ES2253789T3

ES2253789T3 - Cepa de salmonella atenuada usada como vehiculo para inmunizacion oral.

Info

Publication number: ES2253789T3
Application number: ES97953786T
Authority: ES
Inventors: Ayub Darji; Carlos Guzman; Kenneth Timmis; Jurgen Wehland; Siegfried Weiss; Birgit Gerstel; Trinad Chakraborty; Petra Wachholz
Original assignee: Helmholtz Zentrum fuer Infektionsforschung HZI GmbH
Current assignee: Helmholtz Zentrum fuer Infektionsforschung HZI GmbH
Priority date: 1997-04-18
Filing date: 1997-12-11
Publication date: 2006-06-01
Anticipated expiration: 2017-12-11
Also published as: WO1998048026A1; AU5756298A; US20030180320A1; DE69734605T2; EP0977874A1; EP0977874B1; ATE309378T1; DE69734605D1; JP2002513287A; US7115269B2; CA2286210A1; DK0977874T3

Abstract

Se ha empleado una cepa atenuada de Salmonella typhimurium como un vehículo para la inmunización genética oral. Se han empleado vectores de expresión eucarióticos que contienen los genes para la {be}-galactosidasa, o formas truncadas de ActA y listeriolisina -dos factores de virulencia de Listeria monocytogenes - que fueron controlados mediante un promotor eucariótico, para transformar una cepa de S. typhimurium aroA. Inmunizaciones múltiples o incluso inmunización única con estas transformaciones indujeron una respuesta de las células T fuertemente citotóxica y coadyuvante así como una excelente respuesta a anticuerpos. Las inmunizaciones múltiples con transformantes de listeriolisina protegieron a los ratones completamente contra una exposición letal a L. monocytogenes. Ya se observa parcial con una dosis única. ActA no pareció ser un antígeno protector. La resistencia y la cinética de la respuesta sugirió que los antígenos heterólogos fueron expresados sin las células huésped eucarióticas tras la transferencia de ADN plásmido desde la cepa portadora de bacterias. La transferencia de ADN plásmido podría mostrarse de forma inequívoca in vitro empleando macrófagos peritoneales primarios. La demostración de productos empalmados de ARN y la expresión de {be}-galactosidasa en presencia de tetraciclina - un inhibidor de la síntesis de proteínas bacterianas - indicó que el gen fue expresado por células huéspedes más que por bacterias. La inmunización genética oral con vehículos de Salmonella proporciona un sistema altamente versátil para la liberación de antígeno, representa un sistema potente para identificar antígenos protectores candidatos para vacunación y permitirá la generación eficaz de anticuerpos contra virtualmente cualquier segmento de ADN que codifique un marco de lectura abierto.

Description

Cepa de Salmonella atenuada usada como vehículo para inmunización oral.

Introducción

El diseño de vacunas eficaces contra enfermedades infecciosas sigue siendo un reto importante en la ciencia médica. Los objetivos deseables a lograr son el bajo coste, la administración no invasiva, la protección duradera mediante dosis individuales, combinados con la facilidad de preparación, almacenamiento y transporte. A este respecto, los portadores bacterianos atenuados vivos, que expresan antígenos heterólogos, son vehículos atractivos para el suministro oral de vacunas. Este tipo de suministro debe dar como resultado un amplio espectro de respuestas inmunitarias tanto mucosales como sistémicas. El uso de vectores de vacuna salva algunas de las limitaciones del suministro oral de proteínas, que habitualmente son coadministradas con proteínas adyuvantes, tales como la toxina del cólera, para provocar una respuesta inmunitaria (Brown et al., 1987; Flynn et al., 1990). Además, la administración de vectores replicantes vivos puede ser ventajosa sobre otras formas de administración, tal como el microencapsulamiento, debido a las propiedades inmunomoduladoras de los componentes de la pared celular de las bacterias. Finalmente, la ruta natural de entrada probaría ser beneficiosa, puesto que muchas bacterias como Salmonella salen de la luz del intestino, vía las células M, hacia los parches de Peyer (Jones et al., 1994; Neutra et al., 1996; Siebers y Finley, 1996), y eventualmente migran hacia los nódulos linfáticos y al bazo, permitiendo de este modo seleccionar como dianas a vacunas para sitios inductores del sistema inmunitario.

La inmunización genética ha proporcionado recientemente un nuevo enfoque prometedor al problema de la vacunación (para un repaso, véase Donnelly et al., 1007). El ADN plasmídico aislado - introducido en el músculo o en la piel del hospedante - conduce a la expresión de antígeno en las células hospedantes cuando la transcripción está dirigida por elementos de control eucariotas. Esto ha conducido a la estimulación de células B y T, y a respuestas protectoras. Aún no está claro cómo se generan estas respuestas. Las células de los músculos aparentemente expresan niveles bajos de MHC de clase I, pero carecen de MHC de clase II y de moléculas coestimulantes. Aunque no se sabe qué células funcionan como células presentadoras de antígenos (APC) en estas circunstancias, es probable que las células dendríticas residentes o los macrófagos capturen al antígeno y migren a los nódulos linfáticos y al bazo para estimular las células T CD4^{+} y CD8^{+}. De hecho, se han observado células dendríticas que expresan antígeno después de la inmunización genética en la piel usando una pistola génica (Condon et al., 1996). No se sabe si el ADN también se transfiere directamente en las células dendríticas cuando se aplican plásmidos en los músculos.

Se han observado varias ventajas con la inmunización genética con respecto a la vacunación convencional. El ADN se puede detectar durante un período de tiempo considerable, actuando de este modo como un depósito de antígeno (Ning et al., 1993). Los motivos de secuencias en algunos plásmidos son inmunoestimulantes, y pueden funcionar como adyuvantes (Krieg et al., 1995; Messina et al., 1991; Yamamoto et al., 1992). La coexpresión de citoquinas potencia la respuesta y ofrece la posibilidad de modular la inducción de una respuesta inmunitaria en una dirección deseada (Zhignan et al., 1995; Geissler et al., 1997; Kim et al., 1997). Sin embargo, se han de superar algunos obstáculos antes de que se logre una aplicabilidad general.

Si fuese posible suministrar plásmidos para la inmunización genética con un portador bacteriano atenuado, se combinarían las ventajas y versatilidades de ambos sistemas. Además, la ruta natural de administración suministraría ADN a tipos celulares que han evolucionado específicamente para inducir respuestas inmunitarias. Las Salmonella spp. son particularmente adecuadas para este fin, debido al amplísimo conocimiento sobre la genética y la fisiología de muchas de las cepas. Existe una gran cantidad de documentación sobre su utilidad como portadores de antígenos heterólogos, que son capaces de inducir respuestas inmunitarias protectoras (Fairwether et al., 1990; Molina et al., 1990; Newton et al., 1989; revisado por Chatfield et al., 1994; Roberts et al., 1994). También, las cepas atenuadas de Salmonella están disponibles y ya se usan como vacunas en animales y en el hombre (Hassan, 1996; Steinbach, 1996; Fox, 1997; Germanier y Fürer, 1975). Finalmente, los plásmidos recombinantes construidos en cepas de laboratorio de E. coli se pueden introducir directamente en Salmonellae sin manipulaciones adicionales.

Según una realización, la invención se refiere a una cepa atenuada de Salmonella que tiene un vector de expresión eucariota, para la expresión de un gen heterólogo, o un fragmento génico o un gen autólogo, o un fragmento génico, compuesto por el vector, dentro de un marco de lectura abierto, en la que la atenuación se ajusta a una vacunación de vertebrados, incluyendo los seres humanos.

La cepa de Salmonella según la invención puede ser una cepa de S. typhimurium, especialmente aroA SL 7207 de S. typhimurium, o LT2 de S. typhimurium, y preferiblemente aroA544 (ATCC 33275).

Además, la cepa de Salmonella según la invención puede ser una cepa de S. typhii, especialmente Ty21a de S. typhii.

Según la invención, están comprendidas las cepas de Salmonella en las que el vector de expresión eucariota deriva o puede derivar del plásmido pCMV\beta conocido, que comprende:

-: el gen estructural de \beta-galactosidasa (\beta-gal)

-: bajo el control del promotor temprano inmediato de CMV humano, que consta del plásmido pCMV\beta per se, e incluye

-: un dador de corte y empalme,

-: dos sitios aceptores de corte y empalme entre el promotor y el gen de \beta-galactosidasa, y facultativamente

-: el sitio de poliadenilación de SV40.

La cepa de Salmonella según la invención se puede caracterizar mediante un gen heterólogo o un gen autólogo que codifica una proteína, y especialmente una proteína inmunógena o antígeno protector.

Según la invención, están comprendidas las cepas de Salmonella en las que el gen heterólogo se selecciona del grupo que consiste en

-: el gen de \beta-galactosidasa de Escherichia coli (gen lacZ),

-: una variante truncada no hemolítica del gen de listeriolisina de Listeria monocytogenes (gen hly), y

-: una variante truncada del gen actA de Listeria monocytogenes (gen actA).

Otra realización de la invención se refiere a una vacuna para el suministro génico oral y/o nasal y/o mucosal a vertebrados, incluyendo seres humanos, en la que la vacuna comprende una cepa de Salmonella según la invención.

Adicionalmente, otra realización de la invención se refiere a un uso de una cepa de Salmonella según la invención, o de una vacuna según la invención, para la identificación sistemática mediante expresión de genotecas de ADN heterólogo o genotecas de ADNc, mediante vacunación de ADN en vertebrados, excluyendo a los seres humanos.

Finalmente, otra realización de la invención se refiere a un procedimiento para la recuperación, en un animal no humano, de

(i): una cepa de Salmonella atenuada que tiene un vector de expresión eucariota, para la expresión de un gen heterólogo, o de un fragmento génico, o de un gen autólogo, o de un fragmento génico, que comprende el vector dentro de un marco de lectura abierta, en la que la atenuación se ajusta a una vacunación de vertebrados, incluyendo los seres humanos; o

(ii): una vacuna para el suministro génico oral y/o nasal a vertebrados, incluyendo seres humanos, en el que la vacuna comprende una cepa de Salmonella según (i), o

(iii): una proteína inmunógena o un antígeno protector como producto de expresión de un vector de expresión eucariota según (i), caracterizado por

(a): usar la información genética de un ADN heterólogo o autólogo, o de una librería de ADNc, como fragmento génico o gen a expresar por un vector de expresión eucariota transportado por una cepa de Salmonella atenuada, en el que la atenuación se ajusta a una vacunación de vertebrados, incluyendo los seres humanos,

(b): llevar a cabo una vacunación de ADN por medio de la cepa de Salmonella atenuada según (a), en un vertebrado o en un ser humano,

(c): llevar a cabo una identificación sistemática de la expresión para obtener un producto de expresión de un gen o de un fragmento génico según (a) que proporcione una respuesta inmunitaria,

(d): y recuperar una cepa de Salmonella según la invención, o una vacuna según la invención, o una proteína inmunógena o antígeno protector que proporcione una respuesta inmunitaria en vertebrados, incluyendo los seres humanos.

En resumen, se afirma que S. typhimurium aroA administrada oralmente, que porta plásmidos que codifican \beta-galactosidasa (\beta-gal) de Escherichia coli, o formas truncadas de ActA o listeriolisina de Listeria monocytogenes, bajo el control de un promotor eucariota, inducen una respuesta inmunitaria humoral y celular eficaz. La intensidad y la cinética de la respuesta es sólo compatible con la interpretación de una transferencia del plásmido de expresión desde el portador de Salmonella al núcleo de APC del hospedante. La actividad de \beta-galactosidasa fue incluso detectable cinco semanas después de la administración de la vacuna oral. Además, los experimentos in vitro con macrófagos primarios de ratón demostraron una transferencia eficiente de ADN plasmídico desde las bacterias atenuadas a los núcleos de las células hospedantes fagocíticas.

Resultados

Para lograr la inmunización genética con un portador bacteriano atenuado vivo, se usaron tres plásmidos que se basan en el plásmido pCMV\beta comercialmente disponible. Este plásmido contiene el gen estructural de \beta-gal bajo el control del promotor temprano inmediato de CMV humano, e incluye un donante de corte y empalme y dos sitios aceptores de corte y empalme entre el promotor y el gen estructural. Para los estudios que examinan la eficacia de la respuesta inmunitaria contra patógenos, el gen \beta-gal se sustituyó por genes que codifican dos factores de virulencia de Listeria monocytogenes. Se usó un gen truncado, que codifica una variante no hemolítica de listeriolisina (pCMVhly), a partir de las posiciones 26 a 432 de aminoácidos, y una variante truncada del gen estructural de la proteína membránica ActA (pCMVactA) que codifica los aminoácidos 31-613. La cepa SL7207 de S. typhimurium aroA se transformó con estos tres plásmidos, y se inmunizaron oralmente a grupos de ratones alimentando a cada ratón 10^{8} organismos por inmunización. Se encontró que esta dosis era óptima (datos no mostrados). Los ratones no mostraron signos observables de enfermedad usando este programa de inmunización.

Inducción de una fuerte respuesta de células T mediante inmunización con Salmonellae que portan vectores de expresión eucariotas

La hipótesis de trabajo de estos experimentos es que S. typhimurium aroA, administrada oralmente, daría como resultado la captación de la bacteria por macrófagos y/o células dendríticas, con la activación concomitante por la endotoxina de la bacteria. Después de unas pocas rondas de división bacteriana, la bacteria intracelular moriría, debido a su incapacidad para sintetizar aminoácidos aromáticos esenciales. Durante este proceso, se liberarían los plásmidos, y se transferirían al citosol y al núcleo de las células infectadas. Eventualmente, los genes codificados se expresarán por APC del hospedante.

La primera predicción de esta hipótesis es la inducción de una fuerte respuesta citotóxica de las células T CD8, puesto que el antígeno se expresaría en el citosol, el compartimiento celular responsable de la presentación de MHC de clase I. Para este fin, se realizaron dos tipos de experimentos. Los ratones se infectaron oralmente una vez con Salmonellae recombinantes, y se siguieron sus respuestas citotóxicas de las células T durante varias semanas mediante el estudio de sus células del bazo directamente ex vivo (datos no mostrados), o después de una reestimulación in vitro. Como alternativa, los ratones se inmunizaron oralmente cuatro veces, en intervalos de dos semanas, y se examinó el transcurso de la respuesta citotóxica. La Fig. 1 demuestra que se puede provocar una respuesta fuerte y específica de las células T CD8 con Salmonella administrada oralmente, que porta plásmidos de expresión eucariotas. Los ratones inmunizados con el gen truncado de listeriolisina provocaron sólo una respuesta con relación a dianas sensibilizadas con el péptido inmunodominante que comprende AA91-99 de listeriolisina (LLO), y no contra dianas sensibilizadas con lisozima soluble de huevo de gallina (HEL) o con un péptido de control (Fig. 1A). De forma similar, las células del bazo procedentes de ratones inmunizados con Salmonella que porta el plásmido de expresión ActA sólo pudieron responder a ActA (Fig. 1D). Para revelar la respuesta citotóxica frente a ActA, se explotó la actividad formadora de poros de la listeriolisina. Esta actividad de la listeriolisina permite la introducción de proteínas pasajeras solubles, en el citosol de células dianas (Darji et al., 1995a; Darji et al., 1997). Por lo tanto, las células estimulantes y las células dianas se sensibilizaron con una mezcla de ActA soluble y LLO. Se observó una respuesta específica sólo cuando se usó la combinación de ActA y LLO. No se encontró ninguna respuesta cuando se estudió LLO sola. Estas respuestas fueron específicas para el antígeno codificado con el plásmido durante todo el período de tiempo indicado en Fig. 1, paneles B y C, y E y F, y también se observaron cuando se estudió la respuesta de ratones inmunizados con Salmonella que cultiva al plásmido de control de \beta-gal (datos no mostrados).

La cinética de las respuestas indicó que una única dosis provocó una fuerte respuesta citotóxica de las células T, que alcanzó un pico 5 semanas después de la inmunización, y después decayó lentamente (Fig. 1C y F). Por otro lado, la respuesta siguió aumentando incluso al final del período de observación, es decir, 5 semanas después de la última exposición en los ratones que habían recibido cuatro dosis de inmunización (Fig. 1B y E). De este modo, se observó una fuerte respuesta citotóxica cuando se usa Salmonella como vehículo potencial para la inmunización genética.

La inmunización genética también provoca habitualmente una respuesta de células T auxiliares CD4 (Donnelly et al., 1997). Por lo tanto, se estudiaron las células procedentes del bazo y de los nódulos linfáticos mesentéricos de los mismos ratones usados anteriormente, para determinar su respuesta proliferativa frente a proteínas solubles. Este tipo de respuesta es debida principalmente a la presentación de antígeno vía moléculas de MHC de clase II, y realizada por las células T CD4. Como se muestra en la Fig. 2, se observa una respuesta fuerte y específica de las células T auxiliares, en paralelo con la respuesta citotóxica, cuando se usan para inmunización plásmidos de expresión eucariotas portados por Salmonellae (Fig. 2A y D). En cuanto a la respuesta de CD8, una sola dosis fue suficiente para una respuesta, que aún crecía al final del período de observación, independientemente de si se usó listeriolisina o ActA como antígeno (Fig. 2C y F). Sin embargo, cuatro inmunizaciones consecutivas dieron como resultado una respuesta incluso más fuerte, que pareció durar puesto que una respuesta aparentemente aún crecía cinco semanas después de la última exposición (Fig. 2B y E). Se obtuvieron resultados similares con Salmonella que porta el plásmido de control que expresa \beta-gal (datos no mostrados). El análisis de los sobrenadantes de los cultivos in vitro reveló la producción de IFN\gamma por estas células T. No se pudo encontrar IL-4, sugiriendo que tal esquema de inmunización induce principalmente un tipo inflamatorio o TH1 de respuesta de auxiliares T.

Inducción de anticuerpos específicos mediante inmunización con Salmonellae que portan vectores de expresión eucariotas

Los sueros reunidos de los grupos de ratones usados anteriormente se estudiaron para determinar la presencia de anticuerpos específicos. Claramente, además de una respuesta de célula T auxiliar y citotóxica, la inmunización con Salmonellae que portan plásmidos de expresión eucariotas indujo respuestas fuertes y específicas de anticuerpos, según se revela mediante ELISA (Fig. 3A y B) o mediante inmunotransferencia (datos no mostrados). Nuevamente, fue suficiente una única inmunización para una buena respuesta, que alcanzó un pico cuatro semanas después de la administración de la bacteria, y después disminuyó de la misma manera como se observó para la respuesta citotóxica (Fig. 3A y B). Cuatro inmunizaciones no aumentaron el título de anticuerpos significativamente, pero probablemente indujeron una respuesta más duradera puesto que no se alcanzó una meseta de título de anticuerpos incluso al final del período de observación (Fig. 3A y B).

El análisis de la distribución de subclases de ratones individuales en la semana 11 indicó una concentración elevada de IgG2a, mientras que la concentración de IgG2b y de IgG3 fue insignificante (Fig. 3C y D). Esto está de acuerdo con el hallazgo de que sólo se pudo detectar IFN\gamma, y nada de IL-4, en el sobrenadante de las células auxiliares T reestimuladas. Sin embargo, también se observó IgG1 a concentraciones elevadas en los sueros inmunes. Esta subclase se encuentra cuando las células auxiliares TH2 participan en la respuesta inmunitaria, indicando que bajo las condiciones experimentales las células TH2 también pueden ser inducidas, pero no fueron reveladas en el ensayo de células T in vitro. Además, se provocaron anticuerpos de IgA mediante este programa de inmunización (no mostrado).

Tomados juntos, los resultados presentados en la Fig. 1-3 muestran que la inmunización con S. typhimurium aroA que porta vectores de expresión eucariotas puede provocar respuestas en los tres compartimientos efectores específicos del sistema inmunitario, a saber, células T CD8 citotóxicas, células T CD4, y anticuerpos. La respuesta en el compartimiento de auxiliares T se inclinó fuertemente hacia una respuesta de auxiliar T, TH1 o inflamatoria.

Protección frente a dosis letales de L. monocytogenes

La fuerte respuesta observada, en particular la de las células T citotóxicas, sugirió que los ratones inmunizados de esa manera se deben de proteger de una dosis letal de L. monocytogenes. Por lo tanto, 90 días después de la primera inmunización, o 48 días después de la cuarta inmunización - cuando sea aplicable -, los ratones se expusieron i.v. a una dosis de bacterias que corresponde a 10 x LD_{50}. La Fig. 4 muestra que los animales que se inmunizaron cuatro veces consecutivamente con Salmonellae que cultivan un vector de expresión eucariota que codifica LLO truncada, estuvieron completamente protegidos (Fig. 4A). Los animales que habían recibido solamente una única vacunación estuvieron parcial pero significativamente protegidos, puesto que en el momento de la finalización de ese experimento el 60% de los animales estaba aún vivo. Todos los animales que se inmunizaron con Salmonellae que portan el plásmido de control de \beta-gal no estuvieron protegidos, y murieron en cuatro días. Sorprendentemente, las inmunizaciones con Salmonellae que portan el plásmido de expresión ActA no dieron como resultado protección, aunque se pudieron demostrar respuestas citotóxicas y auxiliares de células T en ratones del mismo grupo, indicando que la inmunización había tenido éxito (datos no mostrados). De este modo, la proteína ActA de la membrana listeriana no es un antígeno protector.

Evidencia de la transferencia del plásmido de expresión desde Salmonellae portadoras a células hospedantes in vivo

Existió la preocupación de que una débil actividad del promotor eucariota en la bacteria, o un promotor procariota tríptico en el plasma, pudiera dar como resultado la expresión de los antígenos en el portador bacteriano, provocando de este modo la potente respuesta inmunitaria. De hecho, las Salmonellae recombinantes que cultivan el pCMV\beta exhibieron una baja actividad de \beta-gal (2,5 U), en comparación con la cepa progenitora. Para descartar cualquier posibilidad, se inmunizaron ratones con una cepa de Salmonella recombinante que produjo mayores niveles, de más de 100 veces (334 U), de actividad enzimática de \beta-gal. Una única dosis de vacunación usando estas bacterias no provocó ninguna respuesta medible de células T o de anticuerpos (Fig. 5A-C). Sin embargo, una vacunación repetida dio como resultado una débil respuesta de célula T citotóxica, detectable después de la reestimulación in vitro, aunque apenas alcanzó la intensidad de la respuesta observada usando una única inmunización con Salmonellae que cultivan el plásmido de expresión eucariota de \beta-gal (Fig. 5A). No se observó ninguna respuesta de célula T CD4 ni respuesta de anticuerpo,
incluso después de la inmunización oral repetida con Salmonellae que expresan constitutivamente \beta-gal (Fig. 5B y C).

Como resultado de la mutación aroA, las bacterias parecen morir muy rápidamente, puesto que las bacterias vivas nunca podrían ser demostradas después de la inmunización a los diversos puntos de tiempo examinados. No obstante, incluso a cinco semanas después de la administración oral de Salmonellae que cultivan el plásmido de expresión de \beta-gal eucariota, la actividad enzimática de \beta-gal se pudo detectar en células adherentes - lo más probable, macrófagos - procedentes del bazo de estos ratones, sugiriendo una transferencia de plásmido a la célula eucariota (datos no mostrados). Para corroborar adicionalmente esta observación, se inyectaron Salmonellae que portan el vector pCMV\beta en el peritoneo de ratones, y se cosecharon las células del exudado peritoneal después de 1 hora. Las células se cultivaron entonces toda la noche en presencia de tetraciclina, para inhibir la síntesis de proteína bacteriana, y finalmente se tiñeron para determinar la actividad de \beta-gal. La actividad enzimática de \beta-gal se observó en una gran cantidad de células de tipo macrófago. La tinción fue difusa, y no se restringió claramente a las vesículas endocíticas en las que reside habitualmente la Salmonella. Esto sugiere que el ADN plasmídico se transfirió desde las Salmonellae teñidas a las células hospedantes, y que esto sucedió a una frecuencia elevada.

Transferencia de ADN desde S. typhimurium aroA a células hospedantes de mamíferos in vitro

Para obtener una prueba directa de que la transferencia de ADN tiene lugar desde el portador bacteriano a los macrófagos del ratón, se infectaron macrófagos peritoneales primarios con Salmonellae que contienen el plásmido de expresión de \beta-gal (pCMV\beta). Después de la infección durante una hora, se añadió gentamicina para exterminar las bacterias extracelulares que quedan. Cuatro horas después, se añadió tetraciclina para exterminar las bacterias intracelulares residentes. Después de la incubación toda la noche, las células se tiñeron para determinar la actividad de \beta-gal. La actividad enzimática se pudo demostrar en hasta 30% de las células adherentes, similares a macrófagos, incluso en presencia continua de tetraciclina, que bloquea la síntesis de proteína bacteriana (Fig. 6).

Para demostrar que se produjo \beta-galactosidasa por la célula hospedante, y no por las bacterias, se realizaron dos tipos de experimentos. En primer lugar, se infectaron células peritoneales adherentes, y se trataron como se describe anteriormente. El ARN se extrajo después de la incubación toda la noche. Si ciertamente el plásmido se había transferido y transcrito en el núcleo de la célula hospedante, los productos de corte y empalme de ARN, derivados del dador de corte y empalme y de los sitios aceptores en el vector, deberían ser demostrables. Mediante RT-PCR con un par de cebadores que se hibridan a secuencias en cualquier lado del pequeño intrón, se pudo observar un producto de PCR que correspondió a uno de los productos de corte y empalme esperados (Fig. 7A). La identidad de este producto se confirmó mediante secuenciación de ADN (datos no mostrados).

En segundo lugar, el marcado biosintético de proteínas en presencia de tetraciclina sólo debería permitir la traducción de ARNm producido por las células hospedantes eucariotas. Las células peritoneales adherentes se infectaron como se describió, y se pulsaron durante 30 minutos con ^{35}S-metionina después de 4, 24 ó 48 horas en ausencia o en presencia de tetraciclina. A las cuatro horas, no se pudo observar \beta-gal mediante inmunoprecipitación, incluso en ausencia de tetraciclina, en la que los productos bacterianos se debían de haber marcado (Fig. 7B). De este modo, la transferencia de ADN plasmídico y la expresión eucariota no habían tenido lugar todavía. Sin embargo, \beta-gal se pudo inmunoprecipitar después de un período de incubación de 24 horas o de 48 horas, incluso cuando la tetraciclina estaba continuamente presente durante el período tanto de incubación como de marcado. La incubación del anticuerpo anti-\beta-gal con un exceso de \beta-gal no marcado demostró la especificidad de la inmunoprecipitación (Fig. 7B/línea 10). Esto indica claramente que el \beta-gal precipitado se produjo por la propia célula de hospedante de mamífero infectada, y no por la bacteria que había portado originalmente el plásmido de expresión. De este modo, ha debido de tener lugar una transferencia del plásmido desde Salmonellae a la célula hospedante.

Discusión

Recientemente se ha demostrado la transferencia de plásmidos de expresión eucariota desde bacterias entéricas atenuadas al núcleo de células hospedantes. Mientras este trabajo estaba en desarrollo, se informó que los mutantes auxotrópicos de Shigella y de E. coli que expresan la invasina de Shigella pueden portar plásmidos de expresión eucariotas en células hospedantes (Sizemore et al., 1995; Courvalin et al., 1995). Dado que ambas bacterias son capaces de escapar del fagolisosoma al citosol de la célula hospedante, se deduce que la lisis de las bacterias en este compartimiento permitiría transferir el plásmido liberado al núcleo. La transferencia de plásmido desde patógenos intracelulares, tales como Salmonella, sería más difícil de imaginar, puesto que estas bacterias generalmente son retenidas dentro de las vacuolas de la célula hospedante infectada. De hecho, sólo se ha dado a conocer una "baja eficacia" de la transferencia de plásmido a la estirpe celular de macrófagos, usando Salmonella atenuada (Sizemore et al., 1995). Los experimentos iniciales usando varias estirpes celulares de macrófagos también han indicado que éste era ciertamente el caso (datos no mostrados).

Sin embargo, la cinética y la intensidad de la respuesta inmunitaria después de administrar Salmonella que portan vectores de expresión eucariotas sugirieron que podría haber tenido lugar in vivo una transferencia de plásmido. Por lo tanto, se decidió investigar los macrófagos primarios aislados del peritoneo de ratones. Usando estas células, se podría demostrar claramente una transferencia de un vector plasmídico de expresión eucariota a las células hospedantes. Se ha descrito una ruta que permite transferir proteínas desde vesículas endocíticas al citosol de algunos tipos celulares, incluyendo los macrófagos (Reivindicaciones de Sousa y Germain, 1995; Norbury et al., 1995). Todavía se ha de estudiar si tal ruta podría ser también responsable de la transferencia de ácidos nucleicos observada aquí. El hecho de que la transferencia de plásmido con Salmonella se observó sólo con macrófagos primarios, y no con estirpes celulares, sugiere la presencia de una ruta de transporte que sólo opera eficazmente en células primarias.

La prueba de una transferencia de ADN plasmídico desde Salmonella a la célula hospedante in vitro es irresistible. El corte y empalme de ARN y la síntesis de proteínas en presencia de tetraciclina sólo son posibles si el gen es expresado por la célula hospedante eucariota. También se obtuvo la prueba de que la transferencia del vector de expresión in vivo es responsable de la inducción de la fuerte respuesta inmunitaria observada. La actividad enzimática de \beta-gal se pudo observar cinco semanas después de la última exposición en unas pocas células de bazo adherentes. Sin embargo, no se pudo detectar Salmonella viable incluso cuando se ensayó una semana después de la última infección, argumentando de este modo que la expresión de \beta-gal no pudo ser debida a Salmonella superviviente residual. No obstante, es intrigante cómo tales células que expresan antígeno pueden existir en presencia de células T citotóxicas específicas.

Las fuertes respuestas citotóxicas y protectoras sólo se han dado a conocer con Salmonella que segregan los antígenos. No se han descrito respuestas comparables usando Salmonella que expresan constitutivamente proteínas heterólogas no segregadas (Hess et al., 1996). Se requirieron dosis elevadas de bacterias recombinantes que expresan proteína intracelular para inducir células T CD8 (Turner et al., 1993). Aunque la inducción de anticuerpos específicos se ha estudiado en algunas condiciones experimentales (Guzman et al., 1991; Walker et al., 1992), no se observó ninguna respuesta de anticuerpos en las circunstancias descritas anteriormente (Turner et al., 1993). Esto se confirmó por los resultados dados aquí (Fig. 5). Por lo tanto, es muy improbable que las potentes respuestas de células T citotóxicas y auxiliares, así como la producción de anticuerpos específicos, sea el resultado de una expresión fortuita de los antígenos en la Salmonella portadora.

La intensidad de la respuesta inmunitaria observada, especialmente después de una única dosis de inmunización, indica que la transferencia de ADN por el portador bacteriano es probablemente superior a una aplicación directa de ADN plasmídico aislado en la piel o en los músculos. Esto sugiere que, usando el puerto natural de entrada de un patógeno, el vector de expresión se transfiere en tipos celulares que han evolucionado para inducir eficazmente una respuesta inmunitaria. Es probable que la Salmonella portadora sea recogida por los macrófagos y las células dendríticas. No está claro si los macrófagos desempeñan un papel durante la estimulación de células T sin tratamiento previo frente a bacterias, pero se sabe que las células dendríticas son muy eficaces a la hora de cebar células T en reposo. Puesto que el antígeno se expresa en el citosol de estas células, es de esperar una fuerte respuesta de célula T citotóxica.

La inducción de una respuesta adicionalmente fuerte de células auxiliares y de anticuerpos es extraña, y sólo se pueden hacer cábalas. Algunas proteínas citosólicas pueden ser presentadas eficazmente por moléculas de MHC de clase II (Brooks y McCluskey 1993). Sin embargo, sería una coincidencia muy afortunada si las tres proteínas usadas en el presente estudio desempeñan esta propiedad. En cualquier caso, no podría explicar las respuestas de anticuerpos que se observaron. Es más probable que las APC que expresan el antígeno sean lisadas por células citotóxicas específicas, y que las células que mueren que contienen antígeno o el propio antígeno libre son recogidos por APC vecinas y son presentados vía moléculas de MHC de clase II. La respuesta humoral generada se podría explicar de manera similar.

En resumen, la inmunización genética oral usando Salmonellae atenuadas como portadores podría funcionar como se representa esquemáticamente en la Fig. 8. La Salmonella entra en el hospedante vía las células M en el intestino. Las bacterias son captadas en las áreas abovedadas por células fagocíticas, tales como macrófagos y células dendríticas. Estas células son activadas por el patógeno, y comienzan a diferenciarse y probablemente a migrar a los nódulos linfáticos y al bazo. Durante este período de tiempo, las bacterias mueren debido a su mutación atenuante, y liberan los vectores de expresión eucariota a base de plásmidos. Los plásmidos son transferidos entonces al citosol, vía un sistema de transporte específico o mediante pérdida endosómica. Finalmente, el vector entra en el núcleo y es transcrito, conduciendo de este modo a la expresión del antígeno en el citosol de las células hospedantes. Las células T citotóxicas específicas son inducidas por estas APC activadas que lisan las células que expresan antígeno. El antígeno libre o las células que mueren pueden ser captados por otras APC, que ahora a su vez pueden estimular a células auxiliares. El antígeno libre también sería responsable de la inducción de una respuesta de anticuerpos. Además, la endotoxina bacteriana y los motivos de secuencia de ADN del vector también podrían funcionar como coadyuvantes, y podrían contribuir a la intensidad de las respuestas observadas.

La respuesta de célula T auxiliar inducida con este tipo de inmunización genética pareció desviarse fuertemente al tipo TH1, según se indica por la producción de IFNg de células T reestimuladas in vitro y el elevado título de IgG2a en la respuesta humoral (Mosmann y Coffman, 1989). Esto no es inesperado, puesto que las bacterias habitualmente inducen tipos inflamatorios de respuesta. Para muchas estrategias de vacunación, es deseable inducir una respuesta TH1 para la protección frente al patógeno particular, por ejemplo las razas de ratones que responden con células TH2 frente a Leishmania major no eliminan el parásito y no están protegidas, mientras que los ratones que montan una respuesta TH1 son resistentes (Sher y Coffman, 1992). Por otro lado, la inducción del tipo TH2 de respuestas, o la conversión de una respuesta TH1 en una respuesta TH2, ha demostrado ser ventajosa en enfermedades autoinmunitarias inflamatorias (Tian et al., 1996). De forma similar, las infecciones por nemátodos también pueden requerir una respuesta TH2 (Sher y Coffman, 1992). Puesto que las bacterias sólo se están usando como un vehículo en la transferencia de plásmidos de expresión, y por lo tanto sólo desempeñan un papel secundario, sería posible manipular la respuesta TH1. La inducción de IgG1 específica sugiere la presencia de un componente TH2 durante la respuesta de células auxiliares, que se puede aumentar. La coexpresión del antígeno junto con ciertas citoquinas o moléculas coestimulantes, o alternativamente usando estrategias antisentido para suprimir moléculas coestimulantes, debería hacer posible forzar a las respuestas hacia TH2.

Se estudiaron como antígenos dos factores de virulencia bien caracterizados, para determinar la protección frente a una exposición letal con L. monocytogenes. Se ha demostrado antes que la listeriolisina induce protección (Harty y Bevan, 1992; Hess et al., 1996). Esto también fue verdad en las condiciones experimentales del presente documento. De forma interesante, incluso una única dosis de Salmonellae que contienen el plásmido de expresión de listeriolisina eucariota fue suficiente para proporcionar protección al 60% de los ratones. Por otro lado, ActA no sirvió como antígeno protector. Obviamente, la proteína de membrana ActA no está disponible para los mecanismos de presentación mientras que las bacterias estén vivas. Esto plantea la cuestión de si las proteínas de membrana de las bacterias en general no son protectoras, o si ActA es un caso especial. La fosforilación extensa de la proteína ActA por quinasas del hospedante tras la infección, puede afectar a su capacidad para ser procesada. No obstante, el papel de las proteínas bacterianas unidas a la superficie, en la protección, ahora se puede afrontar usando el sistema de Salmonellae para vacunación genética.

La inducción de una respuesta fuerte y específica de anticuerpos, que se puede medir en un ensayo ELISA y mediante inmunotransferencia, reveló beneficios adicionales derivados del tipo de inmunización descrito aquí. De este modo, para provocar anticuerpos policlonales específicos, y posiblemente también anticuerpos monoclonales, se puede insertar cualquier marco de lectura abierta en un plásmido de expresión, y se puede usar para inmunización. Esto facilitará la caracterización de productos génicos cuando sólo esté disponible la información de la secuencia.

En conclusión: usando Salmonella atenuada, que porta vectores de expresión eucariota, se puede lograr la inmunización genética mediante la administración oral del portador. La estimulación de células T citotóxicas y auxiliares, así como inducción de una fuerte respuesta de anticuerpos, proporciona un sistema muy versátil para nuevas estrategias de inmunización. La fuerza de este enfoque también se aprovecha del desarrollo de cepas de Salmonellae más recientes y más racionalmente atenuadas, así como de los avances técnicos a la hora de proporcionar una expresión eucariota condicional y dirigida a dianas, mediante la célula hospedante infectada. La posibilidad de inmunización genética con fragmentos de ADN que contienen marcos de lectura abierta permitirá definir la función de nuevos productos génicos, proporcionará nuevos reactivos serológicos, y permitirá la delineación y la evaluación de eficacias de antígenos protectores en protocolos de vacunación.

Ahora la invención se describe con más detalle basándose en las figuras y en los datos experimentales.

Leyendas de las Figuras

Fig. 1 Inducción de células T citotóxicas en ratones inmunizados oralmente con 10^{8} de S. typhimurium aroA que portan plásmidos de expresión eucariota que codifican listeriolisina o ActA. Los ratones se inmunizaron cuatro veces con intervalos de dos semanas (A, B, D, E) o una sola vez (C; F) con Salmonella que porta pCMVhly (A-C) o pCMVActA (D-F), y las células del bazo se reestimularon una vez in vitro con un péptido sintético que comprende AA91-99 de listeriolisina (A-C), o con una mezcla de ActA purificada y listeriolisina hemolíticamente activa, lo que da como resultado la presentación de clase I de ActA debido a la actividad formadora de poros de la listeriolisina (Darji et al., 1995a; Darji et al., 1997). Las células T reestimuladas se estudiaron con células diana P815 marcadas radioactivamente, a una relación de efector a diana de 10:1. A: especificidad de la respuesta citotóxica anti-listeriolisina. Las células diana se sensibilizaron con lisozima de huevo de gallina (HEL), con péptido AA 91-99 de listeriolisina (pLLO), o con un péptido control de nucleoproteína del virus de la gripe (pNP). Se presenta el experimento con células del bazo de 5 semanas mostrado en el panel B. Se observó una especificidad similar en todos los otros puntos de tiempo. B: cinética de la respuesta citotóxica de ratones inmunizados cuatro veces con pCMVhly. Las flechas indican las inmunizaciones de refuerzo. C: cinética de la respuesta citotóxica de ratones inmunizados una vez con pCMVhly. D: especificidad de la respuesta citotóxica anti-ActA. Las células diana se sensibilizaron con una mezcla de ActA y listeriolisina (ActA +
LLO), HEL y listeriolisina (HEL + LLO), o con listeriolisina sola (LLO). Se presenta el experimento con células del bazo reestimuladas de 5 semanas mostrado en el panel E. Se observó una especificidad similar en otros puntos de tiempo, e incluyendo otros péptidos sintéticos de diversos orígenes. E: cinética de la respuesta de célula T citotóxica en ratones inmunizados cuatro veces con pCMVActA. Las flechas indican las inmunizaciones de refuerzo. F: cinética de la respuesta de célula T citotóxica en ratones inmunizados una vez con pCMVActA. La especificidad de la respuesta citotóxica se evaluó adicionalmente estudiando las células del bazo de ratones inmunizados de forma similar con pCMV\beta (P-gal) sobre células diana sensibilizadas con pLLO, ActA más listeriolisina, o con un transfectante de P815 que expresa \beta-gal (datos no mostrados). De forma similar, se observó una respuesta de célula T citotóxica específica frente a \beta-gal, pero la cinética no fue seguida tan sistemáticamente como para los otros dos antígenos.

Fig. 2 Inducción de células T auxiliares en ratones inmunizados oralmente con 10^{8} S. typhimurium aroA que portan plásmidos de expresión eucariota que codifican listeriolisina o ActA. Se estudiaron las células del bazo (SPC) y de los nódulos linfáticos (LNC) procedentes de los mismos ratones estudiados para determinar las respuestas de células T citotóxicas presentadas en la Fig. 1, para estudiar las respuestas de células T auxiliares. Los ratones se inmunizaron cuatro veces (A, B, D, E) o una vez (C; F) con Salmonella que porta pCMVhly (A-C) o pCMVActA (D-F), y se reestimularon in vitro. Después de dos días, se estudió la proliferación mediante incorporación de ^{3}H-timidina. A: especificidad de la respuesta proliferativa de células del bazo procedentes de ratones inmunizados con pCMVhly. Las células T estudiadas fueron las mismas que las presentadas en el panel B en la semana 11. Se obtuvieron resultados similares en otros puntos de tiempo. B: cinética de la respuesta proliferativa de células del bazo y de los nódulos linfáticos procedentes de ratones inmunizados cuatro veces con pCMVhly. Las flechas indican las inmunizaciones de refuerzo. C: cinética de la respuesta proliferativa de células del bazo y de nódulos linfáticos procedentes de ratones inmunizados una vez con pCMVhly. D: especificidad de la respuesta proliferativa de células del bazo procedentes de ratones inmunizados cuatro veces con pCMVActA. Las células T estudiadas fueron las mismas que las presentadas en el panel D en la semana 11. Se obtuvieron resultados similares en otros puntos de tiempo. E: cinética de la respuesta proliferativa de células del bazo y de los nódulos linfáticos inmunizadas cuatro veces con pCMVActA. Las flechas indican las inmunizaciones de refuerzo. F: cinética de la respuesta proliferativa de células del bazo y de nódulos linfáticos procedentes de ratones inmunizados una vez con pCMVActA. De forma similar, las células del bazo y de nódulos linfáticos procedentes de ratones inmunizados con pCMV\beta (\beta-gal) nunca reaccionaron con listeriolisina ni con ActA, pero pudieron responder a la reestimulación con \beta-gal (datos no mostrados).

Fig. 3 Cinética y distribución de subclases de IgG sérica específica procedente de ratones inmunizados oralmente con S. typhimurium aroA que porta plásmidos de expresión eucariota que codifican listeriolisina, ActA o \beta-gal. Los sueros procedentes de los mismos ratones estudiados para determinar las respuestas citotóxicas y proliferativas de células T, presentadas en las Fig. 1 y 2, se usaron y se evaluaron en estudios de ELISA específicos. Los ratones se inmunizaron cuatro veces (A) o una vez (B) con pCMVhly, pCMVActA o pCMV\beta, respectivamente, y los sueros reunidos se ensayaron para determinar la IgG sérica específica de antígeno. Para evaluar la especificidad, todos los sueros se ensayaron sobre los tres antígenos. Sólo se observó reactividad frente al agente inmunizante (datos no mostrados). Se obtuvieron resultados idénticos mediante inmunotransferencia, usando los mismos antígenos (datos no mostrados). La distribución de subclases, 11 semanas después de la primera inmunización, se determinó a partir de los sueros individuales inmunizados cuatro veces (símbolos en negrita) o una vez (símbolos en blanco) con pCMVhly (C) o pCMVActA (D).

Fig. 4 La inmunización oral con S. typhimurium aroA que porta el plásmido de expresión eucariota que codifica listeriolisina induce una respuesta inmunitaria protectora, mientras que la inmunización con bacterias que portan el plásmido de expresión para ActA no es protectora. Se inmunizaron grupos de seis ratones cuatro veces con intervalos de dos semanas (A) o sólo una vez (B) con Salmonella que porta pCMVhly, pCMVActA o pCMV\beta, y se expusieron a una dosis letal de 5 x 10^{4} L. monocytogenes EGD (10 x LD_{50}), intravenosamente. Los ratones que se habían inmunizado sólo una vez con pCMVhly estaban moribundos después de dos días. Sin embargo, cuatro de ellos se recuperaron y sobrevivieron en un buen estado hasta que el experimento terminó dos semanas más tarde.

Fig. 5 Comparación de respuestas inmunitarias inducidas oralmente provocadas con Salmonella que contiene plásmidos de expresión procariota o eucariota para \beta-gal. Los ratones se inmunizaron con Salmonella que contiene el plásmido de expresión eucariota pCMV\beta o el plásmido pAH97 que expresó constitutivamente \beta-gal a partir del promotor Pr y Ps de XylS de Pseudomonas putida. Las bacterias que contienen el vector eucariota se administraron oralmente una vez (\bullet), mientras que las bacterias que expresan \beta-gal bajo el control del promotor procariota se administraron una vez (\vardiamondsuit) o cuatro veces con intervalos de dos semanas (\blacktriangledown). Las flechas indican el tiempo de las inmunizaciones de recuerdo. A. Respuesta citotóxica de células de bazo reestimuladas estudiadas a una relación de efector a diana de 10:1. Como diana, se usó el transfectante P13.1, que expresa \beta-gal, en el ensayo de JAM. B. Respuesta de célula T auxiliar proliferativa de células del bazo con \beta-gal aislado como antígeno. C. Respuesta de anticuerpo frente a \beta-gal a partir de sueros reunidos, medida mediante ELISA. Los datos presentados en A-C se obtuvieron con células o sueros procedentes de los mismos ratones. Todos los ensayos se realizaron como se describe en las figuras 1-3.

Fig. 6 Expresión de actividad de \beta-gal enzimática en células de exudado peritoneal tras la infección con S. typhimurium aroA que contiene un plásmido de expresión eucariota para \beta-gal. Se dejó que las células de exudado peritoneal (PEC), aisladas recientemente, se adhiriesen durante dos horas, y se infectaron a una MOI de 10 durante 15 minutos con Salmonella que contiene pCMV\beta en medio libre de antibiótico. Tras un lavado y la adición de gentamicina para exterminar las bacterias que permanecieron fuera de las células, se continuó la incubación durante 3-4 h a 37ºC. El medio se suplementó entonces con tetraciclina para exterminar las bacterias, mediante el bloqueo de su síntesis de proteínas. Después de 24 h adicionales a 37ºC, las células se lavaron con PBS, se secaron, se fijaron con acetona/metanol, y se incubaron toda la noche con el sustrato X-gal. Algunas veces, se observó la expresión de actividad de \beta-gal en hasta un 30% de la población de células adherentes. Sólo las células de tipo macrófagos expresaron actividad enzimática. Las pequeñas células encontradas en los cultivos presentados probablemente representaron linfocitos no adherentes que no se eliminaron en este experimento particular. La tetraciclina permaneció en el medio durante todo el experimento. La tinción de las células después de 4 h no reveló ninguna actividad enzimática.

Fig. 7 Las células hospedantes eucariotas transcriben y traducen \beta-gal derivado de S. typhimurium aroA que contiene el plásmido de expresión. A: el ARN derivado de las PEC 24 h después de la infección con Salmonella que contiene pCMV\beta se analizó mediante RT-PCR. Se usó un par de cebadores que bordean al dador de corte y empalme y a los sitios aceptores en dirección 3' del promotor. En la línea 2 se pudo detectar una banda de 196 pb (indicada por la flecha). La secuenciación de ADN identificó este fragmento como un producto de corte y empalme. El fragmento largo más fuerte de 227 pb observado en esta línea es debido a llevar ADN en la preparación de ARN, o debido a un corte y empalme ineficaz. La línea 1 muestra el control del macrófago no tratado, y la línea marcada con M contiene el marcador de tamaño molecular usado. Puesto que la señal del producto de corte y empalme fue extremadamente débil, se invirtieron los colores de blanco a negro. Esto dio como resultado un aumento del contraste, y permitió la visualización del producto de corte y empalme en la gráfica. B: las PEC se infectaron con Salmonella que contiene pCMV\beta como se describió, y, después de la incubación a diversas longitudes de tiempo, se realizó el marcado biosintético en presencia o en ausencia de tetraciclina, seguido de la inmunoprecipitación con anticuerpos monoclonales específicos de \beta-gal. Controles: (1) células BHK; (2) células BHK transfectadas con \beta-gal (control positivo). PEC infectadas: (3) incubadas cuatro horas tras la infección (p.i.), sin tetraciclina; (4) incubadas cuatro horas p.i., con tetraciclina durante el marcado; (5) incubadas cuatro horas p.i., con tetraciclina durante la incubación y el marcado; (6) incubadas 25 h p.i., sin tetraciclina; (7) incubadas 24 horas p.i., con tetraciclina durante el marcado; (8) incubadas 24 h p.i., con tetraciclina durante la incubación y el marcado; (9) incubadas 48 h p.i., sin tetraciclina; (10) incubadas 48 h p.i., con tetraciclina durante el marcado, y se añadió un exceso de 100 veces de \beta-gal sobre el anticuerpo precipitante al lisado antes de la inmunoprecipitación; (11) incubación de 48 h p.i., con tetraciclina durante el marcado; (12) incubación 48 h p.i., con tetraciclina durante la incubación del marcado. No se observó ninguna banda específica después de 4 h de incubación en ninguna de las condiciones. Sin embargo, después de permitir durante 24 h o más que se produjese una transferencia y una expresión de ADN, se pudo observar una banda específica para \beta-gal - indicada por la flecha.

Fig. 8 Representación esquemática de la secuencia de sucesos que pueden ocurrir in vivo después de la inmunización genética oral con S. typhimurium aroA atenuada.

Materiales y Métodos Cepa LT2 de Salmonella typhimurium

Véase Hosieth y Stocker en Nature, 291 (1981) 238-239. pCMV\beta véase Sizemore et al., en Science, 270 (1995) 299-302. Salmonella typhi Ty21a véase J. Infections Diseases, 131 (1975) 553. Gen de actA véase Domann en EMBO J., 11 (1992) 1981-1990. Gen hly véase Mengaud et al., en Infection Immunity, 56 (1988) 766-772. Identificación sistemática de la expresión véase Mougneau et al., en Science, 268 (1995) 563-566; y Huynh et al., en Glover, DNA Cloning, Vol. 1 (1986): 49-78.

Procedimientos experimentales Ratones

Se obtuvieron ratones hembra BALB/c (H-2^{d}) de 6-8 semanas, de Harlan Winkelmann (Borchem, Alemania).

Medios, reactivos y antígenos

Para las células eucariotas, se usó como medio de cultivo RPMI (Gibco), suplementado con 10% de suero fetal bovino, cuando se requiera, y todos los ensayos funcionales se realizaron en este medio. Para hacer crecer las cepas de E. coli y de S. typhimurium, se usó medio de Luria Bertani sólido y líquido (LB, Sambrook). Para hacer crecer EGD de L. monocytogenes, se usó caldo o agar de infusión de cerebro-corazón (BHI; Difco, Detroit, USA). Los medios se suplementaron, cuando se requiere, con 100 \mug/ml de ampicilina. La concanavalina-A (con-A), la lisozima de huevo de gallina (HEL), la tetraciclina, la \beta-galactosidasa de E. coli, el ferrocianuro potásico y el ferricianuro potásico se adquirieron de Sigma (Sigma, St. Louis, USA), y la listeriolisina se purificó como se describió (Darji et al., 1995b). La proteína ActA soluble (AA 31-505) se purificó a partir de sobrenadantes de L. monocytogenes recombinantes (Gerstel et al. a publicar).

Cepas bacterianas y plásmidos

Como hospedante, se usó la cepa XL1-Blue de E. coli (Stratagene, Heidelberg, Alemania) durante los experimentos de clonación, y para propagar plásmidos. Como portador, para los estudios in vivo, se usó la cepa SL7207 de S. typhimurium aroA auxotrófica (derivado hisG46, de S. typhimurium 2337-65, DEL407 [aroA:Tn10 {Tc-s}]), proporcionado amablemente por el Dr. B. A. D. Stocker, Stanford, CA, USA. Para los ensayos de protección in vivo y para la preparación de ADN genómico, se usó la cepa EGD de L. monocytogenes hemolítica (serotipo 1/2a; Chakraborty et al., 1992). El ADN se usó como molde para la amplificación mediante PCR de los genes actA y hly. Para la clonación se usó el vector de expresión eucariota pCMV\beta (Clontech, Palo Alto, USA), que contiene \beta-gal de E. coli, sustituyendo \beta-gal con los productos de amplificación que contienen una variante truncada de actA o de hly. Para la expresión de \beta-gal en Salmonellae, se usó el plásmido pAH97 (Holtel et al., 1992). Contiene el promotor de Pr y Ps forro de liberación gen Xyl S de Pseudomonas putida, y da como resultado la expresión constitutiva de \beta-gal (384 U) en la cepa de S. typhimurium aroA. Los cultivos bacterianos se hicieron crecer a 37ºC, y se airearon mediante agitación
a 200 r.p.m.

Técnicas de ADN recombinantes

La preparación del ADN, las manipulaciones genéticas y la PCR se llevaron a cabo según protocolos estándares (Sambrook et al., 1982), y la transformación de ADN plasmídico de células bacterianas se realizó como se describe por Hannahan o mediante electroporación (O'Callaghan y Charbit, 1990). La secuenciación del ADN se realizó usando un sistema de secuenciación de ciclo terminador Taq Dye Deoxy (Applied Biosystems), y se analizó en un secuenciador de ADN automatizado Applied Biosystems 373A.

Clonación de actA y hly en el vector de expresión eucariota pCMVb

Para la construcción del vector de expresión eucariota pCMVActA, se amplificó mediante PCR un fragmento de 1,8 kb, que codifica los AA 31 a 613 de un polipéptido ActA sin el ancla de membrana (Domann et al., 1992), usando los cebadores directo e inverso:

5'-ATAAGAATGCGGCCGCCATGGCGACAGATAGCGAAGATTCTAGTC-3' y

5'-ATAAGAATGCGGCCGCTTACGTCGTATGGTTCCCTGGTTCTTC-3', y como mueble un ADN genómico de la cepa EGD de L. monocytogenes. De forma similar, se construyó el plásmido recombinante pCMVhly. Se amplificó un fragmento de 1,6 kb, que codifica una variante no hemolítica que comprende los aminoácidos 26 a 482 de hly, y que suprime el péptido esencial para la actividad hemolítica (Mengaud et al., 1988), usando los cebadores directo e inverso: 5'-ATAAGAATGCGGCCGCCATGGATGCATCTGCATTCAATAAAGAAAATTC-3' y

5'-ATAAGAATGCGGCCGCTTATTTAGCGTAAACATTAATATTTCTCGCG-3'. Los cebadores de la PCR se diseñaron de tal forma que los fragmentos resultantes contienen NotI que flanquea sitios de restricción (subrayado), y se introdujeron codones de comienzo y de parada (ATG y TTA, en negrita). Los fragmentos de la PCR se digirieron con NotI, y se ligaron con pCMVb digerido con NotI, generando de ese modo pCMVActA y pCMVhly, respectivamente. La región codificante para \beta-gal se suprime de pCMVb mediante la digestión con NotI. La secuencia de ADN de los fragmentos de la PCR insertados se verificó mediante la secuenciación de ciclo terminador Taq Dye Deoxy.

Inmunización y exposición

Para la inmunización, se alimentó a grupos de 5-10 ratones hembra BALB/c con 30 ml de tampón de bicarbonato sódico al 10%, que contiene 10^{8} cepas de S. typhimurium aroA recombinantes, que contienen uno de los vectores de expresión eucariota pCMV\beta, pCMVhly o pCMVActA, o el plásmido de expresión de \beta-gal procariota pAH97 (Holtel et al., 1992). Los ratones recibieron una única inmunización, o cuatro inmunizaciones a intervalos de 14 días. Las muestras de suero de ambos grupos de ratones se obtuvieron en el día -1, 7, 21, 35 y 63, y se almacenaron a -20ºC hasta que se usaron en el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), o en una inmunotransferencia. Los ratones de cada grupo se sacrificaron en las semanas 3, 5, 7 y 11 después de la primera inmunización, y se estudiaron para determinar las respuestas de células T. Para estudios de protección, los ratones inmunizados se expusieron i.v. en el día 90 (un mes y medio después de la última revacunación de los ratones que recibieron múltiples inmunizaciones) con
una dosis letal de 5 x 10^{4} L . monocytogenes EGD. La supervivencia de los ratones fue seguida hasta el día 14 después de la exposición.

Ensayo de CTL

Para la determinación de la inducción de células T citotóxicas, se realizó el ensayo de JAM (Matzinger P., 1991). De forma breve, se incubaron 3 x 10^{5} células diana durante 4 h con 5 \muCi de ^{3}H-timidina (Amersham), se lavaron y se cocultivaron con las células del bazo aisladas de ratones inmunizados con cepas de S. typhimurium aroA, que contienen los vectores de expresión eucariota o procariota a diferentes relaciones de efector a diana. Las células del bazo se ensayaron directamente ex vivo o después de la reestimulación in vitro durante 5 días. Para estudiar la determinación de células T citotóxicas específicas de LLO, se sensibilizaron células diana P815 con 1 \mug/ml de péptido AA 91-99 de LLO (Pamer et al., 1991). La citotoxicidad específica de ActA se reveló sensibilizando las células P815 marcadas radioactivamente con una mezcla de 1 \mug/ml de LLO hemolíticamente activa, pura, y 1 \mug/ml de proteína ActA purificada, durante 30 minutos a RT. Se ha demostrado previamente que es posible sensibilizar células diana muy eficazmente in vitro con proteínas solubles usando la actividad de LLO formadora de poros. Las células diana se sensibilizaron con LLO sólo cuando no se sometieron a lisis cuando se estudiaron células T procedentes de ratones que fueron inmunizados con Salmonella que porta el plásmido de expresión de ActA. Esto indica que el ensayo es específico para ActA cuando los ratones se inmunizaron con Salmonellae que contienen los plásmidos de expresión de ActA. Para medir la citotoxicidad específica de \beta-gal, se usaron, como células diana, P13.1 - un derivado de P815 transfectado con el gen de \beta-gal (Rammensee et al., 1989). Se incubaron mezclas de células efectoras y células diana durante 4-5 h a 37º, las placas se cosecharon después sobre fieltros de filtro, que finalmente se contaron en un contador de centelleo. Todos los ensayos se realizaron por triplicado en un volumen final de 200 ml en placas de microtitulación de 96 pocillos con fondo redondo.

Ensayo de proliferación

La inducción de células auxiliares T se evaluó mediante proliferación directa de células aisladas de bazos o de nódulos linfáticos de ratones inmunizados con cepas de S. typhimurium aroA, que contienen el vector de expresión eucariota pCMV\beta, pCMVhly o pCMVActA, o el vector de expresión de \beta-gal procariota pAH97. La proliferación de células T se analizó directamente mediante incorporación de ^{3}H-timidina.

De forma breve, se cocultivaron 2 x 10^{5} células T con 1 x 10^{5} células de bazo genéticamente idénticas irradiadas, junto con 0,5 \mug/ml de LLO purificada, 1 \mug/ml de Act-A, o 1 \mug/ml de \beta-gal. Después de 48 h de incubación a 37ºC, se añadió a cada cultivo 1 mCi de ^{3}H-timidina, y después de una incubación adicional de 18 h las células se cosecharon sobre fieltros de filtro, y la incorporación se contó en un contador de centelleo. Todos los experimentos se realizaron por triplicado en un volumen final de 200 ml en placas de microtitulación de 96 pocillos con fondo plano.

Elisa

Para evaluar los niveles de inmunoglobulinas frente a LLO, Act-A y \beta-gal en muestras de suero, se revistieron placas de ELISA de 96 pocillos (Maxisorp, Nunc) con 0,5 \mug/ml de proteína purificada, durante toda la noche a 4ºC. Las placas se lavaron tres veces con PBS/0,05% de Tween 20, y después se bloquearon con 3% de BSA-PBS durante 2 h a 37ºC. Después de dos lavados con PBS/0,05% de Tween 20, se añadieron muestras de suero de una dilución 1:100 a pocillos individuales, y se incubaron durante 2-3 h a 37ºC. Las placas se lavaron como antes, y a cada pocillo se añadió Ig anti-ratón de cabra biotinilada (Dianova, Hamburgo, Alemania) en 1% de BSA-PBS, y se incubaron durante 1 h a 37ºC. Después de tres lavados con PBS/0,05% de Tween 20, se añadió a cada pocillo estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante (Dianova, Hamburgo, Alemania), en 1% de BSA-PBS, y se incubó durante 1 h a 37ºC. Las placas se lavaron como antes, se desarrollaron con o-fenilendiamina como sustrato, y se midieron en un vector de ELISA a 490 nm. Para la determinación de las subclases de IgG específicas de antígeno, se usaron IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3 anti-ratón de cabra conjugadas con peroxidasa (Caltag laboratories, CA, USA).

Detección de la actividad de \beta-gal

La expresión de \beta-gal en células hospedantes se monitorizó incubando las células fijas con el sustrato indicador X-gal. De forma resumida, se dejó que se adhiriesen macrófagos peritoneales aislados durante un par de horas a 37ºC en placas de 24 pocillos, en medio libre de antibiótico. Después de eliminar las células no adherentes, y de lavar con medio libre de antibiótico, se añadieron a las células, a una MOI de 10, S. typhimurium aroA, que contiene el vector de expresión eucariota pCMV\beta, y se incubaron a 37ºC durante 15-30 minutos. Las células se lavaron nuevamente, y las bacterias extracelulares se exterminaron mediante adición de medio que contiene 50 \mug/ml de gentamicina. Después de 4 h de incubación a 37ºC, se añadieron 10 \mug/ml de tetraciclina a algunos de los cultivos, para bloquear la multiplicación bacteriana intracelular, y se continuó la incubación durante otras 24 h. Se encontró más tarde que esta segunda etapa con antibióticos era innecesaria debido a que las cepas que contienen la mutación aroA sobreviven sólo durante breves períodos de tiempo en estas células (datos no mostrados). Después de 2-3 lavados con PBS, las células se fijaron con acetona/metanol (1:1 v/v), y se añadió el sustrato X-gal recientemente preparado (5 mM de ferrocianuro potásico, 5 mM de ferricianuro potásico, 2 mM de MgCl_{2} y 100 mg/ml de X-gal en PBS). Después de la incubación toda la noche a 37ºC, las células que expresan \beta-gal se detectaron vía microscopio de luz. La cuantificación de la actividad enzimática de \beta-gal en bacterias recombinantes se determinó según los procedimientos estándares (Sambrook et al., 1982). El fondo (4 U) se restó de los valores experi-
mentales.

Aislamiento de ARN y RT-PCR

A fin de determinar la expresión de \beta-gal transferido a las células hospedantes eucariotas vía Salmonella, el ARNm se sondó para determinar la presencia de productos de corte y empalme derivados del dador de corte y empalme y de los aceptores del plásmido de expresión. Para este fin, se infectaron in vitro PEC, a una MOI de 10, con S. typhimurium aroA que contiene el vector de expresión eucariota pCMV\beta, y el ARN se extrajo como se describió (Chomczynski y Sacchi, 1987). Se realizó la RT-PCR del ARN aislado. De forma resumida, se suspendieron 10 \mug de ARN celular total aislado en 20 \mul de DEPC-H_{2}O, y se incubó durante 5 min a 70ºC con 10 \mul de tampón que contiene 6 \mul de tampón de transcriptasa inversa (250 mM de Tris-HCl, 375 mM de KCl, 15 mM de MgCl_{2}); 0,4 mM de dNTPs; 0,05 U de hexámeros aleatorios (Pharmacia, Uppsala, Suecia), y 1 mM de DTT. Las muestras se hicieron girar durante 2 min a 15.000 rpm, y se añadieron 40 U de inhibidor de ribonucleasa de ARNsin (Promega), junto con 200 U de transcriptasa inversa Superscript (Gibco, BRL). El ARN se transcribió de forma inversa durante 45 min a 37ºC, y la reacción se detuvo calentando las muestras a 95ºC durante 1 min, seguido de una breve incubación en hielo. Posteriormente, se amplificaron 50 ng de producto de ADNc mediante PCR en un volumen final de 50 \mul que contiene 0,2 mM de dNTP, 20 mM de DTT, 3 mM de cada uno de los cebadores 5' y 3', 5 \mul de 10 x de tampón de PCR (100 mM de Tris-HCl, pH 9,0, 500 mM de KCl, 1% de gelatina, 1,5 mM de MgCl_{2}, 1% de Tritón X-100), y 5 U de ADN polimerasa AmpliTaq (Perkin Elmer). La reacción de PCR se realizó con una etapa de desnaturalización inicial de 10 minutos a 85ºC, seguida de 35 ciclos de 20 segundos de desnaturalización a 95ºC, 30 segundos de hibridación a 60ºC, y 30 segundos de extensión a 71ºC. Los productos de la amplificación se visualizaron en una lámpara de UV después de la electroforesis de una parte alícuota de 15 \mul de la mezcla de reacción en un gel de agarosa al 2% (p/v) que contiene 0,5 \mug/ml de bromuro de etidio. El par de cebadores se diseñó de forma que la presencia de los productos de corte y empalme se debería de indicar mediante un fragmento de 190 pb y/o un fragmento de 125 pb. La identidad del producto presumible de corte y empalme se confirmó mediante secuenciación de los fragmentos después del aislamiento en un gel de agarosa preparativo. El par de cebadores usado para la amplificación y la secuenciación es: SV40 directo: 5'-GGATCCGGTACTCGAGGAAC-3'; SV40 inverso: 5'-GCTTTAGCAGGCTCTTTCG-3'.

Inmunoprecipitaciones

El marcado biosintético de proteínas en presencia de tetraciclina, seguido de la inmunoprecipitación, debería revelar solamente la expresión de la proteína mediante células hospedantes eucariotas. Por lo tanto, se infectaron 5 x 10^{5} PEC adherentes durante 30 min a 37ºC con aprox. 5 x 10^{6} S. typhimurium aroA que contiene el vector de expresión eucariota pCMV\beta, en medio libre de antibiótico. Después de un lavado a conciencia, y de otras 4 h de incubación a 37ºC, el medio se suplementó con antibióticos, o no, y se dejó a 37ºC durante diversos períodos de tiempo antes del marcado biosintético. Después de dos lavados en PBS, y de 30 min de inanición en medio libre de metionina, las células se pulsaron con 100 \muCi de [^{35}S]metionina, durante 2 h. Las células se lavaron entonces cuidadosamente, y se lisaron en 0,5 ml de tampón de lisis enfriado con hielo (0,5% de NP-40, 50 mM de Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM de MgCl_{2}, 1 mM de PMSF). Después de 45 min en hielo, las células se sometieron a centrifugación, para eliminar los núcleos y el desecho celular, y se incubaron a 4ºC con 4 \mug de anticuerpos anti-\beta-gal (Promega), durante 30 min. Los complejos inmunitarios se precipitaron con proteína A-sefarosa en 0,5% de NP-40, 50 mM de Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM de MgCl_{2}, y 0,5 mM de NaCl, se lavaron varias veces con el mismo tampón, y se analizaron en SDS-PAGE al 8%, seguido de una fluorografía. En algunas de estas muestras se añadió un exceso de 100 veces de proteína de \beta-gal, antes de la adición de los anticuerpos anti-\beta-gal, para determinar la especificidad de la precipitación.

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Claims

1. Cepa de Salmonella atenuada que porta un vector de expresión eucariota para la expresión de un gen heterólogo, o un fragmento génico, o un gen autólogo, o un fragmento génico, bajo el control de un promotor eucariota que comprende el vector en un marco de lectura abierta, en la que la atenuación se ajusta a una vacunación de vertebrados, incluyendo seres humanos.

2. Cepa de Salmonella según la reivindicación 1, en la que la cepa es S. typhimurium aroA SL7207 o S. typhimurium LT2, y preferiblemente aroA544 (ATCC 33275).

3. Cepa de Salmonella según la reivindicación 1, en la que la cepa es una cepa de S. typhi, especialmente S. typhi Ty21a.

4. Cepa de Salmonella según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el vector de expresión eucariota es o puede derivar del plásmido conocido pCMV\beta, que comprende

-: el gen estructural de \beta-galactosidasa (\beta-gal)

-: bajo el control del promotor temprano inmediato de CMV humano que comprende el plásmido pCMV\beta per se, e incluye

-: un dador de corte y empalme,

-: dos sitios aceptores de corte y empalme, entre el promotor y el gen de \beta-galactosidasa, y facultativamente

-: un sitio de poliadenilación de SV40.

5. Cepa de Salmonella según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada por un gen heterólogo o un gen autólogo que codifica una proteína, y especialmente una proteína inmunogénica o antígeno protector.

6. Cepa de Salmonella según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el gen heterólogo se selecciona del grupo que consiste en

-: el gen de \beta-galactosidasa de Escherichia coli (gen lacZ),

7. Vacuna para el suministro génico oral y/o nasal y/o mucosal a vertebrados, incluyendo los seres humanos, en la que la vacuna comprende una cepa de Salmonella según cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

8. Uso de una cepa de Salmonella según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, o de una vacuna según la reivindicación 7, para la identificación sistemática de la expresión, en un animal no humano, de librerías de ADN genómico heterólogo, o librerías de ADNc genómico.

9. Uso de una cepa de Salmonella según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para la preparación de una vacuna para la vacunación de vertebrados, incluyendo seres humanos.

10. Procedimiento para la recuperación, en un animal no humano, de una cepa de Salmonella atenuada que porta un vector de expresión eucariota para la expresión de un gen heterólogo, o de un fragmento génico, o de un gen autólogo, o de un fragmento génico, bajo el control de un promotor eucariota que comprende el vector dentro de un marco de lectura abierta, en el que la atenuación se ajusta a una vacunación de vertebrados, incluyendo seres humanos, que comprende las etapas de

(a): usar la información genética procedente de una librería de ADN heterólogo o autólogo, o de ADNc, como un fragmento génico o como gen a expresar mediante el vector de expresión eucariota portado por la cepa de Salmonella atenuada,

(b): llevar a cabo una identificación sistemática de la expresión para la determinación de un producto de expresión de un gen o de un fragmento génico según (a) que proporciona una respuesta inmunitaria; y

(c): recuperar una cepa de Salmonella según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que proporcione la respuesta inmunitaria en vertebrados, incluyendo los seres humanos.