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Einleitung
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Die
Entwicklung von effizienten Impfstoffen gegen Infektionskrankheiten
stellt nach wie vor eine große
Herausforderung in der medizinischen Wissenschaft dar. Niedrige
Kosten, eine nichtinvasive Verabreichung, ein lebenslanger Schutz
durch einzelne Dosen verbunden mit der Einfachheit der Herstellung,
Lagerung und Transport sind wünschenswerte
Ziele, die erreicht werden sollen. In dieser Hinsicht sind lebende,
abgeschwächte,
bakterielle Träger,
die heterologe Antigene exprimieren, attraktive Transportmittel
für die
orale Abgabe von Impfstoffen. Diese Art der Abgabe sollte ein breites
Spektrum an sowohl mucosalen als auch systemischen Immunantworten
zur Folge haben. Die Verwendung von Impfstoffvektoren überwindet
einige der Einschränkungen
bei der oralen Abgabe von Proteinen, die üblicherweise zusammen mit Adjuvanzproteinen,
wie z.B. Cholera-Toxin,
verabreicht werden, um eine Immunantwort hervorzurufen (Brown et
al., 1987; Flynn et al. 1990). Darüber hinaus kann die Verabreichung von
lebenden replizierenden Vektoren gegenüber anderen Formen der Verabreichung,
wie z.B. Mikroenkapsulation, aufgrund der immunomodulatorischen Eigenschaften
der Zellwandbestandteile der Bakterien vorteilhaft sein. Schließlich könnte sich
der natürliche
Zugangsweg als vorteilhaft erweisen, weil viele Bakterien, wie z.B.
Salmonella, das Darmlumen über M-Zellen in Peyer's-Haufen hinein verlassen
(Jones et al., 1994; Neutra et al., 1996; Siebers und Finley, 1996)
und unter Umständen
in Lymphknoten und die Milz wandern, so dass ein targeting der Impfstoffe
zu den induktiven Stellen des Immunsystems möglich ist.
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Die
genetische Immunisierung stellt seit kurzem einen vielversprechenden
neuen Ansatzpunkt für
das Impfproblem dar (als review siehe Donnelly et al., 1997). Isolierte
Plasmid-DNA, die in die Muskeln oder die Haut des Wirts eingebracht
wurde, führt
zur Expression von Antigen in den Wirtszellen, wenn die Transkription
durch eukaryotische Kontrollelemente gesteuert wird. Dies führte zu
B- und T-Zellstimulation und zu protektiven Antworten. Wie diese
Antworten erzeugt werden, bleibt noch unklar. Muskelzellen exprimieren
offensichtlich niedrige Level an MHC Klasse I, aber es mangelt ihnen
an MHC Klasse II und costimulierenden Verbindungen. Obwohl es nicht
bekannt ist, welche Zellen unter diesen Umständen als Antigen präsentierende
Zellen (APC) wirken, ist es wahrscheinlich, dass residente dendritische Zellen
oder Macrophagen das Antigen einfangen und zu den Lymphknoten und
der Milz wandern, so dass CD4+ und CD8+ T-Zellen stimuliert werden. Es wurden in
der Tat Antigen exprimierende dendritische Zellen nach genetischer
Immunisierung in der Haut unter Verwendung einer Gene Gun beobachtet
(Condon et al., 1996). Es ist nicht bekannt, ob DNA auch direkt
in dendritische Zellen übertragen
wird, wenn Plasmide in Muskeln eingebracht werden.
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Einige
Vorteile wurden beobachtet bei der genetischen Immunisierung gegenüber herkömmlicher
Impfung. Die DNA kann über
eine beträchtliche Zeitspanne
nachgewiesen werden, so dass sie wie ein Depot für Antigen wirkt (Ning et al.,
1993). Sequenzmotive in einigen Plasmiden sind immunostimulatorisch
und können
als Adjuvantien wirken (Krieg et al., 1995; Messina et al., 1991;
Yamamoto et al., 1992). Die Co-Expression von Cytokinen verbessert
die Antwort und bietet die Möglichkeit,
die Induktion einer Immunantwort in eine gewünschte Richtung zu modulieren
(Zhignan et al, 1995; Geissler et al, 1997; Kim et al., 1997). Es
müssen jedoch mehrere
Hindernisse überwunden
werden, bevor eine allgemeine Anwendbarkeit erreicht werden kann.
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Wenn
es möglich
wäre, Plasmide
für eine
genetische Immunisierung mit einem abgeschwächten, bakteriellen Träger zu transportieren,
wären die
Vorteile und Vielseitigkeiten der beiden Systeme kombiniert. Darüber hinaus
würde der
natürliche
Weg der Verabreichung die DNA zu den Zellarten transportieren, die
speziell dazu entwickelt sind, Immunantworten zu induzieren. Salmonella
spp. sind besonders für
diesen Zweck geeignet aufgrund des umfangreichen Wissens über die
Genetik und die Physiologie von vielen Stämmen. Es existieren in großem Umfang
Aufzeichnungen über
ihre Verwendung als heterologe Antigen-Träger, die in der Lage sind,
protektive Immunantworten zu induzieren (Fairwether et al., 1990;
Molina et al., 1990; Newton et al., 1989; als review Chatfield et
al., 1994; Roberts et al., 1994). Es stehen auch sichere, abgeschwächte Salmonella Stämme zur
Verfügung
und sie werden bereits als Impfstoffe bei der Tierhaltung und beim
Menschen verwendet (Hassan, 1996; Steinbach, 1996; Fox, 1997; Germanier
und Fürer,
1975). Schließlich
können
rekombinante Plasmide, die im Labor aus Stämmen von E. coli hergestellt
werden, direkt in Salmonellae ohne weitere Bearbeitung eingeführt werden.
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Entsprechend
einer Ausführungsform
betrifft die Erfindung einen abgeschwächten Salmonella Stamm der
einen eukaryotischen Expressionsvektor für die Expression eines heterologen
Gens oder Genfragments oder eines autologen Gens oder Genfragments
trägt,
welches von dem Vektor innerhalb eines offenen Leserasters umfasst
wird, wobei die Abschwächung
auf eine Impfung von Wirbeltieren, einschließlich des Menschen, eingestellt
wird.
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Der
erfindungsgemäße Salmonella
Stamm kann ein S. typhimurium Stamm, insbesondere S. typhimurium
aroA SL 7207 oder S. typhimurium LT2 und bevorzugt aroA544 (ATCC
33275), sein.
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Weiterhin
kann der erfindungsgemäße Salmonella
Stamm ein S. typhii Stamm, insbesondere S. typhii Ty21a, sein.
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Erfindungsgemäß werden
Salmonella Stämme
umfasst, wobei der eukaryotische Expressionsvektor das bekannte
Plasmid pCMVβ ist
oder davon abgeleitet sein kann, welches umfasst
- – das Struktur-Gen
der β-Galactosidase
(β-gal)
- – unter
der Kontrolle des unmittelbar frühen
Promotors des menschlichen CMV, der von dem Plasmid pCNVβ per se umfasst
wird und mit einschließt
- – einen
Splice-Donor,
- – zwei
Splice-Akzeptorstellen zwischen dem Promotor und dem β-Galactosidase-Gen,
und gegebenenfalls
- – die
Poly-Adenylierungsstelle von SV40.
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Der
erfindungsgemäße Salmonella
Stamm kann durch ein heterologes Gen oder ein autologes Gen, das
für ein
Protein und insbesondere für
ein immunogenes Protein oder ein protektives Antigen codiert, gekennzeichnet
sein.
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Erfindungsgemäß werden
Salmonella Stämme
umfasst, wobei das heterologe Gen ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend
aus
- – dem β-Galactosidase-Gen
von Escherichia coli (lacZ-Gen),
- – einer
nicht-hämolytischen,
verkürzten
Variante des Listerio-Lysin-Gens von Listeria monocytogenes (hly-Gen)
und
- – einer
verkürzten
Variante des actA-Gens von Listeria monocytogenes (actA-Gen).
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Eine
weitere Ausführungsform
der Erfindung betrifft einen Impfstoff für die orale und/oder nasale und/oder
mucosale Abgabe des Gens an Wirbeltiere, einschließlich des
Menschen, wobei der Impfstoff einen erfindungsgemäßen Salmonella
Stamm umfasst.
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Weiterhin
betrifft eine weitere Ausführungsform
der Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen Salmonella Stamms oder
eines erfindungsgemäßen Impfstoffes
für das
Expressions-Screening
von heterologen genomischen DNA-Bibliotheken oder genomischen cDNA-Bibliotheken
durch die Impfung mit DNA bei Wirbeltieren mit Ausnahme des Menschen.
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Schließlich betrifft
eine weitere Ausführungsform
der Erfindung ein Verfahren für
die Gewinnung in einem nicht-menschlichen Tier von
- (i) einem abgeschwächten
Salmonella Stamm, der einen eukaryotischen Expressionsvektor für die Expression
eines heterologen Gens oder Genfragments oder eines autologen Gens
oder Genfragments trägt,
welcher von dem Vektor innerhalb eines offenen Leserasters umfasst
wird, wobei die Abschwächung
auf die Impfung von Wirbeltieren, einschließlich des Menschen, eingestellt
ist; oder
- (ii) einem Impfstoff für
die orale und/oder nasale Abgabe des Gens an Wirbeltiere, einschließlich des
Menschen, wobei der Impfstoff einen Salmonella Stamm gemäß (i) umfasst
oder
- (iii) einem immunogenen Protein oder protektiven Antigen als
Expressionsprodukt eines eukaryotischen Expressionsvektors gemäß (i), gekennzeichnet
durch:
(a) die Verwendung der genetischen Information aus einer
heterologen oder autologen DNA- oder cDNA-Bibliothek als Genfragment
oder Gen, das durch den eukaryotischen Expressionsvektor exprimiert
werden soll, welcher in dem abgeschwächten Salmonella Stamm vorhanden
ist, wobei die Abschwächung
auf eine Impfung von Wirbeltieren, einschließlich des Menschen, eingestellt
wird,
(b) das Durchführen
einer DNA-Impfung mittels des abgeschwächten Salmonella Stamms gemäß (a) bei
einem Wirbeltier oder einem Menschen,
(c) das Durchführen eines
Expressions-Screenings für
ein Expressionsprodukt eines Gens oder Genfragments gemäß (a), das
eine Immunantwort liefert,
(d) und die Gewinnung eines erfindungsgemäßen Salmonella
Stamms oder eines erfindungsgemäßen Impfstoffes
oder eines immunogenen Proteins oder protektiven Antigens, wodurch
für eine Immunantwort
in Wirbeltieren, einschließlich
des Menschen, gesorgt wird.
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Zusammenfassend
berichten wir, dass oral verabreichtes S. typhimurium aroA, das
Plasmide trägt,
die unter der Kontrolle eines eukaryotischen Promotors für β-Galactosidase
(β-gal)
von Escherichia coli oder verkürzten
Formen von ActA oder Listeriolysin von Listeria monocytogenes codieren,
eine wirksame humorale oder zelluläre Immunantwort induziert.
Die Stärke
und Kinetik der Antwort ist nur vereinbar mit der Interpretation
eines Transfers des Expressionsplasmids von dem Salmonella Träger zu dem
Zellkern der APC des Wirts. β-Galactosidase-Aktivität war sogar
noch nach fünf
Wochen nach der Verabreichung des oralen Impfstoffes nachweisbar.
Darüber
hinaus zeigten in vitro Experimente mit primären Maus-Macrophagen einen
wirksamen Transfer der Plasmid-DNA von den abgeschwächten Bakterien
in den Zellkern der phagocytischen Wirtszelle hinein.
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Ergebnisse
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Um
genetische Immunisierung mit einem lebenden, abgeschwächten, bakteriellen
Träger
zu erreichen, wurden drei Plasmide verwendet, die auf dem kommerziell
erhältlichen
Plasmid pCMVβ basieren.
Dieses Plasmid enthält
das strukturelle Gen der β-gal
unter der Kontrolle des unmittelbar frühen Promotors des menschlichen
CMV und beinhaltet einen Splice-Donor und zwei Splice-Akzeptorstellen zwischen
dem Promotor und dem strukturellen Gen. Für Studien, welche die Wirksamkeit
der Immunantwort gegenüber
Pathogenen untersuchen sollen, wurde das β-gal-Gen durch Gene ersetzt,
die für
zwei Virulenz-Faktoren von Listeria monocytogenes codieren. Es wurde
ein verkürztes
Gen, das für
eine nicht-hämolytische
Variante von Listeriolysin (pCMVhly) von den Aminosäure-Positionen
26 bis 482 codiert und eine verkürzte
Variante des strukturellen Gens des Membranproteins ActA (pCMVactA),
das für
die Aminosäuren
31 bis 613 codiert, verwendet. S. typhimurium aroA Stamm SL7207
wurde mit diesen drei Plasmiden transformiert und Gruppen von Mäusen wurden
oral immunisiert, indem 108 Organismen an jede
Maus pro Immunisierung verfüttert
wurden. Es wurde herausgefunden, dass diese Dosis optimal ist (Daten
sind nicht gezeigt). Die Mäuse
zeigten keine ersichtlichen Anzeichen einer Erkrankung bei der Verwendung
dieses Immunisierungsplanes.
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Induktion einer starken
T-Zell-Antwort durch Immunisierung mit Salmonellae, die eukaryotische
Expressionsvektoren tragen
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Die
Arbeitshypothese dieser Experimente ist, dass oral verabreichtes
S. typhimuirum aroA zu einer Aufnahme der Bakterien durch Makrophagen und/oder
dendritischen Zellen führen
würde,
mit gleichzeitiger Aktivierung durch das Endotoxin der Bakterien.
Nach einigen Zellteilungszyklen der Bakterien würden die intrazellulären Bakterien
absterben, da sie nicht in der Lage sind, die essentiellen aromatischen
Aminosäuren
zu synthetisieren. Während
dieses Vorgangs würden
die Plasmide freigesetzt werden und in das Cytosol und den Zellkern
der infizierten Zellen hinein transferiert werden. Die codierten
Gene werden unter Umständen
durch APC des Wirts exprimiert werden.
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Die
erste Voraussage dieser Hypothese ist die Induktion einer starken
cytotoxischen Antwort von CD8 T-Zellen, da das Antigen im Cytosol,
welches das Zellkompartiment ist, das für die MHC Klasse I Präsentation
verantwortlich ist, exprimiert wird. Bis hierhin wurden zwei Arten
von Experimenten durchgeführt.
Mäuse wurden
entweder einmal oral mit rekombinanten Salmonellae infiziert und
ihre cytotoxischen T-Zell-Antworten wurden über mehrere Wochen verfolgt,
indem ihre Milzzellen direkt ex vivo getestet wurden (Daten sind
nicht gezeigt) oder nach einer Re-Stimulation in vitro. Alternativ wurden
Mäuse vier
mal oral immunisiert in Abständen
von zwei Wochen und der Verlauf der cytotoxischen Antwort wurde
untersucht. 1 zeigt, dass eine starke und spezifische
CD8 T-Zell-Antwort durch oral verabreichte Salmonella ausgelöst werden
kann, die eukaryotische Expressionsplasmide tragen. Mäuse, die mit
dem verkürzten
Gen von Listeriolysin immunisiert wurden, lösten nur eine Antwort aus gegenüber Targets,
die mit dem immunodominanten Peptid, das die Aminosäuren 91
bis 99 von Listeriolysin (LLO) umfasst, sensitisiert wurden, und
nicht gegenüber
Targets, die mit löslichem
Hühnerei-Lysozym
(HEL) oder einem Kontrollpeptid sensitisiert wurden (1A). Ähnlich konnten
Milzzellen von Mäusen,
die mit Salmonella immunisiert wurden, die das ActA-Expressionsplasmid
tragen, nur auf ActA antworten (1D). Um
die cytotoxische Antwort gegenüber ActA
aufzudecken, untersuchten wir die Wirksamkeit von Lysteriolysin,
Poren zu bilden. Diese Wirksamkeit von Lysteriolysin ermöglicht das
Einführen
von löslichen
Passenger-Proteinen in das Cytosol der Target-Zellen hinein (Darji
et al., 1995a; Darji et al., 1997). Es wurden daher Stimulatoren
und Target-Zellen mit einer Mischung von löslichem ActA und LLO sensitisiert.
Eine spezifische Antwort wurde nur dann beobachtet, wenn die Kombination
von ActA und LLO verwendet wurde. Keine Antwort wurde gefunden, wenn
LLO allein getestet wurde. Diese Antworten waren spezifisch für das Plasmid-codierte
Antigen während
des gesamten Zeitraums, der in 1 Tafel
B & C und E & F angegeben ist,
und wurden auch beobachtet, wenn die Antwort der Mäuse untersucht wurde,
die mit Salmonella immunisiert wurden, welche das β-gal Kontrollplasmid
beherbergen (Daten sind nicht gezeigt).
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Die
Kinetik der Antworten zeigte, dass sogar eine einzelne Dosis eine
starke cytotoxische T-Zell-Antwort auslöste, die 5 Wochen nach der
Immunisierung ihren Höhepunkt
erreichte und dann langsam abnahm (1C und
F). Auf der anderen Seite nahm die Antwort immer noch zu, sogar
am Ende des Beobachtungszeitraums, d.h. 5 Wochen nach der letzten
Exposition in Mäusen,
die vier Immunisierungsdosen erhalten hatten (1B und
E). Es wurde somit eine starke cytotoxische Antwort beobachtet,
wenn man Salmonella als potentielles Transportmittel für genetische
Immunisierung verwendet.
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Eine
genetische Immunisierung ruft üblicherweise
auch eine CD4 T-Helferzell-Antwort hervor (Donnelly et al., 1997).
Daher wurden Zellen der Milz und der mesenterialen Lymphknoten der
selben, wie oben verwendeten Mäuse
auf ihre proliferative Antwort gegenüber löslichen Proteinen getestet.
Dieser Art der Antwort liegt hauptsächlich eine Präsentation von
Antigen über
MHC Klasse II Molekülen
zugrunde und wird ausgeführt
durch CD4 T-Zellen. Wie in 2 gezeigt,
wird eine starke und spezifische T-Helferzell-Antwort, parallel
zu der cytotoxischen Antwort, beobachtet, wenn eukaryotische Expressionsplasmide,
die durch Salmonellae transportiert werden, für die Immunisierung verwendet
werden (2A und D). Wie bei der CD8 Antwort
genügte eine
einzige Dosis für
eine gute Antwort, die bis zum Ende des Beobachtungszeitraums immer
noch zunahm, unabhängig
davon, ob Listeriolysin oder ActA als Antigen verwendet wurde (2C und
F). Vier aufeinanderfolgende Immunisierungen ergaben jedoch sogar
eine noch stärkere
Antwort, die lang anzuhalten schien, da die Antwort offensichtlich
fünf Wochen
nach der letzten Exposition immer noch anstieg (2B und
E). Ähnliche
Ergebnisse wurden erhalten mit Salmonella, welche das β-gal exprimierende
Kontrollplasmid tragen (Daten sind nicht gezeigt). Die Analyse des Überstandes
der in vitro Kulturen offenbarte die Produktion von IFNγ durch diese T-Zellen.
Es konnte kein IL-4 gefunden werden, woraus geschlossen werden kann,
dass solch ein Immunisierungsschema hauptsächlich eine TH1 Antwort oder
eine T-Helfer-Antwort vom inflammatorischen Typ induziert.
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Induktion von spezifischen
Antikörpern
durch die Immunisierung mit Salmonellae, die eukaryotischen Expressionsvektoren
tragen
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Die
gesammelten Seren der Gruppen der oben verwendeten Mäuse wurde
auf das Vorhandensein von spezifischen Antikörpern hin untersucht. Zusätzlich zu
einer cytotoxischen und T-Helferzell-Antwort induzierte die Immunisierung
mit Salmonellae, die eukaryotische Expressionsplasmide tragen, eindeutig
starke und spezifische Antikörperantworten,
wie durch ELISA (3A und B) oder Immunoblot (Daten
sind nicht gezeigt) offenbart wurde. Wieder war eine einzelne Immunisierung
ausreichend für
eine gute Antwort, die vier Wochen nach der Verabreichung der Bakterien
ihren Höhepunkt
erreichte und dann in derselben Weise abnahm, wie es schon bei der
cytotoxischen Antwort gesehen wurde (3A und
B). Vier Immunisierungen erhöhten nicht
den Antikörper-Titer signifikant,
aber induzierten vermutlich eine länger anhaltende Antwort, da
der Antikörper-Titer
sogar bis zum Ende des Beobachtungszeitraums kein Plateau erreichte
(3A und B).
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Die
Analyse der Unterklassen-Verteilung der individuellen Mäuse in der
11. Woche zeigte eine hohe Konzentration an IgG2a, während die
Konzentration von IgG2b und IgG3 vernachlässigbar war (3C und
D). Dies steht im Einklang mit dem Befund, dass nur IFNγ und nicht
IL-4 in dem Überstand der
re-stimulierten T- Helferzellen
nachgewiesen werden konnte. Es wurde jedoch auch IgG1 in hohen Konzentrationen
in den Immunseren beobachtet. Diese Unterklasse wird gefunden, wenn
TH2-Helferzellen an der Immunantwort beteiligt sind, was darauf hindeutet,
dass unter unseren experimentellen Bedingungen TH2-Zellen auch induziert
werden könnten,
aber sie nicht in dem in vitro T-Zell-Assay zum Vorschein kommen.
Zusätzlich
wurden IgA Antikörper
durch diesen Immunisierungsplan hervorgerufen (nicht gezeigt).
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Zusammenfassend
zeigen die Ergebnisse, die in den 1 bis 3 dargestellt
sind, dass die Immunisierung mit S. typhimurium aroA, die eukaryotische
Expressionsvektoren tragen, Antworten in allen drei spezifischen
Wirkbereichen des Immunsystems hervorrufen können, nämlich cytotoxische CD8 T-Zellen,
CD4 T-Zellen und Antikörper.
Die Antwort in dem T-Helfer-Bereich war stark auf TH1 oder inflammatorische
T-Helfer-Antwort ausgerichtet.
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Schutz gegen lethale Dosen
von L. monocytogenes
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Die
starke beobachtete Antwort, insbesondere die der cytotoxischen T-Zellen,
deutete darauf hin, dass die Mäuse,
die in dieser Art immunisiert wurden, vor einer lethalen Dosis von
L. monocytogenes geschützt
sein sollten. Daher wurden die Mäuse 90
Tage nach der ersten Immunisierung bzw. 48 Tage nach der vierten
Immunisierung, je nachdem was zutreffend war, i.v. mit einer Dosis
an Bakterien exponiert, die der 10-fachen LD50 entspricht. 4 zeigt, dass
die Tiere, die vier mal aufeinanderfolgend mit Salmonellae immunisiert
wurden, welche einen eurkaryotischen Expressionsvektor beherbergen,
der für verkürztes LLO
codiert, vollständig
geschützt (4A)
waren. Die Tiere, die nur eine einzige Impfung erhalten hatten,
waren teilweise, aber signifikant geschützt, da zum Zeitpunkt des Endes
dieses Experimentes 60% der Tiere noch am Leben waren. Alle Tiere,
die mit Salmonellae immunisiert wurden, welche das β-gal Kontrollplasmid
trugen, waren nicht geschützt
und starben innerhalb von vier Tagen. Überraschenderweise führten Immunisierungen
mit Salmonellae, die das ActA Expressionsplasmid trugen, nicht zu
einem Schutz, obwohl starke cytotoxische und T-Helferzell-Antworten bei den
Mäusen
von der selben Gruppe gezeigt werden konnten, was darauf hindeutet,
dass die Immunisierung erfolgreich gewesen war (Daten sind nicht
gezeigt). Folglich ist das listeriale Membran-Protein ActA kein
protektives Antigen.
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Nachweis für den Transfer
des Expressionsplasmids von dem Träger Salmonellae zu den Wirtszellen
in vivo
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Es
beschäftigte
uns, dass eine schwache Aktivität
des eukaryotischen Promotors in den Bakterien oder eines kryptischen
prokaryotischen Promotors in dem Plasmid zu einer Expression der
Antigene in dem bakteriellen Träger
führen
konnte und somit die starke Immunantwort auslöste. Tatsächlich zeigten die rekombinanten
Salmonellae, die das pCMVβ beherbergen,
eine niedrige βgal
Aktivität
(2,5 U) verglichen mit dem ursprünglichen
Stamm. Um sämtliche Eventualitäten auszuschließen, immunisierten
wir Mäuse
mit einem rekombinanten Salmonella Stamm, der mehr als 100-fach
höhere
Level (334 U) an β-gal Enzymaktivität produzierte.
Eine einzelne Impfdosis unter Verwendung dieser Bakterien rief keine
messbare T-Zell- oder Antikörperantwort
hervor (5A–C). Wiederholte Impfungen
jedoch erzielten eine schwache cytotoxische T-Zell-Antwort, die nach
in vitro Restimulation nachweisbar war, obwohl sie kaum die Stärke der
Antwort erreichte, die mit einer einzelnen Immunisierung mit Salmonellae
beobachtet wurde, die das eukaryotische Expressions plasmid von β-gal beherbergen
(5A). Es konnte weder eine CD4 T-Zell- noch eine
Antikörper-Antwort beobachtet
werden, sogar nach wiederholten oralen Immunisierungen mit Salmonellae,
die konstitutiv β-gal
exprimieren (5B und C).
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Als
Ergebnis der aroA Mutation, scheinen die Bakterien sehr schnell
abzusterben, da an verschiedenen Untersuchungszeitpunkten nie lebende
Bakterien nach der Immunisierung nachgewiesen werden konnten. Nichtsdestotrotz
konnte sogar nach fünf Wochen
nach der oralen Verabreichung von Salmonellae, die das eukaryotische β-gal Expressionsplasmid
beherbergen, eine enzymatische Aktivität von β-gal in adhärenten Zellen nachgewiesen
werden, höchstwahrscheinlich
Macrophagen, von der Milz dieser Mäuse, woraus geschlossen werden
kann, dass ein Plasmidtransfer in die eukaryotische Zelle stattfindet
(Daten sind nicht gezeigt). Um diese Beobachtung weiter zu untermauern,
injizierten wir Salmonellae, die den pCMVβ-Vektor tragen, in das Bauchfell
der Mäuse
und ernteten die peritonealen Exudatzellen nach einer Stunde. Die
Zellen wurden dann über
Nacht in Anwesenheit von Tetracyclin kultiviert, um bakterielle
Proteinsynthese zu inhibieren, und schließlich auf β-gal Aktivität angefärbt. Enzymatische Aktivität von β-gal wurde
in einer großen
Anzahl von Macrophagen-ähnlichen
Zellen beobachtet. Die Färbung
war diffus und deutlich nicht auf die endocytischen Vesikel beschränkt, in
denen sich Salmonella üblicherweise
aufhalten. Dies deutet darauf hin, dass Plasmid-DNA von den sterbenden
Salmonellae zu den Wirtszellen transferiert wurde und das dies in
hoher Frequenz geschah.
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DNA-Transfer von S. typhimurium
aroA zu Säugetierwirtszellen
in vitro
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Um
einen direkten Nachweis zu erhalten, dass ein DNA-Transfer von dem
bakteriellen Träger zu
den Macrophagen der Maus stattfinden kann, wurden primäre peritoneale
Macrophagen mit Salmonellae infiziert, die das β-gal Expressionsplasmid (pCMVβ) beherbergen.
Nach der Infizierung über eine
Stunde wurde Gentamicin zugegeben, um die verbleibenden extrazellulären Bakterien
zu töten. Vier
Stunden später
wurde Tetracyclin zugegeben, um residente intrazelluläre Bakterien
zu töten.
Nach Inkubation über
Nacht wurden die Zellen auf β-gal Aktivität angefärbt. In
bis zu 30% der adhärenten, Macrophagen-ähnlichen
Zellen konnte enzymatische Aktivität nachgewiesen werden, sogar
in der gleichzeitigen Anwesenheit von Tetracyclin, das die bakterielle
Proteinsynthese blockiert (6).
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Um
zu zeigen, dass die β-Galactosidase durch
die Wirtszelle und nicht durch die Bakterien produziert wurde, wurden
zwei Arten von Experimenten durchgeführt. Zunächst wurden adhärente peritoneale
Zellen infiziert und wie oben beschrieben behandelt. Nach Inkubation über Nacht
wurde die RNA extrahiert. Falls das Plasmid in der Tat transferiert und
in dem Zellkern der Wirtszelle transkribiert worden war, sollten
RNA Splice-Produkte nachgewiesen werden können, die von dem Splice-Donor
und Akzeptorstellen innerhalb des Vektors abstammen. Durch RT-PCR
mit einem Primer-Paar, das Sequenzen auf jeder Seite des kleinen
Introns hybridisiert, konnte ein PCR-Produkt beobachtet werden,
das einem der erwarteten Splice-Produkte entsprach (7A).
Die Identität
dieses Produktes wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt (Daten
sind nicht gezeigt).
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Zweitens
sollte das biosynthetische Labeln der Proteine in Anwesenheit von
Tetracyclin nur die Translation von mRNA erlauben, die durch die
eukaryotischen Wirtszellen produziert wurde. Adhärente peritoneale Zellen wurden
wie beschrieben infiziert und wurden pulsweise 30 Minuten lang mit 35S-Methionin nach 4, 24 oder 48 Stunden
in Abwesenheit oder Anwesenheit von Tetracyclin versetzt. Nach vier Stunden
konnte kein β-gal
durch Immunopräzipitation
beobachtet werden, sogar in Abwesenheit von Tetracyclin, wo bakterielle
Produkte markiert worden sein sollten (7B). Somit
hat noch kein Transfer der Plasmid-DNA und keine eukaryotische Expression
stattgefunden. Jedoch konnte β-gal
nach einem 24-stündigen
oder 48-stündigen
Inkubationszeitraum immunipräzipitiert
werden, sogar wenn Tetracyclin kontinuierlich während sowohl dem Inkubations-
als auch dem Markierungszeitraum anwesend war. Die Präinkubation
des anti-β-gal Antikörpers mit
einem Überschuss
an unmarkiertem β-gal
machte die Spezifität
der Immunopräzipitation
deutlich (7B/Bahn 10). Dies zeigte deutlich,
dass das präzipitierte β-gal durch
die infizierten Säugetierwirtszelle
selbst produziert wurde und nicht durch das Bakterium, das das Expressionsplasmid
ursprünglich getragen
hatte. Somit musste ein Transfer des Plasmids von Salmonellae auf
die Wirtszelle stattgefunden haben.
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Diskussion
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Der
Transfer von eukaryotischen Expressionsplasmiden von abgeschwächten Enterobakterien in
den Zellkern von Wirtszellen wurde vor kurzem gezeigt. Während diese
Arbeit durchgeführt
wurde, wurde berichtet, dass auxotrophische Mutanten von Shigella
und E. coli, die das Invasin von Shigella exprimieren, eukaryotische
Expressionsplasmide in Wirtszellen hinein übertragen können (Sizemore et al, 1995;
Courvalin et al., 1995). Angesichts der Tatsache, dass beide Bakterien
in der Lage sind, aus dem Phagolysosom in das Cytosol der Wirtszelle
hinein wandern zu können,
folgt, dass die Auflösung (Lysis)
von Bakterien in diesem Kompartiment den Transfer der freigesetzten
Plasmide in den Zellkern hinein ermöglichen würden. Der Transfer von Plasmiden
von intrazellulären
Pathogenen, wie z.B. Salmonella, wäre schwerer vorstellbar, da
diese Bakterien im allgemeinen innerhalb der Vacuolen der infizierten Wirtszellen
zurückgehalten
werden. In der Tat wurde nur eine „geringe Wirksamkeit" des Plasmidtransfers in
eine Makrophagen Zelllinie hinein unter Verwendung von abgeschwächten Salmonella
berichtet (Sizemore et al., 1995). Unsere anfänglichen Experimente, bei denen
mehrere Makrophagen Zelllinien verwendet wurden, hatten auch gezeigt,
dass dies in der Tat der Fall war (Daten sind nicht gezeigt).
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Jedoch
haben die Kinetik und Stärke
der Immunantwort nach Verabreichung von Salmonella, die eukaryotische
Expressionsvektoren tragen, darauf hingedeutet, dass ein Plasmidtransfer
in vivo stattgefunden haben kann. Wir haben uns daher entschieden,
primäre
Makrophagen zu untersuchen, die aus dem Bauchfell der Mäuse isoliert
wurden. Durch die Verwendung dieser Zellen konnten wir deutlich
einen Transfer eines eukaryotischen Expressionsplasmid-Vektors in
Wirtszellen hinein zeigen. Es wurde ein Weg beschrieben, der den
Transfer von Proteinen von endocytischen Vesikeln in das Cytosol
von einigen Zellarten, einschließlich Macrophagen, hinein ermöglicht (Reis
de Sousa und Germain, 1995; Norbury et al., 1995). Ob solch ein
Weg auch für
den hier beobachteten Transfer von Nukleinsäuren verantwortlich ist, bleibt
zu untersuchen. Die Tatsache, dass der Plasmidtransfer mit Salmonella
nur bei primären Macrophagen
und nicht bei Zelllinien beobachtet wurde, deutet auf das Vorliegen
eines Transportweges hin, der nur in primären Zellen wirksam funktioniert.
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Der
Beweis für
einen Transfer von Plasmid-DNA von Salmonella zu den Wirtszellen
in vitro ist zwingend. Splicen von RNA und Proteinsynthese in Anwesenheit
von Tetracyclin sind beide nur möglich,
wenn das Gen durch die eukaryotische Wirtszelle exprimiert wird.
Der Beweis, dass der Transfer des Expressionsvektors in vivo verantwortlich
für die
Induktion der starken, beobachteten Immunantwort ist, wurde auch
erhalten. Eine enzymatische Aktivität von β-gal konnte fünf Wochen
nach der letzten Exposition in einigen adhärenten Milzzellen beobachtet werden.
Es konnten jedoch keine lebenden Salmonella nachgewiesen werden,
sogar wenn eine Woche nach der letzten Infektion getestet wurde.
Daraus folgt, dass die β-gal
Expression nicht aufgrund von übriggebliebenen
lebenden Salmonella erfolgen kann. Nichtsdestotrotz ist es faszinierend,
wie solche Antigenexprimierende Zellen in der Gegenwart von spezifischen
cytotoxischen T-Zellen co-existieren können.
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Starke
cytotoxische und protektive Antworten wurden bisher nur von Salmonella
berichtet, welche die Antigene ausscheiden. Keine vergleichbaren Antworten
wurden bisher bei der Verwendung von Salmonella beschrieben, die
konstitutiv nicht-ausgeschiedene, heterologe Protheine exprimieren
(Ness et al., 1996). Hohe Dosen an rekombinanten Bakterien, die
intrazelluläres
Protein exprimieren, wurden für
die Induktion von CD8 T-Zellen benötigt (Turner et al., 1993).
Obwohl die Induktion von spezifischen Antikörpern unter einigen experimentellen
Bedingungen beschrieben wurde (Guzman et al., 1991; Walker et al.,
1992), wurde unter den oben beschriebenen Umständen keine Antikörperantwort
beobachtet (Turner et al., 1993). Dies wurde durch unsere eigenen
Ergebnisse bestätigt
(5). Wir erachten es daher als höchst unwahrscheinlich,
dass die starken Antworten von cytotoxischen und T-Helferzellen
sowie die spezifische Antikörper-Produktion
das Ergebnis einer zufälligen
Expression von Antigenen in den Salmonella-Trägern sind.
-
Die
Stärke
der beobachteten Immunantwort, insbesondere nach einer einzigen
Immunisierungsdosis, weist darauf hin, dass der Transfer von DNA über bakterielle
Träger
vermutlich einer direkten Anwendung von isolierter Plasmid-DNA in
die Haut oder Muskeln hinein überlegen
ist. Dies deutet darauf hin, dass durch die Verwendung der natürlichen
Eintrittspforte eines Pathogens der Expressionsvektor in die Zelltypen
hinein transferiert wird, die dafür entwickelt sind, wirksam
eine Immunantwort zu induzieren. Es ist wahrscheinlich, dass der
Salmonella-Träger
durch Macrophagen und dendritische Zellen aufgenommen wird. Ob Macrophagen
eine Rolle während
der Stimulierung von nativen T-Zellen
gegen Bakterien spielen, ist nicht klar, aber es ist bekannt, dass
dendritische Zellen hoch wirksam sind, ruhende T-Zellen zu aktivieren. Da das Antigen
in dem Cytosol dieser Zellen exprimiert wird, ist eine starke cytotoxische T-Zell-Antwort zu erwarten.
-
Die
Induktion einer zusätzlich
starken Helfer- und Antikörperantwort
ist rätselhaft
und es kann darüber
nur spekuliert werden. Einige cytosolische Proteine können wirksam
durch MHC Klasse II Moleküle präsentiert
werden (Brooks und McCluskey, 1993). Es wäre allerdings eine sehr glückliche
Koinzidenz, wenn alle drei Proteine, die in der vorliegenden Studie
verwendet wurden, diese Eigenschaft aufweisen. In jedem Fall könnte es
nicht die Antikörperantwort erklären, die
wir beobachtet haben. Es ist wahrscheinlicher, dass APC, die das
Antigen exprimieren, durch spezifische cytotoxische Zellen aufgelöst werden
und sterbende Antigen enthaltende Zellen oder freies Antigen durch
benachbarte APC aufgenommen werden und über MHC Klasse II Moleküle präsentiert
werden. Die hervorgerufene humorale Antwort könnte in einer ähnlichen
Weise erklärt
werden.
-
Zusammenfassend
könnte
eine orale genetische Immunisierung unter Verwendung von abgeschwächten Salmonellae
als Träger
so ablaufen, wie schematisch in 8 dargestellt.
Die Salmonella treten über
M-Zellen im Darm in den Wirt ein. Die Bakterien werden in den Ausstülpungen
(dome areas) durch phagocytische Zellen, wie z.B. Macrophagen und
dendritische Zellen, aufgenommen. Diese Zellen werden durch das
Pathogen aktiviert und fangen an, sich zu differenzieren und wahrscheinlich in
die Lymphknoten und die Milz zu wandern. Während dieses Zeitraums sterben
die Bakterien aufgrund ihrer abschwächenden Mutation ab und setzen die
Plasmid-basierten eukaryotischen Expressionsvektoren frei. Die Plasmide
werden dann in das Cytosol hinein transferiert, entweder über ein
spezifisches Transportsystem oder durch endosomale Lecks. Schließlich tritt
der Vektor in den Zellkern ein und wird transkribiert, was eine
Antigen-Expression in dem Cytosol der Wirtszellen zur Folge hat.
Spezifische cytotoxische T-Zellen werden durch diese aktivierten APC
induziert, die die Antigen exprimierenden Zellen auflösen. Freies
Antigen oder sterbende Zellen können
durch andere APC aufgenommen werden, welche nun wiederum Helferzellen
stimulieren können. Freies
Antigen wäre
auch für
die Induktion einer Antikörperantwort
verantwortlich. Darüberhinaus
können
bakterielles Endotoxin und DNA-Sequenzmotive des Vektors auch als
Adjuvantien wirken und zu der Stärke
der beobachteten Antworten beitragen.
-
Die
T-Helferzell-Antwort, die durch diese Art von genetischer Immunisierung
induziert wird, schien stark von der TH1-Art beeinflusst zu werden,
wie aus der IFNg-Produktion von restimulierenden T-Zellen in vitro
und dem hohen Titer an IgG2a in der humoralen Antwort ersichtlich
ist (Mosmann und Coffman, 1989). Dies ist nicht unerwartet, da Bakterien üblicherweise
Antworten vom inflammatorischen Typ induzieren. Für einige
Impfstrategien ist es erwünscht, eine
TH1-Antwort für
den Schutz gegen das bestimmte Pathogen zu induzieren, z.B. Stämme von Mäusen, die
mit TH2-Zellen gegen Leishmania major antworten, eliminieren nicht
den Parasiten und sind nicht geschützt, während Mäuse, die eine TH1-Antwort haben,
resistent sind. (Sher und Coffman, 1992). Auf der anderen Seite
wurde gezeigt, dass die Induktion von Antworten vom TH2-Typ oder
die Umwandlung einer TH1-Antwort in eine TH2-Antwort bei inflammatorischen
Autoimmun-Erkrankungen vorteilhaft ist (Tian et al., 1996). Ähnlich können Infektionen durch
Nematoden ebenfalls eine TH2-Antwort
erfordern (Sher und Coffman, 1992). Da die Bakterien nur als Transportmittel
für das
Transferieren der Expressionsplasmide verwendet werden und daher
nur eine untergeordnete Rolle spielen, sollte es möglich sein, die
TH1-Antwort zu manipulieren. Die Induktion von spezifischen IgG1
deutet auf das Vorhandensein einer TH2-Komponente während der
Helfer-Antwort hin, die zunehmen kann. Die Co-Expression des Antigens
zusammen mit bestimmten Cytokinen oder co-stimulierenden Molekülen oder
alternativ die Verwendung von Antisense-Strategien, um costimulierende
Moleküle
zu unterdrücken,
sollte es ermöglichen,
die Antworten mehr in Richtung TH2 zu verschieben.
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Zwei
gut charakterisierte Virulenz-Faktoren wurden als Antigene für den Schutz
vor einer lethalen Exposition mit L.monocytogenes getestet. Es wurde vorher
schon gezeigt, dass Listeriolysin einen Schutz bewirken kann (Harty
und Bevan, 1992; Hess et al., 1996). Dies traf auch unter unseren
experimentellen Bedingungen zu. Interessanterweise reichte bereits eine
einzige Dosis an Salmonellae, die das eukaryotische Listeriolysin-Expressionsplasmid
beherbergen, aus, um einen Schutz für 60% der Mäuse zu erzielen. Auf der anderen
Seite wirkte ActA nicht als protektives Antigen. Offensichtlich
steht das Membran-Protein ActA nicht für die Präsentationsmechanismen zur Verfügung, solange
die Bakterien leben. Dies wirft die Frage auf, ob Membranproteine
von Bakterien generell nicht schützend
sind oder ob ActA ein Sonderfall ist. Die ausgeprägte Phosphorylierung des
ActA-Proteins durch Wirtskinasen nach der Infektion könnte dessen
Fähigkeit
beeinflussen, verarbeitet zu werden. Nichtsdestotrotz kann nun die
Bedeutung von bakteriellen, oberflächengebundenen Proteinen für den Schutz
durch die Verwendung des Salmonellae Systems für die genetische Impfung leicht
ermittelt werden.
-
Die
Induktion einer starken und spezifischen Antikörperantwort, die mit ELISA
und Immunoblot gemessen werden kann, offenbarte zusätzliche
Vorzüge,
hervorgerufen durch die Art der hier beschriebenen Immunisierung.
Um spezifische polyklonale und vielleicht auch monoklonale Antikörper hervorzubringen,
kann somit jedes offene Leseraster in ein Expressionsplasmid eingefügt werden
und für
die Immunisierung verwendet werden. Dies wird die Charakterisierung
von Gen-Produkten erleichtern, bei denen nur Sequenz-Informationen
verfügbar
sind.
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Als
Schlussfolgerung: Durch die Verwendung von abgeschwächten Salmonella,
die eukaryotische Expressionsvektoren tragen, kann eine genetische
Immunisierung durch die orale Verabreichung des Trägers erreicht
werden. Die Stimulierung von cytotoxischen und T-Helferzellen sowie
die Induktion einer starken Antikörperantwort stellt ein sehr
vielseitiges System für
neue Immunisierungsstrategien zur Verfügung. Die Stärke dieses
Ansatzes zielt auch auf die Entwicklung von neueren, rationaler
abgeschwächten
Salmonellae Stämmen
sowie technische Vorteile für
das zur Verfügung
stellen von bedingter und zielgerichteter eukaryotischer Expression
durch die infizierten Wirtszellen. Die Möglichkeit der genetischen Immunisierung
mit DNA-Fragmenten, die offene Leseraster enthalten, wird es ermöglichen,
die Funktion von neuen Gen-Produkten zu definieren, neuartige serologische
Reagenzien zur Verfügung
zu stellen und eine Darstellung zu erlauben und die Wirksamkeiten
von protektiven Antigenen bei Impfprotokollen einzuschätzen.
-
Im
folgenden wird die Erfindung auf der Basis von Abbildungen und experimentellen
Daten genauer beschrieben.
-
Legende zu den Abbildungen:
-
1.
Induktion von cytotoxischen T-Zellen in Mäusen, die oral mit 108 S. typhimurium aroA immunisiert wurden,
die eukaryotische Expressionsplasmide tragen, die für Listeriolysin
oder ActA codieren. Die Mäuse
wurden entweder vier mal mit Intervallen von zwei Wochen (A, B,
D, E) oder einmal (C; F) mit Salmonella immunisiert, die pCMVhly
(A-C) oder pCMVActA (D-F) tragen und die Milzzellen wurden einmal
in vitro mit einem synthetischen Peptid re-stimuliert, das die Aminosäuren 91-99
von Listeriolysin (A-C) umfasst oder mit einer Mischung von gereinigtem
ActA und hämolytisch
aktivem Listeriolysin, worauf eine Klasse I Präsentation von ActA aufgrund der
porenbildenden Aktivität
von Listeriolysin erfolgte (Darji et al., 1995a; Darji et al., 1997).
Re-stimulierte T-Zellen wurden mit radioaktiv markierten P815 Targetzellen
bei einem Verhältnis
von Effektor zu Target von 10:1 getestet. A: Spezifität der Anti-Listeriolysin cytotoxischen
Antwort. Die Targetzellen wurden mit Hühnerei-Lysozym (HEL), einem
Peptid mit den Aminosäuren
91 bis 99 von Listeriolysin (pLLO) oder mit einem Kontrollpeptid
des Nucleoproteins des Influenza-Virus (pNP) sensitisiert. Abgebildet
ist das Experiment mit Milzzellen aus der 5. Woche, gezeigt in Tafel B. Ähnliche
Spezifitäten
wurden zu allen anderen Zeitpunkten beobachtet. B: Kinetik der cytotoxischen Antwort
der Mäuse,
die vier mal mit pCMVhly immunisiert wurden. Die Pfeile zeigen die
Wiederholungsimmunisierungen an. C: Kinetik der cytotoxischen Antwort
der Mäuse,
die einmal mit pCMVhly immunisiert wurden. D: Spezifität der anti-ActA
cytotoxischen Antwort. Die Targetzellen wurden mit einer Mischung
von ActA und Listeriolysin (ActA + LLO), HEL und Listeriolysin (HEL
+ LLO) oder Listeriolysin alleine (LLO) sensitisiert. Abgebildet
ist das Experiment mit re-stimulierten Milzzellen von der 5. Woche,
gezeigt in Tafel E. Ähnliche
Spezifität
wurde zu allen anderen Zeitpunkten und ebenso bei anderen synthetischen
Peptiden verschiedener Quellen beobachtet. E: Kinetik der cytotoxischen
T-Zell-Antwort in Mäusen,
die vier mal mit pCMVActA immunisiert wurden. Die Pfeile zeigen
die Wiederholungsimmunisierungen an. F: Kinetik der cytotoxischen
T-Zell-Antwort bei
Mäusen,
die einmal mit pCMVActA immunisiert wurden. Die Spezifität der cytotoxischen
Antwort auf Targetzellen, die mit pLLO, ActA plus Listeriolysin oder
einem β-gal
exprimierenden Transfectanten von P815 sensitisiert wurden, wurde
weiterhin durch das Testen der Milzzellen von Mäusen beurteilt, die in einer ähnlichen
Art und Weise mit pCMVβ (β-gal) immunisiert
wurden (Daten sind nicht gezeigt). Eine ähnliche spezifische cytotoxische
T-Zellantwort wurde gegenüber β-gal beobachtet,
aber die Kinetik wurde nicht so systematisch wie für die beiden
anderen Antigene verfolgt.
-
2.
Induktion von T-Helferzellen in Mäusen, die oral mit 108 S. typhimurium aroA immunisiert wurden,
die eukaryotische Expressionsplasmide tragen, die für Listeriolysin
oder ActA codieren. Milzzellen (SPC) und Lymphknotenzellen (LNC)
von den selben Mäusen,
die auf cytotoxische T-Zell-Antworten getestet wurden, wie in 1 dargestellt,
wurden auf T-Helfer-Antworten
getestet. Die Mäuse
wurden entweder viermal (A, B, D, E) oder einmal (C, F) mit Salmonella
immunisiert, die pCMVhly (A-C) oder pCMVActA (D, F) tragen, und
in vitro re-stimuliert. Nach zwei Tagen wurde die Proliferation
durch Zugabe von 3H-Thymidin getestet. A: Spezifität der proliferativen
Antwort der Milzzellen von Mäusen,
die mit pCMVhly immunisiert wurden. Die getesteten T-Zellen waren
die selben wie diejenigen, die in Tafel 8 in der 11. Woche abgebildet
sind. Ähnliche
Ergebnisse wurden zu den anderen Zeitpunkten erreicht. B: Kinetik
der proliferativen Antwort von Milzzellen und Lymphknotenzellen
von Mäusen,
die viermal mit pCMVhly immunisiert wurden. Die Pfeile zeigen die Wiederholungsimmunisierungen
an. C: Kinetik der proliferativen Antwort der Milzzellen und Lymphknotenzellen
von Mäusen,
die einmal mit pCMVhly immunisiert wurden. D: Spezifität der proliferativen
Antwort der Milzzellen von Mäusen,
die viermal mit pCMVActA immunisiert wurden. Die getesteten T-Zellen waren
die selben wie die jenigen, die in Tafel D in der 11. Woche abgebildet
sind. Ähnliche
Ergebnisse wurden zu den anderen Zeitpunkten erhalten. E: Kinetik der
proliferativen Antwort der Milzzellen und Lymphknotenzellen, die
viermal mit pCMVActA immunisiert wurden. Die Pfeile zeigen die Wiederholungsimmunisierungen
an. F: Kinetik der proliferativen Antwort von Milzzellen und Lymphknotenzellen
von Mäusen, die
einmal mit pCMVActA immunisiert wurden. Ähnlich reagierten Milzzellen
und Lymphknotenzellen von Mäusen,
die mit pCMVβ (β-gal) immunisiert
wurden, niemals mit entweder Listeriolysin oder ActA, aber konnten
auf die Re-Stimulierung mit β-gal
antworten (Daten sind nicht gezeigt).
-
3.
Kinetik und Unterklassenverteilung von spezifischem Serum-IgG von
Mäusen,
die oral mit S. typhimurium aroA immunisiert wurden, die eukaryotische
Expressionsplasmide tragen, die für Listeriolysin, ActA oder β-gal codieren.
Es wurden die Seren der selben Mäuse
verwendet, die auf cytotoxische und proliferative T-Zell-Antworten
getestet wurden, wie in den 1 und 2 gezeigt,
und in spezifischen ELISA's
gemessen. Die Mäuse
wurden vier mal (A) oder einmal (B) mit jeweils pCMVhly, pCMVActA
oder pCMVβ immunisiert
und die gesammelten Seren wurden auf ihr Antigen-spezifisches Serum-IgG
getestet. Um die Spezifität
zu beurteilen, wurden alle Seren auf alle drei Antigene hin getestet. Eine
Reaktivität
wurde nur gegen das immunisierende Antigen beobachtet (Daten sind
nicht gezeigt). Identische Ergebnisse wurden durch Immunoblotting unter
Verwendung der gleichen Antigene erhalten (Daten sind nicht gezeigt).
Die Unterklassenverteilung 11 Wochen nach der ersten Immunisierung
wurde aus den Seren einzelner Mäuse,
die vier mal (gefüllte
Symbole) oder einmal (nicht-gefüllte
Symbole) mit entweder pCMVhly (C) oder pCMVActA (D) immunisiert.
wurden.
-
4.
Orale Immunisierung mit S. typhimurium aroA, die das eukaryotische
Expressionsplasmid tragen, das für
Listeriolysin codiert, induziert eine protektive Immunantwort, während die
Immunisierung mit Bakterien, die das Expressionsplasmid für ActA tragen,
nicht protektiv ist. Gruppen von sechs Mäusen wurden vier mal mit Intervallen
von zwei Wochen (A) oder nur einmal (H) mit Salmonella immunisiert,
die pCMVhly, pCMVActA oder pCMVβ tragen, und
intravenös
mit einer lethalen Dosis von 5 × 104 L. monocytogenes EGD (10-fache LD50) versetzt. Mäuse, die nur einmal mit pCMVhly
immunisiert worden waren, waren nach zwei Tagen dem Tod geweiht.
Jedoch erholten sich vier von ihnen und überlebten in guter Verfassung,
bis das Experiment zwei Wochen später beendet wurde.
-
5.
Vergleich von oral induzierten Immunantworten, ausgelöst durch
Salmonella, die prokaryotische oder eukaryotische Expressionsplasmide von β-gal beherbergen.
Die Mäuse
wurden mit Salmonella immunisiert, die entweder das eukaryotische Expressionsplasmid
pCMVβ oder
das Plasmid pAH97 beherbergen, das konstitutiv β-gal von dem PR und PS Promotor
von XylS von Pseudomonas putida exprimiert. Bakterien, die den eukaryotischen Vektor
beherbergen, wurden einmal oral verabreicht (•), wogegen Bakterien, die β-gal unter
der Kontrolle des prokaryotischen Promotors exprimieren, entweder
einmal (
)oder
vier mal mit Intervallen von zwei Wochen (
)
verabreicht wurden. Die Pfeile zeigen den Zeitpunkt von Wiederholungsimmunisierungen an.
A: Cytotoxische Antwort von re-stimulierten Milzzellen, die bei
einem Verhältnis
von Effektor zu Target von 10:1 getestet wurden. Als Target in dem
JAM-Assay wurde der β-gal exprimierende
Transfektant P13.1 verwendet. B: Proliferative T-Helferzell-Antwort
von Milzzellen mit isolierter β-gal
als Antigen. C: Antikörperantwort
gegen β-gal
aus gesammelten Seren, gemessen mit ELISA. Die in A-C abgebildeten Daten
wurden mit Zellen oder Seren der selben Mäuse erhalten. Alle Assays wurden,
wie in den
1–
3 beschrieben,
durchgeführt.
-
6.
Expression der enzymatischen β-gal Aktivität in peritonealen
Exudatzellen nach Infektion mit S. typhimurium aroA, die ein eukaryotisches
Expressionsplasmid für β-gal beherbergen.
Frisch isolierte peritoneale Exudatzellen (PECs) wurden für zwei Stunden
haften gelassen und bei einer MOI von 10 15 Minuten lang mit Salmonella,
die pCMVβ tragen,
in einem Medium, das frei von Antibotika war, infiziert. Nach Waschen
und Zugabe von Gentamicin, um die Bakterien zu töten, die außerhalb der Zellen verblieben,
wurde die Inkubation für
drei bis vier Stunden bei 37 °C
fortgesetzt. Dem Medium wurde dann Tetracyclin zugesetzt, um die
Bakterien durch Blockieren ihrer Proteinsynthese zu töten. Nach
weiteren 24 Stunden bei 37 °C
wurden die Zellen mit PBS gewaschen, getrocknet, mit Aceton/Methanol
fixiert und über
Nacht mit dem X-gal Substrat inkubiert. Manchmal wurde eine Expression
von β-gal
Aktivität in
bis zu 30% der adhärenten
Zellpopulation beobachtet. Nur Macrophagenähnliche Zellen zeigten enzymatische
Aktivität.
Die kleinen Zellen, die in den abgebildeten Kulturen gefunden wurden,
stellen höchstwahrscheinlich
nicht-adhärente
Lymphocyten dar, die in diesem speziellen Experiment nicht entfernt
wurden. Das Tetracyclin blieb während
des ganzen Experiments hindurch in dem Medium. Ein Anfärben der
Zellen schon nach vier Stunden offenbarte keinerlei enzymatische
Aktivität.
-
7.
Die eukaryotischen Wirtszellen transkribieren und translatieren β-gal, abgeleitet
von S. typhimurium aroA, die das Expressionsplasmid beherbergen.
A: RNA, abgeleitet von PEC's,
24 Stunden nach der Infektion mit Salmonella, die pCMVβ tragen,
wurde mittels RT-PCR analysiert. Es wurde ein Primer-Paar verwendet,
das den Splice-Donor und die Akzeptorstellen stromabwärts von
dem Promotor begrenzt. In Bahn 2 konnte eine Bande von 196 by nachgewiesen
werden (mit dem Pfeil markiert). Eine DNA-Sequenzierung identifizierte
dieses Fragment als ein Splice-Produkt.
Das stärkere
227 by lange Fragment, das in dieser Bahn sichtbar ist, ist entweder
aufgrund einer Verschleppung von DNA in die RNA-Präparation
hinein oder aufgrund eines ineffizienten Splicens vorhanden. Bahn
1 zeigt die unbehandelte Macrophage als Kontrolle und die mit M
bezeichnete Bahn beinhaltet den verwendeten Molekulargrößenmarker.
Da das Signal des Splice-Produkts extrem
schwach war, haben wir die Farben von weiß nach schwarz invertiert.
Daraus ergab sich eine Zunahme an Kontrast und ermöglichte
die Visualisierung des Splice-Produkts auf dem Schaubild. B: PEC's wurden mit pCMVβ tragenden
Salmonella wie beschrieben infiziert und nach Inkubation über verschiedene
Zeiträume
wurde ein biosynthetisches Labeling durchgeführt in Anwesenheit oder Abwesenheit
von Tetracyclin, gefolgt durch Immunopräzipitation mit β-gal spezifischen
monoklonalen Antikörpern. Kontrollversuche:
(1) BHK-Zellen; (2) BHK-Zellen, die mit β-gal transfiziert wurden (positive
Kontrolle). Infizierte PEC's:
(3) vier Stunden lang post infection (p.i.) inkubiert, ohne Tetracyclin;
(4) vier Stunden lang p.i. inkubiert, mit Tetracyclin während des
Labelns; (5) vier Stunden lang p.i. inkubiert mit Tetracyclin während der
Inkubation und des Labels; (6) 24 Stunden lang p.i. inkubiert, ohne
Tetracyclin; (7) 24 Stunden lang p.i. inkubiert, mit Tetracyclin
während
des Labelns; (8) 24 Stunden lang p.i. inkubiert, mit Tetracyclin
während
der Inkubation und des Labelns, (9) 48 Stunden lang p.i. inkubiert,
ohne Tetracyclin; (10) 48 Stunden lang p.i. inkubiert, mit Tetracyclin
während
des Labelns, 100-facher Überschuss
an β-gal gegenüber dem
präzipitierenden
Antikörper
wurde dem Lysat vor der Immunopräzipitation
zugefügt;
(11) 48 Stunden lang p.i. inkubiert, mit Tetracyclin während des
Labelns; (12) 48 Stunden lang p.i. inkubiert, mit Tetracyclin während der
Inkubation und des Labelns. Es wurde keine spezifische Bande nach
vier Stunden Inkubation unter sämtlichen
Bedingungen gefunden. Jedoch nachdem dem DNA-Transfer und der Expression
24 Stunden oder länger
Zeit gelassen wurde, kann eine spezifische Bande für β-gal, durch den
Pfeil angezeigt, beobachtet werden.
-
8.
Schematische Darstellung der Sequenz an Ereignissen, die in vivo
nach oraler genetischer Immunisierung mit abgeschwächten S.
typhimurium aroA auftreten können.
-
Materialien
und Methoden
-
Salmonella
typhimurium Stamm LT2 siehe Hosieth & Stocker in Nature, 291 (1981) 238-239.
-
pCMVβ siehe Sizemore
et al. in Science, 270 (1995) 299-302.
-
Salmonella
typhi Ty21a siehe J. Infections Diseases, 131 (1975) 553.
-
actA
Gen siehe Domann in EMBO J., 11 (1992) 1981-1990.
-
hly
Gen siehe Mengaud et al. in Infection Immunity, 56 (1988) 766-772.
-
Expressionsscreening
siehe Mougneau et al. in Science, 268 (1995) 563-566, und Huynh
et al. in Glover, DNA Cloning, Vol. 1 (1986): 49-78.
-
Experimentelle
Verfahren
-
Mäuse
-
Weibliche
BALB/c (H-2d) Mäuse, 6-8 Wochen alt, wurden
erhalten von Harlan Winkelmann (Borchem, Deutschland).
-
Medien, Reagenzien und
Antigene
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RPMI
(Gibco), wo erforderlich mit 10% fetalem bovinem Serum ergänzt, wurde
als Kulturmedium für
eukaryotische Zellen verwendet und alle funktionellen Assays wurden
in diesem Medium durchgeführt.
Festes und flüssiges
Luria Bertani Medium (LB, Sambrook) wurde für das Wachsen der E. coli und
S. typhimurium Stämme
verwendet. Hirn-Herz-Infusions Boullion oder Agar (BHI; Difco, Detroit,
USA) wurde für
das Wachsen von L. monocytogenes EGD verwendet. Die Medien wurden,
wo erforderlich, mit 100 μg/ml
Ampicillin ergänzt.
Concanavalin-A (con-A), Hühnerei-Lysozym
(HEL), Tetracyclin, β-galactosidase
von E. coli., Kaliumhexacyanoferrat (III) und Kaliumhexacyanoferrat
(II) wurden von Sigma erworben (Sigma, St. Louis, USA), Listeriolysin
wurde wie beschrieben gereinigt (Darji et al., 1995b). Lösliches
ActA Protein (Aminosäuren
31-505) wurde vom Überstand
von rekombinanten L. monocytogenes gereinigt (Gerstel et al., wird
veröffentlicht).
-
Bakterielle
Stämme
und Plasmide
-
Der
E. coli Stamm XL1-Blue (Strategene, Heidelberg, Deutschland) wurde
als Wirt während der
Klonierungsexperimente und für
die Vermehrung der Plasmide verwendet. Der auxotrophe S. typhimurium
aroA Stamm SL7207 (S. typhimurium 2337-65 Derivat hisG46, DEL407 [aroA::
Tn10 {Tc-s}]), wurde freundlicherweise von Dr. B. A. D. Stocker,
Stanford, CA, USA, zur Verfügung
gestellt und wurde als Träger
für die
in vivo Studien verwendet. Der hämolytische
L. monocytogenes Stamm EGD (Serotyp 1/2a; Chakraborty et al., 1992)
wurde für
die in vivo Schutz-Assays und die Herstellung von genomischer DNA
verwendet. Die DNA wurde als Matrize für die PCR-Amplifikation von
actA und hly Genen verwendet. Der eukaryotische Expressionsvektor
pCMVβ (Clontech,
Palo Alto, USA) der β-gal
von E. coli enthält,
wurde für
das Klonieren durch Ersetzen von β-gal
mit den Amplifikationsprodukten, die eine verkürzte Variante von actA oder
von hly enthalten, verwendet. Für
die Expression von β-gal
in Salmonellae wurde Plasmid pAH97 verwendet (Holtel et al, 1992). Es
enthält
den Pr und Ps Promotor des Xyl S Gens von Pseudomanas putida und
ergibt eine konstitutive Expression von β-gal (384 U) in dem S. typhimurium aroA
Stamm. Die Bakterienkulturen wurden bei 37 °C gezüchtet und durch Schütteln bei
200 r.p.m belüftet.
-
Rekombinante
DNA-Techniken
-
Die
DNA-Herstellung, genetische Manipulationen und PCR wurden entsprechend
Standardvorschriften durchgeführt
(Sambrook et al., 1982), und Plasmid DNA-Transformation von bakteriellen
Zellen wurden wie von Hannahan beschrieben oder durch Elektroporation
(O'Callaghan und
Charbit, 1990) durchgeführt.
Die DNA-Sequenzierung
wurde unter Verwendung eines Taq Dye Deoxy Terminator Zyklus Sequenzierungs
System (Applied Biosystems) durchgeführt und auf einem Applied Biosystems 373A
automatischen DNA-Sequenzierer analysiert.
-
Klonierung von actA und
hly in den eukaryotischen Expressionsvektor pCMVb
-
Für den Aufbau
des eukaryotischen Expressionsvektors pCMVActA, wurde ein 1,8 kb
Fragment, das für
die Aminosäuren
31 bis 613 eines ActA Polypeptids ohne den Membran-Anker codiert
(Domann et al., 1992) durch PCR amplifiziert unter Verwendung der
Vorwärts- und Rückwärts-Primer:
5'ATAAGAATGCGGCCGCCATGGCGACAGATAGCGAAGATTCTAGTC-3' und
5'ATAAGAATGCGGCCGCTTACGTCGTATGGTTCCCTGGTTCTTC-3';
und genomische
DNA von L. monocytogenes Stamm EGD als Matrize. In einer ähnlichen
Art wurde das rekombinante Plasmid pCMVhly aufgebaut. Ein 1,4 kb Fragment,
das für
eine nicht-hämolytische
Variante codiert, die die Aminosäuren
26 bis 482 von hly umfasst und das Peptid, das für die hämolytische Aktivität erforderlich
ist, weglässt
(Mengaud et al., 1988), wurde amplifiziert unter Verwendung der
Vorwärts- und
Rückwärts-Primer:
5'-ATAAGAATGCGGCCGCCATGGATGCATCTGCATTCAATAAAGAAAATTC-3' und
5'-ATAAGAATGCGGCCGCTTATTTAGCGTAAACATTAATATTTCTCGCG-3'.
-
Die
PCR-Primer wurden derart gestaltet, dass die sich ergebenden Fragmente
NotI-flankierende Restriktionsstellen (unterstrichen) enthalten und
Start und Stop Codons wurden eingeführt (ATG und TTA, fettgedruckt).
Die PCR-Fragmente wurden mit NotI verdaut und mit NotI-verdautem
pCMVβ verbunden.
Dadurch wurde pCMVActA bzw. pCMVhly hergestellt. Diese Region, die
für β-gal codiert,
wird durch die NotI-Verdauung von pCMVβ abgetrennt. Die DNA-Sequenz der eingefügten PCR-Fragmente wurde
durch Taq Dye Deoxy Terminator Zyklus-Sequenzierung verifiziert.
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Immunisierung
und Exposition
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Für die Immunisierung
wurden Gruppen von 5-10 weiblichen BALB/c Mäusen mit 30 ml an 10%igem Natriumbicarbonatpuffer
gefüttert,
der 108 an rekombinantem S. typhimurium
aroA Stamm enthält,
welcher einen der eukaryotischen Expressionsvektoren pCMVβ, pCMVhly
oder pCMVActA oder das prokaryotische β-gal Expressionsplasmid pAH97
beherbergt (Holtel et al., 1992). Die Mäuse erhielten entweder eine
einzige Immunisierung oder vier Immunisierungen mit Abständen von
14 Tagen. Serumproben von beiden Gruppen an Mäusen wurden am Tag –1, 7, 21,
35 und 63 erhalten und wurden bei –20 °C gelagert, bis sie im Festphasen-Enzym-Immuno-Assay
(ELISA) oder Immunoblot verwendet wurden. Die Mäuse von jeder Gruppe wurden
nach 3, 5, 7 und 11 Wochen nach der ersten Immunisierung getötet und
auf ihre T-Zell-Antwort hin getestet. Für die Schutzstudien wurden
immunisierte Mäuse
i.v. am 90. Tag (ein und einen halben Monat nach der letzten Verstärkung bei
den Mäusen,
die mehrere Immunisierungen erhielten) mit einer tödlichen
Dosis von 5 × 104 L. monocytogenes EGD versetzt. Das Überleben der
Mäuse wurde
bis zum 14. Tag nach der Exposition verfolgt.
-
CTL Assay
-
Für die Bestimmung
der Induktion von cytotoxischen T-Zellen wurde der JAM-Assay durchgeführt (Matzinger
P., 1991). Kurzgefasst wurden 3 × 105 Target-Zellen
vier Stunden lang mit 5 μCi 3H-Thymidin (Amersham) inkubiert, gewaschen
und zusammen mit Milzzellen kultiviert, die von Mäusen isoliert wurden,
welche mit S. typhimurium aroA Stämmen immunisiert wurden, die
die eukaryotischen oder prokaryotischen Expressionsvektoren bei
verschiedenen Verhältnissen
von Effektor zu Target beherbergen.
-
Die
Milzzellen wurden entweder direkt ex vivo oder nach in vitro Re-Stimulation über 5 Tage
untersucht. Zum Testen auf LLO-spezifische
cytotoxische T-Zellen wurden P815 Target-Zellen mit 1 μg/ml LLO-Peptid
Aminosäuren
91-99 sensitisiert (Pamer et al., 1991). Die ActA spezifische Cytotoxizität wurde durch
Sensitisieren der radioaktiv markierten P815-Zellen mit einer Mischung
von 1 μg/ml
gereinigtem, hämolytisch
aktivem LLO und 1 μg/ml
gereinigtem ActA-Protein für
30 Minuten bei Raumtemperatur offengelegt. Wir haben vor kurzem
gezeigt, dass es möglich
ist, Target-Zellen sehr wirksam in vitro mit löslichen Proteinen unter Verwendung
der porenbildenden Aktivität
von LLO zu sensitisieren. Target-Zellen, die nur mit LLO sensitisiert
wurden, wurden nicht aufgelöst,
wenn T-Zellen von Mäusen,
die mit Salmonella immunisiert wurden, welche das ActA-Expressionsplasmid
tragen, getestet wurden. Dies deutet darauf hin, dass der Assay
spezifisch für
ActA ist, wenn Mäuse
mit Salmonellae immunisiert werden, die ActA Expressionsplasmide
beherbergen. Um die β-gal
spezifische Cytotoxizität
zu messen, wurden P13.1, ein P815 Derivat, das mit dem β-gal Gen
transfiziert wurde, als Target-Zellen verwendet (Rammensee et al.,
1989). Mischungen von Effektor- und Target-Zellen wurden 4 bis 5
Stunden lang bei 37 °C
inkubiert, dann wurden die Platten auf Filtermatten geerntet, die
schließlich
in einem Scintillationszähler
gezählt
wurden. Alle Assays wurden dreifach in 200 ml Endvolumen in 96er
Microtiterplatten mit rundem Boden durchgeführt.
-
Proliferations
Assay
-
Die
Induktion von T-Helferzellen wurde durch direkte Proliferation von
Zellen untersucht, die aus der Milz oder aus den Lymphknoten von
Mäusen
isoliert wurden, welche mit S. typhimurium aroA Stämmen immunisiert
wurden, die den eukaryotischen Expressionsvektor pCMVβ, pCMVhly
oder pCMVActA oder den prokaryotischen β-gal Expressionsvektor pAH97
beherbergten. Die Proliferation der T-Zellen wurde direkt durch
den Einbau von 3H-Thymidin analysiert. Kurzgefasst wurden
2 × 105 T-Zellen zusammen mit 1 × 105 bestrahlten, gen-identischen Milzzellen
zusammen mit entweder 0,5 μg/ml
gereinigtem LLO, 1 μg/ml
Act-A oder 1μg/ml β-gal kultiviert.
Nach 48 Stunden Inkubation bei 37 °C wurde 1 mCi 3H-Thymidin
zu jeder Kultur zugegeben und nach weiteren 18 Stunden Inkubation
wurden die Zellen auf Filtermatten geerntet und der Einbau wurde
mit einem Scintillationszähler
gezählt.
Alle Experimente wurden dreifach in 200 ml Endvolumen in 96er Microtiterplatten
mit flachem Boden durchgeführt.
-
ELISA
-
Um
die Level an Immunoglobulinen gegen LLO, Act-A und β-gal in Serumproben
zu ermitteln, wurden 96er ELISA-Platten (Maxisorp, Nunc) mit 0,5 μg/ml gereinigtem
Protein über
Nacht bei 4 °C überzogen.
Die Platten wurden dreimal mit PBS/0,05 Tween 20 gewaschen und dann
mit 3% BSA-PBS 2 Stunden lang bei 37 °C blockiert. Nach zweimaligem Waschen
mit PBS/0,05 Tween 20 wurden Serumproben in einer 1:100 Verdünnung zu
den einzelnen Vertiefungen zugegeben und 2-3 Stunden lang bei 37 °C inkubiert.
Die Platten wurden wie oben gewaschen und biotinyliertes Ziegen
anti-Maus Ig (Dianova, Hamburg, Deutschland) in 1%igem BSA-PBS wurde zu
jeder Vertiefung zugefügt
und eine Stunde lang bei 37 °C
inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS/0,05% Tween 20 wurde
mit Meerrettich Peroxidase konjugiertes Streptavidin (Dionova, Hamburg, Deutschland)
in 1%igem BSA-PBS zu jeder Vertiefung hinzugefügt und 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert.
Die Platten wurden wie oben gewaschen, mit o-Phenylendiamin als Substrat
entwickelt und in einem ELISA-Lesegerät bei 490 nm gemessen. Für die Bestimmung
von Antigen-spezifischen IgG-Unterklassen wurde mit Peroxidase konjugiertes
Ziegen anti-Maus IgG1, IgG2a, IgG2b und IgG3 verwendet (Caltag laboratories,
CA, USA).
-
Nachweis der β-gal Aktivität
-
Die
Expression von β-gal
in Wirtszellen wurde durch Inkubation der fixierten Zellen mit dem
Indikatorsubstrat X-gal überwacht.
Kurzgefasst wurden isolierte peritoneale Macrophagen einige Stunden lang
bei 37 °C
in 24er Platten in Antibiotika-freiem Medium binden gelassen. Nach
dem Entfernen der nicht-gebundenen Zellen und Waschen mit Antibiotika-freiem
Medium wurde S. typimurium aroA, das den eukaryotischen Expressionsvektor
pCMVβ beherbergt,
zu den Zellen bei einem MOI von 10 hinzugegeben und 15-30 Minuten
lang bei 37 °C
inkubiert. Die Zellen wurden wieder gewaschen und die Bakterien,
die extrazellulär
geblieben sind, wurden durch Zugabe eines Mediums, das 50 μg/ml Gentamycin enthält, getötet. Nach
4-stündiger
Inkubation bei 37 °C
wurden 10 μg/ml
Tetracyclin zu einigen der Kulturen zugegeben, um die intrazelluläre bakterielle
Vermehrung zu blockieren, und es wurde weitere 24 Stunden lang inkubiert.
Es stellte sich später
heraus, dass dieser zweite antibiotische Schritt unnötig war, weil
Stämme,
die die aroA Mutation beherbergen, nur einen kurzen Zeitraum lang
in diesen Zellen überleben
(Daten sind nicht gezeigt). Nach 2-3-maligem Waschen mit PBS wurden
die Zellen mit Aceton/Methanol (1:1, v/v) fixiert und frisch hergestelltes X-gal-Substrat (5 mM
Kaliumhexacyanoferrat (II), 5 mM Kaliumhexacyanoferrat (III), 2mM
MgCl2 und 100 mg/ml X-gal in PBS) wurde
hinzugefügt.
Nach Inkubation über
Nacht bei 37 °C
wurden die β-gal exprimierenden
Zellen lichtmikroskopisch nachgewiesen. Die quantitative Bestimmung
der β-gal
enzymatischen Aktivität
in rekombinanten Bakterien wurde entsprechend Standardvorschriften
durchgeführt (Sambrook
et al., 1982). Der Hintergrunf (4U) wurde von den experimentellen
Werten abgezogen.
-
RNA-Isolation
und RT-PCR
-
Um
die Expression von β-gal
zu testen, das über
Salmonella in die eukaryotischen Wirtszellen hinein transferiert
wurde, wurde die mRNA auf die Anwesenheit von Splice-Produkten hin
untersucht, die von dem Splice-Donor und Akzeptoren des Expressionsplasmids
herrühren.
Hierzu wurden PEC's
in vitro bei einem MOI von 10 mit S. typhimurium aroA infiziert,
die den eukaryotischen Expressionsvektor pCMVβ beherbergen, und die RNA wurde,
wie beschrieben, extrahiert (Chomczynski und Sacchi, 1987). Es wurde
eine RT-PCR von isolierter RNA durchgeführt. Kurzgefasst wurden 10 μg isolierter
totaler zellulärer
RNA in 20 μl
DEPC-H2O resuspendiert und 5 Minuten lang
bei 70 °C
mit 10 μl
Puffer inkubiert, der 6 μl
reverse Transcriptase Puffer (250 mM Tris-HCl, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2);
0,4 mM dNTPs; 0,05 U zufällige
Hexamere (Pharmacia, Uppsala, Schweden), und 1 mM DTT enthält. Die
Proben wurden 2 Minuten lang bei 15.000 rpm zentrifugiert und 40
U RNAsin Ribonuclease-Inhibitor (Promega) zusammen mit 200 U Superscript
reverser Transcriptase (Gibco, BRL) wurden hinzugefügt. Die
RNA wurde 45 Minuten lang bei 37 °C
rückwärts transcribiert
und die Reaktion wurde durch Erhitzen der Proben eine Minute lang
auf 95 °C
gestoppt, gefolgt von einer kurzen Inkubation auf Ei,. Anschließend wurden
500 ng des cDNA-Produkts mittels PCR in einem Endvolumen von 50 μl amplifiziert,
das 0,2 mM dNTP, 20 mM DTT, 3 μM
von jedem der 5' und
3' Primer, 5 μl von 10 × PCR-Puffer
(100 mM Tris-HCl, pH 9,0, 500 mM KCl, 1% Gelatine, 1,5 mM MgCl2, 1% Triton X-100) und 5 U AmpliTaq-DNA-Polymerase (Perkin
Elmer) enthält.
Die PCR wurde mit einem anfänglichen
Denaturierungsschritt von 10 Minuten bei 85 °C durchgeführt, gefolgt von 35 Zyklen
von 20 Sekunden Denaturierung bei 95 °C, 30 Sekunden Abkühlen bei
60 °C und
30 Sekunden Erweiterung bei 72 °C.
Die Amplifizierungsprodukte wurden nach Elektrophorese eines 15 μl Aliquots
der Reaktionsmischung auf einem 2% (w/v) Agarose-Gel, das 0,5 μg/ml Ethidiumbromid
enthält,
unter einer W-Lampe sichtbar gemacht. Das Primerpaar war dergestalt,
dass die Anwesenheit von Splice-Produkten
durch ein 190 by und/oder ein 125 by Fragment angezeigt werden sollte.
Die Identität
des vermutlichen Splice-Produktes wurde
durch Sequenzierung der Fragmente nach Isolation auf einem präparativen
Agarose-Gel bestätigt.
Das Primer-Paar, das für
die Amplifizierung und Sequenzierung verwendet wurde – SV40 vorwärts: 5'-GGATCCGGTACTCGAGGAAC-3', SV40 rückwärts: 5'-GCTTTAGCAGGCTCTTTCG-3'.
-
Immunopräzipitationen
-
Das
biosynthetische Markieren von Proteinen in Anwesenheit von Tetracyclin,
gefolgt von Immunopräzipitation,
sollte nur die Protein-Expression von eukaryotischen Wirtszellen
offenbaren. Daher wurden 5 × 105adhärente
PECs 30 Minuten lang bei 37 °C
mit ca. 5 × 106 S. typhimurium aroA, die den eukaryotischen
Expressionsvektor pCMVβ beherbergen,
in Antibiotika-freiem Medium infiziert. Nach einem gründlichen
Waschen und weiteren 4 Stunden Inkubation bei 37 °C wurde das
Medium mit Antibiotika oder nicht mit Antibiotika ergänzt und
verschiedene Zeiträume
lang vor dem biosynthetischen Markieren bei 37 °C gelassen. Nach zweimaligem
Waschen mit PBS und 30-minütigem
verhungern lassen in Methionin-freiem Medium, wurden die Zellen
pulsweise 2 Stunden lang mit 100 μCi
[35S]-Methionin versetzt. Dann wurden die
Zellen vorsichtig gewaschen und in 0,5 ml eiskaltem lysie renden
Puffer aufgelöst
(0,5% NP-40, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM MgCl2,
1 mM PMSF). Nach 45 Minuten auf Eis wurden die Zellen zentrifugiert,
um die Zellkerne und Zelltrümmer
zu entfernen, und 30 Minuten lang bei 4 °C mit 4 μg anti-β-gal-Antikörpern (Promega) inkubiert.
Die Immunkomplexe wurden mit Protein A Sepharose in 0,5% NP-40,
50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 5mM MgCl2 und 0,5 mM
NaCl präzipitiert,
mehrere Male mit dem gleichen Puffer gewaschen und auf einem 8%
SDS-PAGE analysiert, gefolgt durch Fluorographie. In einige Proben
wurde ein 100-facher Überschuss
an β-gal
Protein zugegeben vor der Zugabe von anti-β-gal Antikörpern, um die Spezifität der Präzipitation
zu bestimmen.
-
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