JP6422022B2

JP6422022B2 - Ｖｅｇｆ及び／又はアンギオポエチン−２の特異的エピトープを含むｄｎａワクチン

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Publication number: JP6422022B2
Application number: JP2014533052A
Authority: JP
Inventors: 啓徳中神; 真梨子久徳; 森下　竜一; 竜一森下; 英樹冨岡
Original assignee: ANGES, INC.; Osaka University NUC
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Priority date: 2012-08-31
Filing date: 2013-08-28
Publication date: 2018-11-14
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Description

本発明は、癌の治療や予防に有効なＤＮＡワクチンに関する。

腫瘍が大きく成長するためには、腫瘍の増殖に応じて、栄養や酸素を腫瘍まで運搬する血管を増やしていく必要がある。腫瘍細胞は自ら血管増殖因子を分泌して、近くの血管の血管内皮細胞の増殖を刺激することにより、腫瘍血管の新生を誘導すると考えられている。そのため、血管増殖因子の働きを阻害し、腫瘍血管新生を抑制することにより、腫瘍を治療又は予防する試みがなされており、その１つの方法として腫瘍血管新生関連因子を標的とするワクチン療法が注目されている。該ワクチン療法においては、腫瘍血管新生関連因子、該因子に含まれるエピトープ、或いはこれらをコードする発現ベクターを、癌患者や癌を発症するリスクがある対象に対して投与し、腫瘍血管新生関連因子に対する抗体を該患者の体内に誘導することにより、該因子の機能を中和し、腫瘍血管新生を抑制することにより、癌を治療又は予防する。腫瘍血管新生関連因子としては、ＶＥＧＦ、アンギオポエチン、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ等の様々な因子が知られている。

例えば、特許文献１には、ＶＥＧＦ受容体―１、ＶＥＧＦ受容体−２又はＦｌｋ−１をコードするＤＮＡワクチンを投与することにより、腫瘍の微小環境において血管内皮細胞増殖を阻害し、血管新生を阻止し、腫瘍の成長及び転移を阻害する方法が開示されている。

特許文献２には、異種性のＶＥＧＦワクチンを用いて、血管新生に関連する疾患、特に癌の発生や転移を抑制することが記載されている。

しかしながら、ＶＥＧＦ等の因子は、そもそも患者自身の成分であるため、通常はこれらの因子に対する免疫寛容が成立している。そのため、これらの因子やその部分ペプチドをそのまま患者に投与しても、これらの因子に対する抗体を患者の体内に効率的に誘導することは困難である。そこで、これらの自己抗原を患者の免疫系に認識させ、これに対する抗体産生を誘導するための技術的な工夫が必要である。

Ｂ型肝炎ウイルスコア（ＨＢｃ）抗原タンパク質は、自己集合して球状のコア粒子を構成する。このコア粒子は非常に免疫原性が高い。このＨＢｃ抗原タンパク質の特定の部位に、所望のエピトープを挿入するか、ＨＢｃ抗原タンパク質の末端に所望のエピトープを連結することにより得られる融合ポリペプチドを用いると、自己集合により形成される粒子の表面に当該エピトープが提示される。そのため、この融合ポリペプチドを用いると、挿入したエピトープが免疫系に認識され易くなり、当該エピトープを認識する抗体産生を効率的に誘導することができる。そこで、ＨＢｃ抗原タンパク質をワクチンのプラットフォームとして利用して、免疫系に認識されにくい抗原に対する抗体産生を誘導する試みがなされている（非特許文献１、非特許文献２）。

特許文献３には、エピトープを有する外来アミノ酸配列を含むキメラＨＢｃ抗原タンパク質から構成される粒子であって、外来アミノ酸配列がＨＢｃ抗原のアミノ酸残基８０−８１の間に挿入された粒子が開示されている。

しかしながら、腫瘍血管新生関連因子に対するワクチンの有効性は十分に満足できるものではない。

特表２００５−５１９０９２号公報中国特許出願公開第１４０６６２９号明細書特許第３２２８７３７号公報

D. C. Whitacre et al., Expert Rev. Vaccines, vol.8, no.11, pp.1565-1573, 2009 B. E. Clarke et al., Nature, vol.330, pp.381-384, 1987

特許文献１に記載されたように、ＶＥＧＦ受容体をワクチンの抗原とすると、ワクチンの攻撃目標がＶＥＧＦ受容体を発現している血管内皮細胞又は一部の癌細胞となるため、細胞障害性免疫を高めて腫瘍における血管新生を抑制し、抗腫瘍効果が発揮されることになる。しかしながら、ＶＥＧＦ受容体は、腫瘍組織の新生血管の内皮細胞のみならず、正常な血管内皮細胞にも発現しているため、ＶＥＧＦ受容体をワクチンの抗原とすると、正常な血管機能に悪影響を及ぼすリスクがある。

そこで、本発明は、正常な血管機能への悪影響のリスクが低減された、腫瘍血管新生関連因子を標的とする、癌の治療又は予防のための優れたワクチンを提供することを目的とする。

本発明者らは、鋭意検討の結果、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドのアミノ酸残基８０と８１の間に、ＶＥＧＦやアンギオポエチン−２のような液性因子の特異的エピトープを挿入することにより得られるキメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドの発現ベクターを投与すると、当該液性因子に対する液性免疫が優勢に誘導され、細胞性免疫による正常な血管機能への悪影響を避けつつ、腫瘍血管新生を効果的に抑制し、癌を治療又は予防し得ることを見出した。これらの知見に基づき、更に検討を加え、本発明を完成させた。

即ち、本発明は以下に関する。
［１］ＶＥＧＦの特異的エピトープ及び／又はアンギオポエチン−２の特異的エピトープを含むアミノ酸配列が挿入されたキメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドをコードする発現ベクターを含む、癌の治療又は予防剤であって、該特異的エピトープを含むアミノ酸配列が、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドのアミノ酸残基８０と８１の間に挿入されている、治療又は予防剤。
［２］癌が固形癌である、［１］記載の治療又は予防剤。
［３］固形癌が、非小細胞肺癌、大腸癌、乳癌、膵臓癌、胃癌、子宮癌及び前立腺癌からなる群から選択されるいずれか一種である、［１］又は［２］記載の治療又は予防剤。
［４］挿入アミノ酸配列が配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列を含む、［１］〜［３］のいずれかに記載の治療又は予防剤。
［５］挿入アミノ酸配列が、
配列番号３１、３２又は３３で表されるアミノ酸配列、
配列番号１又は３１で表されるアミノ酸配列を含む、配列番号３２で表されるアミノ酸配列の部分配列、或いは
配列番号２又は３１で表されるアミノ酸配列を含む、配列番号３３で表されるアミノ酸配列の部分配列
を含む、［１］〜［３］のいずれかに記載の治療又は予防剤。
［６］挿入アミノ酸配列が配列番号３又は４で表されるアミノ酸配列を含む、［１］〜［３］のいずれかに記載の治療又は予防剤。
［７］挿入アミノ酸配列が更に１以上の特異的エピトープを含む、［１］〜［６］のいずれかに記載の治療又は予防剤。
［８］複数回投与されることを特徴とする、［１］〜［７］のいずれかに記載の治療又は予防剤。
［９］投与回数が２、３又は４回である、［８］記載の治療又は予防剤。
［１０］投与回数が３回である、［９］記載の治療又は予防剤。
［１１］半年間隔で３回投与することを特徴とする、［１］〜［１０］のいずれかに記載の治療又は予防剤。
［１２］癌の治療又は予防において使用するための、ＶＥＧＦの特異的エピトープ及び／又はアンギオポエチン−２の特異的エピトープを含むアミノ酸配列が挿入されたキメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドをコードする発現ベクターであって、該特異的エピトープを含むアミノ酸配列が、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドのアミノ酸残基８０と８１の間に挿入されている、発現ベクター。
［１３］非小細胞肺癌、大腸癌、乳癌、膵臓癌、胃癌、子宮癌又は前立腺癌の治療又は予防において使用するための、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列が挿入された、キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドをコードする発現ベクターであって、該アミノ酸配列が、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドのアミノ酸残基８０と８１の間に挿入されている、発現ベクター。
［１４］非小細胞肺癌、大腸癌、乳癌、膵臓癌、胃癌、子宮癌又は前立腺癌の治療又は改善において使用するための、配列番号３又は４で表されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列が挿入された、キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドをコードする発現ベクターであって、該アミノ酸配列が、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドのアミノ酸残基８０と８１の間に挿入されている、発現ベクター。
［１５］挿入アミノ酸配列が更に１以上の特異的エピトープを含む、［１２］〜［１４］のいずれかに記載の発現ベクター。
［１６］哺乳動物に対して、ＶＥＧＦの特異的エピトープ及び／又はアンギオポエチン−２の特異的エピトープを含むアミノ酸配列が挿入されたキメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドをコードする発現ベクターの有効量を投与することを含む、当該哺乳動物における癌の治療又は予防方法であって、該特異的エピトープを含むアミノ酸配列が、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドのアミノ酸残基８０と８１の間に挿入されている、方法。

本発明により、正常な血管機能への悪影響のリスクが低減された、腫瘍血管新生関連因子を標的とする、癌の治療又は予防のための優れたワクチンが提供される。
本発明のワクチンにより、細胞性免疫よりも、ＶＥＧＦやアンギオポエチン−２のような液性因子に対する液性免疫の方が優勢に誘導されるので、細胞性免疫による正常な血管機能への悪影響のリスクが低減される。
また、ＶＥＧＦやアンギオポエチン−２は分泌タンパク質であるため、ワクチン接種により誘導された抗体は主として血中でこれらの分泌タンパク質と結合することになるので、組織炎症を来たしにくい。

腫瘍組織の成長に対する、各ワクチン接種の効果。縦軸に腫瘍組織の体積を、横軸に腫瘍注入後の日数を示す。腫瘍を注入したマウスの生存率に対するワクチン接種の効果。縦軸に生存率を、横軸に腫瘍注入後の日数を示す。 VEGF−ベバシズマブインターフェイスにおけるフレームワーク残基。赤：ベバシズマブとの結合表面中の残基。黄：特に重要な赤の残基。青：VEGFR-1との結合表面中の残基。緑：VEGFR-2との結合表面中の残基。各残基は一文字表記で表した。 DNAワクチン接種の時間経過。ワクチン接種は、まず6週齢マウスにおいて実施し（0W）、最初のワクチン接種から、2、4及び8週後に引き続いてワクチン接種を施した。 16週における抗VEGF抗体の力価。HBc-mVEGF (7 a.a.)、HBc-mVEGF (13 a.a.)、HBc-mVEGF (17 a.a.)又はHBcでそれぞれ免疫化したマウスからのマウス血清（100倍希釈）におけるVEGFに対する全IgG力価を定量した。データは、平均値±S.E.M.で示す。ワクチンのプラスミドDNA構築。(a) pcDNA3.1-HBc（コントロールベクター）及びpcDNA3.1-HBc-mVEGF (13 a.a.)（ワクチン接種ベクター）のプラスミドマップ。HBcはHBcの全長配列を示し、HBc-NはHBcのN末端(1-80 a.a.)を示し、HBc-CはHBcのC末端(81-183 a.a.)を示す。mVEGF 13 a.a.は、マウスVEGFタンパク質の抗原を示す。(b) VEGFワクチンプラスミド設計に関する詳細情報を示す。HBc粒子上に提示されたときにVEGFエピトープのコンフォメーションにおける可塑性が許容されるように、VEGFに対する抗原となる13アミノ酸(IMRIKPHQSQHIGE)（配列番号１）及びリンカー（N末端 I-T ジペプチドリンカー及びC末端 G-A-T トリペプチドリンカー）をHBcにインフレームで融合させた。VEGF 13 a.a.及びリンカーは一文字表記で表した。 8週における抗VEGF抗体の力価。HBc-mVEGF (13 a.a.)群からのマウス血清（100倍希釈）のみでVEGFについての全IgG力価が上昇した（左パネル）。HBc-VEGF (13 a.a.) 群からのマウス血清（１００倍希釈）中のIgGサブタイプ分布(IgG1、IgG2a及びIgG2b)をサブタイプ特異的IgG抗体を用いて評価した（右パネル）。データは、平均値±S.E.M.で示す。*p < 0.05 コントロール（HBc及び生理食塩水）に対する。免疫化血清のVEGFに対する特異的結合。ウェスタンブロットにおいて一次抗体として使用した免疫化血清は、BSAにコンジュゲートしたmVEGF (13 a.a.)のみならず組み換え型マウスVEGF (rmVEGF)にも結合した。ローディングサンプルは以下の通りである。レーン1：組み換え型マウスVEGF-A。レーン2：BSAにコンジュゲートしたmVEGF (13 a.a.)。レーン3：陰性タンパク質として、BSAにコンジュゲートしたヒトアンギオポイエチン−2ペプチド。市販されているVEGFに対する抗体であるVG-1を陽性抗体として用いた。免疫化血清又はコントロール血清の存在下、5 ng/mLのmVEGFにより10分間刺激したHUVECからの細胞溶解液の、p-ERK及び全ERKについてのウェスタンブロット。 HUVECのVEGF誘導管形成に対する免疫化血清の効果。マトリジェルでコートしたプレートに1x10⁵個／wellの密度でHUVECを播き、コントロール血清又は免疫化血清の存在下でインキュベートした。７時間後、毛細管ネットワークを撮影し定量した。代表的な血管内皮管を示す。拡大率：50X。データは、トリプリケイトの平均値±S.E.M.で示す。

本発明は、ＶＥＧＦの特異的エピトープ及び／又はアンギオポエチン−２の特異的エピトープを含むアミノ酸配列が挿入されたキメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドをコードする発現ベクターを含む、癌の治療又は予防剤であって、該特異的エピトープを含むアミノ酸配列が、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドのアミノ酸残基８０と８１の間に挿入されている、治療又は予防剤を提供するものである。

ＶＥＧＦの特異的エピトープ及び／又はアンギオポエチン−２の特異的エピトープを含むアミノ酸配列が挿入されたキメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドをコードする発現ベクターを投与すると、発現されたキメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチド中のＶＥＧＦの特異的エピトープ及び／又はアンギオポエチン−２の特異的エピトープに対する免疫反応（好ましくは抗体産生等の液性免疫反応）が誘導され、ＶＥＧＦ及び／又はアンギオポエチン−２の活性が抗体によって中和されることにより、癌組織周辺における血管新生が抑制され、癌組織の成長が阻害される。従って、本発明の治療又は予防剤が標的とする癌は、好ましくは固形癌である。固形癌としては、非小細胞肺癌、大腸癌、乳癌、膵臓癌、胃癌、子宮癌、前立腺癌等を挙げることができるが、これらに限定されない。

本発明の治療又は予防剤の対象となる癌は限定されないが、好ましくは、ＶＥＧＦ及び／又はアンギオポエチン−２を発現する癌である。癌における、ＶＥＧＦ及び／又はアンギオポエチン−２の発現の有無は、ＶＥＧＦに対する特異的抗体及び／アンギオポエチン−２に対する特異的抗体を用いた免疫学的手法（免疫組織学的染色、ウェスタンブロッティング等）により確認することができる。

本発明においては、本発明の治療又は予防剤の適用対象である哺乳動物由来のＶＥＧＦ及びアンギオポエチン−２の使用が意図されるが限定されない。本発明の治療又は予防剤の適用対象は、哺乳動物である。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来る。哺乳動物は、好ましくはげっ歯類（マウス等）又は霊長類（ヒト等）である。従って、例えば、本発明の治療又は治療剤をヒトへ適用する場合、ヒト由来のＶＥＧＦ及びアンギオポエチン−２の使用が意図されるが限定されない。また、本発明の治療又は予防剤をマウスへ適用する場合、マウス由来のＶＥＧＦ及びアンギオポエチン−２の使用が意図されるが限定されない。

本明細書において、特定の因子Ｘ（ポリペプチド又はポリヌクレオチド）について、「生物Ｙ由来の因子Ｘ」又は「生物Ｙ因子Ｘ」とは、該因子Ｘのアミノ酸配列又は核酸配列が、生物Ｙにおいて天然に発現している該因子Ｘのアミノ酸配列又は核酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列又は核酸配列を有することを意味する。「実質的に同一」とは、着目したアミノ酸配列又は核酸配列が、生物Ｘにおいて天然に発現している因子Ｘのアミノ酸配列又は核酸配列と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上）の同一性を有しており、且つ当該因子Ｘの機能が維持されていることを意味する。

ＶＥＧＦ及びアンギオポエチン−２は、公知の血管新生因子であり、そのアミノ酸配列やｃＤＮＡ配列も公知である。ＶＥＧＦには、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＰＬＧＦ−１、ＰＬＧＦ−２の７つのサブタイプが存在しており、いずれのサブタイプのＶＥＧＦの特異的エピトープも、癌を治療又は予防する限り、本発明において用いることができるが、好ましくはＶＥＧＦ-Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅの特異的エピトープが用いられる。それらの代表的なアミノ酸配列としては、以下等を挙げることができる。

アンギオポエチン−２の代表的なアミノ酸配列としては、以下等を挙げることができる。

本明細書において、「エピトープ」とは、個々の抗体又はＴ細胞受容体による認識の基本要素又は最小単位であって、前記抗体又はＴ細胞受容体が結合する特定のドメイン、領域又は分子構造をいう。

本発明に使用されるＶＥＧＦのエピトープ及びアンギオポエチン−２のエピトープは、当該ＶＥＧＦ及びアンギオポエチン−２に特異的である。「特異的」とは、当該ＶＥＧＦ及びアンギオポエチン−２が由来する哺乳動物において天然に発現している当該ＶＥＧＦ及びアンギオポエチン−２以外の遺伝子産物（但し、イムノグロブリンおよびＴ細胞受容体の可変領域を除く）が当該エピトープを含まないことを意味する。

本発明において使用されるＶＥＧＦの特異的エピトープ及びアンギオポエチン−２の特異的エピトープは、当該エピトープを認識する抗体が該エピトープに結合した場合に、ＶＥＧＦ及びアンギオポエチン−２の活性が阻害される位置にあるものが好適に選択される。そのようなエピトープは、例えば、受容体結合部位、２価イオン結合部位、特異的酵素により認識される部位等の機能的部位にあり得る。シグナル配列等、ＶＥＧＦやアンギオポエチン−２の成熟過程で除去される部位に含まれるエピトープは、好ましくは、本発明において使用するエピトープから除外される。当業者であれば、ＶＥＧＦ及びアンギオポエチン−２の立体構造等に基づき、適宜エピトープを選択することができる。

当該エピトープのアミノ酸配列の長さは、通常５〜３０アミノ酸、好ましくは６〜２５アミノ酸、より好ましくは１０〜１８アミノ酸、更により好ましくは１１〜１６アミノ酸である。該アミノ酸配列が短すぎるとエピトープとしての抗原性が失われる可能性ある。また該アミノ酸配列が長すぎると、キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドが自己集合によりコア粒子を形成し難くなり、結果として当該エピトープを特異的に認識する抗体が産生されず、癌に対する良好な治療又は改善効果が得られなくなる可能性がある。

ＶＥＧＦ及びアンギオポエチン−２の好適なエピトープの具体例として、以下のものを挙げることができる。

（ＶＥＧＦ）
（ｉ）ＩＭＲＩＫＰＨＱＳＱＨＩＧ（配列番号１）
（ｉｉ）ＩＭＲＩＫＰＨＱＧＱＨＩＧ（配列番号２）

（アンギオポエチン−２）
（ｉｉｉ）ＰＱＲＱＮＴＮＫＦＮＧＩＫＷＹＹ（配列番号３）
（ｉｖ）ＹＹＰＱＲＱＮＴＮＫＥ（配列番号４）

更なる局面においてＶＥＧＦの好適なエピトープの具体例として、以下を挙げることができる。
（ｖ）ＭＲＩＫＰＨＱ（配列番号３１）
（ｖｉ）ＭＱＩＭＲＩＫＰＨＱＳＱＨＩＧＥＭ（配列番号３２）
（ｖｉｉ）ＭＱＩＭＲＩＫＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭ（配列番号３３）
（ｖｉｉｉ）配列番号１又は３１で表されるアミノ酸配列を含む、配列番号３２で表されるアミノ酸配列の部分配列からなるエピトープ
（ｉｘ）配列番号２又は３１で表されるアミノ酸配列を含む、配列番号３３で表されるアミノ酸配列の部分配列からなるエピトープ

配列番号１、３１及び３２は、マウスＶＥＧＦ-Ａの部分アミノ酸配列である。配列番号２、３１及び３４はヒトＶＥＧＦ-Ａの部分アミノ酸配列である。配列番号３及び４は、ヒトアンギオポエチン−２の部分アミノ酸配列である。

上記（ｖｉｉｉ）及び（ｉｘ）において、部分配列の長さは８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６アミノ酸である。

本発明において使用されるＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドは、
（１）配列番号６で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は
（２）配列番号６で表されるアミノ酸配列と９０％以上（好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、更に好ましくは９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ自己集合によりコア粒子を形成する活性を有するポリペプチドである。

自己集合とは、溶液中に溶けている分子が会合することによって集合体を形成する現象をいう。コア粒子とは、固有の反復性の構成を有する剛性構造をいう。本明細書中のコア粒子は合成工程の産物又は生物的工程の産物であってよい。

（２）の態様のポリペプチドとして、ＷＯ２００３／０３１４６６に開示された配列番号７で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。配列番号７で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの位置４８、６１、１０７及び１８５に対応する位置の１つ又は複数のシステイン残基を欠失させた、又は他のアミノ酸残基（例えば、セリン残基）で置換したポリペプチドも、（２）の態様のポリペプチドとして好ましい。当業者が認識しているように、配列番号７に示されているものと異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドにおける同様な位置にあるシステイン残基も欠失させ、又は他のアミノ酸残基で置換することができ、これらの欠失、置換により得られるポリペプチドも（２）の態様のポリペプチドに包含される。

また、（２）の態様のポリペプチドには、配列番号７における位置９７に対応する位置のイソロイシン残基がロイシン残基又はフェニルアラニン残基で置換されている変異体ポリペプチドが包含される（Ｙｕａｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第７３巻、１０１２２〜１０１２８頁（１９９９））。また、多くのＨＢｃＡｇ変異体ならびに数種のＢ型肝炎コア抗原前駆変異体のアミノ酸配列がＧｅｎＢａｎｋ報告ＡＡＦ１２１２４０、ＡＦ１２１２３９、Ｘ８５２９７、Ｘ０２４９６、Ｘ８５３０５、Ｘ８５３０３、ＡＦ１５１７３５、Ｘ８５２５９、Ｘ８５２８６、Ｘ８５２６０、Ｘ８５３１７、Ｘ８５２９８、ＡＦ０４３５９３、Ｍ２０７０６、Ｘ８５２９５、Ｘ８０９２５、Ｘ８５２８４、Ｘ８５２７５、Ｘ７２７０２、Ｘ８５２９１、Ｘ６５２５８、Ｘ８５３０２、Ｍ３２１３８、Ｘ８５２９３、Ｘ８５３１５、Ｕ９５５５１、Ｘ８５２５６、Ｘ８５３１６、Ｘ８５２９６、ＡＢ０３３５５９、Ｘ５９７９５、Ｘ８５２９、Ｘ８５３０７、Ｘ６５２５７、Ｘ８５３１１、Ｘ８５３０１、Ｘ８５３１４、Ｘ８５２８７、Ｘ８５２７２、Ｘ８５３１９、ＡＢ０１０２８９、Ｘ８５２８５、ＡＢ０１０２８９、ＡＦ１２１２４２、Ｍ９０５２０、Ｐ０３１５３、ＡＦ１１０９９９及びＭ９５５８９に開示されており（この開示のそれぞれが参照により本明細書に組込まれる）、これらの変異体のアミノ酸配列を含むポリペプチドも（２）の態様のポリペプチドに包含される。上記変異体は、配列番号７における位置１２、１３、２１、２２、２４、２９、３２、３３、３５、３８、４０、４２、４４、４５、４９、５１、５７、５８、５９、６４、６６、６７、６９、７４、７７、８０、８１、８７、９２、９３、９７、９８、１００、１０３、１０５、１０６、１０９、１１３、１１６、１２１、１２６、１３０、１３３、１３５、１４１、１４７、１４９、１５７、１７６、１７８、１８２及び１８３に存在するアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を含む多くの位置におけるアミノ酸配列が異なっている。

更に、全部が参照により本明細書に組込まれる国際公開第０１／９８３３３号、国際公開第０１／７７１５８号及び国際公開第０２／１４４７８号に記載されたＨＢｃＡｇ変異体のアミノ酸配列を含むポリペプチドも、（２）の態様のポリペプチドに包含される。

本明細書において、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドのアミノ酸配列のアミノ酸残基の位置は、特にことわりのない限り、配列番号６で表されるアミノ酸配列を基準として特定される。配列番号６で表されるアミノ酸配列を含まないポリペプチドの場合には、当該ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号６で表されるアミノ酸配列と並び合わせ、対応するアミノ酸残基の位置が採用される。

本発明において使用されるＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドは、好ましくは、配列番号６で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。

本発明に用いられるキメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドにおいては、ＶＥＧＦの特異的エピトープ及び／又はアンギオポエチン−２の特異的エピトープを含むアミノ酸配列が、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドのアミノ酸残基８０と８１の間に挿入されている。即ち、本発明に用いられるキメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドは、以下の（ａ）〜（ｃ）の構成要素：
（ａ）Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドのＮ末端部分ポリペプチド残基（Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドのＮ末端からアミノ酸残基８０までの連続する部位アミノ酸配列からなる）、
（ｂ）ＶＥＧＦの特異的エピトープ及び／又はアンギオポエチン−２の特異的エピトープからなるアミノ酸配列、及び
（ｃ）Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドのＣ末端部分ポリペプチド残基（Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドのアミノ酸残基８１からＣ末端までの連続する部位アミノ酸配列からなる）
をＮ末端側から（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の順序で含む。

本発明に用いられるキメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドは、上記構成により、自己集合によりコア粒子を形成し、その粒子の外側にＶＥＧＦの特異的エピトープ及び／又はアンギオポエチン−２の特異的エピトープが提示される。

構成要素（ａ）と構成要素（ｃ）との間の挿入アミノ酸配列には、構成要素（ｂ）（ＶＥＧＦの特異的エピトープ及び／又はアンギオポエチン−２の特異的エピトープからなるアミノ酸配列）に加えて、更に１以上（好ましくは１〜３個、より好ましくは１個）の特異的エピトープが含まれていてもよい。更なる特異的エピトープは、構成要素（ａ）と構成要素（ｂ）の間、構成要素（ｂ）と構成要素（ｃ）の間のいずれの位置に挿入されてもよい。更なる特異的エピトープのアミノ酸配列の長さは、通常５〜３０アミノ酸、好ましくは６〜２５アミノ酸、より好ましくは１０〜１８アミノ酸、更により好ましくは１１〜１６アミノ酸である。

構成要素（ａ）と構成要素（ｃ）との間に、複数個の特異的エピトープが挿入される場合、特異的エピトープ間は、直接共有結合により連結されていてもよいし、スペーサー配列を介して連結されていてもよい。スペーサー配列とは、キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドに含まれる２つの近接した構成要素の間に挿入される１以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を意味する。複数の特異的エピトープがその構造を維持しながら安定に提示され得るように、特異的エピトープ間は、スペーサー配列を介して連結されていることが好ましい。スペーサー配列の長さは、キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドが自己集合によりコア粒子を形成し、その粒子の外側に挿入された全ての特異的エピトープが提示される限り限定されないが、通常１〜１０アミノ酸、好ましくは１〜５アミノ酸、より好ましくは１〜３アミノ酸、最も好ましくは２又は３アミノ酸である。

構成要素（ａ）と構成要素（ｃ）との間の最もＮ末端側の特異的エピトープと、構成要素（ａ）とは、直接共有結合により連結されていてもよいし、スペーサー配列を介して連結されていてもよい。キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドが自己集合して形成するコア粒子の外側に、ＶＥＧＦの特異的エピトープ及び／又はアンギオポエチン−２の特異的エピトープがその構造を維持しながら安定に提示され得るように、構成要素（ａ）と最もＮ末端側の特異的エピトープとは、スペーサー配列を介して連結されていることが好ましい。スペーサー配列の長さは、キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドが自己集合によりコア粒子を形成し、その粒子の外側にＶＥＧＦの特異的エピトープ及び／又はアンギオポエチン−２の特異的エピトープが提示される限り限定されないが、通常１〜１０アミノ酸、好ましくは１〜５アミノ酸、より好ましくは１〜３アミノ酸、最も好ましくは２又は３アミノ酸である。スペーサー配列の種類も、キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドが自己集合によりコア粒子を形成し、その粒子の外側にＶＥＧＦの特異的エピトープ及び／又はアンギオポエチン−２の特異的エピトープが提示される限り限定されない。好ましいスペーサー配列として、ＩＴ、ＧＡＴ、ＣＧＧ等を例示することができるが、これらに限定されない。

構成要素（ａ）と構成要素（ｃ）との間の最もＣ末端側の特異的エピトープと、構成要素（ｃ）とは、直接共有結合により連結されていてもよいし、スペーサー配列を介して連結されていてもよい。キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドが自己集合して形成するコア粒子の外側に、ＶＥＧＦの特異的エピトープ及び／又はアンギオポエチン−２の特異的エピトープがその構造を維持しながら安定に提示され得るように、構成要素（ｂ）と構成要素（ｃ）とは、スペーサー配列を介して連結されていることが好ましい。スペーサー配列の長さは、キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドが自己集合によりコア粒子を形成し、その粒子の外側にＶＥＧＦのエピトープ及び／又はアンギオポエチン−２のエピトープが提示される限り限定されないが、通常１〜１０アミノ酸、好ましくは１〜５アミノ酸、より好ましくは１〜３アミノ酸、最も好ましくは２又は３アミノ酸である。スペーサー配列の種類も、キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドが自己集合によりコア粒子を形成し、その粒子の外側にＶＥＧＦの特異的エピトープ及び／又はアンギオポエチン−２の特異的エピトープが提示される限り限定されない。好ましいスペーサー配列として、ＩＴ、ＧＡＴ、ＣＧＧ等を例示することができるが、これらに限定されない。

構成要素（ａ）と構成要素（ｃ）との間の挿入アミノ酸配列の長さは、キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドが自己集合によりコア粒子を形成し、その粒子の外側にＶＥＧＦ特異的エピトープ及び／又はアンギオポエチン−２特異的エピトープが提示され、癌が治療又は予防できる限り特に限定されないが、通常５〜８０アミノ酸である。挿入アミノ酸配列が短すぎるとエピトープとしての抗原性が失われる可能性ある。また挿入アミノ酸配列が長すぎると、キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドが自己集合によりコア粒子を形成し難くなり、結果として挿入したエピトープを特異的に認識する抗体が産生されず、癌に対する良好な治療又は改善効果が得られなくなる可能性がある。

本発明において用いられる発現ベクターは、上記キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを組込んだ組換えベクターである。当該発現ベクターを対象哺乳動物に投与すると、当該対象哺乳動物の細胞内に該発現ベクターが取り込まれ、該細胞が上記キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドを発現する。キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入する発現ベクターとしてはプラスミド、ウイルス、ファージ、コスミド、及び、当分野において従来用いられるその他のベクターを例示することができる。プラスミドベクターとしては、pCAGGS（Gene 108：193〜199（1991））、pCR-X8（Vaccine 24：4942〜4950（2006））、pcDNA3.1(商品名、Invitrogen）、pZeoSV(商品名、Invitrogen）、及びpBK-CMV(商品名、Stratagene）等を例示することができるがこれらに限定されない。ウイルスベクターは、DNAウイルス又はRNAウイルスである。ウイルスベクターとしては、無毒化レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス（HVJ）、SV40、及びヒト免疫不全ウイルス（HIV）等を例示することができるがこれらに限定されない。さらにセンダイウイルスエンベロープ（HVJ-E）等も利用できる。

上記発現ベクターにおいては、キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）が、投与対象である哺乳動物（好ましくはヒト）の細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されている。

使用されるプロモーターは、投与対象である哺乳動物の細胞内で機能し得るものであれば特に制限はない。プロモーターとしては、ｐｏｌＩ系プロモーター、ｐｏｌＩＩ系プロモーター、ｐｏｌＩＩＩ系プロモーター等を使用することができる。具体的には、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ等のウイルスプロモーター、β−アクチン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーター、並びにｔＲＮＡプロモーター等のＲＮＡプロモーター等が用いられる。

上記発現ベクターは、好ましくはキメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有する。さらに、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含有することもできる。

一態様において、上記発現ベクターは、免疫効果を増強するため、免疫刺激性配列（ＩＳＳ）（ＣｐＧともいう）を含んでいてもよい。免疫刺激性配列は、細菌の非メチル化CpGモチーフを含むDNAであり、特定の受容体（Toll-like receptor 9）のリガンドとして働くことが知られている（詳細はBiochim. Biophys. Acta 1489, 107-116 (1999) 及び Curr. Opin. Microbiol. 6, 472-477 (2003)参照）。免疫刺激性配列の好適な例として、以下を挙げることができる。
CpG-B1018 22bp
5’-tga ctg tga acg ttc gag atg a-3’（配列番号８）
CpG-A D19 20bp (D type)
5’-ggt gca tcg atg cag ggg gg-3’（配列番号９）
CpG-CC274 21bp
5’-tcg tcg aac gtt cga gat gat-3’（配列番号１０）
CpG-CC695 25bp
5’-tcg aac gtt cga acg ttc gaa cgt t-3’（配列番号１１）

或いはこれらのＩＳＳのうちの２、３又は４個を連結して使用してもよい。連結したＩＳＳ配列の好適な例として以下を挙げることができる。
5’-ggt gca tcg atg cag ggg gg tga ctg tga acg ttc gag atg a tcg tcg aac gtt cgagat gat tcg aac gtt cga acg ttc gaa cgt t-3’（配列番号１２）

当業者であれば、例えば、“ｅｄｉｔ．Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）Ｎ．Ｙ．”、及び、“ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（１９８７）ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ” 等に記載の周知の遺伝子工学的技術により上述の発現ベクターを構築することが可能である。

本発明の治療又は改善剤は、治療的有効量の上記発現ベクターに加え、任意の担体、例えば医薬上許容される担体を含む医薬組成物として提供することができる。

医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑沢剤、クエン酸、メントール、グリチルリチン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。

本発明の治療又は改善剤は、その効果を増強するため、アジュバントを更に含有してもよい。アジュバントとしては、水酸化アルミニウム、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、百日咳菌アジュバント、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ＣｐＧ−ＤＮＡ等が挙げられる。

発現ベクターの細胞内への導入を促進するために、本発明の治療又は予防剤は、核酸導入用試薬を更に含有してもよい。核酸導入用試薬としては、リポフェクチン(商品名、Invitrogen）、リポフェクタミン(商品名、Invitrogen）、トランスフェクタム（商品名、Promega）、ＤＯＴＡＰ（商品名、Roche Applied Science）、dioctadecylamidoglycyl spermine（ＤＯＧＳ）、L-dioleoyl phosphatidyl-ethanolamine（ＤＯＰＥ）、dimethyldioctadecyl-ammonium bromide（ＤＤＡＢ）、N,N-di-n-hexadecyl-N,N-dihydroxyethylammonium bromide（ＤＨＤＥＡＢ）、N-n-hexadecyl-N,N-dihydroxyethylammonium bromide（ＨＤＥＡＢ）、ポリブレン、あるいはポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）等の陽イオン性脂質、を用いることが出来る。また、発現ベクターを静電気的リポソームのような脂質二重層で構成される任意の既知のリポソームに封入してもよい。該リポソームは、不活化センダイウイルス（Hemagglutinating virus of Japan；HVJ）のようなウイルスに融合させてもよい。HVJ-リポソームは、通常のリポソームと比較して細胞膜に対して非常に高い融合活性を有する。また、発現ベクターとしてレトロウイルスを用いる場合には、導入試薬としてレトロネクチン、ファイブロネクチン、ポリブレン等を用いることができる。

当該医薬組成物中の上記発現ベクターの含有量は、特に限定されず広範囲に適宜選択されるが、通常、医薬組成物全体の約０．００００１ないし１００重量％である。

本発明の治療又は予防剤は、適用対象である哺乳動物の組織（又は細胞）内への上記発現ベクターの導入により、上記キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドのｉｎｖｉｖｏ発現を誘導し、該キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドに含まれるＶＥＧＦのエピトープ及び／又はアンギオポエチン−２のエピトープに対する抗体産生を誘導し、誘導された抗体がＶＥＧＦ及び／又はアンギオポエチン−２の活性を中和することにより、癌組織周辺における血管新生を抑制し、癌組織の成長を阻害するものである。発現ベクター等の核酸を生体内へ導入する種々の方法が知られており（Ｔ．Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１２７５−１２８１（１９８９））、上記キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドのｉｎｖｉｖｏ発現を誘導し、該キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドに含まれるＶＥＧＦのエピトープ及び／又はアンギオポエチン−２のエピトープに対する抗体産生を誘導し、癌を治療又は予防する限り、どのような導入方法を採用することも可能である。

ｉｎｖｉｖｏで哺乳動物の組織（又は細胞）内に発現ベクターを導入する方法としては、内部型リポソーム法、静電気型リポソーム法、HVJ-リポソーム法、HVJ-AVEリポソーム法、受容体媒介遺伝子導入、パーティクルガン法、裸のDNA法、陽性荷電ポリマーによる導入法、エレクトロポレーション法等が挙げられるが、これらに限定されない。

或いは、適用対象である哺乳動物から、血液細胞、骨髄細胞等の細胞を単離し、該細胞へｅｘｖｉｖｏで上記発現ベクターを導入し、その後、得られた上記発現ベクターを含む細胞を適用対象の哺乳動物へ戻してもよい。

ｅｘｖｉｖｏで哺乳動物の細胞内に発現ベクターを導入する方法としては、リポフェクション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAE-デキストラン法、微小ガラス管を用いる直接DNA導入法、エレクトロポレーション法等が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の治療又は予防剤は、投与対象哺乳動物に、上記キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドのｉｎｖｉｖｏ発現を誘導し、該キメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドに含まれるＶＥＧＦの特異的エピトープ及び／又はアンギオポエチン−２の特異的エピトープに対する抗体産生を誘導し、癌を治療又は予防する限り、いかなる方法により投与してもよい。好ましくは、本発明の治療又は予防剤は非経口的に、投与対象哺乳動物にキメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドに含まれるＶＥＧＦの特異的エピトープ及び／又はアンギオポエチン−２の特異的エピトープに対する抗体産生を誘導し、癌を治療又は予防するのに十分な量が投与される。例えば、静脈内、腹腔内、皮下、皮内、脂肪組織内、乳腺組織内、又は筋肉内の経路を介しての注射；ガス誘導性粒子衝撃法（電子銃等による）；点鼻薬等の形態での粘膜経路を介する方法等が投与方法として例示される。一態様において、本発明の治療又は予防剤は、好ましくは皮下又は筋肉内に注射される。

一実施態様において、本発明の治療又は予防剤は、針無注射器により皮下に投与される。針無注射器は、好ましくは圧力注射器である。針無注射器としては、シマジェット(商品名、島津製作所)、ツインジェクターＥＺＩＩ（商品名、日本ケミカルリサーチ）、シリジェット（商品名、キーストン）、ＺＥＮＥＯ(商品名、クロスジェクト)等を挙げることができるが、これらに限定されない。この場合、本発明の治療又は治療剤は、上記発現ベクター及び針無注射器を含み、該発現ベクターが該針無注射器に封入された、注射製剤として提供することができる。

一実施態様において、本発明の治療又は予防剤は、遺伝子銃により皮下、皮内又は筋肉内へ投与される。この場合、上記発現ベクターを、生体内に導入されるコロイド金粒子等の担体粒子上に被覆して、投与に用いることができる。ポリヌクレオチドで担体粒子をコートする技術は公知である（例えば、ＷＯ９３／１７７０６参照）。最終的に発現ベクターは、生体への投与に適する生理的食塩水等の水溶液中に調製することができる。

良好な免疫応答を誘導するため、本発明の治療又は改善剤は、一定の間隔をあけて複数回投与することが好ましい。該回数は、免疫応答の強さをモニターしながら適宜設定することができるが、通常２〜１０回、好ましくは２〜６回、より好ましくは２、３又は４回、最も好ましくは３回である。

投与頻度は、通常１週間〜１年に１回、好ましくは１〜６ヶ月に１回である。

一実施態様において、本発明の治療又は治療剤は６ヶ月間隔で３回、対象哺乳動物に対して投与される。

本発明の治療又は改善剤の投与量は、有効成分である発現ベクターがコードするキメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドに含まれるＶＥＧＦのエピトープ及び／又はアンギオポエチン−２のエピトープの投与対象哺乳動物における免疫原性に依存するが、一定量の発現ベクターを投与対象である哺乳動物に投与し、ＥＬＩＳＡ等の検定法により当該エピトープに特異的な抗体価を測定して、免疫応答を観察することにより当業者であれば良好な免疫応答に必要な用量を決定することができる。本発明の治療又は予防剤の免疫原性が、有効成分である発現ベクターで用いるプロモーター等の制御配列の強さにも依存するものであることが当業者には理解される。そして当業者であれば、使用する発現ベクターの種類に応じ本発明の治療又は予防剤の投与量を調節することも容易に行い得る。

ＶＥＧＦの特異的エピトープ及び／又はアンギオポエチン−２の特異的エピトープを含むアミノ酸配列が挿入されたキメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドをコードする発現ベクターを投与すると、発現されたキメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチド中のＶＥＧＦの特異的エピトープ及び／又はアンギオポエチン−２の特異的エピトープに対する免疫反応（好ましくは抗体産生等の液性免疫反応）が誘導され、ＶＥＧＦ及び／又はアンギオポエチン−２の活性が抗体によって中和されることにより、癌組織周辺における血管新生が抑制され、癌組織の成長が阻害される。従って、本発明の治療又は予防剤の投与対象としては、癌の患者、癌の罹患歴を有する者、癌の発症リスクを有する非癌患者等を挙げることができる。ＶＥＧＦの特異的エピトープ及び／又はアンギオポエチン−２の特異的エピトープを含むアミノ酸配列が挿入されたキメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドをコードする発現ベクターを癌の患者に投与することにより、該癌患者の癌組織周辺における血管新生を抑制し、癌組織の成長を阻害することにより、癌を治療する。また、該癌患者内の微小転移巣周辺における血管新生を抑制することにより、転移を抑制することができる。ＶＥＧＦの特異的エピトープ及び／又はアンギオポエチン−２の特異的エピトープを含むアミノ酸配列が挿入されたキメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドをコードする発現ベクターを癌の罹患歴を有する者に投与することにより、該罹患歴を有する者の体内に潜んでいる可能性のある微小転移巣周辺における血管新生を抑制し、癌組織の成長を阻害することにより、癌の再発を抑制することが出来る。また、ＶＥＧＦの特異的エピトープ及び／又はアンギオポエチン−２の特異的エピトープを含むアミノ酸配列が挿入されたキメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドをコードする発現ベクターを癌の発症リスクを有する非癌患者に投与することにより、該非癌患者における癌の発症を予防することが出来る。

刊行物、特許文献等を含む、本明細書に引用されたすべての参考文献は、引用により、それらが個々に具体的に参考として援用されかつその内容全体が具体的に記載されているのと同程度まで、本明細書に援用される。

以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。

［実施例１］
HBc-mVEGF(13aa)及びHBc-hAng2(16aa)を発現するコンストラクトの作製
BCCM/LMBP Plasmid Collectionよりplasmid pPLc3（Accession number LMBP 2470）を購入した。ＰＣＲ及びライゲーションにより、HBcのアミノ酸残基８０と８１の間に、マウスＶＥＧＦの部分アミノ酸配列（配列番号１）又はヒトアンギオポエチン−２の部分アミノ酸配列（配列番号３）が挿入された、改変HBcをコードするＤＮＡ断片を得た。このＤＡＮ断片をpcDNA 3.1/V5-His TOPO TA Expression Kit (Invitrogen)にTAクローニングすることによりHBc-AngII ISS(-)ベクターを得た。同様に、鋳型（plasmid pPLc3）、及びプライマーセット（HBcF及びHBcR）を用いてＰＣＲを行い、HBcの全長ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を作製し、これをpcDNA 3.1/V5-His TOPOベクターにTAクローニングすることによりHBc-mVEGF発現ベクター及びHBc-hAng2発現ベクターを得た。作製した、HBc-mVEGF及びHBc-hAng2のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２８及び３０に、各アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を配列番号２７及び２９に、それぞれ示す。以下の領域が挿入配列に相当する。
配列場号２７のヌクレオチドＮｏ．２４４〜２９７（このうち、ヌクレオチドＮｏ．２５０〜２８８が配列番号１をコードする）
配列番号２８のアミノ酸Ｎｏ．８１〜９８（このうち、アミノ酸Ｎｏ．８３〜９５が配列番号１に相当する）
配列番号２９のヌクレオチドＮｏ．２４４〜３０６（このうち、ヌクレオチドＮｏ．２５０〜２９７が配列番号３をコードする）
配列番号３０のアミノ酸Ｎｏ．８１〜１０１（このうち、アミノ酸Ｎｏ．８３〜９８が配列番号３に相当する）

［実施例２］
BALB/cマウス（雌、6週齢）にエレクトロポレーションにより、実施例１で調製した各種発現ベクター（HBc、HBc-mVEGF、HBc-hAng2）を導入した。2週おきに3回免疫後 (0,2,4w)、4週あけて追加免疫(8w)をした。RPMI (10% FBS, pc/sm)にて培養下、増殖期にあるcolon26 (CT-26)細胞をトリプシンにより回収し、PBSで懸濁することにより1×10⁷cells/mL in PBSの濃度の細胞懸濁液を調製した。最後の追加免疫1週後(9w)、免疫付けしたマウス背部の毛を剃り、細胞懸濁液100mL (1×10⁶ cells/mouse)を皮下注した(Day 0)。腫瘍径はノギスにて計測した（tumor volume＝長径×短径×短径÷2）。

ネガティブコントロールベクターと比較して、HBc-mVEGF及びHBc-hAng2で免疫したマウスにおいては、腫瘍増殖が抑制され（図１）、腫瘍移植後の生存率が上昇した（図２）。

［実施例３］
（結果）
VEGFに対するDNAワクチンの製造
このDNAワクチン系が成功裏に抗VEGF抗体産生を誘導するか確認するため、2週間毎に3回、エレクトロポレーターを用いた筋肉内投与及び3回目の免疫化後の追加的ブーストにより、BALB/c雌性マウスを、pcDNA3.1-HBc-mVEGF (7 a.a.) [HBc-mVEGF (7 a.a.)]、pcDNA3.1-HBc [HBc]及び生理食塩水のそれぞれにより免疫接種した（図3及び4）。その結果、HBc-mVEGF (7 a.a.)群において、コントロール（HBc及び生理食塩水）よりもやや高い力価の抗VEGF抗体が認められた（図5）。この７アミノ酸配列は、抗VEGF抗体を誘導するＢ細胞エピトープとして十分ではないかもしれないので、ベバシズマブ、VEGFR-1又はVEGFR-2との結合表面をカバーする、より長い配列を候補抗原として設計した。コア配列に6又は10アミノ酸を付加することにより、標的13アミノ酸配列(IMRIKPHQSQHIG; 13 a.a.)（配列番号１）及び17アミノ酸配列(MQIMRIKPHQSQHIGEM; 17 a.a.)（配列番号３２）を創成した（図3）。次に、pcDNA3.1-mVEGF (13 a.a.) [HBc-mVEGF (13 a.a.)]及びpcDNA3.1-mVEGF (17 a.a.) [HBc-mVEGF (17 a.a.)]を同様に構築し、マウスへワクチン接種した。図5に示すように、両方の抗原とも、成功裏に抗VEGF抗体の産生を誘導した。17 a.a.群及び7 a.a群と比較して、HBc-mVEGF (13 a.a.)群において比較的高い抗VEGFの力価が観察された（図5）。そこで、13 a.a. (IMRIKPHQSQHIG)をHBcシステムを用いたVEGF DNAワクチンの抗原として決定した（図6a及びb）。HBc-mVEGF (13 a.a.)の発現ベクターの機能性をトランスフェクトしたCOS-7細胞で確認した。各コンストラクトとも予想された長さのmRNA及び予想された分子量のタンパク質を発現した。

三回目の免疫から8週間後及び4週間後に抗VEGF抗体の力価を確認した。HBc-mVEGF (13 a.a.)群において高い力価が観察された（図7a及び8）。IgGサブタイプの解析の結果、この免疫はIgG2a及びIgG2b産生優勢なTh1に偏った免疫反応を引き起こすことが示唆された（図７b）。更にHBc-mVEGF (13 a.a.)による免疫で産生された血清がウェスタンブロットにおいて組み換え型マウスVEGF-Aタンパク質を認識するか確認した。市販されたVEGFに対する抗体であるVG-1と同様に、免疫化された血清の組み換え型VEGFタンパク質への特異的結合が確認された（図8）。

VEGF DNAワクチン接種により産生された抗VEGF抗体の中和活性
ワクチン接種したマウスからの血清の中和活性を調べるため、プロテインGカラムを用いてマウス血清からIgGを精製した。免疫化した血清による処理により、HUVECにおけるVEGF-A誘導ERK1/2リン酸化が有意に減弱されたが、コントロール血清では減弱されなかった（図9）。免疫化した血清は、0.4 % FBS及び0.4 %サプリメントを含むEBM-2処理によるマトリジェル中のHUVECの管形成を、コントロール血清の添加と比較して有意に減弱させた（図10）。

（方法）
血清中の抗mVEGF抗体の測定
最初の免疫から8又は16週間後に、全ての群の免疫化マウスから血清を採取した。これらのマウスにおける抗VEGF抗体の血清レベルをELISAにより測定した。端的には、ELISAプレートを5 μg/mLのVEGF 13 a.aをコンジュゲートしたBSAを含む炭酸緩衝液で4℃にて一晩コートした。免疫化したマウスからの血清試料の段階希釈（1:100〜1:312500）をウェルに加え、HRPをコンジュゲートした抗マウスIgG抗体（全IgG、GE Healthcare、UK；各サブタイプ、Abcam、UK)を加えた。PBSTで4回洗浄後、3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン（TMB, Sigma-Aldrich, USA）を加えた。青色の反応産物の産生を0.5 mol/L硫酸の添加により停止させ、得られた最終産物（黄色）の450 nmにおける吸光度を測定した。

IgG 精製
製造者の指示書に従い、プロテインGカラムを用いてマウス血清からIgGを精製した(MAbTrap Kit; GE Healthcare, UK)。端的には、血清試料を結合緩衝液の組成（20 mMリン酸ナトリウム、pH 7.0）に調整した。蒸留水でプロテインGカラムからエタノール保存剤を洗い流し、結合緩衝液で平衡化した。希釈した血清を乗せ、溶出物中に材料が検出されなくなるまで結合緩衝液でカラムを洗浄した。その後、IgG画分を溶出緩衝液（0.1 Mグリシン−HCl、pH2.7）で溶出し、遠心フィルター(Amicon Ultra; Millipore, USA)により濃縮した。

管形成アッセイ
製造者の指示書に従って、マトリジェル(Becton-Dickinson, USA)を用いて管形成アッセイを実施した。端的には、24ウェルプレートのウェルをマトリジェルでコートし、37℃にて１時間重合させた。重合の後、コントロール血清又は免疫化した血清を含む0.3 mlのEBM-2（20 % EGM-2 kit、0.4 % FBS及び20 %サプリメントを含む）中に懸濁したHUVEC（100,000個）を各ウェルに加えた。６時間後、無作為に抽出した５視野について、ウェルを50倍拡大率にて写真撮影し（Olympus）、ImageJを用いて管ネットワークの数をカウントした。

ウェスタンブロット解析
３回の独立した試験のそれぞれについて、記載した処理の後に、プロテアーゼインヒビターカクテル（Roche, Mannhein, Germany）、10 mmol/L NaF、及び1 mmol/L Na₃VO₄を含むRIPAライシスバッファー（Millipore）を用いて、細胞から全タンパク質(10 μg)を単離し、SDS-PAGEによりサイズ分画し、Immobilon-P（Millipore）へ移行させた。ブロットしたタンパク質を、pERKに対する抗体及びERKに対する抗体(cell signaling technology)、並びにこれに引き続く適切なHRPコンジュゲート二次抗体により染色し、ECL(Amersham, Arlington Heights, IL)で検出した。FujiFilm LAS-1000カメラで化学発光シグナルを検出し、Multi Gauge 3.2Vソフトウェアにより解析した。ImageJソフトウェアによりバンドを定量化した。

本発明により、正常な血管機能への悪影響のリスクが低減された、腫瘍血管新生関連因子を標的とする、癌の治療又は予防のための優れたワクチンが提供される。

本出願は日本で出願された特願２０１２−１９１７１７（出願日：２０１２年８月３１日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims

１３〜１６アミノ酸長のＶＥＧＦの特異的エピトープからなるアミノ酸配列が挿入されたキメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドをコードする発現ベクターを含む、癌の治療又は予防剤であって、
該特異的エピトープからなるアミノ酸配列が、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列を含み、
該特異的エピトープからなるアミノ酸配列が、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドのアミノ酸残基８０と８１の間に挿入されている、
治療又は予防剤。
ＶＥＧＦの特異的エピトープからなるアミノ酸配列が挿入されたキメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドをコードする発現ベクターを含む、癌の治療又は予防剤であって、
該特異的エピトープからなるアミノ酸配列が、
配列番号３１、３２又は３３で表されるアミノ酸配列、
配列番号３１で表されるアミノ酸配列を含む、配列番号３２で表されるアミノ酸配列の８以上のアミノ酸長の部分配列、或いは
配列番号３１で表されるアミノ酸配列を含む、配列番号３３で表されるアミノ酸配列の８以上のアミノ酸長の部分配列であり、
該特異的エピトープからなるアミノ酸配列が、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドのアミノ酸残基８０と８１の間に挿入されている、
治療又は予防剤。
癌が固形癌である、請求項１又は２記載の治療又は予防剤。
固形癌が、非小細胞肺癌、大腸癌、乳癌、膵臓癌、胃癌、子宮癌及び前立腺癌からなる群から選択されるいずれか一種である、請求項３記載の治療又は予防剤。
挿入アミノ酸配列が更に１以上の特異的エピトープを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の治療又は予防剤。
複数回投与されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の治療又は予防剤。
投与回数が２、３又は４回である、請求項６記載の治療又は予防剤。
投与回数が３回である、請求項７記載の治療又は予防剤。
半年間隔で３回投与することを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の治療又は予防剤。
非ヒト哺乳動物に対して、１３〜１６アミノ酸長のＶＥＧＦの特異的エピトープからなるアミノ酸配列が挿入されたキメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドをコードする発現ベクターの有効量を投与することを含む、当該非ヒト哺乳動物における癌の治療又は予防方法であって、
該特異的エピトープからなるアミノ酸配列が、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列を含み、
該特異的エピトープからなるアミノ酸配列が、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドのアミノ酸残基８０と８１の間に挿入されている、
方法。
非ヒト哺乳動物に対して、ＶＥＧＦの特異的エピトープからなるアミノ酸配列が挿入されたキメラＢ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドをコードする発現ベクターの有効量を投与することを含む、当該非ヒト哺乳動物における癌の治療又は予防方法であって、
該特異的エピトープからなるアミノ酸配列が、
配列番号３１、３２又は３３で表されるアミノ酸配列、
配列番号３１で表されるアミノ酸配列を含む、配列番号３２で表されるアミノ酸配列の８以上のアミノ酸長の部分配列、或いは
配列番号３１で表されるアミノ酸配列を含む、配列番号３３で表されるアミノ酸配列の８以上のアミノ酸長の部分配列であり、
該特異的エピトープからなるアミノ酸配列が、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原ポリペプチドのアミノ酸残基８０と８１の間に挿入されている、
方法。
癌が固形癌である、請求項１０又は１１記載の方法。
固形癌が、非小細胞肺癌、大腸癌、乳癌、膵臓癌、胃癌、子宮癌及び前立腺癌からなる群から選択されるいずれか一種である、請求項１２記載の方法。
挿入アミノ酸配列が更に１以上の特異的エピトープを含む、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法。
前記発現ベクターを複数回投与することを特徴とする、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の方法。
投与回数が２、３又は４回である、請求項１５記載の方法。
投与回数が３回である、請求項１６記載の方法。
前記発現ベクターを半年間隔で３回投与することを特徴とする、請求項１０〜１７のいずれか１項に記載の方法。