JPH07508178A - レセプター活性化 - Google Patents

レセプター活性化

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JPH07508178A JP6503819A JP50381993A JPH07508178A JP H07508178 A JPH07508178 A JP H07508178A JP 6503819 A JP6503819 A JP 6503819A JP 50381993 A JP50381993 A JP 50381993A JP H07508178 A JPH07508178 A JP H07508178A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 レセプター活性化 発明の技術分野 この出願は、レセプターの活性化方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、リ ガンドに誘発された細胞表面レセプターのオリゴマー形成法に関する。本発明は さらに、各天然のりガントの競合アゴニストとして働くリガンド変異体の製造法 、およびリガンド−免疫グロブリンキメラに関する。
発明の背景 成長因子、分化因子、およびホルモンなどの多くのポリペプチドは、細胞表面レ セプターに結合し該レセプターを活性化することによってその作用を媒介する。
レセプター活性化のメカニズムは特定のレセプター−リガンドペアによって異な り、しばしば完全には理解されていないが、活性になるためにはオリゴマーを形 成する必要があること、またはその活性がオリゴマー形成によって促進されるこ とは多くのレセプターの一般的な特性である。チロシンキナーゼ活性を有する成 長因子レセプター（レセプターチロフンキナーゼ）およびある種のサイトカイン レセブターは、そのようなレセプターの典型例である。
チロシンキナーゼ活性を有するレセプターは、類似の分子トポロジーを有する。
該レセプターはすべて、細胞外リガンド結合性ドメイン、疎水性縁膜ドメイン、 およびチロフンキナーゼ触媒ドメインを含む細胞質ドメインを有し、配列の類似 性および異なる構造特性に基づいてさらに分類することができる［ハンクス４４ ３〜４７８　（１９８８）］。単量体サブクラス■レセプターは、細胞外ドメイ ン中に２つの７ステインに冨んだ繰り返し配列を有し：サブクラス■レセプター は、類似の７ステインに富んだ繰り返し配列を有する、ジスルフィド結合したヘ テロ四量体α２β２−タイプの構造を有し、一方、サブクラス■および■レセプ ターの細胞外ドメインは、それぞれ５または３の免疫グロブリン様繰り返しを有 する。たとえば、インスリルセブター、上皮増殖因子（ＥＧＦ）レセプター、血 小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）＋ノセブター、インスリン様増殖因子（［ＧＦ− １）レセプター、コロニー刺激因子１　（Ｃ３Ｆ−１）レセプター、および肝細 胞増殖因子（ｈｃｐａｔｏｃｙｔｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）　（ＨＧＦ ）レセプターはこのファミリーに属する。
レセプターチロノンキナーゼは、その立体配置のために膜結合アロステリック酵 素として考えることができる。これらレセプターにおいては、水溶性酵素とは対 照的に、リガンド結合性ドメインとチロノンキナーゼ触媒ドメイン（プロティン チロノンキナーゼ活性）とは細胞質膜によって隔てられているので、細胞外リガ ンド結合によるレセプターの活性化は、細胞内ドメイン機能を活性化するために 膜障壁を越えて翻訳される必要がある。
アロステリックレセプターオリゴマー形成モデルによれば、リガンド結合および その結果としての細胞外ドメインのフンホメーノタン変化がレセプターのオリゴ マー形成を誘発し、このことが今度は隣接する細胞質ドメイン間での相互作用を 安定化させ、分子相互作用によってキナーゼ機能の活性化へと導く。レセプター のオリゴマー形成は、縁膜ドメイン内のアミノ酸残基の位置に変化をもたらす必 要もなく、細胞外ドメインから細胞質ドメインへコンホメーション変化を伝達す ることを可能とする。単量体の不活性レセプターは、オリゴマー化した活性化レ セプターと平衡状態にある。成長因子がそのレセプターに結合すると、オリゴマ ー状態（リガンド結合親和性が促進され、プロティンチロノンキナーゼ活性が上 昇している）を安定化させる［ンユレシンガー（Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ、　 Ｊ、）　、Ｊ。
より一般的なアロステリックレセプターオリゴマー形成モデルが、ンユレシンガ ー、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｓｃｉ、１３．４４３〜４４７　（１９ ８８）に記載されている。
レセプターオリゴマー形成は簡単のためレセプター二量体形成として一般に説明 されるが、コンホメーション変化を誘発し、その結果としてレセプター−レセプ ター相互作用を起こさせる単量体リガンド（ＥＧＦなど）によって誘発されるＵ コチェソト（Ｃｏｃｈｅｔ、　Ｃ，）ら、Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、２ 旦旦、３２９０〜３２９５　（１９８８）］。ＰＤＧＦやＣ３Ｆ−１などの２価 リガンドは隣接するレセブこのレセプター活性化モデルのすべてのレセプターチ ロシンキナーゼに対する普遍性は、異なるチロノンキナーゼレセプターサブクラ スの主要なドメインからなる完全に機能性のキメラレセプターを構築することに 関する報告により支持されている［リーデル（Ｒｉｅｄｅｌ、　Ｈ，）ら、ＥＭ ＢＯＪ、８．２９４３〜２９５４（１９８９）］。幾つかの場合において構造的 に非常に類似したレセプター間でのへテロニ量体形成も示されてはいるが［α− およびβ−タイプのＰＤＧＦレセプターについてはハマチャーらの上記文献；イ ンスリンレセプターおよびＩＧＦ−ルセブターについてはスーズ（Ｓｏｏｓ、　 Ｍ、　Ａ、　）およびシラドル（Ｓ　１ｄｄｌｅ、Ｋ、）　、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 　Ｊ、２６３．５５３〜５６３　（１９８９）］　、未だ、そのようなハイブリ ッドレセプターが実際に機能的であるという直接的な証拠はない。一般に、構造 的な不安を一層詳細に解析することおよびレセプターチロシンキナーゼにおいて リガンド誘発による変化のための必要条件は、これら膜結合系の複雑さ、および 高度に精製した天然または組換えレセプターを適当な量で得ることができないこ とのために妨害されている。
チロノンキナーゼ活性を有するレセプターによるシグナル伝達の概略に関しては 、ウルリソヒおよびンユレフンガー、Ｃｅ１１８１．２０３〜２１２　（１９９ ０）、およびポーマン（Ｂｏｒｍａｎｎ、　Ｂ、　Ｊ、）およびエンゲルマン（ Ｅ　ｎｇｅｌｍａｎ、　Ｄ　、　Ｍ、　）、Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｐｈ ｙｓ、　Ｂｉｏｍｏｌ、　Ｓ　ｔｒｕｃｔ、２１．２２３−２６６　（１９９２ ）、並びにその中で引用された文献を参照。
もっと最近になって発見されたレセプターチロノンキナーゼはＨＧＦレセプター 　（ＨＣ；Ｆ　ｒ）であり、これはｃ−ＭＥＴ癌原遺伝子産物として同定されて いるナルノー＝　（Ｎａｌｄｉｎｉ）ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ旦、５０１〜５０４ 　（１９９１）ｌｏ　ＭＥＴは最初、染色体転座を起こした化学的に処理した骨 肉腫細胞株においてトランスフオーム遺伝子として同定された［パーク（Ｐ　ａ ｒｋ、　Ｍ、　）ら、Ｃｅ１１４５．８９５〜９０４　（１９８６）］、成熟１ −１　Ｇ　Ｆ　ｒは、糖付加した１９０ｋＤａ前駆体を５０ｋＤａのαサブユニ ットと１４５ｋＤａのβサブユニットとにタンパク質加水分解することによって 生成する、ジスルフィド結合したヘテロニ量体である［ジョルダーノ（Ｇ　１ｏ ｒｄａｎｏ、　Ｓ　、　）ら、２匹９巴四４．１３８３〜１３８８　（１９８９ ）］。このαサブユニットは細胞外であり、βサブユニットには細胞外領域、シ ングル膜貫通（ＩＩｅｍｂｒａｎｅ−ｓｐａｎｎｉｎｇ）　ドメインおよびチロ シンキナーゼドメインが含まれる。正常細胞では、ＨＧＦｒのチロノンキナーゼ 活性を活性化するにはＨＧＦの結合が必要である。ＨＧＦが結合すると、ＨＧＦ ｒタンパク質は上記１４５ｋＤａのβ−サブユニットのチロシン残基上でリン酸 化される。
レセプターオリゴマー形成（二量体形成）はまた、とりわけ最近発見されたシン グル縁膜レセプターのスーパーファミリー（ヘマトポエチン（ｈｅｍａｔｏｐｏ ｉｅｔｉｎ）レセプタースーパーファミリーと称する）において、ある種のサイ トカインレセブターによるシグナル形成においても重要であると思われる［バザ ン（Ｂ　ａｚａｎ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏ ｍｍｕｎ、ｌ旦Ａ１．７８８〜７９５　（１９８９）；（１９０）；イゼルダ（ Ｉ　ｄｚｅｒｄａ、　Ｒ，Ｌ、　）ら、Ｊ　、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、１７１．８ ６１〜８７３　（１９９０）：ゴドウイン（Ｇｏｄｖｉｎ、　Ｒ，Ｇ、　）ら、 ρヱυ、旦旦、９４１−９５１　（１９９０）：フクナガ（Ｆ　ｕｋｕｎａｇａ 、　Ｒ，）ら、Ｃｅ１１６１．３４１〜３５０　（１９９０）：バザン（Ｂａｚ ａｎ、　Ｊ、Ｆ、）ら、Ｐ　ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ　ｃｉＳ） ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ　８４．６４ ３４〜６４３７　（１９８７）、ドウ・ボ（Ｄｅ　Ｖｏｓ）ら、Ｓ　ｃｉｅｎｃ ｅλ５５．３０６〜３１２　（１９９２）；ロス７　：／　（Ｃｏｓｍａｎ、　 Ｄ、　）ら、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｓｃｉ、１５．２６５〜２７０ 　（１９９０）］。コノスー　バーファミリーの成員としては、成長ホルモン（ ＧＨ）レセプター、プロラクチン（ＰＲＬ）レセプター、胎盤性ラクトゲン（Ｐ 　Ｌ）レセプター、および他のサイトカインおよび造血レセプター、たとえばイ ンターロイキン１〜７　（ＬＬ−１、Ｉ　Ｌ−２、ｐ７５としても知られるβ− サブユニット、ＩＬ−３、ＩＬ〜４、Ｉ　Ｌ−５、Ｉ　Ｌ−６、ＩＬ−７）レセ プター、エリトロポエチン（ＥＰＯ）レセプター、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ −Ｃ３Ｆ）レセプター、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）および 顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ３Ｆ）レセプターが挙げら れる。これらレセプターには、相同な細胞外リガンド結合性ドメイン、およびい ずれの公知のチロシンキナーゼまたは他のタンパク質と相同でない高度に変化し 得る細胞内ドメインが含まれる。
最近、カニンガム（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ、　Ｂ、　Ｃ，）らは、ｈＧＨや他の サイトカインのレセプターの活性化のためには二量体形成が重要であるという証 拠を発行した［　Ｓ　ｃｉｅｎｃｅλ且」、８２１−８２５　（１９９１）コ。
ｈＧＨにおけるホルモンにより誘発された変化の構造的条件およびメカニズムを 解析するため、上記著者らは、大腸菌で発現することにより高収率で産生された ｈＧＨレセプターの細胞外ドメイン（ｈＧＨ結合性タンパク質、ｈＧＨｂｐ）を 用いた。結晶化、サイズ排除クロマトグラフィー、熱量測定研究および蛍光消光 アッセイの結果は、ｈＧ’ＨがｈＧＨｂｐの細胞外ドメインと１２複合体を形成 することを示した。これら研究およびさらなる研究に基づき、ｈＧＨ（ｈＧＨｂ ｐ）２複合体の形成においてｈＧＨｂｐ上の２つの重複部位に結合するための２ つの機能的に区別される部位をｈＧＨが含有すること、および類似の二量体レセ プター複合体が細胞表面上で形成されることがｈＧＨおよびおそらく相同なサイ トカインレセブターのノブナル伝達メカニズムにとって重要であることが結論づ けられた。レセプター二量体形成メカニズムは、第二のレセプター結合部位を欠 く（それゆえｈＧＨｂｐと二量体を形成することができない）ｈＧＨアナログが レセプター結合親和性が減少し飽和へのレセプター下降制御（ｒｅｃｅｐｔｏｒ 　ｄｏｗｎ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ）が減少する という知見によって確認された。
さらに他の例は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプターＴＮＦＲ−１およびＴＮＦ Ｒ−■、ＦａｓおよびＡｐｓ遺伝子産物、および幾つかのＴ細胞およびＢ細胞抗 原などの神経成長因子レセプター（ＮＧＦＲ）関連レセプターのスーパーファミ リーである。このスーパーファミリーに現在のところ含まれるのは、ＮＧＦＲ（ 神経細胞上に認められる）、Ｂ細胞抗原ＣＤ４０、ＭＲＣ０Ｘ−４０抗原（ＣＤ ４表現型の活性化Ｔ細胞のマーカーである）、種々の細胞タイプ上で認められる ＴＮＦＲ−１およびＴＮＦＲ−［＋、未知の機能のタンパク質をコードしＴ細胞 クローンから得られるｃＤＮＡ　（４１８Ｂ）　、および５ＦＶ−Ｔ２　（シｓ −ブ（Ｓ　ｈｏｐｅ）線維腫ウィルス中の読み取り枠）である。このファミリー の成員は、その分子の細胞外ドメイン中の約４０アミノ酸の３または４のンステ インに富んだモチーフによって、およびある場合にはヒンジ様の領域だが他のド メインタイプは存在しないことによって特徴付けられる。機能的には、現在まで に特徴付けられている該レセプタースーパーファミリーの成員は、２以上のリガ ンドと反応することができ、これらリガンドが天然では多鳳体であるというのが 通常である。２価の抗ＴＮＦＲ抗体はＴＮＦＲを活性化するが１価の抗体断片（ Ｆ　ａ　ｂ’断片）はＴＮＦＲを活性化しないことがわかっているので、ＴＮＦ レセプターはオリゴマー形成によって活性化されることが示されている［エンゲ ルマノ（ＥｎｇｅＬｍａｎ、　Ｉ−１，）ら、Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ 　λ６５．１４４９７〜１４５０４　（１９９０）、およびその引用文献］。Ｔ ＮＦ−α　３量体は、２つの細胞表面ＴＮＦＲ分子を架橋することによってノブ ナル伝達を誘発することが示唆されている［アノユケナージ（Ａｓｈｋｅｎａｚ ｉ、　Ａ、　）呟Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８８　１．０ ５３５〜１０５３９　（１９９１）コ。同様に、ＦａｓおよびＡｐｓ遺伝子産物 も抗体によって活性化さね得る。
本発明の目的は、リガンドによって誘発されたレセプターのオリゴマー形成法を 提供することである。
対応の天然リカンドの競合アゴニストとじて働くリガンド変異体の製造法を提供 することが他の目的である。
変異の結果として失われたりガントの生物学的活性を実質的に回復する方法を提 供することが他の目的である。
天然の対応物の作用の競合アンタゴニストであるリガンドをアゴニストに変換す る方法を提供することはさらに別の目的である。
リガンドの半減期を増加させることはさらに他の目的である。
発明の要約 本発明は、一連の組換えｂｕＨＧＦ　（ｒｈｕＨＧＦ）変異体を用いて得られた 観察に基づいている。ｈｕＨＧＦの成熟形化ト血清から精製した主要形態に対応 する）は、ヒトプロホルモンをアミノ酸Ｒ４９４と■４９５との間でタンパク質 加水分解開裂することによって得られるジスルフィド結合したヘテロニ量体であ る。この開裂プロセスにより、４４０アミノ酸のα−サブユニット（Ｍｒ６９ｋ Ｄａ）と２３４アミノ酸のβ−サブユニット（Ｍｒ　３４ｋＤａ）とからなる分 子が生成される。ｈＨＧＦ　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列から、α−およびβ− の両路がプレプロ前躯体タンパク質をコードする単一の読み取り枠中に含まれる ことが明らかとなっている。成熟ｈＨＧＦの予測された一次構造において、鏡開 Ｓ−８架橋はα鎖のＣｙｓ４８７とβ鎖中のＣｙｓ６０４との間で形成される。
α鎖のＮ末端側には、メチオニングループで開始される５４アミノ酸が先行する 。この断片には、３１残基の特徴的な疎水性リーダー（シグナル）配列およびプ ロ配列が含まれる。α鎖はアミノ酸５５から開始され、４つのクリングルドメイ ンを含む。クリングル１ドメインは、α鎖のおよそアミノ酸１２８からおよそア ミノ酸２０６までであり、クリングル２ドメインはおよそアミノ酸２１１からお よそアミノ酸２８８までであり、クリングル３ドメインはおよそアミノ酸３０３ からおよそアミノ酸３８３までであり、クリングル４ドメインはおよそアミノ酸 ３９１からおよそアミノ酸４６４までとして定義される。
プロホルモンのα／β二量体への開裂およびクリングルおよびプロテアーゼ様ド メインの構造的および機能的重要性を決定するため、ｒｈｕＨＧＦ変異体を製造 した。β鎖かまたはβ鎖に加えて連続的な数のクリングルドメインのいずれかを 欠失させることによりｈ　ｕ　ＨＧ　Ｆの一連のＣ末端欠失物を製造し、１鎖→ ２鎖開裂部位またはプロテアーゼドメイン内に変異を導入した。
ｈｕＨＧＦ変異体のあるものはそのレセプター（ＨＧＦｒ）に高親和性で結合す る能力を保持していたがＩ−［Ｇ　Ｆの生物学的活性（マイトツエン活性）は欠 けており、ＨＧＦｒのリン酸化を誘発する能力は減少していた。
そのような変異体ＨＧＦ分子の免疫グロブリン定常ドメイン配列への融合からな る、コンホメーノタン的に正しいキメラタンパク質を製造することができること 、およびそのようなキメラはＨＧＦｒへの結合能を保持していることがわかった 。
さらに、以前はレセプターに結合することができたが野性型のｈｕＨＧＦに比べ てＩＩＣＦの生物学的活性が欠失しているかまたは実質的に減少しているＨＧＦ 変異体の生物学活性を、ＨＧＦ変異体−免疫グロブリンキメラの形態で実質的に 回復することができることがわかった。
ＨＧＦのＨＧＦｒへの結合によって細胞内チロシンキナーゼが活性化されるメカ ニズムは完全には理解されていないが、試験したＨＧＦ変異体−免疫グロブリン キメラによるレセプター活性化は、ＨＧＦ−免疫グロブリンＨ鎖二量体が構造的 にレセプター二量体形成を誘発する能力によるものと思われる。他の方法、たと えば／スティン架橋によって結合した（オリゴマー形成した）ＨＧＦリガンドは 、同様の仕方でレセプター活性化を誘発する。
（完全な）生物学的活性のためにオリゴマー形成を必要とする他のレセプターち また、オリゴマー形成した（たとえば、二量体を形成した）リガンド配列により 、たとえば免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合した対応天然または変異体リ ガンドからのレセプター結合性ドメインからなるキメラ分子により、活性化され 得る。そのようなレセプターとしては、チロノンキナーゼ活性を有する他のレセ プター、たとえば、インスリンレセプター、ＥＧＦレセプター、ＰＤＧＦレセプ ター、ＩＧＦ−ルセブター、Ｃ３Ｆ−ルセブター、サイトカインレセプター、た とえば、ヘマトポエチンレセプタースーパーファミリーの成員（ｈＧＨレセプタ ー、ｈＰＲＬレセプター、ＩＬ−ルセブター、Ｉ　Ｌ−２レセプター、ＩＬ−３ レセプター、ｌ　Ｌ　−、、ルセプター、ＩＬ−５レセプター、Ｉ　Ｌ−６レセ プター、ＩＬ−７レセプクー、エリトロポエチンレセプター、Ｇ−Ｃ３Ｆレセプ ター、Ｍ−Ｃ３Ｆレセプター、およびＧＭ−Ｃ３Ｆレセプター）；およびＮＧＦ Ｒスーパーファミリーの成員、たとえばＮＧＦＲ，ＴＮＦＲ−１およびＴＮＦＲ −■が挙げられる。
一つの側面において、本発明は、（ａ）それぞれ第一のレセプターおよび第二の レセプターに結合することのできる第一のリガンドと第二のリガンドとの直接融 合物からなる結合体を用意し、その際、該第−のレセプターおよび該第二のレセ プターは互いにオリゴマー形成することができ、チロシンキナーゼ活性を有する レセプター、サイトカインレセブター、および神経成長因子レセプタースーパー ファミリーの成員よりなる群から選ばれたものであり、ついで（ｂ）該結合体を 該第−のレセプターおよび該第二のレセプターと接触させて該第−のリガンドを 該第−のレセプターに、該第二のリガンドを該第二のレセプターに結合させる、 ことを特徴とするレセプターの活性化法に関する。
他の側面において、本発明は、（ａ）それぞれ第一のレセプターおよび第二のレ セプターに結合することのできる第一のリガンドおよび第二のリガンドからなる 結合体を用！し、その際、該第−のレセプターおよび該第二のレセプターはチロ ノンキナーゼ活性を有するレセプターから選ばれたものであり、ついで（ｂ）該 結合体を該第−のレセプターおよび該第二のレセプターと接触させて該第−のリ ガンドを該第−のレセプターに、該第二のリガンドを該第二のレセプターに結合 させる、ことを特徴とするレセプターの活性化法に関する。この態様において、 該第−のりガントおよび該第二のりガントは互いに直接融合していてもよいし、 または異種リンカ−を含む共有結合によって連結されていてもよい。異種リンカ −としては、たとえば、免疫グロブリン定常および／または可変ドメイン配列、 非タンパク質性架橋剤からの残基、第一のリガンドと第二のリガンドとの間のジ スルフィド架橋、またはポリペプチドスペーサー配列が挙げられる。
別の態様において、本発明は、チロノンキナーゼ活性を有するレセプター、サイ トノＪイルセプター、および神経成長因子レセプタースーパーファミリーの成員 よりなる群から選ばれたレセプターに選択的に結合することのできるリガンド変 異体の生物学的活性を口（ｌする方法に関し、該方法は、（ａ）該リガンド変異 体の２つの分子を直接融合させてホモ二量体を得るか、または （ｂ）該リガンド変異体を第二のレセプター結合性アミノ酸配列に融合してヘテ ロ二量体を得、ついで （Ｃ）該ホモニ量体またはへテロニ量体を該レセプターと接触させて、該リガン ド変異体の一つの分子を該レセプターの第一の分子に結合させ、該リガンド変異 体の第二の分子または該第二のレセプター結合性配列を該レセプターの第二の分 子に結合させる ことを特徴とする。
レセプターがレセプターチロシンキナーゼのファミリーからのものである場合は 、２つのリガンド変異体を互いに直接融合させるか、または異種リンカ−により 連結することができる。
さらに他の側面において、本発明は、チロシンキナーゼ活性を有するレセプター の天然のりガントに対するアゴニストの製造方法に関し、該方法は、該レセプタ ーに結合することのできる第一のりガント変異体を二量体形成させるか、または 該レセプターに結合することのできる第二のリガンド変異体に該第−の変異体を 結合させることを特徴とする。
さらに別の側面において、本発明は、チロシンキナーゼ活性を有するレセプター に結合することのできる第一のリガンドと第一の免疫グロブリン定常ドメイン配 列との融合物、および該レセプターもしくはチロシンキナーゼ活性を有する他の レセプターに結合することのできる第二のリガンドと第二の免疫グロブリン定常 ドメイン配列との融合物を含むキメラ分子に関する。
図面の簡単な記載 図１は、ｈｕＨＧＦのαサブユニットおよびβサブユニットの模式図である。
α鎖中には、アミノ酸１〜３１にわたる／グナル配列（箱で囲んだ領域）、予測 されたフィンガーおよび４つのクリングルドメイン（それぞれ、３つのノスルフ イド結合を有する）を示しである。ｈｕＨＧＦのへテロ二量体α／β形を生成す るだめの開裂部位は、Ｐ１開裂残基Ｒ４９４の＠後に続く。この最後の残基はＥ 、Ｄまたは八で特異的に置換されて）［ＧＦ一本鎖変異体を生成する。該開裂部 位に続くβ鎖には、セリンプロテアーゼに相同な配列が含まれる。α鎖とβ鎖と は、Ｃ４８７（α）とＣ６０４（β）との間の唯一のジスルフィド架橋によって 一体とされることが提唱されている（ナカムラら、１９８９、上記）。β鎖内の ３つの残基が個々にまたは組み合わせて置換されてセリンプロテアーゼの真正の 残基を再構成した。成熟形のＣ末端側が欠失した変異体の模式図を下に示す　Ｎ −２０７、第一のクリングルから後を欠失：Ｎ−３０３、第二のクリングルから 後を欠失：Ｎ−３８４、第三のクリングルから後を欠失およびα鎖。各クリング ルの欠失が導入された変異体（Δに１、Δに２、Δに３およびΔに４）も示しで ある。各場合において、これら欠失は、Ｃ１からＣ６の全クリングルを特異的に 除去する。
図２は、野性型ｒｈｕＨＧＦおよび一本鎖変異体のウェスタンプロットの結果を 示す。モノク（ｍｏｃｋ）　トランスフェクションした２９３細胞または野性型 ｒｈｕＨＧＦ　（ＷＴ）かまたは変異体Ｒ４９４Ｅ、Ｒ４９４ＡまたはＲ４９４ Ｄのいずれかを発現する安定な２９３細胞からのならし培地を８％ドデンル硫酸 ナトリウムポリアクリルアミドゲル上、還元条件下で分画し、ブロッティングし た。このプロットを、α鎖上に主として存在するエピトープを認識するポリクロ ーナル抗ＨＧＦ抗血清と反応させた。マーカーの分子量（キロダルトン）は示す 通りである。α鎖および非開裂一本鎖の形態のｈｕＨＧＦの位置も示す。該ポリ クローナル抗体は、検出し得る量のｈｕＨＧＦを発現しないコントロールのトラ ンスフェクションした２９３細胞においても存在する未同定バンド（＊）と交差 反応していることに注意すべきである。
図３・野性型（ＷＴ）ｒｈｕＨＧＦおよび一本鎖変異体のマイトジェン活性（Ａ ）および競合レセプター結合性（Ｂ）。（Ａ）実施例２に記載するように、ＷＴ ｒｈｕＨＧＦおよび変異体が初代培養におけるラット肝細胞のＤＮＡ合成を誘発 する能力により生物学的活性を測定した。代表的アッセイにおける２つのものか らの平均ｃｐｍを示す。コントロール細胞からのモノク上澄み液は、これら細胞 においてＤＮＡ合成を刺激しなかった（）＜ツクグラウンドレベルを越えるＣｐ ｍの増加なし）。（Ｂ）競合結合を行うため、実施例２に示すように、ｗｔ　ｒ ｈｕＨＧＦまたは変異体を含有するヒト２９３細胞の種々の希釈の上澄み液を５ ０ｐＭのｈ　ｕ　ＨＧ　Ｆレセプター−１ｇＧ融合タンパク質とともにインキュ ベートした。
データは、代表的実験からの競合リガンドのノく−セントとして結合の押部１を 示し、コントロール２９３細胞からのバックグラウンド値を差し引くことにより 補正した。
図４・野性型ｒｈｕＨＧＦ、一本鎖またはプロテアーゼドメインｈｕＨＧＦ変異 体によるＨＧＦレセプターの１４５ｋＤａ　βサブユニツト上の１ノガンド誘発 されたチロフンリン酸化のウェスタンプロット。２００ｎｇ／ｍＬの精製ｗｔｒ ｈｕＨＧＦ　（ＷＴ）　、一本鎖（Ｒ４９４Ｅ）または二重プロテアーゼ変異体 （Ｙ６７３Ｓ、Ｖ６９２Ｓ）の不在下（−）またはこれらとととも（二５分間イ ンキュベートしたＡ３４９細胞からの溶解液を調製し、抗ＨＧＦレセプター抗体 で免疫沈降さ上杭ホスホチロフン抗体でブロッティングした。分子量（キロダル トン）は示す通りである。
図５　：　ＨＧＦ−１ｇＧキメラの発現および提唱された構造。
八　還元条件下での５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動。
Ｂ　非還元条件下での５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動。レーンＭ、コントロール （モノク）２９３細胞、レーン１　：ＮＫ２−１ｇＧ　、レーン２：ＨＧＦ−１ ｇＧ：レーン３：Ｙ６７３Ｓ、Ｖ６９２Ｓ−１ｇＧ、レーン４　：Ｒ４９４Ｅ　 ＨＧＦ−ｇＧ０ Ｃ，ＨＧＦ変異体−１ｇＧキメラの提唱された構造。
図６　競合結合アッセイ。野性型ｒｈｕＨＧＦおよび種々のｈｕＨＧＦ変異体− ＩｇＧキメラを発現する２９３細胞の細胞培養上澄み液を、２９３細胞力１ら発 現および分圧・された、ヒトＩｇＧ−１のＦｃ定常領域１こ融合しｔこヒトＨＧ Ｆｒの細胞外ドメインへのＣＨ○細胞により発現されｔこ１２Ｊ　ｒｈｕＨＧＦ の結合を阻止する能力について試験した。
１１Ｎ７　：　３８−チミジン取り込みアッセイ。野性型ｒｈｕＨＧＦおよび種 々のｒｈｕｔ−［ＧＦ変異体−１ｇＧキメラを発現する２９３細胞からのならし 培地を、３Ｈ−チミジン取り込みアッセイにおいてマイトジェン効果について試 験した。
モソク　コントロール２９３細１１ｍ。
図８　発現プラスミドｐｆ−ＮＫＩの概略図。ＨＧＦ／ＮＫＩの細菌発現のため 、発現タンパク質のペリブラスム間隙への分泌を指令する５ｔ１１リーダーペプ チドをコードする配列に隣接してアルカリホスファターゼプロモーター（ｐｈ。
Ａ）を含有する発現プラスミドを用いた。発現および精製工程を追跡するため、 Ｆｌａｇエピトープをコードする配列を含ませた。このＦｌａｇ配列の後に、図 示するように、成熟ＨＧＦ／ＮＫＩをコードする配列（斜線部分）が続いていた 。
ｓｔｌ＋リーダー、Ｆｌａｇエピトープ（イタリック）およびＨＧＦ／ＮＫ１部 分（Ｎ末端およびＣ末端、太字部分）の対応ＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示 す。
図９・ＨＧＦ／ＮＫＩの精製のフローチャートおよびＦＰＬＣモノＳカチオン交 換クロマトグラフィーによるヘパリン−セファ０−スプールの分画化。ＮａＣ１ の勾配でヘパリン−セファロースカラムから溶出したタンパク質を２０ｍＭ酢酸 ナトリウム（ｐＨ６，０）　、０．２５Ｍ　ＮａＣ］に対して透析し、この溶液 の一部を同緩衝液で平衡化したＦＰＬＣモノＳカチオン交換カ交換カラ賃上した 。結合したタンパク質を溶出するのに０．２５Ｍ〜１．５Ｍ　ＮａＣ１の直線勾 配を用い、約１．５ｍｌのフラクションを回収した。２８０ｎＭにおける吸光度 を示す。
フラクション６〜９をプールし、さらに実験するために用いた。
図１０：ＨＧＦ／ＮＫＩの粗製の細菌抽出物および精製試料の５ＤＳ−ＰＡＧＥ 分析。マーカーの分子量（キロダルトン、ｋＤａ）を各ゲルの左側に示し、ＨＧ Ｆ／ＮＫＩの移動位置を右側に示す。（Ａ）非誘発細胞からの全細胞溶解液（レ ーン１）およびリン酸飢餓によってＨＧＦ／ＮＫ１発現が誘発された細胞からの 全細胞溶解液（レーン２〜６）を示す。レーン２〜６は、それぞれ１．０ニア、 ２＋３９：６６および７２の吸光度の読み取り（５５０ｎｍ）にて回収した発酵 からの試料を示す。各試料について等量のタンパク質抽出物を還元条件下で分画 し、クマ／−染色により検出した。（Ｂ　）　ＨＧ　Ｆ　／　Ｎ　Ｋ　１発現ベ クターを含有する大腸菌２７Ｃ７細胞の粗製溶解１＆（レーン１および３）また はｐＢＲ３２２のみを含有するコントロール２７Ｃ７細胞の粗製溶解ｆ＆（レー ン２および４）のウェスタンプロット分析を、図示するように非還元条件下およ び還元条件下で分析した。
ＦＬＡＧエピトープを含有するタンパク質を実施例７に記載するようにして検出 した。（Ｃ）それぞれレーン１〜５に示すＦＰＬＣモノＳクロマトグラフィーフ ラクシヲン７〜１１を還元条件下で分析した。タンパク質を銀染色により検出し た。（Ｄ）ＦＰＬＣフラクシジン１．３．５．７．９．１１および１３（レーン １〜７）中に存在するＦｌａｇエピトープを含有するタンパク質をＩＯＢと同様 にして検出した。
図１１．精製した可溶性ＨＧＦレセプターへの（Ａ）またはＡ３４９細胞上のＨ ＧＦレセプターへの（Ｂ）ｒｈｕＨＧＦまたはＨＧＦ／ＮＫＩの存在下での［１ ２５１１１ｊｌｌ識ＨＧＦの競合結合。結合を５０ｐＭの放射性リガンドおよび 図示した１度の冷（ｃｏｌｄ）競合体の存在下で行った。非標識ｒｈｕＨＧＦ、 ＨＧＦ／ＮＫＩ、およびプラスミノーゲンの精製クリングル４（Ｋ４ｐｌａｓ） による［１２５１コ−ＨＧＦの代表的な置換曲線を示す。結合を１１００ｐの放 射性リガンドおよび図示した１度の冷競合体の存在下で行った。３つの独立した 実験から決定された解離定数（Ｋｄ）は、可溶性ＨＧＦレセプターに対してｒｈ ｕＨＧＦについて０．１０＋／−０，０２ｎ〜１およびＨＧＦ／ＮＫＩについて １．１０＋／−０，０４ｎＭ　（Ａ）　、およびＡ３４９細胞上のレセプターに 対してｒｈｕＨＧＦについて０．２１＋／−０，０４％ＭおよびＨＧＦ／ＮＫＩ について１６０＋／−０，０８％Ｍであった（Ｂ）。
図１２．野性型ｒｈｕＨＧＦ　（Ａ）および精製ＨＧＦ／ＮＫＩ　（Ｂ）による ＨＧＦレセプターの１４５ｋＤａ　ｂ−サブユニット上のりガント誘発リン酸化 のウェスタンプロット。上記因子とともに１５分間インキュベートした誘発細胞 からの溶解液を調製し、抗レセプター抗体で免疫沈降させた。５ＤＳ−ＰＡＧＥ から調製したウェスタンプロットを抗ホスホチロノン抗体でプローブした。分子 量（ｋＤａ）を図示する。
図１３．初代培養における肝細胞のＤＮＡ合成に対するＨＧＦ／ＮＫＩ単独（Ａ ）またはｒｈｕＨＧＦとの組み合わせ（Ｂ）における効果。肝細胞を、増加濃度 のｒｈｕＨＧＦまたはＨＧＦ／ＮＫｌ単独（Ａ）または所定濃度のＨＧＦ　（５ ０％の３８−チロノン残基に必要なＨＧ　Ｆの量に対応する０、６４％Ｍ）を加 えた増加濃度のＨＧＦ／ＮＫＩに暴露した（Ｂ）。３つの独立した実験の代表的 曲線を示す。コントロールとして、プラスミノーゲンの精製クリングル４をＨＧ Ｆ活性の中和について試験した。
発明の詳細な記載 本発明の目的のため、「レセプター」とは、チロシンキナーゼ活性を有するレセ プター、サイトカインレセプターおよび神経成長因子レセプタースーパーファミ リーから選ばれ、レセプターのオリゴマー形成が誘発される実際のメカニズムの いかんに拘わらず、オリゴマー形成によって活性化またはシグナル伝達能（ｓｉ ｇｎａｌｉｎｇ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）が媒介される細胞表面レセプターであっ てよい。この場合、「オリゴマー形成」には詳しくは二量体形成並びに一層高度 のオリゴマーの形成が含まれる。この定義には、（ａ）ＥＧＦなどのような、細 胞外ドメイン中にコンホメーション変化を誘発し、その結果レセプター−レセプ ター相互作用を引き起こす単量体リガンド（一つのレセプター結合性ドメインを 有するリガンド）によって、（ｂ）ＰＤＧＦ、Ｃ３Ｆ−１およびｈＧＦなどのよ うな、隣接するレセプターの二量体形成を媒介する２価リガンド（２つのレセプ ター結合性ドメインを有するリガンド）によって、または（Ｃ）インスリンやＩ ＧＦ−１などのような、リガンドとジスルフィド安定化されたレセプター二量体 との相互作用およびその後の複合体内のコンホメーション変化によって、通常活 性化される細胞表面レセプターが含まれる。この定義によって特に包含されるの は、チロシンキナーゼ活性を有するレセプター（レセプターチロシンキナーゼ） およびヘマトポエチンレセプタースーパーファミリーおよび神経成長因子レセプ タースーパーファミリーの成員である。
「サイトカイン」とは、細胞間メディエータ−として他の細胞に対して働く一つ の細胞集団によって放出されたタンパク質の総括名称である。サイトカインに含 まれるものとしては、成長ホルモン、インスリン様増殖因子、インターロイキン 、ｈＧＨ，Ｎ−メチオニルｈ　Ｇ　ｌ−１、ウソ成長ホルモン、副甲状腺ホルモ ン、チロキノン、インスリン、プロインスリン、リラキノン、プロラクチン、濾 胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）　、および黄体形成 ホルモン（Ｌ　ｌ（）などの糖タンパク質ホルモン、造血増殖因子、１４　ＣＦ 　、繊維芽細胞増殖因子、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、腫瘍壊死因子−α および一部（ＴＮＦ−αおよび−β）、ミューラー阻害物質（ＩＩｌｕｃｌｌｃ ｒｉａｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　５ｕｂｓｔａｎｃｅ）、マウスゴナドトロピ ン結合ペプチド（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｅｐｔ ｉｄｅ）　、インヒビン、アクチビン、血管内皮増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ　 ｃｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）　、インテグリン、トロ ンボポエチン、ＮＧＦ−βなどの神経成長因子、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−αおよびＴ ＧＦ−βなどのトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）　、インスリン様増殖 因子−１および−２（ＩＣＦ−１およびＩＧＦ−２）、エリトロポエチン、骨誘 発因子（ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅ　ｆａｃｔｏｒｓ）　、インターフェロ ン（ＩＦＮ）たとえばＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−γ、コロニー刺激 因子（Ｃ３Ｆ）たとえばＭ−Ｃ３ＦＳＧＭ−Ｃ３Ｆ、およびＧ−Ｃ３Ｆ、インタ ーロイキン（ＩＬ）たとえばＩＬ−１、ＩＬ−２、Ｉ　Ｌ−３、ＩＬ−４、夏り 一５、Ｉ　Ｌ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８および他のポリペプチド因子が挙げられ る。
サイトカインレセプターは、上記サイトカインに結合するレセプターである。
「（プロティン）チロノンキナーゼ活性を有するレセプター」および「レセプタ ーチロノンキナーゼＪなる表現およびその文法上の変形は互（１１こ同じ意味で 用いられ、一般に、大きな細胞外リガンド結合性ドメイン、ノングル疎水性膜貫 域およびチロノンキナーゼ触媒ドメインを有するレセプターを（，１Ｌｓ、シュ レノンカー（１９８８）上記、およびウルリノヒおよび／ニレ／ンプｊ−（１， ９９０）上記によって定義されるように、配列の類似性および区別される構造的 特徴１こ基づいてサブクラス（現在の知見によればサブクラスＩ〜■）に分類す ることカベできる。未知の機能の他の高度に保存された配列のうち、これらレセ プターのチロノンキナーゼドメインは、Ａ　Ｔ　Ｐへの結合部位の一部として機 能−１−る共通配グ１ｊＧ　ｌ　ｙ−Ｘ−Ｇ　Ｉ　Ｙ−Ｘ−Ｘ−Ｇ　Ｉ　Ｙ−Ｘ 　（１５〜２０）Ｌｙｓ　を含有する。
レセプターチロノンキナーゼは、それ自体のポリペプチド鎖内のチロノン残基と 同様に外来基質のリン酸化を触媒する。このファミリーには、インスリンレセプ クー（インスリン−Ｒ）、上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦ−Ｒ）　、血小板由 来増殖因子レセプターＡおよびＢ　（Ｐ　Ｄ　Ｇ　Ｆ　−Ｒ−Ａおよび−Ｂ）、 インスリン様増殖因子レセプター（ｊＧＦ−１−Ｒ）　、コロニー刺激因子ルセ プタ−（ＣＳＦ−１−Ｒ）、肝細胞増殖因子レセプター（ＨＧＦｒ）　、ＨＥＲ ２／ｎｅｕ。
１（ＥＲ３／ｃ−ｅ　ｒｂＢ−３、ＩＲＲＳＸｍｒｋおよび酸性繊維芽細胞増殖 因子（ＦＧＦ）および塩基性ＦＧＦのレセプター（ｆｉｇおよびｂｅｋと称する ）が含まれる。オリゴマー形成メカニズムは、構造的に非常に類似したレセプタ ー、たとえばＰＤＧＦ−Ｒ−Ａと−Ｂ、ＥＧＦ−ＲとＨＥＲ２／ｎｅｕ、または インスリン−ＲとＩＧＦ−１−Ｒとの間でのハイブリッド複合体の存在の可能性 を暗示している［ハマチャーら（１９８９）上記；スーズ（Ｓｏｏｓ、　Ｍ、Ａ 、）および７ノドル（Ｓｉｄｄｌｅ、Ｋ、）　、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ　λ旦旦 、５５３〜５６３　（１９８９）コ。
Ｅ　Ｇ　Ｆ　−Ｒは、１価リガンドによって活性化されるサブクラスルレセプタ ーチロノンキナーゼのモデルとして扱うことができる。ＥＧＦ−Ｒは、大きな細 胞外リガンド結合性ドメイン、ノングル疎水性膜貫通領域、および内因性のブロ テイノチロノンキナーゼ活性を有する細胞質領域からなる約１７０．０００ｋＤ の一本鎖ポリペプチドである［ウルリソヒら、Ｎａｔ凹ｒｅ３０９．４１８〜４ ２５（１９８４）］。ヤヤーンおよびンユレフンガー［Ｂｉｏｃｈｅｍｊｓｔｒ ｙ　２６．１４３４〜１４ｉ１２　（１９８７）　；　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ　２４．１４４３〜１４５１　（１９８７）］は、哨製ＥＧＦ−Ｒが迅速で可 逆的なＥＧＦ誘発オリゴマー形成を行うこと、およびレセプターのオリゴマー形 成がＥＧＩ’−Ｒの内因性特性であることを示した。
同様の結果は、コノエツトら［Ｊ　、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ　λ旦１．３２９ ０〜３２９５　（１９８８）］によって生細胞においても得られた。初期の構造 −機能研究およびＥＧＦレセプターの精製細胞外ドメインの電子顕微鏡による特 徴付けからの最初のデータに基づき、ＥＧＦレセプターの細胞外部分の組織化に ついての４−ドメインモデルがウルリノヒおよびノユレノンガー（１９９０）上 記によって提唱されたうこのモデルにおいて、「ドメイン■」および「ドメイン ■」が、レセプターがそのリガンド（ＥＧＦまたはトランスフォーミング成長因 子−α（ＴＧＦ−α）など）と特異的に相互作用することを可能とする決定基の 大部分を構成ことが提唱され、ＥＧＦ結合性領域がドメイン■とドメインＩとの 間に形成される裂は目に存在することが示唆された。ＨＥＲ２／ｎｅｕ［リ−（ Ｌｅｅ、Ｊ、）ら、９１９３〜９１９７　（１９８９）］およびＸｍｒｋ［ウィ ットブ０７ト（Ｗｉｔｔｂｒｏｄｔ、　Ｊ　、　）ら、Ｎａｔｕｒｅ　３４１． ４１５〜４２１　（１９８９）］はこのサブクラスに属する。
サブクラス■レセブターチロフンキナーゼの代表例はインスリン−Ｒおよび４５ 　（１９８４）ニレヒラ−（Ｒｅｃｈｌｅｒ、　Ｍ、　Ｍ、　）およびニスレイ （Ｎｉｓｓｌｅｙ、　Ｓ。
７６〜１１８５　（１９８８）；モーガン（Ｍｏｒｇａｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ旦 λ旦、３０７１〜３０７２　（１９８７）Ｅ。ヘテロ四量体構造を有する［う７ 　（Ｌ　ａＩｌｌｍｅｒ。
ンド結合は、ジスルフィド架橋により安定化したレセプター複合体内の２つのα β半分のアロステリンク相互反応を誘発する［ウルリッヒ（１９９０）、上記］ 。
このサブクラスにはまた、インスリンファミリーのリガンドに対する推定レセプ ターであるＩＲＲが含まれる［シア（Ｓｈｉｅｒ、Ｐ、）およびワット（Ｗａｔ ｔ、　ＶｏＭ、　）、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６４　、１４６０５〜１４６ ０８　（１９８９）　コ　。
サブクラス■レセプターチロ／ンキナーゼは、隣接するレセプターの二量体形成 を媒介する二量体リガンドに結合する。このサブクラスは、ＰＤＧＦ−Ａおよび −Ｂのレセプター、およびＣ３Ｆ−１のレセプターによって代表される。ヒトＰ ＧＤＦは、ジスルフィド結合したＡ鎖およびＢ鎖からなる３つのイソ形として存 在する。これらイソ形は、２つの異なるが構造的に関連した細胞表面レセプター ：　ＰＧＤＦ−Ｒ−ＡおよびＰＧＤＦ−Ｒ−Ｂに結合する。八−タイプのレセプ ターは３つのすべてのイソ形（ＰＧＤＦ−ＡＡ、ＰＧＤＦ−ＡＢおよびＰＧＤＦ −ＢＢ）に結合するが、一方、Ｂ−タイプのレセプターはＰＧＤＦ−ＢＢおよび ＰＧＤＦ−ＡＢにしか結合しない。ＰＤＧＦは、二量体形成することによってそ のレセプターを活性化する２価リガンドであることが示唆されており［ハマチャ ーら、ＥＭＢＯＪ、旦、２４８９〜２４９５　（１９８９）］　、二量体形成が リガンド結合後に起こることおよびレセプターキナーゼ活性化と密接に関連する ことが示されている［ヘルプイン（Ｈｅｌｄｉｎ、　Ｃ−Ｈ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ 、Ｃｈｅｍ、２６４．８９０５〜８９１２　（１９８９）］。
チロ／ンキナーゼレセブターのサブクラス■には、最近記載された酸性ＦＧＦの レセプター（ＦＧＦ−Ｒｆ　Ｉ　ｇ）および塩基性ＦＧＦのレセプター（ＦＣＦ Ｂ、）およびノンガー（Ｓｉｎｇｅｒ、　Ｓ、　Ｊ、）　、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ旦６．５４４９〜５４５３　（１９８９）　、お よびその引用文献］。これらレセプターは、その細胞外ドメイン中に３つの関連 する配列繰り返しを示し、ＩＬ−ルセブターの対応領域に対して弱いが有意の相 同性を示す。
「ヘマトポエチンレセプタースーパーファミリー」なる表現は、活性化リガンド に結合する細胞外ドメイン、短い縁膜切片、および細胞質中に存在するドメイン の３−ドメイン構造を有するシングル−バス（ｓｉｎｇｌｅ−ｐａｓｓ）縁膜レ セプターを定義するものとして用いる。これらレセプターの細胞外ドメインは、 約２００〜２１０アミノ酸からなる細胞外リガンド−結合性ドメイン内に低いが 有意の相同性を有する。この相同領域は、該領域のＮ末端側半分に位置する４つ のシスティン残基、および膜貫通ドメインのすぐ外側に位置するＴ　ｒ　ｐ−３ ｅ　ｔ−Ｘ　−Ｔ　ｒ　ｐ−５ｃ　ｒ　（ＷＳＸＷＳ）モチーフを特徴とする。
これらレセプターの構造的および機能的な一層の詳細はニスマンら（１９９０） 上記によって提供される。
たとえば、ＩＬ−１、［１，−２，１１−３、Ｉ　Ｌ−４、！Ｌ−５、ＩＬ−６ 、Ｉ　Ｌ−７、プロラクチン、胎磐性ラクトゲン、成長ホルモン、ＧＭ−Ｃ３Ｆ 、Ｇ−Ｃ９Ｆ、Ｍ−Ｃ３Ｆおよびエリトロポエチンのレセプターはこのレセプタ ーファミリーの成員として同定されている。
ＩＬ−２レセプターのｌ−２に誘発されたオリゴマー形成は、たとえばオグラ（ ○ｇｕｒａ、　Ｔ、　）ら、Ｍａｔ、　Ｂｉｏｌ、Ｍｅｄ、５．１２３〜１３　 （１９８８）に報告されている。彼らは、！Ｌ−２のそのレセプターに対する高 親和性結合が、ＩＬ−２レセプターα−サブユニット（ｐ５５）、β−サブユニ ット（ｐ７５、ｒコンバーター（ｃｏｎｖｅｒｔｅｒ）とも呼ばれる」）、およ びＩＬ−２からなる３量複合体を化学的架橋によって生成させること示した。単 一のｈＧＨ分子によるｈＧＨ−Ｒの細胞外ドメインの二量体形成がｈＧＨレセプ ターおよび他の関連するサイトカインレセブターのノブナル伝達メカニズムに関 係が深いことがカニンガムら（１９９１）上記によって提唱された。
「神経成長因子レセプター（ＮＧＦＲ）スーパーファミリー」なる表現は、シス ティンに富むモチーフ（低親和性ＮＧＦＲ中で最初に同定された）の存在によっ て定められる膜タンパク質のファミリーを記載するのに用いる。マレ・ソトおよ びバークレイ上記によって最初に記載されたこのスーパーファミリーには、腫瘍 壊死因子の２つのレセプター（ＴＮＦＲ−１およびＴＮＦＲ−Ｉ［）および未だ 機能が決定されていない２つのリンパ球タンパク質が含まれる。
本明細書および請求の範囲において使用する「第一のレセプター」および「第二 のレセプター」なる語は、リガンドによって誘発されたレセプターの活性化の結 果としてインビボでヘテロオリゴマー（ヘテロニ量体）を形成することができる レセプターを示すものとして用いる。そのようなレセプターは、通常、類似の（ 好ましくは同一の）細胞タイプ上に位置し、構造的相同性を示すが、必ずしもそ の必要はない。特定の聾様において、第一のレセプターおよび第二のレセプター は、その活性ドメインにおいて少なくとも約７５％の相同性、好ましくは少なく とも約８０％の相同性、さらに好ましくは少なくとも約８５％の相同性を示し、 好ましくは生理学的機能も類似している。これまで、たとえばＰＧＤＦ−Ｒ−Ａ および−Ｂ、ＥＧＦ−ＲおよびＨＥＲ２／ｎｅｕ、またはインスリン−Ｒおよび ＩＧＦ−１−Ｒなどのレセプター間でヘテロ−レセプター複合体が存在するかも しれないことが言われていた。ヒト染色体３（３ｐ２１）上のＤＮＦ１５Ｓ２遺 伝子座上で最近同定された遺伝子［ハン（Ｈａｎ、　Ｓ、）ら、Ｂ　１ｏｃｈｅ ＋畦銭α旦旦、９７６８〜９７８０　（１９９１）］によってコードされるＨＧ ＦおよびＨＧＦ一様タンパク質のレセプターも、ヘテロ−二量体形成の候補であ る。２つのレセプター間でのへテロニ量体形成は、分析化学の標準法、たとえば 非変性ゲル電気泳動によって検出することができる。好ましい方法において、こ れらレセプター間の相互作用は、共有結合架橋剤を利用することによって、とり わけＥＧＦ−Ｈについてコンエツトら（１９８８）上記によって記載されている ようにして、安定化することができ、共有結合し架橋したレセプターはＳＤＳゲ ル−電気泳動によって分析することができる。
「リガンド」なる語は、上記レセプターに特異的に結合することができる有機分 子、またはペプチドもしくはポリペプチド配列を意味するものとして用いる。
この定義には、レセプターに対するあらゆる天然のリガンドまたは少なくとも定 性的なレセプター結合能を保持しているその領域または誘導体が含まれる。この 定義から特に排除されるのは、レセプターに対する（アゴニストおよびアンタゴ ニスト）抗体および抗体と該抗体に対する抗原との非共宵結合体である。
本発明に従って使用する分子において、第一のリガンドおよび第二のリガンドは 同一かまたは異なっていてよく、天然の２価リガンドからの２つの異なるレセプ ター結合性ドメイン、または少なくとも同じかまたは２つの異なるレセプターに 対する２つの同一または異なるリガンドからのレセプター結合性ドメイン、およ びそのような天然のレセプター結合性配列の誘導体を含む。構造的および／また は機能的に類似のレセプター間に／％イブリッド複合体がオリゴマー形成活性化 メカニズムの一部として存在するかもしれないことが提唱されている。そのよう なレセプターは、たとえば、Ａ−タイプおよびＢ−タイプのＰＤＧＦレセプター 、ＥＧＦ−ＲおよびＨＥＲ２／ｎｅｕ、インスリン−ＲおよびＩＧＦ−１−Ｒで ある。幾つかの場合には、ヘテロニ量体形成はすでに示されている［ハマチャー ら（１９８９）上記、スーズおよびンッドル（１９８９）上記］。そのような密 接に関連したレセプターに対するリガンドのレセプター結合性ドメインからなる 分子は、特に本発明の範囲に包含される。
「誘導体」なる語は、アミノ酸配列および糖付加変異体、および天然リガンドの 共有結合修飾を定めるものとして用いる。
「変異体」なる語は、天然りガントのアミノ酸配列および糖付加変異体を定める ものとして用いる。
「天然リガンド」および「野性型リガンド」なる語は互いに同じ意味で用い、天 然に存在するりガントアミノ酸配列を指し、天然採取源から精製した、化学的に 合成した、または組換えにより製造したそのようなリガンドの成熟、プレープロ およびプロ形態を含む。各個体のアミノ酸配列における１または２以上のアミノ 酸の相違によって示されるように、天然の対立遺伝子変異が存在し、個体間で起 こり得ることが理解されるであろう。これら対立遺伝子変異は本発明の範囲に特 に包含される。
「アミノ酸」とは、天然に存在するすべてのし一α−アミノ酸をいう。アミノ酸 は、１文字または３文字表示のいずれかにより同定される：Ａｓｐ　Ｄ　アスパ ラギン酸 Ｇｌｕ　Ｅ　グルタミン酸 Ｍｅｔ　Ｍ　メチオニン ｌｉｅ　Ｉ　イソロイノン Ｐｈｅ　Ｆ　フェニルアラニン Ｈｉｓ　Ｈヒスチジン ＴｒｐＷ　トリプトファン Ｇｌｎ　Ｑ　グルタミン Ａｓｎ　Ｎ　アスパラギン これらアミノ酸は、化学組成および側鎖の特性に従って分類することができる。
アミノ酸は、荷電したものと荷電していないものとの２つのグループに大きく分 けることができる。これら各グループをさらにサブグループに分けてアミノ酸を 一層正確に分類する。
■、荷電アミノ酸 酸性残基：アスパラギン酸、グルタミン酸「アミノ酸配列変異体」なる語は、リ ガンドの天然の配列に比べてそのアミノ酸配列に幾つかの相違を有する分子を意 味する。通常、アミノ酸配列変異体は、天然のリガンドの少なくとも一つのレセ プター結合性ドメインと少なくとも約７０％の相同性を有し、好ましくは、天然 のリガンドのレセプター結合性ドメインと少なくとも約８０％、一層好ましくは 少なくとも約９０％の相同性を有するであろう。アミノ酸配列変異体は、天然の りガントのアミノ酸配列内のどこがの位置に、置換、欠失、および／または挿入 を有する。
「相同性」は、配列を並べ、最大の相同性パーセントを得るために必要ならギヤ ノブを導入した後、候補アミノ酸配列中において天然のりガントのレセプター結 合性ドメインのアミノ酸配列中の残基と同一の残基のパーセントとして定義され る。整列のための方法およびコンピュータープログラムは、当該技術分野におい てよく知られている。
置換変異体とは、天然の配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、そ の同じ位置に異なるアミノ酸が挿入されたものである。置換は、該分子中の１の みのアミノ酸が置換されている場合には単一（ｓｉｎｇｌｅ）であり、同分子中 で２またはそれ以上のアミノ酸が置換されている場合には複数（ｍｕｌｔｉｐｌ ｅ）である。
挿入変異体とは、天然のりガント配列中の特定位置におけるアミノ酸のすぐ隣に 挿入された１または２以上のアミノ酸を有するものである。アミノ酸のすぐ隣と は、該アミノ酸のα−カルボキシルまたはα−アミノ官能基のいずれかに結合し ていることを意味する。
欠失変異体とは、天然のりガントアミノ酸配列中の１または２以上のアミノ酸が 除去されているものである。通常、欠失変異体は該分子の特定領域中の１または ２のアミノ酸が欠失しているであろう。
「糖付加変異体」なる語は、天然リガンドとは異なる糖付加プロフィルを有する リカノドを指すものとして用いる。ポリペプチドの糖付加は、一般に、Ｎ−結合 または〇−結合のいずれかである。Ｎ−結合とは、アスパラギン残基の側鎖への 炭水化物残基の伺加をいう。アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ −トレオニン（式中、Ｘはプロリン以外のすべてのアミノ酸である）で示される トリペプチド配列は、該アスパラギン側鎖への炭水化物残基の酵素的付加のため の認識配列である。〇−結結合付付加は、糖類のＮ−アセチルグルコサミン、カ ラクトースまたはキノロースの一つがヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセ・ ノンまたはトレオニン（こ１４加することをいうが、５−ヒドロキシプロリンま たは５−ヒドロキシリノンも〇−結結合付付加関与する。天然の対応物と比較し てリカノド中に存在する炭水化物残基の位置および／または性質におけるあらゆ る相違が本発明の範囲に包含される。
天然のりガントの糖付加パターンの決定は、ＨＰＡＥクロマトグラフィー［ハー プイー　（Ｈａｒｄｙ、　Ｍ、　Ｒ，）　ら、Ａｎａｌ、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ　 よヱ旦、５４〜６２　（１９８８）コ、グリコジル結合組成を決定するためのメ チル化分析［リンドバーグ９８３）］、ＮＭＲ分光分析、買置分光分析などを含 む、分析化学のよく知られた方法により行うことができる。
簡単のため、天然のリガンドの糖付加パターンの変化は、とりわけアミノ酸配列 変異体に関して上記で記載した方法を用い、通常、ＤＮＡレベルで行う。
本発明のりガントへのグリコンドの化学的または酵素的カンプリングもまた、炭 水化物置換基の数またはプロフィルを修飾または増加させるのに用いることがで きる。これら手順は、〇−結合（またはＮ−結合）糖付加し得るポリペプチドを 製造する必要がないという点で有利である。使用したカップリング様式に依存し て、糖は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離のカルボキシル基、 （Ｃ）ンステインの遊離のヒドロキシル基などの遊離のヒドロキシル基、（ｄ） セリン、トレオニンまたはヒドロキシプロリンの遊離のスルフヒドリル基などの 遊離のスルフヒドリル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロノンまたはトリプトフ ァンの芳香族残基などの芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合 させることができる。これら方法は、ＷＯ８７１０５３３０（１９８７年９月Ｊ １日公開）、およびアブリン（Ａｐｒｉｎ）およびリストン（Ｗｒｉｓｔｏｎ） のＣＲＣＣｒｉｔ、Ｂｉｏｃｈｅ＋ｎ、２５９−３０６頁に記載されている。
リガンド上に存在する炭水化物残基はまた、化学的または酵素的に除去すること ができる。化学的脱糖付加には、トリフルオロメタンスルホン酸または等価な化 合物にＫＮすることを要する。この処理の結果、結合糖（ｌｉｎｋｉｎｇｓｕｇ ａｒ）以４は殆どまたはすべての糖が開裂され、ポリペプチドは完全なままで残 される。
化学的脱糖付加は、ハキムノン（ＨａｋｉｌＩＩｕｄｄｉｎ）ら、Ａ　ｒｃｈ、 　Ｂ　ｉｏｃｈｅｗ、　Ｂ　１ｏｐｈｙｓ２５９．５２　（１９８７）およびア ミノ（Ｅｄｇｅ）ら、Ａｎａｌ、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ　１１８゜１３１　（１９ ８１）に記載されている。炭水化物残基の除去は、トタクラ（Ｔ　ｈｏｔａｋｕ ｒａ）らのＭＣｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ　よ１旦、３５０　（１９８７）に記載 にされているように、種々のエンドグリコ／ダーゼおよびエキソグリコンダーゼ により行うことができる。糖付加は、ダスキン（Ｄｕｓｋｉｎ）らのＪ、Ｂｉｏ ｌ、Ｃｈｅｍ、２旦１１３１０５　（１９８２）に記載されているように、ツニ カマイシンによって抑制される。ツニカマイシンは、タンパク質−Ｎ−グリコノ ダーゼ結合の形成を阻害する。
本明細書におけるリガンドの付け加変異体はまた、適当な宿主細胞を選択するこ とによって製造することができる。たとえば、酵母は哺乳動物系とは有意に異な る糖付加を導入する。同様に、リガンドの採取源とは異なる種（たとえば、ハム スター、マウス、昆虫、ブタ、ウシまたはヒツジ）または組織（たとえば、肺、 肝臓、リンパ球、間充織または表皮）の哺乳動物細胞を、変異体糖付加を導入す る能力について日常的にスクリーニングできる。
「リガンド変異体」および「変異体リガンド」なる語は相互に同じ意味で用いら れ、天然のリガンドのアミノ酸配列変異体および付け加変異体の両方を含む。
「共有結合誘導体」には、有機のタンパク質性または非タンパク質性の誘導体化 剤による天然のりガントの修飾、および翻訳後修飾が含まれる。共有結合修飾は 、爾来、選択された側鎖または末端残基と反応することができる有機誘導体化剤 にリガンドの標的アミノ酸残基を反応させるか、または選択された組換え宿主細 胞中で機能する翻訳後修飾の機構を利用することによって導入されている。得ら れた共有結合誘導体は、生物学的活性にとって、イムノアッセイにとって、また は組換え糖タンパク質のイムノアフィニティー精製のための抗リガンド抗体の調 製にとって重要な残基の同定に向けられた計画において有用である。そのような 修飾は当該技術分野における通常の技術の範囲内であり、不当な実験を行うこと なく行うことができる。ある種の翻訳後修飾は、発現されたポリペプチドに対す る組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミンおよびアス／（ラギン残基は 、しばしば翻訳後に脱アミド化されて対応グルタミン酸およびアスノくラギン酸 に変えられる。別法として、これら残基は、穏やかな酸性条件下で脱アミド化さ れる。
これら残基のいずれの形態も、本発明に従って用いるリガンド中に存在していて よい。他の翻訳後修飾としては、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリ ンまたはトレオニン残基のヒドロキシル化のリン酸化、リシン、アルギニンおよ びヒスチジン側鎖のα−アミン基のメチル化が挙げられる［クレイトン（Ｔ、　 Ｅ。
Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ）　、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　：　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ 　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、フリーマ：／　（Ｗ、　Ｈ，Ｆ 　ｒｅｅｍａｎ　＆　Ｃｏ、　）　、サンフランシスコ、７９〜８６頁（１９８ ３）］共有結合誘導体には、とりわけ、本発明のリガンドが非タンパク質性ポリ マーに共有結合した融合分子が含まれる。非タンパク質性ポリマーは、通常、親 水性合成ポリマー、すなわち天然では他の仕方では認められないポリマーである 。しかしながら、天然から単離されるポリマーがそうであるように、天然に存在 し組換えまたはインビトロ法で製造されるポリマーが有用である。親水性ポリビ ニルポリマー、たとえばポリビニルアルコールおよびポリビニルピリロドンはこ の発明の範囲に包含される。特に有用なのは、ポリエチレングリコール、ポリプ ロピレングリコールなどのポリビニルアルキレンエーテル類である。
リガンドは、米国特許第４．６４０．８３５　；　４．４９６．６８９　；　４ ．３０１．１４４＋４．６７０．４１７；４．７９１．１９２または４．１７９ ，３３７に記載されているような仕方で、ポリエチレングリコール、ポリプロピ レングリコールまたはポリオキシアルキレン類などの種々の非タンパク質性ポリ マーに結合させることができる。
本発明に従ってレセプターを活性化することができる天然のリガンドおよびその 誘導体は、当該技術分野でよ（知られており、または当該技術分野で公知の方法 により製造することができる。
本発明の実施可能性を、まずＨＧＦｒ／ＨＧＦベアまたはＨＧＦ変異体／リガン ドベアについて示した。ＨＧＦは、最初は肝細胞に対するマイトジェンとして同 定された［ミカロブーロス（Ｍｉｃｈａｌｏｐｏｕｌｏｓ）ら、Ｃａｎｃｅｒ　 Ｒｅｓ、４迭、４４１４〜４４１９　（１９８４）；ラッセル（Ｒｕｓｓｅｌ） ら、Ｊ　、　Ｃｅ１１．　Ｐｈｙｓｉｏｌ土上旦、１８３−１９２　（１９８４ ）およびナカムラ（Ｎａｋａｉｕｒａ）ら、Ｂ　ｉｏｃｈｅｍら（上記）は、部 分的に肝切除したラットの血清からのＨＧＦの精製を報告した。
その後、Ｉ−Ｉ　ＣＦはラットの血小板から精製され、そのサブユニット構造が 決定された［ナカムラら、Ｐ　ｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　Ｕ 　ＳＡ、旦旦、６４８９〜６４９３　（１９８６）；およびナカムラら、ＦＥＢ Ｓ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２２４．３１１〜３１６（１９８７）ｌｏヒト血小板から のヒトＨＧＦ　（ｈｕＨＧＦ）の精製は、ゴーダ（Ｇｏｈｄａ）らによって最初 に記載された［Ｊ、Ｃ１１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、８ユ、４１４〜４１９（１９８ ８）コ。
う、トＨＧＦおよびｈｕＨＧＦの両方とも分子的にクローニングされており、そ れにはｒｄｅｌｔａ５　ＨＧＦＪと称する５つのアミノ酸が欠失した天然に存在 する変異体のクローニングおよび配列決定も含まれるしミャザワ（Ｍｉｙａｚａ 冒ａ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、ＢｉｏｐｈｙＳ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、１旦旦、９６ ７〜９７３　（１９８９）；ナカムラら、Ｎａｔｕｒｅ　３４２．４４０〜４４ ３　（１８８９）：セキ（Ｓ　ｅｋｉ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、ａｎｄ　Ｂｉｏｐ ｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、１７２．３２１〜３２７　（１９９０）； タンｏ　（Ｔａｓｈｉｒｏ）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　Ｕ　Ｓ　Ａ　８ヱ、３２００〜３２０４　（１９９０）：オカノマ（Ｏｋａ ｊｉｍａ）ら、Ｅｕｒ、　Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ　工９３．３７５〜３８１ （１９９０）コ。
成熟形態のｈｕＨＧＦ　代ト血清から精製された主要形態に対応する）は、ヒト プロホルモンをアミノ酸Ｒ４９４とＶ２Ｏ３との間でタンパク質加水分解開裂し て得られるジスルフィド結合したヘテロニ量体である。この開裂工程により、４ ４０アミノ酸のαサブユニット（Ｍｒ６９ｋＤａ）と２３４アミノ酸のβサブユ ニット（Ｍｒ３４ｋＤａ）とからなる分子が得られる。ｈｕＨＧＦ　ｃＤＮＡの ヌクレオチド配列は、α鎖およびβ鎖の両方ともプレプロ前躯体タンノ（り質を コードする単一の読み取り枠中に含まれることを明らかにしている。成熟ｈＨＧ Ｆの予測された一次構造において、鏡開Ｓ−８架橋は、α鎖のＣｙｓ４８７とβ 鎖のＣｙｓ６０４との間で生成される（ナカムラら、Ｎμ巴四、上記を参照）。
α鎖のＮ−末端にはメチオニン基で始まる５４アミノ酸が先行してし）る。この 部分には、３１残基の特徴的な疎水性リーダー（シグナル）配列およびプロ配７ １１カベ含まれる。α鎖はアミノ酸５５から開始され、４つのクリングルドメイ ンを含む。
クリングル１ドメインは、α鎖のおよそアミノ酸１２８からおよそアミノ酸２０ ６にわたり、クリングル２ドメインはおよそアミノ酸２１１とおよそアミノ酸２ ８８との間であり、クリングル３ドメインはおよそアミノ酸３０３からおよそア ミノ酸３８３にわたるものと定義され、クリングル４ドメインはおよそアミノ酸 ３９１からおよそアミノ酸４６４にわたる。種々のクリングルドメインの定義は 他のタンパク質（プロトロンビン、プラスミノーゲン）のクリングル一様ドメイ ンとの相同性に基づくものであり、それゆえ、上記制限はおおよそのものである ことが理解されるであろう。現在までのところ、これらクリングルの機能は決定 されていない。ｈｕＨＧＦのβ鎖は、セリンプロテアーゼの触媒ドメインと高い 相同性を示す（プラスミノーゲンセリンプロテアーゼドメインに対して３８％の 相同性）。しかしながら、セリンプロテアーゼの触媒３つ組残基を形成する３つ の残基のうち２つはｈｕＨＧＦにおいて保存されていない。それゆえ、セリンプ ロテアーゼ様のドメインにも拘わらず、ｈＨＧＦはタンパク質加水分解活性は有 していないと思われ、β鎖の正確な役割は未だわかっていない。ＨＧＦには４つ の推定糖付加部位が含まれ、これらはα鎖の２９４位および４０２位およびβ鎖 の５６６位および６５３位に位置する。
ヒト白血球から単離したｃＤＮＡの一部において、インフレームの１５塩基対の 欠失が観察された。該ｃＤＮＡ配列のＣＯ３−１細胞中での一過性発現により、 クリングル１ドメイン中の５アミノ酸を欠失したコードＨＧＦ分子（ｄｅｌｔａ ５　ＨＧＦ）は完全に機能性であることが明らかとなった（セキら、上記）。
最近、成１！！１ｈｕＨＧＦのＮ−末端のフィンガーおよび最初の２つのクリン グルドメインのコード配列を含有する別のスプライス形態であるｈｕＨＧＦ転写 物に対応する天然に存在するｈｕＨＧＦ変異体が同定された［チャン（Ｃｈａｎ ）ら、称する）は、成熟ｈｕＨＧＦの競合アンタゴニストであると提唱されてい る。
ラットＨＧＦのアミノ酸配列をｈｕＨＧＦのアミノ酸と比較すると、２つの配列 が高度に保存されており、同じ特徴的な構造特性を有することがわかった。ラツ トＨＧＦにおける４つのクリングルドメインの長さはｈｕＨＧＦにおけるものと 全く同じである。さらに、ノステイン残基は全（同じ部位に位置しており；類似 の３次構造を有することを示している（オカノマら、上記；タン口ら、上記）。
本明細書において使用する「肝細胞増殖因子」、ｒＨＧＦＪおよびｒｈｕＨＧＦ Ｊなる語は、野性型の（ヒト）ＨＧＦのレセプターに特異的に結合することので きる（ヒト）増殖因子を指し、該増殖因子は一般に６つのドメイン（フィンガー ドメイン、クリングル１ドメイン、クリングル２ドメイン、クリングル３ドメイ ン、クリングル４ドメイン、およびセリンプロテアーゼドメイン）を有する構造 を有するが、にもかかわらず定性的なＨＧＦレセプター結合能を保持しているな らば、もっと少ないドメインを有していてもよいし、またはそのドメインの幾つ かを繰り返し有していてもよい。この定義には、とりわけ、セキら（上記）によ って開示されたｄｅ　ｌ　ｔａ５　ｈｕＨＧＦが含まれる。「肝細胞増殖因子」 およびｒＨＧＦＪなる語はまた、あらゆる非ヒト動物種からの肝細胞増殖因子、 とりわけラットトＩＣＦをも包含する。
「野性型ヒト肝細胞増殖因子」、「天然ヒト肝細胞増殖因子」、「野性型（ｗｔ ）ｈｕＨＧＦＪおよび「天然ｈｕＨＧＦＪなる語は、天然の配列ヒトＨＧＦ。
すなわち、ミャザワら（上記）（１９８９）またはナカムラら（上記）（１９８ ９）によって公開されたｃＤＮＡ配列によってコードされるものを指し、天然の 採取源から精製され、化学的に合成され、または組換えにより製造された、成熟 影響、プレ形態、ブレープロ形態およびプロ形態を含む。ミャザワらおよびナカ ムラらによって報告された配列は、１４のアミノ酸が異なっている。この差異の 理由は定かではない、冬型またはクローニング人為処理物が可能性として挙げら れる。両配列とも、本発明の目的のために上記で定義した術語により特に包含さ れる。各個体のアミノ酸配列における１または２以上のアミノ酸の相違によって 示されるように、天然の対立遺伝子変異が存在し、個体間で生じ得ることが理解 されるであろう。本明細書における変異体ｈ　ｕ　ＨＧ　Ｆ分子中のアミノ酸位 置は、ミャザワら（１９８９）（上記）の番号付けに従って示しである。
ＨＧＦのアミノ酸配列変異体における構造−活性相関および構造−レセブタ−結 合性相関の最近の研究において（その結果を本明細書の実施例に開示する）、リ ガンド結合性および／または活性化にとって重要なドメインが野性型ＨＧＦアミ ノ酸配列配列中定されている。β鎖かまたはβ鎖に加えて順に増加するクリング ルのいずれかを欠失させることによって、ＨＧＦの多くのＣ末端欠失体を調製し た。ＨＧＦの第一のクリングルの欠失（変異体ΔＫｌ）は、生物学的活性に最も 影響を及ぼし、少なくとも１００倍の減少を示した（ＳＡ　ｗｔ　ｒｈｕＨＧＦ のく０２％）。同様に、この変異体はｗｔ　ｈｕＨＧＦとの結合に対して競合す ることができなかったので、該変異体の結合性もまた影響を受けた。他のすべて のクリングルの欠失（変異体Δに２、Δに３またはΔに４）もまた、マイトジェ ン活性のひどい減少を誘発する。しかしながら、これら欠失変異体のレセプター 結合親和性（Ｋｄ）は、ｗｔ　ｒｈｕＨＧＦで観察されたものと殆ど変わらない ままであった。これらデータは、クリングルに３およびに４がレセプター結合に 必要ではないことを示しており、変異体Ｎ−３０３（アミノ酸配列がＨＧＦ／Ｎ Ｋ２に非常に類似している）がＨＧＦレセプターへの結合に対して充分に競合す る能力を保持している（Ｋｄ〜２８０ｐＭ）という意味において、ミャザワら（ １９９１）（上記）およびチャンら（１９９１）（上記）によって以前に観察さ れた結果と一致した。さらに、レセプターに結合するにはＮ−３０３で充分であ るという観察、およびＨＧＦレセプターに結合するには第二のクリングルは必要 ではない（該分子の残りとの関係において）という観察は、レセプター結合性ド メインがｈｕＨＧＦのフィンガーおよび第一のクリングル内に含まれることを示 唆している。
ＨＧＦのプロテアーゼドメインの機能的重要性を評価するため、可能なセリン− プロテアーゼ活性部位を再構成するために幾つかの一重、二重および三重変異を 作製した。野性型ｈＨＧＦアミノ酸配列の５３４位、６７３位および６９２位に アミノ酸置換を行った。たいていの場合、リガンド結合親和性は実質的に減少す ることな（、生物学的活性は実質的に減少した。二重変異体Ｑ５３４ＨＳＹ５７ ３ＳおよびＹ６７３Ｓ、Ｖ６９２Ｓの生物学的活性および三重変異体Ｑ５３４Ｈ １Ｙ６７３Ｓ、Ｖ６９２Ｓの生物学的活性はＷＴ　ｒｈｕＨＧＦに比べて３％未 満であった。しかしながら、これら変異体のＫｄは野性型のヒトトＩＧＦ分子の Ｋｄと′Ｎ意に異ならなかった。これら結果は、ＨＧ　Ｆのβ鎖内のある種の変 異はマイトツエン活性を阻害するが、ＨＧＦのレセプター結合能には有意の影響 を及ぼさないことを示している。それゆえ、これら変異体はレセプター結合の後 の活性は欠失していると思われる。
ＨＧＦのレセプター結合能を増大させる可能性のある変更は、たとえば、可能な セリンプロテアーゼ活性部位に対応するアミノ酸領域中に存在する。この領域は 、野性型ｈｕＨＧＦアミノ酸配列におけるアミノ酸Ｑ５３４、Ｍｏ７３およびＭ ｏ９２を包含する。これらアミノ酸を他のアミノ酸、好ましくは異なるサイズお よび／または極性を有するアミノ酸と置換すると、ＨＧＦ変異体のレセプター結 合特性をさらに改善すると思われる。
他の変更は、ＨＧＦ分子のＣ末端および／またはクリングルドメイン中にある。
上記欠失変異体に加えて、クリングル１ドメイン内に変更を有するＨＧＦ変異体 も非常に興味がある。本発明者らはレセプター結合性ドメインがＨＧＦ分子のフ ィンガー領域およびクリングル１領域内に含まれることを見いだしたので、これ らドメイン内でのアミノ酸の変更は本発明の変異体のレセプター結合特性（およ び生物学的活性）を有意に変えるであろうことが予想される。クリングル構造中 の内部に最も暴露された残基における変更は、特にＨＧＦ変異体のレセプター結 合特性および／または生物学的活性の大きな変化を引き起こす傾向がある。
チロノンキナーゼ活性を有するレセプターに対する他のリガンドは市販されてお り（たとえば、インスリン）、および／またはそのヌクレオチド配列およびそれ から導かれたアミノ酸配列によって特徴付けられている。その生物学的活性もま た知られている。
ＥＧＦおよび関連タンパク質は知られているこカーペンタ−（Ｃａｒｐｅｎｔｅ ｒ、　Ｇ、　）およびコーエン（Ｃｏｈｅｎ、　Ｓ、）　１．へ曲ｕＲＣｖＢｌ ＯＣｈｅｍ、４３．１９３〜２１６（１９７９）、マノサンク（Ｎｌａｓｓａｎ ｑｕｅ、　Ｊ、）　、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｃｍ、２５５．２１３９３〜２１ ３９６　（１９９０）；グレイ（Ｇｒａｙ、７＼、）ら、％ａｔｕｒｅ　３０３ ．７２２−７２５　（１９８３）：ベル（Ｂｅ１１．　Ｇ、　Ｉ　、　）　ら、 Ｎｕｃｌ、、八ｃｉｄ、　Ｒｅｓ　上４、８４２７〜８４４６　（１９８６）　 コ　。
ヒトインスリン様増殖因子１および２　（ＩＣＦ−１およびＩＧＦ−１１）のア ミノ酸配列および調製は、たとえばＣＰ１２８．７３３　（１９８４年１２月１ ９日公開）に開示されている。
ＨＥＲ２／ｎｅｕ　（ｐ１８５””りに対するリガンドは「ヘレグリン−２（ｈ ｅｒｅｇｕｌｉｎ−２）　（ＨＲＧ２）　Ｊポリペプチドと呼ばれ、ＨＲＧ２− ａおよびＨＲＧ２−β１、−β２および−β３を含む。これらリガンドおよびそ の誘導体（アミノ酸配列変異体を含む）の構造、調製および使用は、継続中の米 国特許出願第０７／７０５．２５６　（１９９１年５月２４日出願）：０７／７ ９０，８０１（１９９１年１１月８日出願）、および０７／８８０．９１７　（ １９９２年５月１１日出願）に開示されている。ＨＲＧのアミノ酸配列は、縁膜 結合増殖因子のＥＧＦファミリーと多（の特徴が共通している。幾つかのヒトＥ ＧＦ関連タンパク質のＥＧＦモチーフの領域およびフランキング縁膜ドメインに おけるアミノ酸配列を整列させると、ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子（ｈｅｐ ａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇＥＧＦ−１ｉｋｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）　 （ＨＢ−ＥＧＦ）　［ヒガンヤ？　（Ｈｉｇａｓｈｉｙａｍａ）ら、５ｃｉｅｎ ｃｅ　２５１．９３６〜９３９　（１９９１）］　；アンフマイグリン（ａｍｐ ｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）　（ＡＲ）　［プローマン（Ｐ　ｌｏｗｍａｎ、　Ｇ、　 Ｄ、　）ら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ−α（ＴＧＦ−α）：ＥＧＦ［ベルら（１，９ ８６）上記］　、およびシュワン鞘腫由来増殖因子（ｓｃｈｗａｎｏＩＩＩａ− ｄｅｒｉｖｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）　［キムテ（Ｋｉｍｕｒａ、　 Ｈ，）ら、１旦」、２５７〜２６０　（１９９０）］と比較的高程度の相同性を 示す。
チロノンキナーゼ活性を有するレセプターに対する２価リガンドの代表例は、血 小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）である。ＰＤＧＦは、培養中の結合組織由来細胞 に対する血清中の主要なマイ１〜ツエンである［概観のため、ロス（Ｒｏｓｓ、 　Ｒ，）ら、Ｃｅ１１４６．１５５−１６９　（１９８６）を参照コ、ＰＤＧＦ は、ジスルフィド結合したＡおよびＢポリペプチド鎖からなる３０ｋＤの二量体 である。これら２本の鎖の３つのイソ形（ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢおよ びＰＤＧＦ−ＢＢ）のすべてが天然の採取源から同定され精製されている［ヘル デイン（Ｈｃｌｄｉｎ、　Ｃ，−Ｈ，）ら、Ｎａｔｕｒｅ　３工旦、５１１〜５ １４　（１９８６）、ノ１マチャーら、Ｅｕｒ、　Ｊ　、　Ｂｉｏｃｈｃｍ、１ ７６．１７９０１８６　（１９８８）；ストルーバント（Ｓ　ｔｒｏｏｂａｎｔ 、　Ｐ、　）およびウォーターフィールド（Ｗａｔｅｒｆｉｅｌｄ、　Ｍ、　Ｄ 、　）、ＥＭＢＯＪ、３．２９６３〜２９６７　（１９８４）］。これら異なる イソ形は、おそらく２つの別々のレセプタークラスに対する異なる結合特異性の ため、機能的活性において異なっていることがわかっている［ニスター（Ｎｉｓ ｔｅｒ、　Ｍ、　）ら、Ｃｅ１１５２．７９１〜７９９　（１９８８）；ヘルプ インら、ＥＭＢＯＪ、ヱ、１３８７〜１３９３　（１９８８）：”−ト（Ｈａｒ ｔ、　Ｃ，Ｅ、　）ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４０９．１５２９〜１５３１　（１ ９８８）コ。八−タイプのＰＤＧＦレセプターは３つのすべてのイソ形ｆＰＤＧ Ｆと結合するが、一方、Ｂ−タイプのレセプターはＰＤＧＦ−ＢＢとは高親和性 で結合し、ＰＤＧＦ−ＡＢとは低親和性で結合するが、ＰＤＧＦ−ＡＡとは評価 し得る親和性で結合しない。
他の２価リガンドは、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）である。ｈＧＨは、胎盤性ラ クトゲン、プロラクチン、および成長ホルモンの他の遺伝的および種変異体を含 む相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）ホルモンファミリーの成員であり、通常、下垂 体ホルモンおよび造血ホルモンを含むヘマトポエチンのファミリーとして言及さ れる［ニコル（Ｎｉｃｏｌｌ、　Ｃ，Ｓ、）ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　Ｒｅｖｉ ｅｗｓヱ、１６９　（１９８６）コ。
ｈＧＨのクローニング遺伝子は、大腸菌中で分泌形として発現されており［チヤ ツクら、Ｇｅｎｅ５５．１８９　（１９８７）］　、ヌクレオチド配列およびア ミノ酸配列が報告されている［ゲソデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）ら、ｒ’ｑａｔｕｒ ｅλ旦１．５４４（１９７９）；グレイ（Ｇｒａｙ）ら、９μ民旦旦、２４７　 （１９８５）］。ブタ成長ホルモン（ｐＧＨ）の３次元折り畳みパターンが報告 されて（する［アブデル−メギド（Ａｂｄｅｌ−Ｍｅｇｕｉｄ、　Ｓ、　Ｓ、） ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８４６４３４　（１９８ ７）］。ｈＧＨレセプターおよび抗体結合部位力（、同族体−スキャニング（ｈ ｏｍｏｌｏｇ−ｓｃａｎｎｉｎｇ）突然変異誘発により同定されて０る［カニン 体およびＮ末端領域に変異を起こしたＧＨ変異体が知られてＬ）る［ガートラ− （Ｇｅｒｔｌｅｒ）ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１１８．７２０　（１９ ８６）　：アノユケナーノーら、Ｅ　ｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ上λ↓、４１４ 　（１９８７）　１およびバインダー９９１）およびその引用文献、およびＷｏ 　９１１０５８５３に記載されている。
ｈＧＨ変異体はまた、カニンガムら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４４．１０８１　（１ ９８９）；およびＳ　ｃｉｅｎｃｅλ迭旦、１３３０〜１３３６　（１９８９） にも開示されている。
幾つかの他の造血リガンドの構造が最近決定された。顆粒球−マクロファージコ ロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ３Ｆ）およびＩＬ−４は、成長ホルモンよりも約６０ 残基短い。ＧＭ−Ｃ３Ｆの結晶構造［ディーデリクス（Ｄ　１ｅｄｅｒｉｃｈｓ 、　Ｋ、）ら、にしたが、以前には認められなかった構造モチーフ、長いクロス オーバ一連結中の残基により生成されたＢ−リボンの短い領域を有していた。こ れまでに利用できる証拠から、２つのトボロノー的に保存されたレセプター結合 性部位がヘマトポエチンの共通の論旨であると思われる。天然のｈＧＨではこれ ら２つの部位を用いて２コピーの同じレセプターに結合するが、！Ｌ−２、ＩＬ −３、ＧＭ−Ｃ３Ｆその他の他の多くの場合には、等価な領域が２つの異なるレ セプターサブユニットに対する結合性界面を生成する。
天然リガンド配列中のレセプター結合性ドメインは、Ｘ線研究、変異分析、およ び抗体結合研究を含む当該技術分野で知られた方法により決定することができる 。変異法としては、エスケープ変異体（ｅｓｃａｐｅ　ｍｕｔａｎｔｓ）の選択 と組み合わせたランダム飽和突然変異誘発（ｒａｎｄｏｍ　５ａｔｕｒａｔｉｏ ｎ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）法、挿入突然変異誘発（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ 　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）　、および同族体−スキャニング突然変異誘発（ヒ トリガンドからの配列（対応レセプターに結合する）を他の動物種、たとえばマ ウスからの対応リガンドの非保存配列（該ヒトレセプターには結合しない）と置 換する）が挙げられる。リガンド中のレセプター結合性ドメインを同定するのに 適した他の方法は、アラニン−スキャニング（ａｌａｎｉｎｅ−ｓｃａｎｎｉｎ ｇ）突然変異誘発として知られる［ＡＬＡ−ｓｃａｎ、カニンガムおよびウェル ズは、荷電アミノ酸側鎖を含有する領域の同定を包含する。同定した各領域中の 荷電残基（すなわち、ＡｒｇｌＡｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、およびＧｌｕ）をアラ ニンで置換しく変異分子当たり一つの領域）、得られたりガントのレセプター結 合性を試験してレセプター結合性における該特定の領域の重要性を評価する。多 くのｈＧＨ変異体とともにポリペプチド中の活性ドメインを同定するための他の 方法が、ＷＯ９０１０４７８８（１９９０年５月３日公開）に開示されている。
この方法によれば、ポリペプチドの選択アミノ酸領域を、該親ポリペプチドに比 べて標的物質（たとえば、レセプター）に対して異なる活性を有する類似ポリペ プチドからの類似ポリペプチド領域で置換することにより、該ポリペプチド中の 活性ドメイン（たとえば、レセプター結合性ドメイン）を決定する。リガンド中 のレセプター結合性ドメインの位置付けを行うための他の強力な方法は、中和（ 阻害）モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を用いることである。通常、これら方法お よび同様の方法を組み合わせてレセプター結合性にとって重要なドメインの位置 付けを行う。
レセプター機能の活性化のためにオリゴマー形成を必要とするレセプターに対す る上記および他のリガンドのアミノ酸配列変異体などの誘導体も知られており、 または前駆体または親リガンドをコードするＤＮＡの部位指向性突然変異誘発に よって該変異体をコードするＤＮＡを得るなど、当該技術分野で公知の方法によ り容易に：１２１製することができる。変異体リガンド分子をコードするＤＮＡ の修飾によって該配列が読み取り枠から外れるようにしてはならず、二次ｍＲＮ Ａ構造を生成し得る相補的領域を創製しないのが好ましい。変異体リガンドをコ ードするＤＮＡを適当な発現ベクター中に挿入し、ついで適当な宿主細胞をこの ＤＮＡでトランスフエクノタンする。該宿主細胞を適当な培地中で培養すると該 ＤＮＡによってコードされるポリペプチドが産生され、該ポリペプチドが宿主細 胞の培地中に分泌される。これら技術については、以下にさらに詳しく記載する であろう。
別法として、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）によって記載されている ように（Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、８５　：　２１４９　［１９６３コ）、 天然リガンド分子のアミノ酸変異体を標準固相ペプチド合成法を用いたインビト ロ合成により調製できるが、当該技術分野で知られた他の等価な化学合成法を用 いることもできる。固相合成は、保護したα−アミノ酸を適当な樹脂上にカップ リングすることによって該ペプチドのＣ末端から開始する。アミノ酸のペプチド 鎖へのカップリングは、ペプチド結合の生成のために当該技術分野でよく知られ た技術を用いて行う。
天然リガンド分子の糖付加変異体は、当該技術分野で知られた技術により調製す ることができる。タンパク質へのグリコノドの化学的および酵素的カップリンい て行うことができる。化学的カップリング法の利点は、比較的簡単であり、天然 の○−およびＮ−結合糖付加に必要な複雑な酵素機械装置を必要としないことで ある。使用したカップリングモードに依存して、糖を（ａ）アルギニンおよびヒ スチジン、（ｂ）グルタミン酸およびアスパラギン酸の遊離カルボキシル基など の遊離力ルボキ／ル基、（Ｃ）／スティンの遊離スルフヒドリル基などの遊離ス ルフヒドリル基、　（ｄ）セリン、トレオニンまたはヒドロキシプロリンの遊離 ヒドロキシル基などの遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン またはトリプトファンの芳香族残基などの芳香族残基、または（ｆ）グルタミン のアミド基に結合させることができる。これら方法は、ＷＯ８７１０５３３０（ １９８７年９月１１日公開）に記載されている。天然リガンドに存在する炭水化 物は、たとえば、エンドグリコノダーゼＨ（Ｅｎｄｏ−Ｈ）（高マンノースおよ びハイプリントオリゴ糖を（部分）除去できる）などのエンドグリコシダーゼを 用いることによって除去することができる。この処理は、それ自体公知の技術５ 　（１９８４）およびリトル（Ｌｉｔｔｌｅ）ら、Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、２３．６ １９１　（１９８４）の方法に従って行うことができる。より好ましくは、リガ ンドの糖付加変異体は、ＤＮＡレベルで適当な変異を起こして所望の変化した糖 付加パターンを有するタンパク質を提供することによって製造する。
本発明によれば、第一のリガンドおよび第二のリガンド（同一であっても異なっ ていてもよい）を互いに直接融合させてよい。そのような融合分子は、組換えＤ ＮＡ技術の標準法を用い、コードＤＮＡ配列を適当な微生物または細胞培養液中 で発現させることによって調製することができる。別法として、化学合成によっ て得ることもできる。
「異種リンカ−」なる語は、たとえば２価リガンドにおいて、天然の環境におい て２つのリガンドを連結しているリンカ−とは異なることを条件に、２つのりガ ント（上記定義した）を結合させる有機または無機リンカ−分子をいうものとし て用いる。２つのリガンドが天然の環境にてアミノ酸で連結されているなら、そ のような連結アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列と厳格な条件下でハイブリダ イズすることのできるＤＮＡ配列によってコードされる変異体は術語「異種リン カ−」なる定義から特に排除される。
「厳格な条件」とは、４０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ（１５０ｍＭ　ＮａＣｌ 、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７，６） 、５×デンハルト溶液、１０％デキストラン硫酸、および２０μｇ／ｍｌの変性 、切断したサケ精子ＤＮＡからなる溶液中に、３７８Ｃにて一夜インキユベート し、ついでｌＸ５ＳＣで約５０°Ｃにてフィルターを洗浄することをいう。
好ましい態様において、リンカ−は免疫グロブリン配列からなる。
「免疫グロブリン」なる語は、一般に、天然のｒＹＪ配置をした通常ともにジス ルフィド結合したＬ鎖またはＨ鎖からなるポリペプチドをいうが、四量体または その集合体を含む該鎖の他の結合も本発明の範囲に包含される。
免疫グロブリン（Ｔｇ）およびその変異体のあるものは知られており、多くは組 換え細胞培養にてＦｌ製されている。たとえば、米国特許第４．７４５．０５５ ；ＥＰ２５６．６５４：フォーフナ−（Ｆ３１１ｋｎｅｒ）　ら、Ｎａｔｕｒｅ λ旦８：２８６（１９８２）：　ＥＰ１２０．６９４　：ＥＰ１２５．０２３　 ＋モリマン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）、Ｊ、　１ｍｍｕｎ、１λ３ニア９３　（１９ ７９）：ケーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）ら１．均王ユＥＰ２５５．６９４；ＥＰ２６ ６．６６３；およびＷｏ　８８１０３５５９を参照。
再配列した（ｒｅａｓｓｏｒｔｅｄ）免疫グロブリン鎖もまた知られている。た とえば、米国特許第４．４４４．８７８　；ＷＯ８８１０３５６５；およびＥＰ ６８，７６３およびその引用文献を参照。本発明のキメラの免疫グロブリン部分 は、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、Ｉ　ｇＧ−３またはＩｇＧ−４サブタイプ、Ｉｇ Ａ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭから得ることができるが、ＩｇＧ−１またはＩ ｇＧ−３が好ましい。
適当な免疫グロブリン定常ドメイン配列に結合したレセプター配列（イムノアド ヒー／ン（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎｓ）　）から構築されるキメラは当該技 術分野で知られている。文献に報告されたイムノアドヒーシンとしては、Ｔ細胞 レセプター＊［ガ（ホーミングレセプター）［ワトソン（Ｗａｔｓｏｎ）ら、Ｊ 　、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、よ１旦、０３−１３１３　（１９９０）］　；ＣＤ ２８＊およびＢ７＊［リンスリー（Ｌ　１ｎｓｌｅｙ）９９１）コ　：ＴＮＦレ セプター［アンユケナーノーら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｆ 。
２３０６０〜２３０６７　（１９９１）コ　；ＩｇＥレセプターα鎖＊［リッジ ウェイ（Ｒｊｄｇｖａｙ）およびゴーマン（Ｇｏｒｍａｎ）　、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ 　Ｂｉｏｌ、工１互、ａｂｓｔｒ。
１．４４８　（１９９１）コ　、ＨＧＦレセプター［マーク（Ｍａｒｋ、　Ｍ、 　Ｒ，）ら、１９９２、Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、提出］が挙げられる （星印（＊）は１ノセブターが免疫グロブリンスーパーファミリーの成員である ことを示す）。これらイムノアドヒーシンはそれぞれ異なる目的を想定して製造 されたが、ヒト抗体の所望の化学的および生物学的特性の多くを所有していると いう点で共通している。
リガンド−免疫グロブリンキメラは、継続中の出願第０７／８３４．９０２号（ １９９２年２月１３日出願）（Ｌ−セレクヂンリガンドについて）、第０７／８ ８４．８１１号および第０７／８８５．９７１号（ともに１９９２年５月１８日 出願）（ＨＧＦ変異体について）に開示されている。これらキメラは、レセプタ ー−免疫グロブリンキメラの構築と同様にして製造することができる。
通常、リガンドはそのＣ末端にて免疫グロブリンの定常領域のＮ末端に可変領域 の代わりに融合させるが、セレクチン変異体のＮ末端融合も望ましい。
一般に、そのような融合物は免疫グロブリンＨ鎖の定常領域の少なくとも機能的 に活性なヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを保持している。融合はまた、定 常ドメインのＦｃ部分のＣ末端側、またはＨ鎖のＣＨＩのすぐＮ末端側またはＬ 鎖の対応領域にて行う。このことは、通常、適当なりＮＡ配列を構築し、それを 組換え細胞培養中で発現させることによって行う。しかしながら、別法として、 この発明のりガント−免疫グロブリンキメラは公知方法に従って合成することが できる。
融合を行う正確な位置は重要ではない、特定の部位はよく知られており、リガノ ドー免疫グロブリンキメラの生物学的活性、分泌または結合特性を最適化するた めに選択することができる。
ある態様において、ハイブリッド免疫グロブリンは、木賃的にＷＯ９１１０８２ ９８に説明しであるように、単量体、またはへテロもしくはホモ多量体として、 とりわけ二量体または二量体として組み立てる。
好ましい態様において、リガンド配列（レセプターに対する結合部位を含有する ）のＣ末端を抗体（とりわけＦｃドメイン）（免疫グロブリン（たとえば、免疫 グロブリンＧ＋（ＩｇＧ　１））のエフェクター機能を有する）のＣ末端側部分 のＮ末端に融合させる。全Ｈ鎖定常領域をレセプター結合性部位を含有する配列 に融合させることも可能である。しかしながら、より好ましくは、パパイン開裂 部位（化学的にＩｇＧＦｃを定める：Ｈ鎖定常領域の最初の残基を１１４として 残基２１６［コベットら、上記］、または他の免疫グロブリンの類似の部位）の すぐ上流のヒンジ領域から開始される配列を融合に用いる。特に好ましい態様に おいて、レセプター結合性部位を含有するアミノ酸配列を、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ −２またはＩｇＧ−３Ｈ鎖のヒンジ領域およびＣＨ２およびＣＨ３またはＣＨＩ 、ヒンジ、Ｃ［（２およびＣＨ３ドメインと融合させる。融合を行う正確な部位 は重要ではなく、最適部位は日常的な実験によって決定することができる。
ある種の態様において、リガンド−免疫グロブリンキメラをヘテロ多量体として 、とりわけへテロニ量体またはへテロ四量体として組み立てる。一般に、これら 組み立てた免疫グロブリンは、知られたユニット構造を有するであろう。基本的 な４鎖構造ユニツトは、ＩｇＧ、ＩｇＤおよびＩｇＥが存在する形態である。
４鎖ユニツトは、一層分子量の大きな免疫グロブリンにおいて繰り返される８１ ｇＭは、一般に、基本的な４鎖ユニツトがノスルフイド結合により結合された二 量体として存在する。ＩｇＡグロブリンおよび場合によりＩｇＧグロブリンは、 血清中で多量体の形態でも存在する。多量体の場合、各４鎖ユニツトは同じであ っても異なっていてもよい。
本発明の範囲に包含される組み立てられたりガント−免疫グロブリンキメラの種 々の例示を以下に図示する （ａ）　、八ＣＬ−ＡＣ，： （ｂ）ＡＣ，、−［ＡＣ，、、ＡＣ，−ＡＣ□、Ａ　Ｃ、−Ｖ　、、　Ｃ、、、 またはＶ、ＣＬ−ＡＣ，、］　；（Ｃ）ＡＣＬ−ＡＣｓ１−　［ＡＣｓ、−ＡＣ ｏ、ＡＣＬ−ＶｏＣｕ、ＶＬＣＬ−ＡＣｓ１、またはＶＬＣ−ＶｈＣｌ、］　： （ｄ）　ＡＣＬ−ＶＩＩＣＩ＋−［ＡＣ□、またはＡＣ，−Ｖ、、Ｃ，、、また はＶＬＣＬ　ＡＣＩ＋］　；（ｅ）　ＶＬＣＬ　ＡＣｓ　［ＡＣＬ　ＶＩＩＣＩ ＋、またはＶＬＣＬ−ＡＣ１ｌ〕　；および（ｆ）　［Ａ　Ｙ］　、−−［ＶＬ ＣＬ　ＶｌｌＣ１ｌコ　、：（式中、Ａは、該レセプターに選択結合することの できる同一または異なるアミノ酸配列： ＶＬは、免疫グロブリンＬ鎖可変ドメイン；Ｖ１１は、免疫グロブリントＩ鎖可 変ドメイン；ＣＬは、免疫グロブリンＬ鎖定常ドメイン。
ＣＨは、免疫グロブリンＨ鎖定常ドメイン。
ｎは、１を越える整数： Ｙは、共有結合架橋剤の残基） 簡潔のため、上記構造では基本的な特徴のみを示しである；上記構造には免疫グ ロブリンのＪドメインまたは他のドメインは示していないし、ジスルフィド結合 も示していない。しかしながら、そのようなドメインが結合活性のために必要で ある場合には、それらが免疫グロブリン分子中で占めている通常の位置に存在す るように構築されるであろう。
別法として、本発明のリガンド配列は、免疫グロブリンＨ鎖配列とＬ鎖配列との 間に挿入して、キメラＨ鎖を含む免疫グロブリンが得られるようにすることがで きる。この態様において、リガンド配列を、ヒンジとＣＨ２ドメインとの間かま たはＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとの間のいずれかにて免疫グロブリンの各 アームにおいて免疫グロブリンＨ鎖の３゛末端に融合させる。同様の構築物がフ ーゲンブーム（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、　Ｈ，Ｒ，）らのＭｏ１．　Ｉ　ａｕｏ ｕｎｏｌ　λ旦、１０２７〜１０３７　（１９９１）により報告されている。
本発明のりガント−免疫グロブリンキメラは、たとえば、ＥＰ１２５，０２３（ １９８４年１１月１４日公開）、米国特許第４．４４４．８７８　（１９８４年 ４月２４日発行）　：　ｖンロ（Ｍｕｎｒｏ、　Ａ、　）　、Ｎａｔｕｒｅ　３ １２．５９７　（１９８４）。
モリソンら、Ｓ　ｃｉｅｎｃｅλ２９．１２０２〜１２０７　（１９８５）：バ ーブ（Ｂｅｒｇ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８旦、 ４７２３〜４７２７　（１９９１）］に開示されているように、２特異的抗体の 構築と同様にして構築される。
本発明における天然のりガントをコードするＤＮＡは、該所望のリガンドに対す るｍＲＮＡを有し検出可能なレベルで発現すると思われる組織から調製したｃＤ Ｎパライブラリ−から得ることができる。目的遺伝子または該遺伝子によってコ ードされるタンパク質を同定すべく設計したプローブを用いてライブラリーをス クリーニングする。ｃＤＮＡ発現ライブラリーに対し、適当なプローブには、通 常、該所望のタンパク質５同じまたは異なる種からのりガントｃＤＮＡの知られ たまたは疑われる部分をコードする長さが約２０〜８０塩基のオリゴヌクレオチ ド、および／または同じまたは類似遺伝子をコードする相補的または相同ｃＤＮ Ａまたはその断片を認識し特異的に結合するモノクローナルまたはポリクローナ ル抗体が含まれる。
所望の天然リガンドをコードする遺伝子を単離する他の手段は、米国特許第４゜ ６８３．１９５号（１９８７年７月２８日発行）、サンプルツク（５ＢＨｂｒｏ ｏｋ）ら、モレキュラー・クローニング　ア・ラボラトリ−・マニュアル（Ｍｏ ｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ ）　、第２版、コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−プレス、ニューヨーク 、１９８９の第１４節、またはカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー ・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａ ｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）　、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、グリーンパブリ ッソングアソ／エイツアンドゥイリー−インターサイエンス１９９１の第１５章 に記載されているように、複製連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いることである。
他の別法は、エンゲルス（Ｅｎｇｅｌｓ）ら、Ａｇｎｅｗ、　ＣｈｅＩｌ、　Ｉ 　ｎｔ、　Ｅｄ、　Ｅｎｇｌ、λ旦、７１６　（１９８９）に記載の方法の一つ を用いて、所望の（天然または変異体の）リガンドをコードする遺伝子を化学的 に合成することである。これら方法には、）・リエステル、亜リン酸塩、ホスホ ルアミダイトおよびＨ−ホスホン酸法、ＰＣＲおよび他のオートプライマー（ａ ｕｔｏｐｒｉｍｅｒ）法、および固体支持体上のオリゴヌクレオチド合成が含ま れる。これら方法は、該遺伝子の全核酸配列が知られているかまたは該コード鎖 に相補的な核酸の配列が利用できる場合に用いることができ、または標的アミノ 酸配列が知られている場合には、各アミノ酸残基に対して知られたおよび好まし いコード残基を用いて可能な核酸配列を推定することができる。
この発明のリガンドのアミノ酸配列変異体は、野性型リガンドのタンｌ（り質コ アをコードするＤＮＡ配列を変異させることによって構築するのが好ましい。一 般に、該ＤＮＡの特定の領域または部位（上記方法によって同定される）が突然 変異誘発の標的とされるため、このことを行うために用いる一般法は部位指向性 突然変異誘発と呼ばれる。これら変異は、制限エンドヌクレアーゼ（ＤＮＡを特 定の位置で開裂する）、ヌクレアーゼ（ＤＮＡを分解する）および／またはポリ メラーゼ（ＤＮＡを合成する）などのＤＮＡ修飾酵素を用いて作成する。
以下に記載するのは、本発明のりガンドニ量体を製造するのに用いることのでき る組換えＤＮＡ法のある種の一般に用いられる技術である。これら技術および同 様の技術は、天然リガンドのレセプター結合性ドメインの変異体、リンカ−（免 疫グロブリン起源のリンカ−を含む）を有するかまたは有しない天然リガンドと 変異体リガンドとの融合体を製造するのに等しく適している。これら技術および 同様の技術の詳細は、一般的な教科書、たとえば、サンプル・ツクら、上記、お よびＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕａｌｒ　Ｂｉｏ ｌｏｇｙ、オースベルら編、上記１：ｌ！己載本発明に従ったリガンド変異体を 含むリガンド変異体および二量体の調製１よ、初期に調製された変異体または該 タンパク質の非変異体をコードするＤＮＡの部位特異的突然変異誘発によって行 うのが好ましい。部位特異的突然変異誘発（ま、所望の変異のＤＮＡ配列をコー ドする特定のオリゴヌクレオチド配列、並び６二横切るノヤンクノタンの両部位 上に安定な二本鎖を形成するの１＝充分なサイズおよび配列の複雑さを有するプ ライマーを提供するための充分な数の隣接ヌクレオチドを使用することにより、 変異体を製造することを可能とする。一般（こ約２０〜２５ヌクレオチドの長さ のプライマーが好ましく、変化させる配列のジャンクションの両部位上に約５〜 １０残基が存在する。一般に、部位特異的突然変異誘発は、たとえばアデルマン （Ａｄｅｌｍａｎ）ら、ＤＮＡ、２　：１８３　（１９８３）などの刊行物に例 示されているように、当該技術分野でよく知られている。
認識されるであろうように、部位特異的突然変異誘発法は、一般に、−重鎖と二 本鎖の両形態で存在するファージベクターを用いる。部位特異的突然変異誘発に おいて有用な典型的なベクターとしては、たとえばメンノング（Ｍｅｓｓｉｎｇ ）ら、Ｔｈ１ｒｄ　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｍａｃｒ ｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　ａｎｄ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡB 編者ウオルトン（Ａ、Ｗａｌｔｏｎ）　、エルセビエ、アムステルダム（１９８ １）に開示されているように、Ｍ１３ファージなどのベクターが挙げられる。こ れらファージは市販のものを容易に利用でき、その使用は一般に当業者によく知 られている。別法として、一本鎖ファージの複製起点を含有するプラスミドベク ター（ベイラ（Ｖｅｉｒａ）ら、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、よ５３　：　３ 　（１９８７））を用い、−重鎖ＤＮＡを得ることもできる。
一般に、部位指向性突然変異誘発は、たとえば、まずその配列内に関連するセレ クチンをコードするＤＮＡ配列を含有する一本鎖ベクターを得ることによって行 うことができる。所望の変異配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを、た とえばフレア（Ｃｒｅａ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（Ｕ ＳＡ）　、ユ河：５７６５　（１９７８）の方法によって一般に合成により製造 する。ついで、このプライマーを、一本鎖リガント配列含有ベクター内にアニー ルし、大腸菌ポリメラーゼｒクレノウフラグメントなどのＤＮＡ重合酵素に供し て変異含有鎖の合成を完成させる。それゆえ、一方の鎖が最初の非変異配列をコ ードし第二の鎖が所望の変異を有するヘテロ二本鎖が形成される。ついで、この ヘテロ二本鎖ベクターを用いてＪＭＩＯＩ細胞などの適当な細胞を形質転換し、 変異配列の配置を有する組換えベクターを含むクローンを、３２ｐ−欄識した突 然変異誘発プライマーからなる放射能プローブへのハイブリダイゼーンタンによ り選択する。
そのようなりローンが選択された後、変異領域を除き、所望の変異体の産生のた めの適当なベクター、一般に適当な真核宿主の形質転換に典型的に用いられるタ イプの発現ベクター中に入れる。本発明においては、チャイニーズハムスター卵 巣（ＣＨＯ）細胞または２９３（グラハム（Ｇ　ｒａｈａｌｌ）ら、Ｊ　、　Ｇ ｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、、３６　：　５９　（１９７７）によって記載されたヒト 腎臓細胞）が、長期間安定なポリペプチド製造体の製造に好ましい。しかしなが ら、とりわけ試験目的のために酵素の一過性の産生のみを所望する場合、他の多 くの細胞タイプを適切に用いることができることが知られているように、本発明 はＣＨＯ産生に限定されるものではない。たとえば、以下に記載するのは、たと えば分析目的のためのりガント−免疫グロブリンキメラなどのリガンド変異体ま たはりガンドニ量体の製造に都合のよい系を提供する２９３細胞を用いた一過性 の系である。
リガンドをコードするＤＮＡ配列中に変異を作製する他の方法には、制限酵素で 消化することにより該ＤＮＡを適当な位置で開裂し、適切に開裂されたＤＮＡを 回収し、所望のアミノ酸をコードするオリゴヌクレオチドおよび平滑末端を有す るポリリンカーなどのフランキング領域（または、ポリリンカーを用いる代わり に、該リガンドをコードするＤＮＡを開裂するのに用いた制限酵素で該合成オリ ゴヌクレオチドを消化して粘着末端を生成させる）を合成し、ついで鉄台成りＮ Ａをリガンドをコードする構造遺伝子の残り中にライゲートすることが含まれる 。
ＰＣＲ突然変異誘発 ＰＣＲ突然変異誘発もまた、本発明を実施するためのりガンドニ量体を含むリガ ンドを製造するのに適している。以下にはＤＮＡについて記載するが、この技術 はＲＮＡに対しても応用できることが理解される。ＰＣＲ法とは、一般に以下の 手順をいう。ＰＣＲにおいて少量の鋳型ＤＮＡを出発物質として用いる場合には 、鋳型ＤＮＡ中の対応領域と配列がわずかに異なるプライマーを用いて、該プラ イマーが鋳型と異なる位置においてのみ鋳型配列と異なる特定ＤＮＡ断片を比較 的多量に生成させることができる。変異をプラスミドＤＮＡ中に導入するには、 プライマーの一方を該変異の位置と重複し該変異を含有するように設計する；他 のプライマーの配列は該プラスミドの反対鎖の配列の広がりと同一でなければな らないが、この配列は該プラスミドＤＮＡ中のいずれにも位置させることができ る。しかしながら、これらプライマーによって最終的に結合されたＤＮＡの全増 幅領域を容易に配列決定できるように、第ニプライマーの配列は第一プライマー の配列から２００ヌクレオチド内に位置しているのが好ましい。かく記載したよ うなプライマー対を用いたＰＣＲ増幅の結果、該プライマーによって特定される 変異の位置、およびおそらくは他の位置にても異なる（鋳型コピーは若干エラー を伴い易いので）ＤＮＡ断片の集団が得られる。
生成物質に対する鋳型の比率が極めて低い場合には、生成物ＤＮＡ断片のかなり の部分は所望の変異を組み込んでいる。この生成物質を、標準ＤＮＡ法を用い、 ＰＣＲ鋳型として機能した該プラスミド中の対応領域と置換することができる。
変異策ニプライマーを用いることによって、または異なる変異プライマーを用い て第二のＰＣＲを行い、得られた２つのＰＣＲ断片を３（またはそれ以上）部分 ライゲーションによりベクター断片中に同時にライゲートすることによって、変 異を別々の位置に導入することができる。
宿主細胞培養およびベクター チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞上およびヒト胚腎臓細胞株２９３［ ウアラウブ（Ｕ　ｒｌａｕｂ）およびチェイシン（Ｃｈａｓｉｎ）　、　Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。
るベクターおよび方法は広範囲の真核生物の宿主細胞中で使用するのに適してい る。
一般に、ＤＮＡ配列の最初のクローニングおよび本発明に有用なベクターを構築 するには原核生物が好ましい。たとえば、大腸菌に１２株２９４　（ＡＴＣＣＮ ｏ、３１．４４６）および大腸菌株Ｗ３１１０　（ＡＴＣＣＮｏ、２７．３２５ ）が特に有用である。他の適当な微生物株としては、大腸菌Ｂおよび大腸菌Ｘ１ ７７６　（ＡＴＣＣＮｏ、３１．５３７）などの大腸菌株が挙げられる。これら 例は、もちろん、例示にすぎず、限定を意図するものではない。
原核生物はまた、発現に有用である。上記株、並びにバシラス・サチリス（Ｂａ ｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）などの桿菌、および池の腸内細菌、たとえば サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ）またはセラチア・マルセッサンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓａｎｓ） 　、および種々のツユ−トモナス（Ｐ　ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種が発現のため に有用な宿主の例である。
一般に、宿主細胞と両立する種に由来するレプリコンおよび制御配列を含有する プラスミドベクターをこれら宿主とともに用いる。ベクターには通常、複製部位 、並びに形質転換した細胞において表現型選択を与えることのできるマーキング 配列が含まれる。たとえば、大腸菌は一般に、大腸菌種に由来するプラスミドで あるｐＢＲ３２２（たとえば、ポリバー（１３０１ｉｖａｒ）ら、９μ思、２＋ ９５（１９７７）を参照）を用いて形質転換する。ｐＢＲ３２２にはアンピシリ ンおよびテトラザイクリン耐性の遺伝子が含まれているので、形質転換した細胞 を容易に同定する手段が得られる。ｐＢＲ３２２プラスミドまたは他の微生物プ ラスミドまたはファージはまた、それ自身のタンパク質の発現のために該微生物 によって使用することのできるプロモーターを含有しているか、または含有する ように修飾する必要がある。
組換えＤＮＡ配列中築において最も一般に用いられるプロモーターとしては、β −ラクタマーゼ（ペニノリナーゼ）およびラクトースプロモーター系（チャンク （Ｃｈａｎｇ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、　３ヱ５：６１５　（１９７８）＋イタクラ （Ｉ　ｔａｋｕｒａ）モーター系（ゲノデルら、Ｎ配匪、旦：４０５７　（１９ ８０）：ＥＰ○出願公開第３６．７７６Ｌおよびアルカリホスファターゼ系が挙 げられる。これらが最も一般的に用いられるものであるが、他の微生物プロモー ターも発見および利用されており、そのヌクレオチド配列の詳細は出版されてお り、当業名は、これら配列をプラスミドベクターと機能的にライゲートすること が可能である（たとえば、ノーベンリ刈・（Ｓ　１ｅｂｅｎｌｉｓｅ）ら、９旦 ■、λ旦　２６９（１９８０）を参照）。
原核生物に加えで、酵母などの真核微生物もまた本発明に用いるのに適してし入 る。サツカロミセス・セレビシェ（Ｓ　ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｃｖ ｉｓｉａｅ）また；ヨ（也の通常のパン酵母が真核微生物のなかでも最も一般的 に用いられるものであるが、多くの他の株も一般に利用できる。たとえば、サツ カロミセス中での発現にはプラスミドＹＲｐ７　（ステインクコーム（Ｓ　ｔｉ ｎｃｈｃｏｍｂ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、λ８２　：　３９（１９７９）：キックス マン（Ｋｉｎｇｓｍａｎ）ら、９μ席、ヱ＋　１４１　（１９７９）、チェンバ ー（Ｔ　ｓｃｈｅｍｐｅｒ）ら、９μ里、１０　：１５７　（１９８０））が一 般に用いられる。このプラスミドには既にｔ　ｒｐｌ遺伝子が含まれており、ト リプトファン中で増殖する能ツノを欠く酵母の変異株（たとえば、ＡＴＣＣＮｏ 、４４゜０７６またはＰＥＰ４−１　（ンヨーンズ（Ｊｏｎｅｓ）　、Ｇｅｎｅ ｔｉｃｓ、　８旦：１２（１９７７）））に対する選択マーカーを提供する。つ いで、酵母宿主細胞ゲノムの特性としてのｔ　ｒｐｌ病変の存在は、トリプトフ ァンの不在下で増殖させることによって形質転換を検出するための有効な環境を 提供する。
酵母ベクター中の適当なプロモート配列としては、３−ホスホグリセリン酸キナ ーゼのプロモーター（ヒノツエマン（Ｈｉｔｚｃｍａｎ）ら、Ｊ　、　Ｂ　ｉｏ ｌ、　Ｃｈｅｗ＋、λ５５　：　２０７３　（１９８０））　、またはエノラー ゼ、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビ ン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース６〜リン酸イソ メラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオース リン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼなど の他の解糖系酵素のブロモ−げられる。適当な発現プラスミドの構築に際し、こ れら遺伝子に付随する終止配列も発現しようとする所望の配列の３°側にで発現 ベクター中にライゲートして、ｍＲＮＡのポリアデニル化および終止を提供する ことができる。増殖条件によって制御される転写の他の利点を有する他のプロモ ーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソノドクロ、Ｚ、　Ｃ、酸性ホス ファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、および上記グリセルアルデヒド３− リン酸デヒドロゲナーゼ、およびマルトースおよびガラクトース利用を担う酵素 のプロモーター領域である。酵母に適合するプロモーター、複製起点および終止 配列を含有するいかなるプラスミドベフターも適している。
微生物に加えて、多細胞生物に由来する細胞の培養液もまた宿主として用いるこ とができる。原則として、を椎動物または非を椎動物の培養液のいずれに由来す るかに拘わらず、そのような細胞培養液はいかなるものでも利用できる。しかし ながら、を椎動物細胞に興味が最も集中しており、培養液（組織培養液）中での を椎動物細胞の増殖は近年における日常的な手順になってきている［Ｔ　１ｓｓ ｕｅＣｕｌｔｕｒｅ、アカデミツクプレス、クルース（Ｋ　ｒｕｓｅ）およびパ ダーリン（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ）　、編者（１９７３）］、そのような有用な宿 主細胞株の例は、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞株、およびＷ２Ｂ５ 、ＢＨＫＳＣＯ８−７、（ＡＴＣＣＣＲＬ　１６５１）、２９３、およびＭＤＣ Ｋ　（ＡＴＣＣＣＣＬ　３４）細胞株である。そのような細胞のための発現ベク ターには、通常、必要なリポソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデ ニル化部位および転写ターミネータ−配列とともに、複製起点、発現すべき遺伝 子の前に位置するプロモーターが含まれる（必要なら）。
哺乳動物細胞中で使用するには、発現ベクター上の制御機能はしばしばウィルス 物質によって提供される。たとえば、一般に用いられるプロモーターは、ポリオ ーマ、アデノウィルス２、および最も頻繁にはンミアンウイルス４０　（ＳＶ４ ０）に由来するものである。ＳＶ４０ウィルスの初期プロモーターおよび後期プ ロモーターは特に有用である。というのは、両者ともにＳＶ４０ウィルスの複製 起点をも含有する断片として該ウィルスから容易に得られるからである（ファイ アーズ（Ｆ　１ｅｒｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、λヱ３　：１１３　（１９７８）） 、より小さなまたはより大きなＳＶ４０断片も適当に用いることができるが、Ｈ ｉｎｄＩ［［部位力）らウィルスの複製起点に位置するＢｇｌ１部位までにわた る約２５０ｂｐの配列を含むことを条件とする。さらに、所望の遺伝子配列に通 常付随するプロモーターまたは制御配列を利用することも可能であり、またしば しば望ましいが、そのような制御配列が宿主細胞系と適合できることが必要であ る。
複製起点は、一般に、ＳＶ４０や他のウィルス（たとえば、ポリオーマ、アゾ八 ｖｓｖ、ＢＰＶ）源に由来するような外来の起点を含むようにベクターを構築す るか、または宿主細胞の染色体複製機構によるかのいずれかにより提供される。
ベクターを宿主細胞染色体中に組み込む場合には、後者がしばしば充分である。
満足のいく量のリガンド変異体または二量体が細胞培養によって産生される。
しかしながら、第二のコード配列を用いた改善によって産生レベルをさらにもっ と促進させることができる。第二のコード配列は、外から制御される因子（たと えば、メトトレキセート（ＭＴＸ））によって影響されるジヒドロ葉酸レダクタ ーゼ（ＤＨＦＲ）を含むため、ＭＴＸ１１度を制御することによって発現を制御 することができる。
変異体セレクチンおよびＤＨＦＲタンパク質の両方をコードするＤＮＡ配列を含 む本発明のベクターによるトランスフェクションのために好ましい宿主細胞を選 択するにあたって、使用するＤＨＦＲタンパク質の種類を考慮することが適当で ある。野性型のＤＨＦＲタンパク質を使用する場合には、ＤＨＦＲを欠失してお り、それゆえヒポキサンチン、グリシノおよびチミジンを欠く選択培地中での成 功したトランスフェクションに対するマーカーとしてＤＨＦＲコード配列を使用 することができるような宿主細胞を選択することが好ましい。この場合の適当性 の欠失したＣＨ○細胞株である。
一方、ＭＴＸに対して低い結合親和性を有するＤＨＦＲタンパク質を制御配列と して用いる場合には、ＤＨＦＲの欠失した細胞を用いる必要はない。この変異体 ＤＨＦＲはＭＴＸに対して耐性であるので、宿主細胞自体がＭＴＸ感受性である ことを条件として、ＭＴＸ含有培地を選択手段として用いることができる。
ＭＴＸを吸収し得る殆どの真核細胞はＭＴＸに対して感受性であると思われる。
そのような有用な細胞株の一つは、ＣＨＯ株、ＣＨＯ−Ｋｌ　（ＡＴＣＣＮｏ、 ＣＣＬ　６１）である。
利用できる典型的なりローニングおよび発現方法哺乳動物細胞を宿主細胞として 用いる場合には、トランスフェクションは一般に、グラハムおよびファン・デア ・ニブ（Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ）　、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、旦旦：５４６　（１９ ７８）に記載されているように、リン酸カルシウム沈殿法によって行う。しかし ながら、核注入、エレクトロポレーション、またはプロトプラスト融合などの、 細胞中にＤＮＡを導入するための他の方法も適切に使用することができる。
酵母を宿主として用いる場合には、ヒネン（Ｈｉｎｎｅｎ）　、Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７５　：　１９２９〜１９３３　（１９７８）によつて教示さ れているように、トランスフェクションは一般にポリエチレングリコールを用い て行う。
原核細胞または実質的な細胞壁構築を含む細胞を用いる場合には、コーエン（Ｃ ｏｈｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）６９　：　 ２１１０　（１９７２）に記載されているようなカル７ウムを用いたカルシウム 処理であるか、または一層最近ではエレクトロポレーションである。
所望のコード配列および制御配列を含む適当なベクターの構築には、標準ライゲ ーション法を用いる。単離したプラスミドまたはＤＮＡ断片を開裂し、修飾しく ｔａｉｌｏｒｅｄ）　、所望のプラスミドを生成するのに望ましい形態にて再ラ イゲートする。
開裂は、適当な緩衝液中で１の制限酵素（または複数の酵素）で処理することに より行う。一般に、約１μｇのプラスミドまたはＤＮＡ断片を約２０μｍの緩衝 液中の約１単位の酵素とともに用い、特定の制限酵素に対する基賞量は製造業者 により特定される。３７°Ｃで約１時間のインキュベーション時間で行うことが できる。インキュベーション後、タンパク質をフェノールおよびクロロホルム抽 出により除去し、核酸をエタノール沈殿により水性フラクションから回収する。
平滑末端を必要とする場合には、調製物を１０単位のＤＮＡポリメラーゼＩのフ レノウ断片（フレノウ）で１５℃にて１５分間処理し、フェノール−クロロホル ム抽出し、ついでエタノール沈殿させる。
開裂した断片のサイズ分離は、ゲノデルら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ ５Ｓ３　：　４０５７　（１９８０）に記載されているように６％ポリアクリル アミドゲルを用Ｌ１て行う。
ライゲーションを行うには、正確なマツチングが得られるように適当に末端を修 飾したほぼ等モル量の所望の成分を、０．５μｇのＤＮＡ当たり約１０単位のＴ ４ＤＮＡリガーゼで処理する。（開裂したベクターを成分として用いる場合には 、細菌のアルカリホスファターゼで前処理することにより該開裂ベクターの再ラ イゲーションを防ぐことが有用である。）上記のように、リガンド変異体は特定 の変異によって製造するのが好ましい。
本発明を実施するのに有用な変異体は、所望の変異のＤＮＡ配列をコードする特 定のオリゴヌクレオチド配列並びに充分な数の隣接ヌクレオチドを使用して、該 変異を横切る両側上に安定な二本鎖を形成するに充分なサイズおよび配列の複雑 さを宵する配列を提供することによって最も容易に生成できる。
プラスミド中で正しい配列が構築されたことを確認するための分析を行うには、 一般に、ライゲーション混合物を用いて大腸菌に１２　（ＡＴＣＣ３１，４４６ ）または他の適当な大腸菌株を形質転換させ、適する場合には、成功した形質転 換体をアンピノリンまたはテトラサイクリン耐性により選択する。形質転換体か ら７＝クエンノングによって調製および分析する。
該ＤＮＡを哺乳動物細胞宿主中に導入し、安定な形質転換体を培地中で選択した 後、宿主細胞培養液を約２０．０００〜５００．ＯＯＯｎＭ濃度のＭＴＸ　（Ｄ ＨＦＲ活性の競合的インヒビターである）の存在下で増殖させることによってＤ ＨＦＲタンパク質コード配列の増幅を行う。有効な濃度範囲は、もちろんＤＨＦ Ｒ遺伝子およびタンパク質の性質および宿主の特性に太き（依存する。明らかに 、一般的に定められた上限および下限を確かめることはできない。他の葉酸類似 体またはＤＨＦＲを阻害する他の化合物も適当な１度で用いることができる。し かしながら、ＭＴＸ自体が都合がよく、容易に入手可能であり、有効である。
特定の聾様において、リガンド−免疫グロブリンキメラ分子を本発明に従って用 いる。リガンド−免疫グロブリンキメラは、分泌タンパク質として培地から回収 することが好ましいが、分圧・ノブナルなしで直接発現される場合には宿主細胞 の溶解液から回収することもできる。該キメラがヒト由来のもの以外の組換え細 胞中に発現される場合には、変異体はそれゆえヒト由来のタンパク質を完全に含 まない。しかしながら、タンパク質に関して実質的に均質な調製物を得るには、 組換え細胞タンパク質から該変異体を精製する必要がある。第一の工程として、 培地または溶解液を遠心分離にかけて粒状の細胞破砕物を除去する。
ついで、たとえば、通常のクロマトグラフィー法、たとえばゲル濾過、イオン交 換、疎水相互作用、アフィニティー、イムノアフィニティークロマトグラフィー 、逆相ＨＰＬＣの適当な組み合わせ、沈殿、たとえばエタノール沈殿、硫酸アン モニウム沈殿、または好ましくはセファロースに共有結合させた抗ＨＧＦ　（ポ リクローナルまたはモノクローナル）抗体を用いた免疫沈降により、該キメラを 混在可溶性タンパク質から精製する。ヘパリンに対する高親和性のため、ＨＧＦ はヘパリン−セファロースカラムなどでヘパリン上で都合よ（精製することがで きる。当業者は、天然ＨＧＦに適した精製法には、組換え細胞培養での発現に際 してのＨＧＦまたはその変異体の特性の変化を考慮した修飾が必要であることを 評価するであろう。
別の態様において、２つの（同一または異なる）リガンドを非免疫グロブリンリ ンカ−で連結させる。このリンカ−は、これら２つのリガンドをレセプター結合 性機能を損なうことなく連結することのできる共有架橋剤の残基であるか、また はそのような架橋剤によって生成が続発される連結であってよい。共有架橋試薬 については、そのような試薬の選択の手引きおよびその調製法を含めた簡潔な概 略がティ（Ｔａｅ、ト１．Ｊｒ、）らのＭｅｔｌｔ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、５８０− ６０９　（１９８３）およびその引用文献により提供されている。広範囲の種々 の架橋剤から特定の目的のために最も適した試薬を選択することは、充分に当業 者の技量に属するものである。
一般に、本発明の目的のためには、ゼロ長の（ｚｃｒｏ　−ｌｅｎｇｔｈ）ホモ またはへテロ２官能性架橋剤が好ましい。ゼロ長の架橋試薬は、いかなる外来性 の物質をも導入することなく２つのリガンドを直接結合させる。ノスルフィド結 合の生成を触媒する剤はこのカテゴリーに属する。他の例は、カルボジイミド、 クロロギ酸エチル、ウッドワード試薬に１、カルボニルジイミダゾールなどのよ うな、カルホキ／基と第一級アミン基とを縮合さ惨てアミド結合を生成させる試 薬である。
ホモ２官能性試薬は２つの同一の官能基を有するが、一方、ヘテロ２官能性試薬 には２つの異なる官能基が含まれる。ヘテロ２官能性架橋剤の大部分は、第一級 アミン反応性の基とチオール反応性の基とを含む。ポルミルに対してチオールカ ップリングするための新規へテロ２官能性リンカ−がバインデル（Ｈｅｉｎｄｅ ｌ、　Ｎ、Ｄ、）らによって開示された（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｗ 、２．４２７〜４３０　（１９９１））。
好ましい態様において、共有架橋剤は、ジスルフィド（−Ｓ　−Ｓ−）架橋、グ リコール（−ＣＨ［ＯＨココ−ｌ−１［０１−１］　−）架橋、アゾ（−Ｎ＝Ｎ −）架橋、スルホン（−３［＝Ｃｈコ−）架橋、まタハエステル（−Ｃ［＝Ｏ］ 　−０−）架橋を生成し得る試薬から選択される。
異なるアプローチにおいては、リガンドをそのオリゴ糖を介して連結させる。
ポリペプチドリガンド上のオリゴ糖のアルデヒドへの化学的または酵素的酸化に より、該分子上に独特の官能基が生成し、これら官能基は、たとえば、アミン、 ヒドラジン、ヒドラジドまたはセミカルバジドを含む化合物と反応することがで きる。糖付加部位はポリペプチド分子中で充分に定められているので、酸化され たオリゴ糖残基による選択的カップリングによって他のカップリング法に比べて 一層均一な生成物が得られるであろうし、リガンドのレセプター結合特性に関し ても副作用が一層少ないことが期待される。炭水化物指向性へテロ２官能性架橋 剤は、たとえば、継続中の特許出願第０７／９２６．０７７号（１９９２年８月 ５日出願）に開示されている。
３以上のリガンド配列を種々の連結配列、たとえば架橋試薬を用いてカップリン グすることが可能であり本発明の範囲に包含されることも理解されるであろう。
別の態様において、２またはそれ以上のりガントがポリペプチドリンカ−配列に よって連結され、従って、それらリガンドのレセプターに一本鎖の多機能性ポリ ペプチド分子として呈示される。ポリペプチドリンカ−は「スペーサー」として 機能し、その機能は、機能性のリガンドドメインが独立に正しい３次元コンホメ ーノタンをとれるようにこれらドメインを分離することである。ポリペプチドリ ンカ−は、通常、約５〜約２５残基を含み、好ましくは少なくとも約１０残基、 一層好ましくは少なくとも約１５アミノ酸を含み、−緒になって親水性で比較的 不統一の（ｕｎｓｔｒｕｃｔｕｒｃｄ）領域を提供するアミノ酸残基からなる。
２次構造を殆どまたは全く有しない連結アミノ酸配列が充分に機能する。所望な ら、特定の開裂剤（たとえば、プロテアーゼ）によって認識され潟る１またはそ れ以上の独特の開裂部位がポリペプチドリンカ−中に含まれていてもよい。スペ ーサー中の特定のアミノ酸配列は種々であってよいが、ノステインは避けるべき である。スペーサー配列は、天然の２官能性リガノドにおいて２つのレセプター 結合性ドメインを通常連結しているアミノ酸配列の３次元構造を擬態するもので あってよい。
ヘリックス構造などの所望の構造をとるように設計することもできる。適当なポ リペプチドリンカ−は、そのようなリンカ−を含む多機能性タンパク質の製造法 とともに、たとえばＷ○８８１０９３４４　（１９８８年１２月１日公開）に開 示されている。
さらに別の特別の態様において、両親媒性ヘリックスによりリガンドを二量体形 成させる。遺伝子制御タンパク質中のアミノ酸ロイ／ン（Ｌ　ｅ　ｕ）の繰り返 しコピーは、２つのタンパク質分子を一緒に「ファスナーで閉めて（ｚｉｐ）　 Ｊ二量体を提供する歯として働き得ることが知られている。ロイノンファスナー は、タンパク質Ｃ／Ｅ　Ｂ　Ｐの小さな断片を仮定的なαヘリックス中に適合さ せたときに最初に発見された。驚くべきことに、ロイノン（このタンパク質にお いて７つのアミノ酸毎に構成する）は縦列をなして配列している。その後、２つ の別のＣ／ＥＢＰ関連タンパク質が同定され、同様の機能を有することが示され た。そのうちの一つ、ＧＣＮ４は酵母からの遺伝子制御タンパク質であり、他方 は庄原遺伝子ｊｕｎの産物である。ファスナー領域は結合するときに平行に会合 する、すなわち並列したこれら分子上のロイノンは１つずつ対応して一列に並ぶ ことがわかっている。同一でないタンパク質をファスナーで閉じてヘテロニ量体 を形成し得ることも示されている。そのようなロイノンファスナーは、本発明の 範囲のりガンビニ１体を調製するのに特に適している。別法として、本質的にノ くツク（Ｐ　ａｃｋ。
Ｐ）およびプルツクサン（Ｐ　１ｕｃｋｔｈｕｎ、　Ａ、　）　、Ｂ　ｉｏｃｈ ｅｍｉｓｔｒｙ　３１．１５７９〜１５８４　（１９９２）に記載されているよ うに、４−ヘリックス東デザイン（ｆｏｕｒ−ｈｃｌｉｘ　ｂｕｎｄｌｅ　ｄｅ ｓｉｇｎ）から両親媒性ヘリックスの配列を得ることもできる。本発明の目的に とって異種リンカ−として働き得る分子（たとえば、ロイノンファスナー）につ いてのさらなる詳細については、たとえば、ランドシュク〜６４．１９９１年４ 月、／ユミノトードール（Ｓ　ｃｈｍｉｄｔ　−Ｄｏｒｒ、　Ｔ、　）ら、Ｂ　 ｉｏｃｈｃｗｉｓｔｒｙ旦旦、９６５７−９６６４　（１９９１）ニブロンデル （Ｂ　１ｏｎｄｅｌ。
Ａ）およびブドウエル（Ｂｅｄｏｕｅｌｌｅ、Ｈ，）　、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎ ｇｉｎｅｅｒｉｎ　４．４５７〜４６１　（１９９１Ｌバツクおよびプルツクサ ンら、上記、およびこれら論文中に引用された文献を参照。
特別の態様において、本発明は、レセプターに結合することができるがレセプタ ーを活性化する能力がないかまたは減少しているリガンド変異体を各天然リガン ドの強力なアゴニストに変換する方法を提供する。標的リガンドは、天然リガン ドの実質的に完全なレセプター結合親和性を保持しているのが好ましい。
本明細書において用いる「天然りガントの実質的に完全なレセプター結合親和性 を保持している」なる表現およびその文法的な変化物は、リガンド変異体のレセ プター結合親和性が、対応天然りガントがそのレセプターに結合する親和性の約 ７０％以上、好ましくは約８０％以上、一層好ましくは約９０％以上、最も好ま しくは約９５％以上であることを意味する。
レセプター結合性は、たとえば実施例に開示する競合結合アッセイなどの標準ア ッセイにより決定することができる。
「実質的にレセプターを活性化することができない」および「実質的に生物学的 活性を有しない」なる表現は、変異体リガンドによって示される活性が、レセプ ター活性化またはリガンドの生物学的活性の確立されたアッセイにおける対応天 然リガンドの各活性の約２Ｑ％未満、好ましくは約１５％未満、一層好ましくは 約１０％未満、最も好ましくは約５％未満であることを意味する。
本発明の実施可能性を、まず、野性型肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）およびそのアミ ノ酸配列変異体を免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合させることによって生 成したキメラ分子でＨＧＦレセプター（ＨＧＦｒ）を活性化することにより示し た。
ＨＧＦの生物学的活性は、たとえば、肝細胞増殖促進のインビトロまたはインビ ボアッセイにより決定することができる。肝細胞の増殖を制御する因子を探求す るため、初代培養の成体ラット肝細胞が大量に用いられている。従って、たとえ ば実施例２に記載するような、初代培養においてラット肝細胞のＤＮＡ合成を誘 発するＨＧＦ分子の能力を試験するのに適したアッセイにおいてＨＧＦ変異体の マイトツエン効果を都合よく決定することができる。ヒト肝細胞はまた、移植に 不適と思われる器官の全肝潅流、子供の移植に用いる成人肝臓の切片（ｐａｒｅ ｄｏｖｎｓ）　、胎児の肝臓および他の適応症のために手術で除去した肝臓残物 から利用することもできる。ヒト肝細胞の培養は、正常ラット肝細胞の初代培養 を調製するために確立された方法と同様にして行うことができる。肝細胞ＤＮＡ 合成は、たとえば、適当なヒドロキシ尿素コントロールを複製合成のために用い 、［’Ｈ］チミジンのＤＮＡ中への導入を測定することによってアッセイするこ とができる。
ＨＧＦ変異体の肝細胞増殖に対する影響はまた、部分肝切除術後のラット、また は四塩化炭素により引き起こされた肝障害、Ｄ−ガラクトサミンにより誘発され た急性肝不全モデルなどの肝臓機能不全および再生の動物モデルにおいてインビ ボで試験することもできる。適当なプロトコールに従い、肝臓前、たとえばα− ナフチルイソチオノアナート（ＡＮＩＴ）を、肝酵素およびビリルビンレベルの 再現性のある有意の上昇を引き起こし得る前以て決定した濃度にてラットに投与 する。ついで、これらラットを試験すべきＨＧＦ変異体で処理し、層殺し、つい で肝酵素およびビリルビンレベルを測定する。肝病変について肝臓をさらに観察 する。
他のりガントおよびリガンド変異体の生物学的活性は、当該技術分野で公知の方 法でアッセイすることができる。
本発明の化合物はそのレセプターを活性化することができ、それゆえ、対応天然 リガンドの生物学的活性を擬態する。本発明の化合物はまた、薬理学的に有用な 組成物を調製するための公知方法に従って調合することができ、それにより、連 結したリガンド変異体を薬理学的に許容し得る担体と混合する。適当な担体およ びその調合物は、Ｒｅｃａｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　 ５ｃｉｅｎｃｅｓ　（第１６版、１９８０、マノク・パブリソ／フグ、オス口（ Ｏｓｌｏ）ら編）に記載されている。これら組成物は、一般に、適量の担体とと もにたとえば約０５〜１０ｍｇ／ｍｌのオーダーで有効量の化合物を含有して、 患者へ有効投与するのに適した薬理学的に許容し得る組成物を調製するであろう 。本発明の化合物は、非経口、または有効な影響での血流中への送達を保証する 他の方法、本質的に対応天然リガンドについて知られた投与経路に従って投与す ることができる。
本発明の化合物の臨床投与に特によぐ適した組成物は、対応天然リガンドについ て知られた調合物と同じかまたは該調合物に基づいて開発することができる。
投与量および医薬組成物の所望の薬剤濃度は、意図する特定の使用に依存して大 きく変わってよい。仮投与量（ｐｒｅｌｉｗｉｎａｒｙ　ｄｏｓａｇｅｓ）を動 物試験において決定することができ、投与量の種間スケーリングを当該技術分野 で公知の仕方、たとえばモーデンテイ（Ｍｏｒｄｅｎｔｉ）ら、Ｐｈａｒｍａｃ ｅｕｔ、　Ｒｅｓ、８．１３５１　（１９９１）およびその引用文献に開示され ているようにして行うことができる。
以下の実施例は、本発明を実施するために現在のところ考えられる最良の形態を 説明するのみであって、本発明を限定するものではない。
Ａ９部位指向性突然変異誘発 プラスミドＤＮＡの単離、ポリアクリルアミドおよびアガロースゲル電気泳動を サンプルツクらの上記文献の開示に従って行った。
ＣＭ■プロモーターを有する吐乳動物発現プラスミドｐＲＫ５．１　（ジエネン テク）を用いてｈ　ｕ　ＨＧ　Ｆの突然変異誘発を行い、ＨＧＦ変異体を培地中 に分泌させて生物学的活性および結合性について直接アッセイした。この発現ベ クターはｐＲＫ５の誘導体であり、ｐＲＫ５の構築はＥＰ３０７．２４７　（１ ９８９年３月１５日公開）に開示されている。ｐＲＫ５．１は、自己相補的な（ ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）オリゴヌクレオチド５−ＡＧＣＴＴＧ ＣＣＴＣＧＡＧＧＣＡ−３’　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１４）を挿入すること によってＲＫ５から得た。このｐＲＫ５．１ベクターをコードするヌクレオチド 配列は、継続中の出願第０７／８８５．９７１号（１９９２年５月１８日出願） に開示されている。
使用するｈｕＨＧＦ　ｃＤＮＡは、以前に刊行されたように（ミャザワら、１９ ８９、上記）、７２８アミノ酸形態に対応する。
突然変異誘発を、大腸菌の市販のｄａｔ−ｕｎｇ−株を用い、クンケル（Ｋｕｎ ｋｅｌ）の方法に従って行った［クンケルら、Ｍｅｔｈｏｄ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ 、１且」、３６７〜３８２　（１９８７）］。インビトロ突然変異誘発に使用し た合成オリゴヌクレオチドおよびノークエンノングプライマーは、記載に従って ［マ・ノテウチ（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ）　ら、Ｊ　、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓ ｏｃ　上０３．３１８５−３１９１　（１９８１）］アプライドパイオシステム ３８０Ａ　ＤＮＡ合成機を用いて調製した。所望の変異を生成させるため、所望 のアミノ酸置換をコードする配列のオリゴヌクレオチドを合成し、プライマーと して用いた。これらオリゴヌクレオチドを、標準方法により調製しておいた一本 鎖ｐＲＫ５．１−ｈｕＨ３Ａにアニールした［ビエラ（Ｖｊｅｒａ）ら、Ｍｅｔ ｈｏｄ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ　よ４２．３　（１９８７）コ。
３種のチオキンリボヌクレオチド、チオキシリポアデノノン（ｄＡＴＰ）　、デ オキ／リボグアノ／ン（ｄＧＴｐ）　、およびチオキシリポチミジン（ｄＴＴＰ ）の混合物を、製造業者によってキラ１−中に提供される修飾チオーデオキシＩ Ｊボヌクレオノン（ｄＣＴＰ　（ａＳ）と呼ばれる）と混合し、上記オリゴヌク レオチドをアニールした一本鎖ｐＲＫ５．］、−ｈｕＨＧＦに加えた。
この混合物にＤ　Ｎ　Ａポリメラーゼを加えると、変異した塩基以外＋１ｐＲＫ ５゜１−ｈｕＨＧＦと同一のＤＮＡ鎖が生成された。加えて、この新ｊこなりＮ Ａ鎖Ｉこは、ｄＣＴＰの代わりにｄＣＴＰ（ａＳ）が含まれており、ｆｆｉ＋限 エンドヌクレアーゼ消化から保護していた。このヘテロ二本鎖の鋳型鎖を適当な ｉｌ＋限酵素でニックした後、変異オリゴマーを含む領域を通り越して鋳型鎖を Ｅｘｏｌ［［ヌクレアーゼで消化した。ついで、反応を停止させて、部分的にの み一本鎖の分子を得た。
ついで、４種のすべてのデオキシリポヌクレオチド三リン酸、ＡＴＰおよびＤＮ Ａリガーゼの存在下でＤＮＡポリメラーゼを作用させることにより、完全な二本 鎖のＤＮＡホモ二本鎖分子を生成させた。
ｐＲＫ５．１−ｈｕＨＧＦ変異体分子を生成させるためのプライマーとして使用 するため、以下のオリゴヌクレオチドを調製した。
ｆｓＲＱ、　ＩＤ、　ＮＯｉ　１１ Ｒ４９４Ｄ　ｈｕｔ（ＧＦ：　ＧＡＡＴＣＣＣＡＴＩＴＡＣＣＡＣＧＴＣＣＡＡ ＴＴＧＴｒＴＣＧ　ｆＳＥＱ　エロ　Ｎ０２）Ｒ４９４Ａ　ｈｕＨＧＦ：　ＣＣ ＣＡＴＴｒＡＣＡＡＣＴＧＣＣＡＡＴＴＧＴＴｒＣＧ　ｆＳＥＱ、より、　Ｎｏ ：　３１Ｑ５コ４ＨｈｕＭＧＦＡＧＡＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＴＧ丁Ｃａ丁ＧＣＡ （ＳＩＩＱ、より、Ｎｏ：４＋Ｙｇ７３Ｓ　ｈｕＨＧＰ：　ＡＧＴＧＧＧＣＣＡ ＣＣＡＧＡＡＴＣＣＣＣＣＴ　ｆＳＥＱ、より、Ｎｏ：　５１ＶＧ９２Ｓ　ｈｕ Ｊ（ＧＦ　ＴＣＣＡＣＧＡＣｃに心Ａ〕いＡ−；ＣｋＣ＋Ｓ！ＩＱ、ＸＤ、Ｎｏ ：　６１Δに１ｈｕＨＧＦ　ＧＣＡＴｒＣＡＡＣＴｒσｒｃａσｒＴＴｃＴＡＡ ＴＧＴＡＧＴｃ　ｆＳＥＱ、より、ＮＯ＋　７１Δに２　ｈｕＨＧＦ：　ＣＡＴ ＡＧＴＡＴＩ’ＧＴＣＡＧＣＴＴ（ンＡＣＴＴσｒＧＡＡＣＡ　＋ＳＥＱ、ＩＤ 、Ｎｏ：　８１Δに３ｈｕｌ（ＧＦ：　ＴＣＣＡＴＧＴＣＡＣＡτＡＴσｒＴｃ ＡＧＴＩ℃Ｔｌ了ＣＣＡＡ　ｆＳＥＱ、ＩＤ、Ｎｏ　９１Δに４　ｈｕＨＧＦ： 　ＴＧＴＧＧＴＡＴＣＡＣＣＴＴＣＡＴＣＴｒＧＴＣＣＡＴＧＴＧＡ　＋ＳＥＱ 、ＸＤ、ＮＯ１０１Ｎ−〕０３　ｈｕＨＧＦ：　ＡＣＣＴｒαすＷχ＊’ｒｒＡ ＭｔＴ７０７ｃ　（ＳＥＱ、ＸＤ、Ｎｏ１ｌｉＮ−１８４ｈｕＨＧＦ　ＴＴＧＴ ＣＣＡＴＧＴＧＡＴＴＡＡＴＣＡＣ八〇Ｔ　ｆＳへＱ　より、ＮＯ１２）６−Ｊ 詮　ＧＴＴＣ！ＴＣＣＣＡＴｒＴＡＣＣＴＡＴＣＧＣＡＡＴｒＧ　ｆ；ＲＱ、よ り、　ＮＯ：Ｌ］１Ｙ６７３Ｓ、Ｖ６９２Ｓ　ｈｕＨＧＦ変異体を、これら２つ の変異を生成するのに使用した両オリゴヌクレオチドを用い、鋳型としての野性 型のｈｕＨＧＦから得た。
上記プロトコールを用いて生成した変異体ｈｕＨＧＦ構築物を、コンピテント細 胞の調製および形質転換のための標準塩化カルシウム法（サンプルツクら、上記 ）を用いて大腸菌宿主株ＭＭ２９４ｔｏｎＡ中に形質転換した。ＭＭ２９４ｔｏ ｎＡ（Ｔｌファージに対して耐性である）は、ＴｎｌＯトランスポゾンのｔｏｎ Ａ遺伝子中への挿入およびその後の不正確な切り取りにより調製した。つ菌宿主 ＭＭ２９４中に挿入した（ＡＴＣＣ３１，４４６）。
細菌形質転換体の個々のコロニーからのＤＮＡ抽出物を、サンプルツクら、上記 の標準ミニプレツブ（＋＋１ｎｉｐｒｅｐ）法を用いて調製した。プラスミドを セファクリルＣＬ６Ｂスピンカラムに通してさらに精製し、ついでンークエフン ングによりおよび制限エンドヌクレアーゼ消化およびアガロースゲル電気泳動に より分析した。
Ｂ　ヒト胚腎臓２９３細胞のトランスフェクション正しい配列を有するプラスミ ドを用い、リン酸カルシウム法によりヒト胎児腎臓２９３細胞をトランスフェク ションした。２９３細胞を６ウエルプレート中で７０％集密（ｃｏｎｆｌｕｅｎ ｃｅ）まで増殖させた。２．５ｕｇのｈｕＨＧＦプラスミドＤＮＡ変異体を１５ ０μｌの１ｍＭトリス−ＨＣＬ　０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ。
０．２２７Ｍ　ＣａＣＬ中に溶解した。これに１５０μｌの５０ｍＭ　ＨＥＰＥ Ｓ緩衝液（ｐＨ７，３５）　、２８０ｍＭ　ＮａＣ１，１，５ｍＭＮａＰ○４を 加え（撹拌しながら滴下）、２５°Ｃにて１０分間沈殿を生成させた。ついで、 懸濁した沈殿を６ウエルプレート中の個々のウェル中の細胞に加えた。細胞単層 をＤＮＡ沈殿の存在下で４時間インキュベートし、ＰＢＳで１回洗浄し、血清不 含培地中で７２時間培養した。安定な集団が生成したときに、ＨＧＦ　ｃＤＮＡ をエビソーム性ＣＭＶ駆動発現プラスミドｐｃｉｓＥＢＯＮ中にサブクローニン グした（カンアンズ（Ｇ、　Ｃａｃｈｉａｎｅｓ）　、ホー（Ｃ，Ｈｏ）、ウェ ーバ−（Ｒ、Ｗｅｂｅｒ）　、ウィリアムス（Ｓ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ）　、ゲソ デル（Ｄ、　Ｇｏｅｄｄｅｌ）およびレンゲ（Ｄ、　Ｌｕｅｎｇ）、調製中）。
ｐｃｉｓＥＢＯＮは、ネオマイコンホスホトランスフエラーゼをコードする選択 マーカー遺伝子（ＮＥＯ）　、エプスタインバーウィルス起源の複製起点（ｏｒ ｉＰ）およびウィルス性ＥＢＮＡ−１遺伝子を含むｐＲＫ５誘導体である。ＥＢ ＮＡ（遺伝子の産物は、ｏｒｉ　Ｐ配列を含むプラスミドの安定なエビソーム複 製を促進する［カシアンズら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、出版中（１９９２）を参照 ］。ｐｃｉｓＥＢＯＮをコードするヌクレオチド配列は、継続中の出願第０７／ ８８５．９７１号（１９９２年５月１８日出願）に開示されている。これら集団 を不オマイフン選択培地中で直接選択した。
実施例２ ＨＧＦ（他の知られた成長因子とは異なる構造を有する分子である）の多面発現 的活性の観点から、この因子とそのレセプターとの分子相互作用を理解すること が重要である。実施例１に記載するようにして産生させたｈｕＨＧＦ変異体を、 初代培養において肝細胞のＤＮＡ合成を誘発する能力および可溶性形態のｈｕＨ ＧＦレセプターへの結合に競合する能力について分析した。
Ａ、野性型ｈｕＨＧＦおよびｈｕＨＧＦ変異体のタンパク質定量２つのモノクロ ーナル抗体を用いた特異的２部位ｈｕＨＧＦサンドイッチＥＬＩＳＡを用い、野 性型組換えｈｕＨＧＦ　（ＷＴ　ｒｈｕＨＧＦ）　、一本線およびプロテアーゼ 置換変異体を定量した。マイクロタイタープレート（マクシソーブ（Ｍａｘｉｓ ｏｒｂ）　、ヌンク）を、５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９，６）中、４℃にて一夜 、モノクローナル抗ｒｈｕＨＧＦ抗体Ａ３．１．２　（ＩｇＧ２ａ表現型、親和 性：３．２Ｘ１０−’モル）（１０ｍｇ／ｍｌ）でコーティングした。０．５％ ＢＳＡ　（シグマ）、０．０１％チメロサール（ＰＢＳ　（ｐＨ７，４）中）で プレートをブロックし、ついで洗浄した後、ＨＧＦ試料の２つずつの系列希釈を 調製し、それと平行してＣＨＯ発現したｒ　ｈ　ｕ　ＨＧ　Ｆ　（４０〜０．１ 　ｎ　ｇ／　ｍＬ）を標準として用いた。これら希釈液（５０μｍ）を１　：　 １５００希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合モノクローナル抗ｒｈｕＨＧ Ｆ抗体Ｂ４．３　（Ｉ　ｇＧ１表現型、親和性。
１．３Ｘ１０−’モル）とともに同時に室温にて２時間インキュベートした。Ｐ ＢＳに領０４％０−フェニレンジアミン２塩酸塩（シグマ）および０．０１２％ （Ｖ／ｖ）過酸化水素（シグマ）を添加することによって基質を調製し、１００ ｍ１を洗浄したプレートに室温にて１５分間加えた。２．２５Ｍ硫酸（５０ｍＬ ）を各ウェルに加えて反応を停止させた。４９０ｎｍにおける吸光度（４０５ｎ ｍにおける吸光度をバックグラウンドとして差し引いた）をマイクロタイタープ レート読み取り機（Ｖｍａｘ、モレキュラー・デバイシズ、メンロパーク、カリ フォルニア州）上で測定した。ジエネンテクが開発した４パラメ一ター曲線適合 プログラム（ｆｏｕｒ−ｐａｒａｍｅｔｅｒ　ｃｕｒｖｅ−ｆｉｔｔｉｎｇ　ｐ ｒｏｇｒａｍ）を用い、データを補正した。
ＨＧＦポリクローナルサンドイッチＥＬＩＳＡを用い、すべてのクリングル欠失 変異体およびＣ末端欠失変異体を定量した。簡単に説明すると、マイクロタイタ ープレート（ヌンク）を、上記のように５ｍｇ／ｍＬのモルモットポリクローナ ル（抗ＣＨ○発現ｒｈｕＨＧＦ）ＩｇＧ抗体調製物（ジエネンテク）でコーティ ングした。この抗体は、ウェスタンプロットの視覚検査にて比較したときにｒｈ ｕＨＧＦとともにＨＧＦ欠失体を認識するため、ＨＧＦ変異体をモニターするに は理想的である。プレートをブロックし、２９３細胞上澄み液の２つずつの系列 希釈（１：１０３−６．１０６）を加え、４℃にて一夜インキユベートした。精 製したＣＨＯ発現ｒｈｕＨＧＦ　（Ｚｏｏ〜０．７８ｎｇ／ｍＬ）を標準として 用い、平行してインキュベートした。プレートを洗浄し、同じポリクローナル抗 体（約４００　ｎ　ｇ／ｍＬ）ではあるがこの場合は変異体の検出のために西洋 ワサビベルオキ／ダーゼを結合したもの（上記参照）の１＋５００希釈液ととも にインキュベートした。ウェスタンブロッティングを行って、発現したＨＧＦ変 異体のサイズを測定した。このため、ポリクローナルＩｇＧ抗体調製物（５００ ｎ　ｇ／ｍＬ）を用いた標準法を用い、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳 動およびウェスタンブロッティングを行った。化学ルミネセンス検出法（アマー ンヤム）およびヤギ抗モルモットＩｇＧ＝西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体（ １：　５０００）を用い、製造業者により記載されたようにしてプロットを発色 させた。
Ｂ　可溶性ＨＧＦレセプター結合アッセイ肝細胞へのＨＧＦ結合性に関する以前 の研究によれば、ｈｕＨＧＦはその細胞表面レセプターに高親和性にて結合し得 ることが示されている（Ｋｄ〜２２４−３２ｐ：ヒグチ（Ｈｉｇｕｃｈｉ）およ びナカムラ（Ｎａｋａｍｕｒａ）　、ＢｉｏｃｈｅＩｌ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。
Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、１７４．８３１−８３８　（１９９１））　。本発明者ら は、ＨＧＦの細胞表面ヘパリン硫酸プロテオグリカンへの非特異的結合性のため ［ナルジーニ（Ｎａｌｄｉｎｉ）　ら、ＥＭＢＯＪ、１０．２８６７〜２８７８ 　（１９９１）］、可溶性形態のレセプターを用いてＨＧＦの結合性を調べる方 を選んだ。
２９３細胞から発現および分泌されたヒトＩｇＧのＦｃ定常領域に融合したヒト ＨＧＦレセプター（ｈｕＨＧＦｒ）の細胞外ドメインへのＣＨＯ発現された”’ ［ｒｈｕＨＧＦ　（２−５Ｘ１０３Ｃｉ／ミリモル、ジオンチェック（Ｔ。
Ｚ　１ｏｎｃｈｅｃｋ）　、ジェネンテクの好意により提供された）の結合を溶 液中でブロックする能力について、細胞上澄み液（ａ度が６００ｎｇ／ｍＬ未満 の場合はアミコンフィルター上で濃縮した）を試験した。
１、ｈｕＨＧＦｒ−１ｇＧキメラの構築ｃＤＮＡライブラリーからおよびＰＣＲ 増幅から単離した部分ｃＤＮＡを結合させることにより、ｈｕＨＧＦｒをコード する完全長のｃＤＮＡクローンを構築した。アミノ酸１−２７０のコード配列を 、５０ｍｅｒオリゴヌクレオチド＋　５　’　−ＡＴＧＡＡＧＧＣＣＣＣＣＧＣ ’ｌ’ＧＴＧＣＴＴＧＣＡＣＣＴＧＧＣＡＴαテＣｅｆｉＡＣＣ−１’　１（Ｓ ＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１５）でスクリーニングしてヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリ ー（メイソン（Ｔ、Ｍａｓｏｎ）　、ジエネンテクにより提供された）から単離 した。
アミノ酸８０９−１３９０をコードする配列を、オリゴヌクレオチドプローブ（ ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１６）を用いてスクリーニングしてヒト肝臓ライブラリ ー（ストラタジーン）から単離した。
ライブラリーをブレーティングする条件およびハイブリダイゼーシヨンおよびフ ィルターを洗浄する条件は、記載に従った［ゴドウスキー（Ｇｏｄｏｗｓｋｉ） ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８旦、８０８３ 〜８０８７　（１９８９）］。
ＰＣＲを用い、ＨＧＦ　ｒ　（ｃ−ｍｅ　ｔ）の残基２７１〜８０８を含有する ｃ　ＤＮＡクローンをＡ３４９細胞から単離した。ベセスダ・リサーチ・ラボラ トリーズによって提供されたモロニーマウス白血病ウィルスの逆転写酵素および 緩衝液を用い、１００μｍの反応液中のＨＧＦｒに特異的なプライマー（ＳＥＱ 　Ｉ　Ｎｏ、１７）を用い、１０μｇの全ＲＮＡを用いて逆転写を行った。この 反応混合物の１／１０をＰＣＲ増幅に用いた。１０μｍの逆転写酵素反応液、１ ０ｍＭ　ＫＣＬ　２０ｍＭ）リス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，８）　、１０ｍＭ（ＮＨ ，）ＳＯ４，６ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，，０１％トリトンＸ−１００、ＩＵのベントＤ ＮＡポリメラーゼにニー・イングランド・バイオラブズ）および各５０ビコモル の正（ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１８）および逆（ ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマー（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９）を含有する１００μ ｌの容量中でＰＣＲ反応を行つた。変性（９５℃、１分）、アニーリング（５５ ℃、４５秒）および伸長（７２℃、２分）を３０サイクル行った後、ＰＣＲ生成 物を低融点アガロースゲルから回収した。完全長のＨＧＦｒ　ｃＤＮＡをベクタ ーｐＲＫ７（ＷＯ２０１０２７９８（１９９０年３月２２日公開）を参照）中に サブクローニングし、ジデオキシヌクレオチド法により二本鎖ＤＮＡノークエン ジングを行った。
ｈｕＨＧＦｒの細胞外ドメインのコード配列をヒトＩｇＧＬＨ鎖のコード配列に ２工程で融合させた。ＰＣＲを用い、ＨＧＦｒアミノ酸９２９のコード配列の３ °側に唯一のＢＳｔＥＩＩ部位を有する断片を生成させた。７２℃における伸長 時間が３分であり４０ｎｇの完全長のＨＧＦｒ発現ベクターを鋳型として用いた 池は上記と同様に１００μｍの反応液中で５゛プライマー（ベクター中でＨＧＦ ｒコード配列の上流に位置する）および３°プライマーｔｓ’−ｘｃｒｒｒ罠丁 Ｃ閃Ｔ込Ｃσ■追πズｉσ℃に■テｃｃ’ｒ↑フ山σＡ實ｈｃ４′１（ＳＥＱ　 ＩＤ　ＮＯ：２０）を用いた。増幅後、該構築物中の唯一のＢｓ　ｔＥＩＩ部位 により上記Ｐ　ＣＲ生成物をヒトＩｇＧ−γ１　Ｈ鎖ｃＤＮＡに結合させた［べ 不ノト（Ｂｅｎｎｅｔｔ）ら、去Ｂｉｏ１．　Ｃｈｅｍ、２６６．２３０６０〜 ２３０６７　（１９９１）］。得られた構築物は、ＢｓｔＥＩＩ部位を介して（ アミノ酸■およびＴの配列を付加）ヒトＩｇＧ−γＩ　Ｈ鎖のアミノ酸２１６〜 ４４３のコード配列に融合したｈｕＨＧＦｒのアミノ酸１〜９２９のコード配列 を含んでいた。この構築物の７−クニンノングを上記と同様にして行った。
２　結合アッセイ ウザギ抗ヒトＴｇＧＦｃ特異的抗体（ジャクノン・イムノリサーチ）（１ｍｇ／ 　ｍ　Ｌ　）で４°Ｃにてコーティングした壊れやすいマイクロタイタープレー ト中で結合アッセイを行い、プレートを０．０５％トウイーン２０を含有するＰ ＢＳで注意深く洗浄した（バイオラド）。この同じ緩衝液中に０．１％ＢＳＡを 含有するＰＢＳでブロックした後、５０ｐＭの１２５１−ｒｈｕＨＧＦをウェル 当たり２５ｍＬにて加えた。各ウェルに、５ＱｍＬの細胞上澄み液の系列希釈液 （１；２５−１　＋　６０００）　、精製したＣＨＯ発現ｒｈｕＨＧＦ　（２５ ，０００−０，０６４ｐＭ）または培地を２つずつ加えた。その後、２５ｍＬの ５ＱｐＭＨＧＦレセプター：ＩｇＧ融合タンパク質を加え、プレートを穏やかに ｉＩ盪しながらインキュベートした。４時間後、平衡に達したら、プレートを洗 浄し、ウェルを個々にガンマ−カウンターでカウントした。非特異的に結合した 放射能の量を、５００倍過剰量の非標識ｒｈｕＨＧＦとともにＨＧＦレセプター ：ＩｇＧをインキュベートすることによって評価した。ＥＬＩ　ＳＡによって決 定したｈｕＨＧＦＩＩｌ［を用い、適合阻害曲線から１ｃ５０にて各類似体の解 離定数（Ｋｄ）を計算した。
Ｃ生物学的アッセイ ＷＴｈｕＨＧＦおよび変異体の生物学的活性を、初代培養におけるラット肝細胞 のＤＮＡ合成を誘発する能力により測定した。肝細胞の単離を、刊行された潅流 法を若干修飾して行った［ガリシン（Ｇａｒｒｉｓｏｎ）およびヘインズ（）（ ３ｙｎｅｓ）、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、１５　Ｑ、２２６９〜２７７　（ １９７５）］ａ簡単に説明すると、０．０２％コラゲナーゼ■型（シグマ）を含 有するＣａ”不含Ｈｅｐｅｓ緩衝食塩水（１００ｍＬ）を用い、雌スプラーグド ーリーラット（１６０〜１８０ｇ）の肝臓を門脈を通して潅流した。２０分後に 肝臓を取り出し、緩衝液中に入れ、穏やかに撹拌して結合組織および血管から肝 細胞を分離し、ナイロンメツンユで濾過した。ついで、細胞を遠心分離により洗 浄し、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍＬ ）　、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、微量元素（００１％）、トランスフェリン（ １０ｍｇ／ｍＬ）およびアプロチニン（１ｍｇ／ｍＬ）を含有するウィリアムス （Ｗｉｌｌｉａｉｓ）培地Ｅ（ギブコ）中ニ１×１０５細胞／ｍＬにて再懸濁し た。肝細胞を９６ウエルのマイクロタイタープレート（ファルコン）中、精製Ｃ ＨＯ発現ｒｈｕＨＧＦ　（１〜０．０３１ｍｇ／ｍＬ）　、２９３上澄み液（１ ４〜１：２５６）または培地のいずれかの２つずつの系列希釈液の存在下でイン キュベートした。３７℃で４８時間後、０．５ｍＣ１の３８−ＴｄＲ（１５Ｃｉ ／ミリモル、アマー／ヤム）を各ウェルに加え、さらに１６時間インキュベート した。細胞を濾紙上で回収し、洗浄し、乾燥し、ついで／ンチレーンタン液を添 加後にベツクマンプ功ンターでカウントした。各ｈｕＨＧＦ変異体について、Ｅ ＬＩＳＡで得られたＨＧＦ１１度を用い、半分−最大増殖（１単位／ｍＬとして 定義する）にて比活性（ＳＡ）（単位／ｍｇで表す）を計算した。
Ｄ、Ａ３４９細胞上でのチロノンリン酸化の誘発ヒト肺癌細胞（Ａ５４９）単層 を１０％ウシ胎仔血清を含有するＲＰＭ１１６４０培地中で培養し、５％Ｃ○２ の湿潤大気中、３７℃にて保持した。血清飢餓細胞をｒｈｕ）（ＧＦなしでまた は２００ｎｇ／ｍＬのｒｈｕＨＧＦとともに３７０Ｃにて５分間インキュベート し、５０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ　ＮａＣ１，１，５ｍＭ　ＭｇＣ］　２ ．１ｍＭ　ＥＧＴＡ、、１０％グリセリン、１％トリトンＸ−１００およびプロ テアーゼインヒビターのカクテルを含有する溶解緩衝液で抽出しこ。溶解液を抗 ＭｅｔＣＯＯｉ（抗体で免疫沈降させ、ついで抗ホスホチロシン抗体でブロッテ ィングした（上記ウェスタンブロッティングを参照）。
実施例３ 開裂部位変異体の分析 プロテアーゼの開裂部位には、一般に、位置Ｐ】に塩基性残基および（併重Ｐ゛ １およびＰ’２に２一つの疎水性アミノ酸残基が含まれる（開裂しプこペプチド 結合ｉ−従う）。ｈｕＨＧＦの提唱された開裂部位（Ｐｉ　Ｒ４９４、Ｐ’１Ｖ ４９５、Ｐ’２　Ｖ４９６）はこの一致に適合している。本発明者らは、Ｐｉ　 Ｒ４９４をり、ＥまたはＡのいずれかで置換することによりｈｕＨＧＦの開裂阻 止を試みることを選択した。、これら細胞中で発現された主要な影響のＷＴ　ｒ ｈｕＨＧＦＩｔ、みかけの分子量６９ｋＤａを有するα鎖の存在によって判断さ れるよう１こ（図２）２鎖の物質に開裂される。これら変異体は還元条件下で９ ４１＜Ｄａ（一本線ＨＧＦの予測されたサイズ）にて単一／くラドとして移動す るので、これら容度Ｔ、体（よｒｈｕＨＧＦのプロセシングを阻止するよう！＝ 思われる。これら変異体（よ、初代培養において肝細胞の増殖を誘発する能力を 完全１こ欠Ｌ＼てＬＳｌこ（図３Ａ）。し力）しながら、これら変異体を、ＨＧ Ｆレセプター＋ＩｇＧ融合タンパク質への結合に対してＷＴ　ｒｈｕＨＧＦと競 合する能力について分析したところ、その阻害曲線はＷＴ　ｒｈｕＨＧＦのもの とほぼ同じであった（図３Ｂ）。これら曲線から決定されたＫｄは、ＷＴ　ｒｈ ｕＨＧＦは該融合タンパク賀に高親和性（５０〜７０ｐＭ）で結合するが、一方 、すべての一本線変異体がＷＴ　ｒｈｕＨＧＦと比べて約２〜１０倍高いＫｄ　 （１００〜５００ｐＭ）を示すことを示した。少なくとも３つの独立のアッセイ からの結果を、Ｖ／Ｔ　ｒｈｕＨＧＦと比較した残留肝細胞増殖活性およびレセ プター結合能として表１にまとめて示す。
本発明者らの結合研究によれば、ヒグンおよびナカムラ（１９９１）によって肝 細胞上で認められたのと同様、単一クラスの高親和性結合部位（５０〜７０ｐＭ ）でＷＴ　ｒｈｕＨＧＦが可溶性レセプター融合タンパク賃に結合することが示 された。しかしながら、細胞上でのＨＧＦの結合はわずかに異なるかもしれない 、なぜなら可溶性レセプターは実際にはＩ　ｇＧＡのＦｃ部分中のヒンジのジス ルフィド架橋によって結合された二量体であるからである。
すべての一本線変異体について比活性（ＳＡ）およびＫｄ比を直接比較すると、 これら変異体は試験した最高１度で不活性であったが（ＳＡ＜３％）、レセプタ ー結合親和性は２〜３の因数で減少しただけであった。
これら結果は、ＨＧＦの２鎖形態への開裂がマイトジェン活性には必要であるこ と、すなわち、一本線ＨＧ　ＦはプロマイトジェンであることおよびＨＧＦの非 開裂影響は減少した親和性ではあるがＨＧＦレセプターに結合することを強く示 している。
胎盤から分離された「ヘルナンデス（Ｈｅｒｎａｄｅｚ）ら、（１９９２）Ｊ、 Ｃｅ１ｉＰｈｙｓλ川−１出版中］またはトランスフェクションしたＣＯ８細胞 中で発現された［ルピン（Ｒｕｂｉｎ）ら、アｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、　Ｑ一旦Δ８−８．４１．５−４１９　（１，９９１）］　ＨＣ； Ｆの主要な影響は一本鎖の影響である。マイトジェンアソセ１′で試験した場合 、−の一本線の影響のＨＧＩ”は生物学的に活性であることがわかる。本発明者 らのデータと総合して、このことは、この−末鎖ＨＧＦがマイト／−ノアノセイ の間に２鎖形聾に活性化されることを示唆している。
第二の観察は、本発明者らの競合結合アッセイによって示唆されるように、一本 線変異体がＨＧＦレセプターに結合する能力を実質的に保持していることである 。このことは、インビボでは一本鎖ＨＧＦが細胞表面のＨＧＦレセプターに不活 性の状態で結合しており、その後に適当なプロテアーゼによって活性な二重鎖の 形態に開裂されるという興味ある可能性を提示している。
ＨＧＦのプロテアーゼドメインの機能的な重要性を明らかにするため、可能性の あるセリンプロテアーゼ活性部位を再構成するために幾つかの一重、二重および 三重変異を作成した。これら変異体の構築は実施例１に記載しである。
本発明者らは、−重、二重または三重変異体のいずれかとして、ＨＧＦ残基のＱ ５３４をＨで、Ｙ６７３をＳで、またはＶ２Ｏ３をＳで置換した。マイトジェン 活性およびレセプター結合性に対するそれら変異体の影響を分析したところ、− 重度異体Ｑ５３４Ｈは、ｗｔ　ｒｈｕＨＧＦ　（３，３１０４単位／ｍｇおよび ７０ｏＭ）と比較した場合に、ＳＡ　（５，２Ｘ１０４単位／ｍｇ）またはＫｄ 　（６０ｏＭ）のいずれをも有意に変化させなかったが、一方、Ｙ６７３Ｓおよ びｖ６９２ＳはＳＡがそれぞれ約５倍および１０倍減少した。事実、これら２つ の変異体は、ＷＴ　ｒｈｕＨＧＦで認められる最大プラトーには決して達しなか った（ｗｔ　ｒｈｕＨＧＦプラトーの約５０％）。興味深いことに、これら変異 体はＷＴｒｈｕＨＧＦと同様のＫｄを示した。他の二重および三重変異体もすべ て、ＨＧＦレセプターへの結合能を保持していたが、ＳＡは明らかに減少してい た（表１）。二重変異体Ｑ５３４Ｈ，Ｙ６７３ＳおよびＹ６７３Ｓ、Ｖ６９２Ｓ 並びに三重変異体Ｑ５３４Ｈ，Ｙ６７３ＳＳＶ６９２Ｓの残留ＳＡは、ＷＴｒｈ ｕＨＧＦと比較して３％未満であった。しかしながら、これら変異体のＫｄはＷ Ｔ　ｒｈｕＨＧＦとは有口には異ならなかった（表■）。これら変異体は、ＨＧ Ｆのβ鎖内での変異はマイトジェン活性を阻害するが、ＨＧＦレセプターには依 然として結合できることを示している。それゆえ、これら変異体はレセプター結 合に引き続いて活性を欠失すると思われる。
これら結果は、β鎖はレセプター結合には必要ではないが、ある種の残基（たと えば、Ｙ６７３およびＶ２Ｏ３）はＨＧＦの構造および／または活性にとって重 要であることを示している。非極性残基のＶ６Ｏ２を極性残基のＳで置換すると 、セリンプロテアーゼで認められるように活性部位残基Ｄ５９４に対して新たな 水素結合が導入されたなら構造的変化が引き起こされたがもしれない。Ｙ６７３ を一層小さな残基であるＳで置換しても、ある種の局所的な構造修飾が導入され るかもしれない。一方、極性残基であるＱ５３４を一層小さなサイズの他の極性 残基であるＨで置換しても、この残基は暴露されるのでＨＧＦのフンホメーシ日 ンに劇的な変化をもたらすことはない、実際、Ｑ５３４Ｈ変異体はｒｈｕＨＧＦ と類似している（表■）。
実施例５ Ｃ末端欠失およびクリングル欠失の影響ＨＧＦ結合または活性にα鎖が必要がど うかを確かめるため、実施例１に記載したようにしてＣ末端欠失体を作成し、α 鎖のみを含有する変異体、または第三クリングルから後を切り取った変異体（Ｎ −３８４）または第二クリングルから後を切り取った変異体（Ｎ−３０３）とし た。
図１に示すように、β鎖かまたは増加数のクリングル配列に加えたβ鎖かのいず れかを欠失させることによってＨＧＦの幾つかのＣ末端欠失体を作成した。第一 のクリングルを有するＮ末端ドメインに対応する一つの変異体（Ｎ−２０７）は 、ポリクローナル抗体調製物を用いてウェスタンブロッティングおよびＥＬＩＳ Ａのいずれにおいても検出可能なレベルのタンパク質を発現しなかったのでそれ 以上調べなかった。ＨＧＦの最初の２つのクリングルを有する変異体（Ｎ−３０ ３）　、３つのクリングルを有する変異体（Ｎ−３８４）または完全なα鎖を有 する変異体の発現は、２５０〜６００ｎｇ／ｍＬの低さであった。ＷＴｒｈｕＨ ＧＦと比較したこれら変異体の残留ＳＡおよびＫｄをまとめて表■に示す。試験 した１度においてバンクグラウンドレベルを越える活性は観察されず、これら変 異体が生物学的活性を喪失していることを示していた。しかしながら、結合の競 合は、変異体Ｎ−３０３、Ｎ−３８４またはα鎖が依然として実質的な結合能を 保持している（ＷＴ　ｒｈｕＨＧＦの結合性と比較して２３％まで）ことを示し た。それゆえ、ＨＧＦレセプターに対する高親和性のためには、ＨＧＦのＮ末端 側２７２残基（変異体Ｎ−３０３の成熟形態）で充分である。
各クリングルドメインを欠失させた結果を表■に示す。ＨＧＦの第一のクリング ルの欠失（変異体ΔＫｌ）は生物学的活性に最も影響し、少なくとも１００倍の 減少を示した（ＳＡ　ｗｔ　ｒｈｕＨＧＦの＜０．２％）。同様に、この変異体 は２ｍｇ／ｍＬまでｗｔ　ｒｈｕＨＧＦへの結合に対して競合することができな かったので、この変異体の結合性も影響を受けた。他のすべてのクリングルの欠 失（変異体Δに２、Δに３またはΔに４）もまた、かなりのマイトジェン活性の 減少をきたした（表［）。しかしながら、これら欠失変異体のＫｄはｗｔ　ｒｈ ｕＨＧＦで観察されたものに近接したままであった。
これらデータは、クリングルに３およびに４はレセプター結合には必要でないこ とを示している。本発明者らのデータは、アミノ酸配列においてＨＧＦ／ＮＫ２ に非常に類似した変異体Ｎ−３０３がＨＧＦレセプターへの結合に対して有効に 競合する能力を保持している（Ｋｄ〜２８０ｐＭ）という意味において、ミャザ ワら、１９９１上記およびチャンら、１９９１上記による以前の観察を支持して いる。さらに、レセプターに結合するにはＮ−３０３で充分であることおよびＨ ＧＦレセプターに結合するには第二のクリングルは必要でない（分子の残り部分 の観点から）という観察は、レセプター結合性ドメインがｈｕＨＧＦのフィンガ ーおよび第一のクリングル内に含まれることを示唆している。残念ながら、本発 明者らは、本発明者らのポリクローナル抗血清を用いてこの変異体の発現を検出 することはできず、変異体Ｎ−２０７（第一のクリングルから後が欠失）が２９ ３細胞中で発現されないことを示唆していた。
表工 Ｒ４９４Ａ　ｃｏ、０３　０．３２　＋／−０，１ａＲ４９４Ｄ（ｏ、０３０． ５１＋７−０．２１Ｒ４９４Ｅ　ｃｏ、０２　０．３１　＋／’　０．１３Ｔ口 １〜７−ｃ二。
ＱＳ３４Ｈ１，Ｌ９４／−０，４４１，４８＋／−０，＋１５Ｙｇ７３ｓ　Ｏ， ２７＋／−０，０７会　１．３５　＋／−０，７２Ｖ６９２Ｓ　Ｏ，Ｏａ　Ｏ／ −０，０４１，０２＋／−。　ユ３Ｑ５コ４Ｈ１Ｙ６７］Ｓ（０，０コ２．２４ ＋／−１，１１Ｙ［１７３Ｓ、Ｖ６９２Ｓ　（０，０２１７６４／−０Ｊ３ＱＳ ］４Ｈ，Ｙ６７３Ｓ、　Ｖ６９２Ｓ　＜０．０２　１．９Ｌ　＋／−１，２１１ （７禾粘″７．、町 Ｎ・３０３（ｏ、０５０．２３＋／−０，０３Ｎ−３８４（０，０５０，２５◆ ／−０，０２ｏ−ｃｈａｚｎ　＜０．０４　０．２５　＋／−０，０１７゛；ン ７”＋ｖ鴬大、 ΔＫｌｃｏ、ｏ０２ｃｏ、０３ ＡＫ２　ｃｏ、０５　ｏ、４ｔ　＋／−０，１１１Δに３（０，０３０，５６＋ ／−０３＆Δに４　（ｏ、０７　０．ａ６　＋／−０，４６実施例６ ｈｕＨＧＦレセプターのチロシンリン酸化の誘発本発明者らは、変異体Ｒ４９４ Ｅまたは変異体Ｙ６７３ＳＳＶ６９２Ｓ　（ＨＧＦレセプターにインビトロで結 合するがマイトジェン活性は欠失している）がＡ３４９細胞中でＨＧＦレセプタ ーのチロシンリン酸化を刺激することができるかどうかを決定した。血清飢餓細 胞を精製したＷＴ　ｒｈｕＨＧＦまたは変異体で処理し、ＨＧＦレセプターの免 疫沈降物をプロットし、ホスホチロシン抗体でプローブした。ｗｔ　ｒｈｕＨＧ Ｆで刺激すると、ＨＧＦレセプターの１４５ｋＤａβサブユニツトのチロシン上 でリン酸化が引き起こされた。両度異体は、ＨＧＦレセプターのリン酸化を誘発 する能力が減少していた。
ＨＧＦによるＨＧＦレセプターβサブユニット上のチロノンリン酸化の刺激は以 前に報告されている［ボッタロら、Ｓ　ｃｉｅｎｃｅス旦よ、８０２〜８０４　 （１９９１）、ナルノー二ら、１９９１上記コ。本発明のデータは、変異体Ｒ４ ９４Ｅおよび変異体Ｙ６７３ＳＳＶ６９２Ｓがインビトロで可溶性ＨＧＦレセプ ター：ＩｇＧタンパク質に結合することができるが、Ａ３４９細胞中でのチロシ ンリン酸化の刺激においては有効ではないことを示している。この結果の一つの 解釈は、これら変異体がＡ３４９細胞上のＨＧＦレセプターに結合することがで きるが、有効なリン酸化を誘発するのに必要な機能、たとえばレセプター二量体 形成に欠けているということである。上皮成長因子や血小板由来成長因子などの 内生チロノンキナーゼを有する他のレセプタータンパク質についても、レセプタ ー−レセプター相互作用または二量体形成がキナーゼ機能の活性化に必要である ことが示されている［概略はウルリッヒおよびンユレノンガー、Ｃｅ１ｌ　６１ 　２０３〜２１２　（１９９０）を参照］。または、これら変異体は、細胞表面 に結合したＨＧＦレセプターに結合できないのかもしれない。
ＨＧＦの独特の構造は、この分子の生物学的活性を制御する複数の事象が存在す るかもしれないことを示唆している。制御の初期段階は、生物学的に活性な２鎖 形態を生成する開裂工程であるかもしれない。興味深いことに、開裂は単純にレ セプター結合を制御しているのではな（、むしろＨＧＦレセプターの活性化に必 要なその後の事象を制御しているのかもしれない。本発明者らのデータはまた、 β鎖はレセプター結合には必ずしも必要でないが、レセプター活性化の工程には 寄与することを示唆している。これら変異体は、ＨＧＦレセプターにおけるシグ ナル事象を分析するうえで有用であるかもしれない。
実施例７ ＨＧＦ／ＮＫＩの生成および特徴付け Ａ、実験手順 牲鼾　ヘパリン−セファロースをパイオーラドから購入した。モノＳカチオン交 換カラムおよびＦＰＬＣ装置をファルマノアから得た。スペクトラポル（Ｓｐｅ ｃｔｒａＰｏｒ）　／　１０透析管（分子量カットオフ　１０．　ＯＯＯ）をス ペクトラム（Ｓ　ｐｅｃｔｒｕｍ）から得た。制限酵素はすべてニュー・イング ランド・バイオラブズから得、製造業者の教示に従って用いた。抗Ｆｌａｇモノ クローナル抗体Ｍ２をＩＢＩ、コダックから得た。組換えヒトＨＧＦをジェネン テク、サウスサンフランノスコで製造した。プラスミノーゲンの精製クリングル ４は、フランク・カステリーノ（Ｆｒａｎｋ　Ｃａ５ｔｅｌｌｉｎｏ）から贈ら れた。
但！−大腸菌株２９４　（ｅｎｄ　Ａｌ　ｔｈｉ−１ｈｓｄＲＦ−ｓｕｐＥ４４ 　；ＡＴＣＣ３１４４６）を日常的な形質転換およびプラスミド調製に用いた。
大腸菌プロテアーゼ欠損株２７Ｃ７（ｔｏｎＡＤ　ｐｈｏＡ、ＤＥ１５　Ｄ　（ ａｒｇＦ−１ａｃ）　１６９　ｐｔｒ３　ｄｅｇＰ　４１　ＫａｎＲｏｌＩｐＴ Ｄ）をｐｈｏＡプロモーターの制御下でＨＧＦ／ＮＫＩを発現するのに用いた。
ズ之玉ミドの構築およびＮＫ１の境界、　プラスミドＤＮＡの単離、およびポリ アクリルアミドおよびアガロースゲル電気泳動を記載に従って行った（マニアチ スら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、コールドスプリングハーバ−ラボ ラトリ−プレス、コールドスプリングハーバ−、ニューヨーク、１９８２）。図 ８に略図で示すように（図８に示す配列は、それぞれＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２７ ．２８および２９に割り当てである）、熱安定エンテロトキフン（ｓｔｎ）シグ ナル配列、１０アミノ酸残基（Ｓ−Ｄ−Ｙ−に−Ｄ−Ｄ−Ｄ−Ｄ−に−Ｌ）（Ｓ ＥＱ　ＩＤＮＯ２６）の修飾Ｆｌａｇエピトープ配列およびヒトＨＧＦ／ＮＫＩ 　（完全なＮ末端ヘアピンおよびクリングル１ドメインを含有するヒトＨＧＦの Ｎ末端残基３２〜２１０）の成熟配列［タンヤ７　（Ｙｏｓｈｉｙａｍａ）ら、 Ｂ　ｊｏｃｈｅｍ、　Ｂ　１ｏｐｈｙｓＲｅｓ、　Ｃｏ＋ｕ、１７５．６６０〜 ６６７　（１９９１）］の３°をサブクローニングした発現プラスミドｐｂ０７ ２０　［チヤツクら、９μｔｅ５５．１８９〜１９６（１９８７）］を用い、細 菌発現を行った。Ｆｌａｇエピトープ［ホ、ノブ（Ｈｏｐｐ）ら、Ｂ　ｉｏｔｅ ｃｈｎｏｌｏｇｙ旦、１２０５−１２１０　（１９８８）］　は、ＨＧＦ／ＮＫ Ｉの発現および分泌を追跡するのに用いた。ＨＧＦ／ＮＫＩ発現の誘発は、記載 に従ってリン酸飢餓により行った（チヤツクら、上記）。サブクローニングのた め、プラスミドｐｂ０７２０をＮｓｉ＋およびＢａｍＨＩで消化し、ウシ腸ホス ファターゼで処理した。Ｆｌａｇエピトープ配列および成熟ＨＧＦの最初の６残 基に隣接するＮ５ｉｌ工ンドヌクレアーゼ制限部位をコードする特定の５゛プラ イマ（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・３０）を用いてト（ＧＦ／ＮＫＩ断片をＰＣＲによ り単離した。逆３゛プライマー （Ｓ’−ＣＣＣＧＧＧＡＧＧＣＣ’ｒＣＴＡＴ’ｒＣＡｋＣコーｒＣＴＧＡＡＣ Ａ、Ｃ〕’Ｇ−Ｊ′１（ＳＥＱＩＤＮｏ、３１）は、ＨＧＦ／ＮＫ１配列の最後 の残基をコードしていた（終止コドンおよび５ｔｕｌ工ンドヌクレアーゼ制限部 位に隣接するクリングル１の最後の７ステインを過ぎて４残基を含む）（図８） 。完全なＨＧＦｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列を含むプラスミドｐＲＫ、ｈｕＨＧＦを鋳型 として用いた［ロッカー　（Ｌｏｋｋｅｒ）　ら、ＥＭＢＯＪ−±↓、２４０３ ＝２５１０　（１９９２）］、ついで、単離したＦｌａｇ−ＮＫ１．ＰＣＲ生成 物をＮ５ｉＩおよびＳ　ｔ　ＩＪ　＋で消化し、ついで上記発現プラスミドｐｂ ０７２０中のＳｔｕｌ−ＢａｍＨＩ　１ｔＯターミネータ−断片（４１４ｂｐ； ノヨルテイセク（Ｓ　ｃｈｏｌｔｉｓｓｅｋ）およびクロス（Ｇｒｏｓｓｅ）　 、Ｎｕｃｌ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５−↓旦、３ｉ８　（１，９８７））＋こライゲ ートシた。ついで、／−クエナーゼキノト（ユナイテノド・ステイ゛ン・）〈イ オケミカル・コーポレーノヨノ）を用い、生成したｐ　ｆ　−ＮＫ　１プラスミ ド′を真正のＨＧＦ／ＮＫＩ配列を確かめるために配列決定しｔこ。生成しｔこ ｐｆ−ＮＫ１発現プラスミドの部分ＤＮＡ配列およびそれから導かれるアミノ酸 配列を図８に図示大腸菌プロテアーゼ欠損株２７Ｃ７を形質転換した。形質転換 株を発酵器中、低リン酸培地（ＩＯＬ）中で３７℃にて増殖させた。接種３６時 間後に細胞を回収し、−２０℃にて細胞ペーストとして貯蔵した。ＩＯＬの発酵 器から約１ｋｇの細胞ペーストが得られた。１００ｇの湿重量の細胞ペーストか ら出発する典型的な精製を図９に概略を示す。細胞ペーストを解凍し、ＩＬの水 冷緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，６，５ｍＭ　ＥＤＴＡ、、０．５ Ｍ　ＮａＣ１）中に懸濁した。この響濁液をホモジナイズしくティソノユマイザ −（ｔｉｓｓｕｍｉｚｅｒ）　、Ｔｅｋｍａｒ）、氷上で１時間撹拌した。この 溶液をツルポール（Ｓｏｒｖａｌｌ）　Ｇ　Ｓ　Ａローター中、１３．０００ｒ ｐｍで３０分間遠心分離にかけた。上澄み液を０．２ｍＭナルゲン（Ｎａｌｇｅ ｎｅ）フィルター（プレフィルタ−を有する）上で清澄化し、１０ｍＭ）リス− ＨＣｌ　ｐＨ７，６，５ｍＭ　ＥＤＴＡＳｏ、１５Ｍ　ＮａＣ１で希釈した。
可溶性フラクションを、平衡化したヘパリン−セファロースアフィニティーカラ ム（２，５Ｘ１．Ｏｃｍ）に流速２０ｍ１／時、４℃にて適用した。２８０ｎｍ での吸光度が基準値に達するまでカラムを１０ｍＭｈリスーＨＣｌ　ｐＨ７，５ ，５ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１５ＭＮａＣ１で洗浄した。結合した物質を１０ｍＭ ）リス−ＨＣｌ、ｐＨ７，６，５ｍＭ　ＥＤＴＡ、２Ｍ　ＮａＣｌで溶出した。
ＨＧＦ／ＨＫＩ含有フラクションを、抗ＦタンｇＭ２モノクローナル抗体（ＩＢ Ｉ／コダノク）を用いたウェスタンブロッティングにより同定した。陽性フラク ションをプールし、１０ｍＭｔ−リス−ＨＣｌ　ｐＨ７，６，５ｍＭＥＤＴＡ、 ０１５ＭＮａＣ１に対して透析し、第二のヘパリンカラム（１ｘ５ｃｍ）に適用 した。結合したタンパク質を１０ｍＭ１−リス−〇ＣＩ　ｐＨ７，６：　５ｍＭ 　ＥＤＴＡ中の０１５Ｍ〜２．０ＭＮａＣ１の線状勾配で溶出した。この段階で 、ＨＧＦ／ＮＫ１調製物は、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧ Ｅ）およびそれに続くクマノーおよび銀染色によって約８０％純粋であると判断 された。ＨＧＦ−ＮＫｌ含有含有フラクションールし、２０ｍＭ酢酸ナトリウム 、ｐＨ６，０、０．２５Ｍ　ＮａＣｌ　（負荷緩衝液）中で透析し、ファルマシ アＦＰＬＣモノＳカチオン交換カラム（サイズ５１５）上でクロマトグラフィー にかけた。０．２５Ｍから１．５ＭＮａＣ］の線状勾配で０．６ｍｌ／分の流速 にてタンパク質を溶出した。１〜１．５ｍｌのフラクションを回収した。ＨＧＦ ／ＮＫＩについて陽性のフラクションをプールし、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ　ｐ Ｈ７，６，５ｍＭＥＤＴＡ、０．２５Ｍ　ＮａＣｌに対して透析した。最終ＨＧ Ｆ／ＮＫＩ試料の銀染色は少なくとも９５％の純度を示していた。タンパク質濃 度を、以下に記載するように、ＨＧＦを標準として用いたブラッドフォード（Ｂ 　ｒａｄｆｏｒｄ）法によって決定し、アミノ酸組成分析した。
レセプター結合、ＨＧＦレセプター自己リン酸化および生物学的アッセイ。
可溶性およびＡ３４９レセプター結合アッセイ、Ａ３４９細胞上でのチロノンリ ン酸化の誘発、および初代培養でのＨＧＦに刺激された肝細胞の増殖を、上記実 施例およびロッカーら、上記（１９９２）およびマーク（Ｍａｒｋ）ら、Ｊ、Ｂ ｉｏ１９展ニー影庄ヱ、２６１６６〜２６１７１　（１９９２）の記載の通りに して行った。これら結合アッセイから、一つのタイプのレセプターに対する２つ のリガンド間での競合阻害についての等式Ｋｄ＝ＩＣ５０／　（１＋　［Ｌ］　 ／Ｋｄ）を用いて非標識競合体のみかけの解離定数（Ｋｄ）を決定した。式中、 ＩＣ５ｏは［１５Ｊ］標識ＨＧＦ結合の５０％置換に必要な非標識競合体の濃度 である。［Ｌ］は放射性標識したＨＧＦの濃度であり、Ｋｄは［”ＳＩＦ　−Ｈ ＧＦのみかけの解離定数である。
ＮＫＩの等電点電気泳動（ＩＥＦ）、　売り主の方法に従ってノベソクス（Ｎｏ ｖｅｘ）ゲルシステムを用い、ＩＥＦポリアクリルアミドゲル（ｐＨ３〜１０） 上でＨＧＦ／ＮＫＩのＩＥＦパターンを調べた。
５ＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質の分析、　ノペックスミニゲル装置およびタ ンパク質中、グリノン含有８〜１６％トリス−グリシン勾配ゲル（ノペックス） を用いた５ＤＳ−ＰＡＧＥによりＨＧＦ／ＮＫＩ試料の分画化を行った。ウェス タンブロッティングのため、ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジーノバブロノ ト（Ｎｏｖａｂｌｏｔ）装置を用いてタンパク質をニトロセルロースに移した。
３％粉乳／トリス緩衝食塩水中、室温にて一夜プロットをブロックした。Ｆｌａ ｇ−ＨＧＦ／ＮＫＩ融合タンパク融合タンパ石質めＭ２モノクローナル抗体（１ ｍｇ／ｍｌ、ＩＢＩ／コダンク）を用いた（２時間、室温）。トリス緩衝食塩水 中で３回洗浄した後、マウスＩｇＧに対する西洋ワサビベルオキシダーゼ結合抗 体（１：　５０００、アマーノヤム）とともにプロットを室温にて２０分間イン キ二べ一トし、４回洗浄した。ウェスタンプロットを、製造業者（アマ−ジャム ）の記載に従って化学ルミネッセンスにより発色させた。
Ｎ末端タンパク質ンークエンシング、オンラインＰＴＨアナライザーを備えたモ デル４７０Ａおよび４７７Ａアブライドバイオシステムズシークエンサー上で自 動タンパク質シークエンシングを行った。電気ブロッティングした（ｅｌｅｃｔ ｒｏｂｌｏｔｔｅｄ）タンパク質をプロットカートリッジ中で配列決定した。ネ ルソンアナリティカル７６０インターフェースを用い、ジャスティスイノベーシ タンソフトウエア（Ｊ　ｕｓｔｉｃｅ　Ｉ　ｎｎｏｖａｔｉｏｎ　ｓｏｆｔｗａ ｒｅ）でピークを積分した。配列の解析をＶＡＸ　８６５０上で行った［Ｊ、　 ｆ≧耶ヨ史ＩＬ：出、４１〜５２［ヘンゲル（Ｈｅｎｚｅｌ）ら（１９８７）コ コ。
アミノ酸分析、　ミリポアピコタグ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｐｉｃｏｔａｇ）ワ ークステーノタンを用い、ペプチドを１１０℃にて６Ｎ定沸ＲＲＨＣＩで２４時 間加水分解した。加水分解物をサバントスビードーバック（Ｓａｖａｎｔ　５ｐ ｅｅｄ−Ｖａｃ）濃縮器上で乾燥させ、４５分自動プログラムを用い、ニンヒド リン検出器を備えたベックマンモデル６３００アミノ酸分析器で分析した。
９９０）］中に注入し、ンエソクス（Ｓｃｉｅｘ）　ＡＰ　Ｉ　ｍ　ｈリブルク アドルブル（ｔｒｉｐｌｅ　ｑｕａｄｒｕｐｌｅ）質量分析計を用いて直接分析 した。ウマミオグロビン（ＭＷ＝１６９５１ｋＤａ）の多価イオンを装置の検量 として用いた。
／ＮＫＩの発現および精製を追跡するため、本発明者らは、図８に示すようにヒ トＨＣＦの残基３２〜２１０の上流に融合した免疫反応性のｒＦＩａｇＪエピト ープのコード配列を含有する遺伝子を構築した。ＨＧＦ／ＮＫＩは１０のシステ ィン残基を含有するので、本発明者らは、該タンパク質をペリプラズム腔へ分泌 させるためにｓｔｎリーダー配列を用い、浸透圧ショックフラクシジンから可溶 性形態を精製した（図９）。クマシー染色および抗Ｆｌａｇモノクローナル抗体 を用いたウェスタンプロット分析は、低リン酸培地中で形質転換株を増殖させる ことによってＨＧＦ／ＮＫＩの充分な誘発が達成されたことを示唆していた（図 １０Ａおよびｌ０Ｂ）、ＨＧＦ／ＮＫＩの発現レベルは１００〜５００ｍｇ／Ｌ と評価される。図９に概略を示すプロトコールを用い、１００ｇの細胞ペースト の可溶性浸透圧ショソクフラクンタンから約５００ｍｇのＨＧＦ／ＮＫ１が精製 された。最終のＦＰＬＣモノＳカチオン交換クロマトグラフィ一工程から精製さ れたＨＧＦ／ＮＫＩは、５ＤＳ−ＰＡＧＥによって決定されるように２２ｋＤａ のみかけの分子量を有し、少なくとも９５％の純度であると判断される（図１０ ０）。ＨＧＦ／ＮＫＩは、非還元条件下での５ＤＳ−ＰＡＧＥによって示される ように単量体として移動する（図１０Ｂ）。精製したタンパク質はまた、Ｆｌａ ｇ配列に対するモノクローナル抗体とも免疫反応し、ＨＧＦ／ＮＫＩとしての同 一性が確認された（図１０Ｄ）。
精製したＨＧＦ／ＮＫＩの生物学的特徴付け　−ＨＧＦ／ＮＫＩの等電点（ｐ　 Ｉ）は、ＩＥＦゲルによって判断されるように（データは示していない）８２〜 ８６である。単離したタンパク質は、正しくプロセシングされたＨＧＦ／　Ｎ　 Ｋ　１の予測されるアミノ酸組成およびＮ末端アミノ酸配列を有している（図８ ）。分子量は、電子イオン化（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ　１ｏｎｉｚａｔｉｏ ｎ）質量分析法により２１．８７２Ｄａ、、！：決定された。この数字は、１０ アミノ酸Ｆｌａｇエピトープに結合したヒトＨＧＦの３２〜２１０断片について 計算された分子量と同一である。
ＨＧＦ／ＮＫＩのレセプター結合　−本発明者らは、可溶性形態のＨＧＦレセプ ターへの競合結合並びにＡ３４９細胞上の細胞表面に結合したＨＧＦレセプター への結合についてＨＧＦ／ＮＫＩ調製物をアッセイした。代表的な実験からの阻 害曲線を図１１ＡおよびＩＩＢに示してあり、減少した親和性（野性型ＨＧＦと 比較した場合、８〜１１倍）ではあるが、［ＩＧＦレセブクーへの放射性標識し た野性型ＨＧＦの結合に対してＨＧＦ／ＮＫＩが競合し得ることを示している。
予想されるように、ヒトプラスミノーゲンからの精製クリングル４は、可溶性Ｈ ＧＦレセプターおよび細胞に結合したＨＧＦレセプターのいずれに対する結合に ついても競合しなかった。少な（とも３つの独立したアッセイにおけるこれら曲 線から評価される解離定数（Ｋｄ）は、野性型ＨＧＦが０．１０　＋／−０，０ ２ｎＭであるのに対してＨＧＦ／ＮＫＩは溶液中では１．１０　＋／　−０，０ ４ｎＭのＫｄにて結合することを示している。同様に、Ａ３４９細胞上では、野 性型ＨＧＦが０．２１　＋／−０，０４ｎＭであるのに比べてＨＧＦ／ＮＫＩは １．６＋／−０，０８ｎＭのＫｄにて結合する。これらデータは、ＨＧＦレセプ ターへの結合を媒介するのにＨＧＦのＮＫＩ領域が充分であることを示している 。
ＨＧＦレセプターのリガンドにより誘発された自己リン酸化　−ＨＧＦレセプタ ーは、リガンドの結合により１４５ｋＤａのｂ−サブユニットの自己リン酸化を 起こす。Ａ３４９細胞では１〜４ｎＭの濃度で最大応答が観察された（図１２） 。これらの１度のＨＧＦ／ＮＫＩではＨＧＦレセプターの自己リン酸化は検出す ることができなかった。しかしながら、一層高い濃度（２０ｎＭおよび１１００ ｎ；図１２）ではいくらかの自己リン酸化を検出することができた。
ＨＧＦ／ＮＫＩの生物学的特性　−ＨＧＦは初代培養の肝細胞において［３Ｈ］ −チミジンの取り込みを０．６４　ｎＭにて最大（ＩＢ、。）効果の半分で刺激 するが、同条件においてＨＧＦ／ＮＫＩは１１０ｎＭの高濃度でもＤＮＡ合成を 促進させない（図１３Ａ）。本発明者らは、ついで、初代培養の肝細胞を用いて ＨＧＦ／ＮＫＩの拮抗作用について試験した（図１３Ｂ）。ＨＧＦ／ＮＫＩは、 ６ｎＭのＩＢ５゜（肝細胞において５０％ＤＮＡ合成を中和するのにＨＧＦに対 して１０倍モル過剰のＨＧＦ／ＮＫＩに対応）でＨＧＦにより誘発されたマイト ジェン活性に対して完全に拮抗した。コントロールとして、本発明者らは、ヒト プラスミノーゲンの精製クリングル４がＨＧＦ誘発細胞分裂促進（ｍｉｔｏｇｅ ｎｅｓｉｓ）に対して拮抗しないこと示した。さらに、ＨＧＦ／ＮＫＩはＥＧＦ によって促進された細胞分裂促進を中和することができなかったので（データは 示していない）、ＨＧＦ／ＮＫＩの作用は特異的であった。それゆえ、ＨＧＦ／ ＮＫＩは、ＨＧＦの強力で特異的なアンタゴニストである。
実施例８ ＨＧＦ−１ｇＧキメラの構築および発現野性型ｈｕＨＧＦ中のコード配列中の唯 一のＫｐｎ１部位を、二本鎖合成リンカ−［５°−ＣＡＣＡＧＴＣＧ−３°（Ｓ ＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１）および５°−ＧＴＧＡＣＣＧＡＣＴＧＴＧＧＴＡＣ− ３°（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２）］によりヒトＩｇＧ−γＩＨ鎖ｃＤＮＡの唯 一のＢｓｔＥｎ部位に連結した。得られた構築物には、２つのアミノ酸（■およ びＴ）によってＩｇＧ−γＩＨ鎖のアミノ酸２１６〜４４３に融合したＨＧＦの 全７２８アミノ酸をコードする配列が含まれていた。
変異体Ｒ４９４Ｅおよび変異体Ｙ６７３Ｓ、Ｖ６９２Ｓ　（実施例１の記載に従 って調製）のコード配列を同様にしてＩｇＧ−７１に融合させた。
ＮＫ２８ＧＦ−ＩｇＧ　（略してＮＫ２−１　ｇｃとも称する）を構築するため 、二本鎖合成リンカ− ５’ＪＬＣＴＧＴＧＣＡＡＴ’ｒＡＡＡＡＣＡＴＧＣＣＡＧＡＣＧ−３−（ＳＥ Ｑより、　Ｎｏ：　２３＋５　’　−ＧＴＧＡＣＣＧＴＣＴＣＧＣＡＴｖ′ｒｒ ｒ＋ｒＡＡＴ］℃ＣＡＣＡＧＴ−３’　ｆｓＥＱ、　ＩＤ、　Ｎｏ：　２４＋を 用いてＩｇＧ中の唯一のＳｃａ　１部位を上記ＩＧＦ−７１Ｈ鎖ｃＤＮＡ構築物 のＢｓｔＥＩＩ部位に連結させた。このことにより、ミャザワら、上記に記載さ れている天然のＨＧＦ／ＮＫ２変異体のコード配列が再構築される。
ＮＫＩ　ＨＧＦ−ＩｇＧ　（ＮＫＩ−ＩｇＧとも称する）の構築は、−重鎖ＨＧ Ｆ−ＮＫ２鋳型を用いて欠失変異体を「選別する（ｌｏｏｐ　ｏｕｔ）　Ｊこと によって行った。使用した変異誘発オリゴヌクレオチドは以下のようであった。
Ｓ　’　−ＧＴＣＧＧＴＧＡＣＣＧＴＣＴＣＴｒαニｉ１闇Ｇ−３′＋　ＳＥＱ 　より、　Ｎｏ：　２５＋。
得られたｃＤＮΔには、アミノ酸Ｅ、Ｔ、ＶおよびＴをコードするリンカ−配列 を介してＩｇＧ−７１のアミノ酸２１６〜４４３をコードする配列に連結したＨ ＧＦのアミノ酸１〜２１０をコードする配列が含まれていた。
２９３細胞中での発現は、上記のようにして行った。
コントロールの２９３細胞およびＨＧＦ−１ｇＧキメラを発現する２９３細胞を 、還元条件下（図５Ａ）および非還元条件下（図５Ｂ）にて８％５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅ上の電気泳動により分析した。レーンＭ（モック）は、コントロール細胞では 発現が検出されなかったことを示している。他のレーンは、以下のキメラを示す 。
レーン１　：Ｎ−Ｎ−３Ｏ３−１ レーン２　：　ＨＧＦ−１ｇＧ レーン３：Ｙ６７３Ｓ、Ｖ６９２Ｓ　ＨＧＦ−ＴｇＧレーン４　：Ｒ４９４Ｅ　 ＨＧＦ−１ｇＧＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の結果は、これらキメラが二量体とし て発現されたことを明らかに示している。
これらＨＧＦ−変異体−免疫グロブリンキメラの幾つかについて提唱されている 構造を図５Ｃに示す。
Ａ３４９細胞への１２＋１ｉ−標識ｒｈｕＨＧＦの結合に対して野性型組換えヒ トＨＧＦ　（ｗｔ　ｒｈｕＨＧＦ）−ＴｇＧキメラまたはＨＧＦ変異体−１ｇＧ キメラのいずれかが競合する能力を、本質的にナルノー二ら、ＥＭＢＯＪ　上ｑ １２８６７〜２８７８　（１９９１）の記載に従うが若干修飾して調べた。２４ ウエルプレート中に１０’細胞／ウエルの密度にて接種したＡ３４９細胞をＤＭ ＥＭ中で一夜増殖させ、ついで血清不含培地に２時間移した。２０ｍＭ　ＨＥＰ ＥＳ。
０２％ＢＳＡおよび０．０２％ＮａＮ３、ｐＨ７，０を含有するハンクス培地中 、４℃にて３時間穏やかに震盪しながら結合を行った。各ウェルに５０ｐＭのＩ ２＄１−ｒｈｕＨＧＦまたはＨＧＦ変異体および指示した濃度の競合体を入れた 。抽出および洗浄をナルジー二ら、上記の記載に従って行った。
図６Ａおよび６Ｂに示す結果は、試験したＨＧＦ−１ｇＧキメラが野性型ヒトＨ ＧＦ　（ｗｔ　ｈｕＨＧＦ）と同様にＡ３４９細胞中の内生ＨＧＦｒに結合する ことを示している。
実施例１０ ラット肝細胞初代培養に対するマイトツエン作用変異体ＨＧＦ分子およびＨＧＦ 変異体−１ｇＧキメラを、実施例２Ａに記載した２部位ｈｕＨＧＦサラドイッチ ＥＬ［ＳＡアッセイで定量した。ｗｔ　ｒｈｕＨＧＦ、所定のＨＧＦ変異体、お よびＨＧＦ変異体−１ｇＧキメラを発現する２９３細胞からのならし培地を、実 施例２Ｃに記載した４Ｈ−チミジン取り込みアツセイにおいてラット肝細胞初代 培養に対するマイトジェン作用について試験した。
その結果を図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃに示す。
図７八に示すように、野性型ｈｕＨＧＦをコードするプラスミドでトランスフェ クションした細胞からのならし培地は、ラット肝細胞初代培養において３Ｈの取 り込みを刺激した。上記で示したように、−重鎖ＨＧＦ変異体Ｒ４９４Ｅ　ＨＧ Ｆおよびプロテアーゼドメイン変異体Ｙ６７３Ｓ、Ｖ６９２Ｓ　ＨＧＦはマイト ジェン活性を欠いていた（図７Ｂ）。しかしながら、興味深いことに、これら変 異体のマイトジェン活性はＩｇＧ融合融合タンパクリて発現された場合には完全 に回復された。同様に、ＮＫ２−１ｇＧ変異体（図７Ａおよび７Ｃ）　、ＮＫＩ −１ｇＧ変異体（図７Ｃ）を発現する細胞からのならし培地も実質的なマイトジ ェン活性を示したが、ＮＫ２またはＮＫ】単独（ＨＧＦ／ＮＫＩについては実施 例７を参照）を発現する細胞からのならし培地では実質的なマイトンエン活性を 示さなかった。これら実験はまた、すべてのＩｇＧ融合融合タンパ肪質マイトジ ェンとして働くわけではないことを示している。なぜなら、ＣＤ４−１ｇＧコン トロール（ま肝細胞の増殖を誘発することができなかったからである。このデー タは、ＩｇＧＨ鎖頌域のＨＧＦ変異体への融合が、これら変異体を二量体として 発現されるようにすることによってマイトジェン活性を回復することを示してい ると思われる。
上記の記載は特に好ましい態様について言及するものであるが、本発明（まこれ らに限定されるものでないことが理解されるであろう。当業者であれ（ｉ、本発 明の総括的な概念から逸脱することなく、開示した書様に種々の変更を施すこと 力（できるであろう。そのような変更はすべて本発明の範囲に包含されるもので ある。
配列表 配列番号：］ 配列の長さ、４７塩基 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロンー：二直鎖状 配列。
ＴＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＴｒＴＡＣＡＡＣＣＴＣＧＡＧＴ’ｒ’ＧＴＴ　ＴＣＧ ＴＴＴＴＧＧＣＡＣＡＡＧＡＴ　Ａ７配列番号：２ 配列の長さ・３０塩基 配列の型：核酸 鎖の数・−重鎖 トポロジー・直鎖状 配列・ 配列番号　３ 配列の長さ・２６塩基 配列の型　核酸 鎖の数　−重鎖 トポロン−直鎖状 配列 ＣＣＣＡＴＴＴＡＣＡ　ＡＣＴＧＣＣＡＡＴＴ　ＧＴｒＴＣＧ　２６配列番号、 ４ 配列の長さ：２２塩基 配列の型：核酸 鎖の数　一本鎖 トポロジー、直鎖状 配列： λフいΩ０コｖＡｃＡｒｒ′ｒＧＴＣＧＴＧ　Ｃλ２２配列番号、５ 配列の長さ　２２塩基 配列の型、核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー：直鎖状 配列。
ＡＧＴＧＧＧＣＣＡＣＣＡＧＡＡＴＣＣＣＣＣＴ　２２配列番号、６ 配列の長さ：２３塩基 配列の型：核酸 鎖の数　一本鎖 トポロジー、直鎖状 配列 ＴＣＣＡＣＧＡＣＣＡ　ＧＧＡＣＡＡＡＴＣＡ　ＣＡＣ２３配列番号、７ 配列の長さ、３０塩基 配列の型：核酸 鎖の数、一本鎖 トポロジー、直鎖状 配列： ＧＣＡＴｒＣＡＡＣＴ　ＴＣＴＧＡＧＴＴＴＣＴＡＡＴＧＴＡＧＴＣ３０配列番 号：８ 配列の長さ、３０塩基 配列の型、核酸 鎖の数、一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列。
ＣＡＴＡＧＴＡＴｒＧ　ＴＣＡＧＣＴＴＣＡＡ　ＣＭ′ｃ′ｒＧＡＡＣＡ３０配 列番号：９ 配列の長さ＝３０塩基 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー、直鎖状 配列： ＴＣＣＡＴＧＴＧＡＣＡＴＡＴＣＴＴＣＡＧ　ＴｒＧＴＴｒＣＣＡＡ　３０配列 番号：１０ 配列の長さ：３０塩基 配列の型・核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー、直鎖状 配列。
ＴＧＴＧＧＴＡＴＣＡ　ＣＣＴｒＣＡＴＣＴＴ　ＧＴＣＣＡＴＧＴＧＡ　３０配 列番号　１１ 配列の長さ、２４塩基 配列の型・核酸 鎖の数・一本鎖 トポロジー・直鎖状 配列： ＡＣＣＴｒＧＧＡＴＧ　ＣＡＴｒＭＧＴＴＧ　ＴＴｒＣ２４配列番号　１２ 配列の長さ：２３塩基 配列の型　核酸 鎖の数　−重鎮 トポロジー・直鎖状 配列 ＴＴＧＴｃｃＡＴＧＴ　ＧＡＴＴＭＴＣＡＣＡＧＴ　２］配列番号：１３ 配列の長さ＝３５塩基 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロンー：直鎖状 配列・ ＧＴＴＣＧ’ｒＧＴＴＧ　ＧＧＡＴＣＣＣＡＴＴ　ＴＡＣＣＴＡＴＣＧＣＡＡＴ ｒＧ　３５配列番号、１４ 配列の長さ＝１６塩基 配列の型：核酸 鎖の数、一本鎖 トポロジー・直鎖状 配列。
ＡＧＣＴＴＧＣＣＴＣＧＡＧＧＣＡ　１６配列番号　１５ 配列の長さ：５１塩基 配列の型、核酸 鎖の数　一本鎖 トポロソー：直鎖状 配列・ ＡＴＧＡＡＧＧＣＣＣＣＣＧＣＴＧＴＧＣＴ　ＴＧＣＡＣＣＴＧＧＣＡＴＣＣＴ ＣＧＴＧＣＴＣＣＴＧＴＴｒＡＣ５０配列番号：１６ 配列の長さ二６０塩基 配列の型：核酸 鎖の数、−末鎖 トポロジー：直鎖状 配列： ＣＡＣＴＡＣＴＴＡＧ　ＱＡＴＧＧＧＧＧＡＣＡＴＧＴＣＴＧＴＣＡ　ＧＡＧＧ ＡＴＡＣＴＧ　ＣＡＣＴＴＧＴＣＧＧ　５０ＣＡＴＧＡＡＣＣＧＴ　Ｇ。
配列番号・１７ 配列の長さ＝２２塩基 配列の型　核酸 鎖の数ニ一本鎖 トポロジー二直鎖状 配列。
ＴＡＧＴＡＣＴＡＧＣＡＣＴＡＴＧＡＴＧＴ　ＣＴ　２２配列番号　１８ 配列の長さ、２２塩基 配列の型：核酸 鎖の数ニ一本鎖 トポロジー・直鎖状 配列・ ＴＴｒＡＣＴｒＣＴＴ　ＧＡＣＧＧＴＣＣＡＡ　ＡＧ　２２配列番号：１９ 配列の長さ一２５塩基 配列の型：核酸 鎖の数ニ一本鎖 トポロジー・直鎖状 配列・ ＣＡＧ（χＫｉＧＡＧＴ　ＴＧＣＡＧＡＴＴＣＡ　Ｇ（ＴＧＴ　２５配列番号、 ２０ 配列の長さ、４５塩基 配列の型・核酸 鎖の数・−末鎖 トポロジー　直鎖状 配列： ＡＧＴＴＴｒＧＴＣＧ　ＧＴＧＡＣＣＴＧＡＴ　ＣＡＴＴＣτＧＡＴＣＷ口’Ｇ ＭＣＴ　ＡＴｒＡＣ４５配列番号＝２１ 配列の長さ：８塩基 配列の型：核酸 鎖の数・−末鎖 トポロジー：直鎖状 配列： ＣＡＣＡＧＴＣＧ　１１ 配列番号：２８ 配列の長さコ４２塩基 配列の型：核酸 鎖の数ニー末鎖 トポロジー：直鎖状 配列： ＴＣＡＧＡＣＴＡＣＡ　ＡＧＧＡＣＧＡＣＧＡ　ＴＧＡＣＡＡＧＣＴＴ　９　Ｇ Ａ　４２配列番号：２９ 配列の長さ、２１塩基 配列の型、核酸 鎖の数、−重鎖 トボロンー：＠鎖状 配列。
ＴＣＡＧＡＡＧ’ｒＴＧ　ＡＡＴＡＱＡＧＧＴＴ’　Ｃ２１配列番号＝３０ 配列の長さ：５９塩基 配列の型：核酸 鎖の数ニー末鎖 トポロジー：直鎖状 配列・ ＡＧＡＡＧＡＡＡＴ　５９ 配列番号・３１ 配列の長さ・３３塩基 配列の型：核酸 鎖の数ニー末鎖 トポロジー：直鎖状 配列： ＣＣＣＧＧＧＡＧＧＣＣＴＣＴＡＴＴＣＡＡ　ｍｃＡ　ＣＴＧ　１３ＦＩＧ、３ Ａ 抑制５災ｔ”ｔ　（ｎ　Ｍ　） ＦＩＧ、３Ｂ ＦＩＧ、４ ＦＩＧ、５Ａ ＦＩＧ、５Ｂ １１０′よ＝コ　ＮＫ２−１９Ｇ ＦＩＧ、５Ｃ ；％　、”（ｎ　Ｍ　） ＦＩＧ、６Ａ 鷹痰（ｐＭ） ＦＩＧ、７Ａ 濃ｎ　（ｐＭ） 凛戊　（ｎｇ／ｍ１） ＦＩＧ、７Ｃ 巳ＰＬＣモ／　Ｓ　ｐＡ−オ？北δ≧乏りコ叶２う７ｔ　−（ＰＨ６，０）ＦＩ Ｇ、９ ２７−−−←ＨＧＦ／ＮＫ１ 濃戊　（ｎＭ） ＦＩＧ、ＩＩＡ ＦＩＧ、１ｌＢ ＦＩＧ、１２ ．１　１　１０　１００　１０００ 孟戊　（ｎＭ） ＦＩＧ、１３Ａ ５ヌ３ミノ支　（ｎＭ） ＦＩＧ、１３Ｂ フロントページの続き （３１）優先権主張番号　９５０，５７２（３２）優先臼　１９９２年９月２２ 日（３３）優先権主張国　米国（ＵＳ） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。
ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、ＣＡ、ＪＰ、ＵＳ

Claims (52)

    【特許請求の範囲】
  1. １．（ａ）それぞれ第一のレセプターおよび第二のレセプターに結合することが できる第一のリガンドおよび第二のリガンドの直接融合物からなる結合体を用意 し、その際、該第一のレセプターおよび該第二のレセプターは互いにオリゴマー を形成することができ、かつチロシンキナーゼ活性を有するレセプター、サイト カインレセプター、および神経成長因子レセプタースーパーファミリーの成員よ りなる群から選ばれたものであり、ついで（ｂ）該結合体を該第一のレセプター および該第二のレセプターと接触させて該第一のリガンドを該第一のレセプター に、該第二のリガンドを該第二のレセプターに結合させる、ことを特徴とするレ セプターの活性化方法。
  2. ２．該第一のリガンドおよび該第二のリガンドが天然のリガンドの変異体である 請求項１に記載の方法。
  3. ３．該第一のリガンドおよび該第二のリガンドが同じ天然のリガンドの変異体で ある請求項２に記載の方法。
  4. ４．該天然のリガンドがチロシンキナーゼ活性を有するレセプターに結合するこ とができる請求項３に記載の方法。
  5. ５．該天然のリガンドが肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン、上皮増殖因子 （ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子−１（Ｉ ＧＦ−１）、コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、およ び線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）よりなる群から選ばれたものである請求項４に 記載の方法。
  6. ６．該天然のリガンドがヒトＨＧＦ（ｈＨＧＦ）である請求項５に記載の方法。
  7. ７．該第一のリガンドおよび該第二のリガンドの少なくとも一方が天然のｈＨＧ Ｆのレセプター結合親和性を実質的に完全に保持しているが、単独ではＨＧＦレ セプター（ＨＧＦｒ）を実質的に活性化することができない、請求項６に記載の 方法。
  8. ８．該天然のリガンドがヘマトポエチンレセプタースーパーファミリーから選ば れるレセプターに結合することができる請求項３に記載の方法。
  9. ９．該天然のリガンドが、成長ホルモン（ＧＨ）、プロラクチン（ＰＲＬ）、胎 盤性ラクトゲン（ＰＬ）、インターロイキン１〜７（ＩＬ−１〜ＩＬ−７）、エ リトロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロフ ァージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、および顆粒球−マクロファージコロニ ー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）よりなる群から選ばれたものである請求項８に記載 の方法。
  10. １０．該天然のリガンドがヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）またはウシ成長ホルモン （ｂＧＨ）である請求項９に記載の方法。
  11. １１．該天然のリガンドが神経成長因子レセプタースーパーファミリーの成員に 結合することができる請求項３に記載の方法。
  12. １２．該天然のリガンドが神経成長因子（ＮＧＦ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ −α）、および腫瘍壊死因子−β（ＴＮＦ−β）よりなる群から選ばれたもので ある請求項１１に記載の方法。
  13. １３．（ａ）それぞれ第一のレセプターおよび第二のレセプターに結合すること ができる第一のリガンドおよび第二のリガンドからなる結合体を用意し、その際 、該第一のレセプターおよび該第二のレセプターはチロシンキナーゼ活性を有す るレセプターから選ばれたものであり、ついで（ｂ）該結合体を該第一のレセプ ターおよび該第二のレセプターと接触させて該第一のリガンドを該第一のレセプ ターに、該第二のリガンドを該第二のレセプターに結合させる、ことを特徴とす るレセプターの活性化方法。
  14. １４．該第一のリガンドおよび該第二のリガンドが互いに共有結合により融合し ている請求項１３に記載の方法。
  15. １５．該共有結合した融合物が異種リンカーを含む請求項１３に記載の方法。
  16. １６．該リンカーが免疫グロブリン定常ドメインまたは可変ドメイン配列を含む 請求項１５に記載の方法。
  17. １７．該第一のリガンドおよび該第二のリガンドの各Ｃ末端が免疫グロブリン定 常ドメイン配列のＮ末端に融合している請求項１６に記載の方法。
  18. １８．該免疫グロブリン定常ドメイン配列が、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ −３、ＩｇＧ−４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭから得られたものであ る請求項１７に記載の方法。
  19. １９．該免疫グロブリン定常ドメイン配列がＩｇＧ−１またはＩｇＧ−３から得 られたものである請求項１８に記載の方法。
  20. ２０．ＩｇＧ−１またはＩｇＧ−３のＨ鎖可変ドメインが該第一のリガンドおよ び該第二のリガンドで置換されており、該分子が、ジスルフィド結合したヘテロ 多量体またはホモ多量体として組み立てられている請求項１９に記載の方法。
  21. ２１．ＩｇＧ−１またはＩｇＧ−３の少なくともＨ鎖可変ドメインおよびＣＨ１ ドメインが該第一のリガンドおよび該第二のリガンドで置換されており、該分子 が、ジスルフィド結合したヘテロ多量体またはホモ多量体として組み立てられて いる請求項１９に記載の方法。
  22. ２２．該リンカーが非タンパク質性架橋剤の残基である請求項１５に記載の方法 。
  23. ２３．該リンカーが該第一のリガンドと該第二のリガンドとの間のジスルフィド 架橋からなる請求項１５に記載の方法。
  24. ２４．該リンカーがポリペプチドスペーサーである請求項１５に記載の方法。
  25. ２５．該スペーサーが約５〜約２５のアミノ酸を含む請求項２４に記載の方法。
  26. ２６．該第一のリガンドおよび該第二のリガンドが天然のリガンドの誘導体であ る請求項１３に記載の方法。
  27. ２７．該第一のリガンドおよび該第二のリガンドが同じ天然のリガンドの誘導体 である請求項２６に記載の方法。
  28. ２８．該天然のリガンドが肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン、上皮増殖因 子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子−１（ ＩＧＦ−１）、コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、お よび線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）よりなる群から選ばれたものである請求項２ ７に記載の方法。
  29. ２９．該天然のリガンドがヒト肝細胞増殖因子（ｈＨＧＦ）である請求項２８に 記載の方法。
  30. ３０．該第一のリガンドおよび該第二のリガンドの少なくとも一方が天然のｈＨ ＧＦのレセプター結合親和性を実質的に完全に保持しているが、単独ではＨＧＦ レセプター（ＨＧＦｒ）を実質的に活性化することができない、請求項２９に記 載の方法。
  31. ３１．該分子が、 （ａ）ＡＣＬ−ＡＣＬ； （ｂ）ＡＣＲ−［ＡＣＲ、ＡＣＬ−ＡＣＲ、ＡＣＬ−ＶＲＣＲ、またはＶＬＣＬ −ＡＣＲ］；（ｃ）ＡＣＬ−ＡＣＲ−［［ＡＣＬ−ＡＣＲ、ＡＣＬ−ＶＲＣＲ、 ＶＬＣＬ−ＡＣＲ、またはＶＬＣＬ−ＶＲＣＲ］； （ｄ）ＡＣＬ−ＶＲＣＲ−［ＡＣＲ、またはＡＣＬ−ＶＲＣＲ］；（ｅ）ＶＬＣ Ｌ−ＡＣＲ−［ＡＣＬ−ＶＲＣＲ、またはＶＬＣＬ−ＡＣＲ］：および（ｆ）［ Ａ−Ｙ］Ｒ−［ＶＬＣＬ−ＶＲＣＲ］２（式中、各Ａは同一または異なるアミノ 酸配列を表す；ＶＬは免疫グロブリンＬ鎖可変ドメイン；ＶＲは免疫グロブリン Ｈ鎖可変ドメイン；ＣＬは免疫グロブリンＬ鎮定常ドメイン；ＣＨは免疫グロブ リンＨ鎖定常ドメイン；ｎは１よりも大きな整数； Ｙは共有架橋剤の残基を示す）よりなる群から選ばれたものである請求項２８に 記載の方法。
  32. ３２．該分子においてＡアミノ酸配列が同一である請求項３１に記載の方法。
  33. ３３．該分子が少なくとも２つの異なるＡアミノ酸配列を含む請求項３１に記載 の方法。
  34. ３４．チロシンキナーゼ活性を有するレセプター、サイトカインレセプター、お よび神経成長因子レセプタースーパーファミリーよりなる群から選ばれたレセプ ターに選択的に結合することができるリガンド変異体の生物学的活性を回復する 方法であって、 （ａ）該リガンド変異体の２つの分子を直接融合させてホモ二量体を得るか；ま たは （ｂ）該リガンド変異体を第二のレセプター結合性アミノ酸配列に融合させてヘ テロ二量体を得；ついで （ｃ）該ホモ二量体またはヘテロ二量体を該レセプターに接触させて、該リガン ド変異体の一つの分子を該レセプターの第一の分子に結合させ、該リガンド変異 体の第二の分子または該第二のレセプター結合性配列を該レセプターの第二の分 子に結合させる ことを特等とする方法。
  35. ３５．チロシンキナーゼ活性を有するレセプターよりなる群から選ばれたレセプ ターに選択的に結合することができるリガンド変異体の生物学的活性を回復する 方法であって、 （ａ）該リガンド変異体の２つの分子を結合させてホモ二量体を得るか；または （ｂ）該リガンド変異体を第二のレセプター結合性アミノ酸配列に結合させてヘ テロ二量体を得；ついで （ｃ）該ホモ二量体またはヘテロ二量体を該レセプターに接触させて、該リガン ド変異体の一つの分子を該レセプターの第一の分子に結合させ、該リガンド変異 体の第二の分子または該第二のレセプター結合性配列を該レセプターの第二の分 子に結合させる ことを特等とする方法。
  36. ３６．該リガンドがｈＨＧＦ変異体である請求項３５に記載の方法。
  37. ３７．該ホモ二量体またはヘテロ二量体が免疫グロブリンアミノ酸配列を含む請 求項３６に記載の方法。
  38. ３８．該ｈＨＧＦ変異体のアミノ酸配列が免疫グロブリンの可変ドメインで置換 されている請求項３７に記載の方法。
  39. ３９．ジスルフィド結合した免疫グロブリンＨ鎖二量体の各アームにおいて、該 ｈＨＧＦ変異体のアミノ酸配列のＣ末端が、ヒンジの少なくとも一部、ＣＨ２お よびＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリン定常ドメイン配列のＮ末端に融合して いる、請求項３８に記載の方法。
  40. ４０．該変異体が、ＮＫ２−ＩｇＧ；ＮＫ１−ＩｇＧ；ΔＫ２−ＩｇＧ；Ｒ４９ ４ＥＨＧＦ−ＩｇＧ；およびＶ６７３Ｓ、Ｖ６９２ＳＨＧＦ−ＩｇＧよりなる群 から選ばれたものである請求項３９に記載の方法。
  41. ４１．チロシンキナーゼ活性を有するレセプター、サイトカインレセプター、お よび神経成長因子レセプタースーパーファミリーよりなる群から選はれたレセプ ターの天然リガンドに対するアゴニストの製造方法であって、該レセプターに結 合することができる第一のリガンド変異体を二量体形成させるか、または該レセ プターに結合することができる第二のリガンド変異体に該第一の変異体を直接融 合させることを特徴とする方法。
  42. ４２．該第一のリガンドおよび第二のリガンドの少なくとも一方が、単量体の形 態にある場合には生物学的活性を実質的に欠く請求項４１に記載の方法。
  43. ４３．チロシンキナーゼ活性を有するレセプターの天然リガンドに対するアゴニ ストの製造方法であって、該レセプターに結合することができる第一のリガンド 変異体を二量体形成させるか、または該レセプターに結合することができる第二 のリガンド変異体に該第一の変異体に結合させることを特徴とする方法。
  44. ４４．該リガンドがｈＨＧＦ変異体である請求項４３に記載の方法。
  45. ４５．該リがンド変異体が異種リンカーによって連結されている請求項４４に記 載の方法。
  46. ４６．該異種リンカーが免疫グロブリン配列を含む請求項４５に記載の方法。
  47. ４７．第一の免疫グロブリン定常ドメイン配列へのチロシンキナーゼ活性を有す るレセプターに結合することができる第一のリガンドの融合物、および第二の免 疫グロブリン定常ドメイン配列への該レセプターまたはチロシンキナーゼ活性を 有する他のレセプターヘ結合することができる第二のリガンドの融合物からなる キメラ分子。
  48. ４８．各リガンドのＣ末端が、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２またはＩｇＧ−３Ｈ鎖の ヒンジ領域およびＣＨ２およびＣＨ３ドメインへ融合したジスルフィド結合二量 体である請求項４７に記載のキメラ分子。
  49. ４９．各リガンドのＣ末端が、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２またはＩｇＧ−３Ｈ鎖の ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインへ融合したジスルフィド結合二 量体である請求項４８に記載のキメラ分子。
  50. ５０．該第一のリガンドおよび第二のリガンドがＨＧＦｒに結合することができ る請求項４８に記載のキメラ分子。
  51. ５１．該第一のリガンドおよび第二のリガンドがＨＧＦｒに結合することができ る請求項４９に記載のキメラ分子。
  52. ５２．ＨＧＦ−ＩｇＧ；ＮＫ２−ＩｇＧ；ＮＫ１−ＩｇＧ；ΔＫ２−ＩｇＧ；Ｙ ６７３Ｓ、Ｖ６９２ＳＨＧＦ−ＩｇＧおよびＲ４９４ＥＨＧＦ−ＩｇＧよりなる 群から選ばれたものである請求項４７に記載のキメラ分子。
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