ES2634256T3 - Composiciones innovadoras y usos de las mismas - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende un primer antígeno que corresponde a un antígeno diana o un polinucleótido a partir del cual se expresa el primer antígeno, junto con un segundo antígeno que corresponde a una forma modificada del antígeno diana y que es un derivado del primer antígeno, en la que la velocidad de degradación proteolítica intracelular del segundo antígeno se aumenta, potencia o de otro modo eleva en relación con el primer antígeno, o un polinucleótido a partir del cual se expresa el segundo antígeno, en la que el segundo antígeno comprende una señal de degradación intracelular que comprende una ubiquitina o un fragmento biológicamente activo de la misma, en la que el primer antígeno es adecuado para provocar una respuesta inmunitaria humoral al antígeno diana, en la que el segundo antígeno es adecuado para provocar una respuesta inmunitaria celular al antígeno diana, y en la que dicha composición es adecuada para provocar una respuesta inmunitaria humoral y celular contra el antígeno diana.

Description

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También se desvela un método para provocar una respuesta inmunitaria humoral y celular contra un antígeno diana, que comprende coadministrar a un paciente:

-células presentadoras de antígeno que se han puesto en contacto con un primer antígeno correspondiente al antígeno diana o con un polinucleótido a partir del cual se expresa el primer antígeno, durante un tiempo y en condiciones suficientes para expresar una forma procesada de dicho primer antígeno para su presentación a las células T y modulación de las mismas; y

-células presentadoras de antígeno que se han puesto en contacto con un segundo antígeno, que corresponde a una forma modificada del antígeno diana, cuya velocidad de degradación proteolítica intracelular se aumenta, potencia o de otro modo eleva en relación con el primer antígeno o con un polinucleótido a partir del cual se expresa el segundo antígeno, durante un tiempo y en condiciones suficientes para expresar una forma procesada de dicho segundo antígeno para su presentación a las células T y modulación de las mismas,

en el que las células presentadoras de antígeno que se han puesto en contacto con el primer antígeno y las células presentadoras de antígeno que se han puesto en contacto con el segundo antígeno pueden ser idénticas o diferentes.

Se desvela un método para provocar una respuesta inmunitaria humoral y celular contra un antígeno diana, que comprende coadministrar a un paciente:

-células presentadoras de antígeno que se han puesto en contacto con un primer antígeno correspondiente al antígeno diana o con un polinucleótido a partir del cual se expresa el primer antígeno, junto con un segundo antígeno, que corresponde a una forma modificada del antígeno diana, cuya velocidad de degradación proteolítica intracelular se aumenta, potencia o de otro modo eleva en relación con el primer antígeno o con un polinucleótido a partir del cual se expresa el segundo antígeno, durante un tiempo y en condiciones suficientes para expresar una forma procesada de dicho primer antígeno y una forma procesada de dicho segundo antígeno para su presentación a las células T y modulación de las mismas.

Se desvela asimismo el uso de un primer antígeno o un polinucleótido a partir del cual se expresa el primer antígeno, junto con un segundo antígeno o un polinucleótido a partir del cual se expresa el segundo antígeno, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o afección asociada con un antígeno diana, dicho primer antígeno correspondiente al antígeno diana y dicho segundo antígeno que corresponde a una forma modificada del antígeno diana, en el que la velocidad de degradación proteolítica intracelular del segundo antígeno se aumenta, potencia o de otro modo eleva en relación con el primer antígeno.

Se desvela además el uso de un primer antígeno o un polinucleótido a partir del cual se expresa el primer antígeno, junto con células presentadoras de antígeno, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o afección asociada con un antígeno diana, en el que dicho primer antígeno corresponde al antígeno diana y en el que dichas células presentadoras de antígeno se han expuesto a un segundo antígeno, que corresponde a una forma modificada del antígeno diana, cuya velocidad de degradación proteolítica intracelular se aumenta, potencia o de otro modo eleva en relación con el primer antígeno, durante un tiempo y en condiciones suficientes para expresar una forma procesada de dicho segundo antígeno para su presentación a las células T y modulación de las mismas.

Se desvela asimismo el uso de células presentadoras de antígeno en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o afección asociada con un antígeno diana, en el que dichas células presentadoras de antígeno se han expuesto a un primer antígeno correspondiente al antígeno diana o a un polinucleótido a partir del cual se expresa el primer antígeno, junto con un segundo antígeno, que corresponde a una forma modificada del antígeno diana, cuya velocidad de degradación proteolítica intracelular se aumenta, potencia o de otro modo eleva en relación con el primer antígeno o con un polinucleótido a partir del cual se expresa el segundo antígeno, durante un tiempo y en condiciones suficientes para expresar una forma procesada de dicho primer antígeno y una forma procesada de dicho segundo antígeno para su presentación a las células T y modulación de las mismas.

Se desvela el uso del polipéptido sintético, el polinucleótido sintético y la construcción sintética como se ha descrito a grandes rasgos previamente en el estudio y la modulación de respuestas inmunitarias.

En particular, la presente invención proporciona una composición que comprende un primer antígeno que corresponde a un antígeno diana o un polinucleótido a partir del cual se expresa el primer antígeno, junto con un segundo antígeno que corresponde a una forma modificada del antígeno diana, y que es un derivado del primer antígeno, en la que la velocidad de degradación proteolítica intracelular del segundo antígeno se aumenta, potencia

o de otro modo eleva en relación con el primer antígeno o un polinucleótido a partir del cual se expresa el segundo antígeno, en la que el segundo antígeno comprende una señal de degradación intracelular que comprende una ubiquitina o un fragmento biológicamente activo de la misma, en la que el primer antígeno es adecuado para provocar una respuesta inmunitaria humoral al antígeno diana, en la que el segundo antígeno es adecuado para provocar una respuesta inmunitaria celular al antígeno diana, y en la que dicha composición es adecuada para provocar una respuesta inmunitaria humoral y celular contra el antígeno diana.

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La presente invención proporciona además una célula hospedadora que comprende la composición descrita anteriormente.

Además, la invención proporciona un método de producción de una composición para provocar una respuesta inmunitaria humoral y celular contra un antígeno diana, comprendiendo el método la combinación de un primer antígeno correspondiente al antígeno diana o un polinucleótido a partir del cual se expresa el primer antígeno, con un segundo antígeno o un polinucleótido a partir del cual se expresa el segundo antígeno, en el que el segundo antígeno corresponde a una forma modificada del antígeno diana y es un derivado del primer antígeno y en el que el segundo antígeno comprende una ubiquitina o un fragmento biológicamente activo de la misma, en el que el primer antígeno es adecuado para provocar una respuesta inmunitaria humoral al antígeno diana y el segundo antígeno es adecuado para provocar una respuesta inmunitaria celular al antígeno diana.

La presente invención también proporciona una composición que se ha descrito anteriormente para su uso como un medicamento y para su uso en la provocación de una respuesta inmunitaria humoral y celular contra un antígeno diana.

Adicionalmente, la presente invención proporciona el uso de una composición como se ha descrito previamente, en la fabricación de un medicamento para provocar una respuesta inmunitaria humoral y celular contra un antígeno diana o modular una respuesta inmunitaria, por lo que, en la administración, dicho primer antígeno y dicho segundo antígeno se expresan conjuntamente en la misma célula receptora o se expresan por separado en diferentes células receptoras.

La invención también contempla el uso de una composición como se ha descrito anteriormente en la fabricación de un medicamento para provocar una respuesta humoral y celular contra un antígeno diana.

La invención proporciona además el uso de un primer antígeno como se define en la composición anterior o un polinucleótido a partir del cual se expresa dicho primer antígeno en la fabricación de un medicamento para provocar una respuesta inmunitaria humoral y celular contra dicho antígeno diana, en el que dicho medicamento es para la coadministración con un segundo antígeno como se define en la composición anterior o un polinucleótido a partir del cual se expresa dicho segundo antígeno. Alternativamente, la invención proporciona el uso de un segundo antígeno como se define en la composición anterior o un polinucleótido a partir del cual se expresa dicho segundo antígeno en la fabricación de un medicamento para provocar una respuesta inmunitaria humoral y celular contra dicho antígeno diana, en el que dicho medicamento es para la coadministración con un primer antígeno como se define en la composición anterior o un polinucleótido a partir del cual se expresa dicho primer antígeno.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una representación gráfica que muestra la inmunogenicidad de HPV6L1 modificado y no modificado con codones. Los gráficos a y b muestran la reactividad de sueros de ratones inmunizados con (■) L1 de pH6L1Δ modificado con codones, única inmunización, o (▼) L1 (pH6L1Δ) modificado con codones, doble inmunización, o (●) L1 (p6L1Δ) no modificado con codones, doble inmunización con (a) PSVs de HPV6bL1 (anticuerpo conformacional) o (b) L1 de HPV6b desnaturalizado (anticuerpo lineal); los gráficos c y d muestran la reactividad de sueros de ratones inmunizados con (■) LIE7.1 de HPV6b modificado con codones, (A) L1-E7.2 de

HPV6b modificado con codones, (◆) L1 de HPV6b-HPV16E7 modificado con codones o (▼) L1 de HPV6b de

secuencia nativa con (c) PSVs de L1 de HPV6b (anticuerpo conformacional), o (d) L1 de HPV6b desnaturalizado (anticuerpo lineal). Todos los resultados son medias ± E:E:M. de grupos de 5 ratones. El gráfico e muestra la reactividad de sueros de ratones inmunizados con p6HL116E7 (■▲), pU6HL116E7 conjugado con ubiquitina imagen7 imagen7

(▼◆) o pCDNA3 (● ) contra PSVs nativas (■▼●) o L1 desnaturalizado (▲◆ ). El gráfico f muestra la

reactividad de suero en HPV6b E7 recombinante de ratones inmunizados con pH6L1E7.1 (carril 1,4), pH6L1E7.2 (carril 2,5), o p6L1Δ (carril 3,6). Carril 1-3: lisado de células Cos-1 transfectadas con pCDNAE7. Carril 4-6: lisado de células Cos-1.

La Figura 2 es una representación gráfica que muestra la inmunidad mediada por células en L1 inducida por vacunas polinucleotídicas. El gráfico a muestra respuestas de HTR cutánea en L1 medidas en grupos de ratones inmunizados con pH6L1Δ modificado con codones, o H6L1E7.1 o .2 quimérico modificado con codones, con p6L1 o p6L1Δ no modificado, o con el vector pCDNA3. El gráfico b ilustra el IFNγ específico del epítopo de LTC de HPV 16E7 secretado por precursores de células T de ganglios linfáticos en ratones C57BL/6 inmunizados con pcDNA3, HPV6L1-HPV16E7 (pH6L1E7) modificado con codones o ADN de HPV6L1-HPV16E7 (pUH6L1E7) modificado con codones y conjugado con ubiquitina. Se muestra la media de triplicados ± 1 D.E. El gráfico c muestra la protección contra el crecimiento subcutáneo de E7 que expresa tumores TC-1 en ratones inmunizados con pcDNA3, pH6L116E7 (ensayo t apareado, P <0,01, pH6L116E7 frente a pUH6L116E7), o ADN de pUH6L116E7 (ensayo t apareado, P <0,01, pcDNA3 frente a pUH6L116E7).

La Figura 3 es una representación gráfica que ilustra la inducción de anticuerpos neutralizantes y células T CD8+ por una vacuna polinucleotídica mixta que comprende HPV6bL116E7 conjugado y no conjugado con ubiquitina.

a. IFNγ específico del epítopo de LTC de HPV 16E7 secretado por precursores de células T de ganglios linfáticos

(L) o bazo (S) en ratones C57BL/6 inmunizados con una mezcla de HPV6L1-HPV16E7 modificado con codones 5 y (mezcla) o un control de ADN de HPV6L1-HPV16E7 modificado con codones y conjugado con ubiquitina.

La Figura 4 es una representación fotográfica de una placa que muestra la inhibición de la aglutinación inducida por L1 de HPV6 de eritrocitos de ratón por sueros de ratones inmunizados con ADN de L1 de HPV6b modificado

o no modificado con codones. Las diluciones en serie (1:100-1:12.800) de sueros de ratones inmunizados con

10 genes L1 modificados con codones; A: pH6L1Δ, una inmunización; B: pH6L1Δ, dos inmunizaciones; C: pH6L1E7.1; D: pH6L1E7.2, aglutinación inhibida, mientras que el gen no modificado (E: p6L1Δ) no indujo anticuerpo inhibidor alguno. El anticuerpo de conejo anti-L1 de HPV6 (F) se utilizó como control positivo.

La Figura 5 es una representación gráfica que muestra la inmunogenicidad de L2 de BPV1 modificado y no 15 modificado con codones. Los grupos de ratones C57BL/6 se inmunizaron con reactividad específica para HBL2E7 (■); HBL2 (▲); L2E7 (▼); L2 (◆) y L2 medida por ELISA. Los resultados se muestran como la

reactividad media ± 1 D:E.

Breve descripción de las secuencias: CUADRO SINÓPTICO 20

TABLA A

SECUENCIA ID

DESCRIPCIÓN LONGITUD

SEQ ID NO: 1

secuencia codificante (CDS) de ubiquitina humana, 1 copia 231 nts

SEQ ID NO: 2

Polipéptido codificado por la SEQ ID NO: 1 76 aa

SEQ ID NO: 3

CDS (L1) de la proteína L1 de tipo natural del VPH tipo 6b como se expone en el n.º de acceso a GenBank NC_001355 1.503 nts

SEQ ID NO: 4

Polipéptido codificado por la SEQ ID NO: 3 500 aa

SEQ ID NO: 5

CDS (L1) de la proteína L1 humanizada del VPH tipo 6b con construcción sintética como se expone en el n.º de acceso a GenBank AF322411 1.503 nts

SEQ ID NO: 6

Polipéptido codificado por la SEQ ID NO: 5 500 aa

SEQ ID NO: 7

CDS (L1) de la proteína L1 AII truncada de tipo natural de VPH tipo 6b con construcción sintética 1.404 nts

SEQ ID NO: 8

Polipéptido codificado por la SEQ ID NO: 7 467 aa

SEQ ID NO: 9

CDS (L1) de la proteína L1 truncada humanizada de VPH tipo 6b con construcción sintética como se expone en el n.º de acceso a GenBank AF322412 1.404 nts

SEQ ID NO: 10

Polipéptido codificado por la SEQ ID NO: 9 467 aa

SEQ ID NO: 11

CDS de la proteína híbrida L1/E7.1 humanizada de VPH tipo 6b con construcción sintética como se expone en el n.º de acceso a GenBank AF322413 1.554 nts

SEQ ID NO: 12

Polipéptido codificado por la SEQ ID NO: 11 517 aa

SEQ ID NO: 13

CDS de la proteína híbrida L1/E7.2 humanizada de VPH tipo 6b con construcción sintética como se expone en el n.º de acceso a GenBank AF322414 1.554 nts

SEQ ID NO: 14

Polipéptido codificado por la SEQ ID NO: 13 517 aa

SEQ ID NO: 15

CDS de la proteína híbrida L1/ubiquitina humanizada de VPH tipo 6b con construcción sintética como se expone en el n.º de acceso a GenBank AF322415 1.728 nts

SEQ ID NO: 16

Polipéptido codificado por la SEQ ID NO: 15 575 aa

SEQ ID NO: 17

CDS de la proteína híbrida del epítopo LTC ubiquitina/L1 delta/H-2Db humanizada de VPH tipo 6b con construcción sintética como se expone en el n.º de acceso a GenBank AF323508 1.677 nts

SEQ ID NO: 18

Polipéptido codificado por la SEQ ID NO: 17 558 aa

SEQ ID NO: 19

CDS de la proteína híbrida del epítopo LTC L1 delta/H-2Db humanizada de VPH tipo 6b con construcción sintética como se expone en el n.º de acceso a GenBank AF323509 1.452 nts

SEQ ID NO: 20

Polipéptido codificado por la SEQ ID NO: 19 483 aa

SEQ ID NO: 21

CDS (L2) de la proteína L2 de tipo natural de BPV tipo 1 como se expone en el n.º de acceso a GenBank X01768 1.404 nts

SEQ ID NO: 22

Polipéptido codificado por la SEQ ID NO: 21 467 aa

SEQ ID NO: 23

CDS (L2) de la proteína L2 humanizada de BPV tipo 1 con construcción sintética 1.410 nts

SEQ ID NO: 24

Polipéptido codificado por la SEQ ID NO: 23 469 aa

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Descripción detallada de la invención

En particular, la presente invención proporciona una composición que comprende un primer antígeno que corresponde a un antígeno diana o un polinucleótido a partir del cual se expresa el primer antígeno, junto con un segundo antígeno que corresponde a una forma modificada del antígeno diana, y que es un derivado del primer antígeno, en la que la velocidad de degradación proteolítica intracelular del segundo antígeno se aumenta, potencia

o de otro modo eleva en relación con el primer antígeno o un polinucleótido a partir del cual se expresa el segundo antígeno, en la que el segundo antígeno comprende una señal de degradación intracelular que comprende una ubiquitina o fragmento biológicamente activo de la misma, en la que el primer antígeno es adecuado para provocar una respuesta inmunitaria humoral al antígeno diana, en la que el segundo antígeno es adecuado para provocar una respuesta inmunitaria celular al antígeno diana, y en la que dicha composición es adecuada para provocar una respuesta inmunitaria humoral y celular contra el antígeno diana.

La presente invención proporciona además una célula hospedadora que comprende la composición descrita anteriormente.

Además, la invención proporciona un método de producción de una composición para provocar una respuesta inmunitaria humoral y celular contra un antígeno diana, comprendiendo el método la combinación de un primer antígeno correspondiente al antígeno diana o un polinucleótido a partir del cual se expresa el primer antígeno, con un segundo antígeno o un polinucleótido a partir del cual se expresa el segundo antígeno, en el que el segundo antígeno corresponde a una forma modificada del antígeno diana y es un derivado del primer antígeno y en el que el segundo antígeno comprende una ubiquitina o un fragmento biológicamente activo de la misma, en el que el primer antígeno es adecuado para provocar una respuesta inmunitaria humoral al antígeno diana y el segundo antígeno es adecuado para provocar una respuesta inmunitaria celular al antígeno diana.

La presente invención también proporciona una composición que se ha descrito anteriormente para su uso como un medicamento y para su uso en la provocación de una respuesta inmunitaria humoral y celular contra un antígeno diana.

Adicionalmente, la presente invención proporciona el uso de una composición que se ha descrito anteriormente, en la fabricación de un medicamento para provocar una respuesta inmunitaria humoral y celular contra un antígeno diana o modular una respuesta inmunitaria, por lo que, en la administración, dicho primer antígeno y dicho segundo antígeno se expresan conjuntamente en la misma célula receptora o se expresan por separado en diferentes células receptoras.

La invención también proporciona el uso de una composición que se ha descrito anteriormente en la fabricación de un medicamento para provocar una respuesta humoral y celular contra un antígeno diana.

La invención proporciona además el uso de un primer antígeno como se define en la composición anterior o un polinucleótido a partir del cual se expresa dicho primer antígeno en la fabricación de un medicamento para provocar una respuesta inmunitaria humoral y celular contra dicho antígeno diana, en el que dicho medicamento es para la coadministración con un segundo antígeno como se define en la composición anterior o un polinucleótido a partir del cual se expresa dicho segundo antígeno. Alternativamente, la invención proporciona el uso de un segundo antígeno como se define en la composición anterior o un polinucleótido a partir del cual se expresa dicho segundo antígeno en la fabricación de un medicamento para provocar una respuesta inmunitaria humoral y celular contra dicho antígeno diana, en el que dicho medicamento es para la coadministración con un primer antígeno como se define en la composición anterior o un polinucleótido a partir del cual se expresa dicho primer antígeno.

1. Definiciones

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por los expertos en la materia a la que pertenece la invención. Aunque cualquiera de los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria pueden utilizarse en la práctica o ensayo de la presente invención, se describen métodos y materiales preferentes. Para los fines de la presente invención, se definen a continuación los siguientes términos.

Los artículos "un" y "una" se utilizan en la presente memoria para referirse a uno o a más de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.

El término "aproximadamente" se utiliza en la presente memoria para referirse a condiciones (p. ej., cantidades, concentraciones, tiempo, etc.) que varían hasta en un 30 %, preferentemente hasta en un 20 %, y más preferentemente hasta en un 10 % en relación con una condición especificada.

Las expresiones "administración simultánea" o "administrar simultáneamente" o "coadministración" y similares se refieren a la administración de una única composición que contiene dos o más activos, o la administración de cada

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activo como composiciones separadas y/o administradas por vías separadas ya sea simultáneamente o secuencialmente en un periodo de tiempo lo suficientemente breve cuyo resultado efectivo sea equivalente al obtenido cuando se administran todos los activos de este tipo como una única composición.

Por "molécula de unión al antígeno" se entiende una molécula que tiene una afinidad de unión para un antígeno diana. Se entenderá que este término se extiende a inmunoglobulinas, fragmentos de inmunoglobulina y armazones de proteínas derivados de no inmunoglobulinas que exhiben actividad de unión al antígeno.

Por "autólogo" se entiende algo (p. ej., células, tejidos, etc.) derivado del mismo organismo.

El término "alogénico", como se utiliza en la presente memoria, se refiere a células, tejidos, organismos, etc. que poseen diferente constitución genética aunque se derive de la misma especie.

Por "fragmento biológicamente activo" se entiende un fragmento de un polipéptido parental de longitud completa cuyo fragmento conserva la actividad del polipéptido parental. Por ejemplo, un fragmento biológicamente activo de la ubiquitina cuando se conjuga con un antígeno de interés aumentará, potenciará o de otro modo elevará la velocidad de degradación proteolítica intracelular de ese antígeno. Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "fragmento biológicamente activo" incluye mutantes de deleción y pequeños péptidos, por ejemplo de al menos 8, preferentemente al menos 10, más preferentemente al menos 15, incluso más preferentemente al menos 20 e incluso más preferentemente al menos 30 aminoácidos contiguos, que comprenden la actividad anterior. Los péptidos de este tipo se pueden obtener mediante la aplicación de técnicas recombinantes o de sintetización convencionales de ácidos nucleicos utilizando técnicas de síntesis en fase líquida o sólida convencionales. Por ejemplo, puede hacerse referencia a la síntesis de solución o síntesis en fase sólida como se describe, por ejemplo, en el capítulo 9 titulado "Peptide Synthesis" de Atherton y Shephard, que se incluye en una publicación titulada "Synthetic Vaccines", editado por Nicholson y publicado por Blackwell Scientific Publications. Alternativamente, los péptidos pueden producirse por la digestión de un polipéptido utilizado en la invención con proteinasas, tales como endoLys-C, endoArg-C, endoGlu-C y proteasa V8 de Staphylococcus. Los fragmentos digeridos pueden purificarse, por ejemplo, por técnicas de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC).

Como se utiliza en la presente memoria, la expresión "secuencia que actúa en cis o región reguladora de cis" o expresión similar se tomará para referirse a cualquier secuencia de nucleótidos que se deriva de una secuencia genética expresable en la que la expresión de la secuencia genética se regula, al menos, en parte, por dicha secuencia de nucleótidos. Los expertos en la materia serán conscientes de que una región reguladora de cis puede ser capaz de activar, silenciar, potenciar, reprimir o de otro modo alterar el nivel de expresión y/o especificidad de tipo celular y/o especificidad de desarrollo de cualquier secuencia génica estructural.

A lo largo de la presente memoria descriptiva, a menos que el contexto sugiera lo contrario, las palabras "comprende", y "que comprende" se entenderán como la implicación de la inclusión de una etapa o elemento o grupo de etapas o elementos indicados, pero no la exclusión de cualquier otra etapa o elemento o grupo de etapas o elementos.

Por "corresponde a" o "correspondiente a" se entiende un polinucleótido (a) que tiene una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente idéntica o complementaria a la totalidad o parte de una secuencia de polinucleótidos de referencia o (b) que codifica una secuencia de aminoácidos idéntica a una secuencia de aminoácidos en un péptido

o proteína. Esta frase también incluye dentro de su alcance un péptido o polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a una secuencia de aminoácidos en un péptido o proteína de referencia.

Por "derivado" se entiende un polipéptido que se ha derivado de la secuencia básica mediante la modificación, por ejemplo, mediante conjugación o formación de complejos con otras mitades químicas o mediante técnicas de modificación post-traduccionales, como se entenderá en la materia. El término "derivado" también incluye dentro de su alcance las alteraciones que se han realizado en una secuencia parental que incluye adiciones, o deleciones que proporcionan moléculas funcionalmente equivalentes.

Por "cantidad eficaz", en el contexto de tratar, prevenir o mejorar los síntomas de una afección, se entiende la administración de esa cantidad de la composición inmunopotenciadora o compuesto activo que provoca una respuesta inmunitaria en un individuo en necesidad de dicho tratamiento, prevención o mejora, ya sea en una dosis única o como parte de una serie, que es eficaz para el tratamiento de esa afección. La cantidad eficaz variará dependiendo de la salud y condición física del individuo a tratar, el grupo taxonómico del individuo a tratar, la formulación de la composición, la evaluación de la situación médica, y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad caiga en un intervalo relativamente amplio que puede determinarse mediante experimentos rutinarios.

Por "expresar", y términos similares, tales como "expresión" y "expresable", en el contexto o expresión de proteínas, se entiende la expresión de una proteína a un nivel suficiente para efectuar una función particular asociada con la proteína.

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nucleótidos, pero el término puede referirse a moléculas de cualquier longitud, aunque el término "polinucleótido" o "ácidos nucleicos" se utilice normalmente para grandes oligonucleótidos.

La expresión "conectado de forma operable" o "vinculado operativamente", como se utiliza en la presente memoria, significa colocar un gen estructural bajo el control regulador de un promotor, que luego controla la transcripción y opcionalmente la traducción del gen. En la construcción del promotor heterólogo/combinaciones génicas estructurales, se prefiere generalmente posicionar la secuencia genética o promotor a una distancia del sitio de inicio de la transcripción del gen que es aproximadamente la misma que la distancia entre esa secuencia genética o promotor y el gen lo controla en su entorno natural; es decir, el gen a partir del cual se deriva la secuencia genética o promotor. Como se conoce en la materia, alguna variación en esta distancia se puede acomodar sin pérdida de función. De manera similar, el posicionamiento preferente de un elemento de secuencia reguladora en relación con un gen heterólogo que va a colocarse bajo su control se define por el posicionamiento del elemento en su entorno natural; es decir, los genes a partir de los cuales se deriva.

El término "paciente" se refiere a pacientes de ser humano u otro mamífero e incluye a cualquier individuo que se desea examinar o tratar utilizando las composiciones de la invención. No obstante, se entenderá que "paciente" no implica que los síntomas estén presentes. Los mamíferos adecuados que caen dentro del alcance de la invención incluyen, entre otros, primates, animales de ganado (p. ej., ovejas, vacas, caballos, burros, cerdos), animales de ensayo de laboratorio (p. ej., conejos, ratones, ratas, cobayas, hámsteres), animales de compañía (p. ej., gatos, perros) y animales salvajes cautivos (p. ej., zorros, ciervos, dingos).

Por "portador farmacéuticamente aceptable" se entiende un relleno sólido o líquido, diluyente o sustancia encapsulante que puede utilizarse con seguridad en la administración tópica o sistémica.

El término "polinucleótido" o "ácidos nucleicos", como se utiliza en la presente memoria, designa ARNm, ARN, ARNc, ADNc o ADN. El término se refiere normalmente a oligonucleótidos superiores a 30 nucleótidos de longitud.

"Polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en la presente memoria para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos y a variantes y análogos sintéticos del mismo. De este modo, estos términos se aplican a los polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos es un aminoácido de origen no natural sintético, tal como un análogo químico de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural.

Por "cebador" se entiende un oligonucleótido que, cuando se empareja con una cadena de ADN, es capaz de iniciar la síntesis de un producto de extensión del cebador en presencia de un agente de polimerización adecuado. El cebador es preferentemente monocatenario para máxima eficiencia en la amplificación, pero alternativamente puede ser bicatenario. Un cebador ha de ser suficientemente largo para cebar la síntesis de productos de extensión en presencia del agente de polimerización. La longitud del cebador depende de muchos factores, incluyendo la aplicación, la temperatura que va a emplearse, las condiciones de reacción de plantilla, otros reactivos, y la fuente de cebadores. Por ejemplo, dependiendo de la complejidad de la secuencia diana, el cebador oligonucleótido contiene normalmente de 15 a 35 o más nucleótidos, aunque puede contener menos nucleótidos. Los cebadores pueden ser grandes polinucleótidos, tal como de aproximadamente 200 nucleótidos a varias kilobases o más. Los cebadores pueden seleccionarse para que sean "sustancialmente complementarios" a la secuencia en la plantilla en la que se diseña para hibridar y servir como un sitio para la iniciación de la síntesis. Por "sustancialmente complementario", se entiende que el cebador es suficientemente complementario para hibridarse con una secuencia de nucleótidos diana. Preferentemente, el cebador no contiene desapareamientos con la plantilla en la que se diseña para hibridarse, pero esto no es esencial. Por ejemplo, los nucleótidos no complementarios pueden unirse al extremo 5' del cebador, siendo el resto de la secuencia del cebador complementario a la plantilla. Alternativamente, los nucleótidos no complementarios o un tramo de nucleótidos no complementarios pueden intercalarse en un cebador, siempre que la secuencia del cebador tenga suficiente complementariedad con la secuencia de la plantilla para hibridarse con ella y de ese modo formar una plantilla para la síntesis del producto de extensión del cebador.

"Sonda" se refiere a una molécula que se une a una secuencia o subsecuencia específica u otra mitad de otra molécula. A menos que se indique lo contrario, el término "sonda" se refiere normalmente a una sonda de polinucleótidos que se une a otros ácidos nucleicos, a menudo llamado "ácidos nucleicos diana", a través del apareamiento de bases complementarias. Las sondas pueden unirse a ácidos nucleicos diana que carecen de complementariedad de secuencia completa con la sonda, dependiendo de la rigurosidad de las condiciones de hibridación. Las sondas pueden marcarse directa o indirectamente.

La referencia en la presente memoria a un "promotor" ha de tomarse en su contexto más amplio e incluye las secuencias reguladoras transcripcionales de un gen genómico clásico, incluyendo la caja TATA que se requiere para el inicio preciso de la transcripción, con o sin una secuencia de caja CCAAT y elementos reguladores adicionales (es decir, secuencias activadoras cadena arriba, potenciadores y silenciadores) que alteran la expresión génica en respuesta a estímulos al desarrollo y/o ambientales, o de una manera específica del tejido o específica del tipo de célula. Un promotor es usualmente, pero no necesariamente, posicionado cadena arriba o 5', de un gen estructural, expresión de la que se regula. Además, los elementos reguladores que comprenden un promotor se posicionan

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beneficio deseado, los inventores descubrieron inadvertidamente que abordando al mismo tiempo los problemas de inmunogenicidad alterada y respuestas inmunológicas controladas, un enfoque combinado podría superar ambos obstáculos.

Por consiguiente, la presente invención se basa, en parte, en una innovadora estrategia para provocar simultáneamente una respuesta de anticuerpos protectores del hospedador y una respuesta inmunitaria mediada por células contra un antígeno diana para combatir, entre otras cosas, las condiciones que tienen periodos de latencia y, por lo tanto, se benefician del doble enfoque de profilaxis y terapia. La estrategia implica administrar a un individuo un primer antígeno correspondiente al antígeno diana, y es adecuadamente intracelularmente resistente a la proteólisis. Además, un segundo antígeno, que corresponde a una forma modificada del antígeno diana, se administra al individuo, en el que la velocidad de degradación proteolítica intracelular del segundo antígeno se aumenta, potencia o de otro modo eleva en relación con el primer antígeno. El primer y segundo antígenos pueden administrarse en una forma proteínica, o en forma de ácidos nucleicos, o una combinación de los mismos. El determinante o determinantes antigénicos o epítopo o epítopos del primer antígeno y el segundo antígeno pueden ser idénticos o diferentes. Por consiguiente, la secuencia que contiene el epítopo del primer antígeno y el segundo antígeno pueden ser idénticos o diferentes. Particularmente, el primer antígeno y el segundo antígeno comprenden el mismo epítopo o epítopos. Adecuadamente, cuando los correspondientes epítopos son diferentes entre el primer antígeno y el segundo antígeno, tales epítopos son preferentemente capaces de provocar la producción de elementos que se unen a un epítopo correspondiente del antígeno diana.

Antígenos diana a modo de ejemplo incluyen, entre otros, al menos una porción de una proteína estructural que incluye, entre otros, proteínas estructurales de los organismos patógenos (p. ej., víricos, bacterianos, fúngicos, protozoos), tales como proteínas de la cápside o capsómeros. En una realización preferente, la proteína de la cápside es de origen vírico. Preferentemente, la proteína de la cápside vírica se refiere a un virus cristalino. Ejemplos de proteínas de la cápside vírica adecuados incluyen, entre otros, las proteínas L1 y/o L2 del virus del papiloma, proteínas de la cápside de un virus del herpes (p. ej., GpD y GpB), VP1-3 del poliomavirus, VP1-6 del virus de la lengua azul, antígeno de superficie de la hepatitis B, antígeno de superficie de la hepatitis C, proteínas de la cápside de parvovirus, proteínas de la cápside de las partículas de levadura Ty, proteínas de la cápside de retrovirus (p. ej., VIH y VSR), proteínas de la cápside de rotavirus, proteínas de la cápside de coronavirus, y proteínas de la cápside de adenovirus. Alternativamente, el antígeno diana es una proteína estructural relativa al núcleo cristalino de un virus con envuelta lípídica. Para un listado más completo de las proteínas estructurales víricas, véase Fields Virology (redactores jefe, Bernard N. Fields, David M. Knipe, Peter M. Howley, 4ª edición, Lippincott-Raven Publishers, 1999, Filadelfia, EE.UU.).

Alternativamente, las proteínas de la cápside vírica adecuadas incluyen las que pueden utilizarse para producir partículas similares a virus, incluyendo, entre otros, partículas similares a virus como se describe por ejemplo por Oliveira-Ferreira et al. (2000 Vaccine, 18 (17): 1863-69), Hirschberg et al. (1999, Int Immunol, 11 (12): 1927-34), Klein et al. (1997, AIDS Res Hum Retroviruses, 13(5): 393-399), Allsopp et al. (1996, Eur J Immunol, 26 (8): 1951195), Bachmann et al. (1996, supra), Layton et al. (1996, Immunology, 87 (2): 171-178; 1993, J Immunol, 151 (2): 1097-1107), Brookman et al. (1995, Virology, 207 (1): 59-67), Burns et al. (1994, Mol Biotechnol, 1 (2): 137-145), Martin et al. (1993, AIDS, 7(10): 1315-1323) y Adams et al. (1987, Nature, 329 (6134): 68-70), partículas similares a virus de la inmunodeficiencia en humanos como, por ejemplo, se describe por Paliard et al. (2000, AIDS Res Hum Retroviruses, 16 (3): 273-282), Notka et al. (1999, Biol Chem, 380 (3): 341-352) y Wagner et al. (1998, Virology, 245 (1): 65-74; 1994, Behring Inst Mitt, (95): 23-34), partículas similares al virus Norwalk como se describe por ejemplo por Ball et al. (1999, Gastroenterology, 117 (1): 40-48) y White et al. (1996, J Virol, 70 (10): 6589-6597), PSV p24 como se describe por ejemplo por Benson et al. (1999, AIDS Res Hum Retroviruses, 15 (2): 105-113) partículas similares al virus del papiloma como se describe por ejemplo por Zhou et al. (1991, Virology, 181: 203-210; ibid 185: 251-257; y la publicación internacional WO 93/02184), Christensen et al. (2000, Virology, 269 (2): 451-461), y Benyacoub et al., (1999, Infect Immun, 67 (7): 3674-3679, partículas similares al virus de la hepatitis como se describe por ejemplo por Falcon et al. (1999, Cell Tissue, 31 (2): 117-125), Li et al. (1997, J Virol, 71 (10): 72077213) y Schirmbeck et al. (1996, Intervirology, 39 (1-2): 111-119), partículas similares a virus del poliomavirus como se describe por ejemplo por Goldmann et al. (1999, J Virol, 73 (5): 4465-4469) y Szomolanyi-Tsuda et al, (1998, J Virol, 72 (8): 6665-6670), partículas similares a virus adenoasociados como se describe por ejemplo por Hoque et al. (1999, Biochem Biophys Res Commun, 266 (2): 371-376), partículas similares a virus a la enfermedad bursal infecciosa como se describe por ejemplo por Hu et al. (1999 Biotechnol Bioeng, 63 (6): 721-729), Kibenge et al. (1999, Can J Vet Res, 63 (1): 49-55) y Fernández-Arias et al. (1998, J Gen Virol, 79 (Pt 5): 1047-54), partículas similares a rotavirus como se describe por ejemplo por Jiang et al. (1999, Vaccine, 17 (7-8): 1005-13), Ciarlet et al. (1998, J Virol, 72 (11): 9233-9246), Gilbert et al. (1997, J Virol, 71 (6): 4555-4563) y Conner et al. (1996, J Infect Dis, 174 Supl. 1: S88-S92), partículas similares a calicivirus como se describe por ejemplo por Jiang et al. (1999, J Virol Methods, 78 (1-2): 81-91), partículas similares al virus de la leucemia bovina como se describe por ejemplo por Kakker et al. (1999, Virology, 265 (2): 308-318), partículas similares a virus de la enfermedad hemorrágica de conejo como se describe por ejemplo por Nagesha et al. (1999, Arch Virol, 144 (12): 2429-2439), partículas similares a parvovirus como se describe por ejemplo por Sedlik et al. (1999, J Virol, 73 (4): 2739-2744), Lo-Man et al. (1998, Eur J Immunol, 28 (4): 1401-1407) y Sedlik et al. (1997, Proc Natl Acad Sci EE.UU., 94 (14): 7503-7508, particulares similares al virus basado en el elemento transponible D como se describe por ejemplo por Hajek et al. (1998, J Virol, 72 (11): 8718-8724), partículas similares al coronavirus de ratón como se describe por ejemplo por Bos et al. (1997,

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J Virol, 71 (12): 9427-9433; 1996, Virology, 218 (1): 52-60), partículas similares al virus del enrollamiento de la hoja de la patata como se describe por ejemplo por Lamb et al. (1996, J Gen Virol, 77 (Pt 7): 1349-58), partículas similares al virus de la lengua azul como se describe por ejemplo por Murray y Eaton. (1996, Vaccines for Vet Aust J, 73 (6): 207-210), partículas similares a virus de protozoos como se describe por ejemplo por Sitja-Bobadilla et al. (1996, Int J Parasitol, 26 (4): 457-459), y partículas similares al virus Epstein-Barr como se describe por ejemplo por Yano et al. (1986, Int J Cancer, 38 (2): 275-284). En una realización preferente, la proteína de la cápside es una proteína de la cápside del virus del papiloma. La proteína de la cápside se selecciona adecuadamente entre las proteínas de la cápside L1 y L2.

3.1 Producción de antígeno modificado

Un segundo antígeno o antígeno modificado para su uso de acuerdo con la presente invención puede prepararse utilizando cualquier técnica adecuada que hace que sea menos resistente a la proteólisis intracelular con relación a un primer antígeno correspondiente al antígeno diana de interés. No obstante, hay que señalar que la presente invención no es dependiente, y no se dirige a, una cualquiera de una técnica particular por la que se produce el segundo antígeno o antígeno modificado. La semivida intracelular de un primer antígeno o antígeno diana es adecuadamente superior a aproximadamente 3 minutos, preferentemente superior a aproximadamente 5 minutos, más preferentemente superior a aproximadamente 10 minutos, aún más preferentemente superior a aproximadamente 15 minutos, incluso más preferentemente superior a aproximadamente 30 minutos, incluso más preferentemente superior a aproximadamente 1 hora, incluso más preferentemente superior a aproximadamente 10 horas, incluso más preferentemente superior a aproximadamente 24 horas, y todavía aún más preferentemente superior a aproximadamente 50 horas. Adecuadamente, un antígeno proteolíticamente resistente es uno que conserva más de aproximadamente el 10 % de su estructura terciaria después de aproximadamente 3 minutos, preferentemente después de aproximadamente 5 minutos, más preferentemente después de aproximadamente 10 minutos, incluso más preferentemente después de aproximadamente 15 minutos, incluso más preferentemente después de aproximadamente 30 minutos, incluso más preferentemente después de aproximadamente 1 hora, incluso más preferentemente después de aproximadamente 10 horas, incluso más preferentemente después de aproximadamente 24 horas, y aún más preferentemente después de aproximadamente 50 horas en condiciones intracelulares o similares a intracelulares. Preferentemente, un antígeno proteolíticamente resistente es uno que conserva más de aproximadamente el 20 % de su estructura terciaria después de aproximadamente 3 minutos, preferentemente después de aproximadamente 5 minutos, más preferentemente después de aproximadamente 10 minutos, incluso más preferentemente después de aproximadamente 15 minutos, incluso más preferentemente después de aproximadamente 30 minutos, incluso más preferentemente después de aproximadamente 1 hora, incluso más preferentemente después de aproximadamente 10 horas, incluso más preferentemente después de aproximadamente 24 horas, y aún más preferentemente después de aproximadamente 50 horas en condiciones intracelulares o similares a intracelulares. Más preferentemente, un antígeno proteolíticamente resistente es uno que conserva más de aproximadamente el 50 % de su estructura terciaria después de aproximadamente 3 minutos, preferentemente después de aproximadamente 5 minutos, más preferentemente después de aproximadamente 10 minutos, incluso más preferentemente después de aproximadamente 15 minutos, incluso más preferentemente después de aproximadamente 30 minutos, incluso más preferentemente después de aproximadamente 1 hora, incluso más preferentemente después de aproximadamente 10 horas, incluso más preferentemente después de aproximadamente 24 horas, y aún más preferentemente después de aproximadamente 50 horas en condiciones intracelulares o similares a intracelulares. Las condiciones intracelulares o similares a intracelulares son preferentemente fisiológicas para el tipo de célula. El tipo de célula es preferentemente una célula presentadora de antígeno, más preferentemente una célula presentadora de antígeno profesional que incluye, entre otros, una célula dendrítica, un macrófago y una célula B. La temperatura de las condiciones intracelulares o similares a intracelulares es preferentemente fisiológica para el tipo de célula. Las temperaturas a modo de ejemplo para las células de mamífero oscilan adecuadamente entre aproximadamente 30 ºC y aproximadamente 42 ºC, y preferentemente de aproximadamente 35 ºC a aproximadamente 37 ºC. La semivida intracelular del segundo antígeno es adecuadamente inferior a aproximadamente 50 horas, preferentemente inferior a aproximadamente 10 horas, más preferentemente inferior a aproximadamente 1 hora, incluso más preferentemente inferior a aproximadamente 30 minutos, incluso más preferentemente inferior a aproximadamente 15 minutos, incluso más preferentemente inferior a aproximadamente 10 minutos y aún incluso más preferentemente inferior a aproximadamente 3 minutos. Como mínimo, la degradación proteolítica potenciada del segundo antígeno se refiere a un nivel de degradación proteolítica que es de al menos aproximadamente 5 %, preferentemente al menos aproximadamente 10 %, más preferentemente al menos aproximadamente 20 %, incluso más preferentemente al menos aproximadamente 40 %, incluso más preferentemente al menos aproximadamente 50 %, incluso más preferentemente al menos aproximadamente 60 %, incluso más preferentemente al menos aproximadamente 70 %, incluso más preferentemente al menos aproximadamente 80 %, incluso más preferentemente al menos aproximadamente 90 %, aún incluso más preferentemente al menos aproximadamente 95 %, superior al de la diana o primer antígeno. Las pruebas para medir la degradación de proteínas se conocen por los expertos en la materia. Por ejemplo, la degradación proteolítica puede medirse utilizando una prueba de lisado celular de mamíferos incluyendo, entre otros, la prueba de lisado de reticulocitos de Bachmair et al en la patente de EE.UU. n.º de serie 5.646.017.

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añadir al extremo 5' de un polinucleótido aislado o sintetizado por ligamento de una secuencia de ácidos nucleicos apropiada para el extremo 5' (codificación amino terminal) del polinucleótido. Los insertos de ácidos nucleicos que codifican los residuos de lisina apropiadamente ubicados (tales como los "segmentos desestabilizadores universales" descritos anteriormente) pueden insertarse de forma adecuada en la región 5' para proporcionar el segundo factor determinante de la degradación amino terminal completa.

El segundo antígeno o antígeno modificado, que comprende un aminoácido desestabilizador en su extremo amino, puede fusionarse o de otro modo conjugarse con una entidad de enmascaramiento, que enmascara dicho amino terminal de modo que cuando se desenmascara el segundo antígeno exhibirá la velocidad deseada de degradación proteolítica intracelular. De forma adecuada, la entidad de enmascaramiento es una secuencia de proteínas de enmascaramiento. La proteína de fusión se diseña de modo que la secuencia de proteínas de enmascaramiento fusionada al extremo amino terminal de la proteína de interés sea susceptible para la escisión específica en la unión entre los dos. La eliminación de la secuencia de proteína desenmascara así el amino terminal de la proteína de interés y la semivida de la proteína liberada se rige de este modo por el amino terminal prediseñado. La proteína de fusión puede diseñarse para la escisión específica in vivo, por ejemplo, mediante una endoproteasa de célula hospedadora o para la escisión específica en un sistema in vitro en el que se puede escindir después del aislamiento a partir de una célula productora (que carece de la capacidad para escindir la proteína de fusión). En consecuencia, la secuencia de proteínas de enmascaramiento puede escindirse por una endoproteasa, que es preferentemente una endoproteasa endógena de una célula de mamífero. Las endoproteasas adecuadas incluyen, entre otros, endoproteasas de serina (p. ej., subtilisinas y furinas) como se describe, por ejemplo, por Creemers, et al. (1998, Semin. Cell Dev. Biol 9 (1): 3-10), endopeptidasas proteasomales como se describe, por ejemplo, por Zwickl, et al. (2000, Curr. Opin. Struct. Biol 10 (2): 242-250), vía de procesamiento de proteasas relacionadas con el CMH clase I como se describe, por ejemplo, por Stolze et al. (2000, Nat. Immunol. 1 413-418) y peptidasas señal como se describe, por ejemplo, por Dalbey, et al. (1997, Protein Sci. 6 (6): 1129-1138). La secuencia de proteínas de enmascaramiento puede comprender una secuencia de péptido señal. Las secuencias de péptidos señal adecuadas se describen, por ejemplo, por Nothwehr et al. (1990., Bioessays 12 (10): 479-484), Izard, et al. (1994, Mol. Microbial. 13 (5): 765-773), Menne, et al. (2000, Bioinformatics. 16 (8): 741-742) y Ladunga (2000, Curr. Opin. Biotechnol. 11 (1): 13-18). Adecuadamente, un sitio de escisión de endoproteasa se interpone entre la secuencia de la proteína de enmascaramiento y el segundo antígeno.

Un segundo antígeno o antígeno modificado con una secuencia de enmascaramiento unida se puede preparar convenientemente mediante la fusión de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de proteínas de enmascaramiento cadena arriba de otra secuencia de ácidos nucleicos que codifica un antígeno, que corresponde al antígeno diana de interés y que incluye un aminoácido desestabilizador en su extremo amino terminal. El codón para el aminoácido amino terminal del antígeno de interés está adecuadamente ubicado inmediatamente adyacente al extremo 3' de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína de enmascaramiento.

El antígeno parental puede modificarse para incluir o de otro modo asociarse con un aceptor de ubiquitina que es una molécula que contiene preferentemente al menos un residuo apropiadamente posicionado desde el N-terminal del antígeno para ser capaz de unirse por moléculas de ubiquitina. Tales residuos tienen preferentemente un grupo amino épsilon, tal como lisina. El análisis físico demuestra que múltiples residuos de lisina funcionan como sitios aceptores de ubiquitina (King et al., 1996, Mol. Biol. Cell 7: 1343-1357; King et al., 1996, Science 274: 1652-1659). Ejemplos de otros aceptores de ubiquitina incluyen ARN polimerasa del virus lacI o Sindis. La ubiquitinación en el extremo N-terminal de la proteína orienta selectivamente de manera específica la proteína para la degradación por medio de la vía ubiquitina-proteosoma.

Se contemplan otras señales de procesamiento de proteínas que desestabilizan un antígeno de interés y permiten la degradación intracelular potenciada. Estos otros métodos pueden no necesariamente estar mediados por la vía de la ubiquitina, pero de otro modo pueden permitir la degradación de las proteínas en el citoplasma por medio de proteosomas. Por ejemplo, pueden utilizarse otras señales de procesamiento intracelulares que regulan la velocidad

o velocidades de degradación de proteínas intracelulares incluyendo, entre otros, las descritas por Bohley et al. (1996, Biol. Chem. Hoppe. Seyler 377: 425-435). Tales señales de procesamiento incluyen aquellas que permiten la fosforilación de la proteína diana (Yaglom et al., 1996, Mol. Cell. Biol. 16: 3679-3684; Yaglom et al., 1995, Mol. Cell Biol. 15: 731-741). Se describe la modificación de un antígeno parental que permite la arginilación post-traduccional (Ferber et al. 1987, Nature 326: 808-811; Bohley et al., 1991, Biomed. Biochim. Acta 50: 343-346) de la proteína que puede potenciar su velocidad o velocidades de degradación intracelular. Ciertas características estructurales de las proteínas se pueden utilizar para poder influir en las velocidades más altas de recambio de proteína intracelular, incluyendo la hidrofobicidad de la superficie de proteína, los agrupamientos de residuos hidrófobos en la proteína (Sadis et al., 1995, Mol. Cell. Biol. 15: 4086-4094), ciertos motivos de pentapéptidos hidrófobos en el extremo carboxi terminal (C-terminal) de la proteína (p. ej., ARINV (SEQ ID NO: 25), como se encuentra en el extremo Cterminal de la ornitina descarboxilasa (Ghoda et al., 1992, Mol. Cell Biol. 12: 2178-2185; Li, et al., 1994, Mol. Cell Biol. 14: 87-92), o AANDENYALAA (SEQ ID NO: 26), como se encuentra en las etiquetas de los extremos Cterminales de los polipéptidos aberrantes (Keiler et al., 1996, Science 271: 990-993), o regiones PEST (regiones ricas en prolina (P), ácido glutámico (E), serina (S) y treonina (T), que están opcionalmente flanqueadas por aminoácidos que comprenden cadenas laterales electropositivas (Rogers et al. 1986, Science 234 (4774): 364-368;

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1988, J. Biol. Chem. 263: 19833-19842). Además, ciertos motivos se han identificado en proteínas que parecen necesarias y, posiblemente, suficientes para lograr la rápida degradación intracelular. Tales motivos incluyen la región RXALGXIXN (SEQ ID NO 27) (en la que X = cualquier aminoácido) en ciclinas (Glotzer et al., 1991, Nature

349: 132-138) y el motivo KTKRNYSARD (SEQ ID NO: 28) en isocitrato liasa (Ordiz et al., 1996, FEBS Lett. 385: 4346).

Se describe la degradación celular potenciada de un antígeno parental que se puede producir por la incorporación en ese antígeno de sitios de escisión de la proteasa conocidos. Por ejemplo, la proteína beta-amiloide puede escindirse por una beta-y gamma-secretasa (Iizuka et al. 1996, Biochem. Biophys. Res. Commun. 218: 238-242) y el factor X de coagulación dependiente de vitamina K de dos cadenas puede escindirse por endoproteasa o endoproteasas dependientes de calcio en el hígado (Wallin et al., 1994, Thromb. Res. 73: 395-403).

En la presente invención, el antígeno parental se conjuga con una ubiquitina o un fragmento biológicamente activo de la misma, para producir un segundo antígeno o antígeno modificado cuya velocidad de degradación proteolítica intracelular se aumenta, potencia o de otro modo eleva en relación con el antígeno parental. En una realización preferente de este tipo, la ubiquitina o un fragmento biológicamente activo se fusiona, o de otro modo se conjuga, al segundo antígeno. Adecuadamente, la ubiquitina es de origen mamífero, más preferentemente de origen humano u otro primate. En una realización preferente de este tipo, la ubiquitina comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2. En una realización alternativa, la ubiquitina comprende dos o más copias de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2.

En una realización, la proteína de fusión ubiquitina-antígeno se produce adecuadamente por la unión covalente de un antígeno que corresponde al antígeno diana a una ubiquitina o a un fragmento biológicamente activo de la misma. La unión covalente se puede efectuar por cualquier medio adecuado conocido por los expertos en la materia. Por ejemplo, los conjugados de proteína se pueden preparar mediante la vinculación de las proteínas entre sí utilizando reactivos bifuncionales. Los reactivos bifuncionales pueden ser homobifuncionales o heterobifuncionales.

Los reactivos homobifuncionales son moléculas con al menos dos grupos funcionales idénticos. Los grupos funcionales del reactivo reaccionan generalmente con uno de los grupos funcionales en una proteína, normalmente un grupo amino. Los ejemplos de reactivos homobifuncionales incluyen glutaraldehído y diimidatos. Un ejemplo del uso de glutaraldehído como un agente de reticulación se describe por Poznansky et al. (1984, Science, 223: 13041306). El uso de diimidatos como un agente de reticulación se describe por ejemplo por Wang, et al. (1977, Biochemistry, 16: 2937-2941). Aunque es posible utilizar reactivos homobifuncionales con el fin de formar un antígeno modificado para su uso de acuerdo con la invención, el personal calificado en la materia apreciará que es difícil unir diferentes proteínas de una manera ordenada con estos reactivos. En este sentido, en el intento de vincular una primera proteína con una segunda proteína por medio de un reactivo homobifuncional, no se puede impedir la vinculación de la primera proteína entre sí y de la segunda entre sí. Los reactivos de reticulación heterobifuncionales son, por lo tanto, preferentes porque se puede controlar la secuencia de reacciones, y combinar proteínas a voluntad. De este modo, los reactivos heterobifuncionales proporcionan un método más sofisticado para vincular dos proteínas. Estos reactivos requieren una de las moléculas a unir, en lo sucesivo denominada miembro B, para poseer un grupo reactivo no encontrado en el otro, en lo sucesivo denominado miembro A, o bien requieren que uno de los dos grupos funcionales se bloquee o de otro modo reduzca en gran medida la reactividad mientras que el otro grupo se hace reaccionar con el socio A. En un proceso típico de dos etapas para formar heteroconjugados, el miembro A se hace reaccionar con el reactivo heterobifuncional para formar una molécula de miembro A derivatizado. Si el grupo funcional sin reaccionar del agente de reticulación se bloquea, se desprotege a continuación. Después de la desprotección, el miembro B se acopla al miembro A derivatizado para formar el conjugado. Los grupos amino primarios en el miembro A se hacen reaccionar con un grupo carboxilato o imidato activado en el agente de reticulación en la etapa de derivatización. Un tiol reactivo o un tiol bloqueado y activado en el otro extremo del agente de reticulación se hacen reaccionar con un grupo electrófilo o con un tiol reactivo, respectivamente, sobre el miembro B. Cuando el agente de reticulación posee un tiol reactivo, el electrófilo sobre el miembro B será preferentemente un grupo tiol bloqueado y activado, una maleimida, o un carbonilo halometileno (p. ej., bromoacetilo o yodoacetilo). Debido a que las macromoléculas biológicas no contienen de forma natural tales electrófilos, han de añadirse al miembro B mediante una reacción de derivatización separada. Cuando el agente de reticulación posee un tiol bloqueado y activado, el tiol sobre el miembro B con el que reacciona puede ser nativo en relación con el miembro B.

Un ejemplo de un reactivo heterobifuncional es N-succinimidil 3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) (véase, por ejemplo Carlsson et al., 1978, Biochem. J., 173: 723-737). Otros reactivos heterobifuncionales para vincular proteínas incluyen, por ejemplo succinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) (Yoshitake et al., 1979, Eur. J. Biochem, 101: 395-399), 2-iminotiolano (IT) (Jue et al., 1978, Biochemistry, 17: 5399-5406), y anhídrido Sacetil mercaptosuccínico (SAMSA) (Klotz y Heiney, 1962, Arch. Biochem. Biophys., 96: 605-612). Los tres reaccionan preferentemente con aminas primarias (p. ej., cadenas laterales de lisina) para formar un grupo amida o amidina que vincula un tiol a la molécula derivatizada (p. ej., un antígeno heterólogo) por medio de un brazo espaciador de conexión corta, de uno a tres átomos de carbono de longitud. Los ejemplos de reactivos heterobifuncionales que comprenden grupos reactivos que tienen un doble enlace que reacciona con un grupo tiol incluyen SMCC mencionados anteriormente, succinimidil m-maleimidobenzoato, succinimidil 3

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antígeno como dianas de LTC. Otros métodos conocidos por los profesionales en la materia, que pueden detectar la presencia de antígeno en la superficie de células presentadoras de antígeno después de la exposición a uno o más de los antígenos modificados y no modificados, también se contemplan.

Cuando las células presentadoras de antígenos son células dendríticas, tales células tienen la capacidad de presentar de manera eficiente una forma procesada del antígeno modificado y el antígeno no modificado en forma de péptidos en moléculas de CMH clase I y clase II. Los antígenos se adquieren por células dendríticas a través de la vía exógena por fagocitosis y, como resultado, moléculas a través del CMH clase II de carga eficiente. En consecuencia, los linfocitos T auxiliares CD4+ y LTC pueden activarse por las células dendríticas que presentan un antígeno modificado y opcionalmente no modificado en el contexto de CMH clase II. Estos linfocitos pueden proporcionar fuentes críticas de ayuda, para la generación de LTC CD8+ activo y en algunas circunstancias pueden sensibilizarse como LTC CD4+ con especificidad para el antígeno diana durante la respuesta aguda al antígeno, y para la generación de la memoria que se requiere para la resistencia y la vacunación a largo plazo. Además, el antígeno y la absorción de antígenos modificados y opcionalmente no modificados y la presentación por las células dendríticas, permite a estas células adaptar los péptidos que son apropiados para productos de CMH individuales, y aumenta el número de células presentadoras de antígeno estimuladoras especializadas. Además, las células dendríticas se pueden cargar con antígenos múltiples en múltiples CMHs para producir la estimulación policlonal u oligoclonal de las células T. De este modo, mediante el uso de los antígenos descritos en la presente memoria para cargar las moléculas a través del CMH clase I y clase II, se puede lograr una modulación de células T eficiente in situ.

8. Composiciones

Los antígenos modificados y antígenos no modificados descritos respectivamente en las secciones 3 y 4, la construcción sintética y el sistema de construcción sintética descritas en la sección 5, y las células presentadoras de antígeno sensibilizadas con antígeno descritas en la sección 7 (agentes terapéuticos/profilácticos) se pueden utilizar como principios activos para el tratamiento o profilaxis de varias afecciones asociadas con la presencia de un antígeno diana. Estos agentes terapéuticos/profilácticos se pueden administrar a un paciente, ya sea por sí mismos,

o en composiciones en las que se mezclan con un portador y/o un diluyente o un adyuvante farmacéuticamente adecuado.

Se describe un método para estimular el sistema inmunitario de un paciente, y para provocar una respuesta inmunitaria humoral y celular contra un antígeno diana, por administración al paciente de un agente terapéutico o composición como se ha descrito anteriormente. Dicha estimulación se puede utilizar para el tratamiento y/o profilaxis de una enfermedad o afección que incluye, entre otros, una infección patógena (p. ej., vírica, bacteriana, fúngica, protozoaria). Alternativamente, la estimulación se puede utilizar para modular una respuesta inmunitaria a un autoantígeno (p. ej., asociado con la artritis reumatoide).

De este modo, se describe un método para el tratamiento y/o profilaxis de una enfermedad o afección, que comprende administrar a un paciente en necesidad de tal tratamiento una cantidad terapéuticamente/profilácticamente eficaz de una composición como se ha descrito a grandes rasgos anteriormente. El método puede comprender administrar simultáneamente al paciente un antígeno no modificado como se ha descrito a grandes rasgos anteriormente, o un polinucleótido a partir del cual se expresa el antígeno no modificado, junto con un antígeno modificado como se ha descrito a grandes rasgos anteriormente, o un polinucleótido a partir del cual se expresa el antígeno modificado. El método puede comprender la coadministración a un paciente de un polinucleótido a partir del cual se expresa dicho antígeno no modificado, y un polinucleótido a partir del cual se expresa dicho antígeno modificado. El método puede comprender la coadministración a un paciente de dicho antígeno no modificado y un polinucleótido a partir del cual se expresa dicho antígeno modificado. El método puede comprender la administración simultánea a un paciente de un polinucleótido a partir del cual se expresa dicho antígeno no modificado, junto con dicho antígeno modificado. El método puede comprender la coadministración a un paciente de dicho antígeno no modificado y células presentadoras de antígenos que se han expuesto a dicho antígeno modificado, o un polinucleótido a partir del cual se expresa dicho antígeno modificado, durante un tiempo y en condiciones suficientes para expresar una forma procesada de dicho antígeno modificado para su presentación a las células T y modulación de las mismas. El método puede comprender la administración simultánea a un paciente de células presentadoras de antígeno que se han expuesto a dicho antígeno modificado, o un polinucleótido a partir del cual se expresa dicho antígeno modificado, y a dicho antígeno no modificado, o un polinucleótido a partir del cual se expresa dicho antígeno no modificado, durante un tiempo y en condiciones suficientes para expresar una forma procesada de dicho antígeno modificado y una forma procesada de dicho antígeno no modificado para su presentación a las células T y modulación de las mismas.

Dependiendo de las afecciones específicas que se tratan, los agentes terapéuticos/profilácticos pueden formularse y administrarse sistémicamente o localmente. Las técnicas para la formulación y administración pueden hallarse en "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, Pa., última edición. Las vías adecuadas pueden, por ejemplo, incluir administración oral, rectal, transmucosal, o intestinal; administración parenteral, incluyendo intramuscular, subcutánea, inyecciones intramedulares, así como inyecciones intratecal, intraventricular directa, intravenosa, intraperitoneal, intranasal, o intraocular. Para la inyección, los agentes terapéuticos descritos en

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descrito en la presente memoria se puede efectuar mediante el recubrimiento del mismo, por ejemplo, con polímeros hidrófobos que incluyen resinas acrílicas, ceras, alcoholes alifáticos superiores, ácidos polilácticos y poliglicólicos y ciertos derivados de celulosa, tales como hidroxipropilmetilcelulosa. Además, la liberación controlada puede efectuarse mediante el uso de otras matrices poliméricas, liposomas y/o microesferas.

Los agentes terapéuticos descritos en la presente memoria pueden proporcionarse como sales con contraiones farmacéuticamente compatibles. Las sales farmacéuticamente compatibles pueden formarse con muchos ácidos, incluyendo, entre otros, ácido clorhídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, etc. Las sales tienden a ser más solubles en disolventes acuosos u otros protónicos que son las formas de base libre correspondientes.

Para cualquier compuesto utilizado en el método descrito en la presente memoria, la dosis eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Por ejemplo, una dosis puede formularse en modelos animales para conseguir un intervalo de concentración circulante que incluye la CI50 como se determina en un cultivo celular

(p. ej., la concentración de un agente de ensayo, que logra una reducción medio máximo en un antígeno diana). Tal información se puede utilizar para determinar con mayor precisión las dosis útiles en seres humanos.

La toxicidad y la eficacia terapéutica de los compuestos descritos en la presente memoria pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales experimentales, p. ej., para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50 % de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación DL50/DE50. Resultan preferentes los compuestos que exhiben grandes índices terapéuticos. Los datos obtenidos de estas pruebas de cultivo celular y estudios animales pueden utilizarse para formular un intervalo de dosificación para su uso en humanos. La dosificación de tales compuestos reside preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con escasa o nula toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. La formulación exacta, vía de administración y dosificación pueden elegirse por el médico individual a la vista de la afección del paciente. (Véase, por ejemplo, Fingl et al., 1975, en "The Pharmacological Basis of Therapeutics", cap. 1 p1).

La cantidad de dosificación y el intervalo se pueden ajustar individualmente para proporcionar niveles en plasma del compuesto o compuestos activos que son suficientes para mantener los efectos reductores de antígeno diana o efectos que mejoran la enfermedad o afección. Las dosificaciones habituales del paciente para el intervalo de la administración sistémica oscilan desde 1-2.000 mg/día, habitualmente de 1-250 mg/día, y normalmente de 10-150 mg/día. Expresado en términos de peso corporal del paciente, las dosificaciones normales oscilan desde 0,02-25 mg/kg/día, habitualmente de 0,02-3 mg/kg/día, normalmente de 0,2-1,5 mg/kg/día. Expresado en términos de superficie corporal del paciente, las dosificaciones habituales oscilan desde 0,5-1.200 mg/m2/día, habitualmente desde 0,5-150 mg/m2/día, normalmente de 5-100 mg/m2/día.

Alternativamente, se puede administrar el agente en forma de una manera local en lugar de sistémica, por ejemplo, por medio de inyección del compuesto directamente en un tejido, a menudo en una formulación de liberación prolongada o sostenida. Además, se puede administrar el agente en un sistema de administración de fármacos dirigido, por ejemplo, en un liposoma recubierto con un anticuerpo específico de tejido. Los liposomas se orientarán selectivamente y se absorberán selectivamente por el tejido.

Considerando lo anteriormente expuesto, se apreciará que los agentes descritos en la presente memoria puedan utilizarse como composiciones inmunomoduladoras terapéuticas o profilácticas o vacunas. En consecuencia, se desvela la producción de composiciones inmunomoduladoras que contienen como compuestos activos uno o más de los agentes terapéuticos/profilácticos descritos en la presente memoria. Cualquier procedimiento adecuado se contempla para producir tales vacunas. Procedimientos a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, los descritos en NEW GENERATION VACCINES (1997, Levine et al., Marcel Dekker, Inc. Nueva York, Basel Hong Kong).

Se desvela el uso de composiciones de ácidos nucleicos para los fines de vacunación o inmunomodulación. En este sentido, una construcción sintética se puede utilizar para inmunizar a un paciente, cuya construcción incluye un polinucleótido que codifica un antígeno modificado desvelado en la presente memoria, y/o un polinucleótido que codifica un antígeno no modificado desvelado en la presente memoria, en el que dicho polinucleótido o polinucleótidos se conectan operativamente a una o secuencias más reguladoras que dirigen la expresión de dicho polinucleótido o polinucleótidos en dicho paciente.

Normalmente, tales construcciones o vectores se derivan de secuencias de ADN víricas, tales como adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes simple y retrovirus. Vectores de inmunomoduladores adecuados actualmente disponibles para el experto pueden encontrarse, por ejemplo, en Wu y Ataai (2000, Curr. Opin. Biotechnol. 11 (2): 205-208), Vigna y Naldini (2000, J. Gene Med. 2 (5): 308-316), Kay, et al. (2001, Nat. Med. 7 (1): 33-40), Athanasopoulos, et al. (2000, Int. J. Mol. Med. 6 (4): 363-375) y Walther y Stein (2000, Drugs 60 (2): 249-271).

La administración de la construcción inmunomoduladora a un paciente, preferentemente un paciente humano, puede incluir la administración por medio de la ingesta oral directa, inyección sistémica, o administración a los tejidos o

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células seleccionados, o indirectamente por medio de la administración a las células aisladas procedentes del paciente o de un donante compatible. La construcción inmunomoduladora puede administrarse por vía intradérmica.

La administración de dicha construcción inmunomoduladora a las células o tejidos del paciente o dicho donante compatible se puede facilitar mediante el bombardeo con microproyectiles, transfección mediada por liposomas (p. ej., lipofectina o lipofectamina), electroporación, fosfato cálcico o transfección mediada por dextrano DEAE, por ejemplo. Una discusión de los métodos de administración adecuados se puede hallar en el capítulo 9 de CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Eds. Ausubel et al.; John Wiley & Sons Inc., 1997 edición), por ejemplo.

La etapa de introducir la construcción inmunomoduladora en una célula o tejido diana será diferente dependiendo del uso y de las especies previstas, y puede involucrar uno o más de los vectores no víricos y víricos, liposomas catiónicos, retrovirus y adenovirus, tales como, por ejemplo, se describe en Mulligan, R.C., (1993). Tales métodos pueden incluir, por ejemplo:

A. Aplicación local del vector de expresión mediante inyección (Wolff et al., 1990), implante quirúrgico, instilación

o cualquier otro medio. Este método también se puede utilizar en combinación con la aplicación local mediante inyección, implante quirúrgico, instilación o cualquier otro medio, de células sensibles a la proteína codificada por el vector de expresión a fin de aumentar la eficacia de dicho tratamiento. Este método también se puede utilizar en combinación con la aplicación local mediante inyección, implante quirúrgico, instilación o cualquier otro medio, de otro factor o factores requeridos para la actividad de dicha proteína.

B.

Administración sistémica general por inyección de ADN, (Calabretta et al., 1993), o ARN, solo o en combinación con liposomas (Zhu et al., 1993), cápsides víricas o nanopartículas (Bertling et al., 1991) o cualquier otro mediador de administración. La orientación selectiva mejorada puede lograrse vinculando el vector polinucleotídico/de expresión a una molécula de direccionamiento (el llamado enfoque de "bala mágica" que emplea, por ejemplo, una molécula de unión a antígeno), o por aplicación local mediante inyección, implantación quirúrgica o cualquier otro medio, de otro factor o factores requeridos para la actividad de la proteína codificada por dicho vector de expresión, o de células sensibles a dicha proteína.

C.

Inyección o implante o administración por cualquier medio de las células que se han modificado ex vivo por transfección (por ejemplo, en presencia de fosfato de calcio: Chen et al., 1987, o de lípidos catiónicos y poliaminas: Rose et al., 1991), infección, inyección, electroporación (Shigekawa et al., 1988) o de cualquier otra manera a fin de aumentar la expresión de dicho polinucleótido en esas células. La modificación puede ser mediada por el plásmido, bacteriófago, cósmido, vectores víricos (tales como adenoviral o retroviral; Mulligan, 1993; Miller, 1992; Salmons. et al., 1993) u otros vectores, u otros agentes de modificación, tales como liposomas (Zhu et al., 1993), cápsides víricas o nanopartículas (Bertling et al., 1991), o cualquier otro mediador de modificación. El uso de células como vehículo de administración para genes o productos génicos se ha descrito por Barr et al., 1991 y por Dhawan et al., 1991. Las células tratadas se pueden administrar en combinación con cualquier nutriente, factor de crecimiento, matriz u otro agente que promueva su supervivencia en el sujeto tratado.

Las composiciones inmunomoduladoras descritas en la presente memoria pueden contener un diluyente o excipiente fisiológicamente aceptable, tal como agua, solución salina tamponada con fosfato y solución salina. También pueden incluir un adyuvante como es bien conocido en la materia. Los adyuvantes adecuados incluyen, entre otros: sustancias tensioactivas, tales como hexadecilamina, octadecilamina, ésteres de aminoácidos de octadecilo, lisolecitina, bromuro de dimetildioctadecilamonio, N,N-dicoctadecil-N',N'-bis(2-hidroxietil-propanodiamina), metoxihexadecilglicerol, y polioles plurónicos; poliaminas, tales como pirano, sulfato de dextrano, poli IC, carbopol; péptidos, tales como dipéptido de muramilo y derivados, dimetilglicina, tuftsina; emulsiones de aceite; y geles minerales, tales como fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio o alumbre; linfoquinas, QuilA y complejos inmunoestimulantes (ISCOMs).

Las células presentadoras de antígeno sensibilizadas con antígeno modificado, y opcionalmente sensibilizadas con antígeno no modificado, descritas en la presente memoria y los linfocitos T específicos de antígeno generados con estas células presentadoras de antígenos se pueden utilizar como compuestos activos en composiciones inmunomoduladoras para aplicaciones profilácticas o terapéuticas. Las células sensibilizadas, que son preferentemente células dendríticas maduras, se pueden inyectar por cualquier método que provoca una respuesta inmunitaria en un animal singénico o ser humano. Preferentemente, las células presentadoras de antígeno se inyectan de nuevo en el mismo animal o ser humano del cual se obtuvo las células/tejidos fuente. El sitio de inyección puede ser subcutáneo, intraperitoneal, intramuscular, intradérmico o intravenoso. El número de células presentadoras de antígeno sensibilizadas con antígeno reinyectadas de nuevo en el animal o ser humano en necesidad de tratamiento puede variar en función, entre otras cosas, del antígeno y tamaño del individuo. Este número puede oscilar por ejemplo entre aproximadamente 104 y 108, y más preferentemente entre aproximadamente 106 y 107 células presentadoras de antígeno sensibilizadas con antígeno (p. ej., células dendríticas). Las células presentadoras de antígeno se deben administrar en un portador farmacéuticamente aceptable, que es no tóxico para las células y el individuo. Tal portador puede ser el medio de crecimiento en el que se cultivaron las células

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Para que la invención pueda entenderse fácilmente y llevarse a la práctica, realizaciones preferentes particulares se describirán ahora por medio de los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos

EJEMPLO 1

Inmunización con ADN y estirpes celulares en ratones

Los ratones hembra BALB/c y C57BL/6 libres de patógenos específicos, de 6 a 8 semanas, se adquirieron del Centro de Recursos Animal (Perth, Australia) y se mantuvieron en condiciones de limpieza en una ratonera convencional.

Los ratones hembra BALB/c y C57 BL/6, de 6 a 8 semanas de edad, se inmunizaron mediante bombardeo de partículas con perlas de oro recubiertas de ADN (2 µg de ADN/dosis) utilizando el sistema de administración de pistola genética de Helios accionada con helio (Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, EE.UU.). El ADN (1,0 µg) se acopló a 0,5 mg de partículas de oro con un diámetro de 1,0 µm, tal como se recomienda por el fabricante. Los microportadores recubiertos de ADN se administraron en la epidermis abdominal a un ajuste de presión de helio de 400 psi.

Una estirpe celular EL-4, C236, transducida con virus del papiloma humano (VPH) 16 E7, y la línea celular parental (EL-4) se mantuvieron en medio RPMI-1640 completo más suero bovino fetal al 10 % (CSL, Melbourne, Australia).

EJEMPLO 2

Reemplazos de codones en el HPV6bL1, E7 y los genes de ubiquitina

El HPV6bL1, HPV6b-E7 y las secuencias del gen ubiquitina humana se modificaron para sustituir los codones preferentes con codones raramente utilizados, de acuerdo con los métodos descritos previamente12. Un polinucleótido que codifica HPV6bL1 truncado de 33 aminoácidos C-terminal se fabricó como una construcción modificada de codones (H6L1Δ) (SEQ ID NO: 9) y también con codones nativos (6L1Δ) (SEQ ID NO: 7).

Un gen de fusión HPV6bL1-E7 (H6L1E7.1) (SEQ ID NO: 11) se construyó mediante la adición a H6L1Δ de una secuencia modificada de codones correspondiente a los aminoácidos 2-50 de la proteína E7 HPV6b. H6L1E7.2 (SEQ ID NO: 13) se construyó de manera similar mediante la adición de un polinucleótido que codifica los aminoácidos 49-98 de E7 de HPV6b, y H6L1-H16E7 (SEQ ID NO: 19) se construyó mediante la adición de un polinucleótido que corresponde al epítopo de LTC H-2 Db mínimo de HPV16 (RAHYNIVTF). La construcción modificada de codones L2 de BPV1 (SEQ ID NO: 23), denominada HBL2, se ha descrito previamente12.

Una construcción de fusión ubiquitina-HL1-16E7 (SEQ ID NO: 15) se produjo mediante la adición de una secuencia que codifica un monómero de ubiquitina 5' en la construcción del gen L1-16E7. Los genes modificados de codones de la secuencia deseada se sintetizaron por Operon (Alameda, California, EE.UU.), y todas las secuencias se verificaron por secuenciación Big Dye Terminator. Las secuencias para las siete innovadoras construcciones de vacunas de polinucleótidos modificados de codones utilizadas en la presente memoria se depositaron ante GenBank bajo los números de acceso AF322411-5 (SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, respectivamente) y AF323508-9 (SEQ ID NO: 17 y 19, respectivamente).

EJEMPLO 3

Construcciones de plásmidos

Los cebadores se diseñaron para permitir la clonación de construcciones de genes en plásmidos de expresión eucariota. Todos los cebadores se codifican para un sitio de restricción EcoRI o KpnII de flanqueo en su extremo Nterminal, y para 18-24 nucleótidos del gen correspondiente. Se utilizaron para amplificar las secuencias de genes VP por PCR. Los productos de PCR amplificados se cortaron con enzimas de restricción KpnII y EcoRI y se ligaron al vector de expresión pCDNA3 de mamífero que contiene el virus del simio 40 (SV40) (Invitrogen, Carlsbad, California, EE.UU.) para producir los plásmidos de expresión correspondientes.

EJEMPLO 4

Medición de las respuestas de anticuerpos

La medición de la IgG específica de PSV total en suero se realizó por ELISA de captura, como se ha descrito previamente37. Para medir el anticuerpo L1 de HPV6b contra epítopos lineales, PSVs de L1 HPV6b se desnaturalizaron por reducción alcalina (tampón Na2CO3 0,2 M, pH 10,6, ditiotreitol 0,01 M)38 y se recubrieron directamente sobre placas de ELISA en una concentración de 20 µg/ml. Para la prueba de anticuerpos L2 (véase el

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por las vacunas quiméricas L1-E7 se sometió a ensayo utilizando células Cos-1 transfectadas con HPV6bE7 como fuente de proteína E7 de HPV6b. La inmunorreactividad con una proteína de 14 kD, que se presupone que era E7, se observó en ratones inmunizados con vacunas quiméricas de polinucleótido L1 que incorporaron la región N-o Cterminal de HPV6bE7 (pH6L1E7.1 o pH6L1E7.2, SEQ ID NO: 11 y 13, respectivamente) (véase la Figura 1f). Como era de esperar, no se apreció reactividad con HPV6bE7 en el suero de ratones inmunizados con pH6L1Δ (SEQ ID NO: 9), o de ratones no inmunizados.

EJEMPLO 7

Inmunidad mediada por células en ratones inmunizados con polinucleótidos híbridos L1-E7 quiméricos

Cuando la intervención terapéutica para VP parece requerir respuestas inmunitarias mediadas por células a las proteínas de VP, a continuación, se midió la inducción de respuestas inmunitarias celulares por las vacunas de polinucleótidos. En primer lugar, se examinó la inducción de hipersensibilidad de tipo retardado (HTR) en la proteína de la cápside L1. La reacción HTR se ensayó mediante una prueba de tumefacción de la oreja, como se ha descrito previamente40, utilizando PSVs L1 de HPV6b purificadas11 como antígeno de desafío. Las respuestas HTR específicas de L1 se observaron para inducirse por la inmunización con pH6L1Δ modificado de codones (SEQ ID NO: 9), y también por las vacunas quiméricas L1 E7 modificadas de codones pH6L1E7.1 y pH6L1E7.2 (SEQ ID NO: 11 y 13, respectivamente), pero no por p6L1Δ no modificado de codones (SEQ ID NO: 7) o por el vector pCDNA3 (véase la Figura 2a).

La respuesta de linfocito T citotóxico (LTC) inducida a un epítopo de LTC restringido por H-2b dominante de E7 de HPV16, incorporado en la construcción quimérica modificada de codones pH6L1-16E7 (SEQ ID NO: 19), se descubrió que era relativamente pobre (véase la Figura 2b).

EJEMPLO 8

La ubiquitinación de 6L1 mejora la respuesta de LTC

Para determinar si la ubiquitinación del producto del gen 6L1 modificado de codones podría mejorar la respuesta de LTC, se fabricó una vacuna en la que se insertó una única copia del gen de la ubiquitina, en el marco 5' al gen L1-E7 quimérico modificado de codones (SEQ ID NO: 17).

Los esplenocitos se prepararon a partir de animales inmunizados y la actividad de LTC se evaluó después de una reestimulación in vitro de 3 días con rIL-2 (Sigma), y el péptido RAHYNIVTF, como se ha descrito previamente44. Las pruebas se realizaron por triplicado, y la liberación espontánea 51Cr de los diversos objetivos no excedió el 15 %.

Una prueba de ELISPOT modificada41 se utilizó para detectar células T CD8+ específicas de E7 de HPV16. Las placas de filtración (96 pocillos) (Millipore, Bedford, Massachusetts, EE.UU.) se recubrieron con 10 µg/ ml de anticuerpo rata anti-IFN-γ de ratón (clon R4-6A2, Pharmingen, San Diego, California, EE.UU.) en 50 µl de TFS. Después de la incubación durante la noche a 4 ºC, los pocillos se lavaron y se bloquearon con medio de cultivo que contenía suero fetal bovino al 10 %. 1 x 106 células de bazo y de ganglios linfáticos aisladas frescas se añadieron al pocillo, junto con 20 UI/ml de IL-2. Las células se incubaron a 37 ºC durante 24 horas con o sin 1 µg/ml de epítopo de LTC H-2Db específico de E7 de HPV16 E7 (E7, aminoácidos 49-57). Después del cultivo, la placa se lavó y luego fue seguido de incubación con 5 µg/ml de anticuerpo IFN-γ biotinilado (clon XMG1.2, PharMingen, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE.UU.) en 50 µl en TFS a 4 ºC durante la noche. Después de lavarse seis veces, se añadieron 1,25 μg/ml de avidina-fosfatasa alcalina (Sigma) en 50 µl de TFS y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. Después del lavado, se desarrollaron manchas mediante la adición de 50 µl de solución de 5-bromo-4-cloro-3-3indolilo fosfato/nitroazul de tetrazolio (Boehringer Manheim, Indianápolis, Indiana, EE.UU.) y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Las manchas se contaron utilizando un microscopio de disección.

La vacuna que contiene ubiquitina, en contraste con la construcción sin ubiquitina, indujo una respuesta de células T CD8 específica de E7 significativa (véase la Figura 2b).

EJEMPLO 9

La respuesta de LTC tras la ubiquitinación es protectora del hospedador

Los ratones se estimularon con un tumor que expresa E7, con el fin de evaluar si la respuesta LTC mejorada observada fue protectora del hospedador. Los ratones se estimularon SC con 2 x 106 células/ células tumorales TC1 de ratón42, del pescuezo, y el peso tumoral se registró 10 días después de la estimulación, como se ha descrito previamente43.

Como puede apreciarse en la Figura 2c, los ratones inmunizados con H6L1-16E7 conjugado con ubiquitina (SEQ ID NO: 17) mostraron una reducción significativa en el peso del tumor, en comparación con los animales inmunizados con la misma construcción sin ubiquitina. Estos datos confirmaron que la respuesta celular inducida fue, de hecho,

protectora del hospedador. De interés, la construcción quimérica conjugada con ubiquitina indujo niveles mínimamente bajos de anticuerpos específicos de VPH (consulte la Figura 1e) en comparación con la construcción sin ubiquitina. Una vacuna de polinucleótido mixta que comprende L1-E7 modificado de codones con y sin ubiquitina se fabricó, por lo tanto, para establecer si la mezcla transmitiría las propiedades de ambos inmunógenos. Los

5 ratones se inmunizaron con la mezcla adquirida tanto del anticuerpo conformacional como no conformacional de L1 (Figura 3 a, b) y desarrollaron células CD8+ secretoras de IFN-γ en los ganglios linfáticos y el bazo (Figura 3c), y se protegieron contra la estimulación del tumor (datos no mostrados), confirmando que la respuesta inmunitaria a la vacuna de polinucleótido mixta era como sería de esperar de la respuesta en cada una de las dos partes.

10 EJEMPLO 10

La vacuna de polinucleótido HPV6bL1 induce anticuerpos neutralizantes

Para confirmar que los diversas construcciones de vacuna L1 modificadas que inducen cada una un anticuerpo

15 neutralizante de VP, se sometieron a ensayo sueros en un ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HAI) mostrados para correlacionarse con la neutralización del virus18. El método se utilizó como se ha descrito previamente18. Los sueros de ratones inmunizados con cada una de las construcciones modificadas de codones y quiméricas modificadas de codones mostraron una fuerte actividad HAI (véase la Figura 4), mientras que no se encontró actividad HAI en los sueros de ratones inmunizados con el gen L1 no modificado.

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EJEMPLO 11

Anticuerpos anti-BPVL2 en ratones inmunizados con una vacuna de polinucleótido L2

25 Para confirmar un gen de VP cuya inmunogenicidad de una vacuna de polinucleótido podría potenciarse por modificación de codones, se inmunizaron ratones con una vacuna de polinucleótido L2 de BPV1 modificada de codones (SEQ ID NO: 23) o no modificada de codones (SEQ ID NO: 21), o con un gen de fusión L2-HPV16E7 de BPV1, también modificado o sin modificado de codones.

30 Los ratones se inmunizaron con anticuerpos anti-BPVL2 desarrollados con HBL2 (SEQ ID NO: 23) y HBL2E7 modificados de codones, mientras que esto no ocurrió con los ratones inmunizados con un gen L2 no modificado de codones (SEQ ID NO: 21) (véase la Figura 5), lo que confirma que la inmunogenicidad del gen L2 también se mejoró por la modificación de codones.

35 TABLAS

TABLA 1

Los codones se utilizaron significativamente con menos frecuencia en genes L1 de CRPV que en L1 de VP poco inmunogénicos como vacunas de ADN.

Codón

Ocurrencias en L1 Uso de consenso de mamífero/1.000 codones1

CRPV

HPV6 BPV1

TTG (Leu) TTA (Leu) AAT (Asn) CGT (Arg)

2 3 2 1 10 14 4 4 7 8 4 2 12,3 7,2 17,1 4,6

1: Los codones que codifican Leu producen 98 de 1.000, Asn 37 de 1.000, y Arg 56 de 1.000 codones cuando se promedian a través de la base de datos GenBank de mamíferos

Bibliografía 40

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Claims (1)

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