ES2531967T3

ES2531967T3 - Composiciones y métodos que comprenden el antigeno KLK3, PSCA o FOLH1

Info

Publication number: ES2531967T3
Application number: ES08754370.8T
Authority: ES
Inventors: Yvonne Paterson; John Rothman; Vafa Shahabi
Original assignee: University of Pennsylvania Penn; Advaxis Inc
Current assignee: University of Pennsylvania Penn; Ayala Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2007-05-10
Filing date: 2008-05-12
Publication date: 2015-03-23
Anticipated expiration: 2028-05-12
Also published as: HUE024509T2; SI2155243T1; WO2008140812A3; US9549973B2; US20070253976A1; EP2155243B8; US20150335721A1; US11446369B2; JP2016187340A; US20170100469A1; JP2010526533A; US9012141B2; US20200069785A1; PL2155243T3; JP5932751B2; PT2155243E; EP2859899A1; EP2155243A4; DK2155243T3; JP2014064569A

Abstract

Una cepa recombinante de Listeria que expresa un péptido de fusión de un péptido peptidasa relacionada con la calicreína 3 (KLK3) que está unido de forma operativa a un péptido listeriolisina (LLO) N-terminal no hemolítico, comprendiendo dicho péptido de fusión la secuencia de SEQ ID NO: 54 o una secuencia homóloga al menos al 99% a la misma, en la que dicho péptido LLO N-terminal potencia la inmunogenicidad del péptido de fusión, y en la que el péptido KLK3 no contiene una secuencia de señal.

Description

Composiciones y métodos que comprenden el antígeno KLK3, PSCA o FOLH1.

CAMPO DELA INVENCIÓN

La presente invención proporciona péptidos KLK3 recombinantes, moléculas nucleotídicas recombinantes que codifican los mismos, cepas recombinantes de Listeria que comprenden los mismos, y usos inmunogénicos y terapéuticos de los mismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La estimulación de una respuesta inmune depende de la presencia de antígenos reconocidos como extraños por el sistema inmune huésped. Los antígenos bacterianos, tales como Salmonella enterica y Mycobacterium bovis BCG, permanecen en el fagosoma y estimulan los linfocitos T CD4+ mediante la presentación antigénica a través de moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad de clase II.En contraste, los antígenos bacterianos, tales como Listeria monocytogenes, salen del fagosoma hacia el citoplasma. El escape fagolisosomal de L. monocytogenes es un mecanismo único que facilita una presentación antigénica del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I de antígenos listerianos. Este escape depende de la citolisina activada por sulfhidrilo formadora de poros, listeriolisina O (LLO).

ActA es una proteína listeriana asociada a la superficie, y actúa como una estructura en las células huésped infectadas para facilitar la polimerización, el montaje y la activación de polímeros de actina huésped para propulsar el organismo de Listeria a través del citoplasma. Poco después de la entrada en el citosol de la célula mamífera, L. monocytogenes induce la polimerización de los filamentos de actina huésped y usa la fuerza generada por la polimerización de la actina para desplazarse, primero intracelularmente y después de célula a célula. Una única proteína bacteriana, ActA, es responsable de mediar la nucleación de la actina y la movilidad basada en actina. La proteína ActA proporciona múltiples sitios de unión para los componentes citoesqueléticos huésped, actuando de este modo como una estructura para montarla maquinaría de polimerización de la actina celular.ElextremoNH2de ActA se une a la actina monomérica y actúa como un factor promotor de la nucleación constitutivamente activa estimulando la actividad de nucleación de la actina intrínseca. Tanto ActA como hly son miembros del grupo génico de 10 kb regulado por el activador transcripcional PrfA, y se regula al alza aproximadamente 226 veces en el citosol mamífero.

El cáncer de próstata es el tipo más frecuente de cáncer en los hombres Americanos y es la segunda causa más importante de muerte relacionada con cáncer en esta población. El antígeno prostático específico (PSA, Prostate Specific Antigen) es un marcador para el cáncer de próstata que se expresa altamente por los tumores prostáticos. Existe la necesidad desde hace tiempo de desarrollar composiciones y métodos para potenciar la inmunogenicidad de los antígenos, especialmente antígenos útiles en la prevención y el tratamiento de tumores y patógenos intracelulares.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona una cepa recombinante de Listeria que expresa un péptido de fusión de un péptido peptidasa relacionada con la calicreína 3 (KLK3) que está unido de forma operativa a un péptido listeriolisina (LLO) N-terminal no hemolítico, comprendiendo dicho péptido de fusión la secuencia de SEQ ID NO: 54 o una secuencia homóloga al menos al 99% a la misma, en la que dicho péptido LLO N-terminal mejora la inmunogenicidad del péptido de fusión, y en la que el péptido KLK3 no contiene una secuencia de señal. En una realización, la cepa recombinante de Listeria se pasa a través de un huésped animal.

La cepa recombinante de Listeria puede ser una cepa auxótrofa de Listeria o una cepa recombinante de Listeria monocytogenes. La cepa auxótrofa de Listeria puede ser un mutante dal/dat o puede comprender adicionalmente una deleción en el gen endógeno ActA. La cepa auxótrofa de Listeria puede comprender un vector de expresión episomal que comprende una enzima metabólica que complementa la auxotrofía de la cepa auxótrofa de Listeria,y la enzima metabólica puede ser una enzima alanina racemasa o una enzima D-aminoácido transferasa.

La presente invención también proporciona un polipéptido recombinante que comprende un péptido de fusión de un péptido KLK3 que está unido de forma operativa a un péptido LLO N-terminal, en el que dicho polipéptido recombinante comprende la secuencia de SEQ ID NO: 54 o una secuencia homóloga al menos al 99% a la misma, en el que dicho péptido LLO N-terminal potencia la inmunogenicidad del péptido de fusión, y en el que el péptido KLK3 no contiene unasecuencia de señal.Lainvención también proporciona unamoléculanucleotídica quecodifica el polipéptido recombinante, y un vector de vacuna recombinante que codifica el polipéptido recombinante o que comprende la molécula nucleotídica que codifica el polipéptido recombinante.

La presente invención también proporciona una vacuna que comprende la cepa recombinante de Listeria, el polipéptido recombinante o la molécula nucleotídica que codifica el polipéptido recombinante, yun adyuvante.

La invención proporciona la cepa recombinante de Listeria, o una composición inmunogénica que comprende el polipéptido recombinante, o el nucleótido recombinante, para su uso como un medicamento.

La invención proporciona adicionalmente la cepa recombinante de Listeria, o una composición inmunogénica que comprende el polipéptido recombinante o el nucleótido recombinante, para su uso en la inducción de una respuesta inmune anti-KLK3 en un sujeto.

La invención también proporciona la cepa recombinante de Listeria, el polipéptido recombinante, o el nucleótido recombinante, para su uso en el tratamiento, inhibición o supresión de un cáncer de próstata que expresa la proteína peptidasa relacionada con la calicreína 3 (KLK3) en un sujeto, por lo que el sujeto acumula una respuesta inmune frente al cáncer de próstata que expresa la proteína KLK3.

El polipéptido recombinante puede hacerse mediante un proceso que comprende la etapa de conjugar químicamente un polipéptido que comprende el péptido KLK3 con un polipéptido que comprende el péptido LLO Nterminal.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1. Lm-E7 y Lm-LLO-E7 usan diferentes sistemas de expresión para expresar y secretar E7. Lm-E7 se generó introduciendo un cassette de gen en el dominio orfZ del genoma de L. monocytogenes (A). El promotor hly impulsa la expresión de la secuencia de señal hly y los primeros cinco aminoácidos (AA) de LLO seguido de HPV-16 E7. B), Lm-LLO-E7 se generó transformando la cepa prfA-XFL-7 con el plásmido pGG-55. pGG-55 tiene el promotor hly que impulsa la expresión de una fusión no hemolítica de LLO-E7. pGG-55 también contiene el gen prfA para seleccionar la retención del plásmido por XFL-7 in vivo. Figura 2. Lm-E7 y Lm-LLO-E7 secretan E7. Lm-Gag (carril 1), Lm-E7 (carril 2), Lm-LLO-NP (carril 3), LmLLO-E7 (carril 4),XFL-7 (carril 5)y10403S(carril 6)se dejaron crecerduranteuna noche a 37 ºC en caldo Luria-Bertoni. Se granularon números equivalentes de bacterias, como se determinó por DO a 600 nm de absorbancia, y 18 ml de cada sobrenadante se precipitaron con TCA. La expresión de E7 se analizó por transferencia deWestern.La transferencia sesondeó con un mAb anti-E7 seguido de anti-ratón conjugado con HRP (Amersham), y despuésse desarrolló usando reactivos de detección ECL. Figura 3. A. Eficacia inmunoterapéutica tumoral de fusiones LLO-E7. El tamaño del tumor en milímetros en ratones se muestra en 7, 14, 21, 28 y 56 días después de la inoculación del tumor. Ratones sin tratar: triángulos blancos; Lm-LLO-E7: círculos negros; Lm-E7: rombos negros; Lm-Gag: X; y Lm-LLO-NP: símbolo +. B. Eficacia inmunoterapéutica tumoral de fusiones LLO-Ova. Figura 4. Los esplenocitos de ratones inmunizados con Lm-LLO-E7 proliferan cuando se exponen a células TC-1. Los ratones C57BL/6se inmunizaron yse reforzaron con cepas Lm-LLO-E7, Lm-E7 o rLm de control. Los esplenocitos se recuperaron 6 días después del refuerzo y se pusieron en placas con células TC-1 irradiadas en las proporcionadasmostradas. Las célulasse pulsaron con 3H timidina y se recuperaron. Cpm se define como (cpm experimental) -(control no TC-1). Figura 5. Eficacia inmunoterapéutica tumoral del antígeno NP expresada en LM. El tamaño del tumor en milímetros en ratones se muestra en 10, 17, 24 y 38 días después de la inoculación del tumor. Ratones sin tratar: X; ratones a los que se les administró Lm-LLO-NP: rombos negros; Lm-NP: cuadrados; Lm-Gag: círculos negros. Figura 6. Representación de constructos de virus vaccinia que expresan diferentes formas de proteína E7 de HPV16. Figura 7. VacLLOE7 provoca una regresión a largo plazo de tumores establecidos de 2 x 105 células TC-1 inyectadas s.c. en ratones C57BL/6. A los ratones se les inyectó 11 y 18 días después de la estimulación tumoral 107UFPdeVacLLOE7,VacSigE7LAMP-1 o VacE7/ratón i.p.o se dejaronsintratar(sin tratamiento previo). Se usaron ocho ratones por grupo de tratamiento, y se muestra la sección transversal de cada tumor (promedio de dos mediciones) para los días indicados después de la inoculación del tumor. Figura 8. A. Representación esquemática de los insertos plasmídicos usados para crear 4 vacunas de LM. El inserto Lm-LLO-E7 contiene cada uno de los genes de Listeria usados. Contiene el promotor hly, las primeras 1,3 kb del gen hly (que codifica la proteína LLO), y el gen E7 de HPV-16. Las primeras 1,3 kb de hly incluyen lasecuenciade señal(ss)ylaregiónPEST.Lm-PEST-E7 incluye el promotor hly, la secuencia de señal, y las secuencias PEST y E7, pero excluye el resto del gen LLO truncado. Lm-∆PEST-E7 excluye la región PEST, pero contiene el promotor hly, la secuencia de señal, E7, y el resto del gen LLO truncado. Lm-E7epi tiene únicamente el promotor hly, la secuencia de señal y E7. B. Representación esquemática del sistema de expresión pActA-E7 usado para expresar y secretar E7 de bacterias recombinantes de Listeria. El promotor hly (pHLY) impulsa la expresión, el gen prfA se usa para seleccionar la retención del plásmido por Listeria recombinante in vivo. C. Panel superior: Los constructos de Listeria que contienen regiones PEST inducen regresión tumoral. Triángulos negros: ratones sin tratar; círculos: Lm-LLO-E7; cuadrados: Lm-E7epi; símbolo +: Lm-∆PEST-E7; triángulos blancos: Lm-PEST-E7. D. Tamaños tumorales medios el día 28 después de la estimulación del tumor en dos experimentos separados. E. Los constructos de Listeria que contienen regiones PEST inducen un mayor porcentaje de linfocitos E7-específicos en el bazo. Se representan el promedio y ET de los datos de tres experimentos. Figura 9. Tamaño del tumor en ratones a los que se les administró Lm-ActA-E7 (cuadrados blancos), Lm-E7 (círculos negros), Lm-LLO-E7 (X), y ratones sin tratar (no vacunados; triángulos blancos). Figura 10. A. Inducción de linfocitos T CD8+ que secretan IFN-gamma específicos de E7 en los bazos y el número que penetra en los tumores, en ratones a los que se les administró células tumorales TC-1 y posteriormente se les administró Lm-E7, Lm-LLO-E7, Lm-ActA-E7 o ninguna vacuna (sin tratar). B. Inducción y penetración de células CD8+ específicas de E7 en los bazos y tumores de los ratones descritos para (A). Figura 11. Los constructos de Listeria que contienen regiones PEST inducen un mayor porcentaje de linfocitos específicos de E7 en el tumor. A. Datos representativos de un experimento. B. Promedio y ET de datos de los tres experimentos. Figura 12. Mapa esquemático de pAdv34 en pGG55. CAT(G-), cloranfenicol acetiltransferasa para E. coli; CAT(G+), cloranfenicol acetiltransferasa para Lm; Ori, región de replicación; prfA, factor A regulador de la patogenicidad de Lm; LLO-PSA, fusión entre el gen que codifica una listeriolisina O truncada en C-terminal, incluyendo su promotor, y el gen que codifica PSA humano. Figura 13. Expresión y secreción de la proteína de fusión LLO-PSA por Lm-LLO-PSA. Las bacterias se dejaron crecer durante una noche y los sobrenadantes celulares se precipitaron en presencia de TCA al 10% a 4 ºC. Las proteínas se separaron por SDS-PAGE y se eliminaron con anticuerpos anti-PSA (A) y anti-LLO (B). El control positivo de PSA fue un lisado de células BscI infectado con PSA/vaccinia. La cepa bacteriana precursora XFL7 y dos cepas irrelevantes de Lm que expresan fragmentos del antígeno humano Her2/neu se usaron como controles negativos. Figura 14. Captación y crecimiento de Lm-LLO-PSA en macrófagos. Las células tipo macrófagos murinos (J774A.1) se infectaron in vitro con MOI de 1:1 con Lm-LLO-PSA, la cepa precursora de Lm XFL7 o la cepa de Lm de tipo salvaje 10403s. El crecimiento intracelular se controló durante 8 horas tomando muestras por duplicado cada dos horas de las células seguido de valoración de las bacterias sobre placas BHI. UFC: Unidades Formadoras de Colonias. Figura 15. Regresión tumoral después de la inmunización con Lm-LLO-PSA. Grupos de 8 ratones se inocularon s.c. con 5 x 106 células T-PSA23 el día 0 y se inmunizaron tres veces con intervalos de una semana, i.p. con Lm-LLO-PSA, Lm-LLO-E7 o no recibieron inmunización (sin tratar). Los tumores se controlaron semanalmente usando un calibre electrónico y se expresan como la media de dos diámetros perpendiculares. Los ratones se sacrificaron cuando los tumores alcanzaron un tamaño de 15-18 mm de diámetro.Los resultadosse representancomotamaño tumoraldecada ratón individual.La tablamuestrael número de ratones en cada grupo que estaban libres de tumores (panel superior) o que sobrevivieron (panel inferior) con respecto al número total de ratones por grupo 1 semana o 7-8 semanas después de la inoculación del tumor. Este experimento se repitió tres vecesmostrando resultados similares. Figura 16. Linfocitos T CD8+ PSA específicos en bazos y tumores. Se implantaron células T-PSA23 s.c. como una mezcla con matrigel. Los ratones se inmunizaron dos veces con Lm-LLO-PSA o Lm-LLO-E7 o se dejaron sin tratar. Los bazos y los tumores se extrajeron 6 días después de la segunda inmunización y se ensayaron para comprobar la presencia de linfocitos T CD8+/tetrámero PSA positivo mediante un análisis FACS. Las inmunizaciones con Lm-LLO-PSA dieron como resultado la generación de linfocitos T CD8+ PSA específicos tanto en bazos(panelsuperior)como en tumores(panelinferior).Losnúmerosdecada esquina indican el % de células PSA positivassobre el número total de linfocitos T CD8+ en cada tejido. Figura 17. Efecto de la vacunación con vacunas de Lm sobre la presencia de Tregs en bazos y tumores. Los esplenocitos aislados y los TIL extraídos de 3 ratones portadores de tumor en el experimento anteriorse agruparon y se tiñeron para CD4, CD25 y FoxP3 para concretar el efecto de la inmunización con Lm-LLO-PSA sobre la presencia de Tregs en estos tejidos. Cada columna presenta el % de población de linfocitos T CD25+/FoxP3+ en relación con los linfocitos CD4+ totales en cada grupo. Figura 18. Secreción de IFN-γ estimulada por la vacunación con Lm-LLO-PSA detectada por ensayo ELISpot. Los ratones se inmunizaron tres veces con 0,1 DL50 de Lm-LLO-PSA. Los esplenocitos aislados se prepararon y se incubaron durante una noche en presencia de un péptido H2Db PSA específico 1 µM, HCIRNKSVIL. La secreción de IFN-γ por células aisladas se detectó usando el kit ELISpot de Mabtech y se expresó como células formadoras de puntos (SFC)/millón de células. Se usaron esplenocitos de Lm-LLOWT1 inmunizado o ratones sin tratar como controles negativos (* indica la importancia estadística con los grupos sin tratar con p<0,0001). Figura 19. Producción de IFN-γ estimulada por la vacuna con Lm-LLO-PSA detectada por tinción intracelular. Los ratones se inmunizaron tres veces con 0,1 DL50 de Lm-LLO-PSA. Los esplenocitos aisladosse prepararon y se incubaron durante 5 horas en presencia de un péptido H2DbPSA específico. La producción de IFN-γ por linfocitos T CD8+ activados se determinó como se describe en los métodos. Se usaron esplenocitos de Lm-LLO-WT1 inmunizado o ratones sin tratar como controles negativos. Figura 20. Respuestas citotóxicas específicas de PSA en ratones. Los animales se inmunizaron tres veces con 0,1 DL50 de Lm-LLO-PSA, Lm-LLO-HPV16E7E6 (como control negativo de Lm) o se dejaron sin tratar. Los esplenocitos aislados se prepararon y se incubaron con células estimuladoras de expresión de PSA durante 5 días. El ensayo CTL se realizó durante 4 horas incubando células efectoras (E) con células EL4 diana pulsadas con péptido H2Db PSA: A) a una relación E:T diferente/concentración peptídica fija (1 µM); o B) a una relación E:T fijada de 1:25 pero diferentes concentraciones peptídicas. Figura 21. Comparación de los efectos anti-tumorales de Lm-LLO-PSA con otras vacunas basadas en PSA. Grupos de 8 ratones se inocularon s.c. con 5 x 106 células T-PSA23 el día 0 y se inmunizaron dos veces con intervalos de una semana, con Lm-LLO-PSA, vaccinia-PSA o pDNA (PSA+GM-CSF) o no recibieron inmunización (sin tratar). Los tumores se controlaron semanalmente usando un calibre electrónico y se expresan como la media de dos diámetros perpendiculares. Los ratones se sacrificaron cuando los tumores alcanzaron un tamaño de 20 mm de diámetro. Los resultados se representan como el tamaño tumoral de cada ratón individual (A). La tabla muestra el número de ratones en cada grupo que no tenían tumores o que sobrevivieron durante 8 semanas después de la inoculación del tumor. B) Promedio de los tamaños tumorales en cada grupo. Cuando los tumores alcanzaron un tamaño de 20 mm, los ratones se sacrificaron. Se les dio un valor de 20 mm para hacer la curva promedio. Este experimento se repitió dos veces mostrando resultados similares. Figura 22. Estabilidad de Lm-PSA. Lm-PSA se dejó crecer y se pasó durante 7 días consecutivos in vitro. El ADN plasmídico se purificó a partir de muestras bacterianas tomadas cada día durante el crecimiento in vitro y se ensayó por amplificación del gen PSA por PCR (A) o mapeo de restricción EcoRI/HindIII del plásmido (B).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona péptidos de fusión KLK3-LLO, péptidos recombinantes que comprenden los mismos, moléculas nucleotídicas recombinantes que codifican los mismos, cepas recombinantes de Listeria que comprenden los mismos, y métodos inmunogénicos y terapéuticos que utilizan losmismos.

Específicamente, la presente invención proporciona una cepa recombinante de Listeria que expresa un péptido de fusión de un péptido peptidasa relacionada con la calicreína 3 (KLK3) que está unido de forma operativa a un péptido listeriolisina (LLO)N-terminal no hemolítico,comprendiendodicho péptido de fusiónlasecuencia de SEQID NO: 54 o unasecuencia homóloga al menos al 99% a la misma, en la que dicho péptido LLO N-terminal potencia la inmunogenicidad del péptido de fusión, y en la que el péptido KLK3 no contiene una secuencia de señal. En una realización, la cepa recombinante de Listeria puede haberse pasado a través de un huésped animal.

La presente invención también proporciona una vacuna que comprende la cepa recombinante de Listeria, el polipéptido recombinante o la molécula nucleotídica que codifica el polipéptido recombinante, y un adyuvante.

En una realización, la presente invención proporciona una cepa recombinante de Listeria que expresa un péptido de fusión peptidasa relacionada con la calicreína 3 (KLK3)-LLO, comprendiendo dicho péptido de fusión la secuencia de SEQ ID NO: 54 o una secuencia homóloga al menos al 99% a la misma. En otra realización, la secuencia del péptido KLK3 en la proteína de fusión se selecciona entre las SEQ ID NOs: 25, 32, 34 y 39. En otra realización, la secuencia del péptido KLK3 comprende una secuencia seleccionada entre la SEQ ID No: 25, 32, 34 y 39. En otra realización, el péptido KLK3 es un fragmento inmunogénico de un péptido KLK3 mayor, en el que la secuencia del péptido KLK3 mayor es una secuencia seleccionada entre SEQ ID No: 25, 32, 34 y 39. En otra realización, la secuencia del péptido KLK3 comprende un fragmento inmunogénico de una secuencia seleccionada entre SEQ ID No: 25, 32, 34 y 39.

El "péptidoKLK3"está carente delpéptidodeseñalKLK3.En otrarealización,la expresiónserefiere auna proteína KLK3 que contiene toda la secuencia KLK3 excepto el péptido señal KLK3. "Secuencia de señal KLK3" se refiere, en otra realización, a cualquier secuencia de señal que se encuentra en la naturaleza en una proteína KLK3. En otra realización, una proteína KLK3 de los métodos y composiciones de la presente invención no contiene ninguna secuencia de señal.

En una realización, "variante" se refiere a una secuencia aminoacídica o de ácidos nucleicos (o en otras realizaciones, un organismo o tejido) que es diferente de la mayor parte de la población pero aún es lo suficientemente similar al modo común para considerarse como una de ellos, por ejemplo variantes de corte y empalme.

En una realización, "isoforma" se refiere a una versión de una molécula, por ejemplo, una proteína, únicamente con ligeras diferencias en comparación con otra isoforma, o versión, de la misma proteína. En una realización, las isoformas pueden producirse a partir de genes diferentes pero relacionados, o en otra realización, pueden surgir del mismo gen corte y empalme alternativo. En otra realización, las isoformas son causadas por polimorfismos de un único nucleótido.

En una realización, "fragmento" se refiere a una proteína o polipéptido que es más corto o comprende menos aminoácidos que la proteína o polipéptido de longitud completa. En otra realización, fragmento se refiere a un ácido nucleico que es más corto o comprende menos nucleótidos que el ácido nucleico de longitud completa. En otra realización, el fragmento es un fragmento N-terminal. En otra realización, el fragmento es un fragmento C-terminal. En una realización, el fragmento es una sección intrasecuencial de la proteína, el péptido o el ácido nucleico. En una realización, el fragmento es un fragmento funcional. En otra realización, el fragmento es un fragmento inmunogénico. En una realización, un fragmento tiene 10-250 ácidos nucleicos o aminoácidos.

En una realización, un "homólogo" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos o aminoacídica que comparte un cierto porcentaje de identidad de secuencia con una secuencia de ácidos nucleicos o aminoacídica particular. En otra realización,unasecuencia útil en la composiciónylosmétodosque seproporcionan en el presentedocumento, puede ser un homólogo de cualquiersecuencia descrita en el presente documento. En una realización, un homólogo comparte al menos un 99% de identidad con una secuencia particular. En una realización, se entenderá que un homólogo de cualquiera de las secuencias que se proporcionan en el presente documento y/o que se describen en el presente documento se considerará como parte de la invención.

En una realización, "heterólogo" como se usa en el presente documento, describe un ácido nucleico, aminoácido, péptido, polipéptido, proteína, etc., que se obtienen a partir de una especie diferente de la especie de referencia. Por lo tanto, por ejemplo, una cepa de Listeria que expresa un polipéptido heterólogo, en una realización, expresará un polipéptido que no es nativo o endógeno a la cepa de Listeria, o en otra realización, un polipéptido que no se expresa normalmente por la cepa de Listeria, o en otra realización, un polipéptido de una fuente distinta de la cepa de Listeria.

En una realización, "endógeno" como se usa en el presente documento, describe un ácido nucleico, aminoácido, péptido, polipéptido, proteína, etc. que se ha desarrollado o generado dentro del organismo de referencia o que ha surgido por causas dentro del organismo de referencia. En otra realización, endógeno se refiere a nativo.

En otra realización, la peptidasa relacionada con la calicreína 3 (proteína KLK3) que es la fuente de un péptido KLK3 de losmétodos y composiciones de la presente invención, es una proteína PSA.

En otra realización, la proteína KLK3 es una proteína KLK3 madura. En otra realización, la proteína KLK3 es una proteína pro-KLK3. En otra realización, la secuencia líder se ha eliminado de una proteína KLK3 madura de los métodos y composiciones de la presente invención. Un ejemplo de una proteína KLK3 madura se codifica por aa378-1088 de SEQ ID No: 40.

En otra realización, la proteína KLK3 que es la fuente de un péptido KLK3 de los métodos y composiciones de la presente invención, es una proteína KLK3 humana.

En otra realización, la proteína KLK3 tiene la secuencia de SEQ ID No: 25 (GenBank Nº de Acceso X14810). En otra realización, la proteína KLK3 es un fragmento de SEQ ID No: 25.

En otra realización, la proteína KLK3 se codifica por una molécula nucleotídica que tiene la secuencia de SEQ ID No: 26 (GenBank Nº de Acceso X14810). En otra realización, la proteína KLK3 se codifica por los residuos 401-446, 1688-1847, 3477-3763, 3907-4043, 5413-5568, o una combinación de los mismos, de SEQ ID No: 26. En otra realización, la proteína KLK3 se codifica por un homólogo de SEQ ID No: 26. En otra realización, la proteína KLK3 se codifica por una variante de SEQ ID No: 26. En otra realización, la proteína KLK3 se codifica por una isoforma de SEQ ID No: 26. En otra realización, la proteína KLK3 se codifica por un fragmento de SEQ ID No: 26.

En otra realización, la proteína KLK3 tiene la secuencia de SEQ ID No: 32 (GenBank Nº de Acceso NM_001648). En otra realización, la proteína KLK3 es un fragmento de SEQ ID No: 32.

En otra realización, la proteína KLK3 se codifica por una molécula nucleotídica que tiene la secuencia de SEQ ID No: 33 (GenBank Nº de Acceso NM_001648). En otra realización, la proteína KLK3 se codifica por los residuos 42827 deSEQIDNo:33.Enotra realización,la proteínaKLK3secodificaporunhomólogodeSEQIDNo:33.Enotra realización, la proteína KLK3 se codifica por una variante de SEQ ID No: 33. En otra realización, la proteína KLK3 se codifica por una isoforma de SEQ ID No: 33. En otra realización, la proteína KLK3 se codifica por un fragmento de SEQ ID No: 33.

En otra realización, la proteína KLK3 tiene la secuencia de SEQ ID No: 34 (GenBank Nº de Acceso BC056665). En otra realización, la proteína KLK3 es un fragmento de SEQ ID No: 34.

En otra realización, la proteína KLK3 se codifica por una molécula nucleotídica que tiene la secuencia de SEQ ID No: 35 (GenBank Nº de Acceso BC056665). En otra realización, la proteína KLK3 se codifica por los residuos 47-832 de SEQ ID No: 35. En otra realización, la proteína KLK3 se codifica por un homólogo de SEQ ID No: 35. En otra realización, la proteína KLK3 se codifica por una variante de SEQ ID No: 35. En otra realización, la proteína KLK3 se codifica por una isoforma de SEQ ID No: 35. En otra realización, la proteína KLK3 se codifica por un fragmento de SEQ ID No: 35.

En otra realización, la proteína KLK3 tiene la secuencia de SEQ ID No: 39 (GenBank Nº de Acceso AJ459783). En otra realización, la proteína KLK3 es un fragmento de SEQ ID No: 39.

En otra realización, la proteína KLK3 se codifica por una molécula nucleotídica que tiene la secuencia de SEQ ID No: 40 (GenBank Nº de Acceso X07730). En otra realización, la proteína KLK3 se codifica por los residuos 67-1088 de SEQ ID No: 40. En otra realización, la proteína KLK3 se codifica por un homólogo de SEQ ID No: 40. En otra realización, la proteína KLK3 se codifica por una variante de SEQ ID No: 40. En otra realización, la proteína KLK3 se codifica por una isoforma de SEQ ID No: 40. En otra realización, la proteína KLK3 se codifica por un fragmento de SEQ ID No: 40.

En otra realización, la proteína KLK3 tiene una secuencia expuesta en uno de los siguientes Números de Acceso al GenBank: BC005307, AJ310938, AJ310937, AF335478, AF335477, M27274 y M26663. En otra realización, la proteína KLK3 se codifica por una secuencia expuesta en uno de los anteriores Números de Acceso al GenBank.

En otra realización, la proteína KLK3 se codifica por una secuencia expuesta en uno de los siguientes Números de Acceso al GenBank: NM_001030050, NM_001030049, NM_001030048, AJ459782, AJ512346 o AJ459784.

En otra realización, la proteína KLK3 tiene la secuencia que comprende una secuencia expuesta en uno de los siguientes Números de Acceso al GenBank: X13943, X13942, X13940, X13941 y X13944.

En otra realización, la presente invención proporciona una vacuna que comprende una cepa recombinante de Listeria de la presente invención y un adyuvante.

En otra realización, la presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende una cepa recombinante de Listeria de la presente invención.

En otra realización, la cepa recombinante de Listeria expresa un polipéptido recombinante que comprende un péptido de fusión KLK3:LLO. En otra realización, la cepa recombinante de Listeria comprende un polipéptido recombinante, en la que el péptido recombinante comprende un péptido de fusión KLK3:LLO. En otra realización, la cepa recombinante de Listeria comprende un nucleótido recombinante que codifica el polipéptido recombinante.

El péptido de fusión KLK3:LLO expresado por la cepa recombinante de Listeria potencia la inmunogenicidad del péptido KLK3.

El péptido no KLK3/no FOLH1 en el péptido de fusión de la presente invención es un péptido LLO, que en otra realización, puede ser un péptido no hemolítico LLO.

En otra realización, la presente invención proporciona una cepa recombinante de Listeria que comprende un polipéptido recombinante de la presente invención. En otra realización, la presente invención proporciona una cepa recombinante de Listeria que comprende un nucleótido recombinante que codifica un polipéptido recombinante de la presente invención. En otra realización, la cepa de vacuna de Listeria es una cepa de la especie Listeria monocytogenes (LM). En otra realización, la presente invención proporciona una composición que comprende la cepa de Listeria. En otra realización, la presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende la cepa de Listeria.

En otra realización, la cepa de Listeria es una cepa recombinante de Listeria seeligeri. En otra realización, la cepa de Listeria es una cepa recombinante de Listeria grayi. En otra realización, la cepa de Listeria es una cepa recombinante de Listeria ivanovii. En otra realización, la cepa de Listeria es una cepa recombinante de Listeria murrayi. En otra realización, la cepa de Listeria es una cepa recombinante de Listeria welshimeri. En otra realización, la cepa de Listeria es una cepa recombinante de cualquier otra especie de Listeria conocida en la técnica.

En otra realización, una cepa recombinante de Listeria de la presente invención se ha pasado a través de un huésped animal. El pase puede maximizar la eficacia de la cepa como un vector de vacuna, estabilizar la inmunogenicidad de la cepa de Listeria, estabilizar la virulencia de la cepa Listeria, aumentar la inmunogenicidad de la cepa de Listeria, aumentar la virulencia de la cepa Listeria, eliminar las sub-cepas inestables de la cepa de Listeria, y/o reducir la prevalencia de sub-cepas inestables de la cepa de Listeria. En otra realización, la cepa de Listeria contiene una inserción genómica del gen que codifica el péptido KLK3. En otra realización, la cepa de Listeria lleva un plásmido que comprende el gen que codifica el péptido de fusión recombinante KLK3:LLO. Se conocen bien en la técnica métodos para pasar una cepa recombinante de Listeria a través de un huésped animal, y se describen, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 2006/0233835. En otra realización, el pase se realiza mediante cualquier otro método conocido en la técnica.

En otra realización, la cepa recombinante de Listeria utilizada en los métodos de la presente invención se ha almacenado en un banco de células congeladas o en un banco de células liofilizadas. El banco de células puedeser un banco de células maestro, un banco de células de trabajo, y/o un banco de células de buenas prácticas de fabricación (GMP, Good Manufacturing Practice). El banco de células puede diseñarse para la producción de material de grado clínico, y/o conforme a las prácticas reguladoras para su uso en seres humanos.

Las "buenas practicas de fabricación" se definen, en otra realización, por (21 CFR 210-211) del Código de Reglamentos Federales de los Estados Unidos. En otra realización, las "buenas prácticas de fabricación" se definen mediante otros estándares para la producción de materialde gradoclínico o parael consumo humano;porejemplo, estándares de un país distinto de Estados Unidos.

En otra realización, una cepa recombinante de Listeria utilizada en la presente invención es de un lote de dosis de vacunas,o procede de unstockcongelado o un stock liofilizado producido por un método desvelado en el presente documento.

En otra realización, un banco de células, stock congelado o lote de dosis de vacunas de la presente invención muestra una viabilidad tras la descongelación de más del 90%. En otra realización, la congelación se sigue del almacenamiento para crioconservación o almacenamiento congelado durante 24 horas. En otra realización, el almacenamiento es durante 2 días, 3 días, 4 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 5 meses, 6 meses, durante 9 meses, o el almacenamiento es durante 1 años.

En otra realización, un banco de células, unstock congelado o un lote de dosis de vacunas de la presente invención se crioconserva mediante un método que comprende cultivar un cultivo de la cepa de Listeria en un medio nutritivo, congelar el cultivo en una solución que comprende glicerol, y almacenar la cepa de Listeria por debajo de -20 grados Celsius. En otra realización, la temperatura es de aproximadamente -70 grados Celsius. En otra realización, la temperatura es de aproximadamente -70--80 grados Celsius.

En otra realización, un bance de células, un stock congelado o un de dosis de vacunas de la presente invención se crioconserva mediante un método que comprende cultivar un cultivo de la cepa de Listeria en un medio definido (como se ha descrito anteriormente), congelar el cultivo en una solución que comprende glicerol, y almacenar la cepa de Listeria por debajo de -20 grados Celsius. En otra realización, la temperatura es de aproximadamente -70 grados Celsius. En otra realización, la temperatura es de aproximadamente -70 --80 grados Celsius. En otra realización, cualquiermedio microbiológico definido puede usarse en este método.

En otra realización, el cultivo (por ejemplo, el cultivo de una cepa de vacuna de Listeria que se usa para producir un lote de dosis de vacuna de Listeria)se inocula de un banco de células. En otra realización, el cultivo se inocula de un stock congelado. En otra realización, el cultivo se inocula de un cultivo masa levada. En otra realización, el cultivo se inocula de una colonia. En otra realización, el cultivo se inocula en la fase media del crecimiento logarítmico. En otra realización, el cultivo se inocula en aproximadamente la fase media del crecimiento logarítmico. En otra realización, el cultivo se inocula en otra fase de crecimiento.

La solución usada para la congelación puede contener otro aditivo coligativo o aditivo con propiedades anticongelantes, en lugar o además de glicerol. En otra realización, el aditivo es manitol, DMSO, sacarosa u cualquier otro aditivo coligativo o aditivo con propiedades anti-congelantes que se conoce en la técnica.

El medio nutritivo utilizado para cultivar un cultivo de una cepa de Listeria puede ser LB, TB o un caldo Terrific modificado sin productos animales. En otra realización, el medio nutritivo es un medio definido. En otra realización, el medio nutritivo es un medio definido de la presente invención. En otra realización, elmedio nutritivo es cualquier otro tipo de medio nutritivo conocido en la técnica.

La etapa de cultivo puede realizarse en un matraz agitador, tal como un matraz agitador apantallado, en un fermentador por lotes, en un tanque o matraz agitado, en un fermentador de tipo airlift, en un reactor por lotes alimentado, en un reactor celular continuo, o en un reactor de células inmovilizadas.

En otra realización, se mantiene un pH constante durante el crecimiento del cultivo (por ejemplo, en un fermentador por lotes). En otra realización, el pH se mantiene a aproximadamente 7,0, aproximadamente 6, aproximadamente 6,5, aproximadamente 7,5, o el pH es aproximadamente 8. En otra realización, el pH es 6,5-7,5. En otra realización, el pH es 6-8. En otra realización, el pH es 6-7. En otra realización, el pH es 7-8.

En otra realización,semantiene unatemperatura constantedurante el crecimiento delcultivo.En otrarealización,la temperatura se mantiene a aproximadamente 37 ºC. En otra realización, la temperatura es 37 ºC, 25 ºC, 27 ºC, 30 ºC, 34 ºC, 36 ºC, 38 ºC, o en otra realización, la temperatura es 39 ºC.

En otra realización, se mantiene una concentración de oxígeno disuelto constante durante el crecimiento del cultivo. En otra realización, la concentración de oxígeno disuelto se mantiene al 20% de saturación. En otra realización, la concentración es del 15% de saturación, o del 16% de saturación, o del 18%, o del 22%, o del 25%, o del 30%, o del 35%, o del 40%, o del 45%, o del 50%, o del 55%, o del 60%, o del 65%, o del 70%, o del 75%, o del 80%, o del 85%, o del 90%, o del 95%, o del 100% de saturación, o casi el 100% de saturación.

En otra realización, el cultivo de Listeria se ultracongela en nitrógeno líquido seguido de almacenamiento a la temperatura de congelación final. En otra realización, el cultivo se congela de manera más gradual; por ejemplo colocando un vial del cultivo en la temperatura de almacenamiento final.

En otra realización, la temperatura de almacenamiento del cultivo está entre -20 y -80 grados Celsius (ºC). En otra realización, la temperatura está significativamente por debajo de -20 ºC. En otra realización, la temperatura no es mayor de -70 ºC, o es -70 ºC o es aproximadamente -70 ºC. En otra realización, la temperatura es -20 ºC o aproximadamente -20 ºC, -30 ºC, -40 ºC, -50 ºC, -60 ºC, -80 ºC, -30 ºC--70 ºC, -40 ºC--70 ºC, -50 ºC--70 ºC, -60 ºC--70 ºC, -30 ºC--80 ºC, -40 ºC--80 ºC, -50 ºC--80 ºC, -60 ºC--80 ºC, -70 ºC--80 ºC, o la temperatura es más fría de -70 ºC o más fría de -80 ºC.

Se conocen bien en la técnica por lo expertos en la técnica métodos para la liofilización y crioconservación de cepas recombinantes de Listeria.

La composición que contiene Listeria es, en otra realización, una composición inmunogénica. En otra realización, la composición es inherentemente inmunogénica comprendiendo en virtud de esto una cepa de Listeria de la presente invención. En otra realización, la composición comprende adicionalmente un adyuvante.

En algunas realizaciones, la expresión "que comprende" se refiere a la inclusión de otros polipéptidos recombinantes, secuencias aminoacídicas o secuencias de ácidos nucleicos, así como la inclusión de otros polipéptidos, secuencias aminoacídicas o secuencias de ácidos nucleicos, que pueden conocerse en la técnica, que en una realización pueden comprender antígenos o polipéptidos de Listeria, secuencias aminoacídicas o secuencias de ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, la expresión "que consiste básicamente en" se refiere a una composición para su uso en los métodos que se proporcionan en el presente documento, que tiene el polipéptido recombinanteespecífico,lasecuencia aminoacídicaolasecuencia de ácidonucleico ounfragmento delmismo.Sin embargo, pueden incluirse otros polipéptidos, secuencias aminoacídicas o secuencias de ácidos nucleicos que no están implicados directamente en la utilidad del polipéptido o polipéptidos recombinantes. En algunas realizaciones, la expresión "que consiste en" se refiere a una composición para su uso en los métodos que se proporcionan en el presente documento que tiene un polipéptido recombinante particular, una secuencia aminoacídica, o una secuencia de ácidos nucleicos, o un fragmento o combinación de polipéptidos recombinantes, secuencias aminoacídicas o secuencias de ácidos nucleicos o fragmentos como se describe en el presente documento.

En otra realización, la presente invención proporciona un polipéptido recombinante, que comprende un péptido KLK3 unido de forma operativa a un péptido LLO que potencia la inmunogenicidad del péptido KLK3.

Como se proporciona en el presente documento, una cepa recombinante de Listeria que expresa una fusión LLO-KLK3 protege los ratones contra tumores y provoca la formación de CTL específicos de antígeno. Por lo tanto, las cepas de Listeria que expresan antígenos específicos de próstata (por ejemplo, antígeno específico de próstata/KLK3) son antigénicas y eficaces en los métodos de vacunación. Adicionalmente, las fusiones de LLO y fragmentos de las mismas a antígenos específicos de próstata (por ejemplo, antígeno específico de próstata/KLK3) son antigénicas y eficaces en losmétodos de vacunación.

Adicionalmente, como se proporciona en el presente documento, Lm-LLO-E7 induce la regresión de tumores inmortalizados HPV-16 subcutáneos establecidos de ratones C57B1/6 (Ejemplo 1). Además, como se proporciona en el presente documento, Lm-LLO-NP protege a los ratones de RENCA-NP, un carcinoma de células renales (Ejemplo 3). Adicionalmente, como se proporciona en el presente documento, la fusión de antígenos a secuencias de tipo ActA y PEST produce resultados similares. Por lo tanto, las secuencias de tipo LLO, ActA y PEST no hemolíticasson todas eficaces en la potenciación de la inmunogenicidad de los péptidos KLK3, PSCAy FOLH1.

En otra realización, la presente invención proporciona una vacuna que comprende un polipéptido de fusión recombinante de la presente invención y un adyuvante.

En otra realización, la presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende un polipéptido de fusión recombinante de la presente invención.

En otra realización, la presente invención proporciona un vector de vacuna recombinante que codifica un polipéptido de fusión recombinante de la presente invención.

En otra realización, la presente invención proporciona una molécula nucleotídica que codifica un polipéptido de fusión recombinante de la presente invención.

En otra realización, la presente invención proporciona una vacuna que comprende una molécula nucleotídica de la presente invención y un adyuvante.

En otra realización, la presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende una molécula nucleotídica de la presente invención.

En otra realización, la presente invención proporciona un vector de vacuna recombinante que comprende una molécula nucleotídica de la presente invención.

En otras realizaciones, el adyuvante de los métodos y composiciones de la presente invención es Montanide ISA 51. Montanide ISA 51 contiene un aceite metabolizable natural y un emulsionante refinado. En otra realización, el adyuvante es GM-CSF. En otra realización, el adyuvante es KLH. GM-CSF recombinante es un vector de crecimiento de proteína humana, en otra realización, es un vector de levadura (S. cerevisiae). GM-CSF promueve la expansión y diferenciación clonal de las células progenitoras hematopoyéticas, APC, y las células dendríticas y los linfocitos T.

El adyuvante puede ser una citocina, un factor de crecimiento de citocina, una población celular, QS21, adyuvante incompleto de Freund, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, BCG, alumbre, una interleucina, un oligonucleótido CpG no metilado, glucósidos de quill, monofosforil lípido A, liposomas, un mitógeno bacteriano, una toxina bacteriana, o una quimiocina. En otra realización, el adyuvante es cualquier otro tipo de adyuvante conocido en la técnica. En otra realización, la vacuna de la presente invención comprende dos de las adyuvantes anteriores. En otra realización, la vacuna comprende más de dos de los adyuvantes anteriores.

En otra realización, la presente invención proporciona una composición que comprende una cepa recombinante de Listeria de la presente invención para su uso en la inducción de una respuesta inmune anti-KLK3 en un sujeto.

En otra realización, la presente invención proporciona una composición que comprende una cepa recombinante de Listeria de la presente invención, para su uso en el tratamiento de un tumor que expresa KLK3 en un sujeto. En otra realización, el tumor que expresa KLK3 es un cáncer de próstata que expresa KLK3. En otra realización, el tumor que expresa KLK3 es un carcinoma de próstata que expresa KLK3.

En una realización, "tratar" se refiere tanto a un tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas y preventivas, donde el objeto es prevenir o disminuir la afección o trastorno patológico diana como se describe en el presente documento. Por lo tanto, en una realización, tratar puede incluir directamente afectar o curar, suprimir, inhibir, prevenir, reducir la gravedad de, retrasar la aparición de, reducir los síntomas relacionados con la enfermedad, trastorno o afección, o una combinación de los mismos. Por lo tanto, en una realización, "tratar" se refiere, entre otros, a retrasar el avance, acelerar la remisión, inducir la remisión, aumentar la remisión, acelerar la recuperación, aumentar la eficacia de o disminuir la resistencia a productos terapéuticos alternativos, o una combinación de los mismos. En una realización, "prevenir" o "impedir" se refiere, entre otros, a retrasar la aparición de síntomas, prevenir la recidiva de una enfermedad, disminuir el número o frecuencia de episodios de recaída, aumentar la latencia entre episodios sintomáticos, o una combinación de los mismos. En una realización, "suprimir" o "inhibir" o "proteger contra" se refieren, entre otros, a reducir la gravedad de los síntomas, reducir la gravedad de un episodio agudo, reducir el número de síntomas, reducir la incidencia de síntomas relacionados con la enfermedad, reducir la latencia de los síntomas, mejorar los síntomas, reducir los síntomas secundarios, reducir las infecciones secundarias, prolongar la supervivencia del paciente, o una combinación de los mismos.

En otra realización, la presente invención proporciona una composición que comprende una cepa recombinante de Listeria de la presente invención para su uso en la protección de un sujeto humano frente a un tumor que expresa KLK3. En otra realización, el tumor que expresa KLK3 es un cáncer de próstata que expresa KLK3. En otra realización, el tumor que expresa KLK3 es un carcinoma de próstata que expresa KLK3.

Se conocen bien en la técnica métodos para evaluar la eficacia de las vacunas para el cáncer de próstata, y se describen, por ejemplo, en Dzojic H y col. (Adenovirus-mediated CD40 ligand therapy induces tumor cell apoptosis and systemic immunity in the TRAMP-C2 mouse prostate cancer model. Prostate. 2006 Jun 1; 66(8): 831-8), Naruishi K y col. (Adenoviral vector-mediated RTVP-1 gene-modified tumor cell-based vaccine suppresses the development of experimental prostate cancer. Cancer Gene Ther. 2006 Jul; 13(7): 658-63), Sehgal I y col. (Cancer Cell Int. 2006 Aug 23; 6: 21), y Heinrich JE y col. (Vaccination against prostate cancer using a live tissue factor deficient cell line in Lobund-Wistar rats. Cancer Immunol Immunother 2007; 56(5): 725-30).

En otra realización, el modelo de cáncer de próstata usado para ensayar los métodos y composiciones de la presente invención es el modelo de tumor de ratón TRAMP-C1 que expresa PSA (TPSA23). En otra realización, el modelo de cáncer de próstata es un modelo de célula 178-2 BMA. En otra realización, el modelo de cáncer de próstata es un modelo de cáncer de adenocarcinoma PAIII. En otra realización, el modelo de cáncer de próstata es un modelo PC-3M. En otra realización, el modelo de cáncer de próstata es cualquier otro modelo de cáncer de próstata conocido en la técnica.

En otra realización, la vacuna se ensaya en sujetos humanos, y la eficacia se controla usando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, midiendo directamente las respuestas de los linfocitos T CD4+ y CD8+, o midiendo el avance de la enfermedad, por ejemplo, determinando el número o tamaño de metástasis tumorales, o controlando los síntomas de la enfermedad (tos, dolor torácico, pérdida de peso, etc.). Se conocen en la técnica métodos para evaluar la eficacia de una vacuna para el cáncer de próstata en sujetos humanos, y se describen, por ejemplo, en Uenaka A y col. (T cell immunomonitoring and tumor responses in patients immunized with a complex of cholesterol-bearing hydrophobized pullulan (CHP) and NY-ESO-1 protein. Cancer Immun. 2007 Apr 19; 7: 9) y Thomas-Kaskel AK y col. (Vaccination of advanced prostate cancer patients with PSCA and PSA peptide-loaded dendritic cells induces DTH responses that correlate with superior overall survival. Int J Cancer. 2006 Nov 15; 119(10): 2428-34).

En otra realización, la presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende un polipéptido de fusión recombinante de la presente invención para su uso en la inducción de una respuesta inmune anti-KLK3 en un sujeto.

En otra realización, la presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende un polipéptido de fusión recombinante de la presente invención para su uso en el tratamiento de un tumor que expresa KLK3 en un sujeto. En una realización, el tumor que expresa KLK3 es un cáncer de próstata que expresa KLK3. En otra realización, el tumor que expresa KLK3 es un carcinoma de próstata que expresa KLK3.

En otra realización, la presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende un polipéptido de fusión recombinante de la presente invención para su uso en la protección de un sujeto humano contra un tumor que expresa KLK3. En otra realización, el tumor que expresa KLK3 es un cáncer de próstata que expresa KLK3. En otra realización, el tumor que expresa KLK3 es un carcinoma de próstata que expresa KLK3.

En otra realización, la presente invención proporciona una molécula nucleotídica de la presente invención para su uso en la inducción de una respuesta inmune anti-KLK3 en un sujeto.

En otra realización, la presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende una molécula nucleotídica de la presente invención para su uso en el tratamiento de un tumor que expresa KLK3 en un sujeto. En otra realización, el tumor que expresa KLK3 es un cáncer de próstata que expresa KLK3. En otra realización, el tumor que expresa KLK3 es un carcinoma de próstata que expresa KLK3.

En otra realización, la presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende una molécula nucleotídica de la presente invención para su uso en la protección de un sujeto humano contra un tumor que expresa KLK3. En otra realización, el tumor que expresa KLK3 es un cáncer de próstata que expresa KLK3. En otra realización, el tumor que expresa KLK3 es un carcinoma de próstata que expresa KLK3.

En otra realización, la presente invención proporciona una composición que comprende una cepa recombinante de Listeria, en la que la cepa comprende un polipéptido de fusión recombinante de la presente invención, para su uso en la inducción de una respuesta inmune anti-KLK3 en un sujeto.

En otra realización, la presente invención proporciona una composición que comprende una cepa recombinante de Listeria, en la que la cepa comprende un polipéptido de fusión recombinante de la presente invención, para su uso en el tratamiento deuntumorqueexpresa KLK3 enunsujeto.En otra realización,eltumorqueexpresaKLK3esun cáncer de próstata que expresa KLK3. En otra realización, el tumor que expresa KLK3 es un carcinoma de próstata que expresa KLK3.

En otra realización, la presente invención proporciona una composición que comprende una cepa recombinante de Listeria, en la que la cepa comprende un polipéptido de fusión recombinante de la presente invención para su uso en la protección de un sujeto humano contra un tumor que expresa KLK3. En otra realización, el tumor que expresa KLK3 es un cáncer de próstata que expresa KLK3. En otra realización, el tumor que expresa KLK3 es un carcinoma de próstata que expresa KLK3.

En otra realización, la presente invención proporciona una composición que comprende una cepa recombinante de Listeria de la presente invención para su uso en impedir un crecimiento de un tumor de cáncer de próstata que expresa KLK3 en un sujeto.

En otra realización, la presente invención proporciona una composición que comprende una cepa recombinante de Listeria de la presente invención para su uso en la superación de una tolerancia inmune de un sujeto a un tumor de cáncer de próstata que expresa KLK3. En otra realización, la presente invención proporciona una combinación de los tratamientos, que en una realización comprende el cebado con Listeria y el refuerzo con polipéptido.

En otra realización, la presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende un polipéptido de fusión recombinante de la presente invención para su uso en interrumpir el crecimiento de un tumor de cáncer de próstata que expresa KLK3 en un sujeto.

En otra realización, la presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende un polipéptido de fusión recombinante de la presente invención para su uso en la superación de una tolerancia inmune de un sujeto a un tumor de cáncer de próstata que expresa KLK3.

En otra realización, la presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende una molécula nucleotídica de la presente invención para su uso en impedir el crecimiento de un tumor de cáncer de próstata que expresa KLK3 en un sujeto.

En otra realización, la presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende una molécula nucleotídica de la presente invención para su uso en la superación de una tolerancia inmune de un sujeto a un tumor de cáncer de próstata que expresa KLK3.

"Tolerancia" se refiere, en otra realización, a una falta de respuesta del huésped a un antígeno. En otra realización, el término se refiere a una falta de respuesta detectable del huésped a un antígeno. En otra realización, el término se refiere a una falta de inmunogenicidad de un antígeno en un huésped. En otra realización, la tolerancia se mide por la falta de respuesta en un ensayo CTL in vitro. En otra realización, la tolerancia se mide por la falta de respuesta en un ensayo de hipersensibilidad de tipo retardado. En otra realización, la tolerancia se mide por la falta de respuesta en cualquier otro ensayo conocido en la técnica. En otra realización, la tolerancia se determina o se mide como se representa en los Ejemplos en el presente documento.

"Superar" se refiere, en otra realización, a una reversibilidad de la tolerancia por una vacuna. En otra realización, el término se refiere a la atribución de una respuesta inmune detectable por una vacuna. En otra realización, la superación de la tolerancia inmune se determina o se mide como se representa en los Ejemplos en el presente documento.

En otra realización, la presente invención proporciona una cepa de Listeria que expresa KLK3 de la presente invención para su uso en el tratamiento de, o la interrupción del avance de, hiperplasia benigna de próstata (BPH) en un sujeto.

En otra realización, la presente invención proporciona una cepa de Listeria que expresa KLK3 de la presente invención para su uso en el tratamiento de, o la interrupción del avance de neoplasia intraepitelial prostática (PIN) en un sujeto.

En otra realización, la presente invención proporciona un péptido de fusión que contiene KLK3 de la presente invención para su uso en el tratamiento de, o la interrupción del avance de, BPH en un sujeto.

En otra realización, la presente invención proporciona un péptido de fusión que contiene KLK3 de la presente invención para su uso en el tratamiento de, o la interrupción del avance de,PIN en un sujeto

En otra realización, la presente invención proporciona una molécula nucleotídica que codifica la proteína de fusión KLK3 de la presente invención para su uso en el tratamiento de, o la interrupción del avance de, BPH en un sujeto.

En otra realización, la presente invención proporciona una molécula nucleotídica que codifica la proteína de fusión KLK3 de la presente invención para su uso en el tratamiento de, o la interrupción del avance de, neoplasia intraepitelial prostática en un sujeto.

En otra realización, las proteínas de fusión de la presente invención no han de expresarse por LM, pero en su lugar pueden expresarse y aislarse a partir de otros vectores y sistemas celulares usados para la expresión y el aislamiento de proteínas.

Como se proporciona en el presente documento, las fusiones LLO-E7 muestran una eficacia terapéutica significativa. En estos experimentos, se construyó un vector vaccinia que expresa E7 como una proteína de fusión con una forma truncada no hemolítica de LLO. La expresión del producto de fusión LLO-E7 por una placa de vaccinia purificada se verificó por transferencia de Western usando un anticuerpo dirigido contra la secuencia de proteína LLO. Se demostró que Vac-LLO-E7 producía linfocitos T CD8+ específicos para LLO y E7 como se determinó usando los epítopos LLO (91-99) y E7 (49-57) de ratones Balb/c y C57/BL6, respectivamente. Los resultados se confirmaron por un ensayo CTL (Ejemplo 4).

Por lo tanto, la expresión de un antígeno, por ejemplo, KLK3, PSCA o FOLH1, como una proteína de fusión con una forma truncada no hemolítica de de LLO, ActA, o una secuencia tipo PEST en sistemas de células huésped en Listeria y sistemas de células huésped distintos de Listeria da como resultado una mejor inmunogenicidad del antígeno. Aunque los experimentos comparativos se realizaron con vaccinia, se conoce una multitud de otros plásmidos y sistemas de expresión que pueden usarse para expresar estas proteínas de fusión. Por ejemplo, los vectores bacterianos útiles en la presente invención incluyen, pero sin limitación, Salmonella sp., Shigella sp., BCG,

L. monocytogenes y S. gordonii. Además, las proteínas de fusión pueden administrarse por vectores bacterianos recombinantes modificados para escapar de la fusión fagolisosomal y vivir en el citoplasma de la célula. Los vectores virales útiles en la presente invención incluyen, pero sin limitación, vaccinia, avipox, adenovirus, AAV, virus vaccinia NYVAC, cepa modificada de vaccinia Ankara (MVA), virus Semliki Forest, virus de la encefalitis equina Venezolana, herpes virus, y retrovirus. También pueden usarse vectores de ADN desnudos.

En otra realización, una proteína KLK3 expresada por la célula tumoral diana comparte homología completa con el péptido KLK3 (por toda la longitud del péptido) expresado por el vector Listerial. En otra realización, la proteína KLK3 es altamente homóloga (por toda la longitud del péptido) al péptido KLK3 expresado por el vector Listerial. "Altamente homólogo" se refiere, en otra realización, a una homología de más del 90%. En otra realización, la expresión se refiere a una homología de más del 92%. En otra realización, la expresión se refiere a una homología de más del 93%. En otra realización, la expresión se refiere a una homología de más del 94%. En otra realización, la expresión se refiere a una homología de más del 95%. En otra realización, la expresión se refiere a una homología de más del 96%. En otra realización, la expresión se refiere a una homología de más del 97%. En otra realización, la expresión se refiere a una homología de más del 98%. En otra realización, la expresión se refiere a una homología de más del 99%. En otra realización, la expresión se refiere a una homología del 100%.

El péptido KLK3 de la proteína de fusión de la presente invención tiene, en otra realización, 240-261 aminoácidos (AA) de longitud. En otra realización, la longitud es de 250-261 AA. En otra realización, la longitud es de aproximadamente 240 AA. En otra realización, la longitud es de aproximadamente 260 AA.

En otra realización, el fragmento KLK3 consiste en aproximadamente el 90% de la proteína KLK3. En otra realización, el fragmento consiste en aproximadamente el 95% de la misma. En otra realización, el fragmento consiste en aproximadamente el 100% de la misma.

En otra realización, un péptido de fusión KLK3 de la presente invención es un péptido inmunogénico. "Inmunogénico" se refiere, en otra realización, a una capacidad de inducir una respuesta inmune al administrarse a un sujeto. En otra realización, elsujeto es un sujeto humano. En otra realización, la respuesta inmune provocada es una respuesta a linfocitos T. En otra realización, la respuesta inmune provocada es una respuesta a linfocitos T citotóxicos (CTL). En otra realización, la respuesta inmune provocada es detectable. En otra realización, la respuesta inmune provocada puede detectarse por un ensayo in vitro. En otra realización, el ensayo es un ensayo de liberación de citocinas (por ejemplo, clasificación de células activadas por fluorescencia; o FACS). En otra realización, el ensayo es un ensayo de liberación de cromo u otro ensayo de citotoxicidad in vitro.

En otra realización, la presente invención proporciona una vacuna, composición inmunogénica o vector que comprende una cepa recombinante de Listeria de la presente invención para su uso en la reducción del tamaño de un tumor que expresa KLK3. En otra realización, una célula del tumor expresa KLK3.

En otra realización, la presente invención proporciona una cantidad eficaz de una vacuna que comprende: (a) una cepa recombinante de Listeria que comprende un fragmento N-terminal de una proteína LLO fusionada a un péptido KLK3;o(b)un nucleótido recombinanteque codificael polipéptido recombinante parasu uso en lasupresión de una formación de un tumor que expresa KLK3.

En otra realización, la presente invención proporciona una vacuna, composición inmunogénica o vector que comprende un polipéptido de fusión recombinante de la presente invención para su uso en la reducción del tamaño de un tumor que expresa KLK3. En otra realización, una célula del tumor expresa KLK3.

En otra realización, la presente invención proporciona una cantidad eficaz de una vacuna que comprende: (a) un polipéptido recombinante que comprende un fragmento N-terminal de una proteína LLO fusionada a un péptido KLK3;o(b)un nucleótido recombinanteque codificael polipéptido recombinante parasu uso en lasupresión de una formación de un tumor que expresa KLK3.

En otra realización, la presente invención proporciona una vacuna, composición inmunogénica o vector que comprende una molécula nucleotídica recombinante de la presente invención para su uso en la reducción del tamaño de un tumor que expresa KLK3. En otra realización, una célula del tumor expresa KLK3.

En otra realización, la presente invención proporciona una cantidad eficaz de una vacuna que comprende: (a) una molécula nucleotídica recombinante que comprende un fragmento N-terminal de una proteína LLO fusionada a un péptido KLK3; o (b) un nucleótido recombinante que codifica el polipéptido recombinante para su uso en la supresión de una formación de un tumor que expresa KLK3.

En esta invención, el péptido de fusión recombinante de los usos médicos y composiciones de la presente invención es un péptido de fusión LLO-KLK3 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID No: 54. En otra realización, el péptido de fusión tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID No: 54. En otra realización, el péptido de fusión es homólogo a la secuencia expuesta en la SEQ ID No: 54, y tiene un porcentaje de identidad con respecto a SEQ ID No: 54 de más del 99%.

La secuencia de la proteína LLO utilizada para construir vacunas de la presente invención es, en otra realización, un fragmento de SEQ ID NO: 17 (GenBank Nº de Acceso P13128; la secuencia de ácidos nucleicos se expone en el GenBank Nº de Acceso X15127). Los primeros 25 aminoácidos de la proteína correspondiente a esta secuencia son la secuencia de señal y se escinden en LLO cuando se secreta por la bacteria. Por lo tanto, en esta realización, la proteína LLO activa de longitud completa tiene 504 residuos de largo.

En otra realización, "péptido LLO" y "fragmento LLO" se refieren a un fragmento N-terminal de una proteína LLO. En otra realización, la expresión se refiere a una proteína LLO de longitud completa pero no hemolítica. En otra realización, los términos se refieren a una proteína no hemolítica que contiene una mutación puntual en cisteína 484 de la secuencia ID Nº: 17 o un residuo correspondiente de la misma en una proteína LLO homóloga.

En otra realización, el fragmento N-terminal de una proteína LLO utilizada en las composiciones y métodos de la presente invención tiene la secuencia de SEQ ID NO: 18.

Como se desvela en el presente documento, las cepas recombinantes de Listeria que expresan fusiones de secuencia tipo PEST-antígeno inducen inmunidad antitumoral (Ejemplo 5) y generan linfocitos T infiltrantes de tumor específicos de antígeno (Ejemplo 6).

En otra realización de la presente invención, "ácidos nucleicos" o "nucleótido" se refiere a una cadena de al menos dos combinaciones base-azúcar-fosfato. La expresión incluye, en una realización, ADN y ARN. "Nucleótidos" se refiere, en una realización, a las unidades monoméricas de polímeros de ácidos nucleicos. ARN puede ser, en una realización, en forma de un ARNt (ARN de transferencia), ARNsn (ARN pequeño nuclear), ARNr (ARN ribosomal), ARNm (ARN mensajero),ARN anti-sentido,ARN pequeño inhibidor(ARNsi),microARN (ARNmi)yribozimas.Se ha descrito el uso de ARNsi y ARNmi (Caudy AA y col., Genes & Devel 16: 2491-96 y referencias citadas en la presente). ADN puede estar en forma de ADN plasmídico, ADN vírico, ADN lineal, o ADN cromosómico o derivados de estos grupos. Además, estas formas de ADN y ARN pueden de hebra única, de doble hebra, triple o cuádruple hebra. El término también incluye, en otra realización, ácidos nucleicos artificiales que pueden contener otros tipos de estructuras pero las mismas bases. En una realización, el ácido nucleico artificial es un PNA (ácido nucleico peptídico). PNA contienen estructuras peptídicas y bases nucleotídicas y son capaces de unirse, tanto a moléculas de ADN como ARN. En otra realización, el nucleótido es oxetano modificado. En otra realización, el nucleótido se modifica por reemplazo de uno o más enlaces fosfodiéster por un enlace fosforotioato. En otra realización, el ácido nucleico artificial contiene cualquier otra variante de la estructura fosfato de ácidos nucleicos nativos conocidos en la técnica.ElusodeácidosnucleicosfosfotioratoyPNAseconocenporlosexpertos en la técnica,yse describen,por ejemplo, en Neilsen PE, Curr Opin Struct Biol 9:353-57; y Raz NK y col. Biochem Biophys Res Commun. 297: 1075

84. La producción y uso de ácidos nucleicos se conoce por los expertos en la técnica y se describe, por ejemplo, en Molecular Cloning, (2001), Sambrook y Russell, eds. y Methods in Enzymology: Methods for molecular cloning in eukaryotic cells (2003) Purchio y G. C. Fareed.

También se describe en el presente documento un kit que comprende un reactivo utilizado en la realización de la presente invención. En otra realización, la presente invención proporciona un kit que comprende una composición, herramienta o instrumento de la presente invención.

En otra realización, el fragmento LLO se une al péptido KLK3 por conjugación química. En otra realización, se usa paraformaldehído para la conjugación. En otra realización, se usa maleimida para la conjugación. En otra realización, la conjugación se realiza usando cualquier método adecuado conocido en la técnica.

En otra realización, el tumor que expresa KLK3 dirigido por composiciones de la presente invención es un cáncer de próstata que expresa KLK3. En otra realización, el tumor que expresa KLK3 es un carcinoma de próstata que expresa KLK3.

Como se desvela en el presente documento, se demostró una inmunidad mediada por células mejorada para las proteínas de fusión que comprende un antígeno y LLO truncada que contiene la secuencia aminoacídica tipo PEST, SEQ ID NO: 1. La ∆LLO usada en algunos de los Ejemplos tenía 416 aminoácidos de largo (tras la escisión del péptido de señal), ya que se truncaron 88 residuos del extremo carboxi que es inclusivo del dominio de activación que contiene cisteína 484. Sin embargo, es evidente a partir de la presente divulgación que otras ∆LLO sin el dominio de activación, y en particular cisteína 484,son eficaces en los métodos de la presente invención.

Como se proporciona en el presente documento, la fusión de un antígeno a una forma truncada no hemolítica de listeriolisina O (LLO) potenció la inmunogenicidad. Un vector de LM que expresa y secreta un producto de fusión de la cepa del virus del papiloma humano (HPV) 16 E7 y LLO era un inmunoterapéutico de cáncer más potente para tumores inmortalizadosconHPVque laLMquesecretala proteína E7 en solitario.Adicionalmente,un virusvaccinia recombinante que lleva el gen para la proteína de fusión LLO-E7 es un inmunoterapéutico de cáncer más potente para tumores inmortalizados con HPV que una cepa isogénica de vaccinia que lleva el gen para la proteína E7 en solitario. En comparación, una proteína de fusión corta Lm-AZ/-E7 que comprende el antígeno E7 fusionado al promotor, una secuencia de señal y los primeros 7 residuos AA de LLO era un inmunoterapéutico antitumoral ineficaz. Esta proteína de fusión corta termina directamente antes de la secuencia tipo PEST y no la contiene.

"Proteína de fusión" se refiere, en otra realización, a una proteína que comprende 2 o más proteínas unidas juntas por enlaces peptídicos u otros enlaces químicos. En otra realización, las proteínas se unen juntas directamente por un péptido u otro enlace químico. En otra realización, las proteínas se unen juntas con uno o más aminoácidos (por ejemplo, un "separador") entre las dos o más proteínas.

Las proteínas de fusión que comprenden un péptido KLK3 se preparan, en otra realización, mediante cualquier método adecuado. En otra realización, una proteína de fusión se prepara por clonación y restricción de las secuencias apropiadas o síntesis química directa mediante métodos analizados a continuación. En otra realización, las subsecuencias se clonan y las subsecuencias apropiadas se escinden usando enzimas de restricción apropiadas. Después, los fragmentos se ligan, en otra realización, para producir la secuencia de ADN deseada. En otra realización, el ADN que codifica el péptido KLK3 se produce usando métodos de amplificación de ADN, por ejemplo reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En primer lugar, los segmentos del ADN nativo en cualquier lado del nuevo extremo se amplifican por separado. El extremo 5' de la secuencia amplificada codifica el enlazador peptídico, mientras que el extremo 3' de la otra secuencia amplificada también codifica el enlazador peptídico. Puesto que el extremo 5' del primer fragmento es complementario al extremo 3' del segundo fragmento, los dos fragmentos (después de la purificación parcial, por ejemplo en LMP agarosa) pueden usarse como una plantilla solapante en una tercera reacción por PCR. La secuencia amplificada contendrá codones, el segmento en el lado carboxi delsitiode apertura (formando ahora la secuencia amino),el enlazador,yla secuencia en el ladoamino del sitio de apertura (formando ahora la secuencia carboxilo). El gen que codifica el péptido KLK3 se liga entonces en un plásmido.

En otrarealización,elpéptido KLK3se conjugaconlaproteína LLOtruncadaporcualquierdeunnúmerodemedios bien conocidos por los expertos en la técnica. En otra realización, el péptido KLK3 se conjuga, directamente o a través de un enlazador (separador), con la proteína. En otra realización, en la que tanto el péptido KLK3 como la proteína LLO son polipéptidos, la molécula quimérica se expresa de forma recombinante como una proteína de fusión monocatenaria.

En otra realización, los péptidos y proteínas de la presente invención se preparan fácilmente por síntesis peptídica en fase sólida ya establecida (SPPS) convencional como se describe por Stewart y col. en Solid Phase Peptide Synthesis, 2ª Edición, 1984, Pierce Chemical Company, Rockford, Ill.; y como se describe por Bodanszky y Bodanszky (The Practice of Peptide Synthesis, 1984, Springer-Verlag, New York). Al inicio, un residuo aminoacídico protegido adecuadamentese unea través de sugrupocarboxilo aunsoporte poliméricoderivatizado e insoluble,tal como poliestireno reticulado o resina de poliamida. "Protegido adecuadamente" se refiere a la presencia de grupos protectores tanto en el grupo alfa-amino del aminoácido, como en cualquier grupo funcional de cadena lateral. Los grupos protectores de cadena lateral son generalmente estables a los disolventes, reactivos y condiciones de reacción usadas en toda la síntesis, y pueden eliminarse en condiciones que no afectarán al producto peptídico final. La síntesis por etapas del oligopéptido se realiza por la eliminación del grupo N-protector del aminoácido inicial, y el acoplamiento al mismo del extremo carboxilo del siguiente aminoácido en la secuencia del péptido deseado. Este aminoácido también está protegido adecuadamente. El carboxilo del aminoácido entrante puede activarse para reaccionar con el extremo N del aminoácido unido al soporte mediante formación en un grupo reactivo tal como la formación en una carbodiimida, un anhídrido de ácido simétrico o un grupo de "éster activo" tal como hidroxibenzotriazol o pentafluorofenil ésteres.

Los ejemplos de métodos de síntesis peptídica en fase sólida incluyen el método BOC que utilizó tercbutiloxicarbonilo como el grupo protector alfa-amino, y el método FMOC que utiliza 9-fluorenilmetiloixcarbonilo para proteger el alfa-amino de los residuos aminoacídicos, cuyos ambos métodos se conocen bien por los expertos en la técnica.

La incorporación de grupos de bloqueo N y/o C también pueden conseguirse usando protocolos convencionales a métodos desíntesis de péptidos en fase sólida. Para la incorporación de grupos debloqueo C-terminal, por ejemplo, la síntesis del péptido deseado se realiza típicamente usando, como fase sólida, una resina de soporte que se ha modificado químicamente de manera que la escisión de la resina dé como resultado un péptido que tiene el grupo de bloqueo C-terminal deseado. Para proporcionar péptidos en los que el extremo C lleva un grupo de bloqueo amino primario, por ejemplo, la síntesis se realiza usando una resina de p-metilbenzidrilamina (MBHA) de manera que, cuando la síntesis peptídica se complete, el tratamiento con ácido fluorhídrico libera el péptido amidado Cterminalmente deseado. De forma análoga, la incorporación de un grupo de bloqueo N-metilamina en el extremo C se consigue usando DVB derivado con N-metilaminoetilo, una resina, que tras el tratamiento de HF libera un péptido que lleva un extremo C N-metilamidado. El bloqueo del extremo C por esterificación puede conseguirse usando procedimientos convencionales. Esto implica el uso de una combinación de resina/grupo de bloqueo que permite la liberación de un péptido de cadena lateral de la resina, para permitir una reacción posterior con el alcohol deseado, para formar la función éster. El grupo protector FMOC, en combinación con resina DVB derivada con alcohol metoxialcoxibencilo o enlazador equivalente, puede usarse para este fin, realizándose la escisión del soporte por TFA en dicolorometano. La esterificación de la función carboxilo activado adecuadamente, por ejemplo, con DCC, puede entonces proseguir por la adición del alcohol deseado seguida de la desprotección y el aislamiento del producto peptídico esterificado.

La incorporación de grupos de bloqueoN-terminalpuedeconseguirse mientras queelpéptido sintetizadoestá unido aún a la resina, por ejemplo, mediante tratamiento con un anhídrido y nitrilo adecuados. Para incorporar un grupo de bloqueo acetilo en el extremo N, por ejemplo, el péptido acoplado a la resina puede tratarse con anhídrido acético al 20% en acetonitrilo. El producto peptídico N-bloqueado puede entonces escindirse de la resina, desprotegerse y aislarse posteriormente.

En otra realización, para garantizar que el péptido obtenido a partir de técnicas sintéticas químicas o biológicas es el péptido deseado, se realiza el análisis de la composición peptídica. En otra realización, se realiza un análisis de la composición aminoacídica usando espectrometría de masas de alto rendimiento para determinar el peso molecular del péptido. Como alternativa, o adicionalmente, el contenido aminoacídico del péptido puede confirmarse hidrolizando el péptido en ácido acuoso, y separando, identificando y cuantificando los componentes de la mezcla usando HPLC, o un analizador de aminoácidos. También pueden usarse secuenciadores de proteínas, que degradan secuencialmente el péptido e identifican los aminoácidos en orden, para determinar definitivamente la secuencia del péptido.

En otra realización, antes de su uso, el péptido se purifica para eliminar los contaminantes. A este respecto, se apreciará que el péptido se purificará para cumplir los estándares expuestos por las agencias reguladoras y directrices apropiadas. Uno cualquiera de varios procedimientos de purificación convencionales puede usarse para conseguir el nivel requerido de pureza que incluye, por ejemplo, cromatografía líquido de alto rendimiento (HPLC) de fase inversa usando una columna de sílice alquilada tal como C4, C8 o C18-sílice. Se usa generalmente un gradiente de fase móvil de aumento de conteo orgánico para conseguir la purificación, por ejemplo, acetonitrilo en un tampón acuoso, que contiene normalmente una pequeña cantidad de ácido trifluoroacético. También puede usarse cromatografía de intercambio iónico para separar péptidos en base a su carga.

La síntesis en fase sólida en la que el AA C-terminal de la secuencia se une a un soporte insoluble seguido de la adición secuencialde los aminoácidosrestantes en la secuencia seusa, en otra realización,para la síntesis química de los polipéptidos de esta invención. Las técnicas para la síntesis en fase sólida se describen por Barany y Merrifield en Solid-Phase Peptide Synthesis; págs. 3-284 en The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A., Merrifield y col.J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2156 (1963), y Stewart y col., Solid Phase Peptide Synthesis, 2ª ed. Pierce Chem. Co., Rockford, Ill. (1984).

En otra realización, los péptidos de la presente invención pueden incorporar residuos AA que se modifican sin afectar a la actividad. Por ejemplo, los extremos pueden derivarse para incluir grupos de bloqueo, es decir, sustituyentes químicos adecuados para proteger y/o estabilizar los extremos N y C de una "degradación no deseada", una expresión que pretende incluir cualquier tipo de descomposición enzimática, química o bioquímica del compuesto en sus extremos que es probable que afecte a la función del compuesto, es decir, la degradación secuencial del compuesto en un extremo terminal delmismo.

En otra realización, los grupos de bloqueo incluyen grupos protectores usados convencionalmente en la técnica de la química de péptidos que no afectarán de forma adversa a las actividades in vivo del péptido. Por ejemplo, los grupos de bloqueo N-terminal adecuados pueden introducirse por alquilación o acilación del extremo N. Los ejemplos de grupos de bloqueo N-terminal adecuados incluyen grupos alquilo C1-C5 ramificados o no ramificados, grupos acilo, tales como grupos formilo y acetilo, así como formas sustituidas de los mismos, tales como el grupo acetamidometilo (Acm). Los análogos desamino de aminoácidos son también grupos de bloqueo N-terminal útiles, y pueden acoplarse al extremo N del péptido o se usan en lugar del residuo N-terminal. Los grupos de bloqueo Cterminal adecuados, en los que el grupo carboxilo del extremo C se incorpora o no, incluyen ésteres, cetonas o amidas. Los grupos alquilo formadores de éster o cetona, particularmente grupos alquilo inferiores, tales como metilo, etilo y propilo, y grupos amino formadores de amida, tales como aminas primarias (--NH2), y grupo amino mono ydialquilo,talescomometilamino,etilamino,dimetilamino,dietilamino,metiletilaminoysimilaresson ejemplos de grupos de bloqueo C-terminal. Los análogos de aminoácido descarboxilado, tales como agmatina, son también grupos de bloqueo C-terminal útiles y pueden acoplarse al residuo C-terminal del péptido o se usan en lugar de éste. Adicionalmente, se apreciará que los grupos amino libre y carboxilo en los extremos pueden eliminarse completamente del péptido para producir formas desamino y descarboxiladas de los mismos sin afectar a la actividad del péptido.

En otra realización, se incorporan otras modificaciones sin afectar de forma adversa a la actividad. En otra realización, dichas modificaciones incluyen, pero sinlimitación, la sustitución de uno o más de los aminoácidos en la forma L-isomérica naturalconaminoácidosen la forma D-isomérica.Porlotanto,el péptido puedeincluiruno o más residuos D-aminoacídicos, o puede comprender aminoácidos que son todos de la forma D. También se contemplan formas retro-inversas de péptidos de acuerdo con la presente invención, por ejemplo, péptidos invertidos en los que todos los aminoácidos están sustituidos con formas de D-aminoácidos.

En otra realización, se utilizan péptidos de sales de adición de ácidos de la presente invención como equivalentes funcionales de los mismos. En otra realización, un péptido de acuerdo con la presente invención tratado con un ácido inorgánico, tal como ácido clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico y similares, o un ácido orgánico, tal como un ácido acético, propiónico, glicólico, pirúvico, oxálico, málico, succínico, maleico, fumárico, tartárico, cítrico, benzoico, cinnámico, mandélico, metanosulfónico, etanosulfónico, p-toluenosulfónico, salicílico y similares, para proporcionar una salsoluble en agua del péptido es adecuado para su uso en la invención.

En otra realización, las modificaciones (que normalmente no alteran la secuencia principal) incluyen derivación química in vivo o in vitro de polipéptidos, por ejemplo, acetilación o carboxilación. También se incluyen modificaciones de glicosilación, por ejemplo las que se hacen modificando los patrones de glicosilación de un polipéptido durante susíntesis yprocesamiento o en etapasde procesamiento adicionales;porejemplo,exponiendo el polipéptido a enzimas que afectan a la glicosilación, por ejemplo, enzimas de glicosilación o de desglicosilación mamíferas. También se incluyen secuencias que tienen residuos aminoacídicos fosforilados, por ejemplo, fosfotirosina, fosfoserina o fosfotreonina.

En otra realización, los polipéptidos se modifican usando técnicas biológicas moléculas habituales para mejorar su resistencia a la degradación proteolítica o para optimizar las propiedades de solubilidad o para hacerlos más adecuados como un agente terapéutico. Los análogos de dichos polipéptidos incluyen los que contienen residuos distintos de L-aminoácidos de origen natural, por ejemplo, D-aminoácidos o aminoácidos sintéticos de origen no natural. Los péptidos de la invención no se limitan a los productos de cualquiera de los procesos ejemplares específicos enumerados en el presente documento.

En otra realización, las proteínas de fusión quiméricas de la presente invención se sintetizan usando metodología de ADN recombinante. En general, esto implica crear una secuencia de ADN que codifique la proteína de fusión, poner el ADN en un cassette de expresión, tal como el plásmido de la presente invención, bajo el control de un elemento promotor/regulador particular, y expresar la proteína. El ADN que codifica una proteína de fusión de la presente invención se prepara, en otra realización, mediante cualquier método adecuado, incluyendo, por ejemplo, la clonación y restricción de las células apropiadas o síntesis química directa por métodos tales como el método de fosfotriéster de Narang y col. (1979, Meth. Enzymol. 68: 90-99); el método de fosfodiéster de Brown y col. (1979, Meth. Enzymol 68: 109-151); el método de dietilfosforamidita de Beaucage y col. (1981, Tetra. Lett., 22: 1859-1862); y el método de soporte sólido de la patente de Estados Unidos Nº 4.458.066.

La síntesisquímica produce unoligonucleótidomonocatenario.Se convierte,enotrarealización,enADN bicatenario por hibridación con una secuencia complementaria, o por polimerización con una ADN polimerasa usando la única hebra como una plantilla. Un experto en la técnica reconocerá que mientras que la síntesis de ADN se limita a secuencias de aproximadamente 100 bases, pueden obtenerse secuencias mayores mediante la ligación de secuencias más cortas.

En otra realización, "ácido nucleico aislado" incluye una secuencia de ARN o una secuencia de ADN que codifica una proteína de fusión de la invención, y cualquier forma modificada de la misma, incluyendo modificaciones químicas del ADN o el ARN que hacen la secuencia nucleotídica más estable cuando está libre de células o cuando se asocia a una célula. Las modificaciones químicas de nucleótidos también pueden usarse para potenciar la eficacia con la que una secuencia nucleotídica se recoge por una célula o la eficacia con la que se expresa en una célula. Dichas modificaciones se detallan en otra parte en el presente documento. Cualquier y todas las combinaciones de modificaciones de lassecuencias nucleotídicasse contemplan en la presente invención.

En otra realización, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un péptido KLK3 unido de forma operativa a una secuencia LLO no hemolítica, donde el ácido nucleico aislado comprende adicionalmente una secuencia promotora/reguladora, de tal forma que el ácido nucleico es capaz preferiblemente de dirigir la expresión de la proteína codificada por el ácido nucleico. Por lo tanto, la invención incluye vectores de expresión y métodos para la introducción de ADN exógeno en células con expresión concomitante del ADN exógeno en las células, tales como los descritos, por ejemplo, en Sambrook y col. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York),y en Ausubel y col. (1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York).

En otra realización, un nucleótido de la presente invención está unido de forma operativa a una secuencia promotora/reguladora que impulsa la expresión del péptido codificado en la cepa de Listeria. Las secuencias promotoras/reguladoras útiles para activar la expresión constitutiva de un gen se conocen bien en la técnica e incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, los promotores PhlyA, PActA y p60 de Listeria, el promotor bac de Streptococcus, el promotor sgiA de Streptomyces griseus, y el promotor phaZ de B. thuringiensis. Por lo tanto, se apreciará quelainvenciónincluye eluso de cualquiersecuencia promotora/reguladora queseacapazde impulsarla expresión de la proteína deseada unida de forma operativa a la misma.

La expresión de un péptido KLK3 unido de forma operativa a una secuencia LLO no hemolítica usando un vector permite el aislamiento de grandes cantidades de proteína producida de forma recombinante. Está dentro de la capacidad del experto escoger secuencias promotoras/reguladoras particulares y unir de forma operativa aquellas secuencias promotoras/reguladoras a unasecuencia de ADN que codifica un polipéptido deseado. Dicha tecnología se conoce bien en la técnica y se describe, por ejemplo, en Sambrook y col. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York), y en Ausubel y col. (1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York).

En otra realización, la presente invención proporciona un vector que comprende un ácido nucleico aislado que codifica un péptido KLK3 unido de forma operativa a una secuencia LLO no hemolítica. La incorporación de un ácido nucleico deseado a un vector y la elección de vectores se conoce bien en la técnica como se describe en, por ejemplo, Sambrook y col. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York), y en Ausubel y col. (1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York).

En otra realización, la presente invención proporciona células, virus, provirus y similares, que contienen dichos vectores. Los métodos para producir células que comprenden vectores y/o ácidos nucleicos exógenos se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook y col. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York), y en Ausubel y col. (1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York).

En otra realización, los ácidos nucleicos que codifican un péptido KLK3 unido de forma operativa a una secuencia LLO no hemolítica se clonan en un vector plasmídico. En otra realización, una cepa recombinante de Listeria se transforma con el vector plasmídico.

Una vez armado con la presente invención, es fácilmente evidente para un experto en la técnica que pueden obtenerse otros ácidos nucleicos que codifican un péptido KLK3 unido de forma operativa a una secuencia LLO no hemolítica siguiendo los procedimientos descritos en el presente documento en la sección de detalles experimentales para la generación de otras proteínas de fusión como se desvela en el presente documento (por ejemplo, mutagénesis de sitio dirigido, mutaciones por desplazamiento de marco, y similares), y los procedimientos en la técnica.

Se conocen bien en la técnica métodos para la generación de formas derivadas o variantes de proteínas de fusión, e incluyen, entre otros, usar una metodología de ADN recombinante bien conocida en la técnica, tal como, por ejemplo, la descrita en Sambrook y col. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York) y Ausubel y col. (1997, Current Protocols in Molecular Biology, Green & Wiley, Nueva York), y en otra parte en el presente documento.

En otra realización, la presente invención proporciona un ácido nucleico que codifica un péptido KLK3 unido de forma operativa a una secuencia LLO no hemolítica, donde un ácido nucleico que codifica un polipéptido marcador se une covalentemente al mismo. Es decir, la invención incluye un ácido nucleico quimérico en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido marcador se une covalentemente al ácido nucleico que codifica una proteína que contiene el péptido KLK3. Dichos péptidos marcadores se conocen bien en la técnica e incluyen, por ejemplo, proteína verde fluorescente (GFP), myc, myc-piruvato cinasa (myc-PK), His6, proteína de unión a maltosa (MBP), un polipéptido marcador de hemaglutinina del virus influenza, un polipéptido marcador flag (FLAG), y un polipéptido marcador de glutatión-S-transferasa (GST). Sin embargo, la invención no debe interpretarse de ningún modo como limitada a los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos marcadores que se han enumerado anteriormente. Por el contrario, cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique un polipéptido que puede funcionar de una manera sustancialmente similar a estos polipéptidos marcadores debe interpretarse como incluida en la presente invención.

En otra realización, la presente invención proporciona un péptido de fusión KLK3 con una mejor inmunogenicidad. Es decir, como los datos desvelados en el presente documento demuestran, un péptido KLK3 fusionado a una proteína LLO no hemolítica truncada, al administrarse a un animal, da como resultado una eliminación de los tumores existentes y la inducción de linfocitos citotóxicos específicos de antígeno capaces de infiltrar células tumorales o infectadas. Al disponer de la presente divulgación, y los usos médicos y composiciones que se desvelan en el presente documento, el experto en la técnica reconocerá fácilmente que la presente invención es idónea para el tratamiento y/o prevención de una multitud de enfermedades.

En otra realización, se usa un plásmido disponible en el mercado en la presente invención. Dichos plásmidos están disponibles a partir de una diversas de fuentes, por ejemplo, Invitrogen (Carlsbad, Calif.), Stratagene (La Jolla, Calif.),Clontech (PaloAlto,Calif.),o pueden construirseusandométodos bien conocidosen la técnica.Un plásmido disponible en el mercado tal como pET (Gibbstown, NJ), que es un vector de expresión procariota con un origen de replicación procariota y elementos promotores/reguladores para facilitar la expresión en un organismo procariota.

La presente invención comprende adicionalmente transformar tal cepa de Listeria con un plásmido que comprende

(a) un péptido KLK3; y (b) un ácido nucleico aislado que codifica una proteína LLO truncada. En otra realización, si una cepa de la vacuna de LM comprende una deleción en el gen prfA o el gen actA, el plásmido comprende un gen prfA o actA para complementar la mutación, restaurando así la función para la cepa de la vacuna de L. monocytogenes. Como se describe en otra parte en el presente documento, se conocen bien en la técnica métodos para transformar bacterias, e incluyen métodos basados en células competentes de cloruro cálcico, métodos de electroporación, transducción mediada por bacteriófagos y técnicas de transformación química y física (de Boer y col., 1989, Cell 56: 641-649; Miller y col., 1995, FASEB J., 9: 190-199; Sambrook y col. 1989, Molecular Cloning: A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York;Ausubel y col., 1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York; Gerhardt y col., eds., 1994, Methods for General and Molecular Bacteriology, American Society for Microbiology, Washington, D.C.; Miller, 1992, A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).

El plásmido de la presente invención comprende, en otra realización, una secuencia promotora/reguladora unida operativamente a un gen que codifica una proteína de fusión.

Los plásmidos y otros vectores de expresión útiles en la presente invención se describen en otra parte en el presente documento, y pueden incluir dichas características como una secuencia promotora/reguladora, un origen de replicación para bacterias gram negativas y/o gram positivas, y un ácido nucleico aislado que codifica una proteína de fusión. Adicionalmente, el ácido nucleico aislado que codifica una proteína de fusión tendrá su propio promotor adecuado para impulsar la expresión de tal ácido nucleico aislado. Los promotores útiles para impulsar la expresión en un sistema bacteriano se conocen bien en la técnica, e incluyen bacteriófago lambda, el promotor bla del gen beta-lactamasa de pBR322, y el promotor CAT del gen cloranfenicol acetil transferasa de pBR325. Los ejemplos adicionales de promotores procariotas incluyen los promotores principales derecho e izquierdo del bacteriófago lambda (PL y PR), los promotores trp, recA, lacZ, lacd y gal de E. coli, la alfa-amilasa (Ulmanen y col., 1985. J. Bacteriol. 162: 176-182) y los promotores S28-específicos de B. subtilis (Gilman y col., 1984 Gene 32: 1120), los promotores de los bacteriófagos de Bacillus (Gryczan, 1982, En: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, Inc., Nueva York), y promotores de Streptomyces (Ward y col., 1986, Mol. Gen. Genet. 203: 468478). Se revisan promotores procariotas adicionales contemplados en la presente invención en, por ejemplo, Glick (1987, J. Ind. Microbiol. 1: 277-282); Cenatiempo, (1986, Biochimie, 68: 505-516); y Gottesman, (1984, Ann. Rev. Genet. 18: 415-442). Los ejemplos adicionales de elementos promotores/reguladores contemplados en la presente invención incluyen, pero sin limitación, el promotor prfA de Listerial (GenBank Acc. Nº Y07639), el promotor hly Listerial (GenBank Acc. Nº X15127), y el promotor p60 Listerial (GenBank Acc. Nº AY126342), o fragmentos de los mismos.

En otra realización, una cepa de Listeria de la presente invención contiene un gen integrado que codifica un péptido que comprende un péptido de fusión KLK3.

En otra realización, una cepa de Listeria de la presente invención se crea usando un vector de integración de sitio específico. En otra realización, una cepa de Listeria que contiene un gen integrado se crea usando recombinación homóloga. En otra realización, una cepa de Listeria que contiene un gen integrado se crea usando cualquier otro método conocido en la técnica de integración de un gen en el cromosoma de Listeria.

En otra realización, el vector de integración comprende un sitio attPP' de PSA. En otra realización, el vector de integración comprende un gen que codifica una PSA integrasa. En otra realización, el vector de integración comprende un sitio attPP' de U153. En otra realización, el vector de integración comprende un gen que codifica una U153 integrasa. En otra realización, el vector de integración comprende un sitio attPP' de A118. En otra realización, el vector de integración comprende un gen que codifica una A118 integrasa. En otra realización, el vector de integración comprendecualquierotrositioattPP'conocido en la técnica.En otra realización,el vectorde integración comprende cualquier otro fago integrasa conocido en la técnica.

En otra realización, una cepa de Listeria de los métodos y composiciones de la presente invención contiene una mutación o auxotrofía en un gen metabólico. En otra realización, una cepa de Listeria de los métodos y composiciones de la presente invención comprende adicionalmente una mutación en el gen endógeno ActA. En otra realización, un plásmido que lleva un péptido de fusión KLK3 comprende un gen metabólico que complementa la mutación o auxotrofía. En otra realización, un vector de integración que codifica el péptido de fusión KLK3 o un constructo usado para la integración en el cromosoma de Listeria contiene un gen que complementa la mutación o auxotrofía. En otra realización, se usa el gen metabólico para la selección en lugar de un gen de resistencia a antibióticos. En otra realización, el gen metabólico se usa para la selección además de un gen de resistencia a antibióticos.

En otra realización, el gen metabólico es un gen que codifica una enzima del metabolismo de aminoácidos. En otra realización, la enzima metabólica es una enzima alanina racemasa (dal). En otra realización, la enzima metabólica es una enzima D-aminoácido transferasa (dat).

En otra realización, la enzima metabólica metaboliza un aminoácido (AA) que se usa para un proceso de crecimiento bacteriano. En otra realización, el producto AA se usa para un proceso de replicación. En otra realización, el producto AA se usa para la síntesis de la pared celular. En otra realización, la enzima metabólica cataliza la formación de un aminoácido usado para la síntesisde la paredcelular.En otra realización,la enzimametabólica es una enzima del metabolismo de aminoácidos. En otra realización, el producto AA se usa para la síntesis de proteínas. En otra realización, el producto AA se usa para el metabolismo de un ácido graso. En otra realización, el producto AA se usa para cualquier otro proceso de crecimiento o replicación conocido en la técnica.

En otra realización,la enzimametabólicacataliza la formación de un AAusado en la síntesisde la pared celular.En otra realización, la enzima metabólica cataliza la síntesis de un AA usado en la síntesis de la pared celular. En otra realización, la enzima metabólica está implicada en la síntesis de un AA usado en la síntesis de la pared celular. En otra realización, el AA se usa en la biogénesis de la pared celular.

En otra realización, la enzima metabólica es una enzima sintética para ácido D-glutámico, un componente de la pared celular.

En otra realización, la enzima metabólica se codifica por un gen de la alanina racemasa (dal). La síntesis de ácido Dglutámico se controla en parte por el gen dal, que está implicado en la conversión de D-glu + pyr a alfa-cetoglutarato

+ D-ala, y la reacción inversa.

En otra realización, la proteína dal de los métodos y composiciones de la presente invención tiene la secuencia de SEQ ID No: 56 (GenBank Acceso Nº: AF038438). En otra realización, la proteína dal es homóloga a la SEQ ID No:

56. En otra realización, la proteína dal es una variante de SEQ ID No: 56. En otra realización, la proteína dal es una isoforma de SEQ ID No: 56. En otra realización, la proteína dal es un fragmento de SEQ ID No: 56. En otra realización, la proteína dal es un fragmento de un homólogo de SEQ ID No: 56. En otra realización, la proteína dal es un fragmento de una variante de SEQ ID No: 56. En otra realización, la proteína dal es un fragmento de una isoforma de SEQ ID No: 56.

En otra realización, la proteína dal es cualquier otra proteína dal de Listeria conocida en la técnica. En otra realización, la proteína dal es cualquier proteína dal de Bacillus subtilis conocida en la técnica. En otra realización, la proteína dal es cualquier otra proteína dal gram-positiva conocida en la técnica. En otra realización, la proteína dal es cualquier otra proteína dal conocida en la técnica.

La proteína dat de los métodos y composiciones de la presente invención se codifica, en otra realización, por la secuencia de SEQ ID No: 57 (GenBank Acceso Nº: AF038439). En otra realización, la proteína dat es homóloga a SEQ ID No: 57. En otra realización, la proteína dat es una variante de SEQ ID No: 57. En otra realización, la proteína dat es una isoforma de SEQ ID No: 57. En otra realización, la proteína dat es un fragmento de SEQ ID No: 57. En otra realización, la proteína dat es un fragmento de un homólogo de SEQ ID No: 57. En otra realización, la proteína dat es un fragmento de una variante de SEQ ID No: 57. En otra realización, la proteína dat es un fragmento de una isoforma de SEQ ID No: 57.

En otra realización, la proteína dat es cualquier otra proteína dat de Listeria conocida en la técnica. En otra realización, la proteína dat es cualquier otra proteína dat gram-positiva conocida en la técnica. En otra realización, la proteína dat es cualquier otra proteína dat conocida en la técnica.

En otra realización, la enzima metabólica es un gen de la síntesis de ácido D-glutámico. En otra realización, la enzima metabólica se codifica por dga. En otra realización, la enzima metabólica se codifica por un gen alr (alanina racemasa). En otra realización, la enzima metabólica es cualquier otra enzima conocida en la técnica que esté implicada en la síntesis de alanina.

En otra realización, la enzima metabólica se codifica por serC, una fosfoserina aminotransferasa. En otra realización, la enzimametabólicase codifica porasd (aspartato beta-semialdehídodeshidrogenasa),implicadoenla síntesis del ácido diaminopimélico que constituye la pared celular. En otra realización, la enzima metabólica se codifica por gsaB-glutamato-1-semialdehído aminotransferasa, que cataliza la formación de 5-aminolevulinato a partir de (S)-4amino-5-oxopentanoato. En otra realización, la enzima metabólica se codifica por HemL, que cataliza la formación de 5-aminolevulinato a partir de (S)-4-amino-5-oxopentanoato. En otra realización, la enzima metabólica se codifica por aspB, un aspartato aminotransferasa que cataliza la formación de oxalozcetato y L-glutamato a partir de Laspartato y 2-oxoglutarato. En otra realización, la enzima metabólica se codifica por argF-1, implicado en la biosíntesis de arginina. En otra realización, la enzima metabólica se codifica por aroE, implicado en la biosíntesis de aminoácidos. En otra realización, la enzima metabólica se codifica por aroB, implicado en la biosíntesis de 3deshidroquinato. En otra realización, la enzima metabólica se codifica por aroD, implicado en una biosíntesis de aminoácidos. En otra realización, la enzima metabólica se codifica por aroC, implicado en la biosíntesis de aminoácidos. En otra realización, la enzima metabólica se codifica por hisB, implicado en la biosíntesis de histidina. En otra realización, la enzima metabólica se codifica por hisD, implicado en la biosíntesis de histidina. En otra realización,laenzima metabólicase codifica porhisG,implicadoenlabiosíntesisde histidina.En otrarealización,la enzima metabólica se codifica por metX, implicado en la biosíntesis de metionina. En otra realización, la enzima metabólica se codifica por proB, implicado en la biosíntesis de prolina. En otra realización, la enzima metabólica se codifica por argR, implicado en la biosíntesis de arginina. En otra realización, la enzima metabólica se codifica por argJ, implicado en la biosíntesis de arginina. En otra realización, la enzima metabólica se codifica por thiI, implicado en la biosíntesis de tiamina. En otra realización, la enzima metabólica se codifica por LMOf2365_1652, implicado en la biosíntesis de triptófano. En otra realización, la enzima metabólica se codifica por aroA, implicado en la biosíntesis de triptófano. En otra realización, la enzima metabólica se codifica por ilvD, implicado en la biosíntesis de valina e isoleucina. En otra realización, la enzima metabólica se codifica por ilvC, implicado en la biosíntesis de valina e isoleucina. En otra realización, la enzima metabólica se codifica por leuA, implicado en la biosíntesis de leucina. En otra realización, la enzima metabólica se codifica por dapF, implicado en la biosíntesis de lisina. En otra realización, la enzima metabólica se codifica por thrB, implicado en la biosíntesis de treonina (todos GenBank Nº de Acceso NC_002973).

En otrarealización,la enzima metabólicaesun ARNtsintetasa.En otrarealización,laenzimametabólicasecodifica por el gen trpS, que codifica triptofanil-ARNt sintetasa. En otra realización, la enzima metabólica es cualquier otro ARNt sintetasa conocido en la técnica.

En otra realización, la bacteria de la cepa huésped es ∆(trpS aroA), y ambos marcadores se incluyen en el vector de integración.

En otra realización, la enzima metabólica se codifica por murE, implicado en la síntesis de ácido diaminopimélico (GenBank Acceso Nº: NC_003485).

En otra realización, la enzima metabólica se codifica por LMOf2365_2494, implicado en la biosíntesis de ácido teicoico.

En otra realización, la enzima metabólica se codifica por WecE (proteína de biosíntesis del lipopolisacárido rffA; GenBank Acceso Nº: AE014075.1). En otra realización, la enzima metabólica se codifica por amiA, una Nacetilmuramoil-L-alanina amidasa. En otra realización, la enzima metabólica es aspartato aminotransferasa. En otra realización, la enzima metabólica es histidinol-fosfato aminotransferasa (GenBank Nº de Acceso NP_466347). En otra realización, la enzima metabólica es la proteína de glicosilación del ácido teicoico de la pared celular GtcA.

En otra realización, la enzima metabólica es una enzima sintética para un componente o precursor de peptidoglicano. En otra realización, el componente es UDP-N-acetilmuramil-pentapéptido. En otra realización, el componente es UDP-N-acetilglucosamina. En otra realización, el componente es MurNAc-(pentapéptido)-pirofosforil

undecaprenol. En otra realización, el componente es GlcNAc-∆-(1,4)-MurNAc-(pentapéptido)-pirofosforilundecaprenol. En otra realización, el componente es cualquier otro componente o precursor de peptidoglicano conocido en la técnica.

En otra realización,la enzimametabólica secodifica pormurG.En otrarealización,la enzimametabólica secodifica por murD. En otra realización, la enzima metabólica se codifica por murA-1. En otra realización, la enzima metabólica se codifica por murA-2 (todos expuestos en GenBank Nº de Acceso NC_002973). En otra realización, la enzima metabólica es cualquier otra enzima sintética para un componente o precursor de peptidoglicano.

En otra realización, la enzima metabólica es una trans-glicosilasa. En otra realización, la enzima metabólica es transpeptidasa. En otra realización, la enzima metabólica es una carboxipeptidasa. En otra realización, la enzima metabólica es cualquier otra clase de enzima metabólica conocida en la técnica.

En otra realización, la enzima metabólica es cualquier otra enzima metabólica de Listeria monocytogenes conocida en la técnica.

En otra realización, la enzima metabólica es cualquier otra enzima metabólica de Listeria conocida en la técnica.

En otra realización, la enzima metabólica es cualquier otra enzima metabólica de bacterias Gram-positivas conocida en la técnica.

En otra realización, la enzima metabólica es cualquier otra enzima metabólica conocida en la técnica.

En otra realización, el vector de integración es cualquier otro vector de integración específico de sitio conocido en la técnica que sea capaz de infectar Listeria.

En otra realización, la presente invención proporciona composiciones para potenciar la inmunogenicidad de un antígeno KLK3 a través de la fusión del antígeno a una forma truncada no hemolítica de LLO ("∆LLO"), tal como SEQ ID NO: 1 de LLO. La presente invención proporciona adicionalmente métodos y composiciones para potenciar la inmunogenicidad de un antígeno KLK3 fusionando el antígeno a una proteína LLO truncada. Como se demuestra por los datos desvelados en el presente documento, un antígeno fusionado a una proteína ActA provoca una respuesta inmune que limpia los tumores existentes y da como resultado la inducción de linfocitos citotóxicos

específicos de antígeno.

En otra realización, las proteínas de fusión de la presente invención se producen de forma recombinante a través de la transcripción y la traducción, en una bacteria, de un plásmido o molécula nucleotídica que codifica tanto un péptido KLK3 como un péptido LLO. En otra realización, el plásmido o nucleótido se transcribe y/o se traduce in vitro. En otra realización, el antígeno se conjuga químicamente a la forma truncada de LLO que comprende la secuencia AA de tipo PEST de L. monocytogenes o una secuencia AA tipo PEST obtenida de otro organismo procariota. "Antígeno" se refiere, en otra realización, al producto génico KLK3 nativo o versiones truncadas de estos que incluyen epítopos de linfocitos T identificados. En otra realización, estas proteínas de fusión se incorporan entonces a vacunas para su administración a un sujeto, para invocar una respuesta inmune mejorada frente al antígeno de la proteína de fusión. En otras realizaciones, las proteínas de fusión de la presente invención se administran como vacunas de ADN, vacunas de ARN o vacunas de ARN replicante. Como será evidente para los expertos en la técnica a partir de esta divulgación, las vacunas que comprenden las proteínas de fusión de la presente invención son particularmente útiles en la prevención y el tratamiento de enfermedades infecciosas y neoplásicas.

La presente invención comprende adicionalmente una composición que comprende una vacuna de la presente invención adecuada para su administración a un animal o ser humano. La composición comprende, entre otras cosas, un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra realización, la composición incluye una cepa de vacuna de Listeria que comprende unaproteína LLOtruncada,oun fragmentodelamisma,fusionadaa un péptido KLK3,yun vehículo farmacéuticamente aceptable.

En la medida en que los siguientes Ejemplos no se refieren a la función de un péptido KLK3 y una proteína LLO, son ejemplos comparativos.

SECCIÓN DE DETALLES EXPERIMENTALES

EJEMPLO 1: LAS FUSIONES DE ANTÍGENO LLO INDUCEN INMUNIDAD ANTI-TUMORAL

MATERIALES Y MÉTODOS EXPERIMENTALES (EJEMPLOS 1-2)

Líneas celulares

El tumor TC-1 C57BL/6 singénico se inmortalizó con E6 y E7 de HPV-16 y se transformó con el oncogén c-Ha-ras. TC-1 expresa bajos niveles de E6 y E7 y es altamente tumorígeno. TC-1 creció en RPMI 1640, FCS al 10%, Lglutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina, aminoácidos no esenciales 100 µM, piruvato sódico 1 mM, 2-ME50 micromolar (mcM), 400 microgramos (mcg)/ml de G418, y medio 109 al 10% de la Colección Nacional de Cultivos Tipo a 37 ºC con CO2 al 10%. C3 es una célula embrionaria de ratón de ratones C57BL/6 inmortalizados con el genoma completo de HPV 16 y se transformaron con pEJ-ras. EL-4/E7 es el timoma EL-4 transducido retrovíricamente con E7.

Cepas de L. monocytogenes y propagación

Las cepas de Listeria usadas fueron Lm-LLO-E7 (gen de fusión hly-E7 en un sistema de expresión episomal; Figura 1A), Lm-E7 (casette del gen E7 de copia única integrado en el genoma de Listeria), Lm-LLO-NP ("DP-L2028"; gen de fusión hly-NP en un sistema de expresión episomal), y Lm-Gag ("ZY-18"; casette del gen Gag de HIV-1 de copia única integrado en el cromosoma).

Para generar pGG-55, el plásmido LLO-E7, E7 se amplificó por PCR usando los cebadores 5'-GGCTCGAGCATGGAGATACACC-3' (SEQ ID No: 8; el sitio XhoI está subrayado) y 5'-GGGGACTAGTTTATGGTTTCTGAGAACA-3' (SEQ ID No: 9; el sitio SpeI está subrayado) y se ligó a pCR2.1 (Invitrogen, San Diego, CA). E7 se extrajo de pCR2.1 por la digestión de XhoI/SpeI y se ligó a pDP-2028 (Ikonomidis G y col. Delivery of a viral antigen to the class I processing and presentation pathway by Listeria monocytogenes. J Exp Med. 1994 Dec 1; 180(6): 2209-18). El gen de fusión hly-E7 y el factor de transcripción pluripotencial prfA se amplificaron y se subclonaron en pAM401, un plásmido lanzadera multicopia (Wirth R y col., J Bacteriol, 165: 831, 1986), generando pGG-55. El promotor hly y el fragmento génico se amplificaron usando los cebadores 5'-GGGGGCTAGCCCTCCTTTGATTAGTATATTC-3' (SEQ ID No: 10; el sitio NheI está subrayado) y 5'-CTCCCTCGAGATCATAATTTACTTCATC-3' (SEQ ID No: 11; el sitio XhoI está subrayado). El gen prfA se amplificó por PCR usando los cebadores 5'-GACTACAAGGACGATGACCGACAAGTGATAACCCGGGATCTAAATAAATCCGTTT-3' (SEQ ID No: 12; el sitio XbaI está subrayado) y 5'-CCCGTCGACCAGCTCTTCTTGGTGAAG-3' (SEQ ID No: 13; el sitio SalI está subrayado).

En el plásmido resultante, pGG-55, el promotor hly impulsa la expresión de los primeros 441 AA del producto génico hly,incluyendo la secuencia de señalescindida posteriormente,quese une porelsitioXhoIal gen E7,produciendo un gen de fusión hly-E7 que se transcribe y se secreta como LLO-E7. Este fragmento LLO carece del extremo C hemolítico y tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID No: 18. A continuación, se denomina como "∆LLO", y es simplemente una ∆LLO ejemplar de lasmuchas que pueden usarse con losmétodos y composiciones de la presente invención. Transformación de una cepa prfA-negativa de Listeria, XFL-7 (proporcionada por el Dr. Hao Shen, University of Pennsylvania), con pGG-55 seleccionado para la retención del plásmido in vivo (figuras 1A-B).

Lm-E7 se generó introduciendo un cassette de expresión que contenía el promotor hly y la secuencia de señal que impulsaba la expresión y secreción de E7 en el dominio orfZ del genoma de LM. E7 se amplificó por PCR usando los cebadores 5'-GCGGATCCCATGGAGATACACCTAC-3' (SEQ ID No: 22; El sitio BamHI está subrayado) y 5'-GCTCTAGATTATGGTTTCTGAG-3' (SEQ ID No: 23; el sitio XbaI está subrayado). Después, E7 se ligó al vector lanzadera pZY-21. La cepa de LM 10403S se transformó con el plásmido resultante, pZY-21-E7, que incluye un cassette de expresión insertado en el medio de una secuencia de 1,6 kb que corresponde al dominio orfX, Y, Z del genoma de LM. El dominio de homología permite la inserción del casete del gen E7 en el dominio orfZ mediante recombinación homóloga. Los clones se cribaron para la integración del casette del gen E7 en el dominio orfZ. Se cultivaron bacteriasenmedio de infusión de cerebro-corazón con (Lm-LLO-E7 y Lm-LLO-NP) osin (Lm-E7 y ZY-18) cloranfenicol (20 µg/ml). Las bacterias se congelaron en alícuotas a -80 ºC. La expresión se verificó por transferencia de Western (figura 2)

Transferencia de Western

Las cepas de Listeria se cultivaron en medio Luria-Bertoni a 37 ºC y se cosecharon a la misma densidad óptica medida a 600 nm. Los sobrenadantes se precipitaron con TCA y se suspendieron de nuevo en un tampón de muestra complementado con NaOH 0,1 N. Se cargaron cantidades idénticas de cada sedimento celular o cada sobrenadante precipitado con TCA sobre geles SDS-PAGE de Tris-glicina al 4-20% (NOVEX, San Diego, CA). Los geles se transfirieron a difluoruro de polivinilideno y se sondaron con un anticuerpo monoclonal anti-E7 (mAb) (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA), después se incubaron con Ab secundario anti-ratón conjugado con HRP (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, Reino Unido), se desarrollaron con reactivos de detección Amersham ECL y se expusieron a Hyperfilm (Amersham Pharmacia Biotech).

Medición del crecimiento tumoral

Los tumores se midieron cada dos días con calibres que abarcan los diámetros superficiales más cortos y más largos. La media de estas dos mediciones se representó como el diámetro tumoral medio en milímetros frente a diversos puntos temporales. Los ratones se sacrificaron cuando el diámetro del tumor alcanzó 20 mm. Las mediciones del tumor para cada punto temporal se muestran únicamente para los ratones supervivientes.

Efectos de los recombinantes de Listeria sobre el crecimiento tumoral establecido

Ratones C57BL/6 de seis a ocho semanas de edad (Charles River) recibieron 2 x 105 células TC-1 s.c. sobre el costado izquierdo. Una semana después de la inoculación del tumor, los tumores habían alcanzado un tamaño palpable de 4-5 mm de diámetro. Después, grupos de 8 ratones se trataron con 0,1 DL50 i.p. de Lm-LLO-E7 (107 UFC), Lm-E7 (106UFC), Lm-LLO-NP (107UFC) o Lm-Gag (5 x 105UFC) los días 7 y 14.

Ensayo de liberación de 51Cr

Ratones C57BL/6, de 6-8 semanas de edad, se inmunizaron i.p. con 0,1 DL50 de Lm-LLO-E7, Lm-E7, Lm-LLO-NP o Lm-Gag. Diez días después de la inmunización los bazosse obtuvieron. Los esplenocitosse establecieron en cultivo con células TC-1 irradiadas (100:1, esplenocitos:TC-1) como células nutrientes; se reforzaron in vitro durante 5 días y después se usaron en un ensayo de liberación de 51Cr convencional, usando las siguientes dianas: EL-4, EL-4/E7

o EL-4 pulsadas con el péptido E7 H-2b (RAHYNIVTF). Las proporciones celulares E:T, realizadas por triplicado, fueron 80:1,40:1,20:1,10:1,5:1 y2.5:1.Después de una incubación de 4 ha 37 ºC,las célulassegranularon,y se eliminaron 50 µl de sobrenadante de cada pocillo. Las muestras se ensayaron con un contador de centelleo Wallac 1450 (Gaithersburg, MD). El porcentaje de lisis específica se determinó como [(conteos experimentales por minuto conteos espontáneos por minuto)/(conteos totales por minuto -conteos espontáneos porminuto)] x 100.

Proliferación específica de TC-1

Se inmunizaron ratones C57BL/6 con 0,1 DL50 y se reforzaron por inyección i.p. 20 días después con 1 LD50 de LmLLO-E7, Lm-E7, Lm-LLO-NP o Lm-Gag. Seis días después de la dosis de refuerzo, se recogieron los bazos de los ratones inmunizados y sin tratar. Los esplenocitos se establecieron en cultivo a 5 x 105/pocillo en placas de fondo plano de 96 pocillos con 2,5 x 104, 1,25 x 104, 6 x 103 o 3 x 103 células TC-1 irradiadas/pocillo como una fuente de

E7 Ag, o sin células TC-1 o con 10 µg/ml de Con A. Las células se pulsaron 45 h más tarde con 0,5 µCi de [3H]timidina/pocillo. Las placas se cosecharon 18 h más tarde usando una cosechadora Tomtec harvester 96 (Orange, CT), y la proliferación se evaluó con un contador de centelleo Wallac 1450. El cambio en conteos por minuto se calculó como conteos experimentales por minuto -conteo no Ag por minuto.

Análisis por citometría de flujo

Se inmunizaron ratones C57BL/6 por vía intravenosa (i.v.) con 0,1 DL50 de Lm-LLO-E7 o Lm-E7 y se reforzaron 30 días más tarde. La citometría de flujo de tres colores para CD8 (53-6.7, PE conjugado), ligando CD62 (CD62L; MEL14, APC conjugado) y el tetrámero H-2Db de E7 se realizó usando un citómetro de flujo FACSCalibur® con el software CellQuest® (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Los esplenocitos recuperados 5 días después de la dosis de refuerzo se tiñeron a temperatura ambiente (ta) con tetrámeros H-2Db cargados con el péptido E7 (RAHYNIVTF) o un péptido de control (HIV-Gag). Los tetrámeros se usaron en una dilución 1/200 y se proporcionaron por el Dr. Larry R. Pease (Mayo Clinic, Rochester, MN) y por el National Institute of Allergy and Infectious Diseases Tetramer Core Facility y los National Institutes of Health AIDS Research and Reference Reagent Program. Se analizaron el tetrámero+, las células CD8+, CD62Lbaja.

Reducción de los componentes inmunes específicos

Las células CD8+, las células CD4+ e IFN se redujeron en ratones portadores de TC-1 inyectando al ratón 0,5 mg por ratón de mAb: 2,43, GK1.5 o xmg1.2, respectivamente, los días 6, 7, 8, 10, 12 y 14 después de la estimulación del tumor. Las poblaciones de células CD4+ y CD8+se redujeron en un 99% (análisis por citometría de flujo). Las células CD25+ se redujeron por inyección i.p. de 0,5 mg/ratón de mAb anti-CD25 (PC61, proporcionado por Andrew J. Caton) los días 4 y 6. El TGF se redujo por inyección i.p. del mAb anti-TGF (2G7, proporcionado por H. I. Levitsky), en ratones portadores de TC-1 los días 6, 7, 8, 10, 12, 14, 16, 18 y 20. Los ratones se trataron con 107 de Lm-LLO-E7 o Lm-E7 el día 7 tras la estimulación del tumor.

Transferencia adoptiva

Los ratones C57BL/6 donantes se inmunizaron y se reforzaron 7 días más tarde con 0,1 DL50 de Lm-E7 o Lm-Gag. Los esplenocitos donantes se recogieron y se pasaron sobre columnas de lana de nylon para enriquecer los linfocitos T. Los linfocitos T CD8+ se redujeron in vitro mediante incubación con 0,1 µg de mAb 2.43 anti-CD8 durante 30 min a ta. Después, las células marcadas se trataron con complemente de conejo. Los esplenocitos donantes fueron >60% de linfocitos T CD4+ (análisis por citometría de flujo). Los ratones receptores portadores del tumor TC-1 se inmunizaron con 0,1 DL50 7 días después de la estimulación del tumor. Los esplenocitos donantes enriquecidos con CD4+ (107) se transfirieron 9 días después de la estimulación del tumor a los ratones receptores por inyección i.v.

Experimento B16F0-Ova

A 24 ratones C57BL/6 se les inoculó 5 x 105 células B16F0-Ova. Los días 3, 10 y 17, grupos de 8 ratones se inmunizaron con 0,1 DL50de Lm-OVA (106ufc), Lm-LLO-OVA (108ufc) y ocho animales se dejaron sin tratar.

Estadísticas

Para la comparación de los diámetros tumorales, se determinaron la media y la DE del tamaño tumoral para cada grupo, y la importancia estadística se determinó mediante la prueba t de Student. p≤0,05 se consideró insignificante.

RESULTADOS

Lm-E7 y Lm-LLO-E7 se compararon para comprobar su capacidad de afectar al crecimiento de TC-1. Se establecieron tumores subcutáneos sobre el costado izquierdo de los ratones C57BL/6. Siete días después, los tumores habían alcanzado un tamaño palpable (4-5 mm). Los ratones se vacunaron los días 7 y 14 con 0,1 DL50 de Lm-E7, Lm-LLO-E7, o, como controles, Lm-Gag y Lm-LLO-NP. Lm-LLO-E7 indujo una regresión completa del 75% de los tumores TC-1 establecidos, mientras que en los otros dos ratones en el grupo controló su crecimiento tumoral (figura 3A). En cambio, la inmunización Lm-E7 y Lm-Gag no indujo una regresión tumoral. Este experimento se repitió múltiples veces, siempre con resultados muy similares. Además, se consiguieron resultados similares para Lm-LLO-E7 en protocolos de inmunización diferentes. En otro experimento, una única inmunización fue capaz de curar a los ratones de los tumores TC-1 establecidos de 5 mm.

En otros experimentos, se obtuvieron resultados similares con dos líneas celulares de tumor de expresión de E7 diferentes: C3 y EL-4/E7. Para confirmar la eficacia de la vacunación con Lm-LLO-E7, los animales a los que se les había eliminado los tumores se estimularon de nuevo con células tumorales TC-1 o EL-4/E7 el día 60 o el día 40, respectivamente. Los animales inmunizados con Lm-LLO-E7 permanecieron sin tumor hasta la finalización del experimento (el día 124 en el caso de TC-1 y el día 54 para EL-4/E7).

Se realizó un experimento similar con el antígeno de ovalbumina de pollo (OVA). Los ratones se inmunizaron con Lm-OVA o Lm-LLO-OVA,después seestimularon con un timoma EL-4 creado por ingeniería para expresar OVA o la línea celulardemelanoma murino muyagresivo B16F0-Ova,que tiene una expresión MHC de clase Imuybaja.En ambos casos, Lm-LLO-OVA, pero no Lm-OVA, indujo la regresión de tumores establecidos. Por ejemplo, al final del experimento con B16F0 (día 25), todos los ratones en el grupo sin tratar y el grupo Lm-OVA habían muerto. Todos los ratones del grupo Lm-LLO-OVA estaban vivos, y el 50% de ellos no tenía tumores (figura 3B).

Por lo tanto, la expresión de un gen antigénico como una proteína de fusión con ∆LLO potencia la inmunogenicidad del antígeno.

EJEMPLO 2: EL TRATAMIENTO CON LM-LLO-E7 PROVOCA UNA PROLIFERACIÓN DE ESPLENOCITOS

ESPECÍFICA DE TC-1

Para medir la inducción de linfocitos T por Lm-E7 con Lm-LLO-E7, se evaluaron las respuestas proliferativas específicas de TC-1 de esplenocitos de ratones inmunizados con rLm, una medición de la inmunocompetencia específica de antígeno. Los esplenocitos de ratones inmunizados con Lm-LLO-E7 proliferaron cuando se expusieron a células TC-1 irradiadas como una fuente de E7, en el esplenocito: relaciones TC-1 de 20:1, 40:1, 80:1 y 160:1 (figura 4). Por el contrario, los esplenocitos de ratones inmunizados con Lm-E7 y rLm de control mostraron únicamente niveles de fondo de proliferación.

EJEMPLO 3: LA FUSIÓN DE NP A LLO POTENCIA SU INMUNOGENICIDAD

MATERIALES Y MÉTODOS EXPERIMENTALES

Se preparó Lm-LLO-NP como se representa en la figura 1, excepto que la nucleoproteína (NP) de influenza reemplazó E7 como el antígeno. 32 ratones BALB/c se inocularon con 5 x 105 células tumorales RENCA-NP. RENCA-NP es un carcinoma de células renales transducido retrovíricamente con nucleoproteína NP de influenza (descrito en la patente de Estados Unidos Nº 5.830.702, que se incorpora en el presente documento por referencia). Después de haber crecido los tumores macrocópicos palpables, el día 10 8 animales en cada grupo se inmunizaron

i.p. con 0,1 DL50 del vector de Listeria respectivo. Los animales recibieron una segunda inmunización una semana más tarde.

RESULTADOS

Con el fin de confirmar la generalidad del hallazgo de que la fusión de LLO a un antígeno confiere una inmunidad mejorada, se construyeron Lm-LLO-NP y Lm-NP (isogénicos con los vectores Lm-E7, pero expresando el antígeno de influenza), y los vectores se compararon para evaluar su capacidad para inducir una regresión tumoral, con Lm-Gag (isogénico con Lm-NP excepto para el antígeno expresado) como control negativo. Como se representa en la figura 5, 6/8 de los ratones que recibieron Lm-LLO-NP no tenían tumores. Por el contrario, únicamente 1/8 y 2/8 ratones en los grupos de Lm-Gag y Lm-NP, respectivamente, estaban libres de tumores. Todos los ratones en el gruposin tratartuvieron tumores grandes o habían muerto para el día 40.Porlo tanto,las cepasLLOque expresan NP y fusiones LLO-NP son inmunogénicas. Se consiguieron resultados similares para Lm-LLO-E7 en protocolos de inmunización diferentes. Adicionalmente, sólo una única inmunización demostró curar ratones de TC-1 establecido con un diámetro de 5 mm.

EJEMPLO 4: LA POTENCIACIÓN DE LA INMUNOGENICIDAD POR FUSIÓN DE UN ANTÍGENO A LLO NO REQUIERE UN VECTOR DE LISTERIA

MATERIALES Y MÉTODOS EXPERIMENTALES

Construcción de Vac-SigE7Lamp

La cepa WR de vaccinia se usó como el receptor y el gen de fusión se extrajo del plásmido Listerial y se insertó en pSC11 bajo el control del promotor p75. Este vector se escogió debido a que es el vector de transferencia usado para los constructos de vaccinia Vac-SigE7Lamp y Vac-E7 y, por lo tanto, permitirá una comparación directa con Vac-LLO-E7. De este modo, los tres recombinantes de vaccinia se expresarán bajo el control delmismo promotor de compuesto temprano/tardío p7.5. Además, SC11 permite la selección de placas víricas recombinantes para la selección TK y el rastreo de beta-galactosidasa. La figura 6 representa los diversos constructos de vaccinia usados en estos experimentos. Vac-SigE7Lamp es un virus vaccinia recombinante que expresa la proteína E7 fusionada entre la secuencia de señal de la proteína de membrana asociada lisosómica (LAMP-1) y la secuencia de la cola citoplasmática de LAMP-1. Se diseñó para facilitar la dirección del antígeno con respecto a la ruta MHC de clase II.

Se hicieron las siguientes modificaciones para permitir la expresión del producto génico por vaccinia: (a) la secuencia T5XT que impide la transcripción temprana por vaccinia se eliminó de la porción 5' de la secuencia LLO-E7 por PCR; y (b) se introdujo un sitio de restricción XmaI adicional por PCR para permitir la inserción final de LLO-E7 en SC11. La introducción con éxito de estos cambios (sin pérdida de la secuencia original que codifica LLO-E7) severificó porsecuenciación.El constructo pSC1 1-E7 resultante se usó paratransfectarla línea celularTK-ve CV1 que se había infectado con la cepa de vaccinia de tipo silvestre, WR. Los lisados celulares obtenidos de esta etapa de co-infección/transfección contienen recombinantes de vaccinia que se purificaron en placas 3 veces. La expresión del producto de fusión LLO-E7 por vaccinia purificada en placas se verificó por transferencia de Western usando un anticuerpo dirigido contra la secuencia de la proteína LLO. Además, la capacidad de Vac-LLO-E7 para producir linfocitos T CD8+ específicos de LLO y E7 se determinó usando los epítopos LLO (91-99) y E7 (49-57) de ratones Balb/c y C57/BL6, respectivamente. Los resultados se confirmaron en un ensayo de liberación de cromo.

RESULTADOS

Para determinar si la potenciación de la inmunogenicidad por la fusión de un antígeno a LLO requiere un vector de Listeria, se construyó un vector de vacuna que expresaba E7 como una proteína de fusión con una forma truncada no hemolítica de LLO (∆LLO). Se realizaron estudios de rechazo tumoral con TC-1 siguiendo el protocolo que se ha descrito para el Ejemplo 1. Se realizaron dos experimentos con diferentes demoras antes de que se iniciara el tratamiento. En un experimento, los tratamientos se iniciaron cuando los tumores tenían aproximadamente 3 mm de diámetro (figura 7). A partir del día 76, el 50% de los ratones tratados con Vac-LLO-E7 están libres de tumores, mientras que únicamente el 25% de los ratones tratados con Vac-SigE7Lamp estaban libres de tumores. En otros experimentos, las fusiones ∆LLO-antígeno eran más inmunogénicas que el péptido E7 mezclado con SBAS2 u oligonucleótidos CpG no metilados en una comparación en paralelo.

Estos resultados muestran que (a) la fusión de las fusiones ∆LLO-antígeno son inmunogénicas no sólo en el contexto de Listeria, sino también en otros contextos; y (b) la inmunogenicidad de las fusiones ∆LLO-antígeno se compara favorablemente con otros enfoques de vacuna aceptados.

EJEMPLO 5: LAS FUSIONES ActA-ANTÍGENO Y PEST-ANTÍGENO CONFIERENINMUNIDAD ANTI-TUMORAL

MATERIALES Y MÉTODOS EXPERIMENTALES

Construcción de Lm-PEST-E7, Lm-∆PEST-E7 y Lm-E7epi (figura 8A)

Lm-PEST-E7 es idéntico a Lm-LLO-E7, excepto que contiene únicamente el promotor y la secuencia PEST del gen hly, específicamente los primeros 50 AA de LLO. Para construir Lm-PEST-E7, el promotor hly y las regiones PEST se fusionaron al gen E7 de longitud completa usando la técnica de PCR SOE (empalme génico por extensión de solapamiento). El gen E7 y el fragmento génico hly-PEST se amplificaron a partir del plásmido pGG-55, que contiene los primeros 441 AA de LLO, y se empalmaron juntos mediante técnicas PCR convencionales. Para crear un plásmido final, pVS16.5, el fragmento hly-PEST-E7 y el gen prfA se subclonaron en el plásmido pAM401, que incluye un gen de resistencia a cloranfenicol para la selección in vitro, y el plásmido resultante se usó para transformar XFL-7.

Lm-∆PEST-E7 es una cepa recombinante de Listeria que es idéntica a Lm-LLO-E7 excepto que carece de la secuencia PEST. Se hizo básicamente como se describe para Lm-PEST-E7, excepto que el sistema de expresión episomal se construyó usando los cebadores diseñados para eliminar la región que contiene PEST (pb 333-387) del gen de fusión hly-E7. Lm-E7epi es una cepa recombinante que secreta E7 sin la región PEST o LLO. El plásmido usado para transformar esta cepa contiene un fragmento génico del promotor hly y una secuencia de señal fusionada al gen E7. Este constructo difiere del Lm-E7 original, que expresó una única copia del gen E7 integrado en el cromosoma. Lm-E7epi es completamente isogénico a Lm-LLO-E7, Lm-PEST-E7 y Lm-∆PEST-E7, excepto para la forma del antígeno E7 expresado.

Construcción de Lm-actA-E7

Lm-actA-E7 es una cepa recombinante de LM, que comprende un plásmido que expresa la proteína E7 fusionada a una versión truncada de la proteína actA. Lm-actA-E7 se generó introduciendo un vector plasmídico pDD-1 construido modificando pDP-2028 en LM. pDD-1 comprende un cassette de expresión que expresa una copia del promotor hly de 310 pb y la secuencia de señal hly (ss), que impulsa la expresión y secreción de actA-E7; 1170 pb del gen actA que comprende 4 secuencias PEST (SEQ ID No: 16) (el polipéptido ActA truncado consiste en los primeros390 AAde lamolécula,SEQIDNo:15);elgenE7*de HPVde300 pb; el genprfA* de1019 pb(controla la expresión de los genes de virulencia); y el gen CAT (gen de resistencia a cloranfenicol) para la selección de clones bacterianos transformados (figura 8B).

El promotor hly (pHly) y el fragmento génico se amplificaron por PCR a partir de pGG-55 (Ejemplo 1) usando los cebadores 5'-GGGGTCTAGACCTCCTTTGATTAGTATATTC-3' (el sitio Xba I está subrayado; SEQ ID NO: 46) y 5'-ATCTTCGCTATCTGTCGCCGCGGCGCGTGCTTCAGTTTGTTGCGC-'3 (el sitio Not I está subrayado; los primeros 18 nucleótidos son el solapamiento del gen ActA; SEQ ID NO: 47). El gen actA se amplificó por PCR a partir del genoma de LM de tipo silvestre 10403s usando el cebador 5'-GCGCAACAAACTGAAGCAGCGGCCGCGGCGACAGATAGCGAAGAT-3' (el sitio NotI está subrayado; SEQ ID NO: 48) y el cebador 5'-TGTAGGTGTATCTCCATGCTCGAGAGCTAGGCGATCAATTTC-3' (el sitio XhoI está subrayado; SEQ ID NO: 49). El gen E7 se amplificó por PCR a partir de pGG55 (pLLO-E7) usando el cebador 5'-GGAATTGATCGCCTAGCTCTCGAGCATGGAGATACACCTACA-3'(elsitioXhoIestásubrayado; SEQ ID NO: 50)y el cebador 5'-AAACGGATTTATTTAGATCCCGGGTTATGGTTTCTGAGAACA-3' (el sitio XmaI está subrayado; SEQ ID NO:51).Elgen prfAse amplificó porPCR a partirdelgenoma de LMde tiposilvestre 10403susandoel cebador 5'-TGTTCTCAGAAACCATAACCCGGGATCTAAATAAATCCGTTT-3' (el sitio XmaI está subrayado; SEQ ID NO: 52) y el cebador 5'-GGGGGTCGACCAGCTCTTCTTGGTGAAG-3' (el sitio SalI está subrayado; SEQ ID NO: 53). El promotorhlyse fusionóalgen actA(pHly-actA),se generó yse amplificó porPCRa partirdel ADN pHlypurificado y el ADN actA purificado usando el cebador pHly corriente arriba (SEQ ID NO: 46) y el cebador actA corriente abajo (SEQ ID NO: 49).

El gen E7 fusionado al gen prfA (E7-prfA) se generó y se amplificó por PCR a partir de ADN E7 purificado y ADN prfA purificado usando el cebador E7 corriente arriba (SEQ ID NO: 50) y el cebador del gen prfA corriente abajo (SEQ ID NO: 53).

El producto de fusión pHly-actA fusionado al producto de fusión E7-prfA se generó y se amplificó por PCR a partir del producto de ADN pHly-actA fusionado y purificado y el producto de ADN E7-prfA fusionado y purificado usando el cebador pHly corriente arriba (SEQ ID NO: 46) y el cebador del gen prfA corriente abajo (SEQ ID NO: 53) y se ligó en pCRII (Invitrogen, La Jolla, Calif.). Las células E. coli competentes (TOP10'F, Invitrogen, La Jolla, Calif.) se transformaron con pCRII-ActAE7. Después de la lisis y el aislamiento, el plásmido se cribó mediante análisis de restricción usando BamHI (tamaños de fragmento esperados 770 pb y 6400 pb (o cuando el inserto se invirtió en el vector: 2500 pb y 4100 pb)) y BstXI (tamaños de fragmento esperados 2800 pb y 3900 pb) y también se cribó con análisis por PCR usando el cebador pHly corriente arriba (SEQ ID NO: 46) y el cebador del gen prfA corriente abajo (SEQ ID NO: 53).

El inserto de ADN pHly-ActA-E7-PrfA se extrajo de pCRII por digestión doble con Xba I y Sal I y se ligó en pDP-2028 también digerido con Xba I y Sal I. Después de transformar las células E. coli competentes TOP10'F (Invitrogen, La Jolla, Calif.) con el sistema de expresión pActAE7, los clones resistentes a cloranfenicol se cribaron mediante análisis por PCR usando el cebador pHly corriente arriba (SEQ ID NO: 46) y el cebador del gen PrfA corriente abajo (SEQ ID NO: 53). Un clon que llevaba pHly-ActA-E7 se cultivó en medio de fusión cerebro-corazón con 20 mcg (microgramos)/ml (mililitro) de cloranfenicol (Difco, Detroit, MI), y pActAE7 se aisló de la célula bacteriana usando un kit de sistema de purificación de ADN midiprep (Promega, Madison, Wis.). La cepa de Listeria tratada con penicilina XFL-7 se transformó con pActAE7, y los clones se seleccionaron para la retención del plásmido in vivo. Los clones se cultivaron en medio de fusión cerebro-corazón con cloranfenicol (20 mcg/ml) a 37 ºC. Las bacteriasse congelaron en alícuotas a -80 ºC.

RESULTADOS

Para comparar la inmunidad antitumoral inducida por Lm-ActA-E7 frente a Lm-LLO-E7, 2 x 105 células de tumor TC1 se implantaron por vía subcutánea en ratones y se dejaron crecer hasta un tamaño palpable (aproximadamente 5 milímetros [mm]). Los ratones se inmunizaron i.p. con una DL50 de Lm-ActA-E7 (5 x 108 UFC), (cruces) Lm-LLO-E7 (108 UFC) (cuadrados) o Lm-E7 (106 UFC) (círculos) los días 7 y 14. El día 26, cada uno de los animales en LmLLO-E7 y Lm-ActA-E7 estaba libre de tumor y permanecieron así, mientras que en cada uno de los animales sin tratar (triángulos) y los animales inmunizados con Lm-E7 se desarrollaron tumores grandes (figura 9). Por lo tanto, la vacunación con fusiones ActA-E7 causa una regresión tumoral.

Además, Lm-LLO-E7, Lm-PEST-E7, Lm-∆PEST-E7 y Lm-E7epi se compararon para evaluar su capacidad de causar la regresión de los tumores que expresan E7. Se establecieron tumores TC-1 s.c. en el costado izquierdo de 40 ratones C57BL/6. Después haber alcanzado los tumores 4-5 mm, los ratones se dividieron en 5 grupos de 8 ratones. Cadagrupo se tratócon1 de 4 vacunasrecombinantesdeLM,y1 grupose dejó sin tratar.Lm-LLO-E7y Lm-PEST-E7 indujeron la regresión de los tumores establecidos en 5/8 y 3/8 casos, respectivamente. No hubo ninguna diferencia estadística entre el tamaño tumoral medio de los ratones tratados con Lm-PEST-E7 o Lm-LLO-E7 en ningún punto temporal. Sin embargo, las vacunas que expresaron E7 sin las secuencias PEST, Lm-∆PEST-E7 y Lm-E7epi, no pudieron causar la regresión tumoral en ningún ratón excepto en uno (figura 8C). Esto fue representativo de dos experimentos, en los que se observó una diferencia estadísticamente significativa en los tamaños tumorales medios en el día 28 entre tumores tratados con Lm-LLO-E7 o Lm-PEST-E7 y los tratados con Lm-E7epi o Lm∆PEST-E7; P<0,001, prueba t de Student; figura 8D). Además, el aumento de los porcentajes de esplenocitos tetrámero-positivo se observó de forma reproducible en los tres experimentos en los bazos de ratones vacunados con vacunas que contienen PEST (figura 8E). Por lo tanto, la vacunación con fusiones PEST-E7 causa una regresión tumoral.

EJEMPLO 6: LA FUSIÓN DE E7 A LLO, ActA, O UNA SECUENCIA TIPO PEST POTENCIA LA INMUNIDADESPECÍFICADEANTÍGENOYGENERACÉLULASCD8+ ESPECÍFICASDEE7 INFILTRANTES DE TUMOR

MATERIALES Y MÉTODOS EXPERIMENTALES

Se implantaron por vía subcutánea 500 mcl (microlitros) de MATRIGEL®, que comprende 100 mcl de 2 x 105 células de tumor TC-1 en solución salina tamponada con fosfato (PBS) más 400 mcl de MATRIGEL® (BD Biosciences, Franklin Lakes, N.J.) en el costado izquierdo de 12 ratones C57BL/6 (n = 3). Los ratones se inmunizaron por vía intraperitoneal el día 7, 14 y 21, y los bazos y tumores se recuperaron el día 28. El MATRIGEL de los tumores se eliminó delosratones yse incubóa 4 ºCdurante unanocheentubosque contenían2mililitros(ml)demedioRP10 sobre hielo. Los tumores se picaron en trozos con fórceps, se cortaron en bloques de 2 mm y se incubaron a 37 ºC durante 1 hora con 3 ml de mezcla enzimática (0,2 mg/ml de colagenasa-P, 1 mg/ml de DNAsa-1 en PBS). La suspensión tisular se filtró a través de una malla de nylon y se lavó con suero fetal bovino al 5% + 0,05% de NaN3en PBS para la tinción de tetrámero y IFN-gamma.

Los esplenocitos y células tumorales se incubaron con péptido E7 1 micromol (mcm) durante 5 horas en presencia de brefeldina A en 107 células/ml. Las células se lavaron dos veces y se incubaron en 50 mcl de sobrenadante del receptor Fc anti-ratón (2.4 G2) durante 1 hora o durante una noche a 4 ºC. Las células se tiñeron para poder identificarlasmoléculasdesuperficieCD8 yCD62L,se permeabilizaron,sefijaron usando elkitde permeabilización Golgi-stop® o Golgi-Plug® (Pharmingen, San Diego, Calif.), y se tiñeron para identificar IFN-gamma. Se adquirieron

500.000 acontecimientos usando citometría de flujo de dos láseres FACSCalibur y se analizaron usando el software Cellquest (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Se calcularon los porcentajes de células secretoras de IFN-gamma en los linfocitos T CD8+ activados (CD62Lbaja).

Para la tinción de tetrámero, el tetrámero H-2Db se cargó con el péptido E7 conjugado con ficoeritrina (PE) (RAHYNIVTF, SEQ ID NO: 24), se tiñó a ta durante 1 hora, y se tiñó con MEL-14 conjugado con anti-aloficocianina (APC)(CD62L)yCD8conjugadocon FITCa4 ºCdurante30min.Lascélulasse analizaroncomparando las células tetrámero+CD8+CD62Lbaja en el bazo y en el tumor.

RESULTADOS

Para analizar la capacidad de Lm-ActA-E7 para potenciar la inmunidad específica de antígeno, a los ratones se les implantó células de tumor TC-1 y se inmunizaron con Lm-LLO-E7 (1 x 107UFC), Lm-E7 (1 x 106UFC) o Lm-ActA-E7 (2 x108UFC),osedejaronsin tratar(sin tratamientoprevio,vírgenes).Lostumoresde los ratonesdelosgruposde Lm-LLO-E7 y Lm-ActA-E7 contenían un mayor porcentaje de linfocitos T CD8+ secretores de IFN-gamma (figura 10A) y células CD8+específicas de tetrámero (figura 10B) que en Lm-E7 o ratones sin tratar.

En otro experimento, a los ratones portadores de tumor se les administró Lm-LLO-E7, Lm-PEST-E7, Lm-∆PEST-E7

o Lm-E7epi, y se midieron los niveles de linfocitos específicos de E7 en el tumor. Los ratones se trataron los días 7 y 14 con 0,1 DL50 de las cuatro vacunas. Los tumores se recuperaron el día 21 y se tiñeron con anticuerpos para CD62L, CD8, y con el tetrámero E7/Db. Se observó un aumento del porcentaje de linfocitos tetrámero-positivo en el tumor en ratones vacunados con Lm-LLO-E7 y Lm-PEST-E7 (figura 11A). Este resultado era reproducible en los tres experimentos (figura 11B).

Por lo tanto, cada uno de Lm-LLO-E7, Lm-ActA-E7 y Lm-PEST-E7 es eficaz en la inducción de linfocitos T CD8+ infiltrantes de tumor y la regresión tumoral.

EJEMPLO 7: CREACIÓN Y VERIFICACIÓN DE CONSTRUCTOS DE LISTERIA-LLO-PSA

MATERIALES Y MÉTODOS EXPERIMENTALES

Se adquirieron oligos y pCDNA3.1 en Invitrogen (Carlsbad, CA) y la secuenciación de ADN se realizo por Genewiz Inc(Plainfield,NJ).Lospéptidosse sintetizaron porEZbiolabs (Westfield,IN).Losreactivos de citometría de flujose adquirieron en Becton Dickinson (BD) Biosciences (San Diego, CA). Los medios de cultivo celular y los complementos eran de Gibco/Invitrogen. Los anticuerpos ELISpot se adquirieron en Mabtech AB (Cincinnati, OH). Otros reactivos, amenos quese indique, eran de Sigma (St. Louis, MO). PSA/vaccinia se proporcionó amablemente por el Dr. Schlom del National Cancer institute, Bethesda, MD.

Ratones, líneas celulares y medios

Los ratones C57BL/6 se adquirieron en Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Los ratones se mantuvieron en la instalación para animales del campus Cook en la Rutgers University, New Brunswick, NJ. Los experimentos con ratones se realizaron de acuerdo con la normativa del Institutional Animal Care and Use Committee de la Rutgers University. Todas las líneas celulares se adquirieron en ATCC (Manassas, VA). La línea celular TRAMPC-1 (adenocarcinoma transgénico de la próstata de ratón (Transgenic Adenocarcinoma of the Mouse Prostate)), obtenida a partir de un ratón C57BL/6, se ha descrito previamente. Las célulasse desarrollaron y se mantuvieron en medio de EaglemodificadoporDulbecco con L-glutamina 4 mMajustado para contener1,5 g/l de bicarbonato sódico y4,5 g/l

de glucosa complementada con 5 µg/ml de insulina bovina, deshidroisoandrosterona 10 nM, suero fetal bovino al 5% y Nu-Serum IV al 5%. Las células de fibrosarcoma MC57G (de origen C57BL/6) se mantuvieron en medio mínimo esencialde Eagle (EMEM)con L-glutamina 2mMyBSSde Earle ajustado para contener1.5g/lbicarbonato sódico, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, y piruvato sódico 1,0 mM y suero fetal bovino al 10%. Las células de linfoma EL4 se mantuvieron en medio de Eagle modificado porDulbecco con L-glutamina 4mMajustado para contener1,5 g/l de bicarbonato sódico y 4,5 g/l de glucosa, suero fetal bovino al 10%. J774A.1, una línea celular de macrófago murino se mantuvo en medioRPMI1640 con L-glutamina 4 mMajustado paracontener 1,5 g/l de bicarbonato sódico y 4,5 g/l de glucosa y suero fetal bovino al 10%. El medio RPMI completo (C-RPMI) contenía RPMI 1640 complementado con glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, y piruvato sódico 1,0 mM y suero fetal bovino al 10%.

Construcción de la vacuna PSA/pCDNA3.1

Todo el marco abierto de lectura de PSA, incluyendo su secuencia de señal se clonó en la estructura del vector pCDNA3.1(-) (Invitrogen) en los sitios XbaI y XhoI. En este plásmido, la expresión de PSA estaba bajo el control del promotorCMVyseconfirmó portransfeccióntransitoriaenlalínea celular293(ATCC).LasecrecióndePSAporlas células transfectadas se confirmó en el sobrenadante de células cultivadas usando un kit ELISA anti-PSA (American Qualex, San Clemente, CA). El plásmido GM-CSF/pCDNA fue donado amablemente por el Dr. Vonderheide, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA.

Construcción de la vacuna Lm-LLO-PSA

El gen que codifica PSA humano (excluyendo su secuencia de señal de secreción) se amplificó usando pfx polimerasa, oligo directo: gtgCTCGAGattgtgggaggctgggagtg (SEQ ID NO: 58), y el oligo inverso: gatACTAGTttaggggttggccacgatgg (SEQ ID NO: 59). Los dos sitios de restricción, XhoI y SpeI que se usaron para la clonación en marco de PSA como una fusión a LLO en pGG55 se indican en letras mayúsculas. El codón de terminación para terminar la traducción de la proteína de fusión LLO-PSA está subrayado en el oligo inverso. El PSA amplificadose clonóenelplásmido de Lm pGG55, como una proteína de fusión a los primeros 441 aminoácidos en el N-terminal de LLO (pAdv34, figura 12), entre los sitios de restricción XhoI y SpeI. El plásmido resultante se secuenció para garantizar la ausencia de mutaciones. El plásmido pAdv34 se sometió a electroporación en la cepa de Lm XFL7 (que carece del gen genómico prfA) y se obtuvo originariamente de la cepa resistente a estreptomicina de Lm 10403s. Se seleccionaron Listeriae que contenían el plásmido (Lm-LLO-PSA) usando cloranfenicol (34 µg/ml) y 250 µg/ml de estreptomicina en placas de infusión de cerebro-corazón (BHI/Chl/S). Las colonias se cribaron por PCR para confirmar la presencia del gen PSA.

Subclonación de LLO-PSA

Un marco abierto de lectura de PSA truncado (GenBank Número de Acceso NM_001648), que carecía de su secuencia de señal de secreción, los primeros 24 AA, se amplificó usando los cebadores: Adv60-PSA(XhoI-no ATG)F: gtgCTCGAGattgtgggaggctgggagtg (SEQ ID No: 58) y Adv61-PSA(SpeI-Stop)R: gatACTAGTttaggggttggccacgatgg (SEQ ID No: 59) y se subclonó en marco con los primeros 441 aminoácidos de LLO (figura 12). La estructura del plásmido, pGG55 (Ejemplo 1), también tiene una copia del gen de virulencia de Listeria prfA, y dos genes de cloranfenicol acetil-transferasa que confieren resistencia al cloranfenicol en las cepas de bacterias tanto Gram-positivas como Gram-negativas. La secuencia AA de LLO-PSA es como se indica a continuación:

(SEQ ID No: 54; la secuencia PSA está subrayada)

Hay una diferencia de AA entre este PSA y la secuencia en NM_001648, en la posición N 221 Y). pGG55-LLO-PSA se sometió a electroporación en XFL-7 de L. monocytogenes (Ejemplo 1).

Crecimiento y almacenamiento de cepas de vacunas bacterianas

Listeria-PSA recombinante se desarrolló en un medio sin productos animales (Caldo Terrific Modificado), en presencia de 34 µg/ml de cloranfenicol y 250 µg/ml de estreptomicina a 37 ºC en una incubadora agitadora. Después de alcanzar una densidad óptica (DO600) de 0,5, que indicaba una fase de crecimiento logarítmica, las bacterias se recogieron por centrifugación, y el gránulo se lavó dos veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se suspendió de nuevo en PBS que contenía glicerol al 2%, después se alicuotó y se almacenó a -80 ºC. Una alícuota se descongeló 1 día después y se valoró para determinar la titulación bacteriana (Unidades Formadoras de Colonias/ml). Las vacunas de Listeria almacenadas de esta manera son estables hasta durante 1 años. Después, estas alícuotas se descongelaron, se diluyeron en 1 x 107 UFC/dosis y se usaron para los estudios de inmunogenicidad como se indica a continuación.

Expresión de LLO-PSA por Lm-LLO-PSA

Se desarrollaron colonias de Lm-LLO-PSA en caldo de BHI/Chl/S a 37 ºC y a 225 rpm durante 8 horas. Las bacterias se separaron delmedio decultivo porcentrifugación a 10.000 g durante 5min ylossobrenadantesse recuperaron. Las proteínas en el sobrenadante de cultivo se precipitaron durante al menos 1 hora en presencia del 10% v/v de ácido tri-cloroacético a 4 ºC y se separaron en un gel al 4-20% por SDS-PAGE. Después de transferir las proteínas sobre membranas de PVDF, la proteína de fusión LLO-PSA se detectó por inmunotransferencia con anticuerpos anti-LLO policlonales de ratón (de elaboración propia) o anti-PSA (Sigma). Lasseñalesse desarrollaron usando el kit cromogénico Western-Breeze (Invitrogen).

Paso in vivo de Lm-LLO-PSA.

Lm-LLO-PSA se pasó in vivo dos veces. En resumen, una dosis de 1 x 106 UFC de Lm-LLO-PSA se inyecto por vía intraperitoneal (i.p.) a ratones de 6-8 semanas de edad. Los bazos se recuperaron 3 días después de la inyección; se prepararon suspensiones de células individuales a partir de los bazos y se pusieron en placas sobre placas de BHI/Chl/S para seleccionar el crecimiento de Lm-LLO-PSA. Este procedimiento se repitió una vez más usando una colonia LLO-PSA positiva del primer pase. Las colonias Lm-LLO-PSA recuperadas después de dos pases in vivo se ensayaron para evaluarla secreción de LLO-PSA.Se escogió un único clonpara usarse para lasecuencia de ADN plasmídico, estudios de tumores y otros ensayos funcionales.

Estudio de la virulencia in vivo

Se realizó un estudio de virulencia para determinar una dosis segura de Lm-LLO-PSA en ratones. A dos grupos de 4 ratones C57BL/6 macho (7 semanas de edad) se les inyectó i.p. dos dosis diferentes de Lm-PSA: 1 x 108 y 5 x 107 UFC/dosis. Los ratones se supervisaron para comprobar síntomas de enfermedad hasta durante 5 días después de la inoculación.

Secuenciación de plásmidos

Lm-LLO-PSA se desarrolló durante una noche en 200 ml de BHI/Chl/S a 37 ºC y 225 rpm. Las bacterias se

5 separaron del caldo de cultivo por centrifugación a 10.000 g a 4 ºC durante 10 min. El sedimento bacteriano se trató con lisozima (2 mg/ml) a 37 ºC durante 30 min para romper la pared celular. El plásmido pAdv34 se purificó usando el kit PureLink plasmid midiprep (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se secuenció en su totalidad por elmétodo de terminador de cadena didesoxi.

10 RESULTADOS

Se creó una cepa de Listeria que expresa una LLO no hemolítica fusionada a un PSA truncado (peptidasa relacionada con la calicreína 3). La cepa recombinante de Listeria resultante secreta una proteína del tamaño predicho para LLO-PSA (75 Kd), que se detecta tanto por el anticuerpo anti-LLO como anti-PSA, mostrando que la

15 proteína LLO-PSA se expresó y se secretó (figura 13).

Generación de L. monocytogenes recombinante que expresa PSA. El gen que codifica PSA humano se clonó como una proteína de fusión con un segmento truncado no hemolítico de LLO, que contiene una secuencia PEST conservada en suN terminal (figura 12).La estructura plasmídica pGG55comose ha descrito previamente,permite

20 la expresión y secreción de proteínas de fusión LLO de un origen episomal por la cepa atenuada de Lm XFL7, que carece del factor de virulencia genómica prfA. El gen prfA se requiere para la supervivencia in vivo de Lm y, por lo tanto, se complementa por una copia llevada en el plásmido. La secuencia de señal de PSA se eliminó para evitar cualquier intervención de esta secuencia con la secreción apropiada de la proteína de fusión LLO-PSA, que está mediada por la secuencia de señal de secreción de LLO en Lm-LLO-PSA.

25 Lm-LLO-PSA puede expresar y secretar la proteína de fusión LLO-PSA. La expresión y secreción de la proteína de fusión LLO-PSA de Lm se ensayó en los sobrenadantes del cultivo celular después del crecimiento in vitro de las bacterias. Se ensayaron cuatro colonias de Lm-LLO-PSA y todas fueron capaces de secretar la proteína de fusión LLO-PSA según se detectó con los tanto con los anticuerpos anti-LLO como anti-PSA (figura 13). Esta secreción se

30 mantuvo en bacterias aisladas después de dos pases in vivo en los ratones (datos no mostrados), sugiriendo que el plásmido es estable y se retiene in vivo durante al menos tres días. Con el fin de confirmar la estabilidad, se extrajo pAdv34 del Lm-LLO-PSA de pase y se secuencia en su totalidad. No se detectó ninguna mutación en la estructura plasmídica o el gen PSA después de dos pases in vivo, en comparación con el plásmido de referencia pGG55 y la secuencia del gen PSA humano (NCBI: NM_001648). Para determinar una dosis segura de Lm-LLO-PSA a usar

35 para los estudios en animales, dos dosis de este constructo se ensayaron en ratones por inyección i.p. (1 x 108 y 5 x 107UFC/dosis).La dosis usada en los experimentos animales (1 x107UFC/ratón) se definió como un décimo de la dosismínima que se observó que tenía un efecto perjudicialsobre los ratones inmunizados.

Para ensayar la estabilidad in vitro de Lm-PSA, la cepa se desarrolló y se pasó durante 7 días consecutivos en caldo

40 terrific modificado. Después de este tiempo, las bacterias retuvieron el plásmido, el plásmido contenía el gen y no hubo ninguna deleción o re-disposición en el plásmido, lo que indica estabilidad plasmídica (figura 22).

Para ensayar la estabilidad in vivo de Lm-PSA, la cepa se pasó dos veces a través de los ratones. Después, el plásmido se secuenció por Genewiz™ y se descubrió que tenía la siguiente secuencia:

La secuencia corresponde exactamente a la secuencia predicha del PSA clonado en pGG55. El marco abierto de lectura de LLO-PSA está subrayado; las letrasminúsculas indican la secuencia de PSA en solitario.

EJEMPLO 8: LOS CONSTRUCTOS DE LISTERIA-LLO-PSA PROVOCAN LINFOCITOS T CITOTÓXICOS ESPECÍFICOSDEANTÍGENO YPROPORCIONAN PROTECCIÓN TUMORAL-I

MATERIALES Y MÉTODOS EXPERIMENTALES

Ensayos CTL

Ratones C57BL/6 macho se inmunizaron i.p. con 0,1 DL50 de Lm-PSA o 0,1 DL50 de Lm-HPV16E7E6TM y se reforzaron 1 vez después de 2 semanas. Los bazos se recuperaron 6 días después de la dosis de refuerzo. Los esplenocitos aislados se prepararon y se estimularon durante 5 días con células MC57G tratadas con mitomicina e infectadas con PSA-vaccinia como alimentadores. En el primer experimento, se realizó un ensayo CTL células EL4 pulsadas con el péptido PSA H2Db (1 µM, HCIRNKSVIL; SEQ ID No: 60) como dianas marcadas con 100 µM de europio (Sigma), usando las siguientes relaciones E:T: 25:1, 8:1, 2,8:1, 0,9:1, 0,3:1, 0,1:1 y 0,03:1. Después de una incubación de 4 horas de dianas mixtas y efectores, las células se separaron del sobrenadante de cultivo por centrifugación. El europio liberado de las células lisadas en el sobrenadante se determinó como se indica a continuación: Se añadieron 10 µl del sobrenadante a 100 µl de solución de potenciación de Europio (Delfia). La absorbancia se leyó a 590 nm usando un electrofotómetro Victor II (Perkin Elmer). La liberación máxima de Europio se determinó a partir del sobrenadante de las células diana marcadas con triton X-100 al 1% y la liberación espontánea se determinó a partir de las células diana incubadas en ausencia de células efectoras. En el segundo experimento, la relación E:T se mantuvo constante a 25:1, y las concentraciones peptídicas variaron como se indicó. El porcentaje de lisis específica se determinó como [(liberación experimental -liberación espontánea)/(liberación máxima -liberación espontánea)] x 100.

Ensayos de secreción de citocinas

Ratones C57BL/6 macho se inmunizaron con Lm-PSA o Listeria que expresaban diferentes fragmentos de antígeno de tumor de Wilm (control negativo) o se dejaron sin inmunizar. Los ratones se reforzaron una vez después de dos semanas y los bazos se recuperaron 6 días después de la dosis de refuerzo. Los esplenocitos aislados se prepararon y se estimularon in vitro durante una noche en presencia del péptido PSA H2Db 1 µM. La secreción de IFN-γ por los esplenocitos aislados se determinó por ensayo ELISpot.

Cultivo celular, materiales y reactivos

Las células de adenocarcinoma de próstata de ratón TRAMP-C1 obtenidas a partir de un tumor de próstata de ratón C57BL/6 se adquirieron en ATCC. Esta línea celular es negativa para la expresión de PSA. Las células se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco con L-glutamina 4 mM ajustado para contener 1,5 g/l de bicarbonato sódico y 4,5 g/l de glucosa complementada con 0,005 mg/ml de insulina bovina y deshidroisoandrosterona 10 nM, 90%; suero fetal bovino, 5%; Nu-Serum IV, 5%. El gen que codifica la proteína PSA humana de longitud completa, incluyendo su secuencia de señal, se subclonó en un plásmido pUV6/v5 (Invitrogen). Después delaconfirmación delasecuenciacorrecta,el plásmido se linearizó yse transfectóencélulas TRAMP-C1

usando Lipofectamina 2000™ (Invitrogen). Los clones positivos se seleccionaron en presencia de 10 µg/ml de blasticidina. Varios clones PSA que se expresan de forma estable se aislaron y se ensayaron para comprobar la secreción de PSA humano en elmedio de cultivo celular.

Inoculación tumoral subcutánea

Dos clones diferentes de células TRAMP-C1 que expresan PSA se resuspendieron en 5 x 106células por 200 mcl de dosis. Ratones C57BL/6 macho (8 por grupo, 6-8 semanas de edad) se inocularon s.c. en el costado izquierdo.

Estudios de regresión tumoral

Siete días después de la inoculación del tumor, los ratones se inmunizan con 0,1 DL50 de Lm-PSA (107 UFC), 0,1 DL50 de Lm-HPV16E7 o PBS. Se administran dos dosis de refuerzo los días 15 y 25 después de la inoculación del tumor. Los tumores se supervisan durante 90 días. El tamaño del tumor se define como la media de dos diámetros perpendiculares.

Inyección ortotópica de células tumorales de próstata

Ratones C57BL/6 macho se seis semanas de edad se anestesian con isoflurano al 2%. En un campo estéril, se hace unaincisión en lalínea mediainferiorpara accederalapróstata.En ellóbuloizquierdodelapróstatadorsalse inyectan 1 x 105 células tumorales TRAMPC-1/PSA de una suspensión de una única célula en PBS, usando una

aguja de calibre 27 equipada en una jeringa Hamilton de 50 µl. Los ratones se suturan, y las suturas se eliminan 10 días después de la cirugía. Siete días más tarde, los ratones se inmunizan i.v. con Lm-PSA, LmHPV16E7 o PBS. Los ratones se sacrifican en diferentes puntos temporales, las próstatas se retiran quirúrgicamente y se pesan para determinar el crecimiento del tumor.

Estudios de protección tumoral

Ratones C57BL/6 se inmunizan y se refuerzan con Lm-PSA, LmHPV16E7 o PBS, como se ha descrito en el Ejemplo anterior. Siete días después de la dosis de refuerzo, a los ratones se les inyectan s.c. 5 x 106 células tumorales TRAMPC-1/PSA. El crecimiento de los tumoresse supervisa midiendo con un calibre durante 90 días.

Inhibición de metástasis de cáncer de próstata

Para una inoculación ortotópica de tumor, se anestesian ratones C57BL/6 macho de 8-10 semanas de edad (Jackson labs) con isoflurano. Se hace una incisión en la piel abdominal baja craneal a las glándulas prepuciales, y las vesículas seminales se exteriorizan cuidadosamente para exponer la próstata dorso-lateral. Usando una jeringa de insulina de calibre 29, 5 x 105 células TRAMPC-1/PSA suspendidas en PBS se inyectan en la próstata dorsolateral en un volumen de 20 l. Las vesículas seminales y la próstata se mantienen durante un minuto para permitir que las células inyectadas se establezcan en la glándula y después se reemplazan suavemente en la cavidad abdominal. La pared del cuerpo y las heridas de la piel cerradas se cierran con 5-0 PDS y 5-0 nylon, respectivamente.

Se deja quelostumoressedesarrollendurante 50 días.El tumorprincipalseeliminadurantelanecropsia,se fija en formalina, después se impregna en parafina, se secciona y se tiñe con H&E. Los nodos linfáticos agrandados de la región paralumbar se visualizan bajo microscopía quirúrgica, después se diseccionan, se fijan, se impregnan y se analizan histológicamente para determinar la presencia de células de cáncer de próstata.

Inmunotinción tisular

Los tejidos de tumor de próstata fijados en formalina se impregnan en parafina, se seccionan, se aplican a Plus slides™(VWR Corp), y despuésse tiñen usando un sistema de autotinción Dako. Los cortesse trataron previamente con peróxido de hidrógeno al 3,0% durante 10 minutos, después se aclararon y se trataron con una solución de 10

µg/ml de solución de proteinasa K durante 3 minutos para potenciar la recuperación antigénica. Los sitios de unión no específicosse bloquean mediante la adición de suero de cabra normal durante 30 minutos, y después se aplica al tejido durante 30 minutos una solución de 10 µg/ml de anticuerpo PSA anti-humano de conejo (Sigma) o un antígeno nuclear de células proliferativas anti-humano de ratón (AB15497, AbCam antibodies). El anticuerpo principal se retira mediante lavado, y se aplica un anticuerpo secundario marcado con peroxidasa de rábano rusticano apropiado durante un periodo de 30 minutos y se detecta usando un sustrato NovaRed™ (Vector Labs, Burlingame, CA) en una incubación de 8 minutos. Los cortesse contratiñen con hematoxilina antes delsecado.

Las células de los cortes de las secciones principal y del nodo linfático se puntúan como positivas o negativas para PSA humano. Se seleccionan de forma aleatoria cuatro regiones de cada corte, y se puntúan 20 células de cada región. La tinción de PSA en tumoresse compara con las metástasis del nodo linfático delmismo ratón.

Cepas de Listeria

Las vacunas de Listeria se preparan y se almacenan como se ha descrito en el Ejemplo anterior.

RESULTADOS

Para ensayar la inmunogenicidad de LLO-PSA, ratones C57BL/6 de 6-8 semanas de edad (Jackson Laboratories) se inmunizaron i.p. con Lm-PSA (0,1 DL50, 1 x 107 UFC/dosis) o Lm-HPV16E7E6TM (control negativo, 0,1 DL50, 1 x 106 UFC/dosis) o se dejaron sin inmunizar. Los esplenocitos de ratones vacunados se ensayaron para determinar su capacidad para reconocer y lisar células que presentan el péptido PSA in vitro en un ensayo CTL. Los esplenocitos de los ratones inmunizados fueron capaces de reconocer y lisar células de tumor pulsadas con el péptido PSA con una elevada eficacia (figura 20A). Adicionalmente, la respuesta fue dependiente de la dosis con respecto a la cantidad de antígeno que presentaban las células diana (figura 20B).

En ensayos adicionales, los ratones se inmunizaron con Lm-PSA o cepas que expresan fragmentos de antígeno de tumor de Wilm (control negativo), y se determinó la secreción de citocinas, en respuesta a la incubación con el péptido PSA. Los esplenocitos de los ratones vacunados mostraban altos niveles de secreción de IFN-γ (figura 18).

Por lo tanto, las cepas de LM que expresan PSA y las fusiones LLO-PSA son eficaces en la inducción de CTL

específicos de antígeno que son capaces de la lisis de células diana y la secreción de IFN-γ. Por consiguiente, las cepas de LM que expresan PSA y las fusiones LLO-PSA son eficaces en la vacunación terapéutica y profiláctica frente a un cáncer de próstata que expresa PSA.

Las vacunas de Listeria que se han descrito en el Ejemplo anterior se usan en experimentos de protección tumoral en un modelo animal de carcinoma de próstata ortotópico. Los ratones se inmunizan con Lm-PSA, LmHPV16E7 o PBS, despuésse les inyectó TRAMPC-1. Lm-PSA protege a los ratones de la formación de tumores.

En experimentos adicionales, a los ratones se les inyectó en primer lugar células de cáncer de próstata TRAMPC-1/PSA, se vacunaronconLm-PSA,LmHPV16E7 o PBS4 díasmás tarde yse reforzaronconlamisma vacuna.Lm-PSA impide el crecimiento de metástasis prostáticas.

Por lo tanto, las cepas de LM que producen PSAy las fusiones LLO-PSA inducen la protección frente a tumores.

EJEMPLO 9: LOS CONSTRUCTOS DE LISTERIA-LLO-PSA PROVOCAN LINFOCITOS T CITOTÓXICOS ESPECÍFICOSDEANTÍGENO YPROPORCIONAN PROTECCIÓN TUMORAL-II MATERIALES Y MÉTODOS EXPERIMENTALES Estudio de invasión por macrófagos in vitro. Las células J774A.1 de tipo macrófago murino se pusieron en

placas a 1 x 106 células por pocillo de placas de 24 pocillos. El día después, las células se infectaron en MOI de 1:1 con diferentes cepas de Lm durante 1 hora en ausencia de antibióticos. Las bacterias extracelulares se eliminaron mediante lavado e incubación de las células en un medio que contenía 50 µg/ml de gentamicina durante 30 min a 37 ºC y CO2 al 5%. El crecimiento bacteriano intracelular se supervisó tomando muestras en diferentes puntos temporales hasta durante 8 horas seguido de valoración de las bacterias en placas de BHI después de lisar las células con dH2O.

Eficacia anti-tumoral. TRAMPC-1 es una línea celular de tumor de próstata de adenocarcinoma murino en el fondo de ratón C57BL/6 yse usó para construirunmodelo de tumorde próstataque secreta PSApara ensayarlaeficacia de Lm-LLO-PSAcomounavacuna.Elmarco abierto delectura dePSAhumanocompleto,incluyendosu secuencia de señal de secreción en el N-terminal de la molécula, se clonó bajo el control del promotor UbC en el plásmido pUB6/V5 (Invitrogen). El plásmido resultante (pAdv63) se secuenció para la confirmación de la secuencia génica PSA correcta y después se transfectó en la línea celular TRAMPC-1 usando lipofectamina 2000 (Invitrogen). Las células transfectadas se seleccionaron cultivando las células en un medio que contenía 10 µg/ml de blasticidina (Invitrogen). Los clones individuales se aislaron mediante el método de dilución limitante y se cribaron para la secreción de PSA en el medio de cultivo extracelular usando un kit ELISA de PSA anti-humano. Se obtuvieron varios clones positivos, se expandieron y se almacenaron en nitrógeno líquido. Se seleccionó un clon (T-PSA23) para estudios adicionales.

Estudio de regresión tumoral. Tres grupos de 8 ratones C57BL/6 macho (6-8 semanas de edad)se inocularon s.c. en el costado derecho con 5 x 106 células T-PSA23. Siete días más tarde, cuando los tumores alcanzaron un diámetro medio de 4-5 mm, se inmunizaron i.p. con Lm-LLO-PSA (1 x 107 UFC/dosis), Lm-LLO-E7 (1 x 108 UFC/dosis) o no se trataron. Lm-LLO-E7quese ha descrito previamente porGunn ycol.,seconstruyó dela misma manera que Lm-LLO-PSA, pero en lugar de PSA, expresó HPV16E7 y se usó en este experimento como un control irrelevante de Lm. Las inmunizaciones se repitieron dos veces con intervalos de 1 semana. Los tumores se supervisaron semanalmente durante siete semanas. Se recogieron muestras de sangre de todos los animales experimentales el día 40 después de la inoculación del tumor de la vena de la cola, y la presencia de la proteína PSA en los sueros se ensayó usando el kit ELISA de PSA. Para estudios de comparación, las células tumorales se inyectaron como se ha descrito anteriormente. Los ratones se inmunizaron dos veces con Lm-LLO-PSA (1 x 107 UFC/dosis en 200 µl de PBS), un PSA-vaccinia recombinante (1 x 107 UFP/dosis en 200 µl de PBS, i.p.) o una vacuna de pDNA que comprende una mezcla de PSA/pCDNA3.1 (100 µg) con GM-CSF/pCDNA3.1 (100 µg)en 50 µl de volumen, por inyección intramuscular en el cuadriceps izquierdo. Los tumores se supervisaron una vez a la semana usando un calibre electrónico y el tamaño de los tumores se expresó como la media de dos diámetros perpendiculares.

Estudios de inmunogenicidad en ratones

Ensayo ELISpot: Grupos de 4-5 ratones macho C57BL/6 (6-8 semanas de edad) se inmunizaron tres veces con Lm-LLO-PSA o un constructo similar que contenía un antígeno irrelevante como control negativo (Lm-LLO-WT1), o no se inmunizaron (sin tratar).Seis díasdespuésde la dosisde refuerzo,losbazosse recuperaron yse procesaron para dar una suspensión de célula única. Los glóbulos rojos se lisaron por incubación de 2 min con solución de lisado ACK seguida de doslavadoscon medioC-RPMI.Los esplenocitosaisladossecolocaron enplacasen2 x105 células/pocillo en presencia del péptido PSA65-74 1 µM (epítopo PSA H2Db-restringido HCIRNKSVIL) en placas ELISpot cubiertas previamente con anticuerpo IFN-γ de ratón (mAb AN18). Las placas se incubaron durante una noche a 37 ºC. Las células formadoras de puntos (SFC) se detectaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Mabtech AB). Los puntos se contaron usando un microscopio de disección.

Tinción intracelular para IFN-γ. Los esplenocitos aislados de los ratones inmunizados, de control o sin tratar se estimularon en 2 x 106 células/pocillo durante 5 h en placas de 96 pocillos de fondo redondo con 1 µM de péptido PSA65-74 o péptidos de control en presencia de IL-2 (50 U/ml) y monensina A (StopGolgi, BD Biosciences). Las células incubadas en el medio sin péptido se usaron como control negativo. Después de la incubación, las célulasse tiñeron con anticuerpos CD8-FITC, CD3-PerCP-Cy5.5 y CD62L-APC anti-ratón. Posteriormente, las células se permeabilizaron y se tiñeron con anticuerpo IFNγ-PE anti-ratón y se analizaron en un citómetro FACS Calibur (BD

Biosciences). Los datos se analizaron usando el software CellQuest Pro. Las células se separaron como CD3+CD8+CD62Lbaja y el número de células IFN-γ-positivas se expresó como un porcentaje de células separadas totales.

Ensayo de citotoxicidad. La actividad citotóxica de linfocitos T en respuesta a la vacunación con Lm-LLO-PSA se midió por un ensayo CTL específico de PSA. A grupos de 4 ratones macho C57BL/6 se les inyectaron i.p. tres dosis de Lm-LLO-PSA (1 x 107 UFC) o una Listeria que expresa un antígeno irrelevante (HPV16E7E6), con intervalos de una semana. El grupo sin tratar no recibió inmunización alguna. Los bazos de los ratones inmunizados y sin tratar se recuperaron 6 días después de la última dosis de refuerzo. Los esplenocitos se incubaron durante 5 días en medio C-RPMI que contenía 20 U/ml de ratón IL-2 (Sigma), en presencia de células MC57G infectadas con PSA/vaccinia (MOI 5 durante 4 horas) y se trataron con mitomicina C en una relación efector:estimulador de 1:20. El ensayo de citotoxicidad se realizó durante 4 horas incubando las células efectoras con células diana EL4, se pulsaron durante 1 hora con el péptido H2Db, PSA65-74 y se marcaron con europio. El Europio liberado de las células lisadas se midió mezclando una muestra del sobrenadante del cultivo celular con una solución de potenciación de europio (Delfia/Perkin Elmer, Waltham, MA) y una lectura de la absorbancia a 590 nm (Perkin Elmer/Wallac, VictorII). Se realizaron dos conjuntos de ensayos: a) usando diferentes relaciones efector:diana (E:T) a una concentración peptídica fija de 1 µM; y b) usando diferentes concentraciones del péptido PSA a una relación fija E:T de 25:1. Los valores SC50 se calcularon como la concentración de péptidos requerida para el 50% del valor de la concentración peptídica máxima usada (1 µM) menos el nivel de fondo a 0 µM.

Análisis de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL): Las células T-PSA23 impregnadas en matrigel se inocularon

s.c. en el costado derecho de ratones C57BL/6 macho, que se inmunizaron los días 7 y 14 con Lm-LLO-PSA, una vacuna de control de Lm o se dejaron sin tratar. El día 20, los tumores se extirparon quirúrgicamente, se lavaron en PBS enfriado con hielo y se picaron con un escalpelo. El tumor se incubó en una solución de recuperación celular de matrigel (BD Biosciences) durante 2 horas sobre hielo. Se liberaron adicionalmente TIL por ruptura mecánica del tejido en un filtro de células usando un émbolo de jeringa. Las células aisladas se tiñeron con un PSA65-74 H-2Db tetrámero-PE y anticuerpos CD8-FITC, CD3-PerCP-Cy5.5 y CD62L-APC anti-ratón para caracterizar CTL específicos para el epítopo PSA. Para analizar los linfocitos T reguladores en el tumor, también se tiñeron TIL con CD4-FITC, CD3-PerCP-Cy5.5 y CD25-APC. Posteriormente, las células se permeabilizaron y se tiñeron con anticuerpo anti-FoxP3-PE (Milteny Biotec). Las células se analizaron en un citómetro FACS Calibur (BD Biosciences). Los datos se analizaron usando el software CellQuest Pro. Los linfocitos T reguladores se definieron como células CD3+CD4+CD25+Fop3+.

Análisis estadístico: Se aplicaron pruebas no paramétricas de Mann-Whitney y Kruskal Wallis para comparar los tamaños tumorales entre diferentes grupos de tratamiento. Los tamaños tumorales se compararon el día 40 para su análisis estadístico, ya que éste fue el último punto temporal con el mayor número de ratones en cada grupo. La prueba tde studentseusópara compararlasmediasenlosexperimentos ELISpot. Un valorp de menosde0,05 se consideró estadísticamente significativo en estos análisis.

RESULTADOS

Lm-LLO-PSA es capaz de infectar macrófagos in vitro. La captación por células que presentan antígeno tales como células dendríticas y macrófagos es un requisito básico para vacunas basadas en Lm para administrar con éxito y presentar antígenos en elsistema inmune. Esta propiedad puede ensayarse in vitro infectando la línea celular de tipo macrófago murino J774A.1 y cuantificando el crecimiento bacteriano intracelular, que es una indicación de que la cepa de vacuna de Lm ha sido capaz de entrar apropiadamente en las células y multiplicarse. En este ensayo, Lm-LLO-PSA se mostró capaz de invadir macrófagos y crecer de manera similar a la cepa de tipo silvestre de Lm 10403s. Por el contrario, la cepa de Lm XFL7, que carece de prfA y no escapa del fagolisosoma, no es capaz de proliferar en células J774A.1 y su titulación permanece constante varias horas tras la infección (figura 14). La complementación de prfA en la cepa de Lm XFL7 con el plásmido pAdv34 dio como resultado la restauración de las propiedades invasivas in vitro de la cepa y esto fue comparable a las de la cepa de tipo silvestre.

Lm-LLO-PSA causa la regresión de tumores que expresan PSA pre-establecidos en ratones. La eficacia de Lm-LLO-PSA en la regresión de tumores que expresan PSA se ensayó en un modelo de ratón usando una línea celular TRAMPC-1 transfectada con PSA. Las células TrampC-1, obtenidas originariamente a partir de un tumor de adenocarcinoma de próstata murino, se transfectan de forma estable con el gen PSA humano bajo el control del promotor de Ubiquitina C humana. La secreción de PSA por células transfectadas se confirma por ELISA. Se expandieron cuatro clones ysepasaron por25 generaciones en ausencia del marcadorde selección de antibiótico, blasticidina. Los sobrenadantes del cultivo celular se ensayaron para comprobar los niveles de secreción de PSA que se mostraron comparables entre las células en un pase temprano y el pase 25 (datos no mostrados). Uno de estos clones retuvieron tumorigenicidad in vivo y formaron tumores sólidos tras la inoculación s.c. en ratones C57BL/6 macho. Un pase temprano de este clon se usó para los estudios de tumor y se denomina como T-PSA23. A tres grupos de 8 ratones se inocularon s.c. 5 x 106 células T-PSA23 y se supervisaron para comprobar el crecimiento tumoral diario. Después de 7 días, se detectó una masa tumoral sólida de 4-5 mm de diámetro en 7 de 8 ratones en cada grupo (figura 15). En este momento, los ratones se inmunizaron con Lm-LLO-PSA (1 x 107 UFC/ratón), Lm-LLO-E7 (1 x 108 UFC/ratón) o se dejaron sin tratar. La inmunización primaria se siguió de dos dosis de refuerzo en intervalos de 1 semana con la misma dosis que la principal. Los ratones (7 de 8) en cada uno de los grupos de control desarrollaron tumores de crecimiento lento que alcanzaron un diámetro de 2 cm en 7 semanas después delainoculación(figura 15),momentoen elque se sacrificaron.Un ratón en cada gruponomostró ningún síntoma de tumor en ningún momento. Cinco días después de la primera inmunización, se observó una reducción del tumor en 7 de 8 del grupo inmunizado con Lm-LLO-PSA y se observó una regresión tumoral completa en 5 de estos ratones después de 1 semana. Uno de los tumores en el grupo inmunizado con Lm-LLO-PSA permaneció estable hasta la tercera inmunización. Sin embargo, una semana después de la tercera vacunación, este tumor también regresó y se volvió indetectable. Otro ratón en este grupo desarrolló un tumor de crecimiento lento que alcanzó un tamaño de 18-20 mm en 7 semanas y se sacrificó. Al final del estudio en la semana 8 después de la inoculación del tumor, 7 de 8 ratones en el grupo inmunizado con Lm-LLO-PSA estaban libres de tumores. Este experimento se repitió dos veces con resultados similares. El análisis no paramétrico estadístico de Kruskal-Wallis se realizó sobre los tamaños de tumor el día 40, antes de que los ratones en los grupos sin tratar y Lm-LLO-E7 se sacrificaran. No hubo ninguna diferencia estadísticamente significativa entre los tamaños tumorales de los ratones en el grupo sin tratar y los ratones inmunizados con Lm-LLO-E7 (p = 0,613). Sin embargo, se demostró que la inmunización con Lm-LLO-PSA tuvo un impacto significativo sobre el crecimiento del tumor T-PSA23 (p = 0,002). Las muestras de suero de controles y ratones inmunizados con Lm-LLO-PSA se recogieron el día 40 después de la estimulación del tumor y se ensayaron para comprobar la presencia de PSA usando un kit ELISA PSA anti-humano (American Qualex). Se detectaron niveles significativos de PSA (5-10 ng/ml) en el suero de ratones de control y en el ratón en el grupo de Lm-LLO-PSA que tenía tumores. No se encontró PSA en el suero de ratones inmunizados con Lm-LLO-PSA después de la regresión tumoral.

Lm-LLO-PSA provoca respuestas inmunes celulares contra PSA tanto en bazos como en tumores. Para dilucidar si la vacunación con Lm-LLO-PSA indujo CTL específicos de PSA capaces de infiltrar el tumor, a los ratones se les implantó s.c. con una mezcla de células T-PSA23 + matrigel y se inmunizaron con dos dosis de Lm-LLO-PSA, Lm-LLO-E7 o ninguna. Los bazos y tumores se recuperaron 6 días después de la última inmunización y se ensayaron para comprobar la presencia de linfocitos T CD8+/PSA65-74(H2Db restringido) tetrámero positivo mediante análisis FACS. No se observó ninguna respuesta anti-PSA significativa en los bazos de ratones sin tratar (0,05%) o vacunados con Lm-LLO-E7 (0,09%) (figura 16, panelsuperior). Sin embargo, tras la inmunización con Lm-LLO-PSA, se encontró un número significativo de linfocitos T CD8+ específicos de PSA en los bazos. De forma interesante, cuando se ensayaron los tumores extirpados de estos ratones para comprobar la presencia de TIL, se identificó un bajo número de linfocitos T CD8+ específicos de PSA tanto en ratones sin tratar como inmunizados con Lm-LLO-E7 (1,5% y 0,51% respectivamente). La inmunización con Lm-LLO-PSA causó un aumento considerable en este número ya que se demostró que el 16,1% de todos los TIL CD8+ era específico de PSA65-74 (figura 16 panel inferior).

La inmunización con Lm-LLO-PSA causa una disminución de los linfocitos T reguladores en los tumores pero no en los bazos. La presencia de linfocitos infiltrantes de tumor T reguladores (Treg) CD4+/CD25+/FoxP3+ ha demostrado estar asociada al aumento de la posibilidad de progresión tumoral. Por lo tanto, se examinó la presencia de esta población de linfocitos T en tumores de ratones inmunizados con Lm-LLO-PSA o de control. De forma interesante, la inmunización con Lm-LLO-PSA o Lm-LLO-E7 causó un descenso considerable en la frecuencia de Tregs en los tumores en comparación con los tumores de ratones sin tratar (figura 17). De hecho, Lm -LLO-PSA tenía ligeramente más impacto que Lm-LLO-E7 en la frecuencia de Treg infiltrantes de tumor. Por otro lado, no hubo ninguna diferencia significativa entre los porcentajes de linfocitos T CD4+/CD25+/FoxP3+ aislados de los bazos de ratones de Lm-LLO-PSA o de control.

La inmunización con Lm-LLO-PSA da como resultado fuertes respuestas inmunes celulares contra PSA. Las respuestas inmunes provocadas por vacunas basadas en Lm han demostrado que dan como resultado respuestas celulares, en lugar de humorales. Se investigó la activación y funcionalidad de linfocitos T CD8+ inducidos por Lm-LLO-PSA en bazos de ratones inmunizados.

Secreción de citocinas. La secreción de IFN-γ por linfocitos T activados en respuesta a una estimulación in vitro con péptido H2Db PSA se ensayó por ELISpot y tinción intracelular de citocinas. Los ratones se inmunizaron tres veces con Lm-LLO-PSA o Lm-LLO-WT-1 (Lm-LLO-Antígeno de tumor de Wilm como control negativo) o se dejaron sin inmunizar(sin tratar).Después,los esplenocitosaisladosse prepararon yse incubaroncon elpéptido PSAylas células CD8+ secretoras de IFN-γ se cuantificaron. En ambos ensayos, los ratones inmunizados con Lm-LLO-PSA mostraron un número significativamente mayor de células secretoras de IFN-γ en respuesta a la pulsación peptídica que los controles negativos (p<0,001). El número de células secretoras IFN-γ medido por ensayo ELISpot, era aproximadamente 11 veces mayor que los controles (figura 18). Al ensayarse por tinción intracelular de citocinas para IFN-γ, se detectó un aumento de 30 veces en el número de células secretoras de IFN-γ CD8+CD62Lbaja de ratones inmunizados con Lm-LLO-PSA en comparación con el control (4,22% para Lm-LLO-PSA frente al 0,15% para ratones sin tratar) (figura 19).

Ensayo de citotoxicidad (CTL). Con el fin de determinar la actividad funcional de los linfocitos T específicos para PSA, los esplenocitos de ratones inmunizados o sin tratar se ensayaron en un ensayo CTL contra células pulsadas con el péptido H2Db PSA. Usando una concentración de péptidos fija (1 µM), los esplenocitos de ratones inmunizados con Lm-LLO-PSA mostraron una lisis específica máxima del 60%, que se redujo en proporción con la relación E:T (figura 20A). Este resultado fue dependiente de la concentración peptídica en el ensayo de lisis con un valor máximo que alcanza una concentración peptídica de únicamente 0,1 µM (figura 20B). El valor SC50 de la población policlonal, que es una medida útil de la avidez de linfocitos T media era aproximadamente 1 pM. Los resultados de este experimento también confirmaron que la inmunización con Lm-LLO-PSA generó linfocitos T

citolíticos específicos de alta avidez capaces de lisar células que muestran el antígeno diana PSA.

Comparación de los efectos anti-tumorales de Lm-LLO-PSA con otras modalidades de vacuna basada en PSA. Finalmente, para evaluar adicionalmente la vacuna de Lm-LLO-PSA se comparó su eficacia antitumoral con dos vacunas basadas en PSA diferentes que se habían descrito en la bibliografía, es decir, un ADN recombinante y una vacuna basada en vaccinia. Para ello, el marco abierto de lectura completo de PSA se clonó en pCDNA3.1 bajo el control del promotor hCMV (pAdv40.1). Una vacuna de ADN similar se describió previamente por Roos y col. usando una estructura de vector similar, es decir, pVax (Invitrogen). La diferencia entre las dos estructuras de vector (pCDNA3.1 y pVax) está únicamente en su marcador de selección de antibiótico. pAdv40.1 se inyecto i.m. como una mezcla con GM-CSF/pCDNA,quese ha usado como un adyuvante eficazparaotras vacunasde ADN.La expresión de PSA del plásmido PSA/pCDNA se confirmó por transfección in vitro en la línea celular 293FT (datos no mostrados). PSA-vaccinia recombinante se ha descrito previamente por Hudge y col. Los ratonesse implantaron con células tumorales T-PSA23 como se ha descrito anteriormente y después se inmunizaron dos veces con cada una de las vacunas por la dosis óptima y la ruta de administración como se cita en la bibliografía. La inmunización PSA/vaccinia no tuvo ningún impacto sobre el crecimiento de tumores T-PSA23 ya que todos los ratones sin tratar e inmunizados con PSA/vaccinia desarrollaron tumores que alcanzaron un tamaño de 20 cm en 7-8 semanas y tuvieron que sacrificarse (figura 21b). Sin embargo, 1 de 8 ratones inmunizados con la vacuna PSA/ADN y 3 de 8 ratones vacunados con Lm-LLO-PSA permanecieron sin tumor durante 90 días, momento en el que el estudio se terminó (figura 21A y el inserto de la tabla). Este experimento se repitió dos veces mostrando resultados similares. Por lo tanto, Lm-LLO-PSA demostró ser la vacuna más eficaz de las tres modalidades PSA-vaccinia en la regresión de los tumores establecidos que expresan PSA. Ha de apreciarse que en los estudios de comparación, debido a la disponibilidad limitada de las otras dos vacunas, únicamente se administraron dos dosis. Por lo tanto, Lm-LLO-PSA se mostró menos eficaz (la regresión tumoral completa se observó en únicamente 3 de 8) que al inyectarse tres veces (donde 7 de 8 tumores regresaron, como se observa en la figura 15). Esta observaciónse confirmó en varios estudios distintos (datos no mostrados).

EJEMPLO COMPARATIVO 10: LOS CONSTRUCTOS DE LISTERIA-LLO-FOLATO HIDROLASA 1 (FOLH1) Y LISTERIA-LLO-ANTÍGENO DE CÉLULAS MADRE DE PRÓSTATA (PSCA) PROVOCAN LINFOCITOS T CITOTÓXICOS ESPECÍFICOS DE ANTÍGENO

MATERIALES Y MÉTODOS EXPERIMENTALES

Crecimiento y almacenamiento de cepas de vacunas bacterianas

Se dejaron crecer Listeria-LLO-FOLH1 y Listeria-LLO-PSCA recombinantes y se mantienen como se ha descrito para Listerin-PSA en el Ejemplo 7 anterior.

RESULTADOS

Un gen que codifica una FOLH1 truncada, que contiene el marco abierto de lectura completo de FOLH1, excepto para su secuencia de señal de secreción, se fusiona a un gen que codifica un fragmento no hemolítico truncado de Listeriolisina O, de una manera similar a la que se ha descrito para KLK3 en el Ejemplo 7 anterior. De forma análoga, un gen que codifica un PSCA truncado, que contiene el marco abierto de lectura completo de PSCA, excepto para su secuencia de señal de secreción, se fusiona a un gen que codifica un fragmento no hemolítico truncado de Listeriolisina O. Cada gen se clona en el plásmido de Listeria pGG55 y se electropora en LM XFL-7. Por lo tanto, la proteína LLO-FOLH1 y la proteína LLO-PSCA se expresan y se secretan episomalmente a partir de cepas recombinantes de Listeria separadas.

Para ensayar la inmunogenicidad de LLO-FOLH1 y LLO-PSCA, los ratones se inmunizaron de nuevo con Lm-LLO-FOLH1, Lm-LLO-PSCA o LmWT1A (control antigénico irrelevante) o PBS (control negativo), como se ha descrito para LLO-KLK3 en el Ejemplo 7 anterior. Tras el cultivo con células estimuladoras infectadas con vaccinia-PSA durante 5 días, los esplenocitos de los ratones vacunados con FOLH1 son capaces de reorganizar y lisar células tumorales pulsadas con el péptido FOLH1 con alta eficacia en un ensayo CTL y los esplenocitos de ratones vacunados con PSCA son capaces de reorganizar y lisar células tumorales pulsadas con el péptido PSCA con alta eficacia en un ensayo CTL. Además, los esplenocitos muestran altos niveles de secreción de IFN-γ, en respuesta a la incubación con el péptido FOLH1 o el péptido PSCA, respectivamente.

Por lo tanto, las cepas de LM que expresan FOLH1, las cepas de LM que expresan PSCA, las fusiones LLO-PSCA y

5 las fusiones LLO-FOLH1 son eficaces en la inducción de CTL específicos de antígeno que son capaces de la lisis de células diana y la secreción de IFN-γ. Por consiguiente, las cepas de LM que expresan FOLH1, las cepas de LM que expresan PSCA, las fusiones LLO-PSCA y las fusiones LLO-FOLH1 son eficaces en la vacunación terapéutico y profiláctica frente a cáncer de próstata que expresa PSA.

EJEMPLO COMPARATIVO 11: LOS CONSTRUCTOS DE LISTERIA-LLO-FOLH1 PROPORCIONAN

PROTECCIÓN TUMORAL

Las vacunas de Listeria que se han descrito en los Ejemplos anteriores se usan en experimentos de protección tumoral en el modelo animal de carcinoma de próstata ortotópico que se ha descrito en los Ejemplos 8 y 9

15 anteriores. Los ratones se inmunizan con Lm-FOLH1, Lm-PSCA, LmWT1A o PBS, y después se les inyectan PC3M-LN4 o células 22Rv1. Lm-FOLH1 y Lm-PSCA protegen a los ratones contra la formación de tumores.

En experimentos adicionales, a los ratones se les inyectó en primer lugar células de cáncer de próstata PC-3M, como se ha descrito para los Ejemplos 8 y 9 anteriores, se vacunaron con Lm-FOLH1, Lm-PSCA, LmWT1A o PBS 4 díasmás tarde, y se reforzaron con la misma vacuna. Lm-FOLH1 y Lm-PSCA impiden metástasis prostáticas.

Por lo tanto, las cepas de LM que producen FOLH1 y PSCA y las fusiones Lm-FOLH1 y Lm-PSCA inducen la protección tumoral.

25 LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Los Directivos de la Universidad de Pensilvania ADVAXIS

<120> COMPOSICIONES Y MÉTODOS QUE COMPRENDEN EL ANTÍGENO KLK3, PSCA O FOLH1

<130> P-7769-PC2

<150> 11/798.177 35 <151> 2007-05-10

<160> 64

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 32

<212> PRT

<213> Listeria monocytogenes 45

<400> 1

<210> 2

<211> 14

<212> PRT

<213> Listeria monocytogenes

<400> 2

55 <210> 3

<211> 28

<212> PRT

<213> Listeria monocytogenes

<211> 20

<212> PRT

<213> Listeria monocytogenes

<400> 4

<210> 5 15 <211> 33

<212> PRT

<213> Listeria monocytogenes

<210> 6

<211> 17

<212> PRT

<213> Streptococcus pyogenes

<400> 6

<210> 7

<211> 17

<212> PRT

<213> Streptococcus equisimilis

<400> 7

35 <210> 8

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

40 <220>

<223> sintetizado químicamente

<400> 8 ggctcgagca tggagataca cc 22

<210> 9

<211> 28

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> sintetizado químicamente

<400> 9 ggggactagt ttatggtttc tgagaaca 28

<210> 10

<211> 31

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> sintetizado químicamente

<400> 10 gggggctagc cctcctttga ttagtatatt c 31

<210> 11

<211> 28

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> sintetizado químicamente

<400> 11 ctccctcgag atcataattt acttcatc 28

<210> 12

<211> 55

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> sintetizado químicamente

<400> 12 gactacaagg acgatgaccg acaagtgata acccgggatc taaataaatc cgttt

<210> 13

<211> 27

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> sintetizado químicamente

<400> 13 cccgtcgacc agctcttctt ggtgaag 27

<210> 14

<211> 100

<212> PRT

<213> Listeria monocytogenes

<400> 14

<210> 15

<211> 390

<212> PRT

<213> Listeria monocytogenes

<400> 15

<210> 16

<211> 1170

<212> ADN

<213> Listeria monocytogenes

<400> 16

<210> 17

<211> 529

<212> PRT

<213> Listeria monocytogenes

<400> 17

<210> 18

<211> 441

<212> PRT

<213> Listeria monocytogenes

<400> 18

<210> 19

<211> 416

<212> PRT

<213> Listeria monocytogenes

<400> 19

<210> 20

<211> 19 <212> PRT

<213> Listeria seeligeri

<210> 21

<211> 19

<212> PRT

<213> Listeria monocytogenes

<400> 21

<210> 22

<211> 25 15 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> sintetizado químicamente 20

<400> 22 gcggatccca tggagataca cctac 25

<210> 23 25 <211> 25

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 30 <223> sintetizado químicamente

<400> 23 gcggatccca tggagataca cctac 25

35 <210> 24

<211> 9

<212> PRT

<213> Virus del papiloma humano

40 <400> 24

<210> 25

<211> 261

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 25

<210> 26

<211> 5873

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 26

<210> 27

<211> 238

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 27

<210> 28

<211> 1906

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 28 <210> 29

<211> 69

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 29 <210> 30

<211> 220

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 30 <210> 31

<211> 218

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 31 <210> 32

<211> 261

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 32 <210> 33

<211> 1464

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 33 <210> 34

<211> 261

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 34 <210> 35

<211> 1495

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 35 <210> 36

<211> 218

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 36 <210> 37

<211> 227

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 37 <210> 38

<211> 104

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 38

<210> 39

<211> 261

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 40

<211> 1729

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 40 <210> 41

<211> 719

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 41

<210> 42

<211> 2472

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 42 <210> 43

<211> 719

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 43

<210> 45

<211> 671

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 45

<210> 46

<211> 31

<212> ADN

<213> Artificial

<220> <223> sintetizado químicamente

<400> 46 ggggtctaga cctcctttga ttagtatatt c 31

<210> 47 <211> 45 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> sintetizado químicamente

<400> 47 atcttcgcta tctgtcgccg cggcgcgtgc ttcagtttgt tgcgc45

<210> 48 <211> 45 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> sintetizado químicamente

<400> 48 gcgcaacaaa ctgaagcagc ggccgcggcg acagatagcg aagat: 45

<210> 49 <211> 42 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> sintetizado químicamente

<400> 49 tgtaggtgta tctccatgct cgagagctag gcgatcaatt tc: 42

<210> 50 <211> 42 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> sintetizado químicamente

<400> 50 ggaattgatc gcctagctct cgagcatgga gatacaccta ca: 42

<210> 51 <211> 42 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> sintetizado químicamente

<400> 51 aaacggattt atttagatcc cgggttatgg tttctgagaa ca: 42

<210> 52

<211> 42

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> sintetizado químicamente

<400> 52 tgttctcaga aaccataacc cgggatctaa ataaatccgt tt 42

<210> 53

<211> 28

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> sintetizado químicamente

<400> 53 gggggtcgac cagctcttct tggtgaag 28

<210> 54

<211> 680

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> sintetizado químicamente

<400> 54

<210> 55

<211> 13294

<212> ADN 5 <213> Artificial

<220>

<223> sintetizado químicamente

10 <400> 55

<210> 56

<211> 368

<212> PRT

<213> Listeria monocytogenes

<400> 56

<210> 57

<211> 289

<212> PRT

<213> Listeria monocytogenes

<400> 57

<210> 58 <211> 29 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> sintetizado químicamente

<400> 58 gtgctcgaga ttgtgggagg ctgggagtg: 29

<210> 59 <211> 29 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> sintetizado químicamente

<400> 59 gatactagtt taggggttgg ccacgatgg: 29

<210> 60 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 60

<210> 61

<211> 390

<212> PRT

<213> Listeria monocytogenes

<400> 61

<210> 62

<211> 1170

<212> ADN

<213> Listeria monocytogenes

<400> 62

<210> 63

<211> 123

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 63

<210> 64 10 <211> 990

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>: 15 <221> misc_feature

<222> (543)..(543)

<223> n es a, c, g o t

<220>: 20 <221> misc_feature

<222> (580)..(580)

<223> n es a, c, g o t <220>

<221> misc_feature

<222> (584)..(584)

<223> n es a, c, g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (604)..(604)

<223> n es a, c, g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (608)..(608)

<223> n es a, c, g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (615)..(615)

<223> n es a, c, g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (636)..(636)

<223> n es a, c, g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (640)..(640)

<223> n es a, c, g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (646)..(646)

<223> n es a, c, g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (697)..(697)

<223> n es a, c, g o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (926)..(926)

<223> n es a, c, g o t

<400> 64

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Una cepa recombinante de Listeria que expresa un péptido de fusión de un péptido peptidasa relacionada con la calicreína 3 (KLK3) que está unido de forma operativa a un péptido listeriolisina (LLO) N-terminal no hemolítico, comprendiendo dicho péptido de fusión la secuencia de SEQ ID NO: 54 o una secuencia homóloga al menos al 99% a la misma, en la que dicho péptido LLO N-terminal potencia la inmunogenicidad del péptido de fusión, y en la que el péptido KLK3 no contiene una secuencia de señal.
2.

La cepa recombinante de Listeria de la reivindicación 1, en la que la cepa recombinante de Listeria es una cepa auxótrofa de Listeria o una cepa recombinante de Listeria monocytogenes.
3.

La cepa recombinante de Listeria de la reivindicación 2, en la que la cepa auxótrofa de Listeria es un mutante dal/dat o comprende adicionalmente una deleción en el gen endógeno ActA.
4.

La cepa recombinante de Listeria de la reivindicación 2, en la que la cepa auxótrofa de Listeria comprende un vector de expresión episomal que comprende una enzima metabólica que complementa la auxotrofía de la cepa auxótrofa de Listeria.
5.

La cepa recombinante de Listeria de la reivindicación 4, en la que la enzima metabólica es una enzima alanina racemasa o una enzima D-aminoácido transferasa.
6.

La cepa recombinante de Listeria de la reivindicación 1, en la que la cepa recombinante de Listeria se ha pasado a través de un huésped animal.
7.

Un polipéptido recombinante que comprende un péptido de fusión de un péptido KLK3 que está unido de forma operativa a un péptido LLO N-terminal, en el que dicho polipéptido recombinante comprende la secuencia de SEQID NO:54 o una secuenciahomóloga al menos al 99% a la misma,en el que dicho péptido LLO N-terminal potencia la inmunogenicidad del péptido de fusión, y en el que el péptido KLK3 no contiene una secuencia de señal.
8.

Una molécula nucleotídica que codifica el polipéptido recombinante de la reivindicación 7.
9.

Una vacuna que comprende la cepa recombinante de Listeria de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el polipéptido recombinante de la reivindicación 7 o la molécula nucleotídica de la reivindicación 8, y un adyuvante.
10.

Una vector de vacuna recombinante que codifica el polipéptido recombinante de la reivindicación 7 o que comprende la molécula nucleotídica de la reivindicación 8.
11.

La cepa recombinante de Listeria de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, una composición inmunogénica que comprende el polipéptido recombinante de la reivindicación 7, o el nucleótido de la reivindicación 8, para su uso en la inducción de una respuesta inmune anti-KLK3 en un sujeto.
12.

La cepa recombinante de Listeria de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el polipéptido recombinante de la reivindicación 7, o el nucleótido de la reivindicación 8, para su uso en el tratamiento de un cáncer de próstata que expresa la proteína peptidasa relacionada con la calicreína 3 (KLK3) en un sujeto, por lo que el sujeto acumula una respuesta inmune frente al cáncer de próstata que expresa la proteína KLK3.
13.

La cepa recombinante de Listeria de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el polipéptido recombinante de la reivindicación 7, o el nucleótido de la reivindicación 8, para su uso en la inhibición o la supresión de un cáncer de próstata que expresa la proteína KLK3 en un sujeto, por lo que el sujeto acumula una respuesta inmune frentealcáncerde próstata queexpresa la proteínaKLK3,inhibiendo osuprimiendode estemodo el cáncer de próstata que expresa la proteína KLK3 en un sujeto.
14.

El polipéptido recombinante de la reivindicación 7 hecho mediante un proceso que comprende la etapa de conjugar químicamente un polipéptido que comprende el péptido KLK3 en un polipéptido que comprende el péptido LLO N-terminal.
15.

La cepa recombinante de Listeria de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, una composición inmunogénica que comprende el polipéptido recombinante de la reivindicación 7, o el nucleótido de la reivindicación 8, para su uso como un medicamento.