ES2310072B1 - Nuevos peptidos determinantes antigenicos t colaboradores (/dth). - Google Patents
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Abstract
Nuevos péptidos determinantes antigénicos T
colaboradores (DTh).
La presente invención se refiere a un péptido
quimérico con capacidad de unirse al menos a una forma alélica de la
molécula HLA-DR. Asimismo, la invención se refiere
a una composición farmacéutica que comprende dicho péptido, así como
a distintos usos del mismo.
Description
Nuevos péptidos determinantes antigénicos T
colaboradores (DTh).
La presente invención se encuentra dentro del
campo de la determinación de péptidos antigénicos, capaces de
estimular las respuestas T colaboradoras (LTh).
Los linfocitos T colaboradores (LTh) realizan
diversas funciones importantes en la inmunidad frente a patógenos.
En primer lugar, la inducción de una respuesta inmune efectora
eficaz, bien sea una respuesta humoral o una respuesta celular
citotóxica, requiere de la activación de LTh, y más concretamente
de subpoblaciones específicas de LTh (Th1, Th2, Th0). En segundo
lugar, los LTh pueden actuar también directamente como células
efectoras, una actividad mediada por contacto celular directo o por
la liberación de linfoquinas (IFN-\gamma,
TNF-\alpha, etc.). Por tanto, la estimulación de
respuestas T colaboradoras (Th) constituye un aspecto muy relevante
para el desarrollo de vacunas.
Es bien conocido como para lograr su efecto
estimulador, los LTh reconocen, a través de receptores específicos
(TCR) situados en su superficie, a complejos formados entre
moléculas MHC de Clase II y péptidos antigénicos. Estos péptidos
que se unen a las moléculas MHC Clase II, conocidos también como
epítopos Th o determinantes antigénicos Th (DTh), tienen
habitualmente tamaños entre 11 y 22 aminoácidos, y más
frecuentemente entre 13 y 16 aminoácidos.
En los últimos años, las vacunas basadas en
epítopos han despertado un interés considerable como posible
herramienta en el desarrollo de nuevas vacunas y estrategias
inmunoterapéuticas. Una cuidada selección de epítopos para células
B y T debería permitir dirigir las respuestas inmunes hacia
epítopos conservados de ciertos patógenos caracterizados por una
gran variabilidad de secuencia (por ejemplo malaria, virus de la
hepatitis C, VIH, etc.).
Por otra parte, las vacunas basadas en epítopos
ofrecen la oportunidad de incluir DTh quiméricos que han sido
fabricados para modular su potencia estimuladora, bien sea
aumentando su capacidad de unión a las moléculas MHC del complejo
principal de histocompatibilidad, o bien modificando los residuos
de contacto con los receptores TCR de células T, o bien modificando
ambas características. Debido a la naturaleza quimérica de estos
péptidos, existen muy pocas posibilidades de que su secuencia esté
contenida en antígenos propios, por lo que si tras su utilización
se indujeran anticuerpos frente a los péptidos habría poca
probabilidad de inducir respuestas indeseadas contra antígenos
propios.
La predicción y selección de los epítopos
apropiados tropieza sin embargo con un obstáculo importante: el
gran número de polimorfismos existente entre las moléculas MHC,
que afectan muy particularmente a las regiones de unión al epítopo
y de reconocimiento de los LTh. Este polimorfismo se produce como
resultado del carácter poligénico del complejo principal de
histocompatibilidad MHC y del gran número de variantes alélicas
existentes para cada uno de estos loci genéticos. Así por
ejemplo, el MHC Clase II humano comprende 3 pares de genes (cada par
con su cadena \alpha y \beta), denominados
HLA-DR, HLA-DP y
HLA-DQ, que dan lugar a 4 tipos básicos de
moléculas HLA Clase II. Una revisión general puede encontrarse en
el manual: Immunobiology - The immune system in health and disease;
Janeway CA Jr and Travers P Eds.; Current Biology Ltd/Garland
Publishing Inc., London, 1997 3^{rd} Ed. Este polimorfismo da
lugar por tanto a la expresión de muchas moléculas MHC distintas,
cada una de ellas con rangos diferentes de especificidad para la
unión de epítopos (restricción MHC).
Aunque los residuos polimórficos específicos de
alelo que bordean el surco de unión al epítopo otorgan a la
molécula MHC la capacidad de unirse a un cierto conjunto de
péptidos, hay bastantes casos en los que un mismo péptido es capaz
de unirse a más de una forma alélica de la molécula MHC. Esto se ha
constatado de modo particular para las moléculas
HLA-DR, donde varias formas alélicas
HLA-DR pueden reconocer motivos similares de
péptidos, al mismo tiempo que se ha comprobado que ciertos péptidos
son reconocidos por diferentes moléculas HLA-DR.
Esto ha llevado al concepto de que ciertos péptidos podrían
representar epítopos promiscuos o universales.
Así, la utilización de diferentes algoritmos ha
permitido definir diversos motivos útiles para la selección de
epítopos, habiéndose identificado algunos epítopos universales
reconocidos por un buen número de isoformas de las moléculas HLA, y
más particularmente de las HLA-DR (WO95/07707;
Alexander J et al. Immunity, 1994, 1:751-761;
WO98/32456).
Este último tipo de péptidos más promiscuos,
podrían ser de gran utilidad para inducir respuestas humorales y
celulares en una gran diversidad de individuos sanos, lo que
evitaría tener que elegir péptidos especiales según fuera el
HLA-DR de dichos individuos.
Aunque se disponga ya de un conjunto de estos
péptidos promiscuos, como los péptidos PADRE (Alexander J et
al. Immunity, 1994, 1:751-761), sigue siendo
interesante identificar nuevos péptidos quiméricos promiscuos. Esto
es debido a que a pesar de que todos estos péptidos comparten el
ser reconocidos por varios HLA-DR, unos péptidos
podrían resultar mejores que otros para el reconocimiento por un
HLA-DR en concreto. Por consiguiente, sería de gran
utilidad disponer de una batería más amplia de péptidos promiscuos
para así cubrir mejor la inducción de respuestas frente a la
totalidad de los HLA-DR. Además, es también
deseable identificar péptidos que se unan y puedan ser reconocidos
en el contexto del resto de isotipos HLA-DP y
HLA-DQ. Esto permitiría generar vacunas y productos
inmunoterapéuticos para un espectro más amplio de personas.
Con el propósito de identificar nuevos péptidos
quiméricos que tuvieran el potencial de unirse fuertemente a
diferentes moléculas HLA-DR, y en consecuencia, ser
capaces de proporcionar ayuda para la inducción de anticuerpos y
también de respuestas T citotóxicas, se sintetizaron un conjunto de
péptidos de 13 aminoácidos. Para ello, se establecieron unas
fórmulas o patrones de secuencia ideados tomando como referencia de
partida un motivo de 8 aminoácidos descrito por los propios
inventores (Borrás-Cuesta F. et al.;
Specific and general HLA-DR binding motifs:
comparison algorithms; Human Immunol., 2000;
61:266-278).
Primeramente se sintetizaron péptidos cuya
secuencia se ajustaba a la fórmula:
- I)
- a_{1}-a_{2}-Y-R-a_{5}-M-a_{7}-R-a_{9}-R-A-A-A;
donde Y es Tyr; R es Arg; M es Met;
A es Ala; a_{1} es Phe o Tyr; a_{2} es Lys o Arg; a_{5},
a_{7} y a_{9} son cualquiera de los 20 aminoácidos
naturales.
En todos los casos se utilizó una tirosina como
ancla primaria en el tercer residuo (primer residuo del motivo
anteriormente referenciado). Además, para alcanzar la longitud
típica de 13 aminoácidos en la mayoría de los DTh (Chicz R.M. et
al.; Predominant naturally processed peptides bound to
HLA-DR1 are derived from MHC-related
molecules and are heterogeneous in size; Nature, 1992; 358:
764-768), al núcleo de 8 aminoácidos se le agregaron
tres alaninas en su extremo C-terminal y otros dos
aminoácidos en su extremo N-terminal: un aminoácido
aromático (fenilalanina o tirosina) en el primer residuo y un
aminoácido con carga positiva (lisina o arginina) en el segundo
residuo. La utilización de fenilananina o tirosina en el primer
residuo proporciona un punto de anclaje
adicional.
adicional.
Además, en dicha fórmula se fijaron los
aminoácidos que ocuparían las posiciones 4, 6, 8 y 10 de los
péptidos.
A partir de esta primera fórmula se
establecieron otras fórmulas para la síntesis y evaluación de
péptidos, en las que se dejó abierta la posibilidad de variar dos
de los cuatro aminoácidos fijados en las posiciones 4, 6, 8 y 10
anteriormente indicadas. Las fórmulas ensayadas fueron las
siguientes:
- II)
- a_{1}-a_{2}-Y-R-a_{5}-M-a_{7}-a_{8}-a_{9}-a_{10}-A-A-A;
- III)
- a_{1}-a_{2}-Y-a_{4}-a_{5}-M-a_{7}-a_{8}-a_{9}-R-A-A-A;
- IV)
- a_{1}-a_{2}-Y-R-a_{5}-a_{6}-a_{7}-a_{8}-a_{9}-R-A-A-A;
donde Y es Tyr; R es Arg; M es Met;
A es Ala; a_{1} es Phe o Tyr; a_{2} es Lys o Arg; a_{4} es
cualquiera de los 20 aminoácidos naturales distinto de Arg;
a_{5}, a_{7} y a_{9} son cualquiera de los 20 aminoácidos
naturales; a_{6} es cualquiera de los 20 aminoácidos naturales
distinto de Met; a_{7} es cualquiera de los 20 aminoácidos
naturales distinto de Arg; y a_{10} es cualquiera de los 20
aminoácidos naturales distinto de
Arg.
Igualmente se sintetizó un péptido de
secuencia:
- V)
- SEQ. ID. NO: 21,
en el que se variaron los
aminoácidos en 3 de las posiciones fijadas inicialmente,
manteniendo la metionina en la posición
6.
Con fines comparativos se sintetizaron también
algunos péptidos cortos de 8 y 9 aminoácidos que también tenían
como ancla primaria tirosina y en la mayoría de las posiciones
restantes del núcleo, aminoácidos que favorecen la unión a
HLA-DR.
Una vez sintetizados se evaluó su capacidad para
unirse fuertemente a distintas formas alélicas de la molécula
HLA-DR, resultando que la mayoría de ellos era
capaz de unirse fuertemente al menos a una de las formas
alélicas.
De lo anterior se obtuvo una secuencia general.
Así, en una primera realización, la presente invención se refiere
a un péptido quimérico con capacidad para unirse al menos a una
forma alélica de la molécula HLA-DR, caracterizado
porque su secuencia de aminoácidos se ajusta a una fórmula
seleccionada entre:
- a)
- a_{1}-a_{2}-Y-a_{4}-a_{5}-a_{6}-a_{7}-a_{8}-a_{9}-a_{10}-A-A-A; y
- b)
- SEQ. ID. NO: 21;
donde Y es Tyr; A es Ala; a_{1}
es Phe o Tyr; a_{2} es Lys o Arg; a_{4} es Arg, excepto cuando
a_{6} y a_{10} son Met y Arg, respectivamente, donde a_{4}
puede ser cualquiera de los aminoácidos naturales; a_{5}, a_{7}
y a_{9} son cualquiera de los 20 aminoácidos naturales; a_{6}
es Met excepto cuando a_{4} y a_{10} son Arg, caso en el que
a_{6} es cualquiera de los aminoácidos naturales; a_{8} es Arg,
excepto cuando a_{4} es Arg, Tyr o His, a_{6} es Met o Val y
a_{10} es Met, His o Arg, caso en el que a_{8} es cualquiera de
los aminoácidos naturales; y a_{10} es Arg, excepto cuando
a_{4} es Arg o His y a_{6} es Met, caso en el que a_{10} es
cualquiera de los aminoácidos
naturales.
Por tanto, un segundo aspecto de la presente
invención se refiere a un péptido quimérico con capacidad para
unirse al menos a una forma alélica de la molécula
HLA-DR cuya secuencia de aminoácidos se ajusta a
una de las fórmulas I), II), III), y IV) definidas anteriormente.
En adelante nos referiremos a él como "péptido quimérico de la
invención" o como "péptido de la invención". En una
realización particular dicha forma alélica HLA-DR
corresponde al serotipo HLA-DR1,
HLA-DR2, HLA-DR3,
HLA-DR4, HLA-DR7,
HLA-DR8 o HLA-DR11.
En una realización particular, el péptido
quimérico de la invención se une fuertemente al menos a 2 formas
alélicas de HLA-DR de distinto serotipo, y
preferentemente a 3, 4, 5, 6 o incluso 7 de estas formas
alélicas.
En algunos casos, el péptido quimérico de la
invención puede unirse también a otros isotipos de moléculas HLA
Clase II, por ejemplo HLA-DP o
HLA-DQ. En una realización particular se unen
también a algunas formas alélicas de HLA-DQ.
En una realización preferente, el péptido
quimérico de la invención se comporta como un epítopo o
determinante antigénico Th (DTh). Los términos epítopo Th o DTh se
utilizan indistintamente y significan que dicho péptido, unido a la
molécula HLA, es reconocido por linfocitos Th, y es capaz de
inducir la activación de dichos linfocitos o células T
colaboradoras Th (respuesta Th). Esta activación se evidencia por
su capacidad para inducir la proliferación de linfocitos Th y para
inducir la producción de linfoquinas específicas de estos
linfocitos Th, como la IL-4, el
IFN-\gamma o el TNF-\alpha. La
respuesta Th inducida puede ser una respuesta Th1, Th2, o una
respuesta mixta Th0. Esta capacidad de actuar como DTh es posible
en el contexto de al menos una de las formas de
HLA-DR, HLA-DP o
HLA-DQ indicadas.
De modo preferente, el péptido quimérico de la
invención es capaz también de inducir una respuesta inmunitaria
efectora humoral o T citotóxica. En una realización dicha respuesta
es una respuesta Tc.
En una realización particular, el péptido
quimérico de la invención es un péptido de secuencia SEQ. ID. NO:
1,
SEQ. ID. NO: 4, SEQ. ID. NO: 5, SEQ. ID. NO: 6, SEQ. ID. NO: 7, SEQ. ID. NO: 10, SEQ. ID. NO: 11,
SEQ. ID. NO: 12, SEQ. ID. NO: 13, SEQ. ID. NO: 14, SEQ. ID. NO: 15, SEQ. ID. NO: 16, SEQ. ID. NO: 17, o
SEQ. ID. NO: 20.
SEQ. ID. NO: 4, SEQ. ID. NO: 5, SEQ. ID. NO: 6, SEQ. ID. NO: 7, SEQ. ID. NO: 10, SEQ. ID. NO: 11,
SEQ. ID. NO: 12, SEQ. ID. NO: 13, SEQ. ID. NO: 14, SEQ. ID. NO: 15, SEQ. ID. NO: 16, SEQ. ID. NO: 17, o
SEQ. ID. NO: 20.
Los péptidos quiméricos de la invención pueden
obtenerse por métodos convencionales, por ejemplo, mediante
técnicas de síntesis química en fase sólida; purificarse mediante
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC); y, si se desea, se
pueden analizar mediante técnicas convencionales, por ejemplo,
mediante secuenciación y espectrometría de masas, análisis de
aminoácidos, resonancia magnética nuclear, etc. Alternativamente,
los péptidos de la invención pueden también obtenerse mediante la
tecnología del ADN recombinante.
Los péptidos quiméricos de la invención podrían
utilizarse para administración a un sujeto (un hombre, una mujer o
cualquier otro animal mamífero) con fines inmunoprofilácticos o
inmunoterapéuticos. Por tanto, en otro aspecto la invención se
refiere también a una composición farmacéutica que contiene un
péptido quimérico de la invención (o una pluralidad de ellos) y un
excipiente farmacéuticamente aceptable.
En una realización particular, un péptido
quimérico de la invención (o una pluralidad de ellos) puede ser
administrado en una combinación inmunoestimuladora junto con otro u
otros inmunógenos distintos de los péptidos quiméricos de la
invención. Esta combinación puede presentarse en forma de una única
composición farmacéutica o de composiciones farmacéuticas separadas
para administración combinada, mediante una administración
simultánea o secuencial, por la misma vía de administración o por
vías distintas. Así, la presente invención se refiere también a una
composición farmacéutica caracterizada porque comprende un péptido
quimérico de la invención y otro inmunógeno.
El término "inmunógeno" se refiere a una
molécula que es capaz de inducir una respuesta inmunológica
específica frente a dicho inmunógeno (humoral: producción de
anticuerpos; o celular: activación de linfocitos Th, activación de
linfocitos Tc, etc.). Por su naturaleza química el inmunógeno
podría ser casi cualquier molécula: por ejemplo, polipéptidos,
lipopéptidos, oligosacáridos, polisacáridos, ácidos nucleicos,
lípidos, u otros compuestos químicos como fármacos. Por su origen,
dicho inmunógeno puede proceder por ejemplo de un patógeno (virus,
bacteria, hongo, parásito, etc.), de una célula tumoral, de
síntesis (fármacos u otros compuestos de síntesis) o de cualquier
otro origen (por ejemplo alergenos). En algunos casos dicho
inmunógeno es un determinante antigénico proteico, por ejemplo un
determinante antigénico Th o un determinante antigénico Tc.
En una realización más particular la composición
farmacéutica de la invención contiene un determinante T citotóxico
(DTc) y un péptido quimérico de la invención (o una pluralidad de
ellos) que actúa como determinante T colaborador (DTh).
Cuando la composición farmacéutica contiene un
péptido quimérico de la invención y otro u otros inmunógenos, estos
pueden presentarse como moléculas separadas o formando conjugados,
por ejemplo mediante enlaces covalentes. La conjugación puede
realizarse por diversos métodos convencionales que se describen por
ejemplo en: "The current protocols in protein chemistry",
publicado por John Wiley & Sons (actualizado periódicamente;
Última actualización 1 de mayo de 2005); "Immobilized affinity
ligand Techniques", GT Hermanson, AK Mallia and PK Smith,
Academic Press, Inc. San Diego, CA, 1992; EP0876398; entre
otros.
La composición farmacéutica que comprende un
péptido quimérico de la invención puede contener adicionalmente
vehiculizantes, excipientes, y otros ingredientes farmacéuticamente
aceptables conocidos.
Todavía en otro aspecto adicional la invención
se refiere al uso de un péptido quimérico de la invención (o una
pluralidad de ellos) en la preparación de una composición
farmacéutica inmunoestimuladora. Esta composición farmacéutica
puede emplearse para inducir una respuesta inmunitaria específica
frente a un inmunógeno administrado en combinación con un péptido
quimérico, dentro de la misma composición o en composiciones
separadas como se ha descrito anteriormente. De esta manera, el
péptido quimérico de la invención se emplea para inducir una
respuesta Th (activación de linfocitos Th) en un sujeto al que se
le administra la composición farmacéutica. Dicha respuesta puede
ser una respuesta Th1, Th2 o una respuesta mixta Th0.
En una realización concreta, esta respuesta Th
coopera en la activación de linfocitos B, de manera que la
composición farmacéutica con el péptido quimérico es útil para
inducir una respuesta inmunitaria humoral.
En otra realización, la respuesta Th colabora en
la activación de linfocitos Tc, de manera que la composición
farmacéutica es útil para inducir una respuesta celular T
citotóxica Tc.
Adicionalmente, la composición farmacéutica
inmunoestimuladora con el péptido quimérico de la invención podría
tener otros usos, como por ejemplo el tratamiento o
pre-condicionamiento in vitro de células
dendríticas con fines terapéuticos.
En consecuencia, la composición farmacéutica
inmunoestimuladora que contiene un péptido quimérico de la
invención es útil para el tratamiento y profilaxis de una enfermedad
infecciosa (bacteriana, viral, fúngica, o parasitaria), tumoral o
alérgica.
La composición farmacéutica inmunoestimuladora
de la invención puede aplicarse a cualquier sujeto animal o
humano: p.ej. mamíferos (humanos o no), aves y similares. Para ello
puede emplearse cualquier vía de administración adecuada de acuerdo
con los métodos convencionales conocidos de la técnica común. Una
revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de
medicamentos y de los excipientes necesarios para la obtención de
las mismas puede encontrarse, por ejemplo, en "Tecnología
farmacéutica", de J.L. Vila Jato, 1997 Vols I y II, Ed.
Síntesis, Madrid; o en "Handbook of pharmaceutical manufacturing
formulations", de S.K. Niazi, 2004 Vols I a VI, CRC Press, Boca
Raton. En una realización concreta, la composición farmacéutica se
administra por vía parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea,
intramuscular, intraperitoneal), transdérmica, mucosa o
similares.
La invención proporciona también un método
terapéutico y/o profiláctico que incluye administrar a un sujeto
una composición farmacéutica que incluye un péptido quimérico de
la invención (o una pluralidad de ellos). Este método permite
activar los linfocitos Th en dicho sujeto induciendo una respuesta
Th que colabora bien en la estimulación de una respuesta humoral
para la producción de anticuerpos, o bien en la estimulación de una
respuesta citotóxica por la activación de linfocitos Tc específicos
frente a un inmunógeno. Dicho método puede ser un método para
tratamiento terapéutico o profiláctico de una enfermedad infecciosa
(bacteriana, viral, fúngica, o parasitaria), tumoral o
alérgica.
alérgica.
Figura 1. Capacidad de unión de péptidos
quiméricos a diferentes moléculas HLA-DR. Se
expresa como porcentaje de unión relativa (%U_{R}), en términos
relativos a la unión del péptido control
HA(306-320) no biotinilado: APKYVKQNTLKLATG.
La densidad de las cuadrículas representa un orden creciente de
porcentaje, de acuerdo con la clave al pie de la figura.
Figura 2. Unión del péptido p45 biotinilado a la
línea celular HLA-DR4. Se incubaron células
HLA-DR4 con diferentes concentraciones de péptido
biotinilado y se midió su fluorescencia (expresada como unidades
arbitrarias de fluorescencia), que es directamente proporcional a
la concentración del péptido p45 biotinilado que se haya
unido.
Figura 3. Porcentaje de inhibición de la unión
del péptido p45 biotinilado a células que expresan
HLA-DR4, en presencia de anticuerpos
anti-HLA específicos: aDR,
anti-HLA-DR; aDP,
anti-HLA-DP; aDQ,
anti-HLA-DQ; y
anti-HLA Clase I.
Figura 4. Inducción de respuestas T helper en
ratones transgénicos HLA-DR4 inmunizados con
diferentes péptidos (50 nanomoles): p37, p45, p61, p62 y PADRE. Las
respuestas frente a cada péptido, se evaluaron a los 15 días:
proliferación linfocitaria, producción de
IFN-\gamma, y producción de
IL-4.
Figura 5. Inducción de respuestas T citotóxicas
en ratones transgénicos HLA-DR4 inmunizados con un
péptido DTc [50 nanomoles de OVA (257-264)] solo o
junto con uno de los péptidos a ensayar como DTh: p37, p45, p61,
p62 ó PADRE. Los ensayos se repitieron con diferentes
concentraciones de péptido a ensayar: A) 50 nanomoles; B) 5
nanomoles; C) 0,5 nanomoles.
Los péptidos para los ensayos de unión a
moléculas HLA y de inducción de respuestas T colaboradoras (Th) y T
citotóxicas (Tc) se sintetizaron manualmente por el método de fase
sólida de Merrifield, utilizando la tecnología Fmoc [(Merrifield
RB; Solid phase synthesis. I. J Am Chem Soc, 1963; 85:2149);
(Atherton E Procedures for solid phase synthesis. J Chem Soc Perkin
Trans, 1989; 1:538)]. Tanto los péptidos a ensayar como los
péptidos utilizados como control se sintetizaron por este mismo
método (Tabla 1).
Para algunos ensayos se utilizaron también
péptidos biotinilados: el péptido HA (306-320)
(APKYVKQNTLK
LATG) de la hemaglutinina del virus de la Influenza y p45. Estos péptidos se sintetizaron manualmente y se conjugaron con biotina (EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin; Pierce Biotechnology, Inc, Rockford, EEUU). Para ello, una vez terminada la síntesis del péptido, este se mantuvo unido a la resina y se realizaron 10 lavados con una mezcla DMF-aqua (7,5:2,5) para preparar la resina a este nuevo solvente. Se añadió biotina disuelta en este solvente, en proporción (1:1) con los miliequivalentes de la resina inicial. La mezcla se dejó reaccionar hora y media. A continuación, la resina se lavó 20 veces con DMF, y se repitió el proceso de reacción hasta 3 veces. Para comprobar que el péptido estaba biotinilado, se realizó el test de Kaiser (Kaiser, 1970; Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides. Anal Biochem. 1970; 34:595-598). Se procedió al corte de la resina, liofilización y análisis por HPLC como en el apartado anterior. [(Merrifield RB; Solid phase synthesis. I. J Am Chem Soc, 1963; 85:2149); (Atherton E Procedures for solid phase synthesis. J Chem Soc Perkin Trans, 1989; 1:538)].
LATG) de la hemaglutinina del virus de la Influenza y p45. Estos péptidos se sintetizaron manualmente y se conjugaron con biotina (EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin; Pierce Biotechnology, Inc, Rockford, EEUU). Para ello, una vez terminada la síntesis del péptido, este se mantuvo unido a la resina y se realizaron 10 lavados con una mezcla DMF-aqua (7,5:2,5) para preparar la resina a este nuevo solvente. Se añadió biotina disuelta en este solvente, en proporción (1:1) con los miliequivalentes de la resina inicial. La mezcla se dejó reaccionar hora y media. A continuación, la resina se lavó 20 veces con DMF, y se repitió el proceso de reacción hasta 3 veces. Para comprobar que el péptido estaba biotinilado, se realizó el test de Kaiser (Kaiser, 1970; Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides. Anal Biochem. 1970; 34:595-598). Se procedió al corte de la resina, liofilización y análisis por HPLC como en el apartado anterior. [(Merrifield RB; Solid phase synthesis. I. J Am Chem Soc, 1963; 85:2149); (Atherton E Procedures for solid phase synthesis. J Chem Soc Perkin Trans, 1989; 1:538)].
El péptido PADRE se sintetizó con fines
comparativos. Este, es un péptido similar a otro desarrollado
anteriormente (Alexander J et al. Immunity, 1994,
1:751-761) con el fin de inducir respuestas T helper
en una amplia variedad de moléculas HLA-DR. Este
péptido PADRE se diferencia del péptido descrito anteriormente en
que se sintetizó con el aminoácido fenilalanina en lugar de la
ciclohexilalanina original.
La medida de unión de los péptidos se llevó a
cabo como describen Busch y cols. (Busch R, Rothbard J: Degenerate
binding of immunogenic peptides to HLA-DR proteins
on B cell surfaces. Int Immunol, 1990; 144:1849).
En los experimentos de la presente invención SE
utilizaron las siguientes líneas de linfocitos E transformados por
el virus de Epstein-Barr (EBV-BLCL),
cada una de ellas homocigóticas para moléculas
HLA-DP diferentes:
Todas las líneas celulares se obtuvieron de la
Colección Europea de Cultivos Celulares Animales (ECACC, PHLS,
Salisbury, UK).
Brevemente, linfocitos B con diferentes
moléculas HLA-DR (a 2,5 x 10^{5} células/pocillo)
se coincubaron toda la noche con HA(306-320)
biotinilado (10 \muM) y HA(306-320) (100
\muM) no biotinilado por un lado, ó con
HA(306-320) (10 \muM) biotinilado y el
péptido a ensayar (100 \muM) por otro. La incubación se realizó
en medio completo MC (RPMI 1640 con 10% de suero de ternera fetal,
2 mM de glutamina, 100 U/ml de penicilina, 100 \mug/ml de
estreptomicina, 5 x 10^{-5} M de 2
\beta-mercaptoetanol, y 0,5% (v/v) de piruvato
sódico). Al día siguiente se realizaron 2 lavados con 200 \mul de
medio de Fac's (PBS al 2,5% de suero fetal de ternera); se
resuspendieron a 5 \mug/ml de conjugado de
estreptavidina-fluoresceína (Pierce) en 100 \mul
de medio de Fac's y se incubaron a 4ºC durante 30 minutos. A
continuación se realizaron 2 lavados y las células se
resuspendieron en 200 \mul de medio de Fac's.
La fluorescencia de la superficie celular se
midió por citometría de flujo en un analizador FACScan
(Becton
Dickinson Immunocytochemistry System, Mountain, USA). Se determinó la media de fluorescencia de 5.000 células marcadas. Se obtuvo una señal de fluorescencia proporcional al número de moléculas de HLA-DR expuestas en el exterior de la célula.
Dickinson Immunocytochemistry System, Mountain, USA). Se determinó la media de fluorescencia de 5.000 células marcadas. Se obtuvo una señal de fluorescencia proporcional al número de moléculas de HLA-DR expuestas en el exterior de la célula.
Para cuantificar la capacidad de unión de cada
péptido (% Unión_{péptido}) se utilizó la siguiente fórmula:
donde F_{péptido} es la
fluorescencia medida para el péptido a ensayar; F_{blco} es la
fluorescencia medida sin péptido añadido (blanco); y F_{ctrl .
biot} es la fluorescencia medida para el péptido control
[HA(306-320)]
biotinilado.
Del mismo modo se calculó el porcentaje de unión
utilizando como péptido a ensayar el péptido control
[HA(306-320)] no biotinilado (
%Unión_{ctrl}):
Se utilizó HA (306-320) como
control de referencia, en lugar del péptido CPKYVKQNTLKLATG
descrito previamente (Rothbard JB; Degenerate binding of
immmunogenic peptides. Int Immunol 1990;
2:443-451), al objeto de impedir la formación de
potenciales puentes disulfuro vía cisteína - NH_{2} terminal.
Se calculó también el porcentaje de unión
relativa (% U_{R}) según la siguiente fórmula:
donde % Unión_{péptido} es el
porcentaje de unión del péptido a ensayar; y donde % Unión_{ctrl}
es el porcentaje de Unión del péptido control
HA(306-320) no
biotinilado.
Todos los ensayos se realizaron por triplicado.
La variación de las intensidades de fluorescencia de los
triplicados estuvo siempre comprendida dentro del rango
5-10%.
De esta manera se pudo obtener una valoración de
la capacidad de unión de los distintos péptidos a las moléculas
HLA-DR1, HLA-DR2,
HLA-DR3, HLA-DR4,
HLA-DR7, HLA-DR8,
HLA-DR11, expresada en términos relativos a la unión
del péptido HA(306-320) no biotinilado:
APKYVKQNTLKLATG (Fig. 1). De la Figura 1 se puede concluir que:
- -
- la mayoría de los péptidos se unen con muy buena afinidad por lo menos a dos moléculas HLA-DR;
- -
- en particular los péptidos p45, p61 y p62 se unen con buena afinidad a casi todas las moléculas HLA-DR estudiadas.
Los péptidos p45, p61 y p62 exhibieron una
capacidad de unión comparable o incluso superior al péptido PADRE
ensayado.
p45 resultó ser bastante insoluble. Al objeto de
caracterizar mejor su capacidad de unión, y para descartar un
posible efecto tóxico del péptido, se decidió realizar algunos
ensayos complementarios utilizando p45 biotinilado. En primer lugar
se realizaron ensayos de unión a HLA-DR en las
diferentes líneas celulares, incubadas con p45 biotinilado a
distintas concentraciones. Para evitar la posible cristalización
del péptido, éste se solubilizó con la ayuda de un sonicador. Se
midió la fluorescencia de la superficie celular por citometría de
flujo en un analizador FACScan tal como se ve en el ejemplo 2,
aunque no se realizó competición con el péptido p45 no biotinilado.
La figura 2 muestra la fluorescencia medida en los ensayos de
unión en la línea que expresa HLA-DR4. Como puede
comprobarse, la unión del péptido es
dosis-dependiente en el rango de concentraciones
ensayado.
En segundo lugar, se incubó la línea celular
HLA-DR4 en presencia del péptido p45 biotinilado y
anticuerpos seleccionados por su especificidad frente a
HLA-DR, HLA-DP,
HLA-DQ y HLA Clase I respectivamente (figura 3).
En una placa de 96 pocillos con fondo en U se
sembró la línea celular HLA-DR4 (ya definida
anteriormente); (2 x 10^{5} por pocillo), añadiendo también
péptido p45 biotinilado (10 \muM), solo o junto con sobrenadante
de los hibridomas L243 anti-HLA-DR
(ATCC Ref: HE-55), ó W6/32
anti-Clase I (ATCC Ref: HB-95) o los
anticuerpos 33.1 anti-HLA-DQ o
anti-HLA-DP B7/21, que fueron
proporcionados por Dra. Ghislaine Sterkers. Todos fueron diluidos a
(1/500) en un volumen final de 100 \mul de RPMI con 2,5 % de FBS.
Al día siguiente se realizaron 2 lavados con 200 \mul de medio de
Fac's, se resuspendieron a 5 \mug/ml de conjugado de
estreptavidina-fluoresceína (Pierce) en 100 \mul
de medio de Fac's, y se incubaron a 4ºC durante 30 minutos. A
continuación se realizaron 2 lavados y las células se resuspendieron
en 200 \mul de medio de Fac's. La fluorescencia de la superficie
celular se midió por citometría de flujo en un analizador FACScan.
Se determinó la media de fluorescencia de 5.000 células marcadas,
de manera que se obtuvo una señal de fluorescencia proporcional al
número de moléculas de HLA expuestas en el exterior de la
célula.
Para cuantificar la disminución de la unión al
añadir los anticuerpos, se utilizó la siguiente fórmula:
donde F_{blco} es la
fluorescencia medida cuando se cultivaron las células sin añadir
péptido o anticuerpos (blanco), F_{p45} es la fluorescencia
medida cuando se incubó con el péptido p45 biotinilado solo, y
F_{p45+aHLA} es la fluorescencia medida cuando se incubó con p45
biotinilado junto con los anticuerpos anti-HLA
correspondientes.
Todos los ensayos se realizaron por triplicado.
La variación de las intensidades de fluorescencia de los
triplicados estuvo siempre comprendida dentro del rango
5-10%.
Como se puede observar en la Figura 3, la
incubación con anticuerpos
anti-HLA-DR o
anti-HLA-DQ produce inhibición
fuerte de la unión, lo que indica que p45 se une tanto a
HLA-DR como a HLA-DQ, pero no a
HLA-DP.
Del mismo modo, estos ensayos se repitieron
sobre las líneas celulares HLA-DR1,
HLA-DR3, HLA-DR7,
HLA-DR8, HLA-DR11. Los porcentajes
de inhibición obtenidos se recogen en la Tabla 2. Como puede
observarse, al incubar las células con p45 biotinilado en presencia
de anti-HLA-DR o
anti-HLA-DQ se produce una fuerte
inhibición en todos los casos, lo que indica que p45 biotinilado
tiene una alta capacidad de unión a HLA-DR y a
HLA-DQ en todas las líneas celulares.
El péptido p45 biotinilado se unió a
HLA-DR1, aunque p45 sin biotinilar no se une en
forma detectable a esta molécula HLA (ver Fig 1). Este fenómeno de
mayor unión del péptido biotinilado se observa también en el
péptido HA(306-320) biotinilado respecto al
HA(306-320) no biotinilado. Ello podría
indicar que la biotina estabiliza la unión a la molécula HLA en
forma adicional o que se aumenta la sensibilidad de la detección de
la unión respecto a la medición por competición con el péptido sin
biotinilar. El resto de los péptidos en estudio no se biotinilaron,
por lo que existe la posibilidad de que pudieran también unirse a
HLA-DQ.
\vskip1.000000\baselineskip
Nota: El grado de unión a las
diferentes moléculas se midió por competición con anticuerpos (aDR:
anti-HLA-DR; aDP:
anti-HLA-DP; aDQ:
anti-HLA-DQ; aClI:
anti-Clase
I).
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de comprobar si los péptidos
sintetizados tenían capacidad de inducir respuestas Th in
vivo, se inmunizaron ratones transgénicos para la molécula
HLA-DR4 con algunos de los péptidos que habían
demostrado capacidad de unión con diversas moléculas
HLA-DR. Para ello se eligieron p37, p45, p6l y p62,
utilizando también el péptido PADRE como control. Todos estos
péptidos mostraron capacidad de unión a varias moléculas
HLA-DR, a la vez que mostraban diferentes grados de
unión a HLA-DR4. La capacidad inductora Th se
valoró midiendo la capacidad que los péptidos tenían de inducir
proliferación celular y de inducir la producción de
IFN-\gamma e IL4 en linfocitos extraídos de los
ratones inmunizados.
Se utilizaron ratones transgénicos hembras
HLA-DR4 obtenidos de Taconic (Germantown, NY, USA),
que se mantuvieron en condiciones libres de patógenos y tratados
de acuerdo a las normas de nuestra institución.
Para la inducción de respuestas Th, se
inmunizaron subcutáneamente grupos de 3 ratones
(4-6 semanas de edad) con 200 \mul de una
emulsión 1:1 de adyuvante completo de Freund y suero salino que
contenía 50 nanomoles del péptido correspondiente. Los animales
inmunizados, se sacrificaron dos semanas después de la inmunización
y se extrajeron los nódulos linfáticos popliteales, inguinales y
periaórticos. Los nódulos se homogeneizaron con una jeringa y se
lavaron tres veces con medio de lavado (medio RPMI 1640) a 4ºC. A
continuación, 5 x 10^{7} células/ml se pulsaron en MC durante 2
horas a 37ºC con 10 \muM del péptido correspondiente.
Posteriormente se centrifugaron y se
resuspendieron, y se cultivaron 2 x 10^{6} células/ml en un
volumen de 2 ml, en placa de 24 pocillos, en estufa, a 37ºC con 5%
de CO_{2} Siete días más tarde, las células se lavaron y 5 x
10^{5} células T por pocillo se cultivaron con 2 x 10^{5}
células de bazo singénicas por pocillo, tratadas con
mitomicina-C, en ausencia o presencia del antígeno
correspondiente. Se recogieron 50 \mul del sobrenadante para
medir IFN-\gamma e IL-4 como en
el apartado anterior. Se midió la proliferación celular.
Tras 48 horas en cultivo, las células fueron
pulsadas con 0,5 \muCi de timidina tritiada durante 18 horas, se
cosecharon y se determinó la incorporación de timidina en un
contador de centelleo (Top-count; Packard, Meridan,
CT, USA).
Las cantidades de IFN-\gamma e
IL-4 se midieron mediante ELISA comercial (OPTEIA
Mouse IFN-\gamma Set, Pharmingen, San Diego,
Estados Unidos y OPTEIA Mouse IL-4 Set, Pharmingen,
San Diego, Estados Unidos) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Los resultados se expresaron como pg/ml utilizando una
curva estándar de cantidades conocidas de citoquinas.
Los resultados (Figura 4) ponen de manifiesto
que la mayor proliferación (mayor incorporación de timidina
tritiada) y producción de IFN-\gamma se produce en
aquellos ratones inmunizados con los péptidos p45 y PADRE. El
péptido p45 estimuló notablemente la producción de
IFN-\gamma y poco o nada la producción de
IL-4, mientras que el péptido PADRE estimuló tanto
la producción de IFN-\gamma como de
IL-4. Estas observaciones permiten concluir que para
la restricción HLA-DR4, p45 y PADRE inducen
respuestas T colaboradoras correspondientes a perfiles de
citoquinas Th1 y Th0 respectivamente. Los péptidos p37, p61 y p62
no dieron lugar a proliferación, ni a la producción de
IFN-\gamma. Sin embargo, p37 y p62 dieron lugar a
la producción de IL-4.
Con el propósito de estudiar la capacidad de los
péptidos para colaborar en la inducción de respuestas efectoras
Tc, se inmunizaron ratones (transgénicos para
HLA-DR4) con p37, p45, p61, p62 o con el péptido
control PADRE, conjuntamente con el péptido SIINFEKL
[OVA(257-264)]. SIINFEKL es un determinante T
citotóxico (DTc) que se une a la molécula de clase I
H-2 K^{b}.
Para la inducción de respuestas citotóxicas, se
inmunizaron subcutáneamente grupos de dos ratones de 4 a 6 semanas
de edad con 200 \mul de una emulsión 1:1 de adyuvante incompleto
de Freund y suero salino, que contenía 50 nanomoles del péptido
SIINFEKL, más el péptido a ensayar como DTh en cantidades
variables.
Entre 10 y 12 días después de la inmunización,
se sacrificaron los animales para extraer los nódulos linfáticos
popliteales, inguinales y periaórticos. Estos fueron homogeneizados
con una jeringa para obtener una suspensión celular y se lavaron
tres veces con RPMI 1640.
Las células obtenidas se incubaron con el
determinante citotóxico SIINFEKL (10 \muM) durante 2 horas a
37ºC, se lavaron 2 veces y se cultivaron en placas de 24 pocillos a
una concentración de 7,5 x 10^{6} células/pocillo. Dos días
después se añadió al cultivo 2,5 U/ml de IL-2 y
cinco días después se midió la actividad citotóxica, siguiendo la
metodología descrita por Brunner (Brunner KT; "Quantitative assay
of the lytic action of immune lymphoid cells on
51-Cr-labelled allogeneic target
cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs";
Immunology, 1968; 14:181).
La actividad citotóxica se valoró por la medida
de la liberación de ^{51}Cr de las células diana, previamente
marcadas. Las células diana utilizadas fueron células de timoma
(H-2^{b})EL-4 (Referencia
ATCC: TIB-39). Para su marcaje se añadieron 50
\muCi de ^{51}CrO_{4}Na_{2} por cada 10^{6} células diana
en un volumen final de 100 \mul y se incubaron en ausencia o
presencia de péptido SIINFEKL (a una concentración de 10 \muM)
durante 2 horas a 37ºC. Después de tres lavados en RPMI 1640, se
resuspendieron en 1 ml de MC. El ensayo se realizó en placas de 96
pocillos con fondo en U. A cada pocillo se le añadieron por
separado las células efectoras y las células diana (3000 por
pocillo). Se ensayaron diferentes proporciones de células efectoras
respecto a las células diana, en diluciones seriadas (100, 33, 11
y 3). Cada ensayo se realizó por triplicado. El volumen final de
cada pocillo fue de 200 \mul.
Se incubaron las placas durante 4 horas a 37ºC.
Posteriormente, se extrajeron 50 \mul de sobrenadarte de cada
pocillo y la radiactividad se contó en un contador de
centelleo.
El porcentaje de lisis específica se calculó
según la siguiente fórmula:
La lisis máxima se determinó midiendo las cpm
(cuentas por minuto) de 3000 células diana incubadas con un 5% de
Triton X-100 y la lisis espontánea a partir de
células incubadas en ausencia de células efectoras.
El porcentaje de lisis que se indica,
corresponde a la lisis neta: valor de la lisis frente a las células
de animales inmunizados al que se le substrae la lisis observada
frente a las células de animales sin inmunizar.
Los resultados, representados en la Figura 5,
muestran que todos los péptidos menos p61 y PADRE proporcionaron
colaboración Th para la inducción de linfocitos Tc específicos de
SIINFEKL. Además, se pudo observar un efecto
dosis-respuesta de forma que cada péptido actúa
mejor a una dosis diferente.
Con el fin de determinar si los péptidos p37,
p45 y p62 podían ser reconocidos por los linfocitos Th humanos de
una población variada, se realizaron experimentos con células
mononucleares de sangre periférica extraídas de cordones
umbilicales de donantes.
Las células extraídas se purificaron mediante el
método del ficol (Noble PB, Cutts JH, Carroll, KK; Ficoll
flotation for the separation of blood leukocyte types; Blood, 1968;
31:66-73). Una vez purificadas, las células (3 x
10^{6} células/ml) se pulsaron durante dos horas con 10 \muM
del péptido en estudio. Las células pulsadas se lavaron y se
plaquearon (10^{5} células/pocillo) en placas de 98 pocillos de
fondo plano. A los días 3 y 7 se añadió IL-2.
Quince días mas tarde, las células de cada pocillo se subdividieron
en dos, para enfrentarlas respectivamente a células (10^{5}
células/pocillo) tratadas con mitomicina C, con o sin cada uno de
los péptidos p37, p45, p62 ó PADRE. Al cabo de dos días se
recogieron 50 \mul de cada sobrenadarte y se mantuvieron
congelados a -20ºC hasta el momento en que se cuantificó la
cantidad de IFN-\gamma mediante ELISA. Las
células se pulsaron al tercer día, durante 18 horas con 0,5 \muCi
de timidina tritiada. Posteriormente se cosecharon y se midió la
incorporación de timidina en un contador de centelleo.
Primeramente se realizó la extracción de ADN a
partir de células mononucleares de sangre periférica de cada
donante. Se utilizó el Kit QIAmp DNA Mini Kit de (Qiagen, Valencia,
EEUU) y se siguió el protocolo indicado por el fabricante.
Para la realización del tipaje a partir del ADN
extraído, se utilizó el Kit Inno-Lipa
HLA-DRB1 Plus (Innogenetics, Ghent, Bélgica),
siguiendo el protocolo indicado por el fabricante.
En la Tabla 3 se indica el número de pocillos
positivos para cada péptido y donante. Se consideraron positivos,
sólo aquellos pocillos que mostraron un índice de estimulación
igual o superior a 3. El índice de estimulación (IE) se expresó
como el cociente entre las cuentas por minuto entre el pocillo con
péptido y el pocillo sin péptido.
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
El número máximo de pocillos positivos posibles
era 48 por péptido y donante. N indica el total de pocillos
positivos frente a cada péptido tomando los 16 donantes.
De la Tabla 3 se puede deducir que:
- -
- los péptidos p45 y PADRE fueron los mejor reconocidos por los linfocitos de 16 donantes; y que
- -
- todos son reconocidos por al menos el 50% de los individuos.
<110> PROYECTO DE BIOMEDICINA CIMA
S.L.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> NUEVOS PÉPTIDOS DETERMINANTES
ANTIGÉNICOS T COLABORADORES (DTh)
\vskip0.400000\baselineskip
<130> FIMA05029
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido quimérico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido quimérico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido quimérico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido quimérico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido quimérico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm16
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido quimérico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm17
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido quimérico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm18
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido quimérico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm19
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido quimérico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm20
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido quimérico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm21
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido quimérico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm22
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido quimérico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm23
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido quimérico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm24
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido quimérico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm25
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido quimérico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm26
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido quimérico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm27
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido quimérico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\hskip1cm28
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido quimérico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip1cm29
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido quimérico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\hskip1cm30
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido quimérico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\hskip1cm31
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido quimérico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\hskip1cm32
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido quimérico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\hskip1cm33
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido quimérico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\hskip1cm34
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\hskip1cm35
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\hskip1cm36
Claims (8)
1. Un péptido quimérico con capacidad para
unirse al menos a una forma alélica de la molécula
HLA-DR, caracterizado porque está
seleccionado entre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.
2. Una composición farmacéutica
caracterizada porque comprende al menos un péptido descrito
en la reivindicación 1 y un excipiente farmacéuticamente
aceptable.
3. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 2, caracterizada porque comprende además otro
inmunógeno.
4. Una composición farmacéutica según una de
las reivindicaciones 2 o 3, caracterizada porque comprende
un determinante T citotóxico (DTc) y un determinante T colaborador
(DTh), donde el determinante DTh es un péptido descrito en la
reivindicación 1.
5. Uso de un péptido descrito en la
reivindicación 1 en la preparación de una composición farmacéutica
útil para estimular la respuesta inmune.
6. Uso de un péptido según la reivindicación 5,
caracterizado porque dicha composición farmacéutica es útil
para inducir la activación de células T colaboradoras Th (Th1, Th2
o Th0).
7. Uso de un péptido según la reivindicación 5,
caracterizado porque dicha composición farmacéutica es útil
para inducir una respuesta inmune T citotóxica (CTL).
8. Uso de un péptido según la reivindicación 5,
caracterizado porque dicha composición farmacéutica es útil
para inducir una respuesta inmune humoral.
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