TW201930340A

TW201930340A - 新抗原及其用途

Info

Publication number: TW201930340A
Application number: TW107145779A
Authority: TW
Inventors: 維克藍朱內賈
Original assignee: 美商尼恩醫療公司
Priority date: 2017-12-18
Filing date: 2018-12-18
Publication date: 2019-08-01
Also published as: US20240100139A1; WO2019126186A1; US11793867B2; US20210177954A1

Abstract

本發明係關於免疫治療組合物，該組合物包含：包含新抗原決定基之免疫治療肽；編碼該等免疫治療肽之聚核苷酸；包含該等免疫治療肽或聚核苷酸之抗原呈現細胞；或對該等新抗原決定基具有特異性的T細胞受體。本發明亦揭示該等免疫治療組合物之用途。

Description

新抗原及其用途

癌症免疫療法為使用免疫系統來治療癌症。免疫療法利用以下事實：癌細胞通常在其表面上具有可藉由免疫系統偵測到之分子，已知為腫瘤抗原，其通常為蛋白質或其他大分子(例如碳水化合物)。主動免疫療法藉由靶向腫瘤抗原引導免疫系統攻擊腫瘤細胞。被動免疫療法增強現有抗腫瘤反應且包括使用單株抗體、淋巴細胞及細胞介素。腫瘤疫苗典型地由腫瘤抗原及免疫刺激分子(例如佐劑、細胞介素或TLR配位體)構成，其一起起作用以誘發識別且溶解腫瘤細胞之抗原特異性細胞毒性T細胞(CTL)。開發治癒性及腫瘤特異性免疫療法之關鍵障礙之一為鑑別及選擇可避免自體免疫的高度特異性及受限制腫瘤抗原。

由於惡性細胞內之基因改變(例如倒位、易位、缺失、錯義突變、剪接位點突變等)出現的腫瘤新抗原表示抗原之大部分腫瘤特異性種類且可為患者特異性或共用的。腫瘤新抗原為腫瘤細胞特有的，因為突變及其對應蛋白質僅存在於腫瘤中。其亦避免中樞抗性且因此更可能為免疫原性的。因此，腫瘤新抗原提供用於包括藉由體液性及細胞免疫之免疫識別之極佳靶標。然而，由於鑑別新抗原、選擇最佳化新抗原及產生用於疫苗或免疫原性組合物中之新抗原存在技術上的困難，癌症疫苗或免疫原性組合物中已很少使用新抗原。因此，仍需要研發額外癌症治療劑。
以引用的方式併入

本說明書中所提及之所有公開案、專利及專利申請案均以引用的方式併入本文中，其引用的程度如各單獨的公開案、專利或專利申請經特定及單獨地指示以引用的方式併入一般。

在一些態樣中，本文提供一種組合物，其包含：(a)包含蛋白質區域之第一新抗原決定基之第一肽及包含相同蛋白質區域之第二新抗原決定基之第二肽，(b)編碼第一肽及第二肽之聚核苷酸，(c)包含第一肽及第二肽之一或多種抗原呈現細胞(APC)，或(d)對與HLA蛋白質複合之第一新抗原決定基具有特異性的第一T細胞受體(TCR)及對與HLA蛋白質複合之第二新抗原決定基具有特異性的第二TCR，其中第一肽與第二肽不同，且其中第一新抗原決定基包含突變且第二新抗原決定基包含相同突變。

在一些實施例中，第一肽長度比第二肽長至少一個胺基酸，且第二肽為至多13個胺基酸長。在一些實施例中，第二新抗原決定基包含在第一新抗原決定基內。在一些實施例中，第一肽包含與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99一致性的至少9個或10個連續胺基酸之序列。在一些實施例中，第二肽包含與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99一致性的至少8個或9個連續胺基酸之序列。

在一些實施例中，第一新抗原決定基結合至I類HLA蛋白質以形成I類HLA-肽複合物或第一新抗原決定基結合至II類HLA蛋白質以形成II類HLA-肽複合物。在一些實施例中，第二新抗原決定基結合至II類HLA蛋白質以形成II類HLA-肽複合物或第二新抗原決定基結合至I類HLA蛋白質以形成I類HLA-肽複合物。在一些實施例中，第一新抗原決定基為藉由APC由第一肽加工之第一新抗原決定基肽，且第二新抗原決定基為未藉由APC由第二肽加工之第二新抗原決定基肽。

在一些實施例中，第一新抗原決定基長度比第一肽短且第二新抗原決定基長度與第二肽相同。在一些實施例中，第二新抗原決定基活化CD8+ T細胞。在一些實施例中，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基活化CD8+ T細胞。在一些實施例中，第二新抗原決定基活化CD4+ T細胞。在一些實施例中，突變選自由以下組成之群：點突變、剪接位點突變、讀框轉移突變、通讀突變、基因融合突變、插入缺失(indel)及其任何組合。在一些實施例中，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基包含由表1或2之基因編碼之序列。在一些實施例中，蛋白質由表1或2之基因編碼。在一些實施例中，突變為表1或2第2行之突變。在一些實施例中，蛋白質為TMRS22::ERG蛋白質、RAS蛋白質或GATA3蛋白質。

在一些態樣中，本文提供一種醫藥組合物，其包含：(a)本文所描述之組合物；及(b)醫藥學上可接受之賦形劑。

在一些態樣中，本文提供一種治療癌症、預防對癌症療法之抗性或誘導免疫反應的方法，該方法包含向有需要之個體投與根據上文所描述之態樣之醫藥組合物。

在一些態樣中，本文提供一種治療癌症、預防癌症、預防對癌症療法之抗性或誘導免疫反應的方法，該方法包含：(a)向個體投與至少一次劑量之第一免疫原性組合物，其為包含蛋白質區域之第一新抗原決定基之第一肽；及(b)向個體依次投與至少一次劑量之第二免疫原性組合物，其包含第二肽，該第二肽包含相同蛋白質區域之第二新抗原決定基，其中第一肽長度比第二肽長至少一個胺基酸，且第二肽為至多13個胺基酸長。

在一些實施例中，該方法包含誘導與藉由單獨投與一或多次劑量之第一免疫原性組合物或一或多次劑量之第二免疫原性組合物所達成相比增強的免疫反應，由此治療癌症，預防癌症或預防對癌症療法之抗性。在一些實施例中，該方法包含誘導與藉由單獨投與兩次或多於兩次劑量之第一免疫原性組合物或兩次或多於兩次劑量之第二免疫原性組合物所達成相比增強的免疫反應，由此治療癌症，預防癌症或預防對癌症療法之抗性。在一些實施例中，增強的免疫反應包含增加CD8+ T細胞之含量。

在一些實施例中，CD8+ T細胞之TCR結合至I類HLA-肽複合物，其包含第一肽或第二肽。在一些實施例中，CD8+ T細胞之TCR結合至包含第一肽或第二肽之II類HLA-肽複合物。在一些實施例中，增強的免疫反應包含增加CD4+ T細胞之含量。在一些實施例中，CD4+細胞之TCR結合至包含第一肽或第二肽之I類HLA-肽複合物。在一些實施例中，CD4+ T細胞之TCR結合至包含第一肽或第二肽之II類HLA-肽複合物。

在一些實施例中，CD8+ T細胞為效應子記憶T細胞。在一些實施例中，CD4+ T細胞為效應子記憶T細胞。在一些實施例中，增強的免疫反應包含將免疫反應維持與藉由單獨投與一或多次劑量之第一免疫原性組合物或一或多次劑量之第二免疫原性組合物所達成相比更長的持續時間。

在一些實施例中，增強的免疫反應持續至少一天、2天、5天、10天、20天、1個月、2個月、3個月、6個月或1年。在一些實施例中，第一免疫原性組合物進一步包含第二肽。在一些實施例中，第二免疫原性組合物進一步包含第一肽。在一些實施例中，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基包含相同突變。在一些實施例中，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基包含至少一個相同區域胺基酸。

在一些實施例中，第二肽具有至少8個、9個、10個、11個或12個胺基酸之長度。在一些實施例中，第一肽具有至少9個胺基酸之長度。在一些實施例中，第二肽包含與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99一致性的至少8個或9個連續胺基酸之序列。

在一些實施例中，第一肽包含與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99一致性的至少9個或10個連續胺基酸之序列。在一些實施例中，第一新抗原決定基比第二新抗原決定基長。在一些實施例中，第二新抗原決定基具有8至13個胺基酸之長度。在一些實施例中，第一新抗原決定基具有9至25個胺基酸之長度。

在一些實施例中，步驟(b)之連續投與在步驟(a)之後至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、14、21、25、50、100或200天進行。在一些實施例中，該方法進一步包含投與1次、2次、3次、4次或5次劑量之第二免疫原性組合物。在一些實施例中，第二免疫原性組合物之劑量少於第一免疫原性組合物之劑量。

在一些實施例中，治療包含使腫瘤生長、腫瘤體積、轉移瘤數目、腫瘤復發或其組合降低至大於藉由單獨投與一或多次劑量之第一免疫原性組合物或一或多次劑量之第二免疫原性組合物所達成者的程度。在一些實施例中，治療包含個體存活率增強至大於藉由單獨投與一或多次劑量之第一免疫原性組合物或一或多次劑量之第二免疫原性組合物所達成者的程度。

在一些態樣中，本文提供一種用於誘導罹患癌症或處於癌症風險下之個體之增強的免疫反應之方法，該方法包含向該個體投與至少一次劑量之第二免疫原性組合物，其包含第二肽，該第二肽包含蛋白質之第二新抗原決定基，其中個體先前已投與至少一次劑量之第一免疫原性組合物，其包含第一肽，該第一肽包含相同蛋白質之第一新抗原決定基，其中第二肽具有至多13個胺基酸之長度，且其中第一肽長度比第二肽長至少一個胺基酸。

交叉引用
本申請案主張2017年12月18日申請之美國臨時申請案第62/607,148號的權益，該臨時申請案以全文引用之方式併入本文中。
序列表
本申請案包含序列表，其業經以ASCII格式藉由電子方式提交且以全文引用的方式併入本文中。該ASCII複本創建於2019年1月10日，命名為50401-721_601_SL.txt且大小為452,220位元。

本文描述基於由個體腫瘤特有的突變事件產生之新抗原之發現的新穎免疫治療劑及其用途。因此，本文所描述之本發明提供可用於例如刺激對腫瘤相關抗原或新抗原決定基之免疫反應以產生用於治療疾病之免疫原性組合物或癌症疫苗的肽、編碼該等肽之聚核苷酸及肽結合劑。

以下描述及實例詳細說明本發明之實施例。應理解，本發明不限於本文所描述之特定實施例且因而可改變。熟習此項技術者應認識到，本發明存在多種變化及修改，其涵蓋在本發明之範疇內。

所有術語均意圖理解為熟習此項技術者所理解之含義。除非另作定義，否則本文所使用之所有技術及科學術語均具有與由一般熟習本發明所屬之技術者通常所理解相同的含義。

本文所使用之部分標題僅出於組織目的且不應理解為限制所描述之主題。

儘管本發明之各種特徵可描述於單個實施例之上下文中，但該等特徵亦可分開或以任何適合組合形式提供。相反地，儘管為了清楚起見在單獨實施例之上下文中可在本文中描述本發明，但本發明亦可實施於單個實施例中。

以下定義係對此項技術中該等定義之補充且針對本申請案，而不應歸於任何相關或不相關情形，例如任何共同擁有之專利或申請案。雖然類似或等效於本文所描述之彼等方法及材料之任何方法及材料可用於本發明之實踐或測試中，但本文描述較佳方法及材料。因此，本文所使用之術語僅出於描述特定實施例的目的且並不意欲為限制性的。

定義

本文所使用之術語僅用於描述特定情況之目的且並不意欲為限制性的。在本申請案中，除非另外明確陳述，否則單數之使用包括複數。如本文所使用，除非上下文另外清楚地指示，否則單數形式「一」及「所述」意欲亦包含複數形式。

在本申請案中，除非另有陳述，否則「或」之使用意謂「及/或」。如本文所使用之術語「及/或」及「其任何組合」及其語法等效物可互換使用。此等術語可表達尤其涵蓋之任何組合。僅出於說明之目的，以下片語「A、B及/或C」或「A、B、C或其任何組合」可意謂「單獨地A；單獨地B；單獨地C；A及B；B及C；A及C；及A、B及C」。除非上下文尤其係指分開使用，否則術語「或」可結合或分開使用。

術語「約」或「大致」可在如一般熟習此項技術者所測定之特定值之可接受的誤差範圍內，其將部分地視值量測或測定方法，亦即量測系統之限制而定。舉例而言，根據此項技術中之實踐，「約」可意謂在1或大於1個標準偏差內。或者，「約」可意謂既定值之至多20%、至多10%、至多5%或至多1%之範圍。或者，尤其就生物系統或方法而言，該術語可意謂在一定值之一個數量級範圍內，較佳在5倍範圍內且更佳在2倍範圍內。若特定值描述於本申請案及申請專利範圍中，除非另有說明，否則應假設術語「約」意謂在特定值之可接受誤差範圍內。

如本說明書及申請專利範圍中所用，詞語「包含(comprising)」(及包含之任何形式，諸如「包含(comprise)」及「包含(comprises)」)、「具有(having)」(及具有之任何形式，諸如「具有(have)」及「具有(has)」)、「包括(including)」(及包括之任何形式，諸如「包括(includes)」及「包括(include)」)或「含有(containing)」(及含有之任何形式，諸如「含有(contains)」及「含有(contain)」為包括性或開放的且不排除額外未列出之要素或方法步驟。預期在本說明書中論述之任何實施例可利用本發明之任何方法或組合物實施，且反之亦然。此外，本發明之組合物可用於實現本發明之方法。

在本說明書中提及「一些實施例」、「一實施例」、「一個實施例」或「其他實施例」意謂結合實施例描述之特定特徵、結構或特性包括於本發明之至少一些實施例，但不一定所有實施例中。為了促進對本發明的理解，在下文中定義多個術語及片語。

「主要組織相容複合體」或「MHC」為在控制引起生理學免疫反應之細胞相互作用方面起作用之基因集群。在人體內，MHC複合物亦稱為人類白細胞抗原(HLA)複合物。對於MHC及HLA複合物之具體實施方式，參見Paul, Fundamental Immunology,第3版, Raven Press, New York (1993)。「主要組織相容複合體(MHC)之蛋白質或分子」、「MHC分子」、「MHC蛋白質」或「HLA蛋白質」應理解為意謂能夠結合由蛋白質抗原之蛋白水解裂解產生之肽且代表潛在淋巴細胞抗原決定基(例如T細胞抗原決定基及B細胞抗原決定基)、將其傳輸至細胞表面且在彼處向特異性細胞，尤其細胞毒性T淋巴球、T-輔助細胞或B細胞呈現其之蛋白質。基因組中之主要組織相容複合體包含表現於細胞表面上之基因產物對於結合及呈現內源性及/或外來抗原且因此用於調整免疫過程而言重要的基因區域。主要組織相容複合體分為編碼不同蛋白質之兩個基因組，亦即，MHC I類分子及MHC II類分子。兩個MHC類別之細胞生物學及表現圖案適於此等不同作用。

「人類白細胞抗原」或「HLA」為人類I類或II類主要組織相容複合體(MHC)蛋白質(參見例如Stites等人, Immunology,第8版, Lange Publishing, Los Altos, Calif. (1994)。

如本文所使用之「多肽」、「肽」及其語法等效物係指胺基酸殘基之聚合物。「成熟蛋白」為全長且視情況包括給定細胞環境中蛋白質典型的糖基化或其他修飾之蛋白質。本文所揭示之多肽及蛋白質(包括其功能性部分及功能變異體)可包含合成胺基酸而非一或多種天然存在的胺基酸。此類合成胺基酸為此項技術中已知的，且包括例如胺基環己烷甲酸、正白胺酸、α-胺基正癸酸、高絲胺酸、S-乙醯胺基甲基-半胱胺酸、反式-3-羥脯胺酸及反式-4-羥脯胺酸、4-胺基苯丙胺酸、4-硝基苯丙胺酸、4-氯苯丙胺酸、4-羧基苯丙胺酸、β-苯基絲胺酸β-羥基苯基丙胺酸、苯基甘胺酸、α-萘基丙胺酸、丙胺酸環己酯、環己基甘胺酸、吲哚啉-2-甲酸、1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酸、胺基丙二酸、胺基丙二酸單醯胺、N'-苯甲基-N'-甲基-離胺酸、N',N'-二苯甲基-離胺酸、6-羥基離胺酸、鳥胺酸、α-胺基環戊烷甲酸、α-胺基環己烷甲酸、α-胺基環庚烷甲酸、α-(2-胺基-2-降冰片烷)-甲酸、α,γ-二胺基丁酸、α,β-二胺基丙酸、高苯丙胺酸及α-第三丁基甘胺酸。本發明進一步涵蓋經工程改造之細胞中之本文所描述之多肽之表現可能與多肽構建體之一或多種胺基酸之轉譯後修飾相關。轉譯後修飾之非限制性實例包括磷酸化、醯化(包括乙醯化及甲醯化)、糖基化(包括N-聯結及O-聯結)、醯胺化、羥基化、烷基化(包括甲基化及乙基化)、泛素化、添加吡咯啶酮甲酸、形成二硫橋鍵、硫酸化、豆蔻醯化、棕櫚醯化、異戊烯化、法呢基化、香葉基化、糖基磷脂醯肌醇化、脂化及碘化。

「免疫原性」肽或「免疫原性」抗原決定基或「肽抗原決定基」為包含對偶基因特異性基元以使得肽將結合HLA分子且誘發細胞介導或體液性反應，例如細胞毒性T淋巴細胞(CTL(例如CD8+))、輔助T淋巴細胞(Th (例如CD4+))及/或B淋巴細胞反應的肽。因此，本文所描述之免疫原性肽能夠結合至適當的HLA分子且其後誘導對肽之CTL (細胞毒性)反應或HTL (及體液性)反應。

「新抗原」意謂由蛋白質之腫瘤特異性變化產生之一類腫瘤抗原。新抗原涵蓋但不限於由例如蛋白質序列取代、讀框轉移突變、融合多肽、框內缺失、插入、內源性逆轉錄病毒多肽表現及多肽之腫瘤特異性過度表現產生的腫瘤抗原。

在本說明書中可與「肽」互換使用之術語「突變肽」、「新抗原肽」及「新抗原肽」係指典型地藉由α-胺基與相鄰胺基酸之羧基之間的肽鍵將一個連接至另一個的一系列殘基，典型地L-胺基酸。類似地，術語「多肽」可在本說明書中與「突變多肽」、「新抗原多肽」及「新抗原多肽」互換使用以表示典型地藉由α-胺基與相鄰胺基酸之羧基之間的肽鍵將一個連接至另一個的一系列殘基，例如L-胺基酸。多肽或肽可為多種長度，呈其中性(不帶電)形式或呈鹽形式，且不含修飾，諸如糖基化、側鏈氧化或磷酸化或含有此等修飾，經受不破壞如本文所描述之多肽之生物活性的修飾之條件。如本文所使用之肽或多肽包含至少一個側接序列。如本文所使用之術語「側接序列」係指不為新抗原決定基之一部分的新抗原肽之片段或區域。

術語「殘基」係指藉由醯胺鍵或醯胺鍵模擬物或編碼胺基酸或胺基酸模擬物之核酸(DNA或RNA)併入肽或蛋白質中之胺基酸殘基或胺基酸模擬物殘基。

「新抗原決定基」、「腫瘤特異性新抗原決定基」或「腫瘤抗原」係指不存在於參考物中之抗原決定基或抗原決定子區域，諸如非病變細胞，例如非癌細胞或生殖系細胞，但於病變細胞，例如癌細胞中可見。此包括對應抗原決定基可見於常用非病變細胞或生殖系細胞中的情境，但歸因於病變細胞，例如癌細胞中之一或多種突變，改變抗原決定基之序列以產生新抗原決定基。如本文所使用之術語「新抗原決定基」係指肽或新抗原肽內之抗原決定子區域。新抗原決定基可包含至少一個「錨殘基」及「至少一個」錨殘基側接區域。新抗原決定基可進一步包含「分離區域」。術語「錨殘基」係指結合至HLA上之特異性袋之胺基酸殘基，產生與HLA之相互作用之特異性。在一些情況下，錨殘基可在典型錨位置處。在其他情況下，錨殘基可在非典型錨位置處。新抗原決定基可經由突出至肽-結合槽中之袋中之一級及二次錨殘基結合至HLA分子。在肽-結合槽中，特異性胺基酸構成適應所呈現之新抗原決定基之錨殘基之對應側鏈的袋。肽-結合優選項存在於HLA I及HLA II分子之不同等位基因中。HLA I類分子結合短新抗原決定基，其N端及C端固定至位於新抗原決定基結合槽之端處的袋中。儘管HLA I類結合新抗原決定基之大部分具有約9個胺基酸，更長新抗原決定基可藉由凸出其中心部分調節，產生約8至12個胺基酸之結合新抗原決定基。結合至HLA II類蛋白質之新抗原決定基不受尺寸限制，且可在約16至25個胺基酸範圍內變化。HLA II類分子中之新抗原決定基結合槽在兩端敞開，其實現具有相對更長長度之肽之結合。儘管核心9個胺基酸殘基長節段大部分有助於識別新抗原決定基，但錨殘基側接區域對於肽對HLA II類對偶基因之特異性亦為重要的。在一些情況下，錨殘基側接區域為N端殘基。在另一情況下，錨殘基側接區域為C端殘基。在又一情況下，錨殘基側接區域為N端殘基及C端殘基。在一些情況下，錨殘基側接區域藉由至少兩個錨殘基側接。藉由錨殘基側接之錨殘基側接區域為「分離區域」。

「參考物」可用於與腫瘤樣本本發明之方法中所獲得之結果進行關聯及比較。典型地，「參考物」可基於一或多種常用樣本，尤其不受癌症疾病影響之樣本(獲自患者或一或多個不同個體，例如健康個體，尤其相同物種之個體)獲得。「參考物」可憑經驗藉由測試足夠大量數目之常用樣本測定。

「抗原決定基」為一起形成藉由例如免疫球蛋白、T細胞受體、HLA分子或嵌合抗原受體識別之位點的分子，諸如一級、二級及三級肽結構及電荷之集合特徵。替代地，抗原決定基可定義為涉及藉由特定免疫球蛋白識別之一組胺基酸殘基，或在T細胞之上下文中，藉由T細胞受體蛋白質、嵌合抗原受體及/或主要組織相容複合體(MHC)受體識別所需的彼等殘基。「T細胞抗原決定基」應理解為意謂可與呈肽呈現MHC分子或MHC複合物形式且隨後以此形式識別且與T細胞，諸如T淋巴球或T-輔助細胞結合的I或II類之MHC分子結合的肽序列。抗原決定基可藉由自天然來源分離製備，或其可根據此項技術中之標準方案合成。合成抗原決定基可包含人造胺基酸殘基、「胺基酸模擬物」，諸如天然存在的L胺基酸殘基或非天然存在的胺基酸殘基之D異構體，諸如丙胺酸環己酯。在整個本發明中，抗原決定基可在一些情況下稱作肽或肽抗原決定基。應瞭解，包含本文所描述之抗原決定基或類似物以及額外胺基酸之蛋白質或肽仍在本發明之界限內。在某些實施例中，肽包含抗原片段。在某些實施例中，對本發明之肽之長度存在限制。當本文所描述之包含抗原決定基之蛋白質或肽包含與天然序列具有100%一致性之區域(亦即，一系列連續胺基酸殘基)時，存在長度有限實施例。為了避免例如在整個天然分子上由讀取界定抗原決定基，與天然肽序列具有100%一致性之任何區域之長度存在限制。因此，對於包含本文所描述之抗原決定基之肽及與天然肽序列具有100%一致性之區域，與天然序列具有100%一致性之區域一般具有以下長度：小於或等於600個胺基酸殘基，小於或等於500個胺基酸殘基，小於或等於400個胺基酸殘基，小於或等於250個胺基酸殘基，小於或等於100個胺基酸殘基，小於或等於個85胺基酸殘基，小於或等於75個胺基酸殘基，小於或等於65個胺基酸殘基，且小於或等於50個胺基酸殘基。在某些實施例中，具有與天然肽序列(以任何增量降至5個胺基酸殘基；例如50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸殘基)具有100%一致性之具有小於51個胺基酸殘基的區域的肽包含本文所描述之「抗原決定基」。

用於描述肽或蛋白質之命名法遵循習知慣例，其中胺基呈現在每一胺基酸殘基左側(胺基或N端)且羧基呈現在每一胺基酸殘基右側(羧基或C端)。當在肽抗原決定基中提及胺基酸殘基位置時，其在胺基至羧基方向上編號，其中一個位置為位於抗原決定基之胺基端處之殘基或肽或其蛋白質可為一部分。在代表本發明之所選特定實施例之式中，除非另外說明，否則胺基及羧基端基(儘管未具體展示)呈其在生理學pH值下將呈現之形式。在胺基酸結構式中，每一殘基一般由標準三個字母或單個字母名稱表示。胺基酸殘基之L-形式由單個大寫字母或三個字母符號之首個大寫字母表示，且具有D-形式之彼等胺基酸殘基之D-形式由單個小寫字母或三個小寫字母符號表示。然而，當無大寫字母之情況下使用三個字母符號或全名時，其可指L胺基酸殘基。甘胺酸不具有不對稱碳原子且僅稱為「Gly」或「G」。一般使用標準單個字母符號指定本文所闡述之肽之胺基酸序列。(A，丙胺酸；C，半胱胺酸；D，天冬胺酸；E，麩胺酸；F，苯丙胺酸；G，甘胺酸；H，組胺酸；I，異白胺酸；K，離胺酸；L，白胺酸；M，甲硫胺酸；N，天冬醯胺；P，脯胺酸；Q，谷醯胺酸；R，精胺酸；S，絲胺酸；T，蘇胺酸；V，纈胺酸；W，色胺酸；及Y，酪胺酸。)

術語「突變」係指相比於參考物，核酸序列之變化或差異(核苷酸取代、添加或缺失)。「體細胞突變」可發生在除胚細胞(精子及卵)外之任何身體細胞中且因此不傳給兒童。此等改變可(但不總是)引起癌症或其他疾病。在一些實施例中，突變為非同義突變。術語「非同義突變」係指突變，例如核苷酸取代，其導致胺基酸改變，諸如轉譯產物中之胺基酸取代。當突變干擾基因密碼子週期性之正相(亦稱為「閱讀框架」)時，發生「讀框轉移」，導致轉譯非天然蛋白質序列。基因中之不同突變有可能實現相同改變的閱讀框架。

「保守性胺基酸取代」為一個胺基酸殘基經具有類似側鏈之另一個胺基酸殘基置換之取代。此項技術中已定義具有類似側鏈之胺基酸殘基家族，包括鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β分支側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。舉例而言，用苯丙胺酸取代酪胺酸為保守取代。鑑別不消除肽官能團之核苷酸及胺基酸保守取代的方法在此項技術中已熟知。

如本文所使用，術語「親和力」係指結合對，例如HLA-結合肽及I或II類HLA之兩個成員之間的結合強度之量度。KD為解離常數且具有莫耳濃度之單位。親和力常數為解離常數之倒數。親和力常數有時用作通用術語以描述此化學實體。其為結合能量之直接量度。可以實驗方式，例如藉由表面電漿子共振(SPR)，使用市售Biacore SPR單位測定親和力。親和力亦可表示為置換50%肽所處之濃度的抑制性濃度50 (IC50)。同樣地，ln(IC50)係指IC50之自然對數。Koff係指解離速率常數，例如對於HLA-結合肽及I或II類HLA之解離。在整個本發明中，「結合資料」結果可在「IC50」方面表示。IC50為觀測到標記參考肽之結合之50%抑制所處的結合分析中之測試肽之濃度。給定進行分析之條件(亦即，限制HLA蛋白質及標記參考肽濃度)，此等值近似KD值。用於測定結合之分析為此項技術中眾所周知的且細節描述於例如PCT公開案WO 94/20127及WO 94/03205及其他公開案中，諸如Sidney等人, Current Protocols in Immunology 18.3.1 (1998)；Sidney等人, J. Immunol. 154:247 (1995)；及Sette等人, Mol. Immunol. 31:813 (1994)。替代地，結合可相對於藉由參考標準肽結合表示。舉例而言，相對於參考標準肽之IC50，可基於其IC50。結合亦可使用包括使用以下之彼等者之其他分析系統測定：活細胞(例如Ceppellini等人, Nature 339:392 (1989)；Christnick等人, Nature 352:67 (1991)；Busch等人, Int. Immunol. 2:443 (1990)；Hill等人, J. Immunol. 147:189 (1991)；del Guercio等人, J. Immunol. 154:685 (1995))；使用清潔劑裂解物之無細胞系統(例如Cerundolo等人, J. Immunol. 21:2069 (1991))；固定化純化MHC (例如Hill等人, J. Immunol. 152, 2890 (1994)；Marshall等人, J. Immunol. 152:4946 (1994))；ELISA系統(例如Reay等人, EMBO J. 11:2829 (1992))；表面電漿子共振(例如Khilko等人, J. Biol. Chem. 268:15425 (1993))；較高通量可溶相分析(Hammer等人, J. Exp. Med. 180:2353 (1994))；及I類MHC穩定或組裝之量測(例如Ljunggren等人, Nature 346:476 (1990)；Schumacher等人, Cell 62:563 (1990)；Townsend等人, Cell 62:285 (1990)；Parker等人, J. Immunol. 149:1896 (1992))。「交叉反應結合」指示肽與多於一種HLA分子結合；同義詞為簡併結合。

術語「衍生」及其語法等效物在用於論述抗原決定基時為「製備」及其語法等效物之同義詞。衍生抗原決定基可自天然來源分離，或其可根據此項技術中之標準方案合成。合成抗原決定基可包含人造胺基酸殘基「胺基酸模擬物」，諸如天然存在的L胺基酸殘基或非天然存在的胺基酸殘基之D異構體，諸如丙胺酸環己酯。衍生或製備的抗原決定基可為天然抗原決定基之類似物。

「稀釋劑」包括無菌液體，諸如水及油，包括石油、動物、植物或合成來源之彼等者，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油及其類似者。水亦為用於醫藥組合物之稀釋劑。亦可使用生理食鹽水溶液及右旋糖水溶液以及甘油溶液作為稀釋劑，例如可注射溶液。

「天然」或「野生型」序列係指自然界中發現之序列。此類序列可包含自然界中更長的序列。

「受體」應理解為意謂能夠結合配位體的生物分子或分子群。受體可用於傳送細胞、細胞形成或生物體的資訊。受體包含至少一個受體單元，例如其中每一受體單元可由蛋白質分子組成。受體具有與配位體結構互補的結構且可與作為結合搭配物的配位體複合。該資訊尤其藉由在細胞表面上之配位體複合之後受體之構形變化傳輸。在一些實施例中，受體應理解為尤其意謂能夠形成與配位體之受體/配位體複合物之MHC I及II類之蛋白質，尤其適合的長度之肽或肽片段。

「配位體」應理解為意謂具有與受體結構互補之結構且能夠與此受體形成複合物的分子。在一些實施例中，配位體應理解為意謂在其胺基酸序列中具有適合的長度及適合的結合基元以使得肽或肽片段能夠與MHC I類或MHC II類之蛋白質形成複合物的肽或肽片段。

在一些實施例中，「受體/配位體複合物」亦應理解為意謂「受體/肽複合物」或「受體/肽片段複合物」包括呈現I類或II類之MHC分子之肽或肽片段。

術語「肽」係指典型地藉由α-胺基與相鄰胺基酸殘基之羧基之間的肽鍵將一個連接至另一個的一系列胺基酸殘基。

「合成肽」係指獲自非天然來源，例如人造的肽。此類肽可使用諸如化學合成或重組DNA技術之方法產生。「合成肽」包括「融合蛋白」。

術語「基元」係指經界定長度之胺基酸序列中之殘基圖案，例如小於約15個胺基酸殘基長或小於約13個胺基酸殘基長，例如約8至約13個胺基酸殘基(例如8、9、10、11、12或13) (對於I類HLA基元)及約6至約25個胺基酸殘基(例如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25) (對於II類HLA基元)的肽，其藉由特定HLA分子識別。對於由給定人類HLA對偶基因編碼之每一HLA蛋白質，基元典型地不同。此等基元不同之處在於一級及二級錨殘基之其圖案。在一些實施例中，MHC I類基元鑑別出9、10或11個胺基酸殘基長之肽。

如本文所使用之術語「天然存在的」及其語法等效物係指自然界中可見的物體之事實。舉例而言，存在於生物體(包括病毒)中且可自自然界中之來源分離且人類尚未在實驗室中有意修飾之肽或核酸為天然存在的。

根據本發明，術語「疫苗」係關於在投與後誘導免疫反應，例如細胞或體液性免疫反應(其識別且攻擊病原體或病變細胞，諸如癌細胞)之醫藥製劑(醫藥組合物)或產物。疫苗可用於預防或治療疾病。術語「個體化癌症疫苗」或「個性化癌症疫苗」涉及特定癌症患者且意謂適於個體癌症患者之需求或特定情況的癌症疫苗。

「保護性免疫反應」或「治療性免疫反應」係指對來源於病原性抗原(例如腫瘤抗原)之抗原的CTL及/或HTL反應，其以某些方式預防或至少部分停滯疾病症狀、副作用或進展。免疫反應亦可包括已藉由刺激輔助T細胞促進之抗體反應。

「抗原處理」或「處理」及其語法等效物係指多肽或抗原降解成處理產物，其為該多肽或抗原之片段(例如多肽降解成肽)及此等片段中之一或多者與藉由細胞，例如抗原呈現細胞呈現至特異性T細胞之MHC分子(例如經由結合)締合。

「抗原呈現細胞」(APC)為呈現與其細胞表面上之MHC分子結合的蛋白質抗原之肽片段的細胞。某些APC可活化抗原特異性T細胞。專業抗原呈現細胞藉由吞噬作用或藉由受體介導之內飲作用，且隨後在其膜上呈現結合至II類MHC分子之抗原之片段而在內化抗原方面極其有效。T細胞識別且與抗原呈現細胞膜上之抗原-II類MHC分子複合物相互作用。額外共刺激信號隨後藉由抗原呈現細胞產生，導致T細胞活化。共刺激分子之表現為專業抗原呈現細胞之限定特徵。專業抗原呈現細胞之主要類型為具有最寬抗原呈現範圍之樹突狀細胞且很可能為最重要的抗原呈現細胞、巨噬細胞、B細胞及某些活化上皮細胞。樹突狀細胞(DC)為經由MHC II及I類抗原呈現路徑呈現在外周組織至T細胞中捕獲之抗原的白細胞群體。眾所周知樹突狀細胞為免疫反應之有效誘導劑且此等細胞之活化為用於誘導抗腫瘤免疫性之關鍵步驟。樹突狀細胞適宜地分成「不成熟」及「成熟」細胞，其可用作在兩種良好表徵表型之間辨別的簡單方式。然而，此命名法不應視為不包括所有可能的分化中間階段。不成熟樹突狀細胞表徵為具有抗原吸收及處理高容量之抗原呈現細胞，其與Fc受體(FcR)及甘露糖受體之較高表現相關。成熟表型典型地藉由此等標記物之較低表現表徵，但引起T細胞活化之細胞表面分子，諸如I類及II類MHC、黏附分子(例如CD54及CD11)及共刺激分子(例如CD40、CD80、CD86及4-1 BB)之較高表現。

如本文所使用之術語「一致性」及其語法等效物或在多肽之兩個核酸序列或胺基酸序列之上下文中的「序列一致性」係指當經由指定比較窗比對最大一致性時相同的兩個序列中之殘基。如本文所使用，「比較窗」係指至少約20個連續位置，通常約50至約200，更通常約100至約150個的節段，其中序列可在兩個序列最佳比對之後與相同數目連續位置之參考序列進行比較。比對供比較之序列的方法係此項技術中熟知的。供比較之序列之最佳比對可藉由Smith及Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 (1981)之局部同源算法；藉由Needleman及Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 (1970)之比對演算法；藉由Pearson及Lipman, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 85:2444 (1988)之類似性方法搜索；藉由此等算法之電腦化實施方案(包括(但不限於) Intelligentics, Mountain View Calif.之PC/基因程序中之CLUSTAL；Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wis., U.S.A.中之GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA及TFASTA)；Higgins及Sharp, Gene, 73:237-244 (1988)及Higgins及Sharp, CABIOS, 5:151-153 (1989)中充分描述之CLUSTAL程序；Corpet等人, Nucleic Acids Res., 16:10881-10890 (1988)；Huang等人, Computer Applications in the Biosciences, 8:155-165 (1992)；及Pearson等人, Methods in Molecular Biology, 24:307-331 (1994)進行。比對亦通常藉由檢測及手動比對進行。在一類實施例中，本文中之多肽與參考多肽或其片段具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性，例如使用默認參數如藉由BLASTP (或CLUSTAL或任何其他可用的比對軟體)所量測。類似地，核酸亦可參考起始核酸描述，例如其可與參考核酸或其片段具有50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、98%、99%或100%序列一致性，例如使用默認參數如藉由BLASTN (或CLUSTAL或任何其他可用的比對軟體)所量測。當一個分子據稱與較大分子具有一定百分比之序列一致性時，其意謂根據兩個分子最佳比對順序當兩個分子最佳比對時，較小分子中該百分比之殘基與較大分子中之殘基匹配。

適用於核酸或胺基酸序列之術語「實質上一致」及其語法等效物意謂核酸或胺基酸序列包含相比於使用上文所描述之方案，例如BLAST，使用標準參數之參考序列具有至少90%或多於90%、至少95%、至少98%及至少99%序列一致性的序列。舉例而言，BLASTN程式(就核苷酸序列而言)使用如下預設值：字長(W)為11，期望值(E)為10，M=5，N=-4及兩股之比較。對於胺基酸序列而言，BLASTP程式係使用字長(W) 3、期望值(E) 10及BLOSUM62評分矩陣(參見Henikoff及Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992))作為預設參數。序列一致性百分比藉由比較兩個在比較窗上最佳比對的序列來確定，其中為了使兩個序列達成最佳比對，多核苷酸序列在比較窗中之部分相較於參考序列(不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(亦即空隙)。藉由如下步驟計算百分比：測定兩個序列中存在之一致核酸鹼基或胺基酸殘基的位置數，得到匹配位置數，將匹配位置數除以比較窗中之總位置數且將結果乘以100，得到序列一致性百分比。在實施例中，實質上一致性在至少約50個殘基長之序列區域上，在至少約100個殘基之區域上存在，且在實施例中，序列在至少約150個殘基上實質上一致。在實施例中，序列在編碼區之整個長度上實質上一致。

如本文所使用之術語「載體」意謂能夠遞送且通常表現宿主細胞中之一或多種相關基因或序列的構建體。載體之實例包括(但不限於)病毒載體、裸DNA或RNA表現載體、質體、黏質體或噬菌體載體、與陽離子縮合劑相關之DNA或RNA表現載體及囊封在脂質體中之DNA或RNA表現載體。

「經分離」之多肽、抗體、聚核苷酸、載體、細胞或組合物為呈自然界中未發現之形式的多肽、抗體、聚核苷酸、載體、細胞或組合物。經分離之多肽、抗體、聚核苷酸、載體、細胞或組合物包括已在一定程度上純化，使得其不再呈自然界中所發現之形式的彼等物。在一些實施例中，經分離之多肽、抗體、聚核苷酸、載體、細胞或組合物實質上為純的。在一些實施例中，「經分離之聚核苷酸」涵蓋PCR或定量PCR反應物，其包含在PCR或定量PCR反應中擴增之聚核苷酸。

術語「經分離」、「生物上純的」或其語法等效物係指實質上或基本上不含組分的材料，其通常伴隨呈其自然狀態下可見的形式之材料。因此，本文所描述之經分離之肽並不含有通常與其原位環境中之肽相關之材料中之一些或全部。「經分離的」抗原決定基係指不包括抗原決定基所衍生之抗原之整個序列的抗原決定基。典型地，「經分離的」抗原決定基不具有附著於其上、產生在天然序列之整個長度上具有100%一致性之序列的額外胺基酸殘基。天然序列可為抗原決定基所衍生的序列，諸如腫瘤相關抗原。因此，術語「經分離的」意謂自其初始環境(例如若其為天然存在的，則為天然環境)移除材料。「經分離的」核酸為自其天然環境移除之核酸。舉例而言，活動物中存在之天然存在的聚核苷酸或肽未分離，但分離自天然系統中之共存材料中之一些或全部分離的相同聚核苷酸或肽。此類聚核苷酸可為載體之部分，及/或此類聚核苷酸或肽可為組合物之部分，且又「經分離」，因為此類載體或組合物不為其天然環境之部分。經分離之RNA分子包括本文所描述之DNA分子之活體內或活體外RNA轉錄物，且進一步包括以合成方式產生之此類分子。

如本文所使用之術語「實質上純化」及其語法等效物係指基本上不含，亦即大於約50%不含，大於約70%不含，大於約90%不含與核酸、多肽、蛋白質或其他化合物自然相關的聚核苷酸、蛋白質、多肽及其他分子的核酸序列、多肽、蛋白質或其他化合物。

如本文所使用之術語「實質上純」係指至少50%純(亦即，不含污染物)、至少90%純、至少95%純、至少98%純或至少99%純的材料。

術語「聚核苷酸」、「核苷酸」、「核酸」、「聚核酸」或「寡核苷酸」及其語法等效物在本文中可互換使用且係指任何長度之核苷酸之聚合物，且包括DNA及RNA，例如mRNA。因此，此等術語包括雙股及單股DNA、三股螺旋DNA以及雙股及單股RNA。其亦包括例如藉由甲基化及/或藉由封蓋經修飾及未經修飾之聚核苷酸形式。術語亦意欲包括：包括非天然存在或合成核苷酸以及核苷酸類似物之分子。本文中所揭示或涵蓋之核酸序列及載體可藉由例如轉染、轉化或轉導引入至細胞中。核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼及/或其類似物或任何可藉由DNA或RNA聚合酶併入聚合物中之受質。在一些實施例中，聚核苷酸及核酸可為活體外經轉錄之mRNA。在一些實施例中，使用本發明之方法投與之聚核苷酸為mRNA。

如本文所使用之「轉染」、「轉化」或「轉導」係指藉由使用物理或化學方法將一或多種外源聚核苷酸引入至宿主細胞中。許多轉染技術為此項技術中已知的且包括例如磷酸鈣DNA共沈澱(參見例如Murray E.J. (編), Methods in Molecular Biology, 第7卷, Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press (1991))；DEAE-葡聚糖；電穿孔；陽離子脂質體介導之轉染；鎢粒子促進之微粒轟擊(Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990))；及磷酸鍶DNA共沈澱(Brash等人, Mol. Cell Biol, 7: 2031-2034 (1987))。在感染性顆粒在適合之包裝細胞中生長之後，可將噬菌體或病毒載體引入至宿主細胞中，其中許多為市售的。

當核酸及/或核酸序列天然或人工地來源於共同上代核酸或核酸序列時，其為「同源」的。當編碼DNA之蛋白質及/或蛋白質序列天然或人工地來源於共同上代核酸或核酸序列時，其為「同源」的。同源分子可稱為同系物。舉例而言，如本文所描述之任何天然存在之蛋白質可藉由任何可用的突變誘發方法經修飾。當表現時，此誘變處理核酸編碼與由初始核酸編碼之蛋白質同源之多肽。同源性一般由兩個或多於兩個核酸或蛋白質(或其序列)之間的序列一致性推斷。適用於確立同源性之序列之間的一致性之精確百分比隨所研究之核酸及蛋白質而變化，但常規地使用小至25%序列一致性來確立同源性。較高水準之序列一致性，例如30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%或多於99%亦可用於確定同源性。用於測測序列一致性百分比(例如使用預設參數之BLASTP及BLASTN)之方法描述於本文中且一般為可用的。

術語「個體」係指任何動物(例如哺乳動物)，包括(但不限於)人類、非人類靈長類動物、犬科動物、貓科動物、嚙齒動物及其類似者，其為特定治療受體。典型地，術語「個體」及「患者」在本文中提及人類個體時可互換使用。

術語「有效量」或「治療有效量」或「治療效果」係指能有效地「治療」個體或哺乳動物之疾病或病症之治療劑的量。藥物之治療有效量具有治療效果且因而可預防疾病或病症發展；減緩疾病或病症發展；減緩疾病或病症進展；在一定程度上緩解與疾病或病症相關之症狀中之一或多者；降低罹病率及死亡率；改良生活品質；或此類作用之組合。

術語「治療(treating/treatment)」或「為了治療(to treat)」或「減輕(alleviating)」或「為了減輕(to alleviate)」係指以下兩者：(1)治癒、減緩、減輕診斷病理病狀或病症的症狀及/或停止其進展之治療措施及(2)預防或減緩靶向的病理病狀或病症之發展之預防性或防治性措施。因此，需要治療的彼等者包括已經患有病症之彼等者；易於患有病症之彼等者；及其中待預防病症之彼等者。

「醫藥學上可接受之」係指一般無毒、惰性及/或生理相容組合物或組合物之組分。

「醫藥賦形劑」或「賦形劑」包含諸如佐劑、載劑、pH調節劑及緩衝劑、張力調節劑、潤濕劑、防腐劑及其類似者的材料。「醫藥賦形劑」為醫藥學上可接受之賦形劑。

新抗原及其用途

開發治癒性及腫瘤特異性免疫療法之關鍵障礙之一是鑑別及選擇出避免自體免疫的高度特異性及受限制腫瘤抗原。惡性細胞內基因改變(例如反轉、易位、缺失、錯義突變、拼接位點突變等)結果所產生的腫瘤新抗原是最具腫瘤特異性類別的抗原。由於鑑別新抗原、選擇最佳化新抗原及產生用於疫苗或免疫原性組合物中之新抗原存在技術上的困難，癌症疫苗或免疫原性組合物中已很少使用新抗原。此等問題可藉由以下步驟解決：鑑別出贅瘤/腫瘤中之突變，該等突變係存在於腫瘤中的DNA層次但不存在於來自大比例患有癌症個體之相配生殖系樣品中；用一或多種肽-MHC結合預測算法分析所鑑別之突變以產生複數個在贅瘤/腫瘤內表現且結合至大比例患者HLA等位基因之新抗原T細胞抗原決定基；及合成選自用於適用於治療大比例患有癌症之個體之癌症疫苗或免疫原性組合物中之所有新抗原肽及預測結合肽之組的複數個新抗原肽。

舉例而言，將肽測序資訊轉譯至治療疫苗中可包括預測可結合至大比例個體之HLA分子之突變肽。高效挑選特定突變以用作免疫原需要預測將高效地結合至大比例患者之HLA等位基因之突變肽的能力。最近，基於神經網路的學習方式配合驗證結合肽及非結合肽已使針對主要HLA-A及HLA-B對偶基因之預測算法的準確度提高。然而，即使使用基於高級神經網路之算法來編碼HLA-肽結合定則，若干因素限制HLA等位基因上呈現之預測肽的能力。

將肽測序資訊轉譯至治療疫苗中之另一實例可包括將藥物調配為長肽之多抗原決定基疫苗。在實務上儘可能靶向許多突變型抗原決定基有可能利用免疫系統的巨大容量，藉由下調免疫靶向基因產物來阻止免疫逃避機會，且彌補抗原決定基預測方式的已知不準確度。合成肽為有效製備多種免疫原及將所鑑別的突變型抗原決定基快速轉譯成有效疫苗提供適用的方式。使用不含污染性細菌或動物物質的試劑可容易在化學上合成肽且容易純化肽。小尺寸允許在蛋白質之突變區域上產生明確焦點且亦減少其他組分(未突變的蛋白質或病毒載體抗原)的無關抗原競爭。

將肽測序資訊轉譯至治療疫苗中之又一實例可包括與強疫苗佐劑之組合。有效疫苗需要強佐劑來起始免疫反應。舉例而言，聚-ICLC (TLR3促效劑)及MDA5及RIG3之RNA解螺旋酶域已顯示疫苗佐劑的若干理想特性。此等特性包括活體內誘導免疫細胞局域及全身性活化、產生刺激性趨化激素及細胞激素及由DC刺激抗原呈現。此外，聚-ICLC能誘導人體中產生持久的CD4+及CD8+反應。重要的是，在接種聚-ICLC的個體中及在已接受高度有效、複製勝任型黃熱病疫苗的自願者中發現在轉錄及信號轉導路徑之上調方面存在驚人的相似性。此外，在最新的1期研究中，用聚-ICLC與NYESO-1肽疫苗(除孟塔納(Montanide)之外)組合免疫之卵巢癌患者中＞90%顯示CD4+及CD8+ T細胞被誘導，以及抗體對肽的反應。同時，聚ICLC迄今為止已在超過25次臨床試驗中接受廣泛測試且展現相對良性的毒性概況。

在一些態樣中，本文提供一種組合物，其包含：包含蛋白質之第一新抗原決定基的第一肽及包含相同蛋白質之第二新抗原決定基的第二肽；編碼第一肽及第二肽之聚核苷酸；包含第一肽及第二肽之一或多種APC；或對與HLA蛋白質複合之第一新抗原決定基具有特異性的第一T細胞受體(TCR)及對與HLA蛋白質複合之第二新抗原決定基具有特異性的第二TCR；其中第一肽與第二肽不同，且其中第一新抗原決定基包含突變且第二新抗原決定基包含相同突變。

在一些態樣中，本文提供一種組合物，其包含：包含蛋白質區域之第一新抗原決定基之第一肽及包含相同蛋白質區域之第二新抗原決定基之第二肽，其中第一新抗原決定基及第二新抗原決定基包含相同區域之至少一個胺基酸；編碼第一肽及第二肽之聚核苷酸；包含第一肽及第二肽之一或多種APC；或對與HLA蛋白質複合之第一新抗原決定基具有特異性的第一T細胞受體(TCR)及對與HLA蛋白質複合之第二新抗原決定基具有特異性的第二TCR；其中第一肽與第二肽不同，且其中第一新抗原決定基包含第一突變且第二新抗原決定基包含第二突變。

在一些實施例中，第一突變及第二突變相同。在一些實施例中，第一肽及第二肽為不同分子。在一些實施例中，第一新抗原決定基包含相同蛋白質區域之第一新抗原決定基，其中第二新抗原決定基包含相同蛋白質區域之第二新抗原決定基。在一些實施例中，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基包含至少一個相同區域胺基酸。在一些實施例中，蛋白質區域包含蛋白質之至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1,000個連續胺基酸。在一些實施例中，蛋白質區域包含蛋白質之至多10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1,000個連續胺基酸。在一些實施例中，第一新抗原決定基結合至I類HLA蛋白質以形成I類HLA-肽複合物。在一些實施例中，第二新抗原決定基結合至II類HLA蛋白質以形成II類HLA-肽複合物。在一些實施例中，第二新抗原決定基結合至I類HLA蛋白質以形成I類HLA-肽複合物。在一些實施例中，第一新抗原決定基結合至II類HLA蛋白質以形成II類HLA-肽複合物。在一些實施例中，第一新抗原決定基為由第一肽加工之第一新抗原決定基肽及/或第二新抗原決定基為由第二肽加工之第二新抗原決定基肽。在一些實施例中，第一新抗原決定基長度比第一肽短及/或第二新抗原決定基長度比第二肽短。在一些實施例中，第一新抗原決定基肽由包含第一肽之抗原呈現細胞(APC)處理及/或第二新抗原決定基肽由包含第二肽之APC處理。在一些實施例中，第一新抗原決定基活化CD8+ T細胞。在一些實施例中，第二新抗原決定基活化CD4+ T細胞。在一些實施例中，第二新抗原決定基活化CD8+ T細胞。在一些實施例中，第一新抗原決定基活化CD4+ T細胞。在一些實施例中，CD4+ T細胞之TCR結合至包含第一或第二肽之II類HLA-肽複合物。在一些實施例中，CD8+ T細胞之TCR結合至包含第一或第二肽之I類HLA-肽複合物。在一些實施例中，CD4+ T細胞之TCR結合至包含第一或第二肽之I類HLA-肽複合物。在一些實施例中，CD8+ T細胞之TCR結合至包含第一或第二肽之II類HLA-肽複合物。在一些實施例中，一或多種APC包含：包含第一肽之第一APC及包含第二肽之第二APC。在一些實施例中，突變選自由以下組成之群：點突變、剪接位點突變、讀框轉移突變、通讀突變、基因融合突變及其任何組合。在一些實施例中，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基包含由表1或2之基因編碼之序列。在一些實施例中，蛋白質由表1或2之基因編碼。在一些實施例中，突變為表1或2第2行之突變。在一些實施例中，蛋白質為KRAS。在一些實施例中，單一多肽包含第一肽及第二肽，或單一聚核苷酸編碼第一肽及第二肽。在一些實施例中，第一肽及第二肽由自相同轉錄起始位點轉錄之序列編碼。在一些實施例中，第一肽由自第一轉錄起始位點轉錄之序列編碼且第二肽由自第二轉錄起始位點轉錄之序列編碼。在一些實施例中，單個多肽具有至少18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、7,500或10,000個胺基酸之長度。在一些實施例中，多肽包含與第一對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的第一序列；及與對應第二野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的第二序列。在一些實施例中，多肽包含與對應第一野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的至少8個或9個連續胺基酸之第一序列；及與對應第二野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的至少16或17個連續胺基酸之第二序列。在一些實施例中，第二肽比第一肽長。在一些實施例中，第一肽比第二肽長。在一些實施例中，第一肽具有至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、7,500或10,000個胺基酸之長度。在一些實施例中，第二肽具有至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、7,500或10,000個胺基酸之長度。在一些實施例中，第一肽包含與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的至少9個連續胺基酸之序列。在一些實施例中，第二肽包含與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的至少17個連續胺基酸之序列。在一些實施例中，第二新抗原決定基比第一新抗原決定基長。在一些實施例中，第一新抗原決定基具有至少8個胺基酸之長度。在一些實施例中，第一新抗原決定基具有8至12個胺基酸之長度。在一些實施例中，第一新抗原決定基包含至少8個連續胺基酸之序列，其中8個連續胺基酸中之至少2個在野生型序列之對應位置處不同。在一些實施例中，第二新抗原決定基具有至少16個胺基酸之長度。在一些實施例中，第二新抗原決定基具有16至25個胺基酸之長度。在一些實施例中，第二新抗原決定基包含至少16個連續胺基酸之序列，其中16個連續胺基酸中之至少2個在野生型序列之對應位置處不同。

在一些實施例中，第二肽具有至多13個胺基酸之長度。在一些實施例中，第二肽具有至少8個、9個、10個、11個或12個胺基酸之長度。在一些實施例中，第一肽具有長於第二肽之至少一個胺基酸之長度。在一些實施例中，第一肽具有至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、7,500或10,000個胺基酸之長度。在一些實施例中，第二肽包含與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的至少8個或9個連續胺基酸之序列。在一些實施例中，第一肽包含與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的至少9個或10個連續胺基酸之序列。在一些實施例中，第二新抗原決定基比第一新抗原決定基長。在一些實施例中，第二新抗原決定基具有至少8個胺基酸之長度。在一些實施例中，第二新抗原決定基具有8至12個胺基酸之長度。在一些實施例中，第二新抗原決定基包含至少8個連續胺基酸之序列，其中8個連續胺基酸中之至少2個在野生型序列之對應位置處不同。在一些實施例中，第二新抗原決定基包含在第一肽內。在一些實施例中，第一新抗原決定基具有至少9個胺基酸之長度。在一些實施例中，第一新抗原決定基具有9至25個胺基酸之長度。在一些實施例中，第一新抗原決定基包含至少9個連續胺基酸之序列，其中16個連續胺基酸中之至少2個在野生型序列之對應位置處不同。

在一些實施例中，第一肽包含至少一種額外突變。在一些實施例中，至少一種額外突變中之一或多者不為第一新抗原決定基中之突變。在一些實施例中，至少一種額外突變中之一或多者為第一新抗原決定基中之突變。在一些實施例中，第二肽包含至少一種額外突變。在一些實施例中，至少一種額外突變中之一或多者不為第二新抗原決定基中之突變。在一些實施例中，至少一種額外突變中之一或多者為第二新抗原決定基中之突變。在一些實施例中，第一肽、第二肽或兩者包含至少一個側接序列，其中至少一個側接序列在新抗原決定基之上游或下游。在一些實施例中，至少一個側接序列與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，至少一個側接序列包含非野生型序列。在一些實施例中，至少一個側接序列為N端側接序列。在一些實施例中，至少一個側接序列為C端側接序列。在一些實施例中，第一肽之至少一個側接序列與第二肽之至少一個側接序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，第一肽之至少一個側接區域與第二肽之至少一個側接區域不同。在一些實施例中，至少一個側接殘基包含突變。在一些實施例中，第一新抗原決定基、第二新抗原決定基或兩者包含至少一個錨殘基。在一些實施例中，第一新抗原決定基之至少一個錨殘基在典型錨位置處。在一些實施例中，第一新抗原決定基之至少一個錨殘基在非典型錨位置處。在一些實施例中，第二新抗原決定基之至少一個錨殘基在典型錨位置處。在一些實施例中，第二新抗原決定基之至少一個錨殘基在非典型錨位置處。在一些實施例中，第一新抗原決定基之至少一個錨殘基與第二新抗原決定基之至少一個錨殘基不同。在一些實施例中，至少一個錨殘基為野生型殘基。在一些實施例中，至少一個錨殘基為取代。在一些實施例中，第一新抗原決定基及/或第二新抗原決定基結合至與不具有取代之對應新抗原決定基相比具有更大親和力之HLA蛋白質。在一些實施例中，第一新抗原決定基及/或第二新抗原決定基結合至與不具有取代之對應野生型序列相比具有更大親和力之HLA蛋白質。在一些實施例中，至少一個錨殘基不包含突變。在一些實施例中，第一新抗原決定基、第二新抗原決定基或兩者包含至少一個錨殘基側接區域。在一些實施例中，新抗原決定基包含至少一個錨殘基。在一些實施例中，至少一個錨殘基包含至少兩個錨殘基。在一些實施例中，至少兩個錨殘基藉由包含至少1個胺基酸之分離區域分離。在一些實施例中，至少一個錨殘基側接區域不在分離區域內。在一些實施例中，至少一個錨殘基側接區域在至少兩個錨殘基之N端錨殘基之上游，在至少兩個錨殘基(a)及(b)兩者之C端錨殘基之下游。

在一些實施例中，組合物包含佐劑。在一些實施例中，該組合物包含一或多種額外肽，其中一或多種額外肽包含第三新抗原決定基。在一些實施例中，第一及/或第二新抗原決定基結合至與對應野生型序列相比具有更大親和力之HLA蛋白質。在一些實施例中，第一及/或第二新抗原決定基結合至具有小於1000 nM、900 nM、800 nM、700 nM、600 nM、500 nM、250 nM、150 nM、100 nM、50 nM、25 nM或10 nM之KD或IC50之HLA蛋白質。在一些實施例中，第一及/或第二新抗原決定基結合至具有小於1000 nM、900 nM、800 nM、700 nM、600 nM、500 nM、250 nM、150 nM、100 nM、50 nM、25 nM或10 nM之KD或IC50的HLA I類蛋白質。在一些實施例中，第一及/或第二新抗原決定基結合至具有小於1000 nM、900 nM、800 nM、700 nM、600 nM、500 nM、250 nM、150 nM、100 nM、50 nM、25 nM或10 nM之KD或IC50的HLA II類蛋白質。在一些實施例中，第一及/或第二新抗原決定基結合至由個體所表現之HLA對偶基因編碼之蛋白質。在一些實施例中，突變不存在於個體之非癌細胞中。在一些實施例中，第一及/或第二新抗原決定基由個體癌細胞之基因或表現基因編碼。在一些實施例中，該組合物包含第一T細胞，其包含第一TCR。在一些實施例中，該組合物包含第二T細胞，其包含第二TCR。在一些實施例中，第一TCR包含非天然細胞內結構域及/或第二TCR包含非天然細胞內結構域。在一些實施例中，第一TCR為可溶性TCR及/或第二TCR為可溶性TCR。在一些實施例中，第一及/或第二T細胞為細胞毒性T細胞。在一些實施例中，第一及/或第二T細胞為γ δ T細胞。在一些實施例中，第一及/或第二T細胞為輔助T細胞。在一些實施例中，第一T細胞為經第一新抗原決定基刺激、擴增或誘發之T細胞，及/或第二T細胞為經第二新抗原決定基刺激、擴增或誘發之T細胞。在一些實施例中，第一及/或第二T細胞為自體T細胞。在一些實施例中，第一及/或第二T細胞為同種異體T細胞。在一些實施例中，第一及/或第二T細胞為工程改造T細胞。在一些實施例中，第一及/或第二T細胞為細胞株之T細胞。在一些實施例中，第一及/或第二TCR結合至具有小於1000 nM、900 nM、800 nM、700 nM、600 nM、500 nM、250 nM、150 nM、100 nM、50 nM、25 nM或10 nM之KD或IC50之HLA-肽複合物。在一些態樣中，本文提供包含編碼本文所描述之第一及第二肽之聚核苷酸的載體。在一些實施例中，聚核苷酸可操作地連接於啟動子。在一些實施例中，載體為自擴增RNA複製子、質體、噬菌體、轉位子、黏質體、病毒或病毒粒子。在一些實施例中，載體為病毒載體。在一些實施例中，載體來源於逆轉錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒、痘病毒、α病毒、牛痘病毒、B型肝炎病毒、人類乳突狀瘤病毒或其假模式標本。在一些實施例中，載體為非病毒載體。在一些實施例中，非病毒載體為奈米粒子、陽離子脂質、陽離子聚合物、金屬奈米聚合物、奈米棒、脂質體、膠束、微泡、細胞穿透肽或脂質球。

在一些態樣中，本文提供一種醫藥組合物，其包含：本文所描述之組合物或本文所描述之載體；及醫藥學上可接受之賦形劑。

在一些實施例中，複數個細胞為自體細胞。在一些實施例中，複數個APC細胞為自體細胞。在一些實施例中，複數個T細胞為自體細胞。在一些實施例中，醫藥組合物進一步包含免疫調節劑或佐劑。在一些實施例中，免疫調節劑為細胞介素。在一些實施例中，佐劑為希托洛。

在一些態樣中，本文提供一種治療癌症之方法，該方法包含向有需要之個體投與本文所描述之醫藥組合物。

在一些態樣中，本文提供一種預防對癌症療法之抗性的方法，該方法包含向有需要之個體投與本文所描述之醫藥組合物。

在一些態樣中，本文提供一種誘導免疫反應之方法，該方法包含向有需要之個體投與本文所描述之醫藥組合物。

在一些實施例中，免疫反應為體液性反應。在一些實施例中，第一肽及第二肽同時、單獨或依次投與。在一些實施例中，第一肽在第二肽之後依次投與。在一些實施例中，第二肽在第一肽之後依次投與。在一些實施例中，第一肽在對於第二肽活化T細胞足夠的時間段之後依次投與。在一些實施例中，第二肽在對於第一肽活化T細胞足夠的時間段之後依次投與。在一些實施例中，第一肽在第二肽再刺激T細胞之後依次投與。在一些實施例中，第二肽在第一肽再刺激T細胞之後依次投與。在一些實施例中，投與第一肽以刺激T細胞且第二肽在第一肽再刺激T細胞之後投與。在一些實施例中，投與第二肽以刺激T細胞且第一肽在第二肽再刺激T細胞之後投與。在一些實施例中，個體患有癌症，其中癌症選自由以下組成之群：黑色素瘤、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、乳癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌及慢性淋巴球性白血病(CLL)。在一些實施例中，個體患有對抗雌激素療法具有抗性之乳癌。在一些實施例中，乳癌表現具有突變之雌激素受體。在一些實施例中，個體患有對依魯替尼(ibrutinib)療法具有抗性之CLL。在一些實施例中，CLL表現具有突變，諸如C481S突變之布魯頓(Bruton)酪胺酸激酶。在一些實施例中，個體患有對酪胺酸激酶抑制劑具有抗性之肺癌。在一些實施例中，肺癌表現具有突變，諸如T790M、L792F或C797S突變之表皮成長因子受體(EGFR)。在一些實施例中，複數個包含第一肽之APC細胞及複數個包含第二肽之APC細胞同時、單獨或依次投與。在一些實施例中，複數個包含第一TCR之T細胞及複數個包含第二TCR之T細胞同時、單獨或依次投與。在一些實施例中，該方法進一步包含投與至少一種額外治療劑或藥征。在一些實施例中，至少一種額外治療劑或藥征為手術、檢查點抑制劑、抗體或其片段、化學治療劑、輻射、疫苗、小分子、T細胞、載體及APC、聚核苷酸、溶瘤病毒或其任何組合。在一些實施例中，至少一種額外治療劑為抗PD-1藥劑及抗PD-L1藥劑、抗CTLA-4藥劑或抗CD40藥劑。在一些實施例中，額外治療劑在投與根據本文所描述之醫藥組合物之前、同時或之後投與。
肽

在態樣中，本發明提供包含來自表1或2之腫瘤特異性突變之經分離之肽。此等肽及多肽在本文中稱作「新抗原肽」或「新抗原多肽」。術語「肽」可在本說明書中與「突變肽」、「新抗原肽」及「新抗原肽」互換使用以表示典型地藉由α-胺基與相鄰胺基酸之羧基之間的肽鍵將一個連接至另一個的一系列殘基，典型地L-胺基酸。類似地，術語「多肽」可在本說明書中與「突變多肽」、「新抗原多肽」及「新抗原多肽」互換使用以表示典型地藉由α-胺基與相鄰胺基酸之羧基之間的肽鍵將一個連接至另一個的一系列殘基，例如L-胺基酸。多肽或肽可為多種長度，呈其中性(不帶電)形式或呈鹽形式，且不含修飾，諸如糖基化、側鏈氧化或磷酸化或含有此等修飾，經受不破壞如本文所描述之多肽之生物活性的修飾之條件。
表 1
¹ 帶下劃線的AA表示非天然AA
² 加粗AA表示由兩個融合基因中之第二個編碼之胺基酸序列之天然AA
³ 加粗且帶下劃線的AA表示歸因於讀框轉移由兩個融合基因中之第二個編碼之胺基酸序列之非天然AA。

表 2
¹ 帶下劃線的AA表示非天然AA
² 加粗AA表示由兩個融合基因中之第二個編碼之胺基酸序列之天然AA
³ 加粗且帶下劃線的AA表示歸因於讀框轉移由兩個融合基因中之第二個編碼之胺基酸序列之非天然AA。

在上表中，對於例示性融合體中之一或多者，在第一個「:」之前出現的序列屬於由第一基因編碼之多肽之外顯子序列，在第二個「:」之後出現的序列屬於由第二基因編碼之多肽之外顯子序列，且在「:」符號之間出現的胺基酸由第一基因所編碼之多肽之外顯子序列與第二基因所編碼之多肽之外顯子序列之間分離的密碼子編碼。

然而，在一些實施例中，舉例而言，NAB:STAT6、NAB外顯子連接至STAT6之5'UTR，且在接合點之後出現的第一胺基酸為STAT6之常用起始密碼子(在此位點處不存在框架(因為其通常不轉譯))。

在一些實施例中，亦可考慮上表中之AR-V7，其為編碼不具有全長AR中發現之配體結合結構域之蛋白質的AR基因之剪接變異體。

在一些實施例中，測序方法用於鑑別腫瘤特異性突變。可根據本發明使用任何適合的測序方法，例如下一代測序(Next Generation Sequencing，NGS)技術。未來第三代測序方法可代替NGS技術以加速方法之測序步驟。出於澄清目的：在本發明之情形下術語「下一代測序」或「NGS」意謂與已知為桑格化學(Sanger chemistry)之「習知」測序方法對比，藉由將整個基因組破碎成小塊，同時沿整個基因組任意讀取核酸模板之所有新穎的高通量測序技術。此類NGS技術(亦稱為大規模平行測序技術)能夠在極短時間段內，例如在1至2週內，例如在1-7天內或在小於24小時內遞送整個基因組、外顯子組、轉錄組(基因組之所有經轉錄序列)或甲基化基因組(基因組之所有甲基化序列)之核酸序列資訊且原則上允許單一細胞測序途徑。市售且文獻中提及之多個NGS平台可用於本發明之上下文中，例如詳細描述於WO 2012/159643中之彼等者。

在某些實施例中，本文所描述之肽可包含但不限於約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29、約30、約31、約32、約33、約34、約35、約36、約37、約38、約39、約40、約41、約42、約43、約44、約45、約46、約47、約48、約49、約50、約60、約70、約80、約90、約100、約110、約120、約150、約200、約300、約350、約400、約450、約500、約600、約700、約800、約900、約1,000、約1,500、約2,000、約2,500、約3,000、約4,000、約5,000、約7,500、約10,000個胺基酸或大於10,000個胺基酸殘基及其中可導出之任何範圍。在特定實施例中，新抗原肽分子等於或小於100個胺基酸。

在一些實施例中，肽可為約8及約50個胺基酸殘基長，或約8及約30，約8及約20，約8及約18，約8及約15，或約8及約12個胺基酸殘基長。在一些實施例中，肽可為約8及約500個胺基酸殘基長，或約8及約450，約8及約400，約8及約350，約8及約300，約8及約250，約8及約200，約8及約150，約8及約100，約8及約50，或約8及約30個胺基酸殘基長。

在一些實施例中，肽可為至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50個或多於50個胺基酸殘基長。在一些實施例中，肽可為至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500或多於500個胺基酸殘基長。在一些實施例中，肽可為至多8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或小於50個胺基酸殘基長。在一些實施例中，肽可為至多8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500或小於500個胺基酸殘基長。

在一些實施例中，肽具有至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450或至少500個胺基酸之全長。

在一些實施例中，肽具有至多8、至多9、至多10、至多11、至多12、至多13、至多14、至多15、至多16、至多17、至多18、至多19、至多20、至多21、至多22、至多23、至多24、至多25、至多26、至多27、至多28、至多29、至多30、至多40、至多50、至多60、至多70、至多80、至多90、至多100、至多150、至多200、至多250、至多300、至多350、至多400、至多450或至多500個胺基酸之全長。

更長肽可以若干方法經設計。在一些實施例中，當HLA-結合肽已預測或已知時，更長肽包含(1)朝向每一對應基因產物之N及C端具有2-5個胺基酸之延伸部分的單獨結合肽；或(2)各自具有延伸序列之結合肽中之一些或全部之序連。在其他實施例中，當測序揭示腫瘤中呈現之長(＞10個殘基)新抗原決定基序列(例如歸因於產生新穎肽序列之讀框轉移、通讀或內含子包括)時，更長肽可由呈單一更長肽或若干重疊更長肽形式之新穎腫瘤特異性胺基酸之整個序列段組成。在一些實施例中，假定使用更長肽以允許藉由患者細胞進行內源性處理且可更實現有效抗原呈現且誘導T細胞反應。在一些實施例中，可使用兩個或多於兩個肽，其中肽重疊且平鋪在長新抗原肽上。

在一些實施例中，肽可具有約0.5至約12，約2至約10，或約4至約8之pI值。在一些實施例中，肽可具有至少4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或更大的pI值。在一些實施例中，肽可具有至多4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或更小的pI值。

在一些實施例中，本文所描述之肽可在溶液中、凍乾或可呈晶體形式。在一些實施例中，本文所描述之肽可藉由重組DNA技術或化學合成以合成方式製備，或可自天然來源，諸如天然腫瘤或病原性生物體分離。新抗原決定基可單獨地合成或直接地或間接地接合在肽中。儘管本文所描述之肽可實質上不含其他天然存在之宿主細胞蛋白質及其片段，在一些實施例中，肽可以合成方式共軛以接合至天然片段或粒子。

在一些實施例中，本文所描述之肽可以廣泛多種方法製備。在一些實施例中，肽可根據習知技術在溶液中或在固體載體上合成。各種自動合成器為市售的且可根據已知方案使用。參見例如Stewart & Young, Solid Phase Peptide Synthesis,第2版, Pierce Chemical Co., 1984。另外，單獨的肽可使用化學連接接合以產生仍在本發明之範圍內的較大肽。

替代地，可採用重組DNA技術，其中編碼插入表現載體中、經轉型或轉染至適當的宿主細胞中且在適用於表現之條件下培育的肽之核苷酸序列。此等程序一般為此項技術中已知的，一般如Sambrook等人, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)中所描述。因此，包含本文所描述之一或多種新抗原肽之重組肽可用於呈現適當的T細胞抗原決定基。

在一些實施例中，肽由具有導致天然肽之胺基酸取代之點突變的基因編碼。在一些實施例中，肽由具有導致讀框轉移突變之點突變的基因編碼。當突變干擾基因密碼子週期性之正相(亦稱為「閱讀框架」)時，發生讀框轉移，導致轉譯非天然蛋白質序列。基因中之不同突變有可能實現相同改變的閱讀框架。在一些實施例中，肽由具有導致融合多肽、框內缺失、插入、內源性逆轉錄病毒多肽表現及多肽之腫瘤特異性過度表現之突變的基因編碼。在一些實施例中，肽由第一基因與第二基因之融合物編碼。在一些實施例中，肽由第一基因與第二基因之框內融合物編碼。在一些實施例中，肽由第一基因與第一基因之剪接變異體之外顯子的融合物編碼。在一些實施例中，肽由第一基因與第一基因之隱藏外顯子之融合物編碼。在一些實施例中，肽由第一基因與第二基因之融合物編碼，其中肽包含由融合物所產生之框失調序列編碼之胺基酸序列。

在一些態樣中，本發明提供一種包含至少兩個或多於兩個肽之組合物。在一些實施例中，本文所描述之組合物含有至少兩個不同肽。在一些實施例中，本文所描述之組合物含有包含第一新抗原決定基之第一肽及包含第二新抗原決定基之第二肽。在一些實施例中，第一及第二肽來源於相同蛋白質。至少兩個不同肽可改變長度、胺基酸序列或兩者。肽可來源於已知至已發現含有腫瘤特異性突變之任何蛋白質。在一些實施例中，本文所描述之組合物包含：包含蛋白質之第一新抗原決定基之第一肽及包含相同蛋白質之第二新抗原決定基之第二肽，其中第一肽與第二肽不同，且其中第一新抗原決定基包含突變且第二新抗原決定基包含相同突變。在一些實施例中，本文所描述之組合物包含：包含蛋白質之第一區域之第一新抗原決定基的第一肽及包含相同蛋白質之第二區域之第二新抗原決定基的第二肽，其中第一區域包含第二區域之至少一個胺基酸，其中第一肽與第二肽不同，且其中第一新抗原決定基包含第一突變且第二新抗原決定基包含第二突變。在一些實施例中，第一突變及第二突變相同。在一些實施例中，突變選自由以下組成之群：點突變、剪接位點突變、讀框轉移突變、通讀突變、基因融合突變及其任何組合。

在一些實施例中，肽可來源於具有取代突變，例如KRAS、G12C、G12D、G12V、Q61H或Q61L突變或NRAS Q61K或Q61R突變之蛋白質。取代可沿著肽之長度置放於任何地方。舉例而言，其可位於三分之一肽之N端、三分之一肽之中央或三分之一肽之C端。在另一實施例中，經取代之殘基位於遠離N端之2-5個殘基或遠離C端之2-5個殘基。肽可類似地來源於腫瘤特異性插入突變，其中該肽包含一或多種或所有插入殘基。

在一些實施例中，第一肽包含至少一種額外突變。在一些實施例中，至少一種額外突變中之一或多者不為第一新抗原決定基中之突變。在一些實施例中，至少一種額外突變中之一或多者為第一新抗原決定基中之突變。在一些實施例中，第二肽包含至少一種額外突變。在一些實施例中，至少一種額外突變中之一或多者不為第二新抗原決定基中之突變。在一些實施例中，至少一種額外突變中之一或多者為第二新抗原決定基中之突變。

在一些態樣中，本發明提供一種組合物，其包含單個多肽，包含第一肽及第二肽；或編碼第一肽及第二肽之單個聚核苷酸。在一些實施例中，本文所提供之組合物包含一或多種額外肽，其中一或多種額外肽包含第三新抗原決定基。在一些實施例中，第一肽及第二肽由自相同轉錄起始位點轉錄之序列編碼。在一些實施例中，第一肽由自第一轉錄起始位點轉錄之序列編碼且第二肽由自第二轉錄起始位點轉錄之序列編碼。在一些實施例中，其中多肽具有至少26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、7,500或10,000個胺基酸之長度。在一些實施例中，多肽包含與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的第一序列；及與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的第二序列。在一些實施例中，多肽包含與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的至少8個或9個連續胺基酸之第一序列；及與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的至少16或17個連續胺基酸之第二序列。

在一些實施例中，第二肽比第一肽長。在一些實施例中，第一肽比第二肽長。在一些實施例中，第一肽具有至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、7,500或10,000個胺基酸之長度。在一些實施例中，第二肽具有至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、7,500或10,000個胺基酸之長度。在一些實施例中，第一肽包含與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的至少9個連續胺基酸之序列。在一些實施例中，第二肽包含與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的至少17個連續胺基酸之序列。

在一些實施例中，第一肽、第二肽或兩者包含至少一個側接序列，其中至少一個側接序列在新抗原決定基之上游或下游。在一些實施例中，至少一個側接序列與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，至少一個側接序列包含非野生型序列。在一些實施例中，至少一個側接序列為N端側接序列。在一些實施例中，至少一個側接序列為C端側接序列。在一些實施例中，第一肽之至少一個側接序列與第二肽之至少一個側接序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，第一肽之至少一個側接區域與第二肽之至少一個側接區域不同。在一些實施例中，至少一個側接殘基包含突變。

在一些實施例中，肽包含新抗原決定基序列，其包含至少一個突變胺基酸。在一些實施例中，肽包含新抗原決定基序列，其包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或多於30個突變胺基酸。在一些實施例中，肽包含來源於包含至少一個突變胺基酸及至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或多於30個非突變胺基酸之蛋白質的新抗原決定基序列。在一些實施例中，肽包含來源於包含至少一個突變胺基酸及至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或多於30個至少一個突變胺基酸上游之非突變胺基酸之蛋白質的新抗原決定基序列。在一些實施例中，肽包含來源於包含至少一個突變胺基酸及至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或多於30個至少一個突變胺基酸下游之非突變胺基酸之蛋白質的新抗原決定基序列。在一些實施例中，肽包含來源於包含至少一個突變胺基酸；至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或多於30個至少一個突變胺基酸上游之非突變胺基酸；及至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或多於30個至少一個突變胺基酸下游之非突變胺基酸的蛋白質之新抗原決定基序列。

在一些實施例中，肽包含表1或2中描繪之新抗原肽序列。在一些實施例中，肽包含表1或2中描繪之新抗原決定基序列。在一些實施例中，肽包含新抗原決定基序列，其包含如表1或2中所描繪之至少一個突變胺基酸(帶下劃線的胺基酸)。在一些實施例中，肽包含新抗原決定基序列，其包含如表1或2中所描繪之至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或多於30個突變胺基酸(帶下劃線的胺基酸)。在一些實施例中，肽包含新抗原決定基序列，其包含如表1或2中所描繪之至少一個突變胺基酸(帶下劃線的胺基酸)及至少一個加粗胺基酸。在一些實施例中，肽包含來源於包含至少一個突變胺基酸(帶下劃線的胺基酸)及至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或多於30個如表1或2中所描繪之非突變胺基酸之蛋白質的新抗原決定基序列。在一些實施例中，肽包含新抗原決定基序列，其來源於包含至少一個突變胺基酸(帶下劃線的胺基酸)及至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或多於30個如表1或2中所描繪之至少一個突變胺基酸上游之非突變胺基酸的蛋白質。在一些實施例中，肽包含新抗原決定基序列，其來源於包含至少一個突變胺基酸(帶下劃線的胺基酸)及至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或多於30個如表1或2中所描繪之至少一個突變胺基酸下游之非突變胺基酸的蛋白質。在一些實施例中，肽包含新抗原決定基序列，其來源於包含至少一個突變胺基酸(帶下劃線的胺基酸)、至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或多於30個至少一個突變胺基酸上游之非突變胺基酸及至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或多於30個如表1或2中所描繪之至少一個突變胺基酸下游之非突變胺基酸的蛋白質。

在一些實施例中，肽包含來源於包含至少一個突變胺基酸之蛋白質的新抗原決定基序列及與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的至少一個突變胺基酸上游之序列。在一些實施例中，肽包含來源於包含至少一個突變胺基酸之蛋白質之新抗原決定基序列及與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的至少一個突變胺基酸下游之序列。在一些實施例中，肽包含來源於包含至少一個突變胺基酸之蛋白質之新抗原決定基序列；與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的至少一個突變胺基酸上游之序列；及與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的至少一個突變胺基酸下游之序列。

在一些實施例中，肽包含來源於包含至少一個突變胺基酸之蛋白質之新抗原決定基序列；及包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或多於30個與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的連續胺基酸之至少一個突變胺基酸上游之序列。在一些實施例中，肽包含來源於包含至少一個突變胺基酸之蛋白質之新抗原決定基序列；及包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或多於30個與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的連續胺基酸之至少一個突變胺基酸下游之序列。在一些實施例中，肽包含來源於包含至少一個突變胺基酸之蛋白質之新抗原決定基序列；包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或多於30個與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的連續胺基酸之至少一個突變胺基酸上游之序列；及包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或多於30個與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之連續胺基酸的至少一個突變胺基酸下游之序列。

在一些實施例中，肽包含來源於包含至少一個如表1或2中所描繪之突變胺基酸(帶下劃線的胺基酸)之蛋白質之新抗原決定基序列；及與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的至少一個突變胺基酸上游之序列。在一些實施例中，肽包含來源於包含至少一個如表1或2中所描繪之突變胺基酸(帶下劃線的胺基酸)之蛋白質的新抗原決定基序列；及與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的至少一個突變胺基酸下游之序列。在一些實施例中，肽包含來源於包含至少一個如表1或2中所描繪之突變胺基酸(帶下劃線的胺基酸)之蛋白質之新抗原決定基序列；與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的至少一個突變胺基酸上游之序列；及與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的至少一個突變胺基酸下游之序列。

在一些實施例中，肽包含來源於包含至少一個如表1或2中所描繪之突變胺基酸(帶下劃線的胺基酸)之蛋白質之新抗原決定基序列；及包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或多於30個與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的連續胺基酸之至少一個突變胺基酸上游之序列。在一些實施例中，肽包含來源於包含至少一個如表1或2中所描繪之突變胺基酸(帶下劃線的胺基酸)之蛋白質之新抗原決定基序列；及包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或多於30個與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的連續胺基酸之至少一個突變胺基酸下游之序列。在一些實施例中，肽包含來源於包含至少一個如表1或2中所描繪之突變胺基酸(帶下劃線的胺基酸)之蛋白質之新抗原決定基序列；包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或多於30個與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的連續胺基酸之至少一個突變胺基酸上游之序列；及包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或多於30個與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的連續胺基酸之至少一個突變胺基酸下游之序列。

在一些實施例中，包含KRAS G12C突變之肽包含序列MTEYKLVVVGACGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETC LLDILDTAGQE (SEQ ID NO: 1303)。在一些實施例中，包含KRAS G12 C突變之肽包含KLVVVGACGV (SEQ ID NO: 1304)之新抗原決定基序列。在一些實施例中，包含KRAS G12 C突變之肽包含LVVVGACGV (SEQ ID NO: 1305)之新抗原決定基序列。在一些實施例中，包含KRAS G12 C突變之肽包含VVGACGVGK (SEQ ID NO: 1306)之新抗原決定基序列。在一些實施例中，包含KRAS G12 C突變之肽包含VVVGACGVGK (SEQ ID NO: 1307)之新抗原決定基序列。

在一些實施例中，包含KRAS G12D突變之肽包含序列MTEYKLVVVGADGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQE (SEQ ID NO: 1308)。在一些實施例中，包含KRAS G12D突變之肽包含新抗原決定基序列VVGADGVGK (SEQ ID NO: 1309)。在一些實施例中，包含KRAS G12D突變之肽包含新抗原決定基序列VVVGADGVGK (SEQ ID NO: 1310)。在一些實施例中，包含KRAS G12D突變之肽包含新抗原決定基序列KLVVVGADGV (SEQ ID NO: 1311)。在一些實施例中，包含KRAS G12D突變之肽包含新抗原決定基序列LVVVGADGV (SEQ ID NO: 1312)。

在一些實施例中，包含KRAS G12V突變之肽包含序列MTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQE (SEQ ID NO: 1313)。在一些實施例中，包含KRAS G12V突變之肽包含新抗原決定基序列KLVVVGAVGV (SEQ ID NO: 1314)。在一些實施例中，包含KRAS G12V突變之肽包含新抗原決定基序列LVVVGAVGV (SEQ ID NO: 1315)。在一些實施例中，包含KRAS G12V突變之肽包含新抗原決定基序列VVGAVGVGK (SEQ ID NO: 1316)。在一些實施例中，包含KRAS G12V突變之肽包含新抗原決定基序列VVVGAVGVGK (SEQ ID NO: 1317)。

在一些實施例中，包含KRAS Q61H突變之肽包含序列AGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGHEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPM (SEQ ID NO: 1318)。在一些實施例中，包含KRAS Q61H突變之肽包含新抗原決定基序列ILDTAGHEEY (SEQ ID NO: 1319)。

在一些實施例中，包含KRAS Q61L突變之肽包含序列AGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGLEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPM (SEQ ID NO: 1320)。在一些實施例中，包含KRAS Q61L突變之肽包含新抗原決定基序列ILDTAGLEEY (SEQ ID NO: 1321)。在一些實施例中，包含KRAS Q61L突變之肽包含新抗原決定基序列LLDILDTAGL (SEQ ID NO: 1322)。

在一些實施例中，包含NRAS Q61K突變之肽包含序列AGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGKEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNSKSFADINLYREQIKRVKDSDDVPM (SEQ ID NO: 1323)。在一些實施例中，包含NRAS Q61K突變之肽包含新抗原決定基序列ILDTAGKEEY (SEQ ID NO: 1324)。

在一些實施例中，包含NRAS Q61R突變之肽包含序列AGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGREEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNSKSFADINLYREQIKRVKDSDDVPM (SEQ ID NO: 1325)。在一些實施例中，包含NRAS Q61R突變之肽包含新抗原決定基序列ILDTAGREEY (SEQ ID NO: 1326)。

在一些實施例中，包含TMPRSS2:ERG融合物之突變之肽包含新抗原決定基序列MALNS::EALSVVSEDQSLFECAYGTPHLAKTEMTASSSSDYGQTSKMSPRVPQQDWALNSEALSV (SEQ ID NO: 1327)。在一些實施例中，包含TMPRSS2:ERG融合物之突變之肽包含新抗原決定基序列ALNSEALSVV (SEQ ID NO: 1328)。在一些實施例中，包含TMPRSS2:ERG融合物之突變之肽包含新抗原決定基序列MALNSEALSV (SEQ ID NO: 1329)。
肽修飾

在一些實施例中，本發明包括經修飾之肽。修飾可包括不改變抗原肽自身之初始胺基酸序列之共價化學修飾。修飾可產生具有所需特性之肽，所需特性例如延長活體內半衰期，提高穩定性，降低清除率，改變免疫原性或過敏原性，使得能夠提高特定抗體、細胞靶向、抗原吸收、抗原處理、HLA親和力、HLA穩定性或抗原呈現。在一些實施例中，肽可包含一或多個藉由APC來增強抗原決定基之處理及呈現，例如用於產生免疫反應之序列。

在一些實施例中，肽可經修飾以提供所需屬性。舉例而言，肽誘導CTL活性之能力可藉由與含有至少一個能夠誘導T輔助細胞反應之抗原決定基的序列連接來增強。在一些實施例中，免疫原性肽/T輔助共軛物藉由間隔子分子連接。在一些實施例中，間隔子包含相對較小中性分子，諸如胺基酸或胺基酸模擬物，其在生理條件下實質上不帶電。間隔子可選自例如Ala、Gly或非極性胺基酸或中性極性胺基酸之其他中性間隔子。應理解，視情況存在之間隔子無需由相同殘基組成，且因此可為雜寡聚物或均寡聚物。新抗原肽可直接或經由在肽之胺基或羧基端處的間隔子連接至T輔助肽。新抗原肽或T輔助肽之胺基端可經醯化。T輔助肽之實例包括破傷風類毒素殘基830-843、流感殘基307-319及瘧疾環子孢子殘基382-398及殘基378-389。

本發明之肽序列可視情況在DNA水準下經由變化改變，尤其藉由使預選的鹼基處之編碼肽的DNA突變以使得產生將轉換成所需胺基酸之密碼子。

在一些實施例中，本文所描述之肽可含有取代以改變所得肽之物理特性(例如穩定性或溶解度)。舉例而言，肽可藉由具有α-胺基丁酸(「B」)之半胱胺酸(C)之取代經修飾。歸因於其化學性質，半胱胺酸具有形成二硫橋鍵之傾向且足夠在結構上改變肽以便減少結合力。用C取代α-胺基丁酸不僅解決此問題，但實際上在某些情況下改良結合及交叉結合能力。用α-胺基丁酸取代半胱胺酸可在新抗原肽之任何殘基處，例如在肽內抗原決定基或類似物之錨或非錨位置處或在肽之其他位置處出現。

肽亦可藉由延伸或減少化合物之胺基酸序列，例如藉由胺基酸之添加或缺失而經修飾。肽或類似物亦可藉由改變某些殘基之順序或組成而經修飾。熟練技術人員應瞭解，生物活性必需之某些胺基酸殘基，例如關鍵接觸部位或保守性殘基處之彼等者可一般不改變，而對生物活性無不良作用。非關鍵性胺基酸無需限於蛋白質中天然存在的彼等者，諸如L-α-胺基酸或其D-異構體，但可同樣包括非天然胺基酸，諸如β-γ-δ-胺基酸以及L-α-胺基酸之多種衍生物。

在一些實施例中，肽可使用具有單胺基酸取代之一系列肽經修飾以測定靜電電荷、疏水性等對HLA結合之作用。舉例而言，一系列帶正電(例如Lys或Arg)或帶負電(例如Glu)胺基酸取代可沿著肽長度製得，揭露不同圖案針對各種HLA分子及T細胞受體之敏感性。另外，可採用使用較小相對中性部分，諸如Ala、Gly、Pro或類似殘基之多個取代。取代可為均寡聚物或雜寡聚物。取代或添加之殘基之數目及類型視必需接觸點及探尋之某些功能性屬性(例如疏水性相對於親水性)之間所需的間距而定。相比於母體肽之親和力，HLA分子或T細胞受體之提高的結合親和力亦可藉由此類取代來達成。在任何情況下，此類取代應採用所選胺基酸殘基或其他分子片段以避免例如可能破壞結合之空間及電荷干擾。胺基酸取代典型地具有單個殘基。取代、缺失、插入或其任何組合可組合以到達最終肽。

在一些實施例中，本文所描述之肽可包含胺基酸模擬物或非天然胺基酸殘基，例如D-或L-萘基丙胺酸；D-或L-苯基甘胺酸；D-或L-2-噻吩基丙胺酸；D-或L-1,-2,3-,或4-芘基丙胺酸；D-或L-3噻吩基丙胺酸；D-或L-(2-吡啶基)-丙胺酸；D-或L-(3-吡啶基)-丙胺酸；D-或L-(2-吡嗪基)-丙胺酸；D-或L-(4-異丙基)-苯基甘胺酸；D-(三氟甲基)-苯基甘胺酸；D-(三氟甲基)-苯丙胺酸；D-ρ-氟苯基丙胺酸；D-或L-ρ-聯二苯-苯丙胺酸；D-或L-ρ-甲氧基聯苯苯丙胺酸；D-或L-2-吲哚(烯丙基)丙胺酸；及D-或L-烷基丙胺酸，其中烷基可為經取代或未經取代之甲基、乙基、丙基、己基、丁基、戊基、異丙基、異丁基、第二異基、異戊基或非酸性胺基酸殘基。非天然胺基酸之芳族環包括例如噻唑基、噻吩基、吡唑基、苯并咪唑基、萘基、呋喃基、吡咯基及吡啶基芳族環。具有各種胺基酸模擬物或非天然胺基酸殘基之經修飾之肽可具有活體內提高的穩定性。此類肽亦可具有改良的儲存壽命或製造特性。

在一些實施例中，本文所描述之肽可藉由末端-NH2醯化，例如藉由烷醯基(C1-C20)或硫代羥乙醯基乙醯化、末端羧基醯胺化，例如氨、甲胺等經修飾。在一些實施例中，此等修飾可提供用於連接至支持體或其他分子之部位。在一些實施例中，本文所描述之肽可含有修飾，諸如(但不限於)糖基化、側鏈氧化、生物素標記、磷酸化、添加表面活性材料，例如脂質，或可經化學修飾，例如乙醯化等。另外，肽中之鍵可不為肽鍵，例如共價鍵、酯或醚鍵、二硫鍵、氫鍵、離子鍵等。

在一些實施例中，本文所描述之肽可包含載體，諸如此項技術中眾所周知之彼等者，例如甲狀球蛋白；白蛋白，諸如人類血清白蛋白；破傷風類毒素；多胺基酸殘基，諸如聚L-離胺酸及聚L-麩胺酸；流感病毒蛋白質；B型肝炎病毒核心蛋白及其類似者。

肽可進一步經修飾以含有額外化學部分，其不為蛋白質之通常部分。彼等者衍生部分可改良蛋白質之溶解度、生物半衰期、吸收率或結合親和力。該等部分亦可減少或消除肽及其類似物之任何所需副作用。針對彼等部分之概述可發現於Remington's Pharmaceutical Sciences, 第20版, Mack Publishing Co., Easton, PA (2000)中。舉例而言，具有所需活性之新抗原肽可視需要經修飾以提供某些所需屬性，例如改良的藥理學特徵，同時提高或至少保留未經修飾之肽之實質上全部生物活性以結合所需HLA分子及活化適當的T細胞。舉例而言，肽可經受各種變化，諸如保守性或非保守性取代，其中此類變化可能在其用途中提供某些優點，諸如改良的HLA結合。此類保守取代可涵蓋用生物及/或化學類似之另一胺基酸殘基置換胺基酸殘基，例如用一個疏水性殘基置換另一個，或用一個極性殘基置換另一個。單胺基酸取代之效應亦可使用D-胺基酸探測。此類修飾可使用熟知的肽合成程序進行，如Merrifield, Science 232:341-347 (1986), Barany及Merrifield, The Peptides, Gross及Meienhofer, 編 (N.Y., Academic Press), 第1-284頁 (1979)；及Stewart及Young, Solid Phase Peptide Synthesis, (Rockford, III., Pierce), 第2版 (1984)中所描述。

在一些實施例中，本文所描述之肽可共軛至較大緩慢代謝大分子，諸如蛋白質；多醣，諸如瓊脂糖凝膠、瓊脂糖、纖維素、纖維素珠粒；聚合物胺基酸，諸如聚麩胺酸、聚離胺酸；胺基酸共聚物；不活化病毒粒子；不活化細菌毒素，諸如來自白喉、破傷風、霍亂、白細胞毒素分子之類毒素；不活化細菌；及樹突狀細胞。

肽變化可包括但不限於共軛至載體蛋白質、共軛至配位體、共軛至抗體、PEG化、聚唾液酸化羥乙基澱粉化、重組PEG模擬物、Fc融合物、白蛋白融合物、奈米粒子附著、奈米顆粒包封、膽固醇融合物、鐵融合物、醯化、醯胺化、糖基化、側鏈氧化、磷酸化、生物素標記、添加表面活性材料、添加胺基酸模擬物或添加非天然胺基酸。

糖基化可影響蛋白質之物理特性，且亦可在蛋白質穩定性、分泌及次細胞定位方面為重要的。恰當糖基化可對生物活性而言為重要的。實際上，當在缺少用於糖基化蛋白質之細胞過程之細菌(例如大腸桿菌)中時，某些來自真核生物體之基因產生藉助於其缺少糖基化具有極小或沒有活性回收之蛋白質。添加糖基化位點可藉由改變胺基酸序列實現。可例如藉由添加一或多種絲胺酸或蘇胺酸殘基(或取代O-聯結糖基化位點)或天冬醯胺殘基(或取代N-聯結糖基化位點)進行肽或蛋白質改變。N-聯結及O-聯結寡醣及每一類型中發現之糖殘基之結構可不同。兩者上通常發現之一種類型糖為N-乙醯基神經胺糖酸(下文稱為唾液酸)。唾液酸通常為N-聯結及O-聯結寡醣之末端殘基，且藉助於其負電荷，可賦予糖蛋白酸性特性。本發明之實施例包含產生及使用N-糖基化變體。移除碳水化合物可以化學或酶促方式或藉由編碼經糖基化之胺基酸殘基之密碼子之取代實現。化學去糖基化技術已知，且可藉由使用多種內及外糖苷酶來實現多肽上碳水化合物部分之酶促裂解。

用於共軛之額外適合的組分及分子包括例如用於靶向淋巴系統之分子、甲狀球蛋白；白蛋白，諸如人類血清白蛋白(HAS)；破傷風類毒素；白喉類毒素；聚胺基酸，諸如聚(D-離胺酸:D-麩胺酸)；輪狀病毒之VP6多肽；流感病毒血球凝集素、流感病毒核蛋白；匙孔螺血氰蛋白(KLH)；及B型肝炎病毒核心蛋白及表面抗原；或前述之任何組合。

另一種類型的修飾為在多肽序列之N及/或C端處共軛(例如連接)一或多種額外組分或分子，諸如另一蛋白質(例如具有個體蛋白質異源之胺基酸序列的蛋白質)或載體分子。因此，例示性多肽序列可以與另一組分或分子之共軛物形式提供。在一些實施例中，白蛋白與本發明之肽或蛋白質之融合可例如藉由基因操控來達成，以使得編碼HSA或其片段之DNA接合至編碼一或多種多肽序列之DNA。其後，適合的宿主可用呈例如適合的質體形式之融合核苷酸序列轉型或轉染以便表現融合多肽。表現可由例如原核或真核細胞活體外實現，或由例如轉基因生物體活體內實現。在本發明之一些實施例中，融合蛋白之表現在哺乳動物細胞株，例如CHO細胞株中進行。此外，白蛋白自身可經修飾以延長其循環半衰期。經修飾之白蛋白與一或多種多肽之融合可藉由上文所描述之基因操控技術或藉由化學共軛獲得；所得融合分子之半衰期超過具有未經修飾之白蛋白之融合體之半衰期(參見例如WO2011/051489)。已開發出若干白蛋白結合策略作為直接融合之替代方案，包括經由結合脂肪酸鏈(醯化)之白蛋白結合。因為血清白蛋白為脂肪酸之轉運蛋白質，具有白蛋白結合活性之此等天然配位體已用於較小蛋白質治療劑之半衰期延長。

用於共軛之額外候選組分及分子包括適用於分離或純化之彼等者。非限制性實例包括結合分子，諸如生物素(生物素-抗生物素蛋白特異性結合對)、抗體、受體、配位體、凝集素或分子，其包含固體載體，包括例如塑膠或聚苯乙烯珠粒、片材或珠粒、磁珠、測試條及膜。諸如陽離子交換層析之純化方法可用於藉由電荷差分離共軛物，其有效地將共軛物分成其各種分子量。藉由陽離子交換層析獲得之溶離份之含量可藉由分子量，使用習知方法，例如質譜分析、SDS-PAGE或用於藉由分子量分離分子實體之其他已知的方法鑑別。

在一些實施例中，本發明之肽或蛋白質序列之胺基或羧基端可與免疫球蛋白Fc區(例如人類Fc)融合以形成融合共軛物(或融合分子)。Fc融合共軛物已顯示提高生物藥劑之系統性半衰期，且因此生物藥劑產物可能需要不太頻繁的投與。Fc結合至血管內襯之內皮細胞中之新生兒Fc受體(FcRn)，且在結合後，Fc融合分子保護免受降解且再釋放至循環中，保持分子在循環中時間更長。此Fc結合咸信為藉由其內源性IgG保持其長血漿半衰期之機制。最新的Fc-融合技術將生物藥劑之單個複本連接至抗體之Fc區以使生物藥劑相比於傳統的Fc-融合共軛物之藥物動力學及藥效動力學特性最佳化。

本發明涵蓋使用目前已知或將來研發之肽之其他修飾以改良一或多個特性。用於延長循環半衰期、提高穩定性、降低清除率或改變本發明之肽之免疫原性或過敏原性之一個此類方法涉及藉由羥乙基澱粉化修飾肽序列，其利用連接至其他分子以便改變分子之特徵之羥乙基澱粉衍生物。羥乙基澱粉化之各種態樣描述於例如美國專利申請案第2007/0134197號及第2006/0258607號中。

肽穩定性可以多種方法加以分析。舉例而言，肽酶及各種生物介質(諸如人類血漿及血清)已用於測試穩定性。參見例如Verhoef等人, Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinetics 11:291 (1986)。肽之半衰期適宜地使用25%人類血清(v/v)分析確定。方案如下：混合人類血清(類型AB，非加熱不活化)藉由離心在使用之前廢棄。血清隨後用RPMI-1640或另一適合的組織培養基稀釋至25%。在預定時間間隔下，將少量反應物溶液移除且添加至6%含水三氯乙酸(TCA)或乙醇中。將混濁的反應樣品冷卻(4℃) 15分鐘，且隨後旋轉集結沈澱的血清蛋白質。隨後使用穩定性特異性層析條件藉由逆相HPLC來判定肽之存在。

與短血漿半衰期或對蛋白酶降解之易感性相關的問題可藉由各種修飾克服，包括將肽或蛋白質序列共軛或連接至多種非蛋白質聚合物，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯(參見例如典型地經由共價鍵結至蛋白質及非蛋白質聚合物兩者之連接部分，例如PEG)中之任一者。此類PEG共軛生物分子已顯示具有臨床上適用的特性，包括更佳物理及熱穩定性、針對酶促降解易感性之保護措施、提高的溶解度、更長活體內循環半衰期及降低的清除率、降低的免疫原性及抗原性及降低的毒性。

適用於共軛至多肽或蛋白質序列之PEG一般在室溫下可溶於水中，且具有通式R-(O-CH2-CH2)n-O-R，其中R為氫或保護基，諸如烷基或烷醇基，且其中n為1至1000之整數。當R為保護基時，其一般具有1至8個碳。共軛至多肽序列之PEG可為直鏈或分支鏈的。本發明涵蓋分支鏈PEG衍生物、「星形PEG」及多臂PEG。本發明亦涵蓋共軛物之組合物，其中PEG具有不同n值，且因此各種不同PEG以特定比率存在。舉例而言，某些組合物包含共軛物之混合物，其中n=l、2、3及4。在某些組合物中，共軛物(其中n=1)之百分比為18-25%，共軛物(其中n=2)之百分比為50-66%，共軛物(其中n=3)之百分比為12-16%，且共軛物(其中n=4)之百分比高達5%。此類組合物可藉由此項技術中已知之反應條件及純化方法產生。舉例而言，陽離子交換層析可用於分離共軛物，且隨後鑑別溶離份，其含有共軛物、附著例如所需數目之PEG、經純化不含未經修飾之蛋白質序列且來自具有其他數目之附著PEG的共軛物。

PEG可經由末端反應性基團(「間隔子」)結合至本發明之肽或蛋白質。間隔子為例如末端反應性基團，其介導多肽序列中之一或多者之游離胺基或羧基與PEG之間的一鍵。具有可結合至游離胺基之間隔子之PEG包括N-羥基丁二醯亞胺PEG，其可藉由用N-羥基丁二醯亞胺活化PEG之丁二酸酯製備。可結合至游離胺基之另一活化PEG為2,4-雙(O-甲氧基聚乙二醇)-6-氯-s-三嗪，其可藉由使PEG單甲醚與三聚氯化氰反應製備。結合至游離羧基之活化PEG包括聚氧基乙二胺。

本發明之肽或蛋白質序列中之一或多者共軛至具有間隔子之PEG可藉由各種習知方法進行。舉例而言，共軛反應物可在溶液中在5至10之pH下，在4℃至室溫之溫度下進行30分鐘至20小時，利用4:1至30:1之反應劑與肽/蛋白質之莫耳比。可選擇反應條件以引導針對主要產生所需取代程度之反應。一般而言，低溫、低pH (例如pH=5)及短反應時間往往會減少附著PEG之數目，而高溫、中等至較高pH (例如pH＞7)及更長反應時間往往會提高附著PEG之數目。此項技術中已知之各種手段可用於終止反應。在一些實施例中，藉由酸化反應混合物且冷凍在例如-20℃下終止反應。

本發明亦涵蓋使用PEG模擬物。已研發出保留PEG之屬性(例如增強的血清半衰期)之重組PEG模擬物，同時賦予若干額外有利特性。藉助於實例，能夠形成類似於PEG之延展結構之簡單多肽鏈(包含例如Ala、Glu、Gly、Pro、Ser及Thr)可以重組方式產生，已融合至相關肽或蛋白質藥物(例如Amunix XTEN技術；Mountain View, CA)。此避免在製造過程期間對額外共軛步驟之需求。另外，已確立之分子生物學技術實現多肽鏈之側鏈組合物之控制，實現免疫原性及製造特性之最佳化。
新抗原決定基

新抗原決定基包含藉由免疫系統識別之新抗原肽或新抗原多肽之新抗原決定子部分。新抗原決定基係指參考物，諸如非病變細胞，例如非癌細胞或生殖系細胞中未呈現，但病變細胞，例如癌細胞中可見之抗原決定基。此包括對應抗原決定基可見於常用非病變細胞或生殖系細胞中的情境，但歸因於病變細胞，例如癌細胞中之一或多種突變，改變抗原決定基之序列以產生新抗原決定基。術語「新抗原決定基」可在本說明書中與「腫瘤特異性新抗原決定基」互換使用以表示典型地藉由α-胺基與相鄰胺基酸之羧基之間的肽鍵將一個連接至另一個的一系列殘基，典型地L-胺基酸。新抗原決定基可為多種長度，呈其中性(不帶電)形式或呈鹽形式，且不含修飾，諸如糖基化、側鏈氧化或磷酸化或含有此等修飾，經受不破壞如本文所描述之多肽之生物活性的修飾之條件。本發明提供包含來自表1或2之腫瘤特異性突變之經分離之新抗原決定基。

在一些實施例中，本文針對HLA I類所描述之新抗原決定基為13個殘基或小於13個殘基長，且通常由約8至約12個殘基，尤其9或10個殘基組成。在一些實施例中，本文針對HLA II類所描述之新抗原決定基為25個殘基或小於25個殘基長，且通常由約16至約25個殘基組成。

在一些實施例中，本文所描述之組合物包含：包含蛋白質之第一新抗原決定基之第一肽及包含相同蛋白質之第二新抗原決定基之第二肽，其中第一肽與第二肽不同，且其中第一新抗原決定基包含突變且第二新抗原決定基包含相同突變。在一些實施例中，本文所描述之組合物包含：包含蛋白質之第一區域之第一新抗原決定基的第一肽及包含相同蛋白質之第二區域之第二新抗原決定基的第二肽，其中第一區域包含第二區域之至少一個胺基酸，其中第一肽與第二肽不同，且其中第一新抗原決定基包含第一突變且第二新抗原決定基包含第二突變。在一些實施例中，第一突變及第二突變相同。在一些實施例中，突變選自由以下組成之群：點突變、剪接位點突變、讀框轉移突變、通讀突變、基因融合突變及其任何組合。

在一些實施例中，第一新抗原決定基結合至I類HLA蛋白質以形成I類HLA-肽複合物。在一些實施例中，第二新抗原決定基結合至II類HLA蛋白質以形成II類HLA-肽複合物。在一些實施例中，第二新抗原決定基結合至I類HLA蛋白質以形成I類HLA-肽複合物。在一些實施例中，第一新抗原決定基結合至II類HLA蛋白質以形成II類HLA-肽複合物。在一些實施例中，第一新抗原決定基活化CD8+ T細胞。在一些實施例中，第一新抗原決定基活化CD4+ T細胞。在一些實施例中，第二新抗原決定基活化CD4+ T細胞。在一些實施例中，第二新抗原決定基活化CD8+ T細胞。在一些實施例中，CD4+ T細胞之TCR結合至II類HLA-肽複合物。在一些實施例中，CD8+ T細胞之TCR結合至II類HLA-肽複合物。在一些實施例中，CD8+ T細胞之TCR結合至I類HLA-肽複合物。在一些實施例中，CD4+ T細胞之TCR結合至I類HLA-肽複合物。

在一些實施例中，第二新抗原決定基比第一新抗原決定基長。在一些實施例中，第一新抗原決定基具有至少8個胺基酸之長度。在一些實施例中，第一新抗原決定基具有8至12個胺基酸之長度。在一些實施例中，第一新抗原決定基包含至少8個連續胺基酸之序列，其中8個連續胺基酸中之至少1個在野生型序列之對應位置處不同。在一些實施例中，第一新抗原決定基包含至少8個連續胺基酸之序列，其中8個連續胺基酸中之至少2個在野生型序列之對應位置處不同。在一些實施例中，第二新抗原決定基具有至少16個胺基酸之長度。在一些實施例中，第二新抗原決定基具有16至25個胺基酸之長度。在一些實施例中，第二新抗原決定基包含至少16個連續胺基酸之序列，其中16個連續胺基酸中之至少1個在野生型序列之對應位置處不同。在一些實施例中，第二新抗原決定基包含至少16個連續胺基酸之序列，其中16個連續胺基酸中之至少2個在野生型序列之對應位置處不同。

在一些實施例中，第二肽具有至多13個胺基酸之長度。在一些實施例中，第二肽具有至少8個、9個、10個、11個或12個胺基酸之長度。在一些實施例中，第一肽具有長於第二肽之至少一個胺基酸之長度。在一些實施例中，第一肽具有至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、7,500或10,000個胺基酸之長度。在一些實施例中，第二肽包含與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的至少8個或9個連續胺基酸之序列。在一些實施例中，第一肽包含與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的至少9個或10個連續胺基酸之序列。在一些實施例中，第二新抗原決定基比第一新抗原決定基長。在一些實施例中，第二新抗原決定基具有至少8個胺基酸之長度。在一些實施例中，第二新抗原決定基具有8至12個胺基酸之長度。在一些實施例中，第二新抗原決定基包含至少8個連續胺基酸之序列，其中8個連續胺基酸中之至少2個在野生型序列之對應位置處不同。在一些實施例中，第二新抗原決定基包含在第一肽內。在一些實施例中，第一新抗原決定基具有至少9個胺基酸之長度。在一些實施例中，第一新抗原決定基具有9至25個胺基酸之長度。在一些實施例中，第一新抗原決定基包含至少9個連續胺基酸之序列，其中16個連續胺基酸中之至少2個在野生型序列之對應位置處不同。在一些實施例中，新抗原決定基包含至少一個錨殘基。在一些實施例中，第一新抗原決定基、第二新抗原決定基或兩者包含至少一個錨殘基。在一個實施例中，第一新抗原決定基之至少一個錨殘基在典型錨位置或非典型錨位置處。在另一實施例中，第二新抗原決定基之至少一個錨殘基在典型錨位置或非典型錨位置處。在又一實施例中，第一新抗原決定基之至少一個錨殘基與第二新抗原決定基之至少一個錨殘基不同。

在一些實施例中，至少一個錨殘基為野生型殘基。在一些實施例中，至少一個錨殘基為取代。在一些實施例中，至少一個錨殘基不包含突變。

在一些實施例中，第二新抗原決定基或兩者包含至少一個錨殘基側接區域。在一些實施例中，新抗原決定基包含至少一個錨殘基。在一些實施例中，至少一個錨殘基包含至少兩個錨殘基。在一些實施例中，至少兩個錨殘基藉由包含至少1個胺基酸之分離區域分離。在一些實施例中，至少一個錨殘基側接區域不在分離區域內。在一些實施例中，至少一個錨殘基側接區域(a)在至少兩個錨殘基之N端錨殘基之上游；(b)在至少兩個錨殘基之C端錨殘基之下游；或(a)及(b)兩者。

在一些實施例中，新抗原決定基結合HLA蛋白質(例如HLA I類或HLA II類)。在一些實施例中，新抗原決定基以與對應野生型肽相比更大的親和力結合HLA蛋白質。在一些實施例中，新抗原決定基具有小於5,000 nM，小於1,000 nM，小於500 nM，小於100 nM，小於50 nM或更小的IC50。

在一些實施例中，新抗原決定基可具有約1 pM與約1 mM，約100 pM與約500 µM，約500 pM與約10 µM，約1 nM與約1 µM，或約10 nM與約1 µM之間的HLA結合親和力。在一些實施例中，新抗原決定基可具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900或1,000 nM或更大的HLA結合親和力。在一些實施例中，新抗原決定基可具有至多2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900或1,000 nM之HLA結合親和力。

在一些實施例中，第一及/或第二新抗原決定基結合至與對應野生型新抗原決定基相比具有更大親和力之HLA蛋白質。在一些實施例中，第一及/或第二新抗原決定基結合至具有小於1,000 nM、900 nM、800 nM、700 nM、600 nM、500 nM、250 nM、150 nM、100 nM、50 nM、25 nM或10 nM之KD或IC50之HLA蛋白質。在一些實施例中，第一及/或第二新抗原決定基結合至具有小於1,000 nM、900 nM、800 nM、700 nM、600 nM、500 nM、250 nM、150 nM、100 nM、50 nM、25 nM或10 nM之KD或IC50的HLA I類蛋白質。在一些實施例中，第一及/或第二新抗原決定基結合至具有小於2,000 nM、1,500 nM、1,000 nM、900 nM、800 nM、700 nM、600 nM、500 nM、250 nM、150 nM、100 nM、50 nM、25 nM或10 nM之KD或IC50的HLA II類蛋白質。

在一態樣中，第一及/或第二新抗原決定基結合至由個體所表現之HLA對偶基因編碼之蛋白質。在另一態樣中，突變不存在於個體之非癌細胞中。在又另一態樣中，第一及/或第二新抗原決定基由個體癌細胞之基因或表現基因編碼。

在一些實施例中，第一新抗原決定基包含如表1或2第2行中所描繪之突變。在一些實施例中，第二新抗原決定基包含如表1或2第2行中所描繪之突變。在一些實施例中，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基來源於TMPRSS2:ERG融合蛋白。在一些實施例中，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基來源於TMPRSS2:ERG融合蛋白，其包含來自序列MALNS::EALSVVSEDQSLFECAYGTPHLAKTEMTASSSSDYGQTSKMSPRVPQQDWALNSEALSV (SEQ ID NO: 1330)之序列S::E。舉例而言，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基可包含序列ALNSEALSVV (SEQ ID NO: 1331)。舉例而言，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基可包含序列MALNSEALSV (SEQ ID NO: 1332)。

在一些實施例中，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基來源於KRAS蛋白質。在一些實施例中，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基來源於NRAS蛋白質。在一些實施例中，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基來源於包含G12C、G12D、G12V、Q61H或Q61L取代之突變之KRAS蛋白質。在一些實施例中，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基來源於包含Q61K或Q61R取代之突變之NRAS蛋白質。在一些實施例中，新抗原決定基包含取代突變，例如KRAS G12C、G12D、G12V、Q61H或Q61L突變或NRAS Q61K或Q61R突變。在一些實施例中，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基來源於KRAS或NRAS蛋白質序列MTEYKLVVVGACGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQE (SEQ ID NO: 1333)。舉例而言，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基可包含序列KLVVVGACGV (SEQ ID NO: 1334)。舉例而言，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基可包含序列LVVVGACGV (SEQ ID NO: 1335)。舉例而言，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基可包含序列VVGACGVGK (SEQ ID NO: 1336)。舉例而言，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基可包含序列VVVGACGVGK (SEQ ID NO: 1337)。在一些實施例中，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基來源於KRAS或NRAS蛋白質序列MTEYKLVVVGADGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEVVGADGVGK (SEQ ID NO: 1338)。舉例而言，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基可包含序列VVVGADGVGK (SEQ ID NO: 1339)。舉例而言，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基可包含序列KLVVVGADGV (SEQ ID NO: 1340)。舉例而言，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基可包含序列LVVVGADGV (SEQ ID NO: 1341)。

在一些實施例中，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基來源於KRAS或NRAS蛋白質序列MTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQE (SEQ ID NO: 1342)。舉例而言，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基可包含序列KLVVVGAVGV (SEQ ID NO: 1343)。舉例而言，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基可包含序列LVVVGAVGV (SEQ ID NO: 1344)。舉例而言，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基可包含序列VVGAVGVGK (SEQ ID NO: 1345)。舉例而言，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基可包含序列VVVGAVGVGK (SEQ ID NO: 1346)。

在一些實施例中，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基來源於KRAS或NRAS蛋白質序列AGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGHEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPM (SEQ ID NO: 1347)。舉例而言，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基可包含序列ILDTAGHEEY (SEQ ID NO: 1348)。

在一些實施例中，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基來源於KRAS或NRAS蛋白質序列AGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGLEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPM (SEQ ID NO: 1349)。舉例而言，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基可包含序列ILDTAGLEEY (SEQ ID NO: 1350)。舉例而言，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基可包含序列LLDILDTAGL (SEQ ID NO: 1351)。

在一些實施例中，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基來源於KRAS或NRAS蛋白質序列AGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGKEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNSKSFADINLYREQIKRVKDSDDVPM (SEQ ID NO: 1352)。舉例而言，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基可包含序列ILDTAGKEEY (SEQ ID NO: 1353)。

在一些實施例中，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基來源於KRAS或NRAS蛋白質序列AGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGREEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNSKSFADINLYREQIKRVKDSDDVPM (SEQ ID NO: 1354)。舉例而言，第一新抗原決定基及第二新抗原決定基可包含序列ILDTAGREEY (SEQ ID NO: 1355)。

取代可沿著新抗原決定基之長度置放於任何地方。舉例而言，其可位於三分之一肽之N端、三分之一肽之中央或三分之一肽之C端。在另一實施例中，經取代之殘基位於遠離N端之2-5個殘基或遠離C端之2-5個殘基。肽可類似地來源於腫瘤特異性插入突變，其中該肽包含一或多種或所有插入殘基。

在一些實施例中，如本文所描述之肽可利用不含污染性細菌或動物物質(Merrifield RB: Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc.85:2149-54, 1963)之試劑而容易地以化學方式合成。在一些實施例中，肽如下製備：(1)利用均一合成及裂解條件在多通道儀器上進行並行固相合成；(2)在利用管柱剝離的RP-HPLC管柱上進行純化；及再洗滌，但肽之間無置換；隨後(3)利用一組有限的提供最多資訊的分析進行分析。優良藥品製造規範(Good Manufacturing Practices；GMP)的覆蓋範圍可圍繞個別患者之該組肽來定義，因此用於不同患者之肽合成之間僅需要程序轉換套件。
聚核苷酸

替代地，編碼本發明之肽之核酸(例如聚核苷酸)可用於活體外產生新抗原肽。聚核苷酸可為例如DNA、cDNA、PNA、CNA、RNA、單股及/或雙股或原生或穩定化形式的聚核苷酸，諸如具有硫代磷酸酯主鏈的聚核苷酸，或其組合，且其可含有或可不含有內含子，只要其編碼肽。在一些實施例中，使用活體外轉譯來產生肽。

本文提供編碼本發明中所描述之新抗原肽中之每一者的新抗原聚核苷酸。術語「聚核苷酸」、「核苷酸」或「核酸」可與本發明中之「突變聚核苷酸」、「突變核苷酸」、「突變核酸」、「新抗原聚核苷酸」、「新抗原核苷酸」或「新抗原突變核酸」互換使用。歸因於遺傳密碼之冗餘，各種核酸序列可編碼相同肽。此等核酸中之每一者屬於本發明之範疇內。編碼肽之核酸可為DNA或RNA，例如mRNA或DNA及RNA之組合。在一些實施例中，編碼肽之核酸為自擴增mRNA (Brito等人, Adv. Genet. 2015; 89:179-233)。編碼本文所描述之肽之任何適合的聚核苷酸屬於本發明之範疇內。

術語「RNA」包括「mRNA」且在一些實施例中係關於「mRNA」。術語「mRNA」意謂「信使-RNA」且係指藉由使用DNA模板產生且編碼肽或多肽之「轉錄物」。典型地，mRNA包含5'-UTR、蛋白質編碼區及3'-UTR。mRNA在細胞中及活體外僅僅具有有限半衰期。在一些實施例中，mRNA為自擴增mRNA。在本發明之上下文中，mRNA可藉由自DNA模板進行活體外轉錄來產生。活體外轉錄方法為熟習此項技術者已知。舉例而言，存在多種市售活體外轉錄套組。

可視需要修飾RNA之穩定性及轉譯效率。舉例而言，RNA可經穩定化且其轉譯藉由具有穩定化作用及/或提高RNA之轉譯效率的一或多種修飾提高。此類修飾描述於例如PCT/EP2006/009448中，其以引用之方式併入本文中。為了提高根據本發明使用之RNA之表現，其可在編碼區內經修飾，亦即，編碼表現之肽或蛋白質之序列，而不改變表現之肽或蛋白質之序列以便提高GC含量以提高mRNA穩定性且實行密碼子優化且因此增強細胞中之轉譯。

在本發明中使用之RNA之上下文中，術語「修飾」包括該RNA中不天然存在之RNA之任何修飾。在一些實施例中，RNA不具有未封端5'-三磷酸鹽。移除此類未封端5'-三磷酸鹽可藉由用磷酸酶處理RNA來實現。在其他實施例中，RNA可具有經修飾之核糖核苷酸以便提高其穩定性及/或減少細胞毒性。在一些實施例中，5-甲基胞苷可在RNA中部分或完全經取代以例如用於胞苷。替代地，假尿苷部分或完全經取代以例如用於尿苷。

在一些實施例中，術語「修飾」係關於提供具有5'-蓋帽或5'-蓋帽類似物之RNA。術語「5'-蓋帽」係指mRNA分子之5'-端上可見之蓋帽結構且一般由經由不常見5'至5'三磷酸鹽鍵連接至mRNA之鳥苷核苷酸組成。在一些實施例中，此鳥苷在7-位置處經甲基化。術語「習知5'-蓋帽」係指7-甲基鳥苷蓋帽(m G)之天然存在之RNA 5'-蓋帽。在本發明之上下文中，術語「5'-蓋帽」包括類似RNA蓋帽結構之5'-蓋帽類似物且經修飾以具有穩定化RNA及/或增強RNA轉譯之能力(若附著於其上、活體內及/或細胞中)。

在某些實施例中，向有需要之個體投與編碼本發明之新抗原肽之mRNA。在一些實施例中，本發明提供RNA、寡核糖核苷酸及包含經修飾之核苷之多核糖核苷酸分子、包含其之基因療法載體、包含其之基因治療方法及基因轉錄沉默方法。在一些實施例中，待投與mRNA包含至少一種經修飾之核苷。

編碼本文所描述之肽的聚核苷酸可藉由化學技術，例如Matteucci等人, J. Am. Chem. Soc. 103:3185 (1981)之磷酸三酯方法合成。編碼包含類似物或由類似物組成之肽之聚核苷酸可僅藉由用適當及所需核酸鹼基取代編碼天然抗原決定基之彼等者製得。

本文所描述之聚核苷酸可在經轉錄之區域中包含一或多種合成或天然存在的內含子。包括mRNA穩定序列及用於哺乳動物細胞中之複製之序列亦可考慮用於提高聚核苷酸表現。另外，本文所描述之聚核苷酸可包含免疫刺激序列(ISS或CpG)。此等序列可包括於載體中，在增強免疫原性之聚核苷酸編碼序列外部。

在一些實施例中，聚核苷酸可包含在相同閱讀框架中與有助於例如肽或蛋白質自宿主細胞表現及分泌之聚核苷酸(例如充當用於控制多肽自細胞輸送之分泌序列的前導序列)融合的肽或蛋白質之編碼序列。具有前導序列之多肽為前蛋白且可具有藉由宿主細胞裂解以形成多肽之成熟形式的前導序列。

在一些實施例中，聚核苷酸可包含在相同閱讀框架中與允許例如純化經編碼之肽之標記物序列(其可隨後併入個體化疾病疫苗或免疫原性組合物中)融合的肽或蛋白質之編碼序列。舉例而言，在細菌宿主的情況下，標記序列可為pQE-9載體所供應的六組胺酸標籤(SEQ ID NO: 1356)以便對與該標記融合之成熟多肽進行純化，或當使用哺乳動物宿主(例如COS-7細胞)時，標記序列可為來源於流感紅血球凝集素蛋白質的紅血球凝集素(HA)標籤。額外標籤包括(但不限於)調鈣蛋白標籤、FLAG標籤、Myc標籤、S標籤、SBP標籤、Softag 1、Softag 3、V5標籤、Xpress標籤、Isopeptag、SpyTag、生物素羧基載體蛋白質(BCCP)標籤、GST標籤、螢光蛋白標籤(例如綠色螢光蛋白標籤)、麥芽糖結合蛋白標籤、Nus標籤、鏈黴素標籤、硫氧還蛋白標籤、TC標籤、Ty標籤及其類似物。

在一些實施例中，聚核苷酸可包含一或多種目前所描述之肽或蛋白質之編碼序列，其在相同閱讀框架中融合以產生能夠產生多種新抗原肽的單一串聯化新抗原肽構建體。

在一些實施例中，使用重組技術藉由分離或合成編碼相關野生型蛋白質的DNA序列來構建DNA序列。視情況，可藉由位點特異性突變誘發誘導序列突變以提供其功能類似物。參見例如Zoeller等人, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 81:5662-5066 (1984)及美國專利第4,588,585號。在另一實施例中，編碼相關肽或蛋白質之DNA序列將藉由化學合成使用寡核苷酸合成器構建。可基於所需肽之胺基酸序列且選擇有利於宿主細胞之彼等密碼子設計此類寡核苷酸，其中產生相關重組多肽。標準方法可應用於合成編碼相關分離多肽中分離之聚核苷酸序列。舉例而言，可利用完整胺基酸序列構建回復轉譯之基因。另外，可合成含有編碼特定分離多肽之核苷酸序列的DNA寡聚物。舉例而言，可合成編碼所需多肽之各部分的若干小寡核苷酸且隨後接合。個別寡核苷酸典型地含有5'或3'突出端用於互補性組裝。

在組裝(例如藉由合成、定點突變誘發或另一方法)後，將編碼特定相關分離多肽之聚核苷酸序列插入表現載體中且視情況可操作地連接於適於在所需宿主中表現之蛋白質之表現控制序列。正確組裝可例如依據核苷酸測序、限制酶圖譜及/或生物活性多肽在適合宿主中之表現來證實。如此項技術中所熟知，為獲得經轉染基因在宿主中之高表現量，基因可操作地連接於在所選表現宿主中具有功能性之轉錄及轉譯表現控制序列。

因此，本發明亦關於適用於產生及投與本文所描述之新抗原肽及新抗原決定基的載體及表現載體及包含此類載體之宿主細胞。
載體

在一些實施例中，亦可製備能夠表現如本文所描述之肽或蛋白質之表現載體。不同細胞類型的表現載體在此項技術中已熟知且無需過度實驗便可選擇。一般而言，將DNA以適當取向插入表現載體(諸如質體)中且校正閱讀框架用於表現。必要時，可將DNA連接至被所要宿主(例如細菌)識別的適當轉錄及轉譯調節控制核苷酸序列，但此類控制通常可在表現載體中獲得。隨後將載體引入宿主細菌中以便使用標準技術進行選殖(參見例如Sambrook等人(1989)Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.)。

適用於產生及投與本文所描述之新抗原肽之大量載體及宿主系統為熟習此項技術者已知且為市售的。藉助於實例提供以下載體。細菌：pQE70、pQE60、pQE-9 (Qiagen)、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pBluescript、SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A (Stratagene)；ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5 (Pharmacia)；pCR (Invitrogen)。真核：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG (Stratagene) pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL (Pharmacia)；p75.6 (Valentis)；pCEP (Invitrogen)；pCEI (Epimmune)。然而，可使用任何其他質體或載體，只要其在宿主中可複製且有活力。

為了表現本文所描述之新抗原肽，編碼序列將配備可操作地連接的起始及終止密碼子、啟動子及終止子區域，且在一些實施例中，及複製系統以提供用於在所需細胞宿主中表現之表現載體。舉例而言，與細菌宿主相容之啟動子序列提供於含有用於插入所需編碼序列之適宜限制位點之質體中。將所得表現載體轉型至適合的細菌宿主中。

哺乳動物表現載體將包含複製起點、適合的啟動子及強化子以及任何所需核糖體結合位點、聚腺苷酸化位點、剪接供體及受體位點、轉錄終止序列及5'側接非轉錄序列。此類啟動子亦可來源於病毒來源，諸如例如人類細胞巨大病毒(CMV-IE啟動子)或單純疱疹病毒1型(HSV TK啟動子)。核酸序列來源於SV40剪接，且聚腺苷酸化位點可用於提供所需非轉錄基因元件。

重組表現載體可用於擴增及表現編碼如本文所描述之肽或蛋白質的DNA。重組表現載體為可複製的DNA構建體，其具有編碼可操作地連接於來源於哺乳動物、微生物、病毒或昆蟲基因之適合的轉錄或轉譯調節元件之肽或生物等效類似物的合成或cDNA衍生DNA片段。轉錄單元一般包含以下組件：(1)在基因表現中具有調節作用之遺傳元件，例如轉錄啟動子或強化子；(2)轉錄成mRNA且轉譯成蛋白質之結構或編碼序列；及(3)適當轉錄及轉譯起始及終止序列，如本文中詳細描述。此類調節元件可包括控制轉錄的操縱序列。可另外併入通常由複製起點賦予之在宿主中複製之能力及促進識別轉型體之選擇基因。DNA區域當其在功能上彼此相關時可操作地連接。舉例而言，若信號肽(分泌前導序列)之DNA表現為參與多肽分泌之前驅物，則其可操作地連接於多肽之DNA；若啟動子控制編碼序列之轉錄，則其可操作地連接於該序列；或若核糖體結合位點經定位從而允許轉譯，則其可操作地連接於編碼序列。一般而言，可操作地連接意謂鄰接且在分泌性前導序列的情況下，意謂鄰接且處於閱讀框架中。意欲用於酵母表現系統中之結構元件包括能夠使轉譯蛋白質由宿主細胞在細胞外分泌的前導序列。替代地，在不經由前導序列或轉運序列來表現重組蛋白質的情況下，其可包括N端甲硫胺酸殘基。此殘基可視情況隨後自表現之重組蛋白質裂解以提供最終產物。

一般而言，重組表現載體將包括准許宿主細胞轉化之複製起點及可選擇標記物，例如大腸桿菌及釀酒酵母TRP1基因之安比西林(ampicillin)抗性基因；及來源於高度表現基因之啟動子以引導下游結構序列轉錄。此類啟動子可尤其來源於編碼糖酵解酶，諸如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、酸磷酸酶或熱休克蛋白之操縱子。異源結構序列在適當的階段中用轉譯起始及終止序列及在一些實施例中能夠引導轉譯蛋白質分泌至周質空隙或胞外介質中之前導序列組裝。視情況，異源序列可編碼融合蛋白，其包括賦予所需特徵，例如表現重組產物之穩定或簡化純化之N端鑑別肽。

編碼本文所描述之新抗原肽的聚核苷酸亦可包含泛素化信號序列及/或靶向序列，諸如內質網(ER)信號序列以促進所得肽移動至內質網中。

在一些實施例中，本文所描述之新抗原肽亦可投與及/或由病毒或細菌載體表現。表現載體之實例包括減毒病毒宿主，諸如牛痘或鳥痘。作為此途徑之實例，牛痘病毒用作載體以表現編碼本文所描述之新抗原肽之核苷酸序列。適用於免疫方案中之牛痘載體及方法描述於例如美國專利第4,722,848號中。另一種載體為BCG (Bacille Calmette Guerin)。Stover等人, Nature 351:456-460 (1991)描述BCG載體。

由本文中之實施方式熟習此項技術者將顯而易知，適用於治療投與或本文所描述之新抗原多肽之免疫的廣泛多種其他載體，例如腺及腺相關病毒載體、逆轉錄病毒載體、鼠傷寒沙門桿菌(Salmonella Typhimurium)載體、解毒化炭疽毒素載體、仙臺病毒載體、痘病毒載體、金絲雀痘載體及鳥痘載體及其類似者。在一些實施例中，載體為改良型安卡拉痘苗病毒(VA) (例如Bavarian Noridic (MVA-BN))。

在可用於實施本發明之載體當中，可利用逆轉錄病毒基因轉移方法整合至細胞宿主基因組中，此往往引起所插入轉殖基因的長期表現。在一些實施例中，逆轉錄病毒為慢病毒。另外，已在許多不同的細胞類型及靶組織中觀測到高轉導效率。逆轉錄病毒的向性可藉由併入外來包膜蛋白、擴增靶細胞的可能目標群體來改變。逆轉錄病毒亦可經工程改造以允許所插入之轉殖基因得到條件表現，使得僅某些細胞類型被慢病毒感染。可使用細胞類型特異性啟動子靶向特定細胞類型中的表現。慢病毒載體為逆轉錄病毒載體(且因此慢病毒與逆轉錄病毒載體均可用於本發明之實施)。另外，慢病毒載體能夠轉導或感染非分裂細胞且典型地產生較高病毒效價。因此逆轉錄病毒基因轉移系統的選擇可視靶組織而定。逆轉錄病毒載體包含具有封裝能力的順式作用長末端重複作為至多6-10 kb的外來序列。最小順式作用LTR足以用於載體的複製及封裝，其隨後用於將所需核酸整合至靶細胞中以提供永久性表現。可用於實施本發明之廣泛使用的逆轉錄病毒載體包括基於小鼠白血病病毒(MuLV)、長臂猿白血病病毒(GaLV)、猿猴免疫缺乏病毒(SIV)、人類免疫不全病毒(HIV)及其組合之彼等者(參見例如Buchscher等人, (1992) J. Virol. 66:2731-2739；Johann等人, (1992) J. Virol.66:1635-1640；Sommnerfelt等人, (1990) Virol.176:58-59；Wilson等人, (1998) J. Virol.63:2374-2378；Miller等人, (1991) J. Virol.65:2220-2224；PCT/US94/05700)。

亦適用於實施本發明的為最小非靈長類動物慢病毒載體，諸如基於馬科動物感染性貧血病毒(EIAV)的慢病毒載體。載體可具有驅動靶基因表現的細胞巨大病毒(CMV)啟動子。因此，本發明涵蓋適用於實施本發明之載體：病毒載體，包括逆轉錄病毒載體及慢病毒載體。

亦適用於實施本發明的是腺病毒載體。一個優點為重組腺病毒能夠活體外及活體內有效轉移且表現多種哺乳動物細胞及組織中之重組基因，從而提高所轉移核酸的表現。另外，能夠高效感染靜態細胞使得重組腺病毒載體的效用擴大。另外，高度表現量確保核酸之產物將表現至充分含量以產生免疫反應(參見例如美國專利第7,029,848號，其以引用之方式併入本文中)。

就適用於實施本發明之腺病毒載體而言，提及美國專利第6,955,808號。所用腺病毒載體可選自由以下組成之群：Ad5、Ad35、Ad11、C6及C7載體。腺病毒5 (「Ad5」)基因組之序列已公開。(Chroboczek, J., Bieber, F.及Jacrot, B. (1992) The Sequence of the Genome of Adenovirus Type 5 and Its Comparison with the Genome of Adenovirus Type 2, Virology 186, 280-285；內容以引用之方式併入本文中)。Ad35載體描述於美國專利第6,974,695號、第6,913,922號及第6,869,794號中。Ad11載體描述於美國專利第6,913,922號中。C6腺病毒載體描述於美國專利第6,780,407號、第6,537,594號、第6,309,647號、第6,265,189號、第6,156,567號、第6,090,393號、第5,942,235號及第5,833,975號中。C7載體描述於美國專利第6,277,558號中。亦可使用缺乏或缺失E1、缺乏或缺失E3及/或缺乏或缺失E4的腺病毒載體。由於缺乏E1的腺病毒突變體在非容許細胞中缺乏複製或至少為高度減毒的，因此E1區域中具有突變的某些腺病毒具有經改良之安全裕度。E3區域中具有突變的腺病毒可藉由中斷腺病毒藉以下調I類MHC分子之機制而具有增強的免疫原性。具有E4突變之腺病毒由於後期基因表現受到抑制而使得腺病毒載體之免疫原性降低。當需要使用相同載體重複進行疫苗再接種時，此類載體可為特別適用的。根據本發明可使用E1、E3、E4；E1及E3；及E1及E4缺失或突變的腺病毒載體。

此外，根據本發明亦可使用其中所有病毒基因均缺失的「無膽量」腺病毒載體。此類載體需要輔助病毒用於其複製且需要表現E1a與Cre (不存在於天然環境中的狀態)的專門人類293細胞株。此類「無膽量」載體無免疫原性且因此可接種載體多次用於疫苗再接種。可利用「無膽量」腺病毒載體插入異質插入序列/基因，諸如本發明之轉殖基因，且甚至可用於許多異質插入序列/基因的共遞送。

在一些實施例中，遞送係經由腺病毒，其可在單一加強劑量下。在一些實施例中，腺病毒經由多次劑量遞送。就活體內遞送而言，AAV優於其他病毒載體，原因在於毒性低及引起插入型突變誘發之機率低(由於其未整合至宿主基因組中)。AAV具有4.5 Kb或4.75 Kb之封裝限制。大於4.5 Kb或4.75 Kb之構築體導致病毒產生顯著減少。存在多種啟動子可用於驅動核酸分子表現。AAV ITR可充當啟動子且有利於排除其他啟動子元件的需要。

對於廣泛表現而言，可使用以下啟動子：CMV、CAG、CBh、PGK、SV40、鐵蛋白重鏈或輕鏈等。對於腦表現而言，可使用以下啟動子：用於所有神經元之突觸蛋白I、用於激動性神經元之CaMK II α、用於GABA激導性神經元之GAD67或GAD65或VGAT等。用於驅動RNA合成的啟動子可包括：Pol III啟動子，諸如U6或H1。Pol II啟動子及內含子卡匣的使用可用於表現導引RNA (gRNA)。關於適用於實施本發明之AAV載體，可提及美國專利第5658785號、第7115391號、第7172893號、第6953690號、第6936466號、第6924128號、第6893865號、第6793926號、第6537540號、第6475769號及第6258595號，及其中引述的文獻。就AAV而言，AAV可為AAV1、AAV2、AAV5或其任何組合。可根據所靶向的細胞來選擇AAV；例如可選擇AAV血清型1、2、5或雜交衣殼AAV1、AAV2、AAV5或其任何組合來靶向腦或神經元細胞；且可選擇AAV4來靶向心臟組織。AAV8適用於遞送至肝臟。在一些實施例中，遞送係經由AAV。可調節劑量以平衡治療益處克服任何副作用。

在一些實施例中，痘病毒用於目前所描述之組合物。此等包括正痘病毒、禽痘、牛痘、MVA、NYVAC、金絲雀痘、ALVAC、鳥痘、TROVAC等(參見例如Verardiet al., Hum. Vaccin. Immunother. 2012年7月;8(7):961-70；及Moss, Vaccine. 2013; 31(39): 4220-4222)。痘病毒表現載體在1982年已有描述且快速廣泛用於疫苗開發以及多領域研究。載體優點包括構造簡單、能夠容納大量外來DNA及高表現量。關於可用於實施本發明之痘病毒(諸如脊椎動物痘病毒亞科(Chordopoxvirinae)痘病毒(脊椎動物之痘病毒)，例如正痘病毒屬及禽痘病毒屬，例如牛痘病毒(例如惠氏病毒株(Wyeth Strain)、WR病毒株(例如ATCC® VR-1354)、哥本哈根病毒株、NYVAC、NYVAC.1、NYVAC.2、MVA、MVA-BN)、金絲雀痘病毒(例如Wheatley C93病毒株、ALVAC)、禽痘病毒(例如FP9病毒株、韋伯斯特病毒株(Webster Strain)、TROVAC)、鴿痘(dovepox)、鴿痘(pigeonpox)、鵪鶉痘及浣熊痘，尤其其合成或非天然存在之重組體、其用途及製備及使用此類重組體之方法)的資訊可見於科學及專利文獻中。

在一些實施例中，牛痘病毒用於疾病疫苗或免疫原性組合物中以表現抗原。(Rolph等人, Recombinant viruses as vaccines and immunological tools. Curr. Opin. Immunol. 9:517-524, 1997)。重組牛痘病毒能夠在所感染宿主細胞之細胞質內複製且相關多肽因此可誘導免疫反應。另外，痘病毒不僅由於能夠藉由直接感染免疫細胞(尤其抗原呈現細胞)而靶向所編碼之抗原以便藉由主要組織相容複合體I類路徑處理，而且由於能夠具自佐劑性，因此痘病毒已廣泛用作疫苗或免疫原性組合物載體。

在一些實施例中，ALVAC用作疾病疫苗或免疫原性組合物中之載體。ALVAC為可經修飾以表現外來轉基因且已用作用於疫苗接種原核及真核抗原之方法的金絲雀痘病毒(Horig H, Lee DS, Conkright W,等人.表現人類癌胚抗原及B7.1共刺激分子之重組金絲雀痘病毒(ALVAC)疫苗之階段I臨床試驗(Phase I clinical trial of a recombinant canarypoxvirus (ALVAC) vaccine expressing human carcinoembryonic antigen and the B7.1 co-stimulatory molecule). Cancer Immunol. Immunother. 2000;49:504-14；von Mehren M, Arlen P, Tsang KY等人.在患有復發性CEA表現腺癌之患者中含有癌胚抗原(CEA)及B7.1轉基因之雙重基因重組禽痘疫苗之預備試驗(Pilot study of a dual gene recombinant avipox vaccine containing both carcinoembryonic antigen (CEA) and B7.1 transgenes in patients with recurrent CEA-expressing adenocarcinomas). Clin. Cancer. Res. 2000; 6:2219-28；Musey L, Ding Y, Elizaga M,等人.可在HIV-1未感染個體中誘發系統性及黏膜性T細胞免疫性之肌內投與的HIV-1疫苗接種(HIV-1 vaccination administered intramuscularly can induce both systemic and mucosal T cell immunity in HIV-1-uninfected individuals). J. Immunol. 2003;171:1094-101；Paoletti E. 將痘病毒載體應用於疫苗接種：更新(Applications of pox virus vectors to vaccination: an update). Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 1996;93:11349-53；美國專利第7,255,862號)。在階段I臨床試驗中，表現腫瘤抗原CEA之ALVAC病毒顯示極佳的安全概況且在所選患者中導致CEA特異性T細胞反應提高；然而未觀測到目標臨床反應(Marshall JL, Hawkins MJ, Tsang KY等人. Phase I study in cancer patients of a replication-defective avipox recombinant vaccine that expresses human carcinoembryonic antigen. J. Clin. Oncol. 1999;17:332-7)。

在一些實施例中，改良型安卡拉痘苗病毒(MVA)病毒可用作用於抗原疫苗或免疫原性組合物之病毒載體。MVA為正痘病毒家族成員且已藉由牛痘病毒(CVA)之安卡拉病毒株在雞胚纖維母細胞上連續繼代約570次來產生(參見例如Mayr,A等人, Infection 3, 6-14, 1975)。由於此等繼代，所得MVA病毒含有相比於CVA少31千鹼基的基因組資訊且對宿主細胞具有高度選擇性(Meyer, H.等人, J. Gen. Virol. 72, 1031-1038, 1991)。MVA的特徵為其毒性大幅降低，亦即毒力或感染能力減弱，但仍然保持極佳免疫原性。當在多種動物模型中測試時，MVA經證實為無毒的，甚至在免疫抑制的個體中。另外，MVA-BN®-HER2為針對治療HER-2-陽性乳癌所設計的候選免疫療法且當前正處於臨床試驗中。(Mandl等人, Cancer Immunol. Immunother. 2012年1月; 61(1): 19-29)。已描述製得及使用重組MVA之方法(例如參見美國專利第8,309,098號及第5,185,146號，在此全文引入)。

適用於表現多肽之宿主細胞包括處於適當啟動子控制下的原核生物、酵母、昆蟲或較高等真核細胞。原核生物包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如大腸桿菌或桿菌。較高等真核細胞包括哺乳動物來源的所建立細胞株。亦可採用無細胞之轉譯系統。與細菌、真菌、酵母及哺乳動物細胞宿主一起使用之適當的選殖及表現載體為此項技術中眾所周知的(參見Pouwels等人, Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., 1985)。

多種哺乳動物或昆蟲細胞培養系統亦有利地用於表現重組蛋白。由於重組蛋白質一般正確摺疊、經適當修飾且具有完全功能，因此此類蛋白質可在哺乳動物細胞中表現。適合哺乳動物宿主細胞株之實例包括Gluzman (Cell 23:175, 1981)所述之猴腎COS-7細胞株，及能夠表現適當載體的其他細胞株，包括例如L細胞、C127、3T3、中國倉鼠卵巢(CHO)、293、海拉(HeLa)及BHK細胞株。哺乳動物表現載體可包含非轉錄元件，諸如複製起點、連接至待表現基因之適合啟動子及增強子，及其他5'或3'側接非轉錄序列，及5'或3'未轉譯序列，諸如必需的核糖體結合位點、聚腺苷酸化位點、剪接供體及受體位點及轉錄終止序列。用於在昆蟲細胞中產生異源蛋白質的桿狀病毒系統回顧於Luckow及Summers, Bio/Technology 6:47 (1988)中。

宿主細胞用可例如為選殖載體或表現載體之載體經基因工程改造(經轉導或轉型或轉染)。載體可例如呈質體、病毒顆粒、噬菌體等形式。經工程改造之宿主細胞可在經修飾而適於活化啟動子、選擇轉化體或擴增聚核苷酸之習知養分培養基中培養。培養條件(諸如溫度、pH及類似條件)為先前用於經選擇用於表現之宿主細胞之培養條件，且對於一般熟習此項技術者而言將顯而易見。

可提及以下作為適當的宿主之代表性實例：細菌細胞，諸如大腸桿菌、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、鼠傷寒沙門桿菌及假單胞菌屬、鏈黴菌屬及葡萄球菌屬內之各種物種；真菌細胞，諸如酵母；昆蟲細胞，諸如果蠅及Sf9；動物細胞，諸如猴腎臟成纖維細胞之COS-7株，藉由Gluzman, Cell 23:175 (1981)所描述；及能夠表現可相容載體之其他細胞株，例如C127、3T3、CHO、海拉及BHK細胞株或Bowes黑色素瘤；植物細胞等。選擇適當的宿主被認為根據本文中之教示內容在熟習此項技術者之範疇內。

亦可使用酵母、昆蟲或哺乳動物細胞宿主，採用適合的載體及控制序列。哺乳動物表現系統之實例包括Gluzman, Cell 23:175 (1981)所描述之猴腎臟成纖維細胞之COS-7株及能夠表現可相容載體之其他細胞株，例如C127、3T3、CHO、海拉及BHK細胞株。

本文所描述之聚核苷酸可在人類細胞中投與及表現(例如免疫細胞，包括樹突狀細胞)。使用人類密碼子使用表來導引各種胺基酸的密碼子選擇。此類聚核苷酸包含抗原決定基及/或類似物之間的間隔子胺基酸殘基，諸如上文所描述之彼等者，或可包含鄰近於抗原決定基及/或類似物(及/或CTL (例如CD8+)、Th (例如CD4+)及B細胞抗原決定基)之天然存在的側接序列。

載體中包括熟習此項技術者熟知的標準調節序列以確保表現於靶細胞中。需要若干向量元件：具有用於聚核苷酸之下游選殖位點，例如小型基因插入之啟動子；用於有效轉錄終止之聚腺苷酸化信號；大腸桿菌複製起點；及大腸桿菌可選擇標記物(例如安比西林或康黴素抗性)。多種啟動子可用於此目的，例如人類細胞巨大病毒(hCMV)啟動子。關於其他適合的啟動子序列，參見例如美國專利第5,580,859號及第5,589,466號。在一些實施例中，啟動子為CMV-IE啟動子。

適用於真核宿主、尤其哺乳動物或人類的表現載體包括例如包含來自SV40、牛科動物乳頭狀瘤病毒、腺病毒及細胞巨大病毒之表現控制序列的載體。適用於細菌宿主之表現載體包括已知細菌質體，諸如來自大腸桿菌之質體，包括pCR1、pBR322、pMB9及其衍生物；較寬宿主範圍質體，諸如M13及絲狀單股DNA噬菌體。

可藉由多種不同方法將載體引入動物組織中。兩種最流行方法為使用標準皮下注射針注射含有DNA的生理鹽水及基因槍遞送。藉由此兩種方法構建DNA疫苗質體及隨後遞送其至宿主中的示意性概述說明於Scientific American (Weiner等人, (1999)Scientific American 281(1): 34-41)中。於生理鹽水中注射通常在骨骼肌肌肉內(IM)進行，或皮內(ID)進行，其中DNA遞送至細胞外空間。此可藉由電穿孔、藉由肌肉毒素(諸如布比卡因(bupivacaine))暫時性損傷肌肉纖維或藉由使用高張力生理鹽水或蔗糖溶液來促進(Alarcon等人, (1999). Adv. Parasitol. Advances in Parasitology 42: 343-410)。此遞送方法之免疫反應可能受多種因素影響，包括針頭類型、針頭對準、注射速度、注射體積、注射之動物之肌肉類型及年齡、性別及生理條件(Alarcon等人, (1999). Adv. Parasitol. Advances in Parasitology 42: 343-410)。

基因槍遞送(另一常用遞送方法)以彈道形式加快已吸附於金或鎢微米粒子上之質體DNA (pDNA)進入靶細胞中，使用壓縮氦氣作為加速劑(Alarcon等人, (1999). Adv. Parasitol. Advances in Parasitology 42: 343-410；Lewis等人, (1999). Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88)。

替代遞送方法可包括以氣溶膠將裸DNA滴入黏膜表面(諸如鼻及肺黏膜)(Lewis等人, (1999). Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88)及局部投與pDNA至眼睛及陰道黏膜(Lewis等人, (1999) Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88)。黏膜表面遞送亦已使用以下達成：陽離子脂質體-DNA製劑、生物可降解微球體、減毒志賀桿菌(Shigella)或李斯特菌(Listeria)載體用於經口投與腸黏膜，及重組腺病毒載體。DNA或RNA亦可在暫時滲透細胞之細胞膜之溫和機械破壞之後遞送至細胞。膜之此類溫和機械破壞可藉由輕輕地迫使細胞通過較小孔口實現(Sharei等人, Ex Vivo Cytosolic Delivery of Functional Macromolecules to Immune Cells, PLOS ONE (2015))。

將聚核苷酸引入宿主細胞中之化學方式包括膠態分散系統，諸如大分子複合物、奈米膠囊、微球、珠粒及基於脂質之系統，包括水包油乳液、微胞、混合微胞及脂質體。用作活體外及活體內傳送媒劑之例示性膠態系統為脂質體(例如人工膜泡)。在利用非病毒傳遞系統之情況下，例示性傳遞媒劑為脂質體。「脂質體」為通用術語，其涵蓋藉由產生經圍封之脂質雙層或聚集物而形成的多種單層及多層脂質媒劑。脂質體之特徵可為具有囊泡結構，其具有磷脂雙層膜及內部水性介質。多層脂質體具有藉由水性介質分隔開之多個脂質層。其在磷脂懸浮於過量水溶液中時自發地形成。脂質組分在形成封閉結構之前進行自身重組且在脂質雙層之間捕獲水及溶解之溶解物(Ghosh等人, Glycobiology 5: 505-10 (1991))。然而，亦涵蓋在溶液中具有與正常囊泡結構不同之結構的組合物。舉例而言，脂質可採用膠束結構或僅以脂質分子之非均勻聚集物形式存在。亦涵蓋脂染胺-核酸複合物。

涵蓋使用脂質調配物將核酸引入宿主細胞中(活體外、離體或活體內)。在另一態樣中，核酸可與脂質締合。與脂質締合之核酸可包封於脂質體之水性內部中，穿插於脂質體之脂質雙層內，經由與脂質體及寡核苷酸締合之連接分子連接至脂質體、包覆於脂質體中，與脂質體複合，分散於含有脂質之溶液中，與脂質混合，與脂質合併，以懸浮液形式含於脂質中，含有微胞或與微胞複合，或以其他方式與脂質締合。與脂質、脂質/DNA或脂質/表現載體締合的組合物不限於溶液中之任何特定結構。舉例而言，其可存在於雙層結構中，以微胞形式存在或具有「塌陷」結構。其亦可簡單地穿插於溶液中，可能形成尺寸或形狀上不均勻的聚集物。脂質為可天然存在之脂肪物質或合成脂質。舉例而言，脂質包括細胞質中天然存在之脂肪滴以及含有長鏈脂族烴及其衍生物之化合物類別(諸如脂肪酸、醇、胺、胺基醇及醛)。

適合於使用之脂質可獲自商業來源。舉例而言，二肉豆蔻基磷脂醯膽鹼(「DMPC」)可獲自Sigma, St. Louis, Mo.；磷酸三十二烷基酯(「DCP」)可獲自K & K Laboratories (Plainview, N.Y.)；膽固醇(「Choi」)可獲自Calbiochem-Behring；二肉豆蔻基磷脂醯甘油(「DMPG」)及其他脂質可獲自Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, Ala.)。氯仿或氯仿/甲醇中之脂質儲備溶液可在約-20℃下儲存。氯仿用作唯一溶劑，因為其比甲醇更容易蒸發。

在一些實施例中，載體包含一種聚核苷酸，其編碼包含第一新抗原決定基之第一肽及包含第二新抗原決定基之第二肽。在一些實施例中，第一及第二肽來源於相同蛋白質。至少兩個不同肽在長度、胺基酸序列或兩者可不同。該等肽來源於已知或已發現含有腫瘤特異性突變之任何蛋白質。在一些實施例中，載體包含：包含蛋白質之第一新抗原決定基之第一肽及包含相同蛋白質之第二新抗原決定基之第二肽，其中第一肽與第二肽不同，且其中第一新抗原決定基包含突變且第二新抗原決定基包含相同突變。在一些實施例中，載體包含：包含蛋白質之第一區域之第一新抗原決定基的第一肽及包含相同蛋白質之第二區域之第二新抗原決定基的第二肽，其中第一區域包含第二區域之至少一個胺基酸，其中第一肽與第二肽不同，且其中第一新抗原決定基包含第一突變且第二新抗原決定基包含第二突變。在一些實施例中，第一突變及第二突變相同。在一些實施例中，突變選自由以下組成之群：點突變、剪接位點突變、讀框轉移突變、通讀突變、基因融合突變及其任何組合。

在一些實施例中，載體包含可操作地連接於啟動子之聚核苷酸。在一些實施例中，載體為自擴增RNA複製子、質體、噬菌體、轉位子、黏質體、病毒或病毒粒子。在一些實施例中，載體來源於逆轉錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒、痘病毒、α病毒、牛痘病毒、B型肝炎病毒、人類乳突狀瘤病毒或其假模式標本。在一些實施例中，載體為非病毒載體。在一些實施例中，非病毒載體為奈米粒子、陽離子脂質、陽離子聚合物、金屬奈米聚合物、奈米棒、脂質體、膠束、微泡、細胞穿透肽或脂質球。
T 細胞受體

在一個態樣中，本發明提供表現使免疫反應性細胞活化之新抗原識別受體(例如T細胞受體(TCR)或嵌合抗原受體(CAR))之細胞，及使用此類細胞來治療需要增強的免疫反應之疾病之方法。此類細胞包括表現抗原識別受體(例如TCR或CAR)之經基因修飾之免疫反應性細胞(例如T細胞、自然殺手(NK)細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL (例如CD8+))細胞、輔助T淋巴細胞(Th (例如CD4+))細胞)，其結合本文所描述之新抗原肽中之一者，及因此用於治療贅瘤及需要提高抗原特異性免疫反應之其他病變的使用方法。T細胞活化藉由靶向抗原之TCR或CAR介導。

本發明提供表現使免疫反應性細胞活化之抗原識別受體(例如TCR、CAR)及嵌合共刺激性受體(CCR)之組合之細胞；及使用此類細胞來治療需要增強的免疫反應之疾病之方法。在一些實施例中，腫瘤抗原特異性T細胞、NK細胞、CTL細胞或其他免疫反應性細胞用作選擇性富集一或多種用於治療或預防贅瘤之共刺激配位體之穿梭子。向有需要之人類個體投與此類細胞以便治療或預防特定癌症。

在一些實施例中，可用於本發明之方法中之腫瘤抗原特異性人類淋巴細胞包括(但不限於)經基因修飾以表現嵌合抗原受體(CAR)之外周供體淋巴細胞(Sadelain, M.等人 2003 Nat Rev Cancer 3:35-45)；經基因修飾以表現包含a及p雜二聚體之全長腫瘤抗原識別T細胞受體複合物之外周供體淋巴細胞(Morgan, R. A.,等人 2006 Science 314:126-129)；來源於腫瘤活檢體中之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)之淋巴細胞培養物(Panelli, M. C.,等人 2000 J Immunol 164:495-504；Panelli, M. C.,等人 2000 J Immunol 164:4382-4392)；及採用人造抗原呈現細胞(AAPC)或脈衝式樹突狀細胞之選擇性活體外擴增抗原特異性末梢血液白血球(Dupont, J.,等人 2005 Cancer Res 65:5417-5427；Papanicolaou, G. A.,等人 2003 Blood 102:2498-2505)。T細胞可為自體、同種異體或活體外來源於經工程改造之祖細胞或幹細胞。

在一些實施例中，免疫治療為經工程改造之受體。在一些實施例中，經工程改造之受體為嵌合抗原受體(CAR)、T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)、過繼T細胞療法(ACT)或其衍生物。在其他態樣中，經工程改造之受體為嵌合抗原受體(CAR)。在一些態樣中，CAR為第一代CAR。在其他態樣中，CAR為第二代CAR。在又其他態樣中，CAR為第三代CAR。在一些態樣中，CAR包含細胞外部分、跨膜部分及細胞內部分。在一些態樣中，細胞內部分包含至少一個T細胞共刺激區域。在一些態樣中，T細胞共刺激區域選自由以下組成之群：CD27、CD28、TNFRS9 (4-1BB)、TNFRSF4 (OX40)、TNFRSF8 (CD30)、CD40LG (CD40L)、ICOS、ITGB2 (LFA-1)、CD2、CD7、KLRC2 (NKG2C)、TNFRS18 (GITR)、TNFRSF14 (HVEM)或其任何組合。

在一些態樣中，經工程改造之受體結合靶標。在一些態樣中，結合特定針對於對罹患疾病或病況之一或多種個體具有特異性的肽。

在一些態樣中，免疫治療為如本文中詳細描述之細胞。在一些態樣中，免疫治療為包含特異性結合本文所描述之肽或新抗原決定基之受體的細胞。在一些態樣中，免疫治療為與本發明之肽/核酸組合使用的細胞。在一些實施例中，細胞為患者細胞。在一些實施例中，細胞為T細胞。在一些實施例中，細胞為腫瘤浸潤性淋巴細胞。

在一些態樣中，基於個體之T細胞受體基因譜，治療患有病況或疾病之個體。在一些實施例中，基於個體之T細胞受體基因譜，選擇肽或新抗原決定基。在一些實施例中，用表現對如本文所描述之肽或新抗原決定基具有特異性的TCR之T細胞治療個體。在一些實施例中，用對TCR，例如個體特異性TCR具有特異性的肽或新抗原決定基治療個體。在一些實施例中，用對表現TCR，例如個體特異性TCR之T細胞具有特異性的肽或新抗原決定基治療個體。在一些實施例中，用對個體特異性TCR具有特異性的肽或新抗原決定基治療個體。

在一些實施例中，基於一或多種個體中鑑別到之TCR，選擇如本文所描述之組合物。在一些實施例中，鑑別T細胞基因譜及測試功能分析用於測定待投與給一或多個患有病況或疾病之個體的組合物。在一些實施例中，組合物為包含一或多種如本文所描述之肽或蛋白質之抗原疫苗。在一些實施例中，疫苗包含個體特異性新抗原肽。在一些實施例中，基於結合至新抗原決定基之個體特異性TCR之定量，選擇疫苗中包括之肽。在一些實施例中，基於肽對TCR之結合親和力，選擇肽。在一些實施例中，選擇係基於數量及結合親和力兩者之組合。舉例而言，在功能分析中很大程度上結合至新抗原決定基，但在TCR基因譜中未高度展現之TCR可為抗原疫苗之良好候選物，因為表現TCR之T細胞將有利地擴增。

在一些實施例中，基於結合至TCR選擇肽或蛋白質以便向一或多種個體投與。在一些實施例中，T細胞，諸如來自患有疾病或病況之個體的T細胞可擴增。表現對新抗原肽或新抗原決定基具有特異性的TCR擴增T細胞可投與返回個體。在一些實施例中，適合的細胞，例如PBMC用聚核苷酸轉導或轉染以用於表現對新抗原肽或新抗原決定基具有特異性的TCR向個體投與之表現對新抗原肽或新抗原決定基具有特異性的TCR之T細胞可擴增及投與返回個體。在一些實施例中，表現對與自體患病組織一起培育時產生溶胞活性之新抗原肽或新抗原決定基具有特異性的TCR之T細胞可擴增且向個體投與。在一些實施例中，使得結合至新抗原肽或新抗原決定基、在功能分析中使用之T細胞可擴增且向個體投與。在一些實施例中，已測定出結合至個體特異性新抗原肽或新抗原決定基之TCR可在T細胞中表現且向個體投與。

在一個實施例中，本發明提供一種組合物，其包含：包含第一新抗原決定基之第一肽及包含第二新抗原決定基之第二肽，其中第一肽與第二肽不同，且其中第一新抗原決定基包含突變且第二新抗原決定基包含相同突變。在一些實施例中，如本文所提供之組合物包含：第一T細胞，其包含對第一新抗原決定基具有特異性的第一T細胞受體(TCR)；及第二T細胞，其包含對第二新抗原決定基具有特異性的第二TCR。在一些實施例中，第一及第二肽來源於相同蛋白質。

在另一實施例中，本發明提供一種組合物，其包含：包含蛋白質之第一區域之第一新抗原決定基的第一肽及包含相同蛋白質之第二區域之第二新抗原決定基的第二肽，其中第一區域包含第二區域之至少一個胺基酸，其中第一肽與第二肽不同，且其中第一新抗原決定基包含第一突變且第二新抗原決定基包含第二突變。在一些實施例中，如本文所提供之組合物包含：第一T細胞，其包含對第一新抗原決定基具有特異性的第一T細胞受體(TCR)；及第二T細胞，其包含對第二新抗原決定基具有特異性的第二TCR。在一些實施例中，第一突變及第二突變相同。

在一些實施例中，第一新抗原決定基結合至I類HLA蛋白質以形成I類HLA-肽複合物。在一些實施例中，第一新抗原決定基結合至II類HLA蛋白質以形成II類HLA-肽複合物。在一些實施例中，第二新抗原決定基結合至II類HLA蛋白質以形成II類HLA-肽複合物。在一些實施例中，第二新抗原決定基結合至I類HLA蛋白質以形成I類HLA-肽複合物。在一些實施例中，第一新抗原決定基活化CD8+ T細胞。在一些實施例中，第一新抗原決定基活化CD4+ T細胞。在一些實施例中，第二新抗原決定基活化CD4+ T細胞。在一些實施例中，第二新抗原決定基活化CD8+ T細胞。在一些實施例中，CD4+ T細胞之TCR結合至II類HLA-肽複合物。在一些實施例中，CD8+ T細胞之TCR結合至II類HLA-肽複合物。在一些實施例中，CD8+ T細胞之TCR結合至I類HLA-肽複合物。在一些實施例中，CD4+ T細胞之TCR結合至I類HLA-肽複合物。

在一些實施例中，第一TCR為對第一新抗原決定基具有特異性的第一嵌合抗原受體，且第二TCR為對第二新抗原決定基具有特異性的第二嵌合抗原受體。在一些實施例中，第一T細胞為細胞毒性T細胞。在一些實施例中，第一T細胞為γ δ T細胞。在一些實施例中，第二T細胞為輔助T細胞。在一些實施例中，第一及/或第二TCR結合至具有小於1,000 nM、900 nM、800 nM、700 nM、600 nM、500 nM、250 nM、150 nM、100 nM、50 nM、25 nM或10 nM之KD或IC50之HLA-肽複合物。在一些實施例中，第一及/或第二TCR結合至具有小於1,000 nM、900 nM、800 nM、700 nM、600 nM、500 nM、250 nM、150 nM、100 nM、50 nM、25 nM或10 nM之KD或IC50之HLA I類-肽複合物。在一些實施例中，第一及/或第二TCR結合至具有小於2,000、1,500、1,000 nM、900 nM、800 nM、700 nM、600 nM、500 nM、250 nM、150 nM、100 nM、50 nM、25 nM或10 nM之KD或IC50之HLA II類-肽複合物。

抗原呈現細胞

新抗原肽或蛋白質可以含有如本文所描述之此類肽、蛋白質或聚核苷酸之抗原呈現細胞(例如樹突狀細胞)形式提供。在其他實施例中，此類抗原呈現細胞用於刺激供患者用之T細胞。因此，本發明之一個實施例為含有經脈衝或裝載有一或多種本文所描述之新抗原肽或聚核苷酸的至少一種抗原呈現細胞(例如樹突狀細胞)的組合物。在一些實施例中，此類APC為自體的(例如自體樹突狀細胞)。替代地，自患者分離之外周血液單核細胞(PBMC)可離體裝載有新抗原肽或聚核苷酸。在相關實施例中，此類APC或PBMC注射回患者體內。在一些實施例中，抗原呈現細胞為樹突狀細胞。在相關實施例中，樹突狀細胞為用新抗原肽或核酸脈衝之自體樹突狀細胞。新抗原肽可為產生適當的T細胞反應之任何適合的肽。使用經來自腫瘤相關抗原之肽脈衝之自體樹突狀細胞的T細胞療法揭示於Murphy等人 (1996) The Prostate 29, 371-380及Tjua等人 (1997) The Prostate 32, 272-278中。在一些實施例中，T細胞為CTL (例如CD8+)。在一些實施例中，T細胞為輔助T淋巴細胞(Th (例如CD4+))。

在一些實施例中，本發明提供一種組合物，其包含亦可向個體投與之基於細胞之免疫原性醫藥組合物。舉例而言，適當時且如此項技術中所理解，可使用熟知技術、載劑及賦形劑中之任一者調配基於抗原呈現細胞(APC)之免疫原性醫藥組合物。APC包括單核球、單核球衍生細胞、巨噬細胞及樹突狀細胞。有時，基於APC之免疫原性醫藥組合物可為基於樹突狀細胞之免疫原性醫藥組合物。

基於樹突狀細胞之免疫原性醫藥組合物可藉由此項技術中熟知之任何方法製備。在一些情況下，基於樹突狀細胞之免疫原性醫藥組合物可經由離體或活體內方法製備。離體方法可包含使用經本文所描述之多肽離體脈衝之自體DC以在向患者投與之前活化或裝載DC。活體內方法可包含使用與本文所描述之多肽偶合之抗體靶向特異性DC受體。基於DC之免疫原性醫藥組合物可進一步包含DC活化劑，諸如TLR3、TLR-7-8及CD40促效劑。基於DC之免疫原性醫藥組合物可進一步包含佐劑及醫藥學上可接受之載劑。

抗原呈現細胞(APC)可由包括人類及非人類靈長類動物、其他哺乳動物及脊椎動物之多種來源製備。在某些實施例中，APC可由人類或非人類脊椎動物之血液製備。APC亦可自白血球之富集群體分離。白血球群體可藉由熟習此項技術者已知之方法製備。此類方法典型地包括採集肝素化血液、血球分離術或白細胞去除、製備白血球層、玫瑰花簇(rosetting)、離心、密度梯度離心(例如使用聚蔗糖(Ficoll)、膠態二氧化矽粒子及蔗糖)、差異溶解非白細胞及過濾。白細胞群體亦可藉由自個體採集血液、去纖維顫動移除血小板及使紅血細胞裂解來製備。白細胞群體可視情況富集單核球性樹突狀細胞前驅體。

血球群體可根據白血球之富集群體之所需用途獲自多種個體。個體可為健康個體。替代地，血細胞可獲自需要免疫刺激之個體，諸如癌症患者或免疫刺激將有利的其他患者。同樣地，血細胞可獲自需要免疫抑制之個體，諸如患有自體免疫病症(例如類風濕性關節炎、糖尿病、狼瘡、多發性硬化症及其類似者)之患者。白血球群體亦可獲自HLA匹配健康個體。

當血液用作APC來源時，血液白血球可使用維持其活力之習知方法獲得。根據本發明之一個態樣，血液可稀釋至可含有或可不含有肝素或其他適合的抗凝劑之培養基中。血液與培養基之體積可為約1至1。可藉由在培養基中在4℃下以約1,000 rpm (150 g)離心血液來濃縮細胞。可藉由使細胞再懸浮於將溶解紅血球之此項技術中已知之任何數目之溶液(例如氯化銨)中來使血小板及紅血細胞耗盡。舉例而言，混合物可為按體積計約1:1之培養基及氯化銨。可藉由在所需溶液中離心及洗滌直至獲得實質上不含血小板及紅血細胞之白血球群體來濃縮細胞。組織培養物中常用之任何等張溶液可用作用於自血小板及紅血細胞分離血白血球之培養基。此類等張溶液之實例可為磷酸鹽緩衝鹽水、漢克斯(Hanks)平衡鹽溶液及完全生長培養基。APC及/或APC前驅體細胞亦可藉由淘析純化。

在一個實施例中，在發炎性或以其他方式活化之條件下，APC可為非標稱APC。舉例而言，非標稱APC可包括用藉由誘發APC活性之因素或條件活化之干擾素-γ、T細胞、B細胞及/或單核球刺激之上皮細胞。此類非標稱APC可根據此項技術中已知之方法製備。

APC可按需要根據APC之類型培養、擴增、分化及/或成化。可在任何適合的培養容器，諸如培養盤、燒瓶、培養袋及生物反應器中培養APC。

在某些實施例中，可在適合的培養物或生長培養基中培養APC以維持及/或擴增製劑中之APC之數目。可根據分離之APC之類型選擇培養基。舉例而言，可在適合於其維持及擴增之生長培養基中培養成熟APC，諸如成熟樹突狀細胞。培養基可補充有胺基酸、維生素、抗生素、二價陽離子及其類似者。另外，細胞介素、生長因子及/或激素可包括於生長培養基中。舉例而言，為了維持及/或擴增成熟樹突狀細胞，可添加細胞介素，諸如粒細胞/巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)及/或介白素4 (IL-4)。在其他實施例中，可培養及/或擴增不成熟APC。不成熟樹突狀細胞可保留其吸收靶mRNA及處理新穎抗原之能力。在一些實施例中，可在適合於其維持及培養之培養基中培養不成熟樹突狀細胞。培養基可補充有胺基酸、維生素、抗生素、二價陽離子及其類似者。另外，細胞介素、生長因子及/或激素可包括於生長培養基中。

可類似地培養或擴增其他不成熟APC。不成熟APC製劑可成化以形成成熟APC。APC之成熟可在曝露於新抗原肽期間或之後發生。在某些實施例中，不成熟樹突狀細胞製劑可成化。適合的成熟因素包括例如細胞介素TNF-α、細菌產物(例如BCG)及其類似者。在另一態樣中，分離之APC前驅體可用於製備不成熟APC製劑。APC前驅體可培養、分化及/或成化。在某些實施例中，單核球性樹突狀細胞前驅體可在補充有胺基酸、維生素、細胞介素及/或二價陽離子之適合的培養基存在下培養以促進單核球性樹突狀細胞前驅體分化成不成熟樹突狀細胞。在一些實施例中，自PBMC分離APC前驅體。PBMC可獲自供體，例如人類供體，且可新鮮使用或冷凍備用。在一些實施例中，APC由一或多種APC製劑製備。在一些實施例中，APC包含：裝載有包含第一及第二新抗原決定基之第一及第二新抗原肽或編碼包含第一及第二新抗原決定基之第一及第二新抗原肽之聚核苷酸的APC。在一些實施例中，APC為自體APC、同種異體APC或人造APC。

在一個實施例中，本發明提供一種包含APC之組合物，該APC包含：包含第一新抗原決定基之第一肽及包含第二新抗原決定基之第二肽，其中第一肽與第二肽不同，且其中第一新抗原決定基包含突變且第二新抗原決定基包含相同突變。在一些實施例中，第一及第二肽來源於相同蛋白質。在另一實施例中，本發明提供一種包含APC之組合物，該APC包含：包含蛋白質之第一區域之第一新抗原決定基的第一肽及包含相同蛋白質之第二區域之第二新抗原決定基的第二肽，其中第一區域包含第二區域之至少一個胺基酸，其中第一肽與第二肽不同，且其中第一新抗原決定基包含第一突變且第二新抗原決定基包含第二突變。在一些實施例中，第一突變及第二突變相同。
佐劑

佐劑可用於增強接受如本文所提供之組合物之患者中誘發之免疫反應(體液及/或細胞)。有時，佐劑可誘發Th1類型反應。其他時間，佐劑可誘發Th2類型反應。Th1類型反應之特徵可在於產生諸如IFN-γ之細胞介素，與此相反，Th2類型反應之特徵可在於產生諸如IL-4、IL-5及IL-10之細胞介素。

在一些態樣中，基於脂質之佐劑，諸如MPLA及MDP可與本文所揭示之免疫原性醫藥組合物一起使用。舉例而言，單磷醯基脂質A (MPLA)為使得針對特異性T淋巴球呈現脂質體抗原增加的佐劑。另外，胞壁醯二肽(MDP)亦可用作適合的佐劑以及本文所描述之免疫原性醫藥調配物。

適合的佐劑為此項技術中已知的(參見WO 2015/095811)且包括(但不限於) 聚(I:C)、聚-ICLC、希托洛、STING促效劑、1018 ISS、鋁鹽、Amplivax、AS15、BCG、CP-870、893、CpG7909、CyaA、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特(Imiquimod)、ImuFact IMP321、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、JuvImmune、LipoVac、MF59、單磷醯基脂質A、孟塔納(Montanide) IMS 1312、孟塔納ISA 206、孟塔納ISA 50V、孟塔納ISA-51、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、PepTel®、載體系統、PLG微米粒子、雷西莫特(resiquimod)、SRL172、病毒顆粒及其他病毒樣粒子、YF-17D、VEGF阱、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、Pam3CSK4、Aquila之QS21刺激子(Aquila Biotech, Worcester, Mass., USA)，其來源於皂素、分支桿菌提取物及合成細菌細胞壁模擬物；及其他專用佐劑，諸如Ribi's Detox. Quil或Superfos。佐劑亦包括不完全弗氏或GM-CSF。先前已描述對樹突狀細胞具有特異性的若干免疫學佐劑(例如MF59)及其製備(Dupuis M,等人, Cell Immunol. 1998; 186(1):18-27; Allison A C; Dev. Biol. Stand. 1998; 92:3-11) (Mosca等人 Frontiers in Bioscience, 2007; 12:4050-4060) (Gamvrellis等人 Immunol & Cell Biol. 2004; 82: 506-516)。亦可使用細胞介素。若干細胞介素已與以下直接有關：影響樹突狀細胞遷移至淋巴組織(例如TNF-α)、加快樹突狀細胞成熟變為T-淋巴球之有效抗原呈現細胞(例如GM-CSF、PGE1、PGE2、IL-1、IL-1b、IL-4、IL-6及CD40L) (美國專利第5,849,589號，其以全文引用之方式併入本文中)及充當免疫佐劑(例如IL-12) (Gabrilovich D I等人, J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 1996 (6):414-418)。

佐劑亦可包含刺激分子，諸如細胞介素。細胞介素之非限制性實例包括：CCL20、a-干擾素(IFN-a)、β-干擾素(IFN-β)、γ-干擾素、血小板衍生生長因子(PDGF)、TNFα、TNFβ (淋巴毒素α(LTα))、GM-CSF、表皮生長因子(EGF)、皮膚T細胞吸引趨化因子(CTACK)、上皮胸腺表現趨化因子(TECK)、黏膜相關上皮趨化因子(MEC)、IL-12、IL-15、IL-28、MHC、CD80、CD86、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、MCP-1、MIP-la、MIP-1-、IL-8、L-選擇素、P-選擇蛋白、E-選擇蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-18之突變形式、CD40、CD40L、血管生長因子、纖維母細胞生長因子、IL-7、神經生長因子血管內皮生長因子、Fas、TNF受體、Fit、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DRS、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、凋亡蛋白酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IκB、失活NIK、SAP K、SAP-I、JNK、干擾素反應基因、NFκB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40 LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAPI及TAP2。

額外佐劑包括：MCP-1、MIP-la、MIP-lp、IL-8、RANTES、L-選擇蛋白、P-選擇蛋白、E-選擇蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18之突變形式、CD40、CD40L、血管生長因子、纖維母細胞生長因子、IL-7、IL-22、神經生長因子、血管內皮生長因子、Fas、TNF受體、Fit、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、凋亡蛋白酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IκB、失活NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干擾素反應基因、NFκB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40 LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2 及其功能片段。

在一些態樣中，佐劑可為鐸樣受體之調節劑。鐸樣受體之調節劑之實例包括TLR-9促效劑且不限於鐸樣受體之小分子調節劑，諸如咪喹莫特。與本文所描述之免疫原性醫藥組合物組合使用之佐劑之其他實例可包括且不限於皂素、CpG ODN及其類似者。有時，佐劑選自細菌類毒素、聚氧化丙烯-聚氧化乙烯嵌段共聚物、鋁鹽、脂質體、CpG聚合物、水包油乳液或其組合。有時，佐劑為水包油乳液。水包油乳液可包括至少一種油狀物及至少一種界面活性劑，其中油狀物及界面活性劑為可生物降解(可代謝)及生物相容的。乳液中之小油滴直徑可小於5 μm，且可甚至具有亞微米直徑，此等較小尺寸用微流化床裝置實現以提供穩定乳液。尺寸小於220 nm之液滴可經受過濾器滅菌。
治療方法及醫藥組合物

本文所描述之新抗原治療劑(例如肽、聚核苷酸、TCR、CAR、含有TCR或CAR之細胞、含有多肽之APC或樹突狀細胞、含有聚核苷酸之樹突狀細胞、抗體等)適用於多種應用中，包括(但不限於)治療性治療方法，諸如癌症治療。在一些實施例中，治療性治療方法包含免疫療法。在某些實施例中，新抗原肽適用於活化、促進、提高及/或增強免疫反應，再引導針對新靶標之現有免疫反應，提高腫瘤免疫原性，抑制腫瘤生長，減小腫瘤體積，提高腫瘤細胞凋亡及/或降低腫瘤致瘤性。使用方法可為活體外、離體或活體內方法。

在一些態樣中，本發明提供使用本文所描述之新抗原肽或蛋白質活化個體之免疫反應的方法。在一些實施例中，本發明提供使用本文所描述之新抗原肽促進個體之免疫反應的方法。在一些實施例中，本發明提供使用本文所描述之新抗原肽提高個體之免疫反應的方法。在一些實施例中，本發明提供使用新抗原肽增強免疫反應之方法。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、提高及/或增強包含提高細胞介導的免疫性。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、提高及/或增強包含提高T細胞活性或體液免疫。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、提高及/或增強包含提高CTL或Th活性。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、提高及/或增強包含提高NK細胞活性。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、提高及/或增強包含提高T細胞活性及提高NK細胞活性。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、提高及/或增強包含提高CTL活性及提高NK細胞活性。在一些實施例中，免疫反應之活化、促進、提高及/或增強包含抑制或降低T調節(Treg)細胞之抑制活性。在一些實施例中，免疫反應為抗原刺激結果。在一些實施例中，抗原刺激為腫瘤細胞。在一些實施例中，抗原刺激為癌症。

在一些實施例中，本發明提供使用本文所描述之新抗原肽活化、促進、提高及/或增強免疫反應之方法。在一些實施例中，一種方法包含向有需要之個體投與治療有效量之新抗原肽，其將新抗原肽或聚核苷酸遞送至抗原呈現細胞(例如腫瘤細胞)。在一些實施例中，一種方法包含向有需要之個體投與治療有效量之藉由抗原呈現細胞(例如腫瘤細胞)內化之新抗原肽。在一些實施例中，一種方法包含向有需要之個體投與治療有效量之藉由抗原呈現細胞(例如腫瘤細胞)內化之新抗原肽，且新抗原肽藉由細胞處理。在一些實施例中，一種方法包含向有需要之個體投與治療有效量之藉由抗原呈現細胞(例如腫瘤細胞)內化之新抗原多肽，且新抗原決定基呈現在抗原呈現細胞之表面上。在一些實施例中，一種方法包含向有需要之個體投與治療有效量之藉由抗原呈現細胞(例如腫瘤細胞)內化、由細胞處理之新抗原多肽，且抗原肽呈現在抗原呈現細胞之表面上。

在一些實施例中，一種方法包含向有需要之個體投與治療有效量之本文所描述之新抗原肽或聚核苷酸，其將包含至少一種新抗原肽之外源性多肽遞送至抗原呈現細胞(例如腫瘤細胞)，其中來源於新抗原肽之至少一種新抗原決定基呈現在抗原呈現細胞之表面上。在一些實施例中，抗原肽呈現在具有MHC I類分子之複合物中之抗原呈現細胞之表面上。在一些實施例中，新抗原決定基呈現在具有MHC II類分子之複合物中之抗原呈現細胞之表面上。

在一些實施例中，一種方法包含使腫瘤細胞與本文所描述之新抗原多肽或聚核苷酸接觸，其將包含至少一種新抗原肽之外源性多肽遞送至抗原呈現細胞，其中來源於至少一種新抗原肽之至少一種新抗原決定基呈現在抗原呈現細胞(例如腫瘤細胞)之表面上。在一些實施例中，新抗原決定基呈現在具有MHC I類分子之複合物中之抗原呈現細胞(例如腫瘤細胞)之表面上。在一些實施例中，新抗原決定基呈現在具有MHC II類分子之複合物中之抗原呈現細胞(例如腫瘤細胞)之表面上。

在一些實施例中，一種方法包含向有需要之個體投與治療有效量之本文所描述之新抗原多肽或聚核苷酸，其將包含至少一種抗原肽之外源性多肽遞送至腫瘤細胞，其中新抗原決定基呈現在腫瘤細胞之表面上，且誘發相對於腫瘤細胞之免疫反應。在一些實施例中，提高相對於腫瘤細胞之免疫反應。在一些實施例中，新抗原多肽或聚核苷酸將包含至少一種新抗原肽之外源性多肽遞送至腫瘤細胞，其中新抗原決定基呈現在腫瘤細胞之表面上，且抑制腫瘤生長。

在一些實施例中，一種方法包含向有需要之個體投與治療有效量之本文所描述之新抗原多肽或聚核苷酸，其將包含至少一種新抗原肽之外源性多肽遞送至腫瘤細胞，其中來源於至少一種新抗原肽之新抗原決定基呈現在腫瘤細胞之表面上，且誘發針對腫瘤細胞之T細胞殺死。在一些實施例中，增強針對腫瘤細胞之T細胞殺死。在一些實施例中，提高針對腫瘤細胞之T細胞殺死。

在一些實施例中，一種提高個體之免疫反應之方法包含向該個體投與治療有效量之本文所描述之新抗原治療劑，其中藥劑為特異性結合本文所描述之新抗原之抗體。在一些實施例中，一種提高個體之免疫反應之方法包含向該個體投與治療有效量之抗體。

本發明提供再引導針對腫瘤之現有免疫反應之方法。在一些實施例中，一種再引導針對腫瘤之現有免疫反應之方法包含向個體投與治療有效量之本文所描述之新抗原治療劑。在一些實施例中，現有免疫反應係針對病毒。在一些實施例中，病毒選自由以下組成之群：麻疹病毒、水痘-帶狀疱疹病毒(VZV；水痘病毒)、流感病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰白質炎病毒、德國麻疹病毒、輪狀病毒、A型肝炎病毒(HAV)、B型肝炎病毒(HBV)、埃-巴二氏病毒(EBV)及細胞巨大病毒(CMV)。在一些實施例中，病毒為水痘-帶狀疱疹病毒。在一些實施例中，病毒為細胞巨大病毒。在一些實施例中，病毒為麻疹病毒。在一些實施例中，已在天然病毒感染之後獲得現有免疫反應。在一些實施例中，現有免疫反應已在針對病毒之疫苗接種之後獲得。在一些實施例中，現有免疫反應為細胞介導之反應。在一些實施例中，現有免疫反應包含細胞毒性T細胞(CTL)或Th細胞。

在一些實施例中，一種再引導個體針對腫瘤之現有免疫反應之方法包含投與融合蛋白，其包含(i)特異性結合新抗原之抗體及(ii)本文所描述之至少一種新抗原肽，其中(a)在結合至腫瘤相關抗原或新抗原決定基之後融合蛋白藉由腫瘤細胞內化；(b)新抗原肽在與MHC I類分子相關之腫瘤細胞之表面上處理及呈現；及(c)藉由細胞毒性T細胞識別新抗原肽/MHC I類複合物。在一些實施例中，細胞毒性T細胞為記憶T細胞。在一些實施例中，記憶T細胞為用新抗原肽疫苗接種之結果。

本發明提供提高腫瘤免疫原性之方法。在一些實施例中，一種提高腫瘤之免疫原性之方法包含使腫瘤或腫瘤細胞與有效量之本文所描述之新抗原治療劑接觸。在一些實施例中，一種提高腫瘤免疫原性之方法包含向個體投與治療有效量之本文所描述之新抗原治療劑。

本發明亦提供使用本文所描述之新抗原治療劑抑制腫瘤生長之方法。在某些實施例中，一種抑制腫瘤生長之方法包含活體外使細胞混合物與新抗原治療劑接觸。舉例而言，在添加新抗原肽之培養基中培養與免疫細胞(例如T細胞)混合之永生化細胞株或癌細胞株。在一些實施例中，腫瘤細胞自患者樣品，例如組織切片、肋膜積液或血液樣品分離，與免疫細胞(例如T細胞)混合，且在添加新抗原治療劑之培養基中培養。在一些實施例中，新抗原治療劑提高、促進及/或增強免疫細胞之活性。在一些實施例中，新抗原治療劑抑制腫瘤細胞生長。在一些實施例中，新抗原治療劑活化腫瘤細胞之殺死。

在某些實施例中，個體為人類。在某些實施例中，個體具有腫瘤或個體具有至少部分已被移除之腫瘤。

在一些實施例中，一種抑制腫瘤生長之方法包含再引導針對新靶標之現有免疫反應，其包含向個體投與治療有效量之新抗原治療劑，其中現有免疫反應係針對藉由新抗原肽遞送至腫瘤細胞之抗原肽。

在某些實施例中，腫瘤包含癌症幹細胞。在某些實施例中，藉由投與新抗原治療劑降低腫瘤中之癌症幹細胞之頻率。在一些實施例中，提供一種降低個體之腫瘤中之癌症幹細胞之頻率的方法，其包含向個體投與治療有效量之新抗原治療劑。

另外，在一些態樣中，本發明提供一種降低個體之腫瘤之致瘤性的方法，其包含向個體投與治療有效量之本文所描述之新抗原治療劑。在某些實施例中，腫瘤包含癌症幹細胞。在一些實施例中，藉由降低腫瘤中之癌症幹細胞之頻率來降低腫瘤之致瘤性。在一些實施例中，方法包含使用本文所描述之新抗原治療劑。在某些實施例中，藉由投與本文所描述之新抗原治療劑降低腫瘤中之癌症幹細胞之頻率。

在一些實施例中，腫瘤為實體腫瘤。在某些實施例中，腫瘤為選自由以下組成之群的腫瘤：結腸直腸腫瘤、胰腺腫瘤、肺臟腫瘤、卵巢腫瘤、肝臟腫瘤、乳房腫瘤、腎臟腫瘤、前列腺腫瘤、神經內分泌腫瘤、胃腸道腫瘤、黑色素瘤、子宮頸腫瘤、膀胱腫瘤、神經膠母細胞瘤及頭部及頸部腫瘤。在某些實施例中，腫瘤為結腸直腸腫瘤。在某些實施例中，腫瘤為卵巢腫瘤。在一些實施例中，腫瘤為乳房腫瘤。在一些實施例中，腫瘤為肺臟腫瘤。在某些實施例中，腫瘤為胰腺腫瘤。在某些實施例中，腫瘤為黑色素瘤腫瘤。在一些實施例中，腫瘤為實體腫瘤。

本發明進一步提供用於治療個體之癌症之方法，其包含向個體投與治療有效量之本文所描述之新抗原治療劑。

在一些實施例中，一種治療癌症之方法包含再引導針對新靶標之現有免疫反應，該方法包含向個體投與治療有效量之新抗原治療劑，其中現有免疫反應係針對藉由新抗原肽遞送至癌細胞之抗原肽。

本發明提供治療癌症之方法，其包含向個體投與治療有效量之本文所描述之新抗原治療劑(例如需要治療之個體)。在某些實施例中，個體為人類。在某些實施例中，個體具有癌性腫瘤。在某些實施例中，個體具有至少部分已被移除之腫瘤。

個體可為例如哺乳動物、人類、妊娠期婦女、老年人、成人、青少年、少年、兒童、幼童、嬰兒、新生兒或初生兒。個體可為患者。在一些情況下，個體可為人類。在一些情況下，個體可為孩子(亦即，青春期年齡以下之年輕人類)。在一些情況下，個體可為嬰兒。在一些情況下，個體可為配方餵養嬰兒。在一些情況下，個體可為入選臨床研究之個體。在一些情況下，個體可為實驗室動物，例如哺乳動物或嚙齒動物。在一些情況下，個體可為小鼠。在一些情況下，個體可為肥胖或超重個體。

在一些實施例中，個體先前已用一或多種不同癌症治療型式加以治療。在一些實施例中，個體先前已用放射線療法、化學療法或免疫療法中之一或多者加以治療。在具體例中，個體已用一種、兩種、三種、四種或五種線路之先前療法加以治療。在一些實施例中，先前療法為細胞毒性療法。

在某些實施例中，癌症為選自由以下組成之群的癌症：結腸直腸癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、乳癌、腎癌、前列腺癌、胃腸癌、黑色素瘤、子宮頸癌、神經內分泌癌症、膀胱癌、神經膠母細胞瘤及頭頸癌。在某些實施例中，癌症為胰臟癌。在某些實施例中，癌症為卵巢癌。在某些實施例中，癌症為結腸直腸癌。在某些實施例中，癌症為乳癌。在某些實施例中，癌症為前列腺癌。在某些實施例中，癌症為肺癌。在某些實施例中，癌症為黑色素瘤。在一些實施例中，癌症為固體癌症。在一些實施例中，癌症包含實體腫瘤。

在一些實施例中，癌症為血液癌。在一些實施例中，癌症選自由以下組成之群：急性骨髓白血病(AML)、霍奇金淋巴瘤、多發性骨髓瘤、T細胞急性淋巴母細胞白血病(T-ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、毛細胞白血病、慢性骨髓性白血病(CML)、非霍奇金淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、套細胞淋巴瘤(MCL)及皮膚T細胞淋巴瘤(CTCL)。

在一些實施例中，新抗原治療劑以組合療法形式投與。具有兩種或多於兩種治療劑之組合療法使用藉由不同作用機制起作用之試劑，儘管此不為所需。使用具有不同作用機制之試劑之組合療法會導致加成或協同作用。組合療法可允許與單一療法中所使用之劑量相比較低劑量之每一藥劑，由此降低毒性副作用及/或提高藥劑之治療指數。組合療法可降低將產生之抗性癌細胞之可能性。在一些實施例中，組合療法包含影響免疫反應(例如增強或活化反應)之治療劑及影響(例如抑制或殺滅)腫瘤/癌細胞之治療劑。

在一些情況下，免疫原性醫藥組合物可與額外藥劑一起投與。選擇額外藥劑可至少部分地視所治療之病況而定。額外藥劑可包括例如檢查點抑制劑，諸如抗PD1、抗CTLA4、抗PD-L1、抗CD40或抗TIM3藥劑(例如抗PD1、抗CTLA4、抗PD-L1、抗CD40或抗TIM3抗體)；或具有病原體感染之治療效果之任何試劑(例如病毒感染)，包括例如用於治療發炎病況，諸如NSAID之藥物，例如布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、乙醯胺苯酚、酮基布洛芬或阿司匹林(aspirin)。舉例而言，檢查點抑制劑可為選自由以下組成之群的PD-1/PD-L1拮抗劑：納武單抗(nivolumab) (ONO-4538/BMS-936558、MDX1 106、OPDIVO)、帕博利珠單抗(pembrolizumab) (MK-3475、KEYTRUDA)、皮立珠單抗(pidilizumab) (CT-011)及MPDL328OA (ROCHE)。作為另一實例，調配物可另外含有一或多種補充劑，諸如維生素C、E或其他抗氧化劑。

本發明之方法可用於治療此項技術中已知之任何類型的癌症。藉由本發明之方法治療之癌症之非限制性實例可包括黑色素瘤(例如轉移性惡性黑素瘤)、腎癌(例如透明細胞癌瘤)、前列腺癌(例如激素頑固性前列腺癌)、胰腺癌、乳癌、結腸癌、肺癌(例如非小細胞肺癌)、食道癌、頭頸部鱗狀細胞癌、肝癌、卵巢癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、神經膠母細胞瘤、神經膠瘤、白血病、淋巴瘤及其他贅生性惡性病。

另外，本文所提供之疾病或病況包括頑固性或復發性惡性病，其生長可使用本發明之治療方法抑制。在一些實施例中，藉由本發明之治療方法治療之癌症選自由以下組成之群：癌瘤、鱗狀癌瘤、腺癌、肉瘤、子宮內膜癌、乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、輸卵管癌、原發性腹膜癌、結腸癌、結腸直腸癌、肛門與生殖器區域之鱗狀細胞癌、黑色素瘤、腎細胞癌、肺癌、非小細胞肺癌、肺臟之鱗狀細胞癌、胃癌、膀胱癌、膽囊癌、肝癌、甲狀腺癌、喉癌、唾液腺癌、食道癌、頭頸癌、神經膠母細胞瘤、神經膠瘤、頭頸部鱗狀細胞癌、前列腺癌、胰臟癌、間皮瘤、肉瘤、血液癌症、白血病、淋巴瘤、神經瘤及其組合。在一些實施例中，藉由本發明之方法治療之癌症包括例如癌瘤、鱗狀癌(例如子宮頸管、眼瞼、結膜、陰道、肺臟、口腔、皮膚、膀胱、舌、喉及食道)及腺癌(例如前列腺、小腸、子宮內膜、子宮頸管、大腸、肺臟、胰腺、食道、直腸、子宮、胃、乳腺及卵巢)。在一些實施例中，藉由本發明之方法治療之癌症進一步包括肉瘤(例如肌源性肉瘤)、白血病、神經瘤、黑色素瘤及淋巴瘤。在一些實施例中，藉由本發明之方法治療之癌症為乳癌。在一些實施例中，藉由本發明之治療方法治療之癌症為三陰性乳癌(TNBC)。在一些實施例中，藉由本發明之治療方法治療之癌症為卵巢癌。在一些實施例中，藉由本發明之治療方法治療之癌症為結腸直腸癌。

在一些實施例中，用本發明之醫藥組合物治療之患者或患者群體具有實體腫瘤。在一些實施例中，實體腫瘤為黑色素瘤、腎細胞癌、肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、膽囊癌、喉癌、肝癌、甲狀腺癌、胃癌、唾液腺癌、前列腺癌、胰臟癌或梅克爾細胞癌(Merkel cell carcinoma)。在一些實施例中，用本發明之醫藥組合物治療之患者或患者群體患有血液癌症。在一些實施例中，患者患有血液癌症，諸如彌漫性大B細胞淋巴瘤(「DLBCL」)、霍奇金氏淋巴瘤(「HL」)、非霍奇金氏淋巴瘤(「NHL」)、濾泡性淋巴瘤(「FL」)、急性骨髓性白血病(「AML」)或多發性骨髓瘤(「MM」)。在一些實施例中，待治療之患者或患者群體患有選自由卵巢癌、肺癌及黑色素瘤組成之群的癌症。

可根據本發明預防及/或治療之癌症之特定實例包括(但不限於)以下：腎癌、腎臟癌、多形性膠質母細胞瘤、轉移性乳癌；乳癌；乳房肉瘤；神經纖維瘤；神經纖維瘤；小兒腫瘤；神經母細胞瘤；惡性黑素瘤；表層癌瘤；白血病，諸如(但不限於)急性白血病；急性淋巴球性白血病；急性骨髓細胞性白血病，諸如骨髓母細胞性、前髓細胞性、骨髓單核細胞性、單核球性、紅白血病及脊髓發育不良症候群；慢性白血病，諸如(但不限於)慢性骨髓細胞性(顆粒球性)白血病、慢性淋巴球性白血病、毛細胞白血病；真性紅細胞增多症；淋巴瘤，諸如(但不限於)霍奇金氏病、非霍奇金氏病；多發性骨髓瘤，諸如(但不限於)鬱積型多發性骨髓瘤、非分泌型骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、漿細胞白血病、孤立性漿細胞瘤及髓外漿細胞瘤；瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症；意義不明之單株球蛋白症；良性單株球蛋白症；重鏈疾病；骨癌及結締組織肉瘤，諸如(但不限於)骨骼肉瘤、骨髓瘤骨骼疾病、多發性骨髓瘤、膽脂瘤誘發骨骼骨肉瘤、骨骼佩吉特氏病、骨肉瘤、軟骨肉瘤、尤文氏肉瘤、惡性巨細胞瘤、骨骼纖維肉瘤、脊索瘤、骨膜肉瘤、軟組織肉瘤、血管肉瘤(血管內皮瘤)、纖維肉瘤、卡堡氏肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管內肉瘤、神經鞘瘤、橫紋肌肉瘤及滑膜肉瘤；腦瘤，諸如(但不限於)神經膠瘤、星形細胞瘤、腦幹神經膠瘤、室管膜瘤、少突神經膠質瘤、非神經膠質性腫瘤、聲學神經鞘瘤、顱咽管瘤、神經管胚細胞瘤、脊膜瘤、松果體細胞瘤、成松果體細胞瘤及原發性腦淋巴瘤；乳癌，包括(但不限於)腺癌、小葉(小細胞)癌瘤、管內癌瘤、髓質乳癌、黏液性乳癌、管狀乳癌、乳頭狀乳癌、佩吉特氏病(包括青少年佩吉特氏病)及炎性乳癌；腎上腺癌症，諸如(但不限於)嗜鉻細胞瘤及腎上腺皮質癌；甲狀腺癌，諸如(但不限於)乳頭狀或濾泡性甲狀腺癌、髓質甲狀腺癌及多形性甲狀腺癌；胰臟癌，諸如(但不限於)胰島素瘤、胃泌素瘤、升糖素瘤、血管活性腸肽瘤、生長抑素分泌腫瘤及類癌或胰島細胞腫瘤；垂體癌症，諸如但限於庫欣氏病(Cushing's disease)、促乳素分泌腫瘤、肢端肥大症及尿崩症；眼部癌症，諸如(但不限於)眼部黑色素瘤，諸如虹膜黑色素瘤、脈絡膜黑色素瘤及睫狀體黑色素瘤及視網膜胚細胞瘤；陰道癌，諸如鱗狀細胞癌、腺癌及黑色素瘤；外陰癌，諸如鱗狀細胞癌、黑色素瘤、腺癌、基底細胞癌、肉瘤及佩吉特氏病；子宮頸癌，諸如(但不限於)鱗狀細胞癌及腺癌；子宮癌，諸如(但不限於)子宮內膜癌瘤及子宮肉瘤；卵巢癌，諸如(但不限於)卵巢上皮癌、交界性腫瘤、生殖細胞腫瘤及基質腫瘤；子宮頸癌；食管癌，諸如(但不限於)鱗狀癌症、腺癌、腺樣囊性癌瘤、黏液表皮樣癌瘤、腺鱗癌瘤、肉瘤、黑色素瘤、漿細胞瘤、疣狀癌及燕麥細胞(小細胞)癌瘤；胃癌，諸如(但不限於)腺癌、蕈傘型(息肉狀)、潰瘍型、表面擴散型、彌散性擴散型、惡性淋巴瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤及癌肉瘤；結腸癌；結腸直腸癌、KRAS突變結腸直腸癌；結腸癌；直腸癌；肝癌，諸如(但不限於)肝細胞癌及肝母細胞瘤；膽囊癌，諸如腺癌；膽管癌，諸如(但不限於)乳頭狀、結節狀及彌散性；肺癌，諸如KRAS突變非小細胞肺癌、非小細胞肺癌、鱗狀細胞癌(表皮樣癌瘤)、腺癌、大細胞癌瘤及小細胞肺癌；肺臟癌瘤；睾丸癌，諸如(但不限於)胚組織瘤、精原細胞瘤(退行性、經典(典型)、精母細胞性)、非精原細胞瘤、胚胎癌、畸胎瘤、絨膜癌(卵黃囊瘤)；前列腺癌，諸如(但不限於)雄激素非依賴性前列腺癌、雄激素依賴性前列腺癌、腺癌、平滑肌肉瘤及橫紋肌肉瘤；陰莖癌；口腔癌，諸如(但不限於)鱗狀細胞癌；基底癌症；唾液腺癌，諸如(但不限於)腺癌、黏液表皮樣癌瘤及腺樣囊性癌瘤；咽癌，諸如(但不限於)鱗狀細胞癌及疣狀；皮膚癌，諸如(但不限於)基底細胞癌、鱗狀細胞癌及黑色素瘤、表面擴散黑素瘤、結節狀黑素瘤、雀斑惡性黑素瘤、肢端雀斑黑素瘤；腎臟癌，諸如(但不限於)腎細胞癌、腺癌、腎上腺樣瘤、纖維肉瘤、移行細胞癌(腎盂及/或尿道)；腎臟癌瘤；威爾姆斯腫瘤(Wilms' tumor)；膀胱癌，諸如(但不限於)移行細胞癌、鱗狀細胞癌、腺癌、癌肉瘤。另外，癌症包括黏液肉瘤、骨原性肉瘤、內皮肉瘤、淋巴內皮肉瘤、間皮瘤、滑膜瘤、血管母細胞瘤、上皮癌、囊腺癌、支氣管癌、汗腺癌瘤、皮脂腺癌瘤、乳頭狀癌及乳頭狀腺癌。

癌症包括(但不限於)B細胞癌症，例如多發性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症；重鏈疾病，諸如α鏈疾病、γ鏈疾病及μ鏈疾病；良性單株球蛋白症；及免疫細胞澱粉樣變性病、黑色素瘤、乳癌、肺癌、支氣管癌、結腸直腸癌、前列腺癌(例如轉移性、激素頑固性前列腺癌)、胰臟癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、大腦或中樞神經系統癌症、周邊神經系統癌症、食道癌、子宮頸癌、子宮或子宮內膜癌、口腔癌或咽癌、肝癌、腎癌、睪丸癌、膽道癌、小腸癌或闌尾癌、唾液腺癌、甲狀腺癌、腎上腺癌、骨肉瘤、軟骨肉瘤、血液組織癌症及其類似者。適用於本發明所涵蓋之方法之癌症類型之其他非限制性實例包括人類肉瘤及癌瘤，例如纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤文氏腫瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、結腸直腸癌、胰臟癌、乳癌、卵巢癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌瘤、皮脂腺癌瘤、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓性癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌瘤、肝癌、絨膜癌、精細胞癌、胚胎性瘤、威爾姆斯氏腫瘤、子宮頸癌、骨癌、腦瘤、睪丸癌、肺臟、癌瘤、小細胞肺臟癌瘤、膀胱癌、上皮癌、神經膠瘤、星形細胞瘤、神經管胚細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、少突神經膠質瘤、脊膜瘤、黑色素瘤、神經母細胞瘤、視網膜胚細胞瘤；白血病，例如急性淋巴球性白血病及急性骨髓細胞性白血病(骨髓母細胞性、前髓細胞性、骨髓單核細胞性、單核球性及紅白血病)；慢性白血病(慢性骨髓細胞性(顆粒球性)白血病及慢性淋巴球性白血病)；及真性紅細胞增多症、淋巴瘤(霍奇金氏病及非霍奇金氏病)、多發性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症及重鏈疾病。在一些實施例中，表型藉由本發明之方法測定之癌症為上皮癌症，諸如(但不限於)膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、婦科癌、腎癌、喉癌、肺癌、口腔癌、頭頸癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌或皮膚癌。在其他實施例中，癌症為乳癌、前列腺癌、肺癌或結腸癌。在另其他實施例中，上皮癌症為非小細胞肺癌、非乳頭狀腎細胞癌、子宮頸癌、卵巢癌(例如漿液性卵巢癌)或乳癌。上皮癌症之特徵可在於各種其他方法，包括(但不限於)漿液性、子宮內膜樣、黏液性、透明細胞、勃倫那或未分化的。在一些實施例中，本發明用於淋巴瘤或其次型(包括(但不限於)套細胞淋巴瘤)之治療、診斷及/或預後。淋巴組織增殖病症亦視為增殖性疾病。

在一些實施例中，本文所描述之藥劑與至少一種額外治療劑之組合產生加成或協同結果。在一些實施例中，組合療法使得藥劑之治療指數提高。在一些實施例中，組合療法使得額外治療劑之治療指數提高。在一些實施例中，組合療法使得藥劑之毒性及/或副作用降低。在一些實施例中，組合療法使得額外治療劑之毒性及/或副作用降低。

在某些實施例中，除了投與本文所描述之新抗原治療劑之外，方法或治療進一步包含投與至少一種額外治療劑。額外治療劑可在投與藥劑之前、同時及/或之後投與。在一些實施例中，至少一種額外治療劑包含1種、2種、3種或多於3種額外治療劑。

可與本文所描述之新抗原治療劑組合投與之治療劑包括化學治療劑。因此，在一些實施例中，方法或治療涉及投與本文所描述之藥劑以及化學治療劑或以及化學治療劑之混合液。藥劑治療可在投與化學療法之前、同時或之後進行。組合投與可包括以單一醫藥調配物或使用分開的調配物共投與，或以任一順序但通常在一段時間內連續投與以使得所有活性劑可同步發揮其生物活性。此類治療劑之製劑及給藥時程可根據製造商說明書使用或由熟習此項技術者根據經驗來確定。此類化學療法之製劑及給藥時程亦描述於The Chemotherapy Source Book,第4版, 2008, M. C. Perry, Editor, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA中。

適用類別之化學治療劑包括例如抗微管蛋白劑、奧瑞他汀(auristatins)、DNA小溝結合劑、DNA複製抑制劑、烷基化劑(例如鉑複合物，諸如順鉑、單(鉑)、雙(鉑)及三-核鉑複合物及卡鉑)、蒽環黴素、抗生素、抗葉酸劑、抗代謝物、化學治療增感劑、倍癌黴素、依讬泊苷(etoposide)、氟化嘧啶、離子載體、萊克希托普森(lexitropsin)、亞硝基脲、順氯氨鉑(platinol)、嘌呤抗代謝物、嘌呤黴素(puromycin)、輻射增感劑、類固醇、紫杉烷、拓樸異構酶抑制劑、長春花生物鹼或其類似物。在某些實施例中，第二治療劑為烷化劑、抗代謝物、抗有絲分裂劑、拓樸異構酶抑制劑或血管生成抑制劑。

適用於本發明中之化學治療劑包括(但不限於)烷基化劑，諸如噻替派(thiotepa)及環磷醯胺(CYTOXAN)；磺酸烷基酯，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，諸如苯唑多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)及尤利多巴(uredopa)；伸乙亞胺及甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺、曲他胺、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫代磷醯胺及三羥甲基三聚氰胺；氮芥，諸如氯芥苯丁酸、萘氮芥、氯磷醯胺、雌莫司汀(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、氮芥氧化物鹽酸鹽、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、潑尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶芥(uracil mustard)；亞硝基脲，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，諸如阿克拉黴素(aclacinomysins)、放射菌素(actinomycin)、安麯黴素(authramycin)、偶氮絲胺酸(azaserine)、博來黴素(bleomycins)、放線菌素C (cactinomycin)、卡奇黴素(calicheamicin)、卡拉比辛(carabicin)、洋紅黴素(caminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycins)、放線菌素D (dactinomycin)、道諾黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-側氧基-L-正白胺酸、小紅莓(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、艾達黴素(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycins)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycins)、培洛黴素(peplomycin)、潑非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、奎那黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈脲菌素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、左柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如甲胺喋呤及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如迪諾特寧(denopterin)、甲胺喋呤(methotrexate)、蝶羅呤(pteropterin)、曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-氮雜尿苷、卡莫氟(carmofur)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside)、二去氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5-FU；雄激素，諸如卡魯睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾內酯(testolactone)；抗腎上腺，諸如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如醛葉酸；乙醯葡醛酯；醛磷醯胺糖苷；胺基乙醯丙酸；安吖啶(amsacrine)；貝斯布西(bestrabucil)；比山群(bisantrene)；艾達曲克(edatraxate)；得弗伐胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾福米辛(elformithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多醣(lentinan)；氯尼達明(lonidamine)；丙脒腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidamol)；尼曲吖啶(nitracrine)；噴司他丁(pentostatin)；苯來美特(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基醯肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK；雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofuran)；螺旋鍺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2''-三氯三乙胺；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿拉伯糖苷(Ara-C)；類紫杉醇(taxoids)，例如太平洋紫杉醇(paclitaxel) (TAXOL)及多烯紫杉醇(docetaxel) (TAXOTERE))；氯芥苯丁酸；吉西他濱(gemcitabine)；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；鉑類似物，諸如順鉑及卡鉑；長春鹼(vinblastine)；鉑；依託泊苷(VP-16)；異環磷醯胺(ifosfamide)；絲裂黴素C；米托蒽醌(mitoxantrone)；長春新鹼(vincristine)；長春瑞濱(vinorelbine)；溫諾平(navelbine)；諾安托(novantrone)；替尼泊甙(teniposide)；柔紅黴素(daunomycin)；胺基喋呤(aminopterin)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；CPT11；拓樸異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；視黃酸；埃斯波黴素(esperamicins)；卡培他濱(capecitabine) (XELODA)；及以上各者中的任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。化學治療劑亦包括用來調控或抑制激素對腫瘤之作用之抗激素劑，諸如抗雌激素，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷諾昔酚(raloxifene)、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)及托瑞米芬(toremifene)(法樂通(FARESTON))；及抗雄激素，諸如氟他胺(flutamide)、尼魯胺(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、亮丙立德(leuprolide)及戈舍瑞林(goserelin)；及以上各者中的任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。在某些實施例中，額外治療劑為順鉑。在某些實施例中，額外治療劑為卡鉑。

在某些實施例中，化學治療劑為拓樸異構酶抑制劑。拓樸異構酶抑制劑為干擾拓樸異構酶(例如拓樸異構酶I或II)之作用之化學療法劑。拓樸異構酶抑制劑包括(但不限於)小紅莓HCl、檸檬酸道諾黴素、米托蒽醌HCl、放線菌素D、依託泊苷、拓朴替康HCl、替尼泊甙(VM-26)及伊立替康(irinotecan)以及此等中之任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。在一些實施例中，額外治療劑為伊立替康。

在某些實施例中，化學治療劑為抗代謝物。抗代謝物為具有與常用生物化學反應所需之代謝物類似的結構，但不同足以干擾細胞之一或多種常用功能，諸如細胞分裂之化學物質。抗代謝物包括(但不限於)吉西他濱、氟尿嘧啶、卡培他濱、甲胺喋呤鈉、雷替曲塞(ralitrexed)、培美曲唑(pemetrexed)、喃氟啶(tegafur)、胞嘧啶阿拉伯糖苷、硫鳥嘌呤、5-氮雜胞苷、6巰基嘌呤、硫唑嘌呤、6-硫鳥嘌呤、噴司他丁、磷酸氟達拉濱及克拉屈濱(cladribine)以及此等中之任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。在某些實施例中，額外治療劑為吉西他濱。

在某些實施例中，化學治療劑為抗有絲分裂劑，包括(但不限於)結合微管蛋白之試劑。在一些實施例中，藥劑為紫杉烷。在某些實施例中，藥劑為太平洋紫杉醇或多烯紫杉醇或太平洋紫杉醇或多烯紫杉醇之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。在某些實施例中，藥劑為太平洋紫杉醇(TAXOL)、多烯紫杉醇(TAXOTERE)、白蛋白結合太平洋紫杉醇(ABRAXANE)、DHA-太平洋紫杉醇或PG-太平洋紫杉醇。在某些替代實施例中，抗有絲分裂劑包含長春花生物鹼，諸如長春新鹼、長春鹼、長春瑞濱或長春地辛或其醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。在一些實施例中，抗有絲分裂劑為驅動蛋白Eg5之抑制劑或有絲分裂激酶之抑制劑，諸如奧洛拉(Aurora) A或Plk1。在某些實施例中，額外治療劑為太平洋紫杉醇。在一些實施例中，額外治療劑為白蛋白結合太平洋紫杉醇。

在一些實施例中，額外治療劑包含藥劑，諸如小分子。舉例而言，治療可涉及本發明之藥劑與充當針對腫瘤相關抗原之抑制劑之小分子之組合投與，該小分子包括(但不限於)EGFR、HER2 (ErbB2)及/或VEGF。在一些實施例中，本發明之藥劑與選自由以下組成之群的蛋白激酶抑制劑組合投與：吉非替尼(gefitinib) (IRESSA)、埃羅替尼(erlotinib) (TARCEVA)、舒尼替尼(sunitinib) (SUTENT)、拉帕替尼(lapatanib)、凡德他尼(vandetanib) (ZACTIMA)、AEE788、CI-1033、西地尼布(cediranib) (RECENTIN)、索拉非尼(sorafenib) (NEXAVAR)及帕唑帕尼(pazopanib) (GW786034B)。在一些實施例中，額外治療劑包含mTOR抑制劑。在另一實施例中，額外治療劑為減少Treg細胞之數目之化學療法或其他抑制劑。在某些實施例中，治療劑為環磷醯胺或抗CTLA4抗體。在另一實施例中，額外治療劑減少骨髓衍生之抑制細胞之存在。在另一實施例中，額外治療劑為卡鉑紫杉酚(carbotaxol)。在另一實施例中，額外治療劑將細胞移向T輔助1反應。在另一實施例中，額外治療劑為依魯替尼。

在一些實施例中，額外治療劑包含生物學分子，諸如抗體。舉例而言，治療可涉及本發明之藥劑與針對腫瘤相關抗原之抗體之組合投與，包括(但不限於)結合EGFR、HER2/ErbB2及/或VEGF之抗體。在某些實施例中，額外治療劑為對癌症幹細胞標記物具有特異性的抗體。在某些實施例中，額外治療劑為血管生成抑制劑之抗體(例如抗VEGF或VEGF受體抗體)。在某些實施例中，額外治療劑為貝伐單抗(bevacizumab) (AVASTIN)、雷莫蘆單抗(ramucirumab)、曲妥珠單抗(trastuzumab) (HERCEPTIN)、帕妥珠單抗(pertuzumab) (OMNITARG)、帕尼單抗(panitumumab) (VECTIBIX)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、紮魯姆單抗(zalutumumab)或西妥昔單抗(cetuximab) (ERBITUX)。

本文所提供之試劑及組合物可單獨或與習知治療方案組合使用，該等方案諸如手術、照射、化學療法及/或骨髓移植(自體、同基因型、同種異體或不相關)。一組腫瘤抗原可例如適用於大部分癌症患者。

在一些實施例中，除了包含免疫原性疫苗之組合物之外，可投與至少一或多種化學治療劑。在一些實施例中，一或多種化學治療劑可屬於不同類別之化學治療劑。

化學療法劑之實例包括(但不限於)烷基化劑，諸如氮芥(nitrogen mustard)(例如氮芥(mechlorethamine)(氮芥(nitrogen mustard))、氯芥苯丁酸、環磷醯胺(Cytoxan®)、異環磷醯胺及美法侖)；亞硝基脲(例如N-亞硝基-N-甲基脲、鏈脲菌素、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀及司莫司汀)；磺酸烷基酯(例如白消安)；四嗪(例如達卡巴嗪(DTIC)、米托唑胺(mitozolomide)及替莫唑胺(temozolomide) (Temodar®))；氮丙啶(例如噻替派、絲裂黴素及地吖醌)；及鉑藥物(例如順鉑、卡鉑及奧賽力鉑)；非經典烷基化劑，諸如丙卡巴肼及六甲蜜胺(六甲三聚氰胺)；抗代謝劑，諸如5-氟尿嘧啶(5-FU)、6-巰基嘌呤(6-MP)、卡培他濱(Xeloda®)、克拉屈濱、氯法拉濱、阿糖胞苷(Ara-C®)、地西他濱(decitabine)、氟尿苷、氟達拉濱(fludarabine)、奈拉濱(nelarabine)、吉西他濱(Gemzar®)、羥基脲、甲胺喋呤、培美曲唑(Alimta®)、噴司他丁、硫鳥嘌呤、維達紮(Vidaza)；抗微管劑，諸如長春花生物鹼(例如長春新鹼、長春鹼、長春瑞濱、長春地辛及長春氟寧)；紫杉烷(例如太平洋紫杉醇(Taxol®)、多烯紫杉醇(Taxotere®))；鬼臼毒素(podophyllotoxin) (例如依託泊苷及替尼泊甙)；埃博黴素(epothilones) (例如伊沙匹隆(ixabepilone) (Ixempra®))；雌莫司汀(Emcyt®)；抗腫瘤抗生素，諸如蒽環黴素(例如道諾黴素、小紅莓(Adriamycin®、表柔比星、艾達黴素)；放射菌素-D；及博萊黴素(bleomycin)；拓樸異構酶I抑制劑，諸如拓朴替康及伊立替康(CPT-11)；拓樸異構酶II抑制劑，諸如依託泊苷(VP-16)、替尼泊甙、米托蒽醌、新生黴素、麥爾巴隆(merbarone)及阿克拉黴素(aclarubicin)；皮質類固醇，諸如潑尼松(prednisone)、甲基潑尼龍(Solumedrol®)及地塞米松(dexamethasone) (Decadron®)；L-天冬醯胺酶；硼替佐米(bortezomib) (Velcade®)；免疫治療劑，諸如利妥昔單抗(rituximab) (Rituxan®)、阿侖妥珠單抗(alemtuzumab) (Campath®)、沙立度胺(thalidomide)、來那度胺(lenalidomide) (Revlimid®)、BCG、介白素-2、干擾素-α；及癌症疫苗，諸如Provenge®；激素治療劑，諸如氟維司群(fulvestrant) (Faslodex®)、他莫昔芬、托瑞米芬(Fareston®)、阿那曲唑(anastrozole) (Arimidex®)、依西美坦(exemestan) (Aromasin®)、來曲唑(letrozole) (Femara®)、乙酸甲地孕酮(Megace®)、雌激素、比卡魯胺(bicalutamide) (Casodex®)、氟他胺(flutamide) (Eulexin®)、尼魯胺(nilutamide) (Nilandron®)、亮丙立德(Lupron®)及戈舍瑞林(Zoladex®)；分化劑，諸如類視黃素、維甲酸(ATRA或Atralin®)、貝瑟羅汀(bexarotene) (Targretin®)及三氧化二砷(Arsenox®)；及目標治療劑，諸如伊馬替尼(imatinib) (Gleevec®)、吉非替尼(Iressa®)及舒尼替尼(Sutent®)。在一些實施例中，化學療法為混合液療法。混合液療法之實例包括(但不限於)CHOP/R-CHOP (美羅華(rituxan)、環磷醯胺、羥基小紅莓、長春新鹼及潑尼松)、EPOCH (依託泊苷、潑尼松、長春新鹼、環磷醯胺、羥基小紅莓)、Hyper-CVAD (環磷醯胺、長春新鹼、羥基小紅莓、地塞米松)、FOLFOX (氟尿嘧啶(5-FU)、甲醯四氫葉酸、奧賽力鉑)、ICE (異環磷醯胺、卡鉑、依託泊苷)、DHAP (高劑量阿糖胞苷[ara-C]、地塞米松、順鉑)、ESHAP (依託泊苷、甲基潑尼龍、阿糖胞苷[ara-C]、順鉑)及CMF (環磷醯胺、甲胺喋呤、氟尿嘧啶)。

在某些實施例中，額外治療劑包含第二免疫治療劑。在一些實施例中，額外免疫治療劑包括(但不限於)群落刺激因子、介白素、阻斷免疫抑制功能之抗體(例如抗CTLA-4抗體、抗CD28抗體、抗CD3抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗TIGIT抗體)、增強免疫細胞功能之抗體(例如抗GITR抗體、抗OX-40抗體、抗CD40抗體或抗4-1BB抗體)、鐸樣受體(例如TLR4、TLR7、TLR9)、可溶性配位體(例如GITRL、GITRL-Fc、OX-40L、OX-40L-Fc、CD40L、CD40L-Fc、4-1BB配位體或4-1BB配位體-Fc)或B7家族成員(例如CD80、CD86)。在一些實施例中，額外免疫治療劑靶向CTLA-4、CD28、CD3、PD-1、PD-L1、TIGIT、GITR、OX-40、CD-40或4-1BB。

在一些實施例中，額外治療劑為免疫檢查點抑制劑。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑為抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗CTLA-4抗體、抗CD28抗體、抗TIGIT抗體、抗LAG3抗體、抗TIM3抗體、抗GITR抗體、抗4-1BB抗體或抗OX-40抗體。在一些實施例中，額外治療劑為抗TIGIT抗體。在一些實施例中，額外治療劑為選自由以下組成之群的抗PD-1抗體：納武單抗(OPDIVO)、帕博利珠單抗(KEYTRUDA)、皮立珠單抗、MEDI0680、REGN2810、BGB-A317及PDR001。在一些實施例中，額外治療劑為選自由以下組成之群的抗PD-L1抗體：BMS935559 (MDX-1105)、阿特力單抗(atexolizumab) (MPDL3280A)、德瓦魯單抗(durvalumab) (MEDI4736)及阿維魯單抗(avelumab) (MSB0010718C)。在一些實施例中，額外治療劑為選自由以下組成之群的抗CTLA-4抗體：伊派利單抗(ipilimumab) (YERVOY)及曲美單抗(tremelimumab)。在一些實施例中，額外治療劑為選自由以下組成之群的抗LAG-3抗體：BMS-986016及LAG525。在一些實施例中，額外治療劑為選自由以下組成之群的抗OX-40抗體：MEDI6469、MEDI0562及MOXR0916。在一些實施例中，額外治療劑為選自由以下組成之群的抗4-1BB抗體：PF-05082566。

在一些實施例中，新抗原治療劑可與選自由以下組成之群的生物分子組合投與：腎上腺髓素(AM)、血管生成素(Ang)、BMP、BDNF、EGF、紅血球生成素(EPO)、FGF、GDNF、粒細胞群落刺激因子(G-CSF)、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)、幹細胞因子(SCF)、GDF9、HGF、HDGF、IGF、遷移刺激因子、肌肉抑制素(GDF-8)、NGF、神經營養素、PDGF、血小板生成素、TGF-α、TGF-β、TNF-α、VEGF、PlGF、γ-IFN、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15及IL-18。

在一些實施例中，本文所描述之新抗原治療劑之治療可附有手術移除腫瘤、移除癌細胞或治療醫師認為必需的任何其他手術療法。

在某些實施例中，治療涉及投與本文所描述之新抗原治療劑以及輻射療法。藥劑治療可在投與輻射療法之前、同時或之後進行。此類輻射療法之給藥時程可藉由熟練的行醫者測定。

組合投與可包括以單一醫藥調配物或使用分開的調配物共投與，或以任一順序但通常在一段時間內連續投與以使得所有活性劑可同步發揮其生物活性。

應瞭解，本文所描述之新抗原治療劑與至少一種額外治療劑之組合可以任何順序投與或同時投與。在一些實施例中，將向此前經受第二治療劑治療之患者投與藥劑。在某些其他實施例中，新抗原治療劑及第二治療劑將實質上同時或並行投與。舉例而言，個體可給予藥劑，同時經受第二治療劑(例如化學療法)治療療程。在某些實施例中，將在第二治療劑治療1年內投與新抗原治療劑。將進一步瞭解，可在約數小時或分鐘(亦即，實質上同時)內向個體投與兩種(或多於兩種)試劑或治療。

為了治療疾病，適當劑量之本文所描述之新抗原治療劑視待治療之疾病類型、疾病之嚴重程度及病程、疾病反應性、是否出於治療或預防目的投與藥劑、先前療法、患者之臨床病史等而定，全部由治療醫師酌情處理。新抗原治療劑可一次性投與或在持續數日至數月的一系列治療期間投與，或直至實現治癒或達成疾病病況之減弱(例如腫瘤尺寸減小)。最佳給藥時程可由患者體內藥物積聚之量測結果來計算且將視個別藥劑之相關效能而變化。投與醫師可決定最優劑量、給藥方法及重複率。

在一些實施例中，新抗原治療劑可以初始較高「加載」劑量，繼而一或多種較低劑量投與。在一些實施例中，亦可改變投與頻率。在一些實施例中，給藥方案可包含一週一次、每兩週一次、每三週一次或每月一次投與初始劑量，繼而額外劑量(或「維持」劑量)。舉例而言，給藥方案可包含投與初始起始劑量，繼而例如二分之一初始劑量之每週維持劑量。或給藥方案可包含投與初始起始劑量，繼而例如每隔一週二分之一初始劑量之維持劑量。或給藥方案可包含投與三個初始劑量持續3週，繼而例如每隔一週相同量之維持劑量。

如熟習此項技術者已知，投與任何治療劑會引起副作用及/或毒性。在一些情況下，副作用及/或毒性如此嚴重以至於妨礙以治療學上有效劑量投與特定藥劑。在一些情況下，療法必須中斷，且可嘗試其他試劑。然而，相同治療劑種類中之多種試劑呈現類似副作用及/或毒性，意謂患者必須中止療法，或若可能，則遭受與治療劑相關之不適副作用。

在一些實施例中，給藥時程可限於投與或「循環」之特定數目。在一些實施例中，投與藥劑3、4、5、6、7、8或多於8次循環。舉例而言，每2週投與藥劑持續6次循環，每3週投與藥劑持續6次循環，每2週投與藥劑持續4次循環，每3週投與藥劑持續4次循環等。給藥時程可由熟習此項技術者決定且隨後進行修改。

本發明提供向個體投與本文所描述之新抗原治療劑之方法，其包含使用間歇性給藥策略以用於投與一或多種試劑，其可減少與投與藥劑、化學治療劑等相關之副作用及/或毒性。在一些實施例中，一種用於治療人類個體之癌症之方法包含投與向該個體治療學上有效劑量之新抗原治療劑以及治療學上有效劑量之化學治療劑，其中藥劑中之一者或兩者根據間歇性給藥策略投與。在一些實施例中，一種用於治療人類個體之癌症之方法包含向該個體投與治療學上有效劑量之新抗原治療劑以及治療學上有效劑量之第二免疫治療劑，其中藥劑中之一者或兩者根據間歇性給藥策略投與。在一些實施例中，間歇性給藥策略包含向個體投與初始劑量之新抗原治療劑及約每2週一次投與後續劑量之藥劑。在一些實施例中，間歇性給藥策略包含向個體投與初始劑量之新抗原治療劑及約每3週一次投與後續劑量之藥劑。在一些實施例中，間歇性給藥策略包含向個體投與初始劑量之新抗原治療劑及約每4週一次投與後續劑量之藥劑。在一些實施例中，使用間歇性給藥策略投與藥劑且每週投與額外治療劑。

本發明提供包含本文所描述之新抗原治療劑之組合物。本發明亦提供包含本文所描述之新抗原治療劑及醫藥學上可接受之媒劑的醫藥組合物。在一些實施例中，醫藥組合物可用於免疫療法中。在一些實施例中，組合物可用於抑制腫瘤生長。在一些實施例中，醫藥組合物可用於抑制個體(例如人類患者)之腫瘤生長。在一些實施例中，組合物可用於治療癌症。在一些實施例中，醫藥組合物可用於治療個體(例如人類患者)之癌症。

藉由將本發明之新抗原治療劑與醫藥學上可接受之媒劑(例如載劑或賦形劑)組合來製備調配物用於儲存及使用。熟習此項技術者一般將醫藥學上可接受之載劑、賦形劑及/或穩定劑考慮為調配物或醫藥組合物之非活性成分。例示性調配物在WO 2015/095811中列出。

適合的醫藥學上可接受之媒劑包括(但不限於)無毒性緩衝劑，諸如磷酸、檸檬酸及其他有機酸；鹽，諸如氯化鈉；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑，諸如十八烷基二甲基苯甲基氯化銨、氯化六羥季銨、苯紮氯銨、苄索氯銨、苯酚、丁醇或苯甲醇、對羥苯甲酸烷酯(諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯)、兒茶酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇及間甲酚；低分子量多肽(例如小於約10個胺基酸殘基)；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、谷醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；碳水化合物，諸如單醣、雙醣、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，諸如鈉；金屬複合物，諸如Zn-蛋白質複合物；及非離子界面活性劑，諸如TWEEN或聚乙二醇(PEG)。(Remington: The Science and Practice of Pharmacy,第22版, 2012, 英國醫藥出版社(Pharmaceutical Press), 倫敦)。在一些實施例中，媒劑為5%右旋糖水溶液。

本文所描述之醫藥組合物可以任何數目用於局部或全身治療方法投與。投與可為局部的，藉由表皮或經皮貼片、軟膏、洗劑、乳霜、凝膠、液滴、栓劑、噴霧、液體及粉劑；經肺的，藉由吸入或吹入粉劑或氣霧劑，包括藉由噴霧器；氣管內及鼻內；經口；或非經腸，包括靜脈內、動脈內、腫瘤內、皮下、腹膜內、肌肉內(例如注射或輸注)或顱內(例如鞘內或心室內)。

治療調配物可呈單位劑型。此類調配物包括錠劑、丸劑、膠囊、粉劑、粒劑、溶液或於水中之懸浮液或非水性培養基或栓劑。

本文所描述之新抗原肽亦可包埋在微膠囊中。此類微膠囊例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合製備，例如分別在膠體藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)或巨乳液中之羥基甲基纖維素或明膠微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊，如Remington: The Science and Practice of Pharmacy,第22版, 2012, 英國醫藥出版社,倫敦中所描述。

在某些實施例中，醫藥調配物包括與脂質體複合之本文所描述之新抗原治療劑。用於產生脂質體之方法為熟習此項技術者已知。舉例而言，某些脂質體可藉由反相蒸發，用包含膽鹼磷脂、膽固醇及PEG衍生之磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)之脂質組合物產生。脂質體經具有界定孔徑之過濾器擠出以產生具有所要直徑之脂質體。

在某些實施例中，可產生包含本文所描述之新抗原肽之持續釋放製劑。持續釋放製劑之適合實例包括含有固體疏水性聚合物之藥劑的半可滲透基質，其中基質呈成形物品(例如膜或微膠囊)形式。持續釋放基質之實例包括聚酯；水凝膠，諸如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇)；聚乳酸交酯；L-麩胺酸及7-L-麩胺酸乙酯之共聚物；非可分解乙烯-乙酸乙烯酯；可分解乳酸-乙醇酸共聚物，諸如LUPRON DEPOT™ (由乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙立德構成之可注射微球體)；蔗糖乙酸酯異丁酸鹽；及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。

本發明提供包含免疫原性疫苗之治療方法。提供疾病(諸如癌症或病毒感染)治療方法。一種方法可包含向個體投與有效量之包含免疫原性抗原之組合物。在一些實施例中，抗原包含病毒抗原。在一些實施例中，抗原包含腫瘤抗原。

可製備之疫苗之非限制性實例包括基於肽之疫苗、基於核酸之疫苗、基於抗體之疫苗、基於T細胞之疫苗及基於抗原呈現細胞之疫苗。

可使用一或多種生理學上可接受之載劑，包括促進將活性劑加工成可在醫藥學上使用之製劑的賦形劑及助劑來調配疫苗組合物。恰當調配物可視所選投與途徑而定。適當時且如此項技術中所理解可使用熟知技術、載劑及賦形劑中之任一者。

在一些情況下，將疫苗組合物調配為基於肽之疫苗、基於核酸之疫苗、基於抗體之疫苗或基於細胞之疫苗。舉例而言，疫苗組合物可包括陽離子脂質調配物中之裸cDNA；脂肽(例如Vitiello, A.等人, J. Clin. Invest. 95:341, 1995)；例如囊封於聚(DL-丙交酯-共-乙交酯) (「PLG」)微球體中之中裸cDNA或肽(參見例如Eldridge,等人, Molec. Immunol. 28:287-294, 1991: Alonso等人, Vaccine 12:299-306, 1994；Jones等人, Vaccine 13:675-681, 1995)；免疫刺激複合物(ISCOMS)中所含有之肽組合物(例如Takahashi等人, Nature 344:873-875, 1990；Hu等人, Clin. Exp. Immunol. 113:235-243, 1998)；或多個抗原肽系統(MAP) (參見例如Tam, J. P., Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 85:5409-5413, 1988; Tarn, J.P., J. Immunol. Methods 196:17-32, 1996)。有時，將疫苗調配為基於肽之疫苗或基於核酸之疫苗，其中核酸編碼多肽。有時，將疫苗調配為基於抗體之疫苗。有時，將疫苗調配為基於細胞之疫苗。

可使用鑑別到之疾病特異性免疫原性新抗原肽之胺基酸序列產生醫藥學上可接受之組合物。抗原來源可為但不限於天然或合成蛋白質，包括醣蛋白、肽及超抗原；抗體/抗原複合物；脂蛋白；RNA或其轉譯產物；及DNA或由DNA編碼之多肽。抗原來源亦可包含未轉型、經轉型、經轉染或經轉導之細胞或細胞株。可使用可用於表現重組抗原之一般熟習此項技術者已知的多種表現或逆轉錄病毒載體中之任一者轉型、轉染或轉導細胞。亦可在已經含有編碼重組抗原之DNA分子之表現或逆轉錄病毒載體轉型、轉染或轉導的任何適當的宿主細胞中實現表現。可使用此項技術中彼等者已知的任何數目之轉染、轉化及轉導方案。重組牛痘載體及感染有牛痘載體之細胞可用作抗原來源。

組合物可包含合成疾病特異性免疫原性新抗原肽。組合物可包含兩種或多於兩種疾病特異性免疫原性新抗原肽。組合物可包含疾病特異性免疫原性肽之前驅體(諸如蛋白質、肽、DNA及RNA)。可產生疾病特異性免疫原性肽之前驅體且針對鑑別出之疾病特異性免疫原性新抗原肽產生。在一些實施例中，治療性組合物包含免疫原性肽之前驅體。疾病特異性免疫原性肽之前驅體可為前藥。在一些實施例中，包含疾病特異性免疫原性新抗原肽之組合物可進一步包含佐劑。舉例而言，新抗原肽可用作疫苗。在一些實施例中，免疫原性疫苗可包含醫藥學上可接受之免疫原性新抗原肽。在一些實施例中，免疫原性疫苗可包含免疫原性新抗原肽之醫藥學上可接受之前驅體(諸如蛋白質、肽、DNA及RNA)。在一些實施例中，治療方法包含向個體投與有效量之特異性識別免疫原性新抗原肽之抗體。在一些實施例中，治療方法包含向個體投與有效量之特異性識別免疫原性新抗原肽之可溶性TCR或TCR類似物。

本文所描述之方法尤其適用於個體化用藥情境，其中免疫原性新抗原肽用於針對相同個體研發治療劑(諸如疫苗或治療抗體)。因此，治療個體之疾病之方法可包含根據本文所描述之方法鑑別個體之免疫原性新抗原肽；及合成肽(或其前驅體)；及向個體投與肽或特異性識別肽之抗體。在一些實施例中，免疫原性新抗原之表現模式可充當用於產生患者特異性疫苗之必需基礎。在一些實施例中，免疫原性新抗原之表現模式可充當用於產生患有特定疾病之患者群組之疫苗之必需基礎。因此，可在患者群組中選擇性地治療特定疾病，例如特定類型腫瘤。

在一些實施例中，本文所描述之肽為可藉由較大患者群組中之自體抗疾病T細胞識別之結構上常用的抗原。在一些實施例中，測定患病個體群組之抗原表現模式，個體疾病在結構上表現常用新抗原。

在一些實施例中，本文所描述之肽包含：包含蛋白質之第一新抗原決定基之第一肽及包含相同蛋白質之第二新抗原決定基之第二肽，其中第一肽與第二肽不同，且其中第一新抗原決定基包含突變且第二新抗原決定基包含相同突變。在一些實施例中，本文所描述之肽包含：包含蛋白質之第一區域之第一新抗原決定基的第一肽及包含相同蛋白質之第二區域之第二新抗原決定基的第二肽，其中第一區域包含第二區域之至少一個胺基酸，其中第一肽與第二肽不同，且其中第一新抗原決定基包含第一突變且第二新抗原決定基包含第二突變。在一些實施例中，第一突變及第二突變相同。在一些實施例中，突變選自由以下組成之群：點突變、剪接位點突變、讀框轉移突變、通讀突變、基因融合突變及其任何組合。

存在多種產生免疫原性新抗原之方法。蛋白質或肽可藉由熟習此項技術者已知的任何技術製得，包括經由標準分子生物技術表現蛋白質、多肽或肽；自天然來源中分離蛋白質或肽；活體外轉譯；或化學合成蛋白質或肽。一般而言，此類疾病特異性新抗原可在活體外或活體內產生。免疫原性新抗原可在活體外作為肽或多肽產生，其可隨後調配成個體化疫苗或免疫原性組合物且向個體投與。免疫原性新抗原之活體外產生可包含肽合成或自多種細菌、真核或病毒重組表現系統中之任一者中之DNA或RNA分子表現肽/多肽，繼而純化表現之肽/多肽。替代地，免疫原性新抗原可藉由引入將免疫原性新抗原編碼至個體中之分子(例如DNA、RNA及病毒表現系統)活體內產生，之後表現經編碼之免疫原性新抗原。在一些實施例中，編碼免疫原性新抗原肽之聚核苷酸可用於活體外產生新抗原肽。

在一些實施例中，聚核苷酸包含與編碼免疫原性新抗原之聚核苷酸具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的序列。

聚核苷酸可為例如DNA、cDNA、PNA、CNA、RNA、單股及/或雙股、聚核苷酸之天然或穩定形式或其組合。編碼免疫原性新抗原肽之核酸可含有或可不含有內含子，只要其編碼肽即可。在一些實施例中，使用活體外轉譯來產生肽。

亦涵蓋包含編碼新抗原之序列之表現載體以及含有表現載體之宿主細胞。適用於本發明中之表現載體可包含操作地連接至核酸序列之至少一種表現控制元件。將表現控制元件插入於載體中以控制及調節核酸序列之表現。表現控制元件之實例為此項技術中眾所周知的且包括例如lac系統、噬菌體λ之操縱子及啟動子區域、酵母啟動子及來源於多瘤病毒、腺病毒、逆轉錄病毒或SV40之啟動子。額外操作元件包括(但不限於)前導序列、終止密碼子、聚腺苷酸化信號及宿主系統中之核酸序列之適當的轉錄及後續轉譯所需或較佳的任何其他序列。熟習此項技術者應理解，表現控制元件之正確組合將視所選宿主系統而定。將進一步理解，表現載體應含有用於轉移及後續複製含有宿主系統中之核酸序列之表現載體所需的額外元件。此類元件之實例包括(但不限於)複製及可選擇標記物之來源。

新抗原肽可以編碼所需新抗原肽的RNA或cDNA分子形式提供。本發明之一或多種新抗原肽可由單一表現載體編碼。一般而言，將DNA以適當取向插入表現載體，諸如質體中，且必要時校正閱讀框架用於表現，DNA可連接至所需宿主(例如細菌)識別之適當的轉錄及轉譯調節控制核苷酸序列，但此類控制一般可用於表現載體中。隨後使用標準技術將載體引入用於選殖之宿主細菌中。適用於真核宿主、尤其哺乳動物或人類的表現載體包括例如包含來自SV40、牛科動物乳頭狀瘤病毒、腺病毒及細胞巨大病毒之表現控制序列的載體。適用於細菌宿主之表現載體包括已知細菌質體，諸如來自大腸桿菌之質體，包括pCR 1、pBR322、pMB9及其衍生物；較寬宿主範圍質體，諸如M13及絲狀單股DNA噬菌體。

在實施例中，使用寡核苷酸合成器，可藉由化學合成來構建編碼相關多肽的DNA序列。可基於所需多肽之胺基酸序列且選擇有利於宿主細胞之彼等密碼子設計此類寡核苷酸，其中產生相關重組多肽。標準方法可應用於合成編碼相關分離多肽中分離之聚核苷酸序列。

適用於表現多肽之宿主細胞包括處於適當啟動子控制下的原核生物、酵母、昆蟲或較高等真核細胞。原核生物包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如大腸桿菌或桿菌。較高等真核細胞包括哺乳動物來源的所建立細胞株。亦可採用無細胞轉譯系統。適用於細菌、真菌、酵母及哺乳動物細胞宿主的選殖及表現載體為此項技術中眾所周知的。各種哺乳動物或昆蟲細胞培養系統亦可用於表現重組蛋白質。例示性哺乳動物宿主細胞株包括(但不限於)COS-7、L細胞、C127、3T3、中國倉鼠卵巢(CHO)、293、海拉及BHK細胞株。哺乳動物表現載體可包含非轉錄元件，諸如複製起點、連接至待表現基因之適合啟動子及增強子，及其他5'或3'側接非轉錄序列，及5'或3'未轉譯序列，諸如必需的核糖體結合位點、聚腺苷酸化位點、剪接供體及受體位點及轉錄終止序列。

經轉型之宿主所產生的蛋白質可根據任何適合方法純化。此類標準方法包括層析(例如離子交換、親和性及篩分管柱層析法及其類似層析)、離心、差異溶解性或用於蛋白質純化的任何其他標準技術。可使親和性標籤(諸如六組胺酸(SEQ ID NO: 1356)、麥芽糖結合域、流感外殼序列、麩胱甘肽-S-轉移酶及其類似物)連接至蛋白質，以藉由通過適當親和管柱而容易純化。經分離之蛋白質亦可使用諸如蛋白分解、核磁共振及x射線結晶學之技術進行物理表徵。

疫苗可包含結合本文所描述之多肽序列之實體。實體可為抗體。適當時且如此項技術中所理解，可使用熟知技術、載劑及賦形劑中之任一者調配基於抗體之疫苗。在一些實施例中，本文所描述之肽可用於製得新抗原特異性治療劑，諸如抗體療法。舉例而言，新抗原可用於提高及/或鑑別特異性識別新抗原之抗體。此等抗體可用作治療劑。抗體可為天然抗體、嵌合抗體、人類化抗體或可為抗體片段。抗體可識別本文所描述之多肽中之一或多者。在一些實施例中，抗體可識別具有與本文所描述之多肽具有至多40%、50%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之序列的多肽。在一些實施例中，抗體可識別具有與本文所描述之多肽具有至少40%、50%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列的多肽。在一些實施例中，抗體可識別長度為本文所描述之多肽的至少30%、40%、50%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之多肽序列。在一些實施例中，抗體可識別長度為本文所描述之多肽的至多30%、40%、50%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之多肽序列。

本發明亦涵蓋使用核酸分子作為用於以例如DNA/RNA疫苗形式向有需要之個體活體內遞送新抗原肽/多肽之媒劑。

在一些實施例中，疫苗為核酸疫苗。在一些實施例中，可藉由使用質體向個體投與新抗原。可藉由多種不同方法，例如在黏膜表面上，諸如經鼻及肺臟黏膜注射或氣溶膠滴注裸DNA來將質體引入動物組織中。在一些實施例中，可使用物理遞送，諸如利用「基因槍」。表現載體之準確選擇可視待表現之肽/多肽而定，且完全在一般技術人員之技術範圍內。

在一些實施例中，核酸編碼免疫原性肽或肽前驅體。在一些實施例中，核酸疫苗包含側接編碼免疫原性肽或肽前驅體之序列的序列。在一些實施例中，核酸疫苗包含多於一種免疫原性抗原決定基。在一些實施例中，核酸疫苗為基於DNA之疫苗。在一些實施例中，核酸疫苗為基於RNA之疫苗。在一些實施例中，基於RNA之疫苗包含mRNA。在一些實施例中，基於RNA之疫苗包含裸mRNA。在一些實施例中，基於RNA之疫苗包含經修飾之mRNA(例如使用含有經修飾之5'CAP結構之魚精蛋白.mRNA或含有經修飾之核苷酸之mRNA保護免受降解之mRNA)。在一些實施例中，基於RNA之疫苗包含單股mRNA。

聚核苷酸可為實質上純的或含於適合的載體或遞送系統中。適合的載體及遞送系統包括病毒，諸如基於腺病毒、牛痘病毒、反轉錄病毒、疱疹病毒、腺相關病毒之系統或含有多於一種病毒元件之雜合體。非病毒遞送系統包括陽離子脂質及陽離子聚合物(例如陽離子脂質體)。

一或多種新抗原肽可使用基於病毒之系統活體內編碼及表現。病毒載體可用作本發明中之重組載體，其中病毒基因組之一部分缺失以引入新基因，而不破壞病毒感染力。本發明之病毒載體為非病原病毒。在一些實施例中，病毒載體具有針對哺乳動物中之特異性細胞類型之向性。在另一實施例中，本發明之病毒載體能夠感染專職抗原呈現細胞，諸如樹突狀細胞及巨噬細胞。在本發明之又一實施例中，病毒載體能夠感染哺乳動物中之任何細胞。病毒載體亦可感染腫瘤細胞。本發明中使用之病毒載體包括但不限於痘病毒，諸如牛痘病毒、禽痘病毒、鳥痘病毒及高度減毒牛痘病毒(安卡拉(Ankara)或MVA)、逆轉錄病毒、腺病毒、桿狀病毒及其類似者。

疫苗可經由多種途徑遞送。遞送途徑可包括經口(包括頰內及舌下)、直腸、經鼻、局部、經皮貼片、經肺、經陰道、栓劑或非經腸(包括肌肉內、動脈內、鞘內、皮內、腹膜內、皮下及靜脈內)投與或呈適合於藉由氣溶膠化、吸入或吹入投與之形式。關於藥物遞送系統之總體資訊可見於Ansel等人, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Lippencott Williams & Wilkins, Baltimore Md. (1999)中。本文所描述之疫苗可投與至肌肉，或可經由皮內或皮下注射或經皮，諸如藉由離子導入投與。可採用疫苗之表皮投與。

在一些情況下，亦可調配疫苗用於經由鼻腔通道投與。適合於經鼻投與之調配物(其中載劑為固體)可包括粗散劑，其具有例如約10至約500微米範圍內之粒徑，其以鼻吸方式投與，亦即，通過鼻腔通道自保持在靠近鼻腔之散劑容器中快速吸入。調配物可為鼻用噴霧、鼻滴劑或藉由噴霧器之氣溶膠投與。調配物可包括疫苗之水性或油性溶液。

疫苗可為液體製劑，諸如懸浮液、糖漿或酏劑。疫苗亦可為用於非經腸、皮下、皮內、肌肉內或靜脈內投與(例如可注射投與)之製劑，諸如無菌懸浮液或乳液。

疫苗可包括用於單次免疫之材料，或可包括用於多次免疫之材料(亦即，『多次劑量』套組)。在多次劑量配置中較佳包括防腐劑。作為在多次劑量組合物中包括防腐劑之替代方案(或另外)，組合物可含於具有用於移除材料之無菌轉接器之容器中。

疫苗可以約0.5 mL之劑量體積投與，但可向兒童投與一半劑量(亦即，約0.25 mL)。有時，疫苗可以較高劑量，例如約1 ml投與。

疫苗可以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或多於10種劑量時程方案投與。有時，疫苗以1、2、3或4種劑量時程方案投與。有時，疫苗以1種劑量時程方案投與。有時，疫苗以2種劑量時程方案投與。

第一劑量及第二劑量之投與可間隔約0天、1天、2天、5天、7天、14天、21天、30天、2個月、4個月、6個月、9個月、1年、1.5年、2年、3年、4年或更久。

本文所描述之疫苗可每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年投與或更久。有時，本文所描述之疫苗每2、3、4、5、6、7年投與或更久。有時，本文所描述之疫苗每4、5、6、7年投與或更久。有時，本文所描述之疫苗投與一次。

劑量實例不受限制且僅用於例證投與本文所描述之疫苗之特定給藥方案。用於人類中之有效量可自動物模型測定。舉例而言，可調配人類劑量以實現動物中已發現有效之循環、肝臟、局部及/或胃腸道濃度。基於動物資料及其他類型之類似資料，熟習此項技術者可測定適於人類之疫苗組合物之有效量。

當提及藥劑或藥劑組合時，有效量將一般意謂醫學或醫藥領域的任一不同監管或諮詢組織(例如FDA、AMA)或製造商或供應商建議或批准的劑量範圍、投與模式、調配物等。

在一些態樣中，本文所描述之疫苗及套組可儲存於2℃至8℃下。在一些情況下，疫苗不冷凍儲存。在一些情況下，疫苗儲存於諸如-20℃或-80℃之溫度下。在一些情況下，疫苗避開日光儲存。

在一些態樣中，本文提供一種用於治療或預防個體之癌症之方法，該方法包含(a)向個體投與至少一次劑量之第一免疫原性組合物及(b)向個體依次投與至少一次劑量第二免疫原性組合物。在一些實施例中，第一免疫原性組合物包含：包含蛋白質之第一新抗原決定基之第一肽及視情況包含相同蛋白質之第二新抗原決定基之第二肽，且第二免疫原性組合物包含第二肽及視情況第一肽。

術語「免疫原性組合物」係指本文所揭示之包含新抗原蛋白質之新抗原決定子(例如新抗原決定基)的任何醫藥組合物，其可用於在哺乳動物中誘發免疫反應。免疫反應可包括T細胞反應、B細胞反應或T細胞及B細胞反應兩者。組合物可藉由在細胞表面處呈現與MHC分子結合之新抗原決定基用以使哺乳動物敏感。另外，可產生新抗原特異性T淋巴球或抗體以允許將來保護經免疫之宿主。術語「免疫反應」意謂係指脊椎動物個體之免疫系統對新抗原或新抗原決定子(例如新抗原決定基)之任何反應，包括體液性免疫反應(例如產生抗原特異性抗體)及細胞介導之免疫反應(例如淋巴細胞增殖及/或活化)。

在一些實施例中，第一免疫原性組合物為引發劑量(prime dose或priming dose)且第二免疫原性組合物為增強劑量。「引發劑量」為向個體投與之新抗原肽之新抗原決定子部分(例如新抗原決定基)之第一劑量。投與引發劑量可在後續投與相同物或相同新抗原肽之第二新抗原決定基後誘發與藉由單獨投與引發劑量所獲得之免疫反應相比更高水準的針對新抗原肽之免疫反應。「增強劑量」為向已暴露於相同新抗原肽之新抗原決定子部分(例如新抗原決定基)之個體投與之新抗原肽之新抗原決定子部分(例如新抗原決定基)的第二或第三等劑量。在一些實施例中，第二免疫原性組合物促進或增強由投與第一免疫原性組合物誘導之免疫反應。

在一些實施例中，該方法包含投與至少一次劑量之第一免疫原性組合物。在一些實施例中，在投與第二免疫原性組合物之前投與第一免疫原性組合物。在一些實施例中，在投與第二免疫原性組合物之前至少或約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、33天、34天、35天、36天、37天、38天、39天、40天、41天、42天、43天、44天、45天、46天、47天、48天、49天、50天、51天、52天、53天、54天、55天、56天、57天、58天、59天、60天、70天、80天、90天或100天投與第一免疫原性組合物之劑量。

在一些實施例中，該方法包含在第二免疫原性組合物之前投與多次劑量之第一免疫原性組合物。在一些實施例中，該方法包含在投與第二免疫原性組合物之前投與1次、2次、3次、4次、5次或多於5次劑量之第一免疫原性組合物。多次劑量可稱作包含初始劑量或第一劑量及一或多次後續劑量。在投與時，第一免疫原性組合物之後續劑量在免疫原性組合物之第一劑量之後進行。第一免疫原性組合物之後續劑量可在第一免疫原性組合物之先前劑量(例如第一劑量)之後任何時間間隔投與。舉例而言，在第一免疫原性組合物之先前劑量之前1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、33天、34天、35天、36天、37天、38天、39天、40天、41天、42天、43天、44天、45天、46天、47天、48天、49天、50天、51天、52天、53天、54天、55天、56天、57天、58天、59天、60天、90天或100天投與第一免疫原性組合物之後續劑量。

在一些實施例中，該方法包含在第一免疫原性組合物之後依次投與至少一次劑量之第二免疫原性組合物。在一些實施例中，在投與第一免疫原性組合物之後至少或約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、33天、34天、35天、36天、37天、38天、39天、40天、41天、42天、43天、44天、45天、46天、47天、48天、49天、50天、51天、52天、53天、54天、55天、56天、57天、58天、59天、60天、70天、80天、90天或100天投與第二免疫原性組合物之劑量。

在一些實施例中，該方法包含在第一免疫原性組合物之後投與多次劑量之第二免疫原性組合物。在一些實施例中，該方法包含在投與第一免疫原性組合物之後投與1次、2次、3次、4次、5次或多於5次劑量之第二免疫原性組合物。多次劑量可稱作包含第二免疫原性組合物之初始劑量或第一劑量及一或多次後續劑量。第二免疫原性組合物之第一或初始劑量在投與第一免疫原性組合物之後投與。在投與時，第二免疫原性組合物之後續劑量在第二免疫原性組合物之第一劑量之後進行。第二免疫原性組合物之後續劑量可在第二免疫原性組合物之先前劑量(例如第一劑量)之後任何時間間隔投與。舉例而言，在第二免疫原性組合物之先前劑量之前1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、33天、34天、35天、36天、37天、38天、39天、40天、41天、42天、43天、44天、45天、46天、47天、48天、49天、50天、51天、52天、53天、54天、55天、56天、57天、58天、59天、60天、90天或100天、120天、150天或180天投與第二免疫原性組合物之後續劑量。

在一些實施例中，該方法在第一免疫原性組合物之後包含至少兩次劑量之第二免疫原性組合物(例如在第一免疫原性組合物之後投與第二免疫原性組合物之第一劑量且在第二免疫原性組合物之先前第一劑量之後投與第二免疫原性組合物之後續劑量)。在一些實施例中，本文中之方法在第一免疫原性組合物之後包含至少三次劑量之第二免疫原性組合物(例如在第一免疫原性組合物之後投與第二免疫原性組合物之第一劑量且在第二免疫原性組合物之先前第一劑量之後投與第二免疫原性組合物之兩次後續劑量)。在一些實施例中，本文中之方法在第一免疫原性組合物之後包含至少四次劑量之第二免疫原性組合物(例如在第一免疫原性組合物之後投與第二免疫原性組合物之第一劑量且在第二免疫原性組合物之先前第一劑量之後投與第二免疫原性組合物之三個次後續劑量)。在一些實施例中，本文中之方法在第一免疫原性組合物之後包含至少五次劑量之第二免疫原性組合物(例如在第一免疫原性組合物之後投與第二免疫原性組合物之第一劑量且在第二免疫原性組合物之先前第一劑量之後投與第二免疫原性組合物之四次後續劑量)。本文中之方法在關於可向個體投與之第一免疫原性組合物及第二免疫原性組合物之劑量數目方面不受限制。熟習此項技術者可容易測定對個體具有有利作用，例如誘導增強免疫反應、減少腫瘤生長、減少腫瘤體積、減少癌轉移、減少腫瘤復發及其類似者所需的劑量數目。

後續劑量可間隔約0天、1天、2天、5天、7天、14天、21天、30天、2個月、4個月、6個月、9個月、1年、1.5年、2年、3年、4年或更久。第二免疫原性組合物之劑量可每1個月、6個月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年投與或更久。

在一些實施例中，第二免疫原性組合物之劑量少於第一免疫原性組合物之劑量。舉例而言，第二免疫原性組合物之劑量可比第一免疫原性組合物少約1%、2%、3%、4%、5%、7.5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、75%或多於75%。在一些實施例中，第一免疫原性組合物之劑量少於第二免疫原性組合物之劑量。舉例而言，第一免疫原性組合物之劑量可比第一免疫原性組合物少約1%、2%、3%、4%、5%、7.5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、75%或多於75%。在一些實施例中，第二免疫原性組合物及第一免疫原性組合物之劑量可相同。在一些實施例中，後續劑量可比先前劑量少例如約1%、2%、3%、4%、5%、7.5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、75%或多於75%。

在一些實施例中，第一免疫原性組合物為引發劑量(prime dose或priming dose)且第二免疫原性組合物為增強劑量。「引發劑量」為向個體投與之新抗原肽之新抗原決定子部分(例如新抗原決定基)之第一劑量。「增強劑量」為向已暴露於相同新抗原肽之新抗原決定子部分(例如新抗原決定基)之個體投與之新抗原肽之新抗原決定子部分(例如新抗原決定基)的第二或第三等劑量。在一些實施例中，依次在第一免疫原性組合物之後投與第二免疫原性組合物可例如誘發與單獨第一免疫原性組合物或第二免疫原性組合物之投與所誘導相比增強的免疫反應。

增強的免疫反應包含增加例如新抗原特異性免疫細胞(例如T淋巴球、B-淋巴球)之含量。免疫細胞之含量變化可包含例如提高免疫細胞之數目或提高活化免疫細胞之數目。如本文所使用，術語含量、數目、計數及濃度可互換使用。增強的免疫反應可包含活化T細胞(例如原始T細胞或靜止T細胞)。含量改變可為例如提高T細胞之數目，提高活化T細胞之數目，提高活性水準(例如效應子功能水準)，增殖速率或涉及特異性反應之T細胞之類似參數。

在一些實施例中，增強的免疫反應包含增加CD8+ T細胞之含量。在一些實施例中，CD8+ T細胞之TCR結合至包含本文所揭示之第一或第二肽之I類HLA-肽複合物。在一些實施例中，CD8+ T細胞之TCR結合至包含本文所揭示之第一或第二肽之II類HLA-肽複合物。在一些實施例中，CD8+ T細胞具有細胞毒性之效應子功能。在一些實施例中，CD8+ T細胞具有IFNγ分泌之效應子功能。

在一些實施例中，本文所揭示之方法可將CD8+ T細胞之含量增加至大於總免疫細胞群體之約10%、20%、30%、40%、50%、60%。在一些實施例中，相對於藉由單獨投與第一免疫原性組合物或第二免疫原性組合物獲得之含量，包含向已投與第一免疫原性組合物之個體投與第二免疫原性組合物的所揭示之方法可提高CD8+ T細胞含量。在一些實施例中，與藉由單獨投與第一免疫原性組合物或第二免疫原性組合物所獲得相比，本文中之方法將CD8+ T細胞之含量提高至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%。在另一實施例中，本文所揭示之方法將CD8+ T細胞之含量提高至少10倍、至少100倍、至少1,000倍、至少10,000倍。在一些實施例中，提高CD8+ T細胞之含量以使得CD8+ T細胞構成總免疫細胞群體之至少約20%＞、約25%、約30%＞、約35%或約40%＞。對如本文所揭示之新抗原肽具有特異性的CD8+ T細胞之含量提高係指誘導增強的免疫反應及癌症治療。

在一些實施例中，增強的免疫反應包含增加CD4+ T細胞之含量。在一些實施例中，CD4+ T細胞之TCR結合至包含本文所揭示之第一或第二肽之I類HLA-肽複合物。在一些實施例中，CD4+ T細胞之TCR結合至包含本文所揭示之第一或第二肽之II類HLA-肽複合物。在一些實施例中，CD4+ T細胞具有巨噬細胞活化及/或B細胞活化之效應子功能。

在一些實施例中，本文所揭示之方法可將CD4+ T細胞之含量提高至大於總免疫細胞群體之約10%、20%、30%、40%、50%、60%。在一些實施例中，相對於藉由單獨投與第一免疫原性組合物或第二免疫原性組合物獲得之含量，包含向已投與第一免疫原性組合物之個體投與第二免疫原性組合物的所揭示之方法提高CD4+ T細胞含量。在一些實施例中，與藉由單獨投與第一免疫原性組合物或第二免疫原性組合物所獲得相比，本文中之方法將CD4+ T細胞之含量提高至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%。在另一實施例中，本文所揭示之方法將CD4+ T細胞之含量提高至少10倍、至少100倍、至少1,000倍、至少10,000倍。在一些實施例中，提高CD4+ T細胞之含量以使得CD4+ T細胞構成總免疫細胞群體之至少約20%＞、約25%、約30%＞、約35%或約40%＞。對如本文所揭示之新抗原肽具有特異性的CD4+ T細胞之含量提高指示誘導增強的免疫反應或癌症治療。

在一些實施例中，增強的免疫反應包含效應子T細胞含量提高。如本文所使用，術語「效應子T細胞」係指可特異性結合至包含本文所揭示之第一或第二肽的I類HLA-肽複合物或包含本文所揭示之第一或第二肽的II類HLA肽複合物且介導不需要進一步分化之免疫反應(效應子功能)的T細胞。效應子T細胞一般能夠離開淋巴系統且進入免疫學外周。在表現型上，其一般為CD62L−CD44hi CD107α+ IGN-γ+ LTβ+ TNF-α+且主動地循環。如本文所使用之術語「效應子功能」係關於在活化後藉由T細胞採集溶胞活性及/或細胞介素分泌。效應子T細胞之實例包括CTL、THI細胞及TH2細胞。相比於效應子T細胞，藉由增殖及分化至效應子T細胞中，原始T細胞未遇到其特異性抗原：MHC複合物，亦不對其作出反應。效應子T細胞可休眠(在細胞循環之Go階段中)或活化(增殖)。在一些實施例中，效應子T細胞為CD8+ T細胞，在一些實施例中，效應子T細胞為CD4+ T細胞。

在一些實施例中，CD8+ T細胞及CD4+ T細胞為效應子記憶T細胞。本文中之「效應子記憶T細胞」意謂表現CD44+CD62Llo CD127hi KLRG1hi之T細胞，因為其已暴露於免疫新抗原且能夠響應於回憶抗原而分化，且顯示有效效應子功能(例如產生效應子細胞介素、細胞毒性)。效應子記憶T細胞可包含提高的CD95/FAS表現及提高的細胞凋亡易感性、CD11a/CD18之較高含量及L-選擇素、a4β7整合素及CD27之非均一表現(Picker及Siegelman, (1999)「Lymphoid Tissues and Organs」於W. E. Paul編, Fundamental Immunology,第4版, 第14章,第479頁-第531頁中)。在一些實施例中，本文所揭示之方法提高效應子記憶T細胞之含量。在一些實施例中，本文所揭示之方法可將效應子記憶T細胞之含量提高至大於總免疫細胞群體之約10%、20%、30%、40%、50%、60%。在一些實施例中，相對於藉由單獨投與第一免疫原性組合物或第二免疫原性組合物獲得之含量，包含向已投與第一免疫原性組合物之個體投與第二免疫原性組合物的所揭示之方法提高效應子記憶T細胞之含量。在一些實施例中，與藉由單獨投與第一免疫原性組合物或第二免疫原性組合物所獲得相比，本文中之方法將效應子記憶T細胞之含量提高至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%。在另一實施例中，本文所揭示之方法將效應子記憶T細胞之含量提高至少10倍、至少100倍、至少1,000倍、至少10,000倍。在一些實施例中，提高效應子記憶T細胞之含量以使得效應子記憶T細胞包含總免疫細胞群體之至少約20%＞、約25%、約30%＞、約35%或約40%＞。對如本文所揭示之新抗原肽具有特異性的效應子記憶T細胞之含量提高係指誘導增強的免疫反應或癌症治療。

在一些實施例中，CD8+ T細胞及CD4+ T細胞為末端效應子T細胞。在一些實施例中，本文中之「末端效應子T細胞」意謂表現CD44+CD62L-/loCD127-KLRG1hi表面標記物之T細胞。在一些實施例中，本文所揭示之方法提高效應子記憶T細胞之含量。在一些實施例中，本文所揭示之方法可將末端效應子T細胞含量提高至大於總免疫細胞群體之約10%、20%、30%、40%、50%、60%。在一些實施例中，相對於藉由單獨投與第一免疫原性組合物或第二免疫原性組合物獲得之含量，包含向已投與第一免疫原性組合物之個體投與第二免疫原性組合物的所揭示之方法提高末端效應子T細胞之含量。在一些實施例中，與藉由單獨投與第一免疫原性組合物或第二免疫原性組合物所獲得相比，本文中之方法將末端效應子T細胞含量提高至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%。在另一實施例中，本文所揭示之方法將末端效應子T細胞之含量提高至少10倍、至少100倍、至少1,000倍、至少10,000倍。在一些實施例中，提高末端效應子T細胞之含量以使得末端效應子T細胞包含總免疫細胞群體之至少約20%＞、約25%、約30%＞、約35%或約40%＞。對如本文所揭示之新抗原肽具有特異性的末端效應子T細胞之含量提高係指誘導增強的免疫反應或癌症治療。

在一些實施例中，CD8+ T細胞及CD4+ T細胞可為記憶前驅體。本文中「記憶前驅體」意謂表現CD44+CD62L-/lo CD127-/+KLRG1lo/int表面標記物之T細胞。在一些實施例中，本文所揭示之方法提高記憶前驅體之含量。在一些實施例中，本文所揭示之方法可將記憶前驅體之含量提高至大於總免疫細胞群體之約10%、20%、30%、40%、50%、60%。在一些實施例中，相對於藉由單獨投與第一免疫原性組合物或第二免疫原性組合物獲得之含量，包含向已投與第一免疫原性組合物之個體投與第二免疫原性組合物的所揭示之方法提高記憶前驅體之含量。在一些實施例中，與藉由單獨投與第一免疫原性組合物或第二免疫原性組合物所獲得相比，本文中之方法將記憶前驅體之含量提高至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%。在另一實施例中，本文所揭示之方法將記憶前驅體之含量提高至少10倍、至少100倍、至少1,000倍、至少10,000倍。在一些實施例中，提高記憶前驅體之含量以使得記憶前驅體構成總免疫細胞群體之至少約20%＞、約25%、約30%＞、約35%或約40%＞。對如本文所揭示之新抗原肽具有特異性的記憶前驅體之含量提高係指誘導增強的免疫反應或癌症治療。

在一些實施例中，CD8+ T細胞及CD4+ T細胞可為中樞記憶T細胞。本文中之「中樞記憶T細胞」意謂表現CD44+ CD62Lhi CD127hi KLRG1lo表面標記物之T細胞。在一些實施例中，本文所揭示之方法提高中樞記憶T細胞之含量。在一些實施例中，本文所揭示之方法可將中樞記憶T細胞之含量提高至大於總免疫細胞群體之約10%、20%、30%、40%、50%、60%。在一些實施例中，相對於藉由單獨投與第一免疫原性組合物或第二免疫原性組合物獲得之含量，包含向已投與第一免疫原性組合物之個體投與第二免疫原性組合物的所揭示之方法提高中樞記憶T細胞之含量。在一些實施例中，與藉由單獨投與第一免疫原性組合物或第二免疫原性組合物所獲得相比，本文中之方法將中樞記憶T細胞之含量提高至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%。在另一實施例中，本文所揭示之方法將中樞記憶T細胞之含量提高至少10倍、至少100倍、至少1,000倍、至少10,000倍。在一些實施例中，提高中樞記憶T細胞之含量以使得中樞記憶T細胞構成總免疫細胞群體之至少約20%＞、約25%、約30%＞、約35%或約40%＞。對如本文所揭示之新抗原肽具有特異性的中樞記憶T細胞之含量提高係指誘導增強的免疫反應或癌症治療。

熟習此項技術者應瞭解，個體之細胞培養系統及免疫系統兩者均包含基本含量之免疫細胞及效應分子(例如細胞介素)。片語基本含量及正常含量可互換使用。如本文所使用，基本含量之一種類型的免疫細胞或效應分子係指在一定參考狀態(例如在健康個體中、在未經治療之個體中、在單獨用第一免疫原性組合物或第二免疫原性組合物治療之個體中或在用習知癌症療法，諸如化學療法治療之個體中)下個體群體中存在之細胞類型或效應分子之平均數目，或基本含量之一種類型的免疫細胞或效應分子係指未活化細胞群體中存在之細胞類型或效應分子之平均含量。熟習此項技術者能夠測定此類細胞群體中或生物樣品中之特定免疫細胞之含量。如本文所使用，術語「生物樣品」在此項技術中具有其通用含義且係指可出於活體外評估的目的獲自個體(例如移植受體)之任何樣品。較佳生物樣品為血液樣品(例如全血樣品、血清樣品或血漿樣品)。

量測免疫細胞之方法為此項技術中眾所周知的，包括例如藉由流式細胞測量術基於鑑別比表面積標記物蛋白質之表現的方法。此等鑑別及分離方法包括FACS、管柱層析、磁珠淘選、西方墨點法、射線照相術、電泳、毛細電泳法、高效液相層析(HPLC)、薄層層析(TLC)、高擴散層析及其類似者；及各種免疫學方法，諸如流體或凝膠沈澱素反應、免疫擴散(單向或雙向)、免疫電泳、放射免疫分析(RIA)、酶聯免疫吸附分析(ELISA)、免疫螢光分析及其類似者。對於免疫學及免疫分析程序之綜述，一般參見Stites及Terr (編) 1991 Basic and Clinical Immunology (第7版)及上文Paul。對於如何製得所選抗原之抗體的論述，參見上文Harlow及Lane (1989)。

在若干配置中之任一者中在細胞純化期間可進行細胞分離或細胞偵測之免疫分析，例如Maggio (編) (1980) Enzyme Immunoassay CRC Press, Boca Raton, FIa.；Tijan (1985) 「Practice and Theory of Enzyme Immunoassays,」 Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam；Harlow及Lane,上文；Chan (編) (1987) Immunoassay: A Practical Guide Academic Press, Orlando, FIa.；Price及Newman (編) (1991) Principles and Practice of Immunoassays Stockton Press, NY；及Ngo (編) (1988) Non-isotopic Immunoassays Plenum Press, NY中綜述之彼等者。可藉由流式細胞測量術方法，諸如FACS分析分離且表徵細胞。已知廣泛多種流式細胞測量術方法。對於螢光活化流式細胞測量術之一般概述，參見例如Abbas等人 (1991) Cellular and Molecular immunology W.B. Saunders Company,尤其第3章；及Kuby (1992) Immunology W.H. Freeman and Company,尤其第6章。FACS機器可例如購自Becton Dickinson。

可用於標記細胞抗原之標記藥劑包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、蛋白質或其他聚合物，諸如親和力基質、碳水化合物或脂質。藉由任何已知方法，諸如免疫墨點、西方墨點分析、放射性或生物發光標記物之追蹤、毛細電泳法或基於尺寸、電荷或親和力追蹤分子之其他方法進行偵測。

亦可藉由量測效應子T細胞反應測定免疫反應之程度或效應細胞之含量。可藉由至少一種指標，例如細胞介素分析、ELISPOT分析、細胞毒性分析、四聚體分析、DTH反應、臨床反應、腫瘤縮小、腫瘤清除、抑制腫瘤進展、改善疾病症狀及其類似者偵測到效應子T細胞反應。方法可進一步包括獲得、偵測或分析對新抗原之效應子T細胞反應。可藉由效應分子測定T細胞之效應子功能，該等效應分子響應於其TCR與包含本文所揭示之第一或第二肽之HLA-新抗原肽複合物在靶細胞上之特異性結合其釋出。儲存於可藉由細胞毒性CD8+ T細胞釋放之溶解顆粒劑中之細胞毒性效應分子包括預成形體、顆粒酶、顆粒溶素及Fas配位體。預成形體在靶細胞中形成跨膜孔隙。顆粒酶為可觸發細胞凋亡之絲胺酸蛋白酶。顆粒溶素誘導靶細胞之細胞凋亡。Fas配位體亦可誘發靶細胞之細胞凋亡。可藉由細胞毒性T細胞釋放之其他效應分子包括IFN-γ、TNF-β及TNF-α。IFN-γ抑制病毒複製且活化巨噬細胞。TNF-β及TNF-α可參與巨噬細胞活化且參與殺死某些靶細胞。

活化可藉由CD4+ THI細胞分泌之效應分子之巨噬細胞包括IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、CD40配位體(坎德拉154)及Fas配位體。CD4+ TH1細胞子組亦可有助於B細胞活化，IFN-γ及CD40配位體活化巨噬細胞以破壞吞噬細菌。可藉由THI細胞釋放之其他效應分子包括IL-3、TNF-β (其抑制B細胞)、IL-2、CXCL2及GROβ。Fas配位體及TNF-β可殺死長期感染有細胞內細菌之細胞。IL-2誘導T細胞增殖。IL-3及GM-CSF誘導巨噬細胞分化。CCL2誘導巨噬細胞之趨化性。

活化可藉由CD4+ TH2細胞分泌之效應分子之B細胞包括IL-4、IL-5、IL-9、IL-13、IL-15及CD40配位體。可藉由TH2細胞釋放之其他效應分子包括IL-3、GM-CSF、IL-IO (其抑制巨噬細胞活化)、TGF-β、IL-2、CCLl 1 (伊紅趨素)及CCL 17 (TARC)。活化TH2細胞(及某些THl細胞)刺激B細胞在其識別特異性抗原(藉由B細胞展現之MHC II類複合物)時增殖及分化。

在一些實施例中，增強的免疫反應包含持續免疫反應。如本文所使用，術語「持續免疫反應」係指在個體保持相對於免疫細胞(例如CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、效應子T細胞、效應子記憶T細胞)及效應分子(諸如IFN-γ)之基本含量的提高。在一些實施例中，包含向已投與如本文所揭示之第一免疫原性組合物之個體投與第二免疫原性組合物的方法延長在個體中使免疫反應持續至大於藉由單獨投與第一免疫原性組合物或第二免疫原性組合物所獲得的程度之時間段。在一些實施例中，增強的免疫反應持續至少約一天、2天、5天、10天、20天、1個月、2個月、3個月、6個月、1年、2年、5年或10年。免疫反應可為細胞的、T-淋巴球及/或B-淋巴球及/或體液的，如藉由活體外分析，諸如T細胞增殖分析、細胞毒性分析、ELISA、RIA、凝膠、FACS分析、西方墨點及其類似者所量測。在一些實施例中，與藉由單獨投與第一免疫原性組合物或第二免疫原性組合物所獲得相比，增強的免疫反應之持續時間延長至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%。在另一實施例中，相對於藉由單獨投與第一免疫原性組合物及第二免疫原性組合物所獲得，本文所揭示之方法使增強的免疫反應時間提高持續至少2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、50倍、60倍、100倍或1,000倍。

在一些實施例中，與藉由單獨投與第一免疫原性組合物或第二免疫原性組合物所誘導相比，包含投與至少一次劑量之第一免疫原性組合物及至少一次劑量之第二免疫原性組合物的本文所揭示之方法可誘發提高的抗腫瘤作用。如本文所使用，術語「抗腫瘤作用」係指有利的生物作用，其可藉由以下中之任何一或多者體現：腫瘤體積降低或穩定；腫瘤細胞之數目降低或穩定；腫瘤生長速率降低或穩定；轉移瘤數目降低或穩定；保護不會腫瘤復發；具有腫瘤之個體之壽命預期或存活率提高；具有腫瘤之個體之壽命預期或存活率提高而無疾病進展或改善與癌性病況相關之各種生理症狀。「抗腫瘤作用」亦可藉由本文所揭示之方法及組合物之能力體現以預防在第一位置中出現腫瘤或腫瘤復發。考慮到其特性，本文所揭示之方法可用於治療休眠、可控或穩定癌症之急性癌症以及癌症預防。在一些實施例中，由向先前已投與本文所揭示之第一免疫原性組合物之個體投與第二免疫原性組合物誘導之增強的免疫反應可使腫瘤生長、腫瘤體積、轉移瘤數目、腫瘤復發或其組合減少至大於藉由單獨投與第一免疫原性組合物或第二免疫原性組合物所獲得者的程度。

在一些實施例中，治療癌症使得腫瘤尺寸減小。腫瘤尺寸減小亦可稱作「腫瘤消退」。較佳地，在使用本文所揭示之方法治療之後，相對於治療之前的數目，腫瘤生長降低5%、10%、20%、30%、40%、50%、75%或大於75%。在一些實施例中，相比於藉由單獨用第一免疫原性組合物或第二免疫原性組合物治療所獲得，腫瘤生長降低更大。腫瘤生長降低程度相比於單獨用第一免疫原性組合物或第二免疫原性組合物治療之程度大5%、10%、20%、30%、40%、50%、75%、85%、90%、95%或99%。可藉由任何可再現之量測手段量測腫瘤尺寸。在一些實施例中，腫瘤尺寸可量測為腫瘤直徑。

在一些實施例中，治療癌症使得腫瘤體積減小。較佳地，在用本文所揭示之方法治療之後，相對於治療之前的數目，腫瘤體積減小5%、10%、20%、30%、40%、50%、75%或大於75%。在一些實施例中，相比於藉由單獨用第一免疫原性組合物或第二免疫原性組合物治療所獲得，腫瘤體積減小更大。腫瘤體積減小程度相比於單獨用第一免疫原性組合物或第二免疫原性組合物治療之程度大5%、10%、20%、30%、40%、50%、75%、85%、90%、95%或99%。可藉由任何可再現之量測手段量測腫瘤體積。

在一些實施例中，治療癌症使得腫瘤數目減少。較佳地，在治療之後，相對於治療之前的數目，腫瘤數目減少5%、10%、20%、30%、40%、50%、75%或大於75%。在一些實施例中，相比於藉由單獨用第一免疫原性組合物或第二免疫原性組合物治療所獲得，腫瘤數目減少更大。腫瘤減少程度相比於單獨用第一免疫原性組合物或第二免疫原性組合物治療之程度大5%、10%、20%、30%、40%、50%、75%、85%、90%、95%或99%。可藉由任何可再現之量測手段量測腫瘤數目。在一些實施例中，可藉由計數肉眼或在指定放大率下可見之腫瘤來量測腫瘤數目。在一些實施例中，指定放大率為2×、3×、4×、5×、10×或50×。

在一些實施例中，治療癌症使得遠離原發性腫瘤位點之其他組織或器官中之轉移性損傷數目減少。較佳地，在治療之後，相對於治療之前的數目，轉移性損傷數目減少5%、10%、20%、30%、40%、50%、75%或大於75%。在一些實施例中，相比於藉由單獨用第一免疫原性組合物或第二免疫原性組合物治療所獲得，轉移性損傷數目減少更大。轉移瘤減少程度相比於單獨用第一免疫原性組合物或第二免疫原性組合物治療之程度大5%、10%、20%、30%、40%、50%、75%、85%、90%、95%或99%。可藉由任何可再現之量測手段量測轉移性損傷數目。在一些實施例中，可藉由計數肉眼或在指定放大率下可見之轉移性損傷來量測轉移性損傷數目。在一些實施例中，指定放大率為2×、3×、4×、5×、10×或50×。

在一些實施例中，治療癌症使得腫瘤生長率降低。較佳地，在治療之後，相對於治療之前的數目，腫瘤生長率降低5%、10%、20%、30%、40%、50%、75%或大於75%。在一些實施例中，相比於藉由單獨用第一免疫原性組合物或第二免疫原性組合物治療所獲得，腫瘤生長降低更大。腫瘤生長降低程度相比於單獨用第一免疫原性組合物或第二免疫原性組合物治療之程度大5%、10%、20%、30%、40%、50%、75%、85%、90%、95%或99%。可藉由任何可再現之量測手段量測腫瘤生長率。在一些實施例中，根據每單位時間之腫瘤直徑變化量測腫瘤生長率。

在一些實施例中，治療癌症使得腫瘤再生或腫瘤復發降低。較佳地，在治療之後，相對於治療之前的數目，腫瘤再生小於5%、10%、20%、30%、40%、50%、75%或大於75%。在一些實施例中，相比於藉由單獨用第一免疫原性組合物或第二免疫原性組合物治療所獲得，腫瘤再生降低更大。腫瘤再生降低程度相比於單獨用第一免疫原性組合物或第二免疫原性組合物治療之程度大5%、10%、20%、30%、40%、50%、75%、85%、90%、95%或99%。可藉由任何可再現之量測手段量測腫瘤再生。在一些實施例中，例如藉由量測治療後先前腫瘤縮小之後腫瘤直徑之提高量測腫瘤再生。在一些實施例中，在治療停止之後腫瘤復發的失敗指明腫瘤再生降低。

在一些實施例中，包含投與至少一次劑量之第一免疫原性組合物及至少一次劑量之第二免疫原性組合物的方法使個體存活率增強至大於藉由單獨投與第一免疫原性組合物或第二免疫原性組合物所獲得者之程度。在一些實施例中，由向先前已投與第一免疫原性組合物之個體投與第二免疫原性組合物誘導之增強的免疫反應可使個體存活率增強至大於藉由單獨投與第一或第二免疫原性組合物所獲得者的程度。如本文所使用，術語「增強的存活率」係指在用本文所揭示之方法及組合物治療後存活之個體或患者經歷的延長的時間長度。增強的存活率表示在特定治療之後罹患癌症之個體保持無疾病進展之機率提高。其亦用於描述相比於對照組在指定持續時間之後疾病可能仍穩定(不顯示進展跡象)之群組中之個體之提高的百分比。其亦用於描述相比於對照組在指定持續時間之後疾病可能治癒(不顯示疾病跡象)之群組中之個體之提高的百分比。此參數可藉由表示為用作特定治療療效指示之「無進展存活期」、「總存活期」及「無疾病存活期」之慣用臨床終點中之任一者量測。

在一些實施例中，存活期為至少一個月、至少兩個月、至少三個月、至少四個月、至少五個月、至少六個月、至少七個月、至少八個月、至少九個月、至少十個月、至少十一個月、至少十二個月、至少十三個月、至少十四個月、至少十五個月、至少十六個月、至少十七個月、至少十八個月、至少十九個月、至少二十個月、至少二十一個月、至少二十兩個月、至少二十三個月或至少二十四個月之時間段。在一些實施例中，存活期為至少1年、至少2年、至少3年、至少4年、至少5年、至少6年、至少7年、至少8年、至少9年或至少10年之時間段。在一些實施例中，在增強劑量或增強方案不存在下實現增強的存活期。在一些情況下，增強的存活期以一或多次劑量之增強劑量或增強方案(例如在第一免疫原性組合物之引發劑量之後投與第二免疫原性組合物)之投與實現。在一些情況下，在引發劑量(例如第一免疫原性組合物之劑量)之後當天或至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、33天、34天、35天、36天、37天、38天、39天、40天、41天、42天、43天、44天、45天、46天、47天、48天、49天、50天、51天、52天、53天、54天、55天、56天、57天、58天、59天、60天、65天、70天、75天、80天、85天、90天、95天、100天、105天、110天、115天、120天、125天、130天、135天、140天、145天、150天、155天、160天、165天、170天、175天、180天、185天、190天、195天、200天、205天、210天、215天、220天、230天或240天投與一或多次增強劑量(例如第二免疫原性組合物之劑量)。
套組

本文所描述之新抗原治療劑可與投與說明書一起提供於套組形式中。典型地，套組將包括容器、單位劑型及投與說明書中之所需新抗原治療劑。在套組中亦可包括額外治療劑，例如細胞介素、淋巴介質、檢查點抑制劑、抗體。亦可能需要的其他套組組分包括例如無菌注射器、增強劑量及其他所需賦形劑。

本文亦提供與本文所描述之一或多種方法一起使用的套組及製品。套組可含有包含一或多種新抗原決定基之一或多種新抗原多肽。套組亦可含有編碼本文所描述之肽或蛋白質中之一或多者的核酸、識別本文所描述之肽中之一或多者的抗體或用本文所描述之肽中之一或多者活化的基於APC之細胞。套組可進一步含有組成及遞送疫苗所需之佐劑、試劑及緩衝劑。

套組亦可包括載劑、封裝或經分隔以接收一或多個容器(諸如小瓶、管及其類似者)之容器，各容器包含用於本文所描述之方法中之各別元件(諸如肽及佐劑)中之一者。適合的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器及試管。容器可由諸如玻璃或塑膠之多種材料形成。

本文所提供之製品含有封裝材料。醫藥封裝材料之實例包括(但不限於)泡殼包裝、瓶子、管、袋、容器、瓶子，及適於所選調配物及預定投藥模式及療法的任何封裝材料。套組典型地包括列出含量之標籤及/或使用說明書，及藥品說明書與使用說明書。典型地將亦包括一組說明書。

將藉助於特定實例更詳細地描述本發明。出於說明之目的提供以下實例，且不意欲以任何方式限制本發明。熟習此項技術者將容易地識別可改變或修改以產生根據本發明之替代實施例的多種非關鍵參數。本文中所列出之所有專利、專利申請案及列印公開案以全文引用之方式併入本文中。
實例

提供此等實例僅為達成說明之目的且不限制本文所提供之申請專利範圍之範疇。
實例 1- 誘導 CD4⁺ 及 CD8⁺ T 細胞反應

活體外T細胞誘導用於擴增新抗原特異性T細胞。按以下方式製備成熟專職APC用於此等分析。單核球使用基於珠粒之套組(Miltenyi)自健康人類供體PBMC富集。將富集細胞接種於GM-CSF及IL-4中以誘發不成熟DC。在5天之後，在添加細胞介素成熟混合液(GM-CSF、IL-1β、IL-4、IL-6、TNFα、PGE1β)之前在37℃下用肽池培育不成熟DC 1小時。肽池可包括多個突變，其分別具有縮短子及增長子兩者以擴增CD8⁺ 及CD4⁺ T細胞。在37℃下培育細胞至成熟DC。

在DC成熟之後，將PBMC (成批或富集T細胞)添加至具有增殖細胞介素之成熟樹突狀細胞中。使用功能分析及/或四聚體染色之組合監測培養物之肽特異性T細胞。具有經修飾及母體肽之平行免疫原性分析允許比較肽擴增之肽特異性T細胞之相對效率。
實例 2- 四聚體染色分析

MHC四聚體購買或現場製造且用於在免疫原性分析中量測肽特異性T細胞擴增。對於評定，根據製造商的說明書，在含有1% FCS及0.1%疊氮化鈉之PBS(FACS緩衝液)中將四聚體添加至1×10⁵ 個細胞中。在暗處在室溫下培育細胞20分鐘。隨後添加對T細胞標記物，諸如CD8具有特異性的抗體直至製造商建議之最終濃度，在暗處在4℃下培育細胞20分鐘。細胞用冷FACS緩衝液洗滌且再懸浮於含有1%甲醛之緩衝液中。在FACS Calibur (Becton Dickinson)儀器上獲得細胞，且藉由使用Cellquest軟體(Becton Dickinson)進行分析。為了分析四聚體陽性細胞，淋巴細胞門取自正散射及旁散射圖。資料報導為CD8⁺ /四聚物⁺ 之細胞之百分比。
實例 3- 細胞內細胞介素染色分析

在鑑別抗原特異性T細胞群體之公認四聚體染色不存在下，可使用細胞介素產量，使用公認流式細胞測量術分析評定估計抗原特異性。簡言之，用相關肽刺激T細胞且與對照組進行比較。在刺激之後，藉由細胞內染色評定CD4⁺ T細胞之細胞介素(例如IFNγ及TNFα)之產量。此等細胞介素，尤其IFNγ用於鑑別經刺激之細胞。
實例 4- 抗原特異性 T 細胞之分析
ELISPOT 分析

使用ELISPOT分析(BD Biosciences)在功能上列舉肽特異性T細胞，該分析在單一細胞基礎上量測IFNγ自T細胞之釋放。將細胞與抗原一起在37℃下培育隔夜(16-18小時)。次日，丟棄細胞懸浮液，且用PBS洗滌孔一次，且用去離子水洗滌兩次。對於分析其餘部分中之所有洗滌步驟，在每一洗滌步驟使孔浸泡3分鐘。隨後用洗滌緩衝液(PBS+0.05% Tween-20)洗滌孔三次，且將偵測抗體(1:250)添加至所有孔中。在室溫下培育培養盤兩小時。丟棄偵測抗體溶液，且用洗滌緩衝液洗滌孔三次。將抗生物素蛋白-HRP (1:250)添加至所有孔中，且在室溫下培育培養盤一小時。丟棄共軛物溶液，且用洗滌緩衝液洗滌孔三次，隨後用PBS洗滌一次。將受質(3-胺基-9-乙基-咔唑，0.1 M乙酸酯緩衝液，H2O2)添加至所有孔中，且監測點發展(約10分鐘)。藉由用水洗滌孔停止受質反應，且使培養盤空氣乾燥隔夜。在具有隨附軟體之ELISPOT讀取器(Cellular Technology Ltd.)上分析培養盤。對應於產生IFNγ之T細胞之數目的點報導為每個數目接種T細胞之點之絕對數。
流式細胞測量術分析

MHC四聚體購買或現場製造且用於在免疫原性分析中量測肽特異性T細胞擴增。對於評定，根據製造商的說明書，在含有1% FCS及0.1%疊氮化鈉之PBS(FACS緩衝液)中將四聚體添加至1×10⁵ 個細胞中。在暗處在室溫下培育細胞20分鐘。隨後添加細胞表面抗體直至製造商建議之最終濃度，且在暗處在4℃下培育細胞20分鐘。藉由諸如CD3及CD8之標記物之存在及諸如CD4、CD11b、CD11c及CD19之標記物之不存在鑑別CD8 T細胞。使用諸如CD44、CD62L、KLRG1、CD127、PD-1、LAG-3及TIM-3之標記物評定細胞表型。細胞用冷FACS緩衝液洗滌且再懸浮於含有1%甲醛之緩衝液中。在FACS Calibur (Becton Dickinson)儀器上獲得細胞，且藉由使用Cellquest軟體(Becton Dickinson)進行分析。為了分析四聚體陽性細胞，淋巴細胞門取自正散射及旁散射圖。
實例 5 -CD107 染色分析

在用同源肽活化之後使CD107a及b在CD8⁺ T細胞之細胞表面上表現。T細胞之溶解顆粒劑具有含有溶酶體相關膜醣蛋白(「LAMP」)之脂質雙層，其包括分子CD107a及b。當經由T細胞受體活化細胞毒性T細胞時，此等溶解顆粒劑之膜使T細胞之質膜移動且與T細胞之質膜融合。釋放顆粒內容物，且此導致靶細胞死亡。因為顆粒膜與質膜融合，使C107a及b暴露於細胞表面上，且因此為去顆粒之標記物。因為在單一細胞基礎上報導如藉由CD107a及b染色所量測之去顆粒，分析用於在功能上計數肽特異性T細胞。為了執行分析，將肽添加至HLA-A0201-經轉染細胞C1R中直至20 μM之最終濃度，在37℃下培育細胞1小時且洗滌三次。將1×10⁵ 個經肽脈衝衝擊之C1R細胞等分至管中，且添加對CD107a及b具有特異性的抗體直至製造商(Becton Dickinson)建議之最終濃度。在添加T細胞之前添加抗體以便「採集」CD107分子，因為其在分析過程期間暫時出現在表面上。隨後添加來自免疫原性培養物之1×10⁵ 個T細胞，且在37℃下培育樣品4小時。進一步染色T細胞之額外細胞表面分子，諸如CD8且在FACS Calibur儀器(Becton Dickinson)上獲得。使用隨附Cellquest軟體分析資料，且結果報導為CD8⁺ /CD107a及b⁺ 細胞之百分比。
實例 6- 細胞毒性分析

使用鉻釋放分析來量測細胞毒活性。在37℃下用Na⁵¹ Cr標記靶T2細胞1小時且洗滌，隨後添加5×10³ 個靶T2細胞以改變來自免疫原性培養物之T細胞之數目。在37℃下培育4小時之後採集的上清液中量測鉻釋放。特異性溶解之百分比經計算為：
實驗釋放-自發性釋放/總釋放-自發性釋放×100
實例 7- 依次活體內使用增長子及縮短子之增強的 CD8⁺ T 細胞反應

增長子肽疫苗接種可誘發CD4⁺ 及CD8⁺ T細胞反應，視肽之處理及呈現而定。極少縮短子抗原決定基疫苗接種集中於產生CD8⁺ T細胞反應，但在抗原呈現之前不需要肽處理。因而，任何細胞可容易地呈現抗原決定基，不僅僅是專職抗原呈現細胞(APC)。此會引起T細胞之抗性，其與呈現抗原之健康細胞接觸作為外周抗性之部分。為了避開此，增長子初始免疫允許僅藉由可處理及呈現肽之APC引發CD8⁺ T細胞。後續免疫促進初始CD8⁺ T細胞反應(圖3-12B)。
活體內免疫原性分析

十九隻8-12週齡雌性C57BL/6小鼠(Taconic Biosciences)在到達時隨機地且預期性地分配給處理組。在研究開始之前使動物適應三(3)天。以LabDiet™ 5053無菌嚙齒動物食物飼養動物且隨意提供無菌水。第1組中之動物充當疫苗接種佐劑-僅對照，且在第0天、第7天及第14天在100 μg下以經由皮下注射(s.c.)投與之0.1 mL之體積單獨投與多聚肌苷酸:多聚胞苷酸(聚I:C)。在第0天、第7天及第14天，在100 μg下以0.1 mL之體積s.c.投與第2組中之動物50 μg六個增長子肽(下文所描述)以及聚I:C中之每一者。在第0天，在100 μg下以0.1 mL之體積s.c.投與第3組中之動物50 μg六個增長子肽(下文所描述)以及聚I:C中之每一者，且在第7天及第14天，在100 μg下以0.1 mL之體積s.c.投與莫耳匹配當量之對應縮短子肽(下文所描述)以及聚I:C。稱重動物且每日監測一般健康。若動物體重相比於第0天之重量損失＞30%；或若發現動物瀕死，則在研究完成第21天藉由CO2過度劑量使動物安樂死。在處死時，採集脾臟且使用標準方案加工成單細胞懸浮液。簡言之，經由70 μM過濾器機械降解脾臟，粒化，且在再懸浮於細胞培養基中之前用ACK裂解緩衝液(Sigma)裂解。
肽

基於小鼠展現誘發CD8⁺ T細胞反應之能力使用六個此前鑑別之小鼠新抗原。對於每一新抗原，已定義對應於極少抗原決定基之縮短子(8-11個胺基酸)。使用對應於突變周圍20-27個胺基酸之增長子。
以下表7顯示六個肽對(縮短子及增長子)。
實例 8 - 誘導長期抗原特異性 T 細胞反應

多種癌症疫苗之基本目的為誘發短期及長期免疫性兩者。由於次最佳引發，短肽疫苗接種可誘發無效長期免疫性。為了避開此，在引發階段期間使用長肽且在增強階段包括短肽以提高T細胞反應。可在初始疫苗接種之後至少60天藉由評定T細胞群體測定反應持久性(圖13-22)。

十八隻8-12週齡雌性C57BL/6小鼠(Taconic Biosciences)在到達時隨機地且預期性地分配給處理組。在研究開始之前使動物適應三(3)天。以LabDiet™ 5053無菌嚙齒動物食物飼養動物且隨意提供無菌水。第1組中之動物充當疫苗接種佐劑-僅對照，且在第0天及第21天在100 μg下以經由皮下注射(s.c.)投與之0.1 mL之體積單獨投與多聚肌苷酸:多聚胞苷酸(聚I:C)。在第0天及第21天，在100 μg下以0.1 mL之體積s.c.投與第2組中之動物50 μg六個增長子肽(下文所描述)以及聚I:C中之每一者。在第0天及第21天，在100 μg下以0.1 mL之體積s.c.投與第3組中之動物50 μg六個增長子肽及莫耳匹配當量之對應縮短子以及聚I:C中之每一者。在第0天，在100 μg下以0.1 mL之體積s.c.投與第4組中之動物50 μg六個增長子肽以及聚I:C中之每一者，且在第0天，在100 μg下以0.1 mL之體積s.c.投與50 μg莫耳匹配當量之對應縮短子肽以及聚I:C。在整個研究中週期性地經由眶後靜脈自動物抽血。稱重動物且每日監測一般健康。若其體重相比於第0天之重量動物損失＞30%；或若發現動物瀕死，則在研究完成第60天藉由CO2過度劑量使動物安樂死。在處死時，採集脾臟且使用標準方案加工成單細胞懸浮液。簡言之，經由70 μM過濾器機械降解脾臟，粒化，且在再懸浮於細胞培養基中之前用ACK裂解緩衝液(Sigma)裂解。
表3列出用包含新抗原決定基(縮短子或增長子)免疫以用於誘導抗原特異性T細胞反應之例示性方法。

引發劑量及增強之表3之投與方案進一步描述於圖13中。本文所描述之圖14A-22顯示誘導長期抗原特異性T細胞反應。結果亦顯示在引發及/或增強時包括縮短子相比於單獨使用增長子提高多聚體+細胞%。第21天之增強提高多聚體+細胞%超出大部分抗原決定基引發之後觀測到的程度。
實例 9- 評定抗原特異性 CD8 T 細胞 之記憶體表型

根據表3之方法，在第0天及第21天，脾臟細胞獲自經包含新抗原決定基(縮短子或增長子)之肽免疫之小鼠。免疫後一週或5週獲得脾臟細胞以便分析記憶體群體。
流式細胞測量術分析

MHC四聚體購買或現場製造且用於在免疫原性分析中量測肽特異性T細胞擴增。對於評定，根據製造商的說明書，在含有1% FCS及0.1%疊氮化鈉之PBS(FACS緩衝液)中將四聚體添加至1×10⁵ 個細胞中。在暗處在室溫下培育細胞20分鐘。隨後添加細胞表面抗體直至製造商建議之最終濃度，且在暗處在4℃下培育細胞20分鐘。藉由諸如CD3及CD8之標記物之存在及諸如CD4、CD11b、CD11c及CD19之標記物之不存在鑑別CD8 T細胞。使用諸如CD44、CD62L、KLRG1、CD127、PD-1、LAG-3及TIM-3之標記物評定細胞表型。細胞用冷FACS緩衝液洗滌且再懸浮於含有1%甲醛之緩衝液中。在FACS Calibur (Becton Dickinson)儀器上獲得細胞，且藉由使用Cellquest軟體(Becton Dickinson)進行分析。為了分析四聚體陽性細胞，淋巴細胞門取自正散射及旁散射圖。CD8 T細胞群體可由表面標記物，諸如中樞記憶體(CD44^hi CD62L^hi )、效應子/效應記憶體(CD44^hi CD62L^lo )、末端效應子(CD44^hi KLRG1+CD127-)或記憶前驅體(CD44^hi KLRG1-CD127+)限定。
實例 11. 藉由誘導抗腫瘤免疫預防腫瘤生長之方法

為了分析由疫苗接種誘導之抗原特異性T細胞之功能，可利用預防性腫瘤模型。簡言之，在不同實驗組中疫苗接種小鼠，且隨後在同一天用腫瘤細胞刺激。減緩或預防腫瘤過度生長之能力用作藉由疫苗接種誘發之T細胞之功能性的量度(圖25-33E)。

五十一隻8-12週齡雌性C57BL/6小鼠(Taconic Biosciences)在到達時隨機地且預期性地分配給處理組。在研究開始之前使動物適應三(3)天。以LabDiet™ 5053無菌嚙齒動物食物飼養動物且隨意提供無菌水。第1組中之動物充當未經處理之對照物。在第-21天及第-7天，在100 μg下以0.1 mL之體積s.c.投與第2組中之動物50 μg不相關肽(亦即，後續腫瘤刺激中未呈現之突變之肽)以及聚I:C中之每一者。在第-21天及第-7天，在100 μg下以0.1 mL之體積s.c.投與第3組中之動物50 μg三個相關增長子肽(Reps1、Adpgk、Irgq)以及聚I:C中之每一者。在第-21天及第-7天，在100 μg下以0.1 mL之體積s.c.投與第4組中之動物莫耳匹配之縮短子肽(Reps1、Adpgk、Irgq)以及聚I:C。在第-21天及第-7天，在100 μg下以0.1 mL之體積s.c.投與第5組中之動物50 μg三個相關增長子肽(Reps1、Adpgk、Irgq)及莫耳匹配之縮短子肽(Reps1、Adpgk、Irgq)以及聚I:C中之每一者。在第0天，小鼠皮下植入有2×10⁵ 個MC38腫瘤細胞。在整個研究中週期性地經由眶後靜脈自動物抽血。稱重動物且每日監測一般健康。若腫瘤達到2000 mm³ ，若腫瘤潰瘍，若動物體重相比於第0天之重量損失＞30%；或若發現動物瀕死，則藉由CO2過度劑量使動物安樂死。在處死時，採集脾臟且使用標準方案加工成單細胞懸浮液。簡言之，經由70 μM過濾器機械降解脾臟，粒化，且在再懸浮於細胞培養基中之前用ACK裂解緩衝液(Sigma)裂解。

表4列出用於投與誘導抗腫瘤免疫之包含新抗原決定基(增長子或縮短子)之肽的例示性方法。

引發劑量及增強之表4之投與方案進一步描述於圖25中。遵循表4中所說明之方法，圖26A-33E顯示增長子之引發及增強免疫提供相比於根據表4中之方法投與時縮短子之引發及增強免疫或縮短子與增長子之混合物之引發及增強免疫提高的抗腫瘤免疫。
實例 10- 免疫方法
表5列出用包含新抗原決定基(縮短子或增長子)免疫以用於誘導抗原特異性T細胞反應之例示性方法。
表6列出研究中使用之增長子及縮短子新抗原
活體內免疫原性分析
引發劑量及增強之表5之投與方案進一步描述於圖34A中。
ELISPOT 分析

進行ELISPOT分析以量測如上文所描述之新抗原之離體T細胞反應。以100 μL將約2×10⁵ 個脾臟細胞與以下抗原池中之10 μM每種肽一起添加至孔中；
增長子刺激池1=Alg8、Adpgk、Irgq
增長子刺激池2=Lama4、Reps1、Obsl1
縮短子刺激池3=Alg8、Adpgk、Irgq
縮短子刺激池4=Lama4、Reps1、Obsl1，
或PMA/離子黴素陽性對照抗原或媒劑。

本發明之特徵在所附申請專利範圍中有細緻闡述。將參考闡述利用本發明之原理及其附圖之說明性實施例之以下具體實施方式獲得對本發明之特徵及優點的較佳理解：

圖1說明包含HLA I類肽結合溝中之第一新抗原決定基之第一肽。第一新抗原決定基中之錨殘基結合至HLA I類分子之對偶基因特異性袋。

圖2說明包含HLA II類肽結合溝中之第二新抗原決定基之第二肽。第二新抗原決定基中之錨殘基結合至HLA II類分子之對偶基因特異性袋。

圖3說明用於包含新抗原決定基之肽之例示性投與方案。上圖描繪投與引發劑量及增長子增強。中間圖描繪投與引發劑量及縮短子增強。下圖描繪投與引發劑量之增長子及縮短子增強。增強劑量在引發劑量之後第7天、第14天及第21天投與。

圖4A-4B顯示在回憶後用短肽增強引發較高T細胞反應。圖4A顯示藉由ELISpot分析來分析的脾臟細胞之對抗原Alg8、Adpgk、Irgq之池的反應性之曲線圖。圖4B顯示藉由ELISpot分析來分析的脾臟細胞對抗原Lama4、Reps1及Obsl1之池的反應性之曲線圖。投與引發及增強劑量根據圖3中描繪之方案進行。

圖5A-5F顯示在根據圖3中所示之方案處理之後的抗原特異性T細胞頻率。****指示p ＜0.0001，且***指示p 0.0005。圖顯示對抗原Alg8 (圖5A)、Lama4 (圖5B)、Adpgk (圖5C)、Reps1 (圖5D)、Irgq (圖5E)及Obsl1 (圖5F)具有特異性的T細胞之頻率。

圖6A-6C描繪當根據圖3中描繪之方案投與時增長子引發/縮短子增強方案產生抗原特異性T細胞之最高頻率。圖顯示T細胞對所有抗原(圖6A)、Alg8及Lama4 (圖6B)及Adpgk、Reps1、Irgq及Obsl1 (圖6C)之頻率。

圖7A-7B顯示在引發或增強時用縮短子免疫對CD8數量之作用(圖7A及7B)。

圖8A-8B顯示在引發或增強時用縮短子免疫提高TE/EM細胞百分比。圖8A顯示代表性流式細胞測量術選通且圖8B顯示CD8 T細胞%之圖表。

圖9A-9B顯示抗原特異性CD8 T細胞為TE/EM細胞。圖9A顯示非抗原特異性之CD8 T細胞%之圖表。圖9B顯示抗原特異性之CD8 T細胞%之圖表。

圖10A-10B顯示藉由僅增長子免疫接種抗原特異性T細胞(圖11B)與總T細胞(圖11A)之末端效應子表型提高。

圖11A-11C顯示增長子引發/縮短子增強免疫在總CD8 T細胞(圖11A)、抗原特異性CD8 T細胞(圖11B)及非抗原特異性CD8 T細胞(指示活化(圖11C))之群體中顯示較高百分比之PD-1+細胞。

圖12A-12B說明TCR親合力(EC50)類似於由縮短子及增長子疫苗接種誘導之CD8T細胞。圖12A描繪在增長子Alg8疫苗接種之後觀測到的TCR親合力。圖12B描繪在縮短子Alg8疫苗接種之後觀測到的TCR親合力。

圖13說明包含新抗原決定基之肽的例示性投與方案。單次增強劑量在投與引發劑量之後21天投與。佐劑希托洛(hiltonol)僅引發劑量及對照條件(第一圖)之增強投與。投與方案可包含僅增長子之引發及增強(第二圖)、增長子及縮短子之合併混合物之引發及增強(第三圖)或增長子之引發劑量及增長子及縮短子之增強(第四圖)。

圖14A-14C描繪在引發及增強中使用縮短子提高Alg8之免疫原性。

圖15A-15C顯示在第21天增強中包括縮短子提高Lama4多聚體+細胞%。

圖16A-16C顯示在增強中使用縮短子提高Reps1之免疫原性。

圖17A-17C顯示在引發及增強中使用縮短子對Irgq之免疫原性之作用。圖表顯示在使用縮短子後免疫原性提高。

圖18顯示使用ELISpot分析針對特異性抗原之反應性分析的脾臟細胞圖表。

圖19顯示在投與引發劑量之後第60天的多聚體+T細胞%。使用縮短子提高第60天的多聚體+T細胞%。

圖20A-20B顯示使用ELISpot分析針對Kif18B (圖20A)及Plod1 (圖20B)之反應性分析的脾臟細胞圖表。

圖21顯示在根據圖13中描繪之投與方案免疫之後5週效應子記憶體及中樞記憶T細胞之比例。

圖22顯示在根據圖13中描繪之投與方案用增長子之引發及增強、縮短子及增長子之引發及增強或增長子之引發劑量及縮短子及增長子之增強免疫之後5週末端效應細胞及記憶前驅體之頻率。

圖23說明包含新抗原決定基之肽的例示性治療投與方案。投與方案可包含增長子之引發劑量及增強(第一圖)、包含用增長子及增長子之增強給藥的集群之引發劑量(第二圖)、縮短子之引發劑量及增強(第三圖)、增長子之引發劑量及縮短子之增強(第四圖)。第一次增強在第一引發劑量(第0天)之後7天投與。第二次增強在第一引發劑量(第0天)之後14天投與。集群給藥(第二圖)可包含在第1天、第2天及第3天之多次連續引發劑量與在第0天之第一引發劑量。對於下文所描述之圖24A-24D，遵循所說明之方案。

圖24A-24D顯示使用ELISpot分析針對Alg8、Adpgk、Irgq增長子池(圖24A)、Alg8、Adpgk、Irgq縮短子池(圖24B)、Lama4、Reps1、Obsl1更長池(圖24C)及Lama4、Reps1、Obsl1縮短子池(圖24D)之反應性分析的脾臟細胞曲線圖。

圖25.說明用於預防腫瘤生長及存活率之包含新抗原決定基之肽的例示性投與方案。投與方案可包含在用腫瘤細胞(第0天)刺激之前21天的引發劑量及在第0天用腫瘤細胞刺激之前7天的增強劑量。對於下文所描述之圖26A-33E，遵循所說明之投與方案。

圖26A說明在圖25中描繪之預防性投與方案之後用腫瘤細胞刺激後10、20及30天的存活率百分比。圖表指示在引發及增強時投與增長子提高存活率。

圖26B為顯示在根據圖25中描繪之方案用增長子之引發及增強劑量、縮短子之引發及增強劑量或增長子及縮短子之引發及增強劑量治療之後腫瘤排斥反應的小鼠數目之圖表。圖表指示在引發及增強時投與增長子提高腫瘤排斥反應。

圖27A-27E顯示未經處理之小鼠(圖27A)、用不相關的肽處理之小鼠(圖27B)、增長子之引發及增強(圖27C)、縮短子之引發及增強(圖27D)或增長子及縮短子之引發及增強(圖27E)的腫瘤體積量測值。投與引發及增強劑量如圖25中所描繪進行。圖表指示在引發及增強時投與增長子提高無腫瘤小鼠數目。

圖28A顯示腫瘤體積之平均量測值。

圖28B顯示在引發及增強時用增長子處理之小鼠中之T細胞反應較高。

圖29A-29C顯示在引發及增強時用增長子免疫產生對Reps1 (圖29A)、Irgq (圖29B)及Adpgk (圖29C)具有特異性的CD8 T細胞之提高的頻率。所遵循之投與方案描繪於圖25中。

圖30A顯示根據圖25中之方案在引發及增強時用增長子預防處理之小鼠中之腫瘤體積之量測值。

圖30B顯示根據圖25中之方案在引發及增強時用增長子預防處理之小鼠中之T細胞反應。

圖31A顯示根據圖25中之方案在引發及增強時用縮短子預防處理之小鼠中之腫瘤體積之量測值。

圖31B顯示根據圖25中之方案在引發及增強時用縮短子預防處理之小鼠中之T細胞反應。

圖32A顯示根據圖25中之方案在引發及增強時用增長子及縮短子之合併混合物預防處理之小鼠中之腫瘤體積之量測值。

圖32B顯示根據圖25中之方案在引發及增強時用增長子及縮短子之合併混合物預防處理之小鼠中之T細胞反應。

圖33A-33E顯示對合併多聚體+細胞百分比具有特異性的T細胞反應之頻率(圖33A)、對Reps1 (圖33B)、Adpgk (圖33C)、Irgq (圖33D)具有特異性的反應及根據圖25中之方案處理之小鼠中之腫瘤不相關抗原Obsl1 (圖33E)。

圖34A說明用於預防腫瘤生長及存活率之包含新抗原決定基之肽的例示性投與方案。投與方案可包含(A)增長子之引發劑量及增強，(B)縮短子之引發劑量及增強或(C)增長子之引發劑量及增長子及縮短子之增強。第一次增強在用引發劑量免疫後7天投與。第二次增強在第一次增強後7天投與。對於下文所描述之圖34B-36，遵循所說明之方案。

圖34B-34E描繪未經處理之小鼠(圖34B)、根據圖34A中所描述之方案用增長子之引發劑量及增強(圖34C)投與、用縮短子之引發劑量及增強投與(圖34D)或用增長子之引發劑量及增長子及縮短子之增強投與(圖34E)的小鼠之腫瘤體積之量測值。引發劑量在相對於腫瘤細胞植入(第0天)天數(-21)投與。對於第0天之腫瘤細胞植入，第一增強劑量在第(-14)天投與且第二增強劑量在第(-7)天投與。圖34B-34E指示在增強時添加縮短子導致較高數目之無腫瘤個體。

圖35A-35C說明在增強時添加縮短子後無腫瘤小鼠中之提高的T細胞反應。圖35A描繪根據圖34A之方案及腫瘤體積之對應變化用增長子之引發及增強投與之小鼠中之T細胞反應。圖35B描繪根據圖34A之方案及腫瘤體積之對應變化用縮短子之引發及增強投與之小鼠中之T細胞反應。圖35C描繪根據圖34A之方案及腫瘤體積之對應變化用增長子之引發劑量及增長子及縮短子之增強投與之小鼠中之T細胞反應。

圖36說明在增強時添加縮短子對負載腫瘤小鼠之存活率之作用。

圖37展現藉由縮短子誘導抗原特異性CD8+ T細胞反應細胞。

圖38展現藉由增長子誘導抗原特異性CD4+ T細胞反應。

Claims

一種組合物，其包含： (a) 包含蛋白質區域之第一新抗原決定基之第一肽及包含相同蛋白質區域之第二新抗原決定基之第二肽， (b) 編碼該第一肽及該第二肽之聚核苷酸， (c) 包含該第一肽及該第二肽之一或多種抗原呈現細胞(APC)，或 (d) 對與HLA蛋白質複合之第一新抗原決定基具有特異性的第一T細胞受體(TCR)及對與HLA蛋白質複合之第二新抗原決定基具有特異性的第二TCR；其中該第一肽與該第二肽不同，及其中該第一新抗原決定基包含突變且該第二新抗原決定基包含相同突變。
如請求項1之組合物，其中該第一肽長度比該第二肽長至少一個胺基酸，且該第二肽為至多13個胺基酸長。
如請求項1之組合物，其中該第二新抗原決定基包含在該第一新抗原決定基內。
如請求項1之組合物，其中該第一肽包含與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99一致性的至少9個或10個連續胺基酸之序列。
如請求項4之組合物，其中該第二肽包含與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99一致性的至少8個或9個連續胺基酸之序列。
如請求項1之組合物，其中該第一新抗原決定基結合至I類HLA蛋白質以形成I類HLA-肽複合物或該第一新抗原決定基結合至II類HLA蛋白質以形成II類HLA-肽複合物。
如請求項6之組合物，其中該第二新抗原決定基結合至II類HLA蛋白質以形成II類HLA-肽複合物或該第二新抗原決定基結合至I類HLA蛋白質以形成I類HLA-肽複合物。
如請求項1之組合物，其中該第一新抗原決定基為藉由APC從該第一肽加工處理之第一新抗原決定基肽，且該第二新抗原決定基為未藉由APC由該第二肽加工處理之第二新抗原決定基肽。
如請求項1之組合物，其中該第一新抗原決定基長度比該第一肽短且該第二新抗原決定基長度與該第二肽相同。
如請求項1之組合物，其中該第二新抗原決定基活化CD8⁺ T細胞。
如請求項1之組合物，其中該第一新抗原決定基及該第二新抗原決定基活化CD8+ T細胞。
如請求項1之組合物，其中該第二新抗原決定基活化CD4⁺ T細胞。
如請求項1之組合物，其中該突變選自由以下組成之群：點突變、剪接位點突變、讀框轉移突變、通讀突變、基因融合突變、插入缺失及其任何組合。
如請求項1之組合物，其中該第一新抗原決定基及該第二新抗原決定基包含由表1或2之基因編碼之序列。
如請求項1之組合物，其中該蛋白質由表1或2之基因編碼。
如請求項1之組合物，其中該突變為表1或2第2行之突變。
如請求項1之組合物，其中該蛋白質為TMRS22::ERG蛋白質、RAS蛋白質或GATA3蛋白質。
一種醫藥組合物，其包含： (a) 如請求項1之組合物；及 (b) 醫藥學上可接受之賦形劑。
一種治療癌症、預防對癌症療法之抗性或誘導免疫反應的方法，該方法包含向有需要之個體投與如請求項18之醫藥組合物。
一種治療癌症、預防癌症、預防對癌症療法之抗性或誘導免疫反應的方法，該方法包含： (a) 向該個體投與至少一次劑量之第一免疫原性組合物，其為包含蛋白質區域之第一新抗原決定基之第一肽；及 (b) 依次向該個體投與至少一次劑量之第二免疫原性組合物，其包含第二肽，該第二肽包含相同蛋白質區域之第二新抗原決定基，其中該第一肽長度比該第二肽長至少一個胺基酸，且該第二肽為至多13個胺基酸長。
如請求項20之方法，其中該方法包含誘導與藉由單獨投與一或多次劑量之該第一免疫原性組合物或一或多次劑量之該第二免疫原性組合物所達成相比增強的免疫反應，由此治療該癌症，預防該癌症或預防對癌症療法之抗性。
如請求項21之方法，其中該方法包含誘導與藉由單獨投與兩次或多於兩次劑量之該第一免疫原性組合物或兩次或多於兩次劑量之該第二免疫原性組合物所達成相比增強的免疫反應，由此治療該癌症，預防該癌症或預防對癌症療法之抗性。
如請求項22之方法，其中該增強的免疫反應包含增加CD8+ T細胞之含量。
如請求項23之方法，其中CD8+ T細胞之TCR結合至包含該第一肽或該第二肽之I類HLA-肽複合物。
如請求項23之方法，其中CD8+ T細胞之TCR結合至包含該第一肽或該第二肽之II類HLA-肽複合物。
如請求項22之方法，其中該增強的免疫反應包含增加CD4+ T細胞之含量。
如請求項26之方法，其中CD4+細胞之TCR結合至包含該第一肽或該第二肽之I類HLA-肽複合物。
如請求項26之方法，其中CD4+ T細胞之TCR結合至包含該第一肽或該第二肽之II類HLA-肽複合物。
如請求項23之方法，其中該CD8+ T細胞為效應子記憶T細胞。
如請求項26之方法，其中該CD4+ T細胞為效應子記憶T細胞。
如請求項22之方法，其中該增強的免疫反應包含將該免疫反應維持與藉由單獨投與一或多次劑量之該第一免疫原性組合物或一或多次劑量之該第二免疫原性組合物所達成者相比更長的持續時間。
如請求項31之方法，其中該增強的免疫反應持續至少1天、2天、5天、10天、20天、1個月、2個月、3個月、6個月或1年。
如請求項20之方法，其中該第一免疫原性組合物進一步包含該第二肽。
如請求項20之方法，其中該第二免疫原性組合物進一步包含該第一肽。
如請求項20之方法，其中該第一新抗原決定基及該第二新抗原決定基包含相同突變。
如請求項20之方法，其中該第一新抗原決定基及該第二新抗原決定基包含相同區域之至少一個胺基酸。
如請求項20之方法，其中該第二肽具有至少8個、9個、10個、11個或12個胺基酸之長度。
如請求項20之方法，其中該第一肽具有至少9個胺基酸之長度。
如請求項20之方法，其中該第二肽包含與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99一致性的至少8個或9個連續胺基酸之序列。
如請求項39之方法，其中該第一肽包含與對應野生型序列具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99一致性的至少9個或10個胺基酸之序列。
如請求項20之方法，其中該第一新抗原決定基比該第二新抗原決定基長。
如請求項20之方法，其中該第二新抗原決定基具有8至13個胺基酸之長度。
如請求項20之方法，其中該第一新抗原決定基具有9至25個胺基酸之長度。
如請求項20之方法，其中步驟(b)之依次投與在步驟(a)之後至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、14、21、25、50、100或200天完成。
如請求項20之方法，其中該方法進一步包含投與1次、2次、3次、4次或5次劑量之該第二免疫原性組合物。
如請求項20之方法，其中該第二免疫原性組合物之劑量少於該第一免疫原性組合物之劑量。
如請求項20之方法，其中該治療包含使腫瘤生長、腫瘤體積、轉移瘤數目、腫瘤復發、治療抗性或其組合降低至大於藉由單獨投與一或多次劑量之該第一免疫原性組合物或一或多次劑量之該第二免疫原性組合物所達成者的程度。
如請求項20之方法，其中該治療包含該個體存活率增強至大於藉由單獨投與一或多次劑量之該第一免疫原性組合物或一或多次劑量之該第二免疫原性組合物所達成者的程度。
一種用於誘導罹患癌症或處於癌症風險下或對癌症療法具有抗性之個體之經增強免疫反應之方法，該方法包含向該個體投與至少一次劑量包含第二肽之第二免疫原性組合物，該第二肽包含蛋白質之第二新抗原決定基，其中該個體先前已投與至少一次劑量包含第一肽之第一免疫原性組合物，該第一肽包含相同蛋白質之第一新抗原決定基，其中該第二肽具有至多13個胺基酸之長度，且其中該第一肽長度比該第二肽長至少一個胺基酸。