CN101827860A - 包含最佳化her1和her3多聚体的组合物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供包含具有改进的结合亲和力的经改造的Her3多聚体的组合物。该多聚体包括(但不限于)Her1/Her3异二聚体，其中该Her3配体结合域经最佳化以增加与Her3的结合。该组合物还可包括Her1同源二聚体、Her3同源二聚体、及Her1/Her3异二聚体的混合物。

Description

包含最佳化HER1和HER3多聚体的组合物及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请主张2007年10月16日提交的美国临时申请60/980,424及2008年4月8日提交的美国临时申请61/043,308的优先权，其皆以引用的方式全部并入本文中。
发明领域
本发明涉及包含经人工改造的Her1及Her3配体结合域的组合物，及制备和使用该等组合物的方法。
背景
受体酪氨酸激酶(RTK)为细胞信号转导分子家族，该分子为涉及许多信号转导路径的多肽。RTK在种种细胞过程中起作用，包括胚胎发生、细胞分裂、增殖、分化、迁移及代谢。RTK可由配体活化。该活化一般又因随后活化信号转导路径的需要而导致受体二聚或寡聚。信号转导路径的活化(诸如通过激发自分泌或旁分泌细胞信号转导路径，例如第二信使的活化)导致特异性生物作用。RTK的配体与同源受体特异性结合。若干癌症中已注意到RTK的失调(disregulation)。举例而言，乳癌可与p185-HER2扩增的表达有关。RTK还与血管生成(包括生理及肿瘤血管形成)中涉及的调节路径有关。RTK还牵涉于细胞增殖、迁移及生存的调节中。
与疾病有关的RTK中包括受体的HER(人类EGFR家族，还称为ErbB或EGFR)家族(例如参见，Hynes等人(2005)Nature Reviews Cancer5：341-354，论述其在癌症中的作用)。这些称为I类受体的受体包括HER1/EGFR、HER2、HER3及HER4。这些受体具有可选的名称。HER1有时称为EGFR及ErbB1；HER2有时称为ErbB2及NEU；HER3有时称为ErbB3；且HER4有时称为ErbB4。此家族的所有成员具有胞外配体结合区、单跨膜区及细胞质的含有酪氨酸激酶的结构域。仅HER1及HER4在配体结合及激酶活性方面完全起作用。HER3的激酶活性受削弱且活性视其异二聚体配偶体的激酶活性而定。
一种靶向涉及p185(Her2)的癌症的方法已使用靶向ErbB2蛋白质二聚体的肽(例如参见，Greene等人，美国专利6,417,168)。目前已描述包括对ErbB2、Erb3及ErbB4的配体结合域的多种类型的嵌合多聚体分子。例如参见美国专利6,696,290及WO 98/02540。然而，这些方法不对具有Her1和/或Her3表达的癌症具有特异性，其还不可用于广泛范围的与Her1和/或Her3表达失调有关的疾病。因而，对于具有Her1失调或Her3失调或该两者的组合的癌症而言，现有技术不足以克服特异性不够的问题。此外，这些I类受体的配体的结合亲和力视受体及其固有生物学性质及结构而变化。因此，与ErbB2结合的分子不一定会与Her1或Her3结合且ErbB2配体的任何最佳化工作无法可预测地应用于Her1或Her3，因为其为具有不同生物学特性及结构的不同受体。
为此目的，所需要的是可以以改进的结合亲和力与Her1及Her3结合的组合物。本文所述的发明提供此需要的解决方法且还提供额外益处。
发明简述
本发明提供包含Her 1和/或Her 3变体的组合物，该变体经最佳化以改进与其同源配体的结合。因此，在一方面中，本发明提供包含来自Her3的胞外域(extracellular domain，ECD)的多聚体，该Her3经最佳化以改进与其同源配体(与Her1ECD连接)的结合。在一实施方案中，最佳化为Y246A突变。在另一实施方案中，最佳化Her3在位置132处另外含有赖氨酸。在一实施方案中，Her3变体具有K132E突变。在另一实施方案中，Her3变体具有Y246A变体，且位置132处具有赖氨酸。在另一实施方案中，Her3变体不具有Y246A变体，而位置132处具有赖氨酸。在另一实施方案中，Her3变体经截短。在另一实施方案中，经截短Her3还在位置132处具有赖氨酸。
在另一方面中，本发明提供包含来自Her 1的胞外域(ECD)的多聚体，该Her1经最佳化以改进与其同源配体(与Her3 ECD连接)的结合。在一实施方案中，Her1 ECD具有T15S突变(或T39S，若将信号序列肽的残基包括在内)。在另一实施方案中，Her1ECD具有T15S及G564S突变。
本发明还提供Her 1及Her3变体的组合物，该等变体以同源二聚体形式彼此缔合。在一实施方案中，Her1同源二聚体由T15S及G564S突变形成。在另一实施方案中，Her3同源二聚体由Y246A突变形成。在另一方面中，本发明提供Her3变体的组合物，该等Her3变体与Her1ECD以异二聚体形式缔合。在一些实施方案中，Her1 ECD还经最佳化以改进与其同源配体的结合(例如，T15S或T15S/G564S突变)。最佳化选自：结构域4缺失、T39S(或T15S，不具有信号序列)、S193N/E330D/G588S、及T39S/G564S。
本发明另外提供包含Her1/Her1同源二聚体、Her1/Her3异二聚体、与Her3/Her3同源二聚体的混合物的组合物，其中Her 1和/或Her3组分经最佳化以改进配体结合。在一些方面中，同源二聚体或异二聚体的任何多聚体通过使用接头(诸如，通用接头)与Fc受体连接。
本发明还提供药物组合物和/或药物，其包含最佳化Her1和/或最佳化Her3变体。本发明还提供最佳化Her1和/或最佳化Her3变体的用途，其用于制造用以抑制癌细胞生长的药物。在另一实施方案中，最佳化Her1和/或最佳化Her3变体用于制造用以治疗表达Her1和/或Her3的细胞异常生长的药物。
本发明还提供使用该组合物于抑制癌细胞生长的方法。在一些实施方案中，癌细胞生长的抑制体内进行，使用治疗组合物。在其它实施方案中，癌细胞生长的抑制为体外的。在其它实施方案中，将包含最佳化Her1和/或最佳化Her3变体的组合物用于离体治疗。
附图简述
图1描绘HER家族及其配体。
图2描绘概述Her调控因子命名的图表。
图3描绘某些具有同样接头及Fc的Her调控因子分子。
图4描绘Her1及Her3 ECD最佳化实验的结果。
图5展示测量HFD300及HFD300.1与其配体的结合亲和力的实验结果。
图6描绘RB242.1B(作为命名的部分的“B”表示使用通用接头)的结合结果。
图7描绘测试Her调控因子同源二聚体抑制Her 3磷酸化的实验结果。
图8展示测试Her调控因子异二聚体相对抑制受体磷酸化的实验结果。
图9展示测试相对抑制受体磷酸化的实验结果，其中当针对配体结合位点数目标准化时将异二聚体与同源二聚体进行比较。
图10展示各种ECD配对的平均改进倍数的结果，其展示配对可影响异二聚体活性。
图11描绘测试Her调控因子抑制NRG-诱导的MCF7增殖的实验结果。
图12展示测试Her调控因子抑制NRG-诱导的T47D增殖的实验结果。
图13展示RB200的配体结合亲和力经由高通量合理突变法最佳化。
图14展示Her调控因子可抑制配体诱导的细胞增殖。
图15展示RB200在大鼠中的药物动力学。RB200在正常大鼠中以15mg/kg单次静脉内(IV)或腹膜内(IP)剂给药，在各时间点收集血浆样本。RB200的血浆浓度经由Her调控因子特异性ELISA使用抗-HER1及抗-HER3作为捕获抗体，抗-人类Fc-HRP作为检测抗体来分析。数据为每时间点2-3只大鼠的平均值±SEM。使用Sigma Plot 10.0.1计算药物动力学参数。
图16展示RB200及RB242在裸鼠中的血浆浓度。RB200及RB242在CD-1裸鼠中以30mg/kg的单次腹膜内剂给药，在24小时及第7天收集血浆样本。RB200及RB242的血浆浓度通过Her调控因子特异性ELISA测定。绘制每时间点4只小鼠的平均血浆浓度(±SD)的数据。
图17展示最佳化双特异性配体阱(trap)RB242.1为经设计的三突变体。RB242.1展示出较高配体结合亲和力(上图)及对生长因子诱导的HER磷酸化(中图)及肿瘤细胞增殖(下图)的增加的抑制活性。测量KD及EC50，且指示相对于亲本/中间形式(parent/interim form)的改进倍数。
图18展示高亲和力EGFR配体结合在Fc介导的EGFR/HER3异二聚体中受抑制。在抗-Fc-涂覆的96-孔培养盘中以固定于表面上的所示纯化EGFR/HER3异二聚体进行125I-配体结合。所示为125I-TGF-α结合(上图)及125I-NRG1-β结合(下图)。结果为三个重复孔的平均值±SEM。
图19展示RB242已恢复针对EGFR配体的高亲和力。如实施例中详述在抗-Fc-涂覆的96-孔培养盘中使用最佳化配体结合条件进行配体结合。图A及B展示Eu-EGF及Eu-NRG1-β的饱和结合。图C及D展示以未标记的TGF-α或HB-EGF置换Eu-EGF。结果为三个独立实验的代表且标准化为与配体结合的受体的分数。
图20在图A中展示RB242比RB200在抑制培养的肿瘤细胞的增殖方面更具潜力。上图展示使用血清饥饿的BxPC3胰腺癌细胞在渐增浓度的RB200或RB242存在下经3nM TGF-α(左上图)或NRG1-β(右上图)处理3天的结果。左下图展示血清饥饿的MCF7细胞在渐增浓度的RB200或RB242存在下经3nM NRG1-β处理3天的结果。右下图展示H1437NSCLC细胞在生长培养基(RPMI1640/10％FBS)中在增加浓度的RB200或RB242存在下历时5天的增殖。细胞增殖使用标准技术定量且于实施例中讨论。结果为8或16个重复样本的平均值±SEM。BxPc3细胞的近似EC50值以约束(constraint)类型设定至最大常数等于100而测定。图B展示RB242在小鼠肿瘤异种移植模型中具有改进的抗肿瘤活性。如实施例中所述，裸鼠用H1437NSCLC细胞皮下移植。当肿瘤体积达到约100mm3时，将小鼠以每公斤12mg PBS媒剂(○)或RB200
Figure GPA00001102394000051
或RB242(▲)处理，其每周腹膜内给药3次历时3周。各处理组存在9只小鼠。数据表示为平均肿瘤体积±SEM。通过双向ANOVA用博非瑞尼后检验(Bonferroni′s posttest)，**＝P＜0.01。
发明详述
本发明提供包含Her1和/或Her3配体结合域的组合物，该结合域经最佳化以改进与其同源配体的结合。这些组合物适用于通过捕获多个HER配体(生长因子)抑制细胞活化。如本文所用，这些类型的组合物可为泛-特异性HER配体阱(pan-HER)或在本文中还称为“Her调控因子(Hermodulin)”。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语具有熟悉本发明所属领域的技术者通常了解的相同意义。除非另外指明，否则本说明书全文提及的所有专利、专利申请、公开申请及公开、GENBANK序列、网站及其它公开材料以引用的方式全部并入。
一般说明
除非另外说明，本发明的实践将采用本领域内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学及免疫学的常规技术。该技术在文献中充分解释，诸如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版(Sambrook等人，1989.Cold Spring Harbor Press)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait编.，1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编.，1987)；Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.)；Handbookof Experimental Immunology(D.M.Weir & C.C.Blackwell编.)；GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller & M.P.Calos，编.，1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编，1987)；PCR：The Polymerase Chain Reaction，(Mullis等人编，1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人编，1991)及Short Protocols in Molecular Biology(Wiley及Sons，1999)。
定义
如本文所用，胞外域(ECD)为出现于受体表面上的细胞表面受体的部分且包括配体结合位点。为本发明的目的，提及ECD包括任何含有ECD的分子或其部分，只要ECD多肽不含有与同源受体的另一结构域(即，跨膜结构域，蛋白激酶结构域或其它)缔合的任何邻近序列。因此，例如，ECD多肽包括细胞表面受体(cell surface receptor，CSR)的可变剪接同种型，其中该同种型具有含有ECD的部分，但缺乏同源CSR的任何其它结构域，且还具有不与同源CSR的另一结构域序列缔合或比对的其它序列。这些额外序列可为内含子编码的序列，诸如以内含子融合蛋白同种型形式出现。通常，其它序列不会抑制或干扰CSR ECD多肽的配体结合和/或受体二聚活性。ECD多肽还包括杂交ECD。
如本文所用，多聚化结构域指促进多肽分子与另一含有互补多聚化结构域的多肽分子的稳定相互作用的氨基酸序列，其可为相同或不同多聚化结构域以与第一结构域形成稳定多聚体。一般而言，多肽与多聚化结构域直接或间接接合。例示性多聚化结构域包括免疫球蛋白序列或其部分、亮氨酸拉链、疏水性区域、亲水性区域、兼容蛋白质-蛋白质相互作用结构域(诸如(但不限于)PKA的R亚基及锚定结构域(anchoring domain，AD))、在两个分子的间形成分子间二硫键的游离硫醇，及形成稳定多聚体的相同或类似尺寸的进入空穴的突起(protuberance-into-cavity)(即，进入空洞的隆起(knob into hole))及互补(compensatory)空穴。多聚化结构域(例如)可为免疫球蛋白恒定区。免疫球蛋白序列可为免疫球蛋白恒定域，诸如来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型、IgA、IgE、IgD及IgM的Fc结构域或其部分。
包含最佳化Her1和/或Her3的组合物
本发明提供包含Her1和/或Her3胞外域(extracellular domain，ECD)的组合物，其经改造(或最佳化)以相较于未经改造的Her 1和/或Her3改进结合。该组合物(例如)有效地用作结合其同源配体的结合测定的组分。在一些方面中，组合物含有Her3ECD同源二聚体的多聚体。Her3ECD可含有下文及图中更详细揭示的突变，其适用于改进与其配体的结合。在其它方面中，组合物含有Her3和Her1同源二聚体的多聚体。对于Her1或Her3中的任一者或其两者而言，最佳化可用于改进与其配体的结合亲和力或另外改进其它生物学特性，包括(但不限于)抑制受体酪氨酸激酶的磷酸化，增加在动物中的生物利用性、较佳活体内药物动力学、抑制细胞迁移、减小肿瘤体积或中断肿瘤生长。在其它方面中，组合物含有Her1/Her1同源二聚体(例如，具有T15S、G564S突变的HER1同源二聚体)、Her1/Her3异二聚体及Her3/Her3同源二聚体的混合物，其中Her3组分经改造用于改进与其配体的结合。图1描绘HER家族及其配体。Her1、Her2及Her3的失调占当前癌症病例50％以上。实施例详述已针对最佳Her3配体结合制造且测试的许多变体。
应了解本发明还涵盖最佳化Her3及最佳化Her1的组合以形成多聚体(同源二聚体或异二聚体)以及Her1/Her1同源二聚体、Her1/Her3异二聚体及Her 3/Her 3同源二聚体的混合物。
HER1ECD结构及结构域组织
HER1的胞外部分包括成熟HER1受体的残基1-621且含有亚域I(氨基酸残基1-165)、II(氨基酸残基166-313)、III(氨基酸残基314-481)及IV(氨基酸残基482-621)。HER1的I、II及III结构域与I型胰岛素样生长因子受体的前三个结构域具有结构及序列同源性(IGF-1R，例如参见Garret等人，(2002)Cell，110：763-773)。与IGF-1R类似，L结构域(即，结构域I及I I I)具有各端由螺旋及双硫键封端的六圈β螺旋结构。相较于IGF-1R，HER1序列包括氨基酸插入，由此造成的生物化学结构对于介导通过HER1的配体结合来说较为重要。其中包括V型偏移(残基8-18)，其坐落于结构域I的大β片层上以形成配体结合界面的主要部分。在结构域III中，对应区域形成也涉及配体结合的环(残基316-326)。结构域III中存在的第三插入区域(残基351-369)为结构域III的第二圈中的额外环。此环为防止配体结合的多个抗体的表位(即，LA22、LA58及LA90，例如参见Wu等人，(1989)J Biol Chem.，264：17469-17475)。此外，第四圈β螺旋管中的其它环参与配体结合。
HER1的配体TGF-α，与一受体分子的L结构域I及III两者的大β片层相互作用。类似地，配体EGF也与HER1的结构域I及III相互作用，但认为EGF与结构域III的相互作用为EGF的主要结合位点(Kim等人，(2002)FEBS，269：2323-2329)。交联研究已确定EGF配体的N-及C-末端部分分别与HER1受体的结构域I及III相互作用。对应于成熟全长HER1的结构域III中的氨基酸Gly441参与经由与人类EGF的Arg45相互作用介导与EGF的结合。202个氨基酸的HER1的40kDa片段(对应于成熟HER1多肽的氨基酸302-503)足以保持HER1与EGF的完全配体结合能力。此202个氨基酸的部分含有全部结构域III，且仅含有结构域II及结构域IV各自的少数残基(Kohda等人，(1993)JBC 268：1976)。
EGFR的结构域I I含有8个双硫键键合的模块。结构域II与结构域I和III两者相互作用。与结构域III的接触经由模块6及7发生，而模块7及8具有一定程度的柔性，藉此用于在无配体形式的EGFR分子中形成铰链。自结构域II的模块5形成有序大环且远离配体结合位点直接伸出。此环对应于残基240-260(还描述为残基242-259)且含有反向平行β-带。该环(还称为二聚化臂)在介导分子内相互作用以及介导受体-受体接触中为重要的。在HER1的非活性的或“栓”(tethered)构型中，环通过在分别对应于氨基酸561-569及572-585的模块5及6中的类似环结构的间插入成熟全长ECD造成分子内相互作用。
缺失结构域II环会消除HER1 ECD的二聚能力，因此显示其在促进分子间相互作用中的重要性。二聚作用由跨越处于结构域I、II及III之间空间中的第二HER分子的结构域II而伸出环来介导。举例而言，通过二聚臂的残基244-253与第二HER分子中结构域I I的凹面上的残基229-239、262-278及282-288形成接触。结构域II中的Tyr246与第二HER分子中的Gly264及Cys283残基形成氢键，且Tyr246的苯基环还与相邻分子的Ser262及Ser282相互作用。EGFR的结构域II与另一HER分子之间的其它氨基酸接触包括Tyr251与Phe263、Gly264、Tyr275及Arg285；Pro248与Phe230及Ala265；Met253与Thr278；及Tyr251与Arg285。此外，Asn247及Asn256对于保持适当构型的环而言为重要的。HER家族成员中的几乎所有这些残基保守且在HER家族受体之间起类似作用。此外，脯氨酸残基出现于HER家族受体中环的位置243、248、255及257中的任一处，其中HER3含有三个脯氨酸。脯氨酸残基使环构象进一步稳定。举例而言，HER1在位置248及257含有脯氨酸。
除了在无活性的HER1分子的栓中参与结构域IV(模块5及6)之外，还看似需要HER1的结构域IV的至少部分模块1来保持活性HER1分子的结构完整性。举例而言，如上文所提及，含有全部结构域III及部分结构域II及IV的HER1的40kDa蛋白水解片段保持完全配体结合能力。此分子中存在的结构域IV的部分对应于氨基酸482-503，包括全部模块1。对应于成熟HER1分子中的Trp492的氨基酸通过与结构域III中的疏水口袋(hydrophobic pocket)相互作用在保持HER1分子稳定性中起作用。含有全部结构域I、II及III但缺乏全部结构域IV的HER1重组分子不能结合配体(对应于成熟HER1的氨基酸1-476，例如参见Elleman等人，(2001)Biochemistry 40：8930-8939)。因此，HER1的配体结合能力看似需要至少全部或部分结构域IV的模块1。结构域IV的剩余部分不可恢复地(expendable)用于配体结合及信号转导。举例而言，缺少成熟HER1多肽的残基521-603的HER1分子中存在HER1的正常配体结合及信号转导特性。
HER 3ECD结构及结构域组织
HER3的胞外部分包括成熟HER3受体的残基1-621且含有亚域I(氨基酸残基1-166)、II(氨基酸残基167-311)、III(氨基酸残基(312-480)及IV(氨基酸残基481-621)。与其它HER家族受体一样，HER3的结构域I、II及III的结构可与IGF-1R重叠，且展示许多与其它HER受体相同的结构特征。举例而言，HER3的结构域I及III展示由含有双硫键的模块的延长重复中断的β-螺旋结构。结构域II及III之间存在结构域间的高度柔性，而IGF-1R则不展现。此外，HER3在结构域II中展现特征β发夹式环或二聚臂(对应于HER3的氨基酸242-259)。β发夹式环提供与结构域IV中的保守残基的分子内接触，产生闭合或无活性的HER3结构。此成栓(tethering)相互作用中重要的残基包括Y246与D562及K583、F251与G563，及Q252与H565的相互作用。与配体结合时，构象改变结构域I及III的方向，从而自栓结构暴露二聚臂以允许受体二聚。
与其它HER家族受体不一样，HER3不具有功能性激酶结构域。激酶区中4个氨基酸残基的改变(此外为在全部蛋白酪氨酸激酶中保守的)使HER3激酶功能失常。然而，HER3在其羧基末端结构域中保持酪氨酸残基，且在适当活化及转磷酸化后即能诱导细胞信号转导。因此，HER3的同源二聚体不能支持线性信号转导。HER3的较佳二聚配偶体为HER2。因而，鉴于此二聚偏好，本文提供的本发明并不受到期待。Her3的配体包括神经调节蛋白-1(NRG-1)及神经调节蛋白-2(NRG-2)。
ECD多聚体的组分及ECD多聚体的形成
ECD杂多聚体包括至少两个不同ECD或其部分，用于与配体结合和/或二聚。在本文的例示性实施方案中，组分ECD中的至少一者为HER3ECD。杂多聚体或均多聚体的ECD经连接，藉此形成多聚体，至少异二聚体或同源二聚体。预期允许或导致ECD相互作用以形成杂多聚体或均多聚体的任何键。
ECD多肽
本文提供的用于产生ECD多聚体的ECD多肽可为Her 3和/或Her 1的全部或部分ECD。如下文更详细论述，可使用各种方法产生展示与其配体改进的结合的这些ECD多肽变体。所用的Her3和/或Her1的ECD可为全长或截短的且还涵盖等位基因变体的使用。
ECD多聚体的形成
ECD多聚体(包括HER ECD多聚体)可为受体ECD的共价连接、非共价连接或化学连接的多聚体，以形成二聚体、三聚体或高级多聚体。在一些状况下，可通过使两个或两个以上ECD多肽二聚形成多聚体。两个ECD多肽之间的多聚作用可为自然发生的，或可由于两个或两个以上多肽的强制键合(forced linkage)而发生。在一实施例中，多聚体可由不同ECD多肽上的半胱氨酸残基之间形成的双硫键连接。在另一实施例中，多聚体可包括经由共价或非共价相互作用与融合至可溶性多肽的肽部分接合的ECD多肽。该肽可为肽接头(间隔子)，或具有促进多聚化的性质的肽。在另一实施例中，可在两个多肽之间通过化学键(诸如通过使用杂双功能接头)形成多聚体。
肽接头
可使用肽接头产生多肽多聚体，诸如一个多聚配偶体为HER家族受体的全部或部分ECD的多聚体。在一实施例中，肽接头可与第一多肽的C末端及第二多肽的N末端融合。此结构可重复多次，使得至少一个，优选2、3、4或多个可溶性多肽经由其各自末端的肽接头彼此连接。举例而言，多聚体多肽可具有序列Z1-X-Z2，其中Z1及Z2各自为细胞表面多肽的全部或部分ECD的序列且其中X为肽接头的序列。在一些情况下，Z1和/或Z2为HER家族受体的全部或部分ECD。在另一实施例中，Z1及Z2为相同的或为不同的。在另一实施例中，多肽具有Z1-X-Z2(-X-Z)n序列，其中“n”为任何整数，即一般为1或2。
通常，肽接头为足够长度以允许可溶性ECD多肽与相邻可溶性ECD多肽形成键。肽接头的实例包括-Gly-Gly-、GGGGG、GGGGS或(GGGGS)n、SSSSG或(SSSSG)n、GKSSGSGSESKS、GGSTSGSGKSSEGKG、GSTSGSGKSSSEGSGSTKG、GSTSGSGKPGSGEGSTKG、EGKSSGSGSESKEF或AlaAlaProAla或(AlaAlaProAla)n，其中n为1至6，诸如1、2、3或4。在优选实施方案中，接头为GGGGG(在本文中还称为“通用接头”，且具有此接头的构建体在其名称末端具有“B”标记)。
连接部分描述于(例如)Huston等人.(1988)PNAS 85：5879-5883，Whitlow等人.(1993)Protein Engineering 6：989-995及Newton等人，(1996)Biochemistry 35：545-553中。其它合适肽接头包括那些描述于美国专利第4,751,180号或第4,935,233号中的任一者，其以引用的方式并入本文中。编码期望的肽接头的聚核苷酸可使用任何合适常规技术插入编码可溶性ECD多肽的聚核苷酸的阅读框架之间或插入同一阅读框架中。在一实施例中，融合多肽具有2至4个可溶性ECD多肽，包括一由肽接头分离的全部或部分HER ECD多肽。
通常，ECD嵌合蛋白的免疫球蛋白部分包括免疫球蛋白多肽的重链，最一般为重链恒定域。在一实施例中，免疫球蛋白多肽嵌合蛋白可包括免疫球蛋白多肽的Fc区。通常，该融合保留至少功能活性铰链，免疫球蛋白重链恒定区的CH2及CH3结构域。另一例示性Fc多肽描述于PCT申请WO93/10151中，且为自人类IgG1抗体的Fc区的N-末端铰链区延伸至天然C-末端的单链多肽。形成键的精确位点不关键：特定位点为熟知的且可经选择以使ECD多肽的生物活性、分泌或结合特征最佳化。举例而言，其它例示性Fc多肽序列在序列的氨基酸C109或P113处开始(例如参见，US2006/0024298)。
除hIgG1 Fc之外，其它Fc区还可包括于ECD嵌合多肽中。举例而言，当由Fc/FcγR相互作用介导的效应功能待最小化时，预期与募集补体或效应细胞不良的IgG同型(诸如，IgG2或IgG4的Fc)的融合。此外，Fc融合可含有实质上由属于任一抗体类的免疫球蛋白基因编码的免疫球蛋白序列，包括(但不限于)抗体的IgG(包括人类子类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgA(包括人类子类IgA1及IgA2)、IgD、IgE及IgM类。此外，接头可用于将Fc与另一多肽共价连接产生Fc嵌合体。
本文还预期经修饰的Fc结构域用于与ECD多肽所形成的嵌合体，例示性修饰(例如)参见美国专利公开第US 2006/0024298号；及国际专利公开第WO 2005/063816号。在一些实施例中，Fc区使得其具有与野生型免疫球蛋白重链的Fc区的效应功能相比改变(即，或多或少)的效应功能。抗体的Fc区与多种Fc受体及配体相互作用，赋予一系列称为效应功能的重要功能性能力。
因此，经修饰Fc结构域可具有改变的亲和力，包括(但不限于)对Fc受体增加或低的亲和力或无亲和力。举例而言，不同IgG子类针对FcγR具有不同亲和力，其中IgG1及IgG3与受体的结合通常实质上优于IgG2及IgG4。此外，不同FcγR介导不同效应功能。FcγR1、FcγRIIa/c及FcγRIIIa为免疫复合物触发的活化的正调控剂，特征为具有基于免疫受体酪氨酸的活化基元(ITAM)的胞内域。然而，FcγRIIb具有基于免疫受体酪氨酸的抑制基元(ITIM)且因此为抑制剂。因此，改变Fc区对受体的亲和力可调节由Fc结构域诱导的效应功能。
在一实施例中，使用经修饰以最佳化与某些FcγR的结合，从而更好地介导效应功能(诸如，ADCC)的Fc区。在另一实施例中，还已知经取代以降低或消除与FcγR的结合的多种Fc突变体。该突变蛋白适用于需要降低或消除由Fc介导的效应功能的状况。此通常为需要拮抗作用，但不杀死携带靶抗原的细胞的状况。该Fc的实施例为美国专利第5,457,035号中所述的Fc突变蛋白。在一些情况下，本文提供的ECD多肽Fc嵌合蛋白可经修饰以增强与补体蛋白C1q的结合。在另一实施例中，可利用与FcRn的结合经修饰的Fc区，从而改进ECD-Fc嵌合多肽的药物动力学。FcRn为新生FcR，与其结合使内吞抗体(endocytosed antibody)自内体再循环回到血液。此过程加上由大尺寸全长分子引起的肾过滤所致的排除，导致1-3周范围内的有利的抗体血清半衰期。Fc与FcRn的结合还在抗体运输中起作用。用于增强与FcRn的结合的Fc蛋白中的例示性修饰包括对应于T34Q、T34E、M212L及M212F的氨基酸修饰。
通常，多肽多聚体为通过将两个相同或不同ECD多肽直接或间接与Fc多肽连接形成的两个嵌合蛋白的二聚体。在一些实施例中，将编码ECD-Fc嵌合蛋白的基因融合物插入至适当表达载体中。所得ECD-Fc嵌合蛋白可表达于以重组表达载体转染的宿主细胞中，且其允许组装非常类似的抗体分子，其中在Fc部分之间形成链间双硫键以产生二价ECD多肽。通常，宿主细胞及表达系统为可用于使适当氨基酸糖基化的哺乳动物表达系统。
含有Fc部分的所得嵌合多肽及由其形成的多聚体可通过于蛋白质A或蛋白质G柱上亲和层析容易地纯化。当将编码不同ECD嵌合多肽的两个核酸转染入细胞时，必须以生物化学方法形成异二聚体，因为携带Fc结构域的ECD嵌合分子也将会表达为双硫键连接的同源二聚体。因此，在有利于破坏链间二硫键，但不影响链内二硫键的条件下可减少同源二聚体。通常，具有不同胞外部分的嵌合单体以等莫耳量混合，且氧化形成同源二聚体与异二聚体的混合物。此混合物的组分由层析技术分离。或者，此类型异二聚体的形成可通过基因工程及表达含有ECD多肽、随后是hIgG的Fc结构域，随后是c-jun或c-fos亮氨酸拉链的ECD融合分子而有所偏向。因为亮氨酸拉链主要形成异二聚体，所以需要时其可用于驱使形成异二聚体。含有Fc区的ECD嵌合多肽还可经改造以包括具有金属螯合物或其它表位的标记。经标记结构域可用于通过金属螯合物层析和/或通过抗体迅速纯化，以允许检测western印迹、免疫沉淀或生物测定中的活性耗尽/封闭。
产生最佳化Her1及3ECD的方法
可使用在ECD、其部分(尤其足以进行配体结合和/或受体二聚的部分)、以及可变剪接部分和多聚化结构域之间产生嵌合多肽的任何合适方法。这些方法为本领域技术人员所已知。类似地，可通过那些本领域技术人员已知的任何方法自嵌合多肽形成多聚体。如所述，多聚体通常包括来自至少一个HER家族成员的ECD，通常是HER1或HER3。
ECD多肽还可使用自动合成多肽的合成法来合成。经克隆和/或电子杂交(in silico)产生的多肽序列可以片段合成且接着化学连接。或者，嵌合分子可合成为单个多肽。编码ECD的核酸分子(包括编码ECD融合物的核酸分子)可使用本领域已知的任何可用方法克隆或分离以克隆及分离核酸分子。该方法包括核酸的PCR扩增，及库筛选，包括核酸杂交筛选，基于抗体的筛选及基于活性的筛选。
如实施例部分进一步论述，Her家族的成员(诸如，Her3)可经改造以最佳化与其配体的结合能力。此可通过使用本领域技术人员已知的多种方法实现。可使用计算机辅助的程序来预测可能突变区域。此后可为使用标准分子生物学技术的氨基酸诱变且接着进行配体结合筛选以识别最佳化结合子。
将编码嵌合多肽的DNA(诸如本文所提供)转染至宿主细胞中以供表达。在一些情况下，其中需要ECD多聚多肽，其中多聚作用由多聚结构域介导，而后宿主细胞以编码将会形成多聚体的单独嵌合ECD分子的DNA转染，最好选择以能够以期望的方式组装多聚体的单独链的宿主细胞。单独单体多肽的组装由各多聚结构域的相互作用促进，其相同或在嵌合ECD多肽之间互补。当HER家族受体ECD或其部分为多聚多肽的一或两个ECD部分时，选择多聚结构域使得单体的组装使HER分子的二聚臂远离配偶体多聚体分子定向。此定向称为“背-对-背”且确保二聚臂可用于与细胞表面上的同源HER二聚。
包括嵌合ECD多肽的ECD多肽可表达于适于产生期望的量及形式的为给药及治疗所需多肽的任何生物体中。一般而言，可经改造以表达异源DNA且具有分泌路径的任何细胞类型为合适的。表达宿主包括原核及真核生物体，诸如大肠杆菌(E.coli)、酵母、植物、昆虫细胞、哺乳动物细胞(包括人类细胞系及转基因动物)。表达宿主的蛋白质产生水平以及所表达蛋白质上存在的翻译后修饰类型可不同。表达宿主的选择可基于这些因素及其它因素进行，诸如调节及安全考虑、生产成本及纯化的需要及方法。
还可根据WO 2007/146959中所揭示的方法进行这些ECD多肽多聚体的产生(包括(但不限于)最佳化、多聚、修饰及连接)，其以引用的方式特定全部并入。
纯化
ECD多肽及嵌合ECD多肽(包括ECD多肽多聚体)可使用本领域熟知的多种技术分离。本领域技术人员可容易地遵循已知方法来分离多肽及蛋白质以获得本文提供的经分离多肽或蛋白质中的一种。这些包括(但不限于)免疫层析法、HPLC、尺寸排阻层析法及离子交换层析法。离子交换层析法的实例包括阴离子及阳离子交换且包括使用DEAE Sepharose、DEAESephadex、CM Sepharose、SP Sepharose或本领域技术人员已知的任何其它类似柱。在一些优选实施方案中，蛋白质纯化通过使用蛋白质A、Ni-Sepharose、Nickel His Trap或抗-EGFR Affibody Sepharose完成。
ECD多肽或ECD多聚体多肽与细胞培养基或溶胞细胞的分离可使用针对嵌合ECD多肽的表位标记或针对ECD多肽的抗体促进，且接着经由免疫沉淀法及经由SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)的分离而分离。或者，包括ECD多聚体的ECD多肽或嵌合ECD多肽可经由使多肽特异性抗体与ECD多肽结合和/或随后使抗体与蛋白质A或蛋白质G琼脂糖柱结合，且自柱洗脱蛋白质来分离。ECD多肽的纯化还可包括使用会与蛋白质结合的试剂固定的亲和柱或珠，随后一或多个用于自结合剂洗脱蛋白质的柱步骤。亲和试剂的实例包括刀豆球蛋白A-琼脂糖、肝素-toyopearl或Cibacrom蓝3Ga琼脂糖。蛋白质还可通过疏水性相互作用层析法使用诸如苯基醚、丁基醚或丙醚的树脂纯化。可使用一个以上柱实现较大纯度。
评估或监测ECD多聚体活性的测定法
一般而言，ECD多聚体调节一或多种，通常两种或多种同源细胞表面受体(CSR)或其它相互作用CSR的一或多种生物活性。可使用体外及体内测定监测ECD多聚体的生物活性。本文提供例示性体外及体内测定以评估HER ECD多聚体的生物活性。测试ECD多聚体对RTK活性的作用的测定包括(但不限于)激酶测定、同源二聚及异二聚测定、蛋白质：蛋白质相互作用测定、结构测定、细胞信号转导测定及体内表型分类(phenotyping)测定。测定还包括使用动物模型，包括可观测和/或测量生物活性的疾病模型。ECD多聚体在该测定中的剂量反应曲线可用于评估生物活性的调节以及测定ECD多聚体用于给药的治疗有效量。下文描述例示性测定法。
1.激酶/磷酸化测定
可直接及间接检测和/或测量激酶活性。举例而言，可使用针对磷酸酪氨酸的抗体检测RTK的磷酸化。举例而言，可在RTK的配体存在下测量RTK的酪氨酸激酶活性的活化。可通过抗磷酸酪氨酸抗体检测转磷酸化作用。可在ECD多聚体存在及不存在下测量和/或检测转磷酸化作用，从而测量ECD多聚体调节RTK转磷酸化的能力。简言之，可将表达RTK的细胞暴露于ECD多聚体且以配体处理。将细胞溶解且将蛋白质提取物(全细胞提取物或分馏提取物)上样至聚丙烯酰胺凝胶上，通过电泳分离且转移至膜，诸如用于western印迹法。使用抗RTK抗体的免疫沉淀还可用于分馏及分离RTK蛋白质，随后进行凝胶电泳及western印迹法。膜可使用抗磷酸酪氨酸抗体探测以检测磷酸化作用以及以抗-RTK抗体探测以检测总RTK蛋白。可使对照细胞(诸如，不表达RTK同种型的细胞及未暴露于配体的细胞)进行相同程序用于比较。
酪氨酸磷酸化作用还可(诸如)通过质谱分析直接测量。举例而言，ECD多聚体对RTK的磷酸化状态的作用可(诸如)通过以多种浓度的ECD多聚体处理完整细胞且测量对RTK活化的作用来测量。RTK可通过免疫沉淀法分离且胰蛋白酶化以产生肽片段用于通过质谱分析来分析。肽质谱分析为用于定量测定蛋白质酪氨酸磷酸化程度的公认方法；酪氨酸的磷酸化会增加含有磷酸酪氨酸的肽离子质量，且此肽通过质谱分析容易地与非磷酸化肽分离。
2.复合/二聚
可检测和/或测量RTK及ECD多聚体的复合作用，诸如二聚作用。举例而言，经分离多肽可混合在一起，进行凝胶电泳及western印迹法。还可将RTK和/或ECD多聚体添加至细胞及细胞提取物，诸如完全细胞或分馏提取物中，且可进行凝胶电泳及western印迹法。识别多肽的抗体可用于检测单体、二聚体及其它复合形式的存在。或者，可在测定中检测经标记的RTK和/或经标记ECD多聚体。该测定可用于在ECD多聚体存在及不存在下比较RTK的同源二聚作用或两种或多种RTK的异二聚作用。还可进行测定来评估ECD多聚体与RTK二聚的能力。举例而言，可评估HER3ECD多聚体与HER1异二聚的能力。
3.配体结合
一般而言，RTK与一或多个配体结合。如上文所述，图1说明一些与HER家族的成员结合的配体。配体结合调节受体的活性且因此(例如)在信号传导路径内调节信号转导。可测量在ECD多聚体存在下与ECD多聚体结合的配体及与RTK结合的配体。举例而言，经标记配体(诸如，放射性标记的配体)在ECD多聚体存在或不存在(对照)下可添加至纯化或部分纯化的RTK。免疫沉淀及测量放射性可用于定量在ECD多聚体存在及不存在下与RTK结合的配体的量。还可(诸如)通过以经标记配体孵育ECD多聚体且测定由ECD多聚体结合的经标记配体的量，相较于野生型或主要形式的对应RTK结合的量，来评估ECD多聚体的配体结合。实施例还列出其它检测配体结合的方式。
4.细胞增殖测定
HER家族受体参与细胞增殖。可测量ECD多聚体对细胞增殖的作用。待测试的细胞通常表达标靶RTK受体。举例而言，可向表达RTK的细胞中添加配体。ECD多聚体可在配体添加之前、同时或之后添加至该细胞中，且测量对细胞增殖的作用。细胞增殖程度可通过以诸如阿尔玛蓝(AlamarBlue)或结晶紫(Crystal Violet)的染料或其它类似染料标记细胞，随后进行最佳化密度测量来评估。MTT[溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑盐]还可用于评估细胞增殖。MTT作为增殖试剂的用途基于来自活细胞的粒线体脱氢酶裂解浅黄色MTT的四唑环且形成在健康细胞中积聚(因为其对细胞膜而言不可渗透)的深蓝色甲
Figure GPA00001102394000191
晶体的能力。通过添加洗涤剂使细胞溶解导致释放及溶解晶体。与活的、增殖的细胞数目成直接正比的颜色可通过分光光度计法定量。因此，在配体存在或不存在下将所选择细胞与ECD多聚体孵育后，可向细胞中添加MTT，细胞可经洗涤剂溶解，且在570nm下读取吸光度。或者，在增殖实验前，细胞可经放射活性标记(诸如，3H-氚)或其它荧光标记(诸如，CFSE)预标记。
5.细胞疾病模型测定
来自疾病或病症或可经调节以模仿疾病或病症的细胞可用于测量和/或检测最佳化Her3多聚体的作用。在细胞中添加或表达最佳化Her3多聚体且相较于未接触或未表达ECD多聚体的细胞测量或检测表型。该测定可用于测量如下作用，包括对细胞增殖、转移、发炎、血管生成、病原体感染及骨吸收的作用。
6.动物模型
可使用动物模型评估最佳化Her1和/或Her3多聚体的作用。举例而言，ECD多聚体对癌细胞增殖、迁移及侵袭的作用可在癌症动物模型中测量。在一该测定中，癌细胞(诸如，卵巢癌细胞)在体外培养后胰蛋白酶化、悬浮于合适缓冲液中，且注射入小鼠(例如，注射入诸如Balb/c裸鼠的模型小鼠的侧腹及肩膀)。在通过任何合适给药途径(即，皮下、静脉内、腹膜内及其它途径)向小鼠给药癌细胞之前、同时或之后，向小鼠共给药。随时间流逝监测肿瘤生长。可以其它细胞类型及动物模型进行类似测定，例如鼠类动物肺癌(LLC)细胞及C57BL/6小鼠及SCID小鼠。可与未给药ECD多聚体的小鼠或缺乏ECD多聚体的各自同源受体或相互作用受体的小鼠比较肿瘤生长。
使用方法
本文揭示的组合物具有多种用途。在一方面中，Her调控因子可用于抑制癌细胞生长。如实施例和图所示，本发明的Her调控因子抑制由天然Her1和/或Her3配体诱导的癌细胞增殖，且其抑制程度是对于本领域普通技术人员所预料不到的。包含最佳化Her1和/或Her1的Her调控因子可以有效量向有需要的个体(例如患癌的个体)给药。癌可为个体能从治疗中受益的任何类型的癌。此处待治疗的癌的实例包括但不限于癌(carcinoma)、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、白血病或淋巴恶性瘤。其他这些癌的实例包括鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)，肺癌包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞状癌，腹膜癌，肝细胞癌，胃(gastric)或胃(stomach)癌包括胃肠癌、胰腺癌，胶质母细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝脏肿瘤，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，肾细胞癌，食管癌，神经胶质瘤，结直肠癌，子宫内膜或子宫癌，唾液腺癌，肾(kidney)或肾(renal)癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌症，肝癌，肛门癌，阴茎癌以及头颈癌。
有需要的个体的其他实例为罹患表达Her1和/或Her3的细胞异常生长的个体。Her调控因子还可用于减小肿瘤体积和/或抑制肿瘤生长。肿瘤可涵盖多种类型的肿瘤，包括(但不限于)癌瘤、基于血液的肿瘤及实体肿瘤。本发明的Her调控因子可用于治疗或减轻其他病症，包括那些涉及细胞增殖和/或迁移，包括那些涉及病理性炎症应答，非恶性过增生疾病，如眼病、皮肤病，导致平滑肌细胞增殖和/或迁移的疾病，如狭窄，包括再狭窄，动脉粥样硬化，膀胱、心脏或其他肌肉的肌肉加厚，子宫内膜异位症，或类风湿性关节炎。本文提供其他可用Her调控因子治疗的疾病包括任何由HER家族受体或其配体介导的疾病或病症，包括但不限于进攻性、生长迟缓、精神分裂症、休克、帕金森病、阿尔茨海默病、充血性心肌病、先兆子痫、神经系统疾病和心力衰竭。对于本领域技术人员显见，基于Her调控因子组合物具有的功能和生物作用，可有其他用途。此处揭示的组合物可与其他试剂组合使用。可与Her调控因子共同时用的组合治疗包括抗激素化合物、保心药、抗癌剂如化疗和生长抑制因子，和任何其他如此处所述的因子。
Her调控因子可配制为医药学上可接受的组合物。组合物可以适于实现生物作用的方法给药。此可以通过任何适合的给药路径(即皮下、静脉内、腹膜内、口服、真皮内和其他路径)。在其它情况下，药物组合物还可经配制用于局部(local，topical)或全身给药。在一些实施方案中，将药物组合物配制为单剂量给药。在其它实施方案中，本发明范畴内涵盖包含最佳化Her调控因子的组合物的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒任选地封装有说明书。试剂盒可含有单剂量或多剂量的Her调控因子。Her调控因子可为以下中的一或多种：最佳化Her1/Her1或最佳化Her3/Her3的同源二聚体、Her1/Her3的最佳化异二聚体、或同源二聚体与异二聚体的混合物。
识别、筛选及制造额外Her调控因子的方法
除本文提供的ECD多聚体外，可鉴定其它候选Her调控因子。本文提供识别Her调控因子的方法及其筛选测定。该方法经设计识别的分子靶向ECD亚域以干扰配体结合和/或受体二聚和/或识别分子(诸如，小分子及多肽)的成栓，该识别分子与这些活动中所涉及的一个以上HER受体家族成员上的区域相互作用。该治疗剂可同时靶向不具有HER受体的多个共表达的HER家族的若干成员。
一种可用于识别药理学活性的泛-HER治疗分子的方法为使用计算机辅助的最佳化技术将导致与配体以较高亲和力结合的可能突变分类。实施例提供如何使用该计算机辅助最佳化技术的指导，且提供使用计算机辅助最佳化产生的最佳化Her3的工作实例。举例而言，与配体具有增强的结合的HER1、HER2、HER3或HER4可由此方式产生且用作制备异多聚体、同源多聚体及其混合物的组分。
可测试上文所述的方法中所识别出的Her调控因子功能性调节一或多种HER活性的能力。该活性为那些本领域技术人员已知且为本文所述。该测定的实例包括配体结合、细胞增殖、细胞磷酸化及复合/二聚作用。因此，本文基于与HER分子或其部分的高亲和力识别为候选物的任何候选物可在其它筛选测定中测试以测定候选治疗剂是否具有泛-HER治疗特性，即针对HER活化的抑制特性。
实施例
包括以下实施例仅为说明性目的且不欲限制本发明范畴。
实施例1具有改进的结合的改造的Her3
图1描绘Her家族及其配体。HER1配体结合域的计算机建模使用EGFR-EGF的共晶体结构(PDB code IMOX-chain C；Ogiso H等人Cell(2002)775-787)与EGFR-TGFα(PDB code 1IVO-chain C，Garrett，T.P.J 2002)进行。通过组合使用计算机重新设计、单氨基酸诱变、高通量配体结合筛选且接着选择最佳的最佳化结合子改进配体阱的Her3部分的结合。对于进一步实验而言，表达按比例增加且进行一些纯化步骤。
计算机设计
使用HER3ECD的结构信息(PDB code IM6B，Cho 2002，Schwede T，KoppJ，Guex N，and Peitsch MC(2003))进行HER3配体结合域的计算机建模。设计的配体-受体相互作用的最佳化是基于氨基酸的物理化学特性及分类，诸如带电、极性、芳香性等。还考虑残基体积、表面积、溶剂可接近性等。使用PAM250矩阵帮助预测氨基酸取代(W.A Pearson，Rapid and SensitiveSequence Comparison with FASTP and FASTA，in Methods in Enzymology编.R.Doolittle(ISBN 0-12-182084-X，Academic Press，San Diego)183(1990)63-98；以及M.O.Dayhoff编，1978，Atlas of Protein Sequenceand Structure，第5卷)。
实施例2高通量诱变
定点诱变通过包括三个相继PCR反应的重叠PCR进行，各反应通过补充有校读DNA聚合酶pfu的热稳定DNA聚合酶链延长酶(Invitrogen)催化。HER1:Fc及HER3:Fc cDNA用作PCR模板。针对具有2对引物的第一轮PCR设定的条件为94℃2min，94℃45s，60℃45s，68℃3min，26个循环。两个由第一轮PCR产生的重叠PCR片段经凝胶纯化，以1∶1摩尔比组合且用于第二轮PCR。第二轮PCR使用94℃2min，94℃45s，57℃45s，68℃30min，历时8个循环的条件，退火两个重叠PCR片段。在第三轮PCR中，将第二轮PCR的产物用作模板。在覆盖启动密码子的正向引物及覆盖终止密码子的反向引物存在下进行PCR扩增。PCR条件为94℃2min，94℃45s，60℃45s，68℃3min，历时26个循环。将携带突变的PCR产物克隆入Gateway System质粒pDONR221(Invitrogen)中。设计的突变由完全测序确认。接着通过根据制造商说明进行LR反应将pDONR221中的插入物转移至表达载体pcDNA3.2-DEST(Gateway System，Invitrogen)。
实施例3蛋白质表达及纯化
对于配体结合筛选而言，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)将序列确认的HER1:Fc及HER3:Fc突变体瞬时转染至HEK293T细胞(ATCC)中。为了表达Fc-介导的HER1/3异二聚体，将HER1:Fc及HER3:Fc或其突变体共转染至HEK293T细胞中。转染后72小时后收集无血清条件培养基。使用人类HER1或HER3 ELISA检测试剂盒根据制造商说明(R&D Systems)定量HER1:Fc及Her3:Fc同源二聚体的水平。为定量Fc介导的异二聚体，将抗-HER3-涂覆的ELISA培养盘用于捕获且将HER1抗体用于检测。
对于成比例增加HER1/3异二聚体的表达而言，在补充有8mM L-谷氨酰胺及1xHT(Gibco)的Pro-CHO5(Lonza)中以1×106/mL将保持于Pro-CHO5(Lonza，Allendale，NJ)中的对数生长期CHO-S细胞(Invitrogen)转移至摇式细胞培养生物反应器(Wave Bio-Reactor)(GEHealthCare)中。第二天，将细胞以相应HER1:Fc及HER3:Fc cDNA构建体共转染。通过使用25Kdal线性PEI(Polysciences)以12mg/L实现转染。转染后4小时，ProCHO5的体积加倍。将转染的细胞保持于摇式细胞培养生物反应器中历时7天，随后采集条件培养基。
通过使用以下方案纯化Fc-介导的HER1/3异二聚体：将来自共转染CHO-S细胞的条件培养基(Invitrogen)净化，10倍浓缩，且应用于MabSelect SuRe亲和柱(GE Healthcare Biosciences AB，Sweden)上。以含有0.1％(体积比)TX-114的磷酸盐缓冲盐水(PBS)大范围洗涤柱且以IgG洗脱缓冲剂(Pierce，Rockville，IL)洗脱。将洗脱的部分以1MTris-HCL迅速中和至pH 8.0。将含有蛋白质的部分的集合上样至Ni-Sepharose柱(GE-Healthcare Biosciences AB，Sweden)上。将柱以含有25mM咪唑的Ni-琼脂糖(Sepharose)缓冲液洗涤。将结合蛋白质以相同缓冲剂中的25-135mM梯度咪唑洗脱。主要异二聚体峰通常在80-125nM咪唑之间洗脱。来自Ni-琼脂糖柱的含有异二聚体的部分的集合在4℃下在PBS中彻底透析。异二聚体制剂的纯度通过分析型反相HPLC测定。
实施例4对于改进配体结合的筛选
通过Delfia(PerkinElmer)筛选铕标记的EGF(Eu-EGF)与NRG1β(Eu-NRG1β)的结合在96孔黄色培养盘(Perkin Elmer)中进行。在室温(RT)下将孔以100μl抗人类Fc抗体(5μg/mL，Sigma-Aldrich)涂覆过夜。在室温下将经涂覆培养盘以PBS/0.05％Tween-20(洗涤缓冲液，WB)冲洗3次且以PBS/1％BSA封闭，历时2小时。将培养盘以WB再冲洗3次。将来自转染HEK293T细胞的条件培养基中的Fc融合蛋白以Delfia结合缓冲液稀释至每孔20ng的浓度且添加至各孔(每孔100μl)中。将培养盘在室温下孵育2小时，且接着以DELFIA洗涤缓冲液冲洗3次。接着将培养盘以100μl Eu-EGF(Perkin Elmer)或Eu-NRG1β(由PerkinElmer定制标记)以0.5nM的浓度孵育。将培养盘在室温下孵育2小时，随后以含有0.02％Tween-20的冰冷Delfia洗涤缓冲液快速冲洗3次。为定量所结合的Eu-配体，每孔添加130μl Delfia增强溶液且将培养盘在荧光培养盘读取器(Envision，model 2100，PerkinElmer)上读取。
使用TGFα及HB-EGF ELISA试剂盒(R&D System)进行针对TGFα及HB-EGF结合的筛选。将以100μl抗-人类Fc抗体以1μg/mL涂覆96孔培养盘在室温下过夜。如上所述冲洗并封闭培养盘。将条件培养基中的Fc融合蛋白以PBS/1％BSA稀释至20ng/孔且以100μl/孔添加至各孔中。将培养盘在室温下孵育2小时，随后以WB冲洗3次。以PBS/1％BSA将TGFα及HB-EGF(R&D Systems)稀释至5nM且添加至培养盘中。将培养盘在室温下孵育2小时，随后以冰冷的WB迅速冲洗3次。使用针对TGFα或HB-EGF的经生物素标记的检测抗体检测所结合的配体。随后根据制造商说明进行ELISA显色步骤。
使用条件培养基针对HER1配体结合(Eu-EGF、TGFα及HB-EGF)至固定HER1/3异二聚体的筛选程序与针对上文所述Eu-EGF、TGFα及HB-EGF结合的筛选相同，其中例外为培养盘经抗人类HER3抗体(DYC1769)以2μg/mL的浓度预涂覆，且将每孔100ng来自条件培养基的Fc-融合蛋白用于配体结合。
通过建模研究可预测在位置246处以丙氨酸取代酪氨酸(Y246A)的变体引起高亲和力且其经筛选且发现与NRG1β结合。先前工作将产生称为T39S的变体(或若不具有24个残基信号序列，则为T15S)的最佳化Her1ECD称为HFD120。经构筑的各种变体的命名描绘于图2及下文中。
Figure GPA00001102394000261
此命名法用于本说明书全文中。这些具有最佳化Her1和/或Her3的各种Her调控因子与图3中所示的相同接头及Fc连接。
实施例3配体结合测定
使用包括(但不限于)I125标记配体、DELFIA(铕标记的配体)、表面等离子共振(Biacore)及等温量热法测定的标准配体结合测定筛选各种HFD构建体。用于饱和结合的例示性方案如下：
Eu-配体饱和结合及置换
Eu-EGF与Eu-NRG1β饱和结合及Eu-EGF置换与上文所述的EU-EGF结合筛选相同，其中例外为使用纯化异二聚体且用于配体结合的异二聚体浓度比所测定配体的KD低至少10倍(Cell surface receptors：a shortcourse on theory and methods，Lee E.Limbird，2004)。对于与Eu-EGF的饱和结合而言，将每孔30ng RB200或每孔2ng RB242固定于抗人类Fc涂覆的培养盘上。对于与Eu-NRG1β的饱和结合而言，将每孔2ng RB200或RB242固定。在增加浓度的所示未标记竞争者存在下将Eu-EGF(对于RB200而言浓度为50nM或对于RB242而言浓度为5nM)添加至孔中来进行置换测定。
125-配体饱和结合
125I-EGF购自GE-Healthcare。TGFα及HB-EGF(R&D Systems)由GE-Healthcare定制标记。将96孔测定培养盘以5μg/mL抗人类Fc抗体涂覆。如上文所述洗涤且封闭经涂覆培养盘。将条件培养基或稀释为每孔20ng的纯化蛋白质固定于抗人类Fc涂覆的孔中。使用增加浓度的125I-配体达到饱和结合。结合后，将具有经结合125I-配体的洗涤过的孔以每孔100μl闪烁混合液OptiPhase“SuperMix”(PerkinElmer，Waltham，MA)覆盖且由Microbeta Trilux(PerkinElmer)读取。
通过与NRG1β1(本文还称为NRGβ1)结合测定Her3最佳化。图4展示测量最佳化Her1及Her3分子的缔合解离速率(on-off rate)的数据。图5展示HFD300及HFD300.1的结合亲和力。
当测试RB242.1B的结合亲和力时，结果(图6)展示其克服配体结合中HER1与HER3之间的拮抗作用。对HER1配体的亲和力的改进优于RB222.1超过30倍。
图13展示RB200的配体结合亲和力经由高通量合理诱变法最佳化。识别出对HER1及HER3配体皆具有低于纳摩尔亲和力的最佳化Her调控因子变体RB242。RB242与其它HER配体(诸如，TGF-α及HBEGF)的结合通过针对Eu-EGF的竞争性结合评估。RB242相对于RB200结合于不同配体的比较基于多种测定法表示为Kd及Bmax的改进倍数。
图17(上图)还展示RB242具有改进的配体结合亲和力。
实施例6Her调控因子同源二聚体对RTK的磷酸化的抑制
测试最佳化Her3构建体是否可抑制NRG-刺激的Her3磷酸化。图7描绘测试Her调控因子同源二聚体抑制Her3磷酸化的实验结果。如所示，HFD320.1展示出乎意料的优于HFD300的42倍改进。
实施例7Her调控因子异二聚体对磷酸化的抑制
测试Her调控因子异二聚体的各种构建体以测定其对磷酸化的作用。进行磷酸酪氨酸ELISA。简言之，在37℃下将血清饥饿细胞以每孔50μl含有0.1％BSA及所指示抑制剂的DMEM预处理30分钟。随后在37℃下以3nM EGF或1nM NRG1β1刺激细胞历时10分钟。接着将具有细胞的培养盘置于冰上，以冰冷PBS洗涤一次，且以含有磷酸酶抑制剂混合物的溶解缓冲液溶解。细胞溶解物通过在4℃下在培养盘振荡器上以20μl蛋白质-A-琼脂糖珠浆料孵育过夜来澄清。接着移除珠粒且将上清液用于磷酸酪氨酸ELISA。用于ELISA的HER1及HER3捕捉抗体培养盘制备如下：将96孔测定培养盘以0.4μg/mL抗人类EGFR抗体(#AF231)或以4μg/mL抗人类ErbB3 DuoSet IC(#DYC1769)涂覆。在室温下，将经涂覆培养盘以PBS中2％牛血清白蛋白及0.05％Tween-20封闭2小时。将如上加工的细胞溶解物(75μl)转移至经涂覆培养盘的各孔中，在4℃下在混合下孵育过夜且接着以WB洗涤4次。HER蛋白质上的酪氨酸磷酸化以每孔100μl根据制造商说明稀释于含有2％BSA的PBS中的抗磷酸酪氨酸-HRP缀合物(R&DSystems)检测，在室温下孵育2小时。将培养盘以WB洗涤4次，且接着以每孔100μl TMB底物随后每孔100μl TMB终止剂(皆来自Sigma-Aldrich)显色。显色时间可变，使得经显色培养盘光学密度在0.5-1.0范围内。将培养盘在650nM下通过VERSAmax微滴定培养盘读取器(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)读取。
图8展示这些测试Her调控因子异二聚体对受体磷酸化的相对抑制的实验结果。如图8所示，对于EGF，异二聚体之间不存在差异。对于TGF-α而言，RB220最有效，而对于HB-EGF而言，异二聚体之间的差异极小。对于NRG而言，RB202.1最有效，而RB200.1及RB222.1比RB200或RB220更有效。
当使配体结合位点数目标准化时，则将结果展示于比较异二聚体与同源二聚体的图9中。该表展示当计算值针对配体结合位点数目标准化时EC50的改进倍数。出乎意料地，这些结果展示当与HFD100配对时，HFD320.1序列比HF300多50倍活性，且当与HF120配对时HFD320.1序列与HF300.1类似。HFD100序列不受二聚配偶体影响，而当与HFD320.1配对时HFD120序列活性相较于HFD300有所减弱。HFD300.1未经测试。因此，结果表明对于多个ECD配对而言，配对的组合可影响异二聚体活性。图10展示各种ECD配对的平均改进倍数的结果，其展示该配对可影响异二聚体活性。
图17(中图)展示RB242比RB 200更有效抑制GF-依赖性HER磷酸化。
实施例8NRG-诱导的细胞增殖的Her调控因子抑制
使用不同细胞系测试Her调控因子对配体诱导的增殖的作用。细胞增殖研究在无血清培养基中进行。将细胞以每孔100μl培养基(对细胞系适当)中2000至5000个细胞涂覆于96孔组织培养盘(Falcon#35-3075，Becton Dickinson，NJ)中且接着生长过夜(15至18小时)。接着使细胞血清饥饿历时24小时，且以3nM EGF或NRG1β在增加浓度的所指示抑制剂存在下处理3天。细胞增殖通过MTS测定定量。接着将培养盘在培养盘读取器上在490nm波长下读取吸光度，其与孔中的细胞量成正比。
图11展示测试抑制NRG-诱导的MCF7增殖的实验结果，而图12展示测试抑制NRG-诱导的T47D增殖的实验结果。对于NRG-诱导的增殖而言，RB222.1最佳作用，随后为HFD320.1及1∶1混合物。RB200为群组中对NRG-诱导的细胞增殖的作用最不有效者，尽管其抑制MCF7细胞的EGF-诱导的增殖。
图14展示Her调控因子可抑制配体诱导的细胞增殖。将BxPC 3胰腺癌细胞以3nM TGF-α(A)或3nM NRG1-β1(B)在增加量的RB200或RB242存在下处理3天。细胞增殖通过MTS测定定量。数据表示为相较于仅以TGFα或NRG1-β1刺激的对照细胞的细胞生长的抑制百分比。数据为8个重复样本的平均值+SEM。图17(下图)还展示RB242.1为GF-诱导的细胞增殖的有效抑制剂。
实施例9Her调控因子的药物动力学分析
全部Her调控因子构建体的啮齿动物模型(包括那些具有最佳化Her3的)中的血浆浓度通过Her调控因子特异性ELISA分析，该ELISA使用抗-HER1(AF231，R&D System)及抗-HER3(AF234，R&D Systems)抗体作为捕捉抗体，HRP缀合的抗人类Fc抗体(Bethyl Laboratories)作为展示完整进入体循环的投药剂量程度的报导抗体。计算生物利用性、清除率及血浆半衰期。对于RB200而言，RB200的绝对生物利用性通过使用下式测量RB200在小鼠中腹膜内给药15-30mg/kg后在体循环中的可用性：
Figure GPA00001102394000301
其中AUC＝曲线下面积。由此计算可见，所估算FRB200h经测定为＞90％。除高生物利用性之外，RB200还展示低分布体积，及与Fc-融合蛋白质及其它治疗性单克隆抗体的预期一致的延长的终末半衰期。其它Her调控因子的计算以相同方式进行以测定生物利用性及终末半衰期。图15及16展示各种Her调控因子在大鼠及裸鼠中的血浆浓度及所计算出的药物动力学参数。
实施例10Her1及Her3的最佳化
下表说明一些针对Her1及与其同源配体的结合活性测试的设计突变。
  EGFR(Her1)突变   亚域   结合活性
  Q8P   I   降低
  S11L   I   降低
  T15S   I   增加
  T15E   I   未结合
  T15Y   I   未结合
  T15Y，Q16E   I   未结合
  T15K   I   未结合
  Q16E   I   降低
  Q16S   I   未分泌
  Q16K   I   增加
  EGFR(Her1)突变   亚域   结合活性
  Q16Y   I   未结合
  Q16Y，G18D   I   未分泌
  L17V   I   未分泌
  EGFR(Her1)突变   亚域   结合活性
  L17I   I   类似
  G18N，D22E   I   未结合
  G18N，T19G   I   降低
  G18N，T19G，F20Y   I   未结合
  G18N，T19N，F20Y   I   降低
  T19D，F20A   I   未结合
  T19D，F20A，D22N，H23Q   I   未结合
  T19D，F20A，D22N，H23Q，F24Y   I   未分泌
  T19K   I   增加
  T19Q   I   增加
  T19D   I   未分泌
  T19Y   I   降低
  T19G   I   类似
  T19I   I   降低
  D22N   I   增加
  L25A   I   类似
  EGFR(Her1)突变   亚域   结合活性
  L25A，S26L   I   未结合
  L25A，S26Q   I   降低
  L25Y，S26A   I   降低
  L25N，S26A   I   未分泌
  L25Q   I   未分泌
  S26L   I   降低
  S26A   I   降低
  S26T   I   未分泌
  M30L   I   类似
  N32E   I   类似
  EGFR(Her1)突变   亚域   结合活性
  T44V，Y45L   I   降低
  T44V，Y45L，V46T，Q47G   I   未分泌
  Y45W   I   增加
  L69V   I   降低
  L69I   I   类似
  T71E，V72F，E73S，R74T   I   未分泌
  V72F   I   未分泌
  Q81R   I   类似
  N86T，M87Q，Y88V   I   类似
  EGFR(Her1)突变   亚域   结合活性
  Y89H，E90D   I   降低
  Y89W   I   类似
  L98M，S99L   I   未分泌
  L98M，S99F，D102N   I   未分泌
  S99A   I   增加
  S99T   I   降低
  P112R，M113L，R114T   I   类似
  F126I，S127E，N128K   I   未分泌
  F126I   I   类似
  F126I，N129K   I   未分泌
  P130D，A131K   I   降低
  S145R，S146G   I   未分泌
  F148R，L149D，S150A，N151E，M152I，S153V   I   增加
  M154V，D155K，F160G，Q161D   I   类似
  Y246A   II   未结合
  Y246M   II   未结合
  Y246V   II   未结合
  EGFR(Her1)突变   亚域   结合活性
  V350L   III   增加
  F352H   III   未结合
  EGFR(Her1)突变   亚域   结合活性
  G354A   III   未分泌
  A385D   III   增加
  W386E   III   未分泌
  H409V，G410R   III   降低
  G410R   III   未分泌
  N420D   III   类似
  S440L   III   增加
  G441R   III   降低
  K463E   III   降低
  K463Q   III   类似
  I467Q，S468K   III   降低
  I467K   III   未分泌
  D563L   IV   类似
  D563P   IV   类似
  G564D   IV   增加
  G564S   IV   增加
  H566G   IV   增加
  H566V   IV   增加
  N579R   IV   类似
  V583E   IV   降低
对于Her3而言，所测试的一些突变如下：
  HER3突变   亚域   结合活性
  HER3突变   亚域   结合活性
  A8S   I   类似
  L14E   I   增加
  G16D   I   降低
  G16K   I   类似
  S18T   I   未结合
  V19Q   I   未结合
  D22T   I   类似
  A23F   I   增加
  A23L   I   降低
  N25   I   降低
  R36N   I   增加
  V47T   I   降低
  L48Y   I   未结合
  G50E   I   降低
  A53Y   I   增加
  V70E   I   降低
  M72L   I   增加
  V86I   I   增加
  D93E   I   类似
  F96L   I   未结合
  M101F   I   降低
  L102S   I   未结合
  N103K   I   未结合
  N105R   I   类似
  T106K   I   增加
  T106Q   I   类似
  HER3突变   亚域   结合活性
  N107D   I   降低
  S109N   I   降低
  H110F   I   降低
  R113Q-Q114E   I   降低
  R116H   I   降低
  T121I，   I   降低
  P165L   I   降低
  Y129R   I   降低
  K132N   I   增加
  132K   I   降低
  G215D   II   降低
  Y246A   II   增加
  Y246P   II   增加
  Y246V   II   增加
  K248E   II   降低
  Q252D   II   增加
  Q252E   II   增加
  P309R   II   类似
  E313N   III   降低
  322DS   III   未结合
  D325N   III   未结合
  G331K   III   类似
  L339N   III   类似
  N341D   III   降低
  D343F   III   未结合
  D343H   III   未结合
 HER3突变   亚域   结合活性
 D343I   III   未结合
 D343L   III   未结合
 D343S   III   降低
 N350H   III   类似
 N350R   III   降低
 P353S   III   降低
 H355N   III   降低
 K356A   III   降低
 P358E   III   类似
 P362S   III   类似
 Y377F   III   降低
 N379L   III   降低
 H386N   III   类似
 H388T   III   类似
 N389D   III   降低
 S403V   III   类似
 L404K   III   降低
 Y405Q   III   降低
 Y405T   III   降低
 N406H   III   降低
 R407G   III   类似
 R407Q   III   降低
 R407Y   III   增加
 F409L，L411   III   降低
 L411，L417Q   III   降低
 L412A   III   增加
  HER3突变   亚域   结合活性
  L412Y   III   降低
  M414V   III   类似
  K415S   III   未结合
  R434N   III   降低
  Y436G   III   降低
  Y436L   III   未结合
  S438H   III   类似
  S438T   III   未结合
  S438V   III   类似
  A439D   III   未结合
  R441S   III   增加
  Q442N   III   类似
  E460K   III   类似
  E460N   III   增加
  E461G   III   类似
  E461Q   III   增加
  L463H   III   降低
  L463S   III   降低
  D464H   III   增加
  D464K   III   降低
  D464Q   III   增加
  D464V   III   降低
  K466I   III   增加
  K466P   III   降低
  K466T   III   增加
  H467D   III   增加
 HER3突变   亚域   结合活性
 H467G   III   增加
 C481R   III   未结合
 S487F   III   类似
 D562-565deL   IV   未结合
 G563F   IV   降低
 G563L   IV   降低
 G563Q   IV   未结合
 G563R   IV   降低
 H565E   IV   未结合
 H565F   IV   降低
 H565I   IV   增加
 H565Q   IV   增加
 S569R   IV   类似
 I581D   IV   类似
 K583E   IV   类似
 I581V   IV   降低
实施例11最佳化HER3:Fc抑制最佳化EGFR的配体结合
EGFRT15S:Fc与HER3Y246A:Fc在HEK293T细胞中共表达，且将所得异二聚体(RB222)纯化至约95％均质性。配体结合表明RB222相较于亲本异二聚体RB200保持针对125I-NRG1-β改进的亲和力(Kd为1.6nM对12.3nM)。然而，RB222不再具有针对EGFR配体改进的亲和力。如图18所示，异二聚体RB200及RB222各自针对125I-TGF-α具有表观Kd＞30nM(在100nM125I-TGF-α下结合不饱和)，而EGFRT15S:Fc同源二聚体针对同一配体呈现1.0nM的Kd。因此，当HER3ECD锁定于Fc介导的异二聚体中时抑制EGFRECD的高亲和力结合。
实施例12G564S突变恢复EGFR配体与RB222的高亲和力结合
为了恢复与异二聚体RB222的高亲和力EGFR配体结合，向集中在其亚域II/IV栓区的RB222的EGFR臂中引入额外单个突变。利用在不预先纯化的情况下在条件培养基中有效筛选与EGFR/HER3异二聚体突变体的EGFR配体结合的方法。将条件培养基中EGFR/HER3:Fc异二聚体以及HER3:Fc同源二聚体固定于96-孔培养盘表面上，该培养盘预涂覆有抗人类HER3(ECD-特异性)抗体。此后使EGFR配体与经固定EGFR/HER3:Fc异二聚体结合。此方法的重要优势为含有异二聚体与同源二聚体的混合物的条件培养基可直接对于异二聚体特异性EGFR配体结合进行筛选，而无须移除污染同源二聚体。
形成10个异二聚体突变体且使用此方法筛选。回收具有位于自体抑制栓的亚域IV中的G564S突变的突变体RB242，其展示恢复的高亲和力EGFR配体结合。随后将RB242纯化至约95％均一性且测定其配体结合亲和力。
上文进行的全部初始配体亲和力筛选使得可获得并比较表观Kd值。为了测定真实Kd，将表观Kd用作起始点校准饱和结合，使得所测定受体的浓度比针对所测定配体测量出的Kd低至少10倍。当根据此数学关系进行结合测定时，在针对Eu-EGF的亲和力方面RB242展示出优于RB200的10倍改进(Kd为1.0nM对9.5nM)，且在针对Eu-NRG1-β的亲和力方面展示出31倍改进(Kd为0.1nM对3.1nM，图19A及B)。进行竞争性配体结合以通过未标记的TGF-α或HB-EGF置换Eu-EGF结合。在这些配体置换测定中，在针对TGF-α的亲和力方面RB242展示出优于RB200的34-倍改进(Ki为0.5nM对17.0nM)，以及在针对HB-EGF的亲和力方面16倍改进(Ki为1.3nM对20.1nM，图19C及D)。
分析经纯化RB200及RB242抑制EGFR及HER3磷酸化的能力。RB200或RB242的配体诱导的EGFR磷酸化的剂量依赖性抑制在N87细胞及MCF7细胞中得以证明。如增加的配体结合亲和力表明，在抑制EGF-诱导的EGFR磷酸化方面RB242比RB200有效65倍(EC50为1.8nM对117.3nM)且在抑制TGF-α-诱导的EGFR磷酸化方面有效10倍(EC50为19.4nM对199.0nM)。类似地，在抑制MCF7细胞中NRG1-β-诱导的HER3磷酸化方面，RB242比RB200有效15倍(EC50为1.7nM对25.1nM)。
实施例13在抑制经培养肿瘤细胞的增殖方面RB242比RB200有效
比较RB200及RB242对经培养单层肿瘤细胞的增殖的作用。BxPC3胰腺癌细胞的增殖由无血清培养基中的TGF-α或NRG1-β诱导。生长因子诱导的BxPC 3增殖由RB200或RB242以剂量依赖性方式抑制(图20A，上图)。在3天增殖测定中，估算出的EC50表明在抑制TGF-α-或NRG1-β-诱导的增殖方面RB242比RB200有效约5倍。在RB242处理的BxPC3细胞中可见多达200％的抑制。推测此由BxPC3细胞在无血清条件下的增殖产生，此增殖由RB242抑制。类似地，血清饥饿的MCF7乳癌细胞体由NRG1-β诱导增殖；此增殖受RB200或RB242抑制(图20A，左下图)。在5天增殖测定中，估算出的EC50表明RB242比RB200有效7倍。在生长培养基(RPMI1640/10％FBS)中以增加的RB200或RB242浓度分析人类H1437NSCLC细胞的增殖。如图20A(右下图)所示，在5天增殖测定中RB242比RB200有效约5倍(EC50为18.9nM对100.7nM)。
实施例14RB242展示出在人类非小细胞肺癌的小鼠模型中改进的抗肿瘤活性
在携带来源于人类H1437NSCLC细胞的肿瘤的裸鼠中比较RB200及RB242的体内功效。所使用的小鼠肿瘤异种移植模型：在雌性CD-1nu/nu裸鼠中进行H1437非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤异种移植研究。以9只小鼠为一组进行功效研究。将H1437细胞保持于RPMI 1640/10％FBS中。将细胞以0.025％EDTA采集，以培养基洗涤两次，再悬浮于无菌PBS中，且接着以100μl体积中6×106个细胞皮下注射入小鼠。使用卡尺测量肿瘤，且自长度、宽度及横截面积计算肿瘤体积。当平均肿瘤体积达到约100mm3时开始处理。将小鼠以RB200或RB242以150μl体积以12mg/kg腹膜内给药，每周3次，历时3周。在实验室动物的人道护理及使用的OLAW公共卫生服务政策(OLAW Public Health Service Policy on Humane Care anduse of Laboratory Animals)(1996)的指导方针，针对实验室动物护理及使用指南中所述的政策及帕拉奥图医疗基金会(Palo Alto MedicalFoundation)的IACUC下进行实验。来自小鼠肿瘤异种移植实验的结果使用双因子ANOVA以及博非瑞尼后检验(Bonferroni′s post-test)进行分析。
选择此小鼠肿瘤模型，部分是因为RB200及RB242展示直接体外抗增殖活性(图20A，右下图)。皮下注射H1437细胞且在开始处理前使其生长至约100mm3。在此模型中，以12mg/kg给药的RB200对已确立的肿瘤展示生长抑制趋势(图20B；P＞0.05)。以相同剂量给药的RB242表明改进的抗肿瘤活性，在2周处理后将肿瘤生长抑制约50％(P＜0.01)，与其在经培养肿瘤细胞中增强的抑制活性一致(图20A)。

Claims (31)

1.一种多聚体，其包含来自Her3的胞外域(ECD)，其中该Her3经最佳化以改进与其同源配体的结合。
2.根据权利要求第1项的多聚体，其中该Her3 ECD包含Y246A突变。
3.根据权利要求第1或2项的多聚体，其中该Her3 ECD在位置132处包含赖氨酸。
4.根据权利要求第1项的多聚体，其中该Her3 ECD为K132E突变。
5.根据权利要求第1至4项中任一项的多聚体，其中该Her3 ECD经截短。
6.根据权利要求第1项的多聚体，其进一步包含来自Her1的ECD。
7.一种多聚体，其包含来自Her1的胞外域(ECD)，其中该Her1经最佳化以改进与其同源配体的结合。
8.根据权利要求第7项的多聚体，其中该Her1 ECD包含T15S突变。
9.根据权利要求第8项的多聚体，其进一步包含G564S突变。
10.根据权利要求第9项的多聚体，其进一步包含含有Y246A突变的Her3ECD。
11.根据权利要求第7项的多聚体，其中该Her1 ECD包含结构域4缺失。
12.根据权利要求第7项的多聚体，其中该Her1 ECD包含一或多个选自S193N、E330D、及G588S的突变。
13.一种包含Her1同源二聚体的组合物，其中该Her1经最佳化以改进与其同源配体的结合。
14.根据权利要求第13项的组合物，其中该Her1包含一或多个选自T15S、G564S、结构域4缺失、S193N、E330D、及G588S的突变。
15.根据权利要求第13项的组合物，其中该Her1包含T15S及G564S突变。
16.一种包含Her3同源二聚体的组合物，其中该Her3经最佳化以改进与其同源配体的结合。
17.根据权利要求第16项的组合物，其中该Her3包含Y246A突变。
18.一种包含Her3变体与Her1变体的异二聚体的组合物，其中两变体均经最佳化以改进与其同源配体的结合。
19.根据权利要求第18项的组合物，其中该Her1变体包含一或多个选自T15S、G564S、结构域4缺失、S193N、E330D及G588S的突变。
20.根据权利要求第18项的组合物，其中该Her1变体包含T15S及G564S突变。
21.根据权利要求第18项的组合物，其中该Her3变体包含一或多个选自Y246A、K132E及K132的突变。
22.根据权利要求第20项的组合物，其中该Her3变体包含Y246A突变。
23.根据上述权利要求中任一项的组合物，其中另外包含与Her1或Her3或此两者连接的Fc受体。
24.一种包含Her1/Her1同源二聚体、Her1/Her3异二聚体、与Her3/Her3同源二聚体的混合物的组合物，其中该Her1和/或该Her3组分经最佳化以改进配体结合。
25.根据权利要求第24项的组合物，其中该Her1变体包含一或多个选自T15S、G564S、结构域4缺失、S193N、E330D及G588S的突变，其中该Her3变体包含一或多个选自Y246A、K132E及K132的突变。
26.根据权利要求第24项的组合物，其中该Her1变体包含T15S及G564S突变，其中该Her3变体包含Y246A突变。
27.根据上述权利要求中任一项的组合物，其进一步包含药学上可接受的赋形剂。
28.一种抑制癌细胞生长的方法，其包含使该细胞与包含Her1变体及Her3变体的组合物接触，其中该Her1和/或该Her3组分已经最佳化以改进配体结合。
29.根据权利要求第28项的方法，其中该Her1变体包含T15S及G564S突变且其中该Her3变体包含Y246A突变。
30.一种减小肿瘤体积的方法，其包含使该细胞与包含Her1变体及Her3变体的组合物接触，其中该Her1和/或该Her3组分已经最佳化以改进配体结合。
31.根据权利要求第30项的方法，其中该Her1变体包含T15S及G564S突变且其中该Her3变体包含Y246A突变。
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