ES2569373T3 - Células madre derivadas del epitelio olfativo y procedimientos para su utilización - Google Patents

Células madre derivadas del epitelio olfativo y procedimientos para su utilización Download PDF

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Abstract

Procedimiento in vitro para producir una neurona dopaminérgica recombinante, comprendiendo el procedimiento: (a) proporcionar células madre derivadas de epitelio olfativo adulto; y (b) introducir uno o más transgenes en las células madre derivadas de epitelio olfativo adulto, en el que dicho uno o más transgenes codifican una combinación de un polipéptido nurr-1 y un polipéptido pitx3; mediante el cual se produce una neurona dopaminérgica recombinante.

Description

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DESCRIPCION

Celulas madre derivadas del epitelio olfativo y procedimientos para su utilizacion CAMPO TECNICO

[0001] La materia aqul descrita se refiere, en general, a las celulas madre derivadas del epitelio olfativo. Mas particularmente, la materia aqul descrita se refiere a celulas madre derivadas del epitelio olfativo y a procedimientos para el empleo de las mismas para mejorar el dano en el sistema nervioso en un sujeto en necesidad de las mismas.

ANTECEDENTES

[0002] Los trastornos neurologicos, que incluyen los que surgen de manera espontanea (por ejemplo, la enfermedad de Parkinson (EP) y la enfermedad de Alzheimer) y las que resultan de una lesion aguda en el tejido neural, generalmente dan como resultado reducciones significativas en la calidad de vida de aquellos que desarrollan los trastornos. Desafortunadamente, los tratamientos para estos trastornos generalmente son de eficacia limitada debido a la incapacidad para prevenir o incluso revertir la naturaleza progresiva del trastorno y/o la incapacidad de proporcionar a un individuo que tiene dicho trastorno con cualquier forma de reparacion del dano causado al tejido nervioso.

[0003] La enfermedad de Parkinson (EP) sigue siendo una de las principales causas de discapacidad neurologica cronica, que afecta a mas de 1.500.000 estadounidenses. La incidencia aumenta con la edad, siendo aproximadamente 1:1000 en general, pero que afecta al 2% de la poblacion mayor de 65 anos. Se presentan aproximadamente 60.000 nuevos casos cada ano, y en los ultimos anos el numero anual de muertes por la EP ha aumentado de forma constante (Stahel, 2006). A nivel internacional, la tasa de incidencia de la EP se aproxima a 17 por 100.000 por ano, aunque esto es probablemente una subestimacion. La enfermedad de Parkinson (PD) se caracteriza por la gran perdida de neuronas dopaminergicas (DA) en la sustancia negra (SN) en el cerebro medio (Hornykiewicz, 1973b). Actualmente el tratamiento principal para la EP es L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-dopa) oral, que es el precursor de la dopamina que puede pasar la barrera hematoencefalica (Hornykiewicz, 1973a).

[0004] L-dopa proporciona ampliamente un alivio sintomatico, pero con el tiempo se vuelve menos eficaz por dos razones. En primer lugar, durante la progresion de la enfermedad las neuronas se vuelven menos sensibles al farmaco. En segundo lugar, la L-dopa no retrasa o disminuye la degeneration de las neuronas dopaminergicas (Lang y Lozano, 1998). Por lo tanto, sigue existiendo una necesidad continua para la identification de nuevas estrategias para inhibir o incluso revertir la progresion de la EP y de otros trastornos neurologicos.

[0005] La investigation reciente ha intentado identificar y aislar poblaciones de celulas que se pueden utilizar para reemplazar las neuronas dopaminergicas perdidas o en degeneracion (Marshall et al, 2006; Anderson & Caldwell, 2007). Un principio subyacente de la terapia de reemplazo celular es que la restauracion de la funcion perdida como resultado de un dano o enfermedad en el SNC puede llevarse a cabo mediante la sustitucion de celulas muertas o moribundas por las sanas. Estudios recientes sugieren ademas que el injerto de celulas madre o progenitoras puede regular o mejorar las poblaciones de progenitoras endogenas existentes y posiblemente rescatar las celulas danadas (Redmond et al., 2007). Otros investigadores han empleado trasplantes de celulas neurales obtenidas de las neuronas dopaminergicas mesencefalico ventrales (VM) fetales (Lindvall et al, 1988; Madrazo et al, 1988; Lindvall et al, 1992; Freeman et al, 1995; Borlongan, 2000). Sin embargo, estos trasplantes con frecuencia conducen a una discinesia molesta (Freed et al, 2001; Olanow et al., 2003). Incluso cuando se obtuvo una excelente reinervacion dopaminergica, que produjo mejoras cllnicas positivas en la ausencia de la discinesia, la cantidad de tejido necesario para cada paciente de EP necesito un mlnimo de 4-5 cerebros fetales (Mendez et al., 2005). Este requisito aumento la posibilidad de infection viral o bacteriana que limito significativamente la utilidad de esta estrategia. Ademas, el numero de neuronas supervivientes fue muy limitado, ya que la mayorla de las celulas injertadas murieron (Borlongan, 2000). El suministro limitado de celulas VM fetales junto con su pobre supervivencia del injerto limita seriamente la utilidad terapeutica de esta estrategia para el tratamiento de la EP. Por lo tanto, la identificacion y el aislamiento de fuentes alternas expandibles de neuronas dopaminergicas se han convertido en un importante foco de investigacion (Daadi, 2002; Doss et al, 2004; Lindvall et al, 2004) y continua siendo una necesidad continua.

[0006] El documento WO 01/53461 describe celulas madre neurales multipotentes de tejidos del sistema nervioso periferico capaces de diferenciarse en tipos de celulas neurales y no neurales.

[0007] El documento WO 03/064601 describe la preparation de celulas madre olfativas humanas aisladas mediante el cultivo de tejido humano de neuroepitelio olfativo para formar neuroesferas.

[0008] El documento WO 2004/029229 describe la promotion del desarrollo neuronal dopaminergico y la production de celulas neurales que tienen un fenotipo dopaminergico.

[0009] Roisen FJ et al., Brain Research, vol. 890 (1), 26 enero de 2001, paginas 11-22, describe celulas madre

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olfativas humanas adultas.

[0010] Zhang X. et al., Brain Research, vol. 1073-1074,16 febrero de 2006, paginas 109-119, describe la induction de la diferenciacion neuronal de celulas progenitoras derivadas de neuroepiteliales olfativas humanas adultas.

[0011] Zhang X. et al., Stem Cells, vol. 24 (2), febrero de 2006, paginas 434-442, describe el papel de los factores de transcription en la diferenciacion motoneuronas de celulas progenitoras derivadas de neuroepiteliales olfativas humanas adultas.

[0012] Marshall CT et al., Histology and Histopatology, vol. 21 (6), 1 junio de 2006, paginas 633-643, describe los usos terapeuticos de celulas madre derivadas de olfativas humanas.

[0013] Por lo tanto, sigue existiendo una necesidad de nuevas estrategias para generar poblaciones de celulas trasplantables adecuadas para una variedad de aplicaciones, incluyendo, pero sin limitation, el tratamiento de la lesion y/o enfermedad de tejidos neurologicos.

[0014] Esta description resumida muestra varias realizaciones de la materia aqul descrita, y en muchos casos se muestran variaciones y permutaciones de estas realizaciones. Esta descripcion resumida es simplemente un ejemplo de las numerosas y variadas realizaciones. La mention de una o mas caracterlsticas representativas de una realization dada es igualmente de ejemplo. Dicha realization habitualmente puede existir con o sin la caracterlstica o caracterlsticas mencionadas; del mismo modo, estas caracterlsticas se pueden aplicar a otras realizaciones de la materia aqul descrita, tanto si aparece o no en esta descripcion resumida. Para evitar la repetition excesiva, esta descripcion resumida no muestra ni sugiere todas las combinaciones posibles de tales caracterlsticas.

[0015] La materia aqul descrita proporciona neuronas dopaminergicas recombinantes o celulas progenitoras recombinantes de las mismas. En algunas realizaciones, las neuronas dopaminergicas recombinantes o celulas progenitoras recombinantes de las mismas comprenden uno o mas transgenes que codifican un polipeptido nurr-1, un polipeptido pitx3, un polipeptido lmx1a, un fragmento biologicamente activo de los mismos, un derivado biologicamente activo de los mismos, y/o cualquier combinacion de los mismos. En algunas realizaciones, un solo transgen codifica dos o mas de un polipeptido nurr-1, un polipeptido pitx3, un polipeptido lmx1a, un fragmento biologicamente activo de los mismos, un derivado biologicamente activo de los mismos, y/o cualquier combinacion de los mismos. En algunas realizaciones, el unico transgen codifica un polipeptido nurr-1 y un polipeptido pitx3. En algunas realizaciones, el progenitor recombinante de las mismas comprende una celula madre derivada del epitelio olfativo recombinante que comprende dicho uno o mas transgenes, o un derivado diferenciado de los mismos.

[0016] La presente invention proporciona un procedimiento in vitro para la production de una neurona dopaminergica recombinante, tal como se expone en las reivindicaciones. El procedimiento comprende

(a) proporcionar celulas madre derivadas del epitelio olfativo

(b) introducir uno o mas transgenes en las celulas madre derivadas del epitelio olfativo adultas, en el que dichos uno o mas transgenes codifican una combination de un polipeptido nurr-1 y un polipeptido pitx3, mediante lo cual se produce una neurona dopaminergica recombinante. En algunas realizaciones, la celula madre derivada del epitelio olfativo adulta es de un cadaver. En algunas realizaciones, la celula madre derivada del epitelio olfativo adulta es de un donante vivo. En algunas realizaciones, el donante vivo es un sujeto que tiene un trastorno neurologico. En algunas realizaciones, el trastorno neurologico es la enfermedad de Parkinson. En algunas realizaciones, las celulas madre derivadas de epitelio olfativo adultas son celulas madre derivadas de epitelio olfativo adultas y al menos uno del polipeptido nurr-1, el polipeptido pitx3, el polipeptido lmx1a o la combinacion de los mismos, derivados de una especie distinta de humano. En algunas realizaciones, el polipeptido pitx3 es un polipeptido pitx de rata. En algunas realizaciones, el polipeptido lmx1a es un polipeptido lmx1a de raton. En algunas realizaciones, el polipeptido nurr-1 es un polipeptido nurr-1 de raton. En algunas realizaciones, el procedimiento in vitro comprende ademas cultivar las celulas madre derivadas de epitelio olfativo adultas antes, durante y/o despues de la etapa de introduction en un medio que comprende un polipeptido Sonic hedgehog (Shh), un fragmento biologicamente activo del mismo, acido retinoico (RA) o un derivado biologicamente activo del mismo, forskolina (FN) o un derivado biologicamente activo de la misma, o cualquier combinacion de los mismos, en condiciones suficientes para inducir la diferenciacion neuronal en laas celulas madre derivadas del epitelio olfativo adultas, tal como se expone en las reivindicaciones.

[0017] La materia aqul descrita tambien proporciona procedimientos para producir celulas cebadas de linaje. En algunas realizaciones, los procedimientos comprenden cultivar una celula madre derivada del epitelio olfativo en un medio que comprende un polipeptido Sonic hedgehog (Shh), un fragmento biologicamente activo del mismo, un derivado del mismo, acido retinoico (RA) o un derivado biologicamente activo del mismo, forskolina (FN) o un derivado biologicamente activo de la misma, o cualquier combinacion de los mismos, en condiciones suficientes para inducir la diferenciacion neuronal en las celulas madre derivadas del epitelio olfativo, mediante lo cual se produce una celula cebada de linaje que comprende una neurona dopaminergica o celula progenitora de la misma. En algunas realizaciones, los procedimientos comprenden ademas expresar en la celula madre derivada de epitelio olfativo recombinante uno o mas transgenes que codifican un polipeptido nurr-1, un polipeptido pitx3, un polipeptido lmx1a, un fragmento biologicamente activo de los mismos, un derivado biologicamente activo de los mismos, y/o cualquier combinacion de los mismos. En algunas realizaciones, dicho uno o mas del polipeptido nurr-1, el

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polipeptido pitx3, el polipeptido lmx1a, el fragmento biologicamente activo de los mismos, el derivado biologicamente activo de los mismos, y/ o la combinacion de los mismos codificados por dicho uno o mas transgenes comprende un ortologo de raton, un ortologo de rata, y/o un ortologo humano, un fragmento biologicamente activo del mismo, un derivado biologicamente activo del mismo, o cualquier combinacion de los mismos.

[0018] La materia aqul descrita proporciona tambien procedimientos para mejorar al menos un slntoma asociado con un trastorno neurologico en un sujeto. En algunas realizaciones, los procedimientos comprenden proporcionar una neurona dopaminergica que expresa uno o mas de un polipeptido nurr-1, un polipeptido pitx3, un polipeptido lmxla, un fragmento biologicamente activo o un derivado de los mismos o un progenitor de la misma; y trasplantar la neurona dopaminergica recombinante o el progenitor de la misma en el sujeto, opcionalmente en la sustancia negra del sujeto. En algunas realizaciones, la neurona dopaminergica es una neurona dopaminergica recombinante que comprende un transgen que (a) codifica uno o mas de un polipeptido nurr-1, un polipeptido pitx3, un polipeptido lmx1a, un fragmento biologicamente activo de los mismos, y un derivado biologicamente activo de los mismos; y/o (b) comprende un promotor que es transcripcionalmente activo en la neurona dopaminergica o un progenitor de la misma que esta operativamente ligado a una secuencia codificante que codifica el polipeptido nurr-1, el polipeptido pitx3, el polipeptido lmx1a, o el fragmento biologicamente activo o derivado de los mismos. En algunas realizaciones, el progenitor es no recombinante. En algunas realizaciones, el progenitor es un progenitor recombinante que comprende uno o mas transgenes que codifican un polipeptido nurr-1, un polipeptido pitx3, un polipeptido lmx1a, un fragmento biologicamente activo de los mismos, un derivado biologicamente activo de los mismos, y/o cualquier combinacion de los mismos. En algunas realizaciones, el trastorno neurologico es la enfermedad de Parkinson. En algunas realizaciones, un solo transgen codifica dos o mas polipeptidos seleccionados del grupo que consiste en un polipeptido nurr-1, un polipeptido pitx3, un polipeptido lmx1a, un fragmento biologicamente activo de los mismos, un derivado biologicamente activo de los mismos, y/o cualquier combinacion de los mismos. En algunas realizaciones, el unico transgen codifica los polipeptidos nurr-1 y pitx3. En algunas realizaciones, la neurona dopaminergica recombinante trasplantada o progenitor recombinante de la misma inducen el crecimiento y/o la regeneracion de una o mas neuronas endogenas en el sujeto.

[0019] La materia aqul descrita proporciona tambien procedimientos para el trasplante. En algunas realizaciones, los procedimientos comprenden trasplantar en un sujeto una celula madre derivada de epitelio olfativo cebada de linaje dopaminergico o un progenitor de la misma, en el que la celula madre derivada de epitelio olfativo cebada de linaje dopaminergico expresa uno o mas transgenes que (a) codifican una o mas de un polipeptido nurr-1, un polipeptido pitx3, un polipeptido lmx1a, un fragmento biologicamente activo de los mismos, y un derivado biologicamente activo de los mismos; y/o (b) comprenden un promotor que es transcripcionalmente activo en la neurona dopaminergica o un progenitor de la misma que esta operativamente ligado a una secuencia codificante que codifica el polipeptido nurr-1, el polipeptido pitx3, el polipeptido lmx1a, o el fragmento biologicamente activo o derivado de los mismos, y ademas en el que el cebado del linaje tiene una eficacia de al menos el 1%, el 5, o el 10%. En algunas realizaciones, el linaje de cebado comprende (a) proporcionar una celula madre derivada del epitelio olfativo, opcionalmente una pluralidad de celulas madre derivadas del epitelio olfativo, opcionalmente ademas en forma de una o mas neuroesferas; y (b) introducir en la celula madre derivada del epitelio olfativo uno o mas transgenes que codifican un polipeptido seleccionado del grupo que consiste en un polipeptido nurr-1, un polipeptido pitx3, un polipeptido lmx1a, un fragmento biologicamente activo de los mismos, un derivado biologicamente activo de los mismos, y/o cualquier combinacion de los mismos. En algunas realizaciones, la pluralidad de celulas madre derivadas del epitelio olfativo se alsla de un cadaver, de un donante vivo, o una combinacion de los mismos. En algunas realizaciones, el donante vivo es el sujeto. En algunas realizaciones, las condiciones suficientes para inducir la diferenciacion neuronal comprenden cultivar la celula madre derivada del epitelio olfativo en un medio de cultivo que comprende acido retinoico aproximadamente 1 pM, forskolina aproximadamente 5 pM, y Sonic hedgehog aproximadamente 15 nM durante al menos aproximadamente 3, 4, 5, 6, o 7 dlas. En algunas realizaciones, la etapa de cultivo produce una neurona dopaminergica o un progenitor recombinante de la misma que expresa un producto de gen endogeno de tirosina hidroxilasa (TH), produce dopamina, segrega dopamina, o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, los procedimientos comprenden, ademas, cultivar la celula madre derivada de epitelio olfativo antes, durante y/o despues de la etapa de introduccion en el medio que comprende un polipeptido Sonic hedgehog (Shh), un fragmento biologicamente activo del mismo, un derivado del mismo, acido retinoico (RA) o un derivado biologicamente activo del mismo, forskolina (FN) o un derivado biologicamente activo del mismo, o cualquier combinacion de los mismos, en condiciones suficientes para inducir la diferenciacion neuronal en la celula madre derivada de epitelio olfativo. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un trastorno neurologico. En algunas realizaciones, el trastorno neurologico es la enfermedad de Parkinson.

[0020] La materia aqul descrita tambien proporciona procedimientos para inducir el crecimiento y/o regeneracion de una neurona en un sujeto. En algunas realizaciones, los procedimientos comprenden trasplantar una pluralidad de celulas madre derivadas del epitelio olfativo en el sujeto en un lugar y en un numero suficiente para inducir el crecimiento y/o regeneracion de una neurona en el sujeto. En algunas realizaciones, el trasplante es en un sitio del sistema nervioso central en el sujeto. En algunas realizaciones, el sitio del sistema nervioso central es la sustancia negra. En algunas realizaciones, el sitio del sistema nervioso central es el cerebro medio del sujeto. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un trastorno neurologico asociado con la perdida de neuronas dopaminergicas, opcionalmente en el que el trastorno neurologico es la enfermedad de Parkinson. En algunas realizaciones, los procedimientos comprenden ademas diferenciar la celula madre derivada de epitelio olfativo in vitro mediante la

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expresion en la celula madre derivada de epitelio olfativo de uno o mas transgenes que codifican un polipeptido seleccionado del grupo que consiste en un polipeptido nurr-1, un polipeptido pitx3, un polipeptido lmx1a, un fragmento biologicamente activo de los mismos, un derivado biologicamente activo de los mismos, y/o cualquier combinacion de los mismos. En algunas realizaciones, al menos uno del polipeptido nurr-1, el polipeptido pitx3, y el polipeptido lmx1a es un ortologo humano del mismo. En algunas realizaciones, el trasplante proporciona a la neurona una cantidad eficaz de un factor neurotrofico suficiente para proporcionar/causar que la neurona crezca y/o se regenere y/o sobreviva. En algunas realizaciones, el factor neurotrofico incluye un factor neurotrofico derivado del cerebro (BDNF).

[0021] La materia aqul descrita proporciona tambien procedimientos para liberar una citoquina o un factor de crecimiento al sistema nervioso central de un sujeto. En algunas realizaciones, los procedimientos comprenden trasplantar en el sujeto una celula madre derivada de epitelio olfativo o un derivado diferenciada de la misma que expresa la citoquina o factor de crecimiento, en el que el trasplante es en un sitio del sistema nervioso central en el sujeto. En algunas realizaciones, la citoquina o factor de crecimiento se seleccionan del grupo que consiste en factor neurotrofico derivado del cerebro (BDNF), factor de crecimiento nervioso (NGF), neurotropina 3 (NT3), neurotropina 4/5 (NT4/5), y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). En algunas realizaciones, la liberacion da lugar a la restauracion de un deficit funcional en el sujeto. En algunas realizaciones, el deficit funcional resulta de una lesion neurologica en el sujeto. En algunas realizaciones, el derivado diferenciado de la misma comprende una neurona dopaminergica recombinante o progenitor recombinante de la misma que comprende uno o mas transgenes que codifican un polipeptido nurr-1, un polipeptido pitx3, un polipeptido lmx1a, un fragmento biologicamente activo de los mismos, un derivado biologicamente activo de los mismos, y/o cualquier combinacion de los mismos. En algunas realizaciones, al menos uno del polipeptido nurr-1, el polipeptido pitx3, y el polipeptido lmx1a es un ortologo humano de los mismos.

[0022] La materia aqul descrita proporciona tambien procedimientos para proporcionar una funcion de neuronas dopaminergicas a un sujeto con necesidad de la misma. En algunas realizaciones, los procedimientos comprenden introducir una pluralidad de celulas madre derivadas del epitelio olfativo y/o derivados diferenciados in vitro de las mismas en el cerebro medio del sujeto en un numero y en condiciones suficientes para permitir que al menos una de la pluralidad de celulas madre derivadas de epitelio olfativo se diferencie en una neurona dopaminergica funcional, proporcionando de este modo una funcion de neuronas dopaminergicas a un sujeto. En algunas realizaciones, los derivados diferenciado in vitro se diferencian mediante la expresion en al menos una celula madr derivada de epitelialo olfativo de uno o mas transgenes que codifican un polipeptido seleccionado del grupo que consiste en un polipeptido nurr-1, un polipeptido pitx3, un polipeptido lmx1a, un fragmento biologicamente activo de los mismos, un derivado biologicamente activo de los mismos, y/o cualquier combinacion de los mismos. En algunas realizaciones, los derivados diferenciados in vitro se diferencian mediante la exposicion de al menos una celula madre derivada de epitelio olfativo a un factor neurotrofico que induce la diferenciacion de la celula madre derivada de epitelio olfativo a una neurona dopaminergica y/o que ceba la celula madre derivada de peitelio olfativo para diferenciarse en una neurona dopaminergica. En algunas realizaciones, las celulas madre derivadas del epitelio olfativo y/o derivados diferenciados in vitro de las mismas se diferencian terminalmente en una neurona dopaminergica funcional en el tema. En algunas realizaciones, la introduccion induce a una celula endogena en el sujeto a diferenciarse en una neurona dopaminergica funcional. En algunas realizaciones, la introduccion induce la reparacion de una neurona dopaminergica endogena no funcional o suboptimamente funcional o un precursor de la misma en el sujeto. En algunas realizaciones, la introduccion rescata una neurona dopaminergica y/o un precursor de la misma de la inactivacion y/o muerte que habrla experimentado en ausencia de la pluralidad de celulas madre derivadas del epitelio olfativo y/o derivados diferenciadas in vitro de las mismas introducidos. En algunas realizaciones, los derivados diferenciados in vitro se diferencian mediante el crecimiento de al menos una celula madre derivada de epitelio olfativo sobre un sustrato en condiciones suficientes para inducir la diferenciacion de la celula madre derivada de epitelio olfativo en una neurona dopaminergica y/o cebar la celula madre derivad de epitelio olfativo para diferenciarse en una neurona dopaminergica.

[0023] La materia aqul descrita proporciona tambien cultivos de celulas que comprende una celula madre derivada de epitelio olfativo recombinante y/o un derivado difernciado de la misma. En algunas realizaciones, la celula madre derivada de epitelio olfativo recombinante y/o el derivado diferenciada de la misma comprende uno o mas transgenes que codifican un polipeptido nurr-1, un polipeptido pitx3, un polipeptido lmx1a, un fragmento biologicamente activo de los mismos, un derivado biologicamente activo de los mismos, y/o cualquier combinacion de los mismos. En algunas realizaciones, el cultivo comprende un medio de cultivo que comprende un polipeptido Sonic hedgehog (Shh), un fragmento biologicamente activo del mismo, un derivado del mismo, acido retinoico (RA) o un derivado biologicamente activo del mismo, forskolina (FN) o un derivado biologicamente activo de la misma, o cualquier combinacion de los mismos. En algunas realizaciones, el medio de cultivo comprende acido retinoico aproximadamente 1 pM, forskolina aproximadamente 5 pM, y Sonic hedgehog aproximadamente 15 nM.

[0024] Un objetivo de la materia aqul descrita es proporcionar una poblacion de celulas trasplantables adecuadas para una variedad de aplicaciones, incluyendo, pero sin limitacion, el tratamiento de la lesion y/o enfermedad de los tejidos neurologicos.

[0025] Un objetivo de la materia aqul descrita expuesto anteriormente, y que se logra en su totalidad o en parte por

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la materia aqul descrita, otros objetivos resultaran evidentes a medida que avance la descripcion cuando se tome en relacion con los dibujos adjuntos como mejor se describe a continuation en este documento.

DESCRIPCION BREVE DE LOS DIBUJOS

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Las Figuras 1A-1H son micrograflas de fluorescencia de celulas formadoras de neuroesferas (NSFC) transfectadas con plasmidos de expresion que codificaban y se tineron con anticuerpos que se unen a tirosina hidroxilasa (TH), pitx3, o nurr1. Tal como se observa en las Figuras 1A-1H, esencialmente todas las NSFC transfectadas con plRES- pitx3-nurr1, pLNCX2-pitx3 y pLNCX2-nurr1 expresaban TH despues de 4 meses de selection con G418 (veanse las Figuras 1C, 1D, 1F, y 1G), pero las NSFC transfectadas con pLNCX2-lmx1a o los vectores de control (pIRES o pLNCX2) eran negativas a TH (veanse las Figuras 1B, 1E, y 1H). Todas las celulas se tineron con clorhidrato de 4', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para mostrar los nucleos.

La Figura 1A es un control negativo para el anticuerpo secundario empleado en la las Figuras 1B-1H. La senal observada es de DAPI. La Figura 1B es un control negativo para los anticuerpos primarios que se unen a la tirosina hidroxilasa (TH) o a pitx3. Las celulas tenidas en la Figura 1B se transfectaron con un vector de expresion vaclo pIRES, y la senal observada es de DAPI. Las celulas tenidas en las Figuras 1C, 1D, 1F y 1G se transfectaron con los plasmidos de expresion pIRES-pitx3-nurr1 (Figuras 1C y 1D), pLNCX2-pitx3 (Figura 1F), o pLNCX2-nurr1 (Figura 1G), y despues de 4 meses la seleccion con G418 se tino con anticuerpos que se unlan a TH y tambien con anticuerpos que se unlan a pitx3 o nurr1 tal como se indica. En cada uno de estos casos, las celulas fueron positivas en TH. Las figuras 1E y 1H muestran los resultados de NSFC transfectadas con los vectores de control pLNCX2 o pLNCX2-lmx1a, respectivamente. En estos casos, las celulas fueron negativas a TH.

La figura 2A representa un analisis de transferencia Western con un anticuerpo que se une a TH (58 kilodaltons (kDa)) de lisados de celulas transfectadas con, de izquierda a derecha, pLNCX2, pLNCX2-pitx3, pLNCX2-nurr1, pLNCX2-Imx1a, plRES, o pIRES-pitx3-nurr1. Las transferencias Western tambien se sondaron con un anticuerpo que se une a actina (43 kDa) como control de carga, en las que las intensidades consistenes de las senales de actina demostraron que la cantidad de protelna cargada en cada carril fue muy similar.

Las figuras 2B-2G son curvas que muestran la expresion de actina como por la densidad de la senal de actina en la la figura 2A para pLNCX2, pLNCX2-pitx3, pLNCX2-nurr1, pLNCX2-lmx1a, pIRES, y pIRES-pitx3-nurr1, respectivamente. Las Figuras 2H-2m son curvas que muestran la expresion de TH como por la densidad de la senal de actina en la figura 2A para pLNCX2, pLNCX2-pitx3, pLNCX2-nurr1, pLNCX2-Imx1a, pIRES, y pIRES-pitx3-nurr1, respectivamente. La Figura 2N es un grafico de barras que muestra las diferencias de cada llnea de NSFC transfectada en la proparte de expresion de TH a actina (por ejemplo, la Figura 2H frente a la Figura 2B, Figura 2I frente a la Figura 2C, etc.).

Las figuras 3A-3I son los resultados de inmunocitoqulmica y analisis de transferencia Western de celulas o lisados ensayados con anticuerpos que se unen a TH, pitx3, o nurr1, lo que demuestra que las NSFC transfectadas con pLNCX2-pitx3, pLNCX2-nurr1 y pIRES-pitx3-nurr1 permanecen sanos y positivas a TH (Figuras 3D, 3F, 3G y 3I), mientras que una llnea SNCF transfectada con pLNCX2-lmx1a perdio la expresion de TH despues de la extraction en almacenamiento criogenico y bajo presion de seleccion (Figuras 3H y 3I). En las figuras 3A-3H, todas las celulas tambien se tineron con DAPI para mostrar los nucleos.

La figura 3A representa inmunocitoqulmica de un control negativo para analizar el anticuerpo secundario utilizado en la inmunocitoqulmica y analisis de transferencia Western representados en las Figuras 3B-3I. La Figura 3B representa los resultados de inmunocitoqulmica de otro control negativo, lo que demuestra que las NSFC no transfectadas son TH-. La figura 3C representa los resultados de inmunocitoqulmica de otro control negativo, lo que demuestra que NSFC transfectadas con un vector vaclo (pIRES) son TH-. La figura 3D representa los resultados de inmunocitoqulmica de NSFC transfectadas con pIRES-pitx3-nurr1, lo que demuestra que estas celulas son TH+. La Figura 3E representa los resultados de inmunocitoqulmica de otro control negativo, lo que demuestra que las NSFC transfectadas con un vector vaclo (pLNCX2) son TH-. Las Figuras 3F-3H representan los resultados de inmunocitoqulmica que demuestran que las NSFC transfectadas con pLNCX2-pitx3 o pLNCX2-nurr1 son TH+, pero que las celulas transfectadas con pLNCX2-Imx1a son TH-. La Figura 3I muestra los resultados de analisis de transferencia de Western que confirma que las NSFC transfectadas con pLNCX2-pitx3, pLNCX2-nurr1, o pIRES- pitx3-nurr1 son TH+, pero las celulas transfectadas con pLNCX2-lmx1a son TH-. Un anticuerpo que se une a actina se utilizo como control de carga en cada carril.

Las figuras 4A y 4B son graficos de barras que representan los resultados de ensayo de los niveles de dopamina por la protelna total (expresado como pg/pl/mg de protelna) de NSFC transfectadas con diferentes construcciones de expresion. Las cajas sombreadas individualmente corresponden a las celulas cultivadas en ausencia de acido retinoico (RA), forskolina (FN), y Sonic hedgehog (Shh), mientras que las cajas doblemente sombreadas corresponden a las celulas cultivadas en presencia de RA, FN, y Shh (RA1FN5Shh, que es RA 1 pM, FN aproximadamente 5 pM, y Shh aproximadamente 0,025 pg/ml). Como se muestra en estas figuras, las NSFC transfectadas con pIRES-pitx3-nurr1 fueron las llneas productoras de dopamina mas eficaces tanto intracelularmente

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como intercelularmente. Se aumentaron los niveles de dopamina en las NSFC y en el medio agotado.

La Figura 4A es un grafico de barras que representa los resultados de ensayo de los niveles de dopamina intracelulares por la protelna total de NSFC transfectadas con diferentes construcciones de expresion, y la Figura 4B es un grafico de barras que representa los resultados de ensayo de los niveles de dopamina extracelular por protelna total de NSFC transfectadas con diferentes construcciones de expresion. Tal como se muestra en estas figuras, las NSFC transfectadas con el plasmido de expresion pIRES-pitx3-nurr1 fueron las celulas productoras de dopamina mas eficaces con respecto tanto a los niveles de dopamina intracelular y extracelular. Los niveles de dopamina intracelular y extracelular aumentaron con el tratamiento de las celulas con RA1FN5Shh en cada llnea especlfica.

Las Figuras 5A-5C representan la inmunocitoqulmica de NSFC tratadas en DMEM/F12 suplementado con 1% B27 y 0,5% N2 y gentamicina 100 pg/ml (DFBNM) suplementado con acido retinoico 1 pM y forskolina 5 pM (RA1FN5) con diferente fuentes de Shh durante 3 dlas. Todas las celulas tambien se tineron con dApI para mostrar los nucleos.

La Figura 5A representa los resultados de cultivo de las celulas en ausencia de Shh. La Figura 2B representa los resultados de cultivo de las celulas en presencia de forskolina 0,25 mg/ml de Sigma-Aldrich Chemical Company (St. Louis, Missouri, Estados Unidos de America). La Figura 2C representa los resultados de cultivo de las celulas en presencia de 0,25 mg/ml de una preparacion altamente purificada de forskolina. La comparacion de las Figuras 5B y 5C muestra que las celulas tratadas con Shh altamente purificado expresaban TH a un nivel mas alto que las celulas tratadas con el producto disponible en el mercado.

Las figuras 6A y 6B representan los resultados de inmunocitoqulmica de NSFC cultivadas en DFBNM complementado con 0,025 mg/ml de Shh (altamente purificado), en presencia o ausencia de RA (1 pM) y FN (5 pm) durante el numero de dlas indicados. Todas las celulas tambien se tineron con DAPI para mostrar los nucleos.

La Figura 6A muestra una comparacion de la tincion de TH de celulas a las 18 horas, 4 dlas, y 7 dlas en DFBNM suplementado con 0,025 mg/ml de Shh solo altamente purificado (tres paneles superiores), en presencia de 0,025 mg/ml de Shh altamente purificado y RA 1 pM (tres paneles medios), o en presencia de 0,025 mg/ml de Shh altamente purificado y RA 1 pM y FN 5 pM (tres paneles inferiores). La Figura 6B representa inmunocitoqulmica de NSFC que muestran tincion positiva de TH despues del tratamiento de 7 dlas con 0,025 mg/ml de Shh altamente purificado, RA 1 pM y FN 5 pM (RA1FN5Shh).

La Figura 7 representa las estructuras de los plasmidos de expresion pLNCX2-nurr1, pLNCX2-pitx3, pLNCX2-lmx1a, y pIRES-pitx3-nurr1.

La Figura 8 es un grafico de barras que muestra los niveles de neurotrofinas en NSFC (pg/ml) que hablan sido transfectadas con diferentes plasmidos de expresion en comparacion con el control y NSFC no transfectadas.

Las Figuras 9A-9F resumen los resultados de los experimentos de injerto en los que las celulas transfectadas con pIRES-pitx3-nurr1 se injertaron en modelos de rata con EP inducida por 6-ODHA.

Las figuras 9A y 9B son graficos que muestran la reduccion de la velocidad de rotacion bajo la misma dosis de estimulacion con anfetaminas en un modelo de MFB (58,2%) y en un modelo de striatum (40,13%) en relacion con los animales de control no injertados.

Las Figuras 9C y 9D son imagenes del aparato de modelo de rotacion.

Las Figuras 9E y 9F muestran analisis inmunocitoqulmicos de los cerebros de animales trasplantados, que muestran que las celulas positivas en TH se encuentran en los cerebros de estos animales 3 meses despues del injerto. Estas micrograflas muestran que la poblacion injertada permanece positiva en TH y parece viable incluso despues de un perlodo de tres meses de trasplante en el cerebro, lo que es indicativo de una alta probabilidad de supervivencia a largo plazo.

DESCRIPCION DETALLADA

[0027] La presente materia se describira a continuacion mas completamente en lo sucesivo con referencia a los Ejemplos adjuntos, en los que se describen realizaciones de ejemplo de la materia aqul descrita. La materia aqul descrita puede, sin embargo, realizarse de diferentes formas y no debe interpretarse como limitada a las realizaciones expuestas en el presente documento. Mas bien, estas realizaciones se proporcionan para que esta descripcion sea minuciosa y completa, y transmita completamente el alcance de la materia aqul descrita a los expertos en la tecnica.

[0028] El uso de celulas madre y derivados de celulas madre ha ganado un mayor interes en la investigation medica, particularmente en el area de proporcionar reactivos para el tratamiento del dano tisular que resulta de, por

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ejemplo, defectos geneticos, lesiones y/o procesos de enfermedades. Idealmente, las celulas que son capaces de diferenciarse en los tipos celulares afectados podrian ser trasplantadas en un sujeto en necesidad de las mismas, donde interactuarian con el microambiente del tejido y suministrarian los tipos de celulas necesarias para reparar la lesion. Alternativamente, o adicionalmente, las celulas trasplantadas tambien podrian influir en el microambiente del tejido para proporcionar senales que repararian y/o rescatarian los tipos de celulas afectadas en el sujeto y/o induciria las celulas endogenas del propio sujeto para diferenciarse en tipos de celulas adecuadas para mejorar asi el dano presente en el tejido.

[0029] Las celulas madre son celulas no diferenciadas que poseen una capacidad de auto-renovacion y el potencial de restriccion de linaje (maduracion) en uno o mas tipos de celulas diferentes en funcion de su origen y las senales microambientales que reciben (Lindvall et al., 2004) . Estas caracteristicas hacen de las celulas madre una poblacion diana atractiva para la terapia de reemplazo celular (Snyder y Olanow, 2005; Sonntag et al, 2005). Las celulas madre embrionarias humanas (hESC), restringidas en linaje hacia neuronas dopaminergicas cuando se trasplantan en un modelo de roedor de EP, proporcionan un alivio significativo de los sintomas. Sin embargo, con el tiempo, los animales injertados con hESC desarrollaron teratomas graves (Brederlau et al., 2006). El uso de celulas madre parcialmente restringidas podria proporcionar celulas que son equivalentes a las progenitoras.

[0030] El epitelio olfativo (EO) es una fuente unica para progenitores neurales que se pueden cultivar con cirugia endoscopica nasal sin craneotomia invasiva (Winstead et al., 2005). Ademas, puesto que no hay deficits olfativos demostrables resultantes de la biopsia OE (Winstead et al., 2005), el tejido se puede utilizar para generar poblaciones de celulas (por ejemplo, celulas progenitoras autologas o no autologas y/o derivados diferenciados de las mismas) para los pacientes con EP. Una fuente de celulas autologas proporciona histocompatibilidad total y por lo tanto elimina la necesidad de una terapia inmunosupresora, asi como largas listas de espera para un tejido compatible disponible. Alternativamente, o adicionalmente, las celulas no autologas se pueden emplear con tratamientos inmunosupresores adecuados, segun sea necesario.

[0031] Los presentes coinventores han creado procedimientos para el aislamiento y cultivo de una poblacion formadora de neuroesferas a partir de OE (Roisen et al, 2001; Winstead et al, 2005). Hasta la fecha, se han establecido mas de 100 lineas celulares especificas para cada paciente de las celulas formadoras de neuroesferas (NSFCs) a partir de cultivos primarios de epitelio olfativo humano adulto aislado a partir de cadaveres (Roisen et al., 2001) y pacientes sometidos a cirugia endoscopica de los senos (Winstead et al., 2005). Los presentes coinventores tambien han demostrado que las NSFC tienen el potencial de diferenciarse a lo largo de varios linajes neuronales diferentes despues de la exposicion a senales ambientales in vitro (Zhang et al., 2006).

[0032] La materia aqui descrita se refiere, en algunas realizaciones a procedimientos para restringir el linaje de NSFC hacia neuronas dopaminergicas. En algunas realizaciones, las tecnicas moleculares se aplican para la transfeccion de los factores de transcripcion de nurr1, pitx3, y/o lmx1a en NSFC para promover la diferenciacion dopaminergica. En algunas realizaciones, las NSFC estan expuestas a Sonic hedgehog (Shh), un factor de regulacion aguas arriba en la formacion de las neuronas dopaminergicas, en presencia o ausencia de acido retinoico (RA) y/o Forskolina (FN). En algunas realizaciones, estas estrategias se combinan en un esfuerzo por obtener ademas un aumento de la eficacia y una expresion dopaminergica mas potente.

I. Definiciones

[0033] Todos los terminos tecnicos y cientificos usados en el presente documento, a menos que se defina lo contrario a continuacion, tienen la intencion de tener el mismo significado que se entiende habitualmente por un experto en la tecnica. Las referencias a tecnicas empleadas en el presente documento pretenden referirse a las tecnicas tal como se entienden hbaitualmente en el sector, incluyendo las variaciones de estas tecnicas o sustituciones de tecnicas equivalentes que serian evidentes para un experto en la tecnica. Aunque se cree que los siguientes terminos son bien entendidos por un experto en la tecnica, las siguientes definiciones se exponen para facilitar la explication de la materia aqui descrita.

[0034] Siguiendo la convention de la ley de patentes de muchos anos, los terminos "un", "una" y "el/la" significan "uno o mas" cuando se usa en esta solicitud, incluyendo las reivindicaciones. Por lo tanto, la frase "una celula madre" se refiere a una o mas celulas madre, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

[0035] El termino "aproximadamente", tal como se utiliza aqui para referirse a un valor medible, tal como una cantidad de peso, tiempo, dosis, etc., tiene por objeto abarcar variaciones en algunas realizaciones de ±20%, en algunas realizaciones ±10%, en algunas realizaciones ±5%, en algunas realizaciones ±1%, en algunas realizaciones ±0,1%, y en algunas realizaciones ±0,01% de la cantidad especificada, ya que tales variaciones son apropiadas para llevar a cabo los procedimientos descritos.

[0036] Tal como se usa en este documento, el termino “lesion” debe interpretarse en sentido amplio para incluir cualquier impacto en una celula, tejido, u organo que se traduce en una consecuencia indeseable a la celula, tejido, u organo. En algunas realizaciones, una lesion resulta de un dano que es observable o no definible, pero la capacidad de identificar el origen de la lesion no es limitante. En algunas realizaciones, una lesion comprende una

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lesion en una celula y/o un tejido del sistema nervioso incluyendo, pero no limitado a, una neurona. Alternativamente, o adicionalmente, en algunas realizaciones, una lesion puede incluir lesiones posteriores a las que una celula, tejido, u organo muestran un deterioro de la funcion que es secundario a una o mas causas, identificables o no.

[0037] El termino "aislado", tal como se utiliza en el contexto de una celula (incluyendo, por ejemplo, una celula madre derivada del epitelio olfativo), indica que la celula existe separada de su entorno nativo. Una celula aislada tambien puede existir en una forma purificada o puede existir en un entorno no nativo.

[0038] Tal como se utiliza aqul, la expresion "trastorno neurologico" se refiere a cualquier trastorno, incluyendo trastornos psiquiatricos, que afectan a una parte del sistema nervioso, tales como los nervios, la medula espinal o el cerebro. Los trastornos neurologicos incluyen, pero no se limitan a, la enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, esclerosis multiple, esclerosis lateral amiotrofica, lesion de la medula espinal, la esquizofrenia, el autismo y el trastorno bipolar.

[0039] Tal como se utiliza aqul, el termino "neurotransmisor" se refiere a cualquier producto qulmico o sustancia capaz de inhibir o excitar una celula postsinaptica. Algunos ejemplos de neurotransmisores incluyen dopamina, serotonina y acetilcolina. Es bien conocido que los niveles inadecuados de neurotransmisores se asocian con numerosos trastornos, incluyendo trastornos neurologicos tales como los descritos anteriormente.

[0040] Tal como se utiliza aqul, el termino "neuritogenesis" se refiere a la formacion de nuevos procesos y la extension de los procesos existentes parecidos a los de las neuronas.

[0041] Tal como se utiliza en el presente documento, una celula existe en una "forma purificada" cuando se ha

aislado de una o mas de otras celulas que existen en su entorno nativo, pero tambien cuando la proparte de esa celula en una mezcla de celulas es mayor que la que se encontrarla en su entorno nativo. Dicho de otra manera, en algunas realizaciones una celula se considera en "forma purificada" cuando la poblacion de celulas en cuestion representa una poblacion enriquecida de la celula de interes, aunque otras celulas y tipos de celulas tambien esten presentes en la poblacion enriquecida. Una celula puede considerarse en forma purificada cuando comprende, en

algunas realizaciones, al menos aproximadamente un 5% de una poblacion mixta de celulas, en algunas

realizaciones, al menos aproximadamente el 10% de una poblacion mixta de celulas, en algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 20% de una poblacion mixta de celulas, en algunas realizaciones, al menos

aproximadamente el 25% de una poblacion mixta de celulas, en algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 30% de una poblacion mixta de celulas, en algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 40% de una poblacion mixta de celulas, en algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 50% de una poblacion mixta de celulas, en algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 60% de una poblacion mixta de celulas, en algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 70% de una poblacion mixta de celulas, en algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 75% de una poblacion mixta de celulas, en algunas realizaciones, al menos

aproximadamente el 80% de una poblacion mixta de celulas, en algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 90% de una poblacion mixta de celulas, en algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 95% de una poblacion mixta de celulas, y en algunas realizaciones, aproximadamente 100% de una poblacion mixta de celulas, con la condicion de que la celula comprenda un mayor porcentaje de la poblacion total de celulas en la poblacion "purificada" que en la poblacion antes de la purificacion. A este respecto, los terminos "purificado" y "enriquecido" pueden ser considerados como sinonimos.

[0042] Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "pluripotentes" se refiere a una celula que tiene una ruta de desarrollo que es al menos parcialmente indeterminada, y por consiguiente, la celula puede diferenciarse en diversos tipos de celulas diferenciadas que incluyen, por ejemplo, neuronas, oligodendrocitos, astrocitos, celulas envainadas o celulas gliales. El termino "multipotente" tambien se refiere a dicha celula. Aunque las celulas pluripotentes son capaces de convertirse en varios tipos de celulas, varias celulas pluripotentes pueden limitarse en el numero de rutas de desarrollo que pueden viajar. Una celula pluripotente se distingue as! de una celula "totipotente", que en si misma o una celula hija de la misma, puede diferenciarse en cualquiera y todos los tipos de celulas en el organismo pertinente. Cabe senalar, sin embargo, que los terminos "totipotente" y "pluripotente" no pretenden ser mutuamente excluyentes en el sentido de que una celula totipotente tambien se puede considerar pluripotente, aunque lo contrario no siempre es cierto.

[0043] Una "celula progenitora" describe cualquier celula precursora, capaz de auto-renovacion, cuyas celulas hijas pueden comprometerse a diferenciarse en otros tipos de celulas (celulas no progenitoras). En general, una celula progenitora es capaz de una proliferation extensa, generando mas celulas progenitoras (auto-renovacion), as! como mas celulas de linaje restringido. Las celulas progenitoras pueden dividirse asimetricamente, manteniendo una celula hija el estado de celulas progenitoras y siendo la otra algo mas restringida en el linaje (por ejemplo, expresando alguna otra funcion y/o fenotipo distinto especlfico). Alternativamente, algunas de las celulas progenitoras en una poblacion se pueden dividir simetricamente en celulas progenitoras, manteniendo as! algunas celulas progenitoras en la poblacion de forma completa, mientras que otras celulas en la poblacion dan lugar solo a las celulas no progenitoras. Los ejemplos de celulas progenitoras incluyen ciertas celulas obtenidas de epitelio olfativo, la medula osea, la grasa, y follculo epidermico. Los ejemplos de celulas progenitoras tambien incluyen

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cualquier celula derivada de un cultivo de celulas primarias que muestra los atributos de las celulas progenitoras. Un ejemplo de una celula progenitora de este tipo incluye celulas formadoras de neuroesferas (NSFC) obtenidas a partir de cultivo de tejido de biopsia de epitelio olfativo (en algunas realizaciones, tejido de biopsia de epitelio olfativo humano, y en algunas realizaciones, tejido de biopsia de epitelio olfativo humano adulto) tal como se describe en la Publicacion de la solicitud de patente internacional PCT No. WO 2003/064601.

[0044] La frase "celula progenitora" se refiere por lo tanto a una celula que muestra la capacidad de experimentar especificacion de linaje restringido. Como tal, en algunas realizaciones, una celula progenitora es una celula que esta en una posicion intermedia a lo largo de una ruta de diferenciacion entre una celula totipotente y una celula que esta comprometida a la diferenciacion terminal. En algunas realizaciones, una celula progenitora es regenerativa y pluripotente.

[0045] Tal como se utiliza aqul, la expresion "derivado diferenciado" se refiere a una celula que esta mas lejos a lo largo de una ruta de diferenciacion que una celula de referencia, que es habitualmente una celula pluripotente o totipotente. En el contexto de derivados diferenciados de un progenitor, un derivado diferenciado es una celula que esta mas lejos a lo largo de una ruta de diferenciacion particular que el progenitor. En algunas realizaciones, un derivado diferenciado de una celula madre derivada de epitelio olfativo es una celula que esta al menos una etapa mas alla a lo largo de una ruta de diferenciacion determinada que la celula madre derivada de epitelio olfativo.

[0046] El termino "tejido diana", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un sitio previsto para la acumulacion de una o mas celulas de la materia aqul descrita y/o una o mas sustancias producidas por las celulas de la materia aqul descrita (por ejemplo, un factor neurotrofico) despues de la administracion de dichas una o mas celulas a un sujeto. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los procedimientos de la materia aqul descrita implican un tejido diana que comprende el tejido nervioso (por ejemplo, neuronas) que ha sido danado, por ejemplo, por defecto genetico, lesion, y/o un proceso de enfermedad. Como tal, un "tejido diana" puede ser una localizacion en la que se implantan las celulas de la materia aqul descrita y tambien una localizacion en la que pretenden actuar las propias celulas o un factor (por ejemplo, un polipeptido).

II. Celulas madre derivadas de epitelio olfativo

II.A. General

[0047] La materia aqul descrita se refiere, en algunas realizaciones a celulas madre derivadas de epitelio olfativo que, en algunas realizaciones, son celulas madre derivadas de epitelio olfativo humano adulto, y los procedimientos de uso para las mismas. En algunas realizaciones, se emplean celulas madre derivadas del epitelio olfativo aisladas per se, y en algunas realizaciones, las celulas madre derivadas del epitelio olfativo se modifican in vitro antes de ser empleadas.

[0048] El epitelio olfativo proporciona una fuente de celulas madre derivadas del epitelio olfativo adulto viables que se pueden emplear, por ejemplo, en investigacion, tratamiento, desarrollo de farmacos, y trasplantes, lo que evita los problemas eticos asociados con el uso de celulas madre embrionarias y fetales. Aun mas, el uso de celulas madre derivadas del epitelio olfativo evita problemas eticos asociados con el uso de modelos animales y se pueden utilizar incluso cuando no existen modelos animales. Las celulas madre derivadas del epitelio olfativo tienen una capacidad de regeneracion de larga vida; las celulas madre derivadas del epitelio olfativo situadas en el epitelio olfativo pueden reemplazar neuronas envejecidas y/o danadas y sus celulas sustentaculares, as! como proporcionar factores que inducen la reparacion y/o regeneracion de varios tipos de celulas neurales.

[0049] La accesibilidad del epitelio olfativo y la capacidad proliferativa hacen que sea una fuente unica de celulas progenitoras. Ademas, la capacidad para obtener celulas madre derivadas del epitelio olfativo, que incluye, pero sin limitacion, celulas madre derivadas del epitelio olfativo humano y/o celulas madre derivadas del epitelio olfativo humano adulto, de la cavidad nasal elimina la necesidad de utilizar procedimientos muy invasivos y perjudiciales que estan disponibles actualmente para obtener celulas madre post-embrionarias. Ademas, dado que uno de los mayores problemas encontrados en los trasplantes es el rechazo de tejidos, la disposicion de celulas de la materia aqul descrita para el trasplante autologo elimina la necesidad de identificar un donante histocompatible y por lo tanto elimina el rechazo. Se observa, sin embargo, que tambien pueden emplearse, si se desea, celulas no autologas, y si es necesario, pueden utilizarse tratamientos inmunosupresores apropiados para reducir el rechazo.

[0050] Tal como se utiliza en el presente documento, la frase "celula madre derivada de olfativo epitelial" se refiere a una celula que, en algunas realizaciones, tiene al menos dos de las siguientes caracterlsticas, en algunas realizaciones, tiene al menos tres de las siguientes caracterlsticas, en algunas realizaciones, tiene al menos cuatro de las siguientes caracterlsticas, en algunas realizaciones, al menos cinco de las siguientes caracterlsticas, y en algunas realizaciones, todas las siguientes caracterlsticas:

i) se divide cada 18-24 horas durante mas de 200 pasajes cuando se cultiva en medio de cultivo tisular estandar suplementado con hasta un 10% suero de ternera fetal inactivado por calor;

ii) la inmunoreactividad para el marcador b-tubulina isotipo III es significativamente elevada cuando la celula se cultiva en varias sustratos, tal como una matriz recubierta con una mezcla de enctanina, laminina y colageno IV

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(matriz ECL), o alternativamente una matriz recubierta con laminina o fibronectina;

iii) la inmunoreactividad para b-tubulina isotipo III es pronunciada y generalmente muestra una red de microtubulos bien desarrollada;

iv) la adicion de dibutiril AMPc a un cultivo en crecimiento en una matriz ECL da lugar a que las celulas formen procesos;

v) immunopositiva para nestina;

vi) expresa y es immunopositiva para periferina;

vii) no requiere una capa de alimentacion para el crecimiento y la proliferacion;

viii) no requiere EGF o FGF exogeno para su supervivencia o la diferenciacion en el cultivo; y

ix) immunopositiva para uno o mas receptores Trk.

[0051] En algunas realizaciones, la celula madre derivada de epitelio olfativo es una celula madre derivada de epitelio olfativo de mamlfero. En algunas realizaciones, la celula madre derivada de epitelio olfativo es una celula madre derivada de epitelio olfativo humano, que opcionalmente puede ser una celula madre derivada de epitelio olfativo adulto.

[0052] Las celulas madre derivadas de epitelio olfativo humano se pueden manipular in vitro para formar neuroesferas de donantes de hasta 95 anos de edad demuestra un notable grado de neuroplasticidad en estas celulas. Ademas, la accesibilidad quirurgica directa, mlnimamente invasiva, de las celulas madre derivadas de epitelio olfativo humano, junto con su pluripotencia, hace que las celulas madre derivadas del epitelio olfativo sean una buena fuente autologa de celulas progenitoras. Estas celulas se pueden extraer, expandir y, opcionalmente, manipular ex vivo antes de volver, a traves de trasplante de donante, para la regeneracion y/o reparacion de tejido neural danado. Estas celulas madre pluripotentes se pueden utilizar tambien para generar poblaciones de celulas especlficas del paciente para la evaluacion y el tratamiento genetico o de diagnostico.

[0053] Como tal, las expresiones "celulas madre derivadas del epitelio olfativo" y "celula formadora de neuroesferas" (NSFC) se utilizan indistintamente para referirse a celulas progenitoras pluripotentes regenerativas del epitelio olfativo (incluyendo, pero sin limitacion, el epitelio olfativo de un humano, opcionalmente un adulto humano) que muestran la capacidad de formar un grupo de aproximadamente 20 a 80 o mas precursores neurales mitoticamente activos (por ejemplo, neuronales y gliales) que en algunas realizaciones son positivos para la protelna marcadora de celulas madre neurales nestina. Morfologicamente, las NSFC representan una poblacion de celulas neurales en diferentes estados de maduracion formados por un solo progenitor que se expande clonalmente que forma estructuras celulares esfericas muy empaquetadas. En algunas realizaciones, las NSFC humanas reaccionan con anticuerpos especlficos para polipeptidos humanos y tienen al menos dos, tres, cuatro, cinco, o mas de las caracterlsticas enumeradas anteriormente en el presente documento para celulas madre derivadas del epitelio olfativo.

II.B. Aislamiento y cultivo de celulas madre de derivadas de epitelio olfativo humano

[0054] Se han descrito procedimientos de ejemplo para el aislamiento de celulas madre derivadas de epitelio olfativo humano, y se pueden emplear procedimientos similares para aislar y cultivar celulas madre derivadas de epitelio olfativo de otros animales (por ejemplo, otros mamlferos). Vease la solicitud de patente internacional PCT n° WO 2003/064601. Como se establece en la misma, se extrae en primer lugar el tejido epitelial olfativo humano de la cavidad nasal. El experto en la tecnica entendera que el tejido epitelial olfativo se puede extraer usando una variedad de procedimientos. Un procedimiento de ejemplo para extraer el tejido epitelial olfativo implica el uso de un endoscopio que tiene un cable de fibra optica con una “pinza” ("pincher") en un extremo para realizar una biopsia. Una ventaja de este procedimiento de ejemplo es que permite la obtencion de muestras de tejido de individuos donantes vivos con una invasividad e incomodidad mlnimas. Una ventaja adicional de la extraccion de tejidos epiteliales olfativos usando un endoscopio es la capacidad de congelar o cultivar las celulas madre del epitelio olfativo obtenidas en una coleccion inicial y la capacidad de tomar multiples colecciones cuando sea necesario para la viabilidad de cultivo in vitro o para alcanzar un nivel deseado de cantidad de celulas madre.

[0055] Un rinotomla lateral es otro ejemplo de procedimiento para la extraccion de tejidos del epitelio olfativo. Una rinotomla lateral es un procedimiento quirurgico en el que se hace una incision en la nariz a lo largo de un lado de modo que se puede girar para proporcionar acceso completo a la cavidad nasal y al tejido del epitelio olfativo. Sin embargo, este procedimiento es altamente invasivo. En algunas realizaciones, el procedimiento de rinotomla lateral se utiliza para extraer tejidos de epitelio olfativo de un cadaver. En este procedimiento, el cadaver es, en algunas realizaciones, de no mas de dieciocho horas despues de la muerte, en algunas realizaciones, es de no mas de seis horas despues de la muerte, y en algunas realizaciones, el cadaver se inmediatamente despues de morir.

[0056] Una vez extraldo, el epitelio olfativo humano puede cultivarse. Por ejemplo, el epitelio olfativo puede cultivarse en medio que contiene medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) y F12 (1:1) con suero bovino fetal inactivado por calor al 10% (FBS; todos los componentes del medio estan disponibles en GIBCO, Grand Island, Nueva York). Se pueden utilizar otros medios, tal como se reconoce por el experto en la materia, as! como diferentes fuentes animales de sueros o el uso de medios libres de suero. Ademas, algunas cultivos pueden emplear suplementos adicionales, incluyendo, pero no limitado a, aminoacidos (tales como glutamina), factores de

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crecimiento, etc.

[0057] Se puede utilizar una variedad de sustratos para cultivar las celulas, por ejemplo, sustratos de plastico o de vidrio, recubiertos o sin recubrir. Por ejemplo, un sustrato puede ser una placa de plastico recubierto con laminina- fibronectina. Alternativamente, el sustrato se puede recubrir con moleculas de la matriz extracelular (por ejemplo, para fomentar la adhesion o para el control de la diferenciacion celular), colageno, o poli-L-lisina (por ejemplo, para fomentar la adhesion libre de efectos biologicos). El sustrato del cultivo celular tambien tambien se puede tratar para que este cargado.

[0058] En el caso en el que la adhesion del sustrato es indeseable, se pueden utilizar cultivos rotatorios, en el que las celulas se mantienen en suspension. Ademas, en algunas realizaciones, la composicion del sustrato puede desempenar un papel en la diferenciacion de las celulas madre del epitelio olfativo.

[0059] El epitelio olfativo extraido no solo contiene celulas madre pluripotentes derivadas del epitelio olfativo/NSFC, sino que tambien puede contener las neuronas receptoras olfativas (ORN), celulas envainadas olfativas (OEC; tambien referidas como celulas sustentaculares), celulas de soporte epitelila, fibroblastos y/o celulas endoteliales y/o leucocitos que pueden aislarse junto con las celulas madre derivadas del epitelio olfativo del tejido conectivo subyacente. Despues de cultivar durante varias semanas, aparece una poblacion de celulas mitoticamente activas, mientras que las ORN y la OEC normalmente se vacuolan, retractan sus procesos, y mueren al cabo de aproximadamente tres a ocho semanas in vitro. Las celulas mitoticamente activas normalmente pueden duplicarse cada dla en el cultivo.

[0060] Despues de algunos dlas adicionales de proliferacion sin perturbaciones, se empiezan a formar neuroesferas. Esto tiene lugar generalmente en 5-60% o mas de los cultivos, de manera que se pueden producir multiples cultivos para asegurar una coleccion de celulas. Las neuroesferas se pueden recoger del cultivo mediante una variedad de procedimientos. En algunas realizaciones, las neuroesferas comienzan a flotar y se pueden extraer con simple aspiracion. Despues de la recogida, las neuroesferas (y las celulas que componen las neuroesferas) se pueden lavar y separar de los restos celulares no deseados por centrifugacion con o sin un gradiente (continuo o por etapas, tal como con polietilenglicol o sacarosa), o clasificar, si se desea, mediante FACS u otras tecnicas basadas en la union, tales como, pero no limitado a, el uso de anticuerpos para un marcador celular especlfico que reviste microesferas (en algunas realizaciones mircoesferas magneticas).

[0061] En algunas realizaciones, todos los procedimientos de recogida se llevan a cabo de forma aseptica. Un experto en la tecnica sabra como determinar correctamente los parametros utiles, tales como los tiempos de incubacion con agentes de extraccion celular (qulmicos o enzimaticos), las temperaturas, la fuerza centrlfuga, y el numero y tipo de lavados. Despues de la recogida, las neuroesferas se pueden dispersar mecanicamente en celulas individuales, lavarse repetidamente con una solucion osmoticamente adecuada (tamponada o no tamponada), generalmente proporcionada por soluciones de sales, tales como solucion salina o solucion de Ringer, centrifugarse para eliminar los restos celulares, y a continuacion volverse a sembrar, en algunas realizaciones, 103 celulas por mm2. En algunas realizaciones, las celulas se volvieron a sembrar en pocillos individuales de una placa de cultivo tisular y se hicieron crecer clonalmente.

[0062] Las celulas se pueden aislar posteriormente de estas celulas resembradas y se caracterizaron mediante el sondeo de las celulas con anticuerpos especlficos de linaje, o se examinaron para otros marcadores utiles. Inicialmente, puede ser deseable determinar si las neuronas estan presentes en los cultivos de celulas aisladas. Ademas de la inspeccion microscopica simple, las neuronas se pueden detectar con mayor sensibilidad mediante la presencia de uno o mas de los siguientes marcadores de ejemplo: nestina, protelnas de neurofilamentos, periferina, protelna asociada a microtubulos 2ab (MAP2ab), b-tubulina isotipo III, A2B5 (ver Dubois et al., 1990; Roisen et al., 2001; disponible de INVITROGEN® Corp., Carlsbad, California, Estados Unidos de America), y el receptor de NGF. Ver tambien la Tabla 1 de la publicacion de la solicitud de patente internacional PCT No. WO 2003/064601.

[0063] Las celulas gliales se pueden detectar en algunas realizaciones mediante la presencia de un gangliosido enriquecido en membrana glial con un anticuerpo monoclonal, tal como A2B5 (ver Dubois et al, 1990; Roisen et al, 2001; disponible de INVITROGEN® Corp., Carlsbad, California, Estados Unidos de America).

[0064] Los astrocitos se pueden detectar en algunas realizaciones mediante la presencia de la protelna acida fibrilar glial (GFAP) utilizando tecnicas estandar conocidas por un experto normal en la tecnica despues de la revision de la presente descripcion.

[0065] La materia aqul descrita por lo tanto tambien proporciona cultivos celulares que comprenden una celula madre derivado de epitelio olfativo (en algunas realizaciones, una celula madre derivada de epitelio olfativo de origen humano y, en algunas realizaciones, una celula madre derivada de epitelio olfativo humano adulto) y/o un derivado diferenciado de las mismas. En algunas realizaciones, la celula madre derivada de epitelio y/o un derivado diferenciado de la misma es una celula madre derivada de epitelio recombinante y/o un derivado diferenciado de la misma, en la que la celula madre derivada de epitelio olfativo recombinante y/o el derivado diferenciado de la misma comprenden uno o mas transgenes que codifican un polipeptido nurr-1, un polipeptido pitx3, un polipeptido lmx1a, un

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fragmento biologicamente activo de los mismos, un derivado biologicamente activo de los mismos, o cualquier combinacion de los mismos. En algunas realizaciones, el cultivo celular comprende un medio de cultivo que comprende un polipeptido Sonic hedgehog (Shh) (incluyendo, pero no limitado a, un polipeptido Shh humano) y/o un fragmento biologicamente activo o derivado de los mismos; acido retinoico (RA) y/o un derivado biologicamente activo del mismo, forskolina (FN) y/o un derivado biologicamente activo de la misma, o cualquier combinacion de los mismos. En algunas realizaciones, el medio de cultivo comprende acido retinoico aproximadamente 1 pM, forskolina aproximadamente 5 pM, y Sonic hedgehog (Shh) aproximadamente 15 nM. En algunas realizaciones, el Shh comprende un polipeptido Shh humano.

II.C. Manipulacion de celulas madre derivadas de epitelio olfativo

[0066] El termino "vector" se refiere a cualquier acido nucleico que es capaz de suministrar una secuencia de nucleotidos a una celula, y/o expresar una secuencia de nucleotidos exogena, y/o recombinarse con una secuencia endogena despues de la introduccion en una celula.

[0067] Se puede utilizar un "marcador" para determinar el estado diferenciado de una celula. Los marcadores son caracterlsticos, ya sea de tipo morfologico o bioqulmico (enzimatico), particulares a un tipo de celula, o moleculas expresadas por el tipo de celula. En algunas realizaciones, tales marcadores son protelnas, y, en algunas realizaciones, poseen un epltopo para los anticuerpos u otras moleculas de union disponibles. Sin embargo, un marcador puede comprender cualquier molecula que se encuentra en una celula, incluyendo, pero no limitado a, protelnas (peptidos y polipeptidos), llpidos, polisacaridos, gangliosidos, acidos nucleicos, esteroides y derivados de los mismos. Los marcadores pueden detectarse mediante cualquier procedimiento disponible para un experto en la tecnica.

[0068] Ademas de los anticuerpos (y todos los derivados de anticuerpos) que reconocen y se unen a al menos un epltopo en una molecula de marcador, los marcadores se pueden detectar usando tecnicas anallticas, tales como, pero no se limitan a, transferencias de puntos de protelnas, electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), y cualquier otro sistema de gel que separa protelnas, con la posterior visualizacion del marcador (por ejemplo, transferencias Western); filtracion en gel; purification en columna de afinidad; morfologicamente, tal como, pero no limitado a, clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS), tincion con colorantes que tienen una reaction especlfica con una molecula de marcador (tal como, rojo rutenio y moleculas de la matriz extracelular), caracterlsticas morfologicas especlficas (tales como la presencia de microvellosidades en el epitelio, o la pseudopodos/filopodios en celulas migratorias, tales como fibroblastos y mesenquima); y/o bioqulmicamente, tal como el ensayo de un producto enzimatico o intermedio, o la composition general de una celula, tal como la proparte de protelna a llpido o de llpido a azucar, o incluso la proparte de dos llpidos especlficos entre si, o polisacaridos. En el caso de marcadores de acido nucleico, se puede utilizar cualquier procedimiento conocido. Si dicho marcador es un acido nucleico, se pueden utilizar PCR, RT-PCR, hibridacion in situ, hibridacion de transferencia puntual, transferencias Northern, transferencias Southern y similares, acopladas a procedimientos de deteccion adecuados.

[0069] Un marcador o una combinacion de marcadores pueden mostrar especificidad para un tipo de celula.

[0070] Las miofibrillas, por ejemplo, son caracterlsticas unicamente de las celulas musculares; los axones se encuentran solo en el tejido nervioso, las cadherinas son tlpicas del epitelio, las b2-integrinas a los globulos blancos del sistema inmunitario, y un alto contenido de llpidos es caracterlstico de los oligodendrocitos, mientras que las gotas de llpidos son exclusivas de los adipocitos. En la Tabla 1 de la solicitud de patente internacional PCT No. de publication WO 2003/064601 se proporciona una lista de marcadores que se pueden utilizar en la materia aqul descrita.

[0071] Alternativamente, si los anticuerpos comerciales no estan disponibles, los expertos en la tecnica conoceran como fabricar anticuerpos, incluyendo, pero no limitado a, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, fragmentos de los mismos (tales como, pero no limitado a, Fab, Fv, Fab', F(ab')2, y dederivados de una sola cadena y humanizados de los mismos). Por ejemplo, se puede fabricar un anticuerpo de la siguiente manera.

[0072] Los anticuerpos policlonales se pueden desarrollar en contra de un huesped mamlfero mediante una o mas inyecciones de un inmunogeno y, si se desea, un adyuvante. Habitualmente, el inmunogeno (y adyuvante) se inyecta en el mamlfero mediante una inyeccion subcutanea o intraperitoneal. El inmunogeno puede incluir moleculas tales como polipeptidos, celulas completas o fracciones de celulas, y pueden producirse de forma recombinante.

[0073] o no recombinante. Ejemplos de adyuvantes incluyen completo de Freund y monofosforil llpido A sintetico- dicorinomicolato de trehalosa (MPL-TDM). Para mejorar la respuesta inmune, puede conjugarse un inmunogeno a un polipeptido que es inmunogenico en el huesped, tal como hemocianina de lapa californiana (KLH), albumina de suero, tiroglobulina bovina, e inhibidor de tripsina de soja. Los protocolos para la production de anticuerpos son bien conocidos (Harlow y Lane, 1988). Alternativamente, los pAbs se pueden fabricar en pollos produciendo moleculas de IgY (Schade y Hlinak, 1996).

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[0074] Un anticuerpo monoclonal (mAb; plural mAbs) tambien se puede fabricar mediante la inmunizacion de un huesped o linfocitos de un huesped, la recogida de los linfocitos que secretan (o potencialmente secretan) mAb, fusion de los linfocitos recogidos a celulas inmortalizadas (por ejemplo, celulas de mieloma), y selection de las celulas que secretan el mAb deseado. Los mAbs pueden aislarse o purificarse a partir del medio de cultivo o fluido ascltico mediante procedimientos convencionales, tales como protelna A-Sepharose®, cromatografla de hidroxilapatita, electroforesis en gel, dialisis, precipitation con sulfato de amonio o cromatografla de afinidad (vease, por ejemplo, Harlow y Lane, 1988; Harlow y Lane, 1999; patente de Estados Unidos n° 5.753.230; 5.733.876; 5.762.918; 5.776.427; 5.766.591; y 5.660.827).

[0075] El termino "plasticidad" se refiere a la capacidad de una celula de variar en un patron de desarrollo; es decir, la capacidad de ser moldeada o alterada. En algunas realizaciones, una celula que muestra "plasticidad" demuestra la capacidad de diferenciarse en diversos tipos de celulas. Como tal, el termino "neuroplasticidad" se refiere a la capacidad de una celula de diferenciarse en una celula del linaje neural.

[0076] El termino "diferenciacion" se refiere a la adquisicion o posesion de una o mas caracterlsticas o funciones diferentes de la del tipo de celula predecesora. Una celula diferenciada es una que tiene un caracter o funcion diferente de las estructuras circundantes o del precursor de esa celula (incluso la misma celula).

[0077] La diferenciacion da lugar a partir de un conjunto limitado de celulas (por ejemplo, en los vertebrados, las tres capas germinales del embrion: ectodermo, mesodermo y endodermo) a la diversidad celular, creando todos de los muchos tipos de celulas especializadas que forman un individuo.

[0078] La diferenciacion es un proceso de desarrollo mediante el cual las celulas asumen un fenotipo especializado; es decir, adquieren una o mas caracterlsticas o funciones distintas de otros tipos de celulas. En la mayorla de los usos, el fenotipo diferenciado se refiere a un fenotipo celular que es en el punto final maduro de alguna ruta de desarrollo. En muchos, pero no todos los tejidos, el proceso de diferenciacion esta acoplado con la salida del ciclo celular; en estos casos, la celula pierde o esta muy restringida en su capacidad de proliferar.

[0079] Un "factor de diferenciacion" es cualquier sustancia qulmica o cosa que provocara la diferenciacion. Esto incluye, por ejemplo, sustratos y factores de crecimiento.

[0080] Tal como se utiliza en el presente documento, la expresion "factor de crecimiento" se refiere a una sustancia (por ejemplo, una citoquina) que promueve el crecimiento y desarrollo celular mediante la direction de la maduracion y diferenciacion celular. Los factores de crecimiento tambien pueden mediar en el mantenimiento y la reparation de tejidos. Los factores de crecimiento se unen mediante receptores especlficos y actuan a concentraciones muy bajas. Muchos factores de crecimiento estan mediados, al menos parcialmente, por segundos mensajeros, tales como AMP clclico (AMPc). Los miembros de la familia de las neurotrofinas (NGF, BDNF, NT-3, y NT4/5) juegan un papel clave en el desarrollo, la diferenciacion y la supervivencia neuronal. Los factores de crecimiento de la familia de las neurotrofinas habitualmente actuan a traves de receptores de tirosina quinasa (Trk).

[0081] En algunas realizaciones, una celula madre derivada del epitelio olfativo, o un derivado de la misma, expresa un factor de crecimiento o citoquina de interes. Ejemplos de factores de crecimiento y citocinas expresadas por las celulas madre derivadas del epitelio olfativo y sus derivados incluyen, pero no se limitan a, NGF, BDNF, NT3, NT4/5, y VEGF.

[0082] Los medios y condiciones para la generation de cultivos primarios y el mantenimiento de los cultivos de neuroesferas anteriores son bien conocidos en la tecnica y pueden variar dependiendo de los tipos de celulas presentes. Por ejemplo, las celulas de musculo esqueletico, hueso, neuronas, piel, hlgado y madre embrionarias son adultos todas crecen en medios que difieren en sus contenidos especlficos. Ademas, los medios para un tipo de celula pueden diferir significativamente de un laboratorio a otro y de una institution a otra. Para mantener las celulas en division, se anade suero, tal como suero de ternera fetal, al medio en cantidades relativamente grandes, 1-30% en volumen, de nuevo dependiendo del tipo de celula o de tejido. Tambien se pueden anadir factores de crecimiento purificados especlficos o cocteles de multiples factores de crecimiento o a veces se sustituyen por suero. Cuando se desea la diferenciacion y no la proliferation, el suero con sus mitogenos se limita generalmente a aproximadamente 0-2% en volumen. Tambien se pueden utilizar factores u hormonas especlficas que promueven la diferenciacion y/o promueven la detention del ciclo celular.

[0083] Se pueden utilizar condiciones de oxlgeno fisiologico y oxlgeno subatmosferico en cualquier momento durante el crecimiento y diferenciacion de celulas en cultivo, como un complemento fundamental para la seleccion de los fenotipos celulares especlficos, crecimiento y proliferacion de tipos celulares especlficos, o la diferenciacion de tipos celulares especlficos. En general, el cultivo fisiologico o de bajo nivel de oxlgeno se consigue mediante procedimientos que limitan la acidosis de los cultivos, tales como la adicion de tampon fuerte a medio (tal como HEPES), y los cambios de medio frecuentes y los cambios en la concentration de CO2.

[0084] Ademas de oxlgeno, los otros gases para el cultivo habitualmente son aproximadamente el 5% de dioxido de carbono y el resto es nitrogeno, pero opcionalmente pueden contener cantidades variables de oxido nltrico (a partir

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de tan solo 3 ppm), monoxido de carbono y otros gases de efecto, tanto inertes como biologicamente activos. Las concentraciones de dioxido de carbono habitualmente varian alrededor del 5%, pero pueden variar entre 2 y 10%. Tanto el oxido nitrico como el monoxido de carbono, cuando es necesario, se administran habitualmente en cantidades muy pequenas (es decir, en el rango de ppm), determinadas empiricamente o a partir de la literatura.

[0085] El medio se puede complementar con una variedad de factores de crecimiento, citoquinas, suero, etc. Ejemplos de factores de crecimiento adecuados son el factor de crecimiento neuronal (NGF), NT3, NT4/5, factor neuronal derivado del cerebro (BDNF) y factor estimulante de colonias (CSF). Ejemplos de aditivos del medio hormonales son estrogeno, progesterona, testosterona, o glucocorticoides, tales como dexametasona. Ejemplos de aditivos del medio de citoquinas son interferones, interleucinas, o factor de necrosis tumoral a (TNF-a). Un experto en la materia entendera como probar aditivos y componentes de cultivo en diferentes condiciones de cultivo, ya que pueden alterar la respuesta celular, la vida activa de los aditivos, u otras caracteristicas que afectan a su bioactividad. Ademas, la superficie sobre la que se cultivan las celulas puede recubrirse con una variedad de sustratos que contribuyen a la supervivencia, el crecimiento y/o diferenciacion de las celulas. Estos sustratos incluyen, pero no se limitan a, la laminina, matriz ECL, colageno, poli-L-lisina, poli-D-lisina, poliornitina y fibronectina. En algunos casos, cuando se desean cultivos de 3 dimensiones, se pueden utilizar geles de matriz extracelular, tales como colageno, matriz ECL o gelatina. Las celulas pueden ser cultivadas en la parte superior de tales matrices, o pueden integrarse dentro de los propios geles. Por ejemplo, el uso de una matriz de ECL promovia la restriccion de linaje de las celulas derivadas del epitelio olfativo hacia la maduracion de neuronas, tal como se indica por el nivel de neuritogenesis.

[0086] Para manipular ADN in vitro de modo que las celulas de la materia aqui descrita esten modificadas con secuencias de acidos nucleicos exogenos, estan disponibles muchas tecnicas para los expertos en la tecnica (vease, por ejemplo, Sambrook y Russell, 2001; Ausubel et al., 2002; Ausubel et al, 2003).

[0087] Los vectores son herramientas utilizadas para transferir ADN entre las celulas huesped o como una estrategia para expresar una secuencia de nucleotidos. Algunos vectores funcionan solamente en procariotas, mientras que otros funcionan tanto en procariotas como en eucariotas, lo que facilita la preparacion de ADN a gran escala a partir de procariotas para la expresion en eucariotas. La insercion del ADN de interes se consigue mediante tecnicas de ligacion y/o protocolos de aparejamiento bien conocidos por el experto en la materia. El ADN se inserta de manera que su integracion no altera ninguno de los componentes necesarios del vector. En el caso de vectores que se utilizan para expresar el polipeptido codificado insertado, el ADN introducido puede ligarse operativamente a los elementos del vector que gobiernan su transcripcion y traduccion.

[0088] Tal como se utiliza en el presente documento, la expresion "ligado operativamente" se refiere a una secuencia de nucleotidos de interes que esta ligada a una o mas secuencias reguladoras de tal manera que se consigue la expresion de la secuencia de nucleotidos bajo el control de dicha una o mas secuencias reguladoras.

[0089] Los vectores se pueden dividir en dos clases generales: Los vectores de clonacion de ejemplo incluyen plasmidos de replicacion, cosmidos, fagos, y cromosomas artificiales bacterianos (BAC) que comprenden regiones que son no esenciales para la propagacion en una celula huesped apropiada y en los que se puede insertar ADN exogeno, dando lugar a la replicacion del ADN exogeno y propagacion en la celula huesped. Se puede utilizar un vector de expresion (tal como un plasmido, levadura o genoma del virus animal) para introducir material genetico exogeno en una celula huesped o tejido con el fin de transcribir y traducir el ADN exogeno. En los vectores de expresion, el ADN introducido esta operativamente ligado a elementos, tales como promotores, que senalan a la celula huesped para transcribir el aDn insertado. Los promotores de ejemplo incluyen promotores constitutivos, promotores inducibles (es decir, que controlan la transcripcion de genes en respuesta a factores especificos), y promotores especificos de tejido.

[0090] Los vectores tienen muchas manifestaciones. Un "plasmido" es una molecula de ADN de doble cadena circular que puede aceptar fragmentos de ADN adicionales. Los vectores virales tambien pueden aceptar segmentos de ADN adicionales en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicacion autonoma en una celula huesped (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicacion bacteriano y vectores de mamiferos episomales). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamiferos no episomales) se integran en el genoma de una celula huesped y se replican como parte del genoma del huesped. En general, los vectores de expresion utiles son plasmidos y vectores virales (por ejemplo, retrovirus, adenovirus y virus adeno-asociados de replicacion defectuosa); tambien se puedne utilizar otros vectores de expresion.

[0091] Alternativamente, los vectores se pueden transcribir y traducir in vitro, por ejemplo utilizando secuencias reguladoras del promotor T7 y T7 ARN polimerasa.

III. Neuronas dopaminergicas recombinantes y progenitores recombinantes de las mismas, incluyendo procedimientos para producir los mismos

[0092] La materia aqui descrita usa el descubrimiento de procedimientos para la manipulacion de celulas progenitoras, tales como celulas formadoras de neuroesferas (NSFC) para producir celulas cebadas de linaje

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adecuadas para usar en estrategias de reemplazo celular y/o para la liberacion de factores neurotroficos a tejidos diana. El cebado de linaje de NSFC da lugar a mecanismos de linaje restringido a celulas que conducen en algunas realizaciones a las celulas cebadas de linaje dopaminergicas. Estas celulas cebadas de linaje pueden trasplantarse a sujetos con traumas del sistema nervioso central y/o enfermedades neurodegenerativas, y son particularmente utiles para el trasplante autologo.

[0093] Las celulas progenitoras que se pueden del epitelio olfativo (en algunas realizaciones, epitelio olfativo humano y en algunas realizaciones epitelio olfativo humano adulto) permanecen relativamente no diferenciadas cuando se mantienen en un medio mlnimo, tal como, pero no limitado a MEM10, o cuando se exponen a una variedad de medios definidos y factores troficos. Estos cultivos de NSFC parecen tener un defecto neuronal inmaduro en el que mas del 97% de las celulas expresan tanto b tubulina III como periferina y habitualmente mas de una mitad de la poblacion de las celulas expresan nestina. Esto sugiere que los cultivos de NSFC obtenidos a partir de epitelio olfativo humano adulto podrlan ser diferentes de celulas madre embrionarias y/o otros tipos de celulas madre neurales.

[0094] Sin embargo, en algunas realizaciones los cultivos de NSFC humanos descritos en este documento tienen caracterlsticas de celulas progenitoras neurales. Por ejemplo, las celulas habitualmente no parecen expresar la protelna astrocltica fibrilar acida de la glia (GFAP) marcadora, el marcador microglial OX42, los marcadores de oligodendrocitos galactocerebrosido (GalC) o la protelna basica de mielina (MBP), o los marcadores neuronales maduros nucleos neuronales (NeuN), HB9, Isl 1/2, transportador vesicular de acetilcolina (VAChT), colina acetiltransferasa (ChAT), y tirosina hidroxilasa (TH), cada uno de los cuales es indicativo de un tipo de celula del sistema nervioso central que ha experimentado la especificacion de linaje restringido mas alla la etapa progenitora. Se observa, sin embargo, que una pequena fraccion de las celulas puede expresar uno o mas de estos marcadores, y este hecho no excluye que esta fraccion de las celulas este comprendida por el termino "NSFC".

[0095] Para determinar si las NSFC pueden experimentar un cebado de linaje a lo largo de las vlas de linaje restringido a celulas utilizando agentes de cebado de linaje, los cultivos de NSFC fueron tratados simultaneamente con diferentes concentraciones y combinaciones de RA, FN, y Shh in vitro. Dependiendo del regimen de tratamiento, los cultivos de NSFC pueden, en algunas realizaciones, someterse a cebado de linaje para producir neuritas que tienen caracterlsticas de celulas cebadas de linaje cebado motoneuronal y celulas cebadas de linaje dopaminergicas. En algunas realizaciones, las NSFC no forman estos tipos de celulas cebadas de linaje despues del tratamiento con RA, FN, o Shh solo.

[0096] En algunas realizaciones, el cebado de linaje puede realizarse mediante el tratamiento de cultivos de NSFC durante siete dlas con RA en presencia de FN, Shh, o una combinacion de FN y Shh. En algunas realizaciones, al menos 1 pM de AR en combinacion con FN a una concentracion de 1 pM a 10 pM, incluyendo, pero no limitado a, 1 pM, 2 pM, 3 pM, 4 pM, 5 pM, 6 pM, 7 pM, 8 pM, 9 pM, y 10 pM, puede dar lugar a celulas cebadas de linaje motoneuronal y dopaminergico. Alternativamente, al menos 1 pM de RA en combinacion con Shh a una concentracion de 5 nM a 20 nM, incluyendo, pero no limitado a, 5 nM, 6 nM, 7 nM, 8 nM, 9 nM, 10 nM, 11 nM, 12 nM, 13 nM, 14 nM, 15 nM, 16 nM, 17 nM, 18 nM, 19 nM, y 20 nM, puede dar lugar a celulas cebadas de linaje motoneuronal y dopaminergico. En algunas realizaciones, al menos 1 pM de RA en combinacion con FN a una concentracion de 1 pM a 10 pM (incluyendo, pero no limitado a, 2 pM, 3 pM, 4 pM, 5 pM, 6 pM, 7 pM, 8 pM, y 9 pM) y Shh a una concentracion de 5 nM a 20 nM (incluyendo, pero no limitado a, 5 nM, 6 nM, 7 nM, 8 nM, 9 nM, 10 nM, 11 nM, 12 nM, 13 nM, 14 nM, 15 nM, 16 nM, 17 nM, 18 nM, 19 nM, y 20 nM) da lugar a celulas cebadas de linaje motoneuronal y dopaminergico. Y en algunas realizaciones, al menos 1 pM de RA en combinacion con 5 pM de FN y 15 nM de Shh da lugar a celulas cebadas de linaje motoneuronal y dopaminergico. En algunas realizaciones, ninguno de estos tratamientos afecta a la viabilidad celular.

[0097] Despues del tratamiento de las cultivos de NSFC con, por ejemplo, 1 pM de RA en combinacion con 5 pM de FN y 15 nM de Shh durante siete dlas, las celulas cebadas de linaje motoneuronal y dopaminergico resultantes expresan antlgenos neuronales maduros. Aproximadamente el 97% de las NSFC eran positivas en b-tubulina III y positivas en periferina, aproximadamente el 82% eran positivas en Tau, y aproximadamente el 86% eran positivas en a-internexina. Ademas, aproximadamente el 31% de las NSFC tratadas expresaron NF68 localizado en el soma celular mientras que aproximadamente el 27% de las celulas expresaron NF160 y el 24% de las celulas expresaron NF200 en el soma y procesos neurlticos. Por el contrario, la expresion de nestina disminuyo en las celulas tratadas a aproximadamente el 17% y no se detectaron GFAP, OX42, GaIQ, o MBP. Ademas, los experimentos de etiquetado confirmaron que las NSFC tratadas con 1 pM de RA en combinacion con 5 pM de FN y/o 15 nM de Shh no incorporaban cantidades significativas de BrdU, pero induclan la expresion de NeuN. Por lo tanto, las NSFC se someten a una especificacion de linaje restringido a lo largo de una via neuronal que incluye celulas cebadas de linaje motoneuronal y dopaminergico.

[0098] Ademas, aproximadamente el 12% de las NSFC tratadas forman celulas cebadas de linaje dopaminergico, como lo demuestra la expresion del antlgeno especlfico neuronal dopaminergico, la tirosina hidroxilasa. Las celulas positivas en TH no pudieron expresar ChAT o VAChT, definiendo por lo tanto estas celulas como celulas cebadas de linaje dopaminergico en lugar de celulas cebadas de linaje motoneuronal.

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[0099] Por lo tanto, en algunas realizaciones, la materia aqul descrita proporciona neuronas dopaminergicas recombinantes y/o progenitores recombinantes de las mismas. La presente invencion proporciona un procedimiento in vitro de produccion de neuronas dopaminergicas recombinantes, tal como se expone en las reivindicaciones.

[0100] En algunas realizaciones de la materia descrita, las neuronas dopaminergicas recombinantes se producen mediante la transformacion de una celula capaz de diferenciarse en una neurona dopaminergica con un acido nucleico (por ejemplo, uno o mas transgenes, opcionalmente presentes en un casete de expresion, ademas opcionalmente presentes en un vector de expresion) que codifica y/o activa transcripcionalmente uno o mas polipeptidos que son capaces de inducir la diferenciacion de una celula progenitora en una neurona dopaminergica (por ejemplo, un "agente de cebado de linaje” tal como se define aqul). Tal como se utiliza en el presente documento, la frase "un acido nucleico que activa transcripcionalmente" se refiere a secuencia de acido nucleico que cuando se inserta en una celula causa la transcripcion de un gen de interes (en algunas realizaciones, un gen endogeno de interes) en la celula que se transcribe a un nivel superior al que habrla ocurrido en ausencia de la secuencia de acido nucleico. Por ejemplo, un promotor que es transcripcionalmente activo en una celula puede introducirse en la celula en condiciones suficientes para integrar de manera homologa el promotor en una posicion en un cromosoma que une operativamente una secuencia de codificacion de interes al promotor, lo que provoca que la secuencia de codificacion de interes se exprese en la celula. En algunas realizaciones, una celula capaz de diferenciarse en una neurona dopaminergica comprende una celula madre derivada de epitelialo olfativo/NSFC, que puede ser, opcionalmente, una celula madre derivada de epitelialo olfativo/NSFC humana o una celula madre derivada de epitelialo olfativo/NSCF humana adulta.

[0101] El termino "transformacion" y las variantes gramaticales del mismo se refieren a cualquier alteracion en la expresion de genes que da lugar a un cambio fenotlpico a una celula. Ejemplos de transformacion incluyen el aumento o disminucion de la expresion de un gen endogeno mediante la incorporacion de agentes de cebado de linaje en el interior de las celulas (por ejemplo, proporcionando a las celulas transgenes que codifican agentes de cebado de linaje) o por contacto de las celulas con agentes linaje de cebado.

[0102] El termino "exogeno" se refiere a cualquier cosa que se expone a una celula o se introduce en una celula que se origina desde el exterior de la celula. Un ejemplo de una secuencia de acido nucleico exogeno es un transgen. Se observa que un acido nucleico puede ser considerado "exogeno" si esta siendo suministrado a una celula en forma recombinante, a pesar de que la propia celula podrla tener una copia endogena de ese acido nucleico. Por ejemplo, las celulas humanas (por ejemplo, NSFC humanas) comprenden secuencia de nurr-1 endogena humana y pueden producir endogenamente un polipeptido nurr-1 humano. Sin embargo, un transgen de nurr-1 humano que se transfecta en una NSFC humana se considerarla un acido nucleico exogeno, ya que se suministra a la NSFC exogenamente en forma recombinante. Del mismo modo, tambien se considerarla que las celulas hijas de una NSFC transfectada que llevan un transgen de nurr-1 (es decir, un acido nucleico de nurr-1 exogeno) comprenden secuencias de nurr-1 exogenas a pesar del hecho de que la propia celula hija no se transfecto con una acido nucleico exogeno.

[0103] Por el contrario, el termino "endogeno" se refiere a una molecula (por ejemplo, un polipeptido, molecula pequena, etc.) que existe naturalmente en una celula o se produce naturalmente dentro de una celula que no sea por la transcripcion y/o traduccion de un acido nucleico exogeno. Como tal, en algunas realizaciones, los terminos "endogeno" y "exogeno" son antonimos.

[0104] La frase "agente de cebado de linaje" se refiere a cualquier composicion que es capaz de cebar el linaje. Por ejemplo, una protelna de cebado de linaje es una protelna que solo o con otros agentes es capaz de cebar el linaje. Otros ejemplos de agentes de cebado de linaje incluyen secuencias de genes exogenos, incluyendo las secuencias de codificacion, tales como marcos de lectura abiertos que codifican una protelna, y secuencias no codificantes, tales como elementos promotores y potenciadores de la transcripcion que pueden aumentar la expresion de genes endogenos despues de la recombination de tales secuencias en las celulas; acidos nucleicos; y moleculas pequenas, tales como moleculas organicas que tienen una masa inferior a 1.000 daltons, y mezclas de los mismos.

[0105] En algunas realizaciones, un agente de cebado de linaje comprende una secuencia codificante de un gen que cuando se expresa en una celula progenitora sola o en combination con otros agentes de cebado de linaje induce la diferenciacion de la celula progenitora en una neurona dopaminergica. Los siguientes genes y los productos codificados por ellos, incluyendo el ADN, ARN y protelnas, son agentes de cebado de linaje dopaminergico, y pueden proceder de cualquier organismo vertebrado, incluyendo el ser humano, mono, raton, perro, pollo, rana, bovino, equino, ovino y cerdo: sonic hedgehog (Shh), nurr-1, pitx3, y lmx1a. La frase "agente de cebado de linaje" incluye cada uno de estos genes, variantes de los mismos, y mezclas de los mismos. Biosecuencias representativas de homologos y ortologos correspondientes a estos productos genicos se presentan en la Tabla 1.

Tabla 1

Nos. de acceso GENBANK® de agente de cebado de linaje de ejemplo

Gen
| Especie | Acido nucleico | Aminoacido

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nurr-1
H. sapiens NM 006186 NP 006177

M. musculus
NM 013613 NP 038641

R. norvegicus
NM 019328 NP 062201

B. Taurus
NM 001076208 NP 001069676

C. familiaris
XM 535920 XP 535920

E. caballus
XM 001490494 XP 001490544

pitx3
H. sapiens NM 005029 NP 005020

M. musculus
NM 008852 NP 032878

R. norvegicus
NM 019247 NP 062120

B. Taurus
XM 589431 XP 589431

C. familiaris
XM 543986 XP 543986

E. caballus
XM 001499135 XP 001499185

lmx1a
H. sapiens NM 177398.2; NM 177399.2; NM 001033507 NP 796372; NP 796373; NP 001028679

M. musculus
NM 033652 NP 387501

R. norvegicus
NM 001105967 NP 001099437

B. Taurus
XM 001789182 XP 001789234

C. familiaris
XM 846259 XP 851352

E. caballus
XM 001493329 XP 001493379

Shh
H. sapiens NM 000193 NP 000184

M. musculus
NM 009170 NP 033196

R. norvegicus
NM 017221 NP 058917

C. familiaris
XM 856335 XP 861428

E. caballus
XM 001914885 XP 001914920

[0106] El termino "acido retinoico" se refiere a acido retinoico en si mismo y cualquier derivado del mismo que puede actuar como un agente de cebado de linaje. Los derivados de acido retinoico de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, la vitamina A, acido retinoico todo-trans, y derivados ester y eter de los mismos.

[0107] El termino "forskolina" se refiere al compuesto de forskolina (nombre IUPAC acetato de (3R,4aR,5S,6S,6aS,10S,10aR,10bS)-6,10,10b-trihidroxi-3,4a,7,7,10a-pentametil-1-oxo-3-vinildodecahidro-1H- benzo[f]cromen-5-ilo), tal como el obtenido a partir de Coleus forskohlii, y cualquier derivado del mismo que puede actuar como un agente de cebado de linaje. Otros inhibidores de la fosfodiesterasa, ademas de forskolina, se pueden emplear tambien como agentes de ceado de linaje, incluyendo, pero no limitado a, papaverina, vinpocetina, nitroprusiato de sodio, milrinona, rolipram, zaprinast y el dipiridamol. Tambien pueden utilizarse otros agentes que aumentan los niveles de AMPc intracelular.

[0108] Como tal, en algunas realizaciones, una neurona dopaminergica recombinante y/o un progenitor recombinante de la misma comprende uno o mas transgenes que codifican un polipeptido nurr-1, un polipeptido pitx3, un polipeptido lmx1a, un fragmento biologicamente activo de los mismos, un derivado biologicamente activo de los mismos, y/o cualquier combinacion de los mismos. En algunas realizaciones, una neurona dopaminergica recombinante y/o un progenitor recombinante de la misma comprende un unico transgen que codifica dos o mas de un polipeptido nurr-1, un polipeptido pitx3, un polipeptido lmx1a, un fragmento biologicamente activo de los mismos, un derivado biologicamente activo de los mismos, y/o cualquier combinacion de los mismos. En algunas realizaciones, una neurona dopaminergica recombinante o un progenitor recombinante de los mismos comprende un unico transgen que codifica un polipeptido nurr-1 y un polipeptido pitx3.

[0109] En algunas realizaciones, un unico transgen que codifica multiples polipeptidos lo hace mediante la codificacion de protelnas de fusion y/o mediante la codificacion de los polipeptidos en una unidad de transcripcion compleja que se traduce diferencialmente para producir polipeptidos distintos. En algunas realizaciones, multiples polipeptidos son codificados por un solo transgen mediante el empleo de una o mas copias de una secuencia de nucleotidos conocida como "sitios de entrada de ribosoma interno (IRES)". El uso de secuencias IRES para codificar mas de un polipeptido distinto en una sola unidad de transcripcion se describe en Zhou et al., 1990 y en la patente de Estados Unidos N° 5.648.235.

[0110] En algunas realizaciones, un progenitor recombinante que puede diferenciarse en una neurona

dopaminergica recombinante comprende una celula cebada de linaje dopaminergico. La frase "celula cebada de linaje dopaminergico" se refiere a una celula que, en algunas realizaciones, tiene por lo menos cuatro de las siguientes caracterlsticas, incluyendo la caracterlstica (i); en algunas realizaciones, tiene al menos cinco de las

siguientes caracterlsticas, incluyendo la caracterlstica (i); en algunas realizaciones, tiene al menos seis de las

siguientes caracterlsticas, incluyendo la caracterlstica (i); en algunas realizaciones, tiene al menos siete de las

siguientes caracterlsticas, incluyendo caracterlstica (i); y en algunas realizaciones, tiene todas las caracterlsticas

siguientes:

(i) expresa TH;

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(ii) expresar la dopamina;

(iii) expresa el neurofilamento 68 (NF68);

(iv) expresa el neurofilamento 160 (NF160);

(v) expresa el neurofilamento 200 ( NF200);

(vi) expresa NeuN;

(vii) expresa Isl 1 y/o Isl 2 (Isl 1/2);

(viii) no expresa VAChT o expresa YAChT en una cantidad de que es indetectable o por debajo de la expresada en celulas neuronales negativas en TH;

(ix) no expresa ChAT o expresa ChAT en una cantidad de que es indetectable o por debajo de la expresada en celulas neuronales negativas en TH;

(x) no expresa GFAP o expresa una cantidad de GFAP que es indetectable o por debajo de la expresada en astrocitos;

(xi) no expresa GalC o expresa una cantidad de GalC que es indetectable o por debajo de la expresada en celulas de oligodendrocitos;

(xii) no expresa MBP o expresa una cantidad de MBP que es indetectable o por debajo de la expresada en celulas de oligodendrocitos; y

(xiii) no expresa OX42 o expresa una cantidad de OX42 que es indetectable o por debajo de la expresada en celulas de la microglia.

Las celulas cebadas de linaje dopaminergico no tienen por que tener todas las caracterlsticas antes mencionadas, pero tendran al menos cuatro de estas caracterlsticas simultaneamente, incluyendo en algunas realizaciones, la caracterlstica (i).

[0111] La presente invention proporciona un procedimiento in vitro para la production de una neurona dopaminergica recombinante, tal como se expone en las reivindicaciones. El procedimiento comprende: (a) proporcionar celulas madre derivadas de epitelio olfativo adulto (en algunas realizaciones, celulas madre derivadas de epitelio olfativo humano); (b) introducir uno o mas transgenes en celulas madre derivadas del epitelio olfativo adulto, en el que dichos uno o mas transgenes codifican una combination de un polipeptido nurr-1 y un polipeptido pitx3, mediante lo cual se produce una neurona dopaminergica recombinante; y que comprende ademas opcionalmente (c) cultivar las celulas madre derivadas de epitelio olfativo adulto antes, durante y/o despues de la etapa de introduction en un medio que comprende un polipeptido Sonic hedgehog (Shh), un fragmento biologicamente activo del mismo, acido retinoico (RA) o un derivado biologicamente activo del mismo, forskolina (FN) o un derivado biologicamente activo de la misma, o cualquier combinacion de los mismos, en condiciones suficientes para inducir la diferenciacion neuronal en las celulas madre derivadas del epitelio olfativo. En algunas realizaciones, las celulas madre derivadas de epitelio olfativo adulto son celulas madre derivadas de epitelio olfativo de adulto humano y al menos uno del polipeptido nurr-1, el polipeptido pitx3, el polipeptido lmx1a o la combinacion de los mismos se deriva de una especie distinta de la humana. En algunas realizaciones, el polipeptido pitx3 es un polipeptido pitx de rata. En algunas realizaciones, el polipeptido lmx1a es un polipeptido lmx1a de raton. En algunas realizaciones, el polipeptido nurr-1 es un polipeptido nurr-1 de raton.

[0112] Como tal, la materia aqul descrita tambien proporciona procedimientos para producir celulas cebadas de linaje. La frase "especificacion de linaje restringido" se refiere al compromiso de una celula progenitora para formar un tipo de celulas no progenitoras.

[0113] El cebado de linaje de NSFC con condiciones de medios de cultivo convencionales, tales como suero bovino fetal al 10%, se produce con una eficacia de menos del 1%. En cambio, la eficacia del cebado de linaje de NSFC con los agentes de cebado de linaje descritos en la materia aqul descrita es de al menos 1%. En algunas realizaciones, la eficacia del cebado de linaje de NSFC es de al menos 5%. En algunas realizaciones, la eficacia del cebado de linaje es de al menos el 10%. En algunas realizaciones, la eficacia del cebado de linaje se encuentra dentro del intervalo de 5% a 95%, incluyendo 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75% y 90%. La eficacia del cebado de linaje se puede determinar de varias maneras, incluyendo el uso de analisis inmunocitoquimico para determinar la proparte de celulas cebadas de linaje de un tipo particular formado en una poblacion de NSFC tratadas con un agente de cebado de linaje.

[0114] El cebado de linaje de NSFC puede dar lugar a poblaciones de celulas mixtas que contienen tanto NSFC como uno o mas diferentes tipos de celulas cebadas del linaje. Por ejemplo, las NSFC, celulas cebadas de linaje motoneuronal, y celulas cebadas de linaje dopaminergico estan presentes despues del tratamiento de los cultivos de NSFC con 1 pM de RA en combinacion con 5 pM de FN y 15 nM de Shh durante siete dias. Cada una de estas poblaciones de celulas muestra marcadores especificos sobre las superficies de las celulas que distinguen los tipos de celulas de cebado de linaje entre si y de NSFC, y esta caracteristica se puede utilizar en un procedimiento para seleccionar poblaciones de celulas homogeneas de un tipo particular. Uno de tales procedimientos es el uso de un anticuerpo que reconoce como antigeno un marcador especifico de celulas cebadas del linaje que no se expresa en otras celulas cebadas de linaje cebado de un tipo diferente o en NSFC. El anticuerpo puede inmovilizarse sobre una matriz solida, tal como una resina o microesfera (por ejemplo, una microesfera magnetica), y se utiliza para unir celulas que contienen antigeno de un tipo particular (por ejemplo, NSFC o poblaciones de celulas cebadas de linaje especifico). Las celulas cebadas de linaje que carecen del antigeno se separan de las celulas cebadas de linaje que contienen antigeno mediante la recuperation de la matriz solida que contiene las celulas unidas a anticuerpo y

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separar por lavado las celulas no unidas. Las celulas cebadas de linaje dopaminergico, por ejemplo, se pueden seleccionar de una poblacion mezclada que contiene NSFC, as! como celulas de cebado de linaje motoneuronal y dopaminergico utilizando un anticuerpo especlfico para un antlgeno expresado especlficamente por las celulas cebadas de linaje dopaminergico (por ejemplo, TH). Estas tecnicas se pueden adaptar para seleccionar NSFC procedentes de los cultivos originales que contienen epitelio olfativo y recuperar NSFC despues de un tratamiento de cebado de linaje. Ejemplos de tales tecnicas de seleccion se describen por Othman et al. 2005 (a) y Othman et al. 2005 (b).

[0115] La frase "cebado de linaje” se refiere a cualquier accion que induce a una celula progenitora a someterse a la especificacion de linaje restringido.

[0116] La frase "celulas cebadas de linaje" se refiere a celulas que se originan de una celula progenitora como resultado de cebado del linaje.

[0117] El termino "eficacia" se refiere a la proparte de celulas no progenitoras formadas a partir de celulas progenitoras como resultado del cebado de linaje. Un ejemplo de un procedimiento para determinar la eficacia del cebado de linaje es utilizar inmunohistoqulmica para visualizar un marcador asociado con solo una celula no progenitora y para contar el numero de celulas que tienen ese marcador y el numero de celulas totales en la poblacion representativa. La eficacia, expresada como un porcentaje, serla la proparte de celulas que tienen el marcador con respecto a la poblacion total de celulas, multiplicado por cien.

[0118] Un "mecanismo de linaje restringido a las celulas" se refiere a estados celulares de celulas no progenitoras que pertenecen a un mecanismo comun de especificacion que puede conducir a una celula terminalmente diferenciada.

[0119] En algunas realizaciones, los procedimientos para producir celulas cebadas de linaje por tanto comprenden (a) cultivar la celula madre derivada de epitelio olfativo (en algunas realizaciones, una celula madre derivada de epitelio olfativo de origen humano y en algunas realizaciones una celula madre derivada de epitelio olfativo humano adulto) en un medio que comprende un polipeptido de Sonic hedgehog (Shh), un fragmento biologicamente activo del mismo, un derivado del mismo, acido retinoico (RA) o un derivado biologicamente activo del mismo, forskolina (FN) o un derivado biologicamente activo del mismo, o cualquier combinacion de los mismos, en condiciones suficientes para inducir la diferenciacion neuronal en las celulas madre derivadas del epitelio olfativo; y (b) expresar en la celula madre derivada de epitelio olfativo recombinante uno o mas transgenes que codifican un polipeptido nurr-1, un polipeptido pitx3, un polipeptido lmxla, un fragmento biologicamente activo del mismo, un derivado biologicamente activo del mismo, y/o cualquier combinacion de los mismos, mediante lo cual se produce una celula cebada de linaje que comprende una neurona dopaminergica recombinante o progenitor recombinante de la misma. En algunas realizaciones, dicho uno o mas del polipeptido nurr-1, el polipeptido pitx3, el polipeptido lmxla, el fragmento biologicamente activo de los mismos, el derivado biologicamente activo de los mismos, y/o la combinacion de los mismos codificados por dicho uno o mas transgenes comprenden un ortologo de raton, un ortologo de rata, y/o un ortologo humano, un fragmento biologicamente activo de los mismos, un derivado biologicamente activo de los mismos, o cualquier combinacion de los mismos.

[0120] Por tanto, el cebado de linaje de NSFC a lo largo de los mecanismos de linaje restringido a celulas neuronales se puede emplear para producir varios tipos de celulas del SNC no progenitoras, incluyendo las celulas cebadas de linaje dopaminergico o celulas cebadas de linaje motoneuronal. Las combinaciones de agentes de cebado de linaje se puede utilizar para el cebado de linaje de las cultivos de NSFC e incluyen los siguientes reglmenes robustos: (1) incubacion de NSFC en medio que contiene RA en combinacion con FN y/o Shh; y (2) expresion dirigida de un producto genico de nurr-1 gen, un producto genico de pitx3, y/o un producto genico de lmx1a, en transfectantes de NSFC. Estos reglmenes tienen utilidad en el establecimiento de tipos de celulas del sistema nervioso central que tienen un fenotipo morfologico y de linaje restringido. Tales materiales celulares son utiles para las estrategias de terapia de reemplazo celular para pacientes que sufren de enfermedades degenerativas del SNC.

[0121] Las celulas de la materia aqul descrita se pueden utilizar para la fabricacion de compuestos farmaceuticamente utiles, tales como dopamina u otros neurotransmisores producidos por neuronas sanas. En algunas realizaciones, una NSFC per se produce uno o mas compuestos farmaceuticamente utiles, tales como, pero no limitado a, NGF, BDNF, NT3, NT4/5, y/o VEGF. Alternativamente, o ademas, mediante el direccionamiento de una celula de la materia aqul descrita aguas debajo de un mecanismo de diferenciacion que conduce a la formacion de neuronas, un cultivo de celulas unicas compuestas de neuronas diferenciadas derivadas de la celula madre de la materia aqul descrita puede proporcionar grandes poblaciones de celulas, capaces de la produccion de grandes cantidades de compuestos farmaceuticamente utiles, tales como la dopamina. Ademas, muchos factores de crecimiento, incluyendo al menos NGF, BDNF, NT3, y NT4/5, se pueden utilizar para inducir las celulas aqul descritas para someterse a la diferenciacion adicional.

[0122] Se pueden utilizar segundos mensajeros, tales como AMPc, para mediar en la interaccion entre los

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receptores de factores de crecimiento de la celula madre diferenciante y los propios factores de crecimiento. Por ejemplo, la exposicion de subcultivos de neuroesferas a los medios que contienen 2,5 mM de dibutiril AMPc disminuye drasticamente la actividad mitotica y aumenta los niveles de a-internexina, un marcador neuronal (filamento intermedio) que aparece antes de la formation de neurofilamentos en el desarrollo de las neuronas.

[0123] Ademas, las celulas de la materia aqul descrita pueden manipularse para expresar transgenes que codifican productos utiles. Una ventaja de la ingenierla de las celulas de la materia aqul descrita, ya sean diferenciadas o no, es la posibilidad de producir polipeptidos, tales como polipeptidos neuronales o polipeptidos especlficos de celulas madre, que se procesan de manera que estarlan en su contexto nativo y de este modo se pueden cultivar en grandes cantidades. Otra ventaja incluye la ingenierla de dichas celulas antes del trasplante a un sujeto de tal manera que se expresa una molecula terapeuticamente util. Por ejemplo, un paciente que sufre de la enfermedad de Parkinson puede tener celulas del epitelio olfativo recogidas para aislar las celulas madre de la materia aqul descrita, pero podrlan no expresar suficiente dopamina para tratar la enfermedad de Parkinson. Por lo tanto, tales celulas pueden modificarse geneticamente con un gen de dopamina de tipo salvaje (ya sea operativamente ligado a los promotores endogenos de dopamina o a un promotor exogeno, dependiendo de la regulation y la cantidad de secretion que se desee) antes de la implantation. En algunas realizaciones, las celulas madre derivadas del epitelio olfativo son autologas, lo que significa que se recogieron de la paciente o el paciente y/o de otra fuente autologa.

IV. Procedimientos y composiciones para el tratamiento utilizando subpoblaciones de celulas madre derivadas de epitelio olfativo

[0124] Las celulas de la materia aqul descrita se pueden usar ademas para formar, reformar, y/o rescatar estructuras del sistema nervioso central danadas o que funcionan mal, tales como axones y/o para estimular el nuevo crecimiento de los axones existentes. Por ejemplo, las celulas pueden diferenciarse, y las celulas envainadas resultantes se pueden seleccionar y trasplantar para reparar el dano neurologico.

[0125] La diferenciacion de celulas madre puede dirigirse para dar lugar a un tipo particular de celula hija que surge de la celula madre parental. Por ejemplo, cuando la celula madre se expone a dibutiril AMPc durante 24 horas, se diferencia entre un progenitor que contiene un precursor de neurofilamentos.

[0126] Ademas, en el cultivo, al menos una parte de las celulas se diferencian de forma espontanea y se pueden seleccionar. La congelation se puede utilizar para almacenar las celulas diferenciadas hasta que sean suficientes para recogerse para un trasplante eficaz. Por lo tanto, mediante la induction de la celula madre de la materia aqul descrita para formar un tipo de celula deseado, y la inyeccion de esta celula diferenciada en el lugar de la lesion, se pueden tratar las estructuras del sistema nervioso central.

IV.A Trasplante

[0127] Por lo tanto, la materia aqul descrita proporciona tambien procedimientos para el trasplante que comprende trasplantar en un sujeto una celula madre derivada de epitelio olfativo cebada de linaje dopaminergico (en algunas realizaciones, una celula madre derivada de epitelio olfativo humano, y en algunas realizaciones, celula madre derivada de epitelio olfativo humano adulto) o un progenitor de la misma, en el que la celula madre derivada de epitelio olfativo cebada de linaje dopaminergico expresa uno o mas transgenes que (a) codifican uno o mas de un polipeptido nurr-1, un polipeptido pitx3, un polipeptido lmxla, un fragmento biologicamente activo de los mismos, y un derivado biologicamente activo de los mismos; y/o (b) comprenden un promotor que es transcripcionalmente activo en la neurona dopaminergica o un progenitor de la misma que esta operativamente ligada a una secuencia codificante que codifica el polipeptido nurr-1, el polipeptido pitx3, el polipeptido lmxla, o el fragmento biologicamente activo o derivado de los mismos, y ademas en el que el cebado de linaje tiene una eficacia de al menos el 1%. En algunas realizaciones, el cebado de linaje tiene una eficacia de al menos 5%, 10%, 15%, 20%, o mas. En algunas realizaciones, el cebado de linaje comprende (a) proporcionar una celula madre derivada de epitelio olfativo (en algunas realizaciones, una celula madre derivada de epitelio olfativo humano, y en algunas realizaciones una celula madre derivada de epitelio olfativo humano adulto), opcionalmente una pluralidad de celulas madre derivadas del epitelio olfativo, ademas opcionalmente en forma de una o mas neuroesferas; (b) introducir en la celula madre derivada de epitelio olfativo uno o mas transgenes que codifican un polipeptido seleccionado del grupo que consiste en un polipeptido nurr-1, un polipeptido pitx3, un polipeptido lmx1a, un fragmento biologicamente activo de los mismos, un derivado biologicamente activo de los mismos , y/o cualquier combinacion de los mismos; y (c) cultivar la celula madre derivada de epitelio olfativo antes, durante y/o despues de la etapa de introduction en un medio que comprende un polipeptido Sonic hedgehog (Shh), un fragmento biologicamente activo del mismo, un derivado del mismo, acido retinoico (RA) o un derivado biologicamente activo del mismo, forskolina (FN) o un derivado biologicamente activo de la misma, o cualquier combination de los mismos, en condiciones suficientes para inducir la diferenciacion neuronal en la celula madre derivada de epitelio olfativo. En algunas realizaciones, las condiciones suficientes para inducir la diferenciacion neuronal comprende cultivar la celula madre derivada de epitelio olfativo en un medio de cultivo que comprende aproximadamente 1 pM de acido retinoico, aproximadamente 5 pM de forskolina, y aproximadamente 15 nM de Sonic hedgehog durante al menos aproximadamente 3, 4, 5, 6, o 7 dlas. En algunas realizaciones, la etapa de cultivo produce una neurona dopaminergica o un progenitor recombinante de la misma que expresa un producto genico endogeno de tirosina hidroxilasa (TH), produce dopamina, segrega

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dopamina, o combinaciones de los mismos.

IV.B Procedimientos para aliviar los sintomas asociados con trastornos neurologicos

[0128] La materia aqul descrita proporciona tambien procedimientos para mejorar al menos un slntoma asociado con un trastorno neurologico en un sujeto. Tal como se usa en el presente documento, la frase "slntoma asociado con un trastorno neurologico en un sujeto" se refiere a cualquier slntoma que existe en un sujeto que tiene un trastorno neurologico que resulta directa o indirectamente de un funcionamiento anormal o suboptimo del sistema nervioso del sujeto. En algunas realizaciones, el slntoma asociado con un trastorno neurologico en un sujeto resulta del dano a uno o mas tipos de celulas del sistema nervioso del sujeto causado por un defecto genetico en el sujeto, una lesion aguda al sujeto, y/o exposition del sujeto a una o mas agresiones ambientales.

[0129] En algunas realizaciones, los procedimientos que proporcionan una neurona dopaminergica que expresa uno o mas de un polipeptido nurr-1, un polipeptido pitx3, un polipeptido lmxla, un fragmento biologicamente activo o derivado del mismo o un progenitor de la misma, y se transplantan de la neurona dopaminergica recombinante o el progenitor de la misma en el sujeto, opcionalmente en la sustancia negra del sujeto. En algunas realizaciones, el trastorno neurologico es la enfermedad de Parkinson.

[0130] En algunas realizaciones, la neurona dopaminergica recombinante trasplantada o progenitor de la misma (en algunas realizaciones, un progenitor recombinante de la misma) induce el crecimiento y/o regeneration de una o mas celulas madre y/o neuronas endogenas en el sujeto. Tal como se utiliza en el presente documento, la frase "crecimiento y/o regeneration de una o mas celulas madre y/o neuronas endogenas en el sujeto" se refiere al crecimiento y o regeneration de una de las propias celulas madre y/o neuronas del sujeto (es decir, una celula madre y/o neurona no recombinante que ya esta presente en el sujeto cuando la neurona dopaminergica recombinante o el progenitor recombinante se trasplanta en el sujeto). Aunque no se desea estar limitado a ninguna teorla particular de operation, las neuronas dopaminergicas recombinantes o progenitores recombinantes de las mismas de la materia aqul descrita secretan varios factores neurotroficos que pueden ayudar en el crecimiento, la reparation y/o regeneration de las propias neuronas del sujeto actuando sobre las neuronas y/o progenitores endogenos de las mismas.

IV.C Procedimientos para inducir el crecimiento y/o regeneration de las neuronas

[0131] La materia aqul descrita tambien proporciona procedimientos para inducir el crecimiento y/o regeneration de una neurona en un sujeto. En algunas realizaciones, los procedimientos comprenden trasplantar una pluralidad de celulas madre derivadas de epitelio olfativo y/o derivados diferenciados de las mismas en el sujeto en un lugar y en un numero suficiente para inducir el crecimiento y/o regeneration de una neurona en el sujeto. Las celulas madre derivadas del epitelio olfativo (en algunas realizaciones, celulas madre derivadas de epitelio olfativo humano, y en algunas realizaciones, celulas madre derivadas de epitelio olfativo humano adulto) y/o los derivados diferenciaos de las mismas se pueden trasplantar en cualquier tejido diana. En algunas realizaciones, las celulas madre derivadas del epitelio olfativo y/o derivados diferenciados de las misma se trasplantan en un sitio del sistema nervioso central en el sujeto, incluyendo, pero no limitado a, la sustancia negra. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un trastorno neurologico asociado con la perdida de las neuronas dopaminergicas, opcionalmente en el que el trastorno neurologico es la enfermedad de Parkinson.

[0132] Los procedimientos aqul descritos en la presente tambien pueden incluir una etapa de diferenciacion de la celula madre derivada de epitelio olfativo in vitro antes del trasplante mediante la expresion en la celula madre derivada de epitelio olfativo de uno o mas transgenes que codifican un agente de cebado de linaje, incluyendo, pero no limitado a, un polipeptido seleccionado del grupo que consiste en un polipeptido nurr-1, un polipeptido pitx3, un polipeptido lmx1a, un fragmento biologicamente activo de los mismos, un derivado biologicamente activo de los mismos, y/o cualquier combination de los mismos. Un listado de los ortologos de mamlfero para estos agentes de cebado de linaje se presenta en la Tabla 1. En algunas realizaciones, el polipeptido nurr-1, el polipeptido pitx3, y/o el polipeptido lmx1a son un ortologo humano de los mismos. En algunas realizaciones, el trasplante proporciona a la neurona una cantidad eficaz de un factor neurotrofico (por ejemplo, BDNF, NGF, CTNF, NT-3, NT-4, o VEGF) suficiente para causar que la neurona crezca y/o se regenere.

IV.D Procedimientos para la liberation de factores neurotroficos a sujetos

[0133] La materia aqul descrita proporciona tambien procedimientos para liberar un factor neurotrofico a un sujeto, incluyendo, pero no limitado a, la liberation del factor neurotrofico directamente al sistema nervioso central del sujeto y evitando as! la barrera hematoencefalica.

[0134] A modo de ejemplo y sin limitation, los procedimientos aqul descritos pueden comprender la liberation de factor neurotrofico derivado del cerebro (BDNF) al sistema nervioso central de un sujeto. En algunas realizaciones, los procedimientos comprenden trasplantar en el sujeto una celula madre derivada de epitelio olfativo o un derivado diferenciado de la misma, en el que el trasplante es en un sitio del sistema nervioso central en el sujeto. Como se describe en el presente documento, las celulas madre derivadas del epitelio olfativo y derivados diferenciados de las

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mismas producen y secretan diversos factores neurotroficos, incluyendo, pero no limitado a, BDNF.

[0135] La disposicion de dichos factores neurotroficos puede ayudar en la restauracion de un deficit funcional en el sujeto. Por ejemplo, se conoce que las lesiones neurologicas dan lugar a deficits funcionales, y la materia aqul descrita puede emplearse para mejorar los deficits funcionales que resultan de este tipo de lesiones.

IV. E. Procedimientos para proporcionar neuronas dopaminergicas a sujetos

[0136] La materia aqul descrita proporciona tambien procedimientos para proporcionar una funcion de neurona dopaminergica a un sujeto en necesidad del mismo. Tal como se utiliza aqul, la frase "una funcion de neurona dopaminergica" se refiere a cualquier funcion normalmente proporcionada por las neuronas dopaminergicas en un sujeto. Una funcion de neurona dopaminergica de ejemplo es la production y liberation de dopamina. En algunas realizaciones, la funcion de neurona dopaminergica es una funcion normalmente proporcionada por neuronas dopaminergicas en un sujeto humano.

[0137] En algunas realizaciones, los procedimientos comprenden la introduction de una pluralidad de celulas madre derivadas del epitelio olfativo y/o derivados diferenciados in vitro de las mismas en el cerebro medio del sujeto en un numero y en condiciones suficientes para permitir que al menos una de la pluralidad de celulas madre derivadas del epitelio olfativo (en algunas realizaciones, celulas madre derivadas de epitelio olfativo humano, y en algunas realizaciones, celulas madre derivadas de epitelio olfativos humano adulto) se diferencie en una neurona dopaminergica funcional, proporcionando de este modo una funcion de neuronas dopaminergicas a un sujeto. Alternativamente, o adicionalmente, los derivados diferenciados in vitro se pueden diferenciar mediante la expresion en al menos una celula madre derivada de epitelio olfativo de uno o mas transgenes que codifican un polipeptido seleccionado del grupo que consiste en un polipeptido nurr-1, un polipeptido pitx3, un lmxla polipeptido, un fragmento biologicamente activo de los mismos, un derivado biologicamente activo de los mismos, y/o cualquier combination de los mismos, y/o mediante la exposition de al menos una celula madre derivada de epitelio olfativo a un factor neurotrofico que induce la diferenciacion de la celula madre derivada de epitelio olfativo a una neurona dopaminergica y/o que ceba la celula madre derivada de epitelio olfativo para diferenciarse en una neurona dopaminergica.

[0138] En los procedimientos aqul descritos, es posible que las celulas madre derivadas del epitelio olfativo introducidas y/o derivados diferenciados in vitro de las mismas se diferencian a si mismas en neuronas dopaminergicas y/o induzcan las propias celulas del sujeto (es decir, endogenas al sujeto) a diferenciarse en neuronas dopaminergicas. Como tal, en algunas realizaciones, las celulas madre derivadas del epitelio olfativo introducidas y/o derivados diferenciados de las mismas in vitro se diferencian terminalmente en una o mas neuronas dopaminergicas funcionales en el sujeto. Alternativamente, o adicionalmente, la introduccion puede inducir una o mas celulas endogenas en el sujeto a diferenciarse en una o mas neuronas dopaminergicas funcionales, puede inducir la reparation de una neurona dopaminergica endogena no funcional o suboptimamente funcional o un precursor de la misma en el sujeto, y/o puede rescatar una neurona dopaminergica y/o un precursor de la misma de la inactivation y/o muerte que habrla experimentado en ausencia de la pluralidad introducida de celulas madre derivadas del epitelio olfativo y/o derivados diferenciados in vitro de las mismas.

IV.F. Sujetos

[0139] En algunas realizaciones, la materia aqul descrita pretende emplearse en un sujeto. El termino "sujeto" como se usa aqul se refiere a un miembro de cualquier especie de invertebrado o vertebrado. En consecuencia, el termino "sujeto" pretende abarcar cualquier miembro del reino animal incluyendo, pero no limitado a, el filo Chordata (es decir, los miembros de las clases Osteichythyes (peces oseos), Amphibia (anfibios), Reptilia (reptiles), Aves (aves), y Mammalia (mamlferos)), y todas las ordenes y familias comprendidas en los mismos. En algunas realizaciones, un sujeto es un mamlfero, y en algunas realizaciones un sujeto es un humano.

[0140] Del mismo modo, todos los genes, los nombres de genes y productos genicoss descritos en este documento pretenden corresponder a homologos y ortologos de cualquiera de las especies para las que son aplicables las composiciones y procedimientos descritos en este documento. Por lo tanto, los terminos incluyen, pero no se limitan a, genes y productos geneticos de seres humanos y ratones. Se entiende que cuando se describe un gen o producto genico de una especie particular, esta description se pretende que sea a modo de ejemplo solamente, y no debe ser interpretado como una limitation a menos que el contexto en el que aparece lo indique claramente. De este modo, por ejemplo, por los genes aqul descritos, que en algunas realizaciones se refieren a secuencias de acidos nucleicos y aminoacidos humanos por GENBANK® No. de Acceso, pretenden abarcar genes y productos genicos homologos y ortologos de otros animales, incluyendo, pero sin limitarse a, otros mamlferos, peces, anfibios, reptiles y aves.

[0141] Los procedimientos de la materia aqul descrita son particularmente utiles para los vertebrados de sangre caliente. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la materia aqul descrita se refiere a mamlferos y aves. Mas en particular, se contempla el aislamiento, la manipulation y el uso de celulas madre derivadas del epitelio olfativo de mamlferos, tales como seres humanos y otros primates, as! como aquellos mamlferos de importancia debido al peligro de extincion (tales como tigres siberianos), de importancia economica (animales criado en granjas para el

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consumo humano) y/o de importancia social (animales mantenidos como mascotas o en zoologicos) para los seres humanos, por ejemplo, carnlvoros no humanos (tales como gatos y perros), cerdos (cerdos, puercos y jaballes), rumiantes (tales como vacas, bueyes, ovejas, jirafas, ciervos, cabras, bisontes y camellos), roedores (tales como ratones, ratas y conejos), marsupiales, y caballos. Tambien se proporciona el uso de los procedimientos y composiciones descritos en las aves, incluyendo aquellos tipos de aves que estan en peligro, de los parques zoologicos, as! como aves, y mas en particular aves domesticadas, por ejemplo, aves de corral, tales como pavos, pollos, patos, gansos, gallinas de Guinea, y similares, ya que son tambien de importancia economica para los humanos. Por lo tanto, el aislamiento, la manipulacion y uso de celulas madre derivadas del epitelio olfativo de granja, incluyendo, pero no limitado a, cerdos domesticados (cerdos y puercos), rumiantes, caballos, aves de corral, y similares, tambien estan abarcados por la materia aqul descrita.

IV.G. Formulaciones

[0142] Las composiciones de la materia aqul descrita comprenden, en algunas realizaciones, una composicion que incluye un vehlculo, particularmente un vehlculo farmaceuticamente aceptable, tal como, pero no limitado a, un vehlculo farmaceuticamente aceptable en seres humanos. Cualquier formulacion farmaceutica adecuada se puede utilizar para preparar las composiciones para la administracion a un sujeto.

[0143] Por ejemplo, las formulaciones adecuadas pueden incluir soluciones acuosas y no acuosas de inyeccion esteril que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostaticos, antibioticos bactericidas y solutos que hacen la formulacion isotonica con los fluidos corporales del receptor previsto.

[0144] Debe entenderse que ademas de los ingredientes particularmente mencionados anteriormente, las formulaciones de la materia aqul descrita pueden incluir otros agentes convencionales en la tecnica con respecto al tipo de formulacion en cuestion. Por ejemplo, se pueden utilizar las soluciones acuosas y no acuosas esteriles libres de pirogenos.

[0145] Los reglmenes terapeuticos y composiciones de la materia aqul descrita se pueden utilizar con adyuvantes adicionales o modificadores de la respuesta biologica incluyendo, pero no limitado a, citoquinas y otros compuestos inmunomoduladores.

IV.H Administracion

[0146] Las celulas madre aqul descritas pueden trasplantarse en un paciente que sufre de un trastorno neurologico, tal como una lesion neurologica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrofica, o la esclerosis multiple, como un procedimiento para tratar el trastorno (por ejemplo, mejorar al menos un slntoma asociado con el trastorno). Los procedimientos de trasplante incluyen la inyeccion de celulas transformadas o eficaces para el tratamiento de un trastorno neurologico, a traves de una variedad de procedimientos, en el sitio de lesion o un sitio distante. Las celulas pueden diferenciarse parcial o completamente antes del trasplante.

[0147] Por lo tanto, los procedimientos adecuados para la administracion de las celulas aqul descritas incluyen, pero no se limitan a, la liberacion directamente en el tejido diana y la liberacion a un sitio que permite que los factores neurotroficos producidos por las celulas de la materia aqul descrita alcancen el tejido diana. En algunas realizaciones, el procedimiento para la administracion abarca caracterlsticas para la liberacion regionalizada o acumulacion de las celulas en el sitio en necesidad de tratamiento. En algunas realizaciones, las celulas se administran directamente en el tejido a tratar.

IV.I. Dosis

[0148] Una dosis eficaz de una composicion de la materia aqul descrita se administra a un sujeto en necesidad de la misma. Una "cantidad efectiva del tratamiento" o una "cantidad terapeutica" es una cantidad de una composicion terapeutica suficiente para producir una respuesta medible (por ejemplo, una respuesta biologica o cllnicamente relevante en un sujeto que esta siendo tratado). Los niveles de dosificacion reales de las celulas en las composiciones de la materia aqul descrita se pueden variar con el fin de administrar una cantidad de una celula y/o un factor neurotrofico que sea eficaz para lograr la respuesta deseada biologica o cllnicamente relevante para un sujeto particular. El nivel de dosificacion seleccionado dependera de la actividad de la composicion, la via de administracion, la combinacion con otros farmacos o tratamientos, la gravedad de la afeccion a tratar, y la condicion y el historial medico previo del sujeto a tratar. Sin embargo, esta dentro de la experiencia de la tecnica comenzar con dosis de las celulas a niveles inferiores a los requeridos para lograr la respuesta relevante biologica o cllnicamente deseada y aumentar gradualmente la dosificacion hasta que se logra la respuesta deseada. La potencia de una composicion puede variar, y por lo tanto una "cantidad eficaz del tratamiento" puede variar. Sin embargo, un experto en la tecnica puede evaluar facilmente la potencia y la eficacia de un compuesto candidato de la materia aqul descrita y ajustar el regimen terapeutico en consecuencia.

[0149] Despues de la revision de la descripcion de la materia aqul descrita presentada en el presente documento, un experto en la tecnica puede adaptar la dosis a un sujeto individual, teniendo en cuenta la formulacion particular, el

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procedimiento de administration a utilizar con la composition, y la enfermedad particular tratada. Otros calculos de las dosis pueden considerar la altura y peso del sujeto, la gravedad y la etapa de los slntomas, y la presencia de condiciones flsicas nocivas adicionales. Dichos ajustes o variaciones, as! como la evaluation de cuando y como hacer tales ajustes o variaciones, son bien conocidos por los expertos normales en la tecnica de la medicina.

V. Acidos Nucleicos y Polipeptidos

[0150] Un aspecto de la materia aqul descrita se refiere a moleculas de acido nucleico aisladas que codifican los productos genicos Sonic Hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o lmxla, o partes biologicamente activas de los mismos. Tambien se incluyen en la materia aqul descrita fragmentos de acido nucleico suficientes para usar como sondas de hibridacion para identificar acidos nucleicos que codifican Sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o lmxla (por ejemplo, Sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y mRNAs lmx1a) y fragmentos para usar como cebadores de la reaction en cadena de la polimerasa (PCR) para la amplification y/o mutation de moleculas sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a. Una "molecula de acido nucleico" incluye moleculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genomico), moleculas de ARN (por ejemplo, ARNm), analogos del ADN o ARN generados utilizando analogos de nucleotidos, y derivados, fragmentos, ortologos y homologos. La molecula de acido nucleico puede ser de cadena sencilla o de doble cadena.

V.A. Sondas

[0151] Las sondas son secuencias de acido nucleico de longitud variable (por ejemplo, al menos aproximadamente 10 nucleotidos (nt), al menos aproximadamente 20 nt, al menos aproximadamente 50 nt, al menos aproximadamente 100 nt, o en algunas realizaciones 200 nt o mas) dependiendo del uso especlfico previsto. Las sondas se pueden utilizar para detectar secuencias de acidos nucleicos identicas, similares o complementarias. Las sondas de mayor longitud se pueden obtener de una fuente natural o recombinante, son altamente especlficas, y mucho mas lentas para hibridarse que las sondas de oligomeros mas cortos de longitud. Las sondas pueden ser de una sola o de doble cadena y disenarse para tener especificidad en la PCR, tecnologlas de hibridacion basadas en membranas, o tecnologlas de tipo ELISA. Las sondas pueden ser oligonucleotidos sustancialmente purificados que se hibridan en condiciones rigurosas con al menos 12, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o 400 de la secuencia de nucleotidos de cadena sentido consecutivos de un producto genico Sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1, o una secuencia de de nucleotidos de cadena anti-sentido de estas secuencias; o de un mutante de origen natural de estas secuencias.

[0152] La secuencia nativa de longitud completa o parcial, por ejemplo, se puede utilizar para identificar y aislar secuencias similares (homologas y/o ortologas) (Sambrook y Russell, 2001; Ausubel et al, 2002; Ausubel et al, 2003), tales como: (1) de longitud completa o fragmentos de un ADNC de Sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a de una biblioteca de ADNc de cualquier especie (por ejemplo, humano, murino, felino, canino, peces, aves, y rana), (2) de celulas o tejidos, (3) variantes dentro de una especie, y (4) homologos y variantes de otras especies. Para encontrar secuencias relacionadas que pueden codificar genes relacionados, la sonda se puede disenar para codificar secuencias unicas o secuencias degeneradas. Las secuencias tambien pueden ser secuencias genomicas que incluyen promotores, elementos potenciadores e intrones de secuencia nativa para productos genicosde Sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a.

[0153] Por ejemplo, una region codificante de Sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a en otra especie puede aislarse utilizando tales sondas. Puede disenarse una sonda de aproximadamente 40 bases y producirse en base a una secuencia de nucleotidos de un producto genico de Sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a. Para detectar las hibridaciones, las sondas pueden marcarse usando, por ejemplo, radionuclidos tales como 32P o 35S, o marcadores enzimaticos, tales como fosfatasa alcalina, acoplados a la sonda a traves de sistemas de avidina-biotina. Las sondas marcadas se pueden utilizar para detectar acidos nucleicos que tienen una secuencia complementaria a la de las secuencias genicas de Sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a en las bibliotecas de ADNc, ADN genomico o ARNm de una especie deseada.

[0154] Tales sondas se pueden utilizar como parte de un kit de prueba de diagnostico para identificar celulas o tejidos que expresan incorrectamente un producto genico de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a, tal como midiendo el nivel de producto genico de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a en una muestra de celulas de un sujeto, por ejemplo, detectando los niveles de ARNm de sonic Hedgehog, nurr 1-, pitx3, y/o Imx1a, o determinando si una secuencia genica de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o ha mutado o suprimido.

V.B. Acido nucleico aislado

[0155] Una molecula de acido nucleico aislada que se puede separar de otras moleculas de acido nucleico que estan presentes en la fuente natural del acido nucleico. En algunas realizaciones, un acido nucleico aislado esta libre de secuencias que flanquean naturalmente el acido nucleico (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del acido nucleico) en el ADN genomico del organismo a partir del cual se deriva el acido nucleico. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los productos genico de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a aislados pueden contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de secuencias de nucleotidos que flanquean naturalmente la molecula de acido nucleico en el ADN genomico de la celula/tejido de los que se deriva el acido nucleico (por ejemplo, cerebro, corazon, hlgado, bazo, etc.). Ademas, una molecula de acido nucleico aislada, tal

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como una molecula de ADNc, puede estar sustancialmente libre de otro material celular o medio de cultivo cuando se produce por tecnicas recombinantes, o de precursores quimicos u otros productos quimicos cuando se sintetiza quimicamente.

[0156] Las tecnicas de amplification de PCR se pueden usar para amplificar un producto genico de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imxla usando ADNc, ARNm o alternativamente, ADN genomico, como plantilla y cebadores de oligonucleotidos apropiados. Tales acidos nucleicos se pueden clonar en un vector apropiado y caracterizarse por analisis de secuencia de ADN. Ademas, los oligonucleotidos correspondientes a secuencias de los productos genicos de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imxla se pueden preparar por tecnicas sinteticas estandar, por ejemplo, un sintetizador de ADN automatizado.

V.C. Oligonucleotidos

[0157] Un oligonucleotido comprende una serie de residuos de nucleotidos unidos, cuyo oligonucleotido tiene un numero suficiente de bases de nucleotidos a utilizar en una reaction de PCR o en otra aplicacion. Una secuencia de oligonucleotidos corta puede basarse en, o disenarse a partir de, una secuencia genomica o de ADNc y se utiliza para amplificar, confirmar o revelar la presencia de un ADN o ARN identico, similar o complementario en una celula o tejido particular. Los oligonucleotidos comprenden partes de una secuencia de acido nucleico que tienen aproximadamente 10 nt, 50 nt, o 100 nt de longitud, en algunas realizaciones, aproximadamente de 15 nt a 30 nt de longitud. En algunas realizaciones de la materia aqui descrita, un oligonucleotido que comprende una molecula de acido nucleico de menos de 100 nt de longitud puede comprender ademas al menos 6 nucleotidos contiguos de un producto genico de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a, o un complemento de los mismos. Los oligonucleotidos se pueden sintetizar quimicamente y tambien pueden ser utilizados como sondas.

V.D. Secuencias de acidos nucleicos complementarias: Union

[0158] Una molecula de acido nucleico aislada puede comprender una molecula de acido nucleico que es un complemento de la secuencia de nucleotidos de un producto genico de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a o una parte de dicha secuencia de nucleotidos (por ejemplo, un fragmento que puede utilizarse como sonda o cebador o un fragmento que codifica una parte biologicamente activa de un Olig2, HB9, Ngn2, SoxW, o NKX2.2). Una molecula de acido nucleico que es complementaria a la secuencia de nucleotidos de un producto genico humano de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a es una que es suficientemente complementaria a la secuencia de nucleotidos que pueden formar enlaces de hidrogeno con pocos o ningun desapareamiento a la secuencia de nucleotidos deseada, formando asi una doble cadena estable.

[0159] Tal como se utiliza aqui, el termino "complementario" se refiere al emparejamiento de bases Watson-Crick o Hoogsteen entre unidades de nucleotidos de una molecula de acido nucleico, y el termino "union" se refiere a la interaction fisica o quimica entre dos polipeptidos o compuestos o polipeptidos asociados o compuestos o combinaciones de los mismos. La union incluye interacciones ionicas, no ionicas, de van der Waals, hidrofobas, y similares. Una interaccion fisica puede ser directa o indirecta. Las interacciones indirectas pueden ser a traves de o debido a los efectos de otro polipeptido o compuesto. La union directa se refiere a interacciones que no tienen lugar a traves de, o debido a, el efecto de otro polipeptido o compuesto, sino que son sin otros intermediarios quimicos sustanciales.

[0160] Los fragmentos de acido nucleico son de al menos 6 acidos nucleicos (contiguos), o de 4 aminoacidos (contiguos), una longitud suficiente para permitir la hibridacion especifica en el caso de acidos nucleicos o para el reconocimiento especifico de un epitopo en el caso de aminoacidos, respectivamente, y son a lo sumo una parte menos de una secuencia de longitud completa. Los fragmentos pueden ser derivados de cualquier parte contigua de una secuencia de acido nucleico de aminoacidos de eleccion.

V.E. Derivados y analogos

[0161] Los derivados son secuencias de acido nucleico o secuencias de aminoacidos formadas a partir de los compuestos nativos ya sea directamente o por modification o sustitucion parcial. Los analogos son secuencias de acido nucleico o secuencias de aminoacidos que tienen una estructura similar a, pero no identicos a, el compuesto nativo pero difieren de el con respecto a ciertos componentes o cadenas laterales. Los analogos pueden ser sinteticos o de un origen evolutivo diferente y pueden tener una actividad metabolica similar u opuesta en comparacion con el tipo salvaje. Los homologos son secuencias de acido nucleico o secuencias de aminoacidos de un gen particular que se derivan de diferentes especies.

[0162] Los derivados y analogos pueden ser de longitud completa o que no sean de longitud completa, si el derivado o analogo contiene un acido nucleico o aminoacido modificado, tal como se describe a continuation. Los derivados o analogos de los acidos nucleicos o proteinas incluyen moleculas que comprenden regiones que son sustancialmente homologas a los acidos nucleicos o proteinas de la materia aqui descrita, en algunas realizaciones, en al menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad sobre una secuencia de acidos nucleicos o aminoacidos de identico tamano o cuando se compara con una secuencia alineada

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en la que la alineacion se realiza mediante un programa de homologla por ordenador conocido en la tecnica, o cuyo acido nucleico codificante es capaz de hibridarse con el complemento de una secuencia que codifica las protelnas mencionadas anteriormente en condiciones rigurosas, moderadamente rigurosas, o poco rigurosas (Ausubel et al, 2002;. Ausubel et al. , 2003).

V.F. Homologla

[0163] Una "secuencia homologa de acido nucleico" o "secuencia homologa de aminoacidos", o variaciones de las mismas, se refieren a secuencias caracterizadas por una homologla a nivel de nucleotidos o de aminoacidos como se indico anteriormente. Las secuencias de nucleotidos homologas codifican aquellas secuencias que codifican isoformas de productos genicos de Sonic Hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imxla. Las isoformas pueden expresarse en diferentes tejidos del mismo organismo como resultado de, por ejemplo, corte y empalme alternativo de ARN. Alternativamente, diferentes genes pueden codificar isoformas. Las secuencias de nucleotidos homologas incluyen secuencias de nucleotidos que codifican un producto genico de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imxla de especies distintas a los seres humanos, incluyendo vertebrados, y por lo tanto pueden incluir, por ejemplo, rana, raton, rata, conejo, perro, gato, vaca, caballo, pescado, aves y otros organismos (tambien denominados en este documento como "ortologos" y sus variantes gramaticales). Las secuencias de nucleotidos homologas tambien incluyen, pero no se limitan a, variaciones alelicas y mutaciones de origen natural de las secuencias de nucleotidos establecidas en este documento. Una secuencia de nucleotidos homologa no incluye, sin embargo, la secuencia de nucleotidos exacta que codifica un producto genico de Sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a. Las secuencias de acido nucleico homologas incluyen aquellas secuencias de acido nucleico que codifican sustituciones de aminoacidos conservativas (vease mas adelante) dentro de un producto genico de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a, as! como un polipeptido que posee una actividad biologica de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a como agente de cebado de linaje.

V.G. Marcos de lectura abierta

[0164] El marco de lectura abierto (ORF) de un produto genico sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a codifica un producto genico de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a. Un ORF es una secuencia de nucleotidos que tiene un codon de inicio (ATG) y termina con un codon de "parada" (TAA, TAG o TGA). Con respecto a la materia aqul descrita, sin embargo, un ORF puede ser cualquier parte de una secuencia de codificacion que comprende o no un codon de iniciacion y un codon de parada. Para lograr una secuencia unica, los ORF de ejemplo de un sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a codifican al menos 50 aminoacidos.

V.H. Polipeptidos

V.H.1. Maduros

[0165] Un producto genico de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a puede codificar un polipeptido de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a maduro. Una forma "madura" de un polipeptido o protelna descrita en el presente documento es el producto de un polipeptido natural o forma precursoa o proprotelna. El polipeptido de origen natural, precursor o proprotelna incluye, por ejemplo, el producto genico de longitud completa codificada por el gen correspondiente. Alternativamente, se puede definir como polipeptido, precursor o proprotelna codificada por un marco de lectura abierto aqul descrito. La forma “madura” del producto surge, por ejemplo, como resultado de una o mas etapas de procesamiento de origen natural, ya que pueden tener lugar dentro de la celula, o la celula huesped, en el que aparece el producto genico. Ejemplos de tales etapas de procesamiento que conducen a una forma "madura" de un polipeptido o protelna incluyen la escision del residuo de metionina N-terminal codificado por el codon de iniciacion de un marco de lectura abierto, o la escision proteolltica de un peptido senal o secuencia llder.

[0166] Por lo tanto, una forma madura derivada de un polipeptido o una protelna precursora que tiene los residuos 1 a N, en donde el residuo 1 es la metionina N-terminal, tendrla los residuos 2 al N restantes despues de la eliminacion de la metionina N-terminal. Como alternativa, una forma madura derivada de un polipeptido o protelna precursora que tiene los residuos 1 a N, en la que se escinde una secuencia senal N-terminal del residuo 1 al residuo M, tendrla los residuos del residuo M + 1 hasta al residuo N restantes. Ademas, tal como se usa en este documento, una forma "madura" de un polipeptido o protelna puede derivar de la modificacion post-traduccional diferente a un evento de escision proteolltica. Tales procesos adicionales incluyen, por ejemplo, glicosilacion, miristoilacion o fosforilacion. En general, un polipeptido o protelna madura pueden resultar de la operacion de uno solo de estos procesos, o una combinacion de cualquiera de ellos.

V.H.2. Activo

[0167] Un polipeptido de Sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a activo o un fragmento de polipeotido de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a activo retiene una actividad biologica y/o una actividad inmunologica similar, pero no necesariamente identica, a una actividad de cebado de linaje de un polipeptido de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a de origen natural (tipo salvaje) de la materia aqul descrita, incluyendo formas maduras. Un ensayo biologico particular, tal como el cebado de linaje, con o sin dependencia de la dosis, se puede utilizar para

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determinar la actividad de Sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imxla. Se puede preparar un fragmento de acido nucleico que codifica una parte biologicamente activa de un producto genico de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imxla mediante aislamiento de una parte del gen correspondiente que codifica un polipeptido que tiene una actividad biologica del producto genico de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a que expresa la parte codificada del producto genico de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a (por ejemplo, por expresion recombinante in vitro) y la evaluacion de la actividad de cebado de linaje de la parte codificada del producto genico de sonic hedgehog, nurr- 1, pitx3, y/o Imx1a. La actividad inmunologica se refiere a la capacidad de inducir la produccion de un anticuerpo contra un epltopo antigenico poseldo por un producto genico nativo de Sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a; la actividad biologica se refiere a una funcion, inhibidora o estimuladora, causada por un producto genico nativo de Sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a que excluye la actividad inmunologica.

V.I. Variantes de acido nucleico e hi bridacion

V.I.1. Variantes de polinucleotidos, genes y genes recombinantes

[0168] La materia aqul descrita abarca ademas moleculas de acido nucleico que difieren de las secuencias de nucleotidos codificadas por los productos genicos de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a descritos en este documento debido a la degeneracion del codigo genetico, y por lo tanto codifican los mismos productos genicos de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a.

[0169] Ademas de las secuencias endogenas de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a, pueden existir polimorfismos de secuencia de ADN que cambian las secuencias de aminoacidos de los productos genicos de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a dentro de una poblacion. Por ejemplo, la variacion alelica entre individuos puede presentar polimorfismo genetico en un producto genico de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a. Los terminos "gen" y "gen recombinante" se refieren a moleculas de acido nucleico que comprende un marco de lectura abierto (ORF) que codifica un producto genico de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a, en algunas realizaciones un producto genico de Sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a de vertebrado. Tales variaciones alelicas naturales pueden resultar habitualmente en una varianza del 1-5% en un producto gencio de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a. La presente descripcion describe cualquiera y todas dichas variaciones de nucleotidos y polimorfismos de aminoacidos resultantes en un producto genico de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a, que son el resultado de la variacion alelica natural y que no alteran la actividad funcional de un producto genico de Sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a.

[0170] Ademas, se contemplan los productos genicos de Sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a de otras especies que tienen una secuencia de nucleotidos que difiere de una secuencia como se describe en la Tabla 1. Las moleculas de acido nucleico correspondientes a variantes alelicas naturales y homologos de un ADNc de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a de la materia aqul descrita se pueden aislar basandose en su homologla con un producto genico de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a usando sondas derivadas de ADNc para hibridarse con secuencias homologas y/u ortologas de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a en condiciones rigurosas.

[0171] La frase "variante de polinucleotido de Sonic hedgehog, nurr-e, pitx3, y/o Imx1a" o "variante de secuencia de acido nucleico de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a" se refieren a moleculas de acido nucleico que codifican los productos genicos activos de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a que (1) tienen una identidad de secuencia de acido nucleico de al menos aproximadamente el 80% con una secuencia de nucleotidos que codifica un producto genico nativo de longitud completa de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a; (2) producto genico nativo de longitud completa de Sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a que carece del peptido senal; (3) los dominios extracelulares de los productos genicos de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a, con o sin el peptido senal; y/o (4) cualquier otro fragmento de productos genicos de longitud completa de Sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a. Ordinariamente, una variante de polinucleotido de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a comprende al menos aproximadamente un 80% de identidad de secuencia de acido nucleico, al menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, de identidad de secuencia de acido nucleico, o al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia de acido nucleico con la secuencia de acido nucleico que codifica una variante de polinucleotido nativo de longitud completa de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a. Dicho acido nucleico puede codificar productos genicos nativos de longitud completa de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a que carecen del peptido senal, un dominio extracelular de un producto genico de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a, con o sin la secuencia senal, o cualquier otro fragmento de un producto genico de longitud completa de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a.

[0172] En algunas realizaciones, una variante de polipeptido de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a tiene al menos aproximadamente 30 nucleotidos de longitud, a menudo al menos aproximadamente 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 450, 600 nucleotidos de longitud, mas a menudo al menos aproximadamente 900 nucleotidos de longitud, o mas.

[0173] La frase "porcentaje (%) de identidad de secuencia de acido nucleico" con respecto a las secuencias de acido nucleico que codifican los productos genicos de Sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a identificadas en este documento se define como el porcentaje de nucleotidos en una secuencia candidata que son identicos con los

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nucleotidos en la secuencia de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imxla de interes despues de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el maximo porcentaje de identidad de secuencia. La alineacion con fines de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de acido nucleico puede conseguirse de diversas maneras que estan dentro de la capacidad en la tecnica, por ejemplo, utilizando software informatico disponible publicamente, tal como el software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la tecnica pueden determinar parametros apropiados para medir la alineacion, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir el maximo alineamiento sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan.

[0174] Cuando las secuencias de nucleotidos estan alineadas, el porcentaje de identidad de secuencia de acido nucleico de una determinada secuencia de acido nucleico C con respecto a, con, o contra una secuencia de acido nucleico determinada D (que alternativamente puede expresarse como una secuencia de acido nucleico determinada C que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de acido nucleico a, con, o contra una determinada secuencia de acido nucleico D) se puede calcular de la siguiente manera: % de identidad de secuencia de acido nucleico = (W/Z) x 100, donde W es el numero de nucleotidos con nucleo evaluados como correspondencias identicas por el programa de alineamiento de secuencia o el alineamiento de algoritmo de C y D, y Z es el numero total de nucleotidos en D.

[0175] Cuando la longitud de la secuencia de acido nucleico C no es igual a la longitud de secuencia de acido nucleico D, el % de identidad de secuencia de acido nucleico de C a D no sera igual al % de identidad de secuencia de acido nucleico de D a C. En algunas realizaciones en el que una secuencia de referencia y de prueba se solapan, el porcentaje de identidad continua sobre toda la longitud de una de las secuencias.

V.I 2. Rigurosidad

[0176] Las secuencias homologas, ortologas (es decir, acidos nucleicos que codifican un producto genico de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a derivado de especies distintas de la humana, por ejemplo), u otras secuencias relacionadas (por ejemplo, paralogos) se pueden obtener mediante hibridacion a baja, moderada o alta rigurosidad con toda o una parte de una secuencia de referencia particular que sirve como sonda en una reaccion de hibridacion de acido nucleico utilizando procedimientos bien conocidos en la tecnica.

[0177] La especificidad del ADN monocatenario para hibridar fragmentos complementarios se determina por la "rigurosidad" de las condiciones de reaccion. La rigurosidad de la hibridacion aumenta a medida que la propension a formar dobles cadenas de ADN disminuye. En las reacciones de hibridacion de acidos nucleicos, la rigurosidad se puede elegir para favorecer hibridaciones especlficas (alta rigurosidad), que pueden ser utilizads para identificar, por ejemplo, clones de longitud completa de una biblioteca. Las hibridaciones menos especlficas (rigurosidad moderada o baja) pueden ser utilizadas para identificar moleculas o segmentos de ADN relacionados, pero no exactos, (homologos, pero no identics).

[0178] Las dobles cadenas de ADN se estabilizan mediante: (1) el numero de pares de bases complementarias; (2) el tipo de pares de bases; (3) concentracion de sal (fuerza ionica) de la mezcla de reaccion; (4) la temperatura de la reaccion; y (5) la presencia de ciertos disolventes organicos, tales como formamida, que disminuye la estabilidad de la doble cadena de ADN. En general, cuanto mas larga es la sonda, mas alta es la temperatura requerida para una hibridacion apropiada. Una estrategia comun es variar la temperatura: temperaturas relativas mas altas resultan en condiciones de reaccion mas rigurosas. La seleccion de la modificacion de diferentes condiciones de rigurosidad basada en el resultado deseado de una reaccion de hibridacion se entenderla por un experto en la tecnica. Vease, por ejemplo, Tijssen, 1993; Sambrook y Russell, 2001; Ausubel et al. 2002; y Ausubel et al., 2003.

V.I.2 (a) Alta rigurosidad

[0179] Las frases " condiciones de hibridacion altamente rigurosas " y "alta rigurosidad" se refieren en general a condiciones bajo las cuales una sonda se hibrida a su subsecuencia diana, habitualmente en una mezcla compleja de acido nucleico, pero no a otras secuencias. Las condiciones altamente rigurosas dependen de la secuencia y pueden ser diferentes en diferentes circunstancias. Las secuencias mas largas se hibridan especlficamente a temperaturas mas altas. Generalmente, las condiciones altamente rigurosas se seleccionan para que sean de aproximadamente 5 a 10°C mas baja que el punto de fusion termico (Tm) para la secuencia especlfica a un pH de fuerza ionica definido. Las condiciones de baja rigurosidad se seleccionan generalmente para que sean aproximadamente 15-30°C por debajo de la Tm. La Tm es la temperatura (bajo una fuerza ionica, pH, y concentracion de acido nucleico definidos) a la que 50% de las sondas complementarias a la diana se hibridan con la secuencia diana en equilibrio (ya que las secuencias diana estan presentes en exceso, a Tm, 50% de las sondas estan ocupadas en equilibrio). Las condiciones rigurosas son aquellas en las que la concentracion de sal es, en algunas realizaciones, menor de aproximadamente 1,0 M de iones sodio, en algunas realizaciones, de aproximadamente 0,01 a 1,0 M de concentracion de iones de sodio (u otras sales) a pH de 7,0 a 8,3 y la temperatura es al menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleotidos) y de al menos aproximadamente 60°C para sondas largas (por ejemplo, mayor de 50 nucleotidos). Las condiciones altamente rigurosas tambien se pueden lograr con la adicion de agentes desestabilizantes, tales como formamida. Para una hibridacion selectiva o especlfica, una senal positiva es, en algunas realizaciones, al menos dos veces el fondo, y, en algunas

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realizaciones, al menos 10 veces la hibridacion de fondo. Los ejemplos de condiciones altamente rigurosas comprenden: (1) baja fuerza ionica y altas temperaturas de lavado (por ejemplo, cloruro de sodio 15 mM, citrato de sodio 1,5 mM, dodecilsulfato de sodio al 0,1% a 50°); (2) un agente desnaturalizante durante la hibridacion (por ejemplo, formamida al 50% (v/v), albumina de suero bovino al 0,1%, Ficoll al 0,1%, polivinilpirrolidona al 0,1%, tampon de fosfato de sodio 50 mM (pH 6,5; cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42°); o (3) formamida al 50% Los lavados habitualmente tambien comprenden 5 x SSC (0,75 M 10 NaCl, 75 mM citrato de sodio), fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sodio al 0,1%, 5 x solucion de Denhardt, ADN de esperma de salmon sonicado (50 mg/ml), SDS al 0,1%, y sulfato de dextrano al 10% a 42° con lavados a 42° en 0,2 x SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) y formamida al 50% a 55°, seguido de un lavado de alta rigurosidad que consiste en 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55°. En algunas realizaciones, las condiciones son tales que las secuencias de al menos aproximadamente 65%, 70%, 75%, 85 %, 90%, 95%, 98%, o 99% homologas entre si permanecen habitualmente hibridadas entre si. Estas condiciones se presentan como ejemplos y no pretenden ser limitativos.

V.I.2. (b) Rigurosidad moderada

[0180] Las frases "condiciones moderadamente rigurosas" y "rigurosidad moderada" se refieren a condiciones de hibridacion y/o soluciones de lavado que son menos rigurosas que las condiciones altamente rigurosas de manera que un polinucleotido que puede hibridarse a una o mas secuencias diana que difieren en sus secuencias de nucleotidos de aquellas a las que se hibridarla en condiciones altamente rigurosas. Una reduccion en la rigurosidad de "alta" a "moderada" se puede lograr mediante la reduccion de la temperatura y/o el aumento de la concentracion de cation monovalente presente en las soluciones de hibridacion y/o lavado. Una condicion de rigurosidad moderada de ejemplo comprende la hibridacion en 6 x SSC, 5 x solucion de Denhardt, SDS al 0,5%, y ADN de esperma de salmon desnaturalizado 100 mg/ml a 55°C, seguido de uno o mas lavados en 1 x SSC, sDs al 0,1% a 37°C. La temperatura, fuerza ionica, etc., se pueden ajustar para acomodar factores experimentales, tales como la longitud de la sonda. Otras condiciones de rigurosidad moderada se describen en Tijssen, 1993; Sambrook y Russell, 2001; Ausubel et al., 2002; y Ausubel et al., 2003.

V.I.2 (c) Baja rigurosidad

[0181] Tal como se usa en el presente documento, las frases "condiciones rigurosas bajas" y "baja rigurosidad" se refieren a condiciones de hibridacion y/o soluciones de lavado que son menos rigurosas que las condiciones moderadamente rigurosas de manera que un polinucleotido que puede hibridarse con una o mas secuencias diana que difieren en sus secuencias de nucleotidos hasta un mayor grado de aquellas a las que se hibridarla en condiciones moderadamente rigurosas. Un ejemplo no limitante de condiciones de hibridacion de rigurosidad baja es la hibridacion en 6 x SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), EDTA 5 mM, PVP al 0,02%, Ficoll al 0,02%, BSA al 0,2%, ADN de esperma de salmon desnaturalizado 100 mg/ml, y sulfato de dextrano al 10% (peso/volumen) a 40°C, seguido de uno o mas lavados en 2 x SSC, 25 mM Tris-HCl (pH 7,4), EDTA 5 mM, y SDS al 0,1% a 50°C. Otras condiciones de baja rigurosidad, tales como las de hibridaciones entre especies, se describen en Tijssen, 1993; Sambrook y Russell, 2001; Ausubel et al., 2002; y Ausubel et al., 2003.

V.J. Polipeptidos

[0182] En algunas realizaciones, la materia aqul descrita se refiere a polipeptidos aislados de Sonic hedgehog, nurr- 1, pitx3, y/o Imx1a, y partes, derivados, fragmentos, analogos, homologos, y ortologos biologicamente activos de de los mismos. Tambien se proporcionan en el presente documento fragmentos de polipeptido adecuados para su uso como inmunogenos para generar anticuerpos anti-Sonic Hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a. En algunas realizaciones, un polipeptido nativo de Sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a se pueden aislar de celulas o fuentes de tejido mediante un esquema de purification apropiado usando tecnicas de purification de protelnas convencionales. En algunas realizaciones, los polipeptidos Sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a se producen mediante tecnicas de ADN recombinante. Alternativamente a la expresion recombinante, los polipeptidos de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a pueden sintetizarse qulmicamente usando tecnicas de slntesis de peptidos estandar.

[0183] Un polipeptido sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a incluye la secuencia de aminoacidos de un producto genico de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, yo Imx1a. La materia aqul descrita tambien incluye una protelna mutante o variante, en la que cualquiera de sus residuos puede cambiarse de los correspondientes residuos encontrados para cada gen, a la vez que todavla codifica una protelna que mantiene sus actividades biologicas y funciones fisiologicas de Sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a como un agente de cebado de linaje, o un fragmento funcional del mismo.

[0184] En general, una variante de Sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a que conserva una funcion del tipo de Sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a similar como agente de cebado de linaje e incluye cualquier variante en la que los residuos en una position particular en la secuencia han sido sustituidos por otros aminoacidos, e incluye ademas la posibilidad de insertar un residuo o residuos adicionales entre dos residuos de la protelna parental, as! como la posibilidad de suprimir uno o mas residuos de la secuencia parental. En circunstancias favorables, la sustitucion es una sustitucion conservativa tal como se ha definido anteriormente.

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[0185] Ademas de variantes alelicas naturales de productos genicos de Sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imxla, los cambios de aminoacidos se pueden introducir de forma recombinante en un polipeptido por mutagenesis de las secuencias de nucleotidos que codifican las secuencias de aminoacidos de los productos genicos de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imxla. En algunas realizaciones, los cambios de aminoacidos se disenan para no alterar sensiblemente las actividades biologicas de los polipeptidos mutados de Sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a en comparacion con los polipeptidos de origen natural (por ejemplo, de tipo salvaje) polipeptidos. Por ejemplo, las sustituciones de nucleotidos que conducen a sustituciones de aminoacidos en residuos de aminoacidos "no esenciales" se pueden realizar en las secuencias de genes correspondientes. Un residuo de aminoacido "no esencial" es un residuo que puede ser alterado con respecto a la secuencia de tipo salvaje de los productos genicos de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a sin alterar su actividad biologica como agente de cebado de linaje, mientras se requiere un residuo de aminoacido "esencial" para dicha actividad biologica.

[0186] Por ejemplo, los residuos de aminoacidos que se conservan entre los genes ortologos de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a de diferentes especies se predice que son particularmente no susceptibles de alteracion. Sin embargo, puede ser posible introducir sustituciones conservadoras de aminoacidos en estos aminoacidos. Los ejemplos de sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 2 a continuation. Las sustituciones conservadoras mediante las cuales un aminoacido de una clase es reemplazado por otro aminoacido del mismo tipo se encuentra dentro del alcance de la materia aqul descrita, siempre que la sustitucion no altere indeseablemente la actividad biologica del polipeptido modificado como agente de cebado de linaje .

Tabla 2

Sustituciones conservadoras de aminoacidos

Residuo original
Sustituciones de ejemplo

Ala (A)
Val, Leu, Ile

Arg (R)
Lys, Gln, Asn

Asn (N)
Gln, His, Lys, Arg

Asp (D)
Glu

Cys (C)
Ser

Gln (Q)
Asn

Glu (E)
Asp

Gly (G)
Pro, Ala

His (H)
Asn, Gln, Lys, Arg

Ile (I)
Leu, Val, Met, Ala, Phe, norleucina (Nor)

Leu (L)
Nor, Ile, Val, Met, Ala, Ile, Phe

Lys (K)
Arg, Gln, Asn

Met (M)
Leu, Phe, Ile

Phe (F)
Leu, Val, Ile, Ala, Tyr

Pro (P)
Ala

Ser (S)
Thr

Thr (T)
Ser

Trp (W)
Phe, Tyr

Tyr (Y)
Trp, Phe, Thr, Ser

Val (V)
Ile, Leu, Met, Phe, Ala, Leu, Nor

[0187] Las sustituciones no conservativas que afectan (1) la estructura del esqueleto del polipeptido, tal como una conformation de lamina b o helice a; (2) la carga; (3) hidrofobicidad o hidrofilicidad; o (4) el volumen de la cadena lateral del sitio diana, pueden modificar la funcion y/o la identidad inmunologica del polipeptido sonic hedgehog, nurr- 1, pitx3, y/o Imx1a. Los residuos se pueden dividir en grupos basados en propiedades comunes de la cadena lateral como se indica en la Tabla 3. En algunas realizaciones, las sustituciones pueden implicar el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase. Las sustituciones en base a las clases enumeradas en la Tabla 3 se pueden introducir en algunas realizaciones en los sitios de sustitucion conservadora, y/o en algunas realizaciones en sitios no conservados.

Tabla 3

Clases de aminoacidos

Clases
aminoacidos de ejemplo

hidrofobos
Nor, Met, Ala, Val, Leu, Ile

neutros/hidrofilos
Cys, Ser, Thr

acidos
Asp, Glu

basicos
Asn, Gln, His, Lys, Arg

conformaciond de cadena alterada
Gly, Pro

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| aromaticos_________________________| Trp, Tyr, Phe___________________|

[0188] Las variantes de polipeptidos que comprenden una o mas sustituciones pueden producirse utilizando procedimientos que son conocidos en la tecnica, tales como mutagenesis mediada por oligonucleotidos (dirigida al sitio), barrido de alanina, y mutagenesis PCR. La mutagenesis dirigida al sitio (Carter, 1986; Zoller y Smith, 1987), mutagenesis de casete, mutagenesis de seleccion por restriccion (Wells et al, 1985), u otras tecnicas conocidas se pueden realizar en una secuencia de acido nucleico aislada para producir, por ejemplo, variantes de acidos nucleicos de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a (vease, por ejemplo, Sambrook y Russell, 2001; Ausubel et al, 2002; Ausubel et al, 2003).

[0189] Una variante de molecula de acido nucleico puede comprender una secuencia de nucleotidos que codifica una variante de protelna, donde la variante de protelna comprende una secuencia de aminoacidos que en algunas realizaciones es de al menos aproximadamente 45%, en algunas realizaciones al menos aproximadamente 50%, en algunas realizaciones al menos aproximadamente 55%, en algunas realizaciones al menos aproximadamente 60%, en algunas realizaciones al menos aproximadamente 65%, en algunas realizaciones al menos aproximadamente 70%, en algunas realizaciones al menos aproximadamente 75%, en algunas realizaciones al menos aproximadamente 80 %, en algunas realizaciones al menos aproximadamente 85%, en algunas realizaciones al menos aproximadamente 90%, en algunas realizaciones al menos aproximadamente 95%, en algunas realizaciones al menos aproximadamente 96%, en algunas realizaciones al menos aproximadamente 97%, en algunas realizaciones al menos aproximadamente 98%, y en algunas realizaciones al menos aproximadamente 99% identica a un producto genico de origen natural de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3 y/o Imx1a.

[0190] Por tanto, la frase "variante de polipeptido sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a" se refiere a un polipeptido activo de Sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a que tiene al menos: (1) aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoacidos con una secuencia de polipeptido nativo de longitud completa de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a; (2) una secuencia de polipeptido de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a que carece del peptido senal; (3) un dominio extracelular de un polipeptido de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a, con o sin el peptido senal; o (4) cualquier otro fragmento de una secuencia de polipeptido de longitud completa de Sonic hedgehog, nurr- 1, pitx3, y/o Imx1a. Por ejemplo, las variantes de polipeptido de Sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a incluyen polipeptidos de Sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a en los que uno o mas residuos de aminoacidos se agregan o eliminan en los extremos N- o C-terminal de la secuencia de aminoacidos nativa de longitud completa. Una variante de polipeptido de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a puede tener en algunas realizaciones al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoacidos, en algunas realizaciones al menos aproximadamente 81% de identidad de secuencia de aminoacidos, en algunas realizaciones al menos aproximadamente 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% de identidad de secuencia de aminoacidos, y en algunas realizaciones al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia de aminoacidos con una secuencia nativa de longitud completa del polipeptido de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a. Una variante de polipeptido de Sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a puede tener una secuencia que carece del peptido senal, un dominio extracelular de un polipeptido de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a, con o sin el peptido senal, o cualquier otro fragmento de una secuencia de polipeptido de longitud completa de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a. Ordinariamente, las variantes de polipeptido de Sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a tienen al menos aproximadamente 10 aminoacidos de longitud, a menudo al menos aproximadamente 20 aminoacidos de longitud, mas a menudo al menos aproximadamente 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, o 300 aminoacidos de longitud, o mas.

[0191] "Porcentaje de identidad de secuencia de aminoacidos" se define como el porcentaje de residuos de aminoacidos que son identicos con los residuos de aminoacidos en una secuencia de polipeptido de referencia de Sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a en una secuencia candidata cuando se alinean las dos secuencias. Para determinar el porcentaje de identidad de aminoacidos, las secuencias se alinean y si es necesario, se introducen huecos para conseguir el maximo porcentaje de identidad de secuencia; las sustituciones conservadoras no se consideran como parte de la identidad de secuencia. Los procedimientos de alineacion de secuencias de aminoacidos para determinar el porcentaje de identidad son conocidos por los expertos en la tecnica. A menudo se utiliza software informatico a disposicion del publico, tal como BLAST, BLAST2, ALIGN2 o Megalign (DNASTAR) para alinear secuencias de peptidos. Los expertos en la tecnica pueden determinar parametros apropiados para medir la alineacion, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir el maximo alineamiento sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan.

[0192] Cuando las secuencias de aminoacidos se alinean, el porcentaje de identidad de secuencia de aminoacidos de una secuencia de aminoacidos determinada A a, con, o contra una secuencia de aminoacidos determinada B (que alternativamente puede expresarse como una secuencia de aminoacidos determinada A que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de aminoacidoa a, con, o contra una secuencia de aminoacidos determinada B) se puede calcular como: % de identidad de secuencia de aminoacidos = (X/Y) x 100, donde X es el numero de residuos de evaluados como correspondencias identicas por el programa de alineamiento de secuencia o el alineamiento de algoritmo de A y B, e Y es el numero total de nucleotidos en B.

[0193] Cuando la longitud de la secuencia de aminoacidos A no es igual a la longitud de secuencia de aminoacidos B, el % de identidad de secuencia de aminoacidos de A a B no sera igual al % de identidad de secuencia de

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aminoacidos de B a A. En algunas realizaciones en las que una secuencia de referenda y de prueba se solapan, el porcentaje de identidad continua sobre toda la longitud de una de las secuencias.

[0194] Un polipeptido, protelna o fragmento biologicamente activo "aislado" o "purificado" se separa y/o recupera de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes incluyen materiales que habitualmente interferirlan con los usos diagnosticos o terapeuticos para el polipeptido, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros materiales proteicos o no proteicos. En algunas realizaciones, el polipeptido se purifica hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de aminoacidos N-terminal o interna. Para ser sustancialmente aislada, las preparaciones tienen en algunas realizaciones menos del 30%, en algunas realizaciones menos del 20%, en algunas realizaciones menos del 10%, y en algunas realizaciones menos del 5% en peso seco de material contaminante no-Olig2, HB9, Ngn2, Sox10, o Nkx2.2. Un Olig2, HB9, Ngn2, Sox10, o Nkx2.2 producido de forma recombinante, asilado, o una parte biologicamente activa esta, en algunas realizaciones, sustancialmente libre de medio de cultivo. Es decir, el medio de cultivo representa en algunas realizaciones menos del 20%, en algunas realizaciones menos de aproximadamente el 10%, y en algunas realizaciones menos de aproximadamente el 5% del volumen de la preparation de Olig2, HB9, Ngn2, Sox10, o Nkx2.2. Ejemplos de contaminantes incluyen restos celulares, medios de cultivo, y las sustancias utilizadas y producidas durante la slntesis in vitro de un Olig2, HB9, Ngn2, Sox10, o Nkx2.2.

[0195] Las partes biologicamente activas de un producto genico de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a incluyen peptidos que comprenden secuencias de aminoacidos suficientemente homologas a o derivadas de las secuencias de aminoacidos de un producto genico de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a (o una secuencia de acido nucleico que codifica dicha parte) que incluyen menos aminoacidos que un producto genico de longitud completa de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a, y exhiben al menos una actividad de un producto genico de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a, tal como su actividad como agente de cebado de linaje. Las partes biologicamente activas pueden comprender un dominio o motivo con al menos una actividad de un producto genico activo de Sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a. Una parte biologicamente activa de un producto genico de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a puede ser un polipeptido que tiene, por ejemplo, 10, 25, 50, 100, o mas residuos de aminoacidos de longitud. Otras partes biologicamente activas, en las que se eliminan otras regiones de la protelna, se pueden preparar por tecnicas recombinantes y evaluarse para una o mas de las actividades funcionales de un Olig2, HB9, Ngn2, Sox10, o NKX2.2 nativo.

[0196] La frase "variante de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a" tambien se refiere, en algunas realizaciones a un producto genico biologicamente activo de Sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a que tiene al menos: (1) una identidad de aproximadamente el 80% de secuencia de aminoacidos con una secuencia nativa de longitud completa de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a; (2) una secuencia de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a que carece del peptido senal; (3) un dominio extracelular de un producto genico de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a, con o sin el peptido senal; o (4) cualquier otro fragmento de una secuencia de longitud total de Sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a. Por ejemplo, las variantes de Sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a incluyen un Sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a en los que uno o mas residuos de aminoacidos se agregan o eliminan en los extremos N- o C-terminal de la secuencia de aminoacidos nativa de longitud completa. Una variante de Sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a puede tener una secuencia que carece del peptido senal, un dominio extracelular de un producto genico de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a, con o sin el peptido senal, o cualquier otro fragmento de una secuencia de longitud completa de sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a. Ordinariamente, las variantes de polipeptido de Sonic hedgehog, nurr-1, pitx3, y/o Imx1a tienen al menos aproximadamente 10 aminoacidos de longitud, a menudo al menos aproximadamente 20 aminoacidos de longitud, mas a menudo al menos aproximadamente 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, o 300 aminoacidos de longitud, o mas.

EJEMPLOS

[0197] Los siguientes ejemplos proporcionan realizaciones ilustrativas. A la luz de la presente description y el nivel general de habilidad en la tecnica, los expertos entenderan que los siguientes Ejemplos pretenden ser solamente de ejemplo y que numerosos cambios, modificaciones y alteraciones se pueden emplear sin apartarse del alcance de la materia aqul descrita.

Materiales y procedimientos empleados en los EJEMPLOS

[0198] Cultivo celular. Las dos llneas progenitoras derivada de epitelio olfativo especlficas de dos pacientes utilizadas en este estudio se obtuvieron de epitelio olfativo adulto recogido de una mujer de 42 anos de edad, y un varon de 20 anos de edad, a traves de la biopsia endoscopica (Roisen et al., 2001; Winstead et al., 2005). Las celulas se cultivaron como celulas formadoras de neuroesferas (NSFC) tal como se describio previamente (Zhang et al, 2004; Winstead et al., 2005). Las NSFC se descongelaron de solution madre congelada que se mantuvo en nitrogeno llquido y se cultivo en medio esencial mlnimo (MEM) con suero bovino fetal (FBS) al 10% inactivado por calor (GIBCO, Grand Island, NY) durante una semana. Las NSFC se adaptaron a la ausencia de suero a traves de la dilution en serie de suero cada dla durante 4 dlas hasta que las celulas se cultivaron finalmente en DFBNM (DMEM/F12 suplementado con B27 al 1% y N2 al 0,5% y 100 mg/ml de gentamicina (GIBCO, Grand Island, NY; Zhang et al, 2004). Se realizaron experimentos independientes paralelos en ambas llneas de NSFC especlficas para

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el paciente. Dado que se consiguieron resultados equivalentes, se han presentado los datos de una sola llnea.

[0199] Construccion de plasmidos de expresion. El ADNc de nurrl de raton se clono en el vector de expresion pLNCX2 (Clontech) entre Clal. Del mismo modo, el ADNc de pitx3 de rata y de Imxla de raton se insertaron en el vector pLNCX2 entre Clal. Para el vector de coexpresion de nurrl y pitx3, el ADNc de nurrl se clono en pIRES (Clontech) entre Xbal y Sall, y pitx3 se inserto entre EcoRI. Los vectores de expresion pLNCX2 y pIRES sirvieron como controles. Todos los vectores de expresion se verificaron mediante secuenciacion de ADN extenso.

[0200] Transfeccion y selection. Todas las construcciones de plasmidos se introdujeron en las NSFC mediante transfection liposomal. Las celulas se sembraron en cubreobjetos de vidrio en placas de seis pocillos (5 x 104 celulas por pocillo de 35 mm) en DFBNM sin antibioticos 1 dla antes de la transfeccion. Las NSFC fueron transfectadas con cada plasmido (4 mg/pocillo) durante 24 horas de acuerdo con el protocolo del fabricante (LIPOFECTAMINE® 2000, Invitrogen, Carlsbad, California, Estados Unidos de America). Un dla despues de la transfeccion, las celulas se alimentaron con FBS al 10% en MEM y se seleccionaron con G418 (400 mg/ml; Invitrogen, Carlsbad, California, Estados Unidos de America). La presion de seleccion se mantuvo durante hasta 4 meses para asegurar una poblacion de celulas transfectadas de forma estable purificadas. Se aplicaron inmunocitoqulmica y analisis de transferencia western para detectar varios marcadores neuronales dopaminergicos. Despues de una seleccion de 4 meses, las NSFC transfectadas se congelaron en nitrogeno llquido durante 4-6 meses adicionales de almacenamiento. Despues de la extraction del almacenamiento criogenico y la recuperation de varios dlas en MEM con FBS al 10% a 37°C, la restriction de linaje dopaminergico se sondeo con inmunocitoqulmica y analisis de transferencia Western.

[0201] Tratamiento morfogenico. Las NSFC se trataron con Shh, en presencia o ausencia de RA (1 mM) y/o FN (5 mM; Zhang et al., 2004). Se aplico Shh altamente purificado (amablemente proporcionado en virtud de un acuerdo de transferencia de material con Curis y Wyeth, Inc.) a NSFC y se comparo con una muestra de control disponible comercialmente obtenida de Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, Missouri, Estados Unidos de America) para determinar el grado en que la purification de Shh puede efectuar la expresion de la tirosina hidroxilasa (TH). Las NSFC se sembraron en cubreobjetos de vidrio en placas de seis pocillos (5 x 104 celulas/pocillo de 35 mm) en DFBNM y se trato con un medio que contenla varias concentraciones y combinaciones de RA, FN, y Shh durante 7 dlas (atmosfera de CO2 al 5% y temperatura de 37°C). El tratamiento con Shh incluyo varias concentraciones de 0,25 mg/ml ("Shh0.25"), 0,1 mg/ml ("Shh.1"), 0,05 mg/ml ("Shh0.05"), 0,025 mg/ml ("Shh0.025") en presencia o ausencia de acido retinoico 1 mM RA ("RA1") y/o forskolina, 5 mM FN ("FN5"). Despues del tratamiento, la expresion de TH se determino en 1-7 dlas in vitro (DIV) mediante analisis inmunocitoqulmico. Una vez se determino el entorno optimizado para la induction de neuronas dopaminergicas, se aplico el medio que contenla la combination optimizada para NSFC transfectadas de forma estable.

[0202] Inmunocitoqulmica. Las NSFC (5 X 104 celulas/pocillo) se sembraron en cubreobjetos de vidrio redondos de 22 mm en placas de seis pocillos de 35 mm (Becton, Dickinson and Co., Franklin Lakes, Nueva Jersey, Estados Unidos de America) y se incubaron a 37°C en 5% CO2/95% de aire durante 24 horas y se trataron con RA, FN, y Shh o se transfectaron y seleccionaron durante diferentes perlodos de tiempo antes de la fijacion para inmunofluorescencia. Se aplico diclorhidrato de 4,6-diamino-2-fenilindol (DAPI; 1:1000, 2 mg /ml, Molecular Probes, Eugene, Oregon, Estados Unidos de America) en cultivo durante 30 min a 37°C para la tincion nuclear vital. Los portaobjetos se enjuagaron con tampon de citoesqueleto (CB) dos veces y se fijaron en paraformaldehldo al 3% en CB (10 minutos). Se aplico Triton X-100 al 0,2% (10 minutos; Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, Missouri, Estados Unidos de America) en TBS y las celulas se incubaron (1 hora) en BSA al 3% en TBS. Se aplicaron anticuerpos primarios durante la noche (4°C). Despues de 30 minutos de lavado (10 minutos cada uno, 3 veces) en TBS, se incubaron las celulas con anticuerpos secundarios: IgG anti-conejo de cabra conjugado a rojo Texas, IgG anti-raton de cabra conjugado a rojo Texas, IgG anti-raton de cabra conjugado a Cy2 y/o IgG anti-conejo de cabra conjugado a Cy2 (todos diluidos 1:600; Cy2, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, Pennsylvania, Estados Unidos de America; Texas Red, Molecular Probes, Eugene, Oregon, Estados Unidos de America). Los cubreobjetos se enjuagaron en TBS durante 30 minutos (10 minutos cada uno, 3 veces) y se montaron sobre los portaobjetos. Los portaobjetos fueron examinados con microscopla confocal. Todos los experimentos se repitieron un mlnimo de dos veces para asegurar la especificidad y la fiabilidad de la tincion; solo se ha presentado un conjunto de datos, ya que se obtuvieron resultados similares.

[0203] Analisis de transferencia Western. Se utilizo el analisis de transferencia Western para examinar a fondo y confirmar los resultados obtenidos con la inmunofluorescencia. Las protelnas de NSFC cultivadas en DFBNM sin transfeccion, NSFC transfectadas con vectores de control, as! como NSFC transfectadas con los vectores mas cada combinacion de factores de transcripciones (pLNCX2-pitx3, pLNCX2-nurr1, pLNCX2-Imx1a, pIRES-pitx3-nurr1), seleccionados en todos los grupos, se recogieron en tampon de lisis celular (Sigma Aldrich Co., St. Louis, Missouri, Estados Unidos de America). Despues de 15 minutos de incubation en hielo, las muestras se centrifugaron durante 30 minutos (4°C) y se determino la concentration de protelna de cada sobrenadante. Las muestras de protelnas (20 mg/pocillo) se sometieron a electroforesis en geles de SDS-poliacrilamida al 10%, junto con protelnas marcadoras de tamano molecular estandarizado en un carril adyacente y se transfirieron del gel a papel de nitrocelulosa. La union no especlfica se bloqueo (1 hora) con leche en polvo desnatada al 5% en tampon TBS-Tween (TBST). Las

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transferencias se incubaron (4°C durante la noche) en anticuerpos primarios (anti-TH, MAB; anti-actina, MAB). Se utilizo TBST tres veces durante 10 minutos en las transferencias. Las transferencias lavadas se incubaron (1 hora, temperatura ambiente) en IgG monoclonal anti-raton marcado con peroxidasa de rabano picante (1:2000). Se utilizaron reactivos de deteccion de transferencia Western ECL (Amersham Biosciences, una division de GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, Nueva Jersey, Estados Unidos de America) para identificar anticuerpos unidos. La densitometrla de las bandas de protelnas se llevo a cabo sobre una pellcula de quimioluminiscencia de alto rendimiento (Amersham Biosciences). Los datos fueron analizados utilizando los programas de software Image- J suministrados por el NIH.

[0204] Ensayo de la dopamina. Las NSFC transfectadas de manera estable se sembraron en matraces (25 cm2, Corning) a 105 por matraz antes de adaptarse a la ausencia de suero por medio de dilucion en serie de suero cada dla durante 4 dlas hasta que las celulas se cultivaron finalmente en DFBNM, que se recogio diariamente despues de eliminar totalmente el suero del medio. A continuacion, DFBNM recogido de cada llnea de SNCF restringida se concentro a 1/50 del volumen, respectivamente, mediante filtros centrlfugos (Amicon Ultra-15; Millipore, Billerica, Massachusetts, Estados Unidos de America). Las NSFC diferenciadas se recogieron a continuacion y se lisaron (tampon de lisis, Sigma). La expresion de la dopamina se analizo cuantitativamente en el medio concentrado, as! como en los lisados celulares con un kit de inmunoensayo enzimatico de dopamina (Dopamine EIA, Immuno- Biological Laboratories, Inc., Minneapolis, Minnesota, Estados Unidos de America), de acuerdo con el protocolo del fabricante.

[0205] Procedimientos quirurgicos generales. Se emplearon ratas hembras Sprague Dawley (250 a 300 g cada una). Veinticuatro horas antes de la cirugla, los animales se pesaron y se asignaron numeros de identificacion. En el dla de la cirugla, los animales se anestesiaron utilizando 37,7 mg de ketamina y 5 mg de xilazina por kilogramo, con 0,1 ml/100 g inyectado i.p. Despues de la anestesia (30 minutos antes de la lesion), se inyectaron 25 mg/kg de desipramina (0,1 ml/100 g de una solucion madre de 25 mg/ml) por via intramuscular en cada raton para proteger las neuronas noradrenergicas de la toxicidad de 6-OHDA. Tambien se administraron 50 mg/kg de pargilina (0,1 ml/100 g de una solucion madre de 50 mg/ml) por via intramuscular a cada raton para inhibir la monoamino oxidasa endogena.

f02061 Lesion unilateral con 6-OHDA. Para cada rata, se afeito el pelo y se preparo la piel con solucion de BETADINE® en el sitio quirurgico. La cabeza de la rata se coloco en un dispositivo de sujecion estereotactico de tres puntos (barra de incision fijada -3,9 mm por debajo de la llnea interaural), se abrio el cuero cabelludo, se perforo un pequeno agujero de en el craneo con un taladro dental, y se corto la duramadre.

[0207] Se emplearon dos modelos de lesion con 6-ODHA. El primero fue un modelo de haz medial del cerebro anterior (MFB). Para este modelo, se inyctaron 4 ml de 6-OHDA recien preparado (5 mg/ml disuelto en 0,2 mg/ml de acido ascorbico en solucion salina al 0,9%, mantenido en la oscuridad hasta su uso) en cada rata en una posicion definida como (- 4,4 mm anterior, +1,2 mm lateral, +7,8 mm ventral a bregma).

[0208] El segundo modelo era un modelo estriado. Se inyectaron 2 ml de 6-OHDA recien preparado en 3,0 mg/ml en cada uno de 3 puntos definidos como (+0,4 mm, +3,0 mm, 5,0 mm; -0,4 mm, +4,2 mm, 5,0 mm; y -1.3 mm, +4,5 mm, 5,0 mm) utilizando una aguja G#31 a una velocidad de 1 ml/min. La aguja se dejo en el lugar durante cuatro minutos para evitar el reflujo y a continuacion se extrajo lentamente. El orificio de trepanacion se relleno con una pieza de espuma de gel y se cerro el cuero cabelludo.

[0209] En ausencia de un trasplante, la administracion de anfetamina para ratas lesionadas dio lugar a animales lesionaos unilateralmente que giran hacia el lado lesionado.

[0210] El antibiotico general de penicilina (100.000 unidades/kg) se administro por via intramuscular a cada animal. Cada animal tambien recibio un analgesico postoperatorio (buprenorfina, 0,02 mg/kg, por via intramuscular). Tambien se administraron 5-10 ml de solucion salina (SC) al 0,9% para contrarrestar cualquier perdida de fluido/sangre.

[0211] Cirugla de trasplante de celulas. Se coloco cada rata bajo anestesia como se describe anteriormente, se colocaron en el soporte estereotactica, se reabrio el cuero cabelludo, se perforo un nuevo orificio de trepano y se administraron 10.000-50.000 NSFC en 5 ml en el cuerpo estriado en 2 puntos (+0,5 mm, +2,5 mm, 4,5/5,5 mm) con una jeringa Hamilton ajustada con una aguja de jeringa G#31. Una vez mas, la aguja se dejo en el lugar durante cuatro minutos y a continuacion se extrajo. El cuero cabelludo se cerro. Cada procedimiento quirurgico duro no mas de 60 minutos. Las coordenadas estereotaxicas eran de Paxinos y Watson, 1998. El cuidado general de la post- operacion fue igual que el anterior, y todas las ratas recibieron ciclosporina (10 mg/kg, i.m.) cada dos dlas para la inmunosupresion durante al menos 16 semanas.

EJEMPLO 1

Transfeccion de celulas progenitoras derivadas de epitelio olfativo (NSFC) para lograr restriccion de linaje dopaminergico

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[0212] Las NSFC humanas se obtuvieron a partir de soluciones madre previamente congeladas con un numero bajo de pases (3-5) y se mantuvieron en medio MEM10 durante su perlodo de recuperacion. Estas celulas mitoticamente activas se dividieron cada 18-20 horas, lo que normalmente requiere el pase tres veces por semana. La naturaleza heterogenea de la poblacion de SNCF antes de la transfeccion se determino mediante inmunocitoqulmica. No se observo reactividad para pitx3, nurr1, Imx1a o el precursor de la dopamina, TH, con las NSFC pretransfectadas. Se utilizaron pases bajos (pases 4-8) de NSCF de 2 llneas celulares diferentes especlficas para cada paciente en experimentos de transfeccion paralelos. Para examinar la expresion fenotlpica de NSFC despues de la transfeccion y seleccion, se evaluaron los cultivos representativos, as! como sus respectivos controles pretransfeccion. Las NSFC no transfectadas o las transfectadas con LIPOFECTAMINE® solo murieron en menos de 1 semana despues de la seleccion con 400 mg/ml de G418 (GIBCO, Grand Island, NY). En cambio, el 30% de las celulas transfectadas (con los genes en cuestion y los vectores de control) sobrevivieron bajo la presion de seleccion. La transfeccion con vectores de control, genes individuales, o pitx3-nurr1 combinados no dio lugar a cambios morfologicos en comparacion con las NSFC pretratadas tlpicas. Sin embargo, las NSFC transfectadas se dividieron mas lentamente, con un nuevo tiempo de duplication de tres a cuatro dlas, lo que requerla una pauta de alimentation de solo dos veces por semana y el pase requerldo cada 9-10 dlas. El analisis de inmunofluorescencia de las poblaciones transfectadas demostro que las NSFC fueron transfectadas de forma estable y expresaron TH.

[0213] Las NSFC derivadas del epitelio olfativo humano fueron transfectadas mediante pIRES-pitx3-nurr1 para restringirlas hacia las neuronas DA. El vector solo se utilizo como control. Para obtener una poblacion purificada de celulas restringidas la poblacion transfectada se mantuvo en G418 (GIBCO, 400 mg/ml) para la seleccion. Aunque solo varias semanas de seleccion produjeron poblaciones relativamente puras, se empleo un intervalo de cuatro meses para asegurar la estabilidad y pureza. Las NSFC permanecieron positivas a TH despues de la transfeccion de pIRESpitx3-Nur1, mientras que la transfeccion de vectores de control no mostro cambios fenotlpicos, lo que demuestra que las NSFC se pueden restringir hacia neuronas dopaminergicas (vease la figura 1).

[0214] Las NSFC fueron transfectadas con pLNCX2-nurr1, pLNCX2-pitx3, pLNCX2-Imx1a o el vector solo como control. Las celulas transfectadas se expusieron a G418 para la seleccion durante perlodos de hasta 4 meses. Las NSFC eran positivas en TH despues de la transfeccion de pLNCX2-nurr1 y pLNCX2-pitx3, mientras que la transfeccion de vectores de control no dio lugar a cambios fenotlpicos. Por lo tanto, se pueden emplear pLNCX2- nurr1 o pLNCX2-pitx3 para limitar el linaje de las NSFC hacia neuronas dopaminergicas. En cambio, las NSFC transfectadas con pLNCX2-Imx1a permanecieron no reactivas para TH, aunque positivas de myc, lo que demuestra la incorporation exitosa del plasmido (vease la figura 1).

[0215] Se empleo el analisis de transferencia Western para confirmar cuantitativamente los estudios inmunocitoqulmicos de las poblaciones de NSFC transfectadas. Se analizaron las siguientes llneas transfectadas para la expresion de TH: las NSFC transfectadas con pIRES-pitx3-nurr1, pLNCX2-nurr1, pLNCX2-pitx3, o pLNCX2- Imx1a se analizaron para la expresion de TH, y se determino que todas eran positivas en TH. Esto indico que estas celulas tenlan el potencial de producir dopamina. Por el contrario, las poblaciones de NSFC transfectadas con los vectores de control (pIRES y pLNCX2) no mostraron expresion de TH. La beta-actina, una protelna que se expresa ampliamente en todas las celulas de mamlferos y aves se utilizo como protelna de referencia para la comparacion de la expresion de TH por las distintas llneas (Tian et al., 1999). Se aplico Imagen-J para el analisis de datos. Cada curva de las figuras 2B a 2M exhibe la densidad de las bandas que se muestran en el gel de western (vease la figura 2A). Se midio el area bajo cada curva. El histograma de la distribution de frecuencias en la figura 2N presenta la proportion de TH con respecto a la expresion de actina en cada llnea celular. Las NSFC transfectadas con pIRES- pitx3-nurr1 mostraron la proporcion mas alta de la expresion de TH con respecto a ACTINA, mientras que las celulas transfectadas con el vector de control (pLNCX2 o pIRES) tenia la menor tincion de TH (vease las Figuras 2B-2N). Estos resultados demostraron que los factores de transcription individuales tenlan capacidades unicas para la promotion de la restriction dopaminergica de NSFC.

EJEMPLO 2

NSFC transfectadas premanecen restringidas al linaje dopaminergico despues de la extraction del almacenamiento criogenico

[0216] Despues de una seleccion 4 meses, las celulas restringidas a linaje dopaminergico se congelaron en nitrogeno llquido durante 4-6 meses adicionales. Despues de la extraccion del almacenamiento criogenico y recuperacion de varios dlas en MEM10 a 37°C, casi todas las poblaciones de NSFC sobrevivieron bajo la presion de seleccion de 400 mg/ml de G418, lo que demuestra que estas celulas fueron transfectadas de forma estable y retuvieron su potencial para el almacenamiento a largo plazo y la aplicacion cllnica. La inmunocitoqulmica y analisis de transferencia Western se aplicaron a estas poblaciones previamente almacenadas para examinar su expresion de TH. Las NSFC transfectadas con pLNCX2-pitx3, pLNCX2-nurr1, y pIRES-pitx3-nurr1 permanecieron sanas y positivas de TH bajo la presion de seleccion, mientras que la llnea transfectada pLNCX2-Imx1a no (vease la figura 3).

EJEMPLO 3

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NSFC restringidas de linaje produjeron y liberaron dopamina

[0217] Despues de la extraccion del almacenamiento criogenico, se detecto la produccion de dopamina en las llneas de NSFC que fueron transfectadas de forma estable con los genes en cuestion, mientras que las celulas transfectadas con vectores de control y las NSFC no transfectadas no produjeron dopamina. El nivel de dopamina de cada muestra se dividio a continuacion por la concentracion de protelna en cada llnea de NSFC especlfica para calcular la eficacia de la produccion de dopamina. Entre todas las 4 llneas transfectadas, las NSFC transfectadas con pIRES-pitx3-nurr1 mostraron la formacion de dopamina mas eficiente (vease la figura 4A). El medio agotado se recogio 4 dlas despues de cultivar las NSFC de linaje restringido. A continuacion, este medio se concentro a 1/50 de volumen, respectivamente, y se aplico dopamina E.I.A. para detectar la liberation de dopamina (niveles extracelulares). Los datos se calcularon de la misma manera que el analisis de la dopamina intracelular. Se detectaron niveles mas bajos de dopamina en los medios concentrados en comparacion con el analisis correspondiente de la lisis celular. El nivel mas alto de la liberacion de dopamina se detecto a partir de NSFC transfectadas con pIRES-pitx3-nurr1 en comparacion con las otras llneas celulares restringidas (vease la figura 4B).

EJEMPLO 4

Efecto de los morfogenos en la expresion de tirosina hidroxilasa y formacion y liberacion de dopamina

[0218] Las NSFC se cultivaron en DFBNM junto con RA (1 mM), FN (5 mM), y una de dos fuentes diferentes (purezas) de Shh durante 1-7 dlas. La expresion de TH fue mayor en las celulas que fueron tratadas con Shh altamente purificado que el producto comercial obtenido de SIGMA cuando ambos se aplicaron durante el mismo perlodo de tiempo. Ambos tratamientos dieron lugar a una mayor expresion que en los cultivados unicamente en DFBNM. Estos estudios sugieren que Shh aumenta la expresion de TH y que la pureza (cantidad) de Shh es un determinante importante de la expresion de TH (vease la Figura 5).

[0219] Las NSFC tratadas con FN5 RA1 y Shh altamente purificado expreso aparentemente reactividad intensa de Th (vease la Figura 5C en comparacion con el control en la figura 5A o Sigma Shh en la figura 5B). Por lo tanto, se redujo la concentracion de Shh para determinar la concentracion mas baja de Shh que podrlan conducir a las NSFC hacia neuronas dopaminergicas. A diferencia de la respuesta cuando se aplico un alto nivel de Shh, la reduction de Shh a 0,025 mg/ml aplicados con RA (1 mM) y FN (5 mM) no produjo una respuesta inmediata. Las NSFC se volvieron positivas en TH solo despues de 18 horas de tratamiento con Shh altamente purificado; sin embargo, estaban sanas y mantuvieron la expresion de TH durante perlodos mas largos. La aplicacion de RA y FN promovio una expresion aun mayor de TH (vease la figura 6A). Por lo tanto, la condition optima para restringir el linaje de las NSFC a neuronas dopaminergicas se determino que era DFBNM suplementado con RA1 FN5Shh0.025 (vease la figura 6B).

[0220] Las NSFC transfectadas de manera estable fueron tratados con un coctel de RA1/FN5/Shh0.025 para determinar si la combination de la modification genetica y el tratamiento morfogenico aumentarla los niveles intracelulares e intercelulares de dopamina. El medio agotado se recogio 4 dlas despues del tratamiento morfogenico y se concentro hasta un volumen de 1/50. Tambien se recogieron las NSFc tratadas de linaje restringido. La dopamina E.I.A. se aplico a la muestra la lisis celular y el medio concentrado. La eficacia en la formacion de la dopamina se calculo como se describe anteriormente. Las NSFC transfectadas con pIRES-pitx3- nurr1 fueron la poblacion mas eficiente con respecto a la formacion de dopamina y la liberacion despues del tratamiento morfogenica (vease la Figura 4). En comparacion con los niveles intracelulares e intercelulares de dopamina en las NSFC de linaje restringido en ausencia de morfogenos, la expresion dopaminergica mejoro en gran medida en las NSFC transfectadas de forma estable en presencia de la combinacion de Shh, RA, y FN (vease la figura 4). Estos estudios sugieren que el tratamiento morfogenico juega un papel importante en la formacion de la y la liberacion de dopamina en las NSFC de linaje restringido.

EJEMPLO 5

Estudios de comportamiento en ratas despues de la lesion con 6-OHDA lesiones con y sin trasplante de NSFC

[0221] La 6-hidroxidopamina (6-OHDA) es una neurotoxina que se ha utilizado para desarrollar ciertos modelos animales in vivo de la enfermedad de Parkinson (vease, por ejemplo, Deumens et al, 2002; Lancu et al, 2005; Metz et al., 2005). Generalmente, la 6-OHDA se introduce en una o mas regiones de los cerebros de las ratas, y despues de que haya pasado el tiempo suficiente para que la toxina dane a las neuronas en las proximidades del sitio de administration, se llevan a cabo una o mas pruebas de comportamiento para determinar que efecto, si lo hay, presentaba el medicamento sobre los animales. En aquellos casos en los que alguna forma de terapia ha sido incluida para contrarrestar los efectos de la toxina, se pueden hacer comparaciones con los animales que no recibieron la terapia para evaluar la eficacia de la terapia.

[0222] A tal fin, se disenaron una serie de pruebas de comportamiento con el fin de evaluar la capacidad de las NSFC trasplantadas para mitigar los danos producidos en el cerebro de rata por las lesiones con 6-OHDA.

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[0223] En la primera serie de pruebas de comportamiento, se realizo una prueba de rotacion inducida por farmacos. Las ratas se lesionaron con 6-OHDA como se describio anteriormente, y tres semanas despues de administrar la toxina, los animales fueron analizados mediante el analisis de comportamiento de rotacion inducido por anfetamina (Anderson y Caldwell, 2007). Las ratas fueron inyectadas con una anfetamina (3,0 mg/ml; Catalogo No. A5880, Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, Missouri, Estados Unidos de America), dosis a 3,0 mg/kg (0,1 ml/100 g de rata; i.p.). Se contaron el numero de giros durante 90 minutos (registro por separado cada 15 minutos) despues de 15 minutos de la inyeccion de farmacos. Los resultados se resumen en la Tabla 4.

[0224] Para los animales injertados, se inyectaron 25.000 celulas aisladas, cultivadas y transfectadas con plRES- pitx3-nurr1 como se describe en el presente documento en el lugar deseado por animal. Las celulas fueron aisladas de una donante (41 anos de edad). Las celulas se congelaron en nitrogeno llquido durante al menos tres meses despues de la transfeccion. Las celulas se descongelaron y se llevaron a traves de varios pases para asegurar que ningun protector DMSO estaba presente antes de realizar el injerto. Las celulas tambien se sometieron a pases inicialmente en suero al 10% y se llevaron a traves de la reduccion de serie para reducir el suero a menos del 0,5% antes de injerto.

[0225] Seis semanas despues del injerto y nueve semanas despues de la lesion, mas del 30% de los animales injertados, ya sea en el haz medial del cerebro anterior (MFB) o el cuerpo estriado exhibieron una recuperacion mejorada del comportamiento en un ensayo de rotacion en comparacion con los deficits motores observados en los controles tratados solo con medio. La poblacion injertada permanecio intacta y positiva de TH durante un mlnimo de tres meses in vivo. Los resultados se representan en la Figura 9.

Tabla 4

Rotaciones inducidas por farmaco de ratas lesionadas con 6-OHDA

Tiempo despues de la inyeccion de celulas

Modelo
Grupo 0 semanas (llnea base) 3 semnas 6 semanas 10 semanas

MFB
Control (n = 8) 843 ± 350 1099±203 1217 ± 371 1300±230

Celulas (n = 13) 906 ± 374 1053±434 1079±467 1068 ± 386

No mejorado (n = 9) 896±410 1195± 386 1305 ± 329 1140± 340

Mejorado (n = 4; 30,8%) 926 ± 332 736 ± 403 572 ± 298 655 ± 78

Estriado
Control (n = 7) 881 ± 454 1259± 376 1308 ± 388 1238 ± 334

Celulas (n = 13) 938 ± 398 1122±284 1157±453 1120±487

No mejorado (n = 9) 989 ± 383 1207±267 1305 ± 351 1385± 313

Mejorado (n = 4; 30,8%) 821 ± 464 932 ± 250 723 ± 361 530±119

[0226] Las ratas lesionadas con 6-OHDA tambien se prueban en ensayos de comportamiento adicionales. Una de estas pruebas es una prueba Esquinas (Miljan et al., 2009), en la que las ratas se colocan en una esquina de angulo recto de una caja enjaulada con las patas delanteras levantadas del piso de la caja. Se registra la direction en la que la rata se vuelve a salir de la esquina se registra, y la prueba se repite ocho veces para cada rata. Las ratas normales (es decir, sin lesion y sin trasplante de celulas) no muestran ninguna preferencia significativa entre giros a la izquierda y derecha.

[0227] Una tercera prueba conductual empleada es una prueba de asimetrla con uso de extremidades (cilindro). En esta prueba, las ratas se colocan en un cilindro de vidrio transparente (por ejemplo, un cilindro de 30 cm de alto por 22 cm de diametro). Se registra el numero de contactos con la pared realizados por las patas delanteras (izquierda, derecha o ambas) durante 5 minutos o 5 veces las traseras. Las ratas normales utilizan simetricamente las patas delanteras izquierda y derecha.

[0228] Una cuarta prueba es una prueba pasos de ajuste lateral (Olsson et al., 1995). Las ratas se mantuvieron por el experimentador con una mano agarrando las extremidades traseras y la otra una extremidad anterior. La pata sin fijar toca la superficie de la mesa ligeramente rugosa y se mueve lentamente hacia el lateral (0,9 m durante 5 segundos). Se cuenta el numero de pasos ajustados en la direccion de derecha en ambas extremidades anteriores. La prueba se repitio dos veces.

[0229] Las ratas lesionadas con 6-OHDA que recibieron NSCF trasplantadas se desarrollan mejor en una o mas de estas pruebas que ratas lesionadas con 6-OHDA que no recibieron NSFC trasplantadas.

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Expresion de neurotrofinas en NSFC transfectadas

[0230] La expresion de las neurotrofinas BDNF, NT3, y CNTF se detecto en NSFC no transfectadas. Las ilneas transfectadas descritas anteriormente se examinaron para determinar si la restriccion de linaje a las neuronas DA altera la slntesis de estas neurotrofinas. Como se muestra en la figura 8, no se observaron diferencias significativas en los niveles intracelulares de neurotrofinas entre NSFC transfectadas y no transfectadas, lo que indica que la transfeccion no alteraba la slntesis de neurotrofinas.

Discusion de los EJEMPLOS

[0231] El epitelio olfativo humano adulto contiene una poblacion de celulas progenitoras que reemplazan los componentes olfativos danados o perdidos durante toda la vida, y es muy probable que otros animales (por ejemplo, mamlferos) tengan una poblacion de celulas similar. Se han desarrollado procedimientos para aislar y expandir estas celulas progenitoras derivadas de epitelio. Cuando se cultivan in vitro, estos progenitores producen celulas formadoras de neuroesferas (NSFC) que tienen el potencial de diferenciarse a lo largo de varios linajes neuronales en respuesta a senales morfogenicas.

[0232] En el presente documento se describe estudios dirigidos a optimizar las condiciones para la diferenciacion de estas celulas en neuronas dopaminergicas y para determinar si estas celulas restringidas se pueden utilizar para la terapia celular en un modelo in vivo de enfermedad neurologica (por ejemplo, la enfermedad de Parkinson). Las NSFC se cultivaron en medio definido y se trataron con Sonic hedgehog (Shh), un factor de regulacion aguas arriba para la formacion de neuronas dopaminergicas, en presencia o ausencia de agentes conocidos por actuar o sospechosos de actuar como promotores de crecimiento durante la neurogenesis del SNC: acido retinoico (RA) y/o forskolina (FN). Los factores de transcripcion, nurrl, pitx3 y Imxla, que promueven el desarrollo neuronal dopaminergico en ratones y/o pollos embrionarios, se emplearon para modular la restriccion de linaje de SNCF.

[0233] Se transfectaron cuatro vectores de expresion, pIRES-pitx3-nurr1, pLNCX2-pitx3, pLNCX2-nurr1 y pLNCX2- Imxla en las NSFC. Se aplico G418 para seleccionar poblaciones transfectadas de forma estable. La expresion de los factores de transcripcion y el precursor de dopamina tirosina hidroxilasa (TH) se detecto en las llneas celulares transfectadas incluso despues de un perlodo de selection de 4 meses. El inmunoensayo enzimatico de dopamina (EIA) se utilizo para detectar la production de dopamina por cada una de las llneas. Estos resultados sugieren que los progenitores derivados del epitelio olfativo transfectados se pueden restringir hacia un linaje dopaminergico. Los efectos de la modification genetica combinada con la exposition a Shh, RA y FN condujeron a mejorar aun mas la expresion dopaminergica estable a largo plazo. En estas condiciones, se detecto dopamina intracelularmente, as! como en el medio agotado concentrado despues del cultivo con las llneas celulares especlficos, lo que indica que los progenitores produjeron y liberaron dopamina.

[0234] La enfermedad de Parkinson (EP), que se caracteriza por una extensa perdida de neuronas dopaminergicas (DA) en una region del cerebro medio llamada sustancia negra (SN), sigue siendo una de las principales causas de discapacidades neurologicas cronicas. Los esfuerzos recientes para tratar la EP han comenzado a considerar la terapia de reemplazo celular. Inicialmente, se empleo el trasplante neural de neuronas dopaminergicas mesencefalicas fetales ventrales (VM), produciendo un resultado positivo que fue acompanado con disquinesia en algunos pacientes. La busqueda de una fuente mas ideal de las neuronas dopaminergicas esta en curso.

[0235] Las celulas madre con su capacidad ilimitada para la auto-renovacion y la capacidad de madurar en una variedad de tipos celulares ofrecen un potencial para la terapia de reemplazo celular. El epitelio olfativo es una fuente de progenitores neurales que se pueden recoger endoscopicamente de un paciente de Ep sin cirugla invasiva perjudicial, y por lo tanto se pueden utilizar para proporcionar progenitores autologos para el trasplante. Una fuente autologa proporciona histocompatibilidad total y evita la necesidad de inmunosupresion.

[0236] Por lo tanto, el uso de progenitores derivados del epitelio olfativo, incluyendo, pero no limitado a progenitores derivados de epitelio olfativo humano y/o humano adulto como una posible terapia celular para la EP tiene varias ventajas unicas: estas celulas pueden recogerse sin cirugla muy invasiva, proporcionan una poblacion autologa que no requerirla agentes inmunosupresores; eliminan la busqueda y el tiempo requerido para encontrar tejido histocompatible disponible, y evitan las preocupaciones eticas asociadas con los tejidos de embriones humanos. Los resultados descritos en este documento indicaban que la expresion de genes especlficos y tratamiento morfogenico pueden mejorar significativamente la restriccion de linaje de celulas progenitoras derivadas de epitelio olfativo humano hacia neuronas dopaminergicas.

[0237] Tambien se describe en este documento el descubrimiento de que la sobreexpresion de pitx3 o nurr1 promovla la expresion de fabricante del marcador TH de neuronas DA in vitro. Las llneas de NSFC que fueron transfectadas de manera estable con pitx3 o nurr1 se mantuvieron sanas y positivas de TH despues de 6 meses de almacenamiento criogenico en nitrogeno llquido.

[0238] Ademas, se evaluo tambien la detection directa de la produccion de dopamina. Los lisados de NSFC transfectadas con pitx3 o nurr1 eran dopaminergicos tal como se determina por analisis EIA de dopamina. Si bien no

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se desea estar ligado por ninguna teorla particular de operacion, estos resultados indicaban que los factores de transcripcion, pitx3 y nurr1, pueden participar en la produccion de dopamina en progenitores derivados de epitelio olfativos humano adulto, potencialmente mediante la colaboracion en la induccion de una mayor eficacia de la produccion de dopamina en la maduracion de neuronas DA en el cerebro medio.

[0239] Los estudios descritos en este documento demostraron que la transfeccion simultanea de pitx3 y nurrl en las NSFC produjo mayores niveles de expresion de TH y produccion de dopamina que la transfeccion de cualquiera de estos genes por si solos. Se evaluo el efecto de la transfeccion sobre el nivel del precursor (TH) y los niveles intracelular y extracelular finales de dopamina para confirmar y comparar la eficacia de las diferentes llneas de NSFC transfectadas.

[0240] Tal como se describe en el presente documento, pitx3 y nurrl indujeron cooperativamente la maduracion de las neuronas DA. Esto demostro la viabilidad de la modificacion genetica de los progenitores derivados de epitelio olfativo humano adulto para promover la generacion de neuronas DA y se apoyo la nocion de que la coexpresion de pitx3 y nurrl puede mejorar la restriccion de linaje de celulas progenitoras humanas hacia neuronas dopaminergicas, que pueden entonces emplearse en paradigmas de reemplazo celular para el tratamiento de EP, entre otras aplicaciones.

[0241] El tratamiento con morfogenos aumenta los niveles intracelulares y extracelulares de dopamina. Como se describe en este documento, se aplico una combinacion de Shh muy purificado, RA, y FN a las NSFC de linaje restringido. El nivel intracelular de la dopamina se incremento significativamente mediante este tratamiento. Ademas, despues de un tratamiento de 4 dlas de RA1FN5Shh, los niveles de dopamina en el medio condicionado agotado mejoraron de forma significativa, lo que indica que los morfogenos promovieron la liberacion de dopamina, que es de interes para estudios de trasplante en NSFC de linaje restringido en un modelo de EP. Entre las 4 llneas de NSFC restringidas de linaje, las celulas transfectadas con pIRES-pitx3-nurr1 produjeron y liberaron los niveles mas elevados de dopamina en presencia de Shh, RA y FN. Este resultado es consistente con el analisis de las celulas de linaje restringido en ausencia de tratamiento con los morfogenos.

[0242] Estos datos apoyan aun mas la conclusion de que las NSFC transfectadas con pIRES-pitx3-nurr1 son la llnea mas eficiente en los estudios de produccion de dopamina hasta la fecha, y por lo tanto son candidatos probables para el injerto en un modelo animal de enfermedad de Parkinson. La distribucion local de los morfogenos Shh, RA, y FN in situ debe influir en las NSFC injertadas y puede soportar su diferenciacion, la supervivencia y la produccion de dopamina despues de un trasplante. El nivel mas alto de liberacion de dopamina despues del tratamiento con Shh, RA, y FN sugiere un papel en la terapia celular para la EP, ya que demuestra la capacidad potencial de las NSFC para responder a los factores dirigidos a sitio. Los resultados de los presentes estudios que utilizan la transfeccion y los morfogenos de este modo apoyan el potencial de progenitores neurales como terapia celular en el tratamiento de la EP, entre otros trastornos.

[0243] Mejora en modelo animal de Parkinson. Tal como se describe en este documento, los animales injertados con NSFC transfectadas con pIRES-pitx3-nurr1 mostraron una mejorla en el modelo de comportamiento rotacional inducido por 6-OHDA/anfetamina, que ha sido empleado como un modelo animal de enfermedad de Parkinson. El injerto de NSFC transfectadas dio como resultado que mas del 30% de los animales injertados en el haz medial del cerebro anterior (MFB) o en el cuerpo estriado muestran mejora en este modelo de EP, apoyando el injerto de NSFC en sujetos con EP la mejora de sus slntomas.

[0244] Supervivencia a largo plazo de las NSFC injertadas. Tambien se examinaron los animales injertados con NSFC para la supervivencia a largo plazo de las NSFC injertadas. Tal como se describe en el presente documento, las NSFC injertadas permanecieron intactas y positivas de TH para un mlnimo de tres meses in vivo. Esto indica que las NSFC injertadas pueden sobrevivir despues del injerto a largo plazo, lo que podrla ser beneficioso en el tratamiento de sujetos con trastornos neurologicos, ya que el injerto de NSCF a largo plazo reducirla o eliminarla la necesidad de realizar multiples injertos.

[0245] En este documento se proporcionan llneas de NSFC que pueden tener utilidad terapeutica en las estrategias para el tratamiento de pacientes con trastornos neurologicos, incluyendo, pero no limitado a, EP. La viabilidad y estabilidad in vivo son de interes, especialmente teniendo en cuenta la posibilidad de que con el tiempo la poblacion injertada pueda morir y haya que sustituirlo. Por lo tanto, como se describe en el presente documento, se llevaron a cabo experimentos para determinar la estabilidad y viabilidad de soluciones madre congeladas de celulas transfectadas. Las NSFC sobrevivieron bajo la presion de seleccion despues de la extraccion de almacenamiento criogenico y mantuvieron su capacidad de expresar TH, as! como de producir y liberar dopamina, lo que destaca el potencial unico de estos progenitores para servir como una fuente de celulas autologas para las estrategias basadas en celulas para el tratamiento a largo plazo de la enfermedad de Parkinson y otros trastornos neurologicos.

REFERENCIAS

[0246] Las referencias que figuran a continuacion, as! como todas las referencias citadas en la memoria, incluyendo patentes, solicitudes de patentes, artlculos de revistas, y todas las entradas de base de datos (por ejemplo,

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GenBank® Nos. de acceso, incluyendo cualquier anotacion que se presenta en la base de datos de GenBank® que este asociada con las secuencias descritas) explican, proporcionan una base para, o ensenar metodologla, tecnicas y/o composiciones empleadas en el presente documento.

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[0247] Se entendera que se pueden modificar diversos detalles de la materia aqul descrita sin apartarse del alcance de la materia aqul descrita. Ademas, la description anterior es para fines ilustrativos unicamente, y no para fines limitativos.

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    REIVINDICACIONES
    1. Procedimiento in vitro para producir una neurona dopaminergica recombinante, comprendiendo el procedimiento:
    (a) proporcionar celulas madre derivadas de epitelio olfativo adulto; y
    (b) introducir uno o mas transgenes en las celulas madre derivadas de epitelio olfativo adulto, en el que dicho uno o mas transgenes codifican una combinacion de un polipeptido nurr-1 y un polipeptido pitx3;
    mediante el cual se produce una neurona dopaminergica recombinante.
  2. 2. Procedimiento in vitro, segun la reivindicacion 1, en el que dicho uno o mas transgenes codifican una combinacion de un polipeptido nurr-1, un polipeptido pitx3 y un polipeptido lmx1a.
  3. 3. Procedimiento in vitro, segun la reivindicacion 1 o 2, en el que la combinacion de polipeptidos es codificada por un unico transgen.
  4. 4. Procedimiento in vitro, segun la reivindicacion 1 o 2, en el que la combinacion de polipeptidos es codificada por mas de un transgen.
  5. 5. Procedimiento in vitro, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la celula madre derivada de epitelio olfativo adulto es de un cadaver.
  6. 6. Procedimiento in vitro, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la celula madre derivada de epitelio olfativo adulto se ha obtenido de un donante vivo.
  7. 7. Procedimiento in vitro, segun la reivindicacion 6, en el que el donante vivo es un sujeto que tiene un trastorno neurologico.
  8. 8. Procedimiento in vitro, segun la reivindicacion 7, en el que el trastorno neurologico es la enfermedad de Parkinson.
  9. 9. Procedimiento in vitro, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que las celulas madre derivadas de epitelio olfativo adulto son celulas madre derivadas de epitelio olfativo adulto humano y en el que al menos uno del polipeptido nurr-1, el polipeptido pitx3, el polipeptido lmx1a, o la combinacion de los mismos, son de una especie diferente al ser humano.
  10. 10. Procedimiento in vitro, segun la reivindicacion 9, en el que el polipeptido pitx3 es un polipeptido pitx de rata.
  11. 11. Procedimiento in vitro, segun la reivindicacion 9, en el que el polipeptido lmx1a es un polipeptido lmx1a de raton; o el polipeptido nurr-1 es un polipeptido nurr-1 de raton.
  12. 12. Procedimiento in vitro, segun la reivindicacion 9, que comprende ademas cultivar las celulas madre derivadas de epitelio olfativo adulto antes, durante y/o despues de la etapa de introduccion, en medio que comprende un polipeptido Sonic hedgehog (Shh) o un fragmento biologicamente activo del mismo, acido retinoico (RA) o un fragmento biologicamente activo del mismo, forskolina (FN) o un fragmento biologicamente activo del mismo, o cualquier combinacion de los mismos, en condiciones suficientes para inducir la diferenciacion neuronal en las celulas madre derivadas de epitelio olfativo adulto.
  13. 13. Procedimiento in vitro, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la neurona dopaminergica recombinante es para el transplante en un sujeto que tiene un trastorno neurologico.
  14. 14. Procedimiento in vitro, segun la reivindicacion 13, en el que el trastorno neurologico es la enfermedad de Parkinson.
  15. 15. Procedimiento in vitro, segun la reivindicacion 13, en el que, despues del transplante, la neurona dopaminergica recombinante induce el crecimiento y/o la regeneracion de una o mas neuronas endogenas en el sujeto.
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