JP2001511132A

JP2001511132A - 広範な反応性のｄｒ制限されたエピトープの同定

Info

Publication number: JP2001511132A
Application number: JP53216698A
Authority: JP
Inventors: セテ，アレサンドロ; シドニー，ジョン; サウスウッド，スコット
Original assignee: エピミュンインコーポレイテッド
Priority date: 1997-01-23
Filing date: 1998-01-23
Publication date: 2001-08-07
Also published as: EP1007079A1; US20020160019A1; WO1998032456A1; AU6433598A; US6413517B1; CN1251042A; CA2278296A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、HLA、DR4w4、DR1、およびDR7のペプチド結合特異性に基づいている。これらのDR分子に結合するペプチドは、１位における大きな芳香族または疎水性残基（Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ）および６位の小さな非荷電残基（Ｓ、Ｔ、Ｃ．Ａ、Ｐ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ）によって特徴づけられるモチーフを有する。さらに、対立遺伝子特異的二次効果および二次アンカーが定義され、そしてこれらの結果を利用して、対立遺伝子特異的アルゴリズムを駆動する。このようなアルゴリズムの組み合わされた使用によって、DR1、4、7結合を縮重し得るペプチドが同定された。

Description

【発明の詳細な説明】広範な反応性のDR制限されたエピトープの同定発明の背景ヘルパーＴリンパ球（HTL）は、病原体に対する免疫性におけるいくつかの重要な機能を果たす。最初に、これらは、CTLおよび抗体応答の両方の誘導の補助を提供する。直接的な接触、ならびにIL2およびIL4のようなリンホカインの分泌の両方によって、HLTは、エフェクター細胞へのＴ細胞前駆体およびＢ細胞前駆体の拡大および分化を促進および支持する。さらに、HTLはまた、まさにそれら自身においてもエフェクターであり得、活性はまた、直接的な細胞の接触およびリンホカイン（例えば、IFNγおよびTNFα）の分泌によって媒介される。HTLは、腫瘍、ならびにウイルス性、細菌性、寄生虫性、および真菌性の感染において、直接的なエフェクター活性を有することが示されてきた。 HTLは、クラスII MHC分子と抗原性ペプチドとの間で形成される、通常、10から20残基の間の長さを有し、そして13から16アミノ酸の間の平均の大きさを有する複合体を認識する。ペプチド−クラスII相互作用は、構造的および機能的レベルの両方で詳細に分析されてきた。そして、種々のヒトおよびマウスクラスII分子に特異的なペプチドモチーフが報告されている。最近の数年間で、エピトープベースのワクチンが、新規の予防用ワクチンおよび免疫治療ストラテジーの開発のための可能性のある手段としてかなり注目されている。適切なＴ細胞およびＢ細胞エピトープの選択は、高い配列可変性によって特徴付けられる病原体（例えば、HIV、HCV、およびマラリア）の保存されたエピトープに対する免疫系に注目することを可能にするはずである。さらに、選択された決定基に対する免疫応答に注目することは、種々の慢性のウイルス疾患およびガンの場合に価値があり得る。ここで、免疫優性エピトープに指向されるＴ細胞は不活化されているが、半優性（subdominant）エピトープに特異的なＴ細胞は、Ｔ細胞寛容性を逸し得る。エピトープベースのワクチンの使用もまた、TH₁応答が所望されるかまたはその逆である条件下で、TH₂応答を誘導する「抑制性」Ｔ細胞決定基を回避することが可能である。最後に、エピトープベースのワクチンはまた、それらの可能性を調節するように操作されているワクチン構築物エピトープ中で誘導される機会を、MHC結合親和性を増大させることによるか、またはそのTCR接触残基の変更によるか、または両方のいずれかで、提供する。病原体エピトープ（例えば、TT由来の「普遍」エピトープ）に対する完全な合成の非天然のまたは遺伝的に無関係である封入もまた、TH₁またはTH₂表現形に応答するHTLを調節する可能な手段を提示する。一旦適切なエピトープ決定基が規定されると、それらは、種々の手段で分類され得るかまたは送達され得る。これには、リポペプチド、ウイルス送達ベクター、ウイルスまたは合成に起源を有する粒子、裸のまたは粒子吸着されたcDNAを含む。しかし、適切なエピトープが規定され得る前に、１つの主要な障害、言いかえれば、ヒトの集団において発現されるMHC分子の非常に高い程度の多型性が克服されなければならない。実際、200以上の異なる型のHLAクラスＩおよびクラスII 分子が、すでに同定されている。HLAクラスＩ分子の場合、いくつかの異なるHLA クラスＩ分子に結合し得るペプチドが同定され得ることが、実証されている。既知HLAクラスＩ分子の60％以上が、実際に、類似のペプチド結合特異性（HLAスーパーモチーフ）によって特徴付けられる、４つの広範なHLAスーパータイプにグループ化され得る。クラスIII分子の場合、複数のHLA型に結合し得、そして異なるHLA分子の状況で免疫原性であるペプチドが実際に存在することが、公知である。しかし、現在までに、それらの同定のための一般的な方法は開発されておらず、おそらく、定量的なDR結合アッセイが集約的な作業であること、および多数の対立遺伝子が考慮されなければならないという事実の少なくとも一部を反映する。本発明は、これらおよび他の要件を取り扱う。発明の要旨本発明は、広範な集団によって代表される種々のDR分子の、特異的モチーフの発見および確認、ならびにアッセイシステムに、少なくとも部分的に基づく。広範な縮重HLAクラスII結合ペプチドの同定へのこれらの適用もまた、記載される。定義用語「ペプチド」は、代表的には、隣接するアミノ酸のα−アミノとカルボキシル基との間のペプチド結合によって互いに連結された一連の残基（代表的には、L-アミノ酸）を示すように、本明細書中で「オリゴペプチド」と互換的に使用される。本発明のオリゴペプチドは、約50残基よりも短い長さであり、そして通常、約10から約30までの間の残基で構成され、より通常には、約12から約25の間、そしてしばしば約15から約20残基の間で構成される。「免疫原性ペプチド」は、対立遺伝子特異的モチーフを含むペプチドである。その結果、このペプチドは、MHC分子に結合し、そしてHTL応答を誘導する。本発明の免疫原性ペプチドは、適切なHLA分子に結合し得、そして免疫原性ペプチドが誘導される抗原に対するHTL応答を誘導し得る。「保存された残基」は、代表的には、MHC構造が免疫原性ペプチドとの接触点を提供し得る、ペプチドモチーフ中の特定の位置を占有する保存されたアミノ酸である。規定された長さのペプチド内の１から３、代表的には２つの保存された残基が、免疫原性ペプチドについてのモチーフを規定する。これらの残基は、代表的には、それ自体の溝の特異的ポケット中に埋め込まれたそれらの側鎖と、ペプチド結合溝で密接に接触する。用語「モチーフ」は、通常は、約８から約11アミノ酸の間の規定された長さの残基のパターンをいう。これは、特定のMHC対立遺伝子によって認識される。用語「スーパーモチーフ」は、免疫原性ペプチド中に存在する場合、ペプチドが１つを超えるHLA抗原を結合することを可能にするモチーフをいう。スーパーモチーフは、好ましくは、ヒト集団中で広範な分布を有する少なくとも１つのHL A対立遺伝子によって認識され、好ましくは、少なくとも２つの対立遺伝子によって認識され、より好ましくは、少なくとも３つの対立遺伝子によって認識され、そして最も好ましくは、３つを超える対立遺伝子によって認識される。句「単離された」または「生物学的に純粋な」は、その天然の状態に見出されるような、通常それに付随する成分を実質的または本質的に含まない物質をいう。従って、本発明のペプチドは、それらのインサイチュ環境（例えば、抗原提示細胞上のMHC Ｉ）に通常は関連する物質を含まない。タンパク質が均質または優性バンドに単離されている場合でさえ、５〜10％の天然のタンパク質の微量な混入物が存在する。これは、所望のタンパク質とともに同時精製される。本発明の単離されたペプチドは、このような内因性の同時精製されたタンパク質を含まない。用語「残基」は、アミド結合またはアミド結合模倣物によってオリゴペプチド中に取りこまれているアミノ酸またはアミノ酸模倣物をいう。図面の簡単な説明図１は、主要なP1-P6アンカーと比較して、特定の部位を占有する場合の、20 個の天然に存在するアミノ酸の各々の、DR4w4結合能力に対するポジティブまたはネガティブな効果のマップを示す。図２Ａは、主要なP1-P6アンカーと比較して、特定の部位を占有する場合の、2 0個の天然に存在するアミノ酸のそれぞれの、DRI結合能力に対するポジティブまたはネガティブな効果のマップを示す。図２Ｂは、主要なP1-P6アンカーと比較して特定の部位を占有する場合の、20 個の天然に存在するアミノ酸のそれぞれの、DR7結合能力に対するポジティブまたはネガティブな効果のマップを示す。好ましい実施態様の説明本発明は、ウイルス、真菌、細菌、および寄生虫による疾患およびガンのような多数の病理学的状態を予防、処置、または診断するための組成物および方法に関する。詳細には、本発明は、選択された主要な組織適合性複合体（MHC）クラスII分子に結合し得、そして免疫応答を誘導し得る新規のペプチドを提供する。 MHC分子に結合するペプチドは、MHC分子の対立遺伝子型およびペプチドのアミノ酸配列によって決定される。MHCクラスＩ結合ペプチドは、通常、MHC分子中の対応する結合ポケットと相互作用するそれらの配列の２つの保存された（「アンカー」）残基中に含まれる。ヒトMHC（HLA、組織適合性白血球抗原）のいくつかの対立遺伝子形態による結合に必要とされるアンカー残基（通常は、「MHCモチーフ」といわれる）の特異的な組み合わせは、国際出願WO 94/03205およびWO 94 /20127に記載される。特異的なMHCモチーフの定義によって、個々のタンパク質のアミノ酸配列からそのペプチドがCTLについて免疫原性である可能性を有することを予想することが可能である。これらの出願は、疾患の処置における免疫原性ペプチドの調製および使用のための方法を記載する。本明細書中で記載されるペプチドはまた、CTL応答を誘導するペプチドと組み合わせて、ヘルパーＴペプチドとして使用され得る。これは、WO 95/07077に記載される。本発明のDR結合ペプチドまたはそれらをコードする核酸は、哺乳動物（特に、ヒト）に、予防目的および／または治療目的で投与され得る。DRペプチドは、本発明のペプチドがヘルパーペプチドとして使用される場合に、ペプチドとともに投与される他の免疫原に対する免疫応答を増強するために使用され得る。例えば、CTL応答を誘導するペプチドと組み合わされた本発明のペプチドの混合物は、ウイルス感染およびガンを処置および／または予防するために使用され得る。あるいは、抗体応答を誘導する免疫原が使用され得る。DRペプチドと他の免疫原との免疫原性混合物を使用して処置され得る疾患の例として、前立腺ガン、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、AIDS、腎臓ガン、頚部のガン、リンパ腫、CMVおよび尖圭コンジロームが挙げられる。 DR結合ペプチドまたはそれらをコードする核酸はまた、所望されないＴ細胞反応性に関連する種々の状態を処置するために使用され得る。DR結合ペプチドを使用して処置され得る疾患の例として、自己免疫疾患（例えば、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、および筋無力症）、同種移植拒絶、アレルギー（例えば、花粉アレルギー）、ライム病、肝炎、LCMV、連鎖球菌による心内膜炎後、または糸球体腎炎、および食物過敏症が挙げられる。治療適用において、免疫原性組成物、または本発明のDR結合ペプチドもしくは核酸は、ガン、自己免疫疾患、または目的のウイルスの感染をすでに罹患している個体に投与される。疾患の温置期または急性期においてそれらは、適切な場合には、DR結合ペプチドまたは免疫原性結合体を別々に用いて、あるいは他の処置と組み合わせて処置され得る。治療適用において、免疫原性組成物を含有する組成物は、ウイルスまたは腫瘍抗原に対する有効な免疫応答を誘発するため、ならびに症状および／または合併症を治療および少なくとも部分的に阻止するために十分な量で、患者に投与される。同様に、DR結合ペプチドを含有する組成物は、疾患およびその合併症の症状を治療または少なくとも部分的に阻止するために十分な量で投与される。これを達成するために適切な量は、「治療有効用量」として規定される。この使用に有効な量は、例えば、ペプチド組成物、投与の様式、処置される疾患の段階および重篤度、患者の体重および一般的な健康状態、ならびに処方する医師の判断による。本発明の免疫原性組成物の治療有効量は、一般的には、最初の免疫については、70kgの患者あたり約1.0μgから約10,000μgのペプチドの範囲であり、通常は、約100から約8000μg、そして好ましくは約200から約6000μgの間である。これらの用量には、患者の血液中の特異的免疫原性活性を測定することによる患者の応答および状態に依存して、数週間から数ヶ月にわたる追加投与レジメに従って、約1.0μgから約1000μgまでの追加用量が続く。本発明の組成物が、一般的に、重篤な疾患状態（すなわち、生命を脅かす状況または生命を脅かす可能性のある状況）で使用され得ることを心に留めておかなければならない。このような場合において、外来性物質の最小化および結合体の比較的無毒性の性質を考慮して、処置する医師によるこれらの組成物の実質的に過剰な投与が可能であり、そして所望されると確信され得る。予防的使用のために、投与は、危険群に対してなされるべきである。例えば、マラリア、肝炎、またはAIDSに対する防御は、本発明の組成物を予防的に投与し、それによって免疫能力を増大することによって達成され得る。治療的投与は、疾患の最初の兆候、または腫瘍の検出もしくは外科的切除、または急性の感染の場合における診断のすぐ後に、開始され得る。これには、少なくとも症状が実質的に減少するまで、およびその後の期間、追加用量が続く。慢性の感染において、負荷用量、続く追加用量が必要とされ得る。本発明の組成物で感染した個体の処置は、急性感染の個体において感染の消散を早め得る。慢性の感染を発症しやすい（または、その素因を有する）これらの個体について、この組成物は、急性から慢性への感染の進行を妨げるための方法において特に有用である。罹患しやすい個体は、感染の前または間に、例えば、本明細書中で記載されるように同定される。組成物は、それらに対して標的化され得、より大きな集団への投与の必要性を最小にし得る。ペプチド混合物または結合体はまた、慢性の感染の処置のため、およびキャリアのウイルス感染細胞を排除する免疫系を剌激するために使用され得る。細胞傷害性Ｔ細応答を効果的に刺激するために充分な投与の処方物および態様において免疫強化ペプチドの量を提供することが重要である。従って、慢性の感染の処置について、代表的な用量は、１回の用量あたり70kgの患者について、約1.0μgから約5000μg、好ましくは、約５μgから1000μgの範囲である。例えば、１週間から４週間の確立された間隔での免疫用量、続く追加免疫用量が、おそらく、個体を効果的に免疫するために延長された期間に必要とされ得る。慢性の感染の場合について、投与は、少なくとも臨床的な症状または研究室試験が、ウイルス感染が排除されたかまたは実質的に減少したことを示すまで、およびその後の期間継続されるべきである。治療的処置または予防的処置のための薬学的組成物は、非経口的、局所的、経口的、または局部的投与について考慮される。代表的には、薬学的組成物は、非経口的に（例えば、静脈内、皮下、皮内、または筋肉内）投与される。投与の容易さのために、本発明のワクチン組成物は、経口投与に特に適切である。従って、本発明は、受容可能なキャリア（好ましくは、水溶性キャリア）中に溶解されたかまたは懸濁されたペプチドまたは結合体の溶液を含む、経口投与のための組成物を提供する。種々の水溶性キャリア（例えば、水、緩衝液、0.9％の生理食塩水、0.3％のグリシン、ヒアルロン酸など）が使用され得る。これらの組成物は、従来の、周知の滅菌技術によって滅菌され得るか、または滅菌濾過され得る。得られる水溶液は、使用のためにパッケージングされ得るかまたは凍結乾燥され得、そして凍結乾燥された調製物は、投与の前に滅菌の溶液と組み合わされる。組成物は、適切な生理学的条件に必要とされる薬学的に受容可能な補助物質（例えば、pH調整剤、緩衝化剤、張性調整剤、湿潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミンなど）を含み得る。薬学的処方物中の本発明のDRおよび／またはCTL刺激ペプチドの濃度は、非常に広く変化し得る。すなわち、重量で、約0.1％未満から通常は約２％または少なくとも約２％から、20％から50％程度またはそれ以上であり、そして選択される投与の特定の態様に従って、液体容量、粘度などによって最初に選択される。本発明のペプチドおよび結合体はまた、特定の組織（例えば、リンパ様組織、または感染した細胞に対して選択的に標的化される組織）に対して結合体を標的化するように、そしてペプチド組成物の半減期を増大させるように作用するリポソームを介して投与され得る。リポソームとして、乳濁物、発泡体、ミセル、不溶性の単層、脂質の結晶、リン脂質分散物、ラメラ層などが挙げられる。これらの調製物において、送達されるペプチドは、リポソームの一部として、単独で、あるいは例えば、リンパ様細胞の中でも一般的なレセプター（例えば、CD45抗原に結合するモノクローナル抗体）に結合する分子と組み合わせて、または他の治療用または免疫原性組成物とともに取りこまれる。従って、本発明の所望のペプチドまたは結合体で満たされたリポソームは、リンパ様細胞の部位に対して指向され得、次いでここで、リポソームは、選択された治療用／免疫原性ペプチド組成物を送達する。本発明での使用のためのリポソームは、標準的なベシクル形成脂質から形成され、これは、一般的に、中性および陰性に荷電したリン脂質およびステロール（例えば、コレステロール）を含む。脂質の選択は、一般的には、例えば、リポソームの大きさ、酸不安定性、および血流中のリポソームの安定性の考慮によって導かれる。種々の方法（例えば、本明細書中で参考として援用される、Szokaら、Ann．Rev．Biophys．Bioeng．9，467（1980）、米国特許第4,23 5,871号、同第4,501,728号、同第4,837,028号、および5,019,369号に記載される）が、リポソームの調製に利用可能である。免疫細胞を標的化するために、リポソーム中に取りこまれるべきリガンドとして、例えば、所望の免疫系の細胞の細胞表面決定基に特異的な抗体またはそのフラグメントが挙げられ得る。ペプチドまたは結合体を含有するリポソーム懸濁物が、静脈内、局部的、局所的などで、とりわけ投与の様式、送達される結合体、および処置される疾患の段階に従って変化する容量で投与され得る。あるいは、１つ以上のDRペプチドをコードするDNAまたはRNA、および１つ以上のCTLエピトープを含むポリペプチドまたはエピトープを含む抗体が、核酸がコードするポリペプチドに対する免疫応答を得るために患者に導入され得る。Wolf fら、Science 247：1465-1468（1990）は、核酸をコードする遺伝子の発現を生じるための核酸の使用を記載する。そのような使用はまた、米国特許第5,580,85 9号および同第5,589,466号において開示されている。核酸はまた、例えば、米国特許第5,204,253号に記載されるような、弾道学的な送達を使用して投与され得る。DNAのみから構成される粒子が投与され得る。あるいは、DNAは、金粒子のような粒子に接着され得る。核酸はまた、カチオン性化合物（例えば、カチオン性脂質）に対して複合体化されて送達され得る。脂質によって媒介される遺伝子送達方法が、例えば、WO 96/18372；WO 93/24640；ManninoおよびGould-Fogerite （1988）Biotechniques 6（7）：682-691；Rose米国特許第5,279,833号；WO 91/ 06309；ならびにFelgnerら（1987）Proc．Natl．Acad．Sci．USA84：7413-7414 に記載されている。本発明のペプチドはまた弱毒化されたウイルス宿主（例えば、ワクシニアまたは鶏痘）によって発現され得る。このアプローチには、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するベクターとしてのワクシニアウイルスの使用を含む。急性または慢性の感染した宿主への導入、または未感染の宿主への導入の際に、組換えワクシニアウイルスは免疫原性ペプチドを発現し、それによって宿主のCTL応答を誘発する。免疫化プロトコールにおいて有用なワクシニアベクターおよび方法は、例えば、本明細書中で参考として援用される米国特許第4,722,848号に記載されている。別のベクターは、BCG（Bacille Ca lmette Guerin）である。BCGベクターは、本明細書中で参考として援用されるSt overら（Nature 351：456-460（1991））に記載されている。本発明のペプチドの治療的投与または免疫化に有用である広範な種々の他のベクター（例えば、Sa lmonella typhiベクターなど）が、本明細書中の記載から当業者に明らかである。本発明のペプチドをコードする核酸を投与する好ましい手段は、CTL誘導性ペプチドとともに本発明の複数のペプチドをコードするミニ遺伝子構築物を使用する。ヒト細胞中での発現のための選択されたDRペプチドおよびCTLエピトープをコードするDNA配列を作製するために、エピトープのアミノ酸配列が逆翻訳される。ヒトのコドン使用表が、各アミノ酸のコドン選択を導くために使用される。これらのエピトープをコードするDNA配列は、直接的に隣接する配列であり、連続するポリペプチド配列を作製する。発現および／または免疫原性を最適化するために、さらなるエレメントが、ミニ遺伝子の設計に取りこまれ得る。逆翻訳され得、そしてミニ遺伝子配列に含まれ得るアミノ酸配列の例として：本発明のDR ペプチド、リーダー（シグナル）配列、１つ以上のCTLエピトープ、および小胞体保持シグナルが挙げられる。さらに、CTLエピトープのMHC提示は、CTLエピトープに隣接する、合成の（例えば、ポリアラニン）または天然に存在する隣接配列を含むことによって改善され得る。ミニ遺伝子配列は、ミニ遺伝子のプラス鎖およびマイナス鎖をコードするオリゴヌクレオチドをアセンブリすることによって、DNAに転換される。重複オリゴヌクレオチド（30〜100塩基長）が、周知の技術を使用して適切な条件下で合成、リン酸化、精製、およびアニーリングされる。オリゴヌクレオチドの末端は、 T4DNAリガーゼを使用して連結される。次いで、CTLエピトープポリペプチドをコードするこの合成ミニ遺伝子は、所望の発現ベクターにクローニングされ得る。当業者に周知の標準的な調節配列が、標的細胞中での発現を確実にするためにベクターに含まれる。いくつかのベクターエレメントが必要とされる：ミニ遺伝子の挿入のための下流のクローニング部位を有するプロモーター；効率的な転写の終結のためのポリアデニル化シグナル；E．coli複製起点；およびE．coli選択マーカー（例えば、アンピシリンまたはカナマイシン耐性）。多数のプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（hCMV）プロモーター）が、この目的のために使用され得る。他の適切なプロモーター配列については、米国特許第5,58 0,859号および同第5,589,466号を参照のこと。さらなるベクターの改変が、ミニ遺伝子の発現および免疫原性を最適化するために所望され得る。いくつかの場合、イントロンが、効率的な遺伝子発現のために必要とされ、そして１つ以上の合成または天然に存在するイントロンが、ミニ遺伝子の転写領域に取りこまれ得る。mRNA安定化配列の包含もまた、ミニ遺伝子の発現を増大させるために考慮され得る。免疫刺激配列（ISSまたはCpG）がDNA ワクチンの免疫原性において役割を果たすことが、最近報告されている。これらの配列は、免疫原性を増強することが見出される場合、ミニ遺伝子のコード配列の外側に、ベクター中に含まれ得る。いくつかの実施態様において、エピトープをコードするミニ遺伝子の産生を可能にするための二重シストロン性(bicistronic)発現ベクター、および免疫原性を増強するかまたは減少させるために含まれる第２のタンパク質が使用され得る。同時発現される場合に有利に免疫応答を増強し得るタンパク質またはポリペプチドの例として、サイトカイン（例えば、IL2、IL12、GM-CSF）、サイトカイン誘導性分子（例えば、LeIF）、または同時刺激性分子が挙げられる。本発明のHT Lエピトープは、細胞内標的化シグナルに連結され得、そしてCTLエピトープと別に発現され得る。このことは、CTLエピトープとは異なる細胞区画へのHTLエピトープの指向を可能にする。必要とされる場合は、これは、MHCクラスII経路へのH TLエピトープのより効率的な進入を促進し得る。それによって、CTL誘導を改良する。CTL誘導とは対照的に、免疫抑制性分子（例えば、TGF-β）の同時発現による免疫応答の特異的な減少は、特定の疾患において有利であり得る。一旦、発現ベクターが選択されると、ミニ遺伝子は、プロモーターの下流のポリリンカー領域にクローニングされる。このプラスミドは、適切なE．coli株に形質転換され、そしてDNAは、標準的な技術を使用して調製される。ミニ遺伝子の方向およびDNA配列、ならびにベクター中に含まれる他のエレメントは、制限マッピングおよびDNA配列分析を使用して確認される。正確なプラスミドを有する細菌細胞が、マスター細胞バンク(bank)および作業細胞バンクとして保存され得る。プラスミドDNAの治療的な量は、E．coliにおける発酵、続く精製によって産生される。作業細胞バンクに由来するアリコートが、発酵培地（例えば、Terrific Broth）を接種するために使用され、そして周知の技術に従って、振盪フラスコまたはバイオリアクターにおいて飽和するまで増殖される。プラスミドDNAは、Q uiagenより提供される固相アニオン交換樹脂のような、標準的な生物分離技術を使用して精製され得る。必要とされる場合は、スーパーコイルDNAが、ゲル電気泳動または他の技術を使用して、開環および直鎖状形態から単離され得る。精製されたプラスミドDNAが、種々の処方物を使用して注射のために調製され得る。これらのうち最も単純なものは、滅菌のリン酸緩衝化生理食塩水中での凍結乾燥したDNAの再構成である。種々の方法が記載されており、そして新規の技術が利用可能となり得る。上記のように、核酸は、カチオン性脂質とともに好都合に処方される。さらに、糖脂質、fusogenicリポソーム、防御的、相互作用的、非縮合(non-condensing)（PINC）として総称的に呼ばれるペプチドおよび化合物がまた、安定性のような可変性、筋肉内分散に影響を与えるか、または特異的な器官または細胞型を通過するように、精製されたプラスミドDNAに対して複合体化され得る。標的細胞の感作が、ミニ遺伝子によってコードされるCTLエピトープの発現およびMHCクラスＩ提示のための機能的アッセイとして使用され得る。プラスミドD NAは、標準的なCTLクロム放出アッセイのための標的として適切な、哺乳動物細胞株中に導入される。使用されるトランスフェクション法は、最終的な処方物に依存する。エレクトロポレーションは、カチオン性脂質が直接的なインビトロでのトランスフェクションを可能にするにもかかわらず、「裸の」DNAについて使用され得る。緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するプラスミドが、蛍光活性化細胞分類（FACS）を使用してトランスフェクトされた細胞の富化を可能にするために、同時トランスフェクトされ得る。次いで、これらの細胞は、クロム-51で標識され、そしてエピトープ特異的CTL株の標的細胞として使用される。51Crの放出によって検出される細胞溶解は、ミニ遺伝子によってコードされるCTLエピトープのMHC提示の産生を示す。インビボでの免疫原性は、ミニ遺伝子DNA処方物の機能的試験のための第２のアプローチである。適切なヒトMHC分子を発現するトランスジェニックマウスが、DNA産物で免疫化される。投与の用量および経路は、処方物に依存する（例えば、PBS中のDNAについてはIM、脂質複合体化DNAについてはIP）。免疫の21日後、脾臓細胞を回収し、そして試験される各エピトープをコードするペプチドの存在下で１週間再刺激する。これらのエフェクター細胞（CTL）を、ペプチドを載せたクロム-51標識化標的細胞の細胞溶解について、標準的な技術を使用してアッセイする。ミニ遺伝子によってコードされるエピトープに対応するペプチドの MHC負荷によって感作された標的細胞の溶解は、CTLのインビボ誘導のためのDNA ワクチン機能を実証する。固形の組成物について、従来の非毒性の固形のキャリアが使用され得る。これは例えば、薬学的グレードの、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどを含む。経口投与について、薬学的に受容可能な非毒性の組成物が、任意の通常使用される賦形剤（例えば、上記に列挙されるキャリア、および一般的に10〜95％の有効成分、すなわち、本発明の１つ以上の結合体、そしてさらに好ましくは、25％〜75％で）を取りこむことによって形成される。エアロゾル投与について、ペプチドは、好ましくは、界面活性剤および噴霧剤とともに細かく分けられて供給される。結合体の代表的な割合は、0.01％〜20％重量であり、好ましくは、１％〜10％である。界面活性剤は、もちろん、非毒性であり、そして好ましくは、噴霧剤に可溶性でなければならない。このような薬剤の代表的なものは、６〜22個の炭素原子から構成される脂肪酸のエステルまたは部分的なエステル（例えば、脂肪族多価アルコールまたはその環状の無水物を有する、カプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレスチン酸(olesteric acid)、およびオレイン酸）である。混合されたエステル（例えば、混合されたまたは天然のグリセリド）が使用され得る。界面活性剤は、組成物の重量の0.1％〜20％を構成し得、好ましくは、0.25〜５％を構成する。組成物の平衡は、通常、噴霧剤である。キャリアがまた、所望される場合は、例えば、鼻腔内送達のためのレシチンとして含まれ得る。別の局面において、本発明は、本明細書中で記載されるような、免疫原性DRペプチドまたはCTL/DRペプチド結合体またはそれらをコードする核酸の、免疫原的に有効量の有効成分として含む、ワクチンに関する。結合体（単数または複数）が、それ自身のキャリアに連結されて、または活性なペプチドユニットのホモポリマーまたはヘテロポリマーとして、ヒトを含む宿主に導入され得る。このようなポリマーは、増大した免疫学的反応の利点を有し、そして、ポリマーを作製するために異なるペプチドが使用される場合、ウイルスまたは腫瘍細胞の異なる抗原決定基と反応する抗体および／またはCTLを誘導するさらなる能力を有する。有用なキャリアがまた当該分野で周知であり、そして例えば、サイログロブリン、アルブミン（例えば、ウシ血清アルブミン）、破傷風毒素、ポリアミノ酸（例えば、ポリ（リジン：グルタミン酸））、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルス組換えワクチンなどが上げられる。ワクチンはまた、例えば、水、リン酸緩衝化生理食塩水、または生理食塩水のような生理学的に寛容な（受容可能な）希釈剤を含み、そしてさらに代表的にはアジュバントを含む。不完全なフロイトのアジュバントのようなアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、またはミョウバンが、当該分野で周知の物質である。そして、上記に記載されるように、CTL応答は、脂質（例えば、P₃CSS）に対して本発明のペプチドを結合させることによって感作され得る。本明細書中に記載されるようなペプチド組成物での、注射、エアロゾル、経口、経皮、または他の経路を介する免疫化の際に、宿主の免疫系は、所望される抗原に特異的な大量のCTLを産生することによってワクチンに応答する。そして宿主は少なくとも部分的に後の感染に対して免疫となるか、または慢性の感染の発症に対して耐性となる。本発明のDRペプチドを含有するワクチン組成物は、疾患（例えば、抗原に対する免疫応答を誘発し、従って患者の自己の免疫応答能力を増強するウイルス感染またはガン）を罹患しやすいか、またはそうでなければ疾患の危険性を有する患者に、例えば、^**に記載されるCTLエピトープを用いて投与される。このような量は、「免疫原的に有効な用量」として規定される。この使用において、正確な量は再度、患者の健康状態および体重、投与の様式、処方物の性質などに依存するが、一般的には、70kgの患者あたり約1.0μgから約5000μgの範囲であり、そして一般的には、70kgの体重あたり約10μgから約500μgである。いくつかの場合、本発明のペプチドワクチンを、目的のウイルス（特に、ウイルスエンベロープ抗原）に対する中和抗体応答を誘導するワクチンと組み合わせることが所望され得る。例えば、PADREペプチドは、可能性を増大するかまたは集団の適用範囲を広げるためにヘルペスワクチンと組み合わされ得る。この様式びEngerix-B（Smith-Kline）が挙げられる。治療または免疫目的のために、本発明のペプチドがまた、ワクシニアまたは鶏痘のような弱毒化されたウイルス宿主によって発現され得る。このアプローチは、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するためのベクターとしてのワクシニアウイルスの使用を含む。急性または慢性の感染した宿主への導入、または未感染の宿主への導入の際に、組換えワクシニアウイルスは、免疫原性ペプチドを発現し、それによって宿主のCTL応答を誘発する。免疫化プロトコールにおいて有用なワクシニアベクターおよび方法が、例えば、本明細書中で参考として援用される米国特許第4,722,848号に記載されている。別のベクターはB CG（Bacille Calmette Guerin）である。BCGベクターは、本明細書中で参考として援用されるStoverら、Nature 351、456-460（1991）に記載されている。本発明のペプチドの治療的投与または免疫化のために有用で広範な種々の他のベクター（例えば、Salmonella typhiベクターなど）が、本明細書の記載から当業者に明らかである。抗原性結合体は、エキソビボでCTLを十分に誘発するために使用され得る。得られるCTLは、他の従来の治療形態には応答しないか、または治療のペプチドワクチンアプローチには応答しない、患者の慢性的な感染（ウイルスまたは細菌）または腫瘍を処置するために使用され得る。特定の病原体（感染性薬剤または腫瘍抗原）に対するエキソビボのCTL応答が、抗原提示細胞（APC）および適切な免疫原性ペプチドの供給源とともに患者のCTL前駆細胞（CTLp）の組織培養物中でインキュベートすることによって誘導される。CTLpが活性化され、そして成熟し、そしてエフェクターCTLに拡大される適切なインキュベーション時間後（代表的には、１〜４週間）、細胞を患者に注射して戻し、ここでこれらは、それらの特異的標的細胞（感染した細胞または腫瘍細胞）を破壊する。本発明のペプチドはまた、モノクローナル抗体を作製するために使用され得る。このような抗体は、可能性のある診断薬または治療剤として有用であり得る。ペプチドはまた、診断試薬としての使用を見出され得る。例えば、本発明のペプチドは、ペプチドまたは関連するペプチドを使用する処置レジメに対して特定の固体の感受性を決定するために使用され得る。従って、これは、罹患した個体について、既存の処置プロトコールを改変することにおいて、または予後の決定において有用であり得る。さらに、ペプチドはまた、どの個体が慢性の感染を発症する実質的な危険性を有するかを予想するために使用され得る。実施例材料および方法細胞。以下のエプスタインバーウイルス（EBV）で形質転換された同種接合性細胞株を、ヒトHLAクラスII分子の供給源として使用した：LG2［DRB1c0101(DR1) 1；GM3107［DRB50101(DR2w2a)］；MAT（DRB10301(DR3)1；PREISS［DRB10401(DR4 w4)1；BIN40［DRB10404(DR4w14)1；SWEIG[DRB11101(DR5w11)]；PITOUT［DRB1070 1(DR7)］(a)；KT3[DRB10405(DR4w15)]；Herluf[DRB11201(DR5w12)]；H0301[DRB1 1302(DR6w19)]；OLL[DRB10802(DR8w2)]；およびHTC9074[DRB10901(DR9)、Paul H arris博士、Columbia Universityの好意によって提供された]。いくつかの場合には、トランスフェクトされた繊維芽細胞を使用した：L466.1［DRB11501（DR2w 2b）］；TR81.19［DRB30101（DR52a）］；およびL257.6［DRB40101（DRw53）］。（Villiら、J．Clin．Invest．91：616（1993）。細胞を、２mMのL-グルタミン［GIBCO，Grand Island，NY］、50μMの2-ME、および10％の熱不活化FCS［Irv ine Scientific，Santa Ana，CA］を補充したRPMI 1640培地で培養することによってインビトロで維持した。細胞をまた、100μg/mlのストレプトマイシンおよび100U/mlのペニシリン［Irvine Scientific］で補充した。大量の細胞を攪拌培養で増殖させた。細胞を、１％のNP-40［Fluka Biochemika，Buchs，Switzerland］、１mMのPMS F［CalBioChem，La Jolla，CA］、５mMのNa-オルトバナデート(orthovanadate) 、および25mMのヨードアセトアミド［Sigma Chemical，St．Louis，Mo］を含有するPBS中で10⁸細胞／mlの濃度で溶解させた。10,000×gで20分間の遠心分離によって、溶解物から破片および核を除去した。 HLA-DR分子の親和性精製。クラスII分子を、以前に記載されるように（Setteら、J．Immunol．142：35（1989）およびGorgaら、J．Biol．Chem．262：16087（1 987））、Sepharose 4Bビーズに結合させたmAb LB3.1を使用してアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。溶解物を、0.8および0.4μMのフィルターを通過させて濾過し、次いで抗DRカラム上を通過させた。次いでこれを、１％の NP-40、PBS中の10mMのTRISの15カラム用量で洗浄し、そして0.4％のn-オクチルグルコシドを含有するPBSの２カラム用量で洗浄した。最後に、DRを、0.4％のn- オクチルグルコシド（pH11.5）を含有する0.15MのNaCl中の50mMのジエチルアミンで溶出した。1/25用量の2.0MのTris（pH6.8）を、約8.0のpHに低下するまで溶出物に添加し、次いで、Centriprep 30濃縮機で2000rpmでの遠心分離によって濃縮した(Amicon，Beverly，MA)。クラスIIペプチド結合アッセイ。13個の異なる特異的DRペプチドアッセイのパネルを、本研究で利用した。これらのアッセイによって、ほぼ一般的なDR対立遺伝子の代表的なものであるとして選択した。表Ｉは、各DR抗原について、利用される代表的な対立遺伝子産物、DRの供給源として利用される細胞株、およびアッセイで利用される放射標識されたプローブを列挙する。精製したヒトクラスII分子［５〜500nM］を種々の未標識のペプチドインヒビターおよび１〜10nMの¹²⁵I放射標識したプローブペプチドとともに、５％のDMSOを含有するPBS中でプロテアーゼインヒビター反応混液の存在下でインキュベートした。使用した放射標識したプローブは、HA Y307-319（DRI）、破傷風毒素［TT］830-843（DR2w2a、DR5w1 11、DR7、DR8w2、DR8w3、DR9）、MBP Y85-100（DR2w2b）、TT1272-1284（DR52a ）、FをDR3で置換したY7を有するMT 65kD Y3-13、配列YARFQSQTTLKQKTを有する非天然のペプチド（DR4w4、DR4w15、DRw53）（Valliら、前出）、ならびにDR5w1 2について、細胞株C1Rから溶出された天然にプロセスされたペプチド、EALIHQLI NPYVLS（DR5w12）およびDR6w19について、650.22ペプチド（TT 830-843 A→S836 アナログ）。放射標識したペプチドを、クロラミン-T法を使用してヨウ素化した。ペプチドインヒビターを代表的には、1201μg/mlから1.2ng/mlの範囲の濃度で試験した。次いで、データをプロットし、そして50％阻害（IC50）を生じる用量を測定した。適切な化学量論条件下で、精製したDRに対する未標識の試験ペプチドのIC50は、相互作用の親和性（Kd）の合理的な近似である。ペプチドを、２から４個の完全に独立した実験において試験した。プロテアーゼインヒビターの最終的な濃度は以下のとおりである：１mMのPMSF、1.3nMの1.10フェナントロリン、73μMのペプスタチンA、8mMのEDTA、および200μMのNα-p-トシル-L-リジンクロロメチルケトン（TLCK）［全て、CalBioChem、La Jolla，CAによるプロテアーゼインヒビター］。インキュベーション混合物中の最終界面活性剤濃度は、0.05％のNonidetP -40であった。アッセイを、DR3を除いてpH7.0で行った。DR3は、pH4.5で行い、そしてDRw53はpH5.0で行った。pHを、以前に記載されるように調節した（Sette ら、J．Immunol．148：844（1992））。クラスIIペプチド複合体を、TSK2000カラム（TosoHaas 16215，Montgomeryvil le，PA）上でのゲル濾過によって遊離ペプチドから分離した。そして結合したペプチドの画分を、以前に記載されるように計算した（Setteら（1989）前出）。予備実験において、DR調製物を、全放射活性の10〜20％が結合するために必要とされるクラスII分子の濃度を決定するために、放射標識したペプチドの固定した量の存在下で力価測定した。全ての続く阻害および直接的な結合アッセイを、これらのクラスII濃度を使用して行った。 DR4w15、DR6w19、DR8w2、DE8w3、およびDR9アッセイのDRBI特異性。精製のために使用される抗体がα-鎖特異的であるので、β1分子は、β3（および／またはβ4およびβ5）分子からは分離されない。DRβ鎖の特異性に関するアッセイの開発および確認は、上記（108）に列挙される多くのDR対立遺伝子について他の場所に詳細に記載されている。本明細書中で本発明者らは、DR4w15、 DR6w19、DR8w2、DR8w3、およびDR9アッセイについて初めて記載する。これらの新規のアッセイのβ鎖特異性に取り組む実験が、この節に記載される。 DR4w15。β4産物DRw53はDR4w15と同時発現され、そしてDR4w15およびDRw53結合アッセイの特異性の決定は、同じ放射標識したリガンドがDR4w15およびDRw53 結合アッセイの両方に使用される点で、複雑である。代表的に、β1鎖が他のβ 鎖よりも５〜10倍高いレベルで発現され、そして全ての結合アッセイが限定量の DRを利用して行われるので、アッセイで検出される優性な特異性はDR4w15であると予想される。実際にこれが真実であることを確認するために、推定のDR4w15特異的アッセイにおける58個の異なる合成ペプチドのパネルの結合パターンと、DR w53特異的アッセイにおいて得られるもの（クラスII分子の供給源としてDRw53線維芽細胞を使用する）とを比較した。２つの非常に異なる結合パターンに注目した。いくつかの例において、ペプチドは、１つのDR分子に高い親和性で結合し、そして他の分子には結合しなかった（データは示さない）。 DR6w19。DR6w19アッセイには、DRB30301（DR52a）を同時発現する、EBVで形質転換したホモ接合型細胞株H0301をクラスII分子の供給源として利用する。DR6w1 9アッセイで使用した放射標識したリガンドはDR52aアッセイで使用したものとは異なるが、リガンドは、高親和性DR52aバインダーに関連する（すなわち、単一の置換アナログである）。DR4w15の場合に行ったように、アッセイの特異性を、 DR6w1およびDR52aに対する天然に存在するペプチドのパネルの結合能力を分析することによって調査した。２つのアッセイは、完全に異なる結合特異性を実証した。例えば相対的な結合に関して、TT 1272-1284は、DR16w19アッセイにおけるよりもDR52aアッセイにおいて63倍良好に結合する。逆に、不変鎖ペプチドは、D R6w19アッセイにおいてよりも189倍良好に結合する。まとめると、これらのデータは、H0301細胞株に由来する精製された推定のクラスII MHCに対する放射標識したペプチド650.22の結合が、DR6w19について特異的であることを実証した。 DR8w2およびDR8w3。DR8w2およびDR8w3アッセイのβ1特異性は、β3（ならびに／またはB4およびβ5）分子が発現されない点で、明らかである。 DR9。DR9アッセイの特異性は、TT 830-843放射標識プローブペプチドがDRw53 分子に結合しないことを示した以前の研究（Alexanderら、Immunity 1：751（19 94））によって推定される。結果 DR制限Ｔ細胞によって認識される抗原性ペプチドのDR結合親和性生物学的に有意であると考えられる、DR結合親和性の閾値を規定するために、本発明者らは、所定のＴ細胞エピトープのDR制限の32個のパネルの報告例の親和性を編集した。約半分の場合において、DR制限は、100nM未満の親和性で会合し、そして他方の例の半分において、100〜1000nMの範囲のIC50％で会合した。32 の場合のうちわずかに１つ（3.1％）で、DR制限が1000nM以上のIC50％で会合した。親和性のこの分布は、エピトープの大部分が50nM以下のIC50%で結合した、以前に報告されたHLAクラスＩエピトープの分布（Setteら、JI，1994）とは異なることに注目した。この比較的低い親和性のクラスII制限エピトープ相互作用は、一般的に、クラスII制限Ｔ細胞の活性化がクラスＩ制限Ｔ細胞と比較してさらに抗原を必要とするという理由を説明し得る。まとめると、この分析によって、1000nMが、DR分子の状況における免疫原性に関連する親和性閾値として規定され得、そしてこの理由のために本発明者らの研究のための適切な標的であると、示唆された。 P1およびP6アンカーはDRB10401結合に必要であるが、十分ではないいくつかの独立した研究によって、Ｎ末端ペプチドの近傍で、かつ９残基のコア領域（残基１〜９）の１位の大きな芳香族または疎水性残基のDRB10401結合における重要な役割が指摘されている。さらに、重要な役割は、この９残基のコア領域の６位（P6）の残基について実証されている。短いおよび／または疎水性残基は、一般的に、この位置が好ましい（O'Sullivanら、JI 147：2663，1991；Se tteら、JI 151：3163，1993；Hammerら、Cell 74：197，1993およびMarshallら、JI 154：5927，1995）。一連の本実験において、384個のペプチドのライブラリーを、DRB10401結合能力について分析し、そしてP1-P6モチーフの存在についてスクリーニングした（すなわち、P1中のF、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、またはＭ、およびP6中のＳ、Ｔ、Ｃ、Ａ、Ｐ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、またはＭ、ペプチドのＣ末端から少なくとも９残基離れる）。この384個のペプチドのセットには、総計80個のDR4w4バインダー（特に27 個の良好なバインダー［100nM以下のIC50］、および53個の中程度のバインダー［100〜1000の範囲のIC50］が含まれていた。80個のDE4w4バインダーのうちの77 個（96％）がP1-P6モチーフを有した。しかし、ほとんどのDR4w4非結合ペプチドもまたP1-P6モチーフを含んでいたことに注目するべきである。本発明者らのデータベースに含まれる384個のペプチドのうち、わずかに125個が、「P1-P6陰性」であった。「P1-P6陰性」ペプチドの77/259（30％）とは対照的に、それらのわずかに３つ（６％）が、精製されたDR4w4に対して評価される程度に結合した。従って、これらの結果は、DRB10401結合のためには適切なP1およびP6アンカーの存在が必要であるが、十分ではないことを実証する。 DRB10401ペプチド相互作用の詳細なマップ次に、各P1-P6が整列されたコア領域について、このストラテジーがペプチドクラスＩ相互作用を精査するために以前に利用したのと同様に、特定の残基を有するペプチドの平均的な結合親和性を、群の残りと比較して、各位置について計算した。この方法に従って、平均の相対結合（ARB）値の表を編集した。この表はまた、主要なP1-P6アンカーと比較して特定の位置を占有する場合の（図１）D RB10401結合能力に対する、20個の天然に存在するアミノ酸のそれぞれのポジティブまたはネガティブな影響のマップも表す。４倍を超えるARB値の変化（ARB≧４または≦0.25）を、DRペプチド相互作用に対する所定の残基の有意かつ二次的影響の指標であると恣意的に考えた。ほとんどの二次的影響は、４位、７位、および９位に関連した。これらの位置は、DR分子上の浅いポケットとかみ合う２次アンカーに対応した。さらに、有意な二次的影響が、３位のＭ（ARB＝12.8）、３位のＴ（ARB＝4.34）、および５位のＩ（AR B＝4.4）について検出された。 DRB10401特異的アルゴリズムの開発次に、ARBの表を利用して、DRB10401特異的アルゴリズムを開発した。0401結合性向を推測するために、それぞれ整列したP1-P6配列を、各位置について、適切なアミノ酸のARB値を乗ずることによってスコア付けした。この手順に従って、数値「アルゴリズムスコア」を導いた。複数のP1-P6整列が可能である場合、結合スコアを、それぞれについて計算し、そして最良のスコアを選択した。0401 の結合能力を推測することにおけるこの方法の効率を、表IIaに示す。 -17.00を超えるアルゴリズムスコアを有するペプチドだけを考慮することで、推定するペプチドのセットを156に減少させた。このセットはなお、全80個の高いまたは中程度のDRバインダーのうち72個（90％）を含んでいた。カットオフを -16.44またはそれ以上のアルゴリズムスコアに上昇させることによって、80個の DR4w4結合ペプチドのうちの60個（75％）の同定が可能となった。107個のペプチドのセット全体のうち、それらの25個が、良好なまたは中程度のいずれかのバインダーであった。言いかえると、予想したように、アルゴリズムスコアの厳密性を増大させることによって、セット中に存在する、より小さな割合の全バインダーが予測されるが、同時により少ない擬陽性ペプチドが同定される。 DRB10401特異的アルゴリズムの推定の能力のブラインドテスト本発明者らのアルゴリズムの推定能力が、アルゴリズム自体を試験および規定するための同じデータのセットを利用したことの里なる反映でないことを確認する為に、本発明者らは、さらに、ブラインド推定試験においてその効率を試験した。この目的のために、本発明者らは、その結合親和性は既知であるが、アルゴリズムの誘導において利用されなかった50個のペプチドの独立したセットに由来するデータを利用した。表IIbに示すように、アルゴリズムは、この独立したペプチドのセットのDR4w4結合能力を推定することにおいて有効であった。-17.00 のアルゴリズムスコアによって、総計18個のペプチドが同定された。このセットには、試験した50個のペプチド全体のうち、３個の全ての良好なバインダーのうちの３個（100％）、および11個の全ての中程度のバインダーのうちの８個（70 ％）が含まれていた。カットオフ値を-16.44に増大させることによって、９個のペプチドのセットが同定された。それらのうちの７個（78％）は、良好なまたは中程度のバインダーのいずれかであった。このセットは、ブラインド推定ペプチドセットに含まれた14個のバインダーのうちの７個（50％）を含んだ。まとめると、これらのデータは、上記のDR4w4特異的アルゴリズムの有効性を支持する。 DRB10401、DRB10101、およびDRB10701ペプチド結合特異性の詳細なマップ次に、本発明者らは、DR4w4アルゴリズムを規定するために利用した384個のペプチドの同じセットについて、精製されたDR1およびDR7分子に対する結合を分析した。このセットは、DR1およびDR7対立遺伝子についてそれぞれ120個および59 個のバインダーを含むことを見出した。総計158個のペプチドが、DR1、DR4w4、またはDR7のいずれかに結合し得た。これらはまた、高い割合（73/158；46％）で、縮重バインダーであり、従って、これらは、３つの対立遺伝子の２つ以上に結合するとさらにみなした。さらに、本発明者らは、90％を超えるDR1またはDR7 の良好なおよび中程度のバインダーがP1-P6モチーフを有したことを見出した。最も重要なことは、73個の縮重DRバインダーのうちの72個（99％）がこのモチーフを有していた（データは示さない）。まとめると、この分析は、P1-P6に基づくアルゴリズムが、縮重DRバインダーを効率良く予想するために利用され得ることを示唆する。 DR4w4分子についての上記と同様に、特異的アルゴリズムを、DR1およびDR7対立遺伝子について設計した。図2Aおよび2Bは、この方法に従って規定された対立遺伝子特異的マップを詳述する。 DRB10401の場合と同様に、ほとんどの二次的影響は、４位、７位、および９位に関係した。４位は、特にDR1場合に顕著であった。一方、７位は、DR7の最も顕著な２次アンカーであった。特異的アルゴリズムを、これらのマップに基づいて開発し、そして75％または90％のバインダーを予想するために必要なカットオフ値がそれぞれ、DR1ついて-19.32および-20.28であり、そしてDR7について20.91 および-21.63であることを見出した。選択される特定の対立遺伝子またはカットオフ値に依存して、40〜60％の推定されるペプチドが、実際に良好または中程度のバインダーであった（データは示さない）。 DR1-4-7組み合わせアルゴリズムの開発最後に、本発明者らは、組み合わせアルゴリズムによって縮重バインダーを推定し得るかどうかを試験した。この目的のために、本発明者らのデータベースにおける384個のペプチドの配列を、３つの（DR1、4w4、および７）特異的アルゴリズムを用いて同時にスクリーニングした。100個（75％のカットオフを使用する）ものペプチドが、考慮される２つまたは３つかのいずれかの対立遺伝子に結合することを推定した。このセットには、実際に縮重1-4-7結合（１つを超えるD R1、4w4、または７対立遺伝子に結合する能力として規定される）し得る73個のペプチドのうちの59個（81％）が含まれていた（表III）。 DR特異性の標的セットの規定、世界人口の代表上記の節で示されるデータは、複数のDR対立遺伝子に結合し得るペプチドが組み合わせ「1-4-7」アルゴリズムの使用によって同定され得る方法を例示する。次に、本発明者らは、縮重1-4-7結合作用を示すペプチドがまた、他の共通のDR 型に十分に結合するかどうかを試験することを望んだ。本発明者らの実験ストラテジーにおいて最初の工程として、本発明者らは、民族集団起源に拘わらず、世界人口の高い割合（≧80％）の代表的な標的DR型のセットを規定することを考えた。この目的のために、７個のさらなるDR抗原を考慮した。本研究で考慮したそれぞれ１個のDR抗原について（DR1、４、および７を含む）、最も最近のHLA研修会（第11回、1991）に従って種々の民族における推定頻度を、これまでに同定した主要なサブタイプとともに表IVaに示す。種々のDR分子に対するペプチドの結合親和性を測定する目的のために、各DR抗原について１つの代表的なサブタイプを選択した（表Ｉ）。ほとんどの抗原について１つのサブタイプがはるかに最も豊富であるか、あるいは別の最も豊富な各 DR抗原のサブタイプによって提示される結合パターンにおいて有意な程度の類似性がおそらく存在するかのいずれかであることが、注目されるべきである（表IV bの注釈の欄を参照のこと）。この一般的傾向に対する１つの例外は、それに対する0401と0405と間のペプチド特異性における有意な差異が報告されているDR4 抗原によって代表される。両方の対立遺伝子が極めて頻出するので（それぞれ、コーカサス人および東洋人において）、本発明者らは、代表的なDR結合アッセイのセットにDR 0401および0405の両方を含ませた。本発明者らの代表的なアッセイのセットはほとんど、遺伝子の対立遺伝子産物に焦点を当てる。なぜなら、これらの分子は、最も豊富に発現されるようであり、従ってこれまで分析されたほとんどのヒトクラスIII応答の優性な制限エレメントとして作用し、そして最も容易に利用可能な血清学およびDNAの型決定のための正確な方法であるからである。しかし、本発明者らはまた、本発明者らの分析アッセイにおいて、DRB3/4/5分子の代表種を考慮した（表IVc）。これらの分子は、機能的な制限エレメントとして作用し、そしてそれらのペプチド結合特異性は、いくつかの共通のDRβ₁対立遺伝子産物の特異性に対して特定の類似性を有することが以前に示されている。 DR縮重バインダーの推定のための一般的なストラテジー 1-4-7組み合わせアルゴリズムによってまた、他の共通のDR型に対する縮重結合を推定するかどうかを試験するために、本発明者らは、精製されたHLA DR分子のパネルに結合する合成ペプチドの３つの異なる群の能力を測定した。この３つの異なるペプチドのセットは以下のとおりである：Ａ）組み合わせ1-4-7アルゴリズムで陽性とはスコア付けされなかった36個のペプチド（推定ではない）、Ｂ）1-4-7アルゴリズムについて、75％のカットオフレベルで陽性とスコア付けされたが、実際の試験の際には縮重1-4-7バインダーでないことが見出された（「誤った」推定）36個のペプチド、およびＣ）1-4-7アルゴリズムで陽性とスコアされ、そして実験的な試験の際に、実際に1-4-7縮重バインダーであることが証明された、29個のペプチド（正しい推定）。この分析の結果を、表Ｖに示す。「推定ではない」ペプチド（表Va）のうち34個のうちの３個（９％）のみが、少なくとも２つの、DR1、4w4、または７分子に結合した。興味深いことに、３個のこれらのペプチドのうちの２個（1136.04および1136.29）がまた、比較的交差反応性であり、そしてさらにDR型（1136.04の場合、DR2w2 β2、DR4w15、5w11、および8w2、ならびに1136.29の場合、2w2 β2、4w15、9および5w12）に結合した。「誤った推定」のペプチドのセットに由来するペプチド（表V5）は、その名の通り、多くてたった１つのDR1、4w4、またはDR7分子に結合し、そして縮重性に乏しいか、または全３個のDR分子に結合するわずか２つのペプチド（1136.22 および1188.35）を有する他のDR型であった。このペプチドのセットにおいて、試験したDR分子の４つ以上に結合するペプチドはなかった（データは示さない）。これらの結果は、組み合わせ1,4,7アルゴリズムの使用によって最初に推定されたペプチドに対応するペプチドのセットで得られ、次いで、縮重DR1-4-7結合であることが実験的に見出されたデータと対照的である。試験した29個のペプチドのうちの14個（48％）が、総計５個以上の対立遺伝子に結合した。これらのうちの４個（1188.16、1188.32、1188.34、およびF107.09）が、顕著に縮重であり、そして試験した11個のDR分子のうちの総計９個に結合した。まとめると、これらの結果は、組み合わせDR1,4,7アルゴリズムおよび定量的DR1,4,7結合アッセイの連続的な使用に基づくストラテジーが、広範に交差反応性のDR結合ペプチドを同定するために利用され得ることを示唆する。 HLA-DR1-4-7スーパータイプの定義上記に示されるデータはまた、いくつかの共通のDR型が、大部分重複するペプチド結合レパートリーによって特徴づけられることを示唆する。この問題を、実際のDR1-4-7縮重バインダーであった表Vaおよびbに由来する32個のペプチドの結合パターンを分析することによって、より詳細に分析した。それらのうちの31個（97％）がDRIに結合し、22個（69％）がDR4w4に結合し、そして21個（66％）が DR7に結合した。これらのファイルは、非縮重結合ペプチドのままであるもののなかで観察される低い結合の割合と対比される（DR1、4w4、および７について、それぞれ、17/67（25％）、8/67（12％）、および7/67（10％））（表VII）。興味深いことに、1-4-7縮重バインダーの大きな画分もまた、特定の他の共通のDR型に結合した。16個（50％）がDR2w2aに結合し、18個（56％）がDR6w19に結合し、18個（56％）がDR2w2bに結合し、そして20個（62％）がDR9に結合した。全ての場合において、非1-4-7縮重ペプチドのセットの結合頻度ははるかに低かった（表VIII）。明らかに、低いにもかかわらず、交差反応の頻度はまた、DR4w15、DR5w11、およびDR8w2について注目された（28から37％の範囲）。最後に、無視できるレベルの交差反応が、DR3および5w12、およびDR53の場合において観察された。さらなる研究は、これらの２つの群の分子のいずれか（一方についてはDR4w15、5w11 、および8w2、ならびに他方については、DR3、DR53、および5w12）が種々のDRスーパータイプに属し得るかどうかについて言及する。まとめると、これらのデータは、DR1、4w4、2w2a、2w2b、７、９、および6w19 を含むDR分子が、大部分重複するペプチド結合レパートリーによって特徴付けられることを実証する。考察本発明の報告において、本発明者らは、広範な種のなかで共通のDR型の代表である、13個の異なるDR分子のセットのペプチド結合特異性を分析した。二次的なアンカーおよび二次的な相互作用の詳細なマップが、それらの３つについて誘導された（DR4w4、DR1、およびDR7）。さらに、本発明者らは、少なくとも７個のD R型のセットがペプチド結合レパートリーを共有することを実証した；そして結果として、広範な縮重HLA DR結合ペプチドが比較的共通して出現することを実証した。本研究はまた、このような縮重ペプチドの同定の作業を大いに補助するはずである、コンピューター化された手順を記載する。本発明者らは、ペプチド−クラスII相互作用の本発明者らの現在の理解の状況、および最近記載されたクラスIスーパーモチーフの状況におけるデータを考察する。最後に、ワクチンの設計に基づくエピトープについての、広範な縮重クラスIIエピトープの可能性のある関係もまた考慮されるべきである。第１に、本発明者らは、本研究で分析した（データは示さない）DR4w4、DR1、 DR7、および他のDR型のほとんどに対して良好な親和性で結合するペプチドの大部分を、O'Sullivanらによって最初に提唱された方法と一致するP1-P6モチーフによって、すべてを特徴付ける方法を説明する。DR-1ペプチド複合体の結晶学的分析によって、これらの位置を占有する残基が、最も重要なアンカー残基および最も深い疎水性ポケットに対応するP1位を有して、DR1分子上の２つの相補的ポケットとかみ合うことを明らかにした。本発明者らの分析はまた、他の「二次的アンカー」位置が対立遺伝子特異的様式ペプチド結合能力に劇的に影響を与える方法を説明する。４位はDR1結合に、９位はDR4w4に、そして７位はDR7に特に重要であることが見出された。これらのデータは、このような対立遺伝子特異的アンカーを最初に記載した以前の結果と一致し、そしてこれらの残基がDR分子上の浅いポケットとかみ合う方法を説明する結晶学的データと一致する。第２に、本発明者らの研究は、結合能力を予想するための定量的アルゴリズムの定義を可能にする大きなペプチドライブラリーの平均の相対結合値のアラインメントおよび計算に基づくアプローチの方法を説明する。本研究は、２つの他の共通のHLA-DR型に対するこれらの観察に拡大し、そして1-4-7アルゴリズムの組み合わせ使用が広範な縮重DR結合ペプチドを同定することを補助し得る方法を説明する。本明細書中で示されるデータは、共通のDR対立遺伝子の群（少なくともDR1、D R2w2a、DR2w2b、DR4w4、DR6w19、DR7およびDR9を含む）が、大部分重複するペプチドレパートリーを共有することを示唆する。複数のDR対立遺伝子に結合し、そして複数のDR型の状況で同じエピトープを認識する縮重ペプチドは、本来、Lanz avechia，SinigalliaおよびRothbardのグループによって記載された。本研究は、DR1、DR2w2a、DR2w2b、DE4w4、DR7、DR9、DR6w19を含む、主要なHLA-DRスーパータイプ（DR1-4-7-様）に属する対立遺伝子の分類を提供する。本明細書中で示されるデータに基づいて、少なくとも２つの対立遺伝子のさらなる群が存在する。第１の群は、有意であるにもかかわらず、1-4-7-様スーパータイプ（DR4w15、 8w2、5w11）と非常に減少した重複を有する分子をコードする。第２の群の対立遺伝子（5w12、3w17、およびw53）は明らかに、1-4-7スーパータイプと関連するレパートリーをほとんど有さない。この状況において、Hammerらが、良好なDR5w 11結合ペプチドが正に荷電した、本明細書中で提唱される1-4-7スーパーモチーフを有するP6アンカー（適合性が乏しい）によってしばしば特徴付けられることに注目した事に注目することが、非常に興味深い。Sidneyらは、DR3w17が他の共通のDR型によって結合されるものから区別される大きなペプチドのセットに結合すると考えたことはまた、興味深い。さらなる研究は、上記に列挙される任意の分子がさらなるDRスーパータイプにグループ分けされ得るかどうかを決定する。本発明者らのグループは、DRのペプチド結合ポケットを内層する多型性残基の分析が、HLA DRスーパータイプの分類および予想を補助するために利用され得るかどうかを現在研究している。本発明者らは、本明細書中で記載されるHLA DRスーパータイプと、現在記載されているHLAクラスＩスーパーモチーフとの間の類似性および差異についてコメントする。クラスＩスーパーモチーフはクリアカット（clear-cut）され、そして一般に、非重複である。これらのうちの４個は、広範な集団の中でも全てほぼ等しい頻度で記載されている。対照的に、本明細書中で記載されるHLA DRスーパータイプを規定するレパートリーは、クリアカットされず、そして少なくとも一部、他の対立遺伝子のレパートリーと重複する。表ＩおよびIVで示されるデータに基づいて、他のDRスーパータイプが存在する場合でさえ、DR1-4-7は、はるかに最も豊富に提示される全体となっている。最後に、本発明者らは、エピトープに基づくワクチンの開発に関して、これらのデータの可能性のある関係を指摘する。クラスII制限HTLは、多くの重要な弛緩からの予防および疾患の停止に関係している。予防的ワクチンまたは治療用ワクチンにおける十分に定義されたクラスIIエピトープの包含は、保存されたエピトープまたは半優性エピトープに対する免疫応答の焦点を当てさせ、そして抑制性の決定を回避する。本明細書中で示される（表IV）データに基づいて、DR1-4- 7スーパータイプは、考慮される民族色に依存して50から80％の範囲で適用することが可能である。従って、広範な、および民族的に偏っていない集団適用範囲が、非常に制限されたペプチド結合特異性を考慮することによって達成され得る。上記の本発明の結果に基づいて、種々の目的の抗原の配列を、DR1-4-7モチーフの存在についてスキャンした。このアプローチを使用して同定したペプチドは、広範に交差反応性の、クラスII制限Ｔ細胞エピトープである。表VIIIは、HBV 、HCV、HIV、およびPlasmodium falciparum（Pf）に由来するこのようなペプチドの限定を示す。全146個のペプチドを同定した：DHBV由来の35個、HCV由来の16 個、HIV由来の50個、およびPf由来の45個。標準的な防御基準を、適切な場合に使用した。上記の実施例は、本発明を説明するために提供され、その範囲を限定するためではない。本発明の他の改変が、当業者に容易に明らかである。本明細書中で引用される全ての刊行物、特許、および特許出願が、全ての目的のために参考として援用される。

【手続補正書】【提出日】平成１２年１２月１４日（２０００．１２．１４）【補正内容】 6.1.請求の範囲を別紙の通り補正します。 6.2.明細書を以下の通り補正します。（１）明細書第17頁第18行に「配列YARFQSQTTLKQKTを有する」とあるのを、「配列YARFQSQTTLKQKT（配列番号５）を有する」に補正します。（２）明細書第17頁第20〜21行に「EALIHQLINPYVLS（DR5w12）」とあるのを、「 EALIHQLKINPYVLS（配列番号６）（DR5w12）」に補正します。（３）明細書第20頁第18行に「P1-P6モチーフの存在」とあるのを、「P1-P6モチーフ（配列番号１）の存在」に補正します。（４）明細書第30頁の表Ｉを別紙の通り補正します。（５）明細書第37頁の表VIを別紙の通り補正します。（６）明細書第39〜41頁の表VIIIを別紙の通り補正します。（７）明細書第42〜44頁の表を別紙の通り補正します。請求の範囲１．複数のペプチドが、免疫原性ペプチドを含む確率を増強するための方法であって： a）HLAクラスII分子に対応するモチーフを保有する少なくとも２つのペプチドを提供する工程； b）少なくとも２つのペプチドを、それらがそれぞれ対応するHLAクラスII分子への結合親和性について試験する工程； c）さらなる分析から、1,000nMを超えるその対応するHLA分子に結合するペプチドを排除する工程；および d）1,000nM以下の結合親和性でHLAクラスII分子に結合する工程b）のペプチドを用いて、免疫原性研究を行う工程、を包含する、方法。２．請求項１に記載の方法であって、ここで工程d）が、500nM以下の結合親和性でHLAクラスII分子に結合する工程b）のペプチドを用いて、免疫原性研究を行う工程を包含する、方法。３．1,000nM以下の結合親和性でHLAクラスII分子に結合するHLAクラスIIモチーフを含むペプチドのヒト投薬形態を含む、薬学的組成物。４．請求項３に記載の薬学的組成物であって、表VIIIからの少なくとも１つのペプチドを含む、薬学的組成物。５．請求項３に記載の薬学的組成物であって、該組成物が、前記ペプチドを、該ペプチドをコードする核酸の形態において含む、薬学的組成物。６．患者においてHTL応答を誘導するための医薬の調製のためのＴヘルパーペプチドの使用であって、ここで該Ｔヘルパーペプチドが、約９残基のモチーフを含み、ここで該モチーフのＮ末端からの第１位が、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍであり、そして該モチーフのＮ末端からの第６位が、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ａ、Ｐ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍであり、そしてここで該Ｔヘルパーペプチドが、1,000nM以下の結合親和性で、HLAクラスII分子に結合するペプチドである、使用。７．前記医薬が、CTL応答を誘導するペプチドをコードする核酸およびＴヘルパーペプチドを含む、請求項６に記載の使用。８．前記CTL応答を誘導するペプチドが、前記Ｔヘルパーペプチドに連結される、請求項７に記載の使用。９．患者におけるヘルパーＴ細胞応答を誘導するための医薬の調製のための、表 VIIIに示されるようなペプチドの使用。１０．前記医薬が前記ペプチドを含む、請求項９に記載の使用。１１．前記医薬が前記ペプチドをコードする核酸を含む、請求項９に記載の使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） // Ｃ０７Ｋ 7/00 Ｃ０７Ｋ 14/005 14/005 14/44 14/44 14/725 14/725 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者サウスウッド，スコットアメリカ合衆国カリフォルニア 92071, サンティー，ストラスモアドライブ 10679

Claims

【特許請求の範囲】１．複数のペプチドが、免疫原性ペプチドを含む確率を増強するための方法であって： a）HLAクラスII分子に対応するモチーフを保有する少なくとも２つのペプチドを提供する工程； b）少なくとも２つのペプチドを、それらがそれぞれ対応するHLAクラスII分子への結合親和性について試験する工程； c）さらなる分析から、1,000nMを超えるその対応するHLA分子に結合するペプチドを排除する工程；および d）1,000nM以下の結合親和性でHLAクラスII分子に結合する工程b）のペプチドを用いて、免疫原性研究を行う工程、を包含する、方法。２．請求項１に記載の方法であって、ここで工程d）が、500nM以下の結合親和性でHLAクラスII分子に結合する工程b）のペプチドを用いて、免疫原性研究を行う工程を包含する、方法。３．1,000nM以下の結合親和性でHLAクラスII分子に結合するHLAクラスIIモチーフを含むペプチドのヒト投薬形態を含む、薬学的組成物。４．請求項３に記載の薬学的組成物であって、表VIIIからの少なくとも１つのペプチドを含む、薬学的組成物。５．請求項３に記載の薬学的組成物であって、該組成物が、前記ペプチドを、該ペプチドをコードする核酸の形態において含む、薬学的組成物。６．患者においてCTL応答を誘導するための医薬の調製のためのＴヘルパーペプチドの使用であって、ここで該Ｔヘルパーペプチドが、約９残基のモチーフを含み、ここで該モチーフのＮ末端からの第１位が、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍであり、そして該モチーフのＮ末端からの第６位が、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ａ、Ｐ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍであり、そしてここで該Ｔヘルパーペプチドが、1,000nM以下の結合親和性で、HLAクラスII分子に結合するペプチドである、使用。７．前記医薬が、CTL応答を誘導するペプチドをコードする核酸およびＴヘルパーペプチドを含む、請求項６に記載の使用。８．前記CTL応答を誘導するペプチドが、前記Ｔヘルパーペプチドに連結される、請求項７に記載の使用。９．患者におけるヘルパーＴ細胞応答を誘導するための医薬の調製のための、表 VIIIに示されるようなペプチドの使用。１０．前記医薬が前記ペプチドを含む、請求項９に記載の使用。１１．前記医薬が前記ペプチドをコードする核酸を含む、請求項９に記載の使用。