KR20180100659A

KR20180100659A - 치료적 항암 네오에피토프 백신

Info

Publication number: KR20180100659A
Application number: KR1020187022898A
Authority: KR
Inventors: 스틴 그라넘; 엘리자베스 스텁스루드; 아그네테 브룬스빅 프레드릭센
Original assignee: 백시바디 에이에스
Priority date: 2016-01-08
Filing date: 2017-01-05
Publication date: 2018-09-11
Also published as: CN108495649A; AU2017205270B2; JP2019505512A; JP2022017499A; EP3400004A1; US20220370579A1; IL260030A; CA3008437A1; WO2017118695A1; BR112018013881A8; BR112018013881A2; RU2018129062A3; AU2017205270A1; US20190022202A1; RU2018129062A

Abstract

본 발명은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 항암 백신, 상기 항암 백신이 사용되는 암 치료 방법 및 상기 백신의 제조 방법에 관한 것이다. 상기 백신은 타겟팅 단위, 다이머화 단위, 제1 링커 및 항원 단위를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 상기 항원 단위는 n-1 개의 항원 소단위를 포함하고, 각 소단위는 암 네오에피토프 서열의 적어도 일부 및 제2 링커를 포함하며, 상기 항원 단위는 최종 암 네오에피토프 서열을 추가로 포함하고, 여기서 n은 3 내지 50의 정수이고, 또는 상기 백신은 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함하거나, 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 2 개의 폴리펩티드로 구성된 다이머 단백질을 포함한다.

Description

치료적 항암 네오에피토프 백신

본 발명은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 항암 백신, 상기 항암 백신을 사용하는 암 치료 방법 및 상기 백신의 제조 방법에 관한 것이다.

암의 치료는 지난 수십 년 동안 특히 조기 발견과 진단으로 인하여 개선되었고, 이는 생존율을 크게 향상시켰음에도 불구하고, 암으로 진단된 환자의 약 60%만이 진단 5년 후에 살아 있다.

사용 중인 대부분의 암 치료법은 수술 절차, 방사선 및 세포 독성 화학 요법이지만, 이들은 모두 심각한 부작용이 있다. 최근에는 공지된 암 관련 항원에 대한 항체를 사용하는 치료 또한 사용되고 있다.

지난 수 년 동안 환자의 면역계의 도움으로 암 세포를 타겟팅하는 암 면역 요법, 즉 암 백신이 관심을 끌었으며, 이는 상기 치료법은 전통적인 암 치료법에서 나타나는 부작용을 감소시키거나 심지어 제거할 수 있기 때문이었다.

면역학의 토대는 자기-비자기 식별 (self-nonself discrimination)에 기반한다. 감염성 질환을 유발하는 병원균의 대부분은 숙주에 의해 인식되어 면역 반응을 유발할 수 있는 분자표지 (molecular signatures)를 함유한다. 그러나 종양 세포는 정상 세포로부터 파생되며, 일반적으로 분자표지를 나타내지 않으므로 정상 세포와 구별하기가 더욱 어렵다.

그럼에도 불구하고, 대부분의 종양 세포는 서로 상이한 유형의 종양 항원을 발현한다. 종양 항원의 한 클래스는 소위 종양 관련 항원 (tumor associated antigens), 즉 정상 조직에서 낮은 수준으로 발현되고 종양 조직에서 훨씬 높은 수준으로 발현되는 항원이다. 이들 종양 관련 항원은 지난 10 년간 암 백신의 표적이 되어왔다. 그러나, 종양 관련 항원에 대한 면역학적 치료는, 종양 세포가 문제의 항원을 하향 조절함으로써 면역계를 피할 수 있고, 치료가 또한 정상 세포 파괴에 의해 독성을 유발할 수 있는 등 여러 가지 문제점을 안고 있다.

최근, 또 다른 클래스의 종양 항원, 소위 종양 신생항원 (tumor neoantigens) 또는 종양 특이적 항원이 식별되었다. 종양 신생항원은 종양 게놈 내 하나 이상의 돌연변이로 인해 발생하며 문제의 단백질 아미노산 서열의 변화를 야기한다. 이들 돌연변이는 정상 조직에서 존재하지 않기 때문에, 종양 관련 항원에 대한 치료의 부작용은 종양 신생항원에 대한 면역 치료로는 발생하지 않는다.

악성 흑색종 (malignant melanoma)에 대한 체세포, 종양 특이적 비동의 (non-synonymous) 돌연변이의 평균 수는 100 내지 120 사이이다. 일부 유전적 변이는 면역계에 의해 인식되어, 이상적인 항원을 나타낸다. 동물 모델은 종양 신생항원으로 면역화의 유용성을 확인하였으며, 2 가지 임상 시험이, 하나는 10 가지의 돌연변이 단백질로 구성된 백신으로 및 다른 하나는 RNA 백신 (IVAC MUTANOME)으로 개시되었다. RNA 백신은 각각 5 개의 상이한 돌연변이 코딩 서열을 포함하는 2 개의 RNA 분자를 포함한다.

그러나, 일부 상이한 단백질 또는 일부 RNA 서열을 투여함으로써, 생체 내 (in vivo)에서 투여 또는 발현되는 다양한 단백질에 대한 면역학적 반응을 조절하는 것은 어렵다.

따라서, 생체 내 또는 시험관 내 (in vitro)에서 돌연변이 단백질의 발현을 보장하고, 항원의 전달 및 강한 T 세포 반응을 유도하는 데 필요한 항원 제시 세포의 활성화를 보장하는 보다 효율적인 백신에 대한 필요성이 존재한다.

본 발명은 종양 신생항원으로부터의 다수의 네오에피토프 (neoepitopes)에 대한 치료적 항암 백신에 관한 것으로, 여기서 네오에피토프는 백시바디 (vaccibody)로 불리는 다이머 단백질로서 면역계에 제공된다. WO 2004/076489는 백시바디라고 불리는 다이머 단백질을 상세하게 기재하고 있다.

한 구현예에서, 본 발명은

1) o 타겟팅 단위

o 다이머화 단위

o 제1 링커

o 항원 단위 (antigenic unit)로서, 여기서 상기 항원 단위는 n-1 개의 항원 소단위를 포함하고, 각 소단위는 암 네오에피토프 서열의 적어도 일부 및 제2링커를 포함하며, 상기 항원 단위는 최종 암 네오에피토프 서열을 추가로 포함하고, 여기서 n은 3 내지 50 사이의 정수인 것인 항원 단위

를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드

또는

2) 1)에서 정의된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것인 폴리펩티드, 또는

3) 1)에서 정의된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 2 개의 폴리펩티드로 구성된 다이머 단백질

의 면역학적 유효량을 포함하는 치료적 항암 네오에피토프 백신에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 정의된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 예컨대, 본 발명에 따른 백신에 유용하다.

제3 측면에서, 본 발명은 상기 정의된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 관한 것이고, 제4 측면에서, 본 발명은 상기 정의된 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.

제5 측면에서, 본 발명은 상기 정의된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드에 관한 것이다. 이러한 폴리펩티드는 예컨대, 본 발명에 따른 백신에 유용하고, 제6 측면에서, 본 발명은 상기 정의된 2 개의 폴리펩티드로 구성된 다이머 단백질에 관한 것이다.

제7 측면에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한, 상기 정의된 폴리펩티드, 다이머 단백질 또는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

전술한 바와 같이, 일부 구현예에서, 상기 백신은 폴리펩티드 또는 다이머 단백질을 포함하고, 따라서 제8 측면에서, 본 발명은 상기 정의된 다이머 단백질 또는 폴리펩티드의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 방법은

a) 상기 정의된 폴리뉴클레오티드를 세포 집단 내로 트랜스펙션시키는 단계;

b) 상기 세포 집단을 배양하는 단계;

c) 상기 세포 집단으로부터 발현된 다이머 단백질 또는 폴리펩티드를 수집 및 정제하는 단계를 포함한다.

기타 구현예에서, 상기 백신은 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 따라서 제9 측면에서, 본 발명은 폴리뉴클레오티드의 면역학적 유효량을 포함하는 백신, 예컨대 DNA 또는 RNA 백신의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 방법은

a. 상기 정의된 폴리뉴클레오티드를 제조하는 단계;

b. 단계 a)에서 수득된 폴리뉴클레오티드를 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 완충제와 혼합함으로써 백신을 수득하는 단계를 포함한다.

제10 측면에서, 본 발명은 환자의 암을 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 환자에게 필요한 경우 상기 정의된 백신을 투여하는 것을 포함한다. 또는 제10 측면에서, 본 발명은 암의 치료 방법에 사용하기 위한 상기 정의된 백신에 관한 것이다.

도 1은 각 모노머에 각각 3, 10 또는 20 개의 네오에피토프를 갖는 본 발명에 따른 다이머 단백질의 개략도를 나타낸다.
도 2는 신생항원 기반의 백시바디 단백질이, HEK293 세포의 VB10.NEO 컨스트럭트로의 트랜스펙션 후 기능성 호모다이머로서 생성 및 분비되는 것을 보여줍니다. 도 2의 상단 왼쪽 패널은 10 개의 네오에피토프를 포함하는 VB10.NEO CT26-X (VB4001) 및 VB10.NEO B16-X (VB4003)의 웨스턴 블롯을 나타내고, 도 2의 하단 왼쪽 패널은 3 개의 네오에피토프를 포함하는 VB10.NEO CT26-III (VB4002) 및 VB10.NEO B16-III (VB4004)의 웨스턴 블롯을 나타낸다. 기능성 호모다이머의 형성은 각 컨스트럭트 (-환원제)에 대한 웨스턴 블롯의 왼쪽 패널에 나타나있다. 오른쪽 패널은 모노머 (+환원제)를 설명한다. 도 2의 오른쪽 패널은 VB10.NEO 컨스트럭트로 트랜스펙션된 HEK293 세포의 상층액 내 백시바디 단백질을 검출하는 두 ELISA 실험의 결과를 나타낸다. 상단 오른쪽 패널은 VB10.NEO CT26 컨스트럭트, VB4001 및 VB4002의 발현 수준을 나타내고, 하단 오른쪽 패널은 VB10.NEO B16 컨스트럭트, VB4003 및 VB4004의 발현 수준을 나타낸다.
도 3은 3 개의 네오에피토프를 포함하는 백시바디 DNA 백신과 비교하였을 때, 10 개의 네오에피토프를 포함하는 백시바디 DNA 백신으로 단일 주입한 후 강력하고 광범위한 T 세포 반응이 유도되었음을 설명한다. 왼쪽 패널은 각각 3 개 및 10 개의 네오에피토프를 포함하는 VB10.NEO B16-III (VB4004) 또는 VB10.NEO B16-X (VB4003)를 주입할 때 B16 흑색종 모델 내의 개별 네오에피토프에 대한 IFN-γ 반응을 나타낸다. 오른쪽 패널은 각각 3 개 및 10 개의 네오에피토프를 포함하는 VB10.NEO CT26-III (VB4002) 또는 VB10.NEO CT26-X (VB4001)를 주입할 때 CT26 결장암 모델 내의 네오에피토프에 대한 IFN-γ 반응을 나타낸다. x축은 10 개의 상이한 네오에피토프인 pepM1-M10을 나타낸다.
VB10.NEO CT26-X = VB4001 = CT26 pepM1-M10,
VB10.NEO CT26-III = VB4002 = CT26 pepM1-M3,
VB10.NEO B16-X = VB4003 = B16 pepM1-M10,
VB10.NEO B16-III = VB4004 = B16 pepM1-M3.
도 4는 단지 3 개의 네오에피토프를 포함하는 백시바디 DNA 백신보다, 10 개의 네오에피토프를 포함하는 백시바디 DNA 백신이 더 강력하고 광범위한 총 면역 반응을 유도하였음을 설명한다. 상단 패널: 10 개의 네오에피토프를 포함하는 VB10.NEO B16-X (VB4003) 및 3 개의 네오에피토프를 포함하는 VB10.NEO B16-III (VB4004)을 주입할 때 B16 흑색종 모델의 네오에피토프에 대한 면역 반응의 비교. 하단 패널: 10 개의 네오에피토프를 포함하는 VB10.NEO CT26-X (VB4001) 및 3 개의 네오에피토프를 포함하는 VB10.NEO CT26-III (VB4002)을 각각 주입할 때 CT26 결장암 모델 내의 네오에피토프에 대한 면역 반응의 비교.
VB10.NEO CT26-X = VB4001 = CT26 pepM1-M10,
VB10.NEO CT26-III = VB4002 = CT26 pepM1-M3,
VB10.NEO B16-X = VB4003 = B16 pepM1-M10,
VB10.NEO B16-III = VB4004 = B16 pepM1-M3.
도 5. 10 개의 네오에피토프를 포함하는 백시바디 DNA 백신은 상응하는 10 개의 펩티드와 보강제의 혼합물보다 훨씬 강력한 면역 반응을 유도한다. 상단 패널: sandwich ELISA에 의해 검출된, 상응하는 백시바디 DNA 컨스트럭트로 트랜스펙션된 HEK293 세포의 상층액 내 10 개의 네오에피토프의 변화 순서를 갖는 VB10.NEO B16-X의 2 가지 변이형 (VB4003 및 VB4014)의 백시바디 발현 수준 비교. VB4003에서, 네오에피토프는 하나 걸러 소수성 또는 친수성인 반면, VB4014에서 소수성 네오에피토프는 네오에피토프 항원성 모듈의 중앙에 배치된다. 항원 모듈 내 네오에피토프의 소수성 코어는 동일한 컨스트럭트에서 기능성 백시바디 단백질의 발현 및 분비를 향상시킬 수 있다. 하단 패널: DNA 백신 VB10.NEO B16-X VB4003 및 VB4014, 및 10 개의 펩티드와 보강제의 혼합물 (VB10.NEO B16-X 컨스트럭트 내 코딩된 것과 동일한 10 개의 네오에피토프)에 의해 유도된 면역 반응을 나타내는 히스토그램. 네오에피토프 항원성 모듈 내의 네오에피토프의 순서는 개별 네오에피토프의 면역원성 계층 구조를 변경하지 않는다.
VB10.NEO B16-X = VB4003 = B16 pepM1-M10,
VB10.NEO B16-X = VB4014 = B16 소수성 코어 (pepM9+pepM5+pepM1+pepM4+pepM6+pepM8+pepM10+pepM3+pepM7+pepM2).
도 6. 10 개의 네오에피토프가 10 개의 아미노산 (aa) 링커로 이격된 VB10.NEO B16-X DNA 백신 (VB4011)은, 10 개의 네오에피토프가 5 개의 aa 링커로 이격된 VB10.NEO B16-X DNA 백신 (VB4003)에 비하여 더 강력한 총 면역 반응을 유도한다. 상단 패널: sandwich ELISA에 의해 검출된, 상응하는 백시바디 DNA 컨스트럭트로 트랜스펙션된 HEK293 세포의 상층액 내 VB4003 및 VB4011의 백시바디 발현 수준 비교. 기능성 백시바디 단백질의 유사 발현 및 분비는 VB4003 및 VB4011에서 관찰된다. 하단 패널: VB4003 또는 VB4011을 마우스 내로 주입한 B16 흑색종 모델의 네오에피토프에 대한 IFN-γ 면역 반응을 나타내는 히스토그램. 10 개의 아미노산 링커로 이격된 10 개의 네오에피토프를 포함하는 백시바디 DNA 백신의 단일 주입은 가장 강력한 총 면역 반응을 유도하였다. 공벡터는 음성 대조군으로 포함시켰다.
VB10.NEO B16-X = VB4003 = B16 pepM1-M10, 5 aa 링커
VB10.NEO B16-X = VB4011 = B16 pepM1-M10, 10 aa 링커.
도 7. 2x10 개의 네오에피토프를 포함하는 백시바디 DNA 백신 (VB4018)은 1x10 개의 네오에피토프를 포함하는 백시바디 DNA 백신 (VB4003)에 비하여, 개별 네오에피토프에 대해 더 광범위한 면역 반응을 유도한다. 상단 패널: sandwich ELISA에 의해 검출된, 상응하는 백시바디 DNA 컨스트럭트로 트랜스펙션된 HEK293 세포의 상층액 내 VB10.NEO B16-X (VB4003) 및 VB10.NEO B16-XX (VB4018)의 백시바디 발현 수준 비교. 하단 패널: VB4003 또는 VB4018을 마우스 내로 주입한 B16 흑색종 모델의 네오에피토프에 대한 IFN-γ 면역 반응을 나타내는 히스토그램. 각 네오에피토프의 2 개의 복제본을 포함하는 것의 이점은 총 면역 반응에 한정되어 있지만, 더 광범위한 면역 반응이 개별 네오에피토프에 대하여 관찰된다.
공벡터는 음성 대조군으로 포함시켰다.
VB10.NEO B16-X = VB4003 = B16 pepM1-M10, 5 aa 링커
VB10.NEO B16-XX = VB4018 = B16 pepM1-M4+M11+M6-M10 x 2, 5 aa 링커
도 8. 백시바디 컨스트럭트에 있는 각 네오에피토프의 여러 복제본은 선택된 5 개의 최상의 네오에피토프에 대해 더 균일한 면역 반응을 나타낸다. 상단 패널: sandwich ELISA에 의해 검출된, 상응하는 백시바디 DNA 컨스트럭트로 트랜스펙션된 HEK293 세포의 상층액 내 VB10.NEO B16-X (VB4003 및 VB4011), VB10.NEO B16-XX (VB4018), VB10.NEO B16-Vx2 (VB4019) 및 VB10.NEO B16-Vx4의 백시바디 발현 수준 비교. 하단 패널: 5 가지 네오에피토프 (PepM3, PepM4, PepM7, PepM9 및 PepM10)를 모두 포함하되 서로 다른 맥락으로 포함하는 5 개의 상이한 백시바디 DNA 백신이 주입된 B16 흑색종 마우스 모델로부터의 이들 5 개의 네오에피토프에 대한 IFN-γ 면역 반응을 나타내는 히스토그램. 공벡터는 음성 대조군으로 포함시켰다. 이 도면은 백시바디 컨스트럭트 VB4019 (Vx2) 및 VB4021 (Vx4)로 관찰된 각 네오에피토프의 몇몇 복제본이, 5 개의 선택된 네오에피토프가 한 번 제시되는 데카토프 VB4003에 비하여, 5 개의 공유 네오에피토프에 대해 더 균등한 면역 반응을 매개한다는 것을 보여준다. 그러나, 10 개의 상이한 네오에피토프 (즉, 이 분석에서 테스트된 5 개의 네오에피토프의 단 하나의 복사본)를 보유하는 컨스트럭트는 중요하게도 링커의 길이가 증가함에 따라 (10 개 아미노산, VB4011), 5 개의 공유 네오에피토프에 대해 가장 강력한 총 면역 반응을 유도하였다.
VB10.NEO B16-X = VB4003 = B16 pepM1-M10, 5 aa 링커
VB10.NEO B16-X = VB4011 = B16 pepM1-M10, 10 aa 링커
VB10.NEO B16-XX = VB4018 = B16 pepM1-M4+M11+M6-M10 x 2, 5 aa 링커
VB10.NEO B16-Vx2 = VB4019 = B16 pepM3+M4+M7+M9+M10 x 2, 5 aa 링커
VB10.NEO B16-Vx4 = VB4021 = B16 pepM3+M4+M7+M9+M10 x 4, 5 aa 링커
도 9는 20 개의 네오에피토프를 포함하는 백시바디 VB4018이 10 개의 네오에피토프를 포함하는 백시바디 VB4017과 동일한 수준으로 발현된다는 것을 보여준다. 상기 백시바디 단백질은 다른 백시바디 DNA 컨스트럭트로 트랜스펙션된 HEK293 세포의 상층액에서 sandwich ELISA에 의해 검출된다.
VB10.NEO B16-X = VB4017= B16 pepM1-M4+M11+M6-M10, 5 aa 링커
VB10.NEO B16-XX = VB4018 = B16 pepM1-M4+M11+M6-M10 x 2, 5 aa 링커
도 10. 3-네오에피토프를 포함하는 상이한 백시바디 컨스트럭트의 발현 수준을 비교하였다. 상기 백시바디 단백질은 다른 백시바디 DNA 컨트스럭트로 트랜스펙션된 HEK293 세포의 상층액에서 sandwich ELISA에 의해 검출된다. 상단 패널: 3 개의 네오에피토프가 5 aa 링커 (VB4004) 보다 10 aa 링커 (VB4012)로 이격되었을 때 기능성 백시바디 단백질의 향상된 발현 및 분비가 관찰된다. 하단 패널: 이 도면은 네오에피토프의 순서를 변경하면 백시바디의 발현에 영향을 줄 수 있음을 보여준다.
VB10.NEO B16-III = VB4004 = B16 pepM1-M3, 5 aa 링커
VB10.NEO B16-III = VB4012 = B16 pepM1-M3, 10 aa 링커
VB10.NEO B16-III = VB4015 = B16 pepM1+M8+M3, 5 aa 링커
VB10.NEO B16-III = VB4016 = B16 pepM1+M3+M2, 5 aa 링커
도 11은 10 개의 네오에피토프 (VB4011), 15 개의 네오에피토프 (VB4024) 또는 20 개의 네오에피토프 (VB4025)를 포함하는 백시바디 DNA 백신으로 단일 주입한 후 유도된 B16 흑색종 마우스에서의 면역 반응을 보여준다. 상단 패널: 10-, 15- 또는 20 개의 네오에피토프를 포함하는 테스트된 백시바디 컨스트럭트의 발현 수준. 상기 백시바디 단백질은 다른 백시바디 DNA 컨스트럭트로 트랜스펙션된 HEK293 세포의 상층액에서 sandwich ELISA에 의해 검출된다. 하단 패널: 10 개의 네오에피토프를 포함하는 VB10.NEO B16-X (VB4011)에 비하여, 15 개의 네오에피토프를 포함하는 VB10.NEO B16-XV (VB4024) 또는 20 개의 네오에피토프를 포함하는 VB10.NEO B16-XX (VB4025) DNA 백신 후보들을 주입한 마우스에서의 네오에피토프에 대한 총 면역 반응. 이 도면은 10⁶ 개의 비장 세포 당 IFNγ-스폿의 총 수를 나타낸다. 음성 대조군으로서, 마우스에 네오에피토프를 포함하지 않는 공벡터를 주입하였다. 이 도면은 20 개의 네오에피토프를 포함하는 백시바디 DNA 백신이 단지 10 개의 네오에피토프만을 포함하는 백시바디 DNA 백신보다 더 강력하고 광범위한 총 면역 반응을 유도함을 보여준다.
도 12는 10 개의 네오에피토프 (VB4009), 15 개의 네오에피토프 (VB4026) 또는 20 개의 네오에피토프 (VB4027)를 포함하는 백시바디 DNA 백신으로 단일 주입한 후 유도된 CT26 결장암 마우스에서의 면역 반응을 보여준다. 상단 패널: 테스트된 10 개의 네오에피토프를 포함하는 백시바디 컨스트럭트 VB10.NEO CT26-X (왼쪽 패널)와 15 및 20 개의 네오에피토프를 각각 포함하는 백시바디 컨스트럭트 VB10.NEO CT26-XV 및 XX (오른쪽 패널)의 발현 수준. 하단 패널: 10 개의 네오에피토프를 포함하는 VB10.NEO CT26-X (VB4009)에 비하여, 15 개의 네오에피토프를 포함하는 VB10.NEO CT26-XV (VB4026) 또는 20 개의 네오에피토프를 포함하는 VB10.NEO CT26-XX (VB4027) DNA 백신 후보들을 주입한 CT26 결장암 마우스 모델에서의 네오에피토프에 대한 총 면역 반응. 이 도면은 10⁶ 개의 비장 세포 당 IFNγ-스폿의 총 수를 나타낸다. 음성 대조군으로서, 마우스에 네오에피토프를 포함하지 않는 공벡터를 주입하였다. 이 도면은 20 또는 15 개의 네오에피토프를 포함하는 백시바디 DNA 백신이 단지 10 개의 네오에피토프만을 포함하는 백시바디 DNA 백신보다 더 강력하고 광범위한 총 면역 반응을 유도함을 보여준다.
NEO CT26-X = VB4009 = CT26 pepM1-M10, 10 aa 링커
NEO CT26-XV = VB4026 = CT26 pepM1-M15, 10 aa 링커
NEO CT26-XX = VB4027 = CT26 pepM1-M20, 10 aa 링커
도 13은 10 개의 네오에피토프를 포함하는 VB10.NEO 백신 후보들로 2 회 면역화된 마우스가 PBS만을 투여한 음성 대조군 마우스에 비하여, a) B16 흑색종 모델 및 b) CT26 결장암 모델 내에서 종양의 성장을 유의하게 지연 및 감소시킬 수 있음을 보여준다. 이 도면은 시간 경과에 따른 종양 부피를 나타낸다. CT26 결장암 실험의 경우, 마우스를 종양의 성장을 안정화시킬 수 있었던 반응자 (responders) 및 비반응자 (non-responders)로 나누었다.
용어의 정의
종양은 혈액과 같은 체액에서 발견되는 종양 세포뿐만 아니라 고형 종양 모두에 대해 본 문맥에서 사용된다.
종양 신생항원은 숙주의 엑솜 (exome)과 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 임의의 종양 특이적 항원에 대해 사용되며, 용어 암 신생항원과 동의어로 사용된다.
종양 네오에피토프는 종양 항원의 임의의 면역원성 돌연변이에 대해 사용되며, 용어 암 네오에피토프와 동의어로 사용된다.
종양 네오에피토프 서열은 항원 소단위의 네오에피토프를 포함하는 서열을 기술하는 데 사용되며, 용어 암 네오에피토프 서열과 동의어로 사용된다.
치료적 항암 백신은 이미 환자에 존재하는 종양 세포를 감소시키거나 파괴하는 데 사용되는 백신을 기술하는 데 사용된다.

암은 돌연변이로 인해 조절되지 않는 세포의 비정상적인 증식을 시작하는 하나 또는 몇 개의 세포에 의해 환자의 정상 조직에서 발생한다. 암세포는 돌연변이 되었더라도, 대부분의 게놈이 환자의 나머지 세포와 동일하며 온전하다. 이는 또한 항암 백신을 개발하기 위한 이전의 시도들에서의 실패 이유이기도 하며, 즉 백신은 어느 정도 환자의 정상 세포로도 향한다. 전술한 바와 같이, 본 발명에 의해 정의된 종양을 공격하는 접근법은, 돌연변이로 인해 임의의 종양이 환자의 정상 세포에 있는 어떠한 단백질과도 동일하지 않은 돌연변이된 단백질, 소위 신생항원을 발현하고, 이에 따라 상기 신생항원이 치료적 항암 백신의 효율적인 표적이 된다는 지식을 사용한다. 종양에서 발견되는 돌연변이는 일반적으로 매우 독특하며, 따라서, 본 발명에 따른 백신은 문제의 돌연변이를 갖는 환자에서만 개인화되어 사용된다.

본 발명에 따른 백신은 정상적인 적응 면역계 (adaptive immune system)를 사용하여 종양 세포에 대한 면역성을 제공한다. 적응 면역계는 모든 외래 항원이 상기 외래 항원에 대한 면역 반응을, 항원 제시 (antigen presentation)라고 불리는 과정 도중의 특정 "비자기 (non-self)" 항원의 인식에 의하여 특이적으로 유발한다는 점에서 독특하다. 적응 면역계의 세포는 림프구, 특히 B 세포와 T 세포이다. B 세포는 체액성 면역 반응에 관여하는 반면, T 세포는 세포성 면역 반응에 관여한다.

특히, 본 발명에 따른 백신은 신생항원에 대한 T 세포의 활성화를 통해 세포성 면역 반응을 유발하도록 고안되었다. T 세포는 네오에피토프가 아래에서 논의되는 바와 같은 MHC 분자와 복합체로 가공 및 제시되었을 때 이를 인식한다.

주요 조직 적합성 복합체 (Major histocompatibility complex; MHC )

본 발명에 따른 네오에피토프는 MHC-네오에피토프 복합체 내에 존재하도록 고안된다. 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 분자에는, MHC I 및 MHC II의 두 가지 주 클래스가 있다.

MHC I은 신체의 모든 유핵 세포의 세포 표면에서 발견된다. MHC I의 한 기능은 세포 내부로부터 세포 독성 T 세포로 비자기 단백질의 펩티드를 디스플레이하는 것이다. MHC I 복합체-펩티드 복합체는 상기 펩티드를 세포 독성 T 세포에 제시하는 세포의 원형질막 내로 삽입되고, 이로써 상기 특정 MHC-펩티드 복합체에 대한 세포 독성 T 세포의 활성화가 촉발된다. 펩티드는 MHC I 분자의 홈 (groove) 내에 위치하여, 펩티드 길이가 약 8-10 개의 아미노산이 되도록 한다.

MHC II 분자는 수지상 세포, 단핵 식세포, 일부 내피 세포, 흉선 상피 세포 및 B 세포와 같은 항원 제시 세포상에서만 정상적으로 발견되는 분자의 패밀리이다.

MHC I과는 반대로, 클래스 II 펩티드에 의해 제시된 항원들은 세포 외 단백질로부터 유래된다. 세포 외 단백질은 엔도시토시스되고 (endocytosed) 리소좀에서 소화되며, 그 결과 생성된 항원성 펩티드는 MHC 클래스 II 분자상에 로딩된 후 상기 세포 표면에 제시된다. MHC 클래스 II 분자의 항원-결합 홈은 양 말단이 개방되어 있으며, 일반적으로 길이가 15 내지 24 개 아미노산 잔기인 더 긴 펩티드를 제시할 수 있다.

클래스 I MHC 분자는 CD8 및 일반적으로 CD8+ 세포로 불리는 T 세포상의 보조 수용체에 의해 인식되는 반면, 클래스 II MHC 분자는 CD4 및 일반적으로 CD4+ 세포로 불리는 T 세포상의 보조 수용체에 의해 인식된다.

백신

본 발명의 신생항원 백신은 3 단위, 즉 타겟팅 단위, 다이머화 단위 및 항원 단위를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다이머화 단위에 의하여 폴리펩티드는 백시바디라고 불리는 다이머 단백질을 형성한다.

3 단위를 코딩하는 유전자들은 유전자 조작되어 하나의 유전자로 발현된다. 생체 내 발현될 때, 상기 폴리펩티드/다이머 단백질은 항원 제시 세포 (APCs)를 표적으로 하며, 이는 동일한 비표적 항원에 비하여 증강된 백신 효능을 나타낸다.

본 발명은 항원 단위가 항원 소단위를 포함하는 백신에 관한 것이며, 여기서 각 소단위는 암 네오에피토프 서열 또는 적어도 암 네오에피토프 서열의 일부를 포함한다. 네오에피토프 서열은 종양 DNA 또는 RNA를 시퀀싱하고, 신생항원을 나타내는 종양 특이적 돌연변이를 식별함으로써 얻어진다. 이에 따라, 상기 식별된 종양 항원을 특이적으로 타겟팅하는 개인화된 신생항원 백신이 얻어진다.

본 발명의 한 측면은 치료적 항암 네오에피토프 백신에 관한 것으로, 상기 백신은

o 타겟팅 단위

o 다이머화 단위

o 제1 링커

o 항원 단위로서, 여기서 상기 항원 단위는 n-1 개의 항원 소단위를 포함하고, 각 소단위는 암 네오에피토프 서열의 적어도 일부 및 제2링커를 포함하며, 상기 항원 단위는 최종 암 네오에피토프 서열을 추가로 포함하고, 여기서 n은 3 내지 50 사이의 정수인 것인 항원 단위

또는

1)에서 정의된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것인 폴리펩티드, 또는

1)에서 정의된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 2 개의 폴리펩티드로 구성된 다이머 단백질

의 면역학적 유효량을 포함한다.

따라서, 상기 백신은 n 개의 네오에피토프 또는 네오에피토프 서열 및 n-1 개의 제2 링커를 포함하며, 여기서 n은 3 내지 50의 정수이다.

항원 단위

본 발명에 따른 항원 단위는 다수의 종양 네오에피토프를 포함하며, 여기서 각 네오에피토프는 종양 신생항원에서 식별된 돌연변이에 해당한다. 상기 돌연변이는 하나 이상의 아미노산을 변화시키는 임의의 돌연변이일 수 있다. 따라서, 상기 돌연변이는 하기 중 하나일 수 있다:

- 아미노산을 변화시키는 비동의 돌연변이

- 프레임 시프트 (frame shift) 및 이로 인한 돌연변이 이후의 방향으로 완전히 상이한 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)을 초래하는 돌연변이

- 종양 특이적 네오에피토프를 갖는 더 긴 단백질을 초래하는, 종결 코돈이 조작 또는 삭제된 리드 스루 (read-through) 돌연변이

- 독특한 종양 특이적 단백질 서열을 유도하는 스플라이스 (splice) 돌연변이

- 두 단백질의 접합부에 종양 특이적 네오에피토프를 갖는 키메라 단백질을 생성시키는 염색체 재배열

항원 단위에서, 종양 네오에피토프의 마지막을 제외한 모든 부분은 항원 소단위 내에 배열되고, 여기서 각 소단위는 종양 네오에피토프 서열 및 제2 링커로 구성되는 반면, 마지막 소단위는 오직 네오에피토프만 포함, 즉 상기 제2 링커를 포함하지 않는다. 상기 제2 링커에 의한 종양 네오에피토프 서열의 분리로 인하여, 각 네오에피토프는 면역계에 최적의 방식으로 제시되어, 하기에서 논의되는 바와 같이 백신의 효율을 보장한다.

암 네오에피토프 서열은 바람직하게는 상기 논의된 MHC 분자에 의한 제시에 적절한 길이를 가진다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 상기 암 네오에피토프의 길이는 7 내지 30 개 아미노산이다. 더 바람직하게는, 암 네오에피토프 서열의 길이는 7 내지 10 개의 아미노산이거나, 암 네오에피토프 서열의 길이는 13 내지 30 개의 아미노산이다.

백신이 돌연변이 유전자의 발현 산물을 향하는 경우, 상기 유전자의 발현을 셧다운시킴으로써 종양이 면역계를 빠져 나가는 것을 피하기 위하여, 다수의 상이한 네오에피토프를 항원 단위에 포함시키는 것이 바람직하다. 일반적으로, 종양이 셧다운시켜야 하는 유전자가 많을수록 종양이 이들 모두를 셧다운시킬 수 있는 가능성이 낮아, 여전히 증식하거나 심지어 생존할 수도 있다. 또한, 종양은 각각의 모든 신생항원이 모든 종양 세포에 의해 발현되는 것은 아니라는 점에서 이질적 (heterogeneous)일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면, 상기 접근법은 효율적으로 종양을 공격하기 위하여 가능한 한 많은 네오에피토프를 백신 내에 포함시킨다. 또한, 모든 네오에피토프가 동일한 항원 제시 세포에 효율적으로 로딩되도록 하기 위하여, 이산 (discrete) 펩티드가 아닌 하나의 아미노산 사슬로 배열된다. 그러나, 전술한 바와 같이, 백신의 목적은 T 세포를 네오에피토프에 대하여 활성화시키는 것이며, 너무 많은 네오에피토프가 백신 내에 포함된 경우 T 세포가 희석될 수 있으므로, 백신의 항원 단위에 최적의 수의 네오에피토프를 제공하는 것이 균형적이다.

하기에서 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 신생항원을 동정한 후 가장 항원성인 네오에피토프를 선택하기 위하여 종양 엑솜을 분석하였다. 본 발명자는 실질적으로 모든 종양 세포를 효율적으로 “타격 (hit)”할 수 있도록, 백신 내에 적어도 3 개의 네오에피토프, 예컨대 적어도 5 개의 네오에피토프, 예컨대 적어도 7 개의 네오에피토프, 예컨대 적어도 10 개의 네오에피토프가 혼입되도록 선택되어야 한다는 것을 발견했다.

또한, 본 발명의 발명자들은 백신 컨스트럭트 내 네오에피토프의 수를 3 개의 네오에피토프에서 10 개의 네오에피토프로 증가시키면 면역 반응이 놀라울 정도로 증가한다는 사실을 발견하였다 (도 4 참조). 또한, 백신 컨스트럭트 내 네오에피토프의 수를 10 개의 네오에피토프에서 15 또는 20 개의 네오에피토프로 증가시키면 면역 반응이 더욱 증가한다는 사실을 발견하였다 (도 11 및 12 참조).

따라서, 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 백신은 적어도 10 개의 네오에피토프를 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 백신은 적어도 15 개의 네오에피토프, 예컨대 적어도 20 개의 네오에피토프를 포함한다.

한 구현예에서, T 세포를 희석시키지 않고 가장 효율적인 면역 반응을 얻기 위하여, 3 내지 50 개의 네오에피토프, 예컨대 3 내지 30 개의 네오에피토프, 예컨대 3 내지 20 개의 네오에피토프, 예컨대 3 내지 15 개의 네오에피토프, 예컨대 3 내지 10 개의 네오에피토프가 백신에 포함되며, 따라서 n은 바람직하게는 3 내지 50, 예컨대 3 내지 30, 예컨대 5 내지 25, 예컨대 3 내지 20, 예컨대 3 내지 15, 예컨대 3 내지 10의 정수이다.

또 다른 구현예에서, T 세포를 희석시키지 않고 가장 효율적인 면역 반응을 얻기 위하여, 5 내지 50 개의 네오에피토프, 예컨대 5 내지 30 개의 네오에피토프, 예컨대 5 내지 25 개의 네오에피토프, 예컨대 5 내지 20 개의 네오에피토프, 예컨대 5 내지 15 개의 네오에피토프, 예컨대 5 내지 10 개의 네오에피토프가 백신에 포함될 수 있으며, 따라서 n은 바람직하게는 5 내지 50, 예컨대 5 내지 30, 예컨대 5 내지 25, 예컨대 5 내지 20, 예컨대 5 내지 15, 예컨대 5 내지 10의 정수이다.

또 다른 구현예에서, T 세포를 희석시키지 않고 가장 효율적인 면역 반응을 얻기 위하여, 10 내지 50 개의 네오에피토프, 예컨대 10 내지 40 개의 네오에피토프, 예컨대 10 내지 30 개의 네오에피토프, 예컨대 10 내지 25 개의 네오에피토프, 예컨대 10 내지 20 개의 네오에피토프, 예컨대 10 내지 15 개의 네오에피토프가 백신에 포함될 수 있으며, 따라서 n은 바람직하게는 10 내지 50, 예컨대 10 내지 30, 예컨대 10 내지 20, 예컨대 10 내지 15의 정수이다.

본 발명의 발명자들은 10 개의 네오에피토프를 포함하는 백시바디 DNA 백신이 오직 3 개의 네오에피토프만을 포함하는 백시바디 DNA 백신보다 더 강력하고 광범위한 총 면역 반응을 유도한다는 것을 보였다 (도 4 및 실시예 2 참조). 또한, 네오에피토프의 수를 20 개 이상으로 증가시키면 T 세포가 희석되어 백신의 효율이 감소될 수 있다. 또한, 20 개 이상의 네오에피토프를 포함시키는 기술적 어려움과도 관련이 있을 수 있다.

따라서, 본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 백신은 10 내지 20 개의 네오에피토프를 포함한다.

또 다른 구현예에서, T 세포를 희석시키지 않고 가장 효율적인 면역 반응을 얻기 위하여, 15 내지 50 개의 네오에피토프, 예컨대 15 내지 30 개의 네오에피토프, 또는 예컨대 15 내지 20 개의 네오에피토프가 백신에 포함되며, 따라서 n은 바람직하게는 15 내지 50, 예컨대 15 내지 30, 또는 예컨대 15 내지 20의 정수이다.

한 구현예에서, 항원 단위는 각 암 네오에피토프의 하나의 카피를 포함하여, 10 개의 네오에피토프가 백신에 포함될 때 10 개의 상이한 네오에피토프에 대한 세포성 면역 반응이 유발될 수 있다.

그러나, 동정된 관련 항원성 돌연변이가 몇 개 되지 않는 경우, 항원 단위는 네오에피토프에 대한 면역 반응을 강화시키기 위하여 이들 네오에피토프 중 적어도 하나의 복제본을 둘 이상 포함할 수 있다. 또한 제조 및 규제상의 이유로도, 플라스미드의 길이, 즉 항원 단위를 일정하게 유지하는 것이 유리할 수 있으며, 따라서 항원 단위 내에 동일한 네오에피토프의 복제본을 하나 이상 포함하는 것이 유리할 수 있다.

전술한 바와 같이, 항원 단위의 길이를 일정하게 유지하는 것이 유리할 수 있으며, 따라서 한 구현예에서, 모든 암 네오에피토프 서열의 길이는 동일한 것이 바람직하다. 그러나, 하나 이상의 네오에피토프가 프레임 시프트 또는 종결 코돈 돌연변이를 일으키는 돌연변이로 인해 발생하면, 네오에피토프는 예컨대 적어도 단백질의 돌연변이된 부분, 돌연변이된 단백질의 가장 항원성인 부분 또는 어쩌면 전체 돌연변이된 단백질로 구성되는 상당한 길이를 가질 수 있으며, 이로써 하나 이상의 네오에피토프의 길이는 비동의 점돌연변이 (point mutation)로부터 발생하는 네오에피토프보다 대체로 더 길다.

상기 항원 단위의 길이는 주로 네오에피토프의 길이 및 항원 단위 내에 배열된 네오에피토프의 수에 의해 결정되며, 약 21 내지 1500, 바람직하게는 약 30 개의 아미노산 내지 약 1000 개의 아미노산, 더 바람직하게는 약 50 내지 약 500 개의 아미노산, 예컨대 약 100 내지 약 400 개의 아미노산, 약 100 내지 약 300 개의 아미노산이다.

특히 네오에피토프가 짧은 경우, 예컨대 적은 수의 아미노산 길이인 경우, 암 네오에피토프 서열은 아미노산 서열이 양 측면 모두에 위치한 네오에피토프를 포함한다. 바람직하게는, 상기 네오에피토프는 네오에피토프가 가공 후 항원 제시 세포에 의해 제시되는 것을 보장하기 위하여, 암 네오에피토프 서열의 중간에 필수적으로 위치한다. 네오에피토프에 인접하고 있는 아미노산 서열은 바람직하게는 신생항원 내의 네오에피토프에 인접하고 있는 아미노산 서열이며, 이로써 암 네오에피토프 서열은 암 신생항원 아미노산 서열의 진정한 하위 서열이다.

비록 네오에피토프가 항원 소단위 내에서 무작위로 배열되는 경우 종양에 대한 관련 면역 반응을 얻는 것이 가능하다고 하더라도, 면역 반응을 증강시키기 위하여 항원 단위 내의 네오에피토프를 정렬하기 위한 다음 방법 중 적어도 하나를 따르는 것이 바람직하다.

한 구현예에서, 선택된 네오에피토프에 따라, 항원 소단위를 제1 링커에서 최종 네오에피토프의 방향으로, 큰 항원성에서 작은 항원성의 순서로 배열한다.

또 다른 구현예에서, 특히 친수성/소수성이 네오에피토프 간 크게 다른 경우, 가장 소수성인 항원 소단위(들)을 실질적으로 항원 단위의 중간에 위치시키고, 가장 친수성인 항원 소단위(들)을 항원 단위의 시작 및/또는 끝 부분에 위치시킨다. 또는, 네오에피토프를 친수성 및 소수성 네오에피토프 교대로 배열할 수도 있다.

또한, GC가 풍부한 네오에피토프는 GC 클러스터를 피할 수 있도록 이격시켜야 하며, GC가 풍부한 네오에피토프를 적어도 하나의 소단위로 이격시키는 것이 바람직하다.

제2 링커는 비면역원성으로 고안되고 바람직하게는 가요성 링커이기도 하며, 이로써 항원 단위 내에 존재하는 다수의 항원 소단위에도 불구하고 종양 네오에피토프가 T 세포에 최적의 방식으로 제시된다. 바람직하게는, 가요성을 확보하기 위하여 제2 링커의 길이는 4 내지 20 개의 아미노산이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 제2 링커의 길이는 8 내지 20 개의 아미노산, 예컨대 8 내지 15 개의 아미노산, 예컨대 8 내지 12 개의 아미노산, 또는 예컨대 10 내지 15 개의 아미노산이다. 특정 구현예에서, 제2 링커의 길이는 10 개의 아미노산이다.

특정 구현예에서, 본 발명의 백신은 10 개의 네오에피토프를 포함하며, 여기서 제2 링커의 길이는 8 내지 20 개의 아미노산, 예컨대 8 내지 15 개의 아미노산, 예컨대 8 내지 12 개의 아미노산, 또는 예컨대 10 내지 15 개의 아미노산이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 백신은 10 개의 네오에피토프를 포함하고, 여기서 제2 링커의 길이는 10 개의 아미노산이다.

제2 링커는 바람직하게는 모든 항원 소단위에서 동일하다. 그러나, 하나 이상의 네오에피토프가 링커와 유사한 아미노산 모티프를 포함하고 있다면, 인접하고 있는 제2 링커를 상이한 서열의 제2 링커로 치환하는 것이 유리할 수 있다. 또한, 네오에피토프-제2 링커 접합이 그 자체로 에피토프를 구성하는 것으로 예측된다면, 상이한 서열의 제2 링커를 사용할 수도 있다.

제2 링커는 바람직하게는 세린-글리신 링커, 예컨대 가요성 GGGGS 링커, 예컨대 GGGSS, GGGSG, GGGGS, 또는 이들의 다양한 변형, 예컨대 GGGGSGGGGS 또는 (GGGGS)_m, (GGGSS)_m, (GGGSG)_m이며, 여기서 m은 1 내지 5, 1 내지 4, 또는 1 내지 3의 정수이다. 바람직한 구현예에서, m은 2이다.

바람직한 구현예에서, 세린-글리신 링커는 하나 이상의 류신 (L), 예컨대 2 개 또는 3 개 이상의 류신을 더 포함한다. 세린-글리신 링커는, 예컨대 1, 2, 3 또는 4 개의 류신을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 세린-글리신 링커는 1 개의 류신 또는 2 개의 류신을 포함한다.

한 구현예에서, 제2 링커는 서열 LGGGS, GLGGS, GGLGS, GGGLS 또는 GGGGL을 포함하거나 이로 구성된다. 또 다른 구현예에서, 제2 링커는 서열 LGGSG, GLGSG, GGLSG, GGGLG 또는 GGGSL을 포함하거나 이로 구성된다. 또 다른 구현예에서, 제2 링커는 서열 LGGSS, GLGSS, GGLSS, GGGLS 또는 GGGSL을 포함하거나 이로 구성된다.

또 다른 구현예에서, 제2 링커는 서열 LGLGS, GLGLS, GLLGS, LGGLS 또는 GLGGL을 포함하거나 이로 구성된다. 또 다른 구현예에서, 제2 링커는 서열 LGLSG, GLLSG, GGLSL, GGLLG 또는 GLGSL을 포함하거나 이로 구성된다. 또 다른 구현예에서, 제2 링커는 서열 LGLSS, GLGLS, GGLLS, GLGSL 또는 GLGSL을 포함하거나 이로 구성된다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 제2 세린-글리신 링커의 길이는 10 개의 아미노산이며, 1 개의 류신 또는 2 개의 류신을 포함한다.

한 구현예에서, 제2 링커는 서열 LGGGSGGGGS, GLGGSGGGGS, GGLGSGGGGS, GGGLSGGGGS 또는 GGGGLGGGGS를 포함하거나 이로 구성된다. 또 다른 구현예에서, 제2 링커는 서열 LGGSGGGGSG, GLGSGGGGSG, GGLSGGGGSG, GGGLGGGGSG 또는 GGGSLGGGSG를 포함하거나 이로 구성된다. 또 다른 구현예에서, 제2 링커는 서열 LGGSSGGGSS, GLGSSGGGSS, GGLSSGGGSS, GGGLSGGGSS 또는 GGGSLGGGSS 를 포함하거나 이로 구성된다.

또 다른 구현예에서, 제2 링커는 서열 LGGGSLGGGS, GLGGSGLGGS, GGLGSGGLGS, GGGLSGGGLS 또는 GGGGLGGGGL을 포함하거나 이로 구성된다. 또 다른 구현예에서, 제2 링커는 서열 LGGSGLGGSG, GLGSGGLGSG, GGLSGGGLSG, GGGLGGGGLG 또는 GGGSLGGGSL을 포함하거나 이로 구성된다. 또 다른 구현예에서, 제2 링커는 서열 LGGSSLGGSS, GLGSSGLGSS, GGLSSGGLSS, GGGLSGGGLS 또는 GGGSLGGGSL을 포함하거나 이로 구성된다.

바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 백신은 10 개의 아미노산 링커에 의해 분리된 적어도 10 개의 네오에피토프를 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 백신은 10 개의 아미노산 링커에 의해 분리된 적어도 15 개의 네오에피토프, 예컨대 10 개의 아미노산 링커에 의해 분리된 적어도 20 개의 네오에피토프를 포함한다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 백신은 제2 링커에 의해 분리된 10 내지 20, 또는 10 내지 25 개의 네오에피토프를 포함한다. 바람직하게는, 상기 제2 링커는 10 개의 아미노산이다. 제2 링커는 또한 본원에서 상기 정의된 바와 같이 임의의 길이, 예컨대 8 내지 12 개의 아미노산을 가질 수 있다.

대안적인 링커들은 GSAT 링커 및 SEG 링커, 또는 이들의 다양한 변형으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

타겟팅 단위

타겟팅 단위로 인하여, 본 발명의 폴리펩티드/다이머 단백질은 수지상 세포 (DCs), 호중구 및 기타 면역 세포를 끌어당긴다. 따라서, 타겟팅 모듈을 포함하는 폴리펩티드/다이머 단백질은 항원을 특정 세포로 타겟팅할 뿐만 아니라, 특정 면역 세포를 백신의 투여 부위에 모집함으로써 반응-증폭 효과 (보조 효과)를 촉진하기도 한다. 이 독특한 메커니즘은 백신 자체가 보조 효과를 제공하기 때문에, 환자들이 어떠한 추가적인 보조제 없이 백신을 접종받을 수 있는 임상 환경에서 매우 중요하다.

본원에 사용된 용어 "타겟팅 단위"는 CD4+ T 세포에 대한 MHC 클래스 II-제한된 제시를 위하여, 또는 MHC 클래스 I 제한에 의해 CD8+ T 세포에 교차 제시를 제공하기 위하여, 폴리펩티드/단백질을 그의 항원과 함께 항원 제시 세포에 전달하는 단위를 지칭한다.

타겟팅 단위는 다이머화 단위를 통해 항원 단위에 연결되고, 여기서 항원 단위는 폴리펩티드/다이머 단백질의 COOH-말단 또는 NH2-말단 중 어느 하나에 존재한다. 바람직하게는, 항원 단위는 폴리펩티드/다이머 단백질의 COOH-말단에 존재한다.

타겟팅 단위는 본 발명의 폴리펩티드/다이머 단백질을 관련 항원 제시 세포상에 발현된 표면 분자, 예컨대 수지상 세포 (DC)의 서브 세트에서 독점적으로 발현된 분자에 타겟팅하도록 고안되었다.

APC상의 이러한 표적 표면 분자의 예시로는 인간 백혈구 항원 (HLA), 분화 클러스터 14 (CD14), 분화 클러스터 40 (CD40), 케모카인 수용체 및 톨 유사 수용체 (Toll-like receptor; TLR)가 있다. HLA는 인간의 주요 조직 적합성 복합체 (MHC)이다. 톨 유사 수용체는 예컨대, TLR-2, TLR-4 및/또는 TLR-5를 포함할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드/다이머 단백질은 예를 들어, CD14, CD40 또는 톨 유사 수용체; 리간드, 예컨대 가용성 CD40 리간드; 케모카인 등의 천연 리간드, 예컨대 RANTES 또는 MIP-1a; 또는 박테리아 항원, 예컨대 플라젤린 (flagellin)에 대한 특이성을 갖는 항체 결합 영역을 포함하는 타겟팅 단위에 의해 상기 표면 분자를 타겟팅할 수 있다.

한 구현예에서, 타겟팅 단위는 MHC 클래스 II 단백질에 대한 친화성을 가진다. 따라서, 한 구현예에서, 타겟팅 단위를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은, 항-HLA-DP, 항-HLA-DR 및 항-HLA-II로 이루어진 군으로부터 선택되는 MHC 클래스 II 단백질에 대한 특이성을 갖는 항체 가변 도메인 (VL 및 VH)를 코딩한다.

또 다른 구현예에서, 타겟팅 단위는 CD40, TLR-2, TLR-4 및 TLR-5로 이루어진 군으로부터 선택되는 표면 분자에 대한 친화성을 가진다. 따라서, 한 구현예에서 타겟팅 단위를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은, 항-CD40, 항-TLR-2, 항-TLR-4 및 항-TLR-5에 특이성을 갖는 항체 가변 도메인 (VL 및 VH)를 코딩한다. 한 구현예에서, 타겟팅 단위를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 플라젤린을 코딩한다. 플라젤린은 TLR-5에 대한 친화성을 가진다.

바람직하게는, 타겟팅 단위는 CCR1, CCR3 및 CCR5 중에서 선택되는 케모카인 수용체에 대한 친화성을 가진다. 더 바람직하게는, 타겟팅 단위를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 케모카인 hMIP-1알파 (LD78베타)를 코딩하며, 이는 APC의 세포 표면상에 발현된 그의 동족 수용체인 CCR1, CCR3 및 CCR5에 결합한다.

본 발명의 폴리펩티드/다이머 단백질과 그의 동족 수용체의 결합은 APC에서의 내재화, 및 MHC 분자상에 로딩되고 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 제시되어 종양 특이적 면역 반응을 유도하는 작은 펩티드로의 단백질의 분해를 일으킨다. 자극을 받은 후 활성화된 CD4+ T 세포의 도움을 받으면, CD8+ T 세포는 동일한 신생항원을 발현하는 종양 세포를 타겟팅하여 죽일 것이다.

본 발명의 한 구현예에서, 타겟팅 단위는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 24-93과 서열 동일성이 80% 이상인 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 타겟팅 단위는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 24-93과 서열 동일성이 85% 이상, 예컨대 86% 이상, 예컨대 87% 이상, 예컨대 88% 이상, 예컨대 89% 이상, 예컨대 90% 이상, 예컨대 91% 이상, 예컨대 92% 이상, 예컨대 93% 이상, 예컨대 94% 이상, 예컨대 95% 이상, 예컨대 96% 이상, 예컨대 97% 이상, 예컨대 98% 이상, 예컨대 99% 이상인 아미노산 서열을 포함한다.

더 바람직한 구현예에서, 타겟팅 단위는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 24-93과 서열 동일성이 80% 이상인 아미노산 서열로 구성되며, 예컨대 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 24-93과 서열 동일성이 85% 이상, 예컨대 86% 이상, 예컨대 87% 이상, 예컨대 88% 이상, 예컨대 89% 이상, 예컨대 90% 이상, 예컨대 91% 이상, 예컨대 92% 이상, 예컨대 93% 이상, 예컨대 94% 이상, 예컨대 95% 이상, 예컨대 96% 이상, 예컨대 97% 이상, 예컨대 98% 이상, 예컨대 99% 이상, 예컨대 100% 이상인 아미노산 서열로 구성된다.

다이머화 단위

본원에서 사용된 용어 "다이머화 단위"는 항원 단위와 타겟팅 단위 사이의 아미노산 서열을 지칭한다. 따라서, 다이머화 단위는 항원 단위와 타겟팅 단위를 연결하는 역할을 하고, 2 개의 모노머 폴리펩티드의 다이머 단백질로의 다이머화를 용이하게 한다. 또한, 다이머화 단위는 타겟팅 단위를 항원 제시 세포 (APCs)상의 표면 분자들에, 이들이 가변 거리에 위치하더라도, 최적으로 결합시킬 수 있도록 폴리펩티드/다이머 단백질에 가요성을 제공한다. 다이머화 단위는 이러한 요구 사항을 충족하는 임의의 단위일 수 있다.

따라서, 한 구현예에서, 다이머화 단위는 힌지 영역 (hinge region) 및 선택적으로 다이머화를 용이하게 하는 또 다른 도메인을 포함할 수 있고, 힌지 영역 및 다른 도메인은 제3 링커를 통해 연결될 수 있다.

용어 "힌지 영역"은 다이머화를 용이하게 하는 다이머 단백질의 펩티드 서열을 지칭한다. 힌지 영역은 단위들 사이의 가요성 스페이서로서 기능하여, 2 개의 타겟팅 단위가 APC상의 2 개의 표적 분자들에, 이들이 가변 거리로 발현되더라도, 동시에 결합할 수 있도록 한다. 힌지 영역은 Ig 유래, 예컨대 IgG3로부터 유래된 것일 수 있다. 힌지 영역은 공유 결합(들), 예컨대 이황화 브릿지(들)의 형성을 통해 다이머화에 기여할 수 있다. 따라서, 한 구현예에서, 힌지 영역은 하나 이상의 공유 결합을 형성하는 능력을 갖는다. 공유 결합은 예컨대, 이황화 브릿지일 수 있다.

한 구현예에서, 다이머화를 용이하게 하는 다른 도메인은 면역 글로불린 도메인, 예컨대 카복시 말단 C 도메인, 또는 C 도메인이나 그의 변이체와 실질적으로 동일한 서열이다. 바람직하게는, 다이머화를 용이하게 하는 다른 도메인은 IgG로부터 유래된 카복시 말단 C 도메인이다.

면역 글로불린 도메인은 비공유 상호 작용, 예컨대 소수성 상호 작용을 통해 다이머화에 기여한다. 예를 들어, 면역 글로불린 도메인은 비공유 상호 작용을 통해 다이머를 형성하는 능력을 갖는다. 바람직하게는, 비공유 상호 작용은 소수성 상호 작용이다.

바람직하게는, 다이머화 단위는 CH2 도메인을 포함하지 않는다.

바람직한 구현예에서, 다이머화 단위는 인간 IgG3의 CH3 도메인에 제3 링커를 통해 연결된 힌지 엑손 h1 및 h4로 구성된다.

본 발명의 한 구현예에서, 다이머화 단위는 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열 94-237과 서열 동일성이 80% 이상인 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 다이머화 단위는 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열 94-237과 서열 동일성이 85% 이상, 예컨대 86% 이상, 예컨대 87% 이상, 예컨대 88% 이상, 예컨대 89% 이상, 예컨대 90% 이상, 예컨대 91% 이상, 예컨대 92% 이상, 예컨대 93% 이상, 예컨대 94% 이상, 예컨대 95% 이상, 예컨대 96% 이상, 예컨대 97% 이상, 예컨대 98% 이상, 예컨대 99% 이상인 아미노산 서열을 포함한다.

더 바람직한 구현예에서, 다이머화 단위는 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열 94-237과 서열 동일성이 80% 이상인 아미노산 서열로 구성되며, 예컨대 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열 94-237과 서열 동일성이 85% 이상, 예컨대 86% 이상, 예컨대 87% 이상, 예컨대 88% 이상, 예컨대 89% 이상, 예컨대 90% 이상, 예컨대 91% 이상, 예컨대 92% 이상, 예컨대 93% 이상, 예컨대 94% 이상, 예컨대 95% 이상, 예컨대 96% 이상, 예컨대 97% 이상, 예컨대 98% 이상, 예컨대 99% 이상, 예컨대 100% 이상인 아미노산 서열로 구성된다.

한 구현예에서, 제3 링커는 G3S2G3SG 링커이다.

다이머화 단위는 항원 단위 및 타겟팅 단위에 대하여 임의의 배향을 가질 수 있음을 이해하여야 한다. 한 구현예에서, 항원 단위는 다이머화 단위의 COOH-말단 끝에 존재하고, 타겟팅 단위는 다이머화 단위의 N-말단 끝에 존재한다. 또 다른 구현예에서, 항원 단위는 다이머화 단위의 N-말단 끝에 존재하고, 타겟팅 단위는 다이머화 단위의 COOH-말단 끝에 존재한다. 바람직하게는, 항원 단위는 다이머화 단위의 COOH-말단에 존재한다.

제1 링커

바람직하게는, 항원 단위와 다이머화 단위는 제1 링커를 통해 연결된다. 제1 링커는 폴리뉴클레오티드의 구축을 용이하게 하도록 제한 부위를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 제1 링커는 GLGGL 링커 또는 GLSGL 링커이다.

신호 펩티드

바람직한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 신호 펩티드는 본 발명의 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션된 세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드의 분비를 허용하도록 구축된다.

임의의 적절한 신호 펩티드를 사용할 수 있다. 적절한 펩티드의 예시로는 SEQ ID NO: 31 등의 Ig VH 신호 펩티드, SEQ ID NO: 32 등의 인간 TPA 신호 펩티드, 및 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 1-23과 서열 동일성이 80% 이상인 아미노산 서열을 포함하는 신호 펩티드가 있다.

바람직한 구현예에서, 신호 펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 1-23과 서열 동일성이 85% 이상, 예컨대 86% 이상, 예컨대 87% 이상, 예컨대 88% 이상, 예컨대 89% 이상, 예컨대 90% 이상, 예컨대 91% 이상, 예컨대 92% 이상, 예컨대 93% 이상, 예컨대 94% 이상, 예컨대 95% 이상, 예컨대 96% 이상, 예컨대 97% 이상, 예컨대 98% 이상, 예컨대 99% 이상, 예컨대 100% 이상인 아미노산 서열을 포함한다.

더 바람직한 구현예에서, 신호 펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 1-23과 서열 동일성이 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 예컨대 86% 이상, 예컨대 87% 이상, 예컨대 88% 이상, 예컨대 89% 이상, 예컨대 90% 이상, 예컨대 91% 이상, 예컨대 92% 이상, 예컨대 93% 이상, 예컨대 94% 이상, 예컨대 95% 이상, 예컨대 96% 이상, 예컨대 97% 이상, 예컨대 98% 이상, 예컨대 99% 이상, 예컨대 100% 이상인 아미노산 서열로 구성된다.

서열 동일성

서열 동일성은 다음과 같이 결정될 수 있다: 높은 수준의 서열 동일성은 제1 서열이 제2 서열로부터 유래되었을 가능성을 나타낸다. 아미노산의 서열 동일성은 두 정렬된 서열 간의 아미노산 서열이 동일할 것을 요한다. 따라서, 기준 서열과 70%의 아미노산 동일성을 공유하는 후보 서열은, 정렬 후, 후보 서열의 아미노산의 70%가 기준 서열의 상응하는 아미노산과 동일할 것을 요한다. 동일성은 컴퓨터 분석, 예컨대 제한 없이, ClustalW 컴퓨터 정렬 프로그램 (Higgins D., Thompson J., Gibson T., Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J., 1994. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22:4673-4680) 및 그 안에 제안된 디폴트 파라미터의 도움으로 측정될 수 있다. 이 프로그램을 디폴트 설정으로 사용하면, 쿼리 및 기준 폴리펩티드의 성숙 (생체 활성) 부분이 정렬된다. 온전히 보존된 잔기의 수를 세어 기준 폴리펩티드의 길이로 나눈다. 그렇게 함에 있어서, 쿼리 서열의 일부를 형성하는 융합 단백질 서열 또는 임의의 태그는, 서열 동일성의 정렬 및 후속의 측정에서 무시된다.

ClustalW 알고리즘은 뉴클레오티드 서열을 정렬하는 데 유사하게 사용될 수 있다. 서열 동일성은 아미노산 서열에 대해 지시된 것과 유사한 방식으로 계산될 수 있다.

서열의 비교에 이용되는 수학적 알고리즘의 또 다른 바람직한, 비제한적인 예시로는 Myers and Miller, CABIOS (1989)의 알고리즘이 있다. 이러한 알고리즘은 FASTA 서열 정렬 소프트웨어 패키지 (Pearson WR, Methods Mol Biol, 2000, 132:185-219)의 일부인 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 통합된다. Align은 글로벌 정렬에 기반하여 서열 동일성을 계산한다. Align0은 서열의 말단에 존재하는 갭에 페널라이징하지 않는다. 아미노산 서열을 비교하기 위하여 ALIGN 또는 Align0 프로그램을 이용할 때, 갭 오프닝/연장 페널티가 -12/-2인 BLOSUM50 치환 매트릭스가 사용되는 것이 바람직하다.

폴리뉴클레오티드

본 발명은 또한 전술한 바와 같은 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드는 DNA 뉴클레오티드 서열 또는 RNA 뉴클레오티드 서열, 예컨대 게놈 DNA, cDNA 및 RNA 서열 (이중 가닥 또는 단일 가닥)을 포함할 수 있다.

바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 종에 대하여 최적화되어 본 발명에 따른 폴리펩티드를 발현하며, 즉, 바람직하게는 폴리뉴클레오티드 서열은 인간 코돈 최적화된 것이다.

폴리펩티드 및 다이머 단백질

본 발명은 또한 상기 정의된 폴리뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩되는 폴리펩티드에 관한 것이다. 폴리펩티드는 본 발명에 따른 백신의 제조를 위하여 시험관 내에서 발현될 수 있거나, 또는 폴리펩티드는 상기 정의된 폴리뉴클레오티드의 투여의 결과로서 생체 내에서 발현될 수 있다.

다이머화 단위의 존재로 인하여, 폴리펩티드가 발현될 때 다이머 단백질이 형성된다. 다이머 단백질은 2 개의 폴리펩티드 사슬이 동일하고 결과적으로 동일한 네오에피토프를 포함하는 호모다이머일 수 있거나, 또는 다이머 단백질은 항원 단위로 코딩된 2 개의 상이한 모노머 폴리펩티드를 포함하는 헤테로다이머일 수 있다. 후자는 네오에피토프의 양이 항원 단위에 대해 크기 상한을 초과하는 경우 관련될 수 있다. 그러나, 다이머 단백질은 호모다이머 단백질인 것이 바람직하다.

벡터

또한, 본 발명은 상기 정의된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 바람직하게는, 벡터는 전술한 다양한 단위, 특히 항원 단위의 용이한 교환을 가능하게 한다. 특히, 발현 벡터는 pUMVC4a 벡터 또는 NTC9385R 벡터 백본일 수 있다. 항원 단위는, 5' 부위는 GLGGL/GLSGL 링커에 통합되고 3' 부위는 벡터 내 종결 코돈 다음으로 포함된 SfiI 제한 효소 카세트에 의하여 절단된 항원 단위 카세트로 교환될 수 있다.

숙주 세포

본 발명은 또한 상기 정의된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 본 발명에 따른 폴리펩티드의 발현을 위한 상기 정의된 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.

적절한 숙주 세포는 원핵 생물, 효모, 곤충 또는 고등 진핵 세포를 포함한다.

백신의 제조 방법

바람직하게는, 본 발명에 따른 백신은 신생항원이 환자의 종양에서 동정되고, 이에 따라 백신이 환자의 종양 내의 특정 돌연변이된 단백질을 정확하게 향한다는 점에서 개인화된 백신이다.

따라서, 한 측면에서, 본 발명은 다이머 단백질, 또는 폴리펩티드의 면역학적 유효량을 시험관 내에서 제조함으로써 상기 정의된 폴리펩티드를 포함하는 백신의 제조 방법에 관한 것이다. 폴리펩티드 및 단백질의 시험관 내 합성은 통상의 기술자에게 공지된 임의의 적절한 방법, 예컨대 펩티드 합성 또는 다양한 발현 시스템 중 어느 하나에서의 폴리펩티드의 발현 후 정제를 통해 수행될 수 있다. 따라서, 한 구현예에서, 본 발명은

a) 상기 정의된 폴리뉴클레오티드를 세포 집단 내에 트랜스펙션시키는 단계;

b) 상기 세포 집단을 배양하는 단계;

c) 상기 다이머 단백질 또는 세포 집단으로부터 발현된 폴리펩티드를 수집 및 정제하는 단계; 및

d) 단계 c)에서 수득된 다이머 단백질 또는 폴리펩티드를 약학적으로 허용 가능한 담체와 혼합함으로써 백신을 수득하는 단계를 포함한다.

바람직한 구현예에서, 단계 c)에서 수득된 다이머 단백질 또는 폴리펩티드는 상기 약학적으로 허용 가능한 담체에 용해된다.

또한, 보조제 또는 완충제를 상기 백신에 첨가할 수 있다.

정제는 크로마토그래피, 원심 분리 또는 차등 용해도와 같은 임의의 적절한 방법에 따라 수행될 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 정의된 폴리뉴클레오티드의 면역학적 유효량을 포함하는 백신의 제조 방법에 관한 것이다. 한 구현예에서, 상기 방법은

a. 상기 정의된 폴리뉴클레오티드를 제조하는 단계;

b. 단계 a)에서 수득된 폴리뉴클레오티드를 약학적으로 허용 가능한 담체와 혼합함으로써 백신을 수득하는 단계를 포함한다.

폴리뉴클레오티드는 통상의 기술자에게 공지된 임의의 적절한 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 올리고 뉴클레오티드 합성기를 사용하는 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다.

특히, 더 작은 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 타겟팅 단위, 다이머화 단위 및/또는 항원 단위의 소단위를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은, 개별적으로 합성된 후 벡터 백본으로 최종 폴리뉴클레오티드를 제조하도록 결찰될 수 있다.

개인화된 백신의 고안을 위하여, 상기 방법은 폴리뉴클레오티드에 포함될 네오에피토프를 동정하는 방법으로 선행된다.

바람직하게는, 이 방법은

- 게놈 또는 종양의 엑솜을 시퀀싱하는 단계

- 상기 종양으로부터의 네오에피토프를 포함하는 종양 신생항원을 동정하는 단계,

- 예측 항원성에 기초하여 네오에피토프를 선택하는 단계를 포함한다.

종양 또는 종양 부분은 임의의 적절한 방법, 예컨대 종양의 생검을 얻거나 종양의 절제에 의하거나, 또는 임의의 적절한 체액, 예컨대 혈액 샘플이나 소변 샘플로부터 유래될 수 있다.

종양 게놈 또는 엑솜의 시퀀싱

게놈 또는 엑솜, 즉 게놈의 코딩 부분을 전체 엑솜 시퀀싱과 같은 임의의 적절한 방법을 사용하여 시퀀싱할 수 있다. 특히 시퀀서는 Paired-end 2x100-125 또는 PE100-125 (리드 길이), 멀티플렉스를 사용하는 Illumina HiSeq2500일 수 있다.

종양 항원의 동정

일단 종양 특이적 돌연변이를 동정하면, 다음 단계는 네오에피토프를 포함하는 예측 항원성 펩티드를 선택하는 것이다.

종양과 정상 조직을 시퀀싱하여 종양 돌연변이를 발견하고 수득된 서열을 비교한다. 개개인의 DNA 또는 RNA 내 특정 돌연변이 또는 대립 유전자의 존재를 검출하기 위한 다양한 방법이 이용 가능하다. 예를 들어, 동적 대립 형질 특이적 혼성화 (dynamic allele- specific hybridization; DASH), 마이크로플레이트 어레이 대각선 겔 전기 영동 (microplate array diagonal gel electrophoresis; MADGE), 파이로 시퀀싱 (pyrosequencing), 올리고 뉴클레오티드 특이적 결찰 (oligonucleotide- specific ligation), TaqMan 시스템 및 Affymetrix SNP 칩 등의 다양한 DNA "칩" 기술을 비롯한 기술들이 적용될 수 있다.

또는, 직접적 단백질 시퀀싱 (direct protein sequencing)에 의하여 돌연변이를 동정하는 방법이 수행될 수 있다.

종양 엑솜 내 아마도 수백 또는 수천 개의 돌연변이 중에서, 네오에피토프를 예측 HLA-결합 알고리즘을 기반으로 인실리코 (in silico) 선택한다. 이는 모든 관련 네오에피토프를 동정하고, 랭킹 또는 스코어를 매긴 후 문제의 특정 환자용 백신에 포함시킬 네오에피토프를 결정하고자 하는 것이다.

적절한 알고리즘, 예컨대 다음 중 하나를 사용할 수 있다:

펩티드-MHC 결합에 대하여 이용 가능한 프리 소프트웨어 분석 (IEDB 및 NetMHC)은 다음의 웹사이트에서 다운로드할 수 있다:

http://www.iedb.org/

http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/

백신 고안을 위한 최적의 펩티드를 예측하기 위해 상업적으로 이용 가능한 고급 소프트웨어는 다음에서 찾을 수 있다:

http://www.oncoimmunity.com/

https://omictools.com/t-cell-epitopes-category

https://github.com/griffithlab/pVAC-Seq

http://crdd.osdd.net/raghava/cancertope/help.php

http://www.epivax.com/tag/neoantigen/

각 돌연변이는 그 항원성에 대하여 스코어가 매겨지며, 가장 항원성인 네오에피토프가 선택되어 폴리뉴클레오티드 내에서 최적으로 고안된다. 전술한 바와 같이, 3 내지 50 개의 네오에피토프가 본 발명에 따라 바람직하다.

백신

이어서 최종 백신은 다음 중 하나를 포함하도록 제조된다:

- 상기 정의된 폴리뉴클레오티드

- 상기 정의된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드

- 폴리펩티드 사슬들을 포함하는 다이머 단백질

백신은 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 보조제 또는 완충제를 추가로 포함할 수 있다.

약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 및 완충제는 생리 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올, 멸균 등장성 수성 완충제 및 이들의 조합을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

특히 폴리펩티드/단백질을 포함하는 백신의 경우, 약학적으로 허용 가능한 보조제는 폴리-ICLC, 1018 ISS, 알루미늄 염, Amplivax, AS 15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, GM-CSF, IC30, IC31, Imiquimod, ImuFact EV1P321, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, Juvlmmune, LipoVac, MF59, 모노포스포릴 지질 A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, PepTel.RTM, 벡터 시스템, PLGA 미립자, resiquimod, SRL172, Virosomes 및 기타 바이러스-유사 입자, YF-17D, VEGF 트랩, R848, 베타-글루칸, Pam3Cys, Aquila's QS21 stimulon, 바디메잔 (vadimezan) 및/또는 AsA404 (DMXAA)를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

특히, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백신의 경우, 담체는 세포의 트랜스펙션을 용이하게 하는 분자를 포함할 수 있고, 보조제는 면역 반응을 증강시키기 위하여 케모카인 또는 사이토카인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 플라스미드를 포함할 수 있다.

백신을 피내 또는 근내 주입용 액상 제제와 같은 임의의 적절한 제제로 제형화한다.

투여

백신을 폴리펩티드/단백질 백신 또는 폴리뉴클레오티드 백신에 대한 임의의 적절한 방법으로 투여할 수 있으며, 예컨대 피내, 근내, 피하 주입에 의하여 투여하거나, 또는 점막이나 상피 적용에 의하여, 예컨대 비강내, 구강내, 장관내 또는 방광에 투여할 수 있다.

특히, 백신이 폴리뉴클레오티드 백신일 때, 백신을 근내 또는 피내 투여하는 것이 바람직하다.

특정 구현예에서, 백신을 절내 주입 (intranodal injection)의 방법으로 투여한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "절내 주입"은 백신을 림프절 내에 주입하는 것을 의미한다.

치료

폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및 다이머 단백질은 암 치료용인 것이 바람직하며, 전술한 바와 같이 백신으로 제형화된다. 본원에 기술된 방법에 의하여, 환자의 종양에 존재하는 임의의 돌연변이를 검사하고, 백신을 제조한 후, 그 또는 그녀의 종양에 존재하는 신생항원에 정확하게 향하는 백신으로 환자를 면역화함으로써, 암을 앓고 있는 환자를 치료할 수 있다. 오늘날 시퀀싱, 에피토프-결정 및 뉴클레오티드 서열 생성을 위한 빠르고 믿을 수 있는 방법으로 인하여, 환자는 종양 절제 후 12 주 이내에 백신을 접종 받을 수 있다.

상기 암은 암 세포가 돌연변이를 포함하는 것인 임의의 암일 수 있다. 암은 원발성 종양, 전이 또는 둘 다일 수 있다. 돌연변이 검사된 종양은 원발성 종양 또는 전이일 수 있다. 치료받을 암은 특히 돌연변이 로드가 높은 것으로 알려진 암, 예컨대 흑색종, 폐암, 유방암, 전립선암 또는 결장암이다.

바람직한 구현예에서, 치료는 전술한 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백신으로 수행되며, 여기서 예컨대 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA이다.

폴리뉴클레오티드 백신을 큰 근육, 예컨대 어깨, 엉덩이 또는 허벅지 내에 근내 주입하는 것이 바람직하다. 폴리펩티드는 국부적으로 생성되고, 관련 면역 세포는 본질적으로 생성 부위에서 폴리펩티드/단백질을 내재화시키며, 실질적으로 폴리펩티드 또는 단백질은 혈류에 도달하지 않는다는 사실이 밝혀졌다.

제트 인젝터를 사용하거나, 일렉트로포레이션의 보조를 받는 등, 임의의 적절한 방법을 사용하여 폴리뉴클레오티드를 주입할 수 있다.

투여 요법

백신을 단일 투여량으로 투여하거나, 반복 투여할 수 있다. 백신 투여를 반복하는 경우, T 세포의 소진을 피하기 위하여 적어도 3 주 간격으로 투여하는 것이 바람직하다.

따라서, 한 구현예에서, 투여 요법은 0, 3, 6 주에, 이후에는 4 주에 한 번씩 환자가 임상적 이점을 가지는 한 백신 접종하는 것이 될 것이다. 백신을 1 년 이상 동안 투여할 수 있다.

백신은 면역학적 유효량으로 투여된다. "면역학적 유효량"은 종양 감소 효과를 확립하기 위해 필요한 백신의 양을 의미한다. 결국, 의사는 일반적으로 DNA 백신의 경우 0.3-6 mg의 범위에서, 폴리펩티드/단백질 백신의 경우 5 μg-5 mg의 범위에서 투여량을 결정한다.

조합 치료

본 발명에 따른 백신 치료는 방사선 요법, 화학 요법 및 외과 치료와 같은 임의의 다른 항암 치료와 조합될 수 있다.

본 발명에 따른 백신 치료는 체크 포인트-차단 억제제 치료 (checkpoint-blockade inhibitor treatment)와 조합될 수도 있다.

구체적인 구현예들

1. 치료적 항암 네오에피토프 백신으로서,

o 타겟팅 단위

o 다이머화 단위

o 제1 링커

또는

의 면역학적 유효량을 포함하는 것인 치료적 항암 네오에피토프 백신.

2. 구현예 1에 있어서, 상기 항원 단위는 각 암 네오에피토프의 하나의 복제본을 포함하는 것인 백신.

3. 구현예 1에 있어서, 상기 항원 단위는 적어도 하나의 네오에피토프의 복제본을 둘 이상 포함하는 것인 백신.

4. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 암 네오에피토프 서열의 길이는 7 내지 30 개의 아미노산인 것인 백신.

5. 구현예 4에 있어서, 상기 암 네오에피토프 서열의 길이는 7 내지 10 개의 아미노산인 것인 백신.

6. 구현예 4에 있어서, 상기 암 네오에피토프 서열의 길이는 13 내지 30 개의 아미노산인 것인 백신.

7. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 각 암 네오에피토프 서열의 길이는 동일한 것인 백신.

8. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 암 네오에피토프는 본질적으로 암 네오에피토프 서열의 중간에 위치하는 것인 백신.

9. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 암 네오에피토프 서열은 암 신생항원의 하위 서열인 것인 백신.

10. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 항원 소단위는 제1 링커에서부터, 큰 항원성에서 작은 항원성의 순서로 배열된 것인 백신.

11. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 가장 소수성인 항원 소단위(들)은 실질적으로 항원 단위의 중간에 위치하고, 가장 친수성인 항원 소단위(들)은 항원 단위의 말단에 위치하는 것인 백신.

12. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 링커는 가요성 링커인 것인 백신.

13. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 링커는 비면역원성인 것인 백신.

14. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 링커는 모든 항원 소단위에서 동일한 것인 백신.

15. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 링커는 세린-글리신 링커인 것인 백신.

16. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 링커의 길이는 4 내지 20 개의 아미노산인 것인 백신.

17. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 링커의 길이는 10 개의 아미노산인 것인 백신.

18. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 항원 단위의 길이는 약 100 개의 아미노산 내지 약 1000 개의 아미노산인 것인 백신.

19. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 n은 3 내지 30의 정수인 것인 백신.

20. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 다이머화 단위는 경우에 따라 제3 링커를 통해 연결되는, 힌지 영역 및 선택적으로 다이머화를 용이하게 하는 또 다른 도메인을 포함하는 것인 백신.

21. 구현예 20에 있어서, 상기 힌지 영역은 Ig 유래인 것인 백신.

22. 구현예 20 또는 21에 있어서, 상기 힌지 영역은 하나 이상의 공유 결합을 형성하는 능력을 갖는 것인 백신.

23. 구현예 22에 있어서, 상기 공유 결합은 이황화 브릿지인 것인 백신.

24. 구현예 20 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 상기 다이머화를 용이하게 하는 또 다른 도메인은 면역 글로불린 도메인, 바람직하게는 카복시 말단 C 도메인, 또는 상기 C 도메인이나 그의 변이체와 실질적으로 동일한 서열인 것인 백신.

25. 구현예 24에 있어서, 상기 카복시 말단 C 도메인은 IgG로부터 유래된 것인 백신.

26. 구현예 24 또는 25에 있어서, 상기 다이머화 단위의 면역 글로불린 도메인은 호모다이머화하는 능력을 갖는 것인 백신.

27. 구현예 24 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 글로불린 도메인은 비공유 상호 작용을 통해 호모다이머화하는 능력을 갖는 것인 백신.

28. 구현예 27에 있어서, 상기 비공유 상호 작용은 소수성 상호 작용인 것인 백신.

29. 구현예 20 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 상기 다이머화 단위는 CH2 도메인을 포함하지 않는 것인 백신.

30. 구현예 20 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 상기 다이머화 단위는 인간 IgG3의 CH3 도메인에 상기 제3 링커를 통해 연결된 힌지 엑손 h1 및 h4로 구성된 것인 백신.

31. 구현예 20 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 상기 다이머화 단위는 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열 94-237과 서열 동일성이 80% 이상인 아미노산 서열을 포함하는 것인 백신.

32. 구현예 30 또는 31에 있어서, 상기 제3 링커는 G₃S₂G₃SG 링커인 것인 백신.

33. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 항원 단위 및 다이머화 단위는 상기 제1 링커를 통해 연결된 것인 백신.

34. 구현예 33에 있어서, 상기 제1 링커는 제한 부위를 포함하는 것인 백신.

35. 구현예 33 또는 34에 있어서, 상기 제1 링커는 GLGGL 링커 또는 GLSGL 링커인 것인 백신.

36. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 타겟팅 단위는 CCR1, CCR3 및 CCR5 중에서 선택되는 케모카인 수용체에 대한 친화성을 갖는 것인 백신.

37. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 타겟팅 단위는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 24-93과 서열 동일성이 80% 이상인 아미노산 서열을 포함하는 것인 백신.

38. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 타겟팅 단위는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 24-93과 서열 동일성이 85% 이상인 아미노산 서열로 구성된 것인 백신.

39. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열은 신호 펩티드를 추가로 코딩하는 것인 백신.

40. 구현예 39에 있어서, 상기 신호 펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 1-23과 서열 동일성이 80% 이상인 아미노산 서열을 포함하는 것인 백신.

41. 구현예 39 또는 40에 있어서, 상기 신호 펩티드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 1-23과 서열 동일성이 85% 이상인 아미노산 서열로 구성된 것인 백신.

42. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 펩티드 내의 상기 타겟팅 단위, 다이머화 단위 및 항원 단위는 타겟팅 단위, 다이머화 단위 및 항원 단위의 N-말단에서 C-말단의 순서로 존재하는 것인 백신.

43. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 인간 코돈 최적화된 것인 백신.

44. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 DNA 뉴클레오티드 서열 또는 RNA 뉴클레오티드 서열인 것인 백신.

45. 전술한 구현예 중 어느 하나에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 보조제를 추가로 포함하는 것인 백신.

46. 구현예 1 내지 45 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드.

47. 구현예 1 내지 45 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터.

48. 구현예 1 내지 45 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 구현예 47에서 정의된 바와 같은 벡터를 포함하는 숙주 세포.

49. 구현예 46에 있어서, 환자 내 다이머 단백질의 생성을 유도하기 위하여, 상기 환자에게 투여하기 위해 제형화된 것인 폴리뉴클레오티드.

50. 구현예 1 내지 45 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드.

51. 구현예 50에서 정의된 바와 같은 2 개의 폴리펩티드로 구성된 다이머 단백질.

52. 구현예 51에 있어서, 호모다이머 단백질인 것인 다이머 단백질.

53. 약제로서 사용하기 위한, 구현예 50에서 정의된 바와 같은 폴리펩티드, 구현예 51 및 52에서 정의된 바와 같은 다이머 단백질, 또는 구현예 46에서 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드.

54. 구현예 50에서 정의된 바와 같은 다이머 단백질, 또는 구현예 50에서 정의된 바와 같은 폴리펩티드의 면역학적 유효량을 포함하는 백신의 제조 방법으로서,

a) 구현예 46에서 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 세포 집단 내에 트랜스펙션시키는 단계;

b) 상기 세포 집단을 배양하는 단계;

c) 상기 다이머 단백질 또는 세포 집단으로부터 발현된 폴리펩티드를 수집 및 정제하는 단계;

d) 단계 c)에서 수득된 다이머 단백질 또는 폴리펩티드를 약학적으로 허용 가능한 담체와 혼합함으로써 백신을 수득하는 단계를 포함하는 방법.

55. 구현예 46에 따른 폴리뉴클레오티드의 면역학적 유효량을 포함하는 백신의 제조 방법으로서,

A. 구현예 46에 따른 폴리뉴클레오티드를 제조하는 단계;

B. 단계 a)에서 수득된 폴리뉴클레오티드를 약학적으로 허용 가능한 담체와 혼합함으로써 백신을 수득하는 단계를 포함하는 방법.

56. 구현예 55에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드를 제조하는 단계에 선행하여,

- 종양의 엑솜을 시퀀싱하는 단계

- 항원성에 기초하여 네오에피토프를 선택하는 단계를 포함하는 것인 방법.

57. 환자의 암을 치료하는 방법으로서, 환자에게 필요한 경우 구현예 1 내지 45 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 백신을 투여하는 것을 포함하는 방법.

58. 구현예 57에 있어서, 상기 백신은 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 피내 또는 근내 투여되는 것인 방법.

59. 구현예 58에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA인 것인 방법.

60. 구현예 59에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 RNA인 것인 방법.

61. 구현예 57 내지 60 중 어느 하나에 있어서, 상기 투여는 제트 인젝터로 수행되는 것인 방법.

62. 구현예 57 내지 60 중 어느 하나에 있어서, 상기 투여는 일렉트로포레이션에 의해 보조되는 것인 방법.

실시예

실시예 1: 백신의 구축 및 발현.

유전자 서열을 하기 구조에 따라 고안하였다:

전술한 마우스 흑색종 암 세포주 B16-F10과 마우스 결장암 세포주 CT26의 엑솜 시퀀싱 및 RNA 시퀀싱은 수백 내지 수천 종의 종양 특이적 비동의 돌연변이를 밝혀냈다 (Castle et al 2012, Castle et al 2014 and Kreiter et al 2015). 인실리코 기반의 방법들이 잠재적 면역원성 네오에피토프를 동정하기 위하여 사용되었다. 마우스는 돌연변이된 에피토프를 코딩하는 펩티드로 면역화되었으며, 이들의 면역원성은 특이적 T 세포 면역 반응으로 관찰되었다 (ELISpot 분석). 또한, 마우스를 ELISpot로부터 선택된 가장 면역원성인 에피토프로 백신 접종한 경우 강력한 항-종양 활성이 부여되었다 (Castle et al 2012 and Kreiter et al 2015).각 네오에피토프는 가요성 GGGGS 링커에 의해 분리된 27 개 아미노산의 펩티드이다. 짧은 펩티드 (<20 개의 아미노산)가 가공되고 신규 에피토프가 MHC 클래스 I 분자상에 제시될 수 있으며 CD8+ T 세포를 활성화시킬 수 있다. 그러나 바람직하게는, 백신은 CD8+ 및 CD4+ T 세포를 활성화시키고, 이에 따라 긴 펩티드 (>20 개의 아미노산)를 코딩하는 네오에피토프가 선택된다. 이는 효율적인 펩티드 가공과 MHC 클래스 I 및 II 상에서 모두 제시를 가능하게 한다 (Kreiter et al 2015). 초기 두 VB10.NEO-X 컨스트럭트에서 선택된 소수성 및 친수성 네오에피토프는 고르게 분포되어 있다. 27mer 네오에피토프 사이의 중성의 가요성 GGGGS 링커는 결합된 네오에피토프의 접합부에서 새로운 면역원성 에피토프가 생성되는 것을 피하기 위하여 중요하다.

B16-F10 및 CT26 세포주에서 발견된 네오에피토프의 서열을 표 1 및 표 2에 나타냈다.

표 1 - CT26 세포주

돌연변이 번호 폴리펩티드 ( 백시바디 )	유전자	백신 접종에 사용된 돌연변이 서열	Sub.WT, AA#, Mut )	반응성 T 세포 서브유형	MHC I 스코어 (최적 예측)
CT26-PepM1	E2f8	VILPQAPSGPSYATYLQPAQAQMLTPP (SEQ ID NO: 14)	I522T	CD8+	0,1
CT26-PepM2	Aldh18a1	LHSGQNHLKEMAISVLEARACAAAGQS (SEQ ID NO: 15)	P154S
CT26-PepM3	Slc4a3	PLLPFYPPDEALEIGLELNSSALPPTE (SEQ ID NO: 16)	T373I	CD4+	0,9
CT26-PepM4	Nphp3	AGTQCEYWASRALDSEHSIGSMIQLPQ (SEQ ID NO: 17)	G234D	CD4+	0,1
CT26-PepM5	Tdg	AAYKGHHYPGPGNYFWKCLFMSGLSEV (SEQ ID NO: 18)	H169Y	CD4+	0,3
CT26-PepM6	Ubqln1	DTLSAMSNPRAMQVLLQIQQGLQTLAT (SEQ ID NO: 19)	A62V
CT26-PepM7	Slc20a1	DKPLRRNNSYTSYIMAICGMPLDSFRA (SEQ ID NO: 20)	T425I	CD4+	0,3
CT26-PepM8	Dhx35	EVIQTSKYYMRDVIAIESAWLLELAPH (SEQ ID NO: 21)	T646I	CD4+	0,1
CT26-PepM9	Als2	GYISRVTAGKDSYIALVDKNIMGYIAS (SEQ ID NO: 22)	L675I	CD8+	0,2
CT26-PepM10	Agxt2l2	EHIHRAGGLFVADAIQVGFGRIGKHFW (SEQ ID NO: 23)	E247A	CD4+	0,2
CT26-PepM11	Tmem87a	QAIVRGCSMPGPWRSGRLLVSRRWSVE (SEQ ID NO: 50)	G63R	CD8+	0.7
CT26-PepM12	Ppp6r1	DGQLELLAQGALDNALSSMGALHALRP (SEQ ID NO: 51)	D309N	CD4+
CT26-PepM13	Deptor	SHDSRKSTSFMSVNPSKEIKIVSAVRR (SEQ ID NO: 52)	S253N	CD4+	0.3
CT26-PepM14	Nap1l4	HTPSSYIETLPKAIKRRINALKQLQVR (SEQ ID NO: 53)	V63I	CD4+	0.7
CT26-PepM15	Cxcr7	MKAFIFKYSAKTGFTKLIDASRVSETE (SEQ ID NO: 54)	L340F	CD4+	1.8
CT26-PepM16	Dkk2	EGDPCLRSSDCIDEFCCARHFWTKICK (SEQ ID NO: 55)	G192E	CD4+	9.7
CT26-PepM17	Trip12	WKGGPVKIDPLALMQAIERYLVVRGYG (SEQ ID NO: 56)	V1328M	CD8+
CT26-PepM18	Steap2	VTSIPSVSNALNWKEFSFIQSTLGYVA (SEQ ID NO: 57)	R388K	CD4+	6.8
Ct26-PepM19	Gpc1	YRGANLHLEETLAGFWARLLERLFKQL(SEQ ID NO: 58)	E165G	CD8+	1.9
CT26-PepM20	Usp26	KTTLSHTQDSSQSLQSSSDSSKSSRCS (SEQ ID NO: 59)	S715L	n.d.	5.8

표 2 - B16-F10 세포주

돌연변이 번호 폴리펩티드 ( 백시바디 )	유전자	백신 접종에 사용된 돌연변이 서열	Substi . WT,AA #, Mut )	반응성 T 세포 서브유형	MHC I 스코어 (최적 예측)
B16-PepM1	Kif18b	PSKPSFQEFVDWENVSPELNSTDQPFL (SEQ ID NO: 4)	K739N	CD4+	1,2
B16-PepM2	Obsl1	REGVELCPGNKYEMRRHGTTHSLVIHD (SEQ ID NO: 5)	T176M	CD8+	2,3
B16-PepM3	Def8	SHCHWNDLAVIPAGVVHNWDFEPRKVS (SEQ ID NO: 6)	R255G	CD4+	3,8
B16-PepM4	Rpl13a	GRGHLLGRLAAIVGKQVLLGRKVVVVR (SEQ ID NO: 7)	A24G	CD4+	0,5
B16-PepM5	Tubb3	FRRKAFLHWYTGEAMDEMEFTEAESNM (SEQ ID NO: 8)	G402A	CD4+	1,9
B16-PepM6	Tnpo3	VVDRNPQFLDPVLAYLMKGLCEKPLAS (SEQ ID NO: 9)	G504A	CD4+	1
B16-PepM7	Atp11a	SSPDEVALVEGVQSLGFTYLRLKDNYM (SEQ ID NO: 10)	R552S	CD4+	0,1
B16-PepM8	Cpsf3l	EFKHIKAFDRTFANNPGPMVVFATPGM (SEQ ID NO: 11)	D314N	CD4+	0,5
B16-PepM9	Plod1	STANYNTSHLNNDVWQIFENPVDWKEK (SEQ ID NO: 12)	F530V	CD4+	0,1
B16-PepM10	Pbk	DSGSPFPAAVILRDALHMARGLKYLHQ (SEQ ID NO: 13)	V145D	CD8+	0,1
B16-PepM11	Ddx23	ANFESGKHKYRQTAMFTATMPPAVERL (SEQ ID NO: 36)	V602A	CD4+	1,3
B16-PepM12	Actn4	NHSGLVTFQAFIDVMSRETTDTDTADQ (SEQ ID NO: 60)	F835V	CD4+	0.2
B16-PepM13	Tm9sf3	CGTAFFINFIAIYHHASRAIPFGTMVA (SEQ ID NO: 61)	Y382H	CD4+	0.2
B16-PepM14	Eef2	FVVKAYLPVNESFAFTADLRSNTGGQA (SEQ ID NO: 62)	G795A	CD4+	1.1
B16-PepM15	Gnas	TPPPEEAMPFEFNGPAQGDHSQPPLQV (SEQ ID NO: 63)	S111G	CD4+	1.2
B16-PepM16	Asf1b	PKPDFSQLQRNILPSNPRVTRFHINWD (SEQ ID NO: 64)	A141P	CD4+	1.7
B16-PepM17	Mthfd1l	IPSGTTILNCFHDVLSGKLSGGSPGVP (SEQ ID NO: 65)	F294V	CD4+	1.7
B16-PepM18	Sema3b	GFSQPLRRLVLHVVSAAQAERLARAEE (SEQ ID NO: 66)	L663V	CD4+	2.9
B16-PepM19	Mkm1	ECRITSNFVIPSEYWVEEKEEKQKLIQ (SEQ ID NO: 67)	N346Y	CD4+	1.4
B16-PepM20	Ppp1r7	NIEGIDKLTQLKKPFLVNNKINKIENI(SEQ ID NO: 68)	L170P	CD4+	3.2

실시예 2: 3 또는 10 개의 네오에피토프를 포함하는 백시바디의 비교

3 또는 10 개의 네오에피토프를 함유하는 백시바디 백신을 비교하였다. 10 개짜리의 네오에피토프 백시바디 DNA 컨스트럭트에서 처음 3 개의 (N-말단) 펩티드의 위치 및 순서는, 3 개짜리의 네오에피토프 백시바디 DNA 컨스트럭트와 유사하다. 이는 이들 3 개의 네오에피토프의 면역원성을, 이들 3 개의 네오에피토프에 더해 7개의 네오에피토프를 더 함유하는 경우의 면역원성과 비교하기 위함이다.

VB4001 (VB10.NEO CT26-X), VB4002 (VB10.NEO CT26-III), VB4003 (VB10.NEO B16-X) 및 VB4004 (VB10.NEO B16-III)를 백신 후보로 선택하였다. 백시바디의 개략도를 도 1에 나타냈다.

백신 VB4001-VB4021에 사용된 네오에피토프를 아래에 나타냈다. 예를 들어, VB4015는 5 개의 아미노산 링커에 의해 분리된 3 개의 네오에피토프, B16 pepM1+pepM8+pepM3를 포함한다. VB4018은 5 개의 아미노산 링커에 의해 분리된 10 개의 네오에피토프, B16 pepM1+pepM2+pepM3+pepM4+pepM11+pepM6+pepM7+pepM8+pepM9+pepM10의 두 복제본을 포함한다. 네오에피토프 서열을 표 1 및 표 2에 나타냈다.

VB4001 = VB10.NEO CT26-X = CT26 pepM1-M10, 5 aa 링커

VB4002 = VB10.NEO CT26-III = CT26 pepM1-M3, 5 aa 링커

VB4003 = VB10.NEO B16-X = B16 pepM1-M10, 5 aa 링커

VB4004 = VB10.NEO B16-III = B16 pepM1-M3, 5 aa 링커

VB4011 = VB10.NEO B16-X = B16 pepM1-M10, 10 aa 링커

VB4012 = VB10.NEO B16-III = B16 pepM1-M3, 10 aa 링커

VB4014 = VB10.NEO B16-X = B16 소수성 코어, (pepM9+pepM5+pepM1+pepM4+pepM6+pepM8+pepM10+pepM3+pepM7+pepM2), 5 aa 링커

VB4015 = VB10.NEO B16-III = B16 pepM1+M8+M3, 5 aa 링커

VB4016 = VB10.NEO B16-III = B16 pepM1+M3+M2, 5 aa 링커

VB4017 = VB10.NEO B16-X = B16 pepM1-M4+M11+M6-M10, 5 aa 링커

VB4018 = VB10.NEO B16-XX = B16 pepM1-M4+M11+M6-M10 x 2, 5 aa 링커

VB4019 = VB10.NEO B16-Vx2 = B16 pepM3+M4+M7+M9+M10 x 2, 5 aa 링커

VB4021 = VB10.NEO B16-Vx4 = B16 pepM3+M4+M7+M9-M10 x 4, 5 aa 링커

모든 네오에피토프 유전자 서열을 Genescript (New Jersey, US)에서 주문하였고, LD78베타 타겟팅 단위 및 hIgG3 다이머화 단위를 보유하는 발현 벡터 pUMVC4a 내로 클로닝하였다.

모든 컨스트럭트를 HEK293 세포 내로 트랜스펙션시키고 상층액의 백시바디 단백질을 웨스턴 블롯 및/또는 sandwich ELISA로 확인하였다. pUMVC4a 공벡터를 음성 대조군으로 포함시켰다. 도 2, 왼쪽 패널: 온전한 호모다이머 단백질의 형성을 설명하기 위하여, 트랜스펙션된 세포의 상층액 내에 있는 단백질을, 환원제의 존재 또는 부재하에서, 항-hMIP-1알파 항체에 의해 웨스턴 블롯에서 검출하였다. 호모다이머의 형성은 왼쪽 열 (-환원제)에 나타낸 반면, 모노머는 오른쪽 열 (+환원제)에 도시하였다. 도 2, 오른쪽 패널은 hMIP-1알파 및 hIgG3 모두에 대한 항체를 사용하는 sandwich ELISA로 검출한, 다양한 VB10.NEO 컨스트럭트로 트랜스펙션된 HEK293 세포의 상층액 내에 있는 백시바디 단백질의 발현 수준을 나타낸다. 오른쪽, 상단 패널은 각각 10 또는 3 개의 네오에피토프를 포함하는, VB10.NEO CT26-X (VB4001) 및 VB10.NEO CT26-III (VB4002) 컨스트럭트의 발현 수준을 나타낸다. 오른쪽, 하단 패널은 각각 10 또는 3 개의 네오에피토프를 포함하는, VB10.NEO B16-X (VB4003) 및 VB10.NEO B16-III (VB4004) 컨스트럭트의 발현 수준을 나타낸다. 3 또는 10 개의 네오에피토프를 포함하는 백시바디의 면역원성을 비교하기 위하여, 각 백시바디 후보의 플라스미드 DNA 20 μg을 C57BI/6-마우스 (B16 컨스트럭트) 또는 BALB/c-마우스 (CT26 컨스트럭트)의 전경골근 (tibial anterior muscle) 내로 근내 주입한 후, TriGrid, Ichor, (US)를 사용하여 일렉트로포레이션하였다. 13일 째, 마우스를 안락사시키고 비장을 채취하였다.

T 세포 반응은 IFN-감마 ELISpot에 의해 평가되었다. 결과를 도 3에 나타냈으며, 여기서 T 세포 반응은 IFN-γ 스폿의 수/10⁶ 개의 비장 세포로 나타냈다. 우리는 10 개의 네오에피토프를 포함하는 백시바디가 동일한 마우스의 10 개의 포함된 네오에피토프 중 4-6 개에 대해 유의한 T 세포 반응을 유도한다는 것을 관찰했다. 가장 강한 IFN-γ 반응을 자극하는 펩티드는 일반적으로 가장 우수한 MHC I 결합 스코어를 갖는다.

3 또는 10 개의 네오에피토프를 포함하는 백시바디 컨스트럭트에 의해 유도된 총 신생항원 특이적 면역 반응을 도 4에 나타냈다. 10 개의 네오에피토프를 포함하는 백시바디 (VB10.NEO B16-X 및 VB10.NEO CT26-X)는 3 개의 네오에피토프를 포함하는 백시바디 (VB10.NEO B16-III 및 VB10.NEO CT26-III)에 비하여, 총 신생항원 특이적 면역 반응을 증가시켰다.

실시예 3: 백시바디 DNA 백신 및 상응하는 펩티드 + 보조제 백신의 면역원성 비교.

VB10.NEO 컨스트럭트를 마우스 백신 접종 연구에 사용하기 전에, 도 2의 설명 부분에서 앞서 상세히 기재한대로, sandwich ELISA 분석을 사용하여 HEK293 세포 내의 백시바디 단백질 발현 및 분비를 확인하였다. 네오에피토프의 순서는 기능성 백시바디의 발현 및 분비에 영향을 미칠 수 있다. 도 5, 상단 패널에서 우리는 VB10.NEO B16-X 컨스트럭트 VB4014가 VB10.NEO B16-X 컨스트럭트 VB4003에 비하여 기능성 백시바디 단백질의 발현 및 분비가 약간 개선되었음을 관찰하였다. VB4014 내 10 개의 네오에피토프는 VB4003과 유사하지만, 네오에피토프의 순서가 변경되었고 가장 소수성인 네오에피토프가 네오에피토프 항원 모듈의 코어에 위치하였다. poly (I:C) 보조제와 함께 전달된 네오에피토프만을 포함하는 펩티드와 비교하여, 백시바디 DNA 백신 VB4003 및 VB4014의 면역원성을 테스트하기 위해, C57/Bl6 마우스에 20 mg의 VB10.NEO B16-X 컨스트럭트 VB4003 및 VB4014를 주입하였다. (유도된 면역 반응을 VB4003 및 VB4014에 의해 코딩된 10 개의 네오에피토프를 포함하는 20 μg 또는 200 μg 펩티드 혼합물 + 50 μg poly I:C를 주입한 마우스의 면역 반응과 비교하였다. T 세포 반응은 IFN-감마 ELISpot에 의해 평가되었다. 도 5의 하단 패널에 나타난 결과는, 백시바디가 펩티드+보조제보다 훨씬 더 강력한 반응을 유도한다는 것을 확실히 보여준다. 또한, VB10.NEO B16-X VB4014 컨스트럭트로 면역화된 동물의 일부는 백신에 포함된 10 개의 모든 네오에피토프에 반응하였다.

실시예 4: 길이가 5 또는 10 개의 아미노산인 제2 링커를 포함하는 백시바디의 비교.

각 네오에피토프는 제2 링커에 의해 분리된다. 본 실시예에서, 제2 링커는 가요성 GGGGS 링커이다. 제2 링커의 길이가 발현 수준에 어떠한 영향을 미치는지 테스트하기 위하여, HEK293 세포를 길이가 5 또는 10 개의 아미노산인 제2 링커를 포함하는 VB10.NEO B16-X 컨스트럭트로 트랜스펙션시켰다. 도 6은 링커의 길이를 5 (VB4003)에서 10 (VB4011) 개의 아미노산으로 변경하는 것이 10 개의 네오에피토프를 포함하는 백시바디의 발현에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여준다 (도 6, 상단 패널). 제2 링커의 길이가 면역 반응에 어떠한 영향을 미치는지 테스트하기 위하여, C57Bl/6 마우스에 5 (VB4003) 또는 10 (VB4011) 개의 아미노산 링커를 갖는 10 개의 네오에피토프를 포함하는 VB10.NEO B16-X 컨스트럭트를 주입하였다. 13일 째, 마우스를 희생시키고 비장을 채취하여, 24 시간 동안 각각의 상응하는 네오에피토프 펩티드로 자극하고 T 세포 반응을 IFN-감마 ELISpot 분석으로 정량화하였다. 그 결과를 도 6, 하단 패널에 나타냈으며, 이는 5 개의 아미노산 링커를 포함하는 백시바디 (VB4003)에 비하여, 10 개의 아미노산 링커를 포함하는 백시바디 (VB4011) 컨스트럭트가 총 면역 반응을 증가시킨다는 것을 입증하였다. 공벡터는 음성 대조군으로 포함시켰다.

실시예 5: 동일한 네오에피토프의 상이한 수의 복제본을 포함하는 백시바디의 비교.

다음의 컨스트럭트들을 테스트하였다:

VB4003 = VB10.NEO B16-X = B16 pepM1-M10, 5 aa 링커

VB4018 = VB10.NEO B16-XX = B16 pepM1-M4+M11+M6-M10 x 2, 5 aa 링커

10 개의 네오에피토프를 포함하는 VB10.NEO B16-X (VB4003) 컨스트럭트의 발현 수준을 2x10 개의 네오에피토프를 포함하는 VB10.NEO B16-XX (VB4018)의 발현 수준과 비교하였다. 그 결과는 20 개의 네오에피토프를 포함하는 VB10.NEO B16-XX (VB4018)가 10 개의 네오에피토프를 포함하는 VB10.NEO B16-X (VB4003)에 비하여 약간 덜 발현된다는 것을 입증하였다 (도 7, 상단 패널).

10 또는 20 개의 네오에피토프를 포함하는 백시바디의 면역원성을, C57Bl/6 마우스에 백시바디 DNA 백신 VB10.NEO B16-X (VB4003) 및 VB10.NEO B16-XX (VB4018)을 근내 주입함으로써 테스트하였다. 13일 째, 마우스를 희생시키고 비장을 채취하여, 24 시간 동안 각각의 상응하는 네오에피토프 펩티드로 자극하고 T 세포 반응을 IFN-감마 ELISpot 분석으로 정량화하였다. 그 결과를 도 7, 하단 패널에 나타냈으며, 이는 네오에피토프 (2x10 개의 네오에피토프) 당 2 개의 복제본을 포함하는 것의 이점이 총 면역 반응에 대해 제한되지만, 각각의 네오에피토프에 대해 더 광범위한 면역 반응이 관찰된다는 것을 보여준다.

다음으로, 5 개의 선택된 네오에피토프, PepM3, PepM4, PepM7, PepM9 및 PepM10의 하나 이상의 복제본을 포함하는 백시바디 컨스트럭트의 발현 수준을 테스트하였다 (도 8, 상단 패널).

C57Bl/6 마우스에 다음의 백시바디 컨스트럭트들을 주입하였다:

VB4003 = VB10.NEO B16-X = B16 pepM1-M10, 5 aa 링커

VB4011 = VB10.NEO B16-X = B16 pepM1-M10, 10 aa 링커

VB4018 = VB10.NEO B16-XX = B16 pepM1-M4+M11+M6-M10 x 2, 5 aa 링커

VB4019 = VB10.NEO B16-Vx2 = B16 pepM3+M4+M7+M9+M10 x 2, 5 aa 링커

VB4021 = VB10.NEO B16-Vx4 = B16 pepM3+M4+M7+M9+M10 x 4, 5 aa 링커

선택된 5 개의 네오에피토프 각각에 대한 백시바디 후보의 면역 반응을 도 8, 하단 패널에 나타냈다. 5 개의 네오에피토프의 여러 복사본은 총 면역 반응에 제한적인 영향을 미쳤다. 그러나, 각 네오에피토프의 여러 복제본 (VB4018, VB4019 및 VB4021)은 5 개의 네오에피토프가 한 번 제시되는 데카토프 VB4003에 비하여, 5 개의 공유 네오에피토프에 대해 더 균등한 면역 반응을 제공하였다. 흥미롭게도, 10 개의 아미노산 제2 링커 및 네오에피토프만을 한 번 포함하는 백시바디 (VB4011)는 5 개의 네오에피토프의 여러 복사본을 포함하는 백시바디보다 더 우수한 총 면역 반응을 나타냈다.

실시예 6: 상이한 수의 네오에피토프를 포함하는 백시바디의 비교

네오에피토프를 더 추가하는 것의 면역학적 효과를 테스트하기 위하여, 상이한 수의 네오에피토프를 포함하는 백시바디 컨스트럭트의 면역 반응을 비교하였다.

총 면역 반응을 다음의 컨스트럭트들을 사용하여 B16 흑색종 마우스 모델에서 테스트하였다:

NEO B16-X = VB4011 = B16 pepM1-M10, 10 aa 링커

NEO B16-XV = VB4024 = B16 pepM1-M15, 10 aa 링커

NEO B16-XX = VB4025 = B16 pepM1-M20, 10 aa 링커

상기 네오에피토프 서열을 표 2에 나타냈다.

테스트한 세 가지 백시바디 컨스트럭트의 발현 수준을 도 11, 상단 패널에 나타냈다.

C57Bl/6 마우스에 DNA 백신 후보인 15 개의 네오에피토프를 포함하는 VB10.NEO B16-XV (VB4024) 또는 20 개의 네오에피토프를 포함하는 VB10.NEO B16-XX (VB4025)를 주입하여, 10 개의 네오에피토프를 포함하는 VB10.NEO B16-X (VB4011)와 비교하였다. 도 11, 하단 패널은 10⁶ 개의 비장 세포 당 총 IFNγ-스폿의 수를 나타낸다. 15 및 20 개의 네오에피토프를 갖는 컨스트럭트는 단지 10 개의 네오에피토프만을 갖는 컨스트럭트와 비교할 때, 더 많은 개별 네오에피토프에 대한 더 광범위한 면역 반응 및 더 높은 총 T 세포 반응을 초래하였다. 음성 대조군으로서, 마우스에 네오에피토프를 포함하지 않는 공벡터를 주입하였다. 도 11, 하단 패널로부터 알 수 있듯이, 공벡터의 주입은 개별 네오에피토프에 대한 유의한 면역 반응을 초래하지 않았다.

또한, 총 면역 반응을 다음의 컨스트럭트들을 사용하여 CT26 흑색종 마우스 모델에서 테스트하였다:

NEO CT26-X = VB4009 = CT26 pepM1-M10, 10 aa 링커

NEO CT26-XV = VB4026 = CT26 pepM1-M15, 10 aa 링커

NEO CT26-XX = VB4027 = CT26 pepM1-M20, 10 aa 링커

상기 네오에피토프 서열을 표 1에 나타냈다.

BALB/c 마우스에 DNA 백신 후보인 15 개의 네오에피토프를 포함하는 VB10.NEO CT26-XV (VB4026) 또는 20 개의 네오에피토프를 포함하는 VB10.NEO CT26-XX (VB4027)를 주입하여, 10 개의 네오에피토프를 포함하는 VB10.NEO CT26-X (VB4009)와 비교하였다. 도 12, 하단 패널은 10⁶ 개의 비장 세포 당 총 IFNγ-스폿의 수를 나타낸다. 15 및 20 개의 네오에피토프를 갖는 컨스트럭트는 단지 10 개의 네오에피토프만을 갖는 컨스트럭트와 비교할 때, 더 많은 개별 네오에피토프에 대한 더 광범위한 면역 반응 및 더 높은 총 T 세포 반응을 초래하였다. 음성 대조군으로서, 마우스에 네오에피토프를 포함하지 않는 공벡터를 주입하였다. 도 12, 하단 패널로부터 알 수 있듯이, 공벡터의 주입은 개별 네오에피토프에 대한 유의한 면역 반응을 초래하지 않았다.

실시예 7: 상이한 백시바디 컨스트럭트의 발현 수준을 비교하였다.

다음의 컨스트럭트들을 테스트하였다:

VB4004 = VB10.NEO B16-III = B16 pepM1-M3, 5 aa 링커

VB4012 = VB10.NEO B16-III = B16 pepM1-M3, 10 aa 링커

VB4015 = VB10.NEO B16-III = B16 pepM1+M8+M3, 5 aa 링커

VB4016 = VB10.NEO B16-III = B16 pepM1+M3+M2, 5 aa 링커

VB4017 = VB10.NEO B16-X = B16 pepM1-M4+M11+M6-M10, 5 aa 링커

VB4018 = VB10.NEO B16-XX = B16 pepM1-M4+M11+M6-M10 x 2, 5 aa 링커

유사한 기능성 백시바디 단백질의 발현 및 분비가 VB10.NEO B16-X (VB4017) 및 VB10.NEO B16-XX (VB4018)에 대해서 관찰되었다 (도 9).

기능성 백시바디 단백질의 개선된 발현 및 분비는 3 개의 네오에피토프가, VB10.NEO B16-III (VB4004) 컨스트럭트에서의 5 aa 링커에 비하여 VB10.NEO B16-III (VB4012) 컨스트럭트에서와 같이 10 aa 링커로 이격된 경우 관찰된다 (도 10, 상단 패널). 또한, VB4004, VB4015 및 VB4016을 비교하여 나타낸 바와 같이 (도 10, 하단 패널), 세 가지 네오에피토프의 순서 변경은 백시바디의 발현 수준에 영향을 미칠 수 있다.

실시예 8: 치료적 효과

VB10.NEO를 치료적 백신 연구를 위한 백신 후보로서 사용하였다.

7.5x10⁴ B16.F10 세포 또는 1×10⁵ CT26 세포 (ATCC)를 C57BI/6 마우스 또는 BALB/c 마우스의 허벅지 영역에 주입하였다. 1 일 및 8 일 후, 마우스에 20 μg의 플라스미드 DNA를 백신 접종한 후, 일렉트로포레이션, TriGrid, Ichor, US 하였다. 종양 크기를 일주일에 2 내지 3 회 측정하였다. 도 13은 10 개의 네오에피토프를 포함하는 VB10.NEO DNA 백신 후보가 종양 성장을 상당히 지연 및 감소시킬 수 있음을 보여준다.

실시예 9: 치료적 DNA 백신

사용될 치료적 DNA 백신은, 규제 당국의 지침에 따른 플라스미드 백신의 GMP 제조 및 DNA 백신의 충전 & 포장 (Fill & Finish)에 의하여 제조될 수 있다. DNA 백신은 2-6 mg/ml 농도의 PBS와 같은 식염수 용액에 용해시킴으로써 제형화될 수 있다. 백신은 일렉트로포레이션 또는 대안으로 제트 인젝터를 사용하거나 사용하지 않고 피내 또는 근내 투여될 수 있다.

서열

SEQ ID NO: 1

신호 펩티드 및 성숙 펩티드 (LD78-베타)를 포함하는 C-C 모티프 케모카인 3-유사 1 전구체, aa 24-93:

MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLSAPLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIADYFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA

SEQ ID NO: 2

모든 VB10.NEO 컨스트럭트의 불변 코딩 부분의 DNA 서열

상기 컨스트럭트는 네오에피토프를 삽입하는 데 사용할 수 있는 표준 컨스트럭트이다. 네오에피토프 서열은 링커 GGCCTCGGTGGCCTG 다음에 첨가될 수 있다.

ATGCAGGTCTCCACTGCTGCCCTTGCCGTCCTCCTCTGCACCATGGCTCTCTGCAACCAGGTCCTCTCT | GCACCACTT GCTGCTGACACGCCGACCGCCTGCTGCTTCAGCTACACCTCCCGACAGATTCCACAGAATTTCATAGCTGACTACTTTG AGACGAGCAGCCAGTGCTCCAAGCCCAGTGTCATCTTCCTAACCAAGAGAGGCCGGCAGGTCTGTGCTGACCCCAGTGA GGAGTGGGTCCAGAAATACGTCAGTGACCTGGAGCTGAGTGCC | GAGCTCAAAACCCCACTTGGTGACACAACTCACAC A I GAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCGTGCCCAAGGTGCCCA | GGCGGTGGAAGCAGCGGAGGTGGAAGTGGA | GGACAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCT GCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAGCGGGCAGCCGGAGAACAACTACAACAC CACGCCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAG GGGAACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGCTTCACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGG GTAAA I GGCCTCGGTGGCCTG |

SEQ ID NO: 3

모든 VB10.NEO 단백질의 불변 코딩 부분의 아미노산 서열:B4001

MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLS | APLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIAD

YFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA | ELKTPLG

DTTHT I EPKSCDTPPPCPRCP | GGGSSGGGSG | GQPREPQVYTLPPSREEMTK

NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK | GLGGL |

SEQ ID NO: 4

B16-F10 돌연변이 에피토프, B16-PepM1, 아미노산 서열

PSKPSFQEFVDWENVSPELNSTDQPFL

SEQ ID NO: 5

B16-F10 돌연변이 에피토프, B16-PepM2, 아미노산 서열

REGVELCPGNKYEMRRHGTTHSLVIHD

SEQ ID NO: 6

B16-F10 돌연변이 에피토프, B16-PepM3, 아미노산 서열

SHCHWNDLAVIPAGVVHNWDFEPRKVS

SEQ ID NO: 7

B16-F10 돌연변이 에피토프, B16-PepM4, 아미노산 서열

GRGHLLGRLAAIVGKQVLLGRKVVVVR

SEQ ID NO: 8

B16-F10 돌연변이 에피토프, B16-PepM5, 아미노산 서열

FRRKAFLHWYTGEAMDEMEFTEAESNM

SEQ ID NO: 9

B16-F10 돌연변이 에피토프, B16-PepM6, 아미노산 서열

VVDRNPQFLDPVLAYLMKGLCEKPLAS

SEQ ID NO: 10

B16-F10 돌연변이 에피토프, B16-PepM7, 아미노산 서열

SSPDEVALVEGVQSLGFTYLRLKDNYM

SEQ ID NO: 11

B16-F10 돌연변이 에피토프, B16-PepM8, 아미노산 서열

EFKHIKAFDRTFANNPGPMVVFATPGM

SEQ ID NO: 12

B16-F10 돌연변이 에피토프, B16-PepM9, 아미노산 서열

STANYNTSHLNNDVWQIFENPVDWKEK

SEQ ID NO: 13

B16-F10 돌연변이 에피토프, B16-PepM10, 아미노산 서열

DSGSPFPAAVILRDALHMARGLKYLHQ

SEQ ID NO: 14

CT26 돌연변이 에피토프, CT26-PepM1, 아미노산 서열

VILPQAPSGPSYATYLQPAQAQMLTPP

SEQ ID NO: 15

CT26 돌연변이 에피토프, CT26-PepM2, 아미노산 서열

LHSGQNHLKEMAISVLEARACAAAGQS

SEQ ID NO: 16

CT26 돌연변이 에피토프, CT26-PepM3, 아미노산 서열

PLLPFYPPDEALEIGLELNSSALPPTE

SEQ ID NO: 17

CT26 돌연변이 에피토프, CT26-PepM4, 아미노산 서열

AGTQCEYWASRALDSEHSIGSMIQLPQ

SEQ ID NO: 18

CT26 돌연변이 에피토프, CT26-PepM5, 아미노산 서열

AAYKGHHYPGPGNYFWKCLFMSGLSEV

SEQ ID NO: 19

CT26 돌연변이 에피토프, CT26-PepM6, 아미노산 서열

DTLSAMSNPRAMQVLLQIQQGLQTLAT

SEQ ID NO: 20

CT26 돌연변이 에피토프, CT26-PepM7, 아미노산 서열

DKPLRRNNSYTSYIMAICGMPLDSFRA

SEQ ID NO: 21

CT26 돌연변이 에피토프, CT26-PepM8, 아미노산 서열

EVIQTSKYYMRDVIAIESAWLLELAPH

SEQ ID NO: 22

CT26 돌연변이 에피토프, CT26-PepM9, 아미노산 서열

GYISRVTAGKDSYIALVDKNIMGYIAS

SEQ ID NO: 23

CT26 돌연변이 에피토프, CT26-PepM10, 아미노산 서열

EHIHRAGGLFVADAIQVGFGRIGKHFW

SEQ ID NO: 24

제1 링커, 아미노산 서열: GLSGL

SEQ ID NO: 25

제1 링커, 아미노산 서열: GLGGL

SEQ ID NO: 26

힌지 영역 (IgG3 UH 힌지), 12 개의 아미노산: ELKTPLGDTTHT

SEQ ID NO: 27

힌지 영역 (IgG3, MH 힌지, 15 개의 아미노산): EPKSCDTPPPCPRCP

SEQ ID NO: 28

Gly-Ser 링커: GGGSSGGGSG

SEQ ID NO: 29

hCH3 IgG3, 아미노산 서열:

GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NIFSCSVM H EALH N RFTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 30

VB4001 = VB10.NEO CT26-X = CT26 pepM1-M10, 5 aa 링커의 아미노산 서열

네오에피토프 서열은 GGGSSGGGSG 다음에 삽입된다.

MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLS | APLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIAD

YFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA | ELKTPLG

DTTHT I EPKSCDTPPPCPRCP | GGGSSGGGSG | GQPREPQVYTLPPSREEMTK

NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK | GLGGL | MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYGYGQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFC

CKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP | GGGSSGGGSG |

VILPQAPSGPSYATYLQPAQAQMLTPPGGGGSLHSGQNHLKEMAISVLEARACAAAGQSGGGGSPLLPFYPPDEALEIGLELNSSALPPTEGGGGSAGTQCEYWASRALDSEHSIGSMIQLPQGGGGSAAYKGHHYPGPGNYFWKCLFMSGLSEVGGGGSDTLSAMSNPRAMQVLLQIQQGLQTLATGGGGSDKPLRRNNSYTSYIMAICGMPLDSFRAGGGGSEVIQTSKYYMRDVIAIESAWLLELAPHGGGGSGYISRVTAGKDSYIALVDKNIMGYIASGGGGSEHIHRAGGLFVADAIQVGFGRIGKHFW

SEQ ID NO: 31

VB4002 VB10.NEO CT26-III = CT26 pepM1-M3, 5 aa 링커의 아미노산 서열

MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLS | APLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIAD

YFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA | ELKTPLG

DTTHT I EPKSCDTPPPCPRCP | GGGSSGGGSG | GQPREPQVYTLPPSREEMTK

NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK | GLGGL | MHGDTPTL

HEYMLDLQPETTDLYGYGQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFC

CKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP | GGGSSGGGSG |

VILPQAPSGPSYATYLQPAQAQMLTPPGGGGSLHSGQNHLKEMAISVLEARACAAAGQSGGGGSPLLPFYPPDEALEIGLELNSSALPPTE

SEQ ID NO: 32

VB4003 = VB10.NEO B16-X = B16 pepM1-M10, 5 aa 링커의 아미노산 서열

(VB10.Neo-10B)

MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLS | APLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIAD

YFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA | ELKTPLG

DTTHT I EPKSCDTPPPCPRCP | GGGSSGGGSG | GQPREPQVYTLPPSREEMTK

HEYMLDLQPETTDLYGYGQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFC

CKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP | GGGSSGGGSG |

PSKPSFQEFVDWENVSPELNSTDQPFLGGGGSREGVELCPGNKYEMRRHGTTHSLVIHDGGGGSSHCHWNDLAVIPAGVVHNWDFEPRKVSGGGGSGRGHLLGRLAAIVGKQVLLGRKVVVVRGGGGSFRRKAFLHWYTGEAMDEMEFTEAESNMGGGGSVVDRNPQFLDPVLAYLMKGLCEKPLASGGGGSSSPDEVALVEGVQSLGFTYLRLKDNYMGGGGSEFKHIKAFDRTFANNPGPMVVFATPGMGGGGSSTANYNTSHLNNDVWQIFENPVDWKEKGGGGSDSGSPFPAAVILRDALHMARGLKYLHQ

SEQ ID NO: 33

VB4004 = VB10.NEO B16-III = B16 pepM1 -M3, 5 aa 링커의 아미노산 서열

MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLS | APLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIAD

YFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA | ELKTPLG

DTTHT I EPKSCDTPPPCPRCP | GGGSSGGGSG | GQPREPQVYTLPPSREEMTK

HEYMLDLQPETTDLYGYGQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFC

CKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP | GGGSSGGGSG |

PSKPSFQEFVDWENVSPELNSTDQPFLGGGGSREGVELCPGNKYEMRRHGTTHSLVIHDGGGGSSHCHWNDLAVIPAGVVHNWDFEPRKVS

SEQ ID NO: 34

신호 펩티드

MNFGLRLIFLVLTLKGVQC

SEQ ID NO: 35

신호 펩티드

MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP

SEQ ID NO: 36

B16-F10 돌연변이 에피토프, B16-pepM11, 아미노산 서열

ANFESGKHKYRQTAMFTATMPPAVERL

SEQ ID NO: 37

VB4011 = VB10.NEO B16-X = B16 pepM1 -M10, 10 aa 링커의 아미노산 서열

MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLS | APLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIAD

YFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA | ELKTPLG

DTTHT I EPKSCDTPPPCPRCP | GGGSSGGGSG | GQPREPQVYTLPPSREEMTK

HEYMLDLQPETTDLYGYGQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFC

CKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP | GGGSSGGGSG |

PSKPSFQEFVDWENVSPELNSTDQPFLGGGGSGGGGSREGVELCPGNKYEMRRHGTTHSLVIHDGGGGSGGGGSSHCHWNDLAVIPAGVVHNWDFEPRKVSGGGGSGGGGSGRGHLLGRLAAIVGKQVLLGRKVVVVRGGGGSGGGGSFRRKAFLHWYTGEAMDEMEFTEAESNMGGGGSGGGGSVVDRNPQFLDPVLAYLMKGLCEKPLASGGGGSGGGGSSSPDEVALVEGVQSLGFTYLRLKDNYMGGGGSGGGGSEFKHIKAFDRTFANNPGPMVVFATPGMGGGGSGGGGSSTANYNTSHLNNDVWQIFENPVDWKEKGGGGSGGGGSDSGSPFPAAVILRDALHMARGLKYLHQ

SEQ ID NO: 38

VB4012 = VB10.NEO B16-III = B16 pepM1-M3, 10 aa 링커의 아미노산 서열

MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLS | APLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIAD

YFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA | ELKTPLG

DTTHT I EPKSCDTPPPCPRCP | GGGSSGGGSG | GQPREPQVYTLPPSREEMTK

HEYMLDLQPETTDLYGYGQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFC

CKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP | GGGSSGGGSG |

PSKPSFQEFVDWENVSPELNSTDQPFLGGGGSGGGGSREGVELCPGNKYEMRRHGTTHSLVIHDGGGGSGGGGSSHCHWNDLAVIPAGVVHNWDFEPRKVS

SEQ ID NO: 39

VB4014 = VB10.NEO B16-X = B16 소수성 코어, (pepM9+M5+M1+M4+M6+M8+M10+M3+M7+M2), 5 aa 링커의 아미노산 서열

MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLS | APLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIAD

YFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA | ELKTPLG

DTTHT I EPKSCDTPPPCPRCP | GGGSSGGGSG | GQPREPQVYTLPPSREEMTK

HEYMLDLQPETTDLYGYGQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFC

CKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP | GGGSSGGGSG |

STANYNTSHLNNDVWQIFENPVDWKEKGGGGSFRRKAFLHWYTGEAMDEMEFTEAESNMGGGGSPSKPSFQEFVDWENVSPELNSTDQPFLGGGGSGRGHLLGRLAAIVGKQVLLGRKVVVVRGGGGSVVDRNPQFLDPVLAYLMKGLCEKPLASGGGGSEFKHIKAFDRTFANNPGPMVVFATPGMGGGGSDSGSPFPAAVILRDALHMARGLKYLHQGGGGSSHCHWNDLAVIPAGVVHNWDFEPRKVSGGGGSSSPDEVALVEGVQSLGFTYLRLKDNYMGGGGSREGVELCPGNKYEMRRHGTTHSLVIHD

SEQ ID NO: 40

VB4015 = VB10.NEO B16-III = B16 pepM1-M8-M3, 5 aa 링커의 아미노산 서열

MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLS | APLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIAD

YFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA | ELKTPLG

DTTHT I EPKSCDTPPPCPRCP | GGGSSGGGSG | GQPREPQVYTLPPSREEMTK

HEYMLDLQPETTDLYGYGQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFC

CKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP | GGGSSGGGSG |

PSKPSFQEFVDWENVSPELNSTDQPFLGGGGSEFKHIKAFDRTFANNPGPMVVFATPGMGGGGSSHCHWNDLAVIPAGVVHNWDFEPRKVS

SEQ ID NO: 41

VB4016 = VB10.NEO B16-III = B16 pepM1-M3-M2, 5 aa 링커의 아미노산 서열

MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLS | APLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIAD

YFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA | ELKTPLG

DTTHT I EPKSCDTPPPCPRCP | GGGSSGGGSG | GQPREPQVYTLPPSREEMTK

HEYMLDLQPETTDLYGYGQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFC

CKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP | GGGSSGGGSG |

PSKPSFQEFVDWENVSPELNSTDQPFLGGGGSSHCHWNDLAVIPAGVVHNWDFEPRKVSGGGGSREGVELCPGNKYEMRRHGTTHSLVIHD

SEQ ID NO: 42

VB4017 = VB10.NEO B16-X = B16 pepM1-M4+M11+M6-M10, 5 aa 링커의 아미노산 서열

MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLS | APLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIAD

YFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA | ELKTPLG

DTTHT I EPKSCDTPPPCPRCP | GGGSSGGGSG | GQPREPQVYTLPPSREEMTK

HEYMLDLQPETTDLYGYGQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFC

CKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP | GGGSSGGGSG |

PSKPSFQEFVDWENVSPELNSTDQPFLGGGGSREGVELCPGNKYEMRRHGTTHSLVIHDGGGGSSHCHWNDLAVIPAGVVHNWDFEPRKVSGGGGSGRGHLLGRLAAIVGKQVLLGRKVVVVRGGGGSANFESGKHKYRQTAMFTATMPPAVERLGGGGSVVDRNPQFLDPVLAYLMKGLCEKPLASGGGGSSSPDEVALVEGVQSLGFTYLRLKDNYMGGGGSEFKHIKAFDRTFANNPGPMVVFATPGMGGGGSSTANYNTSHLNNDVWQIFENPVDWKEKGGGGSDSGSPFPAAVILRDALHMARGLKYLHQ

SEQ ID NO: 43

VB4018 = VB10.NEO B16-XX = B16 pepM1-M4+M11+M6-M10 x 2, 5 aa 링커의 아미노산 서열

MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLS | APLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIAD

YFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA | ELKTPLG

DTTHT I EPKSCDTPPPCPRCP | GGGSSGGGSG | GQPREPQVYTLPPSREEMTK

HEYMLDLQPETTDLYGYGQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFC

CKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP | GGGSSGGGSG |

PSKPSFQEFVDWENVSPELNSTDQPFLGGGGSREGVELCPGNKYEMRRHGTTHSLVIHDGGGGSSHCHWNDLAVIPAGVVHNWDFEPRKVSGGGGSGRGHLLGRLAAIVGKQVLLGRKVVVVRGGGGSANFESGKHKYRQTAMFTATMPPAVERLGGGGSVVDRNPQFLDPVLAYLMKGLCEKPLASGGGGSSSPDEVALVEGVQSLGFTYLRLKDNYMGGGGSEFKHIKAFDRTFANNPGPMVVFATPGMGGGGSSTANYNTSHLNNDVWQIFENPVDWKEKGGGGSDSGSPFPAAVILRDALHMARGLKYLHQGGGGSPSKPSFQEFVDWENVSPELNSTDQPFLGGGGSREGVELCPGNKYEMRRHGTTHSLVIHDGGGGSSHCHWNDLAVIPAGVVHNWDFEPRKVSGGGGSGRGHLLGRLAAIVGKQVLLGRKVVVVRGGGGSANFESGKHKYRQTAMFTATMPPAVERLGGGGSVVDRNPQFLDPVLAYLMKGLCEKPLASGGGGSSSPDEVALVEGVQSLGFTYLRLKDNYMGGGGSEFKHIKAFDRTFANNPGPMVVFATPGMGGGGSSTANYNTSHLNNDVWQIFENPVDWKEKGGGGSDSGSPFPAAVILRDALHMARGLKYLHQ

SEQ ID NO: 44

VB4019 = VB10.NEO B16-Vx2 = B16 pepM3-M4-M7-M9-M10 x 2, 5 aa 링커의 아미노산 서열

MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLS | APLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIAD

YFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA | ELKTPLG

DTTHT I EPKSCDTPPPCPRCP | GGGSSGGGSG | GQPREPQVYTLPPSREEMTK

HEYMLDLQPETTDLYGYGQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFC

CKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP | GGGSSGGGSG |

SHCHWNDLAVIPAGVVHNWDFEPRKVSGGGGSGRGHLLGRLAAIVGKQVLLGRKVVVVRGGGGSSSPDEVALVEGVQSLGFTYLRLKDNYMGGGGSSTANYNTSHLNNDVWQIFENPVDWKEKGGGGSDSGSPFPAAVILRDALHMARGLKYLHQGGGGSSHCHWNDLAVIPAGVVHNWDFEPRKVSGGGGSGRGHLLGRLAAIVGKQVLLGRKVVVVRGGGGSSSPDEVALVEGVQSLGFTYLRLKDNYMGGGGSSTANYNTSHLNNDVWQIFENPVDWKEKGGGGSDSGSPFPAAVILRDALHMARGLKYLHQ

SEQ ID NO: 45

VB4021 = VB10.NEO B16-Vx4 = B16 pepM3-M4-M7-M9-M10 x 4, 5 aa 링커의 아미노산 서열

MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLS | APLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIAD

YFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA | ELKTPLG

DTTHT I EPKSCDTPPPCPRCP | GGGSSGGGSG | GQPREPQVYTLPPSREEMTK

HEYMLDLQPETTDLYGYGQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFC

CKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP | GGGSSGGGSG |

SHCHWNDLAVIPAGVVHNWDFEPRKVSGGGGSGRGHLLGRLAAIVGKQVLLGRKVVVVRGGGGSSSPDEVALVEGVQSLGFTYLRLKDNYMGGGGSSTANYNTSHLNNDVWQIFENPVDWKEKGGGGSDSGSPFPAAVILRDALHMARGLKYLHQGGGGSSHCHWNDLAVIPAGVVHNWDFEPRKVSGGGGSGRGHLLGRLAAIVGKQVLLGRKVVVVRGGGGSSSPDEVALVEGVQSLGFTYLRLKDNYMGGGGSSTANYNTSHLNNDVWQIFENPVDWKEKGGGGSDSGSPFPAAVILRDALHMARGLKYLHQGGGGSSHCHWNDLAVIPAGVVHNWDFEPRKVSGGGGSGRGHLLGRLAAIVGKQVLLGRKVVVVRGGGGSSSPDEVALVEGVQSLGFTYLRLKDNYMGGGGSSTANYNTSHLNNDVWQIFENPVDWKEKGGGGSDSGSPFPAAVILRDALHMARGLKYLHQ

SEQ ID NO: 46

VB4024 = VB10.NEO B16- XV = B16 pepM1 -M15, 10 aa 링커의 아미노산 서열

MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLS | APLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIAD

YFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA | ELKTPLG

DTTHT I EPKSCDTPPPCPRCP | GGGSSGGGSG | GQPREPQVYTLPPSREEMTK

HEYMLDLQPETTDLYGYGQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFC

CKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP | GGGSSGGGSG |

PSKPSFQEFVDWENVSPELNSTDQPFLGGGGSGGGGSREGVELCPGNKYEMRRHGTTHSLVIHDGGGGSGGGGSSHCHWNDLAVIPAGVVHNWDFEPRKVSGGGGSGGGGSGRGHLLGRLAAIVGKQVLLGRKVVVVRGGGGSGGGGSFRRKAFLHWYTGEAMDEMEFTEAESNMGGGGSGGGGSVVDRNPQFLDPVLAYLMKGLCEKPLASGGGGSGGGGSSSPDEVALVEGVQSLGFTYLRLKDNYMGGGGSGGGGSEFKHIKAFDRTFANNPGPMVVFATPGMGGGGSGGGGSSTANYNTSHLNNDVWQIFENPVDWKEKGGGGSGGGGSDSGSPFPAAVILRDALHMARGLKYLHQGGGGSGGGGSANFESGKHKYRQTAMFTATMPPAVERLGGGGSGGGGSNHSGLVTFQAFIDVMSRETTDTDTADQGGGGSGGGGSCGTAFFINFIAIYHHASRAIPFGTMVAGGGGSGGGGSFVVKAYLPVNESFAFTADLRSNTGGQAGGGGSGGGGSTPPPEEAMPFEFNGPAQGDHSQPPLQV

SEQ ID NO: 47

VB4025 = VB10.NEO B16- XX = B16 pepM1 -M20, 10 aa 링커의 아미노산 서열

MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLS | APLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIAD

YFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA | ELKTPLG

DTTHT I EPKSCDTPPPCPRCP | GGGSSGGGSG | GQPREPQVYTLPPSREEMTK

HEYMLDLQPETTDLYGYGQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFC

CKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP | GGGSSGGGSG |

PSKPSFQEFVDWENVSPELNSTDQPFLGGGGSGGGGSREGVELCPGNKYEMRRHGTTHSLVIHDGGGGSGGGGSSHCHWNDLAVIPAGVVHNWDFEPRKVSGGGGSGGGGSGRGHLLGRLAAIVGKQVLLGRKVVVVRGGGGSGGGGSFRRKAFLHWYTGEAMDEMEFTEAESNMGGGGSGGGGSVVDRNPQFLDPVLAYLMKGLCEKPLASGGGGSGGGGSSSPDEVALVEGVQSLGFTYLRLKDNYMGGGGSGGGGSEFKHIKAFDRTFANNPGPMVVFATPGMGGGGSGGGGSSTANYNTSHLNNDVWQIFENPVDWKEKGGGGSGGGGSDSGSPFPAAVILRDALHMARGLKYLHQGGGGSGGGGSANFESGKHKYRQTAMFTATMPPAVERLGGGGSGGGGSNHSGLVTFQAFIDVMSRETTDTDTADQGGGGSGGGGSCGTAFFINFIAIYHHASRAIPFGTMVAGGGGSGGGGSFVVKAYLPVNESFAFTADLRSNTGGQAGGGGSGGGGSTPPPEEAMPFEFNGPAQGDHSQPPLQVGGGGSGGGGSPKPDFSQLQRNILPSNPRVTRFHINWDGGGGSGGGGSIPSGTTILNCFHDVLSGKLSGGSPGVPGGGGSGGGGSGFSQPLRRLVLHVVSAAQAERLARAEEGGGGSGGGGSECRITSNFVIPSEYWVEEKEEKQKLIQGGGGSGGGGSNIEGIDKLTQLKKPFLVNNKINKIENI

SEQ ID NO: 48

VB4026 = VB10.NEO CT26- XV = CT26 pepM1 -M15, 10 aa 링커의 아미노산 서열

MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLS | APLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIAD

YFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA | ELKTPLG

DTTHT I EPKSCDTPPPCPRCP | GGGSSGGGSG | GQPREPQVYTLPPSREEMTK

HEYMLDLQPETTDLYGYGQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFC

CKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP | GGGSSGGGSG |

VILPQAPSGPSYATYLQPAQAQMLTPPGGGGSGGGGSLHSGQNHLKEMAISVLEARACAAAGQSGGGGSGGGGSPLLPFYPPDEALEIGLELNSSALPPTEGGGGSGGGGSAGTQCEYWASRALDSEHSIGSMIQLPQGGGGSGGGGSAAYKGHHYPGPGNYFWKCLFMSGLSEVGGGGSGGGGSDTLSAMSNPRAMQVLLQIQQGLQTLATGGGGSGGGGSDKPLRRNNSYTSYIMAICGMPLDSFRAGGGGSGGGGSEVIQTSKYYMRDVIAIESAWLLELAPHGGGGSGGGGSGYISRVTAGKDSYIALVDKNIMGYIASGGGGSGGGGSEHIHRAGGLFVADAIQVGFGRIGKHFWGGGGSGGGGSQAIVRGCSMPGPWRSGRLLVSRRWSVEGGGGSGGGGSDGQLELLAQGALDNALSSMGALHALRPGGGGSGGGGSSHDSRKSTSFMSVNPSKEIKIVSAVRRGGGGSGGGGSHTPSSYIETLPKAIKRRINALKQLQVRGGGGSGGGGSMKAFIFKYSAKTGFTKLIDASRVSETE

SEQ ID NO: 49

VB4027 = VB10.NEO CT26- XX = CT26 pepM1 -M20, 10 aa 링커의 아미노산 서열

MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLS | APLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIAD

YFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA | ELKTPLG

DTTHT I EPKSCDTPPPCPRCP | GGGSSGGGSG | GQPREPQVYTLPPSREEMTK

HEYMLDLQPETTDLYGYGQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFC

CKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP | GGGSSGGGSG |

VILPQAPSGPSYATYLQPAQAQMLTPPGGGGSGGGGSLHSGQNHLKEMAISVLEARACAAAGQSGGGGSGGGGSPLLPFYPPDEALEIGLELNSSALPPTEGGGGSGGGGSAGTQCEYWASRALDSEHSIGSMIQLPQGGGGSGGGGSAAYKGHHYPGPGNYFWKCLFMSGLSEVGGGGSGGGGSDTLSAMSNPRAMQVLLQIQQGLQTLATGGGGSGGGGSDKPLRRNNSYTSYIMAICGMPLDSFRAGGGGSGGGGSEVIQTSKYYMRDVIAIESAWLLELAPHGGGGSGGGGSGYISRVTAGKDSYIALVDKNIMGYIASGGGGSGGGGSEHIHRAGGLFVADAIQVGFGRIGKHFWGGGGSGGGGSQAIVRGCSMPGPWRSGRLLVSRRWSVEGGGGSGGGGSDGQLELLAQGALDNALSSMGALHALRPGGGGSGGGGSSHDSRKSTSFMSVNPSKEIKIVSAVRRGGGGSGGGGSHTPSSYIETLPKAIKRRINALKQLQVRGGGGSGGGGSMKAFIFKYSAKTGFTKLIDASRVSETEGGGGSGGGGSEGDPCLRSSDCIDEFCCARHFWTKICKGGGGSGGGGSWKGGPVKIDPLALMQAIERYLVVRGYGGGGGSGGGGSVTSIPSVSNALNWKEFSFIQSTLGYVAGGGGSGGGGSYRGANLHLEETLAGFWARLLERLFKQLGGGGSGGGGSKTTLSHTQDSSQSLQSSSDSSKSSRCS

SEQ ID NO: 50

CT26 돌연변이 에피토프, CT26-PepM11, 아미노산 서열

QAIVRGCSMPGPWRSGRLLVSRRWSVE

SEQ ID NO: 51

CT26 돌연변이 에피토프, CT26-PepM12, 아미노산 서열

DGQLELLAQGALDNALSSMGALHALRP

SEQ ID NO: 52

CT26 돌연변이 에피토프, CT26-PepM13, 아미노산 서열

SHDSRKSTSFMSVNPSKEIKIVSAVRR

SEQ ID NO: 53

CT26 돌연변이 에피토프, CT26-PepM14, 아미노산 서열

HTPSSYIETLPKAIKRRINALKQLQVR

SEQ ID NO: 54

CT26 돌연변이 에피토프, CT26-PepM15, 아미노산 서열

MKAFIFKYSAKTGFTKLIDASRVSETE

SEQ ID NO: 55

CT26 돌연변이 에피토프, CT26-PepM16, 아미노산 서열

EGDPCLRSSDCIDEFCCARHFWTKICK

SEQ ID NO: 56

CT26 돌연변이 에피토프, CT26-PepM17, 아미노산 서열

WKGGPVKIDPLALMQAIERYLVVRGYG

SEQ ID NO: 57

CT26 돌연변이 에피토프, CT26-PepM18, 아미노산 서열

VTSIPSVSNALNWKEFSFIQSTLGYVA

SEQ ID NO: 58

CT26 돌연변이 에피토프, CT26-PepM19, 아미노산 서열

YRGANLHLEETLAGFWARLLERLFKQL

SEQ ID NO: 59

CT26 돌연변이 에피토프, CT26-PepM20, 아미노산 서열

KTTLSHTQDSSQSLQSSSDSSKSSRCS

SEQ ID NO: 60

B16-F10 돌연변이 에피토프, B16-PepM12, 아미노산 서열

NHSGLVTFQAFIDVMSRETTDTDTADQ

SEQ ID NO: 61

B16-F10 돌연변이 에피토프, B16-PepM13, 아미노산 서열

CGTAFFINFIAIYHHASRAIPFGTMVA

SEQ ID NO: 62

B16-F10 돌연변이 에피토프, B16-PepM14, 아미노산 서열

FVVKAYLPVNESFAFTADLRSNTGGQA

SEQ ID NO: 63

B16-F10 돌연변이 에피토프, B16-PepM15, 아미노산 서열

TPPPEEAMPFEFNGPAQGDHSQPPLQV

SEQ ID NO: 64

B16-F10 돌연변이 에피토프, B16-PepM16, 아미노산 서열

PKPDFSQLQRNILPSNPRVTRFHINWD

SEQ ID NO: 65

B16-F10 돌연변이 에피토프, B16-PepM17, 아미노산 서열

IPSGTTILNCFHDVLSGKLSGGSPGVP

SEQ ID NO: 66

B16-F10 돌연변이 에피토프, B16-PepM18, 아미노산 서열

GFSQPLRRLVLHVVSAAQAERLARAEE

SEQ ID NO: 67

B16-F10 돌연변이 에피토프, B16-PepM19, 아미노산 서열

ECRITSNFVIPSEYWVEEKEEKQKLIQ

SEQ ID NO: 68

B16-F10 돌연변이 에피토프, B16-PepM20, 아미노산 서열

NIEGIDKLTQLKKPFLVNNKINKIENI

SEQ ID NO: 69. 링커: GGGSS

SEQ ID NO: 70. 링커: GGGSG

SEQ ID NO: 71. 링커: GGGGS

SEQ ID NO: 72. 링커: LGGGS

SEQ ID NO: 73. 링커: GLGGS

SEQ ID NO: 74. 링커: GGLGS

SEQ ID NO: 75. 링커: GGGLS

SEQ ID NO: 76. 링커: GGGGL

SEQ ID NO: 77. 링커: LGGSG

SEQ ID NO: 78. 링커: GLGSG

SEQ ID NO: 79. 링커: GGLSG

SEQ ID NO: 80. 링커: GGGLG

SEQ ID NO: 81. 링커: GGGSL

SEQ ID NO: 82. 링커: LGGSS

SEQ ID NO: 83. 링커: GLGSS

SEQ ID NO: 84. 링커: GGLSS

SEQ ID NO: 85. 링커: GGGLS

SEQ ID NO: 86. 링커: GGGSL

SEQ ID NO: 87. 링커: LGLGS

SEQ ID NO: 88. 링커: GLGLS

SEQ ID NO: 89. 링커: GLLGS

SEQ ID NO: 90. 링커: LGGLS

SEQ ID NO: 91. 링커: GLGGL

SEQ ID NO: 92. 링커: LGLSG

SEQ ID NO: 93. 링커: GLLSG

SEQ ID NO: 94. 링커: GGLSL

SEQ ID NO: 95. 링커: GGLLG

SEQ ID NO: 96. 링커: GLGSL

SEQ ID NO: 97. 링커: LGLSS

SEQ ID NO: 98. 링커: GLGLS

SEQ ID NO: 99. 링커: GGLLS

SEQ ID NO: 100. 링커: GLGSL

SEQ ID NO: 101. 링커: GLGSL

SEQ ID NO: 102. 링커: LGGGSGGGGS

SEQ ID NO: 103. 링커: GLGGSGGGGS

SEQ ID NO: 104. 링커: GGLGSGGGGS

SEQ ID NO: 105. 링커: GGGLSGGGGS

SEQ ID NO: 106. 링커: GGGGLGGGGS

SEQ ID NO: 107. 링커: LGGSGGGGSG

SEQ ID NO: 108. 링커: GLGSGGGGSG

SEQ ID NO: 109. 링커: GGLSGGGGSG

SEQ ID NO: 110. 링커: GGGLGGGGSG

SEQ ID NO: 111. 링커: GGGSLGGGSG

SEQ ID NO: 112. 링커: GGGSLGGGSG

SEQ ID NO: 113. 링커: GLGSSGGGSS

SEQ ID NO: 114. 링커: GGLSSGGGSS

SEQ ID NO: 115. 링커: GGGLSGGGSS

SEQ ID NO: 116. 링커: GGGSLGGGSS

SEQ ID NO: 117. 링커: LGGGSLGGGS

SEQ ID NO: 118. 링커: GLGGSGLGGS

SEQ ID NO: 119. 링커: GGLGSGGLGS

SEQ ID NO: 120. 링커: GGGLSGGGLS

SEQ ID NO: 121. 링커: GGGGLGGGGL

SEQ ID NO: 122. 링커: LGGSGLGGSG

SEQ ID NO: 123. 링커: GLGSGGLGSG

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SEQ ID NO: 125. 링커: GGGLGGGGLG

SEQ ID NO: 126. 링커: GGGSLGGGSL

SEQ ID NO: 127. 링커: LGGSSLGGSS

SEQ ID NO: 128. 링커: GLGSSGLGSS

SEQ ID NO: 129. 링커: GGLSSGGLSS

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SEQ ID NO: 131. 링커: GGGSLGGGSL

SEQUENCE LISTING <110> Vaccibody AS <120> Therapeutic anticancer neoepitope vaccine <130> P4068PC00 <160> 131 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 93 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gln Val Ser Thr Ala Ala Leu Ala Val Leu Leu Cys Thr Met Ala 1 5 10 15 Leu Cys Asn Gln Val Leu Ser Ala Pro Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr 20 25 30 Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr Ser Arg Gln Ile Pro Gln Asn Phe Ile 35 40 45 Ala Asp Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Gln Cys Ser Lys Pro Ser Val Ile 50 55 60 Phe Leu Thr Lys Arg Gly Arg Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu 65 70 75 80 Trp Val Gln Lys Tyr Val Ser Asp Leu Glu Leu Ser Ala 85 90 <210> 2 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vector <400> 2 atgcaggtct ccactgctgc ccttgccgtc ctcctctgca ccatggctct ctgcaaccag 60 gtcctctctg caccacttgc tgctgacacg ccgaccgcct gctgcttcag ctacacctcc 120 cgacagattc cacagaattt catagctgac tactttgaga cgagcagcca gtgctccaag 180 cccagtgtca tcttcctaac caagagaggc cggcaggtct gtgctgaccc cagtgaggag 240 tgggtccaga aatacgtcag 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Linker <400> 95 Gly Gly Leu Leu Gly 1 5 <210> 96 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 96 Gly Leu Gly Ser Leu 1 5 <210> 97 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 97 Leu Gly Leu Ser Ser 1 5 <210> 98 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 98 Gly Leu Gly Leu Ser 1 5 <210> 99 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 99 Gly Gly Leu Leu Ser 1 5 <210> 100 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 100 Gly Leu Gly Ser Leu 1 5 <210> 101 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 101 Gly Leu Gly Ser Leu 1 5 <210> 102 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 102 Leu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 103 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 103 Gly Leu Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 104 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 104 Gly Gly Leu Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 105 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 105 Gly Gly Gly Leu Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 106 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 106 Gly Gly Gly Gly Leu Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 107 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 107 Leu Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 <210> 108 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 108 Gly Leu Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 <210> 109 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 109 Gly Gly Leu Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 <210> 110 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 110 Gly Gly Gly Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 <210> 111 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 111 Gly Gly Gly Ser Leu Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 <210> 112 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 112 Gly Gly Gly Ser Leu Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 <210> 113 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 113 Gly Leu Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser 1 5 10 <210> 114 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 114 Gly Gly Leu Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser 1 5 10 <210> 115 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 115 Gly Gly Gly Leu Ser Gly Gly Gly Ser Ser 1 5 10 <210> 116 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 116 Gly Gly Gly Ser Leu Gly Gly Gly Ser Ser 1 5 10 <210> 117 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 117 Leu Gly Gly Gly Ser Leu Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 118 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 118 Gly Leu Gly Gly Ser Gly Leu Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 119 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 119 Gly Gly Leu Gly Ser Gly Gly Leu Gly Ser 1 5 10 <210> 120 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 120 Gly Gly Gly Leu Ser Gly Gly Gly Leu Ser 1 5 10 <210> 121 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 121 Gly Gly Gly Gly Leu Gly Gly Gly Gly Leu 1 5 10 <210> 122 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 122 Leu Gly Gly Ser Gly Leu Gly Gly Ser Gly 1 5 10 <210> 123 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 123 Gly Leu Gly Ser Gly Gly Leu Gly Ser Gly 1 5 10 <210> 124 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 124 Gly Gly Leu Ser Gly Gly Gly Leu Ser Gly 1 5 10 <210> 125 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 125 Gly Gly Gly Leu Gly Gly Gly Gly Leu Gly 1 5 10 <210> 126 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 126 Gly Gly Gly Ser Leu Gly Gly Gly Ser Leu 1 5 10 <210> 127 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 127 Leu Gly Gly Ser Ser Leu Gly Gly Ser Ser 1 5 10 <210> 128 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 128 Gly Leu Gly Ser Ser Gly Leu Gly Ser Ser 1 5 10 <210> 129 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 129 Gly Gly Leu Ser Ser Gly Gly Leu Ser Ser 1 5 10 <210> 130 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 130 Gly Gly Gly Leu Ser Gly Gly Gly Leu Ser 1 5 10 <210> 131 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 131 Gly Gly Gly Ser Leu Gly Gly Gly Ser Leu 1 5 10

Claims

치료적 항암 네오에피토프 백신으로서,
o 타겟팅 단위
o 다이머화 단위
o 제1 링커
o 항원 단위 (antigenic unit)로서, 여기서 상기 항원 단위는 n-1 개의 항원 소단위를 포함하고, 각 소단위는 암 네오에피토프 서열의 적어도 일부 및 제2링커를 포함하며, 상기 항원 단위는 최종 암 네오에피토프 서열을 추가로 포함하고, 여기서 n은 3 내지 50 사이의 정수인 것인 항원 단위
를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드
또는
1)에서 정의된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것인 폴리펩티드, 또는
1)에서 정의된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 2 개의 폴리펩티드로 구성된 다이머 단백질
의 면역학적 유효량을 포함하는 것인 치료적 항암 네오에피토프 백신.
제1항에 있어서, 상기 항원 단위는 각 암 네오에피토프의 하나의 복제본을 포함하는 것인 백신.
제1항에 있어서, 상기 항원 단위는 적어도 하나의 네오에피토프의 복제본을 둘 이상 포함하는 것인 백신.
전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 암 네오에피토프 서열의 길이는 7 내지 30 개의 아미노산인 것인 백신.
전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 각 암 네오에피토프 서열의 길이는 동일한 것인 백신.
전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 암 네오에피토프는 본질적으로 암 네오에피토프 서열의 중간에 위치하는 것인 백신.
전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 암 네오에피토프 서열은 암 신생항원의 하위 서열인 것인 백신.
전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항원 소단위는 제1 링커에서부터, 큰 항원성에서 작은 항원성의 순서로 배열된 것인 백신.
전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 가장 소수성인 항원 소단위(들)은 실질적으로 항원 단위의 중간에 위치하고, 가장 친수성인 항원 소단위(들)은 항원 단위의 말단에 위치하는 것인 백신.
전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제2 링커는 가요성 링커인 것인 백신.
전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제2 링커는 모든 항원 소단위에서 동일한 것인 백신.
전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제2 링커는 세린-글리신 링커인 것인 백신.
전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항원 단위의 길이는 약 300 개의 아미노산 내지 약 1000 개의 아미노산인 것인 백신.
전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 다이머화 단위는 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열 94-237과 서열 동일성이 80% 이상인 아미노산 서열을 포함하는 것인 백신.
전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 타겟팅 단위는 CCR1, CCR3 및 CCR5 중에서 선택되는 케모카인 수용체에 대한 친화성을 갖는 것인 백신.
전술한 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 펩티드 내의 상기 타겟팅 단위, 다이머화 단위 및 항원 단위는 타겟팅 단위, 다이머화 단위 및 항원 단위의 N-말단에서 C-말단의 순서로 존재하는 것인 백신.
암의 치료를 위한 제1항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에서 정의된 바와 같은 백신의 용도.