JP6840072B2 - Ｔ細胞認識を決定するための手段及び方法 - Google Patents
Ｔ細胞認識を決定するための手段及び方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6840072B2 JP6840072B2 JP2017516628A JP2017516628A JP6840072B2 JP 6840072 B2 JP6840072 B2 JP 6840072B2 JP 2017516628 A JP2017516628 A JP 2017516628A JP 2017516628 A JP2017516628 A JP 2017516628A JP 6840072 B2 JP6840072 B2 JP 6840072B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- cell
- sample
- bcl
- derived
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 title claims description 523
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 129
- 230000005859 cell recognition Effects 0.000 title description 11
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 288
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 108
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 93
- 101100381525 Mus musculus Bcl6 gene Proteins 0.000 claims description 75
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 70
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 67
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 64
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 63
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 54
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 54
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 51
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 50
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 50
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 49
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 41
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 37
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 36
- 230000002424 anti-apoptotic effect Effects 0.000 claims description 25
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 24
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 21
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 21
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 claims description 21
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 20
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 19
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 18
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 16
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 claims description 14
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 claims description 14
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 14
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 14
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 13
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 11
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 11
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 8
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 8
- 102000051485 Bcl-2 family Human genes 0.000 claims description 7
- 108700038897 Bcl-2 family Proteins 0.000 claims description 7
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 claims description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 5
- 208000015943 Coeliac disease Diseases 0.000 claims description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 5
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 5
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 claims description 5
- 244000045947 parasite Species 0.000 claims description 5
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 claims description 4
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 4
- 102000001712 STAT5 Transcription Factor Human genes 0.000 claims description 3
- 108010029477 STAT5 Transcription Factor Proteins 0.000 claims description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 claims description 2
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 claims description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 2
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 claims description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 64
- 102100026596 Bcl-2-like protein 1 Human genes 0.000 description 50
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 46
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 41
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 39
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 37
- 101000687343 Mus musculus PR domain zinc finger protein 1 Proteins 0.000 description 34
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 34
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 33
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 33
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 32
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 27
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 26
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 26
- 239000000047 product Substances 0.000 description 24
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 23
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 21
- 101001056180 Homo sapiens Induced myeloid leukemia cell differentiation protein Mcl-1 Proteins 0.000 description 20
- 102100026539 Induced myeloid leukemia cell differentiation protein Mcl-1 Human genes 0.000 description 20
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 description 19
- 101000971171 Homo sapiens Apoptosis regulator Bcl-2 Proteins 0.000 description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 19
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 18
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 17
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 17
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 17
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 16
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 16
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 16
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 14
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 14
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 14
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 14
- 238000003359 percent control normalization Methods 0.000 description 14
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 11
- 102100024003 Arf-GAP with SH3 domain, ANK repeat and PH domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 10
- 101000975752 Homo sapiens Arf-GAP with SH3 domain, ANK repeat and PH domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 10
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 10
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 10
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 10
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 10
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 10
- 230000004044 response Effects 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 8
- UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N Ecdysone Natural products O=C1[C@H]2[C@@](C)([C@@H]3C([C@@]4(O)[C@@](C)([C@H]([C@H]([C@@H](O)CCC(O)(C)C)C)CC4)CC3)=C1)C[C@H](O)[C@H](O)C2 UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N 0.000 description 8
- 102100030704 Interleukin-21 Human genes 0.000 description 8
- UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N alpha-Ecdysone Natural products C1C(O)C(O)CC2(C)C(CCC3(C(C(C(O)CCC(C)(C)O)C)CCC33O)C)C3=CC(=O)C21 UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N ecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@H]([C@H](O)CCC(C)(C)O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 8
- 108010074108 interleukin-21 Proteins 0.000 description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 8
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 7
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 7
- 102000015617 Janus Kinases Human genes 0.000 description 7
- 108010024121 Janus Kinases Proteins 0.000 description 7
- 102100039640 Rho-related GTP-binding protein RhoE Human genes 0.000 description 7
- 108050007494 Rho-related GTP-binding protein RhoE Proteins 0.000 description 7
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 7
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 7
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 7
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 7
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 7
- 101001007417 Homo sapiens LEM domain-containing protein 2 Proteins 0.000 description 6
- 102100028291 LEM domain-containing protein 2 Human genes 0.000 description 6
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 6
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 6
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 6
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- 238000007482 whole exome sequencing Methods 0.000 description 6
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 5
- -1 CD86 Proteins 0.000 description 5
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 description 5
- 101710145006 Lysis protein Proteins 0.000 description 5
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 5
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 102000015694 estrogen receptors Human genes 0.000 description 5
- 108010038795 estrogen receptors Proteins 0.000 description 5
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 5
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 5
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 5
- DODQJNMQWMSYGS-QPLCGJKRSA-N 4-[(z)-1-[4-[2-(dimethylamino)ethoxy]phenyl]-1-phenylbut-1-en-2-yl]phenol Chemical compound C=1C=C(O)C=CC=1C(/CC)=C(C=1C=CC(OCCN(C)C)=CC=1)/C1=CC=CC=C1 DODQJNMQWMSYGS-QPLCGJKRSA-N 0.000 description 4
- 102100021631 B-cell lymphoma 6 protein Human genes 0.000 description 4
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 4
- 102100028972 HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Human genes 0.000 description 4
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 4
- 101000971234 Homo sapiens B-cell lymphoma 6 protein Proteins 0.000 description 4
- 101000633680 Homo sapiens Tetratricopeptide repeat protein 37 Proteins 0.000 description 4
- 101000671676 Homo sapiens U3 small nucleolar RNA-associated protein 4 homolog Proteins 0.000 description 4
- 101150106931 IFNG gene Proteins 0.000 description 4
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 4
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 4
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 4
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 4
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 102100029210 Tetratricopeptide repeat protein 37 Human genes 0.000 description 4
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 4
- 102100040072 U3 small nucleolar RNA-associated protein 4 homolog Human genes 0.000 description 4
- 238000011467 adoptive cell therapy Methods 0.000 description 4
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 4
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 4
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 4
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 4
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 102100023912 40S ribosomal protein S12 Human genes 0.000 description 3
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 102100032218 Cytokine-inducible SH2-containing protein Human genes 0.000 description 3
- 101710132484 Cytokine-inducible SH2-containing protein Proteins 0.000 description 3
- 102000026633 IL6 Human genes 0.000 description 3
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 description 3
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 description 3
- 108010066979 Interleukin-27 Proteins 0.000 description 3
- 102100036678 Interleukin-27 subunit alpha Human genes 0.000 description 3
- 102000000704 Interleukin-7 Human genes 0.000 description 3
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 3
- 102000034527 Retinoid X Receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010038912 Retinoid X Receptors Proteins 0.000 description 3
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 3
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 238000002619 cancer immunotherapy Methods 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N tetracycline Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 2
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 description 2
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 108010063104 Apoptosis Regulatory Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000010565 Apoptosis Regulatory Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 description 2
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 102100020857 Beta-1,3-glucuronyltransferase LARGE2 Human genes 0.000 description 2
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 102100027943 Carnitine O-palmitoyltransferase 1, liver isoform Human genes 0.000 description 2
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 102000005611 Dysbindin Human genes 0.000 description 2
- 108010045061 Dysbindin Proteins 0.000 description 2
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 101000639726 Homo sapiens 28S ribosomal protein S12, mitochondrial Proteins 0.000 description 2
- 101000682687 Homo sapiens 40S ribosomal protein S12 Proteins 0.000 description 2
- 101001138033 Homo sapiens Beta-1,3-glucuronyltransferase LARGE2 Proteins 0.000 description 2
- 101000859570 Homo sapiens Carnitine O-palmitoyltransferase 1, liver isoform Proteins 0.000 description 2
- 101000575457 Homo sapiens Major facilitator superfamily domain-containing protein 9 Proteins 0.000 description 2
- 101001035259 Homo sapiens Probable E3 ubiquitin-protein ligase HERC4 Proteins 0.000 description 2
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 2
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 2
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 2
- 102100025611 Major facilitator superfamily domain-containing protein 9 Human genes 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 2
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 2
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 2
- 102100039913 Probable E3 ubiquitin-protein ligase HERC4 Human genes 0.000 description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 2
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 108010075383 Suppressor of Cytokine Signaling Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000008036 Suppressor of Cytokine Signaling Proteins Human genes 0.000 description 2
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 2
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 description 2
- 102100038313 Transcription factor E2-alpha Human genes 0.000 description 2
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000002223 anti-pathogen Effects 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 201000010240 chromophobe renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 208000032852 chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 108010057988 ecdysone receptor Proteins 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 2
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 2
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 210000001700 mitochondrial membrane Anatomy 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 210000003720 plasmablast Anatomy 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 2
- 208000015347 renal cell adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000013515 script Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 210000004500 stellate cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 description 2
- SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N (4s,4ar,5s,5ar,6r,12ar)-4-(dimethylamino)-1,5,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4a,5,5a,6-tetrahydro-4h-tetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@H](C)[C@@H]([C@H](O)[C@@H]3[C@](C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@H]3N(C)C)(O)C3=O)C3=C(O)C2=C1O SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N 0.000 description 1
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 108091007065 BIRCs Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102100034798 CCAAT/enhancer-binding protein beta Human genes 0.000 description 1
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 1
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 241000255601 Drosophila melanogaster Species 0.000 description 1
- 206010015108 Epstein-Barr virus infection Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100028976 HLA class I histocompatibility antigen, B alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 108010058607 HLA-B Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010068250 Herpes Simplex Virus Protein Vmw65 Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 1
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 1
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 1
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 1
- 101000945963 Homo sapiens CCAAT/enhancer-binding protein beta Proteins 0.000 description 1
- 101001019455 Homo sapiens ICOS ligand Proteins 0.000 description 1
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101001051730 Homo sapiens Keratin-associated protein 4-11 Proteins 0.000 description 1
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 1
- 102100034980 ICOS ligand Human genes 0.000 description 1
- 102000055031 Inhibitor of Apoptosis Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102220474932 Insulin-like 3_P49S_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 102100024904 Keratin-associated protein 4-11 Human genes 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 102000000909 LEM domains Human genes 0.000 description 1
- 108050007943 LEM domains Proteins 0.000 description 1
- 108010066345 MHC binding peptide Proteins 0.000 description 1
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 1
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102100025169 Max-binding protein MNT Human genes 0.000 description 1
- 206010027480 Metastatic malignant melanoma Diseases 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- PJYYBCXMCWDUAZ-YKDQUOQBSA-N Ponasterone A Natural products O=C1[C@H]2[C@@](C)([C@@H]3C([C@@]4(O)[C@@](C)([C@H]([C@@](O)([C@@H](O)CCC(C)C)C)CC4)CC3)=C1)C[C@H](O)[C@H](O)C2 PJYYBCXMCWDUAZ-YKDQUOQBSA-N 0.000 description 1
- 108010090931 Proto-Oncogene Proteins c-bcl-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000013535 Proto-Oncogene Proteins c-bcl-2 Human genes 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 101150043341 Socs3 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 1
- 108010048999 Transcription Factor 3 Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000887 Transcription factor STAT Human genes 0.000 description 1
- 108050007918 Transcription factor STAT Proteins 0.000 description 1
- 102000001742 Tumor Suppressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010040002 Tumor Suppressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 239000003875 Wang resin Substances 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NERFNHBZJXXFGY-UHFFFAOYSA-N [4-[(4-methylphenyl)methoxy]phenyl]methanol Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1COC1=CC=C(CO)C=C1 NERFNHBZJXXFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- USDJGQLNFPZEON-UHFFFAOYSA-N [[4,6-bis(hydroxymethylamino)-1,3,5-triazin-2-yl]amino]methanol Chemical compound OCNC1=NC(NCO)=NC(NCO)=N1 USDJGQLNFPZEON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 102000006707 alpha-beta T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010087408 alpha-beta T-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000006909 anti-apoptosis Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- FIVPIPIDMRVLAY-UHFFFAOYSA-N aspergillin Natural products C1C2=CC=CC(O)C2N2C1(SS1)C(=O)N(C)C1(CO)C2=O FIVPIPIDMRVLAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003190 augmentative effect Effects 0.000 description 1
- 210000003445 biliary tract Anatomy 0.000 description 1
- 201000000053 blastoma Diseases 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000011748 cell maturation Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 208000006990 cholangiocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 229960003722 doxycycline Drugs 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 201000008184 embryoma Diseases 0.000 description 1
- 230000000763 evoking effect Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 1
- 210000001102 germinal center b cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000012178 germinal center formation Effects 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000037041 intracellular level Effects 0.000 description 1
- 238000011246 intracellular protein detection Methods 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000005415 magnetization Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000021039 metastatic melanoma Diseases 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000006667 mitochondrial pathway Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000036438 mutation frequency Effects 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 230000036281 parasite infection Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000000861 pro-apoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 102000037983 regulatory factors Human genes 0.000 description 1
- 108091008025 regulatory factors Proteins 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 108010092841 ribosomal protein S12 Proteins 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 108700020534 tetracycline resistance-encoding transposon repressor Proteins 0.000 description 1
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 1
- 108091006107 transcriptional repressors Proteins 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
- G01N33/5047—Cells of the immune system
- G01N33/5052—Cells of the immune system involving B-cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/00119—Melanoma antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4612—B-cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
- A61K39/4622—Antigen presenting cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/46449—Melanoma antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
- G01N33/5047—Cells of the immune system
- G01N33/505—Cells of the immune system involving T-cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
- G01N33/56977—HLA or MHC typing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
- A61K2239/57—Skin; melanoma
Description
本発明は、生物学及び医薬品の分野に関する。
T細胞応答は、哺乳動物免疫系において重要な役割を果たす。例えば、CD8+細胞障害性T細胞(CTL)は、病原体に感染した細胞及び腫瘍細胞に対抗するのに重要な役割を果たす。免疫応答はまた、CTLを活性化して、抗体産生B細胞の成熟を誘導する、例えばインターフェロンガンマ(通常、IFN-γ又はIFNgと略記)、腫瘍壊死因子アルファ(TNF-α)及びインターロイキン2(IL-2)等の多重エフェクターサイトカインの産生を介して、CD4+ヘルパーT細胞により誘発される。腫瘍治療に関してますます検討されている養子細胞療法は、in vivoで起きるT細胞応答を利用している。この療法中、腫瘍特異的T細胞を患者から単離して、ex vivoで培養する。続いて、腫瘍特異的T細胞を、好ましくは免疫調節性細胞を排除するために化学療法誘導性リンパ球枯渇(lymphodepletion)後に患者へ再導入させて、抗腫瘍応答の増加をもたらす。例えば、Rosenberg等、2011は、IL-2を併用した自己CD8+CTL含有腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の養子移入による転移性黒色腫患者の治療について記載する。高い応答率が観察され、この研究では、黒色腫患者の22%が、完全な腫瘍退縮を達成した。Tran等、2014は、上皮がんの免疫療法について記載する。CD4+T細胞を患者から入手して、腫瘍特異的突然変異を有するペプチドを提示する自己樹状細胞(DC)と共にインキュベートした。1つの腫瘍特異的突然変異に特異的なT細胞クローンが見出されており、患者へのこれらのT細胞の注入は、腫瘍退縮及び疾患の安定化の延長をもたらした。
樹状細胞は、プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)であり、それらは、主要組織適合複合体I又はII(MHC-I又はMHC-II)の状況で抗原を提示するのに特に適している。したがって、DCは、T細胞エピトープを提示して、所望の特異性を有するT細胞を同定するための第1の選択肢の細胞である。しかしながら、成熟DCは、長期培養で増殖させることができないため、単球は、個体の大量の血液又は骨髄から新たに入手しなくてはならず、短命なDC培養物は、所与のT細胞選択手順が実施可能になる前に、毎回調製されなくてはならない。これは、時間がかかり、高価であり、個体に著しい不快感を与える。
Christopherson, K.S.等 PNAS 89、6314〜8頁(1992)
Guzman, L.M.等 Bacteriol 177、4121〜4130頁(1995)
本発明の目的は、T細胞がT細胞エピトープを認識するかどうかを決定するための最適化された方法を提供することである。
したがって、本発明の一態様は、T細胞がT細胞エピトープを認識するかどうかを決定する方法であって、
- 少なくとも1つのB細胞において、BCL6の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程、
- 前記少なくとも1つのB細胞において、抗アポトーシス核酸の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程、
- 前記少なくとも1つのB細胞の、B細胞培養物への増殖を可能にする工程、
- 前記B細胞培養物のB細胞を、少なくとも1つの化合物と共にインキュベートする工程、
- 得られたB細胞を、T細胞と共にインキュベートする工程、及び
- 少なくとも1つのT細胞が、前記少なくとも1つの化合物の少なくとも1つのT細胞エピトープを認識するかどうかを決定する工程
を含む方法を提供する。
- 少なくとも1つのB細胞において、BCL6の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程、
- 前記少なくとも1つのB細胞において、抗アポトーシス核酸の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程、
- 前記少なくとも1つのB細胞の、B細胞培養物への増殖を可能にする工程、
- 前記B細胞培養物のB細胞を、少なくとも1つの化合物と共にインキュベートする工程、
- 得られたB細胞を、T細胞と共にインキュベートする工程、及び
- 少なくとも1つのT細胞が、前記少なくとも1つの化合物の少なくとも1つのT細胞エピトープを認識するかどうかを決定する工程
を含む方法を提供する。
本発明による方法の興味深い用途の1つは、T細胞エピトープに関するスクリーニングアッセイである。この実施形態では、まず、in vitroでのB細胞培養物を得る。次に、この培養物由来のB細胞を、潜在的なT細胞エピトープであるか、又は潜在的なT細胞エピトープをコードする試験化合物と共にそれらをインキュベートすることにより、抗原提示細胞として使用し、その結果、潜在的なT細胞エピトープが、MHCの状況でB細胞表面に表示される。続いて、T細胞が潜在的なT細胞エピトープのいずれかを認識するかどうかを試験するために、負荷されたB細胞をT細胞と共にインキュベートする。これは、例えば、T細胞が試験エピトープのいずれかに結合されるかどうかを決定することにより試験される。好ましくは、T細胞活性化が測定される。例えば、T細胞がサイトカインを産生するかどうかを試験すること、又はT細胞が増殖するかどうかを試験すること等のT細胞活性化を決定する各種方法が、当該技術分野で公知である。腫瘍特異的T細胞が探索される場合、多くの腫瘍特異的T細胞が、IFNgを産生するため、インターフェロンガンマ放出が測定されることが好ましい。試験エピトープがT細胞により認識される場合、それは通常、更なる研究のために、例えば、免疫原性組成物若しくはワクチンの開発のために、及び/又は当該エピトープの存在に関連付けられる疾患に対してT細胞応答を誘発若しくはブーストするために選択される。一実施形態では、このようなT細胞応答は、例えばがん又は病原性感染等の前記エピトープの存在に関連付けられる疾患に罹患しているか又は罹患する危険性のある個体へのエピトープの投与により、in vivoで誘発又はブーストされる。或いは、本発明による方法を用いて同定されたT細胞エピトープに対するT細胞応答は、好ましくは、前記エピトープの存在に関連付けられる疾患に罹患しているか又は罹患する危険性のある個体由来のT細胞を使用して、in vitroで誘発され、その後、T細胞は培養されて、続いて、前記疾患に対する医薬又は予防剤として個体へ投与される。
本発明による方法の別の用途は、公知のT細胞エピトープに対するT細胞の存在に関するスクリーニングアッセイである。この実施形態では、上述のB細胞培養物由来のB細胞を、1つ又は複数の公知のT細胞エピトープと共にインキュベートする。同様に、T細胞エピトープが、MHCの状況でB細胞表面に表示される。次に、エピトープで負荷されたB細胞を試料由来のT細胞と共にインキュベートして、その試料がT細胞エピトープの1つ又は複数を認識するT細胞を含有するかどうかを試験する。それに該当するようであれば、例えば、試料を得た個体(の少なくとも1人)が、試験したT細胞エピトープの少なくとも1つに対して、in vivoでT細胞応答を示すと結論付けることができる。これは、例えば、ある特定の治療又はワクチン接種手順が成功したことを意味し得る。
本明細書で使用する場合、T細胞エピトープは、MHC分子により結合され、且つT細胞により、例えばCD8+CTL又はCD4+ヘルパーT細胞等により認識される能力を有するアミノ酸配列を意味する。
本発明で使用される場合の化合物は通常、アミノ酸残基又はアミノ酸残基をコードする核酸配列を含む。前記化合物は、好ましくはタンパク質若しくは(ポリ)ペプチド、又はタンパク質若しくは(ポリ)ペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子である。化合物は通常、1つ又は複数の公知のT細胞エピトープを含むか、或いはそれは、1つ又は複数のT細胞エピトープの存在に関して試験される。好ましくは、前記化合物は、タンパク質又は(ポリ)ペプチドである。
本明細書で使用する場合、「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸並びに非天然又は人工アミノ酸を包含する。
本明細書で使用する場合、「核酸分子」及び「核酸配列」という用語は、ヌクレオチド鎖、好ましくはDNA又はRNAを指す。他の実施形態では、核酸分子は、例えば、DNA/RNAヘリックス、ペプチド核酸(PNA)、ロックド核酸(LNA)及び/又はリボザイム等の他の種類の核酸構造を含む。
本明細書で使用する場合、T細胞は、それがMHCの状況でエピトープに特異的に結合する場合に、T細胞エピトープを「認識する」。これは、前記T細胞が他の抗原よりも前記エピトープを優先的に結合することを意味する。T細胞は通常、そのT細胞受容体(TCR)を介してT細胞エピトープを結合する。T細胞の、ある特定の化合物への非特異的な結合又は固着は、「認識している」という用語に包含されない。
B細胞を、化合物と共に、又はT細胞と共に「インキュベートすること」という用語は、B細胞と化合物又はT細胞との間で相互作用が可能になるような十分長い時間、B細胞を化合物又はT細胞に曝露することを意味する。通常、前記化合物がペプチドである場合、インキュベーション時間は、タンパク質に関するインキュベーション時間よりも大幅に短くてよい。タンパク質はまず、タンパク質由来のペプチドがB細胞の表面に表示される前に、B細胞によりプロセシングされなくてならないのに対して、ペプチドは通常、内在化(internalization)及びプロセシングの必要性なく、B細胞のMHC分子を直接的に結合することができる。一実施形態では、B細胞をペプチドと共に、約15〜25時間、好ましくは約18〜24時間インキュベートする。次に、ペプチドを負荷したB細胞を好ましくは、T細胞と共に、約5〜50時間、好ましくは約6〜48時間インキュベートする。前記化合物が、タンパク質又は(ポリ)ペプチドをコードする核酸分子である場合、B細胞は、前記核酸分子で形質導入又はトランスフェクトされて、前記核酸分子の翻訳及び前記コードタンパク質又は(ポリ)ペプチドの細胞内産生をもたらす。核酸分子によるB細胞の形質導入又はトランスフェクションは、当該技術分野で一般的に公知の方法を用いて達成することができる。このような方法として、ウイルスベクター粒子媒介性形質導入、マイクロインジェクション、並びにリン酸カルシウム沈殿、リポソーム、ポリカチオン、マグネトフェクション及びエレクトロポレーションに基づく方法等の標準的な核酸トランスフェクション方法が挙げられるが、それらに限定されない。
本発明による方法の重要な利点は、数週、数か月又は更には数年を含む長期間維持することができるin vitroでのB細胞培養物を使用するという事実である。APCが必要とされる毎に、スクリーニングアッセイのために、B細胞をこのようなB細胞培養物から採取することができる。したがって、B細胞のみを一度個体から収集する必要があり、その後、それらは培養状態のまま維持され、続くアッセイに利用可能な状態に維持される。これは、樹状細胞の使用を上回る重要な利点である。
更に、本発明者等は、驚くべきことに、本発明の方法を用いると、試験エピトープ以外のエピトープに対するT細胞活性化(バックグラウンドシグナル又はバックグラウンドノイズ)が特に低いことを発見したので、本発明による方法は、高い感度でT細胞エピトープ認識の検出を可能にする。これは、例えば、エプスタインバーウイルス(EBV)不死化B細胞を抗原提示細胞として使用する場合の結果と対比する。例えば、図4では、高レベルのバックグラウンドシグナルに起因して、ドット(APCとしてEBV不死化B細胞を使用したT細胞活性化)のどれが関連するかどうかを確立することは非常に困難である。他方で、本発明による方法を用いて得られるT細胞活性化シグナル(三角)は、低い(又は更には存在しない)バックグラウンドノイズの結果としてはっきりと検出可能である。したがって、バックグラウンドシグナル伝達が非常に低いため、関連するT細胞エピトープが即座に明らかとなるため、シグナルが弱い場合でさえ、本発明による方法は、T細胞エピトープに関する遥かにより正確で、且つ感度の高いスクリーニング方法を提供する。このような弱いシグナルは、例えば、比較的低い程度のT細胞活性化により引き起こされ得るか、又は少数のエピトープを認識するT細胞が、アッセイ中に存在し得る。EBV不死化B細胞が使用される従来技術の既存の方法では、多くの関連するシグナルは、それらが大きなバックグラウンドノイズと区別することができないために見逃されているのに対して、本発明による方法では、関連するT細胞エピトープは、より良好に検出される。
長期間にわたりin vitroで培養されるB細胞が使用されるため、本発明による方法を用いて得られる特に良好な結果及び低いバックグラウンドノイズは驚くべきことである。これらのB細胞は、「形質芽細胞様状態」で残存し、in vitroでのB細胞が、複製すること及び抗体産生の両方が可能であることを意味する。自然の状況では、形質芽細胞は、in vivoではほんの短命である。抗体は通常、それらの増殖する能力を失っている形質細胞へ分化されたB細胞により産生される。したがって、本発明で使用する長期間の「形質芽細胞様培養物」は、実際には存在しない特有の細胞である。これらの細胞は、非天然特性を有する。例えば、それらのサイズは、天然のin vivoでの形質芽細胞と比較した場合により大きく、それらは、CD40、CD80、CD86、ICOSLのような共刺激分子を高度に発現する。したがって、このような非天然B細胞をT細胞と共にインキュベートする場合、バックグラウンドノイズが予想された。しかしながら、驚くべきことに、本発明による方法は、このような低いバックグラウンドノイズを含むため、非常に感度の高いアッセイが可能となった。
したがって、非天然環境中に存在し、且つB細胞の特徴に影響を及ぼす非天然処理を受けたin vitroでの培養B細胞が使用されるため、非常に低いレベルのバックグラウンドノイズは驚くべきことである。更に、好ましい実施形態では、B細胞は、多くの場合、例えば、緑色蛍光タンパク質等の非天然検出可能標識を含有する1つ又は複数の外因性核酸分子を含有する。したがって、in vitroでの得られたB細胞は、それらの天然の対応物とは異なり、試験アッセイの投与エピトープとは独立してT細胞を活性化すると予想された。けれども、本発明による方法を用いると、バックグラウンドノイズは、驚くべきことに、非常に感度の高い試験アッセイが利用可能となっているような程度に回避される。したがって、本発明による方法は、長寿命であり、個体から一度入手されれば十分であるB細胞を使用して、T細胞エピトープのT細胞認識に関する非常に感度の高く、正確で単純なスクリーニングアッセイを可能にするため、既存の従来技術の方法よりも好ましい。単球の収集の繰り返し、及びDCへのこれらの細胞の分化はもはや必要ではなく、それにより、処理時間、費用及び個体の不快感の程度が低減される。
本発明による方法の更なる利点は、アッセイで使用される長期間の「形質芽細胞様」B細胞が、in vivoにおけるそれらの天然の対応物よりも大きいことである。これは、より多くのMHCがB細胞の表面に存在し、その結果、より多数のエピトープが表示され得ることを意味する。これはまた、本発明のアッセイの感度を増加させる。
B細胞は、以前は抗原提示細胞として使用されてきた。例えば、Schultze等は、黒色腫特異的T細胞を生成するために、CD40活性化B細胞が、健常な個体由来のT細胞へ、黒色腫由来のペプチドを提示するためにAPCとして使用される方法を記載している。しかしながら、健常な個体由来のT細胞をT細胞エピトープと共にインキュベートすることによる抗原特異的T細胞の生成は、上述の感度の懸念を包含しない。目的のT細胞の低濃度の検出が問題である場合、本発明によるスクリーニング方法は、特に有利である。
各種の化合物が、本発明によるスクリーニング方法における使用に適している。例えば、B細胞により内在化されて、プロセシングされたタンパク質を使用してもよく、次に、ペプチド断片が、それらの表面で表示される。T細胞がこのようなペプチドを結合して、活性化されるようになる場合、前記タンパク質は、T細胞により認識されるT細胞エピトープを含むと結論付けられる。
好ましい実施形態では、B細胞をペプチドと共にインキュベートする。これは、ペプチドの少なくとも幾つかが、B細胞の表面MHCに直接結合されて、その結果、B細胞による内部プロセシングがこれらのペプチドに必要ではないという利点を提供する。これは、より速いエピトープ提示、したがってより短いアッセイ時間を可能にする。本発明の培養B細胞は通常、MHCと複合して、それらの表面ですでにペプチドを表示するが、これらのMHC結合性ペプチドの多くは、投与エピトープにより容易に置き換えられ、T細胞活性化に関して続いて試験されるMHC-試験ペプチド複合体をもたらす。
効率的なT細胞認識を可能にするために、前記ペプチドは好ましくは、5から40の間のアミノ酸、好ましくは5から35の間のアミノ酸、より好ましくは8から35の間のアミノ酸又は9から31の間のアミノ酸又は10から31の間のアミノ酸又は11から31の間のアミノ酸又は8から20の間のアミノ酸又は9から20の間のアミノ酸又は10から20の間のアミノ酸又は11から20の間のアミノ酸又は8から15の間のアミノ酸又は8から12の間のアミノ酸又は8から11の間のアミノ酸の長さを有し、効率的なMHC結合及び表面提示を可能にする。当業者により周知であるように、MHCクラスIにより提示されるT細胞エピトープは通常、8から11の間のアミノ酸の長さを有するのに対して、MHCクラスIIにより提示されるT細胞エピトープは通常、11から20の間のアミノ酸の長さを有する。したがって、類似の長さを有する試験ペプチドは、これがMHC結合を促進するため有利である。しかしながら、実施例で示されるように、より長いペプチドはまた、潜在的なT細胞エピトープを試験するのに適している。このようなより長いペプチドは、内在化されて、且つB細胞によりプロセシングされるか、又はMHCに直接結合される。MHC-IIは、より大きなペプチドと結合しそれを提示させることが特によくできる。したがって、より長いペプチドは、CD4+T細胞エピトープ認識を試験するのに特に適している。
本明細書で使用する場合、数的範囲は、当該範囲の上限値及び下限値を含む。したがって、「xからyの間のアミノ酸の長さを有するペプチド」という用語は、x個のアミノ酸の長さを有するペプチド、及びy個のアミノ酸の長さを有するペプチド、並びにこれらの値の間の長さを有するペプチドを包含する。
或いは、タンパク質又は(ポリ)ペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子を使用することができる。その場合、B細胞を前記核酸分子で形質導入又はトランスフェクトして、前記核酸配列の翻訳及び前記コードタンパク質又はポリ(ペプチド)の細胞内産生をもたらす。このようなタンパク質及びこのようなペプチドの断片は、任意にB細胞によりプロセシングされた後に、B細胞表面で表示される。
種々の試験エピトープのT細胞認識を試験することが可能であるために、前記B細胞を、好ましくは種々の種類のペプチドと共に、又は種々の種類のペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子と共に、好ましくは少なくとも2個、少なくとも3個又は少なくとも4個の異なるペプチド若しくはコード核酸配列、好ましくはペプチドと共にインキュベートすることが好ましい。更なる実施形態では、前記細胞を、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個又は少なくとも10個の異なるペプチド又はコード核酸配列、好ましくはペプチドと共にインキュベートする。種々のエピトープ間を区別することが可能であるために、B細胞は好ましくは、空間的にアドレス可能な位置に存在する。各位置で、1つ又は複数の化合物がB細胞へ投与される。T細胞認識が、ある特定の位置で存在するようである場合、どのエピトープが認識されるかどうかを決定することができる。一実施形態では、幾つかのタンパク質又はペプチド混合物が使用される。例えば、B細胞は、種々のウェル中に存在し、各ウェルを種々のタンパク質/ペプチド混合物と共にインキュベートする。続いて、1つのウェル中で、T細胞認識が行われるようである場合、当該特定のウェルの混合物のタンパク質及び/又はペプチドは通常、どのエピトープが認識されるかどうかを決定するために、続いて個別に試験される。T細胞認識がある特定のウェル中で存在しない場合、当該ウェルへ投与された混合物全体を無視することができる。
T細胞エピトープのT細胞認識は、当該技術分野で公知の各種方法で測定することができる。1つの好ましい方法は、T細胞活性化の測定である。エピトープの認識時に、T細胞は通常、活性化されるようになり、それは例えば、インターフェロンガンマ放出の程度を決定することにより測定可能である。したがって、本発明の一実施形態では、好ましくはT細胞によるサイトカイン放出を測定することにより、T細胞が活性化されるかどうかを決定することにより、前記T細胞が少なくとも1つのエピトープで認識されたかどうかが決定される。一実施形態では、インターフェロンガンマ放出が測定される。
一実施形態では、本発明による化合物を負荷したB細胞(好ましくは、タンパク質を負荷、ペプチドを負荷、又は核酸分子を負荷したB細胞)を、CD8+CTLと共にインキュベートする。更なる実施形態では、本発明による化合物を負荷したB細胞を、CD4+ヘルパーT細胞と共にインキュベートする。
CD8+CTLは、腫瘍細胞、並びに病原体により感染される細胞に対抗するのに重要な役割を果たす。通常、CD8+CTLの特異性は、Davis等, 2011に記載されるように、例えばペプチド-MHC-I多量体等の非細胞性ペプチド-MHC-I複合体を使用して試験することができる。ペプチドを負荷したMHCに対するT細胞受容体(TCR)の親和性がとても低く、その結果単一のペプチド-MHC複合体は、試験アッセイを実施するのに十分な強度でT細胞を結合することが不可能であるため、ペプチド-MHC多量体が使用される。Davis等, 2011に記載されるように、本発明者等の一人により開発されている紫外線(UV)感受性ペプチドを有するMHC多量体、通常四量体が使用されることが好ましい。これらのUV感受性ペプチドは、UV光により切断され、その後、得られたMHC多量体に試験ペプチドを負荷して、T細胞結合アッセイに使用する。
ペプチド-MHC多量体は、CD8+T細胞結合アッセイを実施するための良好なツールを提供するが、これらの多量体は、必ずしも適切であるわけではない。例えば、ペプチド-MHC多量体を用いる場合、試験ペプチドへのT細胞の結合のみを決定することができる。例えば活性化等のこれらのT細胞の生物活性は、これらの多量体を用いて試験されない。更に、MHC多量体は、各MHC対立遺伝子に利用可能ではない。したがって、ある特定の個体が、集団中に一般的に存在しないMHC対立遺伝子を発現するようである場合、これらの珍しいMHC対立遺伝子の多量体は通常、利用可能ではない。このような場合、このような個体のT細胞の結合特性は、既存のMHC多量体を用いて測定することができない。
したがって、CD8+T細胞の生物活性が研究されるべきである場合、又は珍しいMHC-I対立遺伝子を有する個体由来のT細胞が試験される場合、ペプチド-MHC多量体は通常、不適切である。したがって、B細胞がT細胞用のAPCとして使用される本発明による方法が好ましい。
更に、本発明による方法はまた、CD4+T細胞を試験するのに好ましい。in vivoで、CD4+ヘルパーT細胞は、多重エフェクターサイトカインの産生を介して抗病原体応答及び抗腫瘍応答を誘発し、それらは、CTLを活性化して、抗体産生B細胞の成熟を誘導する。がん患者の養子細胞療法に関して、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を使用することが好ましい。通常、TILでは、CD4+T細胞の比率が、CD8+CTLの比率よりも高い。したがって、CD4+T細胞エピトープの調査は、養子細胞療法のための重要な応用である。CD4+細胞の使用は、これが、有効なT細胞応答を提供するのに対して、リンパ球枯渇の必要性が、CD8+CTLの使用と比較した場合に減少するため有利である。同様に、医薬又はワクチンにおけるCD4+T細胞エピトープの使用は、このような医薬又はワクチンが通常、個体において有効な免疫応答を誘発するため有利である。したがって、CD4+T細胞エピトープ認識の決定は、好ましい実施形態である。しかしながら、ペプチド結合部位が唯一のポリペプチドから構成されるMHC-I分子とは対照的に、MHC-II分子は、2つの異なるポリペプチドから構成されるペプチド結合部位を有するので、UV感受性の交換可能なペプチドを有するMHCクラスII多量体の産生は、ペプチド-MHC-I多量体の産生よりも困難である。ペプチド-MHC-II多量体は、一般的に利用可能でないため、また同様に、ペプチド-MHC-II多量体は、T細胞活性化を決定するのに使用することができないという事実を考慮して、またMHC-IIは、ある特定の種類の細胞でのみ発現されるという事実を考慮して、B細胞がCD4+T細胞エピトープ認識を試験するのにAPCとして使用される本発明による方法が、特に好ましい実施形態である。
1つの特定の実施形態は、前記少なくとも1つのB細胞及び前記T細胞が同じヒト個体由来である本発明による方法を提供する。この実施形態では、ある特定のエピトープのT細胞認識が、ある特定の障害に対する医薬としてT細胞を使用する目的で試験される場合に特に有利である。興味深い用途の1つは、養子細胞療法である。疾患を患う患者は多くの場合、疾患に対する免疫応答を示す。がんの場合、このような免疫応答は通常、腫瘍中に存在するタンパク質突然変異に向けられるが、個体の元の健常組織には向けられず、その結果、突然変異は、非自己として認識される。このような突然変異を本明細書では「腫瘍特異的突然変異」又は「腫瘍特異的アミノ酸配列」と称し(同種のアミノ酸配列は、同様に他の疾患又は病原体でも生じ得るが)、得られた抗原を通常、「修飾自己抗原」と称する。更に、「疾患特異的T細胞エピトープ」は、個体におけるその存在が疾患と関連付けられるT細胞エピトープとして本明細書で定義される。疾患特異的T細胞エピトープは例えば、病原体の表面タンパク質由来のT細胞エピトープを含む。同種のT細胞エピトープは、各種疾患又は病原体で生じ得るが、通常、個体の健常組織中に存在しないか、又はかなり低い程度で存在する。
しかしながら、個体の免疫応答は多くの場合、例えば回避機序及び/又は免疫調節性細胞に起因して、疾患に対抗するのに十分ではない。このような場合、患者由来のT細胞は好ましくは、本発明による方法で試験される。同じ患者由来のB細胞を使用する場合、自己B細胞は、同種B細胞と比較した場合にT細胞にとってあまり免疫原性ではないので、バックグラウンドシグナルは更に低減される。したがって、養子細胞療法に関して、患者由来のB細胞は、腫瘍特異的又は病原体特異的アミノ酸配列等の疾患特異的T細胞エピトープを含むか、又はコードする化合物と共にインキュベートすることが好ましく、T細胞認識は、同じ患者由来のT細胞を使用して試験される。
このような疾患特異的エピトープを認識するT細胞は、好ましくはin vitroで増殖させて、続いて、患者へ投与して、それは、例えば、抗腫瘍又は抗病原体T細胞応答をもたらす。或いは、又は更に、患者の免疫系をブーストするために、患者のT細胞により認識される疾患特異的T細胞エピトープを患者に投与して、免疫応答の増強をもたらす。このような疾患特異的T細胞エピトープは、それ自体として、又は例えばオリゴペプチド、タンパク質、エピトープ-担体複合体、若しくはエピトープ-MHC複合体等のより大きな複合体の一部として投与されてもよい。一実施形態では、このような疾患特異的T細胞エピトープは、抗原提示細胞、好ましくは、本発明による方法で調製されるようなB細胞培養物由来のB細胞に結合される。このようなAPCの投与は、in vivoで抗腫瘍応答を誘発又はブーストする。
1つの好ましい実施形態は、前記T細胞エピトープが修飾自己抗原由来である本発明による方法を提供する。前記T細胞エピトープは好ましくは、腫瘍特異的アミノ酸配列を含む。前記腫瘍は、任意の種類の腫瘍であり得る。好ましい例は、黒色腫、上皮がん、肺扁平上皮癌、肺腺癌、胃がん、食道がん、肺小細胞癌、結腸直腸がん、膀胱がん、子宮がん、子宮頸がん、肝臓がん、頭部及び頸部がん、腎明細胞がん、B細胞リンパ腫、腎乳頭がん、乳がん、膵臓がん、骨髄腫、卵巣がん、前立腺がん、神経膠芽腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、髄芽腫、CLL、嫌色素性腎細胞癌、甲状腺がん、ALL、AML及び毛様細胞性星状細胞腫である。好ましくは、前記T細胞エピトープは、黒色腫特異的エピトープ又は上皮がん特異的エピトープである。また、B細胞が、がん、好ましくは黒色腫又は上皮がんに罹患しているか又は罹患していた個体由来のT細胞と共にインキュベートされる本発明による方法が提供される。
別の好ましい実施形態は、前記T細胞エピトープが、非自己抗原由来、好ましくは病原体由来である本発明による方法を提供する。前記病原体は、これらの病原体が通常、in vivoで細胞媒介性免疫応答を起こすため、好ましくは、ウイルス、細菌又は寄生虫である。一実施形態では、例えば、ある特定の病原体に対するT細胞ワクチンを開発するために、ペプチドは、前記病原体の表面タンパク質の配列に基づいて産生される。本明細書で記載するようなB細胞培養物由来のB細胞を、これらのペプチドと共に、続いてT細胞と共にインキュベートする。好ましくは、先に前記病原体へ曝露された個体由来であるT細胞が使用され、その結果、メモリーT細胞が存在する。1つ又は複数の試験ペプチドが、T細胞により認識されるようである場合、これらのペプチドは、前記病原体に対するワクチンに関する候補物である。同様に、本発明によるこのようなスクリーニング方法の感度が重要である。
したがって、B細胞が、病原体、好ましくはウイルス、細菌又は寄生虫に罹患しているか又は罹患していた個体由来のT細胞と共にインキュベートされる本発明による方法もまた提供される。
別の好ましい実施形態は、前記T細胞エピトープが自己抗原由来である本発明による方法を提供する。これは、このようなT細胞エピトープが、個体において天然に存在するタンパク質(又は核酸)中に存在することを意味し、ここで、エピトープは、個体の免疫系により一般的に許容されるが、エピトープは、自己免疫疾患を患う個体の免疫系により認識される。このような自己免疫疾患の非限定的な例として、I型糖尿病(インスリン産生膵細胞に対する免疫応答)、多発性硬化症(神経細胞の絶縁カバーに対する免疫応答)及びグルテンタンパク質への曝露により免疫系が小腸組織と交差反応するセリアック病が挙げられる。幾つかの実施形態では、本発明によるスクリーニング方法は、試料が、自己抗原を認識するT細胞を含むかどうかを決定するために使用される。例えば、Bcl-6及びBcl-xLの発現が誘導、増強及び/又は維持されたB細胞を、1つ又は複数の自己抗原(又はそれらに由来するペプチド)と共にインキュベートして、その後、T細胞エピトープは、B細胞の表面に表示される。続いて、B細胞を、試料由来のT細胞と共にインキュベートする。1つ又は複数のT細胞エピトープが、前記試料由来のT細胞により結合されるようである場合、前記試料は、自己抗原を認識するT細胞を含むと結論付けられる。次に、このような試料は通常、ある特定の自己免疫疾患に特異的であると分類される。続いて、幾つかの実施形態では、この結果は、試料が入手された個体が、自己免疫疾患に罹患しているか又は罹患する危険性があるかどうかを決定するのに使用される。
幾つかの実施形態では、潜在的な自己免疫T細胞エピトープに関して試験するために、本発明によるスクリーニングアッセイが実施される。これらの実施形態によれば、Bcl-6及びBcl-xLの発現が、誘導、増強及び/又は維持されたB細胞を、1つ又は複数の試験化合物、好ましくはペプチドと共にインキュベートして、その後、ペプチドを負荷したB細胞を、自己免疫患者由来のT細胞と共にインキュベートする。続いて、これらのT細胞により結合されるようであるペプチドを、例えば更なる自己免疫研究のために選択する。
したがって、B細胞が、自己免疫疾患、好ましくは多発性硬化症、糖尿病又はセリアック病に罹患しているか又は罹患していた個体由来のT細胞と共にインキュベートされる本発明による方法もまた提供される。
本明細書で使用する場合、修飾自己抗原「由来の」又は非自己抗原「由来の」又は自己抗原「由来の」T細胞エピトープは、前記配列がまた、それぞれ、前記修飾自己抗原又は非自己抗原又は自己抗原の上或いは中に存在するT細胞エピトープ配列を意味する。前記T細胞エピトープは、例えば、前記抗原から入手されるペプチドであってもよく(例えば、B細胞による抗原の内在化及びプロセシングを介して、その後、T細胞エピトープは、MHCの状況でB細胞の表面で提示される)、或いは前記T細胞エピトープは、例えば、組換え細胞ペプチド産生プラットフォーム又は化学的ペプチド合成機を使用して、人工的に産生され得る。したがって、ある特定の抗原「由来の」T細胞エピトープは、前記抗原から物理的に入手される必要はない。代わりに、このようなT細胞エピトープの配列が一度公知であると、前記T細胞エピトープは、別個に産生されてもよい。前記T細胞エピトープは好ましくは、ペプチドを含む。幾つかの実施形態では、前記T細胞エピトープは、タンパク質又はポリペプチド又は他のタンパク質様化合物の一部である。
本明細書で使用する場合、「B細胞」という用語は、個体から入手されたB細胞、又はこのようなB細胞から生じるB細胞を意味する。前記個体は好ましくは、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、類人猿、サル、ウシ、ヒツジ、イヌ又はネコ等の哺乳動物である。1つの好ましい実施形態では、前記個体は、ヒト個体又はウサギである。個体のB細胞から生じるB細胞の例は、1回又は複数回の細胞分裂サイクル後にin vitroで形成される個体由来のB細胞の子孫である。このような子孫は例えば、ex vivoでのB細胞培養物を含む。
ex vivoでのB細胞培養物は、B細胞及び/又はそれらの子孫を含有する培養物である。他の種類の細胞もまた、培養物中に存在してもよい。例えば、CD40陽性L細胞及び/又はEL4B5細胞等のB細胞刺激細胞もまた通常、本発明で使用するB細胞培養物中に存在する。更に、B細胞が入手された個体由来の試料中にも存在していた他の種類の細胞は、依然としてB細胞培養物中に存在し得る。B細胞培養条件で存在する場合、このような非B細胞は通常、B細胞と比較した場合に増殖することがあまり可能ではなく、その結果、このような混入細胞の数は通常、経時的に減少する。好ましくは、B細胞培養物の細胞の少なくとも70%がB細胞である。より好ましくは、前記B細胞培養物の細胞の少なくとも75%、80%、85%、90%又は95%がB細胞である。一実施形態では、B細胞並びにCD40陽性L細胞及び/又はEL4B5細胞等のB細胞刺激細胞は、本明細書で使用する場合、B細胞培養物中に存在する、本質的に唯一の種類の細胞である。幾つかの実施形態では、前記B細胞培養物の本質的に全ての細胞がB細胞である。
Bcl-6は、正常なB細胞及びT細胞の発生及び成熟に必要とされ、また胚中心の形成に必要とされる転写リプレッサーをコードする。Bcl-6は、胚中心B細胞で高度に発現されるのに対して、それは、形質細胞ではほとんど発現されない。Bcl-6は、形質細胞への活性化B細胞の分化を抑制する。本発明による方法では、Bcl-6発現産物は、ex vivoで培養物のB細胞中に依然として存在する。Bcl-6発現産物の存在は、抗アポトーシス核酸の存在と共に、B細胞の複製寿命を延長させる。Bcl-6の発現は好ましくは、Bcl-6発現促進化合物を、培養に使用する元のB細胞へ投与することにより、又はこのような化合物の存在下でB細胞を培養することにより、誘導、増強又は維持される。
したがって、前記少なくとも1つのB細胞におけるBcl-6の発現が、
- 前記B細胞に、Bcl-6の発現を直接的又は間接的に増強することが可能な化合物を供給する工程、及び/又は
- Bcl-6の発現を直接的又は間接的に増強することが可能な化合物の存在下で、前記B細胞を培養する工程
により誘導、増強及び/又は維持される本発明による方法が更に提供される。
- 前記B細胞に、Bcl-6の発現を直接的又は間接的に増強することが可能な化合物を供給する工程、及び/又は
- Bcl-6の発現を直接的又は間接的に増強することが可能な化合物の存在下で、前記B細胞を培養する工程
により誘導、増強及び/又は維持される本発明による方法が更に提供される。
本明細書で使用する場合、「Bcl-6」という用語はまた、非ヒト哺乳動物中に存在するBcl-6ホモログ等のそのホモログを包含する。
Bcl-6の発現を直接的又は間接的に増強することが可能な各種化合物は、当該技術分野で公知である。このような化合物は例えば、シグナル伝達性転写因子5(STAT5)タンパク質又はその機能性部分若しくは機能性誘導体、及び/又はそれらをコードする核酸配列を含む。STAT5は、Bcl-6発現を増強することが可能なシグナル伝達物質である。STAT5の2つの公知の形態STAT5a及びSTAT5bが存在し、それらは、2つの異なる縦列連結遺伝子によりコードされる。STAT5若しくはそのホモログの投与及び/又は活性化は、Bcl-6のレベルの増強をもたらす。したがって、STAT5、又はそのホモログ、又はその機能性部分若しくは機能性誘導体は、Bcl-6の発現を直接的に増加させることが可能である。したがって、
- 少なくとも1つのB細胞におけるSTAT5の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程、
- 前記少なくとも1つのB細胞における抗アポトーシス核酸の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程、
- B細胞培養物への前記少なくとも1つのB細胞の増殖を可能にする工程、
- 前記B細胞培養物のB細胞を、少なくとも1つの化合物と共にインキュベートする工程、
- 得られたB細胞を、T細胞と共にインキュベートする工程、及び
- 少なくとも1つのT細胞が、前記少なくとも1つの化合物の少なくとも1つのT細胞エピトープを認識するかどうかを決定する工程
を含む、本発明による方法が提供される。また、前記少なくとも1つのB細胞におけるBcl-6の発現が、前記B細胞に、STAT5を、又はそのホモログを、又はその機能性部分若しくは機能性誘導体を供給することにより誘導、増強及び/又は維持される本発明による方法が提供される。或いは、又は更に、前記少なくとも1つのB細胞におけるBcl-6の発現は、前記B細胞に、STAT5、又はそのホモログ、又はその機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする核酸分子を供給することにより、或いはSTAT5の存在下で、又はそのホモログ、又はその機能性部分若しくは機能性誘導体の存在下で、前記B細胞を培養することにより誘導、増強及び/又は維持される。
- 少なくとも1つのB細胞におけるSTAT5の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程、
- 前記少なくとも1つのB細胞における抗アポトーシス核酸の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程、
- B細胞培養物への前記少なくとも1つのB細胞の増殖を可能にする工程、
- 前記B細胞培養物のB細胞を、少なくとも1つの化合物と共にインキュベートする工程、
- 得られたB細胞を、T細胞と共にインキュベートする工程、及び
- 少なくとも1つのT細胞が、前記少なくとも1つの化合物の少なくとも1つのT細胞エピトープを認識するかどうかを決定する工程
を含む、本発明による方法が提供される。また、前記少なくとも1つのB細胞におけるBcl-6の発現が、前記B細胞に、STAT5を、又はそのホモログを、又はその機能性部分若しくは機能性誘導体を供給することにより誘導、増強及び/又は維持される本発明による方法が提供される。或いは、又は更に、前記少なくとも1つのB細胞におけるBcl-6の発現は、前記B細胞に、STAT5、又はそのホモログ、又はその機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする核酸分子を供給することにより、或いはSTAT5の存在下で、又はそのホモログ、又はその機能性部分若しくは機能性誘導体の存在下で、前記B細胞を培養することにより誘導、増強及び/又は維持される。
STAT5の存在は、Bcl-6の量を直接的に増加させる。また、Bcl-6の発現を間接的に増加させることも可能である。これは、例えば、順にSTAT5、若しくはそのホモログを直接的又は間接的に活性化すること、及び/又はSTAT5の発現、若しくはそのホモログの発現を増加させることが可能である、ある特定の化合物の量を調節することにより行われる。したがって、一実施形態では、内因性及び/又は外因性STAT5の発現及び/又は活性、或いはそのホモログの発現が増加される。
本明細書で使用する場合、例えば、Bcl-6又はSTAT5又はBlimp-1の「ホモログ」という用語は、ぞれぞれ、Bcl-6又はSTAT5又はBlimp-1に相当する哺乳動物タンパク質を意味し、それが、ヒトB細胞におけるBcl-6又はSTAT5又はBlimp-1の機能と比較した場合に、非ヒトB細胞において、相当する類似した機能を有することを意味する。
B細胞に、Bcl-6をコードするか、或いはそのホモログ、又はその機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする核酸分子を供給することは好ましい。このように、前記B細胞において、Bcl-6発現産物の量を直接的に調節することが可能である。したがって、また、前記少なくとも1つのB細胞におけるBcl-6の発現が、前記B細胞に、Bcl-6をコードするか、或いはBcl-6のホモログ、又は機能性部分、若しくは機能性誘導体をコードする核酸分子を供給することにより誘導、増強及び/又は維持される本発明による方法が提供される。一実施形態では、前記核酸分子は、構成的に活性であり、Bcl-6、又はそのホモログ、機能性部分若しくは機能性誘導体が、調節因子の存在に関係なく、連続して発現されることを意味する。別の実施形態では、前記核酸分子は、誘導性であり、それらの発現が、少なくとも1つの誘導因子及び/又はリプレッサーにより調節されることを意味する。このように、前記核酸分子の発現は、随意に調節される。例えば、Tet-On及びTet-Off発現系(例えば、Tet-On(登録商標)及びTet-Off(登録商標) Advanced Inducible Gene Expression Systems、Clontech社)は、目的の核酸配列の誘導性発現に使用することができる。これらの系では、転写活性化因子(tTA)の発現は、テトラサイクリン(TC)の存在(Tet-On)若しくは非存在(Tet-Off)又はドキシサイクリン(dox)のような誘導体により調節される。原則として、tTAは、大腸菌(Escherichia coli)Tetリプレッサータンパク質(TetR)及び単純ヘルペス(Herpes simplex)ウイルストランス活性化ドメインVP16から構成される。tTAは、Tetオペレーター(TetO)DNA配列及びプロモーター配列、例えばヒトサイトメガロウイルス(hCMV)プロモーターを含むテトラサイクリン応答要素(TRE)の制御下で目的の核酸配列の転写を調節する。例えば、Bcl6、或いはそのホモログ又は機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする核酸配列は、このプロモーターの下流に配置させることができる。
Tet-off系では、tTAは、TC又はdoxの非存在下でTREへ結合して、目的の核酸配列の転写が活性化されるのに対して、TC又はdoxの存在下では、tTAは、TREを結合することができず、目的の核酸配列の発現は阻害される。対照的に、Tet-on系は、doxの存在下で唯一TREを結合させることができる逆tTA(rtTA)を使用する。目的の核酸配列の転写は、doxの非存在下で阻害され、doxの存在下で活性化される。
別の実施形態では、誘導性発現は、例えば、エクジソン誘導性遺伝子発現系(例えば、RheoSwitch(登録商標)、New England Biolabs社)等のホルモン誘導性遺伝子発現系を使用して実行される(Christopherson, K.S.等 PNAS 89、6314〜8頁(1992))。エクジソンは、例えばキイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)由来の昆虫ステロイドホルモンである。エクジソン受容体でトランスフェクトした細胞では、エクジソン受容体(Ecr)及びレチノイドX受容体(RXR)からなるヘテロ二量体が、エクジソン、ムリステロンA及びポナステロンA等のその類縁体の1つ、及び非ステロイドエクジソンアゴニストから選択されるエクジソンアゴニストの存在下で形成される。アゴニストの存在下では、Ecr及びRXRは、発現カセット上に存在するエクジソン応答要素に相互作用して、それに結合する。したがって、エクジソン応答要素の下流で発現カセットに配置される目的の核酸配列の発現は、B細胞をエクジソンアゴニストへ曝露することにより誘導される。
本発明の更に別の実施形態では、誘導性発現は、アラビノース誘導性遺伝子発現系(例えば、pBAD/gIIIキット、Invitrogen社)を使用して実行される(Guzman, L. M.等 Bacteriol 177、4121〜4130頁(1995))。アラビノースは、5つの炭素原子を含有する単糖である。続いて、アラビノース誘導性プロモーターPBADでトランスフェクトした細胞では、PBADの下流に配置される目的の核酸配列の発現は、アラビノースの存在下で誘導され得る。
また、Bcl-6タンパク質、或いはそのホモログ又は機能性部分若しくは機能性誘導体(をコードする核酸分子)を使用することが可能であり、ここで、前記Bcl-6或いはホモログ又は機能性部分若しくは機能性誘導体の活性は、少なくとも1つの誘導因子及び/又はリプレッサーにより調節される。非限定的な例は、調節要素がBcl-6の少なくとも一部をコードする配列に融合される融合タンパク質である。例えば、エストロゲン受容体(ER)はBcl-6に融合されて、融合タンパク質ER-Bcl-6を生じる。この融合タンパク質は、それが、細胞質ゾルにおいて熱ショックタンパク質と複合体を形成するので不活性である。外因性誘導因子4-ヒドロキシ-タモキシフェン(4HT)の投与時に、融合タンパク質ER-Bcl-6は、熱ショックタンパク質から解離して、その結果、融合タンパク質のBcl-6部分が活性になる。
本明細書で使用する場合、「抗アポトーシス核酸分子」という用語は、B細胞においてアポトーシスを遅延及び/又は防止することが可能である核酸分子を指す。好ましくは、前記抗アポトーシス核酸分子は、本発明で使用する場合のB細胞培養物中に通常存在する形質芽細胞様B細胞においてアポトーシスを遅延及び/又は防止することが可能である。好ましくは、外因性核酸分子を含む抗アポトーシス核酸分子が使用される。これは、B細胞において天然で発現されない核酸配列が使用されるか、又は天然に存在する核酸配列の更なるコピーが使用されることを意味し、その結果、得られたB細胞における発現は、in vivoで天然B細胞と比較した場合に増強される。各種抗アポトーシス核酸分子が、当該技術分野で公知であり、その結果、各種実施形態が利用可能である。好ましくは、抗アポトーシスBcl-2タンパク質は、B細胞における良好なアポトーシス阻害因子であるため、Bcl-2ファミリーの抗アポトーシスの成員である抗アポトーシス核酸分子が使用される。Bcl-2ファミリー(そのファミリーは、アポトーシス促進性及び抗アポトーシスタンパク質の両方を含む)により制御される多くのプロセスは、アポトーシスのミトコンドリア経路に関する。Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、A1、Bcl2L10及びMcl-1は概して、ミトコンドリア外膜と一体化されるため、抗アポトーシスBcl-2ファミリーの成員であるBcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Bcl-2関連タンパク質A1(Bcl2-A1又はA1とも名付けられる)、Bcl-2様10(Bcl2L10)及びMcl-1、或いはそれらのホモログ、又はそれらの機能性部分若しくは機能性誘導体の使用が好ましい。それらは、ミトコンドリア膜完全性を保護するために、Bcl-2ファミリーに属するアポトーシス促進性タンパク質を直接的に結合及び阻害する。
したがって、好ましい実施形態は、前記抗アポトーシス核酸分子が、Bcl2ファミリー、好ましくはBcl-xL又はMcl-1又はBcl-2又はA1又はBcl-w又はBcl2L10、或いはそれらのホモログ、又はそれらの機能性部分若しくは機能性誘導体の抗アポトーシス遺伝子を含む本発明による方法を提供する。
一実施形態では、Bcl-xL又はMcl-1又はBcl-2又はA1又はBcl-w又はBcl2L10、或いはそれらのホモログの発現は、これらの抗アポトーシス遺伝子のいずれかの発現を促進することが可能な少なくとも1つの化合物を、B細胞へ投与することにより、又はこのような化合物の存在下で、B細胞を培養することにより誘導、増強又は維持される。したがって、
- 前記B細胞に、Bcl-xL及び/又はMcl-1及び/又はBcl-2及び/又はA1及び/又はBcl-w及び/又はBcl2L10、或いはそれらのホモログの発現を直接的又は間接的に増強することが可能な化合物を供給する工程、及び/又は
- Bcl-xL及び/又はMcl-1及び/又はBcl-2及び/又はA1及び/又はBcl-w及び/又はBcl2L10、或いはそれらのホモログの発現を直接的又は間接的に増強することが可能な化合物の存在下で、前記B細胞を培養する工程
を含む本発明による方法が更に提供される。
- 前記B細胞に、Bcl-xL及び/又はMcl-1及び/又はBcl-2及び/又はA1及び/又はBcl-w及び/又はBcl2L10、或いはそれらのホモログの発現を直接的又は間接的に増強することが可能な化合物を供給する工程、及び/又は
- Bcl-xL及び/又はMcl-1及び/又はBcl-2及び/又はA1及び/又はBcl-w及び/又はBcl2L10、或いはそれらのホモログの発現を直接的又は間接的に増強することが可能な化合物の存在下で、前記B細胞を培養する工程
を含む本発明による方法が更に提供される。
しかしながら、好ましくは、B細胞に、好ましくはBcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w、Bcl2L10、並びにそれらのホモログ、及びそれらの機能性部分及びそれらの機能性誘導体からなる群から選択されるBcl2ファミリーの抗アポトーシス遺伝子をコードする少なくとも1つの核酸分子を供給する。このように、前記B細胞において発現産物の量を直接的に増強することが可能である。したがって、また、前記B細胞に、好ましくはBcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w、Bcl2L10、並びにそれらのホモログ、及びそれらの機能性部分及び機能性誘導体からなる群から選択されるBcl2ファミリーの抗アポトーシス遺伝子をコードする少なくとも1つの核酸分子を供給する工程を含む、本発明による方法が提供される。一実施形態では、前記核酸分子は、構成的に活性であり、前記核酸分子は、連続して発現されることを意味する。別の実施形態では、前記核酸分子は、誘導性であり、それらの発現が、少なくとも1つの誘導因子及び/又はリプレッサーにより調節されることを意味する。当該技術分野で公知の誘導性核酸発現系の非限定的な例は、本明細書で前に記載している。
特に好ましい実施形態では、前記抗アポトーシス核酸分子は、Bcl-xL又はMcl-1、或いはそれらのホモログ、又はそれらの機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする。本発明によれば、Bcl-6及びBcl-xLの組合せは、B細胞の複製寿命を増加させることが特に十分可能であり、それにより得られた形質芽細胞様B細胞の長期培養物を形成させる。同じことが、Bcl-6及びMcl-1の組合せにも当てはまる。最も好ましくは、前記抗アポトーシス核酸は、Bcl-xL又はその機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする。
Bcl-6、Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w又はBcl2L10、或いはそれらのホモログの機能性部分は、それぞれ、天然のBcl-6、Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w又はBcl2L10、或いはそれらのホモログと比較した場合に、B細胞の複製寿命を増加させる同じ能力を有する(種類についてであり、量については必ずしも同じではない)タンパク質様分子である。このような機能性部分は、例えば前記能力に関与にされないか、又はほんのごくわずか関与されるアミノ酸を欠如している。
例えば、Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w及びBcl2L10の、又はそれらのホモログの機能性部分は、それぞれ、完全長Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w及びBcl2L10、又はそれらのホモログと同じ種類の抗アポトーシス特性を保持した(種類についてであり、量についてはは必ずしも同じではない)、それぞれ、Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w及びBcl2L10の、又はそれらのホモログの断片として、本明細書で定義される。Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w又はBcl2L10の、或いはそれらのホモログの機能性部分は通常、B細胞においてアポトーシスを遅延及び/又は防止することが可能である、それぞれ、Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w又はBcl2L10の、或いはそれらのホモログのより短い断片である。このような機能性部分は、例えばBcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w及びBcl2L10の抗アポトーシス活性に著しく寄与しない配列を欠如している。Bcl-6の、又はそのホモログの機能性部分は通常、同様にB細胞の複製寿命を増加させることが可能であるBcl-6のより短い断片、又はそのホモログのより短い断片である。
Bcl-6、Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w又はBcl2L10の、或いはそれらのホモログの機能性誘導体は、変更されているが、B細胞の複製寿命を増加させるその能力を維持した(種類については維持したが、量については必ずしも維持しなかった)、それぞれ、Bcl-6、Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w又はBcl2L10タンパク質、又はそれらのホモログとして定義される。機能性誘導体は、多くの方法で、例えば保存的アミノ酸置換によって提供され、保存的アミノ酸置換では、全体的な官能性(functioning)が著しく影響されないように、アミノ酸の1つが、一般的に類似した特性(サイズ、疎水性等)を有する別のアミノ酸で置換される。或いは、機能性誘導体は例えば、検出可能標識、又は誘導性化合物を有する融合タンパク質を含む。
Bcl-6発現及び抗アポトーシス核酸分子の発現を増加させること以外に、B細胞において、Blimp-1、又はそのホモログの発現を誘導、増強及び/又は維持することもまた有利である。したがって、一態様は、前記少なくとも1つのB細胞において、Blimp-1、又はそのホモログの発現を誘導、増強及び/又は維持することを更に含む、本発明による方法を提供する。
B細胞におけるBlimp-1の、又はそのホモログの発現の程度は、様々な方法で調節される。一実施形態では、B細胞に、Blimp-1の、又はそのホモログの発現を直接的又は間接的に増加させることが可能である化合物を供給する。更に、又は或いは、B細胞は、Blimp-1の、又はそのホモログの発現を直接的又は間接的に増加させることが可能な化合物の存在下で培養される。したがって、
- 前記B細胞に、Blimp-1の発現、又はBlimp-1ホモログの発現を直接的又は間接的に増加させることが可能な化合物を供給する工程、及び/又は
- Blimp-1の発現、又はBlimp-1ホモログの発現を直接的又は間接的に増加させることが可能な化合物の存在下で、前記B細胞を培養する工程
を更に含む、本発明による方法が更に提供される。
- 前記B細胞に、Blimp-1の発現、又はBlimp-1ホモログの発現を直接的又は間接的に増加させることが可能な化合物を供給する工程、及び/又は
- Blimp-1の発現、又はBlimp-1ホモログの発現を直接的又は間接的に増加させることが可能な化合物の存在下で、前記B細胞を培養する工程
を更に含む、本発明による方法が更に提供される。
Blimp-1発現を増加させることが可能な前記化合物は、最も好ましくはIL21を含む。したがって、本発明の1つの好ましい実施形態では、B細胞は、培養時間の少なくとも一部中に、IL21の存在下で培養される。
別の実施形態では、Blimp-1発現を増加させることが可能な前記化合物は、シグナル伝達性転写因子3(STAT3)タンパク質又はその機能性部分若しくは機能性誘導体、及び/又はそれらをコードする核酸分子を含む。STAT3は、B細胞発生及び分化に関与されるシグナル伝達物質である。STAT3は、Blimp-1発現をアップレギュレートすることが可能である。1つの好ましい実施形態では、B細胞に、STAT3又はその機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする核酸分子を供給し、ここで、前記核酸分子の発現は、リプレッサーの外因性誘導因子により調節され、その結果、STAT3発現の程度は、随意に調節される。例えば、上述する誘導性発現系の1つが使用される。一実施形態では、STAT3、又は機能性部分若しくは機能性誘導体、及びERを含む融合産物が使用される。例えば、B細胞に、融合タンパク質ER-STAT3としてエストロゲン受容体(ER)及びSTAT3をコードする核酸分子を供給する。この融合タンパク質は、それが、細胞質ゾルにおいて熱ショックタンパク質と複合体を形成するので不活性である。このように、STAT3は、核に到達することは不可能であり、Blimp-1発現は増強されない。外因性誘導因子4-ヒドロキシ-タモキシフェン(4HT)の投与時に、融合タンパク質ER-STAT3は、熱ショックタンパク質から解離して、その結果、STAT3は、核に入ること、及びBlimp-1発現を活性化させることが可能である。
本明細書で使用する場合、STAT3の機能性部分は、天然のSTAT3と比較した場合に、Blimp-1の、又はそのホモログの発現を増加させる同じ能力を有する(種類についてであり、量については必ずしも同じではない)STAT3の断片として定義される。このような機能性部分は、例えば前記能力に関与にされないか、又はほんのごくわずか関与されるアミノ酸を欠如している。
STAT3の機能性誘導体は、変更されているが、Blimp-1の、又はそのホモログの発現を増加させるその能力を維持した(種類については維持したが、量については必ずしも維持しなかった)、STAT3タンパク質として定義される。機能性誘導体は、多くの方法で、例えば保存的アミノ酸置換によって提供され、保存的アミノ酸置換では、全体的な官能性が著しく影響されないように、アミノ酸の1つが、一般的に類似した特性(サイズ、疎水性等)を有する別のアミノ酸で置換される。或いは、機能性誘導体は例えば、検出可能標識、又は誘導性化合物を有する融合タンパク質を含む。
STAT3は、Blimp-1の発現を増加させることが可能であるため、STAT3の活性及び/又は発現を増加させることが可能な化合物を投与することにより、Blimp-1の、又はBlimp-1ホモログの発現を間接的に増加させることも可能である。したがって、一実施形態では、B細胞に、STAT3の活性を増強することが可能である化合物を供給して、その結果、Blimp-1の、又はBlimp-1ホモログの発現が、間接的に増強される。
STAT3は、様々な方法で活性化される。好ましくは、STAT3は、B細胞にサイトカインを供給することにより活性化される。B細胞分化に天然で関与されるサイトカインは、STATタンパク質を調節するのに非常に有効である。STAT3の非常に有効な活性化因子は、IL21及びIL6であるが、IL2、IL7、IL10、IL15及びIL27もまた、STAT3を活性化することが公知である。更に、先天免疫に関与されるToll様受容体(TLR)もまた、STAT3を活性化することが可能である。したがって、一実施形態は、前記B細胞が、IL21、IL2、IL6、IL7、IL10、IL15及び/又はIL27の存在下で培養される本発明の方法を提供する。Blimp-1発現がBCL6により相殺される場合でさえ、IL21は、Blimp-1発現をアップレギュレートするのに特に適しているため、IL21が使用されることが最も好ましい。
更に、又は或いは、突然変異ヤヌスキナーゼ(JAK)、又はJAKの突然変異ホモログは、STAT3を活性化させるために使用される。天然で、JAKは、それ自体が、少なくとも1つのサイトカインにより活性化されていた後に、STAT3をリン酸化することが可能である。サイトカインの存在とは独立してSTAT3を活性化することが可能な突然変異ヤヌスキナーゼ、又はJAKの突然変異ホモログは、本発明による方法で特に適している。
更に別の実施形態では、Blimp-1の、又はBlimp-1ホモログの発現は、B細胞に、サイトカインシグナル伝達の抑制因子(SOCS)タンパク質、又はSOCSホモログを供給することにより、及び/又は前記細胞内で、SOCSタンパク質又はSOCSホモログを活性化することにより増加される。或いは、又は更に、Blimp-1の発現、又はBlimp-1ホモログの発現を増加させるために、E-タンパク質E47、E12、E2-2及びHEBのうちの少なくとも1つが使用される。E47は、E-タンパク質と呼ばれるヘリックス-ループ-ヘリックスタンパク質のファミリーに属する転写因子である。リンパ球発生に関与される4つのE-タンパク質E12、E47、E2-2及びHEBが存在する。E12及びE47は、異なってスプライシングされるE2Aと呼ばれる1つの遺伝子によりコードされる。Eタンパク質は、腫瘍抑制因子として記載されている。E47の特異的標的のうちの1つが、Socsl及びSocs3遺伝子である。
したがって、一態様は、前記B細胞に、Blimp-1の発現を直接的又は間接的に増加させることが可能な化合物を供給することにより、及び/又はBlimp-1の発現を直接的又は間接的に増加させることが可能な化合物の存在下で、前記B細胞を培養することにより、B細胞においてBlimp-1の発現を更に増加させる本発明による方法を提供し、ここで、前記化合物は、
- STAT3又はその機能性部分若しくは機能性誘導体、及び/又は
- STAT3を活性化することが可能な化合物、及び/又は
- STAT3の発現を増強することが可能な化合物、及び/又は
- IL21、IL2、IL6、IL7、IL10、IL15、IL27、SOCSタンパク質、E-タンパク質E47、E12、E2-2又はHEBのうちの1つ、突然変異ヤヌスキナーゼ及び/又はSTAT3、或いはそのホモログ又は機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする核酸配列
を含む。
- STAT3又はその機能性部分若しくは機能性誘導体、及び/又は
- STAT3を活性化することが可能な化合物、及び/又は
- STAT3の発現を増強することが可能な化合物、及び/又は
- IL21、IL2、IL6、IL7、IL10、IL15、IL27、SOCSタンパク質、E-タンパク質E47、E12、E2-2又はHEBのうちの1つ、突然変異ヤヌスキナーゼ及び/又はSTAT3、或いはそのホモログ又は機能性部分若しくは機能性誘導体をコードする核酸配列
を含む。
最も好ましくは、前記化合物はIL21である。
上述するように、本発明による方法は、好ましくは腫瘍、病原体及び/又は自己免疫疾患に対する医薬及びワクチンを開発するのに特に適している。したがって、一態様は、試験化合物の、又は試験化合物によりコードされる少なくとも1つのT細胞エピトープを認識するT細胞を含む医薬を調製する工程を更に含む、本発明のよる方法を提供する。また、本発明による方法を用いて入手される場合、疾患特異的エピトープ、好ましくは腫瘍特異的エピトープ又は病原体若しくは自己抗原由来のT細胞エピトープを認識するT細胞を含む医薬が、更に提供される。前記医薬は好ましくは、薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を更に含む。前記医薬は好ましくは、黒色腫、上皮がん、肺扁平上皮癌、肺腺癌、胃がん、食道がん、肺小細胞癌、結腸直腸がん、膀胱がん、子宮がん、子宮頸がん、肝臓がん、頭部及び頸部がん、腎明細胞がん、B細胞リンパ腫、腎乳頭がん、乳がん、膵臓がん、骨髄腫、卵巣がん、前立腺がん、神経膠芽腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、髄芽腫、CLL、嫌色素性腎細胞癌、甲状腺がん、ALL、AML又は毛様細胞性星状細胞腫に対する医薬である。最も好ましくは、前記医薬は、黒色腫又は上皮がんに対するものである。
幾つかの実施形態では、前記医薬は、好ましくはウイルス、細菌又は寄生虫により引き起こされる感染性疾患に対するものである。
本明細書で使用する場合、ある特定の疾患「に対する医薬」という用語は、前記医薬が、前記疾患の発病又は進行を、少なくとも部分的に治療又は防止又は遅延することが可能であることを意味する。更に、又は或いは、前記医薬は、前記疾患の少なくとも1つの症状を少なくとも部分的に軽減することが可能である。
別の態様は、試験アッセイにおいてT細胞により認識される少なくとも1つのT細胞エピトープを同定する工程を更に含む、本発明による方法を提供する。T細胞により認識されるこのようなエピトープは好ましくは、免疫原性組成物、又は予防剤若しくはワクチンを調製するのに使用される。
更なる態様は、試験アッセイにおいてT細胞により認識される少なくとも1つのT細胞エピトープを、その表面に表示するB細胞を含む免疫原性組成物、又は予防剤若しくはワクチンを調製する工程を更に含む、本発明による方法を提供する。本発明による免疫原性組成物、又は予防剤若しくはワクチンは好ましくは、薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を更に含む。
本発明による方法を用いて入手される場合、疾患特異的T細胞エピトープ、好ましくは腫瘍特異的T細胞エピトープ又は病原体若しくは自己抗原由来のT細胞エピトープを含む免疫原性組成物、又は予防剤若しくはワクチンもまた提供される。前記T細胞エピトープは、本明細書で使用する場合、抗原提示細胞、好ましくはB細胞の表面上に表示され得る。
先で論述するように、本発明による方法の利点の1つは、入手される非常に低い程度(存在したとしても)のバックグラウンドシグナルであり、その結果、より一層低い程度のT細胞認識が検出され得る。これは、試験化合物を負荷したB細胞が、障害を患う個体由来のT細胞と共にインキュベートされる場合に特に有利である。前記個体内の疾患特異的T細胞レベルが低い場合、これらの低量のT細胞によるエピトープ認識は、ほとんどの個体において比較的高頻度のEBV特異的T細胞により引き起こされる多くのバックグラウンドシグナルに起因して、既存のEBV不死化B細胞アッセイにおいて容易に見逃される。本発明による方法は、これに対する解決策を提供する。実施例に示すように、少数のT細胞エピトープを認識するT細胞でも、本発明による方法を用いて検出可能である。例えば、APCとしてEBV不死化B細胞を使用する場合、唯一の非常に卓越した疾患特異的T細胞応答が検出され、ここで、目的のT細胞の量は、注入細胞産物内の総T細胞の24%もの多さであった。他方で、Bcl-6及びBcl-xLの発現が誘導、増強及び/又は維持されるB細胞を使用する本発明による方法を使用する場合、遥かに低い頻度で、0.264〜0.053%もの低いT細胞応答でも検出することが可能となった(図3b及び図3c)。したがって、1つの好ましい実施形態は、前記T細胞が前記個体由来の試料由来であり、前記試料において、又は前記試料のin vitroの増殖後のT細胞培養物において、T細胞の総量に対する、前記疾患と関連付けられるT細胞エピトープに特異的なT細胞の比率が、24%よりも低く、より好ましくは23%よりも低く、より好ましくは22%よりも低く、より好ましくは21%よりも低く、より好ましくは20%よりも低く、より好ましくは15%よりも低く、より好ましくは10%よりも低く、より好ましくは9%よりも低く、より好ましくは8%よりも低く、より好ましくは7%よりも低く、より好ましくは6%よりも低く、より好ましくは5%よりも低いことを特徴とする、本発明による方法を提供する。
好ましい実施形態では、前記T細胞が前記個体由来の試料由来であり、前記試料において、又は前記試料のin vitroの増殖後のT細胞培養物において、T細胞の総量に対する、目的の障害と関連付けられるT細胞エピトープに特異的なT細胞の比率が、1.9%よりも低く、より好ましくは1.8%よりも低く、より好ましくは1.7%よりも低く、より好ましくは1.6%よりも低く、より好ましくは1.5%よりも低いことを特徴とする、本発明による方法が提供される。
更に好ましい実施形態では、前記T細胞は、前記個体由来の試料由来であり、前記試料において、又は前記試料のin vitroの増殖後のT細胞培養物において、T細胞の総量に対する、目的の障害と関連付けられるT細胞エピトープに特異的なT細胞の比率が、1.0%よりも低く、より好ましくは0.9%よりも低く、より好ましくは0.8%よりも低く、より好ましくは0.7%よりも低く、より好ましくは0.6%よりも低く、より好ましくは0.5%よりも低く、より好ましくは0.4%よりも低く、より好ましくは0.3%よりも低いことを特徴とする。一実施形態では、前記比率は、0.264%から0.053%の間である。更なる実施形態では、前記比率は、0.264%以下である。更なる実施形態では、前記比率は、0.246%以下である。更なる実施形態では、前記比率は、0.096%以下である。更なる実施形態では、前記比率は、0.053%以下である。
また、前記個体由来の試料が使用されるか、又は前記試料のin vitroの増殖後に得られたT細胞培養物のT細胞が使用され、前記試料において、又は前記得られたin vitroのT細胞培養物において、T細胞の総数に対する、前記疾患と関連付けられるT細胞エピトープに特異的なT細胞の割合が、24%よりも低く、より好ましくは23%よりも低く、より好ましくは22%よりも低く、より好ましくは21%よりも低く、より好ましくは20%よりも低く、より好ましくは15%よりも低く、より好ましくは10%よりも低く、より好ましくは9%よりも低く、より好ましくは8%よりも低く、より好ましくは7%よりも低く、より好ましくは6%よりも低く、より好ましくは5%よりも低い、本発明による方法が提供される。
好ましい実施形態では、前記個体由来の試料が使用されるか、又は前記試料のin vitroの増殖後に得られたT細胞培養物のT細胞が使用され、前記試料において、又は前記得られたin vitroのT細胞培養物において、T細胞の総数に対する、目的の障害と関連付けられるT細胞エピトープに特異的なT細胞の割合が、1.9%よりも低く、より好ましくは1.8%よりも低く、より好ましくは1.7%よりも低く、より好ましくは1.6%よりも低く、より好ましくは1.5%よりも低い、本発明による方法が提供される。
更に好ましい実施形態では、前記個体由来の試料が使用されるか、又は前記試料のin vitroの増殖後に得られたT細胞培養物のT細胞が使用され、前記試料において、又は前記得られたin vitroのT細胞培養物において、T細胞の総数に対する、目的の障害と関連付けられるT細胞エピトープに特異的なT細胞の割合が、1.0%よりも低く、より好ましくは0.9%よりも低く、より好ましくは0.8%よりも低く、より好ましくは0.7%よりも低く、より好ましくは0.6%よりも低く、より好ましくは0.5%よりも低く、より好ましくは0.4%よりも低く、より好ましくは0.3%よりも低い、本発明による方法が提供される。一実施形態では、前記割合は、0.264%から0.053%の間である。更なる実施形態では、前記割合は、0.264%以下である。更なる実施形態では、前記割合は、0.246%以下である。更なる実施形態では、前記割合は、0.096%以下である。更なる実施形態では、前記割合は、0.053%以下である。
前記疾患又は前記障害は、好ましくは:
- がん、好ましくは黒色腫又は上皮がん、及び
- 感染性疾患、好ましくはウイルス感染、細菌感染又は寄生虫感染、及び
- 自己免疫疾患、好ましくは多発性硬化症、糖尿病又はセリアック病
からなる群から選択される。
- がん、好ましくは黒色腫又は上皮がん、及び
- 感染性疾患、好ましくはウイルス感染、細菌感染又は寄生虫感染、及び
- 自己免疫疾患、好ましくは多発性硬化症、糖尿病又はセリアック病
からなる群から選択される。
1つの好ましい実施形態では、前記T細胞は、CD4+T細胞である。したがって、1つの好ましい態様は、前記T細胞が、疾患に罹患しているか又は罹患していた個体由来の試料由来のCD4+T細胞であり、前記疾患と関連付けられるT細胞エピトープに特異的であるCD4+T細胞の、前記試料における、又は前記試料のin vitroの増殖後のT細胞培養物における濃度が、前記試料において、又は前記T細胞培養物において、CD4+T細胞の総量の24%よりも低いことを特徴とする、本発明による方法を提供する。試料又はT細胞培養物におけるCD4+T細胞の総量と比較した、目的のある特定のCD4+T細胞の比率は、頻度と呼ばれる。好ましくは、前記疾患と関連付けられるT細胞エピトープに特異的であるCD4+T細胞の頻度は、前記試料において、又は前記T細胞培養物において、CD4+T細胞の総量の23%よりも低く、より好ましくは22%よりも低く、より好ましくは21%よりも低く、より好ましくは20%よりも低く、より好ましくは15%よりも低く、より好ましくは10%よりも低く、より好ましくは9%よりも低く、より好ましくは8%よりも低く、より好ましくは7%よりも低く、より好ましくは6%よりも低く、及び更により好ましくは5%よりも低い。一実施形態では、前記疾患と関連付けられるT細胞エピトープに特異的であるCD4+T細胞の頻度は、前記試料において、又は前記T細胞培養物において、総CD4+細胞の1.7%から4.5%の間である。
好ましい実施形態では、前記T細胞が、疾患に罹患しているか又は罹患していた個体由来の試料由来のCD4+T細胞であり、前記疾患と関連付けられるT細胞エピトープに特異的であるCD4+T細胞の、前記試料における、又は前記試料のin vitroの増殖後のT細胞培養物における濃度が、前記試料において、又は前記T細胞培養物において、CD4+T細胞の総量の1.9%よりも低く、より好ましくは1.8%よりも低く、より好ましくは1.7%よりも低く、より好ましくは1.6%よりも低く、より好ましくは1.5%よりも低いことを特徴とする、本発明による方法が提供される。
更に好ましい実施形態では、前記T細胞が、疾患に罹患しているか又は罹患していた個体由来の試料由来のCD4+T細胞であり、前記疾患と関連付けられるT細胞エピトープに特異的であるCD4+T細胞の、前記試料における、又は前記試料のin vitroの増殖後のT細胞培養物における濃度が、前記試料において、又は前記T細胞培養物において、CD4+T細胞の総量の1.0%よりも低く、より好ましくは0.9%よりも低く、より好ましくは0.8%よりも低く、より好ましくは0.7%よりも低く、より好ましくは0.6%よりも低く、より好ましくは0.5%よりも低く、より好ましくは0.4%よりも低く、より好ましくは0.3%よりも低いことを特徴とする、本発明による方法が提供される。一実施形態では、前記CD4+T細胞濃度は、0.264%から0.053%の間である。更なる実施形態では、前記濃度は、0.264%以下である。更なる実施形態では、前記濃度は、0.246%以下である。更なる実施形態では、前記濃度は、0.096%以下である。更なる実施形態では、前記濃度は、0.053%以下である。
前記疾患と関連付けられる前記T細胞エピトープは好ましくは、腫瘍特異的T細胞エピトープ又は病原体由来のT細胞エピトープ又は自己抗原由来のT細胞エピトープである。
同様に、低レベルのCD8+T細胞は、本発明による方法を用いて検出可能である。したがって、1つの好ましい態様は、前記T細胞が、疾患に罹患しているか又は罹患していた個体由来の試料由来のCD8+T細胞であり、前記疾患と関連付けられるT細胞エピトープに特異的であるCD8+T細胞の、前記試料における、又は前記試料のin vitroの増殖後のT細胞培養物における比率が、前記試料において、又は前記T細胞培養物において、CD8+T細胞の総量の24%よりも低いことを特徴とする、本発明による方法を提供する。好ましくは、前記試料において、又は前記T細胞培養物において、CD8+T細胞の総量に対する、前記疾患と関連付けられるT細胞エピトープに特異的であるCD8+T細胞の頻度は、前記試料において、又は前記T細胞培養物において、CD8+T細胞の総量の23%よりも低く、より好ましくは22%よりも低く、より好ましくは21%よりも低く、より好ましくは20%よりも低く、より好ましくは15%よりも低く、より好ましくは10%よりも低く、より好ましくは9%よりも低く、より好ましくは8%よりも低く、より好ましくは7%よりも低く、より好ましくは6%よりも低く、及び更により好ましくは5%よりも低い。
好ましい実施形態では、前記T細胞が、疾患に罹患しているか又は罹患していた個体由来の試料由来のCD8+T細胞であり、前記疾患と関連付けられるT細胞エピトープに特異的であるCD8+T細胞の、前記試料における、又は前記試料のin vitroの増殖後のT細胞培養物における比率が、前記試料において、又は前記T細胞培養物において、CD8+T細胞の総量の1.9%よりも低く、より好ましくは1.8%よりも低く、より好ましくは1.7%よりも低く、より好ましくは1.6%よりも低く、より好ましくは1.5%よりも低いことを特徴とする、本発明による方法が提供される。
更に好ましい実施形態では、前記T細胞が、疾患に罹患しているか又は罹患していた個体由来の試料由来のCD8+T細胞であり、前記疾患と関連付けられるT細胞エピトープに特異的であるCD8+T細胞の、前記試料における、又は前記試料のin vitroの増殖後のT細胞培養物における比率が、前記試料において、又は前記T細胞培養物において、CD8+T細胞の総量の1.0%よりも低く、より好ましくは0.9%よりも低く、より好ましくは0.8%よりも低く、より好ましくは0.7%よりも低く、より好ましくは0.6%よりも低く、より好ましくは0.5%よりも低く、より好ましくは0.4%よりも低く、より好ましくは0.3%よりも低いことを特徴とする、本発明による方法が提供される。上述するように、前記疾患と関連付けられる前記T細胞エピトープは好ましくは、腫瘍特異的T細胞エピトープ又は病原体由来のT細胞エピトープ又は自己抗原由来のT細胞エピトープである。
また、障害に罹患しているか又は罹患していた個体由来の試料が使用されるか、又は前記試料のin vitroの増殖後に得られたT細胞培養物のT細胞が使用され、前記試料における、又は前記得られたin vitroのT細胞培養物における、T細胞の総数に対する、前記疾患と関連付けられるT細胞エピトープに、好ましくは腫瘍特異的T細胞エピトープ又は病原体由来のT細胞エピトープ又は自己抗原由来のT細胞エピトープに特異的であるT細胞の比率が、前記試料において、又は前記得られたT細胞培養物において、T細胞の総量の24%よりも低く、より好ましくは23%よりも低く、より好ましくは22%よりも低く、より好ましくは21%よりも低く、より好ましくは20%よりも低く、より好ましくは15%よりも低く、より好ましくは10%よりも低く、より好ましくは9%よりも低く、より好ましくは8%よりも低く、より好ましくは7%よりも低く、より好ましくは6%よりも低く、及び更により好ましくは5%よりも低い、本発明による方法が提供される。幾つかの実施形態では、前記試料における、又は前記得られたin vitroのT細胞培養物におけるT細胞の総数に対する、前記疾患と関連付けられるT細胞エピトープに特異的であるT細胞の、前記試料における、又は前記得られたin vitroのT細胞培養物における前記比率は、前記試料において、又は前記in vitroでのT細胞培養物において、T細胞の総量の1.7%から4.5%の間であり、好ましくは1.9%よりも低く、より好ましくは1.8%よりも低く、より好ましくは1.7%よりも低く、より好ましくは1.6%よりも低く、より好ましくは1.5%よりも低く、より好ましくは1.0%よりも低く、より好ましくは0.9%よりも低く、より好ましくは0.8%よりも低く、より好ましくは0.7%よりも低く、より好ましくは0.6%よりも低く、より好ましくは0.5%よりも低く、より好ましくは0.4%よりも低く、より好ましくは0.3%よりも低い。1つの好ましい実施形態では、前記T細胞は、CD4+T細胞である。
本発明の別の態様は、目的のエピトープを提示するためのB細胞の使用であって、前記B細胞のin vitroでの複製寿命が、前記B細胞において、Bcl-6及び/又はSTAT5の発現を誘導、増強及び/又は維持することにより、並びに前記B細胞において、抗アポトーシス核酸の発現を誘導、増強及び/又は維持することにより延長されることを特徴とする使用を提供する。前記エピトープは、好ましくはT細胞エピトープである。
一実施形態では、本発明による方法は、ある特定の(試験)化合物に対するB細胞の親和性を試験するのに使用される。この実施形態では、B細胞を、例えばB細胞の表面でMHC分子へ直接結合することができないタンパク質又はポリペプチド等の大きな化合物と共にインキュベートする。代わりに、化合物は、B細胞受容体(BCR)を介して内在化されてもよく、或いはされなくてもよい。内在化される場合、化合物はプロセシングされて、続いてB細部の表面で表示される。次に、B細胞をT細胞と共にインキュベートする。T細胞が、アッセイで使用された化合物に由来する表面結合性ペプチドを認識するようである場合、B細胞は、前記化合物を効率的に内在化させることが可能であったと結論付けられる。したがって、このように、B細胞が、1つ又は複数の試験化合物に対して高い親和性を有するかどうかが決定される。次に、1つ又は複数の試験化合物に対する親和性を有するB細胞は、更なる使用のために選択され得る。幾つかの実施形態では、所与の試験化合物に対する幾つかのB細胞の親和性が、互いに比較される。これは、例えば段階希釈実験を使用して可能であり、ここで、B細胞を、減少濃度の所与の試験化合物と共にインキュベートする場合に、T細胞活性化が依然として起きるかどうかが決定される。続いて、試験化合物に対する1つ又は複数の他のB細胞の親和性と比較した場合に、前記試験化合物に対してより高い親和性を有するB細胞が、選択されることが好ましい。
更なる実施形態では、少なくとも1つのB細胞エピトープ及び少なくとも1つのT細胞エピトープの両方を含む化合物が使用される本発明による方法が提供される。B細胞と、このような化合物とのインキュベーションは、化合物由来のペプチドの効率的な内在化及び提示もたらし、得られたB細胞はまた、特に高いT細胞応答を誘発することが可能である。
本発明は、下記実施例で更に説明される。これらの実施例は、本発明の範囲を限定せず、本発明を明確にするのに役立つにすぎない。
参考文献
(実施例1)
突然変異抗原に対する腫瘍内CD4+T細胞反応性は、ヒト黒色腫で一般的に観察される
方法
TIL材料、腫瘍細胞株及びBcl-6/Bcl-xL形質導入B細胞の生成。PBMC及びTIL材料は、署名されたインフォームドコンセントを受けて、且つNKI-AVLでの医療倫理委員会(Medisch Ethische Toetsingscommissie)の承認後に適用可能である場合に、オランダのガイドラインに従って、ステージIVの黒色腫を有する個体から入手した。
突然変異抗原に対する腫瘍内CD4+T細胞反応性は、ヒト黒色腫で一般的に観察される
方法
TIL材料、腫瘍細胞株及びBcl-6/Bcl-xL形質導入B細胞の生成。PBMC及びTIL材料は、署名されたインフォームドコンセントを受けて、且つNKI-AVLでの医療倫理委員会(Medisch Ethische Toetsingscommissie)の承認後に適用可能である場合に、オランダのガイドラインに従って、ステージIVの黒色腫を有する個体から入手した。
PBMC材料は、フィコール-アイソパック密度遠心分離により調製した。TIL材料及び短期腫瘍株は、切除した黒色腫病巣から入手した。新鮮な腫瘍材料を、ペニシリン-ストレプトマイシン(Roche社)、0.01mg ml-1のプルモザイム(Roche社)及び1mg ml-1のコラゲナーゼIV型(BD Biosciences社)を補充したRPMI 1640(Life Technologies社)中で一晩、細分化(minced)及び消化させた。腫瘍株は、ペニシリン-ストレプトマイシン(Roche社)及び10%(v/v)の熱失活させたウシ胎児血清(Sigma-Aldrich社)を補充したRPMI 1640中での得られた細胞懸濁液の培養により入手した。TILは、ペニシリン-ストレプトマイシン、10%(v/v)AB血清(Sanquin Blood Supply and Life Technologies社)、L-グルタミン(Life Technologies社)及び6000IU ml-1のrhIL-2(Novartis社)を補充したRPMI 1640中で懸濁細胞を培養することにより入手した。
PBMC材料由来の自己B細胞は、これまでに説明されているように15、16、AIMM Therapeutics社による提携契約の一部としてBcl-6/Bcl-xL遺伝子移入により不死化させた。詳細な説明に関してはまた、WO 2007/067046を参照されたい。Bcl-6/Bcl-xL形質導入B細胞を、10%(v/v)ウシ胎児血清(Hyclone社)、ペニシリン-ストレプトマイシン(Roche社)及び50ng ml-1 rm-IL21(AIMM Therapeutics社)により補充されたIMDM(Life Technologies社)中で培養して、CD40Lを発現する照射(50Gy)マウスL細胞線維芽細胞(2:1のB細胞/L細胞比)により3〜5日毎に刺激した。
エクソームシーケンシング。ゲノムDNAを、DNeasy精製キット(Qiagen社)を使用して細胞ペレットから抽出して、Covaris S220 Focused-ultrasonicator(Woburn社)を使用して断片化した。Illumina TruSeq DNAライブラリー調製キットを使用して、DNAライブラリーを創出した。エクソン配列は、修飾を伴うAgilent社のプロトコールに従って、Sure Select Human All Exon 50Mb Target Enrichmentシステム(Agilent社)でDNA断片を捕獲して濃縮させた28。1:2の標準物質ベイト反応物を使用して、ハイブリダイゼーション混合物中のBlock#3を、カスタムNKI-Block#3で置き換えて、TruSeq DNAライブラリーを支持し、そこでは、インデックスは、更なるブロッキングを要する。NKI-Block#3は、16.6μg/μlで等量の2つのDNAオリゴ(IDT-DNA)からなる:
NKI3.1
5'AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGC CGTCTTCTGCTTG/3'ddC/3'
NKI3.2
5'CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGT GCTCTTCCGATCT/3'ddC/3'
NKI3.1
5'AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGC CGTCTTCTGCTTG/3'ddC/3'
NKI3.2
5'CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGT GCTCTTCCGATCT/3'ddC/3'
捕獲したライブラリー断片を2つのフラクションに分割して、Illumina P5及びP7オリゴヌクレオチド(IDT-DNA社)を使用して、両方をPCR濃縮した(13サイクル)。
P5プライマー:5'AATGATACGGCGACCACCGAGATCT3'、
P7プライマー:5'CAAGCAGAAGACGGCATACGAG3'。
P5プライマー:5'AATGATACGGCGACCACCGAGATCT3'、
P7プライマー:5'CAAGCAGAAGACGGCATACGAG3'。
両方のPCR反応は、BioAnalyzer DNA 7500チップ(Agilent社)で定量化して、同様に、Illumina HiSeq2000シーケンサーでのペアエンド75bpシーケンシング用に10nM濃度へ組み合わせて、希釈した。BWAバージョン0.5.10を使用して、読取りをヒト参照ゲノムGRCh37へ整列させた20。PCR複製物は、Picard(http://picard.sourceforge.net)を使用してフィルタリングさせて、挿入及び欠失(挿入欠失)付近の再整列を、GATKツールキットを使用して実施した21。
体細胞単一ヌクレオチド変異体(SNV)は、Somatic-sniperを使用して要求され22、腫瘍及び対照の両方における34を上回る体細胞スコアカットオフ及び最低4回の読取りを使用してフィルタリングした。体細胞挿入欠失は、GATK体細胞挿入欠失検出器を使用して要求され、25%の最小変異頻度を使用して、また挿入欠失を示す少なくとも5回の読取りを有してフィルタリングした。検出される体細胞変異体の近傍にある生殖系列変異体は、Samtoolsを使用して同定され23、最小被覆率並びにそれぞれ、10回及び6回の読取りの最小数の交互読取りを使用してフィルタリングされた。次に、SNPeff24を使用して、Ensembl遺伝子ビルドバージョン65に対する全ての変異体の効果を予測した。カスタムPerIスクリプト及びEnsembl APIを使用して、コード変異体はcDNA配列へと編集され、続いて、タンパク質配列へ翻訳された。これらのタンパク質配列は、正常(生殖系列変異体のみ)及び腫瘍試料(生殖系列変異体及び腫瘍特異的突然変異)に関して別個に生成させた。
RNA-シーケンシング。RNAは、TriZol試薬(Life Technologies社)を使用して単離した。ポリA選択RNAライブラリーは、TruSeq RNAライブラリープロトコール(Illumina社)を使用して調製され、ペアエンド50bpシーケンシングをIllumina HiSeq2000で実施した。Tophat 1.4を使用して、読取りをヒト参照ゲノムGRCh37へ整列させた25。Cufflinksを使用して、発現値をFPKMとして算出した26。
ペプチド合成。ペプチドは、NKIペプチド合成施設(アムステルダム)で、前負荷させたWang樹脂を使用してSYRO IIロボットを用いて標準的なFmoc固相ペプチド化学を使用して、活性化因子及び基材としてPyBop及びDipeaを用いて合成した。
TIL由来のCD4+T細胞材料の生成及びネオ抗原反応性の検出。細胞選別は、FACSAria I(BD Biosciences社)又はMoFlo Astrios(Beckman Coulter社)で実施した。バルクCD4+T細胞集団は、CD8(BD Biosciences社;SK1;1:50)及びCD4(BD Biosciences社;SK3;1:50)に対する生きた単一CD4+T細胞染色した抗体の選別により、冷凍保存したTIL材料から生成させた。10%AB血清(Life Technologies社)、Glutamax(Life Technologies社)を補充したRPMI 1640及びAIM-Vの1:1(v/v)培地混合物(Life Technologies社)中で、30ng ml-1のCD3特異的抗体(OKT-3; Janssen-Cilag社)及び3,000IU ml-1 rh-IL-2(Novartis社)を使用して、T細胞/支持細胞比1:200で、単離した生きた単一CD4+CD8-T細胞を増殖させて、ネオエピトープに対するT細胞反応性の決定に使用される純粋なCD4+T細胞集団(日常的に97%を上回るCD4+)を入手した。
ネオエピトープ反応性CD4+T細胞の検出。1ウェル当たり1×105個のBcl-6/Bcl-xL形質導入B細胞に、10%(v/v)ウシ胎児血清(Hyclone社)、ペニシリン-ストレプトマイシン(Roche社)及び50ng ml-1のrm-IL21(AIMM Therapeutics社)により補充されたIMDM培地(Life Technologies社)200μl中で18〜24時間、96丸底プレートにおいてペプチド(別記されない限りは、20μg ml-1)を負荷した。その後、培地を除去して、10%(v/v)AB血清(Life Technologies社)、ペニシリン-ストレプトマイシン(Roche社)及び50ng ml-1のrm-IL21(AIMM Therapeutics社)により補充されたRPMI 1640(Life Technologies社)200μl中で、1ウェル当たり1×105個のCD4+T細胞を添加した。48時間後、培養上清を収集して、製造業者のガイドラインに従って、ヒトTH1/TH2/TH17サイトメトリービーズアレイ(BD Biosciences社)又はIFN-γ FlexビーズE7サイトメトリービーズアレイ(BD Biosciences社)を使用して分析した。フローサイトメトリーによるIFN-γの細胞内レベルの検出に関して、CD4+T細胞を、ペプチドを負荷したB細胞で24時間刺激した。続いて、製造業者のガイドラインに従って、死滅細胞の排除のためのIR-Dye(Life Technologies社)、Cytofix/Cytopermキット(BD Biosciences社)及びIFN-γに対する抗体(BD Biosciences社;25723;1:50)を使用して、細胞を染色した。生IFN-γ産生CD4+T細胞の単離に関して、T細胞を、ペプチドを負荷したB細胞で6時間刺激した。続いて、IFN-γ分泌キャプチャーキット(Miltenyi Biotec社)及びCD4用の抗体(BD Biosciences社;SK3;1:50)を使用して、細胞を染色した。単一の生IFN-γ産生CD4+T細胞をフローサイトメトリーにより選別して、10%AB血清(Life Technologies社)、ペニシリン-ストレプトマイシン(Roche社)及びGlutamax(Life Technologies社)で補充されたRPMI 1640及びAIM-Vの1:1(v/v)培地混合物(Life Technologies社)200μl中で、2×105個の照射PBMC、30ng ml-1のCD3特異的抗体(OKT-3;Janssen-Cilag社)及び3,000IU ml-1の組換えヒトIL-2(Novartis社)を含有する96ウェル丸底プ培養レート中に回収した。7日後、100μlを、rh-IL-2(最終3,000IU ml-1)で補充した新鮮な培地と交換して、14日後にネオエピトープに応答したIFN-γを評価することにより、T細胞特異性が確認された。
TCR配列の同定。T細胞クローンのcDNAを生成及び使用して、Illumina TruSeq DNAライブラリー調製キットを用いてDNAライブラリーを調製した。得られたDNAライブラリーを、ペアエンド150bp化学を使用して、Illumina MiSeqシーケンサーで配列決定した。FASTQファイルにおける配列決定の読取りをヒトゲノムへマッピングして、BWA20及びSAMtools23を使用してNCBI36/hgl8を構築した。得られたBAMファイルにおけるPCR複製物は、Picard(http://picard.sourceforge.net)を使用してフィルタリングさせた。CDR3 TCR配列は、これまでに報告されるように同定した27。TCRα及びβ配列は、社内で開発したパイソンスクリプトで付与した。
統計分析。サイトカイン産生T細胞のサイトカイン濃度及び頻度の差を、両側スチューデントt検定を使用して比較した。0.05未満のP値を有意であるとみなした;有意性は、P<0.05(*)、P<0.01(**)及びP<0.001(***)として示した。
結果
ヒトのがんにおける突然変異の結果として生じる腫瘍特異的ネオ抗原1、2は、臨床上使用されるがん免疫療法の有効性にとって重要であると考えられる3〜5。腫瘍特異的CD4+T細胞応答は公知であり、増えてきた証拠により、ネオ抗原は、腫瘍内CD8+T細胞によりに一般的に認識され得ることが示唆される3、4、6一方で、ネオ抗原特異的CD4+T細胞が、ヒト腫瘍内に一般的に存在するかどうかは未知である。ここで、本発明者等は、不死化Bcl-6/Bcl-xL形質導入B細胞を使用して、腫瘍エクソームシーケンシングにより同定される推定ネオエピトープに対するCD4+T細胞応答の発生を測定する。このアプローチを使用して、本発明者等は、養子T細胞療法後の臨床応答を実証する黒色腫患者を含む、分析した5人の黒色腫患者のうち4人で、ネオ抗原反応性CD4+T細胞の存在を示す。
ヒトのがんにおける突然変異の結果として生じる腫瘍特異的ネオ抗原1、2は、臨床上使用されるがん免疫療法の有効性にとって重要であると考えられる3〜5。腫瘍特異的CD4+T細胞応答は公知であり、増えてきた証拠により、ネオ抗原は、腫瘍内CD8+T細胞によりに一般的に認識され得ることが示唆される3、4、6一方で、ネオ抗原特異的CD4+T細胞が、ヒト腫瘍内に一般的に存在するかどうかは未知である。ここで、本発明者等は、不死化Bcl-6/Bcl-xL形質導入B細胞を使用して、腫瘍エクソームシーケンシングにより同定される推定ネオエピトープに対するCD4+T細胞応答の発生を測定する。このアプローチを使用して、本発明者等は、養子T細胞療法後の臨床応答を実証する黒色腫患者を含む、分析した5人の黒色腫患者のうち4人で、ネオ抗原反応性CD4+T細胞の存在を示す。
I)がん免疫療法の有効性におけるCD4+T細胞に関する役割を支持する証拠7〜12、II)突然変異荷重と、免疫療法に対する臨床応答との間の提唱される相関性13、及びIII)ネオ抗原特異的CD4+T細胞が、転移性胆管細胞癌における腫瘍退縮を媒介し得るという最近の観察10に基づいて、本発明者等は、ネオ抗原特異的CD4+T細胞反応性が、ヒトのがんにおいて稀な現象であるか、又は一般的な現象であるかどうかを理解していくことを望む。黒色腫の平均突然変異荷重は高い1。更に、黒色腫の細胞療法のために生成される腫瘍浸潤リンパ球(TIL)産物14は、通常はかなりの割合のCD4+T細胞を含有し、臨床効果を潜在的に媒介する7、10。これらのデータのため、本発明者等は、様々な突然変異荷重を用いて、一連の黒色腫検体においてネオ抗原特異的CD4+T細胞反応性の発生を検査することを選択した。
これらの腫瘍内の非同義的体細胞突然変異に対する腫瘍内CD4+T細胞応答の発生を評価するために、本発明者等は、全エクソームシーケンシング及びRNA-シーケンシングデータを使用して、まず、発現遺伝子内の一連の腫瘍特異的な非同義的突然変異全体を同定した。続いて、これらの突然変異ペプチドのいずれかに対するCD4+T細胞反応性を、突然変異ペプチドで負荷したレトロウイルスによりBcl-6及びBcl-xL不死化自己B細胞を用いることで分析した15、16(WO 2007/067046も参照)(図1)。
このスクリーニングプラットフォームは、対症的転移巣切除術を受けた患者由来の3つの黒色腫病巣、NKIRTIL018、NKIRTIL034及びNKIRTIL045の分析により確証された。3つの腫瘍全てが、予想されるUV誘導性の突然変異痕跡を示した一方で、総合的な突然変異荷重は大幅に変化した(範囲:180〜464の体細胞突然変異、図2)1、2。平均して153個の突然変異(範囲:99〜187)が、候補物ネオエピトープとして同定された(確認されるRNA発現を有する遺伝子における腫瘍特異的な非同義的突然変異として定義される)。次に、個々の突然変異を網羅するペプチド(31アミノ酸)を、Bcl-6/Bcl-xL不死化自己B細胞上へ負荷させて、得られた標的を、in vitroで増殖させた腫瘍内CD4+T細胞と共にインキュベートした(日常的に97%を上回るCD4+)。続いて、本発明者等は、TH1、TH2及びTH17サイトカインIFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-2、IL-4、IL-6及びIL-17aの存在に関して、培養上清を評価した。対象となるNKIRTIL018に関して、腫瘍由来のCD4+T細胞のIFN-γ産生は、3つの突然変異遺伝子産物CIRH1A P333L(CIRH1AP>L)、GART V551A(GARTV>A)、及びASAP1 P941L(ASAP1P>L)に応答して観察された(図3a)。
重要なことに、これらのネオ抗原特異的CD4+T細胞の検出は、自己Bcl-6/Bcl-xL不死化B細胞を使用する場合に観察される一定の低いバックグラウンドの結果として容易に実行可能であった。逆に、これらのネオ抗原特異的CD4+T細胞の検出は、自己エプスタインバーウイルス(EBV)不死化B細胞では不可能であった(図4)。
これにより、Bcl-6/Bcl-xL不死化B細胞の使用は、EBV不死化B細胞の使用よりも優れていることが実証される。
対象となるNKIRTIL034の黒色腫由来のCD4+T細胞はまた、この場合はRhoファミリーGTPアーゼ3 RND P49S(RND3P>S)内の突然変異に対してネオ抗原反応性を示した。最低の突然変異荷重を有する対象であるNKIRTIL027においてのみ、TH-サイトカインの産生により測定する場合のネオ抗原に対する反応性は、腫瘍内CD4+T細胞区画内で観察されなかった(図3a、データは示していない)。NKIRTIL018及びNKIRTIL034の黒色腫病巣内のネオ抗原反応性CD4+T細胞の存在は、抗原刺激時の細胞内IFN-γレベルの分析により確認した(図3b、図3c)。注目すべきことに、Bcl-6/Bcl-xL不死化B細胞が使用されるこの実験では、非負荷B細胞との共培養後の単一の生CD4+IFN-γ+T細胞の対照頻度は、0.078%(図3b)又は0.277%(図3c)であった。これは、非負荷Bcl-6/Bcl-xL不死化B細胞と共に共培養したCD4+T細胞のほんの0.078%又は0.277%のみが、IFN-γ産生(T細胞活性化を示す)を表示したことを意味する。重要なことに、これらの対照頻度は、EBV不死化B細胞を使用した場合に得られる1.98%の対照頻度よりも遥かに低かった(実施例3及び図10cを参照)。
図3b及び図3cに示すように、CIRH1aP>L認識T細胞の頻度は、0.096%(即ち、0.174%-対照頻度0.078%)であった。GARTV>A認識T細胞の頻度は、0.053%(即ち、0.131%-対照頻度0.078%)であった。ASAP1P>L認識T細胞の頻度は、0.264%(即ち、0.342%-対照頻度0.078%)であり、RND3P>S認識T細胞の頻度は、0.246%(即ち、0.523%-対照頻度0.277%)であった。したがって、ネオ抗原認識T細胞は、非常に低頻度で存在したことが明らかである。それにもかかわらず、それらは、Bcl-6/Bcl-xL不死化B細胞がT細胞ネオ抗原提示用に使用される本発明による非常に感度の高いスクリーニング方法のおかげで、依然として検出され得る。これらのT細胞は、抗原提示細胞としてEBV不死化B細胞を使用して検出されていない。
ネオ抗原反応性CD4+T細胞は、試験した他のサイトカインのいずれの産生も示さなかった(図5)。
T細胞受容体は、多数の異なるエピトープとの相互作用時にT細胞機能を誘発することができ、前記スクリーンでは、多様なT細胞プールが、相当の一連のペプチドの認識に関して試験される。したがって、本発明者等は、観察されるT細胞反応性が、T細胞交差反応性ではなく、本当のネオ抗原駆動型T細胞応答を表したかどうかを、一連の確証スクリーンにおいて評価した。これらのスクリーンでは、NKIRTIL018及びNKIRTIL034のCD4+T細胞プールの、他の対象の一連の潜在的なネオエピトープに対して反応する能力を評価した。この分析により他の対象のネオエピトープのいずれも認識されなかったため、腫瘍由来のCD4+T細胞によるIFN-γ産生が、患者ミュータノーム(mutanome)特異的であることが示され(図6)、Bcl-6/Bcl-xL不死化B細胞の使用によって同定されるネオ抗原反応性のCD4+T細胞の存在が、自己黒色腫における抗原の発現により駆動される真のネオ抗原特異的CD4+T細胞応答を反映することを示した。
これらの黒色腫患者において、ネオ抗原反応性CD4+T細胞区画を更に特徴付けるために、本発明者等は、抗原特異的IFN-γ産生CD4+T細胞の単離により、TILからネオエピトープ反応性CD4+T細胞クローンのパネルを作成した(図7+図8)。ネオ抗原反応性CD4+T細胞の、突然変異同族ペプチドと、その親配列との間を識別する能力を評価するために、ネオ抗原特異的CD4+T細胞を、種々の濃度のいずれかのペプチドで刺激した(図7c+図9)。ASAP1P>L、CIRH1AP>L又はGARTV>Aのいずれかに特異的なT細胞クローン全てに関して、突然変異体ペプチドの認識を、親ペプチドの認識に必要とされる濃度よりも、およそ100〜1,000倍を上回る低い濃度で検出可能であった(図7c+図9)。したがって、自己ミュータノームセットに対するそれらの制限、及びその野生型対応物を上回る突然変異体ペプチドのそれらの優先的認識の両方により、これらの腫瘍常在性CD4+T細胞応答を、真のネオ抗原駆動型T細胞応答として定義する。
同定されたネオエピトープの2つの切断型により、13アミノ酸(RKITFLHRCLISC;CIRH1AP>L)及び19アミノ酸(KPPPGDLPLKPTELAPKPQ;ASAP1P>L)のペプチドが、依然として高い効率で認識されることが明らかとなった(図7c)。両方のエピトープに関して、突然変異残基は、T細胞活性化におけるこのアミノ酸の必須の役割と一致して、切断型エピトープ内の中心位置に位置していた17、18。4つの同定されたネオエピトープそれぞれに関して、TCRアルファ-ベータ配列は、T細胞クローンの小さなセット(8〜11)に関して得られた。この分析により、ネオエピトープ特異的T細胞応答のTCRレパートリーは概して、オリゴクローナルからポリクローナルまで様々であり、これらの4つのエピトープに関して2〜7個の同定されたTCRクロノタイプを有することが実証された(図7b)。したがって、これらの4つのエピトープに対するネオ抗原特異的T細胞応答は、稀なネオ抗原反応性CD4+T細胞の成長(outgrowth)に起因せず、オリゴクローナルからポリクローナルまで様々である。
(実施例2)
ネオ抗原特異的CD4+T細胞反応性が、がんエクソームデータに基づいて容易に検出できること(図3)、及び高頻度のネオ抗原特異的CD4+T細胞を含有するT細胞産物が、胆管細胞癌の部分的退縮を媒介することが近年示されたこと10の観察に基づいて、本発明者等は、ネオ抗原反応性CD4+T細胞区画がまた、養子T細胞療法時に臨床応答を受ける黒色腫患者に普及しているかどうかを分析した。
ネオ抗原特異的CD4+T細胞反応性が、がんエクソームデータに基づいて容易に検出できること(図3)、及び高頻度のネオ抗原特異的CD4+T細胞を含有するT細胞産物が、胆管細胞癌の部分的退縮を媒介することが近年示されたこと10の観察に基づいて、本発明者等は、ネオ抗原反応性CD4+T細胞区画がまた、養子T細胞療法時に臨床応答を受ける黒色腫患者に普及しているかどうかを分析した。
第1の患者であるNKIRTIL027は、TIL療法時に部分的臨床応答を示したステージIVの黒色腫患者であった。エクソームシーケンシングにより、この患者の腫瘍における非常に高い突然変異バーデン(burden)が明らかとなった(総計1393個の体細胞突然変異)(図2)。Bcl-6/Bcl-xL形質導入B細胞を、582個の候補物ネオエピトープの一群で負荷して、非同義的及びRNA発現される突然変異に関するフィルタリング後に同定して、自己黒色腫病巣から増殖させたCD4+T細胞に対する標的として使用した。顕著なことに、この分析により、培養上清におけるIFN-γ産生及びIFN-γ産生の細胞内検出による独立した確認により検出されるように、7つの異なる突然変異遺伝子産物(CPT1A G212S(CPT1AG>S)、HERC4 P768S(HERC4P>S)、GYLTL1B D597E(GYLTL1BD>E)、KRTAP4-11 P187S(KRTAP4-llP>S)、LEMD2 P495L(LEMD2P>L)、DTNBP1 D334H(DTNBP1D>H)、MFSD9 P219L(MFSD9P>L))に対するCD4+T細胞反応性を同定した。特に、この分析により、IFNγ分泌により検出されるように、2 P495L(LEMD2P>L)を含有する突然変異遺伝子産物LEMドメインに対して強力なCD4+T細胞反応性が同定された(図10a)。
注目すべきことに、対象NKIRTIL027へ注入されたT細胞産物は、かなりの割合のCD4+T細胞を含有していた(全てのCD3+T細胞の70%、データは示していない)。したがって、本発明者等は、養子T細胞療法に使用されるT細胞産物内のネオ抗原反応性CD4+T細胞の頻度を評価した。この分析により、総CD4+T細胞の2.9%(範囲:1.7〜4.5%)の平均頻度を有する注入細胞産物内の7つの異なるネオエピトープ反応性CD4+T細胞集団の存在が明らかとなった。図10bは、細胞内サイトカイン染色により、養子T細胞療法に使用されるT細胞産物内で観察されたLEMD2P>L反応性CD4+T細胞(総CD4+T細胞の3.8%)を表す。
注目すべきことに、Bcl-6/Bcl-xL不死化B細胞が使用されたこの実験ではまた、非負荷B細胞との共培養後の単一の生CD4+,IFN-γ+T細胞の対照頻度は、0.52%(自己黒色腫病巣由来のin vitroで増殖させた腫瘍内CD4+T細胞)及び0.20%(養子T細胞療法に使用されるTIL注入産物)であった;図10bを参照されたい。重要なことに、これらの対照頻度は、EBV不死化B細胞が使用される場合に得られた対照頻度1.98%よりも遥かに低い(実施例3及び図10cを参照)。
in vitroで増殖させた腫瘍内CD4+T細胞におけるLEMD2P>L認識T細胞の頻度は、4.74%(即ち、5.26%-対照頻度0.52%)であった。養子T細胞療法に使用されるTIL注入産物におけるLEMD2P>L認識T細胞の頻度は、3.33%(即ち、3.53%-対照頻度0.20%)であった。
(実施例3)
次に、本発明者等は、自己腫瘍細胞による末梢血単核球(PBMC)の刺激により得られるin vitroで増殖させた自己腫瘍特異的T細胞の多重注入を受容したステージIVの黒色腫患者(BO)におけるネオ抗原特異的CD4+T細胞反応性を分析した(ref 19)。治療後に、この患者は、完全な腫瘍寛解を受け、7年間今も継続している。更に、T細胞産物内に存在するCD4+T細胞は、自己黒色腫株の強力な認識を示した(図10c)。Bcl-6/Bcl-xL不死化B細胞は、この対象にはまだ利用可能でなかったため、より大きなバックグラウンドノイズにもかかわらず、自己EBV不死化B細胞を使用しなくてはならなかった。EBV不死化B細胞を、この患者で検出される発現遺伝子内の501個の非同義的突然変異を包含する31量体ペプチドで負荷した。EBV形質転換APCの使用に起因したより高いバックグラウンドノイズにもかかわらず、このスクリーンは、リボソームタンパク質S12の突然変異体バージョン(RPS12 V104I)に向けられた1つの顕著なCD4+T細胞応答(注入産物内の総CD4+T細胞の24%;即ち、26.0%-対照頻度1.98%)を同定した(図10c)。
次に、本発明者等は、自己腫瘍細胞による末梢血単核球(PBMC)の刺激により得られるin vitroで増殖させた自己腫瘍特異的T細胞の多重注入を受容したステージIVの黒色腫患者(BO)におけるネオ抗原特異的CD4+T細胞反応性を分析した(ref 19)。治療後に、この患者は、完全な腫瘍寛解を受け、7年間今も継続している。更に、T細胞産物内に存在するCD4+T細胞は、自己黒色腫株の強力な認識を示した(図10c)。Bcl-6/Bcl-xL不死化B細胞は、この対象にはまだ利用可能でなかったため、より大きなバックグラウンドノイズにもかかわらず、自己EBV不死化B細胞を使用しなくてはならなかった。EBV不死化B細胞を、この患者で検出される発現遺伝子内の501個の非同義的突然変異を包含する31量体ペプチドで負荷した。EBV形質転換APCの使用に起因したより高いバックグラウンドノイズにもかかわらず、このスクリーンは、リボソームタンパク質S12の突然変異体バージョン(RPS12 V104I)に向けられた1つの顕著なCD4+T細胞応答(注入産物内の総CD4+T細胞の24%;即ち、26.0%-対照頻度1.98%)を同定した(図10c)。
注目すべきことに、EBV不死化B細胞を使用したこの実験では、非負荷B細胞との共培養後の単一の生CD4+,IFN-γ+T細胞の対照頻度は、1.98%である。これは、非負荷EBV不死化B細胞と共に共培養したCD4+T細胞の1.98%が、IFN-γ産生(T細胞活性化を示す)を表示したことを意味する。重要なことに、この対照頻度は、実施例1で見られた4つのネオエピトープ特異的T細胞それぞれの頻度よりも遥かに高い。図3b及び図3cに示すように、CIRH1aP>L認識T細胞の頻度は、0.096%(即ち、0.174%-対照頻度0.078%)であった。GARTV>A認識T細胞の頻度は、0.053%(即ち、0.131%-対照頻度0.078%)であった。ASAP1P>L認識T細胞の頻度は、0.264%(即ち、0.342%-対照頻度0.078%)であり、RND3P>S認識T細胞の頻度は、0.246%(即ち、0.523%-対照頻度0.277%)であった。これらの低濃度のネオエピトープ特異的T細胞が、EBV不死化B細胞を使用する場合に存在する遥かに高いバックグラウンドノイズに鑑みて、EBV不死化B細胞を使用して検出されなかったことは明らかである。したがって、EBV不死化B細胞をAPCとして使用した場合、実施例1で同定される4つのネオエピトープ特異的T細胞全てを見逃してきた。これにより、T細胞(ネオ)エピトープ提示APCとしてのBcl-6/Bcl-xL不死化B細胞の使用の優位性が強調される。
結論
前記データは、WO 2007/067046に従う方法で不死化されるB細胞が、T細胞エピトープのT細胞認識を試験するための好ましいAPCであることを示す。
前記データは、WO 2007/067046に従う方法で不死化されるB細胞が、T細胞エピトープのT細胞認識を試験するための好ましいAPCであることを示す。
実施例1及び実施例2に示すように、EBV不死化B細胞は、高レベルのバックグラウンドノイズを提供するので、Bcl-6/Bcl-xL不死化B細胞の使用は、EBV不死化B細胞の使用よりも優れている。逆に、Bcl-6/Bcl-xL不死化B細胞をAPCとして使用する場合、バックグラウンドノイズは、存在したとしても遥かに低い。これは、例えば図4に示される。
これはまた、APCとしてのBcl-6/Bcl-xL不死化B細胞の使用で得られる図3b及び図3cの低い対照頻度(それぞれ、0.078%及び0.277%)と、APCとしてのEBV不死化B細胞の使用で得られる図10の高い対照頻度(1.98%)との間の比較からも明らかである。実際に、図10の対照頻度は、図3に表すネオエピトープ特異的T細胞の頻度よりも遥かに高い。
その結果として、より感度の高い検出方法が、本発明により提供され、それにより、低頻度で存在するT細胞の検出が可能となる。例えば、総CD4+T細胞の2.9%の平均頻度を有する7つの異なるネオエピトープ反応性CD4+T細胞集団が、APCとしてBcl-6/Bcl-xL不死化B細胞を使用して、実施例1で同定された。EBV不死化B細胞を用いた場合、総CD4+T細胞の24%の遥かに高い頻度を有する唯一の顕著なCD4+T細胞応答が検出された(即ち、26.0%-対照頻度1.98%)。
(実施例4)
ヒト黒色腫病巣におけるネオエピトープ特異的CD8+T細胞の検出
この実施例は、ネオエピトープ特異的CD4+T細胞応答の同定に関してこれまでの実施例で記載されるような、APCとしてのBcl-6/Bcl-xL不死化B細胞の使用がまた、ネオエピトープ特異的CD8+T細胞応答を同定するのにも適していることを示す。
ヒト黒色腫病巣におけるネオエピトープ特異的CD8+T細胞の検出
この実施例は、ネオエピトープ特異的CD4+T細胞応答の同定に関してこれまでの実施例で記載されるような、APCとしてのBcl-6/Bcl-xL不死化B細胞の使用がまた、ネオエピトープ特異的CD8+T細胞応答を同定するのにも適していることを示す。
患者NKIRTIL027のエクソーム及びRNAシーケンシングデータ(実施例2を参照)に基づいて、0 FPKMを上回るRNA発現を有する582個の腫瘍特異的単一ヌクレオチド変異体を同定した。これらの突然変異を包含する31アミノ酸のペプチドを合成して、Bcl-6/Bcl-xL不死化自己B細胞上に負荷した。CD8濃縮腫瘍浸潤T細胞(TIL)との48個の共培養を実施して、IFNg濃度を培養上清で測定した。CD8濃縮TIlと、1つのペプチド(TTC37A>V)とのインキュベーションは、バックグラウンドを超える(即ち、非負荷B細胞の対照シグナルを超える)シグナルをもたらした。これは、図11aに示される。この結果の確証として、IFNg濃度が培養上清で測定された別個の共培養を実施した(図11b)。並行して、エピトープ予測を実施し、ここでは、31個のAAエピトープをnetMHCpanへ供給して、患者のHLA-A及びHLA-B対立遺伝子に対する親和性に関して試験した。推定候補物11量体エピトープは、HLA-A*01:01に結合すると予測された。HLA-A*01:01 TTC37A>V多量体を生成させて、2つの異なる蛍光色素にコンジュゲートされた。CD8+濃縮T細胞産物の染色は、全てのCD8+T細胞の0.737%の二重陽性多量体染色をもたらした(図11c)。
ネオエピトープ特異的CD8及びCD4制限T細胞応答の両方のスクリーニングのためのAPCとしてのBcl-6/Bcl-xL不死化B細胞の使用の利用可能性は、がん免疫療法の分野で、この分析プラットフォームの価値を大いに高める。
実施例1〜4の参考文献
[参考文献]
[参考文献]
Claims (40)
- 個体由来の試料が、腫瘍特異的T細胞エピトープ、あるいは自己抗原由来の、又は腫瘍特異的突然変異自己抗原由来の、又は病原体由来のT細胞エピトープを認識するT細胞を含むかどうかを決定する方法であって、
- 少なくとも1つのB細胞において、Bcl-6及び/又はSTAT5の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程、
- 前記少なくとも1つのB細胞において、抗アポトーシス核酸の発現を誘導、増強及び/又は維持する工程、
- 前記少なくとも1つのB細胞の、B細胞培養物への増殖を可能にする工程、
- 前記B細胞培養物のB細胞を、前記T細胞エピトープを含む少なくとも1つの化合物と共にインキュベートする工程、
- 得られたB細胞を、前記試料由来のT細胞と共にインキュベートする工程、及び
- 少なくとも1つのT細胞が、前記T細胞エピトープを認識するかどうかを決定する工程
を含む方法。 - 前記B細胞培養物の前記B細胞を、少なくとも1つのペプチドと共にインキュベートする工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのペプチドが、5から40の間のアミノ酸の長さを有する、請求項2に記載の方法。
- 前記B細胞が、少なくとも2つの異なるペプチドと共にインキュベートされる、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記T細胞が、CD8+細胞障害性T細胞及び/又はCD4+ヘルパーT細胞を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのB細胞及び前記T細胞が、同じヒト個体由来である、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記T細胞エピトープが、修飾自己抗原由来、又は非自己抗原由来、又は自己抗原由来である、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記T細胞エピトープが、腫瘍特異的T細胞エピトープである、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記腫瘍が、黒色腫又は上皮がんである、請求項8に記載の方法。
- 前記T細胞エピトープが、病原体由来である、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記病原体が、ウイルス、細菌又は寄生虫である、請求項10に記載の方法。
- 前記T細胞エピトープが、自己抗原由来である、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料由来の少なくとも1つのT細胞が前記T細胞エピトープの少なくとも1つを認識したかどうかが、前記少なくとも1つのT細胞が活性化されるかどうかを決定することにより決定される、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記T細胞活性化が、サイトカイン放出を測定することにより決定される、請求項13に記載の方法。
- 前記化合物の少なくとも1つのT細胞エピトープを認識するT細胞を含む医薬を調製する工程を更に含む、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
- T細胞により認識される少なくとも1つのT細胞エピトープを同定する工程を更に含む、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのT細胞エピトープを含む、免疫原性組成物、又は予防剤若しくはワクチンを調製する工程を更に含む、請求項16に記載の方法。
- 表面上に前記少なくとも1つのT細胞エピトープを表示する抗原提示細胞を含む、免疫原性組成物、又は予防剤若しくはワクチンを調製する工程を更に含む、請求項16に記載の方法。
- 抗原提示細胞がB細胞である、請求項18に記載の方法。
- 前記B細胞が、障害に罹患しているか又は罹患していた個体由来のT細胞と共にインキュベートされる、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記個体が、がんに罹患しているか又は罹患していた、請求項20に記載の方法。
- 前記がんが黒色腫又は上皮がんである、請求項21に記載の方法。
- 前記個体が、病原体に罹患しているか又は罹患していた、請求項20に記載の方法。
- 前記病原体が、ウイルス、細菌又は寄生虫である、請求項23に記載の方法。
- 前記個体が、自己免疫疾患に罹患しているか又は罹患していた、請求項20に記載の方法。
- 前記自己免疫疾患が、多発性硬化症、糖尿病又はセリアック病である、請求項25に記載の方法。
- 前記T細胞が、前記個体由来の試料由来であり、前記試料において、又は前記試料のin vitroの増殖後のT細胞培養物において、T細胞の総量に対する、前記障害と関連付けられるT細胞エピトープに特異的なT細胞の比率が、10%よりも低いことを特徴とする、請求項20に記載の方法。
- 前記T細胞が、前記個体由来の試料由来であり、前記試料において、又は前記試料のin vitroの増殖後のT細胞培養物において、T細胞の総量に対する、目的の障害と関連付けられるT細胞エピトープに特異的なT細胞の比率が、1.9%よりも低いことを特徴とする、請求項1から27のいずれか一項に記載の方法。
- 前記T細胞が、前記個体由来の試料由来であり、前記試料において、又は前記試料のin vitroの増殖後のT細胞培養物において、T細胞の総量に対する、目的の障害と関連付けられるT細胞エピトープに特異的なT細胞の比率が、1.0%よりも低いことを特徴とする、請求項1から28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記個体由来の試料が使用されるか、又は前記試料のin vitroの増殖後に得られたT細胞培養物のT細胞が使用され、前記試料において、又は前記得られたin vitroのT細胞培養物において、T細胞の総数に対する、前記障害と関連付けられるT細胞エピトープに特異的なT細胞の割合が、10%よりも低い、請求項20に記載の方法。
- 前記個体由来の試料が使用されるか、又は前記試料のin vitroの増殖後に得られたT細胞培養物のT細胞が使用され、前記試料において、又は前記得られたin vitroのT細胞培養物において、T細胞の総数に対する、目的の障害と関連付けられるT細胞エピトープに特異的なT細胞の割合が、1.9%よりも低い、請求項1から30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記個体由来の試料が使用されるか、又は前記試料のin vitroの増殖後に得られたT細胞培養物のT細胞が使用され、前記試料において、又は前記得られたin vitroのT細胞培養物において、T細胞の総数に対する、目的の障害と関連付けられるT細胞エピトープに特異的なT細胞の割合が、1.0%よりも低い、請求項1から31のいずれか一項に記載の方法。
- 前記障害が、がん、感染性疾患、及び自己免疫疾患からなる群から選択される、請求項27から32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記がんが、黒色腫又は上皮がんである、請求項33に記載の方法。
- 前記感染性疾患が、ウイルス感染、細菌感染又は寄生虫感染である、請求項33に記載の方法。
- 前記自己免疫疾患が、多発性硬化症、糖尿病又はセリアック病である、請求項33に記載の方法。
- 前記抗アポトーシス核酸が、抗アポトーシス分子をコードする遺伝子を含む、請求項1から36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗アポトーシス核酸が、BCL2ファミリーの抗アポトーシス分子をコードする遺伝子を含む、請求項37に記載の方法。
- 前記BCL2ファミリーの抗アポトーシス分子をコードする遺伝子が、Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2、A1、Bcl-w、Bcl2L10、又はそれらの機能性部分若しくはホモログである、請求項38に記載の方法。
- 前記T細胞が、CD4+T細胞又はCD8+T細胞である、請求項1から39のいずれか一項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP14171396.6 | 2014-06-05 | ||
| EP14171396 | 2014-06-05 | ||
| PCT/NL2015/050405 WO2015187018A2 (en) | 2014-06-05 | 2015-06-05 | Means and methods for determining t cell recognition |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2017520276A JP2017520276A (ja) | 2017-07-27 |
| JP6840072B2 true JP6840072B2 (ja) | 2021-03-10 |
Family
ID=50897423
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2017516628A Active JP6840072B2 (ja) | 2014-06-05 | 2015-06-05 | Ｔ細胞認識を決定するための手段及び方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10690658B2 (ja) |
| EP (1) | EP3152569B1 (ja) |
| JP (1) | JP6840072B2 (ja) |
| AU (1) | AU2015268982B2 (ja) |
| CA (1) | CA2953277A1 (ja) |
| DK (1) | DK3152569T3 (ja) |
| WO (1) | WO2015187018A2 (ja) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BR112012029066A2 (pt) | 2010-05-14 | 2020-09-01 | The General Hospital Corporation | composições e processos de identificação de neoantígenos específicos de tumor. |
| US10801070B2 (en) | 2013-11-25 | 2020-10-13 | The Broad Institute, Inc. | Compositions and methods for diagnosing, evaluating and treating cancer |
| WO2015085147A1 (en) | 2013-12-05 | 2015-06-11 | The Broad Institute Inc. | Polymorphic gene typing and somatic change detection using sequencing data |
| KR20230076867A (ko) | 2013-12-20 | 2023-05-31 | 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 | 신생항원 백신과의 병용 요법 |
| EP3234193B1 (en) | 2014-12-19 | 2020-07-15 | Massachusetts Institute of Technology | Molecular biomarkers for cancer immunotherapy |
| US10993997B2 (en) * | 2014-12-19 | 2021-05-04 | The Broad Institute, Inc. | Methods for profiling the t cell repertoire |
| IL294183B2 (en) | 2015-05-20 | 2023-10-01 | Dana Farber Cancer Inst Inc | shared neoantigens |
| TWI788307B (zh) | 2016-10-31 | 2023-01-01 | 美商艾歐凡斯生物治療公司 | 用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞之工程化人造抗原呈現細胞 |
| EP3574116A1 (en) | 2017-01-24 | 2019-12-04 | The Broad Institute, Inc. | Compositions and methods for detecting a mutant variant of a polynucleotide |
| US11793867B2 (en) | 2017-12-18 | 2023-10-24 | Biontech Us Inc. | Neoantigens and uses thereof |
| WO2022159460A1 (en) * | 2021-01-20 | 2022-07-28 | Neogene Therapeutics B.V. | Engineered antigen presenting cells |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6982326B1 (en) * | 1991-07-12 | 2006-01-03 | Immulogic Pharmaceutical Corporation | Allergenic proteins and peptides from Japanese cedar pollen |
| AU2006323315B2 (en) * | 2005-12-09 | 2014-02-20 | Academisch Medisch Centrum Bij De Universiteit Van Amsterdam | Means and methods for influencing the stability of antibody producing cells |
| WO2011008093A1 (en) * | 2009-07-15 | 2011-01-20 | Aimm Therapeutics B.V. | Means and methods for producing high affinity antibodies |
| CA2834001C (en) * | 2010-04-22 | 2019-10-29 | Centre Hospitalier De L'universite De Montreal | Method for the identification of t cell epitopes |
-
2015
- 2015-06-05 US US15/316,419 patent/US10690658B2/en active Active
- 2015-06-05 AU AU2015268982A patent/AU2015268982B2/en active Active
- 2015-06-05 CA CA2953277A patent/CA2953277A1/en active Pending
- 2015-06-05 WO PCT/NL2015/050405 patent/WO2015187018A2/en active Application Filing
- 2015-06-05 EP EP15732977.2A patent/EP3152569B1/en active Active
- 2015-06-05 DK DK15732977.2T patent/DK3152569T3/da active
- 2015-06-05 JP JP2017516628A patent/JP6840072B2/ja active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2015268982A1 (en) | 2016-12-22 |
| WO2015187018A3 (en) | 2016-01-28 |
| WO2015187018A2 (en) | 2015-12-10 |
| JP2017520276A (ja) | 2017-07-27 |
| DK3152569T3 (da) | 2020-08-17 |
| NZ727750A (en) | 2021-06-25 |
| EP3152569B1 (en) | 2020-06-10 |
| EP3152569A2 (en) | 2017-04-12 |
| US20170160269A1 (en) | 2017-06-08 |
| CA2953277A1 (en) | 2015-12-10 |
| US10690658B2 (en) | 2020-06-23 |
| AU2015268982B2 (en) | 2021-11-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6840072B2 (ja) | Ｔ細胞認識を決定するための手段及び方法 | |
| Laumont et al. | Tumour-infiltrating B cells: immunological mechanisms, clinical impact and therapeutic opportunities | |
| AU2018390960B2 (en) | Immune cell organoid co-cultures | |
| TWI752930B (zh) | 抗原特異性ｔｃｒ的新生成 | |
| JP2021535752A (ja) | 複数の主要組織適合遺伝子複合体分子に制限したｎｙ−ｅｓｏ−１−特異的ｔ細胞受容体の組成物 | |
| US9040051B2 (en) | Marker genes for regulatory T cells from human blood | |
| CA3189269A1 (en) | Ras neoantigens and uses thereof | |
| JP4365405B2 (ja) | Ｍｈｃ分子と結合する腫瘍関連ペプチド | |
| MX2011006755A (es) | Peptidos clorf59 y vacunas que los incluyen. | |
| NZ727750B2 (en) | Means and methods for determining t cell recognition | |
| US20220228164A1 (en) | Engineered antigen presenting cells | |
| JP2018505682A (ja) | 新規マイナー組織適合抗原およびその使用 | |
| WO2023250168A2 (en) | Magea4 specific t cell receptors | |
| EA041619B1 (ru) | Способ продуцирования человеческих антигенспецифических т-лимфоцитов |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20180514 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20190314 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190408 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20190705 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20190909 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20191007 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200225 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20200508 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200820 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20210118 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20210216 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6840072 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |