＡ又はプロテインＧカラムによるアフィニティクロマトグラフィーによって容易に精製され得る。異なるＥＣＤキメラポリペプチドをコードする２つの核酸が細胞中に形質転換される場合、Ｆｃドメインを運ぶＥＣＤキメラ分子が、ジスルフィド結合したホモ二量体として同様に発現されるため、ヘテロ二量体の形成が生物化学的に達成されなければならない。したがってホモ二量体は、鎖間ジスルフィドの破壊に有利に働くが、鎖内ジスルフィドに影響しない条件下で減少され得る。通常、異なる細胞外部分を有するキメラ単量体は、等モル量で混合され、そして酸化されてホモ及びヘテロ二量体の混合物を形成する。この混合物の成分は、クロマトグラフィー技術によって分離される。代わりに、このタイプのヘテロ二量体の形成は、遺伝子操作によって、及びＥＣＤポリペプチドを含むＥＣＤ融合分子であって、その後ｈＩｇＧのＦｃ−ドメイン、その後ｃ−ｊｕｎ又はｃ−ｆｏｓロイシンジッパーのいずれかとなるものを発現することによって偏らされ得る。ロイシンジッパーは主にヘテロ二量体を形成するため、それらは、所望であるとき、ヘテロ二量体の形成を推進するために使用され得る。Ｆｃ領域を含有するＥＣＤキメラポリペプチドはまた、金属キレート又は他のエピトープとのタグを含むように遺伝子操作され得る。タグを付けられたドメインは、金属キレートクロマトグラフィー及び／又は抗体による迅速な精製のために使用され得、その後ウェスタンブロット、免疫沈降法、又はバイオアッセイにおける活性減少／阻害の検出を可能とする。

最適化されたＨｅｒ１及び３ ＥＣＤを製造する方法
ＥＣＤ、その一部、特にリガンド結合及び／若しくは受容体二量化に十分な部分、及び代わりにスプライス部位と、多量化ドメインとの間においてキメラポリペプチドを製造するための、任意の好適な方法が使用され得る。これらの方法は、当業者に既知である。同様に、キメラポリペプチド由来の多量体の形成は、当業者に周知の任意の方法によって達成され得る。留意すべきこととして、多量体は通常、少なくとも一つのＨＥＲファミリーメンバー、通常ＨＥＲ１又はＨＥＲ３由来のＥＣＤを含む。

ＥＣＤポリペプチドはまた、自動化合成ポリペプチド合成を使用して合成され得る。クローニングされた、及び／又はイン・シリコで作製されたポリペプチド配列は、断片状態で合成され得、その後化学的に連結される。代わりに、キメラ分子が単一のポリペプチドとして合成され得る。ＥＣＤ融合をコードする核酸分子を含む、ＥＣＤをコードする核酸分子は、核酸分子をクローニング及び単離するために、当技術分野において既知である任意の利用可能な方法を使用することで、クローニングされ得るか、又は単離され得る。かかる方法は、核酸のＰＣＲ増幅、並びに、核酸ハイブリダイゼーションスクニーニング、抗体系スクリーニング、及び活性系スクリーニングを含む、ライブラリーのスクリーニングを含む。

実施例の部においてさらに説明されるように、Ｈｅｒファミリーのメンバー、例えばＨｅｒ３は、そのリガンドへの結合能力を最適化するために遺伝子操作され得る。これは、当業者に既知である種々の方法を使用することによって達成され得る。コンピュータ支援プログラムは、変異のために有望な領域を予測するために使用され得る。この後、標準的な分子生物学的技術を使用してアミノ酸変異誘発を行い得、その後リガンド結合スクリーニングを行い、最適化された結合剤を同定し得る。

キメラポリペプチドをコードするＤＮＡ、例えば本明細書において提供される任意のものは、発現のために宿主細胞へとトランスフェクトされる。ＥＣＤ多量体ポリペプチドが所望である幾つかの例において、多量化は、多量化ドメインによって媒介され、その後宿主細胞が、多量体を製造することとなる分離したキメラＥＣＤ分子をコードするＤＮＡを用いて形質転換され、ここで当該宿主細胞が、多量体の分離した鎖を、所望の様式で集合し得るように最適に選択されている。分離した単量体ポリペプチドの集合は、キメラＥＣＤポリペプチド間で、同一か又は相補的である各々の多量化ドメインの相互作用によって促進される。ＨＥＲファミリー受容体ＥＣＤ又はその一部が、多量体ポリペプチドのＥＣＤドメインの一つ又は両方である場合、多量化ドメインは、対となる多量体分子から離れて、ＨＥＲ分子の二量化アームを向かわせるように選択される。この方向付けは、「バック・トゥ・バック」と呼ばれ、そして二量化アームが、細胞表面上の同族ＨＥＲとの二量化のために接近可能であることを保証する。

キメラＥＣＤポリペプチドを含むＥＣＤポリペプチドは、投与及び処置のために必要とされるポリペプチドの必要量及び形態を産生するために好適である任意の生物中において発現され得る。一般的に、異種ＤＮＡを発現するために遺伝子操作され得、そして分泌経路を有する任意の細胞種が好適である。発現宿主は、原核生物及び、真核生物、例えばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、植物、昆虫細胞、ヒト細胞株及びトランスジェニック動物を含む哺乳動物細胞を含む。発現宿主は、それらのタンパク質産生レベル、及び発現タンパク質に存在する翻訳後修飾のタイプが異なり得る。発現宿主の選択は、これら及び他の要因、例えば制御及び安全性に対する考慮、産生コスト、並びに精製の必要性及び方法に基づいてなされ得る。

限定されないが、最適化、多量化、修飾及び連結を含むこれらのＥＣＤポリペプチド多量体の産生はまた、国際公開第２００７／１４６９５９号に開示されている方法に従って行われ得、そしてそれは全体として参照により具体的に援用される。

精製
ＥＣＤポリペプチド多量体を含む、ＥＣＤポリペプチド及びキメラＥＣＤポリペプチドは、当技術分野において周知の種々の技術を使用して単離され得る。本明細書において提供される単離ポリペプチド又はタンパク質の一つを得るために、当業者は、ポリペプチド及びタンパク質を単離するための既知の方法に容易に従うことができる。これらは、限定されないが、免疫クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、及びイオン交換クロマトグラフィーを含む。イオン交換クロマトグラフィーの例は、陰イオン及び陽イオン交換を含み、そしてＤＥＡＥセファロース、ＤＥＡＥセファデックス、ＣＭセファロース、ＳＰセファロース、又は当業者に既知である任意の他の同様なカラムの使用を含む。幾つかの好ましい実施形態において、タンパク質精製は、プロテインＡ、Ｎｉ−セファロース、ニッケルＨｉｓ Ｔｒａｐ又は抗ＥＧＦＲアフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）・セファロースを使用することによって達成される。

細胞培養培地からの、又は溶解細胞からのＥＣＤポリペプチド又はＥＣＤ多量体の単離は、キメラＥＣＤポリペプチドにおけるエピトープタグ、又はＥＣＤポリペプチドのいずれかに対する抗体を使用することによって促進され得、その後免疫沈降法、及びＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を使用した分離を通じて単離され得る。代わりに、ポリペプチド特異的抗体をＥＣＤポリペプチドへ結合させ、及び／又はその後、当該抗体をプロテイン−Ａ又はプロテイン−Ｇへ結合させ、そしてカラムからタンパク質を溶出させることにより、ＥＣＤ多量体を含む、ＥＣＤポリペプチド及びキメラＥＣＤポリペプチドが単離され得る。ＥＣＤポリペプチドの精製はまた、親和性カラム、又はタンパク質と結合する物質を用いて固定化されたビーズを含み得、その後、当該結合剤からのタンパク質の溶出のためのカラムステップが続く。親和性剤の例は、コンカナバリンＡ−アガロース、ヘパリン−トヨパール（ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）、又はＣｉｂａｃｒｏｍ ｂｌｕｅ ３Ｇａセファロースを含む。タンパク質はまた、例えば、フェニルエーテル、ブチルエーテル、又はプロピルエーテルを使用する疎水性相互作用クロマトグラフィーによって精製され得る。一つ超のカラムが、より高い純度を達成するために使用され得る。

ＥＣＤ多量体活性を評価又は観察するためのアッセイ
一般的に、ＥＣＤ多量体は、一つ以上、通常は二つ以上の同族の細胞表面受容体（ＣＳＲ）又は他の相互作用ＣＳＲにおける一つ以上の生物学的活性を調節する。ＥＣＤ多量体の生物学的活性を評価するために、インビトロ及びインビボにおけるアッセイが使用され得る。ＨＥＲのＥＣＤ多量体の生物学的活性を評価するために、例示的なインビトロ及びインビボにおけるアッセイが、本明細書において提供される。ＲＴＫ活性におけるＥＣＤ多量体の効果を試験するためのアッセイは、限定されないが、キナーゼアッセイ、ホモ二量化及びヘテロ二量化アッセイ、タンパク質間相互作用アッセイ、構造アッセイ、細胞シグナルアッセイ、及びインビボ・フェノタイピングアッセイを含む。アッセイはまた、生物学的活性が観測され及び／又は測定され得る疾患モデルを含む、動物モデルの使用を含む。かかるアッセイにおけるＥＣＤ多量体の用量反応曲線が、生物学的活性の調節を評価するために、及び投与のためのＥＣＤ多量体の治療的に有効な量を決定するために使用され得る。例示的アッセイは、以下に記載される。

１．キナーゼ／リン酸化アッセイ
キナーゼの活性は、直接的に及び間接的に、検出及び／又は測定され得る。例えば、ホスホチロシンは、ＲＴＫのリン酸化を検出するために使用され得る。例えば、ＲＴＫのチロシンキナーゼ活性の活性化は、ＲＴＫのリガンドの存在中で測定され得る。トランスリン酸化は、抗ホスホチロシン抗体によって検出され得る。トランスリン酸化は、ＥＣＤ多量体の存在下及び不在下において測定及び／又は検出され得、したがって、ＲＴＫのトランスリン酸化を調節するためのＥＣＤ多量体の能力を測定することができる。簡潔に言えば、ＲＴＫを発現する細胞は、ＥＣＤ多量体へと曝露され、そしてリガンドで処理され得る。細胞は溶解され、そしてタンパク質抽出物（全細胞抽出物又は分画抽出物）は、ポリアクリルアミドゲル上にロードされ、電気泳動によって分離され、そして例えばウェスタンブロッティングのために使用される膜へと移される。抗ＲＴＫ抗体を用いた免疫沈降がまた、ゲル電気泳動及びウェスタンブロッティングを行う前に、ＲＴＫタンパク質を分画及び単離するために使用され得る。膜は、リン酸化を検出するために抗ホスホチロシン抗体を用いて検査され得、並びに全ＲＴＫタンパク質を検出するために抗ＲＴＫ抗体を用いて検査され得る。対照細胞、例えばＲＴＫアイソフォームを発現しない細胞、及びリガンドへ曝露されない細胞は、比較のために同一の手順に従い得る。

チロシンリン酸化はまた、例えば質量分析によって直接的に測定され得る。例えば、種々の濃度のＥＣＤ多量体を用いて無傷細胞を処理することによって、及びＲＴＫの活性化に対する効果を測定することによって、ＲＴＫのリン酸化状態に対するＥＣＤ多量体の効果が測定され得る。ＲＴＫは、免疫沈降によって単離され得、そして質量分析用のペプチド断片を産生するためにトリプシン処理され得る。ペプチド質量分析は、タンパク質のチロシンリン酸化の程度を定量的に決定するための十分に確立された方法である：チロシンのリン酸化は、ホスホチロシンを含有するペプチドイオンの質量を増大させ、そしてこのペプチドが質量分析によって非リン酸化ペプチドから容易に分離される。

２．複合体形成／二量化
複合体形成、例えばＲＴＫ及びＥＣＤ多量体の二量化は、検出され得、及び／又は測定され得る。例えば、単離されたポリペプチドは、共に混合され得、ゲル電気泳動及びウェスタンブロッティングがなされる。ＲＴＫ及び／又はＥＣＤ多量体はまた、細胞及び細胞抽出物、例えば全細胞抽出物又は分画抽出物へと添加され得、そしてゲル電気泳動及びウェスタンブロッティングがなされ得る。ポリペプチドを認識する抗体は、単量体、二量体及び他の複合体形態の存在を検出するために使用され得る。代わりに、ラベル化されたＲＴＫ及び／又はラベル化されたＥＣＤ多量体は、アッセイ中において検出され得る。かかるアッセイは、ＥＣＤ多量体の存在下及び不在下において、ＲＴＫのホモ二量化、又は２つ以上のＲＴＫのヘテロ二量化を比較するために使用され得る。アッセイはまた、ＲＴＫと二量化するＥＣＤ多量体の能力を評価するために行われ得る。例えば、ＨＥＲ３ ＥＣＤ多量体は、ＨＥＲ１のヘテロ二量化する能力を評価され得る。

３．リガンド結合
一般的に、ＲＴＫは一つ以上のリガンドと結合する。上で議論された通り、図１はＨＥＲファミリーのメンバーと結合する幾つかのリガンドを示す。リガンド結合は、受容体の活性を調節し、したがって例えばシグナル伝達系内へのシグナリングを調節する。ＥＣＤ多量体へのリガンド結合、及びＥＣＤ多量体の存在下におけるＲＴＫのリガンド結合が測定され得る。例えば、標識化リガンド、例えば放射性標識リガンドが、ＥＣＤ多量体の存在下又は不在下（対照）、精製された又は部分的に精製されたＲＴＫへ添加され得る。免疫沈降及び放射化性の測定が、ＥＣＤ多量体の存在下及び不在下における、ＲＴＫと結合するリガンドの量を定量化するために使用され得る。ＥＣＤ多量体はまた、例えば標識化リガンドと共にＥＣＤ多量体をインキュベートすることによって、及びＥＣＤ多量体によって結合される標識化リガンド量を決定することによって、例えば野生型又は対応するＲＴＫの優性形態によって結合される量と比較して、リガンド結合を評価され得る。実施例はまた、リガンド結合を検出する他の方法を列挙している。

４．細胞増殖アッセイ
ＨＥＲ受容体は、細胞増殖に関与する。細胞増殖におけるＥＣＤ多量体の効果が測定され得る。試験されるべき細胞は通常、標的ＲＴＫ受容体を発現する。例えばリガンドが、ＲＴＫを発現する細胞へと添加され得る。ＥＣＤ多量体は、リガンド添加の前、同時、又は後にかかる細胞へと添加され得、そして細胞増殖における効果が測定され得る。細胞増殖レベルが、アラマーブルー（Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ）若しくはクリスタルバイオレット（Ｃｒｙｓｔａｌ Ｖｉｏｌｅｔ）、又は他の類似の染料で細胞を標識化し、その後最適密度測定を行うことによって評価され得る。ＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド］がまた、細胞増殖を評価するために使用され得る。増殖剤としてのＭＴＴの使用は、淡黄色のＭＴＴのテトラゾリウム環を切断し、そして細胞膜を透過できないために健常細胞中に蓄積する、暗青色のホルマザン結晶を形成する、生細胞におけるミトコンドリアのデヒドロゲナーゼ酵素の能力に基づく。洗浄剤の添加による細胞の溶解は、結晶の放出及び溶解をもたらす。生存する増殖細胞の数に直接的に比例する呈色は、分光光度法的手段によって定量化され得る。したがって、リガンドの存在下又は不在下において、ＥＣＤ多量体と共に、選択された細胞のインキュベーションの後に、ＭＴＴは細胞へ添加され得、当該細胞が洗浄剤を用いて溶解され得、そして吸光度を５７０ｎｍで読み取る。代わりに、増殖実験の前に、３Ｈ−トリチウムのような放射活性標識を用いて、又はＣＦＳＥのような蛍光標識を用いて、細胞があらかじめ標識化され得る。

５．細胞疾患モデルアッセイ
疾患若しくは病気由来の細胞、又は疾患若しくは病気を再現するために調節され得る細胞が、最適化されたＨｅｒ３多量体の効果を測定及び／又は検出するために使用され得る。最適化されたＨｅｒ３多量体は、細胞中に添加されるか又は発現され、そしてＥＣＤ多量体に曝露されていない細胞又はＥＣＤ多量体を発現していない細胞と比較して、表現型が測定又は検出される。かかるアッセイは、細胞増殖、転移、炎症、血管新生、病原感染、及び骨吸収における効果を含む効果を測定することによって使用され得る。

６．動物モデル
動物モデルが、最適化されたＨｅｒ１及び／又はＨｅｒ３多量体の効果を評価するために使用され得る。例えば、癌細胞の増殖、転移、及び侵襲性におけるＥＣＤ多量体の効果は、癌の動物モデルで測定され得る。ひとつのかかるアッセイにおいて、インビトロで培養した後の癌細胞、例えば卵巣癌細胞がトリプシン処理され、好適なバッファー中に懸濁され、そしてマウスへと（モデルマウス、例えばＢａｌｂ／ｃヌードマウスの側腹部及び肩部へと）注射される。マウスは、癌細胞投与の前、同時、又は後のいずれかで、任意の好適な投与経路（すなわち、皮下、静脈内、腹腔内及び他の経路）で同時投与される。腫瘍の成長は、時間をかけて観測される。類似のアッセイが、他の細胞種及び動物モデル、例えば、マウス肺癌（ＬＬＣ）細胞、及びＣ５７ＢＬ／６マウス及びＳＣＩＤマウスを用いて行われ得る。腫瘍成長が、ＥＣＤ多量体を投与されていないマウスと比較され得、或いはＥＣＤ多量体の各々の同族受容体又は相互作用受容体を欠損しているマウスと比較され得る。

使用方法
本明細書において開示された組成物は、種々の用途を有する。一つの態様において、ハーモジュリン（Ｈｅｒｍｏｄｕｌｉｎ）は、癌性細胞の増殖を阻害するために使用され得る。実施例及び図において示されるように、本発明のハーモジュリンは、天然のＨｅｒ１及び／又はＨｅｒ３リガンドによって誘導された癌性細胞の増殖を、当業者が予測し得ない程度まで阻害する。最適化されたＨｅｒ１及び／又はＨｅｒ１を含むハーモジュリンが、それを必要とする個体、例えば癌を患う個体へ有効量投与され得る。癌は、処置される個体のためになる任意のタイプの癌であり得る。本明細書において処置されるべき癌の例は、限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病又はリンパ系腫瘍を含む。かかる癌のさらなる例は、扁平上皮細胞癌（例えば口腔扁平上皮細胞癌）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、及び肺の扁平上皮癌を含む肺癌、腹膜の癌、肝細胞癌、消化器癌を含む胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）若しくは胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、膵癌、神経膠芽腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、食道癌、グリオーマ、結腸直腸癌、子宮内膜癌若しくは子宮癌、唾液腺癌、腎癌若しくは腎臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝細胞癌、肛門癌、陰茎癌、及び頭頚部癌を含む。

それを必要とする個体の別の例は、Ｈｅｒ１及び／又はＨｅｒ３を発現する細胞の異常増殖を患う個体である。ハーモジュリンはまた、腫瘍量を減少させるために、及び／又は腫瘍の成長を阻害するために使用され得る。腫瘍は、限定されないが、癌性腫瘍、血液系腫瘍、及び固形腫瘍を含む、複数の種類の腫瘍を含み得る。本発明のハーモジュリンは、細胞増殖及び／又は遊走に関与するものを含み、病理学的炎症応答、非転移性過剰増殖性疾患に関与するもの、例えば眼症状、皮膚症状、平滑筋細胞の増殖及び／又は遊走から生じる症状、例えば、再狭窄、動脈硬化、膀胱、心臓若しくは他の筋肉の筋肉肥厚、子宮内膜症、又は関節リウマチを含む狭窄症を含む他の症状を処置し及び／又は寛解させるために使用され得る。

本明細書において提供されるハーモジュリンを用いて処置され得る他の疾患は、ＨＥＲファミリー受容体、又はそのリガンドによって媒介される任意の疾患又は障害、限定されないが、攻撃性（ａｇｒｅｓｓｉｖｅｎｅｓｓ）、発育遅延、統合失調症、ショック、パーキンソン病、アルツハイマー病、鬱血性心筋症、子癇前症、神経系疾患、及び心不全を含む。ハーモジュリンの組成物が有する機能的及び生物学的効果に基づく他の用途が、利用可能であるということが、当業者に明らかであろう。本明細書において開示された組成物は、他の薬剤との併用で使用され得る。抗ホルモン組成物、心保護剤（ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）、抗癌剤、例えば化学療法剤及び増殖阻害剤、並びに本明細書において説明されている他のものを含む併用療法が、ハーモジュリンと共に使用され得る。

ハーモジュリンは、医薬として許容される組成物として製剤化され得る。当該組成物は、有効な生物学的効果のために好適な手順で投与され得る。これは、任意の好適な投与経路（すなわち、皮下、静脈内、腹腔内、経口、皮内、及び他の経路）によってであり得る。他の場合において、医薬組成物はまた、局所的、局部的、又は全身投与用に製剤化され得る。幾つかの実施形態において、医薬組成物は単回投与用に製剤化される。他の実施形態において、最適化されたハーモジュリンの組成物を含むキットは、本発明の範囲内であることが意図される。幾つかの実施形態において、当該キットは、場合により使用説明書と共にパッケージ化される。当該キットは、ハーモジュリンの単一用量、又は複数用量を含み得る。ハーモジュリンは、一つ以上の、以下のものであり得る：最適化Ｈｅｒ１／Ｈｅｒ１若しくは最適化Ｈｅｒ３／Ｈｅｒ３のホモ二量体、Ｈｅｒ１／Ｈｅｒ３の最適化ヘテロ二量体、又はホモ二量体とヘテロ二量体との混合物。

追加のハーモジュリンを同定、スクリーニング及び製造するための方法
本明細書において提供されるＥＣＤ多量体に加えて、他の候補ハーモジュリンが同定され得る。ハーモジュリンを同定するための方法、及びそのためのスクリーニングアッセイが本明細書において提供される。リガンド結合、及び／又は受容体二量化、及び／又は連結を阻害するために、分子、例えば小分子およびポリペプチドであって、これらの活性に関与する一つ超のファミリーメンバー上の領域と相互作用するものを同定することによって、ＥＣＤサブドメインを標的とする分子を同定するように当該方法は設計される。

かかる治療法は、ＨＥＲ受容体の多重的共発現を有さないＨＥＲファミリーの幾つかのメンバーを同時に標的化し得る。

薬理学的に活性な全（ｐａｎ−）ＨＥＲ治療分子を同定するために使用され得る一つの方法は、リガンド（単数又は複数）とのより高い親和性結合をもたらす，可能な変異を通じて選別するための、コンピュータ支援による最適化技術を使用することである。実施例は、どのようにしてかかるコンピュータ支援最適化技術が使用され得るかについての指針を提供し、そしてコンピュータ支援最適化の使用を用いて作製された最適化Ｈｅｒ３の実施例を提供する。例えば、リガンドへの強化された結合を有するＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、又はＨＥＲ４は、この方法で作製され得、そしてヘテロ二量体、ホモ二量体、及び両方の混合物を製造するための成分として使用され得る。

上で記載された方法で同定されたハーモジュリンが、一つ以上のＨＥＲ活性を機能的に調節する能力に関して試験され得る。かかる活性は当業者に既知であり、そして本明細書において記載されている。かかるアッセイの例は、リガンド結合、細胞増殖、細胞リン酸化、及び複合化／二量化を含む。したがって、ＨＥＲ分子又はその一部への高い親和性結合に基づく候補として本明細書において同定される任意の候補は、当該候補治療剤が全ＨＥＲ治療特性、すなわちＨＥＲ活性化に対する阻害特性を有するか否かを決定するためのさらなるスクリーニングアッセイにおいて試験され得る。

以下の実施例は、説明目的のためにのみ含まれ、そして発明の範囲を限定することを意図するものではない。

実施例１ 改善された結合能を有する、遺伝子操作されたＨｅｒ３
Ｈｅｒファミリー及びそのリガンドを図１に示す。ＨＥＲ１リガンド結合ドメインのコンピュータモデリングを、ＥＧＦＲ−ＥＧＦ（ＰＤＢ ｃｏｄｅ ＩＭＯＸ−ｃｈａｉｎ Ｃ； Ｏｇｉｓｏ Ｈ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ（２００２）７７５−７８７）及びＥＧＦＲ−ＴＧＦａ（ＰＤＢ ｃｏｄｅ １ＩＶＯ−ｃｈａｉｎ Ｃ，Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｔ．Ｐ．Ｊ（２００２））の共結晶構造を使用することで行った。コンピュータを用いた再設計、単一アミノ酸変異誘発、ハイスループット・リガンド結合スクリーニングを、及びその後の最適化バインダーの選択を使用することによって、リガンドトラップのＨｅｒ３部分を結合のために改良した。さらなる実験に関して、発現をスケールアップし、その後幾つかの精製ステップにかけた。

コンピュータによる設計
ＨＥＲ３リガンド結合ドメインのコンピュータ・モデリングを、ＨＥＲ３ ＥＣＤの構造情報（ＰＤＢ ｃｏｄｅ ＩＭ６Ｂ，Ｃｈｏ ２００２，Ｓｃｈｗｅｄｅ Ｔ，Ｋｏｐｐ Ｊ，Ｇｕｅｘ Ｎ，ａｎｄ Ｐｅｉｔｓｃｈ ＭＣ（２００３））を使用して行った。リガンド−受容体相互作用の設計された最適化は、アミノ酸の物理化学的特性及び分類、例えば荷電性、局性、芳香族性などに基づいて行われた。残基の量、表面積、溶媒接近可能性などもまた、考慮された。アミノ酸置換の予測を支援するために、ＰＡＭ２５０マトリックスを使用した（Ｗ．Ａ Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ＦＡＳＴＰ ａｎｄ ＦＡＳＴＡ，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｒ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（ＩＳＢＮ ０−１２−１８２０８４−Ｘ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）１８３（１９９０）６３−９８；及び、Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄ．，１９７８，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．５）。

実施例２ ハイスループット変異誘発
プルーフ・リーディングＤＮＡポリメラーゼｐｆｕ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を追加した、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであるエロンゲース（ｅｌｏｎｇａｓｅ）によって各々触媒される３連続ＰＣＲ反応を含む、オーバーラッピングＰＣＲによって、部位特異的変異誘発を行った。ＨＥＲ１：Ｆｃ及びＨＥＲ３：Ｆｃ ｃＤＮＡを、ＰＣＲ鋳型として使用した。２つの対のプライマーを用いた第一ラウンドのＰＣＲのために設定された条件は、２６サイクルに関して、９４℃で２分、９４℃で４５秒、６０℃で４５秒、６８℃で３分であった。第一ラウンドＰＣＲによって生じる、２つのオーバーラッピングＰＣＲ断片をゲルで精製し、モル比１：１で混合し、そして第二ラウンドＰＣＲのために使用した。８サイクルに関して、９４℃で２分、９４℃で４５秒、５７℃で４５秒、６８℃で３０分の条件を使用して、第二ラウンドＰＣＲは、２つのオーバーラッピングＰＣＲ断片をアニールした。第３ラウンドＰＣＲにおいて、第２ラウンドＰＣＲの産物を鋳型として使用した。開始コドンを含む順方向プライマー、及び停止コドンを含む逆方向プライマーの存在下で、ＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ条件は、２６サイクルに関して、９４℃で２分、９４℃で４５秒、６０℃で４５秒、６８℃で３分であった。変異を有するＰＣＲ産物を、Ｇａｔｅｗａｙ Ｓｙｓｔｅｍプラスミド ｐＤＯＮＲ２２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングした。設計された変異を、完全シーケンシングによって確認した。ｐＤＯＮＲ２２１における挿入をその後、製造業者の指示書に従って、ＬＲ反応によって発現ベクター ｐｃＤＮＡ３．２−ＤＥＳＴ（Ｇａｔｅｗａｙ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へと移した。

実施例３ タンパク質発現及び精製
リガンド結合スクリーニングに関して、配列を確認したＨＥＲ１：Ｆｃ及びＨＥＲ３：Ｆｃ変異体を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）へと一時的に移した。Ｆｃ媒介性ＨＥＲ１／３ヘテロ二量体の発現に関して、ＨＥＲ１：Ｆｃ、及びＨＥＲ３：Ｆｃ、又はそれらの変異体をＨＥＫ２９３Ｔ細胞へとコトランスフェクトした。無血清条件培地をトランスフェクション後７２時間で回収した。ＨＥＲ１：Ｆｃ、及びＨＥＲ３：Ｆｃホモ二量体のレベルを、ヒトＨＥＲ１又はＨＥＲ３ ＥＬＩＳＡ検出キット（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）を使用して、製造業者の指示書に従って定量した。Ｆｃ媒介性ヘテロ二量体を定量化するために、抗体ＨＥＲ３のコーティングされたＥＬＩＳＡプレートを捕獲用に使用し、そしてＨＥＲ１抗体を検出用に使用した。

ＨＥＲ１／３ヘテロ二量体のスケールアップ発現のために、Ｐｒｏ−ＣＨＯ５（Ｌｏｎｚａ，Ａｌｌｅｎｄａｌｅ，ＮＪ）中で維持された対数期ＣＨＯ−Ｓ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、８ｍＭのＬ−グルタミン及び１ｘＨＴ（Ｇｉｂｃｏ）を添加した、Ｐｒｏ−ＣＨＯ（Ｌｏｎｚａ）中、１×１０⁶／ｍＬで、Ｗａｖｅ Ｂｉｏ−Ｒｅａｃｔｏｒ （ＧＥ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）へと移した。次の日、対応するＨＥＲ１：Ｆｃ及びＨＥＲ３：Ｆｃ ｃＤＮＡコンストラクトを用いて、細胞をコトランスフェクトした。トランスフェクションは、２５ｋｄａｌの直線状ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を１２ｍｇ／Ｌで使用することによって達成された。ＰｒｏＣＨＯ５の量は、トランスフェクション後４時間で２倍となった。トランスフェクトされた細胞を、条件培地が採取される以前７日間、Ｗａｖｅ Ｂｉｏ−Ｒｅｃｔｏｒ中で維持した。

Ｆｃ媒介性ＨＥＲ１／３ヘテロ二量体を、以下の手順を使用して精製した；コトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｓ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からの条件培地を浄化し、１０倍に濃縮し、そしてＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅアフィニティ・カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）へとアプライした。カラムを、０．１％（ｖ／ｖ）ＴＸ−１１４を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて高範囲に洗浄し、そしてＩｇＧ溶出バッファー（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＩＬ）を用いて溶出された。溶出画分を、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬを用いて中和し、ｐＨ８．０とした。タンパク質含有画分の貯留物をＮｉ−セファロースカラム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）へとロードした。２５ｍＭのイミダゾールを含有するＮｉ−セファロースバッファーを用いてカラムを洗浄した。結合したタンパク質を、同一バッファー中２５〜１３５ｎＭのイミダゾールのグラジエントで溶出した。ヘテロ二量体のメインピークを、通常８０〜１２５ｎＭのイミダゾールで溶出した。Ｎｉ−セファロースカラムからのヘテロ二量体含有画分の貯留物を、ＰＢＳ中４℃にて完全に透析した。ヘテロ二量体調製物の純度を、分析用逆相ＨＰＬＣによって決定した。

実施例４ 改善されたリガンド結合に関するスクリーニング
Ｄｅｌｆｉａ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）による、ユーロピウム標識したＥＧＦ（Ｅｕ−ＥＧＦ）及びＮＲＧ１β（Ｅｕ−ＮＲＧ １β）の結合のためのスクリーニングを、９６ウェル黄色プレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）中で行った。１００μｌの抗ヒトＦｃ抗体（５ｕｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でウェルを室温（ＲＴ）にて一晩コーティングした。コーティングしたプレートを、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（洗浄バッファー，ＷＢ）を用いて３回洗浄し、そしてＰＢＳ／１％ＢＳＡを用いてＲＴにて２時間ブロッキングした。プレートを、再度ＷＢを用いて３回洗浄した。トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの条件培地中におけるＦｃ−融合タンパク質を、Ｄｅｌｆｉａ結合バッファーを用いて２０ｎｇ／ウェルの濃度で希釈し、そして各々のウェルへ添加した（１００μｌ／ウェル）。プレートをＲＴで２時間インキュベートし、その後ＤＥＬＦＩＡ洗浄バッファーで３回洗浄した。当該プレートをその後１００μｌのＥｕ−ＥＧＦ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）又はＥｕ−ＮＲＧ１β（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒによりカスタムラベル（ｃｕｓｔｏｍ−ｌａｂｅｌｅｄ）されたもの）を用いて、０．５ｎＭの濃度でインキュベートした。当該プレートをＲＴで２時間インキュベーションした後、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する氷冷したＤｅｌｆｉａ洗浄バッファーを用いて速やかに３回洗浄した。結合したＥｕ−リガンドを定量化するために、１３０μｌ／ウェルのＤｅｌｆｉａ増強（ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）溶液を添加し、そして蛍光プレートリーダー（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ，ｍｏｄｅｌ ２１００，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で読み取った。

ＴＧＦａ及びＨＢ−ＥＧＦ結合に関するスクリーニングを、ＴＧＦａ及びＨＢ−ＥＧＦ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用して行った。１μｇ／ｍＬの、１００μｌの抗ヒトＦｃ抗体で、９６ウェルプレートをＲＴにて一晩コーティングした。プレートを洗浄し、そして上記の通りブロッキングした。条件培地中のＦｃ融合タンパク質を、ＰＢＳ／１％ＢＳＡで２０ｎｇ／ウェルへと希釈し、そしてウェルへ１００μｌ／ウェルにて添加した。プレートを、ＲＴにて２時間インキュベートし、その後ＷＢで３回洗浄した。ＴＧＦα及びＨＢ−ＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、ＰＢＳ／１％ＢＳＡを用いて５ｎＭへと希釈し、そして当該プレートへと添加した。当該プレートを、ＲＴにて２時間インキュベートし、その後、氷冷ＷＢを用いて速やかに３回洗浄した。結合されたリガンドを、ＴＧＦα又はＨＢ−ＥＧＦに対するビオチン化検出抗体を使用して検出した。その後のＥＬＩＳＡ着色ステップを、製造業者の指示書に従って行った。

条件培地を使用した、固定化ＨＥＲ１／３ヘテロ二量体へのＨＥＲ１リガンド結合（Ｅｕ−ＥＧＦ、ＴＧＦα、及びＨＢ−ＥＧＦ）のためのスクリーニングの手順は、当該プレートを２μｇ／ｍＬの抗ヒトＨＥＲ３抗体（ＤＹＣ１７６９）を用いてプレコーティングをすること、及び条件培地からの、１００ｎｇ／ウェルのＦｃ融合タンパク質を、リガンド結合のために使用することを除いて、上記のＥｕ−ＥＧＦ、ＴＧＦα、及びＨＢ−ＥＧＦのためのスクリーニングと同一であった。

２４６番のチロシンからアラニンへと置換された変異体（Ｙ２４６Ａ）は、高い親和性を有するとモデリング試験によって予測され、そしてスクリーニングされ、そしてＮＲＧ１βと結合することが判明した。先の試験はＨｅｒ１ ＥＣＤを最適化し、ＨＦＤ１２０と呼ばれる、Ｔ３９Ｓと呼ばれる（又は２４残基のシグナル配列を除いてＴ１５Ｓである）変異体を生じた。種々の変異体の命名を構築し、そして図２及び以下に示す。

この命名を、本明細書を通じて使用する。最適化されたＨｅｒ１及び／又はＨｅｒ３を有するこれらの種々のハーモジュリンは、図３に示されるＦｃ一定のリンカー及びＦｃへと連結された。

例５ リガンド結合アッセイ
種々のＨＦＤコンストラクトを、限定されないが、Ｉ¹²⁵標識リガンド、ＤＥＬＦＩＡ（ユーロピウム標識リガンド）、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）及び等温カロリメトリーを含む標準的リガンド結合を使用してスクリーニングした。飽和結合に関する例示的手順は、以下の通りである：

Ｅｕリガンド飽和結合及び置換
Ｅｕ−ＥＧＦ及びＥｕ−ＮＲＧ１β飽和結合及びＥｕ−ＥＧＦ置換は、精製ヘテロ二量体を使用し、そしてリガンド結合のために使用されるヘテロ二量体濃度が、アッセイされるリガンドのＫＤよりも少なくとも１０倍低いことを除いて、上記のＥＵ−ＥＧＦ結合スクリーニングと同一であった（ＣＥＬＬ ＳＵＲＦＡＣＥ ＲＥＣＥＰＴＯＲＳ：Ａ ＳＨＯＲＴ ＣＯＵＲＳＥ ＯＮ ＴＨＥＯＲＹ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ，Ｌｅｅ Ｅ． Ｌｉｍｂｉｒｄ，２００４）。Ｅｕ−ＥＧＦとの飽和結合のために、３０ｎｇ／ウェルのＲＢ２００又は２ｎｇ／ウェルのＲＢ２４２を、抗ヒトＦｃコーティングプレート上に固定化した。Ｅｕ−ＮＲＧ１βとの飽和結合のために、２ｎｇ／ウェルのＲＢ２００又はＲＢ２４２を固定化した。所定の非標識競合剤の増大する濃度の存在下、ウェルへと添加されるＥｕ−ＥＧＦを用いて（ＲＢ２００に関しては５０ｎＭの、ＲＢ２４２に関しては５ｎＭの濃度で）置換アッセイを行なった。

１２５−リガンド飽和結合
¹²⁵Ｉ−ＥＧＦを、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入した。ＴＧＦα及びＨＢ−ＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）は、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって特注にて標識化された。９６ウェルアッセイプレートを、５μｇ／ｍＬの抗ヒトＦｃ抗体を用いてコーティングした。コーティングしたプレートを、上記の通り洗浄かつブロッキングした。２０ｎｇ／ウェルへと希釈された条件培地又は精製タンパク質を、抗ヒトＦｃコーティングウェルへと固定化した。¹²⁵Ｉリガンドの増大する濃度を、飽和結合に達するために使用した。結合後、結合された¹²⁵Ｉ−リガンドを用いて洗浄されたウェルを、１００μｌ／ウェルのシンチレーションカクテルＯｐｔｉＰｈａｓｅ「ＳｕｐｅｒＭｉｘ」（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて覆い、そしてＭｉｃｒｏｂｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で読み取った。

Ｈｅｒ３最適化を、ＮＲＧ１β１（本明細書においてＮＲＧβ１とも呼ばれる）への結合によって決定した。図４は、最適化Ｈｅｒ１及びＨｅｒ３分子に関するオン−オフ速度の測定データを示す。図５は、ＨＦＤ３００及びＨＦＤ３００．１に対する結合親和性を示す。

ＲＢ２４２．１Ｂを結合親和性に関して試験し、当該結果（図６）は、リガンド結合におけるＨＥＲ１とＨＥＲ３との間の拮抗作用を克服することを示した。ＨＥＲ１リガンドに関するその親和性に関して、ＲＢ２２２．１よりも３０倍超高い改善がなされた。

図１３は、ＲＢ２００のリガンド結合親和性が、ハイスループット合理的変異誘発工程を通じて最適化されたことを示す。ＨＥＲ１及びＨＥＲ３リガンドの両方に関して１ｎＭ未満の親和性を有する、最適化ハーモジュリン変異体ＲＢ２４２が同定された。他のＨＥＲリガンド、例えばＴＧＦ−α及ＩＩＢＥＧＦへのＲＢ２４２の結合を、Ｅｕ−ＥＧＦに対する競合的結合によって評価した。異なるリガンドへの結合におけるＲＢ２４２ｖｓ．ＲＢ２００の比較は、多重決定に基づくＫｄ及びＢｍａｘにおける倍数改善として表現される。

図１７（上のパネル）はまた、ＲＢ２４２が、改善されたリガンド結合親和性を有することを示す。

例６ ハーモジュリンホモ二量体を用いたＲＴＫリン酸化の阻害
最適化Ｈｅｒ３コンストラクトを、それらがＨｅｒ３のＮＲＧ刺激リン酸化を阻害出来るか否かを調べるために試験した。図７は、ＨＥＲ３リン酸化のハーモジュリンホモ二量体阻害に関して試験する実験からの結果を示す。示される通り、ＨＦＤ３２０．１は、ＨＦＤ３００よりも４２倍の予期しない改善を示した。

実施例７ ハーモジュリンヘテロ二量体によるリン酸化の阻害
ハーモジュリン・ヘテロモジュリン（ｈｅｔｅｒｏｍｏｄｕｌｉｎ）の種々のコンストラクトを、リン酸化におけるそれらの効果を決定するために試験した。ホスホチロシンＥＬＩＳＡを行った。簡潔に言えば、血清飢餓細胞を、０．１％ＢＳＡ及び所定の阻害剤を含む、５０μｌ／ウェルＤＭＥＭを用いて３７℃で３０分間前処理した。この後、３ｎＭ ＥＧＦ又は１ｎＭ ＮＲＧ１β１のいずれかを用いて、１０分間３７℃にて細胞刺激した。その後、細胞を有するプレートを氷上に置き、氷冷したＰＢＳを用いて１回洗浄し、そしてホスファターゼ阻害剤カクテルを含む溶解バッファーを用いて溶解した。プレートシェーカー上にて、２０μｌのプロテインＡ−セファロースビーズスラリーを用いて、４℃で一晩のインキュベーションにより細胞溶解物を洗浄した。ビーズをその後除去し、そして上清をホスホチロシンＥＬＩＳＡのために使用した。ＥＬＩＳＡのためのＨＥＲ１及びＨＥＲ３捕獲抗体プレートを、以下の通りに調製した：９６ウェルアッセイプレートを、０．４μｇ／ｍＬの抗ヒトＥＧＦＲ抗体（＃ＡＦ２３１）又は４μｇ／ｍＬの抗ヒトＥｒｂＢ３ ＤｕｏＳｅｔ ＩＣ（＃ＤＹＣ１７６９）を用いてコーティングした。コーティングされたプレートを、２％ウシ血清アルブミン及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０のＰＢＳ液を用いて、ＲＴにて２時間ブロッキングした。上で処理された細胞溶解物（７５μｌ）を、コーティングされた個々のウェルへと移し、撹拌しながら４℃にて一晩インキュベートし、その後ＷＢを用いて４回洗浄した。ＨＥＲタンパク質におけるチロシンリン酸化を、製造業者の指示書に従って希釈された、１００μｌ／ウェルの抗ホスホチロシン−ＨＲＰ複合体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の、２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ液を用いて検出し、そしてＲＴにて２時間インキュベートした。当該プレートを、ＷＢを用いて４回洗浄し、その後１００μｌ／ウェルのＴＭＢ基質を用いて着色させ、その後１００μｌ／ウェルのＴＭＢに対する停止試薬を使用した（いずれもＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）。着色時間を、着色されたプレートの最適密度が０．５〜１．０の範囲となるように変化させた。当該プレートを、ＶＥＲＳＡｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）によって６５０ｎＭにて読み取った。

図８は、ハーモジュリンヘテロ二量体による受容体リン酸化の相対的阻害を試験する、これらの実験の結果を示す。図８において示されるように、ＥＧＦについてのヘテロ二量体間において違いはない。ＴＧＦ−ａに関しては、ＲＢ２２０は最も有効であったが、ＨＢ−ＥＧＦに関して、ヘテロ二量体間において最小の違いを有する。ＮＲＧに関して、ＲＢ２０２．１が最も強力であるが、一方でＲＢ２００．１及びＲＢ２２２．１は、ＲＢ２００又はＲＢ２２０よりも効果的である。

リガンド結合部位の数に関して正規化した時、その結果を図９に示し、ここでヘテロ二量体はホモ二量体と比較される。計算がリガンド結合部位の数に関して正規化される時、表はＥＣ₅₀における倍数改善を示す。予想外のことだが、これらの結果は、ＨＦＤ１００と対になったとき、ＨＦＤ３２０．１配列がＨＦ３００よりも１５倍超活性であることを示し、そしてＨＦ１２０と対となったとき、ＨＦ３００．１と同等であることを示す。ＨＦＤ１００配列は、二量化パートナーによって影響されないが、ＨＦＤ１２０配列活性は、ＨＦＤ３２０．１と対になったとき、ＨＦＤ３００と比較して減弱される。ＨＦＤ３００．１は試験されなかった。したがって、当該結果は、種々のＥＣＤ対に関して、対の組み合わせがヘテロ二量体の活性に影響を及ぼし得ることを示す。図１０は、当該対がヘテロ二量体活性に影響し得ることを示す、種々のＥＣＤ対に関する平均の倍数改善の結果を示す。

図１７（真ん中のパネル）は、ＲＢ２４２が、ＧＦ依存的ＨＥＲリン酸化の阻害において、ＲＢ２００よりも強力であることを示す。

実施例８ ＮＲＧ誘導性細胞増殖のハーモジュリン阻害
異なる細胞株を、リガンド誘導性増殖におけるハーモジュリンの効果に関して試験するために使用した。細胞増殖試験を無血清培地中で行った。細胞を、９６ウェル組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ＃３５−３０７５，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＮＪ）に、細胞株に好適であるように、１００μｌ培養培地中、２０００〜５０００細胞／ウェルで置き、その後一晩（１５〜１８時間）増殖させた。当該細胞をその後、２４時間血清飢餓状態とし、そして所定の阻害剤の増大する濃度下において３日間、３ｎＭのＥＧＦ又はＮＲＧ１βで処理した。細胞増殖をＭＴＳアッセイにより定量化した。当該プレートをその後、４９０ｎｍの波長で吸光度を読み取り、そしてそれはウェル中の細胞量と正比例した。

図１１は、ＮＲＧ誘導性ＭＣＦ７増殖の阻害を試験する実験結果を示し、一方で、図１２は、ＮＲＧ誘導性Ｔ４７Ｄ増殖の阻害を試験する実験結果を示す。ＮＲＧ誘導性増殖に関して、ＲＢ２２２．１は最もよく作用し、それにＨＦＤ３２０．１及び１：１混合物が続いた。ＲＢ２００は、ＭＣＦ７細胞のＥＧＦ誘導性増殖を阻害するが、ＮＲＧ誘導性細胞増殖に関するその効果に関して、それは当該群の中で最も効果がなかった。

図１４は、ハーモジュリンがリガンド誘導性細胞増殖を阻害し得ることを示す。ＲＢ２００又はＲＢ２４２の増大する量の存在下、ＢｘＰＣ３膵臓癌細胞を、３ｎＭのＴＧＦ−α（Ａ）又は３ｎＭのＮＲＧ１−β１（Ｂ）で３日間処理した。細胞増殖をＭＴＳアッセイによって定量化した。当該データを、ＴＧＦα又はＮＲＧ１−β１単体で刺激した対照細胞と比較した場合の、細胞増殖のパーセント阻害として表現した。８つの複製試料の平均±ＳＥＭである。図１７（下のパネル）はまた、ＲＢ２４２．１がＧＦ誘導性細胞増殖の強力な阻害剤であることを示す。

実施例９ ハーモジュリンの薬物動態分析
げっ歯類モデルにおける、最適化Ｈｅｒ３を有するものを含む全ハーモジュリンコンストラクトの血漿濃度を、ハーモジュリン特異的ＥＬＩＳＡによって分析し、そしてそれは抗ＨＥＲ１（ＡＦ２３１，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）及び抗ＨＥＲ３（ＡＦ２３４，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）抗体を捕獲剤（ｃａｐｔｕｒｅ）として使用し、ＨＲＰ複合化抗ヒトＦｃ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を無傷体循環（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ｉｎｔａｃｔ）に達する投与量を示すためのリポーターとして使用した。バイオアベイラビリティ、クリアランス率、および血漿半減期をその後計算した。ＲＢ２００に関して、ＲＢ２００の絶対的バイオアベイラビリティは、以下の式を使用することによって、マウスに１５〜３０ｍｇ／ｋｇのＩＰ投与後における、体循環中のＲＢ２００のアベイラビリティを測定する。：

ここで、ＡＵＣは曲線化面積である。この計算から、推定Ｆ_RB200hは、９０％超であると決定された。高いバイオアベイラビリティに加え、ＲＢ２００はまた、低い分布容積、及びＦｃ融合タンパク質及び他の治療用モノクローナル抗体に関する予測と一致する延長された消失半減期を示す。他のハーモジュリンに関する計算が、バイオアベイラビリティ及び消失半減期を決定するために、同様の方法で行われる。図１５及び１６は、ラット及びヌードマウス中における種々のハーモジュリンの血漿濃度、並びに計算された薬物動態パラメータを示す。

実施例１０ Ｈｅｒ１及びＨｅｒ３の最適化
以下の表は、Ｈｅｒ１に関して、及びその同族リガンドへの結合活性が試験された，幾つかの設計された変異を示す。

Ｈｅｒ３に関して、試験された幾つかの変異は以下の通りである：

実施例１１ 最適化ＨＥＲ３：Ｆｃは、最適化ＥＧＦＲによるリガンド結合を抑制する。
ＥＧＦＲ_T15S：Ｆｃを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中においてＨＥＲ３_Y246A：Ｆｃと共に共発現し、そして生じるヘテロ二量体（ＲＢ２２２）を約９５％の均一性になるまで精製した。リガンド結合は、ＲＢ２２２が、元のヘテロ二量体ＲＢ２００と比較して、₁₂₅Ｉ−ＮＲＧ１−βに関して改善された親和性を保持することを示した（１．６ｎＭ対１２．３ｎＭのＫ_d）。しかし、ＲＢ２２２は、ＥＧＦＲリガンドに対して改善された親和性を保持しなかった。図１８に示すように、ヘテロ二量体ＲＢ２００及びＲＢ２２２の各々は、₁₂₅Ｉ−ＮＲＧ１−aに関して見かけ上、Ｋ_d＞３０ｎＭを有した（結合は、１００ｎＭの₁₂₅Ｉ−ＮＲＧ１−ａで飽和しなかった）が、ＥＧＦＲ_T15S：Ｆｃホモ二量体は、同一のリガンドに対して、約１．０ｎＭのＫ_dを示した。したがって、ＨＥＲ３ ＥＣＤは、それらがＦｃ媒介性ヘテロ二量体中に固定されるとき、ＥＧＦＲ ＥＣＤの高親和性結合を抑制する。

実施例１２ Ｇ５６４Ｓ変異は、ＲＢ２２２へのＥＧＦＲリガンドの高親和性結合を回復する。
ヘテロ二量体ＲＢ２２２への高親和性ＥＧＦＲリガンド結合を回復するために、さらなる単一の変異を、ＲＢ２２２サブドメインＩＩ／ＩＶ連結領域上に集中するＲＢ２２２のＥＧＦＲアームへと導入した。先立った精製無しに条件培地中においてＥＧＦＲ／ＨＥＲ３ヘテロ二量体へのＥＧＦＲリガンド結合に対する効率的なスクリーニング方法が利用された。条件培地中におけるＥＧＦＲ／ＨＥＲ３：Ｆｃヘテロ二量体及びＨＥＲ３：Ｆｃホモ二量体は、抗ヒトＨＥＲ３（ＥＣＤ特異的）抗体でプレコーティングされた９６ウェルプレートの表面上に固定化された。この後、ＥＧＦＲリガンドを、固定化されたＥＧＦＲ／ＨＥＲ３：Ｆｃヘテロ二量体へと結合させた。この方法の重要な利点は、ヘテロ二量体及びホモ二量体の混合物を含む条件培地が、混入しているホモ二量体の除去無しに、ヘテロ二量体特異的ＥＧＦＲリガンド結合に対して直接的にスクリーニングされ得ることである。

１０個のヘテロ二量体変異体をコーティングし、そしてこの方法を使用してスクリーニングした。回復された高親和性ＥＧＦＲリガンド結合を示す、自己抑制性連結のサブドメインＩＶに位置するＧ５６４Ｓ変異を有する変異ＲＢ２４２を回収した。ＲＢ２４２をその後、約９５％の均一性になるまで精製し、そしてそのリガンド結合親和性をアッセイした。

上で行われた全ての初期リガンド親和性スクリーニングにより、見かけのＫ_d値の獲得及び比較が可能となった。真のＫ_dを決定するために、アッセイされたリガンドに関して、アッセイされた受容体の濃度が、測定されたものよりも少なくとも１０倍低い飽和結合を較正するための出発点として、見かけのＫ_dを使用した。この数学的関係に従って結合アッセイを行った時、ＲＢ２４２は、Ｅｕ−ＥＧＦに対する親和性において、ＲＢ２００よりも１０倍の改善を示し（１．０ｎＭ対９．５ｎＭのＫ_d）、そしてＥｕ−ＮＲＧ１−βに対する親和性において３１倍の改善を示した（０．１ｎＭ対３．１ｎＭのＫ_d、図１９Ａ及びＢ）。非標識ＴＧＦ−ａ又はＨＢ−ＥＧＦによって、Ｅｕ−ＥＧＦ結合を置換するために、競合的リガンド結合を行った。これらのリガンド置換アッセイにおいて、ＲＢ２４２は、ＴＧＦ−ａに関する親和性において３４倍の改善を示し（０．５ｎＭ対１７．０ｎＭのＫｉ）、そしてＨＢ−ＥＧＦに関する親和性において１６倍の改善を示した（１．３ｎＭ対２０．１ｎＭのＫｉ、図１９Ｃ及びＤ）。

精製ＲＢ２００及びＲＢ２４２を、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３リン酸化を阻害する能力に関してアッセイした。ＲＢ２００又はＲＢ２４２による、リガンド誘導性ＥＧＦＲリン酸化の用量依存性阻害が、Ｎ８７細胞及びＭＣＦ７細胞において示された。増大したリガンド結合親和性によって示唆されたように、ＲＢ２４２は、ＥＧＦ誘導性ＥＧＦＲリン酸化の阻害において、ＲＢ２００よりも６５倍強力であり（１．８ｎＭ対１１７．３ｎＭのＥＣ₅₀）、そしてＴＧＦ−ａ−誘導性ＥＧＦＲリン酸化の阻害において１０倍より強力であった（１９．４ｎＭ対１９９．０ｎＭのＥＣ₅₀）。同様に、ＲＢ２４２は、ＭＣＦ７細胞中のＮＲＧ１−β誘導性ＨＥＲ３リン酸化阻害において、ＲＢ２００よりも１５倍強力であった（１．７ｎＭ対２５．１ｎＭのＥＣ₅₀）。

実施例１３ 培養腫瘍細胞の増殖阻害において、ＲＢ２４２は、ＲＢ２００よりも強力である。
培養単層腫瘍細胞の増殖における、ＲＢ２００及びＲＢ２４２の効果を比較した。ＢｘＰＣ３膵臓癌細胞の増殖は、無血清培地中、ＴＧＦ−ａ又はＮＲＧ１−βによって誘導された。増殖因子誘導性ＢｘＰＣ３増殖は、用量依存的にＲＢ２００又はＲＢ２４２によって阻害された（図２０Ａ、上部パネル）。３日間の増殖アッセイにおいて、推定ＥＣ₅₀は、ＴＧＦ−ａ又はＮＲＧ１−β誘導性増殖の阻害に関して、ＲＢ２４２がＲＢ２００よりも約５倍強力であることを示した。２００％の阻害が、ＲＢ２４２処理ＢｘＰＣ３細胞において見られた。これはおそらく、ＲＢ２４２によって阻害された、無血清条件下におけるＢｘＰＣ３細胞の増殖に起因する。同様に、血清飢餓ＭＣＦ７乳癌細胞が、ＮＲＧ１−βによって増殖するように誘導された；この増殖は、ＲＢ２００又はＲＢ２４２によって阻害された（図２０Ａ、左下のパネル）。５日間増殖アッセイにおいて、推定のＥＣ₅₀は、ＲＢ２００よりも７倍強力であることを示した。ヒトＨ１４３７ＮＳＣＬＣ細胞の増殖を、増殖培地（ＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＢＳ）中、ＲＢ２００又はＲＢ２４２の増大する濃度を用いて分析した。図２０Ａ（右下のパネル）に示されるように、５日間増殖アッセイにおいて、ＲＢ２４２は、ＲＢ２００よりも約５倍強力であった（１８．９ｎＭ対１００．７ｎＭのＥＣ₅₀）。

実施例１４ ＲＢ２４２は、ヒト非小細胞肺癌マウスモデルにおいて、改善された抗腫瘍活性を示す。
ＲＢ２００及びＲＢ２４２のインビボ有効性は、ヒトＨ１４３７ＮＳＣＬＣ細胞由来の腫瘍を生じるヌードマウスにおいて比較された。マウス腫瘍異種移植モデルを使用した：Ｈ１４３７非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）腫瘍異種移植試験を、雌のＣＤ−１ｎｕ／ｎｕヌードマウスにおいて行った。有効性試験を、９匹のマウス群において行った。Ｈ１４３７細胞を、ＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＢＳ中において維持した。細胞を、０．０２５％ＥＤＴＡと共に採取し、培養培地を２度洗浄し、滅菌ＰＢＳ中に再懸濁し、その後１００μｌ中６×１０⁶細胞で、マウスへと皮下注射した。キャリパーを使用して腫瘍測定を行い、そして腫瘍量を長さ、幅、及び断面積から計算した。平均腫瘍量が約１００ｍｍ³に達したときに処置を開始した。ＲＢ２００又はＲＢ２４２を、１２ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．で１５０μｌ、週に３回で３週間、マウスに投与した。ＯＬＡＷ実験動物の人道的管理と使用に関する米国公衆衛生局規範（Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｐｏｌｉｃｙ ｏｎ Ｈｕｍａｎｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）（１９９６）の規制ガイドラインに従って（当該規範は、実験動物の管理及び使用に関するガイド中に説明されている）、そしてＰａｌｏ Ａｌｔｏ Ｍｅｄｉｃａｌ ＦｏｕｎｄａｔｉｏｎのＩＡＣＵＣに従って、実験を行った。マウス腫瘍異種移植実験からの結果を、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’ｓ ｐｏｓｔ−ｔｅｓｔを用いた二元分散分析（ｔｗｏ ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を使用して分析した。

ＲＢ２００及びＲＢ２４２が、インビトロにおいて直接的な抗増殖活性を示すために、このマウス腫瘍モデルを一部で選択した（図２０Ａ右下）。Ｈ１４３７細胞を皮下注射し、そして処置開始前に約１００ｍｍ³まで増殖させた。このモデルにおいて、１２ｍｇ／ｋｇで投与されたＲＢ２００は、確立された腫瘍の増殖阻害傾向を示した（図２０Ｂ；Ｐ＞０．０５）。同一用量で投与された場合、ＲＢ２４２は、２週間の処置後において、腫瘍増殖の約５０％阻害を有する、改善された抗腫瘍活性を示し（Ｐ＜０．０１）、そしてそれは培養された腫瘍細胞における向上された阻害活性と一致する（図２０Ａ）。

Claims (31)

1. Ｈｅｒ３由来の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）であって、その同族リガンドへの結合を改善するために最適化された前記細胞外ドメインを含む多量体。
2. 前記Ｈｅｒ３ ＥＣＤが、Ｙ２４６Ａ変異を含む、請求項１に記載の多量体。
3. 前記Ｈｅｒ３ ＥＣＤが、１３２番目においてリシンを含む、請求項１又は２に記載の多量体。
4. 前記Ｈｅｒ３ ＥＣＤが、Ｋ１３２Ｅ変異体である、請求項１に記載の多量体。
5. 前記Ｈｅｒ３ ＥＣＤが切断されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の多量体。
6. Ｈｅｒ１由来のＥＣＤをさらに含む、請求項１に記載の多量体。
7. Ｈｅｒ１由来の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）であって、その同族リガンドへの結合を改善するために最適化された前記細胞外ドメインを含む多量体。
8. 前記Ｈｅｒ１ ＥＣＤがＴ１５Ｓ変異を含む、請求項７に記載の多量体。
9. Ｇ５６４Ｓ変異をさらに含む、請求項８に記載の多量体。
10. Ｙ２４６Ａ変異を含むＨｅｒ３ ＥＣＤをさらに含む、請求項９に記載の多量体。
11. 前記Ｈｅｒ１ ＥＣＤがドメイン４の欠失を含む、請求項７に記載の多量体。
12. 前記Ｈｅｒ１ ＥＣＤが、Ｓ１９３Ｎ、Ｅ３３０Ｄ、及びＧ５８８Ｓからなる群から選択される一つ以上の変異を含む、請求項７に記載の多量体。
13. Ｈｅｒ１ホモ二量体を含む組成物であって、前記Ｈｅｒ１が、その同族リガンドへの結合を改善するために最適化されている、前記組成物。
14. 前記Ｈｅｒ１が、Ｔ１５Ｓ、Ｇ５６４Ｓ、ドメイン４欠失、Ｓ１９３Ｎ、Ｅ３３０Ｄ、及びＧ５８８Ｓからなる群から選択される一つ以上の変異を含む、請求項１３に記載の組成物。
15. 前記Ｈｅｒ１が、Ｔ１５Ｓ及びＧ５６４Ｓ変異を含む、請求項１３に記載の組成物。
16. Ｈｅｒ３ホモ二量体を含む組成物であって、前記Ｈｅｒ３が、その同族リガンドへの結合を改善するために最適化されている、前記組成物。
17. 前記Ｈｅｒ３がＹ２４６Ａ変異を含む、請求項１６に記載の組成物。
18. Ｈｅｒ３変異体及びＨｅｒ１変異体のヘテロ二量体を含む組成物であって、前記の両方の変異体が、その同族リガンドへの結合を改善するために最適化されている、前記組成物。
19. 前記Ｈｅｒ１変異体が、Ｔ１５Ｓ、Ｇ５６４Ｓ、ドメイン４欠失、Ｓ１９３Ｎ、Ｅ３３０Ｄ、及びＧ５８８Ｓからなる群から選択される一つ以上の変異を含む、請求項１８に記載の組成物。
20. 前記Ｈｅｒ１変異体が、Ｔ１５Ｓ及びＧ５６４Ｓ変異を含む、請求項１８に記載の組成物。
21. 前記Ｈｅｒ３変異体が、Ｙ２４６Ａ、Ｋ１３２Ｅ、及びＫ１３２からなる群から選択される一つ以上の変異を含む、請求項１８に記載の組成物。
22. 前記Ｈｅｒ３変異体が、Ｙ２４６Ａ変異を含む、請求項２０に記載の組成物。
23. Ｈｅｒ１若しくはＨｅｒ３、又はそれらの両方と結合したＦｃ受容体をさらに含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
24. Ｈｅｒ１／Ｈｅｒ１ホモ二量体、Ｈｅｒ１／Ｈｅｒ３ヘテロ二量体、及びＨｅｒ３／Ｈｅｒ３ホモ二量体の混合物を含む組成物であって、前記Ｈｅｒ１及び／又は前記Ｈｅｒ３成分が、リガンド結合を改善するために最適化されている、前記組成物。
25. 前記Ｈｅｒ１変異体が、Ｔ１５Ｓ、Ｇ５６４Ｓ、ドメイン４欠失、Ｓ１９３Ｎ、Ｅ３３０Ｄ、及びＧ５８８Ｓからなる群から選択される一つ以上の変異を含み、前記Ｈｅｒ３変異体が、Ｙ２４６Ａ、Ｋ１３２Ｅ、及びＫ１３２からなる群から選択される一つ以上の変異を含む、請求項２４に記載の組成物。
26. 前記Ｈｅｒ１変異体がＴ１５Ｓ及びＧ５６４Ｓ変異を含み、そして前記Ｈｅｒ３変異体がＹ２４６Ａ変異を含む、請求項２４に記載の組成物。
27. 薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
28. 癌細胞と、Ｈｅｒ１変異体及びＨｅｒ３変異体を含む組成物とを接触させることを含む、前記癌細胞の増殖を阻害する方法であって、前記Ｈｅｒ１成分及び／又は前記Ｈｅｒ３成分が、リガンド結合を改善するために最適化されている、前記方法。
29. 前記Ｈｅｒ１変異体がＴ１５Ｓ及びＧ５６４Ｓ変異を含み、前記Ｈｅｒ３変異体がＹ２４６Ａ変異を含む、請求項２８に記載の方法。
30. 癌細胞と、Ｈｅｒ１変異体及びＨｅｒ３変異体を含む組成物とを接触させることを含む、腫瘍量を減少させる方法であって、前記Ｈｅｒ１成分及び／又は前記Ｈｅｒ３成分が、リガンド結合を改善するために最適化されている、前記方法。
31. 前記Ｈｅｒ１変異体がＴ１５Ｓ及びＧ５６４Ｓ変異を含み、前記Ｈｅｒ３変異体がＹ２４６Ａ変異を含む、請求項３０に記載の方法。

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