MX2011006755A

MX2011006755A - Peptidos clorf59 y vacunas que los incluyen.

Info

Publication number: MX2011006755A
Application number: MX2011006755A
Authority: MX
Inventors: Takuya Tsunoda; Ryuji Ohsawa; Sachiko Yoshimura; Tomohisa Watanabe
Original assignee: Oncotherapy Science Inc
Priority date: 2008-12-24
Filing date: 2009-12-17
Publication date: 2011-07-20
Also published as: US20140199335A1; TW201030018A; JP2012513742A; US20120003253A1; RU2011130796A; CN102333867B; AU2009332389A1; EP2382314A1; IL213318A0; KR20110117112A; SG172374A1; US8735361B2; EP2382314A4; JP5728716B2; CA2747686A1; WO2010073551A1; BRPI0923402A2; CN104193816A; CN102333867A

Abstract

La presente invención proporciona péptidos aislados que tienen la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 43 o fragmentos inmunológicamente activos del mismo, el cual se enlaza a un antígeno HLA y tiene la capacidad de inducción de los linfocitos T citotóxicos (CTL). La presente invención proporciona además péptidos los cuales incluyen uno, dos, o varias inserciones, substituciones, o adiciones de aminoácidos a péptidos o fragmentos anteriormente mencionados, pero todavía tiene la capacidad de inducción de la célula T citotóxica. Además se proporcionan ácidos nucleicos que codifican cualquiera de los péptidos anteriormente mencionados así como agentes y composiciones farmacéuticas que incluyen cualquiera de los péptidos anteriormente mencionados o ácidos nucleicos. Los péptidos, ácidos nucleicos, agentes y composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser utilizados para el tratamiento de cáncer o tumores.

Description

PÉPTIDOS C1QRF59 Y VACUNAS QUE LOS INCLUYEN Referencia Cruzada con Solicitudes Relacionadas La presente solicitud reclama el beneficio de la Solicitud de Patente Japonesa No. 2008-327358, presentada en Diciembre 24, 2008, y la Solicitud de Patente Provisional Norteamericana No. 61/145,912, presentada en Enero 20, 2009, cuyos contenidos están incorporados a la presente descripción como referencia.

Campo de la Invención La presente invención se refiere al campo de la ciencia biológica, más específicamente al campo de la terapia para el cáncer. En particular, la presente invención se refiere a péptidos novedosos que son extremadamente efectivos como vacunas para el cáncer, y fármacos para tratar y prevenir los tumores.

Antecedentes de la Invención Se ha demostrado que los linfocitos T citotóxicos CD8 + (CTLs) reconocen péptidos de epítope derivados de los antígenos asociados con el tumor (TAAs) en moléculas de complejo de histocompatibilidad principales (MHC) de la clase I, y luego matan a células de tumor. Desde el descubrimiento de la familia de antígenos del melanoma (MAGE) como el primer ejemplo de los TAAs, se han descubierto muchos otros TAAs principalmente a través de los métodos inmunológicos (NPL 1: Boon T, Int J Cáncer 1993 Mayo 8, 54(2): páginas de la 177 a la 180; NPL 2: Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Marzo 1, 183(3): páginas de la 725 a la 729). Algunos de estos TAAs están pasando actualmente por el desarrollo clínico objetivo e inmunoterapéutico.

Identificación de los nuevos TAAs que tienen la capacidad de inducir una respuesta inmune potente y específica contra el tumor, garantiza además el desarrollo de la aplicación clínica de las estrategias de vacunación con el péptido para diferentes tipos de cáncer (NPL 3: Harris CC, J Nati Cáncer Inst 1996 Oct 16, 88(20): páginas de la 1442 a la 1455; NPL 4: Butterfield LH y asociados, Cáncer Res 1999 Jul 1, 59(13): páginas de la 3134 a la 3142; NPL 5: Vissers JL y asociados, Cáncer Res 1999 Nov 1, 59(21): páginas de la 5554 a la 5559; NPL 6: van der Burg SH y asociados, J Immunol 1996 May 1, 156(9): páginas de la 3308 a la 3314; NPL 7: Tanaka F y asociados, Cáncer Res 1997 Oct 15, 57(20): páginas de la 4465 a la 4468; NPL 8: Fujie T y asociados, Int J Cáncer 1999 Jan 18, 80(2): páginas de la 169 a la 172; NPL 9: Kikuchi M y asociados, Int J Cáncer 1999 May 5, 81(3): páginas de la 459 a la 466; NPL 10: Oiso M y asociados, Int J Cáncer 1999 May 5, 81(3): páginas de la 387 a la 394). Hasta la fecha, han existido varios reportes clínicos de ensayos utilizando estos péptidos derivados de antígenos asociados con el tumor (NPL 11: Belli F y asociados, J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): páginas de la 4169 a la 4180; NPL 12: Coulie PG y asociados, Immunol Rev 2002 Oct, 188: páginas de la 33 a ia 42; NPL 13: Rosenberg SA y asociados, Nat Med 2004 Sep, 10(9): páginas de la 909 a la 915).

Se ha identificado el 59 (C1orf59) de cuadro de lectura abierta de cromosoma 1, a través de la biblioteca del cADN por medio de la Colección de Genes de Mamíferos (MGC) (NPL 14: Equipo de Programa MGC, Proc Nati Acad Sci E. U. A. 2002 Dic 24; 99(26): páginas de la 16899 a la 16903). Sin embargo no ha sido confirmado si el gen C1orf59 podría ser utilizado como un objetivo para la inmunoterapia contra el cáncer en pacientes con tumores.

Lista de Notaciones Literatura que no son Patentes [NPL 1] Boon T, Int J Cáncer 1993 Mayo 8, 54(2): páginas de la 177 a la 180 [NPL 2] Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): páginas de la 725 a la 729 [NPL 3] Harris CC, J Nati Cáncer Inst 1996 Oct 16, 88(20): páginas de la 1442 a la 1455 [NPL 4] Butterfield LH y asociados, Cáncer Res 1999 Jul 1, 59(13): páginas de la 3134 a la 3142 [NPL 5] Vissers JL y asociados, Cáncer Res 1999 Nov 1, 59(21): páginas de la 5554 a la 5559 [NPL 6] van der Burg SH y asociados, J Immunol 1996 Mayo 1, 156(9): páginas de la 3308 a la 3314 [NPL 7] Tanaka F y asociados, Cáncer Res 1997 Oct 15, 57(20): páginas de la 4465 a la 4468 [NPL 8] Fujie T y asociados, Int J Cáncer 1999 Enero 18, 80(2): páginas de la 169 a la 172 [NPL 9] Kikuchi M y asociados, Int J Cáncer 1999 Mayo 5, 81(3): páginas de la 459 a la 466 [NPL 10] Oiso M y asociados, Int J Cáncer 1999 Mayo 5, 81(3): páginas de la 387 a la 394 [NPL 11] Belli F y asociados, J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): páginas de la 4169 a la 4180 [NPL 12] Coulie PG y asociados, Immunol Rev 2002 Oct, 188: páginas de la 33 a la 42 [NPL 13] Rosenberg SA y asociados, Nat Med 2004 Sep, 10(9): páginas de la 909 a la 915 [NPL 14] Equipo del programa MGC, Proc Nati Acad Sci E.U.A. 2002 Dic 24; 99(26): páginas de la 16899 a la 16903 Breve Descripción de la Invención La presente invención está basada en parte en el descubrimiento de objetivos adecuados de inmunoterapia. Debido a que los TAAs generalmente son percibidos por el sistema inmune como "independiente" y por lo tanto con frecuencia no tienen inmunogenicidad , el descubrimiento de los objetivos apropiados es de extrema importancia. Como se observó anteriormente, el C1orf59 (SEQ ID NO: 43 codificado por el gen de GenBank Acceso No. NM_144584 (SEQ ID NO: 42)) ha sido identificado como activado en los tejidos de cáncer, tales como cáncer de la vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer colo-rectal, cáncer del esófago, cáncer de pulmón de célula no pequeña, (NSCLC), osteosarcoma, cáncer del ovario, cáncer pancreático, cáncer de la próstata, y cáncer de pulmón de célula pequeña, (SCLC). Por lo tanto, el gen C1orf59 es el objetivo candidato de inmunoterapia.

La presente invención está basada, por lo menos en parte, en la identificación de péptidos del epítope específicos del gen C1orf59, los cuales poseen la capacidad de inducir linfocitos citotóxicos T (CTLs) específicos del gen C1orf59. Como se explicará con mayor detalle más adelante, las células mononucleares de la sangre periférica (PBMCs) obtenidas de donantes sanos fueron estimuladas utilizando los péptidos de candidatos de enlace HLA-A*0201 o A*2402 derivados del gen C1orf59. Las líneas CTL con citotoxicidad específica contra las células objetivo positivas HLA-A02 o A24 impulsadas con cada uno de los péptidos candidato fueron establecidas entonces. Estos resultados demuestran que estos péptidos son péptidos de epítope HLA-A02 o A24 restringidos que pueden inducir respuestas inmunes específicas y potentes contra las células que expresan el gen C1orf59. Estos resultados demuestran que el gen C1orf59 es fuertemente inmunogénico y los epítopes del mismo son objetivos efectivos para la inmunoterapia del tumor.

Por consiguiente, es un objeto de la presente invención proporcionar péptidos aislados separados del gen C1orf59 (SEQ ID NO: 43) o fragmentos inmunológicamente activos de los mismos que se enlazan a los antígenos de HLA. Los péptidos de la presente invención se espera que tengan la capacidad de inducción de CTL. Pueden ser utilizados para inducir el CTL ex vivo o pueden ser administrados a un sujeto para inducir respuestas inmunes contra cánceres tales como el cáncer de la vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer colo-rectal, cáncer del esófago, NSCLC, osteosarcoma, cáncer del ovario, cáncer pancreático, cáncer de la próstata, y SCLC. Preferentemente, los péptidos son nonapéptidos o decapéptidos y generalmente, consisten de una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo consistente de las SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 7, 9, 13, 15, 17, 20, 26, 32, 34, 40 y 41, que muestran una capacidad fuerte de inducción de CTL.

La presente invención contempla péptidos modificados, que tienen una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 7, 9, 13, 15, 17, 20, 26, 32, 34, 40 y 41 en donde uno, dos o más aminoácidos son substituidos o agregados, siempre que los péptidos modificados retengan la capacidad de inducción original de CTL.

Además, la presente invención, proporciona polinucleótidos aislados que codifican cualquiera de los péptidos de la presente invención. Estos polinucleótidos pueden ser utilizados para inducir células que expresan el antígeno (APCs) con capacidad de inducción CTL pueden ser administrados a un sujeto para inducir respuestas inmunes contra cánceres así como los péptidos de la presente invención.

Cuando son administrados a un sujeto, los péptidos de la presente invención son presentados en la superficie de las APCs y luego inducir el envío al objetivo CTLs en los péptidos respectivos. Por lo tanto, es un aspecto de la presente invención, proporcionar agentes que incluyen cualesquiera péptidos o polinucleótidos de la presente invención para inducir el CTL. Además, los agentes que incluyen cualquiera de los péptidos o polinucleótidos pueden ser utilizados para el tratamiento y/o para la profilaxis de cánceres, tales como cáncer de la vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer colo-rectal, cáncer del esófago, NSCLC, osteosarcoma, cáncer del ovario, cáncer pancreático, cáncer de la próstata, y SCLC, y/o para prevenir la recurrencia postoperatoria de los mismos. Por lo tanto, todavía un objeto de la presente invención proporcionará agentes farmacéuticos para el tratamiento y/o para la profilaxis de cánceres, y/o para prevenir la recurrencia postoperatoria de los mismos, los cuales incluyen cualquiera de los péptidos de la presente invención. En vez de o además de los péptidos o polinucleótidos de la presente invención, los agentes o agentes farmacéuticos de la presente invención pueden incluir, como ingredientes activos, APCs o exosomas los cuales presentan cualquiera de los péptidos actuales.

Los péptidos o polipéptidos de la presente invención pueden ser utilizados para inducir las APCs las cuales presentan en su superficie un complejo de un antígeno de HLA y el péptido presente, por ejemplo, poniendo en contacto los APCs derivados de un sujeto con el péptido actual o introduciendo un polinucleótido que codifica los péptidos presentes en APCs. Dichos APCs tienen una capacidad alta de inducción de CTL contra los péptidos objetivo y son útiles para la inmunoterapia del cáncer. Por lo tanto, es otro objeto de la presente invención proporcionar métodos para inducir APCs con capacidad de inducción de CTL así como APCs obtenidos por los métodos.

Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un método para inducir CTL, el cual incluye el paso de co-cultivar las células CD8- positivas con APCs o exosomas que presentan un péptido de la presente invención en su superficie o el paso de introducir un gen que incluye un polinucleótido que codifica una subunidad del receptor de célula T (TCR) que se enlaza al péptido presente. Los CTLs que se pueden obtener por los métodos actuales también encuentran uso en el tratamiento y/o prevención de cánceres en los cuales el gen C1orf59 está sobre-expresado, tal como cáncer de la vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer colo-rectal, cáncer del esófago, NSCLC, osteosarcoma, cáncer del ovario, cáncer pancreático, cáncer de la próstata, y SCLC. Por lo tanto, es otro objeto de la presente invención, proporcionar CTLs que se pueden obtener por lo métodos actuales.

Además, un objeto adicional de la presente invención es proporcionar métodos para inducir respuesta inmune contra los cánceres, cuyos métodos incluyen el paso de administrar agentes o composiciones que contienen el gen C1orf59 o fragmentos inmunológicamente activos del mismo, polinucleótidos que codifican el gen C1orf59 o fragmentos de los mismos, o exosomas o APCs que presentan el gen C1orf59 o fragmentos del mismo.

La presente invención también puede ser aplicada a cualesquiera enfermedades relacionadas con la sobre-expresión del gen C1orf59 incluyendo el cáncer, tales como cáncer de la vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer colo-rectal, cáncer del esófago, NSCLC, osteosarcoma, cáncer del ovario, cáncer pancreático, cáncer de la próstata, y SCLC.

Deberá quedar entendido que ambos de la breve descripción de la invención anterior como la siguiente descripción detallada son modalidades de ejemplo, y no restrictivas de la presente invención u otras modalidades alternativas de la presente invención.

Breve Descripción de los Dibujos Aquellos expertos en la técnica podrán apreciar varios aspectos y aplicaciones de la presente invención al tomar en consideración la breve descripción de las figuras y la descripción detallada de la presente invención y sus modalidades preferidas siguientes.

La figura 1, incluye una serie de fotografías de la (a) a la (j) que ilustran los resultados de los ensayos ELISPOT de IFN-gamma en los CTLs que fueron inducidos con los péptidos derivados del gen C1orf59. Los CTLs en el depósito #6 estimulado con el gen C1 orf59-A02-9-261 (SEQ ID NO: 1) (a), #2 y #7 con C1 orf59-A02-9-152 (SEQ ID NO: 3) (b), #4 y #6 con C1orf59-A02-9-121 (SEQ ID NO 4) (c), #3 con C1 orf59-A02-9-122 (SEQ ID NO 7) (d), #5 con C1 orf59-A02-10-240 (SEQ ID NO: 9) (e), #4 con C1 orf59-A02-10-90 (SEQ ID NO: 13) (f), #7 con C1orf59-A02-10-188 (SEQ ID NO: 15) (g), #4 y #8 con C1orf59-A02-10-122 (SEQ ID NO: 17) (h), y #2 con C1orf59-A02-10-196 (SEQ ID NO: 20) (i) mostraron una producción potente de IFN-gamma comparada con el control, respectivamente. Las células en los depósitos indicaron con el cuadro rectangular fueron expandidas para establecer las líneas CTL. En contraste, como un caso típico de datos negativos, no se detectó producción específica IFN-gamma para los CTL estimulados con el gen C1 orf59-A02-10-261 (SEQ ID NO: 8) (j). En las figuras, " + " indica la producción de IFN-gamma contra las células objetivo impulsadas por el péptido apropiado y "-" indica que la producción de IFN-gamma contra las células objetivo no han sido impulsadas con péptido alguno.

La figura 2 incluye una serie de gráficas de línea de la (a) a la (e) que ilustran la producción de IFN-gamma en líneas de células estimuladas CTL con el gen C1 orf59-A02-9-152 (SEQ ID NO: 3) (a), C1 orf59-A02-9-121 (SEQ ID NO: 4) (b). C1orf59-A02-10-188 (SEQ ID NO: 15) (c), C1 orf 59-A02-10-122 (SEQ ID NO: 17) (d), y C1 orf59-A02-10-196 (SEQ ID NO: 20) (e) con el ensayo ELISA de IFN-gamma. Las líneas CTL establecidas por estímulo con cada péptido mostraron una producción potente de IFN-gamma comparada con el control. En las figuras, " + " indica que la producción de IFN-gamma contra las células objetivo se impulsaron con los péptidos apropiados y "-" indica que la producción IFN-gamma contra las células objetivo no había sido impulsada con péptidos algunos.

La figura 3 ilustra una producción de IFN-gamma de los clones CTL establecida por la limitación de la dilución de las líneas CTL estimuladas con el gen C1 orf59-A02-9-121 (SEQ ID NO: 4) (a), C 1 orf59-A02-10-188 (SEQ ID NO: 15) (b) y C1orf59-A02-10-196 (SEQ ID NO: 20) (c). Los resultados ilustrados en esta solicitud demuestran que los clones CTL establecidos por el estímulo de cada uno de los péptidos mostraron una producción potente de IFN-gamma comparada con el control. En la figura, " + " indica la producción de IFN-gamma contra las células objetivo impulsadas con el péptido apropiado y "-" indica la producción de IFN-gamma contra células objetivo que no han sido impulsadas con péptidos alguno.

La figura 4, incluye una serie de gráficas de líneas de la (a) a la (c) que ¡lustran la actividad específica del CTL contra las células objetivo que expresan exógenamente el gen C1orf59 y HLA-A*0201. Las células COS7 transfectadas con el antígeno de HLA-A*0201 o con el gen C1orf59 de longitud completa fueron preparadas como control. Las líneas CTL establecidas con el gen C1 orf59-A02-9-152 (SEQ ID NO: 3) (a), C1orf59-A02-9-121 (SEQ ID NO: 4) (b) y C1 orf59-A02-10-188 (SEQ ID NO: 15) (c) mostraron una actividad CTL específica contra las células COS7 transfectadas con ambos genes C1orf59 y el HLA-A*0201 (pastillas negras). En contraste, no se detectó actividad CTL específica importante contra las células objetivo que expresen ya sea el antígeno HLA-A*0201 (triángulo) o el gen C1orf59 (círculo).

La figura 5 ilustra fotografías que muestran los resultados del ensayo ELISPOT de IFN-gamma en los CTLs que fueron inducidos con los péptidos derivados del gen C1orf59. Los CTLs en el depósito #5 estimulado con el gen C1 orf59-A24-9-221 (SEQ ID NO: 26) (a), #3 con el gen C1 orf59-A24-9-66 (SEQ ID NO: 32) (b), #4 con el gen C1 orf59-A24-9-200 (SEQ ID NO: 34) (c), #5 con el gen C1 orf59-A24-10-124 (SEQ ID NO: 40) (d) y #7 con el gen C1 orf59-A24-10-363 (SEQ ID NO: 41) (e) mostraron una producción potente de IFN-gamma comparada con el control, respectivamente. El cuadrado en el depósito de estas fotos indican que las células del depósito correspondientes expandidas para establecer las líneas CTL. En las figuras, " + " indica las células en los depósitos que fueron impulsadas con los péptidos apropiados, y "-" indica que las células han sido expulsadas con los péptidos.

La figura 6 ilustra las gráficas de líneas que muestran la producción de IFN-gamma de las líneas CTL estimuladas por el gen C1 orf59-A24-9-221 (SEQ ID NO: 26) (a), C1 orf59-A24-9-66 (SEQ ID NO: 32) (b), C1 orf59-A24-9-200 (SEQ ID NO: 34) (c), C1orf59-A24-10-124 (SEQ ID NO: 40) (d) y el gen C1orf59-A24-10-363 (SEQ ID NO: 41) (e) con la prueba de ELISA. Se demostró que las líneas CTL establecidas por el estímulo con cada péptido mostraron una producción potente de IFN-gamma comparada con el control. En las figuras, " + " indica que las células fueron impulsadas con el péptido apropiado y "-" indica que las células no habían sido impulsadas con péptidos algunos.

La figura 7 muestra que la producción de IFN-gamma de los clones CTL establecidos por el límite de la dilución de las líneas CTL estimuladas con el gen C1orf59-A24-9-221 (SEQ ID NO: 26) (a y b), C1 orf59-A24-9-66 (SEQ ID NO: 32) (c), C1orf59-A24-9-200 (SEQ ID NO: 34) (d), C 1 orf 59-A24- 10- 124 (SEQ ID NO: 40) (e) y C1 orf 59-A24-10-363 (SEQ ID NO: 41) (f). Se demostró que los clones CTL que se establecieron para estos péptidos mostraron una producción potente de IFN-gamma comparada con el control. En las figuras, " + " indica que las células fueron impulsadas con la SEQ ID NO: 26 (a y b), SEQ ID NO: 32 (c), SEQ ID NO: 34 (d), SEQ ID NO: 40 (e) y la SEQ ID NO: 41 (f) y la "-" indica que las células no han sido impulsadas con péptido alguno.

La figura 8 ilustra gráficas de líneas que muestran la actividad específica del CTL contra las células objetivo que expresan el gen C1orf59 y HLA-A*2402. Las células COS7 transfectadas con solamente el antígeno de HLA-A*2402 o con el gen C1orf59 de longitud completa solamente, fueron preparadas como control. Los clones de CTL establecidos con el gen C1 orf59-A24-9-221 (SEQ ID NO: 26) mostraron específicamente una actividad CTL contra las células COS7 transfectadas con ambos genes C1orf59 y el antígeno HLA-A*2402 (pastilla negra). Por otra parte, no se detectó actividad específica del CTL importante contra las células objetivo que expresan cualquiera del antígeno HLA-A*2402 (triángulo) o el gen C1orf59 (círculo).

Descripción Detallada de la Invención Aunque cualquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los aquí descritos pueden ser utilizados en la práctica o prueba de las modalidades de la presente invención, los métodos preferidos, aparatos, y materiales se describirán ahora. Sin embargo, antes que los materiales y métodos presentes estén descritos, deberá quedar entendido que la presente invención no está limitada a tamaños, formas, dimensiones, materiales, metodologías, protocolos, etc. aquí descritos, ya que estos pueden variar de acuerdo con la experimentación de rutina y optimización. También deberá quedar entendido que la terminología utilizada en la descripción para propósitos de descripción de las versiones particulares o modalidades solamente, y que no pretenden limitar el alcance de la presente invención el cual será limitado solamente por las reivindicaciones adjuntas.

La descripción de todas las publicaciones, patentes o solicitudes de patentes mencionadas en esta descripción están incorporadas específicamente a la misma en su totalidad como referencia. Sin embargo, nada de lo que se ha expresado deberá ser interpretado como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a anteceder dicha descripción o en virtud de una invención anterior.

En caso de conflicto, la presente descripción, incluyendo las definiciones serán las que controlen. Además, los materiales, métodos y ejemplos son únicamente ilustrativos y no pretenden ser limitativos.

I. Definiciones Las palabras "uno", "una", y "el/la" como se usan en la presente descripción significan "por lo menos uno" a menos que se indique específicamente lo contrario.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" son utilizados de manera intercambiable para referirnos a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos aplican a los polímeros de aminoácidos en los cuales uno o más residuos de aminoácidos son un residuo modificado, o un residuo que ocurre de manera que no es natural tal como una imitación química artificial de un aminoácido que ocurre naturalmente correspondiente, como los polímeros de aminoácidos que ocurren de manera natural.

El término "aminoácido" como se usa en la presente descripción se refiere a aminoácidos sintéticos y que ocurren de manera natural, así como análogos de aminoácidos e imitaciones de aminoácidos que funcionan de una manera similar a los aminoácidos que ocurren de manera natural. Los aminoácidos pueden ser ya sea L-aminoácidos o D-aminoácidos. Los aminoácidos que ocurren de manera natural son aquellos codificados por el código genético, así como aquellos modificados después de la traducción en las células (por ejemplo, hidroxiprolina, gama-carboxiglutamato, y O-fosfoserina). La frase "análogo de aminoácido" se refiere a compuestos que tienen la misma estructura química básica (un enlace de alfa carbono a un hidrógeno, grupo carboxi, un grupo amino, y un grupo R) como los aminoácidos que ocurren de manera natural pero que tienen un grupo R modificado o estructuras modificadas (por ejemplo, homoserina, norleucina, metionina, sulfóxido, metionina metil sulfonio). La frase "imitación de aminoácido" se refiere a compuestos químicos que tienen estructuras diferentes pero funciones similares a los aminoácidos generales.

A los aminoácidos nos podemos referir en la presente descripción por sus símbolos generalmente conocidos de tres letras o los símbolos de una letra recomendados por la IUPAC-IUB Comisión de Nomenclatura Bioquímica.

Los términos "gen", "polinucleótidos", "nucleótidos" y "ácidos nucleicos" son utilizados de manera intercambiable y, a menos que se indique específicamente lo contrario son similares a los aminoácidos que nos referimos por sus códigos de una sola letra generalmente aceptados. A menos que se defina lo contrario, el término "cáncer" se refiere a los cánceres que sobre-expresan el gen C1orf59, los ejemplos incluyen pero no están limitados a cáncer de la vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer colo-rectal, cáncer del esófago, cáncer del pulmón de célula no pequeña (NSCLC), osteosarcoma, cáncer del ovario, cáncer pancreático, cáncer de la próstata, y cáncer del pulmón de célula pequeña (SCLC)s.

A menos que se defina lo contrario, los términos "linfocito T citotóxico", "célula T citotóxica" y "CTL" son utilizados de manera intercambiable en la presente descripción y a menos que se indique específicamente lo contrario se refiere a un sub-grupo de linfocitos T que tienen la capacidad de reconocer células que no son independientes (por ejemplo, células de tumor, células infectadas con virus) e inducir la muerte de dichas células.

A menos que se defina lo contrario, los términos "HLA-A02" se refieren al antígeno HLA-A2 del tipo que contienen los subtipos tales como los antígenos HLA-A0201 o HLA-A0206.

A menos que se defina lo contrario, los términos técnicos y científicos aquí utilizados tienen el mismo significado que el generalmente entendido por un experto en la técnica el cual permanece a la presente invención.

II. Péptidos Con el objeto de mostrar que los péptidos derivados del gen C1orf59 funcionan como un antígeno reconocido por los CTLs, los péptidos derivados del gen C1orf59 (SEQ ID NO: 43) fueron analizados para determinar si eran epítopes del antígeno restringidos por HLA-A02 o A24 los cuales son generalmente encontrados en los alelos de HLA (Date Y y asociados, Tissue Antigens 47: páginas 93 a 101, 1996; Kondo A y asociados, J Immunol 155: páginas 4307 a 4312, 1995; Kubo RT y asociados, J Immunol 152: páginas 3913 a 3924, 1994). Los candidatos de los péptidos de enlace HLA-A02 derivados del gen C1orf59 fueron identificados basados en sus afinidades de enlace al antígeno de HLA-A02. Los siguientes péptidos son los péptidos candidato: C1orf59-A02-9-261 (SEQ ID NO: 1), C1orf59-A02-9-333 (SEQ ID NO: 2), C1orf59-A02-9-152 (SEQ ID NO: 3), C1orf59-A02-9-121 (SEQ ID NO: 4), C1orf59-A02-9-271 (SEQ ID NO: 5), C1orf59-A02-9-63 (SEQ ID NO: 6), C1orf59-A02-9-122 (SEQ ID NO: 7), C1orf59-A02-10-240 (SEQ ID NO: 9), C1orf59-A02-10-260 (SEQ ID NO: 10), C1orf59-A02-10-270 (SEQ ID NO: 11), C1orf59-A02-10-346 (SEQ ID NO: 12), C1orf59-A02-10-90 (SEQ ID NO: 13), C1orf59-A02-10-334 (SEQ ID NO: 14), C1orf59-A02-10-188 (SEQ ID NO: 15), C1orf59-A02-10-121 (SEQ ID NO: 16), C1orf59-A02-10-122 (SEQ ID NO: 17), C1orf59-A02-10-30 (SEQ ID NO: 18), C1orf59-A02-10-183 (SEQ ID NO: 19), C1orf59-A02-10-196 (SEQ ID NO: 20), C1orf59-A02-10-10 (SEQ ID NO: 21), C1orf59-A02-10-66 (SEQ ID NO: 22), C1orf59-A02-10-326 (SEQ ID NO: 23), y C1orf59-A02-10-252 (SEQ ID NO: 24).

Después del estímulo in vitro de las células T por las células dendríticas (DCs) cargados con estos péptidos, Los CTLs fueron establecidos de manera exitosa utilizando cada uno de los siguientes péptidos: C1orf59-A02-9-261 (SEQ ID NO: 1), C1orf59-A02-9-152 (SEQ ID NO: 3), C1orf59-A02-9-121 (SEQ ID NO: 4), C1orf59-A02-9-122 (SEQ ID NO: 7), C1orf59-A02-10-240 (SEQ ID NO: 9), C1orf59-A02-10-90 (SEQ ID NO: 13), C1orf59-A02-10-188 (SEQ ID NO: 15), C1orf59-A02-10-122 (SEQ ID NO: 17), y C1orf59-A02-10-196 (SEQ ID NO: 20).

Los candidatos de los péptidos de enlace de HLA-A24 derivados del gen C1orf59 fueron identificados basados en sus afinidades de enlace al antígeno de HLA-A24. Los péptidos siguientes son los péptidos candidatos: C1orf59-A24-9-385-25 (SEQ ID NO: 25), C1orf59-A24-9-221-26 (SEQ ID NO: 26), C1orf59-A24-9-338-27 (SEQ ID NO: 27), C1orf59-A24-9-339-28 (SEQ ID NO: 28), C1orf59-A24-9-182-29 (SEQ ID NO: 29), C1orf59-A24-9-35-30 (SEQ ID NO: 30), C1orf59-A24-9-253-31 (SEQ ID NO: 31) C1orf59-A24-9-66-32 (SEQ ID NO: 32), C1orf59-A24-9-145-33 (SEQ ID NO: 33), C1orf59-A24-9-200-34 (SEQ ID NO: 34), C1orf59-A24-9-257-35 (SEQ ID NO: 35), C1orf59-A24-9-144-36 (SEQ ID NO: 36), C1orf59-A24-9-151-37 (SEQ ID NO: 37), C1orf59-A24-9-338-38 (SEQ ID NO: 38), C1orf59-A24-9-97-39 (SEQ ID NO: 39), C1orf59-A24-9-124-40 (SEQ ID NO: 40), y C1orf59-A24-9-363-41 (SEQ ID NO: 41).

Después del estímulo in vitro, de las células T por las células dendríticas (DCs) cargadas con estos péptidos, se establecieron de manera exitosa los CTLs utilizando cada uno de los siguientes péptidos: C1orf59-A24-9-221-26 (SEQ ID NO: 26), C1orf59-A24-9-66-32 (SEQ ID NO: 32), C1orf59-A24-9-200-34 (SEQ ID NO: 34), C1orf59-A24-9-124-40 (SEQ ID NO: 40), y C1orf59-A24-9-363-41 (SEQ ID NO: 41).

Estos CTLs establecidos muestran una actividad potente específica del CTL contra las células objetivo impulsadas con los péptidos respectivos. Estos resultados aquí demuestran que el gen C1orf59 es un antígeno reconocido por el CTL y que los péptidos son péptidos del epítope del gen C1orf59 restringidos por los antígenos HLA-A02 o A24.

Debido a que el gen C1orf59 expresado en las células cancerosas tales como cáncer de la vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer colo-rectal, cáncer del esófago, NSCLC, osteosarcoma, cáncer del ovario, cáncer pancreático, cáncer de la próstata, y SCLC y no expresados en la mayor parte de los órganos normales, es un buen objetivo para la inmunoterapia. Por lo tanto, la presente invención proporciona nonapéptidos (péptidos que contienen nueve residuos de aminoácidos) y decapéptidos (péptidos que contienen diez residuos de aminoácidos) correspondientes a los epítopes del gen CTL reconocidos por el C1orf59. Los ejemplos preferidos de los nonapéptidos y de los decapéptidos de la presente invención incluyen aquellos péptidos que consisten de la secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 7, 9, 13, 15, 17, 20, 26, 32, 34, 40 y 41.

Generalmente, los programas de software actualmente disponibles en el Internet, tales como aquellos que describen en Parker KC y asociados en, J Immunol 1994 Enero 1, 152(1): páginas 163 a 175, pueden ser utilizados para calcular las afinidades de enlace entre los diferentes péptidos y antígenos de HLA en sílice. Las afinidades de enlace con los antígenos de HLA pueden ser medidos como se describen, por ejemplo, en las referencias de Parker KC y asociados, en J Immunol 1994 Enero 1, 152(1): páginas 163 a 175; y Kuzushima K y asociados, en Blood 2001, 98(6): páginas 1872 a 1881. Los métodos para determinar la afinidad de enlace se describen, por ejemplo, en el artículo "Diario de Métodos Inmunológicos", (Journal of Immunological Methods), 1995, 185: páginas 181 a 190; "Ciencia de las Proteínas", (Protein Science), 2000, 9: páginas 1838 a 1846. Por lo tanto, se pueden seleccionar fragmentos inmunológicamente activos derivados del gen C1orf59, los cuales tienen una alta afinidad de enlace con los antígenos de HLA utilizando dichos programas de software. Por lo tanto, la presente invención comprende péptidos que consisten de cualesquiera fragmentos inmunológicamente activos derivados del gen C1orf59 los cuales se enlazan a los antígenos de HLA identificado utilizando dichos programas conocidos. El péptido de la presente invención puede ser el péptido que consiste del gen C1orf59 de longitud completa.

Los péptidos de la presente invención pueden ser flanqueados con residuos adicionales de aminoácidos siempre que el péptido resultante retenga la capacidad de inducción de CTL. Los residuos de aminoácidos que van a ser flanqueados a los péptidos actuales pueden estar completos de un tipo de aminoácido siempre que no dañen la capacidad de inducción de CTL del péptido original. Por lo tanto, la presente invención comprende péptidos que incluyen los péptidos derivados de C1orf59 y una afinidad de enlace con los antígenos HLA. Dichos péptidos generalmente son menores que aproximadamente 40 aminoácidos, con frecuencia menores de aproximadamente 20 aminoácidos, y generalmente menores de aproximadamente 15 aminoácidos.

En general, la modificación de uno, dos o más aminoácidos en un péptido no influirán en la función del péptido y en algunos casos inclusive mejorará la función deseada de la proteína original. De hecho, los péptidos modificados (es decir, los péptidos compuestos de la secuencia de aminoácidos en las cuales uno, dos o varios residuos de aminoácidos han sido modificados (por ejemplo, substituidos, eliminados, agregados, o insertados comparados con una secuencia de referencia original) han sido conocidos que retienen la actividad biológica del péptido original (ver Publicaciones de Mark y asociados, en Proc Nati Acad Sci EUA 1984, 81: páginas 5662 a 5666; Zoller y Smith, en Nucleic Acids Res 1982, 10: páginas 6487 a 6500; Dalbadie-McFarland y asociados, en Proc Nati Acad Sci EUA 1982, 79: páginas 6409 a 6413). Por lo tanto, en una modalidad, los péptidos de la presente invención, deben tener tanto la capacidad de inducción de CTL como la secuencia de aminoácido seleccionada de entre la SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 7, 9, 13, 15, 17, 20, 26, 32, 34, 40 y 41, en donde uno, dos o más aminoácidos son agregados, insertados y/o substituidos.

Aquellos expertos en la técnica reconocerán que las adiciones o substituciones individuales a una secuencia de aminoácidos que altera un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos tiende a resultar en la conservación de las propiedades de la secuencia original de aminoácidos. Como tal, ellos con frecuencia son a los que nos referimos como "substituciones conservadoras" o "modificaciones conservadoras", en donde la alteración de la proteína resulta en una proteína modificada que tiene un análogo de función a la proteína original. Las tablas de substitución conservadoras que proporcionan aminoácidos similares funcionalmente son bien conocidas en la técnica. Los ejemplos de las características de cadena lateral de aminoácidos que se desean conservar incluyen, por ejemplo, aminoácidos hidrofóbicos (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), aminoácidos hidrofílicos (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), y cadenas laterales que tienen los siguientes grupos funcionales o características en común: cadena lateral alifática (G, A, V, L, I, P); una cadena lateral que contiene un grupo hidroxilo (S, T, Y); una cadena lateral que contiene un átomo de azufre (C, M); una cadena lateral que contiene un ácido carboxílico y amida (D, N, E, Q); una cadena lateral que contiene una base (R, K, H); y una cadena lateral que contiene un aromático (H, F, Y, W). Además, los siguientes ocho grupos cada uno contiene aminoácidos que son aceptados en la técnica como substituciones conservadoras entre ellas: 1 ) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E); 3) Aspargina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); y 8) Cisteína (C), Metionina (M) (ver por ejemplo, Creighton, en "Proteínas" (Proteins) 1984).

Dichos péptidos modificados conservadoramente también son considerados que son péptidos de la presente invención.

Sin embargo, los péptidos de la presente invención no están restringidos a los mismos y pueden incluir modificaciones no conservadoras, siempre que el péptido modificado retenga la capacidad de inducción de CTL del péptido original. Además, los péptidos modificados no deben de excluir los péptidos que se pueden inducir en CTL de variantes polimórficas, homólogos interespecies, y alelos del gen C1orf59.

Para retener la capacidad de inducción de CTL requerida se puede modificar (insertar, eliminar, agregar y/o substituir) un número pequeño (por ejemplo, 1, 2 o varios) o un porcentaje pequeño de aminoácidos. En la presente descripción el término "varios" significa 5 o menos aminoácidos, por ejemplo, 4, 3 o menos. El porcentaje de aminoácidos que van a ser modificados preferentemente es del 20% o menor, más preferentemente del 15% o menor, y todavía más preferentemente del 10% o menor o de 1% a 5%.

Además, los péptidos de la presente invención pueden ser insertados, substituidos o agregados con los residuos de aminoácidos o los residuos de aminoácidos pueden ser eliminados para lograr una afinidad de enlace más alta. Cuando son utilizados en el contexto de inmunoterapia, los péptidos presentes deben de ser presentados en la superficie de una célula o exosoma, preferentemente en una forma de un complejo con un antígeno de HLA. Además de los péptidos que son mostrados naturalmente, debido a la regularidad de las secuencias de péptidos mostradas por los antígenos de enlace HLA que ya son conocidos (J Immunol 1994, 152: página 3913; Immunogenetics 1995, 41: página 178; J Immunol 1994, 155: página 4307), modificaciones basadas en dicha regularidad pueden ser introducidas dentro del péptido inmunogénico de la presente invención. Por ejemplo, puede ser deseable substituir el segundo aminoácido de la terminal -N substituidos con fenilalanina, tirosina, metionina, o triptofano, y/o el aminoácido en la Terminal-C con fenilalanina, leucina, isoleucina, triptofano, o metionina con el objeto de aumentar el enlace al antígeno HLA-A24. Por lo tanto, los péptidos que tienen la secuencia de aminoácidos seleccionados del grupo consistente de las SEQ ID NOs: 26, 32, 34, 40 y 41 en donde el segundo aminoácido de la terminal — N es la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs que es substituida con fenilalanina, tirosina, metionina, o triptofano, y péptidos y/o en donde la Terminal -C de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs es substituida por fenilalanina, leucina, isoleucina, triptofano, o metionina están comprendidos por la presente invención. Por otra parte, los péptidos que poseen una alta afinidad al antígeno HLA-A02 tienen su segundo aminoácido de la terminal -N substituido por leucina o metionina, y el aminoácido de la Terminal -C es substituido por valina o leucina. Por lo tanto, los péptidos que tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 7, 9, 13, 15, 17 y 20 en donde el segundo aminoácido de la terminal -N es substituido por leucina o metionina y/o en donde el de la terminal -C es substituido con valina o leucina están comprendidos por la presente invención. Las substituciones se pueden introducir no solamente en los aminoácidos terminales sino también en la posición de receptor potencial de la célula T (TCR) reconocimiento de los péptidos. Varios estudios han demostrado que un péptido con substituciones de aminoácidos pueden ser igual o mejor que el original, por ejemplo, CAP1, p53 (264-272), Her-2/neu (369-377) o gp100 (209-217) (Zaremba y asociados. Cáncer Res. 57, páginas 4570 a 4577, 1997, T. K. Hoffmann y asociados. J Immunol. (2002) Feb 1 ; 168(3):páginas 1338 a 1347., S. O. Dionne y asociados. Cáncer Immunol immunother. (2003) 52: páginas 199 a 206 y S. O. Dionne y asociados. Cáncer Immunology, Immunotherapy (2004) 53, páginas 307 a 314).

La presente invención también contempla la adición de uno, dos o varios aminoácidos a las terminales -N y/o -C de los péptidos descritos. Dichos péptidos modificados que tienen una alta afinidad de enlace del antígeno de HLA y la capacidad de inducción de CTL retenida también están incluidos en la presente invención.

Sin embargo, cuando la secuencia de péptidos es idéntica a la porción de la secuencia de aminoácido de una proteína exógena o endógena que tienen una función diferente, se pueden inducir efectos secundarios tales como enfermedades autoinmunes y/o síntomas alérgicos contra substancias específicas. Por lo tanto, se prefiere realizar primero las búsquedas de homología utilizando las bases de datos disponibles para evitar situaciones en las cuales la secuencia del péptido se acopla con la secuencia de aminoácidos de otra proteína. Cuando queda claro a partir de las búsquedas de homología que no existen aún un péptido con 1 6 2 diferencias de aminoácidos comparados con el péptido objetivo, el péptido objetivo puede ser modificado con el objeto de aumentar su afinidad de enlace con los antígenos HLA, y/o aumentar su capacidad de inducción de CTL sin peligro alguno de dichos efectos secundarios.

Aunque los péptidos que tienen alta afinidad de enlace con los antígenos HLA que se describen anteriormente se espera que se hagan altamente efectivos, los péptidos candidatos, los cuales son seleccionados de acuerdo con la presencia de la alta afinidad de enlace como un indicador, son examinados adicionalmente por la presencia de la capacidad de inducción de CTL. En este caso, la frase "capacidad de inducción de CTL" indica la capacidad del péptido para inducir los CTLs cuando son presentados en las células que presentan el antígeno (APCs). Además, "la capacidad de inducción de CTL" incluye la capacidad del péptido para inducir la activación CTL, la proliferación de CTL, promover la lisis del CTL de las células objetivo, y para aumentar la producción de IFN-gamma de CTL.

La confirmación de la capacidad de inducción de CTL es lograda induciendo antígenos humanos HC portadores de los APCs (por ejemplo, B-linfocitos, macrófagos, y células dendríticas (DCs)), o más específicamente las DCs derivadas de los leucocitos mononucleares de la sangre periférica humana, y después del estímulo con los péptidos, mezclar las células CD8- positivas, y luego medir el IFN-gamma producido y liberado por el CTL contra las células objetivo. Conforme el sistema de reacción, los animales transgénicos que han sido producidos para expresar un antígeno de HLA humano (por ejemplo, aquellos descritos en BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Agosto, 61(8): páginas 764 a 779, Artículos Relacionados, Libros, Inducción del Desenlace de la respuesta de CTL por una vacuna mínima del epítope en los antígenos HLA A*0201/DR1 de los ratones transgénicos: se puede utilizar la dependencia de los antígenos HLA clase II de la respuesta T(H) restringida). Por ejemplo, las células objetivo pueden ser etiquetadas con 51Cr y similares, y la actividad citotóxica puede ser calculada a partir de la radioactividad liberada de células objetivo. Alternativamente, la capacidad de inducción de CTL puede ser evaluada midiendo el IFN-gamma producido y liberado por el CTL en la presencia de APCs que es portador de péptidos inmovilizados, y visualizando la zona de inhibición de los medios usando anticuerpos monoclonales y anti-IFN-gamma.

Como resultado de examinar la capacidad de inducción de CTL de los péptidos como se describieron anteriormente, se descubrió que los nonapéptidos o decapéptidos seleccionados de los péptidos consistentes de las secuencias de aminoácidos indicadas por las SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 7, 9, 13, 15, 17, 20, 26, 32, 34, 40 y 41 mostraron una capacidad de inducción de CTL particularmente alta así como una afinidad alta de enlace a un antígeno de HLA. Por lo tanto, estos péptidos son ejemplificados como modalidades preferidas de la presente invención.

Además, el resultado del análisis de homología mostró que esos péptidos no tienen homología significativa con péptidos derivados de cualquiera de los productos de gen humanos conocidos. Esto disminuye la posibilidad de respuestas inmunes no deseables o desconocidas cuando son utilizadas por la inmunoterapia. Por lo tanto, también a partir de este aspecto, estos péptidos encuentran uso para promover la inmunidad en pacientes de cáncer contra el gen C1orf59. Por lo tanto, los péptidos de la presente invención, preferentemente, los péptidos que consisten de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo consistente de las SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 7, 9, 13, 15, 17, 20, 26, 32, 34, 40 y 41.

Además de la modificación de los péptidos explicados anteriormente, los péptidos descritos pueden ser enlazados adicionalmente a otras substancias, siempre que retengan la capacidad de inducción del CTL de los péptidos originales. Las substancias de ejemplo incluyen: péptidos, lípidos, azúcares y cadenas de azúcar, grupos acetilo, polímeros naturales y sintéticos, etc. Los péptidos presentes pueden contener modificaciones tales como glicosilación, oxidación de la cadena lateral, y/o fosforilación, siempre que las modificaciones no destruyan la actividad biológica del péptido original. Estos tipos de modificaciones pueden conferir funciones adicionales (por ejemplo, función de envío al objetivo, y función de administración) y/o estabilizar los péptidos.

Por ejemplo, para aumentar la estabilidad in vivo de un polipéptido, es sabido en la técnica introducir los D-aminoácidos, e imitaciones de aminoácidos o aminoácidos no naturales; este concepto también puede ser adaptado para los polipéptidos presentes. La estabilidad de un polipéptido puede ser probada de diferentes maneras. Por ejemplo, las peptidasas y varios medios biológicos tales como el plasma y suero humanos, son utilizados para la prueba de estabilidad (ver por ejemplo, Verhoef y asociados, Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11: páginas 291 a 302).

En la presente descripción los péptidos de la misma también pueden ser descritos como "péptidos C1orf59" o "polipéptidos C1orf59".

III. Preparación de los péptidos C1orf59 Los péptidos de la presente invención pueden ser preparados utilizando técnicas bien conocidas. Por ejemplo, los péptidos pueden ser preparados sintéticamente, utilizando la tecnología de ADN recombinante o la síntesis química. Los péptidos de la presente invención pueden ser sintetizados individualmente o como polipéptidos más largos compuestos de dos o más péptidos. Los péptidos entonces pueden ser aislados por ejemplo, purificados o aislados como para que sean substancialmente libres de otras proteínas o fragmentos de las mismas de las células huésped que ocurren de manera natural, o cualquier otra substancia química.

Un péptido de la presente invención puede ser obtenido a través de la síntesis química basada en la secuencia de aminoácido seleccionada. Los ejemplos de los métodos de síntesis de péptidos convencionales que pueden ser adaptados a la síntesis incluyen, pero no están limitados a: (i) Síntesis de Péptido, Interscience, New York, 1966; (ii) Las Proteínas, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976; (iii) Síntesis de Péptidos (en Japonés), Maruzen Co., 1975; (iv) Básicos y Experimentos de la Síntesis de Péptidos (en Japonés), Maruzen Co., 1985; (v) Desarrollo de Productos Farmacéuticos (segundo volumen) (en Japonés), Vol. 14 (síntesis de péptidos), Hirokawa, 1991 ; (vi) Documento W099/67288; y (vii) Publicación de Barany G. & Merrifield R.B., en "péptidos" (Peptides) Vol. 2, "Síntesis de Péptidos de Fase Sólida" (Solid Phase Peptide Synthesis), Academic Press, New York, 1980, páginas 100 a 118.

Alternativamente, los péptidos de la presente invención pueden ser obtenidos adaptando cualquier método de ingeniería genética conocido para producir péptidos (por ejemplo, Morrison J, J Bacteriology 1977, 132: páginas 349 a 351; Clark-Curtiss & Curtiss, "Métodos de Enzimología" (Methods in Enzymology) (eds. Wu et al.) 1983, 101: páginas 347 a 362). Por ejemplo, primero, un vector adecuado que hace puente con un polinucleótido que codifica el péptido objetivo es de una forma que se puede expresar (por ejemplo, debajo de una secuencia regulatoria correspondiente a una secuencia promotora) es preparado y transformado en la célula huésped adecuada. La célula huésped entonces es cultivada para producir el péptido de interés. El péptido puede también ser producido in vitro adaptando un sistema de traducción in vitro.

IV. Polinucleótidos La presente invención también proporciona un polinucleótido el cual codifica cualquiera de los péptidos anteriormente mencionados de la presente invención. Estos incluyen polinucleótidos derivados de los genes C1orf59 que ocurren de manera natural (GenBank No. de Acceso NM_144584 (SEQ ID NO: 42)) así como aquellos que tienen una secuencia de nucleótidos de los mismos modificada conservadoramente. En este caso, la frase "secuencia de nucleótidos modificada conservadoramente" se refiere a secuencias las cuales codifican secuencias idénticas o esencialmente idénticas de aminoácidos. Debido a la degeneración del código genético, un número grande de ácidos nucleicos idénticos funcionalmente codifican cualquier proteína determinada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG, y GCU todos codifican la alanina del aminoácido. Por lo tanto, en cada posición en donde es especificada la alanina por un codón, el codón puede ser alterado a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Dichas variantes de ácido nucleico son "variantes silenciosas", las cuales son una especie de variaciones modificadas conservadoramente. Cada secuencia de ácido nucleico de la presente invención que codifica un péptido también describe cualquier variación silenciosa posible del ácido nucleico. Un experto en la técnica reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto el AUG, el cual generalmente es el único codón para la metionina, y TGG, el cual generalmente es el único codón para triptofano) puede ser modificado para producir una molécula idéntica funcionalmente. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un péptido es implícitamente descrita en cada una de las secuencias.

El polinucieótidos de la presente invención puede estar compuesto de ADN, ARN, y derivados de los mismos. Un ADN está compuesto de manera conveniente de bases tales como A, T, C, y G, y T es reemplazado por U en un ARN.

El polinucleótido de la presente invención puede codificar péptidos múltiples de la presente invención con o sin secuencias de aminoácidos de intervención entre ellos. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que interviene puede proporcionar un sitio de disociación (por ejemplo, una secuencia de reconocimiento de la enzima) del polinucleótido o los péptidos traducidos. Además, el polinucleótido puede incluir cualesquiera secuencias adicionales a la secuencia de codificación que codifican el péptido de la presente invención. Por ejemplo, el polinucleótido puede ser un polinucleótido recombinante que incluye las secuencias regulatorias requeridas para la expresión del péptido o pueden ser un vector de expresión (plásmido) con genes marcadores como tales. En general, dichos polinucieótidos recombinantes pueden ser preparados por la manipulación de los polinucieótidos a través de técnicas recombinantes convencionales utilizando, por ejemplo, polimerasas y endonucleasas.

Ambas técnicas de síntesis química y recombinante pueden ser utilizadas para producir los polinucieótidos de la presente invención. Por ejemplo, un polinucleótido puede ser producido mediante la inserción en un vector apropiado, el cual puede ser expresado cuando es transfectado dentro de la célula competente. Alternativamente, un polinucleótido puede ser amplificado utilizando las técnicas PCR o la expresión en un huésped adecuado (por ejemplo consultar el libro de, Sambrook y asociados, "Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio" (Molecular Cloning: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1989). Alternativamente, un polinucleótido puede ser sintetizado utilizando técnicas de fase sólida como lo describe en Beaucage SL & lyer RP, en Tetrahedron 1992, 48: páginas 2223 a 2231; Matthes y asociados, EMBO J 1984, 3: páginas 801 a 805.

V. Exosomas La presente invención proporciona además vesículas intracelulares denominadas exosomas, las cuales presentan complejos formados entre los péptidos de la presente invención y los antígenos de HLA en su superficie. Los exosomas pueden ser preparados, por ejemplo, utilizando los métodos detallados de la Solicitud de Patente Japonesa Kohyo Publications Nos. Hei 11-510507 y el Documento WO99/03499 , y pueden ser preparadas utilizando los APCs obtenidos de los pacientes que están sometidos al tratamiento y/o prevención. Los exosomas de la presente invención pueden ser inoculados en la forma de vacunas, y de un modo similar a los péptidos de la presente invención.

El tipo de antígenos de HLA contenido en los complejos debe de acoplarse a los del sujeto que requiere del tratamiento y/o prevención. Por ejemplo, en la población Japonesa, el antígeno de HLA-A02 (particularmente, el A*0201 y también el A*0206) y el A24 (particularmente, el A*2402) son prevalentes y por lo tanto serían apropiados para el tratamiento de un paciente Japonés. El uso del tipo A02 o A24 que es altamente expresado entre los Japoneses y Caucásicos es favorable para obtener resultados efectivos. Generalmente, en la clínica, el tipo de antígeno de HLA del paciente que requiera del tratamiento es investigado por anticipado, el cual hace posible la selección apropiada de los péptidos que tienen altos niveles de afinidad de enlace con el antígeno particular, o que tienen la capacidad de inducción de CTL por la presentación del antígeno. Además, con el objeto de obtener péptidos que tienen tanto una alta afinidad de enlace como una capacidad de inducción CTL, substitución, inserción y/o adición de 1, 2, o varios aminoácidos se puede realizar basada en la secuencia de aminoácidos del péptido parcial del gen C1orf59 que ocurre de manera natural.

Cuando se utiliza el antígeno MLA del tipo A02 para el exosoma de la presente invención, los péptidos que tienen una secuencia de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 7, 9, 13, 15, 17 y, 20 encuentran su uso. Alternativamente, cuando se utiliza un antígeno de HLA del tipo A24 para el exosoma de la presente invención, encuentran su uso los péptidos de una secuencia de cualquiera de las SEQ ID NOs: 26, 32, 34, 40 y 41.

VI. Células de Presentación del Antígeno (APCs) La presente invención también proporciona APCs aisladas que presentan complejos formados entre los antígenos de HLA y los péptidos de la presente invención en su superficie. Las APCs pueden ser derivadas de pacientes que son sometidos a tratamiento y/o prevención, y pueden ser administrados en la forma de vacunas por ellas mismas o en combinación con otros fármacos incluyendo los péptidos de la presente invención, exosomas, o CTLs.

Los APCs no están limitados a un tipo particular de células que incluyen células DCs, células de Langerhans, macrófagos, células B, y células T activadas, las cuales se sabe que presentan antígenos proteináceos en su superficie celular como para ser reconocidos por los linfocitos. Debido a que una célula DC es un representante del APC que tiene la acción de inducción de CTL más fuerte entre las APCs, las DCs encuentran uso como las APCs de la presente invención.

Por ejemplo, las APCs de la presente invención puede ser obtenida induciendo las DCs de los monocitos de sangre periférica y luego poniéndolos en contacto (estimulándolas) con los péptidos de la presente invención in vitro, ex vivo o in vivo. Cuando los péptidos de la presente invención son administrados a los sujetos, las APCs que presentan los péptidos de la presente invención son inducidos en el cuerpo del sujeto. Por lo tanto, los APCs de la presente invención pueden ser obtenidos recolectando los APCs de sujetos después de la administración de los péptidos de la presente invención al sujeto. Alternativamente, los APCs de la presente invención pueden ser obtenidos poniendo en contacto los APCs recolectados de los sujetos con el péptido de la presente invención.

Los APCs de la presente invención pueden ser administrados solos o en combinación con otros fármacos incluyendo los péptidos, exosomas o CTLs de la presente invención a un sujeto para inducir una respuesta inmune contra el cáncer en el sujeto. Por ejemplo, la administración ex vivo puede incluir los pasos de: a: recolectar los APCs del primer sujeto, b: poner en contacto los APCs del paso a, con el péptido y c: administrar los APCs del paso b al segundo sujeto.

El primer sujeto y el segundo sujeto pueden ser el mismo individuo, o pueden ser individuos diferentes. Los APCs obtenidos en el paso b pueden ser administrados en la forma de una vacuna para tratamiento y/o prevención del cáncer incluyendo cáncer de la vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer colo-rectal, cáncer del esófago, NSCLC, osteosarcoma, cáncer del ovario, cáncer pancreático, y cáncer de la próstata, y SCLC.

La presente invención también proporciona un método o proceso de manufactura de una composición farmacéutica que induce los APCs, en donde el método incluye el paso de mezclar o formular los péptidos de la presente invención con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, los APCs tienen un nivel alto de capacidad de inducción de CTL. En el término de "alto nivel de capacidad de inducción de CTL", el alto nivel se refiere a el nivel de ese poniendo en contacto el APC con o sin péptido o péptidos que no pueden inducir el CTL. Dichos APCs que tienen un alto nivel de capacidad de inducción de CTL pueden ser preparados por un método que incluye el paso de transferir un polinucleótido que codifica el péptido de la presente invención a los APCs in vitro así como el método mencionado anteriormente. Los genes introducidos pueden ser en la forma de ADNs o ARNs. Los ejemplos de los métodos para la introducción incluyen, sin limitación particular, varios métodos convencionalmente realizados en este campo, tal como lipofección, electroporación y un método de fosfato de calcio. Más específicamente, se puede realizar como se describe en Cáncer Res 1996, 56: páginas 5672 a 5677; J Immunol 1998, 161: páginas 5607 a 5613; J Exp Med 1996, 184: páginas 465 a 472; Publicados en la Traducción Japonesa de la Solicitud Internacional No. 2000-509281. Transfiriendo el gen en los APCs, el gen pasa por la transcripción, traducción, y similares en la célula, y entonces la proteína obtenida es procesada por MHC Clase I o Clase II, y procede a través de una trayectoria de presentación para presentar los péptidos.

VIL Linfocitos T Citotóxicos (CTLs) Un CTL inducido contra cualquiera de los péptidos de la presente invención fortalece las células de cáncer del objetivo de la respuesta inmune in vivo y por lo tanto puede ser utilizado como vacunas de un modo similar a los péptidos por ellos mismos. Por lo tanto, la presente invención también proporciona los CTLs aislados que son específicamente inducidos o activados por cualquiera de los péptidos actuales. Dichos CTLs pueden ser obtenidos mediante (1) administración del péptido(s) de la presente invención al sujeto, y recolectando los CTLs del sujeto; (2) poniendo en contacto (estimulando) las células APCs y CD8- positivas derivadas del sujeto o los leucocitos mononucleares de la sangre periférica in vitro con los péptidos de la presente invención y luego aislando los CTLs; (3) poniendo en contacto las células CD8- positivas o los leucocitos mononucleares de la sangre periférica in vitro con los APCs o exosomas que presentan un complejo de un antígeno de HLA y el presente péptldo en su superficie y luego aislando los CTLs; o (4) introduciendo un gen que incluye un polinucleótido que codifica el receptor de la célula T en su subunidad de enlace (TCR) a los péptidos de la presente invención a los CTLs. Los APCs anteriormente mencionados y los exosomas pueden ser preparados por métodos descritos anteriormente y los métodos de (4) que se detallan más adelante en la sección "VIII. Receptor de célula T (TCR)".

Los CTLs de la presente invención pueden ser derivados de pacientes que son sometidos al tratamiento y/o prevención, y pueden ser administrados por ellos mismos o en combinación con otros fármacos incluyendo los péptidos de la presente invención o exosomas para propósitos de efectos de regulación. Los CTLs obtenidos actúan específicamente contra las células objetivo presentando los péptidos de la presente invención, por ejemplo, los mismos péptidos utilizados para la inducción. Las células objetivo pueden ser células que expresan endógenamente el gen C1orf59, tales como células de cáncer, o células que son transfectadas con el gen C1orf59; y células que presentan un péptido de la presente invención de la superficie celular debido al estímulo del péptido que también puede servir como objetivo en el ataque del CTL activado.

VIII. receptor de célula T (TCR) La presente invención también proporciona una composición que contiene ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos que tiene una capacidad de formar una subunidad de un receptor de célula T (TCR), y métodos para utilizarlos. Las subunidades TCR tienen la capacidad de formar el TCRs que confieren la especificidad a las células T contra las células del tumor que expresan el gen C1orf59. Utilizando métodos conocidos en la técnica, la secuencia de ácido nucleico que codifica las cadenas alfa- y beta- de las subunidades TCR las cuales son portadas por los CTLs inducidos con los péptidos de la presente invención pueden ser identificados (WO2007/032255 y Morgan y asociados, J Immunol, 171, página 3288 (2003)). Por ejemplo, el método PCR es preferido para analizar la secuencia de ácido nucleico que codifica la subunidad TCR. Los cebadores PCR para el análisis pueden ser, por ejemplo, cebadores 5'-R (5'-gtctaccaggcattcgcttcat-3') como cebadores de lado 5' (SEQ ID NO: 44) y cebadores 3-TRa-C (5'-tcagctggaccacagccgcagcgt-3') específico para la región C de la cadena alfa de TCR (SEQ ID NO: 45), cebadores 3-TRb-C1 (5'-tcagaaatcctttctcttgac-3') específica de la región C1 de la cadena beta de TCR (SEQ ID NO: 46) o cebadores 3-TRbeta-C2 (5'- ctagcctctggaatcctttctctt-3') específico de la región C2 de la cadena TCR beta (SEQ ID NO: 47) como los cebadores de lado 3', pero no limitados. Los TCRs derivados pueden enlazarse a las células objetivo que muestran el péptido del gen C1orf59 con una alta avidez, y opcionalmente son portadores del exterminio eficiente de las células objetivo que presentan el péptido C1orf59 in vivo e ¡n vitro.

Los ácidos nucleicos que codifican las subunidades TCR pueden ser incorporados en vectores adecuados, por ejemplo vectores retrovirales. Estos vectores son bien conocidos en la técnica. Los ácidos nucleicos o los vectores que los contienen pueden ser transferidos a las células T, por ejemplo, una célula T de un paciente, que utiliza métodos bien conocidos en la técnica. Ventajosamente, la presente invención proporciona una composición fuera del almacén que permite la modificación rápida de las propias células T del paciente (o aquellas de otro mamífero) para producir rápidamente y fácilmente las células T modificadas que tienen excelentes propiedades de exterminio de las células cancerosas.

El TCR codificado por los ácidos nucleicos aislados de un CTL inducido por el péptido de la presente invención tiene la capacidad de reconocer específicamente un complejo de los péptidos de la presente invención y la molécula del antígeno de HLA, dándole una actividad específica a la célula T contra las células objetivo cuando el TCR es portado en la superficie de la célula T. dicho reconocimiento específico puede ser confirmado por cualesquiera métodos conocidos, y los métodos preferidos incluyen, por ejemplo, el análisis de tetrámero utilizando moléculas de HLA y el péptido de la presente invención (ver las Publicaciones de, por ejemplo, Altman y asociados en Science. 274, páginas 94 a 96 (1996); Mc ichael y asociados en J Exp Med. 187, páginas 1367 a 1371 (1998)), y el ensayo ELISPOT. Realizando el ensayo ELISPOT, se puede confirmar que una célula T que expresa el TCR en la superficie de la célula reconoce una célula por medio del TCR, y la señal es transmitida intracelularmente, y entonces una citocina, tal como la INF-gamma, es liberada de la célula T. La actividad citotóxica de la célula T contra las células objetivo puede ser examinada utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Un método preferido incluye, por ejemplo, el ensayo de liberación de cromo que utiliza las células HLA positivas que expresan el gen C1orf59 como células objetivo.

También, la presente invención proporciona los CTLs los cuales son preparados mediante la transducción con ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de las subunidades TCR que se enlazan al péptido del gen C1orf59 de por ejemplo, las SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 7, 9, 13, 15, 17 y, 20 en el contexto del antígeno HLA-A02 y también los péptidos de las SEQ ID NOs: 26, 32, 34, 40 y 41 en el contexto del antígeno de HLA-A24. Los CTLs transducidos tienen la capacidad de alojarse en las células de cáncer in vivo, y pueden ser expandidas mediante métodos de cultivo in vitro bien conocidos (por ejemplo, Kawakami y asociados, J Immunol., 142, páginas 3452 a 3461 (1989)). Las CTLs de la presente invención pueden ser utilizadas para un paciente que necesita una terapia o protección (Documento WO2006/031221 ).

IX. Agentes o composiciones Farmacéuticas La prevención y profilaxis incluyen cualquier actividad que reduce la carga de mortalidad o morbidez de la enfermedad. La prevención y profilaxis pueden ocurrir "en niveles de prevención primario, secundario, y terciario". Aunque la prevención y profilaxis primaria evita el desarrollo de una enfermedad, los niveles secundarios y terciarios de prevención y profilaxis comprende y la actividad que tiene por objetivo la prevención y profilaxis del progreso de una enfermedad y la emergencia de los síntomas así como la reducción del impacto negativo de una enfermedad establecida restaurando la función y reduciendo las complicaciones relacionadas con la enfermedad. Alternativamente, la prevención y profilaxis incluyen un amplio rango de terapias profilácticas que tienen por objetivo aliviar la severidad de una enfermedad particular, por ejemplo, reduciendo la proliferación y metástasis de los tumores, reduciendo la angiogénesis. El tratamiento y/o la profilaxis del cáncer, y/o la prevención de la recurrencia postoperatoria del mismo incluye cualquiera de los pasos siguientes, tales como la remoción quirúrgica de las células cancerosas, la inhibición de crecimiento de las células cancerosas, la involución o regresión de un tumor, la inducción de la remisión y supresión de ocurrencia de cáncer, la regresión del tumor, y la reducción o inhibición de las metástasis. El tratamiento de manera efectiva y/o la profilaxis del cáncer disminuyen la mortalidad y mejora el pronóstico de los individuos que tienen cáncer, disminuye los niveles de marcadores del tumor en la sangre, y alivia los síntomas detectables que acompañan el cáncer. Por ejemplo, la reducción o mejora de los síntomas constituye el tratamiento efectivo y/o la profilaxis incluye el 10%, 20%, 30% o más de reducción, o una enfermedad estable.

Debido a que la expresión del gen C1orf59 es específicamente elevada en cánceres incluyendo cáncer de la vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer colo-rectal, cáncer del esófago, NSCLC, osteosarcoma, cáncer del ovario, cáncer pancreático, y cáncer de la próstata, y SCLC, comparados con un tejido normal, los péptidos de la presente invención o polinucleótidos codifican dichos péptidos que pueden ser utilizados para el tratamiento y/o para la profilaxis del cáncer o tumor, y/o la prevención de la recurrencia postoperatoria del mismo. Por lo tanto, la presente invención proporciona un agente farmacéutico o composición para el tratamiento y/o la profilaxis del cáncer o tumor, y/o la prevención de la recurrencia postoperatoria del mismo, lo cual incluye uno o más de los péptidos de la presente invención, o polinucleótidos que codifican los péptidos como un ingrediente activo. Alternativamente, los péptidos presentes pueden ser expresados en la superficie de cualquiera de los exosomas o células anteriores, tales como las APCs para el uso como agentes farmacéuticos o composiciones. Además, los CTLs anteriormente mencionados que tienen por objetivo cualquiera de los péptidos de la presente invención también pueden ser utilizados como el ingrediente activo de las composiciones de agentes farmacéuticos actuales.

En otra modalidad, la presente invención también proporciona el uso de un ingrediente activo seleccionado de entre: (a) un péptido de la presente invención; (b) un ácido nucleico que codifica dicho péptido como aquí se describe en una forma que se puede expresar; (c) una APC o un exosoma que presenta un péptido de la presente invención en su superficie; y (d) una célula T citotóxica de la presente invención en la manufactura de una composición farmacéutica o agente para el tratamiento del cáncer o tumor. Alternativamente, la presente invención proporciona además un ingrediente activo seleccionado de entre: (a) un péptido de la presente invención; (b) un ácido nucleico que codifica dicho péptido como aquí se describe en una forma que se puede expresar; (c) un APC o un exosoma que presenta un péptido de la presente invención en su superficie; y (d) una célula T citotóxica de la presente invención para utilizarse en el tratamiento de un cáncer o de un tumor.

Alternativamente, la presente invención proporciona además un método o proceso para la manufactura de una composición o agente farmacéutico para el tratamiento de cáncer o tumor, en donde el método o proceso incluye el paso de formular un vehículo farmacéutica o fisiológicamente aceptable con un ingrediente activo seleccionado entre: (a) un péptido de la presente invención; (b) un ácido nucleico que codifica dicho péptido como aquí se describe en una forma que se puede expresar; (c) un APC o un exosoma que presenta un péptido de la presente invención en su superficie; y (d) una célula T citotóxica de la presente invención como ingredientes activos.

En otra modalidad, la presente invención también proporciona un método o proceso para la manufactura de una composición o agente farmacéutico para el tratamiento del cáncer o tumor, en donde el método o proceso incluye los pasos de mezclar un ingrediente activo con un vehículo farmacéutica o fisiológicamente aceptable, en donde el ingrediente activo es seleccionado de entre: (a) un péptido de la presente invención; (b) un ácido nucleico que codifica dicho péptido como aquí se describe en una forma que se puede expresar; (c) un APC o un exosoma que presenta un péptido de la presente invención en su superficie; y (d) una célula T citotóxica de la presente invención.

Alternativamente, la composición o agente farmacéutico de la presente invención puede ser utilizada para cualquiera o ambos la profilaxis del cáncer o tumor y la prevención de la recurrencia del mismo de manera postoperatoria.

Los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención encuentran uso como una vacuna. En el contexto de la presente invención, la frase "vacuna" (a la que también nos referimos como una "composición inmunogénica") se refiere a una substancia que tiene la función de inducir una inmunidad contra el tumor al momento de la inoculación en los animales.

Los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser utilizados para tratar y/o prevenir cánceres o tumores, y/o la prevención de la recurrencia postoperatoria de los mismos en sujetos o pacientes que incluyen humanos y cualquier otro mamífero incluyendo, pero sin limitarse a, ratón, rata, cobayo, conejo, gato, perro, oveja, cabra, cerdo, ganado, caballo, mono, babuino, y chimpancé, particularmente un animal comercialmente importante o un animal domesticado.

De acuerdo con la presente invención, los péptidos que tienen una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID Nos: 1, 3, 4, 7, 9, 13, 15, 17, 20, 26, 32, 34, 40 y 41 se ha encontrado que son péptidos de epítopes restringidos a HLA-A02 o A24 o candidatos que pueden inducir una respuesta inmune específica y potente. Por lo tanto, los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención que incluyen cualquiera de estos péptidos que tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 1, 3, 4, 7, 9, 13, 15, 17 y 20 son particularmente adecuados para la administración a sujetos cuyos antígenos de HLA son HLA-A02, y los péptidos que tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 26, 32, 34, 40 y 41 son particularmente adecuados para la administración a sujetos cuyos antígenos de HLA son HLA-A24. Lo mismo aplica a los agentes y composiciones farmacéuticas que incluyen polinucleótidos que codifican cualquiera de estos péptidos (por ejemplo, los polinucleótidos de la presente invención).

Los cánceres o tumores que van a ser tratados por los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención no están limitados e incluyen todos los tipos de cánceres o tumores en donde está involucrado el gen Clorf59, incluyendo por ejemplo, cáncer de la vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer colo-rectal, cáncer del esófago, NSCLC, osteosarcoma, cáncer del ovario, cáncer pancreático, cáncer de la próstata y SCLC.

Los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden contener además de los ingredientes activos anteriormente mencionados, otros péptidos que tienen la capacidad de inducir CTLs contra células cancerosas, otros polinucleótidos que codifican otros péptidos, otras células que presentan los otros péptidos, o similares. En la presente invención, los otros péptidos que tienen la capacidad de inducir CTLs contra células cancerosas son ejemplificados por antígenos específicos del cáncer (por ejemplo, los TAAs identificados), pero no están limitados a ellos.

Si se necesita, los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden incluir opcionalmente otras substancias terapéuticas como ingredientes activos, siempre que la substancia no inhiba el efecto antitumoral del ingrediente activo, por ejemplo, cualquiera de los péptidos actuales. Por ejemplo, las formulaciones pueden incluir agentes antiinflamatorios, exterminadores de dolor, agentes quimioterapéuticos, y similares. Además de incluir otras substancias terapéuticas en el medicamento mismo, los medicamentos de la presente invención también pueden ser administrados consecutiva o concurrentemente con uno o más de otros agentes farmacológicos. Las cantidades de medicamento y el agente farmacológico dependen, por ejemplo, del tipo de agentes farmacológicos que están siendo utilizados, la enfermedad que está siendo tratada, y la programación y rutas de administración.

Deberá quedar entendido, que además de los ingredientes particularmente mencionados en esta descripción, los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden incluir otros agentes convencionales en la técnica con respecto al tipo de formulación en cuestión. En una modalidad de la presente invención, los agentes o composiciones farmacéuticas de la misma pueden ser incluidos en artículos de manufactura y equipos que contienen materiales útiles para el tratamiento de padecimientos patológicos de la enfermedad que va a ser tratada, por ejemplo, el cáncer. El artículo de manufactura puede incluir un contenedor de cualquiera de los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención con una etiqueta. Los contenedores adecuados incluyen botellas, frascos, y tubos de prueba. Los contenedores pueden ser formados de una variedad de materiales, tales como vidrio o plástico. La etiqueta en el contenedor debe indicar el agente que es utilizado para el tratamiento o prevención de uno o más padecimientos de la enfermedad. La etiqueta también puede indicar instrucciones para la administración y así sucesivamente.

Además del contenedor descrito anteriormente, el equipo que incluye el agente o composición farmacéutica de la presente invención puede incluir opcionalmente además un segundo contenedor que aloja un diluyente farmacéuticamente aceptable. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista del usuario y comercial, incluyendo otros reguladores, diluyentes, filtros, agujas, jeringas, e insertos del empaque con instrucciones de uso.

Los agentes o composiciones farmacéuticas pueden, si se desea, ser presentados en un paquete o un aparato abastecedor el cual puede contener una o más formas de dosificación unitaria que contienen el ingrediente activo. El empaque puede, por ejemplo, incluir lámina de metal o plástico, tal como un empaque blister. El empaque o aparato abastecedor puede estar acompañado de instrucciones para la administración. (1) Agentes o composiciones farmacéuticas que contienen los péptidos como un ingrediente activo.

Los péptidos de la presente invención pueden ser administrados directamente como agentes o composiciones farmacéuticas, o de ser necesario, que han sido formulados mediante métodos de formulación convencionales. En el último caso, además de los péptidos de la presente invención, se pueden incluir según sea apropiado vehículos, excipientes, y aquellos que son generalmente utilizados para los fármacos sin limitaciones particulares. Los ejemplos de dichos vehículos son agua esterilizada, solución salina fisiológica, regulador de fosfato, fluido de cultivo y similares. Además, los agentes o composiciones farmacéuticas pueden contener según sea necesario, estabilizadores, suspensiones, conservadores, tensioactivos y similares. Los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser utilizados para propósitos contra el cáncer.

Los péptidos de la presente invención pueden ser preparados como una combinación compuesta de dos o más de los péptidos de la presente invención, para inducir los CTLs in vivo. La combinación del péptido puede tomar la forma de un cocktail o puede ser conjugada entre ellos utilizando técnicas estándar. Por ejemplo, los péptidos pueden ser enlazados químicamente o expresados como una sola secuencia de polipéptidos de fusión. Los péptidos en la combinación pueden ser el mismo o diferentes. Administrando los péptidos de la presente invención, los péptidos son presentados en una alta densidad por los antígenos de HLA en los APCs, entonces son inducidos los CTLs que reaccionan específicamente hacia el complejo formado entre el péptido mostrado y el antígeno de HLA. Alternativamente, los APCs que presentan cualquiera de los péptidos de la presente invención en su superficie celular, los cuales pueden ser obtenidos estimulando los APCs (por ejemplo, DCs) derivados de un sujeto con los péptidos de la presente invención pueden ser administrados a los sujetos, y como resultado, son inducidos CTLs en el sujeto y puede ser aumentada la agresividad hacia las células cancerosas.

Los agentes o composiciones farmacéuticas para el tratamiento y/o prevención del cáncer o tumor, los cuales incluyen un péptido de la presente invención como ingrediente activo, pueden incluir también un adyuvante conocido para inducir de manera efectiva la inmunidad celular. Alternativamente, los agentes o composiciones farmacéuticas pueden ser administrados con otros ingredientes activos o administrados mediante formulación en gránulos. Un adyuvante se refiere a un compuesto que mejora la respuesta inmune contra la proteína cuando es administrado junto (o sucesivamente) con la proteína que tiene la actividad inmunológica. Los adyuvantes contemplados en la presente invención incluyen aquellos descritos en la literatura (Clin Microbiol Rev 1994, 7: páginas 277 a 289). Los ejemplos de los adyuvantes adecuados incluyen fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, alum, toxina de cólera, toxina de salmonella, y similares, pero no están limitados a los mismos.

Además, se pueden utilizar de manera conveniente las formulaciones de liposoma, formulaciones granulares en las cuales el péptido es enlazado a cuentas de diámetros de unos cuantos micrómetros, y las formulaciones en las cuales está enlazado un lípido al péptido.

En otra modalidad de la presente invención, los péptidos de la invención también pueden ser administrados en la forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Se prefieren los ejemplos de las sales que incluyen sales con un metal alcalino, sales con un metal, sales con una base orgánica, sales con un ácido orgánico o sales con un ácido inorgánico.

En algunas modalidades, los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden incluir además un componente el cual prepara los CTLs. Los lípidos han sido identificados como agentes con capacidad para preparar los CTLs in vivo contra los antígenos virales. Por ejemplo, se pueden adherir residuos de ácido palmítico a los grupos epsilon y alfa-amino de un residuo de Usina y entonces ser enlazados a un péptido de la presente invención. El péptido lipidado puede entonces ser administrado ya sea directamente en una micela o partícula, incorporado en un liposoma, o emulsificado en un adyuvante. Como otro ejemplo de la preparación del lípido de las respuestas CTL, las lipoproteínas de E. coli, tales como tripalmitoil-S-glicerilcisteinliseril-serina (P3CSS) pueden ser utilizadas para preparar el CTL cuando son enlazadas de manera covalente a un péptido apropiado (consultar, por ejemplo, Deres y asociados, Nature 1989, 342: páginas 561 a 564).

El método de administración puede ser oral, por medio de inyección intradérmica, subcutánea, intravenosa, o similares, y la administración sistémica o administración local en la cercanía de los sitios del objetivo. La administración se puede realizar por una sola administración o ser reforzada por administraciones múltiples. La dosis de los péptidos de la presente invención puede ser ajustada de manera apropiada de acuerdo con la enfermedad que va a ser tratada, edad del paciente, peso, método de administración, y similares, y generalmente es de 0.001 mg a 1000 mg, por ejemplo, de 0.001 mg a 1000 mg, por ejemplo, de 0.1 mg a 10 mg, y pueden ser administradas una vez en un período de unos cuantos días a unos cuantos meses. Un experto en la técnica puede seleccionar de manera correcta la dosis adecuada. (2) Agentes o composiciones farmacéuticas que contienen polinucleótidos como ingrediente activo Los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden contener ácidos nucleicos que codifican los péptidos aquí descritos de una manera que se puede expresar. En esta descripción, la frase "en una forma que se puede expresar" significa que el polinucleótido, cuando es introducido en una célula, será expresado in vivo como un polipéptido que induce una inmunidad contra el tumor. En una modalidad ejemplificada, la secuencia de ácido nucleico del polinucleótido de interés incluye los elementos regulatorios necesarios para la expresión del polinucleótido. Los polinucleótidos pueden ser equipados como para lograr la inserción estable en el genoma de la célula objetivo (ver, por ejemplo, Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: páginas 503 a 512 para una descripción de los vectores de cassette de recombinación homologa). Ver, por ejemplo, Wolff y asociados, Science 1990, 247: páginas 1465 a 1468; las Patentes Norteamericanas Nos. 5,580,859; 5,589,466; 5,804,566; 5,739,118; 5,736,524; 5,679,647; y el documento WO 98/04720. Los ejemplos de las tecnologías de administración basadas en el ADN incluyen "ADN desnudo", administración facilitada (bupivacaína , polímeros, péptidos portados), complejos lípidos catiónicos, y partículas portadas ("pistola genética") o administración portada por presión (ver, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,922,687).

Los péptidos de la presente invención también pueden ser expresados por vectores virales o bacteriales. Los ejemplos de los vectores de expresión incluyen huéspedes virales atenuados, tales como vacunas o viruelas. Este método comprende el uso de un virus de vacuna, por ejemplo, como un vector para expresar las secuencias de nucleótidos que codifican el péptido. Al momento de la introducción en el huésped, el virus de vacuna recombinante expresa el péptido inmunogénico, y de esta manera promueve una respuesta inmune. Los vectores de vacuna y métodos en los protocolos de inmunización son descritos en, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 4,722,848. Otro vector es el BCG (Bacille Calmette Guerin). Los vectores BCG se describen en la publicación de Stover y asociados, Nature 1991, 351: páginas 456 a 460. Una amplia variedad de otros vectores útiles para la administración o inmunización terapéutica, por ejemplo, se pueden apreciar los vectores de virus asociados con adeno y adeno, vectores retrovirales, vectores de Salmonella typhi, vectores de toxina de ántrax destoxificada, y similares. Consultar por ejemplo, las publicaciones de Shata y asociados, en Mol Med Today 2000, 6: páginas 66 a 71; Shedlock y asociados, en J Leukoc Biol 2000, 68: páginas 793 a 806; Hipp y asociados, en In Vivo 2000, 14: páginas 571 a 585.

La administración de un polinucleótido en un sujeto puede ser ya sea directa, en cuyo caso el sujeto es expuesto directamente a un vector portador de polinucleótidos, o indirecto, en cuyo caso, las células son transformadas primero con el polinucleótido de interés in vitro, y luego las células son transplantadas al sujeto. Estos dos métodos son conocidos, respectivamente, como terapias genéticas in vivo y ex vivo.

Para revisiones generales de los métodos de terapia genética, consultar las publicaciones de Goldspiel y asociados, en Clinical Pharmacy 1993, 12: páginas 488 a 505; Wu y Wu, en Biotherapy 1991, 3: páginas 87 a 95; Tolstoshev, en Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: páginas 573 a 596; Mulligan, en Science 1993, 260: páginas 926 a 932; Morgan & Anderson, en Ann Rev Biochem 1993, 62: páginas 191 a 217; Trends in Biotechnology 1993, 11(5): páginas 155 a 215). Los métodos generalmente conocidos en la técnica de la tecnología de ADN recombinante los cuales también pueden ser utilizados para la presente invención se describen en las ediciones de Ausubel y asociados, "Protocolos actuales en Biología Molecular" (Current Protocols in Molecular Biology), John Wiley & Sons, NY, 1993; y el libro de Krieger, "Transferencia y Expresión de Genes, un Manual de Laboratorio" (Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual), Stockton Press, NY, 1990.

El método de administración puede ser oral, por medio de inyección intradérmica, subcutánea, intravenosa, o similares, y puede también utilizarse una administración sistémica o administración local en la cercanía de los sitios objetivo. La administración puede ser realizada por medio de una sola administración o reforzada por administraciones múltiples. La dosis del polinucleótido en el vehículo adecuado o células transformadas con el polinucleotido que codifican los péptidos de la presente invención puede ser ajustada de manera correcta de acuerdo con la enfermedad que va a ser tratada, la edad del paciente, el peso, el método de administración, y similares, y generalmente en dosificaciones de 0.001 mg a 1000 mg, por ejemplo, de 0.001 mg a 1000 mg, por ejemplo, de 0.1 mg a 10 mg, y puede ser administrada una vez en un período de unos cuantos días a unos cuantos meses. Un experto en la técnica puede seleccionar de manera correcta la dosis adecuada.

X. Métodos y uso de péptidos, exosomas, APCs v CTLs Los péptidos y polinucleótidos de la presente invención pueden ser utilizados para inducir los APCs y CTLs. Los exosomas y los APCs de la presente invención también pueden ser utilizados para inducir los CTLs. Los péptidos, polinucleótidos, exosomas y APCs pueden ser utilizados en combinación con cualesquiera otros compuestos siempre que los compuestos no inhiban su capacidad de inducción de los CTL. Por lo tanto, cualquiera de los agentes o composiciones farmacéuticas anteriormente mencionadas de la presente invención pueden ser utilizadas para inducir los CTLs, y además de ellos, aquellos que incluyen los péptidos y polinucleótidos también pueden ser utilizados para inducir los APCs como se explicará detalladamente más adelante. (1) Método para inducir células que presentan el antígeno (APCs) La presente invención proporciona métodos para inducir los APCs con una alta capacidad de inducción de CTL utilizando los péptidos o polinucleótidos de la presente invención.

Los métodos de la presente invención incluyen el paso de poner en contacto los APCs con los péptidos de la presente invención in vitro, ex vivo o in vivo. Por ejemplo, el método que pone en contacto los APCs con los péptidos ex vivo puede incluir los pasos de: a: recolectar los APCs de un sujeto; y b: poner en contacto los APCs del paso a con el péptido.

Los APCs no están limitados a un tipo particular de células e incluyen las células DCs, células de Langerhans, macrófagos, células B, y células T activadas, las cuales se sabe que presentan antígenos proteináceos en su superficie celular como para que sean reconocidos por los linfocitos. Los DCs pueden preferentemente ser utilizados debido a su capacidad de inducción de CTL más fuerte entre los APCs. Cualesquiera péptidos de la presente invención, pueden ser utilizados como el péptido del paso b por ellos mismos o en combinación con otros péptidos de la presente invención.

De forma alternativa, los péptidos de la presente invención pueden ser administrados a un sujeto para contactar los péptidos con APCs in vivo. Los APCs con una inducción de CTL alta pueden ser inducidos en el cuerpo del sujeto. Además, la presente invención también contempla un método para administrar los péptidos de la presente invención a un sujeto para inducir APCs in vivo. También es posible el administrar polinucleótidos que codifican los péptidos de la presente invención a un sujeto de una forma que puede ser expresada, de forma que los péptidos de la presente invención sean contactados y expresados con APCs in vivo, para consecuentemente inducir APCs con una inducción de CTL alta en el cuerpo del sujeto. Además, la presente invención también contempla un método para administrar los polinucleótidos de la presente invención a un sujeto para inducir APCs in vivo. La frase "forma que puede ser expresada" fue definida anteriormente en la sección "IX. Agente farmacéuticos (2) Agentes farmacéuticos que contienen polinucleótidos como el ingrediente activo".

De forma adicional, la presente invención incluye introducir el polinucleotido de la presente invención dentro de un APC para inducir APCs con una inducción de CTL. Por ejemplo, el método puede incluir los pasos de: a: recolectar los APCs de un sujeto:, e b: introducir un polinucleotido que codifica un péptido de la presente invención.

El paso b puede ser llevado a cabo tal y como fue descrito anteriormente en la sección "VI. Células que presentan el antígeno". (2) Método para inducir CTLs De forma adicional, la presente invención proporciona métodos para inducir CTLs que utilizan los péptidos, polinucleótidos o exosomas o APCs de la presente invención.

La presente invención también proporciona métodos para inducir CTLs que utilizan un polinucleótido que codifica un péptido que es capaz de formar una subunidad de receptor de célula T (TCR) que reconoce un complejo de péptidos de la presente invención y antígenos HLA. Preferentemente, los métodos para inducir CTLs incluyen al menos un paso seleccionado del grupo que consiste de: a) contactar una célula T con CD8+ con una célula que presenta un antígeno y/o un exosoma que presenta en su superficie un complejo de un antígeno HLA y un péptido de la presente invención; y b) introducir un polinucleótido que codifica un polipéptido que es capaz de formar una subunidad TCR que reconoce un complejo de un péptido de la presente invención y un antígeno HLA dentro de una célula con CD8 + .

Cuando los péptidos, los polinucleótidos, APCs o exosomas de la presente invención son administrados a un sujeto, los CTLs son inducidos en el cuerpo del sujeto, y la fuerza de la respuesta inmune que identifica las células cancerígenas es mejorada. Además, la presente invención también contempla un método el cual incluye el paso de administrar los péptidos, los polinucleótidos, los APCs o los exosomas de la presente invención a un sujeto para inducir CTLs.

De forma alternativa, los CTLs también pueden ser inducidos por su uso ex vivo. En dicho caso, después de la inducción de CTLs, los CTLs activados serán regresados al sujeto. Por ejemplo, un método de la presente invención para inducir CTLs puede incluir los pasos de: a) recolectar los APCs de un sujeto; b) contactar los APCs del paso a) con el péptido; y c) co-cultivar los APCs del paso b) con las células con CD8 + .

Los APCs que serán co-cultivados con las células con CD8+ en el paso anterior c también pueden ser preparados al transferir un gen que incluya un polinucleótido de la presente invención dentro de los APCs, tal y como fue descrito anteriormente en la sección "VI. Células que presentan antígenos"; pero no se encuentran limitados ahí mismo, y cualquier APC que efectivamente presente en su superficie un complejo de un antígeno HLA y el péptido de la presente invención puede ser utilizado para el método instantáneo.

En lugar de dichos APCs, los exosomas que presentan en su superficie un complejo de un antígeno HLA y el péptido de la presente invención también pueden ser utilizados. Principalmente, la presente invención también contempla un método en donde los exosomas que presentan en su superficie un complejo de un antígeno HLA y el péptido de la presente invención son co-cultivados con las células con CD8 + . Dichos exosomas pueden ser preparados por los métodos descritos anteriormente en la sección "V. Exosomas".

De forma adicional, el CTL puede ser inducido al introducir un gen que incluya un polinucleótido que codifique una subunidad TCR que se enlace al péptido de la presente invención dentro de las células con CD8 + . Dicha transducción puede ser llevada a cabo tal y como fue descrito anteriormente en la sección "VIII. Receptor de célula T (TCR)".

De forma adicional, la presente invención proporciona un método o proceso para fabricar un agente farmacéutico o una composición que induzca CTLs, donde el método incluye el paso de mezclar o formular el péptido de la presente invención con un transportador farmacéutico aceptable. (3) Método para inducir una respuesta inmune De forma adicional, la presente invención proporciona métodos para inducir una respuesta inmune contra enfermedades relacionadas con el gen C1orf59. Una enfermedad adecuada incluye cáncer, cuyos ejemplos incluyen cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer colo-rectal, cáncer de esófago, NSCLC, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de próstata y SCLC.

Los métodos incluyen el paso de administrar agentes o composiciones que contienen cualquiera de los péptidos de la presente invención o polinucleótidos que los codifican. El método de la presente invención también contempla la administración de exosomas o APCs que presentan cualquiera de los péptidos de la presente invención. Para mayor detalle, ver el artículo "IX. Agentes o composiciones farmacéuticas", particularmente la parte que describe el uso de los agentes o composiciones farmacéuticas de la presente invención como vacunas. De forma adicional, los exosomas y APCs que pueden ser utilizados para los métodos de la presente invención para inducir la respuesta inmune son descritos a detalle en los artículos "V. Exosomas", "VI. Células que presentan antígeno (APCs)" y (1) y (2) de "X. Métodos que utilizan los péptidos, exosomas, APCs y CTLs", mencionados anteriormente.

La presente invención también proporciona un método o proceso para fabricar un agente o composición farmacéutica que incluye una respuesta inmune, donde el método incluye el paso de mezclar o formular el péptido de la presente invención con un transportador farmacéutico aceptable.

De forma alternativa, el método de la presente invención puede incluir el paso de administrar una vacuna o una composición farmacéutica, la cual contiene: a) un péptido de la presente invención; b) un ácido nucleico que codifica dicho péptido de la presente invención en una forma de expresión; c) una APC o un exosoma presente en un péptido de la presente invención en su superficie; y d) una célula T citotóxica de la presente invención.

En la presente invención, el cáncer que sobre-expresa el gen C1orf59 puede ser tratado con estos ingredientes activos. El cáncer incluye, pero no se limita a, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer colo-rectal, cáncer de esófago, cáncer de pulmón de célula no pequeña (NSCLC), osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de próstata y cáncer de pulmón de célula pequeña (SCLC). Consecuentemente, anterior a la administración de las vacunas o composiciones farmacéuticas que contienen los ingredientes activos, es preferible el confirmar cuando el nivel de expresión del gen C1orf59 en las células o tejidos cancerígenos que serán tratados es mejor en comparación con las células normales del mismo órgano. Además, en una modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar cáncer (encima) que sobre-expresa el gen C1orf59, cuyo método puede incluir los pasos de: i) determinar el nivel de expresión del gen C1orf59 en las células o tejidos cancerígenos obtenidos de un sujeto con el cáncer que será tratado; ii) comparar el nivel de expresión del gen C1orf59 con un control normal, y iii) administrar al menos un componente, seleccionado del grupo que consiste de (a) a (d) descritos anteriormente, a un sujeto con cáncer que sobre-expresa el gen C1orf59 en comparación con el control normal.

De forma alternativa, la presente invención también proporciona una vacuna o composición farmacéutica que comprende al menos un componente seleccionado del grupo que consiste de (a) a (d) descritos anteriormente, para su uso en la administración a un sujeto que tiene un cáncer que sobre-expresa el gen C1orf59. En otras palabras, la presente invención proporciona de forma adicional un método para identificar a un sujeto que será tratado con el polipéptido C1orf59 de la presente invención, cuyo método puede incluir el paso de determinar un nivel de expresión del gen C1orf59 en las células o tejidos derivados del sujeto, donde un aumento del nivel comparado con el nivel del control normal del gen indica que el sujeto tiene un cáncer que puede ser tratado con el polipéptido C1orf59 de la presente invención.

Consecuente con la presente invención, es determinado el nivel de expresión del gen C1orf59 en las células o tejidos cancerígenos obtenidos de un sujeto. El nivel de expresión puede ser determinado en el nivel del producto de transcripción (ácido nucleico), utilizando los métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el mARN del gen C1orf59 puede ser cuantificado utilizando sondas mediante métodos de hibridación (por ejemplo, hibridación Northern). La detección puede ser llevada a cabo en un chip o en una adaptación. El uso de una adaptación es preferible para detectar el nivel de expresión del gen C1orf59. Aquellos expertos en la técnica pueden preparar dichas sondas utilizando la secuencia de información del gen C1orf59. Por ejemplo, el cADN del gen C1orf59 puede ser utilizado como las sondas. En caso de que sea necesario, la sonda puede ser etiquetada con una etiqueta adecuada, tal como tintas, substancias e isótopos fluorescentes, y el nivel de expresión del gen puede ser detectado como la intensidad de las etiquetas hibridadas, De forma adicional, el producto de transcripción del gen C1orf59 puede ser cuantificado utilizando los cebadores mediante los métodos de detección basados en la amplificación (por ejemplo, RT-PCR). Dichos cebadores pueden ser preparados con base en la secuencia de información disponible del gen.

Específicamente, una sonda o el cebador utilizado para el método de la presente invención se híbrida bajo condiciones severas, moderadamente severas o poco severas al mARN del gen C1orf59. Tal y como fue utilizado en la presente invención, la frase "condiciones (hibridación) severas" se refiere a las condiciones bajo las cuales una sonda o un cebador se hibridarán a una secuencia elegida, pero no a otra secuencias. Las condiciones severas dependen de las secuencias y serán diferentes bajo circunstancias diferentes. La hibridación específica de las secuencias más largas es observada a altas temperaturas a diferencia de las secuencias más cortas. Generalmente, la temperatura de una condición severa es seleccionada para que se encuentre cerca de 5 grados Centígrados por debajo del punto de fusión (Tm) para una secuencia específica en una fuerza iónica definida y pH. El Tm es la temperatura (bajo una fuerza iónica definida, pH y una concentración de ácido nucleico) en la cual 50% de las sondas complementarias a su secuencia seleccionada se hibridan a la secuencia identificada en equilibrio. De ahí que las secuencias señaladas se encuentran generalmente presentes en exceso, al Tm, 50% de las sondas se encuentran ocupadas en el equilibrio. Comúnmente, las condiciones severas serán aquellas en donde la concentración de sal sea menor a un ión de sodio de aproximadamente 1-0 M, comúnmente uno de ión de sodio de 0.01 a 1.0 M (u otras sales) a un pH de 7.0 a 8.3 y la temperatura es al menos de 30 grados Centígrados para sondas pequeñas o cebadores (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y al menos 60 grados Centígrados para sondas o cebadores más grandes. Las condiciones severas también pueden ser logradas al agregar agentes de desestabilización, tales como formamida De forma alternativa, el producto de traducción puede ser detectado para la determinación del nivel de expresión del gen C1orf59. Por ejemplo, la cantidad de la proteína C1orf59 puede ser determinada. Los métodos para determinar la cantidad de la proteína como el producto de traducción incluyen métodos de inmuno pruebas que utilizan un anticuerpo que específicamente reconoce la proteína. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. De forma adicional, cualquier fragmento o modificación (por ejemplo., anticuerpo quimérico, scFv, Fab, F(ab'), Fv, etc) del anticuerpo puede ser utilizado para la detección, mientras que el fragmento o anticuerpo modificado retenga la habilidad de enlace de la proteína C1orf59. Los métodos para preparar este tipo de anticuerpos para la detección de proteínas son bien conocidos en la técnica, y cualquier método puede ser utilizado en la presente invención para preparar dichos anticuerpos y equivalentes del mismo.

Como otro método para detectar el nivel de expresión del gen C1orf59 con base en el producto de traducción, la intensidad del manchado puede ser observada mediante un análisis inmunohistoquímico que utiliza el anticuerpo en contra de la proteína C1orf59. Principalmente, en esta medida, una mancha fuerte indica un aumento en la presencia/nivel de la proteína y, al mismo tiempo, un alto nivel de expresión del gen C1orf59.

El nivel de expresión del gen C1orf59 en las células cancerígenas puede ser determinado para ser aumentado si el nivel aumenta desde el nivel de control (por ejemplo, el nivel en las células normales) del gen señalado, por ejemplo, 10%, 25% ó 50%; o aumenta a más de 1.1 veces, más de 1.5 veces, más de 2.0 veces, más de 5.0 veces, más de 10.0 veces o más.

El nivel de control puede ser determinado al mismo tiempo con las células cancerígenas al utilizar una muestra recolectada anteriormente y almacenada de un sujeto/sujetos cuyo estado de enfermedad (canceroso o no canceroso) es/son conocido(s). De forma adicional, las células normales obtenidas de las regiones no cancerosas de un órgano que tiene el cáncer que será tratado pueden ser utilizadas como un control normal. De forma alternativa, el nivel de control puede ser determinado por un método estadístico basado en los resultados obtenidos al analizar anteriormente los niveles de expresión determinados del gen C1orf59 en muestras de sujetos cuyo estado de enfermedad es conocido. De forma adicional, el nivel de control puede ser derivado de una base de datos de patrones de expresión de células probadas previamente.

Además, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, el nivel de expresión del gen C1orf59 en una muestra derivada de un sujeto puede ser comparado con los niveles de control múltiples, los cuales son determinados a partir de múltiples muestras de referencia. Es preferido utilizar un nivel de control determinado de una muestra de referencia derivada de un tipo de tejido similar al de la muestra derivada del sujeto. Adicionalmente, es preferido utilizar el valor estándar de los niveles de expresión del gen C1orf59 en una población con un estado de enfermedad conocido. El valor estándar puede ser obtenido por cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, un rango de medio +1-2 D.E. o un medio +/-3 D.E. puede ser utilizado como el valor estándar.

En el contexto de la presente invención, nos referimos a un nivel de control determinado por una muestra biológica que es conocido que no es canceroso, es como un "nivel de control normal". Por otro lado, si el nivel de control es determinado a partir de una muestra biológica cancerosa, nos referimos a el como un "nivel de control canceroso".

Cuando el nivel de expresión del gen C1orf59 es aumentado en comparación con el nivel de control normal, o es similar/equivalente al nivel de control canceroso, el sujeto es preferentemente tratado con una vacuna o una composición farmacéutica de la presente invención.

Más específicamente, la presente invención proporciona un método de (i) diagnosticar cuando el sujeto tiene el cáncer que será tratado, y/o (¡i) seleccionar un sujeto para el tratamiento de cáncer, cuyo método incluye los pasos de: a) determinar el nivel de expresión del gen C1orf59 en las células o tejido cancerígeno obtenido a partir de un sujeto del cual se sospecha que tiene el cáncer que será tratado: b) comparar el nivel de expresión del gen C1orf59 con un nivel de control normal; c) diagnosticar si el sujeto tiene el cáncer que será tratado, si el nivel de expresión del gen C1orf59 es aumentado en comparación con el nivel de control normal; y d) seleccionar al sujeto para el tratamiento de cáncer, si el sujeto es diagnosticado con el cáncer que será tratado, en el paso c).

De forma alternativa, dicho método incluye los pasos de: a) determinar el nivel de expresión del gen C1orf59 en las células o tejidos cancerígenos obtenidos a partir de un sujeto del que se sospecha que tiene el cáncer que será tratado; b) comparar el nivel de expresión del gen C1orf59 con un nivel de control canceroso; c) diagnosticar si el sujeto tiene el cáncer que será tratado, si el nivel de expresión del gen C1orf59 es similar o equivalente al nivel de control canceroso; y d) seleccionar al sujeto para el tratamiento de cáncer, si el sujeto es diagnosticado con el cáncer que será tratado, en el paso c).

La presente invención también proporciona un equipo para determinar un sujeto que sufre de cáncer que puede ser tratado con el polipéptido C1orf59 de la presente invención, el cual también puede ser útil para dirigirse y/o monitorear la eficacia de una inmunoterapia de cáncer. Preferentemente, el cáncer incluye, pero no se limita a cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer colo-rectal, cáncer de esófago, cáncer de pulmón de célula no pequeña (NSCLC), osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de próstata y cáncer de pulmón de célula pequeña (SCLC). Más particularmente, el equipo preferentemente incluye al menos un reactivo para detectar la expresión del gen C1orf59 en una célula de cáncer derivada del sujeto, cuyo reactivo puede ser seleccionado del grupo de: a) un reactivo para detectar mARN del gen C1orf59; b) un reactivo para detectar la proteína C1orf59; y c) un reactivo para detectar la actividad biológica de la proteína C1 orf59.

Los reactivos adecuados para detectar mARN del gen C1orf59 incluyen ácidos nucleicos que específicamente se enlazan o que identifican el mARN del gen C1orf59, tales como oligonucleótidos que tienen una secuencia complementaria a una parte del mARN del gen C1orf59. Estos tipos de oligonucleótidos pueden ser preparados con base en los métodos bien conocidos en la técnica. Si es necesario, el reactivo para detectar el mARN del gen C1orf59 puede ser inmovilizado en una matriz sólida. Además, más de un reactivo para detectar el MARN del gen C1orf59 puede ser incluido en el equipo.

Por el otro lado, los reactivos adecuados para detectar la proteína C1orf59 incluyen anticuerpos de la proteína C1orf59. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. Adicionalmente, cualquier fragmento o modificación (por ejemplo, anticuerpo quimérico, scFv, Fab, F(ab')2, FV, etc.) del anticuerpo puede ser utilizado como el reactivo, mientras que el fragmento del anticuerpo modificado retenga la habilidad de enlazarse a la proteína C1orf59. Los métodos para preparar este tipo de anticuerpos para la detección de proteínas son bien conocidos en la técnica, y cualquier método puede ser utilizado en la presente invención para preparar dichos anticuerpos y equivalentes del mismo. De forma adicional, el anticuerpo puede ser etiquetado con moléculas de generación de señal mediante un enlace directo o una técnica de etiquetación indirecta. Las etiquetas y métodos para etiquetar anticuerpos y detectar el enlace de los anticuerpos a sus objetivos son bien conocidos en la técnica, y cualquier etiqueta o método puede ser utilizado para la presente invención. Adicionalmente, más de un reactivo para detectar la proteína C1orf59 puede ser incluido en el equipo.

El equipo puede contener más de uno de los reactivos mencionados anteriormente. Por ejemplo, las muestras de tejido obtenidas de los sujetos sin cáncer o que sufren de cáncer pueden ser útiles como reactivos. Un equipo de la presente invención puede incluir de forma adicional otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, incluyendo reguladores, diluyentes, filtros, agujas, jeringas e inserciones de paquetes (por ejemplo, escritos, grabados, CD-ROM, etc.) con instrucciones para su uso. Estos reactivos e instrucciones pueden ser retenidos en un contenedor con una etiqueta. Los contenedores adecuados incluyen botellas, frascos y tubos de ensayo. Los contenedores pueden ser formados de una variedad de materiales, tales como vidrio o plástico.

En una modalidad de la presente invención, cuando el reactivo es una sonda contra el mARN del gen C1orf59, el reactivo puede ser inmovilizado en una matriz sólida, tal como una tira porosa, para formar al menos un sitio de detección. La región de medición o detección de la tira porosa puede incluir una pluralidad de sitios, cada uno conteniendo un ácido nucleico (sonda). Una tira de prueba también puede contener sitios para un control negativo y/o positivo. De forma alternativa, los sitios de control pueden ser localizados en una tira separada de la tira de prueba. De forma opcional, los diferentes sitios de detección pueden contener diferentes cantidades de ácidos nucleicos inmovilizados, por ejemplo, una cantidad mayor en el primer sitio de detección y cantidades menores en los sitios subsecuentes. Encima de la adición de una muestra de prueba, el número de sitios que muestran una señal detectable proporcionan una indicación cuantitativa de la cantidad de mARN del gen C1orf59 presente en la muestra. Los sitios de detección pueden ser configurados en cualquier forma detectable adecuada y se encuentran comúnmente en la forma de una barra o punto que abarca el ancho de una tira de prueba.

El equipo de la presente invención puede incluir de forma adicional una muestra de control positiva o una muestra estándar del gen C1orf59. La muestra de control positiva de la presente invención puede ser preparada al recolectar las muestras positivas del gen C1orf59 y entonces probar sus niveles del gen C1orf59. De forma alternativa, una proteína del gen C1orf59 purificada o un polinucleótido pueden ser agregado a las células que no expresan el gen C1orf59 para formar la muestra positiva o la muestra estándar del gen C1orf59. En la presente invención, el gen C1orf59 purificado puede ser una proteína recombinante. El nivel del gen C1orf59 de la muestra de control positiva es, por ejemplo, más del valor de corte.

Los siguientes ejemplos son presentados para ilustrar la presente invención y para ayudar a una persona común en la creación y uso del mismo. Los ejemplos no son en forma alguna para limitar el alcance de la presente invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Materiales y Métodos Líneas celulares La línea celular B-linfoblastoide humana 12 (HLA-A2) y las células COS7, línea celular de riñon de mono verde africano, fueron comprados en ATCC.

Selección de candidato de péptidos derivados del gen C1orf59 Los péptidos 9-mer y 10-mer derivados del gen C1orf59 que se enlazan a la molécula HLA-A*0201 fueron pronosticados utilizando un software de predicción de enlace "BIMAS" (www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind) (Parker y asociados., J Immunol 1994, 152(1): páginas 164 a 175), Kuzushima y asociados., Blood 2001, (98)6: páginas 1872 a 1881)). Estos péptidos fueron sintetizados por Biosíntesis (Lewisville, Texas) de acuerdo con un método de síntesis de fase sólida estándar y purificada por una cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (HPLC). La pureza (>90%) y la identidad de los péptidos fueron determinadas por un HPLC analítico y un análisis de espectrometría de masa, respectivamente. Los péptidos fueron disueltos en dimetilsulfóxido (DMSO) a 20 mg/ml y almacenados a -80 grados C.

Inducción de CTL ¡n Vitro Las células dendríticas derivadas de monocito (DCs) fueron utilizadas como células que presentan antígeno (APCs) para inducir respuestas de linfocito T citotóxicos (CTL) contra los péptidos presentados en un antígeno de leucocito humano (HLA). Los DCs fueron generados in Vitro tal y como fueron descrito en cualquier lugar de (Nakahara S y asociados., Cáncer Res 2003 Jul 15, 63(14): páginas 4112 a 4118). Específicamente, las células mononucleares de la sangre periféricas (PBMCs) aisladas de un voluntario normal (HLA-A*0201 positivo) por una solución Ficoll-Plaque (Pharmacia) fueron separadas por la adherencia a un plato de plástico de cultivo de tejidos (Beckon Dickinson) para enriquecerlas como la fracción de monocito. La población enriquecida con monocito fue cultivada en la presencia de 1,000 U/ml de un factor que estimula la colonia de macrófago de granulocitos (GM-CSF) (R&D System) y 1,000 U/ml de interleucina (IL)-4 (R&D System) en un Medio AIM-V (Invitrogen) que contiene 2% de un suero autólogo desactivado por calor (AS). Después de 7 días de cultivo, los DCs inducidos con citocina fueron impulsados con 20 microgramos/ml de cada uno de los péptidos sintetizados en la presencia de 3 microgramos/ml de beta-2-microglobulina durante 3 horas a 37 grados C en un Medio AIM-V. Las células generadas aparentemente expresan moléculas asociadas con DC, tales como CD80, CD83, CD86 y HLA clase II, en sus superficies celulares (los datos no son mostrados). Estos DCs impulsados por péptidos fueron desactivados por una irradiación X (20 Gy) y mezclados a una proporción de 1:20 con células T CD8+ autólogas, obtenidas por una selección positiva con un Equipo de Aislamiento Positivo CD8 (Dynal). Estos cultivos fueron acomodados en placas con 48 depósitos (Corning), cada depósito contiene DCs impulsados por un péptido de 1.5 x 104, células T CD8+ de 3 x 105 y 10 ng/ml de IL-7 (R&D System) en 0.5 mi de AIM-V/2% de un medio AS. Tres días después, estos cultivos fueron suplementados con IL-2 (CHIRON) a una concentración final de 20 lU/ml. En los días 7 y 14, las células T fueron adicionalmente estimuladas con los DCs impulsados por péptido autólogos. Los DCs fueron preparados cada vez de la misma forma, tal y como fue descrito anteriormente. El CTL fue probado contra células T2 impulsadas por péptidos después de una tercera ronda de estimulación del péptido en el día 21 (Tanaka H y asociados., BR J Cáncer 2001 Enero 5, 84(1): páginas 94 a 99; Umano Y y asociados., Br J Cáncer 2001 Abr 20, 84(8): páginas 1052 a 1057; Uchida N y asociados., Clin Cáncer Res 2004 Dic 15, 10(24): páginas 8577 a 8586; Suda T y asociados., Cáncer Sci 2006 Mayo, 97(5): páginas 411 a 419; Watanabe T asociados., Cáncer Sci 2005 Ago (96)8: páginas 498 a 506).

Procedimiento de Expansión de CTL Los CTLs fueron expandidos en un cultivo que utiliza un método similar al descrito por Riddell y asociados (Walter EA y asociados., N Engl J Med 1995 Oct 19, 333(16): páginas 1038 a 1044; Riddell SR y asociados., Nat Med 1996 Feb, 2(2): páginas 216 a 223). Un total de 5 x 104 CTLs fueron suspendidos en 25 mi de un medio AS AIM-/V5% con 2 tipos de líneas celulares B-linfoblastoides humanas, desactivadas por Mitomicina C, en la presencia de 40 ng/ml de un anticuerpo monoclonal anti-CD3 (Pharmingen). Un día después de haber iniciado los cultivos, 120 lU/ml de IL-2 fueron agregados a los cultivos. Los cultivos fueron alimentados con un medio AS AIM-V/5% fresco que contiene 30 lU/ml de IL-2 en los días 5, 8 y 11 (Tanaka H y asociados., Br J Cáncer 2001 Enero 5, 84(1): páginas 94 a 99, Umano Y y asociados., Br J Cáncer 2001 Abr 20, 84(8): páginas 1052 a 1057; Uchida N y asociados., Clin Cáncer Res 2004 Dic 15, 10(24): páginas 8577 a 8586; Suda T y asociados., Cáncer Sci 2006 Mayo, 97(5): páginas 411 a 419; Watanabe T y asociados., Cáncer Sci 2005 Ago, 96(8): páginas 498 a 506).

Establecimiento de los clones CTL Las diluciones fueron hechas para tener 0.3, 1 y 3 CTLs/depósito en 96 placas micro trituradoras con fondo redondo (Nalge Nunc Internacional). Los CTLs fueron cultivados en un depósito celular de 1 x 104 de 2 tipos de líneas celulares B-linfoblastoide humano, 30 ng/ml de un anticuerpo anti-CD3, y 125 U/ml de IL-2 en un total de 150 microlitros/depósito de un Medio AIM-V que contiene 5% de AS. 50 microlitros/depósito de IL-2 fueron agregados al medio 10 días después para que alcance una concentración final de 125 U/ml IL-2. La actividad CTL fue probada en el día 14, y los clones CTL fueron expandidos utilizando el mismo método, tal y como fue descrito anteriormente (Uchida N y asociados.. Clin Cáncer Es 2004 Dic 15, 10(24): páginas 8577 a 8586; Suda T y asociados., Cáncer Sci 2006 Mayo, 97(5): páginas 411 a 419; Watanabe T y asociados., Cáncer Sci 2005 Ago, 96(8): páginas 498 a 506).

Actividad específica de CTL Para examinar la actividad de CTL específica, la prueba de inmunomancha enlazada a la enzima (IFN)-gamma de interferón (ELISPOT) y la prueba de inmunoabsorción enlazada a la encima IFN-gamma (ELISA) fueron llevadas a cabo. Específicamente, el T2 impulsado por péptido (1 x 104/depósito) fue preparado como un estimulador de células. Las células cultivadas en 48 depósitos fueron utilizadas como células de respuesta. La prueba ELISPOT IFN-gamma y la prueba ELISA IFN-gamma fueron llevadas a cabo bajo procedimientos de fabricación.

Preparación de las células que expresan de forma exógena el gen objetivo v el antíqeno HLA-A02 El cADN que codifica un marco de lectura abierto de los genes seleccionados o el antígeno HLA-A02 fue amplificado por PCR. El producto amplificado por PCR fue clonado dentro del vector pCAGGS. Los plásmidos fueron transferidos dentro de COS7, el cual es el gen seleccionado y la línea celular HLA-A02 nula, utilizando lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acuerdo con los procedimientos recomendados por el fabricante, después de 2 días de la transfección , las célula transferidas fueron cultivadas con versene (Invitrogen) y utilizadas como las células seleccionadas (5 x 10" células/depósito) para una prueba de actividad CTL.

Resultados Expresión mejorada del gen C1orf59 en cánceres Los datos del perfil de expresión global del gen obtenidos a partir de diferentes cánceres que utilizan una microadaptación de cADN revelaron que la expresión del gen C1orf59 (GenBank No. de Acceso NM:144584; SEQ ID No: 42) fue elevada. La expresión del gen C1orf59 fue válidamente elevada en 31 de 33 cánceres de vejiga, 34 de 70 cánceres de mama, 2 de 10 NSCLC, 8 de 18 osteosarcomas, 1 de 1 cánceres de ovario, 3 de 6 cánceres pancreáticos, 20 de 41 cánceres de próstata, 7 de 13 SCLC y 24 de 34 tumores de tejido blando, tal y como fue comparado con el tejido normal correspondiente (Tabla 1).

Tabla 1 Proporción de casos donde se observó la activación del gen C1orf59 en tejido canceroso en comparación con el tejido normal correspondiente.

Predicción de péptidos que se enlazan a antíqenos HLA-A02 derivados del gen C1orf59 La tabla 2 muestra los péptidos que se enlazan al antígeno HLA-A02 del gen C1orf59 en el orden de una afinidad de enlace alta. Un total de 24 péptidos con un potencial de habilidad de enlace al antígeno HLA-A02 fueron seleccionados y examinados para determinar los péptidos epítopes. (Tabla 2).

HLA-A02 que se enlaza al péptido 9mer y 10mer derivados del gen C1orf59 La posición inicial indica el número de residuo de amino ácido de la Terminal N del gen C1orf59.

La calificación de enlace es derivada de "BIMAS".

Inducción de CTL con los péptidos pronosticados del gen C1orf59 restringidos con HLA-A*0201 Los CTLs para aquellos péptidos derivados del gen C1orf59 fueron generados de acuerdo con los protocolos descritos en "Materiales y Métodos". La actividad de CTL del péptido específico fue determinada por una prueba ELISPOT IFN-gamma (Figura 1 (a)-(i)). Mostró que el depósito número #6 estimulado con el gen C1 orf59-A02-9-261 (SEQ ID NO: 1) (a), #2 y #7 con el gen C1 orf59-A02-0-152 (SEQ ID NO: 3) (b), #4 y #6 con el gen C1 orf59-A02-9-121 (SEQ ID NI: 4) (c), #3 con el gen C1 orf59-A02-9-122 (SEQ ID NO: 7) (d), #5 con el gen C1orf59-A02-10-240 (SEQ ID NO: 9) (e), #4 con el gen C1orf59-A02-10-90 (SEQ ID NO: 13) (f), #7 con el gen C1 orf59-A02-10-188 (SEQ ID NO: 15) (g), #4 y #8 con el gen C1 orf59-A02-10-122 (SEQ ID NO: 17) (h), y #2 con el gen C1 orf59-A02-10-196 (SEQ ID NO: 20) (i) demostró una producción de IFN-gamma potente tal y como fue comparada con los depósitos de control. Por el otro lado, la actividad de CTL no específica fue determinada mediante la estimulación con otros péptidos mostrados en la Tabla 1, a pesar de que aquellos péptidos tuvieron una actividad de enlace posible con el antígeno HLA-A*0201. Como un caso común de los datos negativos, la producción de IFN-gamma específica no fue detectada por el CTL estimulado con el gen C1 orf59-A02-10-261 (SEQ ID NO: 8) (Fig 1 (j)). Como resultado, 9 péptidos derivados del gen C1orf59 fueron vistos como péptidos que pueden inducir CTLs potentes.

Establecimiento de líneas CTL v clones contra los péptidos específicos del gen C1orf59 Las células que mostraron una actividad CTL específica del péptido detectadas por la prueba ELISPOT IFN-gamma en el depósito número #7 con el gen C1 orf59-A02-9-152 (SEQ ID NO: 3), #6 con el gen C1 orf59-A02-9-121 (SEQ ID NO: 4), #7 con el gen C1 orf59-A02-10-188 (SEQ ID NO: 15), #8 con el gen C1orf59-A02-10-122 (SEQ ID NO: 17) y #2 con el gen C1orf59-A02-10-196 (SEQ ID NO: 20) fueron expandidas y establecidas como líneas CTL. Cada actividad CTL de aquellas líneas CTL fue determinada por una prueba ELISA IFN-gamma (Fig 2 (a)-(e)). Se mostró que todas las líneas CTL demostraron una producción de IFN-gamma potente contra las células objetivo impulsadas con el péptido correspondiente tal y como es comparada con las células seleccionadas sin el impulso del péptido. De forma adicional, los clones CTL fueron establecidos al limitar la dilución de las líneas CTL, tal y como fue descrito en "Materiales y Métodos", y la producción de IFN-gamma de los clones CTL contra las células seleccionadas impulsadas con el péptido fueron determinadas por clones CTL estimulados con los genes Clorf50-A02-9-121 (SEQ ID NOI: 4), C 1 orf59-A02-10-188 (SEQ ID NO: 15) y C1 orf59-A02-10-196 (SEQ ID NO: 20).

Actividad de CTL específica contra las células seleccionadas que expresan de forma exógena C1orf59 y HLA-A*0201 Las líneas de CTL establecidas confrontadas contra estos péptidos fueron examinadas por su habilidad para reconocer las células seleccionadas que expresan de forma exógena el gen C1orf59 y la molécula HLA-A*0201. La actividad de CTL específica contra las células COS7, que fueron transfectadas con la longitud total tanto del gen C1orf59 como del gen de la molécula HLA-A*0201 (un modelo específico para las células seleccionadas que expresan de forma exógena el gen C1orf59 y la molécula HLA-A*0201 ) fue probada utilizando las líneas CTL confrontadas por el péptido correspondiente como las células efectuadoras. Las células COS7 transfectadas con la longitud total de tanto los genes C1orf59 como el antígeno HLA-A*0201 fueron preparadas como control. En la figura 4, los CTLs estimulados con los genes C1 orf59-A02-9-152 (SEQ ID NO: 3) (a), C1orf59-A02-9-121 (SEQ ID NO: 4) (b) y C1 orf59-A02-10-188 (SEQ ID NO: 15) (c) mostraron una actividad potente de CTL contra las células COS7 que expresan tanto el gen C1orf59 como el antígeno HLA-A*0201. Por el otro lado, no fue detectada actividad específica alguna de CTL contra los controles. Además, estos datos claramente demuestran que los genes C1 orf59-A02-9-152 (SEC ID NO: 3), C1 orf59-A02-9-121 (SEQ ID NO: 4) y C1 orf59-A02-10-188 (SEQ ID NO: 15) son expresados de forma natural en las células seleccionadas con la molécula HLA-A*0201 y son reconocidas por los CTLs. Estos resultados indican que estos péptidos derivados del gen C1orf59 pueden encontrarse disponibles para aplicar vacunas de cáncer para pacientes con el gen C1orf59 que expresa tumores.

Análisis de homología de péptidos de antíqeno Los CTLs estimulados con El gen C1 orf59-A02-9-261 (SEQ ID NO:1), El gen C1 orf59-A02-9-152 (SEQ ID NO:3), El gen C1 orf59-A02-9-121 (SEQ ID NO:4), El gen C1 orf59-A02-9-122 (SEQ ID NO:7), El gen C1 orf59-A02-10-240 (SEQ ID NO:9), El gen C1 orf59-A02-10-90 (SEQ ID NO:13), El gen C1 orf 59-A02-10-188 (SEQ ID NO:15), El gen C1 orf59-A02-10-122 (SEQ ID NO:17) y El gen C1 orf59-A02-10-196 (SEQ ID NO: 20) mostraron una actividad de CTL específica y significativa. Este resultado puede ser debido al hecho de que las secuencias de los genes C1orf59-A02-9-261 (SEQ ID NO:1), C 1 orf59-A02-9- 152 (SEQ ID NO:3), C1orf59-A02-9-121 (SEQ ID NO:4), C 1 orf 59-A02-9- 122 (SEQ ID NO:7), C 1 orf59-A02-10-240 (SEQ ID NO:9), C1orf59-A02-10-90 (SEQ ID NO:13), C1 orf59-A02-10-188 (SEQ ID NO:15), C1orf59-A02-10-122 (SEQ ID NO:17) y C1 orf59-A02-10- 196 (SEQ ID NO: 20) son homologas a los péptidos derivados de otras moléculas que es sabido que sensibilizan el sistema inmune humano. Para excluir esta posibilidad, los análisis de homología fueron llevados a cabo para esas secuencias de péptidos utilizando como consulta el algoritmo BLAST (www, nbci .nlm.nih.gov/blast/blast.cqi). los cuales revelan secuencias con una homología significativa. Los resultados de los análisis de homología indican que las secuencias de El gen C1 orf59-A02-9-261 (SEQ ID NO:1), El gen C1 orf 59-A02-9-152 (SEQ ID NO:3), El gen C1 orf 59-A02-9-121 (SEQ ID NO:4), El gen C1 orf59-A02-9-122 (SEQ ID NO:7), El gen C1 orf59-A02-10-240 (SEQ ID NO:9), El gen C1 orf59-A02-10-90 (SEQ ID NO:13), El gen C1 orf59-A02-10-188 (SEQ ID NO:15), El gen C1 orf59-A02-10-122 (SEQ ID NO:17) y El gen C1 orf59-A02-10-196 (SEQ ID NO: 20) son únicas y además, existe una pequeña posibilidad, a nuestro mejor entendimiento, de que esas moléculas lleven a respuestas inmunológicas no pretendidas a algunas moléculas no relacionadas.

Como conclusión, el péptido del epítope HLA-A02 novedoso derivado del gen C1orf59 fue derivado y quedó demostrado que se puede aplicar la inmunoterapia contra el cáncer.

Ejemplo 2 Materiales v Métodos Líneas celulares La línea celular linfoblastoide A24 (A24LCL) fue establecida por una transformación con el virus Epstein-Barr dentro del linfocito B humano con HLA-A24 positivo. COS7, la línea celular de riñon de mono verde africano, fue comprada en ATCC.

Selección de candidato de péptidos derivados del gen C1orf59 Los péptidos 9-mer y 10-mer derivados del gen C1orf59 que se enlazan a la molécula HLA-A*2402 fueron pronosticados utilizando un software de predicción de enlace "BIMAS" (www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind) (Parker y asociados., J Immunol 1994, 152(1): páginas 163 a 175), Kuzushima y asociados., Blood 2001, (98)6: páginas 1872 a 1881)). Estos péptidos fueron sintetizados por Sigma (Saporo, Japón) de acuerdo con un método de síntesis de fase sólida estándar y purificados por una cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (HPLC). La pureza (>90%) y la identidad de los péptidos fueron determinadas por un HPLC analítico y un análisis de espectrometría de masa, respectivamente. Los péptidos fueron disueltos en dimetilsulfóxido (DMSO) a 20 mg/ml y almacenados a -80 grados C.

Inducción de CTL in Vitro Las células dendríticas derivadas de monocitos (DCs) fueron utilizadas como células que presentan antígenos (APCs) para inducir respuestas de linfocito T citotóxicas (CTL) contra los péptidos presentados en un antígeno de leucocito humano (HLA). Los DCs fueron generados in Vitro tal y como fueron descrito en cualquier lugar de (Nakahara S y asociados., Cáncer Res 2003 Jul 15, 63(14): páginas 4112 a 4118). Específicamente, las células mononucleares en la sangre periférica (PBMCs) aisladas de un voluntario normal (HLA-A*2402 positivo) por una solución Ficoll-Plaque (Pharmacia) fueron separadas por la adherencia a un plato de plástico de cultivo de tejidos (Beckon Dickinson) para enriquecerlas como la fracción de monocito. La población enriquecida con monocitos fue cultivada en la presencia de 1,000 U/ml de un factor que estimula la colonia de macrófago de granulocitos (GM-CSF) (R&D System) y 1,000 U/ml de interleucina (I L)-4 (R&D System) en un Medio AIM-V (Invitrogen) que contiene 2% de un suero autólogo desactivado por calor (AS). Después de 7 días de cultivo, los DCs inducidos con citocina fueron impulsados con 20 microgramos/ml de cada uno de los péptidos sintetizados en la presencia de 3 microgramos/ml de beta-2-microglobulina durante 3 horas a 37 grados C en un Medio AIM-V. Las células generadas aparentemente expresan moléculas asociadas con DC, tales como CD80, CD83, CD86 y HLA clase II, en sus superficies celulares (los datos no son mostrados). Estos DCs impulsados por péptidos fueron desactivados por una irradiación X (20 Gy) y mezclados a una proporción de 1:20 con células T CD8+ autólogas, obtenidas por una selección positiva con un Equipo de Aislamiento Positivo CD8 (Dynal). Estos cultivos fueron acomodados en placas con 48 depósitos (Corning), cada depósito contiene DCs impulsados por péptido de 1.5 x 104 células T CD8+ de 3 x 105 y 10 ng/ml de IL-7 (R&D System) en 0.5 mi de AIM-V/2% de un medio AS. Tres días después, estos cultivos fueron suplementados con IL-2 (CHIRON) a una concentración final de 20 IU/ml. En los días 7 y 14, las células T fueron adicionalmente estimuladas con los DCs impulsados por péptidos autólogos. Los DCs fueron preparados cada vez de la misma forma, tal y como fue descrito anteriormente. El CTL fue probado contra células T2 impulsadas por péptido después de una tercera ronda de estimulación del péptido en el día 21 (Tanaka H y asociados., BR J Cáncer 2001 Enero 5, 84(1): páginas 94 a 99; Umano Y y asociados., Br J Cáncer 2001 Abr 20, 84(8): páginas 1052 a 1057; Uchida N y asociados., Clin Cáncer Res 2004 Dic 15, 10(24): páginas 8577 a 8586; Suda T y asociados., Cáncer Sci 2006 Mayo, 97(5): páginas 411 a 419; Watanabe T asociados., Cáncer Sci 2005 Ago (96)8: páginas 498 a 506).

Procedimiento de Expansión de CTL Los CTLs fueron expandidos en un cultivo que utiliza un método similar al descrito por Riddell y asociados (Walter EA y asociados., N Engl J Med 1995 Oct 19, 333(16): páginas 1038 1044; Riddell SR y asociados., Nat Med 1996 Feb, 2(2): páginas 216 a 223). Un total de 5 x 104 CTLs fueron suspendidos en 25 mi de un medio AS AIM-/V5% con 2 tipos de líneas celulares B-linfoblastoides humanas, desactivadas por MMC, en la presencia de 40 ng/ml de un anticuerpo monoclonal anti-CD3 (Pharmingen). Un día después de haber iniciado los cultivos, 120 lU/ml de IL-2 fueron agregados a los cultivos. Los cultivos fueron alimentados con un medio AS AIM-V/5% fresco que contiene 30 lU/ml de IL-2 en los días 5, 8 y 11 (Tanaka H y asociados., Br J Cáncer 2001 Enero 5, 84(1): páginas 94 a 99, Umano Y y asociados., Br J Cáncer 2001 Abr 20, 84(8): páginas 1052 a 1057; Uchida N y asociados., Clin Cáncer Res 2004 Dic 15, 10(24): páginas 8577 a 8586; Suda T y asociados., Cáncer Sci 2006 Mayo, 97(5): páginas 411 a 419; Watanabe T y asociados., Cáncer Sci 2005 Ago, 96(8): páginas 498 a 506).

Establecimiento de los clones CTL Las diluciones fueron hechas para tener 0.3, 1 y 3 CTLs/depósitos en 96 placas micro trituradoras con fondo redondo (Nalge Nunc Internacional). Los CTLs fueron cultivados en un depósito celular de 1 x 104 de 2 tipos de líneas celulares B-linfoblastoide humano, 30 ng/ml de un anticuerpo anti-CD3, y 125 U/ml de IL-2 en un total de 150 microlitros/depósito de un Medio AIM-V que contiene 5% de AS. 50 microlitros/depósito de IL-2 fueron agregadas al medio 10 días después para que alcance una concentración final de 125 U/ml IL-2. La actividad CTL fue probada en el día 14, y los clones CTL fueron expandidos utilizando el mismo método, tal y como fue descrito anteriormente (Uchida N y asociados., Clin Cáncer Es 2004 Dic 15, 10(24): páginas 8577 a 8586; Suda T y asociados., Cáncer Sci 2006 Mayo, 97(5): páginas 411 a 419; Watanabe T y asociados., Cáncer Sci 2005 Ago, 96(8): páginas 498 a 506).

Actividad específica de CTL Para examinar la actividad específica de CTL, se llevaron a cabo la prueba de inmunomanchado enlazado a la enzima (IFN)-gamma de interferón (ELISPOT) y la prueba de inmunoabsorción enlazada a la encima IFN-gamma (ELISA). Específicamente, el A24 LCL impulsado por péptidos (1 x 104/depósito) fue preparado como un estimulador de células. Las células cultivadas en 48 depósitos fueron utilizadas como células de respuesta. La prueba ELISPOT IFN-gamma y la prueba ELISA IFN-gamma fueron llevadas a cabo bajo procedimientos de fabricación.

Establecimiento de células que expresan forzosamente va sea el gen objetivo y el antígeno HLA-A24 El cADN que codifica un marco de lectura abierto de los genes seleccionados o el antígeno HLA-A24 fue amplificado por PCR. El producto del PCR amplificado fue clonado dentro del vector pCAGGS. Los plásmidos fueron transfectados dentro de células COS7, el cual es el gen seleccionado y la línea celular HLA-A24 nula, utilizando lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acuerdo con los procedimientos recomendados por el fabricante. Dos días después de la transfección , las células transfectadas fueron cultivadas con versene (Invitrogen) y utilizadas como las células identificadas (depósitos celulares de 5 X 104) para la prueba de actividad de CTL..

Resultados Predicción de los péptidos que se enlazan al antígeno HLA-A24 derivados del gen C1orf59 La tabla 3 muestra los péptidos que se enlazan al antígeno HLA-A24 del gen C1orf59 en el orden de una alta afinidad de enlace. Un total de 17 péptidos con una habilidad de potencial de enlace a HLA-A24 fueron seleccionados y examinados para determinar los péptidos epítopes (Tabla 3).

Tabla 3 HLA-A24 que se enlaza a los péptidos 9mer y 10mer derivados del gen C1orf59 Insertar tabla 3 pagina 44 La posición de inicio indica el número de residuos de aminoácido de la terminal -N del gen C1orf59.

La calificación de enlace es derivada de "BIMAS".

Inducción de CTL con los péptidos pronosticados del gen C1orf59 restringidos con el antígeno HLA-A*2402 y establecimiento para las líneas CTL estimuladas con péptidos derivados del gen C1orf59 Los CTLs para aquellos péptidos derivados del gen C1orf59 fueron generados de acuerdo con los protocolos descritos en "Materiales y Métodos". La actividad CTL específica del péptido fue determinada por una prueba ELISPOT IFN-gamma (Figura 5a-e). Mostró que los depósitos número #5 estimulado con el gen C1 orf59-A24-9-221 (SEQ ID NO: 26) (a), #3 con el gen C1 orf59-A24-9-66 (SEQ ID NO: 32) (b), #4 con el gen C1 orf 59-A24-9-200 (SEQ ID NO: 34) (c), #5 con el gen C1orf59-A24-10-124 (SEQ ID NO: 40) (d) y #7 con el gen C1orf59-A24-10-363 (SEQ ID NO: 41 (e) demostraron una producción de IFN-gamma potente comparada con los depósitos de control. De forma adicional, todas estas células en los depósitos positivos fueron expandidas y las líneas CTL fueron establecidas. La actividad CTL de aquellas líneas CTL fue determinada por la prueba ELISA IFN-gamma (Figura 6a-e). Se mostró que todas las líneas CTL demostraron una producción de IFN-gamma potente contra las células seleccionadas impulsadas con el péptido correspondiente en comparación con las células seleccionadas sin el impulso del péptido. Por el otro lado, ninguna línea CTL pudo ser establecida por la estimulación con otros péptidos mostrados en la Tabla 3, a pesar que aquellos péptidos pudieron tener una actividad de enlace posible con HLA-A*2402 (los datos no fueron mostrados). Como resultado, se indicó que 5 péptidos derivados del gen C1orf59 fueron proyectados como los péptidos que pueden inducir líneas CTL potentes.

Establecimiento de clones CTL contra los péptidos específicos del gen C1orf59 Los clones CTL fueron establecidos al limitar la dilución de las líneas CTL, tal y como fue descrito en "Materiales y Métodos", la producción de IFN-gamma de los clones CTL contra las células seleccionadas impulsadas con péptido fue determinada por la prueba ELISA IFN-gamma. Las producciones de IFN-gamma potentes fueron determinadas por los clones CTL estimulados con el gen C1 orf59-A24-9-221 (SEQ ID NO: 26) (a), C1orf59-A24-9-66 (SEQ ID NO: 32) (b), C1 orf59-A24-9-200 (SEQ ID NO: 34) (c), C1 orf59-A24-10-124 (SEQ ID NO: 40) (d) y C1orf59-A24-10-363 (SEQ ID NO: 41) en la figura 7.

Actividad específica de CTL contra las células seleccionadas que expresan de forma exógena el gen C1orf59 v el antíqeno HLA-A*2402 Las líneas CTL establecidas confrontadas contra esos péptidos fueron examinadas por su habilidad de reconocer las células seleccionadas que expresan el gen C1orf59 y la molécula HLA-A*2402. La actividad CTL específica contra las células COS7 las cuales fueron transfectadas con la longitud total del gen C1orf59 y el gen de la moléculas HLA-A*2402 (un modelo específico para las células seleccionadas que expresan el gen C1orf59 y el gen de la moléculas HLA-A*2402) fue probado utilizando las líneas CTL confrontadas por el péptido correspondiente como las células efectuadoras. Las células COS7 transfectadas con la longitud total de los genes C1orf59 o el antígeno HLA-A*2402 fueron preparadas como control. En la figura 8, los CTLs estimulados con la SEQ ID NO: 26 mostraron una actividad de CTL potente contra las células COS7 que expresan tanto los genes C1orf59 y el antígeno HLA-A*2402. Por el otro lado, ninguna actividad de CTL específica fue detectada contra los controles. Además, estos datos claramente demostraron que el gen C1 orf59-A24-9-221 (SEQ ID NO: 26) fue disociado de forma natural y expresado en las células seleccionadas con la molécula HLA-A*2402, y el complejo fue reconocido por los CTLs. Estos resultados indican que este péptido derivado del gen C1orf59 puede estar disponible para aplicar vacunas contra el cáncer para paciente que expresan tumores con el gen C1orf59.

Análisis de homología de péptidos de antígeno Los CTLs estimulados con los genes C1 orf59-A24-9-221 (SEQ ID NO: 26) (a), C1 orf59-A24-9-66 (SEQ ID NO: 32) (b), C1orf59-A24-9-200 (SEQ ID NO: 34) (c), C1 orf59-A24-10-124 (SEQ ID NO: 40) (d) y C1 orf59-A24-10-363 (SEQ ID NO: 41) mostraron una actividad CTL significativa y específica. Este resultado puede ser debido al hecho de que las secuencias de los genes C1orf59-A24-9-221 (SEQ ID NO: 26) (a), C1orf59-A24-9-66 (SEQ ID NO: 32) (b), C1 orf59-A24-9-200 (SEQ ID NO: 34) (c), C1orf59-A24-10-124 (SEQ ID NO: 40) (d) y C1orf59- A24-10-363 (SEQ ID NO: 41) son homologas a los péptidos derivados de otras moléculas que son conocidas por sensibilizar el sistema inmune humano. Para excluir esta posibilidad, fueron llevados a cabo los análisis homólogos para esas secuencias de péptido que utilizan como consulta el algoritmo BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cqi) que no revelaron secuencia alguna con homología significativa. Estos resultados del análisis de homología indican que las secuencias de los genes C1 orf59-A24-9-221 (SEQ ID NO: 26) (a), C1 orf59-A24-9-66 (SEQ ID NO: 32) (b), C1 orf59-A24-9-200 (SEQ ID NO: 34) (c), C1orf59-A24-10-124 (SEQ ID NO: 40) (d) y C1 orf59-A24-10-363 (SEQ ID NO: 41) son únicas y además, existe una pequeña posibilidad, a nuestro mejor entender, de que esas moléculas produzcan una respuesta inmunológica no pretendida a cierta molécula no relacionada.

Aplicación Industrial La presente invención describe nuevos TAAs, particularmente aquellos derivados del gen C1orf59, los cuales inducen respuestas inmunes anti-tumor específicas potentes y tienen aplicación en una amplia selección de tipo de cáncer. Dichos TAAs son útiles como vacunas de péptido contra enfermedades asociadas con una sobre-expresión del gen C1orf59, por ejemplo el cáncer, más particularmente, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer colo-rectal, cáncer de esófago, cáncer de pulmón de célula no pequeña (NSCLC), osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata y cáncer de pulmón de célula pequeña (SCLC).

Aunque que la presente invención es descrita en detalle y con referencia a las modalidades específicas de la misma, deberá de ser entendido que la descripción anterior es ejemplar y explicativa en su naturaleza y se pretende ilustrar la presente invención y sus modalidades preferidas. Mediante una experimentación de rutina, un experto en la técnica fácilmente reconocerá que pueden ser hechos varios cambios y modificaciones sin salirse del espíritu y alcance de la presente invención, las medidas y límites son definidos por las reivindicaciones adjuntas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un péptido de enlace del antígeno HLA que tiene capacidad de inducción de linfocitos citotóxicos T (CTL), caracterizado porque el péptido consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 43 o es un fragmento inmunológicamente activo del mismo.

2. El péptido aislado tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el antígeno de HLA es HLA-A02.

3. El péptido aislado tal y como se describe en la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente de las SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 7, 9, 13, 15, 17 y, 20.

4. El péptido aislado tal y como se describe de la reivindicación 1 a la 3, caracterizado porque es un nonapéptido o decapéptido.

5. El péptido aislado tal y como se describe en la reivindicación 4, caracterizado porque consiste de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente de las SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 7, 9, 13, 15, 17 y, 20, en donde 1, 2, o varios aminoácidos son insertados, substituidos, eliminados o agregados.

6. El péptido tal y como se describe en la reivindicación 5, caracterizado porque tiene una o ambas de las siguientes características: (a) el segundo aminoácido de la terminal -N es seleccionado del grupo de leucina y metionina; (b) el aminoácido de la terminal -C es seleccionado del grupo de valina y leucina.

7. El péptido aislado tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque, el antígeno de HLA es HLA-A24.

8. El péptido aislado tal y como se describe en la reivindicación 1 ó 7, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo consistente de las SEQ ID NOs: 26, 32, 34, 40 y 41.

9. El péptido aislado tal y como se describe en la reivindicación 7 u 8, caracterizado porque es un nonapéptido o decapéptido.

10. El péptido aislado tal y como se describe en la reivindicación 9, caracterizado porque consiste de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente de las SEQ ID NOs: 26, 32, 34, 40 y 41, en donde 1, 2, o varios aminoácidos son insertados, substituidos, eliminados o agregados.

11. El péptido tal y como se describe en la reivindicación 9, caracterizado porque tiene una o ambas de las siguientes características: (a) el segundo aminoácido de la terminal -N es seleccionado del grupo consistente de fenilalanina, tirosina, metionina y triptofano; y (b) el aminoácido de la terminal -C es seleccionado del grupo de fenilalanina, leucina, isoleucina, triptofano y metionina.

12. Un polinucleótido aislado que codifica un péptido tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 11.

13. Un agente para inducir el CTL, caracterizado porque el agente comprende uno o más péptidos tal y como se describen en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 11, o uno o más polinucleótidos tal y como se describen en la reivindicación 12.

14. Un agente farmacéutico para el tratamiento y/o profilaxis de cánceres y/o la prevención de la recurrencia postoperatoria de los mismos, caracterizado porque el agente comprende uno o más péptidos tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 11, o uno o más polinucleótidos tal y como se describen en la reivindicación 12.

15. El agente farmacéutico tal y como se describe en la reivindicación 14, caracterizado porque es formulado para la administración a un sujeto cuyo antígeno de HLA es HLA-A02 o A24.

16. El agente farmacéutico tal y como se describe en la reivindicación 14 ó 15, caracterizado porque es formulada para el tratamiento del cáncer.

17. Un método para inducir una célula que presenta un antígeno (APC) con la capacidad de inducción de CTL, caracterizado porque el método comprende los siguientes pasos: (a) poner en contacto un APC con un péptido tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 11 in vi tro, ex vivo o in vivo; y (b) introducir un polinucleótido que codifica un péptido tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 11 dentro de un APC.

18. Un método para inducir el CTL por medio de cualquiera de los métodos que comprenden al menos uno de los siguientes pasos: (a) co-cultivar células T del CD8- positivas con APCs, los cuales presentan en su superficie un complejo de un antígeno HLA y un péptido tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 11; (b) co-cultivar la célula T del CD8- positivas con exosomas, los cuales presentan en su superficie un complejo de un antígeno HLA o péptido tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 11; y (c) introducir un gen que comprende un polinucleótido que codifica un receptor de la célula T (TCR) el enlace del polipéptido de la sub-unidad de un péptido tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 11 dentro de una célula T.

19. Una APC aislada que presenta en su superficie un complejo de un antígeno de HLA en un péptido tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 11.

20. Una APC tal y como se describe en la reivindicación 19, el cual es inducido mediante el método tal y como se describe en la reivindicación 17.

21. Un CTL aislado que tiene como objetivo un péptido tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 11.

22. Un CTL tal y como se describe en la reivindicación 21, el cual es inducido por un método tal y como se describe en la reivindicación 18.

23. Un método para inducir una respuesta inmune contra el cáncer en un sujeto que comprende la administración al sujeto de un agente que comprende un péptido tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 11, un fragmento inmunológicamente activo del mismo, o un polinucleótido que codifica el péptido o el fragmento.