JP2003523365A

JP2003523365A - Ｈｉｖ感染の診断及びコントロールのためのｈｉｖペプチド及びそれをエンコードする核酸

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Publication number: JP2003523365A
Application number: JP2001561029A
Authority: JP
Inventors: フォムスガード，アンデル; ブラナック，ソレン; バス，ソレン; コルベット，シルヴィ; ラエモラー，サンヌ，リース; ハンセン，ジャン
Original assignee: Statens Serum Institut SSI
Current assignee: Statens Serum Institut SSI
Priority date: 2000-01-28
Filing date: 2001-01-29
Publication date: 2003-08-05
Also published as: CA2397998A1; AU2001228320A1; WO2001055177A2; EP1250351B1; EP1250351A2; ATE311404T1; WO2001055177A3

Abstract

(57)【要約】この発明は、生化学アッセイ、統計学上のマトリクス算出及び擬似神経回路網の組合わせによるCTLエピトープの同定に関する。一連のペプチドライブラリーは、全ての潜在的な非冗長ペプチドに対するMHC結合の一次予測を得るために用いられるペプチド-MHC相互作用を示す完全な不偏向マトリクスを生じるために用いられる。最良バインダーは、定量的生化学結合アッセイ、次いで、これらのインビトロの実験的MHC-I結合データから構築される、コンピューター処理される擬似神経回路網予測プログラムに付される。方法は、さらに、アミノ酸を置換して同定エピトープを改良し、インビトロ及びインビボモデルで同定CTLエピトープを試験することからなる。したがって、この発明のひとつの態様は、ワクチンのCTL成分の同定及び該CTL成分の開発に関する。この発明の別の態様は、該CTL成分について同定されたエピトープに関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野この発明は、生化学アッセイ、統計学上のマトリクス算出(statistical matri
x calculation)及び擬似神経回路網(artificial neural network)の組合わせに
よるCTLエピトープの同定に関する。この発明は、さらに、生化学的なインビト
ロのアッセイ及びインビボの動物モデルにおける同定されたCTLエピトープの試
験に関する。この発明の1つの観点は、同定され、試験されたCTLエピトープの、
例えば診断剤、予防剤及び治療剤の製造のための薬剤における使用に関する。

【０００２】発明の背景ウイルスは、細胞内生物である。したがって、細胞障害性のT-細胞リンパ球(C
TL)は、ウイルス疾患に対する主要な保護機序である。抗体は細胞外のヒト免疫
不全ウイルス(HIV)を中和し、その結果、宿主における細胞の感染を制限又は妨
げる(Shibataら, 1999)が、CTLは細胞を殺し、アポトーシスを誘発し、抗ウイル
ス物質を誘発し、及び/又は既に感染した細胞の細胞内溶解を増大させることに
よってウイルス産生を制限し、その結果、疾患を治癒又は予防する。 CD8⁺ CTLが初期のHIV感染の予防及び制限の双方に主要な役割を果たし(Koupら
, 1994)、同時にHIV感染のあいだ活性である(Harrerら, 1994)ことは、相当量の
論証が示唆している。CTL活性と保護との相関関係は、サル(Schmitzら, 1999)及
び誘発試験実験(Gallimoreら, 1995)で確認された。したがって、CTLを活性化さ
せる予防接種によりHIV感染を予防及び/又は治療するためには、新しいCTLエピ
トープの同定が極めて重要である。

【０００３】最近20年のあいだになされた進歩により、最も重要な免疫認識の1つ‐T細胞の
免疫認識‐は複雑な標的構造の一部としてペプチドを用いることが確証されてい
る。T-細胞は、主要組織適合性複合体(MHC)分子に関連して提示されるペプチド
に特異的である; その現象は、MHC拘束として知られる。個体発生のあいだ、宿
主に利用可能なMHC分子は、選択過程によりT-細胞レパートリーの形成に関わっ
ており、その結果、宿主MHC分子によってT-細胞認識が拘束される。後に、宿主M
HC分子の1つに関連して提示される病原体由来ペプチドのみが宿主T-細胞免疫系
によって認識され得る。このように、宿主に利用可能な特定のMHC分子は、T-細
胞免疫系の特異性に極めて直接的な影響を及ぼす。したがって、MHC分子の特異
性は、かなり科学的かつ実用的興味の対象となる。 MHC拘束と、例えば生化学アッセイにおける推定上のCTLエピトープに対するMH
C分子の結合能とには、良好な相関関係が確立されている。生化学的なアプロー
チの主たる利点は、結合が正確に定量でき、MHC特異性が分離して(in isolation
)、非常に適切に、高度に制御された条件下でアドレッシングされ得ることであ
る。MHC特異性、例えば一次アンカー、二次アンカー及び疎外(disfavoured)アミ
ノ酸は、精製MHCとペプチドとの相互作用によって研究できると、現在確信され
ている。

【０００４】幾つかのMHC分子の生化学的特異性は今や非常に詳細に記載され(Falkら, 1991
, Ruppertら, 1993)、構造的に説明されている(Maddenら, 1995)。予想されたよ
うに、ペプチド結合特異性はかなり広い。この広範な特異性はペプチドモチーフ
の認識;あるアンカー位置における特定のアミノ酸の存在及び適当な間隔のよう
な重要な構造上の要件の存在を要する認識形式によって得られる(Falkら, 1991,
Setteら, 1987, Rammenseeら, 1995)。したがって、同じMHCアロタイプに結合
するペプチドはある程度の類似性を示すが、同一である必要はない。X-線結晶学
は、MHCの多様な形態の外部ドメインにユニークなペプチド結合部位を同定して
いる(Fremontら, 1992)。これらの外部ドメインは、A〜Fの種々のポケットに細
別できる溝を形成する(Garrettら, 1989)。大多数のペプチド-MHC 結合は、MHC
クラスIに対する末端を含むペプチド主鎖(又は骨格)原子を包含する(Fremontら,
1992)。これにより、骨格原子が全ペプチドに共通なので、ひとつのMHCハプロ
タイプが、いかにして多数かつ多様なレパートリーのペプチドに対し高親和性(K _D = 10^-8〜10^-9 M)結合を行い得るかが説明される。ペプチド側鎖原子に関わる
結合エネルギーは、ごくわずかでしかない。しかし、これらの相互作用はMHCの
特異性を説明するものと考えられている(Matsumuraら, 1992)。

【０００５】 MHC特異性は種々の方法で示されており、これらの最も精巧なものは、エピト
ープの所定位置における特定のアミノ酸の頻度を示す完全な統計学上のマトリク
スである。このようなマトリクスは、大きなシリーズの類似体の分析(偏向マト
リクス)、又はペプチドライブラリー分析(非偏向マトリクス) に基づくことがで
き、後者により、かなり良好な予測が得られる。しかし、マトリクスから得られ
る予測は全て、各サブ部位の特異性は隣接するサブ部位に存在する残基から独立
していることを仮定している。マトリクスから得られる推測がそこそこ成功する
のであれば、これは一般的仮定として支持されるであろう。しかし、結晶構造は
、この仮説に反する例を明らかに同定している。したがって、結合の予測におけ
るさらなる改良には、多少長い範囲の相関作用を含む全配列を考慮に入れる必要
がある。これらの非-線形の作用を含む単純な一連の規則は、考えにくい。

【０００６】完全に無作為な8マーのペプチドライブラリーは、MHC結合アッセイで検出され
るのに十分なペプチドバインダーを含むことが、最近明らかにされた。これらの
知見はあるストラテジを示唆しているが、それには研究中の所定の大きさと組成
の全ての可能性あるペプチドを、系統的な一連のサブライブラリーによって提示
することを要する。各サブライブラリーでは、ある位置のあるアミノ酸は一定に
維持されるが、残りの位置はアミノ酸混合物を含む。同様のデザインはHoughten
と共働者によって最近報告されており、「位置走査コンビナトリアルペプチドラ
イブラリー(positional scanning combinatorial peptide library)」(PSCPL)と
命名された。多大な労力を要する伝統的な実験エピトープマッピングを回避するために、線
状タンパク質配列からコンピューター処理した予測でCTLエピトープの同定を用
い、試験される推定上のエピトープ量を限定できる可能性がある。この目的のた
め、多少正確な予測プログラムが開発され(Schaferら, 1998)、これらの幾つか
がインターネットで利用できるようにもなっている。擬似神経回路網は、複雑な
パターン認識を行うのに特に良く適しており、MHC結合の予測において多少の見
込みを既に示している。

【０００７】発明の詳細な説明この発明の最も広い態様は、 (a) 実験によるMHCクラスIの構造又はペプチド結合データから、一次的な位置特
異的予測手段を講じ; (b) 一連のタンパク質配列を走査し、工程(a)で得られた一次予測手段にしたが
って結合親和性を算出することによって、潜在的に結合親和性の高いエピトープ
を同定し; (c) 任意に、配列類似性に基づく排他的手段によって、工程(b)で同定された多
数のペプチドを減少させ; (d) 工程(c)又は(b)で同定されたペプチドについて実験的な結合データを生成し
;

【０００８】 (e) 工程(d)からの実験的な結合データを用いて、1nM〜50,000 nMの結合親和性
範囲におけるサブインターバルでの頻度にしたがって加重された個々のペプチド
結合データ例が等しく提示されるように、MHCクラスIに対する結合親和性を予測
するための1以上の擬似神経回路網を調製し; かつ (f) 疑わしいペプチドを工程(e)で調製された擬似神経回路網それぞれで試験し
、擬似神経回路網それぞれから疑わしいペプチドについて近似の結合親和性を得
、近似の結合の加重平均値を算出し、それにより疑わしいペプチドについて結合
親和性を見積もることによって、疑わしいペプチドの結合親和性を評価する工程からなる、MHCクラスI結合親和性の加重平均が500nM未満のCTLエピトープの
同定方法に関する。

【０００９】記載の方法は、後述の工程によりさらに改良してもよい。提案する変更のいず
れの組合わせも方法に追加できることに留意されたい。ひとつの態様において、工程(a)〜(f)に記載の方法は、 (g) 少なくとも1つの擬似神経回路網が高い親和性バインダーを予測し、少なく
とも1つの別の擬似神経回路網が高い親和性バインダーを予測しない工程(f)から
疑わしいペプチドを同定し; (h) 工程(g)で同定したペプチドについて実験的な結合親和性データを得て; (i) 1nM〜50,000 nMの結合親和性範囲におけるサブインターバルでの頻度にした
がって加重された個々のペプチド結合親和性データ例が等しく提示されるように
、工程(d)〜(h)の実験的な結合親和性データの組合わせについて1以上の擬似神
経回路網を調製し；かつ (j) 工程(i)で調製された擬似神経回路網それぞれで疑わしいペプチドを試験し
、擬似神経回路網それぞれから疑わしいペプチドについて近似の結合親和性を得
て、近似の結合の加重平均値を算出し、それにより疑わしいペプチドについて結
合親和性を見積もることによって、疑わしいペプチドの結合親和性を評価する工程によって、CTLエピトープが500nM未満のMHCクラスI結合親和性加重平均を有
するよう、さらに改良できる。

【００１０】工程(g)〜(i)に記載の反復方法は、少なくとも1つの擬似神経回路網によってM
HCクラスIに高い結合親和性を持ち、少なくとも1つの別の擬似神経回路網によっ
てMHCクラスIに低い結合親和性を持つと見積もられる全ての疑わしいペプチドに
繰り返すことができる。擬似神経回路網が「一致しない」CTLエピトープは、MHC
クラスI結合親和性が評価するには複雑な構造的な特徴を含むと現在考えられて
いる。これらのCTLエピトープの真の結合親和性を実験的に測定することによっ
て、擬似神経回路網によるMHCクラスI結合親和性の予測が改善される。一次的位置特異的予測手段は、多くの方法で講じることができる。この発明の
一つの具体例では、一次的位置特異的予測手段は、Falkら(1991)に記載されるよ
うなプールシーケンシングによって得られる。この方法は単純な天然モチーフの
同定をもたらし、種々の位置で多少好ましいアミノ酸を大雑把に分類するものと
して示される。別の具体例では、一次的位置特異的予測手段は、Ruppertら(1993
)に記載されるような拡張モチーフで得られる。生化学実験を含むこの方法は、
各位置で全アミノ酸の頻度を示す完全な統計学上のマトリクスとして報告されて
いる。このような実験は、(例えばRuppertら(1993)、Parkerら(1992)に記載され
るような)多少、無作為に選択されるペプチドのパネルを用いる実験、又は(例え
ばStryhnら(1996)に記載されるような)ペプチドライブラリー手法に基づいてい
る。さらに別の具体例では、一次的位置特異的予測手段は構造上の情報によって
得られる。

【００１１】単純なモチーフ及び統計学上の結合マトリクスを用いて、(例えばSetteら(198
9)、Meisterら(1995)に記載されるように)MHC結合ペプチドについて大雑把に検
討することが好ましい。単純モチーフよりむしろ拡張モチーフを用いる場合は、
予測がかなり改善される。統計学上のマトリクス、例えばPSCPL法で得られるマ
トリクスは、予測される結合を算出するために直接的に用いられる。各位置の各
アミノ酸が隣接残基から独立してある結合エネルギーに寄与しており(「側鎖か
らの独立結合」)、所定のペプチドの結合が種々の残基からの寄与が組み合わさ
った結果である(Parkerら, 1992)とすれば、関連マトリクス値の掛け算は、対応
するペプチドの結合親和性を示すものとなる。さらに、この発明の他の具体例は
、分子力学(例えばRognanら(1994)、Mataら(1998)記載)、コンピュータ処理(例
えばAltuviaら(1995)、Altuviaら(1997)記載)及びMHCポケットの特異性をアドレ
ッシングするためのコンピュータ法(例えばVasmatzisら(1996)、Zhangら(1998)
記載)のような方法を用いる知識に基づく予測に関する。

【００１２】 PSCPL法には、MHCクラスI特異性の測定に用いられる従来の方法と比較して、
幾つかの重要な進歩が見られる。特に、それは一般的で、偏りがない。PSCPL 法
は、MHCクラスI結合の機能的に重要な成分全てを同定する。PSCPL法は、同様の
方法よりも二次アンカー及び疎外アミノ酸に感受性が高いと思われる。実際、そ
のために、MHCクラスI特異性のコンビナトリアル特異性について詳細な量的記載
が可能であり、対象のMHCクラスIに特異的な完全な結合マトリクスが得られる。
これらのマトリクスは、結合についての予測を改善するために用いることができ
る(Stryhnら, 1996)。多くの異なるMHC分子はまさに同じセットのPSCPLサブ-ラ
イブラリーでアドレッシングされ得るので、PSCPL法は一般的である。これは、
そうではない従来の技術に伴う費用、実験及びデータの取り扱いを著しく軽減す
るであろう。したがって、多くのMHC特異性について詳細なマッピングを容易に
構想することができる。

【００１３】非常に強靭で、ローテクで、さらに正確で処理量の高いペプチド-MHC結合分析
技術が開発されている。改良型スパンカラムゲル濾過アッセイは、新しい原理に
より遊離ペプチドとMHC-結合ペプチドとの効率的な分離のために最適化された。
この原理は、「勾配遠心分離」と称されている(Buusら, 1995)。それには、従来
のゲル濾過アッセイと比べて幾つかの利点がある: 感度及び処理量がはるかに良
く、独特の試薬及び労力双方の観点において必要な資源が少なく、そして有害な
廃棄物が少ない。結合アッセイをいったん開始すると、既知の相互作用阻害剤と
してこの未知の調製物を用いることにより、他の調製物の結合能力が測定しやす
い。50％阻害(IC₅₀)を得るのに必要な阻害剤が少量であるほど、結合が良好であ
る。非阻害最大結合は、測定されるIC₅₀がK_Dの近似になるように30％未満でなけ
ればならない(さもなければ、リガンドの涸渇が認められ、IC₅₀値が信用できな
い)。

【００１４】天然のHLA分子は、一般にEBV形質転換B細胞系(例えば12.th IHWC からのホモ接
合体細胞系)から得られる。それらは、通常大規模なインビトロ培養で増殖され
、洗剤で抽出され、アフィニティクロマトグラフィーで精製され、濃縮される。この実施例で、PSCPLの完全な8-マー、9-マー及び10-マーのセットを、表１、
表６及び実施例１に記載するように合成した。

【００１５】

【表１】

【００１６】各位置について、その位置で天然に存在する20個のL-アミノ酸の1つをそれぞ
れ示す20個のサブ-ライブラリーを合成した。他の位置は、全てアミノ酸混合物
を含んだ。これにより、全部で25.6 x 10⁹個の可能性のある8-マーのペプチド等
を示す8 x 20 = 160 個のサブ-ライブラリー全体の合成がもたらされた。生化学
結合アッセイでの3つの異なるクラスI分子に対する結合能について、各PSCPL サ
ブ-ライブラリーを試験した。驚くべきことに、強いMHC依存性シグナルが検出さ
れ(相当するアンカー位置に見られるアミノ酸の90％までをアンカー残基が占め
たが、幾つかの位置で1％未満の疎外アミノ酸が認められた)、これらの偏りがな
いペプチドライブラリーからMHCが実際にペプチドを選択したことが示された。P
SCPL法は一次アンカー残基を明らかに同定し、二次アンカー残基及び疎外残基も
同定した。試験された3つのMHCクラスI分子の8-マーのモチーフ中のあらゆる位
置に対応して、PSCPLは結合を増加又は低下させるアミノ酸を同定した。つまり
、あらゆる位置が全体的な結合特異性に寄与できる。既知の特異性が試験された
3つのMHCクラスI分子のうち3つについて確認されたのは、心強いことであった(S
tryhnら, 1996)。さらに、幾つかの、少数ではあるが、重要で積極的な寄与及び
これまで未知の多くの疎外アミノ酸が同定された。特に注目すべきことに、20ア
ミノ酸のうち12〜14個は既知のアンカー位置では許容されず、残りの位置にわた
って散在している疎外アミノ酸も頻繁に認められた。

【００１７】データは、相対的な結合因子からなる統計学上のマトリクスとして報告するこ
とができる。これらは、特定位置の所定のアミノ酸がその位置で「平均的アミノ
酸」に比較して結合を増す(RB＞1)か、又は減少する(RB＜1)かどうかとして、IC ₅₀ (X8)/ IC₅₀として各位置の各アミノ酸を算出する(PSCPL-サブライブラリー)
。データは、量的に結合特異性の特徴を例示するための簡便な方法で作表し、用
いることができる(実施例については表６参照)。 PSCPLによって得られたマトリクス値を用いて、予測を改善することができる
。各位置の各アミノ酸が隣接残基から独立してある結合エネルギーで寄与し、所
定のペプチドの結合が種々の残基からの寄与が組み合わさった結果である(Parke
r ら, 1992)とすれば、所定のペプチドの種々の残基についての相対的な結合因
数の掛け算は、ペプチドが、完全に無作為なライブラリーよりどの程度良く又は
悪く結合しているかを示す。PSCPLから得られるマトリクスに基づく予測が比較
的成功すれば、所定のMHC分子に対する未知のペプチドの結合がある程度、コン
ビナトリアル特異性の結果であることを示唆しており、その仮定を証明すること
になる。

【００１８】したがって、この発明による好ましい方法では、PSCPLは、工程(a)での一次的
位置特異的予測手段を講じるために用いられる。主要組織適合性複合体(MHC)は、脊椎動物の免疫学、特にT-細胞媒介性免疫応答
に必須である。ヒトではHLA複合体の用語が用いられるが、マウスではH2複合体
の用語が用いられる。HLAとH2複合体の構造上の特徴は、かなり似ている。した
がって、好ましい具体例では、工程(a)でのMHC クラスIの構造データ又はペプチ
ド結合親和性データは、HLAの構造データ又はペプチド結合親和性データである
。HLAの構造データ又はペプチド結合親和性データを用いることによって、この
発明の方法で同定されるCTLエピトープは HLA複合体に結合するCTLエピトープで
あり、この結果、ヒトの治療、予防及び/又は診断に特に好ましいであろう。好
ましい具体例では、HLAサブタイプA1、A2、AB、A11及び/又はA24 が選択される
。本出願をとおして、用語「MHC クラスI」が用いられる。しかし、当業者に自
明であるように、CTLエピトープがヒトの医薬で用いられる場合には、エピトー
プはHLAに結合するはずである。

【００１９】この発明の1つの態様は、結合親和性が潜在的に高いエピトープを求めて、例
えばTrEMBL データベースもしくはSWISS-PROTデータベース等のタンパク質デー
タベースの非冗長部分を走査するために、不偏向マトリクス予測のような一次的
位置特異的予測手段を使用することに関する。この明細書で、結合親和性の高い
エピトープは、一次的位置特異的予測マトリクスで100 nM未満のIC₅₀、つまりK_D ≦ 100 nMに近似の結合親和性が予測されるエピトープとして定義される。この
走査は、潜在的に結合親和性が高いエピトープを大量に選択するものと考えられ
る。したがって、数が多ければ、ペプチドは任意に配列類似性に基づく排他的手段
によって縮小される。この発明の好ましい具体例では、配列類似性の縮小はHobo
hmの方法で行う。この発明の方法における次の工程は、潜在的に親和性が高いバインダーについ
て得られた代表的な試料を合成し、生化学結合アッセイで試験することを意味す
る。エピトープを合成し、試験する、限定ではない例証的な実施例を実施例１に
示す。

【００２０】配列独立性のコンビナトリアル特異性は平均的な考察として正確であるかもし
れないが、個々のペプチドについては誤っていることが明らかに知られている。
MHC分子の結晶構造に基づけば、独立したコンビナトリアル特異性が正しいもの
とは思われない。これに対し、擬似神経回路網は、いかなる非線形の配列依存性
情報又は相互作用の取り扱い及び認識に特によく適していることが立証されてい
る。このような関係は、インプット層、1以上の隠匿(hidden)層及びアウトプッ
ト層からなり、ひとつの層のユニットがその後の層のユニットに加重によって連
結される神経回路網アルゴリズムに整えることができる。このような擬似神経回
路網は、インプット(つまりペプチド)を所定のアウトプット(つまりMHC結合親和
性値)に関連させて認識するよう整えることができる。いったん整えれば、回路
網は結合と適合する複雑なペプチドパターンを認識する。擬似神経回路網の方法
では、調整セットの大きさと質は極めて重要である。これは、所定のHLAには約0
.1〜1％の無作為な一連のペプチドが結合するにすぎないので、HLAの場合に特に
当てはまる。したがって、例えばわずか100例のペプチドバインダーを生成する
のに、無作為なペプチドをスクリーンすれば、約10万のペプチドの合成と試験が
必要になる。これにより、調整セットのバインダー数がこのように適度であって
も、多量の資源と労力を必要とすることが提案される。しかし、ペプチドを最初
にPSCPL選択することによって、妥当な量の真性HLAバインダーを得るために合成
する必要のあるペプチド数は、劇的に縮小される。

【００２１】これらのデータは、続いて、擬似神経回路網を調整するのに用いられる。回路
網は、以前の方法でのように、擬似的に選択されたバインダー及び非バインダー
の範疇ではなく、MHC結合の真の実数強度値を予測するのに調整される。均衡の
取れた調整スキームを用いると、1 nM 〜 50000 nMの範囲の結合親和性間隔にわ
たって分布が歪んでいるオリジナルデータを、サブインターバルからの例が均等
な頻度で提示されるように選択し、全範囲にわたってほぼ均しく十分に予測でき
る回路網が生じる。それにより、バインダー又は非バインダーのいずれかを主と
して同定するように回路網を偏向させる、過大予測又は過小予測が避けられる。この発明による方法の次工程は、疑わしいペプチドの結合親和性を評価するこ
とからなる。疑わしいペプチドは、無作為なペプチドの組合わせ、又は市販、個
人もしくは公のタンパク質配列データベースのようなペプチドライブラリーのい
ずれかの源から得られる。この発明の好ましい態様では、タンパク質データベー
スはHIV-1 又はHIV-2タンパク質配列データベース、又はその一部である。好ま
しいデータベースは、シークエンスされた全長HIV-1遺伝子、例えばThe Los Ala
mos 1998/1999 HIV シークエンスデータベース(http://hiv-web.lanl.gov/)から
なる。これらのタンパク質は、全ての利用可能なシークエンスされた全長HIV-1
遺伝子の翻訳産物であり、HIV-1の主たる遺伝的多様性を反映している。

【００２２】この発明のひとつの具体例では、擬似神経回路網は3層の神経からなる。別の
具体例では、疑わしいペプチドは20ディジットの二進数として擬似神経回路網に
提示される。この具体例の結果として、インプット層は疑わしいペプチド中のア
ミノ酸数の20倍からなるであろう。上記のように、結合親和性を幾つかの擬似神経回路網によって評価させること
は極めて価値がある。したがって、この発明のひとつの具体例では1以上の擬似
神経回路網が整えられる。調整は、回路網にできるだけ多くの特徴を導入するた
めに、調整データの種々の部分で行うことが好ましい。この発明のひとつの態様
では、擬似神経回路網は1個のみ整えられる。別の具体例では、2、3、4、5、6、
7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25又は30個の擬似神経回路網が整えら
れる。非常に好ましい具体例では、7個の擬似神経回路網が整えられる。

【００２３】好ましい具体例では、調整用アルゴリズムは勾配降下型で、配列フラグメント
の提示によって回路網に正確なアウトプットを生じさせるように、調整可能な回
路網の加重値が繰り返し変えられる。さらに好ましい具体例では、回路網はMcCl
ellandによって提案される誤差関数を用いて調整される。この発明のひとつの具体例では、擬似神経回路網それぞれが試験される。試験
は、交差確認(cross validation)で行うことが好ましい。交差確認試験の例証例
を実施例2に示す。整えられた擬似神経回路網の使用における必須工程は、疑わしいペプチドの結
合評価に関する。これは、整えられた擬似神経回路網それぞれにおいて疑わしい
ペプチドを試験し、擬似神経回路網それぞれから疑わしいペプチドの近似の結合
親和性を得て、近似結合の加重平均を算出し、それにより疑わしいペプチドにつ
いて結合親和性を評価することによって行われる。

【００２４】系統発生研究に基づけば、HIV-1ウイルスは3つの遺伝群;多数(major)を表す群
M、外部(outer)を表す群O及び新規(new)を表す群Nに分類される。HIV-1の群Mの
ウイルスは世界中のHIV-感染の多数を占めるが、HIV-1 の群 O 及びNは主として
中央アフリカの限られた地域(大部分はカメルーン)で認められる。HIV-1の群Mは
現在、8個の基準となる遺伝サブタイプに分類されている: A、B、 C、D、F、G、
H、J (http://hiv-web.lanl.gov/ で利用可能)。しかし、個別のサブタイプ間の
組換え事象は、1以上の遺伝サブタイプに同時感染した個体で明らかにされてい
る。サブタイプAB、AC、AD、ADI、AE、AG、AGI、AGJ、BF、CDは、サブタイプ内
組み換えHIV-1配列である。しかし、群Mに属するウイルスは、WHOにより報告さ
れているHIV-1感染症例の大部分を占める。HIV-1の群O及びNのウイルスが世界中
に蔓延する可能性は未知で、過小評価すべきでない。さらに、HIV-1M/O組換えウ
イルスについての近年の特徴づけは、このようなウイルスの世界的流行について
新たな推測を提起している。

【００２５】 CTLエピトープの同定後、疑わしいペプチドの結合親和性についての擬似神経
回路網の評価に基づいて、CTLエピトープは、この発明の大部分の具体例で、ワ
クチン又は診断剤への導入のような医薬用途に十分適しているさらなる特性を有
していなければならない。そのような特性の一つは、HIV群及びサブタイプのな
かでのCTLエピトープの保存である。したがって、この発明のひとつの具体例で
、CTLエピトープの同定方法は、さらに (k) 一連のHIVタンパク質配列にわたって疑わしいペプチドの全体的保存を測定
する工程からなり、工程(k)のCTLエピトープは、＜500 nM未満のMHCクラスI結合親和
性を有する。

【００２６】この明細書で、用語「全体的保存」は、9個のHIV-1 タンパク質、Gag、Pol、E
nv、Vif、Vpr、Vpu、Tat、Rev 及びNefのうち、CTLエピトープがHIV-1の全ての
サブタイプ及び群にどの程度の頻度で認められるかを示す数として理解されるべ
きである。全体的保存の％は、疑わしい配列を持つタンパク質配列数／タンパク
質配列の全数×100として算出される。用語「サブタイプ内保存」は、9個のHIV-
1 タンパク質、Gag、Pol、Env、Vif、Vpr、Vpu、Tat、Rev 及びNefのうち、CTL
エピトープが1つのHIVサブタイプ内でどの程度の頻度で認められるかを示す数と
して理解されるべきである。例えば、あるエピトープが8個のHIV-1 サブタイプA
Gagタンパク質のうち6個で認められるのみならず、32個のHIV-1 サブタイプB G
agタンパク質のうち10個及び8個のHIV-1サブタイプC Gagタンパク質のうち4個で
認められれば、そのサブタイプ内A、B及びC保存は、それぞれ75％、31.25％及び
50％であろう。この発明のひとつの具体例では、全体的保存は、the Los Alamos
HIV-1 タンパク質データベースにおけるHIVタンパク質配列全サブタイプを比較
して測定される。

【００２７】この発明の好ましい具体例では、全体的保存は1％より多い。関連する態様で
は、この発明による方法は、1％より多い全体的保存、及び疑わしいペプチドに
ついてMHCクラスI結合親和性の加重平均が100 nM未満のカットオフ値で行われる
ことが好ましい。これにより、結合親和性が高く、全体的保存が中間的なCTLエ
ピトープが得られる。この特に好ましい具体例を、さらに実施例４に記載する。
これらの特徴を満たす、この発明による方法によって同定される特異的CTLエピ
トープの例を、表５Aに示す。この発明の別の具体例では、全体的保存は2%より多く、例えば3%、4%、5%、6%
、7%、8%、9%、10%、11%、12%、14%、16%、18%より多く、あるいは20%より多い
。

【００２８】好ましい具体例では、全体的保存はHIVタンパク質配列中で8% より多い。関連
する態様では、この発明による方法は、8％より多い全体的保存、及び疑わしい
ペプチドについてMHCクラスI結合親和性の加重平均が500 nM未満のカットオフ値
で行われることが好ましい。これにより、結合親和性が中間的で、全体的保存が
高いCTLエピトープが得られる。特に関連する具体例では、結合が中間的なCTLエ
ピトープのみが、MHCクラスI結合親和性の加重平均が50 nMより多いというさら
なる特徴によって同定される。この特に好ましい具体例を、さらに実施例４に記
載する。これらの特徴を満たす、この発明による方法によって同定される特異的
CTLエピトープの例を、表５B及び５Cに示す。この発明の全般的な態様において、MHCクラスI結合親和性の加重平均は、1000
nM未満、例えば500未満、300、200、100、50、25未満、あるいは10 nM未満です
らある。

【００２９】当業者に認識されるように、MHCクラスI分子によって天然に提示されるペプチ
ドは8〜10 アミノ酸長で、疎水性又は電荷のような特性を共有する特異的なアン
カー残基を含む。アンカー残基の側鎖はMHC分子の抗原-提示溝内に深く埋め込ま
れており、アンカー残基が最初にMHCクラスI結合に関与していることを示唆して
いる。アンカー残基の側鎖はペプチド結合溝に埋もれているので、アンカー残基
はT-細胞応答には直接関わっていないものと考えられる。これは、アンカー残基
が、T-細胞の認識に影響を及ぼさすに置換され得ることを示唆している。

【００３０】 HLA複合体の場合、HLA-A2ペプチドエピトープの結合親和性は、一次アンカー
位置の非最適アミノ酸を該一次アンカー位置のより最適なアミノ酸で置換するこ
とによって改善できることが一般的に認められている。これは、この発明による
全てのCTLエピトープに該当するものと考えられる。したがって、例として HLA-
A2を用いると、一次アンカー位置は、エピトープにおける第二アミノ酸(2)及び
エピトープにおける末端アミノ酸(Ω)として定義される。例えば、9アミノ酸長
のHLA-A2結合モチーフの一次アンカー位置は、位置2及び位置9に局在している。
好ましい具体例では、アンカー位置2のアミノ酸は、ロイシン、メチオニン、グ
ルタミン又はイソロイシンで置換される。さらに好ましい最適な一次アンカーア
ミノ酸は、この明細書において位置2のロイシンである。この発明の別の具体例
では、アンカー位置Ωで置換されるアミノ酸はバリン、イソロイシン、ロイシン
又はアラニンである。非常に好ましい最適な一次アンカーアミノ酸は、この明細
書では位置9のバリンである。

【００３１】結合親和性が改善された修飾CTLエピトープでの免疫化は、天然のCTLエピトー
プで誘発されるCTL応答よりも高い応答を誘発するものと現在考えられている。
したがって、この発明において中間的なCTLエピトープバインダーを同定するこ
とは、極めて重要である。このような中間的なバインダーはHIV感染細胞に対し
て新たな標的となる可能性がある。感染中、これらの中間的な結合エピトープは
、十分な免疫を誘発するにはあまりにも低いが、十分な免疫が誘発されれば優れ
た標的を生じるのに十分高い親和性でMHC-Iに結合する。この発明のある好まし
い具体例では、この発明で記載される方法で同定される非免疫原性の中間バイン
ダーは、アンカー位置のアミノ酸の交換によって免疫原性に変えることができる
。アンカー位置のアミノ酸の交換は、擬似神経回路網でエピトープの結合親和性
に対する作用についてさらに評価できる可能性がある。したがって、抗原性では
あるが免疫原性が不十分な中間バインダーの同定と、MHC-I結合親和性を改善す
るためのアンカー位置のアミノ酸の交換との組合わせは新規であり、広く適応さ
れるHIVワクチンについて多くの新たな可能性を提供している。改良されたエピ
トープに対して生じるCTLエフェクターは、表面に天然エピトープを提示する標
的細胞を認識し、次いで溶解できるであろう。

【００３２】

【表３】

【００３３】位置2及び/又はΩでの表3のアミノ酸修飾については、全ての組合わせが可能
であるが、MHCクラスIに対して同じ結合親和性を生じないであろう。結合親和性
は、二次アンカー位置によっても影響される。かくして、この発明の具体例では、CTLエピトープの同定方法は、さらに (l) アンカー位置のアミノ酸をコンピューター操作で置換してCTLエピトープを
修飾し; かつ (m) 工程(e)又は(i)で整えられる擬似神経回路網それぞれで工程(l)の修飾CTLエ
ピトープを試験し、擬似神経回路網それぞれからCTLエピトープの近似結合親和
性を得、近似結合の加重平均を算出し、それによりCTLエピトープについて推測
される結合親和性を生じることによって、該修飾CTLエピトープの結合親和性を
評価する工程からなり、修飾CTLエピトープは、天然CTLエピトープに比較して改善された
予測されるMHCクラスI結合親和性を有する。改善された結合親和性とは、IC₅₀値
がより低いことであると明らかに理解される。

【００３４】実施例4に、アンカー位置のアミノ酸置換によって結合親和性が改善された例
証例を示す。これらの基準を満たす、この発明による方法で同定される特異的CT
Lエピトープの例を表５Dに示す。したがって、この発明の特に好ましい具体例で
は、修飾CTLエピトープは、エピトープの免疫優性部位を共有する、非常に多く
の天然のCTLエピトープ、つまりアンカー位置のアミノ酸のみが異なるエピトー
プに対して免疫応答を生ずることができるであろう。天然のエピトープと交差反
応するCTL免疫応答を改良型CTLエピトープが生じることができるかどうかを確認
する方法は、実施例７に記載している。ここで用語「改善された結合」などを用いる場合、それは、結合親和性(ある
いは要するに結合)の低下として考える。したがって、50 nMのCTLエピトープの
結合は500 nMより低い結合を有し、50 nMのCTLエピトープの結合は、400 nMに対
する結合を有するCTLエピトープに比較して結合が改善されている。

【００３５】この発明で同定されたCTLエピトープは、細胞障害性 T-細胞が応答する基準を
満たさなければならない。現在、データによれば、T-細胞が7、8、9、10 又は11
アミノ酸からなるCTLエピトープに応答することが示唆されている。この発明による方法から明らかであるように、ひとつの目的はCTLエピトープ
の同定である。したがって、この発明のひとつの態様は、この方法で同定される
CTLエピトープに関する。さらなる具体例では、この発明は、HIVエピトープであ
るCTLエピトープに関する。

【００３６】ひとつの態様において、この発明による方法で同定されるエピトープは、以下
からなる群から選択されるCTLエピトープである： SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2
、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、
SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12
、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO:
17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID
NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ
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、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO:
41、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID
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、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO:
65、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 69、SEQ ID
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ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 79、S
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、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO:
89、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 93、SEQ ID
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6、SEQ ID NO: 167、SEQ ID NO: 168、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 170、SEQ I
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787、SEQ ID NO: 788、SEQ ID NO: 789、SEQ ID NO: 790、SEQ ID NO: 791、SEQ
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850、SEQ ID NO: 851、SEQ ID NO: 852、SEQ ID NO: 853、SEQ ID NO: 854、SEQ
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859、SEQ ID NO: 860、SEQ ID NO: 861、SEQ ID NO: 862、SEQ ID NO: 863、SEQ
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868、SEQ ID NO: 869、SEQ ID NO: 870、SEQ ID NO: 871、SEQ ID NO: 872、SEQ
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877、SEQ ID NO: 878、SEQ ID NO: 879、SEQ ID NO: 880、SEQ ID NO: 881、SEQ
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886、SEQ ID NO: 887、SEQ ID NO: 888、SEQ ID NO: 889、SEQ ID NO: 890、SEQ
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895、SEQ ID NO: 896、SEQ ID NO: 897、SEQ ID NO: 898、SEQ ID NO: 899、SEQ
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904、SEQ ID NO: 905、SEQ ID NO: 906、SEQ ID NO: 907、SEQ ID NO: 908、SEQ
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913、SEQ ID NO: 914、SEQ ID NO: 915、SEQ ID NO: 916、SEQ ID NO: 917、SEQ
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940、SEQ ID NO: 941、SEQ ID NO: 942、SEQ ID NO: 943、SEQ ID NO: 944、SEQ
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949、SEQ ID NO: 950、SEQ ID NO: 951、SEQ ID NO: 952、SEQ ID NO: 953、SEQ
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958、SEQ ID NO: 959、SEQ ID NO: 960、SEQ ID NO: 961、SEQ ID NO: 962、SEQ
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967、SEQ ID NO: 968、SEQ ID NO: 969、SEQ ID NO: 970、SEQ ID NO: 971、SEQ
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976、SEQ ID NO: 977、SEQ ID NO: 978、SEQ ID NO: 979、SEQ ID NO: 980、SEQ
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985、SEQ ID NO: 986、SEQ ID NO: 987、SEQ ID NO: 988、SEQ ID NO: 989、SEQ
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994、SEQ ID NO: 995、SEQ ID NO: 996、SEQ ID NO: 997、SEQ ID NO: 998、SEQ
ID NO: 999、SEQ ID NO: 1000、SEQ ID NO: 1001、SEQ ID NO: 1002、SEQ ID N
O: 1003、SEQ ID NO: 1004、SEQ ID NO: 1005、SEQ ID NO: 1006、SEQ ID NO: 1
007、SEQ ID NO: 1008、SEQ ID NO: 1009、SEQ ID NO: 1010、SEQ ID NO: 1011
、SEQ ID NO: 1012、SEQ ID NO: 1013、SEQ ID NO: 1014、SEQ ID NO: 1015、SE
Q ID NO: 1016、SEQ ID NO: 1017、SEQ ID NO: 1018、SEQ ID NO: 1019、SEQ ID
NO: 1020、SEQ ID NO: 1021、SEQ ID NO: 1022、SEQ ID NO: 1023、SEQ ID NO:
1024、SEQ ID NO: 1025、SEQ ID NO: 1026、SEQ ID NO: 1027、SEQ ID NO: 102
8、SEQ ID NO: 1029、SEQ ID NO: 1030、SEQ ID NO: 1031、SEQ ID NO: 1032、S
EQ ID NO: 1033、SEQ ID NO: 1034、SEQ ID NO: 1035、SEQ ID NO: 1036、SEQ I
D NO: 1037、SEQ ID NO: 1038、SEQ ID NO: 1039、SEQ ID NO: 1040、SEQ ID NO
: 1041、SEQ ID NO: 1042、SEQ ID NO: 1043、SEQ ID NO: 1044、SEQ ID NO: 10
45、SEQ ID NO: 1046、SEQ ID NO: 1047、SEQ ID NO: 1048、SEQ ID NO: 1049、
SEQ ID NO: 1050、SEQ ID NO: 1051、SEQ ID NO: 1052、SEQ ID NO: 1053、SEQ
ID NO: 1054、SEQ ID NO: 1055、SEQ ID NO: 1056、SEQ ID NO: 1057、SEQ ID N
O: 1058、SEQ ID NO: 1059、SEQ ID NO: 1060、SEQ ID NO: 1061、SEQ ID NO: 1
062、SEQ ID NO: 1063、SEQ ID NO: 1064、SEQ ID NO: 1065、SEQ ID NO: 1066
、SEQ ID NO: 1067、SEQ ID NO: 1068、SEQ ID NO: 1069、SEQ ID NO: 1070、SE
Q ID NO: 1071、SEQ ID NO: 1072、SEQ ID NO: 1073、SEQ ID NO: 1074、SEQ ID
NO: 1075、SEQ ID NO: 1076、SEQ ID NO: 1077、SEQ ID NO: 1078、SEQ ID NO:
1079、SEQ ID NO: 1080、SEQ ID NO: 1081、SEQ ID NO: 1082、SEQ ID NO: 108
3、SEQ ID NO: 1084、SEQ ID NO: 1085、SEQ ID NO: 1086、SEQ ID NO: 1087、S
EQ ID NO: 1088、SEQ ID NO: 1089、SEQ ID NO: 1090、SEQ ID NO: 1091、SEQ I
D NO: 1092、SEQ ID NO: 1093、SEQ ID NO: 1094、SEQ ID NO: 1095、SEQ ID NO
: 1096、SEQ ID NO: 1097、SEQ ID NO: 1098、SEQ ID NO: 1099、SEQ ID NO: 11
00、SEQ ID NO: 1101、SEQ ID NO: 1102、SEQ ID NO: 1103、SEQ ID NO: 1104、
SEQ ID NO: 1105、SEQ ID NO: 1106、SEQ ID NO: 1107、SEQ ID NO: 1108、SEQ
ID NO: 1109、SEQ ID NO: 1110、SEQ ID NO: 1111、SEQ ID NO: 1112、SEQ ID N
O: 1113、SEQ ID NO: 1114、SEQ ID NO: 1115、SEQ ID NO: 1116、SEQ ID NO: 1
117、SEQ ID NO: 1118、SEQ ID NO: 1119、SEQ ID NO: 1120、SEQ ID NO: 1121
、SEQ ID NO: 1122、SEQ ID NO: 1123、SEQ ID NO: 1124、SEQ ID NO: 1125、SE
Q ID NO: 1126、SEQ ID NO: 1127、SEQ ID NO: 1128、SEQ ID NO: 1129、SEQ ID
NO: 1130、SEQ ID NO: 1131、SEQ ID NO: 1132、SEQ ID NO: 1133、SEQ ID NO:
1134、SEQ ID NO: 1135、SEQ ID NO: 1136、SEQ ID NO: 1137、SEQ ID NO: 113
8、SEQ ID NO: 1139、SEQ ID NO: 1140、SEQ ID NO: 1141、SEQ ID NO: 1142、S
EQ ID NO: 1143、SEQ ID NO: 1144、SEQ ID NO: 1145、SEQ ID NO: 1146、SEQ I
D NO: 1147、SEQ ID NO: 1148、SEQ ID NO: 1149、SEQ ID NO: 1150、SEQ ID NO
: 1151、SEQ ID NO: 1152、SEQ ID NO: 1153、SEQ ID NO: 1154、SEQ ID NO: 11
55、SEQ ID NO: 1156、SEQ ID NO: 1157、SEQ ID NO: 1158、SEQ ID NO: 1159、
SEQ ID NO: 1160、SEQ ID NO: 1161、SEQ ID NO: 1162、SEQ ID NO: 1163、SEQ
ID NO: 1164、SEQ ID NO: 1165、SEQ ID NO: 1166、SEQ ID NO: 1167、SEQ ID N
O: 1168、SEQ ID NO: 1169、SEQ ID NO: 1170、及びSEQ ID NO: 1171。

【００３７】より好ましい具体例では、この発明は、全体的保存が1％より多く、疑わしい
ペプチドについてのMHCクラスI結合親和性加重平均が100 nM未満のCTLエピトー
プに関する。関連する具体例では、この発明は、以下からなる群から選択される
CTLエピトープに関する：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID
NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID N
O: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID
NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ
ID NO: 19、 SEQ ID NO: 20、 SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23
、SEQ ID NO: 24、 SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO
: 28、SEQ ID NO: 29、 SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ I
D NO: 33、SEQ ID NO: 34、 SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、S
EQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、 SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 4
2、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO
: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID
NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ
ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、
SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 6
6、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO
: 71、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 75、SEQ ID
NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 80、SEQ
ID NO: 81、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 85、
SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 9
0、SEQ ID NO: 91、 SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 94、SEQ ID N
O: 95、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 99、SEQ I
D NO: 100、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 10
4、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ I
D NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 11
3、SEQ ID NO: 114、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 117、SEQ I
D NO: 118、SEQ ID NO: 119、SEQ ID NO: 120、SEQ ID NO: 121、SEQ ID NO: 12
2、SEQ ID NO: 123、SEQ ID NO: 124、SEQ ID NO: 125、SEQ ID NO: 126、SEQ I
D NO: 127、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 13
1、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 134、SEQ ID NO: 135、SEQ I
D NO: 136、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 138、SEQ ID NO: 139、SEQ ID NO: 14
0、SEQ ID NO: 141、SEQ ID NO: 142、SEQ ID NO: 143、SEQ ID NO: 144、SEQ I
D NO: 145、SEQ ID NO: 146、SEQ ID NO: 147、SEQ ID NO: 148、SEQ ID NO: 14
9、SEQ ID NO: 150、SEQ ID NO: 151、SEQ ID NO: 152、SEQ ID NO: 153、SEQ I
D NO: 154、SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 156、SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 15
8、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 160、SEQ ID NO: 161、SEQ ID NO: 162、SEQ I
D NO: 163、SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 166、SEQ ID NO: 16
7、SEQ ID NO: 168、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 170、SEQ ID NO: 171、SEQ I
D NO: 172、SEQ ID NO: 173、SEQ ID NO: 174、SEQ ID NO: 175、SEQ ID NO: 17
6、SEQ ID NO: 177、SEQ ID NO: 178、SEQ ID NO: 179、SEQ ID NO: 180、SEQ I
D NO: 181、SEQ ID NO: 182、SEQ ID NO: 183、SEQ ID NO: 184、SEQ ID NO: 18
5、SEQ ID NO: 186、SEQ ID NO: 187、SEQ ID NO: 188、SEQ ID NO: 189、SEQ I
D NO: 190、SEQ ID NO: 191、SEQ ID NO: 192、SEQ ID NO: 193、SEQ ID NO: 19
4、SEQ ID NO: 195、SEQ ID NO: 196、SEQ ID NO: 197、SEQ ID NO: 198、SEQ I
D NO: 199、SEQ ID NO: 200、SEQ ID NO: 201、SEQ ID NO: 202、SEQ ID NO: 20
3、SEQ ID NO: 204、SEQ ID NO: 205、SEQ ID NO: 206、SEQ ID NO: 207、SEQ I
D NO: 208、SEQ ID NO: 209、SEQ ID NO: 210、SEQ ID NO: 211、SEQ ID NO: 21
2及びSEQ ID NO: 213。

【００３８】別の態様では、この発明は、アンカーアミノ酸が修飾されているCTLエピトー
プに関する。関連する態様では、この発明は、以下からなる群から選択されるCT
Lエピトープに関する：SEQ ID NO: 214、SEQ ID NO: 215、SEQ ID NO: 216、SEQ
ID NO: 217、SEQ ID NO: 218、SEQ ID NO: 219、SEQ ID NO: 220、SEQ ID NO:
221、SEQ ID NO: 222、SEQ ID NO: 223、SEQ ID NO: 224、SEQ ID NO: 225、SEQ
ID NO: 226、SEQ ID NO: 227、SEQ ID NO: 228、SEQ ID NO: 229、SEQ ID NO:
230、SEQ ID NO: 231、SEQ ID NO: 232、SEQ ID NO: 233、SEQ ID NO: 234、SEQ
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239、SEQ ID NO: 240、SEQ ID NO: 241、SEQ ID NO: 242、SEQ ID NO: 243、SEQ
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356、SEQ ID NO: 357、SEQ ID NO: 358及びSEQ ID NO: 359。

【００３９】但し、以下の天然のHLA-A2制限的CTLエピトープについては権利を放棄する:9-
マー: LVGPTPVNI、FPISPIETV、LTFGWCFKL、SLYNTVATL、FLQSRPEPT、KLTPLCVTL、
YCAPAGFAI、VTVYYGVPV、NTVATLYCV；8-マー: FHHVAREL、FHHMAREL、YLKDQQLL、Y
LRDQQLL。 HIVの高度な多様性に合わせるため、好ましい治療上又は予防上のワクチンは
複数のCTLエピトープを含む。好ましいワクチンの一例は、(DNAワクチンによっ
てエンコードされるCTLエピトープである)ワクチン遺伝子産物の細胞内産によっ
てCTLを誘発し、そのためにMHC-Iを提示するDNAワクチンによって具体化される
であろう。別の例は、大きな全体的保存及び/又はサブタイプ内保存をともに示
す複数の半優性のエピトープを含み、それ故に種々のHIV領域で免疫優性なエピ
トープの代わりに好ましいであろう。多くのエピトープがこれまで知られている
(例えばデータベース: http://wehih.wehi.edu.au/mhcpep/ 及びhttp:// hiv-we
b.lanl.gov/immuno/index.html); しかし、その多くは、免疫エスケープ(immune
escaped)する可能性があるか、ごく限られた数の(一次、臨床上の)HIV株でしか
エピトープとなり得ない免疫優性エピトープである可能性がある。したがって、
この発明のひとつの具体例は、上記の少なくとも１つのエピトープからなるポリ
トープに関する。HIV-1ウイルスの系統発生研究に関する上記の理由のため、「
将来の(tomorrow's) 」HIVワクチンは、全てのHIV-1遺伝群に対し広い免疫応答
を誘発するようデザインすべきである。

【００４０】 CTLエピトープ同定後の、ある重要な態様は、そのエピトープの試験である。広
範囲な試験が当業者には明らかであろう。この発明のひとつの具体例では、最初
の試験は、エピトープの合成及びHLA-A2に対する実際の結合の測定によって行わ
れる。第二の試験は、エピトープの合成及びその免疫応答誘発能についての試験
によって行われる。第二の試験について、種々の試験が利用可能である。ある例
は、HLA-A2トランスジェニックマウスを免疫化して、(実施例７で詳細に例証さ
れるように)ペプチドパルス細胞又はトランスフェクト標的細胞もしくは感染標
的細胞を用いるCr-リリースアッセイ(release assay)においてE:T比50:1で標的
細胞の溶解が＞10％と測定されるポジティブのCTL応答を生じる。第二試験での
別の例は、ヌクレオチド配列産物を発現させる条件下での、細胞系、例えば哺乳
動物へのエピトープをエンコードするヌクレオチド配列の投与、その後の例えば
Cr-リリースアッセイである。第三試験は、当業者に明らかであるようにエピト
ープの悪影響、例えば毒理学を含む。

【００４１】ヌクレオチドの用語をこの出願で用いる場合、それはもっとも広い意味で理解
すべきである。つまり、もっとも頻繁には、ヌクレオチドはDNAとして考慮すべ
きである。しかし、ヌクレオチドの用語は、当業者に明らかであるようにRNAの
具体例を含むRNAとしてもみなすことができる。さらに、ヌクレオチドの用語は
、PNA及びLNAのような合成DNA又はRNA類似体としてもみなすべきである。したがって、この発明は、CTLエピトープをエンコードする核酸フラグメント
からなるワクチンにも関する。ワクチンは、ワクチンを投与するヒトを含む動物
によって抗原をインビボで発現させ、その発現される抗原の量は、ヒトを含む動
物におけるHIV感染に対する耐性を実質的に増すのに有効である。

【００４２】このような「DNAワクチン」の効力は、例えばワクシニアウイルスA(MVA)、ア
デノウイルス、シミキフォレスト(simikiforest)ウイルスのようなワクチン関連
微生物、又は例えばラクトコッカス、サルモネラ又は大腸菌種のような細菌に構
築された発現産物をエンコードする遺伝子を、免疫応答調節能を有するポリペプ
チドをエンコードするDNAフラグメントとともに投与することによって増強でき
る可能性がある。例えば、T-ヘルパーエピトープ又はリンホカイン前駆体又はリ
ンホカイン(例えばIFN-γ、IL-2 又はIL-12)をエンコードする遺伝子は、2つの
個別のDNAフラグメントを投与するか、又はDNAフラグメント双方を同じベクター
に含めて投与することによって、CTLエピトープをエンコードする遺伝子と共に
投与できる。さらに、CTLエピトープに対する免疫応答の誘発及び/又は増強を助
けるため、ヌクレオチド配列に免疫刺激CpG モチーフを含めることができる。ま
た、ここに開示される広範囲な関連CTLエピトープと免疫系が連続的な感作をも
つように、これらのエピトープをそれぞれエンコードする多数のヌクレオチド配
列からなるDNAフラグメントを投与できる可能性がある。

【００４３】この発明のひとつの具体例では、HIV感染に対する哺乳動物での免疫応答の誘
発に用いられるか、又は進行中のHIV感染に対抗するための免疫原性組成物の製
造には、上記CTLエピトープのいずれもが用いられる。好ましくは、免疫原性組
成物はワクチンとして用いられる。有効成分としてペプチド配列、例えばCTLエピトープを含むワクチンの製造は
、引用によりここに導入される米国特許4,608,251; 4,601,903; 4,599,231 及び
4,599,230の全てで例示されるように、一般に当該分野で十分に理解されている
。概して、このようなワクチンは、液体又は懸濁液のいずれかのような注射可能
薬剤として製造され; 注射の前に液体又は懸濁液とするのに適した固体形態も製
造され得る。製剤は、乳化されてもよい。有効な免疫原性成分は、医薬上、許容
され、有効成分と相溶性の賦形剤としばしば混合される。適当な賦形剤は、例え
ば水、サリン、デキストロース、グリコース、グリセロール、エタノールなど、
及びその組合わせである。さらに、望ましい場合には、ワクチンは湿潤剤又は乳
化剤、pH緩衝剤、ブピバカイン又はワクチンの有効性を増強するアジュバントの
ような補助物質を少量含んでいてもよい。

【００４４】ワクチンは、通常、注射、例えば皮下注射又は筋肉内注射によって非経口的に
投与される。他の投与様式に適した別の製剤には、坐薬、ある場合には経口製剤
が含まれる。坐薬については、伝統的なバインダー及び担体、例えばポリアルキ
レングリコール又はトリグリセリドが含まれてもよい;このような坐薬は、0.5〜
10%、好ましくは1-2%の範囲で有効成分を含む混合物から形成してもよい。経口
製剤には、かかる通常用いられる賦形剤、例えば医薬グレードのマンニトール、
ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロ
ース、炭酸マグネシウムなどが含まれる。これらの組成物は、溶剤、懸濁剤、錠
剤、丸剤、カプセル剤、放出持続性製剤又は粉剤の形態をとり、有効成分を10〜
95%、好ましくは25〜70%含む。 CTLエピトープ又はエピトープ類は、中性又は塩の形態としてワクチンに製剤
化してもよい。医薬上許容される塩には(ペプチドの遊離アミノ基と形成される)
酸付加塩、及び例えば塩酸もしくはリン酸のような無機酸、又は酢酸、シュウ酸
、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸と形成される酸付加塩が含まれる。遊
離のカルボキシル基と形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニ
ウム、カルシウム、又は水酸化鉄のような無機塩基、イソプロピルアミン、トリ
メチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインのような有
機塩基などから誘導されてもよい。

【００４５】ワクチンは、用量製剤に適した方法で、治療上有効かつ免疫原性であるような
量で投与される。投与量は、例えば免疫応答を生じる個体の免疫系能及び望まれ
る保護の程度を含む、治療対象に依存する。予防接種当たりの有効成分について
適当な用量範囲は数100μgのオーダーで、好ましい範囲は約0.1〜1000μg、例え
ば約1〜300μgの範囲、特に約10〜50μgの範囲である。最初の投与及びブースタ
ー注射に適当な型も多様であるが、最初に投与し、その後接種又は他の投与を行
うのが一般的である。適用方法は、広範囲に変化し得る。ワクチンの投与についてのいずれの従来法
も適用できる。好ましい投与経路は、非経口経路、例えば静脈、腹腔内、筋肉内
、皮下、皮内又は真皮内経路；(固体の生理学的に許容される基体又は生理学的
に許容される分散剤における)経口、口腔、舌下、鼻腔、直腸又は経皮経路であ
る。ワクチンの用量は投与経路に依存し、予防接種される人の年齢、及びそれよ
りは低い程度であるが、予防接種される人の体重によって変化する。

【００４６】幾つかのCTLエピトープはワクチン中で十分に免疫原性であるが、他のエピト
ープについては、ワクチンがさらにアジュバント物質を含むならば、免疫応答を
増強する場合がある。ワクチンに対するアジュバント作用を達成する種々の方法
には、リン酸緩衝液中0.05〜0.1％溶液として通常用いられる水酸化アルミニウ
ム又はリン酸アルミニウム(alum)のような剤の使用、0.25％溶液として用いられ
る糖の合成ポリマー(carbopol) との混合、それぞれ30秒〜2分70〜101℃の温度
範囲での熱処理によるワクチン中のCTLエピトープの凝集が含まれる。アルブミ
ンに対するペプシン処理(Fab)抗体での再活生化による凝集、C. parvumのような
細菌細胞又は内毒素又はリポ多糖又はグラム陰性細菌の脂質A成分との混合、マ
ンニットモノオレエート(Aracel A)のような生理学的に許容される油賦形剤中の
乳化又はブロックの代用として用いられるパーフルオロカーボン(Fluosol-DA)の
20％溶液との乳化も、用いることができる。この発明によれば、DDA(ジメチルジ
オクタデシルアンモニウムブロミド)は興味深いアジュバント候補であるが、フ
ロイント完全アジュバント及び不完全アジュバントならびにQuilA、Quil A誘導
体及びRIBI アジュバントも興味深い可能性がある。

【００４７】免疫原性作用を増強する他の可能性には、上記アジュバントと組み合わせた、
リンホカイン(例えばIFN-γ、IL-2 及び IL-12) のような免疫調節物質、又はポ
リI:C のような合成IFN-γインデューサーの使用も含まれる。多くの例で、通常は6回を越えない予防接種、より通常は4回を越えない予防接
種、通常は少なくともほぼ3回の予防接種、好ましくは1回もしくは2回の予防接
種で、複数回ワクチンを投与する必要がある。予防接種は、通常は2〜12週の間
隔、より通常は3〜5週の間隔である。保護免疫を望ましいレベルに維持するには
、1〜25年、例えば20年、好ましくは15又は10年、より好ましくは1〜5年、通常
は3年の間隔での周期的なブースターが望ましい。

【００４８】かくして、この発明は、ワクチンの製造のためのCTLエピトープの使用及びワ
クチンの製造のためのCTLエピトープをエンコードするヌクレオチド配列の使用
にも関する。関連する具体例では、この発明は、必要性がある人へのワクチン、
又は上記に詳述した免疫原性組成物の投与により、その人物におけるHIV感染を
治療する方法に関する。この発明の好ましい具体例では、CTLエピトープはHIVウイルスエピトープであ
り、ワクチンはHIVウイルスに対するものである。関連するHIVワクチンは、予防
ワクチンとしてのみならず、例えば抗ウイルス治療中のHIV感染患者に治療ワク
チンとしても使用できる可能性がある。HIV特異的ワクチンは、必要な特異的免
疫性を誘発又は再誘発し、HIV感染の制限又は根絶において抗ウイルス治療を助
けるであろう。HIV陽性患者では、治療ワクチンは抗ウイルス治療の必要性を先
延ばしするか、又はウイルスが抗ウイルス治療に耐性を生じる場合には、抗ウイ
ルス治療中の患者のHIV感染を制限し得る。

【００４９】この発明の好ましい具体例では、臨床上関連のあるA2-特異的CTLエピトープは
、ワクチンの製造に用いられる。この明細書で、臨床上関連のあるA2-特異的エピ
トープは、以下の特徴を満たす天然又は改良型CTLエピトープである: - HLA-A2結合親和性の加重平均が100 nM未満である; - ペプチドパルス細胞又はトランスフェクトもしくは感染した標的細胞でのCr-
リリースアッセイにおいてE:T 比 50:1で標的細胞の溶解が＞10％と測定される
ようにCTL免疫応答をHLA-A2 トランスジェニックマウスで誘発でき; - 改良型ワクチンCTL-エピトープが由来する天然のCTLエピトープを提示する細
胞でのCr-リリースアッセイにおいてE:T 比 50:1で標的細胞の溶解が＞10％と測
定されるようにCTL免疫応答をHLA-A2 トランスジェニックマウスで誘発でき;か
つ - 少なくとも1つのHIV-1遺伝サブタイプ内で10%より高い%が保存されているか
、又はHIV-1遺伝群内の幾つかの遺伝サブタイプに8%より高い%が保存されている
。

【００５０】好ましい具体例では、臨床上関連のあるCTLエピトープは、HIV-1のうち群M、O
又はN、もっとも好ましくは群 Mのウイルスに保存されている。関連する具体例
では、CTL エピトープは、HIV-1 サブタイプA、B、C、D、E、F、G、H、I、J又は
K、非常に好ましくはサブタイプBウイルスに保存されている。

【００５１】実施例実施例1：ペプチド結合細胞：EBV形質転換細胞系、RMLはHLA-A^*0204生産物から用いた。 MHC精製：細胞を界面活性剤で溶解し、以前に記載されているように(Buus ら,19
95)MHCクラスI分子をアフィニティ精製した。アフィニティ精製に用いたモノク
ローナル抗体は、BB7.2であった。ヒトβ2-マイクログロブリンは尿毒症患者の
尿より採取し、ゲルろ過とクロマトフォーカシングによって均質に精製するか、
あるいはSigmaから購入した。

【００５２】ペプチド合成：ペプチドは、第一アミノ酸を付着させたPepSyn KA樹脂で、FMOC-
保護ストラテジを用いて、並行マルチカラムペプチドシンセサイザー(Holmら、8
9)で合成した。配列にしたがって全てのカップリングが終了した後、保護基を除
き、95％水性トリフルオロ酢酸を2時間用いて樹脂からペプチドを切断した。エ
ーテル及びエーテル/酢酸エチルを用いてペプチドを沈澱させ、凍結乾燥した。
逆相高速液体クロマトグラフィー(HPLC)及び質量分析(MS)により、ペプチドを分
析した。ペプチドの放射線標識：以前に述べられているように(Buusら、1986)、クロラミ
ンTを用いて1mCi²⁵ヨウ素(Amersham,Sweden)で、2〜10μgのペプチドを標識した
。比活性は、1〜5×10⁸cpm/ペプチドmgと計測された。

【００５３】ペプチド-MHCクラスI結合アッセイ：一般に、アフィニティ精製した2〜10μMのM
HCクラスI分子を、以前(Buusら、1986)に述べられているように、プロテアーゼ
阻害剤カクテルを含む反応混合物中で約10〜100nMの放射線標識ペプチドと48時
間18℃でインキュベートした。反応混合物における最終的な界面活性剤濃度は、
0.05％ NP-40(Sigma)であった。ペプチド-MHCクラス複合体を、G25スパンカラム
を用いるゲル濾過で遊離のペプチドから分離した(2回)(Buusら,1995)。除かれた
「空隙」容量及び含有された容量の放射活性を、ガンマスペクトロメトリ(Packa
rd)で測定した。提供したペプチドの全量に対してMHCクラスIに結合したペプチ
ドの画分を算出し、MHC不在下の空隙容量に生じるペプチド画分(通常1％未満)を
控除して補正した。スパンカラムと以前に報告されているSephadex G50カラム
クロマトグラフィーアッセイは、同様の結果を生じた(Buusら、1995)。複合体の
回収とリガンドの排除は、95〜100％であった。結合データを表１１に示す。

【００５４】実施例２：神経回路網配列情報をエンコードするインプット層、隠匿単位の1つの層、及び結合親和
性についての浮動小数点値を示す(0〜1のあいだに正規化される)ひとつのアウト
プット単位からなる回路網構造で、データから得られる神経回路網アルゴリズム
を用いた。配列フラグメント対及び関連する結合親和性からなるデータの調整中
、加重を、本質的にRumelhartら(1986)によって記載される方法にしたがって調
整した。したがって、インプット層のものに加えて各神経(単位)は、そのインプ
ットの加重合計を算出し、この合計をS字状の関数を通して、アウトプット

【数１】 [Nは層における神経単位数で、I_nは神経単位に対するn番目のインプットであり
、かつw_nはこのインプットの加重である。σはS字状の関数

【数２】であり、tはその閾値である]を生じる。

【００５５】調整アルゴリズムは勾配降下型で、配列フラグメントの提示によって回路網に
正確なアウトプットを生じさせるために、調節可能な回路網加重が繰り返し変え
られている。回路網の調整時に、従来の誤差関数

【数３】の代わりに、McClellandによって提案されているやや強力な誤差関数

【数４】を用いた。

【００５６】この対数関数的な誤差関数は収束時間をかなり減じ、回路網の大きさを増さな
いで(標準的な誤差処理に比較して)より複雑な作業を所定の回路に学習させる性
質をも有する。回路網について、アミノ酸配列間の実験的に測定された関係及び
実験的に測定された結合親和性を調整した。調整の目的は、回路網の加重と閾値
を調整し、推測された結合親和性と実験的に測定された結合親和性との誤差を定
量的に最小限にすることである。実験データは一般に結合親和性の所定範囲に均一に分布していないので、その
範囲の最大分布部分でしか回路網が十分正確に予測できないことがないように、
バランススキームをデザインした。一般に、その範囲の最大分布部分は、特異的
な閾値を用いて定量的に定義できる「非バインダー」である。アウトプットの間
隔(0〜1)を幾つかの囲いに分け、各囲いについて発見された例の数を算出した。
バランス調整スキームでは、全間隔が均等の頻度で提示されるように、神経回路
網に提示するための例を選択した。具体的には、分布が最少の囲いからの例を調
整の時期で常に選択する一方、分布が多い他の囲いからの例を無作為に選択して
除き、平均して全ての囲いが均等な頻度で提示されるようにした。

【００５７】配列フラグメントの各アミノ酸は、20ビットの二進法のストリング(binary st
ring)として表し、したがって各残基について20インプットの神経単位を用いた
。例えば、アラニン及びシステインは、それぞれストリング1000000000000000000
0及び01000000000000000000として示された。アウトプットは、種々の形態の対
数目盛を用いて再正規化された親和性を示す、ひとつの実数値であった。最善の回路網を見出すために、品質基準ならびに標準的なピアスン相関基準と
して分類相関係数C (Mathews 1975, Brunak 1991) を用いて、上記のデータの一
部を用いて調整し、残りの配列フラグメントについて回路網の性能を試験するこ
とにより、種々の回路網構造(インプット(8、9又は10-マー)層及び隠匿層の単位
数が異なる)の性能を試験した。例えば、分類係数は(バインダーと非バインダー
を分離する特定閾値が規定される場合)以下のように定義される：

【数５】

【００５８】この方程式で、P_xは真にポジティブな数(実験的に測定されたバインダー、予
測されるバインダー)、N_xは真にネガティブな数(実験による非バインダー、予測
される非バインダー)、P_fxは偽ポジティブの数(実験による非バインダー、予測
されるバインダー)、かつN_fxは偽ネガティブの数(実験によるバインダー、予測
される非バインダー)である。利用可能なデータの種々の部分について調整され
ていてもよい、構造の異なる回路網からの予測を平均化することによって、疑わ
しいフラグメントを最終的に予測することは、一般的に行われていることである
。ここで、試験の性能は、交差確認によって算出した：一連のデータをほぼ同じ
大きさの7個の部分に分け、試験データとして1部を用い、調整データとして他の
6部分を用いて回路網ごとに操作した。次に、一連のデータの7個の異なる部分の
平均として、性能基準を算出した(幾つかの回路網からのアウトプットは、平均
化前に再正規化してもよい)。交差確認回路網数は、一般に利用可能なデータ量(
データが乏しければ、数百個の回路網を調整することは、ほとんど意味をなさな
い)及び費やすことが望まれるコンピューター時間量によって設定される。この
場合、調整及び試験設定が合理的な規模になるので、7個の回路網を選択した。

【００５９】調べた4つのペプチド-MHCクラスIの組合わせのうち4つについて、擬似神経回
路網はマトリクスから得られる予測よりも良く機能した。予測は、バインダー対
非バインダーへの任意の分類よりむしろ、実際の結合 IC₅₀ 値を予測するように
行った。実際、大きな範囲にわたってバインダーを予測したところ、親和性の高
いバインダーならびに親和性の低いバインダー及び非バインダーを同定すること
ができた。この発明の目的のため、HLA-A^*0204予測の忠実度は非常に重要である
。316個の8-マー及び398個の9-マーのペプチドを合成し、結合を試験した。7つ
の擬似神経回路網それぞれを、ペプチドの6/7について調整し、残りの1/7を試験
に残した。7つの擬似神経回路網それぞれでは、交差確認スキームでペプチドの1
/7の異なるものを用いた。(対数関数変換後に)観察値に対して予測平均を集める
ことによって、線形の回帰分析(lenar regression analysis)が可能となり、予
測されるy = x に近い線を(補正なしに)得た(9マーについては、線はピアソン係
数0.87でlog(実測) = log (予測) x 0.9734 + 0.1807)。他の予測を用いて同じ
一連のデータを分析し、ピアソン係数0,78 (Rammensee http://134.2.96. 221/s
cripts/hlaserver.dll/home.htm)、0,83 (Parker, http://bimas.dcrt.nih. gov
/molbio/hla_bind/) 及び0,85 (Stryhnら, 1996)を得た。第一世代の擬似神経回
路網でさえ、代わりの予測法のどれよりも良い。最終的な回路網全体は、この結
果、7つの擬似神経回路網からなり、疑わしいペプチドについての予測は、7つの
アウトプット値の平均から得られる。

【００６０】実施例3: 選択基準疑わしいエピトープについてのHIV-1タンパク質配列は、The Los Alamos 1998
/1999 HIV 配列データベース(http://hiv-web.lanl.gov/)から得た。これらのタ
ンパク質は、シークエンスされた、利用可能な全ての全長HIV-1タンパク質の翻
訳産物で、HIV-1の重要な遺伝多様性を反映している(http://hiv-web.lanl. gov/
で世界的に入手可能なHIV-1の重要な遺伝多様性を示す配列を参照のこと)。全
ての利用可能なGag (96配列)、Pol(86配列)、Vif (265配列)、Vpr (173配列)、V
pu (156配列)、Tat (101配列)、Rev (105配列)、Env (213配列) 及びNef(251配
列) のタンパク質配列は、HIV-1/SIVcpz タンパク質アラインメントから抽出し
た。アラインメントのために配列中に挿入した全ての残留ギャップを除いた。Lo
s Alamos HIVデータベースのアミノ酸配列(全ジーンバンクHIV配列も含む)を用
い、各タンパク質の完全配列のみを選択した。

【００６１】表7は、HLA-A2エピトープの推測の元となったHIV-1タンパク質配列数と、それ
らの群 M を構成する遺伝サブタイプ(サブタイプA、AB、AC、AD、ADI、AE、AG、
AGI、AGJ、B、BF、C、CD、D、F、G、H、J) 又は群N もしくは群O内での分布を要
約している。SIVcpzウイルスがEnvにおいてHIV-1 群Nと高度な遺伝的ホモロジー
を共有しているために、SIVcpz のようなHIV-1-関連配列を含めた。全タンパク質を、調整した擬似神経回路網(上記のとおり)を用いてHLA-A2結合
モチーフを示す9又は8残基長のペプチドについて個々に走査した。予測されるペ
プチド-HLA-A2 結合親和性の最大値に対するカットオフは500nMで設定した。全HIVタンパク質の走査後に、IC₅₀が500nM 未満で、全体的HIV-I 保存が0%よ
り高い総計4215 個のHLA-A2結合モチーフを認めた(表2参照)。

【００６２】実施例4:予測エピトープの特徴づけワクチンに含有される臨床上関連性のあるHLA-A2エピトープは、同じHIV-1サ
ブタイプのウイルスの大部分に対して、又は1以上のHIV-1遺伝サブタイプに属す
るウイルスに対して、又は異なるHIV-1遺伝群に属するウイルスに対して、潜在
的に免疫応答を誘発し得るべきである。表8は、HIV-1 サブタイプB配列が、HLA-A2エピトープの予測に用いたデータベ
ースでしばしば優位を占めることを示している。例えば、Nef-特異的HLA-A2エピ
トープの予測に用いたNefタンパク質の66,5%は、HIV-1サブタイプBに属した。こ
の偏向は、1つのエピトープが異なるHIV-1サブタイプを網羅するか否か、又は1
つのエピトープがHIV-1サブタイプBのみを提示するのか否かについての評価を難
しくしている。最も臨床上関連しているHLA-A2エピトープを選択する最初の試み
のあいだ、全体的な保存カットオフは50%であった。後に観察したところ、サブ
タイプB以外のHIV-1 サブタイプで認められる(サブタイプBでは認められない)エ
ピトープが逆に選択された。これらのサブタイプは、データベースにはあまり示
されなかった。例えば、全体保存10,35%のNefで予測されるエピトープは、サブ
タイプ C (7,97%)、G (1,19%) 及びH (1,19%)内の全タンパク質に実際に存在し
得た。選択基準にこのデータベースの偏向を考慮するために、全体保存が8％よ
り高い全エピトープを分析した。少数のサブタイプに保存されるエピトープを取
り上げるために、このカットオフを割り当てた。

【００６３】どのHIV-1サブタイプが、少なくとも8％の全体保存を有する各エピトープに関
連しているかが同定された。データベースの命名法によれば、全てのHIV-1 配列
は、それらが属する遺伝的サブタイプにしたがって命名される。つまり、名称の
最初の文字は、サブタイプに対応している。各エピトープとのアミノ酸配列ホモ
ロジーが100％のタンパク質配列の名称を分類し、文字A、AB、AC、AD、ADI、AE
、AG、AGI、AGJ、B、BF、C、CD、D、F、G、H、J 又はO 又はNのいずれかが何回
名称に現れるかを計測した。基準HIV-1株HXB2内の各エピトープの位置付けエピトープが互いの変異体であるかどうかをより良く評価するため、HXB2基準
株の9個のタンパク質内のエピトープをマッピングした。この位置付けは、分析
した各エピトープとのホモロジーが最高のHXB2の領域を位置付けることによって
行った。各エピトープは、従来の一対のホモロジー検索を用いて相当する HXB2
タンパク質とアラインさせた。

【００６４】分子HLA-A2に対する結合親和性によって予測されるエピトープのランキング IC₅₀の結合親和性が50nM以下のペプチドエピトープは一般にHLA-A2に対して良
好なバインダーとして認識されているが、IC₅₀結合親和性が50nM〜500nMのペプ
チドエピトープは、中間的なバインダーと考えられる。良好なバインダーはCTL
応答の誘発において良好な能力を有するが、中間的なバインダーは、そのような
良好なCTL応答を誘発しない。しかし、それらは良好な標的となる。というのは
、宿主の感染細胞が、必ずしもCTL免疫を誘発できない標的として機能できるこ
れらのCTLエピトープを提示できるからである。

【００６５】しかし、神経回路網は、因子2によって結合親和性を誤って推測し得る。した
がって、包括的であるために、HLA-A2の良好なバインダーを規定するIC₅₀親和性
閾値を100nMまで上げ、そのようなHLA-A2エピトープを天然の免疫原とみなした
。結合親和性IC₅₀が100nM 以下で、全体保存が1%より高い全てのHLA-A2エピトー
プを個別に分類した。それらは、天然に免疫原性のHIV-1 HLA-A2エピトープと考
えた。これらのペプチドエピトープを表5Aに挙げる。表5Aは、213個のHLA-A2エ
ピトープを含む。それらをタンパク質ファミリーで分類し、その長さ(9又は8ア
ミノ酸残基)及びその全体保存にしたがってランク付けする。結合親和性IC₅₀が5
0nM〜500nMで、全体保存が8%より高い推測されるHLA-A2エピトープを全て分類し
、良好なCTL応答の誘発能力が低い可能性がある天然のHLA-A2中間バインダーと
考えた。それらの中間バインダーを、免疫原性が低いが抗原性のバインダーとみ
なした。結合親和性が50nM〜500nMで、全体保存が8%より高いかそれに等しい推
測されるHLA-A2エピトープを、全て表5Bと5Cに個別に分類した。158個(110個の9
-マー(表5B)及び48個の8-マー(表5C))のHLA-A2 天然エピトープが認められた。
これらの158個の HLA-A2 エピトープを、1つ又は2つの一次アンカー位置を変え
ることによって、結合親和性を増し、100nMより低い改善されたIC₅₀結合親和性
とすることができる天然の中間バインダーとみなした。改良型エピトープ、及び
その推測される結合を、表5B 及び5Cに挙げる。少数のケースでは、改良型エピ
トープは1以上の天然のエピトープを網羅する。したがって、表5Bは100個の改良
型エピトープを挙げており、表5Cは46個の改良型エピトープを挙げている。「良
好及び中間的なHLA-A2バインダー」の選択基準を表2に示す。

【００６６】

【表２】

【００６７】天然の中間バインダーからの予測の改善 1つ又は2つの一次アンカー残基を交換することによって、最良の146個の中間
バインダー(表5B)それぞれの結合親和性が改善されるかどうかを評価した。その
目的のため、上記アミノ酸のそれぞれで一次アンカー残基を入れ替えて、各ペプ
チド配列をデザインした。全ての組合わせを分析した。配列がXLXXXXXXAで、結
合親和性IC₅₀が100nMより大きい天然中間バインダーについては、表4に示すよう
に15個のエピトープを人為的にデザインした。

【００６８】

【表４】

【００６９】次いで、これらの15個のデザインしたHLA-A2 エピトープのHLA-A2 結合親和性
を、この発明に記載される擬似神経回路網を用いて推測した。推測される結合の
親和性閾値は、免疫原性が得られるように100nMに設定した。推測される結合親
和性IC₅₀が100nMより低く、天然エピトープのIC₅₀値よりIC₅₀値が低いデザイン
されたエピトープは、全て改良型HLA-A2 エピトープとみなした。958個の改良型
エピトープの総量を表5B、5C 及び 5Dに挙げる。これらから、各天然エピトープ
について最良の新たな改良型バインダーを選択した(表5B 及び5C参照)。 50nM〜100nMの親和性を示し、全体保存が8％より高い表5BのHLA-A2予測エピト
ープを、全て親和性の改善についてアッセイした。親和性が理論上改善され、そ
れぞれの天然エピトープの結合親和性に匹敵する20個のペプチドエピトープを表
5Bから分類した。

【００７０】実施例5: HIV-1 ポリトープワクチンを構築するための臨床上関連のある新たなH
LA-A2 エピトープの選択理想的な「カバー-オール」候補ワクチンは、9個のエピトープセットからなる
。各セットは、9個の HIV-1タンパク質の1つに特異的で、上記基準を満たす1〜1
0個のエピトープからなる。

【００７１】セット1: Vpuに特異的な1〜10個のエピトープセット 2: Vprに特異的な1〜10個のエピトープセット 3: Vifに特異的な1〜10個のエピトープセット 4: Revに特異的な1〜10個のエピトープセット 5: Tatに特異的な1〜10個のエピトープセット 6: Nefに特異的な1〜10個のエピトープセット 7: Gagに特異的な1〜10個のエピトープセット 8: Polに特異的な1〜10個のエピトープセット 9: Envに特異的な1〜10個のエピトープ

【００７２】セット当たり最小限1つのエピトープが予見できるが、幾つかの根拠から「最
少の選択法」はとらない方がよさそうである: -1) 全ての選択基準、特に「カバー-オール」保存基準を満たすことのできるエ
ピトープは、ほとんどない。これは、Rev、Tat、Vpu、Vpr、Vif 及びNefのよう
な調節又は補助ウイルスタンパク質に推測されるA2-エピトープに特に当てはま
る。HIV-1 株の多様性をできるだけ網羅するためには、幾つかのエピトープを組
合わせる必要がある。

【００７３】 -2) ウイルスはそのタンパク質配列を変えることによって宿主免疫応答を回避で
きるので、ウイルスタンパク質当たりに1つだけエピトープを選択することは、
ウイルスが、ワクチンで誘発されるCTL応答を回避する機会を増強させることに
なる可能性がある。ウイルスと闘うためには、できるだけ多くのエピトープをセ
ットに含めるべきである。ウイルスの回避を克服するために、2つのストラテジ
を選択できる。1つのストラテジは「エピトープ」ファミリーを構成し、その結
果互いにエピトープ変異体であるA2-エピトープを全て選択することである。か
かる変異体ファミリーで免疫化することによって、データベースに存在するよう
な多くの回避変異体(escape variant)に対する免疫応答の誘発が期待される。し
かし、このようなエピトープ変異体ファミリーは、ウイルスにあまり損害を与え
ずに高い変異率を受けることができる、ウイルスタンパク質の何かの領域に局在
している。そこで、ウイルスは、ワクチンによる免疫選択圧下のこの領域に新た
な回避変異を導入する機会を多く有する。別の補助的な方法は、ウイルスタンパ
ク質の高度な保存領域に局在する高度に保存されたエピトープを選択することで
ある。このような高度な保存は、回避変異を受ければ必ずウイルスに危険性を及
ぼすタンパク質の機能ドメインを反映している可能性がある。

【００７４】 -3) 不完全であるが、ペプチドへのタンパク質の抗原-プロセシングを制御する
選択機序についてデータが現在利用可能である(www.cbs.dtu.dk/services参照)
。全タンパク質からの特定のペプチドの切除は、そのペプチドをフランクする特
定残基をタンパク質分解酵素が認識することに依存するものと考えられている。
これらのフランキング残基は周知ではないので、各選択エピトープが(ウイルス
感染細胞表面で)ペプチド形態に天然のウイルスタンパク質から適当に処理され
、次いで抗原的に利用可能であるかどうかは、不明である。選択されたエピトー
プは予防接種をとおして良好な免疫応答を生じることができるとはいえ、このよ
うな免疫応答は、これらのエピトープが感染細胞表面でペプチド-HLA-A2複合体
としてインビボで提示される場合にのみ、有効である。この不確実性を克服する
ために、ウイルスタンパク質の種々の領域(つまり、理論的に個別のフランキン
グ環境)に局在する幾つかのエピトープを選択すべきである。

【００７５】上記基準に基づき、354個のエピトープのうち53個を選択し、合成ポリトープ
ワクチンに導入した。これらの53個のエピトープを表9及び10に示す。それらを
、8セットに分ける: セット 1: Vpuに局在する4エピトープセット 2: Vprに局在する4エピトープセット 3: Vifに局在する6エピトープセット 4: Revに局在する4エピトープセット 5: Nefに局在する5エピトープセット 6: Polに局在する10エピトープ。このうち、 4個は逆転写酵素ポリペプ
チド(p51)に局在し、1つのエピトープはインテグラーゼポリペプチド(p31)に局
在できる。セット 7: Gagに局在する10エピトープセット 8: Envに局在する10エピトープ

【００７６】 Pol、Gag 及び Envのような構造タンパク質と比較して、Vpu、Vpr、Vif、Rev
及びNefのような調節及び補助タンパク質について選択できるエピトープは、ほ
とんどない。これは、これらの調節及び補助タンパク質の大きさが小さく、変異
性が高度なためであり、このために、認められるエピトープによって全ての選択
基準を充足することが難しくなっている。例えば、Tatについてはエピトープを
選択できない。というのは、擬似神経回路網によって推測される少数のエピトー
プは、保存基準を十分に満たさないからである。 Vpu、Vpr、Vif、Revについて選択された少数のエピトープは、全てのHIV-1 サ
ブタイプで高度に保存されていなかったが、それらは少なくとも1つのHIV-1サブ
タイプの20％より多い株で保存されていたので、興味を引くものであった。例え
ば、セット1では、天然エピトープIVGLIVALは、その全体保存が全HIV-1 株の3,2
% であるにもかかわらず、HIV-1 AE 組換え株の66,6% で保存された。このエピ
トープは、HIV-1 AE 組換え株に対するCTL応答を生じるための良好な免疫原候補
とみなされた。

【００７７】選択されたエピトープの大部分は、HLA-A2に対する結合が改善されていた。改
良型エピトープの使用は、最良に保存されている天然エピトープの大部分が中間
又は低いA2-バインダーであり、また、これらの改良型エピトープは、由来する
天然エピトープに対しCTL応答を生じることが期待されるという認識に左右され
た。幾つかの場合に、ある特定の改良型エピトープは幾つかの天然エピトープの
改良型で、この結果、このような改良型エピトープに対して生じた免疫応答が、
種々の天然エピトープを発現する全てのHIV-1株に相対することができた。

【００７８】例えば、改良型エピトープILAIVVWTVは、2つの天然エピトープ: それぞれ試験
された全HIV-1 株の32,1% 及び 9,6%で認められる IIAIVVWTI (Kd=373,1nM) 及
びILAIVVWTI (Kd=39,9nM) に関連していた。したがって、この改良型エピトープ
で行った免疫化は、HIV-1株の41,7% (32,1%+9,6%) (全体範囲%)に対し免疫応答
を生ずることが期待された。天然エピトープIIAIVVWTI は、HIV-1 サブタイプA
株の33,3%、HIV-1 サブタイプB 株の32％、HIV-1 サブタイプC 株の54%、HIV-1
サブタイプD 株の56,2％、組換えAE 株の33,3%、サブタイプF の66,65% 及びサ
ブタイプHの66,65％で保存されていた。天然エピトープILAIVVWTI は、HIV-1 サ
ブタイプA株の41,6%、 AC 組換え株の33,3%、HIV-1 サブタイプB 株の3,1%、HIV
-1 サブタイプD株の 31,2%で認められた。改良型エピトープILAIVVWTVは、した
がってHIV-1 サブタイプA株の 74,9% (33,3% + 41,6%)、サブタイプB株の35%(32
%+3%)、サブタイプB株の54％、サブタイプD株の87,4% (56,2%+31,2%)に対しCTL
免疫応答を誘発できることが期待された。

【００７９】実施例6:「カバー-オール」ポリトープワクチンのデザイン及び構築「カバー-オール」ポリトープワクチンは、各「パール」が1つのペプチド-エ
ピトープである複数のパールの一掛け(string)からなる。第一工程では、合成タンパク質配列をコンピューターでデザインする。全ペプ
チド-エピトープ配列は、各ペプチド-エピトープ間にアミノ酸リンカーを全く挿
入せずに互いに配置する。この合成タンパク質内のペプチド-エピトープの順序
は無作為に行うか、又は全てのペプチド-エピトープの組合わせ位置によって生
じる種々のタンパク質分解-特異的シグナル化部位を評価できるコンピューター
プログラムを用いて定義する。

【００８０】第二工程では、デザインしたポリエピトープタンパク質配列を、DNAstar (Las
ergene) のようなソフトウエア又はいずれかの他の一般的に利用可能なプログラ
ムを用いてヌクレオチド配列に翻訳し戻す。各アミノ酸残基について、高度に発
現される哺乳動物のコドンを選択し、設計した合成遺伝子の転写レベル及び翻訳
レベルを増強する。最終工程では、デザインしたヌクレオチド配列を修飾し、ユニークな制限酵素
部位を生じるサイレント変異を導入する。このようなユニークな制限酵素部位は
、幾つかのカセット系としてこの合成遺伝子を構築することを可能にする。各カ
セットは、核酸配列(いわゆるミニ遺伝子)をエンコードする幾つかのペプチドを
含む。最終的には、遺伝子の5'- 及び 3'-末端に特異的な制限部位を付加し、適
当な哺乳動物の発現ベクター及び/又はウイルスベクターに「カバー-オール」ポ
リトープの合成した全長遺伝子をクローンする。

【００８１】合成ポリトープ遺伝子の構築合成「カバー-オール」ポリトープ遺伝子は、長いオリゴヌクレオチド相補ア
ニーリング技術を用いて構築する(Fomsgaardら, 1999)。遺伝子のヌクレオチド
配列は、約100〜120塩基対のフラグメントに分ける。例えば、1417塩基対長の合
成遺伝子(39個の9マーのペプチド及び14個の8マーのペプチド)は、12〜14フラグ
メントに分けることができる。これらの二本鎖DNAフラグメントそれぞれを、相
補オリゴヌクレオチド対(センス鎖及びアンチセンス鎖)として合成する。これら
の一対のオリゴヌクレオチドそれぞれの各末端は、アニーリング後に二本鎖DNA
フラグメントが5'及び3'に隣接するDNA フラグメントを有する末端を相補的に突
出するようにデザインする。相補的なセンス及びアンチセンスのオリゴヌクレオ
チドの各対を個々にアニールする。連結方法は、300〜480bp遺伝カセットの集合
及びpMOSBLUE 又はpBlueScriptのような適当なベクターへのその挿入を可能にす
るために、3〜4個の個別の再アニール二本鎖DNAフラグメントを用いて行う。XL1
-ブルーの細菌又はいずれかの適当な大腸菌株を、連結生成物を用いて形質転換
する。ポジティブの組換えクローンを増幅する。組換えプラスミドDNAを精製し
、その配列をシーケンシングによって確認する。この方法は、デザインしたカセ
ット(300-480 bpフラグメント)の全てを合成し、クローンするまで、行う。全カ
セット(11〜18 ペプチド-エピトープを含む5又は3個のカセット) を次いで互い
に連結し、全長遺伝子を再構築し、適当な哺乳動物の発現ベクター及び/又はウ
イルスベクターにクローンする。

【００８２】実施例7: マウスの実験推測されるエピトープの免疫原性を分析するために、HLA-A2トランスジェニッ
クマウスを、エピトープを提示するペプチドで免疫化した。このための免疫化及
びCTL法は、知られているように文献に記載されており(Setteら, 1994,)、実験
の大部分をこの論文にしたがって行った。手短に言えば、ストック溶液は、疑わ
しいペプチド(水中4 mg/ml)及び水中4.8 mg/mlのT-ヘルパーエピトープペプチド
(アミノ酸配列: TPPAYRPPNAPIL) (Milichら, 1988) 及び不完全フロイントアジ
ュバント(Statens Serum Institut, DK)から調製した。IFA (0.2 ml)とTh-ペプ
チド(0.2 ml) さらに試験エピトープペプチド(0.2 ml)の混合物を、氷上で調製
した。IFA/ペプチド混合物100μlを、HLA-A2 トランスジェニックマウス(Dr Nic
holas Holmes, Camebridge, UKから供与)の尾の根元に皮内注射(i.c.)した。通
常、疑わしいペプチド当たり3匹のマウスを注射した。CTLは、10日目に測定した
。

【００８３】細胞障害性T リンパ球(CTL)アッセイ CTLアッセイ法は文献に記載されており(Setteら, 1994)、大部分、上記文献に
したがって実験を行った。手短に言えば、ペプチドで免疫化したHLA-A2トランス
ジェニックマウスの脾臓を、免疫化してから10日後に無菌的に集め、氷上の5ml
の細胞培地(RPMI 1640、ペニシリン+ストレプトマイシン(P+S)、2% Hepes緩衝液
、10% ウシ胎児血清)に入れた。脾細胞を、100 μg/mlのペプチドで被覆したLPS
芽細胞(刺激細胞)の存在下で6日間培養し、次いで標的細胞として疑わしいペプ
チドの存在下又は不在下のEL4-A2 及びEL4細胞系を用いてペプチド-特異的なA^*0
201/Kb-制限CTL 活性をアッセイした。2.5/1 の応答/刺激細胞比で刺激細胞とと
もに混合して6日間培養した免疫化マウス由来の脾細胞を、「エフェクター細胞
」と称する。

【００８４】 LPS芽細胞は、1つの正常な脾臓(非免疫化HLA-A2マウス)から調製した。最終容
量40mlのLPS培地1ml当たり、脾細胞は3〜5 x 10⁶個である。LPS培地は、RPMI 16
40、1% ペニシリン-ストレプトマイシン、2% Hepes、10% FCS、7μg/100 mlのデ
キストランスルフェート培地(Pharmacia #17-0340-01) 及び 25 ug/100 mlのLPS
培地(Sigma #L-2387)であった。LPS培地で脾細胞を培養してから3日後、LPS芽細
胞をミトマイシンで処理し細胞分裂を阻害した。LPS芽細胞に標的ペプチドをロ
ーディングすると同時に、ミトマイシンで処理した。芽細胞2mlをペプチド20μg
及びPBS中100μgのミトマイシンと混合した。インキュベーターにおいて5% CO₂
中37℃で1時間培養した。LPS 芽細胞を次いで媒体中で洗浄し、2 x 10⁷ 細胞/培
地ml (RPMI 1640, P+S, Hepes, 50 μM メルカプトエタノール) に調製した。

【００８５】この発明で、EL-4-A2 又は EL4 細胞又はEL4-A2kb 細胞系は互換性があり、以
下のように記載される: プラスミドpA2kb は、Nikolas Holmesからの提供物であ
る。ジーンパルサーシステム(BIO-RAD)を用いて、10⁷ 個のEL4 細胞(ATCC TIB-3
9)を 20μgのpA2kbでエレクトロポレートする(Potterら,1993)。エレクトロポレ
ーションは、製造者の推奨にしたがって行った。600μg/ml のゲネシチン(genet
icin) (G418 Gibco BRL)を用いて48時間後に選択を行う。FACS分析によって、HL
A-A2特異的モノクローナル抗体(BB7.2 ATCC-HB82)を用いて細胞クローンをスク
リーンする。

【００８６】標準的な⁵¹Cr リリースCTL アッセイは、Markerら, 1973にしたがって行った
。手短に言えば、クロム酸ナトリウム⁵¹Cr 200μlの存在下で37℃で1時間インキ
ュベートし、3回洗浄し、適当なペプチド10μg/mlの不在又は存在下、10⁵細胞/
mlの濃度でRPMI 1640、10% FCSに再懸濁した標的細胞は、EL-4-A2 又は EL4 細
胞であった。アッセイについては、100μlの標的細胞を、U-底の96-ウェルプレ
ートで種々の濃度のエフェクター細胞100μlとインキュベートした。上清(100μ
l)を37℃で6時間後に除き、式により溶解％を測定した: リリース% = 100 x (実験的リリース−自発的リリース) / (最大リリース−自発
的リリース)

【００８７】 CTLアッセイのデータ例を図1に示す。 3匹のHLA-A2 トランスジェニックC57BL/6 マウス(4-4、5-1、5-2)のうち、全
て(A2+H3 (4-4)、A2+H3 (5-2)、A2+H3 (5-1))が、HLA-A2 CTLエピトープとして
文献に既に記載されている予測CTLエピトープ(アミノ酸配列ILKEPVHGV)を提示す
るペプチド(H3)での予防接種に応答した(E: T=50での特異的溶解＞10％)。EL4-A
2 標的細胞に対するエフェクター細胞比(E: T 比)が高度になればなるほど、特
異的溶解%が高くなる。ペプチドをローディングしていないEL4-A2 標的細胞に、
非特異的溶解は認められなかった(A2 -pep (4-4)、A2 -pep (5-1)、A2 -pep (5-
2))。HLA-A2 ネガティブEL4 標的細胞の非特異的溶解は、H3 ペプチドをローデ
ィングするにせよ、しないにせよ、認められなかった(EL4+H3 (4-4)、EL4+H3 (5
-1)、EL4+H3 (5-2)) 又は非(EL4 -pep (4-4)、EL4 -pep (5-1)、EL4 -pep (5-2)
)。

【００８８】 2つの対照実験を行い、5日間のエフェクター細胞のインビトロ刺激の処理自体
で、標的細胞を溶解し得るエフェクター細胞を生じることができないことを確認
した。「非免疫化再刺激 w. H3」: H3ペプチドで免疫化していないが、そのエフェクタ
ー脾細胞がH3ローディング刺激芽細胞でインビトロで刺激されているHLA-A2 ト
ランスジェニックマウスは、H3ペプチドをローディングしているEL4-A2 標的細
胞(A2+H3)、又はローディングしていない細胞(A2 -pep)に反応しなかった。これ
は、5日間のインビトロ刺激の処理自体では、特異的ペプチドをローディングし
たEL4-A2 標的細胞に対して反応するエフェクター細胞を生じることができない
ことを立証した。これにより、ペプチド免疫化によるCTLの特異的誘導が確認さ
れた。これらの非免疫化HLA-A2 マウス由来のインビトロ刺激エフェクター細胞
は、H3をローディングしていようと(EL4+H3)、いなかろうと(EL4 -pep)、HLA-A2
ネガティブEL4標的細胞に反応しなかった。

【００８９】対照実験「非免疫化再刺激w. LV9」は、非免疫化HLA-A2 トランスジェニック
マウス由来の脾細胞が、LV9ペプチドローディング芽細胞での5日間のインビトロ
刺激によっては腫瘍抗原p53からの別の既知HLA-A2制限エピトープペプチド(LV9
、配列LLGRNSFEV)に反応するようにならないことを示した。つまり、図は、EL4
標的細胞(Kdポジティブ、HLA-A2ネガティブ) 又はLV9でローディングしたEL4-A2
標的細胞(それぞれEL4+LV9 及びA2+LV9) 又はペプチドをローディングしていな
い標的細胞(それぞれEL4 -pep 及びA2 -pep)に反応がなかったことを示した(結
果を図1に示す)。

【００９０】実施例8: 改良エピトープ及び天然エピトープの交差反応を確認するためのマウ
ス実験天然エピトープと交差反応するCTL免疫応答を生じる能力が改善されたエピト
ープを確認する方法は、実施例7に記載の方法と同様である。 A2 トランスジェニック免疫化: IFA (30%)、HBV T-ヘルパーエピトープ(960μg)
及び試験エピトープ(800μg)を含む混合物600μlのうち100μlを用いて選択し
た改良型エピトープを用いてマウスを免疫化した。CTLは、免疫化から10日後に
測定した。 CTLエフェクターのインビトロ刺激: 免疫化マウスから得た脾細胞を2つに分けた
。脾細胞の最初の半分を、関連する天然エピトープペプチドでローディングした
LPS芽細胞の存在下で刺激した。刺激は、5〜6日行った(結果を図2に示す)。

【００９１】細胞障害性T-リンパ球アッセイ: ペプチドをローディングした、又はローディン
グしていないEL4-A2⁺ 及びEL4 (A2^-)細胞系の溶解能力について、刺激したCTLエ
フェクターをアッセイした。改良型エピトープでインビトロ刺激したCTLエフェ
クターを、改良ペプチドでローディングした標的細胞の特異的溶解について試験
した。相互的に、天然エピトープでインビトロ刺激したCTLエフェクターを、天
然ペプチドをローディングした標的細胞の特異的溶解について試験した。改良ペ
プチドをローディングした標的細胞で得られる特異的溶解の％を、次いで、天然
ペプチドをローディングした標的細胞で得られる特異的溶解の％と比較した。改
良ペプチドでローディングした標的細胞のA2-制限的特異的溶解が10％より高い
ことは、この改良ペプチドが免疫原性であることを示した。天然ペプチドでロー
ディングした標的細胞のA2-制限特異的溶解が10％より高いことは、改良ペプチ
ドに対してインビボで生じたCTL エフェクターが天然ペプチドを認識できること
を示した。並行実験で、A2トランスジェニックマウスにおけるCTL応答の誘発能
について天然のエピトープ-ペプチドを試験した。天然ペプチド及び改良ペプチ
ドの免疫原性を次いで比較した。天然ペプチドに対する改良ペプチドの増強され
た免疫原性は、改良ペプチドで免疫化したマウス由来のCTLエフェクターを用い
ると、天然ペプチドに対する特異的溶解が著しく高いことを結論付けた。詳細な
結果については、図3及びその説明を参照のこと。

【００９２】表表5A: 全体保存が1％より高く、疑わしいペプチドに対するMHCクラスI結合の加重平
均のカットオフ値が100nM未満であることを意味する、結合親和性が高く、全体
保存が中間的なCTLエピトープ。この特に好ましい具体例を、さらに実施例4に記
載する。表5Aは、213個の新たなHLA-A2エピトープを含む。それらをタンパク質
ファミリーで分類し、その長さ(9 又は8 アミノ酸残基)及びその全体保存にした
がってランク付けする。

【００９３】

【表５Ａ】

【００９４】

【表５Ａつづき】

【００９５】

【表５Ａつづき】

【００９６】

【表５Ａつづき】

【００９７】

【表５Ａつづき】

【００９８】

【表５Ａつづき】

【００９９】

【表５Ａつづき】

【０１００】

【表５Ａつづき】

【０１０１】表5B: 結合親和性IC₅₀が50nM〜500nMで、全体保存が8%より高い天然エピトープそれ
ぞれについて最良の新たな改良バインダーを示す9-マー。100個のHLA-A2 9-マー
-エピトープを見出した。これらの110個の HLA-A2 エピトープを天然の中間バイ
ンダーとみなした。その結合親和性は、一次アンカー位置の1つ又は2つを変える
ことによって増し、100nMより低い改善された結合親和性IC₅₀を生じることがで
きた。100個の最適な(最良の)改良HLA-A2 制限HIVエピトープを同定した。

【０１０２】

【表５Ｂ】

【０１０３】

【表５Ｂつづき】

【０１０４】

【表５Ｂつづき】

【０１０５】

【表５Ｂつづき】

【０１０６】表5C: 結合親和性IC₅₀が50nM〜500nMで、全体保存が8%より高い天然エピトープそれ
ぞれについて最良の新たな改良バインダーを示す8-マー。47個のHLA-A2 8-マー-
エピトープを見出した。これらの47個の HLA-A2 エピトープを天然の中間バイン
ダーとみなした。その結合親和性は、一次アンカー位置の1つ又は2つを変えるこ
とによって増し、100nMより低い改善された結合親和性IC₅₀を生じることができ
た。45個の最適な(最良の)改良HLA-A2 制限HIVエピトープを同定した。

【０１０７】

【表５Ｃ】

【０１０８】

【表５Ｃつづき】

【０１０９】表5D: 結合親和性IC₅₀が50nM〜500nMで、全体保存が8%より高い天然エピトープそれ
ぞれについて他の改良バインダーを示す8-マー及び9-マー。812個のHLA-A2 エピ
トープを見出した。これらの812個の HLA-A2 エピトープを天然の中間バインダ
ーとみなした。その結合親和性は、一次アンカー位置の1つ又は2つを変えること
によって増し、100nMより低い改善された結合親和性IC₅₀を生じることができた
。

【０１１０】

【表５Ｄ】

【０１１１】

【表５Ｄつづき】

【０１１２】

【表５Ｄつづき】

【０１１３】

【表５Ｄつづき】

【０１１４】

【表５Ｄつづき】

【０１１５】

【表５Ｄつづき】

【０１１６】

【表５Ｄつづき】

【０１１７】

【表５Ｄつづき】

【０１１８】表5E: HIV株のうちで全体保存が8％より高く、アンカー位置アミノ酸を変えることによ
って容易に改善できない新たな天然の中間バインダー(予測結合IC₅₀ = 50 〜500
nM)を提示する8-マー及び9-マー

【０１１９】

【表５Ｅ】

【０１２０】表6: PSCPLの完全な8-マー、9-マー及び 10-マーのセットは、明細書に記載するよ
うに合成した。

【０１２１】

【表６】

【０１２２】表 7: HLA-A2エピトープが予測されるHIV-1タンパク質配列、及び群Mを構成する遺伝サ
ブタイプ(サブタイプA、AB、AC、AD、ADI、AE、AG、AGI、AGJ、B、BF、C、CD、D
、F、G、H、J)又は群Nもしくは群O内でのその分布。SIVcpzウイルスはEnvでHIV-
1 群Nと高度な遺伝ホモロジーを共有しているため、SIVcpz のようなHIV-1-関連
配列を含めた。

【０１２３】

【表７】

【０１２４】表8: HLA-A2エピトープの予測に用いたデータベースでHIV-1 サブタイプB配列がしば
しば優位を占めることを示す

【０１２５】

【表８】

【０１２６】表9 及び 10: 明細書に記載の基準に基づけば、354個のうち53個のエピトープを選択し、合
成ポリトープワクチンに導入した。それらを8セットに分ける: セット 1: Vpuに局在する4エピトープセット 2: Vprに局在する4エピトープセット 3: Vifに局在する6エピトープセット4: Revに局在する4エピトープセット 5: Nefに局在する5エピトープセット 6: Polに局在する10エピトープ。このうち、4個は逆転写酵素ポリペプチ
ド(p51)に局在し、1個のエピトープはインテグラーゼポリペプチド(p31)に局在
できる。セット 7: Gagに局在する10エピトープセット 8: Envに局在する10エピトープ各エピトープについて、改良エピトープ又は良好な結合(IC₅₀＜100nM)が測定
された関連する天然エピトープを選択した。

【０１２７】

【表９】

【０１２８】

【表９つづき】

【０１２９】

【表１０】

【０１３０】

【表１０つづき】

【０１３１】表11: 表11は、表5及び6の「カバーオール」エピトープからのエピトープについて予
測Kd及び測定Kdの例を示している。関連する天然型を含む表5及び6のエピトープ
に相当するペプチドを合成し、HLA-A2 MHC-Iに対する結合を実施例１に記載され
るようにインビトロで測定した。関連する天然エピトープに対しKd値を増すこと
によって結果を分類する。関連する天然エピトープから測定される結合値(表の
右側)は、予測されるようにアンカーの最適化(エピトープ、表の左側)によって
改善できる。

【０１３２】

【表１１】

【０１３３】

【表１１つづき】

【０１３４】参考文献 Sette A, Vitiello A, Reherman B, Fowler P, Nayersina R, Kast WM, Melief
CJM, Oseroff C, Yuan L, Ruppert J, Sidney J, del Guercio M-F, Southwood
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supp.2):77-78,1994 Falk K, Rotzschke O, Stevanovic S ら、Allele-specific motifs revealed by
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erging principles for the recognition of peptide antigens by MHC class I
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independent sub-specificities: quantitation by peptide libraries and imp
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plex binding regions of protein antigens by sequence pattern analysis. P
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tion algorithms based on MHC-binding motifs; comparison of predicted and
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-peptide complexes as a tool for predicting potential T cell epitopes. B
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predictable MHC-binding motif and binds to Kd through interactions betw
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47. 米国特許4,608,251; 4,601,903; 4,599,231; 4,599,230; 4,596,792; 及び 4,57
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de side-chains. J Immunol 1994; 152:163-75.

【０１３５】好ましいCTL エピトープのリスト SEQ ID NO:1-213は結合親和性が高く、全体保存が中間的なエピトープで、全
体保存が1％より高く、疑わしいペプチドへのMHCクラスI結合の加重平均につい
てのカットオフ値が100nM未満であることを意味する。SEQ ID NO: 214-314は、
結合親和性IC₅₀が50nM 〜500nMで、全体的保存が8％より高い天然エピトープそ
れぞれに対し最良の新たな改良バインダーを示す8-マーのエピトープである。SE
Q ID NO: 314-359 は、結合親和性IC₅₀が50nM 〜500nMで、全体的保存が8％より
高い天然エピトープそれぞれに対し最良の新たな改良バインダーを示す9-マーの
エピトープである。

【０１３６】

【表】

【０１３７】

【表つづき】

【０１３８】

【表つづき】

【０１３９】

【表つづき】

【０１４０】

【表つづき】

【０１４１】

【表つづき】

【０１４２】

【表つづき】

【０１４３】

【表つづき】

【０１４４】

【表つづき】

【０１４５】

【表つづき】

【図面の簡単な説明】

【図１】図1は、予測されるHLA-A2 CTLエピトープを提示するペプチドでHLA-A2 トランス
ジェニックC57BL/6マウスを免疫化した後のCTLの誘導を立証している。図1A: 3匹のHLA-A2トランスジェニックマウス(4-4、5-1、5-2)を0日目にフロイ
ント不完全アジュバント中のH3ペプチドで免疫化した。10日目から、H3ペプチド
ローディングLPS-芽細胞で脾細胞を5日間インビトロで刺激し、H3ペプチドでロ
ーディングしているか、又はローディングしていないEL4-A2 もしくはEL4標的細
胞系に対する免疫反応性について⁵¹Crリリースアッセイでアッセイした。標的細
胞に対する種々のエフェクター(E: T)比を試験した。図1B : LV9ローディングLPS-芽細胞でのインビトロ刺激から5日後でさえ、非免疫
化HLA-A2マウス由来のエフェクター脾細胞によってでは、別のHLA-A2制限エピト
ープペプチドLV9 (配列LLGRNSFEV)でローディングした、もしくはローディング
しないEL4-A2又は EL4標的細胞が溶解しないことを示す対照実験。図1C : H3ペプチドローディングLPS-芽細胞でのインビトロ刺激から5日後でさえ
、非免疫化HLA-A2マウス由来のエフェクター脾細胞によってでは、H3でローディ
ングした、もしくはローディングしないEL4-A2 又はEL4 標的細胞が溶解しない
ことを示す対照実験。

【図２】図2は、インビトロの再刺激から5日後のペプチド-免疫化C57Bl6/A2 トランスジ
ェニックマウスから得られる脾細胞の細胞障害活性を示す。白抜きの記号はペプ
チド-パルスしたEL4A2の特異的溶解を示すが、黒塗りの記号はペプチド-パルス
したEL4(Kb)標的細胞の特異的溶解を示す。図2A : 天然ペプチドに対して生じたCTL応答。脾細胞は、天然エピトープ(LTFGWC
FKL)で免疫化した2匹のマウス(m9-1 及びm9-3)から得た。天然ペプチドでパルス
したEL4A2標的に対しては、特異的溶解が認められなかった(10％未満の標的が溶
解した)。図2B :改良ペプチドに対して生じたCTL応答。1匹のマウス(m9-4)を、アンカー位
置改良ペプチド(LLFGWCFKL)で免疫化した。改良ペプチド又は天然ペプチドのい
ずれかを用いて、脾細胞をインビトロで再刺激した。再刺激から5日後、脾細胞
は、改良ペプチドでパルスしたEL4A2標的に対して高度な細胞障害活性を有する(
E:T 比50で特異的溶解90％)。さらに、改良エピトープに対して誘発される脾細
胞は、天然ペプチドでパルスした EL4A2標的を溶解することができる(E:T比50で
特異的溶解14％)。

【図３】図3は、アンカー最適化ペプチド8.54 RLLNAWVKV (表5B 及び10)でのインビト
ロ再刺激から5日後に同じペプチドで免疫化し、同じペプチド8.54(■)又は関連
する天然の8.54Nat エピトープペプチド(▲)でパルスしたEL4-A2標的細胞に対し
てアッセイしたC57BL6/A2トランスジェニックマウスから得られる脾細胞の細胞
障害活性を示す。右のパネル(図3B 及び3D)は、エフェクター脾細胞が表面にHLA
-A2 MHC-Iを持たないペプチド-パルスEL4細胞に対して反応しないネガティブの
対照を示す。関連する天然のエピトープに交差反応性の免疫化に用いたペプチド
に対する明らかな応答は4匹のマウスのうち1匹で認められ(マウス1、上のパネル
、図3A)、マウス2ではあまり応答がなかった(下のパネル、図3C)。A2異種マウス
の技術的及び生物学的変化の双方に起因し得る応答を、かかるペプチドの予防接
種で群のマウスが行うとは限らないことは、知られている。

【配列表】

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１４年１月２８日（２００２．１．２８）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者フォムスガード，アンデルデンマーク、ディーケー−1954 フレデリクスベルグシー、ホストラップハヴ５ (72)発明者ブラナック，ソレンデンマーク、ディーケー−1851 フレデリクスベルグシー、ニーヴェイ６ (72)発明者バス，ソレンデンマーク、ディーケー−2700 ブロンショイ、ステンマグルヴェイ 29 (72)発明者コルベット，シルヴィデンマーク、ディーケー−1954 フレデリクスベルグシー、ホストラップハヴ５ (72)発明者ラエモラー，サンヌ，リースデンマーク、ディーケー−3000 ヘルシンガー、バデヴェイ５、２ティーエイチ (72)発明者ハンセン，ジャンデンマーク、ディーケー−2830 ヴィルム、クラソルモスヴェイ６Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA06 AA07 BA01 BA08 BA17 BA18 BA23 CA59 DA42 NA14 ZC55 4C085 AA03 BB11 EE01 4H045 AA10 AA30 BA15 CA05 DA86 EA31 EA53 【要約の続き】

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 (a) 実験によるMHCクラスIの構造又はペプチド結合データか
ら、一次的な位置特異的予測手段を講じ; (b) 一連のタンパク質配列を走査し、工程(a)で得られた一次予測手段にしたが
って結合親和性を算出することによって、潜在的に結合親和性の高いエピトープ
を同定し; (c) 任意に、配列類似性に基づく排他的手段によって、工程(b)で同定された多
数のペプチドを減少させ; (d) 工程(c)又は(b)で同定されたペプチドについて実験的な結合データを生成し
; (e) 工程(d)からの実験的な結合データを用いて、1nM〜50,000 nMの結合親和性
範囲におけるサブインターバルでの頻度にしたがって加重された個々のペプチド
結合データ例が等しく提示されるように、MHCクラスIに対する結合親和性を予測
するための1以上の擬似神経回路網を調製し; かつ (f) 疑わしいペプチドを工程(e)で調製された擬似神経回路網それぞれで試験し
、擬似神経回路網それぞれから疑わしいペプチドについて近似の結合親和性を得
、近似の結合の加重平均値を算出し、それにより疑わしいペプチドについて結合
親和性を見積もることによって、疑わしいペプチドの結合親和性を評価する工程からなる、MHCクラスI結合親和性の加重平均が500nM未満のCTLエピトープの
同定方法。
【請求項２】 PSCPLが、工程(a)での一次的位置特異的予測手段を講じるた
めに用いられる請求項１に記載の方法。
【請求項３】工程(a)でのMHC クラスIの構造データ又はペプチド結合デー
タが、HLAの構造データ又はペプチド結合データである請求項１又は２に記載の
方法。
【請求項４】疑わしいペプチドが、HIV-1 又はHIV-2タンパク質配列デー
タベース又はその一部である、タンパク質データベースに由来する前記請求項の
いずれかに記載の方法。
【請求項５】さらに、 (k) 一連のHIVタンパク質配列にわたる、疑わしいペプチドの全体的保存を測定
する工程からなり、工程(k)のCTLエピトープは、＜500 nM未満のMHCクラスI結合を有
する前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】全体的保存が1％より多い請求項５に記載の方法。
【請求項７】 MHCクラスI結合の加重平均が100 nM未満である前記請求項の
いずれかに記載の方法。
【請求項８】全体的保存がHIVタンパク質配列にわたって8％より多い請求
項５〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】 MHCクラスI結合の加重平均が50 nMより多い請求項５〜８に
記載の方法。
【請求項１０】エピトープが、HLA制限的HIVエピトープである前記請求項
のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】さらに、 (l) アンカー位置のアミノ酸をコンピューター操作で置換してCTLエピトープを
修飾し; かつ (m) 工程(i)で整えられる擬似神経回路網それぞれで工程(l)の修飾CTLエピトー
プを試験し、擬似神経回路網それぞれからCTLエピトープの近似結合親和性を得
、近似結合の加重平均を算出し、それによりCTLエピトープについて推測される
結合親和性を得ることによって、該修飾CTLエピトープの結合親和性を評価する
工程からなり、修飾CTLエピトープの予測されるMHCクラスI結合が、100 nM未満で、天然CTLエピ
トープよりも結合が小さい、前記請求項のいずれかによる方法。
【請求項１２】前記請求項のいずれかによる方法で同定されるCTLエピト
ープ。
【請求項１３】 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:
4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9
、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO:
14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID
NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ
ID NO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、S
EQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33
、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO:
38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42、SEQ ID
NO: 43、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ
ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52、S
EQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57
、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO:
62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66、SEQ ID
NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ
ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、S
EQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 81
、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO:
86、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 90、SEQ ID
NO: 91、SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 95、SEQ
ID NO: 96、SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100、
SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104、SEQ ID N
O: 105、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、
SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 113、SEQ ID N
O: 114、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 118、
SEQ ID NO: 119、SEQ ID NO: 120、SEQ ID NO: 121、SEQ ID NO: 122、SEQ ID N
O: 123、SEQ ID NO: 124、SEQ ID NO: 125、SEQ ID NO: 126、SEQ ID NO: 127、
SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 131、SEQ ID N
O: 132、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 134、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 136、
SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 138、SEQ ID NO: 139、SEQ ID NO: 140、SEQ ID N
O: 141、SEQ ID NO: 142、SEQ ID NO: 143、SEQ ID NO: 144、SEQ ID NO: 145、
SEQ ID NO: 146、SEQ ID NO: 147、SEQ ID NO: 148、SEQ ID NO: 149、SEQ ID N
O: 150、SEQ ID NO: 151、SEQ ID NO: 152、SEQ ID NO: 153、SEQ ID NO: 154、
SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 156、SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 158、SEQ ID N
O: 159、SEQ ID NO: 160、SEQ ID NO: 161、SEQ ID NO: 162、SEQ ID NO: 163、
SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 166、SEQ ID NO: 167、SEQ ID N
O: 168、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 170、SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 172、
SEQ ID NO: 173、SEQ ID NO: 174、SEQ ID NO: 175、SEQ ID NO: 176、SEQ ID N
O: 177、SEQ ID NO: 178、SEQ ID NO: 179、SEQ ID NO: 180、SEQ ID NO: 181、
SEQ ID NO: 182、SEQ ID NO: 183、SEQ ID NO: 184、SEQ ID NO: 185、SEQ ID N
O: 186、SEQ ID NO: 187、SEQ ID NO: 188、SEQ ID NO: 189、SEQ ID NO: 190、
SEQ ID NO: 191、SEQ ID NO: 192、SEQ ID NO: 193、SEQ ID NO: 194、SEQ ID N
O: 195、SEQ ID NO: 196、SEQ ID NO: 197、SEQ ID NO: 198、SEQ ID NO: 199、
SEQ ID NO: 200、SEQ ID NO: 201、SEQ ID NO: 202、SEQ ID NO: 203、SEQ ID N
O: 204、SEQ ID NO: 205、SEQ ID NO: 206、SEQ ID NO: 207、SEQ ID NO: 208、
SEQ ID NO: 209、SEQ ID NO: 210、SEQ ID NO: 211、SEQ ID NO: 212、SEQ ID N
O: 213、SEQ ID NO: 214、SEQ ID NO: 215、SEQ ID NO: 216、SEQ ID NO: 217、
SEQ ID NO: 218、SEQ ID NO: 219、SEQ ID NO: 220、SEQ ID NO: 221、SEQ ID N
O: 222、SEQ ID NO: 223、SEQ ID NO: 224、SEQ ID NO: 225、SEQ ID NO: 226、
SEQ ID NO: 227、SEQ ID NO: 228、SEQ ID NO: 229、SEQ ID NO: 230、SEQ ID N
O: 231、SEQ ID NO: 232、SEQ ID NO: 233、SEQ ID NO: 234、SEQ ID NO: 235、
SEQ ID NO: 236、SEQ ID NO: 237、SEQ ID NO: 238、SEQ ID NO: 239、SEQ ID N
O: 240、SEQ ID NO: 241、SEQ ID NO: 242、SEQ ID NO: 243、SEQ ID NO: 244、
SEQ ID NO: 245、SEQ ID NO: 246、SEQ ID NO: 247、SEQ ID NO: 248、SEQ ID N
O: 249、SEQ ID NO: 250、SEQ ID NO: 251、SEQ ID NO: 252、SEQ ID NO: 253、
SEQ ID NO: 254、SEQ ID NO: 255、SEQ ID NO: 256、SEQ ID NO: 257、SEQ ID N
O: 258、SEQ ID NO: 259、SEQ ID NO: 260、SEQ ID NO: 261、SEQ ID NO: 262、
SEQ ID NO: 263、SEQ ID NO: 264、SEQ ID NO: 265、SEQ ID NO: 266、SEQ ID N
O: 267、SEQ ID NO: 268、SEQ ID NO: 269、SEQ ID NO: 270、SEQ ID NO: 271、
SEQ ID NO: 272、SEQ ID NO: 273、SEQ ID NO: 274、SEQ ID NO: 275、SEQ ID N
O: 276、SEQ ID NO: 277、SEQ ID NO: 278、SEQ ID NO: 279、SEQ ID NO: 280、
SEQ ID NO: 281、SEQ ID NO: 282、SEQ ID NO: 283、SEQ ID NO: 284、SEQ ID N
O: 285、SEQ ID NO: 286、SEQ ID NO: 287、SEQ ID NO: 288、SEQ ID NO: 289、
SEQ ID NO: 290、SEQ ID NO: 291、SEQ ID NO: 292、SEQ ID NO: 293、SEQ ID N
O: 294、SEQ ID NO: 295、SEQ ID NO: 296、SEQ ID NO: 297、SEQ ID NO: 298、
SEQ ID NO: 299、SEQ ID NO: 300、SEQ ID NO: 301、SEQ ID NO: 302、SEQ ID N
O: 303、SEQ ID NO: 304、SEQ ID NO: 305、SEQ ID NO: 306、SEQ ID NO: 307、
SEQ ID NO: 308、SEQ ID NO: 309、SEQ ID NO: 310、SEQ ID NO: 311、SEQ ID N
O: 312、SEQ ID NO: 313、SEQ ID NO: 314、SEQ ID NO: 315、SEQ ID NO: 316、
SEQ ID NO: 317、SEQ ID NO: 318、SEQ ID NO: 319、SEQ ID NO: 320、SEQ ID N
O: 321、SEQ ID NO: 322、SEQ ID NO: 323、SEQ ID NO: 324、SEQ ID NO: 325、
SEQ ID NO: 326、SEQ ID NO: 327、SEQ ID NO: 328、 SEQ ID NO: 329、SEQ ID
NO: 330、SEQ ID NO: 331、SEQ ID NO: 332、SEQ ID NO: 333、SEQ ID NO: 334
、SEQ ID NO: 335、SEQ ID NO: 336、SEQ ID NO: 337、SEQ ID NO: 338、SEQ ID
NO: 339、SEQ ID NO: 340、SEQ ID NO: 341、SEQ ID NO: 342、SEQ ID NO: 343
、SEQ ID NO: 344、SEQ ID NO: 345、SEQ ID NO: 346、SEQ ID NO: 347、SEQ ID
NO: 348、SEQ ID NO: 1172、SEQ ID NO: 1173、SEQ ID NO: 1174、SEQ ID NO:
1175、SEQ ID NO: 1176、SEQ ID NO: 1177、SEQ ID NO: 1178、SEQ ID NO: 1179
、SEQ ID NO: 1180、SEQ ID NO: 1181、SEQ ID NO: 1182、SEQ ID NO: 1183、SE
Q ID NO: 1184、SEQ ID NO: 1185及びSEQ ID NO: 1186からなる群から選択され
る請求項１２に記載のCTLエピトープ。
【請求項１４】医薬として用いるための請求項１２〜１３のいずれかに記
載のCTLエピトープ。
【請求項１５】ワクチンの製造のための請求項１２〜１３のいずれかに記
載のCTLエピトープの使用。
【請求項１６】診断剤の製造のための請求項１２〜１３のいずれかに記載
のCTLエピトープの使用。