JP2008503214A - ミコバクテリウム・ツベルクローシスのエピトープ、およびその使用法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、一般的に免疫学に、かつより具体的にはT細胞エピトープの同定、およびミコバクテリウム種に感染したかまたは曝露されたヒト被験体を同定する方法に関する。
本出願は、米国特許法第119条(e)項に基づいて、2004年6月17日に出願された米国特許出願第60/580,559号、および2004年10月27日に出願された米国特許出願第60/622,505号の優先権の恩典を主張し、各々の内容は全体として、参照により本明細書に組み入れられる。
ミコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)(MTB)は、世界人口の3分の1に感染し、かつ毎年200〜300万人の死の原因である。毎年800万人の人々が臨床的疾患を生じる。防御ワクチンはいまだに利用可能でなく、かつ多剤耐性MTB株が、発展途上国および先進工業国において、脅威を与えている。多重防御機構が、細胞内MTB感染を潜伏に封じ込めるのに利用可能であり、これには、抗MTB制御を維持するのに役立つ、抗原反応性γδ+ T細胞、記憶Tリンパ球に分化し得るCD4+ T細胞、およびCD8+ T細胞が含まれる。
本発明は、ミコバクテリウム・ツベルクローシス(MTB)由来の単離ヒトHLA-DR4拘束性T細胞エピトープを提供することによって、当技術分野のこれらの問題および他の問題を解決する。エピトープは、例えば、SEQ ID NO:3、6、7、または8に示すようなアミノ酸配列を含む。
本発明は、ミコバクテリウム感染に関連する抗原から提供される、新規に同定されたMHC結合性ペプチド・エピトープを用いて、インビトロ操作の必要性を伴わずに、MHCクラスI拘束性およびクラスII拘束性およびMTBエピトープ特異的T細胞を、末梢血において、直接視覚化可能であるという発見に基づく。エクスビボ選別されたDR4/ペプチド・テトラマー反応性T細胞が、自己マクロファージ上の、天然にプロセシングされかつ提示されたターゲット抗原由来のエピトープを認識し(図10)、かつDR4+/MTBペプチド・テトラマー複合体が、尖叉試験陽性個体由来の肉芽腫組織における、肉芽腫関連リンパ球を特異的に染色する(図14)という観察によって、これらのHLAに提示されるペプチドの生物学的重要性が立証される。T細胞分化マーカー分析と組み合わせた、抗原特異的T細胞の同時試験によって、潜伏性TBにおけるMTB指向免疫応答を評価する新たなプラットホームが提供される。
a)SEQ ID NO:3に示すようなアミノ酸配列を含む、結合したHLA結合性ペプチドを有する、HLA-A2モノマーまたは修飾モノマーのテトラマー、オリゴマー、またはマルチマーと、被験体から得られたPBLを接触させる工程;および
b)PBLへのテトラマーの結合を検出する工程、ここで、PBLへのテトラマーの結合は、被験体におけるMTB感染または曝露の存在の指標となる。本方法は、SEQ ID NO:1または2に示すようなアミノ酸配列を含む、結合したHLA結合性ペプチドを有する、HLA-A2モノマーまたは修飾モノマーのさらなるテトラマー、オリゴマー、またはマルチマーと、PBLを接触させる工程、およびPBLへのさらなるテトラマーの少なくとも1つの結合を検出する工程をさらに含んでもよい。
a)潜伏性MTBのため薬剤を用いた治療を受けている、DR4アレルを持つ患者から、PBLを含む試料を得る工程;
b)適切な結合条件下で、以下の少なくとも1つから選択されるHLAモノマーまたは修飾モノマーの結合したテトラマー、オリゴマー、またはマルチマーを有する固体支持体と、試料を接触させる工程:
1)SEQ ID NO:6、7、8に示すアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、結合したHLA結合性ペプチドを有する、HLA-DR4モノマーまたは修飾モノマー;および
2)SEQ ID NO:1、2または3に示すようなアミノ酸配列を含む、結合したHLA結合性ペプチドを有する、HLA-A2モノマーまたは修飾モノマー。PBLへのテトラマーの結合量を検出する。治療期間の適切な間隔後に、プロセスを反復し、かつ結果を比較する。比較により、治療期間の適切な間隔後に結合量の減少が見られる場合は、薬剤の有効性が示され、減少の欠如は、ヒトにおけるMTBの感染または潜伏の治療または予防のための薬剤の有効性の欠如を示す。本発明の方法の他の態様におけるように、薬剤または薬剤候補の有効性を決定するための方法は、薬剤候補を薬剤スクリーニングするために当技術分野に公知の適応を用いた、任意の型のハイスループット・スクリーニングによく適しており、かつ抗TBワクチン候補の予備スクリーニングにおいて、または任意のミコバクテリウムの増殖をインビトロで減少させるかまたは抑止することが公知の化学的化合物(すなわち「小分子」)をスクリーニングするために使用可能である。
、多価実体はハイブリドーマであってもよく、かつMHCモノマーまたは修飾MHCモノマーをハイブリドーマ表面上で発現させてもよい。さらに別の態様において、架橋複合体中の非TCR所持ターゲット細胞は、抗体が特異的であるペプチドをその細胞表面上に発現するハイブリドーマであってもよい。
Vβファミリー拡大によって特徴付けられるGALの機能に取り組む前に、より一般的なアプローチを用いて、生存MTBにインビトロで一晩感染させておいた自己マクロファージを抗原提示細胞(APC)として用いるサイトカイン放出アッセイにおいて、不均質なCD4+およびCD8+ GAL集団の機能を決定した。分析した5人の患者のうち、4人の患者のCD4+ GALは、769から>2000pg/mlのレベルのIFN-γを産生し(図1B)、一方、GM-CSFは、このサイトカインの産生に関して分析した3人の患者すべてで、38〜2031pg/mlのレベルで測定可能であった(#3、#6、および#7;データ示さず)。CD8+ TCR+ GALに関しては、分析した3人の患者のうち2人が、それぞれ614および>2000pg/mlのIFN-γを産生し(図2B)、かつ3つのCD8+ GAL集団がすべて、35〜1262pg/mlのレベルでGM-CSF産生に関して免疫応答を示し、一方、IL-4はどの患者でも測定不能であった(データ示さず)。驚くべきことに、生検にTB特異的病変がない(患者#6および#7)が、ESAT-6応答性のため、陽性の「免疫学的診断」を有する患者(以下を参照されたい)であっても、やはり、MTBに対して48時間以内に、強い細胞仲介性免疫応答を開始することが可能であった。注目すべきことに、分析したリンパ球を、MTB抗原を用いてあらかじめインビトロ刺激はしていなかった。
ヒトにおいて、クラスI MHCは染色体6上に位置し、かつ3つの遺伝子座、HLA-、HLA-B、およびHLA-Cを有する。最初の2つの遺伝子座は、アロ抗原をコードする多数のアレルを有する。これらは44Kd重鎖サブユニットおよびすべての抗原特異性に共通の12Kdβ-2-ミクログロブリン・サブユニットからなることが見出されている。例えば、Turner, M. J. et al., J. Biol. Chem. (1977) 252:7555-7567によって記載されるように、ホモ接合体ヒト・リンパ芽球細胞株J-Y由来の形質膜のパパイン消化後に、可溶性HLA-A2を精製することも可能である。パパインは、膜貫通領域近くで44Kd重鎖を切断し、α1、α2、α3ドメインおよびβ-2-ミクログロブリンで構成される分子を生じる。
抗原提示細胞(APC)の表面上のMHC糖タンパク質による抗原の提示は、抗原性タンパク質がより小さいペプチド単位に加水分解されるのに続いて起こると考えられる。抗原性タンパク質内のこれらのより小さいセグメントの位置は、実験的に決定可能である。これらのMHC結合性ペプチドは、長さ約8〜約10、おそらく約8〜約11、または約8〜約12残基であると考えられ、かつアグリトープ(MHC分子に認識される)およびエピトープ(T細胞上のT細胞受容体によって認識される)両方を含有する。エピトープは、長さ約8〜約10、おそらく約8〜約11、または約8〜約12残基の直鎖配列であり、抗原特異的T細胞受容体に認識される。アグリトープは、MHC糖タンパク質とペプチドの結合の原因となる、連続性または不連続性配列である。本発明は、推定上のMHC結合性ペプチドを評価して、こうした断片をMHCモノマーまたは修飾MHCモノマーとの三元複合体に取り込み可能であるかどうかを決定するための、系、キット、およびアッセイを提供する。
CD4+およびCD8+ GAL集団内のVβファミリーの拡大が、実際に疾患との戦いにおける大きな機能的役割の指標であるのかどうかを調べるため、拡大されたVβファミリーにしたがってGALを選別し、かつサイトカイン放出アッセイにおいて分析した。上に詳述するように、CDR3スペクトラタイピングをフローサイトメトリーと組み合わせると、CD4+ GAL集団における主要な提示Vβファミリーとして、患者#1ではVβ9およびVβ14、患者#2ではVβ8およびVβ9、かつ患者#5ではVβ7が認識可能になり、ならびにCD8+ GALにおいては、患者#1でVβ3が認識可能になった。これらの患者は、TBに関して陽性の病的診断を有した。本発明者らは、適切なVβファミリーを発現するT細胞を選別し、かつ上述のように、MTB感染マクロファージに48時間曝露した。これらのT細胞によるIFN-γの産生は、匹敵する細胞数のGAL全集団によって産生されるより、はるかにより高い濃度を生じた(CD4+ GALに関しては、1300〜9955pg/ml、CD8+ GALに関しては、1185pg/ml;図5A〜C)。予期されるように、MHCクラスIに対して向けられるmAbは、Vβ3+CD8+ GALのサイトカイン産生を阻害した。CD4+、Vβ選別GALでは、DR、DP、またはDQ mAbのいずれかによって、IFN-γ産生が遮断され、選別されたT細胞が単一のMHCクラスIIアレルに拘束されていることが示唆された。
選別したCD4+ GALの抗原特異性を決定するため、Vβ選別したT細胞がMTB由来DR結合性ペプチドESAT-61-20およびESAT-672-95を認識する能力の分析を行った。これらの研究において、Vβ選別したGALは、患者#1、#2、および#5において、ESAT-61-20を認識し、かつIFN-γを産生し;一方、ESAT-672-95は、患者#5のVβ7+ GALにおいてのみ、バックグラウンドレベルを超えたIFN-γ産生上昇を誘導した(図6E)。ペプチド濃度の増加は、図6B、D、およびFに示すように、より強いサイトカイン応答を誘発したが、試験した最高ペプチド濃度では、結果は多様であり、患者#2におけるさらなる増加から、患者#5におけるIFN-γ抑制までの範囲があった。同一の実験設定で、対応するVβが枯渇したGAL集団を分析すると、バックグラウンドレベルを超えて測定可能なIFN-γ産生がないように、これらのGALがESAT-61-20ペプチドを認識しないことが観察された(患者#1ではVβ9陰性GAL:4pg/ml;患者#2ではVβ9陰性GAL:検出レベル未満;患者#5ではVβ7陰性GAL:45pg/ml;図6A中、データ示さず)。したがって、ESAT-61-20の認識は、これらの3人の患者において、単一Vβファミリーに拘束され、または患者#5では、単一のVβ7+ T細胞クローンにさえ拘束された。
HLA A2+患者のCD8+ GAL集団において、抗原性ペプチドの認識を調べた(表1、図8A〜C)。MTB由来HLA A2結合性ペプチド、Ag85A48-56、Ag85A242-250、Ag85B143-152、Ag85B199-207、および19kDa Ag88-97を、それぞれ、T2細胞に負荷し、CD8+ GALを添加し、かつインキュベーション48時間後、インビトロ・サイトカイン産生を測定した。黒色腫由来Gp100ペプチドを陰性対照として用いた。
TB特異的病変を提示する患者#3および#4において、Ag85b199-207および19kDa Ag88-97のHLA A2テトラマーで、肺切片を染色することによって、抗原特異的CD8+ GALをインサイチューで視覚化した。TCR結合テトラマーは、CLSMでは赤色に見え、一方、CD8αに対して向けられるmAbは、FITC標識され、緑色に見える。ネズミ・リンパ系組織で先に観察されたように、テトラマー染色は、T細胞の1つ(またはいくつか)の極でクラスター形成するようであるTCRを視覚化し、球状の細胞上、単数または複数の鮮赤色の点の印象を与えたが、一方、CD8は、より一様に分布しているようであり、細胞に均質な環状の外見を与えた。二重発現に際して、赤色および緑色は、細胞の橙色〜黄色の着色を生じた。陰性対照としてgp100-MHCテトラマーで染色すると、単なるバックグラウンド染色が導かれた。テトラマー陽性細胞は、肺切片内のいくつかの異なる場所に集中した。
肺結核と診断された患者(7人のうち5人)を、Heidelberg大学病院から採用した。典型的な病巣y X線およびPCRに基づくMTB同定によって、結核を診断した。悪性病巣を排除するため、手術によって肺組織を得た。HE染色によって肉芽腫組織が同定されたならば、新鮮に単離された肺組織を、10% FCSおよび抗生物質を補ったRPMI培地中に入れ、かつ結腸直腸癌組織からT細胞を得るために先に記載されたように処理した。肺肉芽腫肺組織由来のT細胞を肉芽腫関連リンパ球(GAL)と名づけた。7人の患者のうち2人が、それぞれ、リウマチ様関節炎またはサルコイドーシスと診断された(表2に列挙)。すべての患者はPPD反応性に関して陽性と判定された。地元の倫理委員会によって認可された研究に登録した個人のインフォームドコンセントを得た後、血液を抜き取った。
肺結核診断時、および標準的三重療法(リファンピシン、エタンブトール、およびイソニジド)の開始後の異なる時点で、ヘパリン処理した血液を患者から抜き取った。これらの研究に用いたすべての患者は、治療に適合し、かつ肺病巣の排除を示した。Ficoll勾配上の分離によって末梢血単核細胞(PBMC)を得て、かつ90%ウシ胎児血清(FCS)および10% DMSO中、1〜5x107細胞/バイアルで液体窒素中に保存した。凍結末梢血白血球(PBL)を融解し、かつ20% FCSを補ったRPMI-1640中で洗浄し、1% FCSを補ったRPMI中に細胞ペレットを再懸濁し、かつ1μgフィコエリトリン(PE)標識テトラマー試薬と室温で30分間インキュベーションし(MHCクラスIテトラマーの場合)、その後、直接、エネルギー・カップリング色素(ECD)標識抗CD45RA(クローン2H4LDH11LDB9、ネズミIgGl)またはフィコエリトリン-シアニン(PC5)標識抗CD8αmAbクローンB9.11(ネズミIgGl)および抗CD28 mAb(FITC、クローンCD28.2)とインキュベーションした。以下に記載するように、PBLを2時間インキュベーションすることによって、抗原特異的HLA-DR4拘束性CD4+ T細胞の染色を達成した。BD/Pharmingen(San Diego, CA)から購入したCCR5特異的mAb(CD 195)を除いて、すべてのmAbは、Beckman/Coulter, Krefeld, Germanyから得た。
Coulter Epics XLおよびXLシステム・ソフトウェア2.1(Beckman-Coulter, Fullerton, CA)を用いて、細胞を分析した。CD8+ CD45RA+またはCD8+ CD45RA-細胞に対して細胞を別個にゲーティングし、その後、CD28+/-細胞に関してゲーティングして、かつ最後にテトラマー結合を評価した。T細胞分化、ホーミングおよびエフェクター機能を反映する、前駆体(CD45RA+、CD28+)、活性化(CD45RA-、CD28+)、記憶(CD45RA-、CD28-)またはエフェクター(CD45RA+、CD28-)Tリンパ球を含む、異なるT細胞亜集団における抗原反応性リンパ球の存在を、記載するように行った。結腸直腸癌患者由来のTILに関して記載されるように、肺結核またはサルコイドーシスを患う患者由来のGAL(肉芽腫関連リンパ球)を調製した(Maeurer et al., J. Exp. Med., 1996)。National Center for Clinical Laboratory Standardsガイドラインにしたがって、尖叉試験を適用し、かつこの実験は地元の倫理委員会によって認可された。公知の方法を用いたゲノム型決定によって、各個体由来のMHCクラスIおよびIIアレルを決定した。
HLA-A2野生型(wt)またはHLA-A2突然変異体(HLA-A2m、MHCクラスI-α3ドメインの245位のアラニン→バリン、MHCクラスI重鎖とCD8の相互作用がより有効でないため、減少したバックグラウンド染色を生じる)からテトラマー複合体を調製した。19kDa抗原(VLTDGNPPEV)(アミノ酸88〜97位)(SEQ ID NO:1)、Ag85b(KLVANNTRL)(SEQ ID NO:2)またはESAT-6(アミノ酸28〜36位)(LLDEGKQSL)(SEQ ID NO:3)由来の、HLA-A2に提示されるMTBエピトープのいずれかを、HLAモノマーに負荷した。CMVpp65抗原エピトープ(NLVPMVATV)(SEQ ID NO:4)または黒色腫関連抗原gplOO(YLEPGPVTV)(SEQ ID NO:5)を対照として用いた。 HLA-DR4テトラマー複合体に、(QMPYQPVQSPTQVEA)(19kDA Ag)(SEQ ID NO:6)、(PVEYLQYPSPSMGRD)(Ag85b)(SEQ ID NO:7)または(FAGIEAAASAIQGNV)(ESAT-8-22)(SEQ ID NO:8)のいずれかを負荷した。テトラマー複合体をPEに直接カップリングし、かつPBLと2時間、室温(Ag85bおよび19kDa Ag由来ペプチド)または4℃(ESAT-6)のいずれかでインキュベーションし、その後、本明細書に記載するようなT細胞マーカーで染色した。
抗CD8コーティング免疫磁気ビーズ(Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany)を用いて、3〜5x107 PMBCからCD4+ T細胞を分離した。CD8+ T細胞が枯渇したPBMC集団を、示すように、それぞれのPE標識テトラマー試薬(1μgテトラマー/2xl07細胞)と2時間インキュベーションし、1回洗浄し、かつ免疫磁気ビーズ(Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany)に付着した抗PE指向(directed)mAbと15分間インキュベーションした。10% FCSおよび50 ng/mlヒト組換えIL-7(Dr. Natalio Vita, Sanofi, Franceによって提供された)を補ったGibco(Eggenstein, Germany)から得られる50% AIM-V培地、50% DMEM(高グルコース)を含有する96ウェルプレート中、陽性選択細胞を、24時間休止させた。
臨床的結核の徴候がない尖叉+個体(これらの個体は肺癌を排除する診断目的で開胸術を受けた)由来の肺肉芽腫組織由来の新鮮凍結5μm厚切片を、適切なペプチド(最終濃度1μg/ml)を負荷したHLA-A2またはDR4テトラマー複合体、およびDAKO抗体希釈剤ChemMate希釈緩衝液(DAKO, Hamburg, Germany)中で希釈したヒトCD8α鎖のカルボキシ末端のペプチド・マッピングに対して向けられるヤギ抗CD8 Ab(最終濃度0.002μg/ml、Santa Cruz、sc-1141)と、振盪装置上、4℃で一晩インキュベーションした。抗CD4抗体(ヤギ)もまた、DAKOから得た。以下の工程を室温(RT)で行った: PBSで2分間の洗浄を3回、PBS中で緩衝された2%ホルムアルデヒド溶液中で5分間の固定、およびPBSで2分間を3回、その後、希釈緩衝液中のマウス抗PE(最終濃度0.001μg/ml;Miltenyi, Germany)を30分間、その後、PBSで5分間を3回。希釈緩衝液中のビオチン化F(ab)2断片(最終濃度3.25μg/ml、Dianova, Hamburg, Germany)を30分間添加した。Alexa Fluor 594結合ストレプトアビジン(最終濃度1.25μg/ml、Molecular Probes, Mobitec, Gottingen, Germany)およびAlexa Fluor 488ロバ抗ヤギ(最終濃度5 μg/ml)を、希釈緩衝液中で30分間添加し、その後、PBSで5分間3回の洗浄工程および蒸留水で3回の洗浄工程を行った。試料を風乾し、かつVectaShield封入剤(Vector Laboratories, Burlinghame, CA, USA)中で封入した。Zeiss Axioskop 2(Zeiss, Oberkochen, Germany)を用いてスライドを分析し、かつColorview-XS DIGITAL カメラ(Olympus, Hamburg, Germany)で記録した。
Ag85b、19kDAg、およびM.ツベルクローシス特異的抗原ESAT-6から提供されるペプチドを負荷したHLA-DR4テトラマーとの反応性に関して、健康なHLA-DR4+血液ドナー由来のPBLを試験した。尖叉試験陽性個体では、CD4+ T細胞集団において、上に列挙する抗原のいずれに対しても、反応性がもっぱら陽性と判定された。わずかな(nominal)T細胞エピトープの存在下で、CD4+ PBLをインビトロ拡大すると、尖叉試験陽性および陰性個体において、CD4+テトラマー反応性T細胞の拡大を生じた。インビトロ刺激の前および後の両方で、これらのT細胞は、前駆体CD4+CD45RA+CD28+ T細胞サブセットのメンバーであった。Ag85bまたはESAT-6エピトープいずれかを用いたテトラマー選別CD4+ T細胞のエクスビボ分析によって、CD4+、HLA-DR4拘束性、およびAg85b反応性T細胞が、M.ツベルクローシスおよびM.アビウム・イントラセルラレから提供される、天然にプロセシングされかつ提示されたエピトープを認識することが明らかに示された(図11A〜D)。対照的に、DR-4拘束性およびESAT-6特異的T細胞は、M.ツベルクローシスに感染した自己マクロファージのみを認識し、M.アビウム・イントラセルラレに感染したものは認識しなかった。DR4拘束性およびミコバクテリウム種特異的CD4+ T細胞が、尖叉陽性個体の肺由来の肉芽腫病巣にもまた存在するかどうかを調べるため、テトラマー・インサイチュー染色、およびフローサイトメトリーによる肉芽腫関連リンパ球(GAL)のエクスビボ分析を用いて、CD4+およびミコバクテリウム種抗原特異的T細胞を検出した。肺組織におけるテトラマー反応性およびCD4+ T細胞の共染色は、フローサイトメトリーによって、同じ検体由来のGALの染色によって統合された、HLA-DR4拘束性および19kDA抗原特異的またはESAT-6特異的T細胞の存在を示した: CD4+ GALの0.1%がESAT-6エピトープに関して陽性に染色され;19kDa抗原では0.3%;およびAg85b抗原では0.2%であった。HLA-A2に提示されるESAT-6エピトープに関して、類似のエクスビボ状況が当てはまることが見出された: ESAT-6または19kDaテトラマー複合体およびCD8での共染色は、肉芽腫病巣内に、抗原特異的およびHLA-A2拘束性T細胞を検出した。無関係な対照(黒色腫gp100抗原)テトラマー試薬では、テトラマー染色はまったく検出不能であった。
長期分析のため、診断時、ならびに診断/療法開始の2週間後および16週間後、5人の肺結核患者からPBLを採取し、かつHLA-DR4拘束性CD4+ T細胞における19kDA抗原、Ag85b、およびESAT-6に対する反応性に関して試験した(図11A)。対応するCD8+およびHLA-A2拘束性T細胞応答を3人の患者で評価した。5人の患者のうち3人は、経時的に、ESAT-6反応性に関してDR4拘束性T細胞の増加を示した(患者MZTB1、-3および-4)。患者MZTBC-3および-4はまた、ESAT-6に対するHLA-A2拘束性エピトープの対応する増加も示し、患者MZTBC-1におけるCD8+ T細胞応答は試験しなかった。5人の患者のうち4人(患者MZTBC-4を除く)は、経時的にAg85bエピトープに関するDR4拘束性T細胞の減少を示した。MHCクラスII拘束性およびAg85反応性T細胞のパターンは、HLA-A2拘束性CD8+免疫応答に類似であることが見出された:DR4拘束性およびA2拘束性両方のAg85b特異的T細胞応答において、患者MZTBC-3は減少を示し、かつ患者MZTBC-4は増加を示した。
健康な尖叉試験陽性個体における状況と同様、結核患者において、DR4の脈絡において、AG85b、19kDa、またはESAT-6抗原のいずれかを認識する少数または検出不能なCD4+ T細胞(例えば患者MZTBC5由来のPBL)が、インビトロで、適切なペプチドで7日間刺激する間に拡大可能であった:主なCD4+ T細胞応答は、やはり前駆体(CD45RA+CD28+)または活性化(CD45RA-CD28+)T細胞サブセット内で検出される(図13AおよびB)。しかし、注目すべきことに、療法開始後の血液採取時点にかかわりなく、わずかなペプチド・エピトープの存在下で抗原反応性CD4+ T細胞のインビトロ拡大が、劇的に、CD45RA-CD28-およびCD45RA+CD28- T細胞サブセットを減少させ、かつCD45RA+CD28+およびCD45RA-CD28+ T細胞集団を増加させた。HLA-A2提示ミコバクテリウム・ペプチドでのインビトロ拡大に供されたCD8+ T細胞に関しても、同じパターンが当てはまることが見出された(データ示さず)。
TBにおける疾患封じ込めは、異なるT細胞サブセットの複雑なネットワーク、および有効な免疫応答を開始し、かつ維持する能力を伴う。関与する免疫事象すべての知識はいまだに完全ではない。MHCクラスII拘束性CD4+およびMHCクラスI拘束性CD8+ T細胞の必須の役割がよく確立されている。その主な武器の1つは、マクロファージを活性化し、かつ殺細菌分子の産生を誘導可能なサイトカイン、例えばIFN-γおよびTNF-αの産生である。非古典的な拘束性CD8+リンパ球、CD4- CD8-およびCD1拘束性T細胞、γδ+ T細胞およびNK細胞もまた、MTB関連抗原を認識し、かつ疾患制御に関与することが報告されている。
肺の悪性病巣を排除するため、試験的手術を受けた5人の患者を、Heidelberg大学病院から採用した。HE染色によって、手術検体(およそ10mmx8mm)を分析し、かつ癌の徴候がないが、強いT細胞浸潤と関連する肉芽腫形成があることが明らかになった。石灰化または乾酪性改変の大きな領域は同定されなかった。NCCLS基準にしたがって、痰(手術後に得られたもの)ならびに手術検体由来のアリコットを、液体(BACTEC MGlT 960、Becton Dickinson, Heidelberg, Germany)培地中で、および固形(Lowenstein-Jenssen、Becton Dickinson, Heidelberg, Germany)培地を用いて、6週間培養した。生存ミコバクテリウムは同定不能であった。手術検体由来のアリコットは、MTBに関するPCR(Cobas Amplicor(商標)ミコバクテリウム・ツベルクローシス試験、Roche, Diisseldorf, Germany)によって、陽性と判定された。したがって、i) X線による典型的な肺病巣、ii) PCRに基づくMTB検出、およびiii) HE染色によって定義される典型的な肉芽腫形成に基づいて、潜伏性MTB感染に関して患者を診断した。このパターン(培養可能な細菌が存在しない)は、MTBの臨床的徴候を伴わない個体から得られたヒト肺組織(剖検時)のインサイチューPCR分析と一致して最近概説されたような「潜伏性MTB感染」と一致する。各手術検体のアリコットを、結腸直腸癌患者由来の検体に関して先に記載されたように、小片(1 mm x 1 mm)に切り刻んだ。簡潔には、組織切片を、RPMI、10% FCSおよび抗生物質に加えて、Dr. Adrian Minty, Sanofi, France から厚意で提供された50 ng組換えヒトIL-7/mlを補った48ウェルプレートに入れた。
患者からヘパリン処理した血液を抜き取り、かつFicoll勾配上の分離によってPBMCを得て、かつ90%ウシ胎児血清および10% DMSO中、1〜5x107細胞/バイアルで液体窒素中に保存した。Immunomics Corporation(Beckman Coulter, San Diego, USA)から、HLA-A2結合性M.ツベルクローシス19kDaペプチドVLTDGNPPEV(SEQ ID NO:1)、M.ツベルクローシス・ペプチドMTB Ag85b、KLVANNTRL(SEQ ID NO:2)、ESAT-6ペプチドLLDEGKQSL(SEQ ID NO:3)を負荷したテトラマー試薬、またはESAT-6ペプチドFAGIEAAASAIQGNV(SEQ ID NO:8)を負荷したHLA-DR4テトラマー複合体が調製され、かつ得られた。CMVpp65エピトープNLVPMVATV(SEQ ID NO:4)または黒色腫関連gplOOペプチドYLEPGPVTV(SEQ ID NO:5)を負荷したHLA-A2テトラマー複合体(Beckman/Coulter)が対照として働いた。凍結PBLを融解し、洗浄し、かつ先に詳細に記載されるように、テトラマー分析またはTCR VB頻度を行った。
TCR-CDR3分析に供したものと同一の肉芽腫病変を用いて、テトラマー・インサイチュー染色を行った。本発明者らには、T細胞インサイチュー検出を行うのに利用可能な患者#3および#4由来の十分な量の組織しかなかった。肺組織由来の10μm厚の10〜20の凍結切片を得て、かつ上に列挙するような、M.ツベルクローシス19kDaまたはAg85bエピトープを負荷したPE標識HLA-A2テトラマーのいずれかと、4℃で一晩インキュベーションした(PBS中の2%正常ヤギ血清中で希釈した、最終濃度1μg/ml)。以下の工程をすべて、室温で行い、かつ抗体希釈緩衝液(DAKO, Hamburg, Germany)中で、一次および二次抗血清を希釈した。PBS中で切片を3回洗浄し、PBS中で緩衝した2%ホルムアルデヒド溶液中で5分間固定し、その後、PBSを用いた3回の洗浄工程を行った。マウス抗PE(Sigma, Deisenhofen, Germany)を1:100で2時間インキュベーションし、その後、PBSで3回洗浄した。Cy3標識ロバ抗マウス(Dianova, Hamburg, Germany)を1:800希釈で1時間用いた。1:50希釈のマウス抗ヒトCD8α(DAKO、クローンC8/144B)を用いた二重染色を1時間行った。このインキュベーション前に、交差認識を回避するため、製造者の指示にしたがって、ARK(商標)キット(DAKO)でのビオチン化工程を適用した。FITC標識ストレプトアビジン(DAKO)を1:50で適用して、CD8+ T細胞を検出した。テトラマー陽性細胞は赤色に見え、CD8+ T細胞は緑色に見える。Zeiss Axioskop顕微鏡(Zeiss, Oberkochen, Germany)に取り付けたColorView-XS(Olympus, Hamburg, Germany)を用いて、検体の写真を撮影した。
抗CD4またはCD8コーティング免疫磁気ビーズ(Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany)を用いて、3〜5x106 PMBCまたはGALからCD4+またはCD8+ T細胞を分離した。PEで直接標識したVB特異的mAb(Beckman Coulter, Krefeld, Germany)を用い、その後、抗PE特異的免疫磁気ビーズ選別を用いて、TCR VB選別T細胞を得た。10% FCSおよび50 ng/mlヒト組換えIL-7を補った、Gibco(Eggenstein, Germany)から得られる50% AIM-V培地、50% DMEM(高グルコース)を含有する96ウェルプレート中、T細胞を48時間培養した。HLA-A2+患者に関して、MHCクラスI拘束性サイトカイン産生を決定するため、適切なペプチド・エピトープでパルス処理したT2細胞と、CD4+、CD8+またはTCR-VB選別細胞を混合した。希釈剤のみ(10% DMSO、90% RPMI)または示すような1μgペプチドのいずれかを負荷し、SIGMA(Deisenhofen, Germany)から得られるヒトβ-2ミクログロブリン(20μg/106細胞/ml)を補ったT2細胞が、ターゲット細胞集団として働いた。ウェル当たり50μlのこのターゲット細胞懸濁物を用い、エフェクター・ターゲット比は1:1であった。自己の放射線照射PBMCを用いて、MHCクラスII応答を検出した。個々の患者由来のPBMCをESAT-6由来ペプチド(アミノ酸1〜20位 MTEQQWNFAGIEAAASAIQG(SEQ ID NO:26)およびアミノ酸72〜95位 LARTISEAGQAMASTEGNVT-GMFA)(SEQ ID NO:27)で、示すように、37℃で2時間パルス処理し、その後、CD4+応答性T細胞と48時間インキュベーションした。これらのESAT-6由来ペプチドは、結核患者由来の大部分のT細胞によって認識されることが記載されており、かつ大部分のHLA-DRアレルに無差別に結合するようである。M.ツベルクローシス感染自己マクロファージを試験するため、プラスチックに2時間PBMCを接着させ、その後、FCSを補った培地で2回注意深く洗浄する工程を行うことによって、マクロファージを選択した。先に記載するように、アッセイ24時間前に、肺結核を患う患者の痰由来のM.ツベルクローシスMZ#610と名づけた新鮮単離M.ツベルクローシス株に、マクロファージを感染させた。エフェクターT細胞をターゲットと48時間インキュベーションし(E:T比=1:1)、上清を採取し、かつDiaclone, Besancon, France から得たELISA系を用いて、IFNγ、IL-4またはGM-CSFに関して試験した。異なるエフェクター集団(例えばCD4+またはCD8+ GAL対TCR-VB選別GAL)を用いた結果を比較するため、本発明者らは、すべての実験において、同じバッチのAPCを使用し、MHCクラスI拘束性T細胞応答は、10μg/ウェルの抗MHCクラスI特異的mAb W6/32で遮断され、抗DR特異的mAb L243を用いて、MHCクラスII拘束性(HLA-DR)T細胞応答を遮断した。クローンH143は、DPに対して向けられ、かつクローンTU169はDQクラスIIアレルに対して向けられた。どちらもBD/Pharmingen, Hamburg, Germanyから得られた。
CD4もしくはCD8いずれかの陽性選別T細胞(免疫磁気ビーズを用いる)、またはHLA-A2/Ag85bもしくはHLA-DR4/ESAT-6複合体いずれかを用いたテトラマー選別T細胞の分子TCR組成を、記載するように完成させた。これらのT細胞は、インビトロで再刺激されず、IL-7の存在下で48時間の培養期間の後に得られた。注目すべきことに、IL-7は、TCRレパートリーを歪めないと報告されている。簡潔には、2x105細胞からRNAを抽出し、かつcDNAに逆転写し、個々のTCR VB特異的プライマー対によって増幅し、かつフルオロフォア標識TCR-CB特異的プライマーを用いたランオフ反応を行った(PCR条件:94℃、1分間/60℃、1分間/72℃、1分間、40サイクル)。適切なサイズ標準および310配列決定装置およびGenescanソフトウェア(ABI, Weiterstadt, Germany)を用いたDNA断片分析によって、標識単位複製配列を分析した。CD4+またはCD8+選別T細胞集団いずれかの連続希釈(10x105m 5x105、2x105、1x105、0.5x105)は、このアッセイ系において、少なくとも1x105 T細胞を用いると、アッセイ内変動およびアッセイ間変動に関連して、非常に再現性があるTCRパターンが生じ、かつ「偽陽性」モノクローン性TCR-CDR3パターンにつながらないことを示した。モノクローン性/オリゴクローン性TCR転写物を同定するため、単位複製配列をTA配列決定ベクター(Invitrogen, Groningen, The Netherlands)にサブクローニングした。TCR VA/VBは、PCR単位複製配列またはすべてのサブクローニングPCR転写物の直接配列決定のいずれかが、同一のTCR配列を生じる場合のみ、モノクローン性として報告された。TCR VA/VBファミリーがオリゴクローン性またはポリクローン性である場合、CDR3長のガウス分布が生じる。各ピークは、所与のCDR3長を持つインフレーム転写物に相当する。曲線下の領域は、個々のTCR VA/VBファミリーにおける別個のCDR3長の頻度に相当する。単一試料分析からの情報を凝縮するため、個々のTCR VAまたはVBファミリーを、アミノ酸数として表したCDR3長と共にVB1〜VB24の単一の合計数にグループ分けした。このTCR-CDR3ランドスケープは、T細胞亜集団における各TCRファミリーのTCR-CDR3長によって定義されるような「構造的解剖学」を提供する。各CDR3ピークの曲線下の領域は、全CDR3の領域(100%)の割合として表される。見やすくするため、スケール間隔上に示すように、相違を異なる色で表す。肉芽腫病巣から得られたCD8+またはCD4+ T細胞(GAL)から得られたCDR3パターンを、同時に、すなわち手術中に得られた、CD4+またはCD8+選別PBLと比較してもよい。各試料におけるCDR3分布および対照分布間の領域によって、各CDR3長内のこのTCR「摂動」を計算する。陽性または陰性摂動が各TCR VA/VB CDR3ピークで起こり得るし、かつこれを対照試料に比較した際の相違として表す。10%の相違を生じる各摂動を異なる色で表す。この分析において、「フラットな」TCRランドスケープは、摂動が存在しない、すなわちTCR-VA/VBランドスケープが、対照試料と比較した際に同一の図を生じることを暗示することに注目されたい。2人の患者から得られた対応する新鮮に採取された肺組織を用いて、CD8+、CD4+(未選別)GALにおいてTCR CDR3長測定の比較分析を行った。
TCRスペクトラタイピングは、T細胞集団の定性的評価のみを生じ、定量的評価は生じない。TCR VB鎖に対して向けられる24の個々のmAbのパネル(Beckman Coulter, Krefeld, Germany)を、FITC、PEで標識されたか、またはFITC/PEで二重標識されたかいずれかの3つの個々の抗VB mAbにグループ分けし、これらは、ECD-CD4またはPC5-CD8+ T細胞いずれかに関してゲーティング可能である。したがって、CD4+またはCD8+ T細胞集団いずれかの24の個々のTCR VBファミリーの頻度を、8つの異なる試験管で分析可能であり、これによって、CD3+ CD8+ T細胞における割合が得られる(VBファミリーのX%)。ここで、この因子を用いて、CDR3-VBランドスケープ分析を補正してもよい。TCR VB鎖に対して向けられるmAbパネルのみが入手可能であり、TCR-VA鎖に対して向けられるパネルは入手可能でない。
未知の病因の肺病変を提示する5人の患者の肺生検から、肉芽腫関連リンパ球を培養した。病理学的診断(典型的肉芽腫形成)およびMTBのPCR補助増幅によって、5/5の患者で、潜伏性結核感染が明らかになった。生存ミコバクテリウムは、痰、気管支洗浄液、または生検自体からは単離不能であった。したがって、本発明者らは、PCR陽性、培養陰性のヒト肺肉芽腫組織を、MTB関連抗原に対するT細胞反応性に関して分析する可能性を有した。
磁気ビーズ選別後、フローサイトメトリーによって測定されるTCRレパートリーの定量的評価によって補完される、TCR CDR3スペクトラタイピングによって定義される、TCRレパートリーの「客観的」構造組成に関して、CD4+およびCD8+ GAL集団を、別個に分析した。図1および図2においては、x軸上に24のVBファミリーを、z軸上にアミノ酸数としてのファミリー内のCDR3長を、かつy軸上に、フローサイトメトリー列挙およびCDR3分析によって決定されるような曲線下の領域の組み合わせとして、リンパ球集団内のCDR3長の割合を示す、「TCRランドスケープ」をプロットした。
VBファミリー拡大によって特徴付けられるGALの機能に取り組む前に、本発明者らは、より一般的なアプローチで、生存MTBバチルスにインビトロで一晩感染させておいた自己マクロファージを抗原提示細胞(APC)として用いる、サイトカイン放出アッセイにおいて、不均質なCD4+およびCD8+ GAL集団の機能を決定した。3/5の患者由来のCD4+ GALは十分に拡大可能であった。これらは、110から>1000pg/mlレベルでIFN-γを産生し(図1)、一方、GM-CSFは患者#3由来のCD4+ GALのみで測定可能であった(データ示さず)。CD8+ TCR+ GALに関しては、分析した患者の0/3がIFN-γを産生し、患者#3由来のCD8+ GALのみがGM-CSF産生に関して免疫応答を示し、一方、IL-4はどの患者でも測定不能であった(データ示さず)。注目すべきことに、分析したリンパ球を、MTB抗原を用いてあらかじめインビトロ刺激はしていなかった。
CD4+およびCD8+ GAL集団内のVBファミリーの拡大が、実際に疾患との戦いにおける大きな機能的役割の指標であるのかどうかを調べるため、本発明者らは、拡大されたVBファミリーにしたがってGALを選別し、かつサイトカイン放出アッセイにおいて分析した。上に詳述するように、TCR-CDR3スペクトラタイピングをフローサイトメトリーと組み合わせると、CD4+ GAL集団における主要な提示VBファミリーとして、患者#1ではVB9および14、患者#2ではVB8およびVB9、かつ患者#5ではVB7が認識可能になり、ならびにCD8+ GALにおいては、患者#1でVB3が認識可能になった。本発明者らは、適切なVBファミリーを発現するT細胞を選別し、かつ上述のように、MTB感染自己マクロファージに48時間曝露した。これらのT細胞によるIFN-γの産生は、匹敵する細胞数のGAL全集団によって産生されるより、はるかにより高い濃度を生じた(CD4+ GALに関しては、1300〜9955pg/mlの範囲、CD8+ GALに関しては、1185pg/mlの範囲;図5)。予期されるように、MHCクラスIに対して向けられるmAbは、VB3+CD8+ GALのサイトカイン産生を阻害した。CD4+、VB選別GALではDR、DP、またはDQ mAbのいずれかによって、IFN-γ産生が遮断され、選別されたT細胞が単一のMHCクラスIIアレルに拘束されていることが示唆された。
選別したCD4+ GALの抗原特異性を決定するため、本発明者らは、個々のTCR VB選別したT細胞がMTB由来DR結合性ペプチドESAT-61-20およびESAT-672-95を認識する能力を分析した。VB選別したGALは、患者#1、#2、および#5において、ESAT-61-20を認識し、かつIFN-γを産生し、一方、ESAT-672-95は、患者#5のVB7+ GALにおいてのみ、バックグラウンドレベルを超えたIFN-γ産生上昇を誘導した(図6)。
HLA A2+患者のCD8+ GAL集団において、MTB関連抗原ESAT-6、19kDa AgまたはAg85a/bによって提供されるペプチドの認識を調べた(表1、図8A〜B)。MTB由来HLA A2結合性ペプチド、Ag85a48-56、Ag85a242-250、Ag85b143-152、Ag85b199-207、および19kDa Ag88-97を、それぞれ、T2細胞に負荷し、CD8+ GALを添加し、かつインキュベーション48時間後、インビトロ・サイトカイン産生を測定した。黒色腫由来HLA-A2結合性gp100由来ペプチドを陰性対照として用いた。
本発明者らは、Ag85b199-207および19kDa Ag88-97のHLA A2テトラマーで染色することによって、抗原特異的CD8+ GALをインサイチューで視覚化するのを可能にする、十分な連続切片を、患者#3および#4由来の肉芽腫病変から得ることが可能であった。TCR結合テトラマーは、CLSMでは赤色に見え、一方、CD8αに対して向けられるmAbは、FITC標識され、緑色に見えた(図20)。しかし、テトラマー・インサイチュー染色によって、MHCクラス1/ペプチド特異的T細胞の空間的配置がインサイチューで視覚化可能になるが、この染色は、抗原特異的T細胞集団の分子組成には対処しない。MHC/ペプチド特異的T細胞におけるTCR使用を評価するため、本発明者らは、患者#3由来のHLA-2/Ag85b結合性CD8+ GALを選別し、かつTCR-CDR3分析を行った(図21)。テトラマー選別およびCD8+ GALにおけるTCR使用を比較すると、定義されるT細胞エピトープに対して向けられる、いくつかのクローン型の存在が示される。T細胞は、顕著なリンパ球浸潤(図20a)を伴って、肉芽腫病巣(HE、平行切片)から採取されている。潜伏性ヒト肺結核の異なる患者から単離されたHLA-DR4拘束性ESAT-6特異的CD4+ T細胞集団もまた、いくつかのT細胞クローン型が構成する(図21)。テトラマー・インサイチュー染色(図20b)は、Ag85b反応性T細胞が、肉芽腫組織のいくつかの場所に集中することを示唆する。ネズミ・リンパ系組織で先に観察されたように、テトラマー染色は、T細胞の1つ(またはいくつか)の極でクラスター形成するようであるTCRを視覚化し、球状の細胞上、単数または複数の鮮赤色の点の印象を与えたが、一方、CD8は、より一様に分布しているようであり、細胞に均質な環状の外見を与えた。二重発現に際して、赤色および緑色は、細胞の橙色〜黄色の着色を生じた。陰性対照としてgp100-MHCテトラマーで染色すると、単なるバックグラウンド染色が導かれる。テトラマー陽性細胞は、肉芽腫切片内のいくつかの異なる場所に集中した。患者#3に関して、平行組織切片のHE染色を示す。
潜伏性結核の免疫学的状況は、理解および研究が困難であった。ヒトにおけるPBLの分析から得られる結果は、感染部位自体での免疫応答を必ずしも反映しない可能性がある。いくつかの研究は、PBLにおいて、Th2型サイトカイン、例えばIL-10が顕著であることを報告する。他方、活性TB患者の他の区画、例えば胸水由来のT細胞、または気管支肺胞洗浄液によって単離されたT細胞は、顕著なIFN-γおよび/または増殖性応答を示し、これは、分析した同じ患者のPBLにおいては、低いかまたは存在さえしなかった。この現象は、おそらくCCR2またはCCR5などの特定のケモカイン受容体のため、特殊なMTB反応性T細胞が感染部位に隔離されてしまうためである可能性がある。したがって、肺組織自体における免疫学的事象をより詳細に見ることが、MTBに対する防御免疫のよりよい理解に必須である。
Claims (36)
- SEQ ID NO:3に示すようなアミノ酸配列を含む、ミコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)(MTB)由来の単離ヒトHLA-A2拘束性T細胞エピトープ。
- ヒトにおけるMTBまたはMTB以外のミコバクテリウムの感染またはこれらに対する曝露に関連する、請求項1記載のエピトープ。
- SEQ ID NO:3に示すようなアミノ酸配列を含む、ミコバクテリウム・ツベルクローシス(MTB)由来の単離ヒトHLA-A2拘束性T細胞エピトープ、およびその保存的バリエーション。
- SEQ ID NO:6、7、または8に示すようなアミノ酸配列を含む、ミコバクテリウム・ツベルクローシス(MTB)由来の単離ヒトHLA-DR4拘束性T細胞エピトープ。
- SEQ ID NO:6、7、または8に示すようなアミノ酸配列を含む、ミコバクテリウム・ツベルクローシス(MTB)由来の単離ヒトHLA-A2拘束性T細胞エピトープ、およびその保存的バリエーション。
- SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含む、請求項5記載のエピトープ。
- SEQ ID NO:7に示すようなアミノ酸配列を含む、請求項5記載のエピトープ。
- SEQ ID NO:8に示すようなアミノ酸配列を含む、請求項5記載のエピトープ。
- 請求項1、3、4、または5に示すようなポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
- DNAまたはcDNAである、請求項9記載の単離ポリヌクレオチド。
- RNAである、請求項9記載の単離ポリヌクレオチド。
- 遺伝コードの結果として、請求項9記載のポリヌクレオチド配列に縮重している、単離ポリヌクレオチド。
- T細胞エピトープが組換えにより産生される、請求項9記載の単離ポリヌクレオチド。
- 請求項9記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
- ウイルスである、請求項14記載のベクター。
- 請求項14記載のベクターで安定に形質転換された、宿主細胞。
- a)SEQ ID NO:8に示すようなアミノ酸配列を含む、結合したHLA結合性ペプチドを有する、HLA-DR4モノマーまたは修飾モノマーのマルチマーまたはオリゴマーと、被験体から得られたPBLを接触させる工程;
b)被験体におけるMTB感染または曝露の存在の指標となる、PBLへのマルチマーまたはオリゴマーの結合を、検出する工程
を含む、ヒト被験体において、MTBによる感染またはMTBに対する曝露の存在を診断するための方法。 - SEQ ID NO:6または7に示すようなアミノ酸配列を含む、結合したHLA結合性ペプチドを有する、HLA-DR4モノマーまたは修飾モノマーのさらなるマルチマーと、PBLを接触させる工程、およびPBLへのさらなるテトラマーの少なくとも1つの結合を検出する工程をさらに含む、請求項17記載の方法。
- 検出する工程がハイスループット・スクリーニングを含む、請求項18記載の方法。
- フルオロフォアでテトラマーを標識する工程をさらに含む方法であって、検出する工程が、フルオロフォアによって産生されるシグナルを測定する工程を含む、請求項18記載の方法。
- オリゴマーが、ストレプトアビジンまたは別の多価実体を含むテトラマーであり、かつフルオロフォアがストレプトアビジンに付着している、請求項20記載の方法。
- モノマーをビオチン化する工程、およびビオチンを介してストレプトアビジンにモノマーを結合させる工程をさらに含む、請求項21記載の方法。
- SEQ ID NO:6または7に示すようなアミノ酸配列を含む、結合したHLA結合性ペプチドを有する、HLA-DR4モノマーまたは修飾モノマーのさらなるテトラマーと、PBLを接触させる工程、およびPBLへのさらなるテトラマーの少なくとも1つの結合を検出する工程をさらに含む、請求項18記載の方法。
- a)SEQ ID NO:3に示すようなアミノ酸配列を含む、結合したHLA結合性ペプチドを有する、HLA-A2モノマーまたは修飾モノマーのテトラマー、オリゴマー、またはマルチマーと、被験体から得られたPBLを接触させる工程;および
b)被験体におけるMTB感染または曝露の存在の指標となる、PBLへのテトラマーの結合を、検出する工程
を含む、ヒト被験体において、MTBによる感染またはMTBに対する曝露の存在を診断するための方法。 - SEQ ID NO:1または2に示すようなアミノ酸配列を含む、結合したHLA結合性ペプチドを有する、HLA-A2モノマーまたは修飾モノマーのさらなるテトラマー、オリゴマー、またはマルチマーと、PBLを接触させる工程、およびPBLへのさらなるテトラマーの少なくとも1つの結合を検出する工程をさらに含む、請求項24記載の方法。
- 検出する工程がハイスループット・スクリーニングを含む、請求項24記載の方法。
- フルオロフォアでテトラマーを標識する工程をさらに含む方法であって、検出する工程が、フルオロフォアによって産生されるシグナルを測定する工程を含む、請求項24記載の方法。
- テトラマーがストレプトアビジンを含み、かつフルオロフォアがストレプトアビジンに付着している、請求項27記載の方法。
- モノマーをビオチン化する工程、およびビオチンを介してストレプトアビジンにモノマーを結合させる工程をさらに含む、請求項28記載の方法。
- a)潜伏性MTBのため薬剤を用いた治療を受けている、DR4アレルを持つ患者から、PBLを含む試料を得る工程;
b)適切な結合条件下で、以下の少なくとも1つから選択されるHLAモノマーまたは修飾モノマーの結合したテトラマーを有する固体支持体と、試料を接触させる工程:
1)SEQ ID NO:6、7、8に示すアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、結合したHLA結合性ペプチドを有する、HLA-DR4モノマーまたは修飾モノマー;および
2)SEQ ID NO:1、2、または3に示すようなアミノ酸配列を含む、結合したHLA結合性ペプチドを有する、HLA-A2モノマーまたは修飾モノマー;および
c)PBLへのテトラマーの結合量を検出する工程;および
d)治療期間の適切な間隔後に、a)、b)、およびc)を反復する工程
を含み、
治療期間の適切な間隔後の結合量の減少が、薬剤の有効性を示し、かつ減少の欠如が、ヒトにおけるMTBの感染または潜伏の治療または予防のための薬剤の有効性の欠如を示す、
ヒト被験体におけるMTB感染の感染または潜伏の治療または予防のための薬剤の有効性を決定するための方法。 - 薬剤が抗TBワクチンである、請求項30記載の方法。
- 薬剤が、任意のミコバクテリウムのインビトロ増殖を減少させるかまたは抑止する、任意の化学的化合物である、請求項30記載の方法。
- 被験体がHLA-DR4アレルを有し、かつ結合性ペプチドがSEQ ID NO:8に示すようなアミノ酸配列を含む、または被験体がHLA-A2アレルを有し、かつ結合性ペプチドがSEQ ID NO:3に示すようなアミノ酸配列を含み、
a)結合したHLA結合性ペプチドを有する、HLAモノマーまたは修飾モノマーのテトラマーと、被験体から得られたPBLを接触させる工程;および
b)PBLへのテトラマーの結合を検出して、被験体における、M.レプレ(M. leprae)またはM.ツベルクローシス感染または曝露の存在を同定する工程
を含む方法。 - SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、およびその保存的バリエーションからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ミコバクテリウム・ツベルクローシス(MTB)由来の単離ヒトHLA-A2拘束性T細胞エピトープ。
- a)SEQ ID NO:21〜25のいずれかに示すようなアミノ酸配列を含む、結合したHLA結合性ペプチドを有する、HLA-A2モノマーまたは修飾モノマーのテトラマー、オリゴマー、またはマルチマーと、被験体から得られたPBLを接触させる工程;および
b)被験体におけるMTB感染または曝露の存在の指標となる、PBLへのテトラマーの結合を、検出する工程
を含む、ヒト被験体において、MTBによる感染またはMTBに対する曝露の存在を診断するための方法。 - a)潜伏性MTBのため薬剤を用いた治療を受けている、DR4アレルを持つ患者から、PBLを含む試料を得る工程;
b)適切な結合条件下で、以下の少なくとも1つから選択されるHLAモノマーまたは修飾モノマーの結合したテトラマーを有する固体支持体と、試料を接触させる工程:
1)SEQ ID NO:6、7、8に示すアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、結合したHLA結合性ペプチドを有する、HLA-DR4モノマーまたは修飾モノマー;および
2)SEQ ID NO:1、2、3、21、22、23、24、または25に示すようなアミノ酸配列を含む、結合したHLA結合性ペプチドを有する、HLA-A2モノマーまたは修飾モノマー;および
c)PBLへのテトラマーの結合量を検出する工程;および
d)治療期間の適切な間隔後に、a)、b)、およびc)を反復する工程
を含み、
治療期間の適切な間隔後の結合量の減少が、薬剤の有効性を示し、かつ減少の欠如が、ヒトにおけるMTBの感染または潜伏の治療または予防のための薬剤の有効性の欠如を示す、
ヒト被験体におけるMTB感染の感染または潜伏の治療または予防のための薬剤の有効性を決定するための方法。
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