JP3944452B2 - 潜伏性ヒト結核モデル、診断用抗原、および使用法 - Google Patents
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Description
本出願は、2001年1月8日に出願された、米国特許仮出願第60/260,348号、および、2001年8月9日に出願された、米国特許仮出願第60/311,235号の利権を主張する。
本発明は、米国政府機関である、連邦防疫センター(Centers for Disease Control and Prevention)によって行われた。したがって、米国政府は、本発明において、一定の権利を有する。
本開示は、ミコバクテリアの潜伏期についての技術分野に関連し、特に、ミコバクテリアの研究のための、ならびに、結核薬およびワクチン候補の開発のための、インビトロの肉芽腫モデルに関連する、ならびに、免疫学的検定法を用いた潜伏性ミコバクテリア感染の検出に関連する。
世界中のどこかで、およそ10秒毎に人は結核によって死亡している。結核は、感染症の中では、世界で死亡例が最も多いものであり、生殖年齢にある女性では最上位の死因となっている。開発途上国が最も多く疾患を保有しているにも関わらず、米国国民は非常に高い頻度で結核に罹患しており、2000年には16,377例が報告されている。
結核潜伏期についてのインビトロのモデルが、本開示のある態様において説明される。特に、インビトロの肉芽腫モデルおよびそのモデルを使用するための方法が提供される。ある態様においては、インビトロの肉芽腫モデルは、ヒトの末梢血単核細胞、自己マクロファージおよびミコバクテリアを含む。ある態様においては、これらの成分は、低付着性容器において組み合わせられる。特定の例においては、インビトロの肉芽腫モデルは、例えばヒトの肺線維芽細胞のような線維芽細胞をさらに含む。
付随の配列表において挙げられる核酸配列およびアミノ酸配列は、37 C.F.R. 1.822において定義されるように、ヌクレオチド塩基については標準の文字略語、および、アミノ酸については3文字コードを用いて示される。各核酸配列の一方の鎖のみが示されるが、その相補鎖は、示された鎖についてのいかなる言及によっても包含されるものと理解される。付随の配列表においては:
配列番号:1および配列番号:2は、N末端FLAG-Acr融合物を作製するために使用されるプライマーの配列である。
配列番号:3および配列番号:4は、C末端Acr-FLAG融合物を作製するために使用されるプライマーの配列である。
I.略語
Acr アルファ(α)クリスタリン
ELISA 酵素結合イムノソルベントアッセイ
HS ヒト血清
LSA 潜伏期特異的抗原
LSBP 潜伏期特異的結合パートナー
PBMC 末梢血単核細胞
RPA リボヌクレアーゼ保護アッセイ
RT-PCR 逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
II.用語
特記しない限り、技術的用語は、従来的な語法に従って使用される。分子生物学における一般用語の定義は、Benjamin Lewin, 「遺伝子V(Genes V)」, Oxford University Press, 1994(ISBN 0-19-854287-9);Kendrewら(編), 「分子生物学辞典(The Encyclopedia of Molecular Biology)」, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9);およびRobert A. Meyers(編), 「分子生物学およびバイオテクノロジー:包括的な参考書(Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference)」, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)において見出すことができよう。
1)アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T);
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
4)アルギニン(R)、リシン(K);
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);および
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)。
本明細書の第一の態様においては、被験者における潜伏性結核を検出するための免疫学的アッセイ法が提供される。そのような方法は、被験者に由来する、第一の潜伏期特異的結合パートナー(LSBP)を含み得る生物学的サンプルを、対応するLSBPと接触させる段階、および、第一のLSBPと対応するLSBPとの間の結合を検出する段階を含み、そのような結合は被験者における潜伏性結核を示唆する。これらの方法のある特定の例においては、第一のLSBPは抗体であり、対応するLSBPは潜伏期特異的なヒト結核菌抗原(例えば、α-クリスタリン(Acr)またはその免疫原性断片)である。本方法の他の特定の例においては、第一のLSBPは潜伏期特異的なヒト結核菌抗原であり、対応するLSBPは抗体である。本方法のある特定の例においては、抗原はAcrまたはその免疫原性断片である。
本開示は、本態様において、一貫した、複製可能な、および確実な実験系を提供するような、インビトロの肉芽腫モデルを作製および使用するための方法を提供する。インビトロの肉芽腫は、例えば、肉芽腫の形成および維持について研究するため、ならびに、肉芽腫の形成、維持、または返転(reversion)に影響を与える化合物を、同定および特徴付けするため、ならびに、特にミコバクテリアの潜伏期を含むミコバクテリアの局面について研究するためのような、多くの適用において使用することができる。
本明細書において説明されるインビトロの肉芽腫モデルは、例えば結核薬候補のような候補化合物を正確にスクリーニングするために使用することができる。結核薬候補をスクリーニングする方法は、インビトロの肉芽腫モデルに薬剤候補を加える段階、および、薬剤が、肉芽腫に含まれるミコバクテリアを殺すか、またはさもなくば、肉芽腫中の細菌もしくは他の細胞の生理学を変化させるかどうかを決定する段階を含む。本モデルは、選択的に、潜伏性ミコバクテリア感染の治療において使用するための薬剤をスクリーニングするために使用される。
ミコバクテリアの休眠の分子メカニズムについての洞察を得るために、ならびに、休眠感染を検出および/または追跡するための分子を提供するために、低酸素への適応に関与すると疑われる遺伝子およびタンパク質を調べた。(本明細書において説明されるように)逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)技術を用いた結果、推定上の様々なストレス応答遺伝子の示差的な発現が確証された。嫌気性(シフトダウン)肉芽腫モデルにおいて増加した活性を示す、これらの遺伝子のうち2つは、酸化ストレス応答に関与する、oxyRおよびaphCである(Dhadayauthapaniら, J. Bacteriol. 178:3641〜3649, 1996)。第三の遺伝子は、マクロファージ内における細菌の増殖に必要とされることが報告された(Yuanら, Microbiol. 95, 16:9578〜9583, 1998)、α-クリスタリン、即ち、ATP非依存性のシャペロンをコードする(Henriquesら, J. Bacter. 179:1887〜1897, 1997;Horwitz, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 89:10449〜10453, 1992)。
潜伏性ヒト結核菌が、潜伏性ヒト結核菌感染を有する被験者において、その抗原、および/または、それに対して反応性の抗体を検出することができる程十分に高いレベルの潜伏期特異的抗原を産生し得ることが意外にも見出された。
潜伏期特異的なヒト結核菌タンパク質が一旦同定されれば、そのタンパク質、および/または、そのタンパク質上の1つまたはそれ以上のエピトープを特異的に認識する抗体を、免疫学的アッセイまたは他のアッセイにおいて使用するために十分な量で作製することは有益である。タンパク質、および、同定されたタンパク質に対して反応性の抗体を作製するための方法は、当業者にはよく知られている。以下の方法は、典型的な例として提供され、限定するものとして見なされるべきではない。
潜伏期特異的なタンパク質が一旦同定されれば、そのタンパク質をコードする配列を決定するのは、よく知られた技術の問題となる。例えば、ヒト結核菌ゲノムの全コード配列が知られている(Coleら、Nature 393:537〜544, 1998);これは、単離されたある潜伏期特異的タンパク質をコードする遺伝子を同定するために使用することができる。コード配列はその後、インビトロにおいて多量のタンパク質を作製するために使用することができる。
ヒト結核菌潜伏期特異的タンパク質、またはそのようなタンパク質内の特異的なエピトープに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を産生することができる。最適には、潜伏期特異的タンパク質に対して生み出された抗体は、特異的にそのタンパク質を検出する。即ち、そのような抗体は、Acrタンパク質を認識および結合し、生物学的サンプル中において認められる他のタンパク質を実質的には認識または結合しない。ある抗体が特異的にその標的潜伏期特異的タンパク質を検出することは、多くの標準免疫学的検定法の任意の1つによって決定される;例えば、ウエスタンブロット技術(Sambrookら, 「分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」, CSHL, New York, 1989)。
説明されるように同定および単離された、潜伏期特異的タンパク質(例えばAcr)のエピトープに対するモノクローナル抗体は、KohlerおよびMilstein(Nature 256:495, 1975)の古典的な方法、またはその派生法に従って、マウスのハイブリドーマから調製することができる。簡潔に言えば、数週間の期間に渡って、選択されたタンパク質の数μgを用いて、マウスに繰り返し接種する。マウスをその後殺し、脾臓の抗体産生細胞を単離する。ポリエチレングリコールによって、脾臓細胞はマウス骨髄腫細胞と融合され、アミノプテリンを含む選択培地(HAT培地)上における系の増殖によって、過剰な非融合細胞は破壊される。首尾よく融合した細胞を希釈し、希釈液のアリコートを、培養の増殖が続けられるマイクロタイタープレートのウェル中に入れる。抗体産生クローンは、Engvall(Enzymol. 70:419, 1980)によって初めに説明されたようなELISA、およびその派生法のような、免疫学的検定法による、ウェルの上清液中の抗体の検出によって同定される。選択された陽性クローンは増殖させることができ、それらのモノクローナル抗体産物を使用するために収集することができる。モノクローナル抗体産生についての手法の詳細は、HarlowおよびLane(「抗体、実験マニュアル(Antibodies, A Laboratory Manual)」, CSHL, New York, 1988)において説明されている。
1つのタンパク質の不均質なエピトープに対する抗体を含むポリクローナル抗血清は、修飾しないもの、または、免疫原性を増強するために修飾したものであり得る発現タンパク質を用いて、適切な動物個体を免疫化することによって調製することができる。有効なポリクローナル抗体産生は、抗原および宿主種の双方に関連する多くの要因によって影響される。例えば、小分子は、他のものより免疫原性がより弱い傾向があり、担体およびアジュバントの使用を必要とする可能性がある。さらに、宿主動物は、接種部位および用量に応じて変化し、不十分または過剰な抗原用量のいずれかによって力価の低い抗血清を生じさせる。複数の皮内部位において投与される、低用量(ngレベル)の抗原が最も確実であると考えられる。ウサギについての有効な免疫化プロトコールは、Vaitukaitisら(J. Clin. Endocrinol. Metab. 33:988〜991, 1971)において見出すことができる。
潜伏期特異的タンパク質に対する抗体を生み出すための第三のアプローチは、潜伏期特異的タンパク質の予測されるアミノ酸配列に基づき、商品として入手可能なペプチドシンセサイザーにおいて合成される、合成ペプチドを使用するものである。
抗体は、潜伏期特異的タンパク質を発現するDNAベクターを、マウスのような実験動物に皮下注射することによって、潜伏期特異的タンパク質に対して生じさせることができる。動物個体への組換えベクターの送達は、Tangら(Nature 356:152〜154, 1992)によって説明されるように、Biolisticシステム(Sanfordら, Particulate Sci. Technol. 5:27〜37, 1987)のハンディ形態を用いて達成することができる。この目的に適した発現ベクターは、ヒトβ-アクチンプロモーターまたはサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターのいずれかの転写調節下においてZ47コード配列を発現するものを含み得る。
本明細書における、潜伏性結核感染に特有の抗原の提供により、被験者におけるそのような抗原に対する免疫応答を刺激するための方法がここで可能になる。ある態様においては、そのような免疫応答は、被験者における潜伏性結核感染の成立に対して防御的なものとなる。潜伏期特異的なタンパク質(例えばAcr)は、例えば、潜伏性結核の治療、改善、または予防における免疫原性作用物質として使用することができる。このタイプの治療について選択される被験者は、潜伏性結核感染を有することが知られているもの、または有することが疑われるもの、または感染のリスクを有するものである。そのようなヒトの例は、ツベルクリン皮膚試験で陽性となるが、活性な疾患の根拠(例えば、疲労、食欲不振、体重減少、熱、夜間発汗、咳、喀血のような臨床的症状、または、活性な疾患を示唆するものとして認識されるX線撮影、もしくは他の検査による根拠)がない、または限られた根拠のみを有するようなものである。
免疫学的エリシター組成物およびワクチンを含む免疫学的組成物、および、潜伏期特異的ポリペプチドまたはその抗原性断片を含む、他の薬学的組成物は、ミコバクテリア感染、特に潜伏性ヒト結核菌感染を低減させる、改善する、治療する、またはことによると予防するために有用である。1つまたはそれ以上のポリペプチドは、ワクチン技術分野における当業者に知られる方法および材料を用いて、単独で、またはアジュバントもしくは他の抗原と組み合わせて、製剤化および包装される。そのような免疫学的組成物に対する被験者の免疫学的反応は、治療的に、または予防的に使用することができ、ある態様においては、細胞傷害性Tリンパ球またはCD4+Tリンパ球のようなTリンパ球によって生み出されるもののような、抗体免疫および/または細胞性免疫を提供する。
インビトロの肉芽腫を増殖させるために、または、免疫学的結合反応を用いて生物学的サンプル中における潜伏期特異的抗原および/もしくは抗体の存在(もしくは不在)を決定するために、必要な試薬を含むキットが提供される。診断キットにおいて提供される使用説明書は、決定された(例えば実験的に測定された)値または他の結果と比較するために、検量線、ダイアグラム、説明図、または図表もしくは同様のものを含み得る。
インビトロの肉芽腫を増殖させるためのキットは、例えば、細胞培養基(例えばRPMIに10%のヒト血清、HSを加えたもの)を含み、選択的に、低付着性容器(例えば、全ての付着を妨げるように処理した組織培養皿)、フィルター、および/または固定液を含み得る。そのようなキットの特定の例は、例えばIL-2、IFN-γ、および/またはTNF-αのような、ある量の1つまたはそれ以上のサイトカインをも含む。キットにおいて供給される試薬は、別々の容器に含まれることが可能である。
潜伏期特異的ヒト結核菌タンパク質発現の検出のためのキットは、例えば、少なくとも1つの標的タンパク質特異的結合作用物質(例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体または抗体断片)を含み、少なくとも1つの対照を含み得る。潜伏期特異的タンパク質特異的結合作用物質および対照は、別々の容器に含まれることが可能である。本キットはまた、例えば作用物質を検出可能なように標識することができる、標的タンパク質:作用物質複合体を検出するための方法をも含み得る。検出可能な作用物質が標識されない場合は、それは、例えばあるキットにおいて1つまたはそれ以上の別々の容器にて同様に提供することができる、二次抗体またはプロテインAによって検出することができる。そのような技術はよく知られている。
アッセイキットの他の例では、抗原として組換え潜伏期特異的タンパク質、二次抗体として酵素結合ヤギ抗ヒトIgGが提供される。そのようなキットの例はまた、1つまたはそれ以上の酵素の基質をも含み得る。そのようなキットは、被験者からの生物学的サンプルが潜伏期特異的タンパク質に対する抗体を含むかどうかを試験するために使用することができる。
実施例1:インビトロの肉芽腫モデルの調製および特徴付け
ミコバクテリア感染に対するヒト宿主の主な防御は、Tリンパ球に囲まれた、および後にはマクロファージのコアの周りに凝集する線維芽細胞およびコラーゲンに囲まれる、類上皮細胞および多核巨細胞を含む、活性化マクロファージの密集した組織化集塊である、肉芽腫の形成である。肉芽腫は、侵襲する生物体を隔離することによって、活性な(非潜伏性の)疾患を予防し得る。肉芽腫が維持される場合、これらの細菌は何年間も潜伏性のままである可能性がある。
低酸素チェンバーにおいて培養された細菌を用いて、利用可能な酸素の大部分が利用された後に示差的に発現されたヒト結核菌遺伝子を同定した。示差的に発現された遺伝子は、acr、sigF、oxyRおよびaphCであった。これらの4つの遺伝子のうち、acrは、ミコバクテリウム属によって分泌されるタンパク質(α-クリスタリン)をコードする。
以下の実施例は、(例えば、薬剤および免疫刺激化合物をスクリーニングするために、ならびに、潜伏期特異的抗原を同定するために、)例えば、インビトロの肉芽腫モデルについて得られた結果を確証するために使用することができる、他のインビトロの潜伏期モデルを提供する。
少数のヒト結核菌を用いてエアロゾル接種によって感染させた場合、細菌が、深部の肺胞における肺胞上皮細胞と関連した肉芽腫の形成を引き起こすことが認められた。これらの肉芽腫は明らかに、感染を完全に抑えることができず、細菌は結局はこの動物個体を圧倒するが、ヒトの肉芽腫と多くの類似点がある。例えば、これらの肉芽腫は壊死領域に集中し、類上皮細胞および多核巨細胞およびTリンパ球を含むマクロファージを主に含む。これらの肉芽腫においては、細菌のAcr遺伝子の示差的な転写が検出された。
WayneおよびHayesは、調節された撹拌を伴う、密閉容器におけるインキュベーションにより、ヒト結核菌から徐々に酸素を剥奪する、インビトロの存続モデルを開発した(WayneおよびHayes, Infect. Immun. 64:2062〜2069, 1996)。これらの条件下における増殖は、操作上、2つの非複製存続(NRP)状態:グリシンデヒドロゲナーゼ活性の誘導に関連する微好気状態(NRP1)、およびそれに続く、グリシンデヒドロゲナーゼ活性が低下し、薬剤感受性における変化が明らかとなる、さらなる低酸素状態(NRP2)に分けることができる。具体的には、多分DNA超らせん性および細胞の透過性の各々における変化によって、細胞は、シプロフロキサシン(ciprofloxicin)に対して耐性となり、メトロニダゾルに対して感受性となる(WayneおよびHayes, Infect. Immun. 64:2062〜2069, 1996)。これらの観察は、1つの抗生物質療法に対する臨床的TBの難治性と関連付けられる(DickinsonおよびMitchison, Am. Rev. Respir. Dis. 123:367〜371, 1981)。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、作製した。これらのプライマーは、どのプライマーペアーが使用されたかによって、Acrのアミノ末端またはカルボキシ末端に融合されるFLAG(Sigma)エピトープタグを加えて、ヒト結核菌からのhspX遺伝子(Acrをコードする)を増幅させるよう設計された。プライマーの設計は、これらの増幅配列のクローニングおよび発現に関与する、後の組換えDNA法を容易にするための、制限エンドヌクレアーゼ認識部位の導入をも含んだ。N末端のFLAG-Acr融合を生み出すプライマーの配列は、配列番号:1および配列番号:2であった。C末端のAcr-FLAG融合を生み出すプライマーの配列は、配列番号:3および配列番号:4であった。
Acr-FLAG融合タンパク質を、製造業者の使用説明書に従い、シグマ社(Sigma)から得られるFLAG免疫沈降キットを用いて免疫沈降した。製造業者の使用説明書に従って、Acrに対して生じさせたポリクローナルウサギ抗体が結合されたセファロースCL4Bビーズ(Pharmacia)を用い、ミコバクテリア溶解産物について、天然Acrの免疫沈降を行った。手短に言えば、溶解産物から、セファロースビーズに非特異的に結合し得るいかなるタンパク質をも取り除くために、予備除去段階を実行した。これは、1.5 mLの微量遠心管において、975μlのTSA(0.01 M Tris-HCl、pH 8;0.14 M NaCl;0.025% NaN3)および16μlのMTB溶解産物(2.3 mg/mL)に50μlの非結合セファロースを加えることによって達成された。溶液を、常時揺り動かしながら4℃にて1時間インキュベートした。溶液をその後、14,000 rpmにて5秒間、遠心分離機にかけ、セファロースをペレット化し、上清を取り除き、新しい微量遠心管に移した。25μlの抗Acr抗体に結合させたセファロースビーズを上清に加え、常時揺り動かしながら4℃にて1時間インキュベートした。溶液をその後、以前に説明されたように遠心分離機にかけ、上清を除去して捨てた。セファロースペレットをその後、1)TSAに溶解した0.1%のTriton X-100、2)TSAに溶解した0.1%のTriton X-100、3)TSA、4)pH 6.8の0.05 M Tris-HClの各1 mLを用いて4回洗浄した。各溶液の添加に続き、セファロースペレットを再懸濁し、5秒間遠心分離機にかけ、セファロースを再ペレット化し、洗浄上清を除去した。最終的に、40μlの2×ゲル充填緩衝液(Novex)をセファロースペレットに加え、懸濁液を56℃にて1.5時間インキュベートした。セファロースを再ペレット化するために最終遠心分離を行い、上清(免疫沈降Acrタンパク質を含む)を取り除き、ウエスタンブロット法による解析のために残しておいた。
200ボルトの定電圧における、1時間の、既製の4〜12%bis-Trisポリアクリルアミド勾配ゲル(Novex)を用いたドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって、免疫沈降Acrサンプルまたはミコバクテリア溶解産物を分離した。電気泳動に続き、分離されたタンパク質を、製造業者の使用説明書に従って、150 ミリアンペア定電流における1時間の電気毛管移動により、カット済みの0.2ミクロンポリビニリデンジフルオリド膜(PVDF, Novex)に移行させた。Acrの検出のために、メタノール中に浸すことによって乾燥膜を調製し、3%のゼラチンを含むTBS Tween20(BioRad)中において、常時揺り動かしながら膜を1時間インキュベートすることによって、非結合PVDF表面をブロックした。膜をその後、Tween20を加えたTBSを用いて、常時揺り動かしながら各々10分間、3回洗浄した。
Acr-FLAG融合プラスミドを有するスメグマ菌およびヒト結核菌の溶解産物を調製した。細菌の懸濁培養を遠心分離機にかけること(5,000 rpm、10分間)によってペレット化し、リン酸緩衝液(PBS)で細菌のペレットを洗浄した。ペレットをその後、1 mLの9 M 尿素中にて再懸濁し、懸濁液を、およそ200μlの直径0.1 mmガラスビーズ(Biospec products)を含む2 mLの微量遠心管に移した。細胞をその後、ミニビーズビーター(Minibeadbeater)(Biospec products)における急速な振とう(3回、各1分間)によって溶解した。溶解に続き、遠心分離によって細胞の破砕物およびガラスビーズをペレット化し、上清を取り除いた。比色BioRadタンパク質アッセイ(BioRad)を用いてタンパク質の定量を行った。
クローン化ヒト結核菌 Acrタンパク質に対して生じさせたポリクローナル抗体を用い、低酸素チェンバーおよびインビトロの肉芽腫モデルからの培養上清において、分泌された細菌のAcrを検出した(図9)。エアロゾル感染モルモット肺肉芽腫組織におけるミコバクテリアを検出するためにも、Acrタンパク質に対するポリクローナル抗血清を使用した(図1C)。
Claims (4)
- 以下の段階を含む、被験者における潜伏性結核を検出するための免疫学的アッセイ法:
被験者に由来する第一の潜伏期特異的結合パートナー(LSBP)を含み得る生物学的サンプルを、対応するLSBPと接触させる段階であって、該第一のLSBPは潜伏期特異的ヒト結核菌抗原であり、該抗原はα - クリスタリン( Acr )またはその免疫原性断片である、段階、および
第一のLSBPと対応するLSBPとの間の結合を検出する段階であり、そのような結合が、被験者における潜伏性結核を示唆するものであるような段階。 - 対応するLSBPが抗体またはその断片である、請求項1記載の方法。
- 少なくとも1つのLSBP、および、請求項1記載の方法を実行するための使用説明書を含む、被験者における潜伏性結核を検出するためのキット。
- 生物学的サンプルが生物学的液体サンプルを含む、請求項1記載の方法。
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