ES2670859T3 - Secuencias peptídicas y composiciones de Anopheles gambiae - Google Patents

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Abstract

Un polipéptido que consiste en entre 20 y 55 aminoácidos, cuyo polipéptido comprende SEQ ID NO: 35, una secuencia de polipéptido que tiene al menos 90% de homología con SEQ ID NO: 35, o una subsecuencia de SEQ ID NO: 35, el sub-secuencias que tienen 20 aminoácidos o más, donde el polipéptido no es una proteína de saliva de artrópodo completa, en donde el polipéptido es inmunogénico en un vertebrado y en el que el vertebrado produce células del sistema inmunitario capaces de reconocer al menos un epítopo de una fracción proteica de saliva de artrópodo.

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Secuencias peptídicas y composiciones de Anopheles gambiae Descripción
[0001] La invención se refiere a secuencias peptídicas, composiciones que comprenden las secuencias de péptidos, en las vacunas particulares contra enfermedades transmitidas por artrópodos que comprenden las secuencias y las composiciones, y usos de las secuencias. La presente invención se refiere particularmente a vacunas que son protectoras contra una o más enfermedades transmitidas por mosquitos, que incluyen una o más cepas de malaria.
[0002] La defensa contra la enfermedad es crítica para la supervivencia de todos los animales, y el mecanismo de defensa empleado para este fin es el sistema inmune animal. La comprensión del sistema inmune es, por lo tanto, una clave para comprender el desarrollo de tratamientos nuevos y más sofisticados tanto para humanos como para animales.
[0003] El mecanismo de funcionamiento del sistema inmunológico ha estado bajo investigación durante muchos años. El sistema está compuesto por varios tipos de células y una variedad de moléculas, lo que lo hace extremadamente complejo. Incluso después de muchos años de estudio, se comprende imperfectamente el alcance total de los componentes del sistema inmune y su interacción entre ellos.
[0004] Hace muchos años se reconoció que una persona que se recupera de una enfermedad en particular puede adquirir algún tipo de protección en el futuro contra esa enfermedad, pero no contra una enfermedad que esa persona todavía no ha contratado. Este aspecto fundamental del sistema inmune fue interpretado en ese momento al considerar que el sistema inmune adquirió una especie de "memoria" contra ciertos patógenos una vez que se había producido la exposición a tales patógenos, que la memoria es específica de una determinada enfermedad.
[0005] Poco a poco, se conocía que la exposición a variantes menos nocivos de un patógeno podría inducir la protección contra las variantes más nocivas (por ejemplo, la exposición a la viruela vacuna para proteger contra la viruela, o la exposición a un ántrax inactivado para proteger contra el ántrax vivo). Por lo tanto, surgió la idea de la vacunación contra una enfermedad.
[0006] Ahora se sabe que el sistema inmune tiene al menos dos divisiones: la inmunidad innata y la inmunidad adaptativa. El sistema innato es completamente funcional antes de que un patógeno ingrese al sistema, mientras que el sistema adaptativo se enciende luego de que el patógeno ingrese al sistema. Luego desarrolla un ataque específico para el patógeno. El sistema innato comprende una serie de componentes, incluidos los fagocitos, como los macrófagos, que (como su nombre indica) "comen" o engullen cuerpos extraños como los patógenos.
[0007] Típicamente, pero no exclusivamente, la presente invención se refiere al sistema inmune adaptativo, y a menos que se indique específicamente lo contrario, 'sistema inmune' en el presente contexto se refiere al sistema inmune adaptativo.
[0008] Con el fin de comprender mejor cómo funciona el sistema inmunológico, el papel de sus componentes individuales debe ser considerado cuidadosamente. Con respecto al sistema inmune adaptativo, es bien sabido que la inmunidad contra los patógenos es proporcionada por la acción de los linfocitos, que constituyen el tipo de célula más común en el sistema inmune. Hay dos tipos de linfocitos: el linfocito B y el linfocito T. Generalmente se denominan células B y células T, respectivamente.
[0009] Las células B tienen la capacidad de convertirse en células plasmáticas, que fabrican anticuerpos. Los anticuerpos son componentes muy importantes del sistema inmune de los animales. Se producen en respuesta a una porción característica del patógeno invasor (un antígeno del patógeno - antígenos que aquí se definen como cualquier sustancia extraña reconocida por el sistema inmune) y generalmente son específicos de ese patógeno. Sin embargo, si dos patógenos son muy similares, o al menos contienen el mismo antígeno, entonces los anticuerpos producidos contra uno pueden, no obstante, ser efectivos contra el otro (pueden tener una reacción cruzada). Esto explica por qué la inoculación con viruela vacuna puede proteger contra la viruela. Es importante darse cuenta de que los anticuerpos "reconocen" solo una pequeña porción de la molécula antigénica del patógeno en lugar del patógeno como un todo. Estas porciones se denominan epítopes.
[0010] Las células T no poseen o producen anticuerpos. Por el contrario, reconocen fragmentos (es decir, epítopes) del antígeno extraño complejado con el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) (o en el caso de humanos, antígeno leucocitario humano (HLA)) a través de un receptor especializado conocido como TCR (receptor de células T). Las células T son divisibles en subconjuntos que pueden tener una función reguladora o una función efectora. Las células efectoras están involucradas en "efectuar" la eliminación de sustancias extrañas. Por ejemplo, las células T citotóxicas (CTL) son células efectoras capaces de matar las células infectadas, así como otras especies no deseadas, como las células tumorales. Las células reguladoras T, por otro lado, juegan un papel en ayudar a las células T y B efectoras a ser más efectivas. Debido a esta función, estas células T reguladoras a menudo se denominan células T "auxiliares". Se cree que otras células T reguladoras, denominadas células T "supresoras", inhiben la respuesta inmune, pero estas se conocen menos. Las células T reguladoras también pueden interactuar
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con los componentes del sistema inmune innato para estimular su actividad.
[0011] En un individuo sano normal, los linfocitos en el sistema inmunológico permanecen en un estado inactivo "reposo: hasta que se desencadena una respuesta inmune. Cuando se requiere una respuesta inmune, los linfocitos se activan, proliferan y comienzan a llevar a cabo sus funciones designadas. Por ejemplo, cualquier célula T en reposo que muestra en su superficie un TCR que reconoce un epítopo del patógeno invasor complejado con una molécula MHC se activa, prolifera (esto se denomina expansión clonal) y la descendencia resultante comienza a llevar a cabo activamente sus funciones efectoras predeterminadas requeridas para combatir a los organismos invasores.
[0012] Cuando se ha completado la respuesta inmune, (es decir, los patógenos y/o células infectadas han sido eliminadas) los linfocitos revierten a un estado de reposo una vez más. Sin embargo, este estado de reposo no es equivalente al estado inicial de reposo inactivo. Los linfocitos activados, pero en reposo, pueden ser rápidamente reclutados e inducidos a proliferar en respuesta a una infección por el mismo patógeno, o estrechamente relacionados, en un momento posterior.
[0013] Esta capacidad de activar linfocitos en reposo, para ofrecer una respuesta más rápida y más potente después de un segundo encuentro con un patógeno invasor, proporciona eficazmente el sistema inmune con “memoria”. La explotación de la memoria del sistema inmune es la base de todos los fármacos inmunoprofilácticos a largo plazo (por ejemplo, vacunas) y sigue siendo el objetivo de mucho desarrollo de fármacos inmunoterapéuticos a largo plazo.
[0014] Para que las células realicen sus funciones dentro de los complejos sistemas de un animal, las células necesitan tener “receptores” en sus superficies. Estos receptores son capaces de "reconocer" sustancias específicas que controlan diversos procesos esenciales, como la activación, la proliferación y la adherencia a otras células o sustratos. Por ejemplo, en el caso del sistema inmune, los receptores en las células T y B les permiten no solo reconocer el antígeno sino también interactuar entre sí y así regular sus actividades. Sin estos receptores, las células carecerían de un medio esencial de comunicación y no podrían actuar eficazmente de la manera concertada que es esencial para el sistema inmune de un organismo multicelular.
[0015] Con el fin de ser capaz de reconocer específicamente y ocuparse de la amplia gama de patógenos presentes en el medio ambiente, el sistema inmune ha desarrollado dos tipos de receptor de antígeno altamente variable en los linfocitos: los anticuerpos en las células B y receptores de células T, o TCR , en células T.
[0016] Hay un gran número de diferentes posibles receptores de antígenos presentes en el cuerpo, para que el sistema inmune reconozca una amplia variedad de patógenos invasores. De hecho, hay aproximadamente 1012 células B diferentes y receptores de células T en un individuo. Cada célula B individual tiene solo un tipo de receptor y, por lo tanto, para ocuparse de un patógeno particular, se debe seleccionar una célula B que tenga el receptor "mejor adaptado" para un antígeno de ese patógeno. Este proceso se denomina “selección clonal”. En teoría, solo un clon puede responder (una respuesta monoclonal) o varias (una respuesta oligoclonal) o muchas (una respuesta policlonal) dependiendo del número de antígenos/epítopos exhibidos por el patógeno, y la especificidad de las diversas células B seleccionadas a estos antígenos/epítopes.
[0017] Existe una gran diferencia entre los tipos de antígenos que pueden ser reconocidos por las células B y células T. Por lo que se sabe, solo los receptores en la superficie de los linfocitos B (es decir, anticuerpos) son capaces de reconocer directamente antígenos tales como proteínas en virus y bacterias, o moléculas extrañas disueltas en el fluido corporal. Los anticuerpos también pueden ser producidos en una forma soluble por las células B cuando se activan y se convierten en células plasmáticas. Los anticuerpos también se denominan inmunoglobulinas (abreviadas a Ig). Los receptores de células T, por otro lado, reconocen solo péptidos cortos, también conocidos como epítopos de células T, en la superficie de las células del cuerpo. Estos epítopos de células T se producen por degradación de proteínas más grandes que son propias (es decir, proteínas corporales naturales) o no propias (es decir, derivadas de organismos extraños que infectan el cuerpo). Solo aquellos derivados de proteínas extrañas, es decir, antígenos, son normalmente capaces de inducir una respuesta inmune en el cuerpo. Una vez producidos, estos epítopos se unen a un tipo especial de molécula, el MHC (complejo mayor de histocompatibilidad) y el complejo resultante se presenta luego en la superficie de la célula para unirse al receptor de la célula T.
[0018] Debe quedar claro que, debido a la naturaleza destructiva de la respuesta inmune, la respuesta tiene que actuar sólo contra patógenos extraños, no contra las células o proteínas propias del cuerpo. Por lo tanto, el sistema inmune necesita distinguir entre "yo" y "no yo". Se ha propuesto que aunque se producen clones de linfocitos que reaccionan contra uno mismo, se eliminan antes de que pueda producirse cualquier reacción. Este proceso se denomina “eliminación clonal”. También se ha propuesto que cualquier linfocito que reacciona por sí mismo podría retenerse, pero solo en un estado desconectado. Este mecanismo se denomina “anergia clonal”. Independientemente del proceso considerado, sigue sin estar claro cuál es el mecanismo subyacente exacto que permite que los tejidos linfoides, como el timo, identifiquen clones de células T individuales que reaccionan contra sí mismos del grupo de linfocitos T que reaccionan solo contra los no propios.
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[0019] Se ha sabido durante muchos años que el complejo principal de histocompatibilidad (MHC) desempeña un papel clave en el sistema inmunológico de los animales. Las moléculas MHC permiten a las células T reconocer los antígenos, como ya se ha discutido anteriormente. Hay tres tipos generales de molécula MHC, clase I, clase II y clase III. Las moléculas del MHC de clase I y clase II son glicoproteínas que están presentes en la superficie de la célula, mientras que las de clase III suelen ser moléculas solubles presentes en el interior de la célula. Hay una gran cantidad de diferentes tipos de moléculas MHC. Por ejemplo, en humanos (donde el MHC se denomina HLA, antígeno leucocitario humano) existen varios cientos de alelos diferentes de los genes que codifican las moléculas del MHC, lo que significa que en la población humana hay muchos tipos diferentes de HLA. El MHC de diferentes especies se nombra típicamente según diferentes convenciones, por lo que MHC para ratón se denomina H-2, para RT1 de rata y para RLA de conejo. Las diferentes regiones de genes que codifican diferentes moléculas de MHC en un individuo se nombran individualmente de forma individual, tales como HLA-A, HLA-C, etc. en humanos.
[0020] La molécula de MHC es una molécula del sistema inmunológico crítico, ya que es esta molécula que presenta los epítopos de los antígenos al sistema inmune. Por ejemplo, si una célula T responde a un patógeno en particular, el patógeno debe tener al menos un antígeno (como una proteína) que tenga al menos un epítopo (como una porción peptídica de la proteína) que pueda unirse a un patógeno. Molécula MHC en la superficie de una célula y así interactuar con una célula T que se une al complejo de péptido MHC. Por lo tanto, la respuesta inmune depende de la capacidad del MHC para unirse a un epítopo. Si no hay un epítopo al que se una el MHC, o si no hay células T que se unirán al complejo de péptido MHC, entonces no se producirá una respuesta inmune.
[0021] Con respecto a las proteínas “yo”, sin embargo, uno de varios epítopos puede ser capaz de unirse a la molécula MHC y, por lo tanto, potencialmente inducen una respuesta inmune. En estas ocasiones, debe proporcionarse una "señal" específica para que los clones de linfocitos que reaccionan espontáneamente se eliminen o "se apaguen".
[0022] A pesar del creciente conocimiento del funcionamiento del sistema inmune de los vertebrados, las vacunas contra muchas enfermedades siguen siendo difíciles de alcanzar. Ciertos patógenos están sujetos a mutación rápida (por ejemplo, VIH e influenza), de forma que los epítopos que pueden ser objetivos de vacuna útiles para una cepa, no son útiles después de que se ha producido la mutación porque el epítopo ha cambiado en la nueva cepa. Otros patógenos como el plasmodium (el patógeno responsable de la malaria) han sido ampliamente investigados, pero los objetivos en el patógeno que pueden ser útiles en el desarrollo de la vacuna han demostrado ser difíciles de identificar, o simplemente no han logrado administrar una vacuna efectiva in vivo.
[0023] Los agentes patógenos para los que existe una necesidad particular de progreso son aquellos que son a cargo de los artrópodos y causar las llamadas "enfermedades transmitidas por artrópodos". Dichas enfermedades son una de las principales causas de muerte en todo el mundo e incluyen, entre otros, la malaria y el dengue, algunas de las principales causas de muerte en la población actual, especialmente en las regiones más pobres del mundo. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, los enumerados en la Tabla 1 a continuación.
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Tabla 1 - Enfermedades transmitidas por artrópodos, con sus patógenos y vectores
Enfermedad
Patógeno (parásito/virus) Vector de artrópodo
Malaria
Plasmodium sp. Anopheles sp.
Filariasis
Wuchereria sp. Anopheles sp.
Brugia sp. Aedes sp.
Loa sp. Culex sp.
Mansonella sp. Mansonia sp. Chrysops sp.
Ceguera del río
Onchocerca sp. Simulium sp.
Enfermedad de Chagas
Trypanosoma sp. Triatoma sp.
Enfermedad del sueño
Rhodnius sp.
Panstrongylus sp. Glossina sp. Tabanus sp.
Leishmaniasis
Leishmania sp. Phlebotomus sp. Lutzomyia sp.
Tularemia
Franciscella tulariensis Tabanus sp.
Fiebre recidivante
Borrelia sp. Pediculus sp.
Enfermedad de Lyme
Ornithodoros sp. Ixodes sp.
Tifus
Rickettsia sp. Pediculus sp. Pulex sp.
Plaga
Yersinia sp. Pulex sp.
Dengue
Flavivirus DEN-1 a -4 Aedes sp.
Fiebre amarilla
Flavivirus de la fiebre amarilla Aedes sp. Hemagogo spegazzani.
Fiebre del valle del Rift
Virus del valle del Rift Aedes sp.
Encefalitis
Virus Flavi-, Alpha- y Bunya Culex sp.
Incluyendo
Ochlerotatus sp.
Encefalitis de San Luis
Aedes sp.
Fiebre del Nilo Occidental
Coquillettidia sp.
Encefalitis equina oriental Encefalitis equina oriental Encefalitis equina
Anopheles sp.
[0024] Anteriormente, los intentos para proporcionar vacunas contra la enfermedad transmitidas por artrópodos han implicado la identificación de cepas de patógenos existentes y luego producir una vacuna específica para ese patógeno. En general, las vacunas se han basado en una respuesta de células B (anticuerpo) (u ocasionalmente una respuesta de células T) siendo el anticuerpo reactivo con los antígenos de superficie de la cepa patógena específica contra la que se ha desarrollado. Típicamente, las proteínas de superficie que comprenden los antígenos son variables de una cepa de enfermedad a la siguiente, y completamente diferentes para diferentes patógenos. La consecuencia de esto es que las vacunas convencionales generalmente protegen solo contra un patógeno específico o cepa patógena (si son efectivas en absoluto) y no protegerán contra otras cepas o una nueva cepa que resulte de una mutación. Por lo tanto, se requiere una vacuna por separado para la protección contra cada enfermedad y, a menudo, contra cepas diferentes y/o nuevas de la misma enfermedad.
[0025] Se ha sabido desde hace tiempo que la inmunización contra la saliva de artrópodos, o en contra de antígenos expresados en el intestino de los artrópodos puede proteger a un individuo de la infección. Los artículos que discuten esto incluyen los que se resumen a continuación.
[0026] R.G. Tito et al. "The immunomodulatory factors of arthropod saliva and the potential for these factors to serve as vaccine targets to prevent pathogen transmission.", Parasite Immunology, 2006, 28, 131-141. El artículo revisa los inmunomoduladores conocidos en las glándulas salivales de artrópodos. Los factores inmunomoduladores pueden mejorar la transmisión de patógenos por artrópodos. La saliva de vectores contiene una gran cantidad de sustancias cuyas actividades incluyen la capacidad de inhibir la hanostasis, la vasoconstricción y el desarrollo de inflamación y una respuesta inmune. En los mosquitos hay varios inhibidores de células T. Si la saliva artrópoda aumenta la infección con los patógenos transmitidos por artrópodos, debería ser posible controlar la transmisión del patógeno vacunando al huésped contra la(s) molécula(s) en la saliva que potencian la infección, bloqueando los efectos potenciadores de la saliva y evitando que el patógeno establezca infección en el anfitrión. El gen maxadilan o MAX que codifica el potente vasodilatador en la saliva de sandfly se clonó y se examinaron las actividades del producto proteico del gen. Los efectos de sandfly MAX se manifiestan a través de efectos primarios sobre las células
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fagocíticas y esto conduce a efectos inmunomoduladores/inhibidores corriente abajo sobre las respuestas de las células T. Los ratones se vacunaron contra MAX inyectando MAX en adyuvante de Freund completo seguido de MAX en adyuvante de Freund incompleto y luego se reforzaron con MAX soluble hasta que el título de anticuerpos anti-MAX circulante estuvo entre 1/10.000 y 1/20.000. Los ratones vacunados estaban marcadamente protegidos de la infección.
[0027] G.A.T. Targett, "Parasites, arthropod vectors, and immune responses.", Parasite Immunology, 2006, 28, 117119. Este artículo muestra que la alimentación de sangre por los mosquitos induce respuestas inmunes a la saliva de los insectos. Incluyen reacciones de hipersensibilidad y anticuerpos anti-mosquito. La medición de estas respuestas de anticuerpos puede ser de valor epidemiológico para el monitoreo de poblaciones de vectores y la aplicación de tales respuestas a la evaluación de la efectividad de las estrategias de intervención. La producción de vacunas que perjudiquen la alimentación, el desarrollo y/o la supervivencia de vectores de artrópodos o ectoparásitos es una idea atractiva aunque ambiciosa. Un objetivo importante es el control de los propios artrópodos ectoparasitarios, mientras que el segundo es usar la vacuna antiartrópodo como una forma de dañar los parásitos que el artrópodo transmite dentro del propio artrópodo o cuando se produce la transmisión al huésped vertebrado.
[0028] M.M.A. Whitten et al, "Mosquito midguts and malaria: cell biology, compartmentalization and immunology.", Parasite Immunology, 2006, 28, 121-130. El intestino medio de mosquito representa uno de los entornos más desafiantes para la supervivencia y el desarrollo de Plasmodium. Durante sus intentos de cruzar el epitelio del intestino medio hacia las glándulas salivales, los oocinatos móviles se detectan rápidamente y se etiquetan mediante factores de reconocimiento de mosquitos y se destruyen mediante una variedad de respuestas inmunes que reclutan factores asesinos tanto del intestino medio como de otros tejidos del cavidad corporal circundante. La interacción exacta entre estos factores y el parásito es altamente específica de especie y cepa, así como el momento y la ruta de la invasión del parásito. El intestino medio forma una barrera física que separa y protege los tejidos de hemocoel de las enzimas digestivas y los agentes infecciosos. Está compuesto por una sola capa de células epiteliales polarizadas, con cualquier polo que muestra diferentes adaptaciones morfológicas para aumentar el área de superficie involucrada en el intercambio de moléculas. La superficie apical microvellositaria distinta está expuesta a la luz y su función principal es la secreción de enzimas digestivas y la absorción de nutrientes. Las modificaciones estructurales desencadenadas por la alimentación sanguínea incluyen la formación de una gruesa matriz peritrófica (PM) no celular, quitinosa, secretada por el epitelio del intestino medio y que es polimerizada por la harina de sangre ingerida. El PM rodea el bolo de sangre y forma una barrera para los parásitos y las bacterias que intentan penetrar en el epitelio del intestino medio.
[0029] P.F. Billingsley et al. " Immune interactions between mosquitoes and their hosts.", Parasite Immunology, 2006, 28, 143-153. Los anticuerpos dirigidos al intestino medio del mosquito también son importantes en el desarrollo de vacunas contra mosquitos. La secreción de saliva por un mosquito durante la alimentación es importante para la ubicación exitosa de los vasos sanguíneos del huésped y la manipulación de la respuesta hemostática e inmunitaria del huésped. Las técnicas de inmunotransferencia se han usado para caracterizar el reconocimiento por anticuerpos anti-mosquito del huésped de antígenos salivales. Cuando un mosquito se alimenta, ingiere factores inmunes del huésped, tanto solubles como celulares, que permanecen activos en el intestino medio. A diferencia de los antígenos salivales, el huésped normalmente no ha estado expuesto a antígenos de los órganos internos del mosquito, lo que lleva a la idea de que estos antígenos "ocultos" sean objetivos de la vacuna. La mejor fuente de antígenos ocultos es el intestino medio, porque después de alimentarse contiene la harina de sangre con sus moléculas y moléculas efectoras inmunes componentes. Intestinos medios y preparaciones de todo el cuerpo de Ae. Aegypti indujeron altos títulos de anticuerpos en ratones y la mayor mortalidad de los mosquitos que se alimentan de ellos se correlacionó con anticuerpos que se unen a las microvellosidades del intestino medio. Las respuestas de IgG se indujeron en ratones a los que se había inyectado una biblioteca de ADNc de intestino medio de An. Gambiae, y altos títulos de anticuerpos logrados después del refuerzo con proteínas del intestino medio. Los mosquitos que se alimentan de estos ratones mostraron reducciones reproducibles en la supervivencia y la fecundidad, pero las respuestas interesantes más celulares que humorales parecían ser responsables de los efectos mosquitocidas. Estos estudios han encontrado problemas. Incluso dentro de los experimentos, la variabilidad puede ser alta y la reproducibilidad del efecto difícil de lograr. La inmunización con una mezcla compleja de extractos de proteína del intestino medio o una biblioteca de ADNc del intestino medio ha significado que no se han identificado antígenos diana protectores.
[0030] Sin embargo, a pesar de este conocimiento, no existe una vacuna eficaz contra las enfermedades transmitidas por artrópodos que hace uso de este mecanismo de acción. Otro problema significativo con las vacunas existentes contra los patógenos transmitidos por artrópodos, ya sea que se basen en una respuesta de células B o células T, es que cada protección solo protege contra un único patógeno o como máximo una única cepa patógena existente y no proporciona protección contra posibles cepas futuras o contra múltiples patógenos. Existe una necesidad desesperada de una vacuna para proteger contra una pluralidad de enfermedades transmitidas por artrópodos, que incluyen asesinos a gran escala como la malaria y el dengue.
[0031] Los inventores han sido ahora capaces de identificar secuencias de péptidos inmunogénicos específicos presentes en proteínas de la saliva de artrópodos que pueden proporcionar protección contra todos los patógenos transmitidos por artrópodos, y se han desarrollado vacunas para las enfermedades que causan, utilizando las
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secuencias identificadas. Por lo tanto, los inventores han desarrollado péptidos útiles en vacunas que provocan una respuesta inmune, y en particular una respuesta inmune secundaria rápida contra enfermedades transmitidas por artrópodos.
[0032] En consecuencia, es un objetivo de la presente invención resolver los problemas asociados con la técnica anterior conocida tal como se establece anteriormente. Un objetivo adicional de la presente invención consiste en proporcionar una composición polipeptídica que sea capaz de provocar una respuesta inmune (por ejemplo, una respuesta celular que incluye una respuesta de células T y/o células B) en vertebrados frente a una pluralidad de enfermedades transmitidas por artrópodos, es decir, enfermedades causadas por una pluralidad de patógenos o cepas de patógenos. Un objetivo adicional de la presente invención consiste en proporcionar una vacuna contra la enfermedad transmitida por artrópodos usando las composiciones polipeptídicas de la invención.
[0033] Por consiguiente, la presente invención proporciona un polipéptido que consiste en entre 20 y 55 aminoácidos, cuyo polipéptido comprende la SEQ ID NO: 35, una secuencia polipeptídica que tiene al menos un 90% de homología con la SEQ ID NO: 35, o una subsecuencia de SEQ ID NO: 35, las sub-secuencias que tienen 20 aminoácidos o más, donde el polipéptido no es una proteína de saliva de artrópodo entera, en donde el polipéptido es inmunogénico en un vertebrado y en el que el vertebrado produce células del sistema inmunitario capaces de reconocer al menos un epítopo de una fracción proteica de saliva de artrópodos.
[0034] La presente invención también proporciona una composición de polipéptido que comprende uno o más polipéptidos de la invención.
[0035] La presente invención también proporciona un polipéptido de la invención o una composición de polipéptido de la invención, para uso en medicina.
[0036] Se proporciona además de acuerdo con la invención un método para producir una composición de polipéptido de la invención, método que comprende la mezcla o combinación de uno o más polipéptidos de la invención con uno o más componentes adicionales, tal como un vehículo, un excipiente, un adyuvante, un tampón o un estabilizador.
[0037] Se proporciona además de acuerdo con la invención una construcción de ácido nucleico que comprende uno o más ácidos nucleicos que comprenden la secuencia codificante de un polipéptido de la invención.
[0038] Se proporciona además de acuerdo con la invención un medicamento o composición de vacuna contra una enfermedad transmitida por artrópodos, que comprende un polipéptido de la invención o una composición de polipéptido de la invención y un excipiente y/o adyuvante adecuado.
[0039] Se proporciona además de acuerdo con la invención un método de producción de una composición de medicamento o vacuna de la invención, método que comprende unir, combinar o mezclar un polipéptido de la invención y/o una composición de polipéptido de la invención y/o un constructo de ácido nucleico de la invención con un excipiente y/o adyuvante apropiado.
[0040] Se proporciona además de acuerdo con la invención un polipéptido de la invención, una composición de polipéptido de la invención, un constructo de ácido nucleico de la invención, o una composición de medicamento o vacuna de la invención para uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad portada por artrópodo; preferiblemente en donde la enfermedad transmitida por artrópodos es una enfermedad en un vertebrado, preferiblemente, en donde el vertebrado se selecciona de un mamífero, un pájaro, un reptil y un pez, y preferiblemente de un ser humano, un animal doméstico o un animal de granja, un bovino animal o aves de corral.
[0041] La presente descripción incluye una composición de polipéptido que comprende uno o más polipéptidos, cuyos polipéptidos son inmunogénicos en un vertebrado, de tal manera que hacen que el vertebrado produzca células del sistema inmunológico (o promueva la producción de tales células) capaces de reconocer en al menos un epítopo de una fracción de proteína de saliva de artrópodo, en donde la fracción de proteína de saliva de artrópodo tiene una masa de 40 kDa o menos, y en donde los polipéptidos se seleccionan independientemente de:
(a) las secuencias polipeptídicas de SEQ ID 1-44 o las sub-secuencias de estas secuencias, las sub-secuencias que tienen 7 aminoácidos o más:
SEQ ID 1 SEQ ID 2 SEQ ID 3 SEQ ID 4 SEQ ID 5 SEQ ID 6 SEQ ID 7 SEQ ID 8 SEQ ID 9
HLTLFTVAVLLLAAAALLLLLPPAYSTTLTPP
PLSYCHLFLTHTLARALSFSRSDCL
KNVFFALLLVVLVCCLVSVQGNEI
KLLVLLICLFFYHTHCTTAYLWLAMGV
FLKGSFPRFQMCVMLIGFFSSAKCL
NDYQALLGLCCPWIDLAAADLPMRRHAKA
FYSVGKLVKVLLVMAVCCLLLCTAPTGADPL
MKFAFAFVLIALFAVFAVSQALPQPEQAAA
DGASAITKIVLELTPEQAAAV
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SEQ ID 10 TLFIFLVCCQIPLFGIMSSDSADPFYWIRVILA
SEQ ID 11 GRVMCLLRLMSTLLVVLSIVGK
SEQ ID 12 LYSGYRLLVLLVMTVCCLLLFIAPTGADPLPGQTQRTL
SEQ ID 13 MYCVIKGKTGGYCNSEGLCTCRAEDLHFLLKPIINKD
SEQ ID 14 NAEDPRTELIGCGSVLFHLAANRLSLQLEEFAVCKR
SEQ ID 15 ALIGLLLCSVQSVTANDPVDALGACSGNLFGLLMTRL
SEQ ID 16 SKLFVLAFLCLALVVVVQSAPQYARGDVPT
SEQ ID 17 SMLVAFATLSVALVVVVAIPANFNYGGGGGYFINGTGQ
SEQ ID 18 IYEKLPAYLSEVSARVNVLQVSLQHDLPNLQ
SEQ ID 19 EMKLAKVALVTISLWFMAWTPYLVINFTGI
SEQ ID 20 LLPAKVIPDKTAAYVAYGGQETLVEHVEVLV
SEQ ID 21 FYTCFLGTSSLAGFKNAVDYDELLKAG
SEQ ID 22 VLEVLGFVEDNGELVFQELLGVLKMVDPDGD
SEQ ID 23 KLTPTVVVVLLCLTFVADALTIQELRAQIAQQRIQQRYGVTVATT
SEQ ID 24 SLSDYGLIELKEHCLECCQKDTEADSKLKVYPAAVLEV
SEQ ID 25 TYICFILHGVSEIIPQQQKKTMKFLLLVASVLCLVLI
SEQ ID 26 RYFVVIALICPLIIVETLAV
SEQ ID 27 LLLYLDAADLRRALHQYQLLAAQGDRHLPQQIVKFV
SEQ ID 28 VLLTPALQAYIMDEHNLNRSNIALGRIRPYPSAVKMP
SEQ ID 29 VLKGETHKALKLKDGGHYLVEFKSIYM
SEQ ID 30 VLHSMLVNASLAEMVKESYQTHGADGRMVVRMLKFVRLLP
SEQ ID 31 RVRALRALLETLLQHQGEQNNDVYLIRLAHET
SEQ ID 32 ELQQALSSLNAGSGSCAEVFNAYLPVHNKYIGVSRKI
SEQ ID 33 KFYRLISTLLVVVVIAPRHQCSPFFFQYNRPYL
SEQ ID 34 NYVPDVSALEQDIIEVDPETKEMLKHLDFNNIVVQL
SEQ ID 35 QYSMECLEAAEPKYLDGLKTLADETAQC
SEQ ID 36 EYAQVTKMLGNGRLEAMCFDGVKRLCHIRGKL
SEQ ID 37 KLFLTLLSTLSVAMVFALPAHHHSRG
SEQ ID 38 ELEEARLVAEELEERQQELDYLKRYLVGRLQAV
SEQ ID 39 SYFLTVCLLALVQSETVQD
SEQ ID 40 AMTNANLVGLTISLAYAIFFLLYTPPTGRSS
SEQ ID 41 SFAWLLYGIILRSNFLWQNLMALALSAVQLSLFII
SEQ ID 42 AFPFISGFLSCFMWLKYGVLTEESTLILVNFIGSAL
SEQ ID 43 GLLCCCLAVLFFASPLTMLAHVIR
SEQ ID 44 LLLAMVLLPLLLLESVVPYAAAEKVW
(b) las secuencias definidas por los siguientes residuos de aminoácidos de una proteína de saliva de artrópodo, o sub-secuencias de estas secuencias, las sub-secuencias que tienen 7 aminoácidos o más:
residuos 2-33 de >gi|18389913|gb|AAL68793.1|AF457563_1 proteína hipotética 16 [Anopheles gambiae]
residuos 2-26 de >gi|18389909|gb|AAL68791.1|AF457561_1 proteína hipotética 14 [Anopheles gambiae]
residuos 2-25 de >gi|18389907|gb|AAL68790.1|AF457560_1 proteína hipotética 13 [Anopheles gambiae]
residuos 10-36 de >gi|18389903|gb|AAL68788.1|AF457558_1 proteína hipotética 11 [Anopheles gambiae]
residuos 2-26 de >gi|62546227|gb|AAX86005.1|precursor de hyp3.5 [Anopheles gambiae]
residuos 14-42 de gi|18389899|gb|AAL68786.1|AF457556_1 glándula salival 7-proteína similar [Anopheles
gambiae]
residuos 3-33 de >gi|18389911|gb|AAL68792.1|AF457562_1 proteína hipotética 15 [Anopheles gambiae]
residuos 1-30 de >gi|62546225|gb|AAX86004.1|precursor de hyp6.3 [Anopheles gambiae]
residuos 34-54 de >gi|62546225|gb|AAX86004.1|precursor de hyp6.3 [Anopheles gambiae]
residuos 38-70 de >gi|17026153|emb|CAD12038.1|proteína Sec61 [Anopheles gambiae]
residuos 2-23 de >gi|62546223|gb|AAX86003.1|precursor de hyp6.2 [Anopheles gambiae]
residuos 17-54 de >gi|18389915|gb|AAL68794.1|AF457564_1 proteína hipotética 17 [Anopheles gambiae]
residuos 57-93 de >gi|87080391|gb|ABD18596.1|defensina [Anopheles gambiae]
residuos 22-57 de >gi|18389901|gb|AAL68787.1|AF457557_1 proteína hipotética 10 [Anopheles gambiae]
residuos 7-43 de >gi|18389905|gb|AAL68789.1|AF457559_1 proteína hipotética 12 [Anopheles gambiae]
residuos 3-32 de >gi|4127344|emb|CAA76832.1|proteína cE5 [Anopheles gambiae]
residuos 3-40 de >gi|4210617|emb|CAA10259.1|proteína SG2 [Anopheles gambiae]
residuos 91-121 de >gi|4127309|emb|CAA76820.1|proteína hipotética [Anopheles gambiae]
residuos 65-94 de >gi|4375824|emb|CAA76825.1|opsina [Anopheles gambiae]
residuos 41-71 de >gi|62546233|gb|AAX86008.1|desconocido [Anopheles gambiae]
residuos 117-143 de >gi|3378531|emb|CAA03872.1|proteína D7r2 [Anopheles gambiae]
residuos 63-93 de >gi|3378529|emb|CAA03871.1|proteína D7r3 [Anopheles gambiae]
residuos 23-67 de >gi|18389893|gb|AAL68783,1|AF457553_1 proteína similar a mucina [Anopheles gambiae]
residuos 43-80 de >gi|18389881|gb|AAL68777.1|AF457547_1 selenoproteína [Anopheles gambiae]
residuos 6-42 de >gi|18389879|gb|AAL68776.1|AF457546_1 proteína de 30 kDa [Anopheles gambiae]
residuos 4-23 de >gi|18378603|gb|AAL68639.1|AF458073_1 proteína relacionada con D7 5 [Anopheles gambiae]
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residuos 20-55 de >gi|18389897|gb|AAL68785.1|AF457555_1 glándula salival tipo 1 4 proteína [Anopheles gambiae] residuos 59-95 de >gi|18389883|gb|AAL68778.1|AF457548_1 antígeno 5-relacionado 1 proteína [Anopheles gambiae]
residuos 158-184 de >gi|83016748|dbj|BAE53441.1|DsRed [construcción sintética]
residuos 37-76 de >gi|18389895|gb|AAL68784.1|AF457554_1 glándula salival 1 proteína de tipo 3 [Anopheles gambiae]
residuos 191-222 de >gi|18389895|gb|AAL68784. 1|AF457554_l glándula salival de tipo 1 3 proteína [Anopheles gambiae]
residuos 113-149 de >gi|18389891|gb|AAL68782.1|AF457552_1 proteína D7 de forma larga [Anopheles gambiae] residuos 1-37 de >emb|CAC35527.1|proteína gSG9 [Anopheles gambiae] residuos 81-120 de >sp|Q9U9L1|RS17_ANOGA 40S proteína ribosomal S17 residuos 111-142 de >emb|CAC35523.1|proteína gSG7 [Anopheles gambiae]
residuos 32-67 de >gb|AAD47075.1|AF164151_1 factor de iniciación de traducción 4C (1A) [Anopheles gambiae] residuos 1-29 de >emb|CAC35519.1|proteína tipo gSG2 [Anopheles gambiae] residuos 106-142 de >emb|CAC35451.1|proteína hipotética [Anopheles gambiae] residuos 6-28 de >emb|CAC35524.1|proteína D7r4 [Anopheles gambiae]
residuos 70-104 de >ref|XP_001230998.1|ENSANGP00000014906 [Anopheles gambiae str. PEST] residuos 174-213 de >ref|XP_316361.2|ENSANGP00000012984 [Anopheles gambiae str. PEST] residuos 41-80 de >ref|XP_314140.3|ENSANGP00000015780 [Anopheles gambiae str. PARÁSITO] residuos 126-153 de >ref|XP_314140.3|ENSANGP00000015780 [Anopheles gambiae str. PEST] residuos 5-34 de >emb|CAC35522.1|proteína gSG6 [Anopheles gambiae]
(c) y de secuencias polipeptídicas que tienen 85% de homología o más con una o más de las secuencias en (a) o (b) y que están contenidas en una o más de las siguientes bases de datos: GenBank, Protein Data Bank (PDB), SwissProt, Protein Information Resource (PIR), Protein Research Foundation (PRF), o las traducciones de CDS de estos.
[0042] CDS es la abreviatura de "CoDing Sequence", es decir, una región de nucleótidos que corresponde a la secuencia de aminoácidos en una proteína predicha. El CDS incluye codones de inicio y finalización, por lo tanto, las secuencias de codificación comienzan con un "ATG" y terminan con un codón de parada. Las secuencias no expresadas, que incluyen la 5'-UTR, la 3'-UTR, intrones o bases no expresadas debido al cambio de marco de lectura, no están incluidas dentro de un CDS. Tenga en cuenta que el CDS no se corresponde con la secuencia de ARNm real. Como resultado, una traducción de CDS es la proteína que resultaría si se tradujeran todos los codones entre los codones de inicio y de detención.
[0043] APB significa Protein Data Bank. Esta base de datos (
http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do) es mantenida por Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB), un consorcio sin fines de lucro dedicado a mejorar la comprensión de la función de los sistemas biológicos. a través del estudio de la estructura 3-D de las macromoléculas biológicas.
[0044] El Recurso de Información de Proteína (PIR) (
http://pir.georgetown.edu/). es un recurso de bioinformática público integrado establecido en 1984 por la National Biomedical Research Foundation (NBRF) como un recurso para ayudar a los investigadores en la identificación e interpretación de la información de secuencia de proteínas (Wu cH, Yeh LS, Huang H, Arminski L, Castro-Alvear J, Chen Y, Hu Z, Kourtesis P, Ledley RS, Suzek BE, Garrett L, Vinayaka CR, Zhang J, Barker WC (2003). "The Protein Information Resource". Nucleic Acids Res 31 (1): 345-7.)
[0045] PRF es una base de datos mantenida por el Protein Research Foundation (PRF) (
http://www.prf.or.jp/en/in- dex.shtml). La base de datos contiene información relacionada con aminoácidos, péptidos y proteínas recogidos de diarios científicos, datos de secuencias de proteínas y péptidos, datos sobre compuestos sintéticos y aspectos moleculares de proteínas.
[0046] GenBank es la base de datos de secuencia genética NIH (
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), una colección comentada de todas las secuencias de ADN disponibles públicamente. Se realiza una nueva versión cada dos meses. GenBank forma parte de la Colaboración Internacional de Base de Datos de Secuencia de Nucleótidos, que está compuesta por el Banco de Datos de ADN de Japón (DDBJ), el Laboratorio de Biología Molecular Europeo (EMBL) y GenBank en el Centro Nacional de Información Biotecnológica.
[0047] Swissprot (también conocido como UniProtKB/Swiss-Prot) es una base de datos de secuencias de proteínas curada (
http://expasy.org/sprot/) mantenida por el Instituto Suizo de Bioinformática (SIB). La base de datos trata de proporcionar un alto nivel de anotación (como la descripción de la función de una proteína, su estructura de dominios, modificaciones postraduccionales, variantes, etc.), un nivel mínimo de redundancia y un alto nivel de integración con otras bases de datos.
[0048] Estas bases de datos se actualizan semanalmente o mensualmente, y las secuencias se extienden a las de las bases de datos en el momento de presentación de esta solicitud. Al encontrar secuencias dentro de las bases de datos que tienen la homología deseada, se puede emplear cualquier método, dependiendo de los criterios de
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coincidencia. Sin embargo, preferiblemente se puede emplear el programa BLASTP [BLAST y sus programas derivados (por ejemplo, BLASTP) son software de dominio público].
[0049] En lugar de (o además de) el 85% de homología mencionado anteriormente en la parte (c), las secuencias de polipéptidos dentro de las bases de datos anteriores que tienen al menos 85% de sus aminoácidos en común (en términos tanto de identidad de aminoácidos, como posición en la secuencia) con una parte de una secuencia en (a) o (b) que 8 aminoácidos o más de longitud, y preferiblemente de 8 aminoácidos de longitud hasta un tercio de la longitud del secuencia en (a) o (b). En otras palabras, para una secuencia en (a) o (b) que tiene 30 aminoácidos de longitud, también se incluye una secuencia en la base de datos si comparte 85% o más de sus aminoácidos con cualquier parte de la secuencia en (a) o (b) que tiene 8 aminoácidos de longitud o más, preferiblemente de 8-10 aminoácidos. De manera similar, si una secuencia en (a) o (b) tiene 60 aminoácidos de longitud, también se incluye una secuencia en la base de datos si comparte 85% o más de sus aminoácidos con cualquier parte de la secuencia en (a) o (b) que tiene 8 aminoácidos de longitud o más, preferiblemente de 8-20 aminoácidos. Los aminoácidos coincidentes no necesitan ser consecutivos. Por ejemplo, en el caso de una secuencia de 20 aminoácidos en (a) o (b), donde una secuencia de base de datos correspondiente comparte 17 o más aminoácidos en las posiciones correctas, se incluye, incluso si estas posiciones no son todas consecutivas.
[0050] Típicamente, los polipéptidos en la composición no son proteínas de saliva de artrópodo completas (no llenas o no enteras). Por completos (o llenos o enteros) se entiende que los polipéptidos no contienen todos los residuos de aminoácidos presentes en cualquiera de las proteínas de saliva de artrópodo que se producen de forma natural.
[0051] Por lo tanto, el polipéptido es uno que puede comprender la totalidad de (o puede comprender al menos un 7 o más partes de residuos de) cualquiera de las secuencias anteriores. El polipéptido también debe ser inmunogénico en un vertebrado. Típicamente, esta inmunogenicidad es tal que los polipéptidos provocan que el vertebrado produzca células del sistema inmunitario capaces de reconocer al menos un epítopo de una fracción de proteína de saliva de artrópodo. Por lo tanto, cuando un polipéptido desencadena una respuesta de células T o células B, es inmunogénico en un vertebrado. El polipéptido puede ser alternativamente un epítopo de linfocito T auxiliar (Th), o puede ser un epítopo de linfocito B.
[0052] Un método para determinar si un polipéptido posee inmunogenicidad se expone en el Experimento 2 a continuación. Sin embargo, la presente invención no se limita a dichos métodos, y la persona experta puede seleccionar cualquier método conocido para determinar la inmunogenicidad, según se desee.
[0053] Se prefiere particularmente que los polipéptidos de la composición de polipéptido se seleccionan independientemente de SEQ ID 1-6, 20, 28, 30-32 y 35, o sub-secuencias de estas secuencias, las sub-secuencias que tienen de 7 aminoácidos o más, o de secuencias polipeptídicas que tienen un 85% de homología o más con una de estas secuencias y están contenidas en una o más de las siguientes bases de datos: GenBank, Protein Data Bank (PDB), SwissProt, Protein Information Resource (PIR), Protein Research Foundation (PRF), o traducciones de CDS de estos.
[0054] Típicamente, pero no exclusivamente, la composición de polipéptido de la presente invención, comprende 2 o más polipéptidos, preferiblemente de 2 a 10 polipéptidos, o más preferiblemente de 2-6 polipéptidos. Sin embargo, la composición puede comprender un único polipéptido y otros componentes no polipeptídicos, si se desea.
[0055] En general, en la composición polipeptídica, la fracción de proteína de saliva de artrópodo tiene una masa de 40 kDa o menos, 30 kDa o menos, o más preferiblemente 20 kDa o menos. La fracción también puede tener una masa de 20-40 kDa, de 20-30 kDa, o de 10-20 kDa.
[0056] Como se describe en el presente documento la composición de polipéptido comprende la SEQ ID 131, o comprende una o más sub-secuencias de SEQ ID 131 que tienen de 7 aminoácidos o más, o comprende secuencias de polipéptido que tienen 85% de homología o más con una de estas secuencias y contenida en una o más de las siguientes bases de datos: GenBank, Protein Data Bank (PDB), SwissProt, Protein Information Resource (PIR), Protein Research Foundation (PRF), o traducciones CDS de estos.
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SEQ ID 131
FLKGSFPRFQMCVMLIGFFSSAKCLFYSVGKLVKVLLVMAVCCLLLCTAPTGADPL
MKFAFAFVLIALFAVFAVSQALPQPEQAAAGRVMCLLRLMSTLLVVLSIVGKLYSGY
rllvllvmtvcclllfla.pt g adplpgqt qrtlaliglllc s vq s vt andpvdalga
C SGNLF GLLMTRLSKLFVLAFLC LAL W V V QS APQ Y ARGD V PTLLP AKVIP DKTAA Y
VÁYGGQETLVEHVEVLVRYFVVIALICPLIIVETLAWLLTPALQAYIMDEHNLNRSK
1ALGRTRPYPSAVKMPVTHSMLVNASTAFJV1VKESYQTHGADGRMVVRMLKPVRLL
PRVRALRALLETTXQHQGEGNNDVYURLAHETELQQALSSLNAGSCiSCAEVFNAYL
P VHNKYIGVSRKIQ YSMEC f JR A AEPKYLDGI .KTLADET A QC SF A WLL Y GIILRSNFL
VVQNLMALALSAVQLSLFÜAFPFISGFLSCFMWLKYGVLTEESTLÍLVNFÍGSAL
[0057] Como también se da a conocer en el presente documento, la composición de polipéptido comprende una o más secuencias seleccionadas de SEQ ID 1-4, 6, 9, 10, 13, 14, 17-19, 21-25, 27, 29, 33, 34, 36-40, 43 y 44 o comprende una o más sub-secuencias de estas secuencias que tienen 7 aminoácidos o más, o comprende secuencias polipeptídicas que tienen un 85% de homología o más con una de estas secuencias y que están contenidas en una o más de las siguientes bases de datos: GenBank, Protein Data Bank (PDB), SwissProt, Protein Information Resource (PIR), Protein Research Foundation (PRF), o CDS traducciones de estos.
[0058] Como también se da a conocer en el presente documento, la composición de polipéptido comprende la SEQ ID 132, o comprende una o más sub-secuencias de SEQ ID 132 que tiene 7 aminoácidos o más, o comprende secuencias de polipéptido que tiene 85% de homología o más con una de estas secuencias y contenida en una o más de las siguientes bases de datos: GenBank, Protein Data Bank (PDB), SwissProt, Protein Information Resource (PIR), Protein Research Foundation (PRF), o traducciones CDS de estos.
SEQ ID 132
HLILFTVAVLLLAAAALLLLLPPAYSTTLTPPPLSYCHLFLTHTLARALSFSRSDeLKN
VPFALLLVVLVCCLVSVQGNEIKLLVLLICLFFYHTHCTTAYLWLAMGVNDYQALL
GLCCPWIDLAAADLPMRRHAKADGASAITKIVLHLTPEQAAAVTLFIFLVCCQIPLFGI
MSSDSADPF YWIRVIL A.MY C V1KGKT GGY CNSEGLCTCRAEDLHFLLKPÍINKDNAE
DPRTFJLIGCGS VLFH F, A ANRLSLQLEEFA V CKRSMLV AF ATI ,S V AL V V V V AIP ANFN
YGGGGGYFÍNGTGQ1YEKLPAYLSEVSARVNVLQVSLQHDLPNLQEMKLAKVALVT
ISLWFMAWTPYLVINFTGIFYTCPLGTSSLAGFKNAVDYDELLKAGVLEVLGFVEDN
GELVFQELLGVTKMVDPDGDKLTPTVWVLLCLTFVADALTIQELRAQIAQQRÍQQR
YGVTVATTSLSDYGLIELKEHCLECCQKDTEADSKLKVYPAAVLEVTYICFILHGVSE
TIPQQQKKTMKFLLLVASVLCLVLILLLYLDAADLRRALHQYQLLAAQGDRHLPQQI
VKFVVLKGETHKALKLKDGGHYLVEFKSIYMKFYRLISTLLVVVVIAPRHQCSPFFF
QYNRPYLNYVPDVSALEQDIIEVDPETKEML-KHLDFNNIVVQLEYAQVTKMLGNGR
LEAMCFDGVKRLCIIIRCtKLKLFLTLLSTLSVAMVFALPAIIHHSRGELEEARLVAEEL
EERQQELDYLKRYL V G RLQ A V SYFLTV CLL AL VQ SET V QD AMTN ANLV GLTISLA Y
aiffllytpptgrssgllccclavlffaspltmlahvirlllamvllpllllesvvpya
AAEKVW
[0059] Como también se da a conocer en el presente documento la composición de polipéptido comprende la SEQ ID 133, o comprende una o más sub-secuencias de SEQ ID 133 que tiene de 7 aminoácidos o más, o comprende
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secuencias de polipéptido que tiene 85% de homología o más con una de estas secuencias y contenida en una o más de las siguientes bases de datos: GenBank, Protein Data Bank (PDB), SwissProt, Protein Information Resource (PIR), Protein Research Foundation (PRF), o traducciones CDS de estos.
SEQ ID 133
HLTLFTVAVLLLAAAAIXLLLPPAYSTTLTFPPLSYCIILFLTHTLARALSFSRSDCLKN
VFFALLLYVLVCCLVSVQGNE1KLLVLLICLFFYHTHCTTAYLWLAMGVFLKGSFPR
FQMCVMLIGFFSSAKCLNDYQALLGLCCPWIDLAAADLPMRRHAKA
[0060] Como también se da a conocer en el presente documento la composición de polipéptido comprende la SEQ ID 134, o comprende una o más sub-secuencias de SEQ ID 134 que tiene de 7 aminoácidos o más, o comprende secuencias de polipéptido que tiene 85% de homología o más con una de estas secuencias y contenida en una o más de las siguientes bases de datos: GenBank, Protein Data Bank (PDB), SwissProt, Protein Information Resource (PIR), Protein Research Foundation (PRF), o traducciones CDS de estos.
SEQ ID 134
llpakyipdktaayvayggqetlvehvevlvylltpai.qayimdehnlnrsnialgr
IRPYPS A V KMP V LH S MLVN ASLAEM VKES YQTHG ADGRMV VRMI.KF V RLLPRVRA LRALLETLLQHQGEQNNDVYURLAHETELQQALSSLNAGSGSCAEVFNAYLPVIIN K Y1GV SRKIQ YSMECLEA AEPK Y LDG L KTL ADET A QC
[0061] De manera importante, en todas las realizaciones de la invención, se puede emplear cualquier combinación de las secuencias enumeradas, ya sea solas o en combinación. Los polipéptidos particularmente preferidos son aquellos que tienen secuencias de SEQ ID 1-6, y/o aquellos que tienen secuencias de SEQ ID 20, 28, 30-32 y 35. Se prefiere especialmente que uno o más de estos estén presentes, y particularmente preferidos que todas las SEQ ID 1-6 y/o todas las SEQ ID 20, 28, 30-32 y 35 están presentes.
[0062] Los presentes inventores han encontrado que las secuencias anteriores comprenden un epítopo, o una pluralidad de epítopos, que puede ofrecer una protección contra las enfermedades transmitidas por artrópodos para una amplia variedad de vertebrados en una población. Las picaduras de artrópodos inducen en el huésped respuestas inmunes a los componentes de la saliva que se caracterizan por un fenotipo Th2 (es decir, regulación a la baja de la producción de IFN-y y regulación positiva de la producción de IL-4) (Mbow et al, 1998). Se ha encontrado que esta respuesta inmune, junto con el efecto antiheosatético de muchas de estas moléculas salivales, facilita y potencia la transmisión del parásito en general (Dhar y Kumar, 2003) y promueve la infección por Leishmania en particular (Kamhawi et al., 2000). Por el contrario, se ha demostrado que un aumento en la respuesta inmune celular caracterizado por una producción incrementada de IFN-y e IL-12, ambas citocinas de tipo Th1, en el sitio de la infección (es decir, el sitio de mordida) induce protección contra la infección por Leishmania por la picadura de moscas de arena infectadas (Kamhawi et al., 2000).
[0063] Sin pretender imponer ninguna teoría, se cree que la inmunización con proteínas salivales que conducen a la activación de una respuesta de tipo Th1 dará lugar al rápido reconocimiento de antígenos salivales en el sitio de la mordedura por las células del sistema inmune (tales como células T citotóxicas activadas (CTL) y células T auxiliares tipo 1) y la producción de IFN-y. Esta citocina (1) estimula las células T y NK para producir más IFN-y, (2) promueve la actividad microbicida de los macrófagos, (3) induce el cambio de isotipo y aumenta la producción de IgG2a por las células B y, (4) la producción de múltiples citoquinas (p. ej., TNF-a, interleuquina (IL) 12 e IL-18) que, combinadas, desencadenan una cascada de reacciones inmunes que conducen a la muerte de parásitos intracelulares. Las referencias que detallan esto se establecen a continuación.
[0064] Mbow ML, Bleyenberg JA, Hall LR & Tito RG. 1998. Phlebotomus papatasi sandfly salivary gland lysate down- regulates a Th1, but up-regulates a Th2, response in mice infected with Leishmania major. J. Immunol; 161: 5571-5577.
[0065] Dhar, R., Kumar, N., 2003. Role of mosquito salivary glands.. Canalla. Sci. 85, 1308-1313. Kamhawi, S., Belkaid, Y., Modi, G., Rowton, E., Sacks, D., 2000. Protection against cutaneous leishmaniasis resulting from bites of uninfected sand flies. Science 290, 1351-1354
[0066] Malaguarnera L, Musumeci S. 2002. The immune response to Plasmodium falciparum malaria. Lancet Infect Di. Aug; 2 (8): 472-8.
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65
[0067] Como se discutió anteriormente, las secuencias se han identificado después de un análisis de secuencias de saliva en Anopheles gambiae. Será evidente para los expertos en la materia que la invención se extiende no solo a las secuencias y sus epítopos, sino también a secuencias más grandes en proteínas de saliva de artrópodos que contienen estas secuencias, y a secuencias que son homólogas a estas secuencias y tienen actividad inmunogénica. Por lo tanto, las secuencias con alguna homología con las secuencias consenso también están dentro del alcance de la invención. Tal homología permite la sustitución de, por ejemplo, hasta 3 aminoácidos en un epítopo de 8-mer (62,5% de homología) o en un epítopo de 9-mer, 10-mer u 11-mer. Se prefiere que no más de 10 de tales sustituciones sean identificables en una secuencia de la invención correspondiente a las secuencias completas de SEQ ID 1-44 (66,6% de homología para un 30-mer). Tales sustituciones son preferiblemente sustituciones conservadoras en línea con esquemas de sustitución conocidos.
[0068] También se describe un polipéptido que comprende una o más secuencias definidas por las siguientes secuencias de SEQ ID 1-44, o de los siguientes residuos de aminoácidos de una proteína de la saliva de artrópodos, o que comprende una o más sub-secuencias de estas secuencias, las sub-secuencias que tienen 7 aminoácidos o más, o que comprenden secuencias polipeptídicas que tienen un 85% de homología o más con una de las secuencias y están contenidas en una o más de las siguientes bases de datos: GenBank, Protein Data Bank (PDB), SwissProt, Protein Information Resource (PIR), Protein Research Foundation (PRF), o las traducciones de CDS de estos.
SEQ ID 1 HLTLFTVAVLLLAAAALLLLLPPAYSTTLTPP
SEQ ID 2 PLSYCHLFLTHTLARALSFSRSDCL
SEQ ID 3 KNVFFALLLVVLVCCLVSVQGNEI
SEQ ID 4 KLLVLLICLFFYHTHCTTAYLWLAMGV
SEQ ID 5 FLKGSFPRFQMCVMLIGFFSSAKCL
SEQ ID 6 NDYQALLGLCCPWIDLAAADLPMRRHAKA
SEQ ID 7 FYSVGKLVKVLLVMAVCCLLLCTAPTGADPL
SEQ ID 8 MKFAFAFVLIALFAVFAVSQALPQPEQAAA
SEQ ID 9 DGASAITKIVLELTPEQAAAV
SEQ ID 10 TLFIFLVCCQIPLFGIMSSDSADPFYWIRVILA
SEQ ID 11 GRVMCLLRLMSTLLVVLSIVGK
SEQ ID 12 LYSGYRLLVLLVMTVCCLLLFIAPTGADPLPGQTQRTL
SEQ ID 13 MYCVIKGKTGGYCNSEGLCTCRAEDLHFLLKPIINKD
SEQ ID 14 NAEDPRTELIGCGSVLFHLAANRLSLQLEEFAVCKR
SEQ ID 15 ALIGLLLCSVQSVTANDPVDALGACSGNLFGLLMTRL
SEQ ID 16 SKLFVLAFLCLALVVVVQSAPQYARGDVPT
SEQ ID 17 SMLVAFATLSVALVVVVAIPANFNYGGGGGYFINGTGQ
SEQ ID 18 IYEKLPAYLSEVSARVNVLQVSLQHDLPNLQ
SEQ ID 19 EMKLAKVALVTISLWFMAWTPYLVINFTGI
SEQ ID 20 LLPAKVIPDKTAAYVAYGGQETLVEHVEVLV
SEQ ID 21 FYTCFLGTSSLAGFKNAVDYDELLKAG
SEQ ID 22 VLEVLGFVEDNGELVFQELLGVLKMVDPDGD
SEQ ID 23 KLTPTVVVVLLCLTFVADALTIQELRAQIAQQRIQQRYGVTVATT
SEQ ID 24 SLSDYGLIELKEHCLECCQKDTEADSKLKVYPAAVLEV
SEQ ID 25 TYICFILHGVSEIIPQQQKKTMKFLLLVASVLCLVLI
SEQ ID 26 RYFVVIALICPLIIVETLAV
SEQ ID 27 LLLYLDAADLRRALHQYQLLAAQGDRHLPQQIVKFV
SEQ ID 28 VLLTPALQAYIMDEHNLNRSNIALGRIRPYPSAVKMP
SEQ ID 29 VLKGETHKALKLKDGGHYLVEFKSIYM
SEQ ID 30 VLHSMLVNASLAEMVKESYQTHGADGRMVVRMLKFVRLLP
SEQ ID 31 RVRALRALLETLLQHQGEQNNDVYLIRLAHET
SEQ ID 32 ELQQALSSLNAGSGSCAEVFNAYLPVHNKYIGVSRKI
SEQ ID 33 KFYRLISTLLVVVVIAPRHQCSPFFFQYNRPYL
SEQ ID 34 NYVPDVSALEQDIIEVDPETKEMLKHLDFNNIVVQL
SEQ ID 35 QYSMECLEAAEPKYLDGLKTLADETAQC
SEQ ID 36 EYAQVTKMLGNGRLEAMCFDGVKRLCHIRGKL
SEQ ID 37 KLFLTLLSTLSVAMVFALPAHHHSRG
SEQ ID 38 ELEEARLVAEELEERQQELDYLKRYLVGRLQAV
SEQ ID 39 SYFLTVCLLALVQSETVQD
SEQ ID 40 AMTNANLVGLTISLAYAIFFLLYTPPTGRSS
SEQ ID 41 SFAWLLYGIILRSNFLVVQNLMALALSAVQLSLFII
SEQ ID 42 AFPFISGFLSCFMWLKYGVLTEESTLILVNFIGSAL
SEQ ID 43 GLLCCCLAVLFFASPLTMLAHVIR
SEQ ID 44 LLLAMVLLPLLLLESVVPYAAAEKVW
residuos 2-33 de >gi|18389913|gb|AAL68793.1|AF457563_1 proteína hipotética 16 [Anopheles gambiae]
residuos 2-26 de >gi|18389909|gb|AAL68791.1|AF457561_1 proteína hipotética 14 [Anopheles gambiae]
5
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25
30
35
40
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65
residuos 2 -25 de >gi|18389907|gb|AAL68790.1|AF457560_1 proteína hipotética 13 [Anopheles gambiae]
residuos 10-36 de >gi|18389903|gb|AAL68788.1|AF457558_1 proteína hipotética 11 [Anopheles gambiae]
residuos 2-26 de >gi|62546227|gb|AAX86005.1|precursor de hyp3.5 [Anopheles gambiae]
residuos 14-42 de gi|18389899|gb|AAL68786.1|AF457556_1 glándula salival 7-proteína similar [Anopheles
gambiae]
residuos 3-33 de >gi|18389911|gb|AAL68792.1|AF457562_1 proteína hipotética 15 [Anopheles gambiae]
residuos 1-30 de >gi|62546225|gb|AAX86004.1|precursor de hyp6.3 [Anopheles gambiae]
residuos 34-54 de >gi|62546225|gb|AAX86004.1|precursor de hyp6.3 [Anopheles gambiae]
residuos 38-70 de >gi|17026153|emb|CAD12038.1|proteína Sec61 [Anopheles gambiae]
residuos 2-23 de >gi|62546223|gb|AAX86003.1|precursor de hyp6.2 [Anopheles gambiae]
residuos 17-54 de >gi|18389915|gb|AAL68794.1|AF457564_1 proteína hipotética 17 [Anopheles gambiae]
residuos 57-93 de >gi|87080391|gb|ABD18596.1|defensina [Anopheles gambiae]
residuos 22-57 de >gi|18389901|gb|AAL68787.1|AF457557_1 proteína hipotética 10 [Anopheles gambiae]
residuos 7-43 de >gi|18389905|gb|AAL68789.1|AF457559_1 proteína hipotética 12 [Anopheles gambiae]
residuos 3-32 de >gi|4127344|emb|CAA76832.1|proteína cE5 [Anopheles gambiae]
residuos 3-40 de >gi|4210617|emb|CAA10259.1|proteína SG2 [Anopheles gambiae]
residuos 91-121 de >gi|4127309|emb|CAA76820.1|proteína hipotética [Anopheles gambiae]
residuos 65-94 de >gi|4375824|emb|CAA76825.1|opsina [Anopheles gambiae]
residuos 41-71 de >gi|62546233|gb|AAX86008.1|desconocido [Anopheles gambiae]
residuos 117-143 de >gi|3378531|emb|CAA03872.1|proteína D7r2 [Anopheles gambiae]
residuos 63-93 de >gi|3378529|emb|CAA03871.1|proteína D7r3 [Anopheles gambiae]
residuos 23-67 de >gi|18389893|gb|AAL68783.1|AF457553_1 proteína de mucina [Anopheles gambiae]
residuos 43-80 de >gi|18389881|gb|AAL68777.1|AF457547_1 selenoproteína [Anopheles gambiae]
residuos 6-42 de >gi|18389879|gb|AAL68776.1|AF457546_1 proteína de 30 kDa [Anopheles gambiae]
residuos 4-23 de >gi|18378603|gb|AAL68639.1|AF458073_1 proteína relacionada con D7 5 [Anopheles gambiae]
residuos 20-55 de >gi|18389897|gb|AAL68785.1|AF457555_1 glándula salival tipo 1 4 proteína [Anopheles
gambiae]
residuos 59-95 de >gi|18389883|gb|AAL68778.1|AF457548_1 antígeno 5 relacionado 1 proteína [Anopheles gambiae]
residuos 158-184 de >gi|83016748|dbj|BAE53441.1|DsRed [construcción sintética]
residuos 37-76 de >gi|18389895|gb|AAL68784.1|AF457554_1 glándula salival tipo 1 3 proteínas [Anopheles gambiae]
residuos 191-222 de >gi|18389895|gb|AAL68784.1|AF457554_1 glándula salival tipo 1 3 protein [Anopheles gambiae]
residuos 113-149 de >gi|18389891|gb|AAL68782.1|AF457552_1 proteína D7 de forma larga [Anopheles gambiae] residuos 3-35 de >gi|13537676|emb|CAC35527. 1|proteína gSG9 [Anopheles gambiae] residuos 83-118 de sp|Q9U9L1|RS17_ANOGA 40S proteína ribosomal S17 y gb|AAD47077.1|AF164153_1 proteína ribosómica S17 [Anopheles gambiae]
residuos 113-140 de >emb|CAC35523.1|proteína gSG7 [Anopheles gambiae]
residuos 34-65 de> gb|AAD47075.1|AF164151_1 factor de iniciación de traducción 4C (1A) [Anopheles gambiae] residuos 2-27 de >emb|CAC35519.1|proteína gSG2-like [Anopheles gambiae]
residuos 108-140 de >emb|CAC35451.1|proteína hipotética [Anopheles gambiae] y >gb|EAU75730.1|ENSANGP00000031975 [Anopheles gambiae str. PEST]
residuos 8-26 de >emb|CAC35524.1|proteína D7r4 [Anopheles gambiae] y >gb|AAK84945.1|proteína 4 relacionada con D7 [Anopheles gambiae]
residuos 72-102 de >ref|XP_001230998.1|ENSANGP00000014906 [Anopheles gambiae str. PEST] y gb|EAU76798.1|ENSANGP00000014906 [Anopheles gambiae str. PEST]
residuos 176-211 de >ref|XP_316361.2|ENSANGP00000012984 [Anopheles gambiae str. PEST] y
>gb|EAA10852.2|ENSANGP00000012984 [Anopheles gambiae str. PEST]
residuos 43-78 de >ref|XP_314140.3|ENSANGP00000015780 [Anopheles gambiae str. PEST] y gb|EAA09398.3|ENSANGP00000015780 [Anopheles gambiae str. PEST]
residuos 128-151 de >ref|XP_314140.3|ENSANGP00000015780 [Anopheles gambiae str. PEST] y
gb|EAA09398.3|ENSANGP00000015780 [Anopheles gambiae str. PEST] residuos 7-32 de >emb|CAC35522.1|proteína gSG6 [Anopheles gambiae]
[0069] Preferiblemente, el polipéptido no es una proteína de saliva de artrópodo completa.
[0070] La secuencia de numeración se hace referencia en la presente invención se define de acuerdo con principios bien reconocidos. Por lo tanto, la numeración comienza en 1 del codón de inicio de traducción reconocido (ATG). Esto corresponde a una metionina (M), para el segmento del genoma que codifica la proteína de interés. En otras palabras, comienza en 1 con respecto a la metionina mostrada como el primer aminoácido en la secuencia de proteína de interés tal como se usa y se define por las bases de datos en las que se han establecido las secuencias (es decir, GenBank, SwissProt, etc.).
[0071] La presente invención se describirá en más detalle a modo de ejemplo solamente con referencia a las siguientes figuras, en las que:
5
10
15
20
25
30
35
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65
Figuras 1 y 9 muestran geles de IEF de glándulas anopheles gambiae salivales (mancha azul Comassie), tal como se produce de acuerdo con los protocolos establecidos en los Ejemplos;
Figura 2 muestra una SDS-PAGe del gel IEF de la Figura 1 (tinción de plata) - el rectángulo rojo indica la ubicación de una de las proteínas diana (<30 kDa)
Figuras 3A-3I muestran datos sobre el efecto de la vacuna en la fecundidad de mosquitos, de la siguiente manera:
3A: Porcentaje que se alimentó 3C: Promedio sin huevos puestos 3E: Promedio sin larvas 3G: Porcentaje de pupación 3I: Promedio sin adultos
3B: Promedio sin huevos producidos 3D: Porcentaje de eclosión 3F: Promedio sin pupas 3H: Porcentaje de aparición
Figura 4 muestra los datos sobre la supervivencia porcentual de los mosquitos después de alimentarse de ratones inmunizados.
Figura 5 muestra la producción de IFN-gamma después de la estimulación de 96 horas in vitro con los antígenos en el Experimento 3.
Figura 6 muestra la respuesta total de Ig en suero a los antígenos según el Experimento 3.
Figura 7 muestra la respuesta total de Ig en sueros a la mezcla AGS en el día 21 de acuerdo con el Experimento 4. Figura 8 muestra el grupo inmunizado con mezcla AGS del Experimento 4 que muestra una tasa de supervivencia aumentada en comparación con el grupo de control inmunizado de mezcla de NRP.
[0072] El polipéptido descrito anteriormente comprende típicamente uno o más (preferiblemente dos o más) epítopos. Estos epítopes son preferiblemente epítopos de células T, tales como epítopos de linfocitos T citotóxicos (CTL), pero también pueden contener epítopos de células B. Generalmente, el polipéptido es inmunogénico a una proteína de saliva de artrópodo, y preferiblemente a una pluralidad de tales proteínas. En el presente contexto, se entiende que un polipéptido inmunogénico para una proteína de saliva de artrópodo significa un polipéptido que es parte de una proteína de saliva de artrópodo y que provoca una respuesta del sistema inmune. Un método para determinar si un polipéptido posee tal inmunogenicidad se establece en el Experimento 2 a continuación. Sin embargo, la presente invención no se limita a dichos métodos, y la persona experta puede seleccionar cualquier método conocido para determinar la inmunogenicidad, según se desee.
[0073] En la presente invención, la composición de polipéptido comprende una o más secuencias como se describió anteriormente. Típicamente, dos, tres, cuatro, cinco o más de tales secuencias pueden estar presentes en el polipéptido, si se desea. Cuantos más epítopos estén presentes, mayor será la amplitud de protección ofrecida dentro de una población de seres humanos y/o animales individuos con HLA o MHC diferentes. Esto es particularmente así si los epítopos incluidos son de la saliva de una pluralidad de artrópodos diferentes o compartidos por proteínas salivales de diferentes especies de artrópodos, y por lo tanto pueden ofrecer protección contra enfermedades portadas por una pluralidad de diferentes artrópodos. Típicamente, la composición polipeptídica comprende 10 polipéptidos o menos, preferiblemente 6 polipéptidos o menos, y típicamente de 2-10 polipéptidos, y más preferiblemente de 2-6 polipéptidos.
[0074] La composición de polipéptido de acuerdo con la presente invención también puede comprender una o más secuencias que no son epítopos, si se desea. Típicamente, las secuencias adicionales son de una o más proteínas de saliva de artrópodo, preferiblemente seleccionadas de las secuencias de SEQ ID 45-85 o sub-secuencias de éstas. Estas secuencias pueden estar situadas entre dos o más de las secuencias (los epítopos) descritas anteriormente, o pueden estar situadas en uno o ambos extremos del polipéptido. La presencia de tales secuencias adicionales no debería afectar a la función del polipéptido, con la condición de que el polipéptido como un todo no se vuelva demasiado grande, interfiriendo con la presentación de los epítopos en el sistema inmune del vertebrado.
[0075] En las realizaciones más preferidas, las secuencias adicionales de las proteínas antes mencionadas son las que son (o se encuentran dentro de) las secuencias siguientes:
SEQ ID 45 - >gi|18389913|gb|AAL68793.1|AF457563_1 proteína hipotética 16 [Anopheles gambiae]
MHLTLFTVAVLLLAAAALLLLLPPAYSTTLTPPAPPRLSHLGITIGRI
SEQ ID 46 - >gi|18389909|gb|AAL68791.1|AF457561_1 proteína hipotética 14 [Anopheles gambiae]
MPLSYCHLFLTHTLARALSFSRSDCLKFSEKRLLFSGSKTFPTTLL
SEQ ID 47 - >gi|18389907|gb|AAL68790.1|AF457560_1 proteína hipotética 13 [Anopheles gambiae]
MKNVFFALLLVVLVCCLVSVQGNEIIQNVVKRSIPLRQLILQHNALDDSNSDSGSQ
SEQ ID 48 - >gi|18389903|gb|AAL68788.1|AF457558_1 proteína hipotética 11 [Anopheles gambiae]
MCIFFQAGIKLLVLLICLFFYHTHCTTAYLWLAMGVEAKSIKARGTAHSKSRTSTN
SEQ ID 49 - >gi|62546227|gb|AAX86005.1|precursor de hyp3.5 [Anopheles gambiae]
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
MFLKGSFPRFQMCVMLIGFFSSAKCLMCFADWEGMLLMTMEVFDFQUVFTPVLKR
S
SEQ ID 50 - >gi|18389899|gb|AAL68786.1|AF457556_1 glándula salival tipo 7 protein [Anopheles gambiae]
MAGESQKNARSKQNDYQALLGLCCPWIDLAAADLPMRJRHAKAREAINFLLQAHEA
GPNEEPSLPA
SEQ ID 51 - >gi|18389911|gb|AAL68792.1|AF457562_1 proteína hipotética 15 [Anopheles gambiae]
MKFYSVGKLVKVLLVMAVeCLLLCTAPTGADPLPGRDRNTIANKSKDKKASAPKHS
LGTGARMALTGGGVLGGVLTNM
SEQ ID 52 - >gi|62546225|gb|AAX86004.1|precursor de hyp6.3 [Anopheles gambiae]
MKFAFAFVLÍALFAVFAVSQALPQPEQAAASSNDGASÁITKIVLELTPEQÁAAVQKM
GGRGFWPIMMKSVKKIMAIGCDLÍDC
SEQ ID 53 - >gi|17026153|emb|CAD12038.1|proteína Sec61 [Anopheles gambiae]
MGIKFLEHKPFCGILPEIAKPERKIQFREKVLWTAITLFIFLVCCQIPLFGIMSSDSADPF
YW1RVILASNRGTLM
SEQ ID 54 - >gi|62546223|gb|AAX86003.1|precursor de hyp6.2 [Anopheles gambiae]
MGRVMCLLRLMSTLLVVLSIVGKKTNAAPQVTEAPGNVGSTYSPMADIGRLATGAT
KLFGQFWNTGTRFGTELSRRTFDFLRVKK
SEQ ID 55 - >gi|18389915|gb|AAL68794.1|AF457564_1 proteína hipotética 17 [Anopheles gambiae]
M AG DIQLFST R BTTM KI ,Y SG YRLLYLLVMT V CCLLLFIAPTG ADPLPGQT QRTLG YR GNDKRATPPMHSLGS GARMAMT GGGILGGIFS AL
SEQ ID 56 - >gi|87080391|gb|ABD18596.1|defensina [Anopheles gambiae]
MDQCSVPRLCIIIMKSFIAAÁVIALICAIAVSGTTVTLQSTCKLFTADVVSSITCKMYC
VIKGKTGGYCNSEGLCTCRAEDLHFLLKPIINKD
SEQ ID 57 - >gi|18389901|gb|AAL68787.1|AF457557_1 proteína hipotética 10 [Anopheles gambiae]
MRFLS VLTV GLL V WV G VF ATVNAEDPRTELIGCG SV LFHLAANRLSLQ LEEF AV CK RSNPGYDCSDS1HRAISDLQQGLFDLNHCTKDIR
SEQ ID 58 - >gi|18389905|gb|AAL68789.1|AF457559_1 proteína hipotética 12 [Anopheles gambiae]
MRFCCVALIGLIACSVQSVTANDPVDALGACSGNLFGLLMTRLQQMVHDFTACRQE ATAN DP QHDRSDSIQRAK VDLQQQI ,VN Y S Y CTKNIQ
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
MASKLFVLAFLCLALVVVVQSAPQYARGDVPTYDEEDFDEESLKPHSSSPSDDGEEE
FDPSLLEEHADAPTARDPGRNPEFLRNSNTDEQASAPAASSSDS
SEQ ID 60 - >gi|4210617|emb|CAA10259.1|proteína SG2 [Anopheles gambiae]
MKSMLVAFATLSVALYVYVAIPANFNYGGGGGYFINGTGQSFNFSGESNGTS1PGLP DFGSFLPNLGNLTQQFGGSSGAFPQFSIPSWTNFTDAFTSILPFFGNGQGGGFPFFG SEQ ID 61 - >gi|4127309|emb|CAA76820.1|proteína hipotética [Anopheles gambiae]
MTPLIATLAACALTLSIVHSRGLPESSDKLEACGQHYGXLLKASTTWNEKECNGSTK
LAACVVSEHEQAYRELKQRCQEAHDERTAKVNAIYEKLPAYLSEVSARVNVLQVSL
QHDLPNLQE
SEQ ID 62 - >gi|4375824|emb|CAA76825.1|opsina [Anopheles gambiae]
PD V AEPI ,VHHHI .RHLRVLA A A ADHHIJ ,VHLHPEGCVRSREEH ARAGQEGN V ASLR
TQEAQNTSTEMKLAKYALVTISLWFMAWTPYLVINFTGIFKAAPISPLATIRGSLFAK
ANAVYNPIVYG
SEQ ID 63 - >gi|62546233|gb|AAX86008.1|desconocido [Anopheles gambiae]
MATTWIPTSVHGPYPPHMVPGGVDSDGAQIFVGRAHHAGDLLPAKVIPDKTAAYVA
YGGQETLVEHVEVLVHKQLIWDTASAGQVPLGAVVGGHTSDGEILYVGRAYHEGS
QTIGKYQCSHNCIYIPYGGAEVSVPTYEVIGER
SEQ ID 64 - >gi|3378531|emb|CAA03872.1|proteína D7r2 [Anopheles gambiae]
MFKKLLLSVGLVWCIJSLGQARKESTVEECEKNIGDSLKDRVCELRQYTPVSSDDM
DKUMQCVLEVVGFVDGNGEVKESVLLELLQRVDSGVNHAANMKKCVTEASTSGSD
KKANTFYTCFLGTSSLAGFKNAVDYDELLKAGKMQTSDP
SEQ ID 65 - >gi|3378529|emb|CAA03871.1|proteína D7r3 [Anopheles gambiae]
MFGKLLPC AIIA, WCLFSLGQARQEETVEECERNIP ASLKERV CEI >RQ YTP V QGKDMD SHMQCVLEVLGFVEDNGELVFQELLGVLKMVDPDGDHAGSMKKCNGEAEKVDTSS
K ANTF YTCFI «GTSSAQAFK Y AVD YVXAXR AGKLDMGTTFNAG Q V
SEQ ID 66 - >gi|18389893|gb|AAL68783.1|AF457553_1 proteína tipo mucina [Anopheles gambiae]
AGGFSLFEALKQTTTRGEMFRRKLTPTVYVVLLCLIFVADALTIGELRAQIAQQRIQQ
RYGVTYATTSAATTTAATTSAATTSEATFrAAASTTQASDSDNTTTTAEATTTTEAQ
TTSSSDNSTTTEAAATTTAASETTADSSSTGTTSVEAGLRAQYRDQVRQQAIERALA
RAAAFG
SEQ ID 67 - >gi|18389881|gb|AAL68777.1|AF457547_1 selenoproteína [Anopheles gambiae]
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
MRLFAITCLLFSIVTVIGAEFSAEDCRELGLIKSQLFCSACSSLSDYGLIELKEHCLECC QKDTEADSKLKVYPAAVLEVCTCKFGAYPQIQAFIKSDRPAKFPNLTIKYVRGLDPIV KLMDEQGTV KETLSINKWNTDT V QEFFETRLAKVEDDD YIKTNRV
SEQ ID 68 - >gi|18389879|gb|AAL68776.l|AF457546_1 proteína de 30 kDa [Anopheles gambiae]
MAGAITYICFILHGVSEIIPQQQKKTMKFLLLVASVLCLVLIVSARPADDTSDQESSTE
LSDDAGAEEGAEDAGSDAEADAGAADGEEGATDTESGAEGDDSEMDSAMKEGEEG
AGSDDAVSGADDETBESKDDAEEDSEEGGEEGGDSASGGEGGEKESPRNTYRQVHK
LLKKIMKVDTKD
SEQ ID 69 - >gi|18378603|gb|AAL68639.1|AF458073_1 proteína relacionada con D7 5 [Anopheles gambiae]
MEWRYFYVIALICPLIIVETLA V S DC VRHV SES ARNTV CDVRQ YRVTKGVEADRYV Q
CFMTALGFADESGSIQRSNVLTALDAVETHDGVYTDAVDVCLSKAKKLPGTERSGY
FFSCMLRTESALNFRDAVELQELRVASKWPEGERFDRSKVQQMMRELNSQLRC
SEQ ID 70 - >gi|18389897|gb|AAL68785.1|AF457555_1 glandula salival tipo 1 4 protein [Anopheles gambiae]
GREAIETMRTEQRNHRQQLLLLYLDA ADLRRALPIQ YQLLAAQGDRHLPQQIV KF V Y AAPRHENRRLENLLDLVRQLPARQDQRTLYQLLQPEIMKRPAQNQSTLAMLTALEM GQVVEGNGELKKQQDAMYQLVLKRWMFLCLAGQYREIVQFATKHPRLFE
SEQ ID 71 - >gi|18389883|gb|AAL68778.1|AF457548_1 proteína 5 relacionada con antígeno 5 [Anopheles gambiae]
MAIWIVCATLLLAVLSVVSVGGQYCSSDLCPRGGPHVGCNPPSSSGGPTCQGKQKA
RKVLLTPALQAYIMDEHNLNRSNIALGRIRPYPSAVKMPTL'HVDPELASLADANARS
CNYGHDRCRATKKFPYAGQNIAITQFFGYRFTEKDLIHKFVSSWWSEYLDARPEHVR
KYPSSYSG
SEQ ID 72 - >gi|83016748|dbj|BAE53441.1|DsRed [construcción sintética]
MKLASSENVITEFMRFKVRMEGTVNGHEFEIEGEGEGRPYEGHNTVKLKVTKGGPL PPAWDILSPQFQYGSKVYVKHPAD1PDYKKLSFPBGFKWERVMNFEDGGYATVTQD SSLQDGCFIYKVKFIGVNFPSDGPVMQKKTMGWEASTERLYPRDGVLKGETHKALK LK DGGH YL VEFKSIYMAKKPV QT ,PG YY YVD AKLDITSHNEDYTIV EQYERTEGRHH LFLRSRAPPPPPLT
SEQ ID 73 - >gi|18389895|gb|AAL68784.1|AF457554_1 glandula salival tipo 1 3 protein [Anopheles gambiae]
MAGQRHLIEQAWQYGAQLQHELMLTSMESDRVQRALVLHSMLVNASLAEMVKES
YQTHGADGRMVVRMLKFVRLLPGADERVAVYKQLAELLKSNGQDGRFPAV1FSTD
VRQLEDRYKPDHAQYEGKYVERWLAELQAGTFHEWEFARDYPEYFARVEEPLYE
TLKQQWSAEGLDRMVSPPNALPVGVQRVRALRALLETLLQHQGEQNNDVYLIRLA
HETGRVEATVGQADAAVRQALDDVKKLFEQFKYQRGFPDYEALYKLFKGL
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
MrVPRVLLFILLELFVQATQAFKALDPEEAWYVYERCHEDHLPSGPNRETYLKTWKF
WKLEPNDAVTHCYVKCTLAGLQMYDEKTNTFKPETVPVQHEAYKSFTEVESSKYN
ELQQALSSLNAGSGSCAEVFNAYLPYHNKYIGVSRKIYHGTVDSVAKIYEAKPEIKK
QEESFFAYCAKKALGANGKEGYKKIRDYELADSAEFRNAMDCVFRGFRYMDDSGL
KVDEVVRDFNLINKSDLEPEVRSVLASCTGTHAYDYYSCLLNSSVKEDFRNAFYFHE
LRS AN Y GYLAMGKVYEGPEK.VKEELKKLN Y
SEQ ID 75 -> emb|CAC35527.1|proteína gSG9 [Anopheles gambiae]
MCKFYRLISTLLWWIAPRHQCSPFFFQYNRPYLSQPSSQIASTAANWQRSNVTVA
LGNR1NTDT ALDD Y GTRV
SEQ ID 76 -> sp|Q9U9L1 |RS17_ANOGA 40S proteína ribosomal S17
MGRVRTKTIKKASKVUEKYYTRLTMDFDTNKRIVEEVAIIPTKPLRNKIAGFVTHLM
KRLRHSQVRGISIKLQEEERERRDNYVPDVSALEQDIIEVDPETKEMLKHLDFNNIYV QLTNPT APG Y SNRRN
SEQ ID 77 -> emb|CAC35523.1|proteína gSG7 [Anopheles gambiae]
MHAKPAFVL1ALGVICLLQTTPTSASTNHVQQLMKVFRSMTQNFDYTKKPSYLQRA
KYGVQNQLRNPLVQKAGNLPKSAKLSDGCLKQMVARVTDLEASFYASFSYNCHDH
DQ YS MECLEA AEPKY LDGLKTL ADET AQCMRDQQ
SEQ ID 78 -> gb|AAD47075.1|AF164151_1 factor de inicio de traducción 4C (1A) [Anopheles gambiae]
MPKNKGKGGKNRRRGKNENESEKRELTFKEDEQEYAQVTKMLGNGRLEAMCFDGV KRLCHIRGKLRKKV W1N QGDIILIGLRD Y QDSKADVILKYTPDE ARNLKT Y GEFPES V R1NETVTFVENDMDDDIEFGDDYSSSEEGDA1DAI
SEQ ID 79 -> emb|CAC35519.1|proteína similar a gSG2 [Anopheles gambiae]
MKLFLTLLSTLSVAMVPALPAHHHSRGGDGSSANSTGNSDNNSAGVPDFGFNSQSN
VPGFGNGQQPGQQQQGQQGQGFPFFGQGQSGFPSFGNRLQPFFGQNQQGQDGDAQ
QGRGVPFFGQGGGQGGIPSFGSGQQNGGVPFLGNGQGQSGFPSFGNGQQGGNFPFF
G
SEQ ID 80 -> emb|CAC35451.1|proteína hipotética [Anopheles gambiae]
MKLYAFALVLCVGLAVGAEVDSVPEVPSDLQQQLDELQLADKPEAPVDDAEQPLPP
NGDELPEDAPEPVPEDGSPDEEHLEEEQEEEAEADEEEADESESEESEESDELEEARL
VAEELEERQQELDYLKRYLVGRLQAVAILDRRVRPAVIRRPWIRRPWIRRPG
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
MIRQVIISYFLTVCLLALVQSETVQDCENKLPPSLKSRLCEIRRYEIIEGPEMDKHIHCV
MRALDFVYEDGRGDYIIKLYDPLNIIELDKRHDVNLEKCIGECVQVPTSERAHVFYK CLLKSTTGRTFKKVFDLMET,KKAGKVPOHORYTAF,FVOIMKDYDKALNC SEQ ID 82 -> ref|XP_001230998.1|ENSANGP00000014906 [Anopheles gambiae str. PEST]
MEAISEALQPYKEQVGMAAGÍLTVGQMFSGCFVCNDIRKKGTTDGFSAMPFVGGCG
LTVLFLQHGMLMNDSAMTNANLVGLTISLAYAIFFLLYTPPTGRSSYWRQVGGTALF
TITLLGYYKVENPSVVEDRFGMIITVLMLALIGQPLFGLPDIIRRKSTEGLPFAMILSGT
IVGLS WLL YG VII ,NN VF W CQNLA A VTLSGIQL ALF AIYPSKAAPP SKKRE
SEQ ID 83 -> ref|XP_316361.2|ENSANGP00000012984 [Anopheles gambiae str. PEST]
MESIAVALQPYKDTVGLTAAIVTVVQFFSGVLALNAIRRQGNTRGFSALPFLGGTVF CLLNIQFGQMLRDDGMIRVNFIGLALNLLYVCGFYLYTEGPAKTAVWGQIGLAGAL TAGVLS Y V Q Y EDPQLVEFRFGLILTGLL WTLV GMPLLGLGDILKKKSTEGLPFPIIFLG AVVSFAWLLYGIILRSNFLWQNLMALALSAVQLSLFIIFPSGAAKPPPTPAKKRN
SEQ ID 84 -> ref|XP_314140.3|ENSANGP00000015780 [Anopheles gambiae str. PEST]
MDGIMSKGSLASLATVATVLQFLTGTVICNRYIRKKSTGDTSAFPFISGFLSCFMWLK
YGVLTEESTLILVNFIGSALFFSYTVVFFIFCVNKREVIRQMMVISCIILSATLYTLFETD
DEKSIRVIGLLCCCLAVLFFASPLTMLAHVIRTQNTDSLPFPIIMASFFVCLLWTAYGV
LIG'DRFIQIPNLLGGILAGIQLTLYVIYPKKKASFSGGPRYSPLVSENPIL
SEQ ID 85 -> emb|CAC35522.1|proteína gSG6 [Anopheles gambiae]
MAIRVELLLAMVLLPLLLLESVVPYAAAEKVWVDRDKVYCGHLDCTRVATFKGER
FCTLCDTRHFCECKETREPLPYMYACPGTBPCQSSDRLGSCSKSMÍIDVLCDRIDOAF
LEQ
[0076] Los péptidos de la presente invención, tales como los de SEQ ID 1-44 y aquellos dentro de la SEQ ID 131134 descritos anteriormente comprenden preferentemente uno o más aminoácidos en uno o ambos de sus extremos con el fin de ayudar en su procesamiento en vacunas. Típicamente, estos aminoácidos adicionales son los adyacentes a cada uno de los términos de SEQ ID 1-44, como se muestra en las proteínas más grandes de SEQ ID 45-85 anterior (estas proteínas más grandes contienen las secuencias de SEQ ID 1-44). Preferiblemente, el número de aminoácidos adicionales en cada extremo es de 1-5, más preferiblemente de 1-3, y lo más preferiblemente 2 en cada término. En cada uno de estos casos, si hay menos de dos aminoácidos adicionales en ese extremo de las secuencias de SEQ ID 1-44, entonces los aminoácidos adicionales incluyen todos los aminoácidos restantes en ese extremo. Las secuencias particularmente preferidas de este tipo, que corresponden a SEQ ID 1-44, son las siguientes:
SEQ ID NO: 86 MHLTLFTVAVLLLAAAALLLLLPPAYSTTLTPPAP
SEQ ID 87 MPLSYCHLFLTHTLARALSFSRSDCLKF
SEQ ID 88 MKNVFFALLLVVLVCCLVSVQGNEIIQ
SEQ ID 89 GIKLLVLLICLFFYHTHCTTAYLWLAMGVEA
SEQ ID 90 MFLKGSFPRFQMCVMLIGFFSSAKCLMC
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
SEQ ID 91 KQNDYQALLGLCCPWIDLAAADLPMRRHAKARE SEQ ID 92 MKFYSVGKLVKVLLVMAVCCLLLCTAPTGADPLPG SEQ ID 93 MKFAFAFVLIALFAVFAVSQALPQPEQAAASS SEQ ID 94 SNDGASAITKIVLELTPEQAAAVQK SEQ ID 95 AITLFIFLVCCQIPLFGIMSSDSADPFYWIRVILASN SEQ ID 96 MGRVMCLLRLMSTLLVVLSIVGKKT
SEQ ID 97 MKLYSGYRLLVLLVMTVCCLLLFIAPTGADPLPGQTQRTLGY
SEQ ID 98 CKMYCVIKGKTGGYCNSEGLCTCRAEDLHFLLKPIINKD
SEQ ID 99 TVNAEDPRTELIGCGSVLFHLAANRLSLQLEEFAVCKRSN
SEQ ID 100 CVALIGLLLCSVQSVTANDPVDALGACSGNLFGLLMTRLQQ
SEQ ID 101 MASKLFVLAFLCLALVVVVQSAPQYARGDVPTYD
SEQ ID 102 MKSMLVAFATLSVALVVVVAIPANFNYGGGGGYFINGTGQSF
SEQ ID 103 NAIYEKLPAYLSEVSARVNVLQVSLQHDLPNLQE
SEQ ID 104 STEMKLAKVALVTISLWFMAWTPYLVINFTGIFK
SEQ ID 105 GDLLPAKVIPDKTAAYVAYGGQETLVEHVEVLVHK
SEQ ID 106 NTFYTCFLGTSSLAGFKNAVDYDELLKAGKM
SEQ ID 107 QCVLEVLGFVEDNGELVFQELLGVLKMVDPDGDHA
SEQ ID 108 RRKLTPTVVVVLLCLTFVADALTIQELRAQIAQQRIQQRYGVTVATTSA
SEQ ID 109 CSSLSDYGLIELKEHCLECCQKDTEADSKLKVYPAAVLEVCT
SEQ ID 110 AITYICFILHGVSEIIPQQQKKTMKFLLLVASVLCLVLIVS
SEQ ID 111 EWRYFVVIALICPLIIVETLAVSD
SEQ ID 112 QLLLLYLDAADLRRALHQYQLLAAQGDRHLPQQIVKFVYA
SEQ ID 113 RKVLLTPALQAYIMDEHNLNRSNIALGRIRPYPSAVKMPTL
SEQ ID 114 DGVLKGETHKALKLKDGGHYLVEFKSIYMAK
SEQ ID 115 ALVLHSMLVNASLAEMVKESYQTHGADGRMVVRMLKFVRLLPGA
SEQ ID 116 VQRVRALRALLETLLQHQGEQNNDVYLIRLAHETGR
SEQ ID 117 VNELQQALSSLNAGSGSCAEVFNAYLPVHNKYIGVSRKIYH
SEQ ID 118 MCKFYRLISTLLVVVVIAPRHQCSPFFFQYNRPYLSQ
SEQ ID 119 RDNYVPDVSALEQDIIEVDPETKEMLKHLDFNNIVVQLTN
SEQ ID 120 HDQYSMECLEAAEPKYLDGLKTLADETAQCMR
SEQ ID 121 EQEYAQVTKMLGNGRLEAMCFDGVKRLCHIRGKLRK
SEQ ID 122 MKLFLTLLSTLSVAMVFALPAHHHSRGGD
SEQ ID 123 SDELEEARLVAEELEERQQELDYLKRYLVGRLQAVAI
SEQ ID 124 IISYFLTVCLLALVQSETVQDCE
SEQ ID 125 DSAMTNANLVGLTISLAYAIFFLLYTPPTGRSSYW
SEQ ID 126 WSFAWLLYGIILRSNFLWQNLMALALSAVQLSLFIIFP
SEQ ID 127 TSAFPFISGFLSCFMWLKYGVLTEESTLILVNFIGSALFF
SEQ ID 128 VIGLLCCCLAVLFFASPLTMLAHVIRTQ
SEQ ID 129 VELLLAMVLLPLLLLESVVPYAAAEKVWVD
[0077] particularmente preferidos tales péptidos también incluyen los siguientes:
residuos 1-35 de >gi|18389913|gb|AAL68793.1|AF457563_1 proteína hipotética 16 [Anopheles gambiae]
residuos 1-28 de >gi|18389909|gb|AAL68791.1 |AF457561_1 proteína hipotética 14 [Anopheles gambiae]
residuos 1 -27 de >gi|18389907|gb|AAL68790.1|AF457560_1 proteína hipotética 13 [Anopheles gambiae]
residuos 8-38 de >gi|18389903|gb|AAL68788.1|AF457558_1 proteína hipotética 11 [Anopheles gambiae]
residuos 1-28 de >gi|62546227|gb|AAX86005.1|precursor de hyp3.5 [Anopheles gambiae]
residuos 12-44 de gi|18389899|gb|AAL68786.1 |Af457556_1 glándula salival proteína tipo 7 [Anopheles gambiae]
residuos 1-35 de >gi|18389911|gb|AAL68792.1|AF457562_1 proteína hipotética 15 [Anopheles gambiae]
residuos 1-32 de >gi|62546225|gb|AAX86004.1|precursor de hyp6.3 [Anopheles gambiae]
residuos 32-56 de >gi|62546225|gb|AAX86004.1|precursor de hyp6.3 [Anopheles gambiae]
residuos 36-72 de >gi|17026153|emb|CAD12038.1|proteína Sec61 [Anopheles gambiae]
residuos 1-25 de >gi|62546223|gb|AAX86003.1|hyp6.2 precursor [Anopheles gambiae]
residuos 15-56 de >gi|18389915|gb|AAL68794.1 |Af457564_1 proteína hipotética 17 [Anopheles gambiae]
residuos 55-93 de >gi|87080391 |gb|ABD18596.1 |restos de defensina [Anopheles gambiae]
20-59 de >gi|18389901|gb|AAL68787.1|AF457557_1 proteína hipotética 10 [Anopheles gambiae]
residuos 5-45 de >gi|18389905|gb|AAL68789.1|AF457559_1 proteína hipotética 12 [Anopheles gambiae]
residuos 1-34 de >gi|4127344|emb|CAA76832.1|proteína cE5 [Anopheles gambiae]
residuos 1-42 de >gi|4210617|emb|CAA10259.1|proteína SG2 [Anopheles gambiae]
residuos 89-122 de >gi|4127309|emb|CAA76820.1|proteína hipotética [Anopheles gambiae]
residuos 63-96 de >gi|4375824|emb|CAA76825.1|opsina [Anopheles gambiae]
residuos 39-73 de >gi|62546233|gb|AAX86008.1|
restos [Anopheles gambiae] desconocidos 115-145 de >gi|3378531|emb|CAA03872.1|proteína D7r2 [Anopheles gambiae]
residuos 61-95 de >gi|3378529|emb|CAA03871.1|proteína D7r3 [Anopheles gambiae]
residuos 21-69 de >gi|18389893|gb|AAL68783.1 |Af457553_1 proteína de mucina [Anopheles gambiae]
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
residuos 41-82 de >gi|18389881|gb|AAL68777.1|AF457547_1 selenoproteína [Anopheles gambiae] residuos 4-44 de >gi|18389879|gb|AAL68776.1|AF457546_1 proteína de 30 kDa [Anopheles gambiae] residuos 2-25 de >gi|18378603|gb|AAL68639.1|AF458073_1 proteína relacionada con D7 5 [Anopheles gambiae]
residuos 18-57 de >gi|18389897|gb|AAL68785.1|AF457555_1 glándula salival proteína tipo 1 4 [Anopheles gambiae] residuos 57-97 de >gi|18389883|gb|AAL68778.1|AF457548_1 antígeno 5-proteína relacionada 1 [Anopheles gambiae] residuos 156-186 de >gi|83016748|dbj|BAE53441.1|DsRed [constructo sintético] residuos 35-78 de >gi|18389895|gb|AAL68784.1|AF457554_1 glándula salival tipo 1 3 proteínas [Anopheles gambiae] residuos 189-224 de >gi|18389895|gb|AAL68784.1|AF457554_1 glándula salival tipo 1 3 proteína [Anopheles gambiae] residuos 111-151 de >gi|18389891|gb|AAL68782.1|AF457552_1 proteína D7 de forma larga [Anopheles gambiae] residuos 1-37 de >emb|CAC35527.1|proteína gSG9 [Anopheles gambiae] residuos 81-120 de> sp|Q9U9L1|RS17_ANOGA 40s proteína ribosómica S17 residuos 111 a 142 de >emb|CAC35523.1|proteína gSG7 [Anopheles gambiae]
residuos 32-67 de> gb|AAD47075.1|AF164151_1 factor de iniciación de traducción 4C (1A) [Anopheles gambiae] residuos 1-29 de >emb|CAC35519.1|proteína gSG2-like [Anopheles gambiae] residuos 106-142 de >emb|CAC35451.1] proteína hipotética [Anopheles gambiae] residuos 6-28 de >emb|CAC35524.1|proteína D7r4 [Anopheles gambiae]
residuos 70-104 de >ref|XP_001230998.1|ENSANGP00000014906 [Anopheles gambiae str. PEST] residuos 174-213 de >ref|XP_316361.2|ENSANGP00000012984 [Anopheles gambiae str. PEST] residuos 41-80 de >ref|XP_314140.3|ENSANGP00000015780 [Anopheles gambiae str. PEST] residuos 126-153 de >ref|XP_314140.3|ENSANGP00000015780 [Anopheles gambiae str. PEST] residuos 5-34 de >emb|CAC35522.1|proteína gSG6 [Anopheles gambiae]
[0078] En formas de realización alternativas de la presente invención, la invención se refiere a composiciones que comprenden polipéptidos que son homólogos a los descritos anteriormente, en particular los péptidos que son homólogos a cualquiera de las SEQ ID 1-134. La homología referida anteriormente con respecto a estas secuencias es preferiblemente 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o sustancialmente 100%.
[0079] El porcentaje de homología de una primera secuencia de polipéptidos con una segunda secuencia de polipéptido, como se indica en el contexto de la presente invención, se define como el número de residuos de aminoácidos en la segunda secuencia que coincide tanto en la posición como la identidad a los en la primera secuencia, dividida por el número total de residuos de aminoácidos en el segundo polipéptido (tanto el primer como el segundo polipéptido deben tener el mismo número de residuos de aminoácidos) y multiplicados por 100. En la presente divulgación, se prefiere que la homología del polipéptido a las secuencias definidas es 75% o más, 80% o más, 85% o más, 90% o más, 95% o más o 100% (o sustancialmente 100%).
[0080] En la presente invención, la enfermedad transmitida por artrópodos no está especialmente limitada, y los polipéptidos pueden ser inmunogénicos contra, y/o derivados de cualquier enfermedad conocida transmitida por artrópodos. Los ejemplos de enfermedades, patógenos y vectores cubiertos por la presente invención se exponen en la Tabla 1 anterior. Preferiblemente, sin embargo, la enfermedad relevante es la malaria (incluyendo cualquier cepa de malaria), como causada por una cualquiera de las cepas de Plasmodium.
[0081] Las secuencias específicas homólogas a cualquiera de las SEQ ID 1-134 descritas anteriormente son preferentemente las que están en las posiciones apropiadas dentro de las proteínas de artrópodos conocidas, que se pueden encontrar en la base de datos pública de proteínas NCBI, a la que se puede acceder en línea en la siguiente dirección URL
http://www.ncb¡.nlm.nih.gov/entrez/querv/stat¡c/help/help-doc.html#Prote¡n. La lista suele tener el formato|número de versión (número gi)|identificación de base de datos (por ejemplo, gb para Gen- Bank)|número de adhesión NCBI|información adicional opcional (por ejemplo, el número de acceso de la secuencia de nucleótidos de la que se deriva la secuencia de proteína). Las secuencias La base de datos de proteínas contiene datos de secuencia de las regiones de codificación traducidas de secuencias de ADN en GenBank, EMBL y DDBJ, así como secuencias de proteínas enviadas a Protein Information Resource (PIR), SWISS-PROT, Protein Research Foundation (PRF) y Protein Data Bank (PDB) (secuencias de estructuras resueltas).
[0082] Los epítopos dentro de las secuencias definidas anteriormente no son especialmente limitados, siempre que contengan 7 residuos de aminoácidos o más. Preferiblemente, los epítopos son al menos de una longitud que es apropiada para los epítopos inmunogénicos más pequeños, tales como CTL, auxiliares T y epítopes de células B en una especie de vertebrado particular, tal como en un ser humano. Típicamente, los epítopos contienen 8, 9, 10 u 11 residuos de aminoácidos, pero pueden contener más si se desea.
[0083] A pesar de que puede comprender más aminoácidos típicamente, el polipéptido comprende 100 aminoácidos o menos, preferiblemente entre 7 y 100 aminoácidos, y más preferiblemente de 8-75 aminoácidos. El tamaño no debería ser tan grande que los epítopos útiles compitan con epítopos no protectores en el sistema inmune (por esta razón, no se incluyen proteínas completas), ni el tamaño debería ser tan pequeño que solo se ofrezca un rango de protección muy estrecho. Los intervalos más preferidos son de 15-75 aminoácidos, 20-55 aminoácidos y 23-50 aminoácidos. Se prefiere particularmente que el polipéptido consista (o consista sustancialmente) en una secuencia seleccionada de las secuencias definidas anteriormente.
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[0084] Además de los polipéptidos descritos anteriormente, la presente descripción también incluye polipéptidos inmunogénicos de múltiples epítopos que comprenden dos o más polipéptidos de la presente invención ya sea como polipéptidos multi-ramificados o secuencias concatenadas. Estos polipéptidos de múltiples epítopos no están limitados en tamaño y pueden comprender, por ejemplo, hasta 1.400, o hasta 900, o hasta 550 aminoácidos. Por lo tanto, se extienden no solo a los polipéptidos descritos anteriormente, sino también a polipéptidos más grandes, con la condición de que estos polipéptidos más grandes comprendan dos o más unidades, cada unidad constituida por un polipéptido de la invención. Por lo tanto, un polipéptido que tiene 100 unidades repetitivas de un 7-mer de acuerdo con la presente invención se incluye en la presente invención, como es un polipéptido que tiene, digamos 52 unidades de un epítopo de 8 meros, y 23 unidades de un segundo epítopo 10-mer. Los polipéptidos de este tipo no sufrirán los problemas de competición asociados con polipéptidos de longitud similar que comprenden solo uno o dos epítopos. Para evitar dudas, el polipéptido multi-epítopo puede comprender múltiples copias del mismo epítopo, o copias únicas de una pluralidad de epítopos diferentes, o copias múltiples de 2 o más epítopos. Es particularmente preferido que un polipéptido multiepítopo comprenda dos o más de las secuencias descritas anteriormente en SEQ ID 1-44 (y especialmente las de SEQ ID 1-6, 7, 8, 11, 12, 15, 16, 20, 26, 28, 30-32, 35, 41 y 42) o en la SEQ ID 86134.
[0085] Como se ha mencionado, la invención proporciona una composición de polipéptido que comprende uno o más, preferiblemente dos o más polipéptidos diferentes como se define anteriormente. De este modo, la composición polipeptídica puede comprender cualquier número de polipéptidos de la presente invención juntos en la misma secuencia, mezcla o formulación. La presencia de una pluralidad de polipéptidos juntos es útil ya que cada uno puede provocar su propia respuesta inmune, ampliando el efecto protector de la composición. Se prefiere particularmente que la composición contenga dos o más de (o todas) las secuencias de SEQ ID 1-44 (y especialmente las de SEQ ID 1-6, 7, 8, 11, 12, 15, 16, 20, 26, 28, 30-32, 35, 41 y 42), y/o dos o más de los epítopos dentro de la SEQ ID 86-134. En la composición, cada secuencia y/o epítopo puede estar presente como un péptido separado, o como un número de péptidos mayores que comprenden varios epítopos y/o secuencias concatenadas (por ejemplo, tres secuencias concatenadas en un péptido mayor y otras 4 en otro péptido mayor; etc.).
[0086] La invención también proporciona una construcción de polipéptido, cuyo constructo comprende un polipéptido como se ha definido anteriormente y un portador. La construcción puede formarse combinando uno o más epítopos y/o polipéptidos como se definió anteriormente con el vehículo. El vehículo puede ser una molécula, tal como un adyuvante y/o un excipiente. La combinación en este contexto significa mezclar juntos, o unir juntos (por ejemplo, a través de un enlace covalente).
[0087] La presente invención proporciona además un polipéptido como se define anteriormente para su uso en medicina. También se proporciona un medicamento o composición de vacuna contra enfermedades transmitidas por artrópodos, que comprende un polipéptido como se definió anteriormente, y uno o más excipientes y/o adyuvantes apropiados, o una construcción polipeptídica como se definió anteriormente y opcionalmente uno o más excipientes y/o adyuvantes apropiados (si la parte del portador de la construcción es ella misma un excipiente o adyuvante, entonces puede no ser necesario otro excipiente o adyuvante). El excipiente o adyuvante no está especialmente limitado, y se puede emplear cualquier excipiente o adyuvante usado en medicamentos y vacunas. El medicamento o composición de vacuna puede producirse de acuerdo con cualquier método conocido apropiadamente adaptado a la presente invención, tal como mezclando un polipéptido de la invención con un excipiente apropiado.
[0088] La invención también proporciona un método para producir un polipéptido como se definió anteriormente. El método no está especialmente limitado, y típicamente comprende unir dos o más epítopos para formar el polipéptido. Sin embargo, el polipéptido puede sintetizarse mediante síntesis química directa (por ejemplo, incorporando un aminoácido por vez hasta que se forma el polipéptido completo) o mediante métodos recombinantes. Tales métodos generales son bien conocidos por la persona experta y pueden adaptarse a la presente invención según se desee. En algunos casos, el polipéptido de la presente invención puede comprender secuencias de aminoácidos adicionales en uno o ambos extremos para ayudar en la síntesis del polipéptido. Estas secuencias adicionales son preferiblemente de 1-5 aminoácidos de longitud. Típicamente 2 aminoácidos están involucrados. Los ejemplos de tales secuencias se proporcionan como SEQ ID 86-129, como se describió anteriormente.
[0089] La invención se refiere además al uso de un polipéptido o composición como se define anteriormente, en la fabricación de un medicamento o vacuna, eficaz en el tratamiento o prevención de una enfermedad transmitida por artrópodos. También se describe un método para tratar o prevenir una enfermedad transmitida por artrópodos, cuyo método comprende administrar un polipéptido, una composición, un medicamento o una vacuna como se definió anteriormente a un vertebrado. El método de administración no está especialmente limitado y puede comprender administración subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica o intranasal, o puede administrarse por vía oral (p. ej., en forma de píldora o preparación líquida), o puede estar en la forma de un supositorio, si se desea. La forma de tales preparaciones de administración no está especialmente limitada, y las formas conocidas se pueden emplear con modificaciones apropiadas que serán evidentes para la persona experta. La dosificación no está especialmente limitada y puede variar de 1 pg a 100 g, preferiblemente de 1 ng a 100 g del polipéptido por individuo, dependiendo del tamaño, peso y especies del individuo involucrado.
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[0090] La invención se puede aplicar a cualquier vertebrado, ya que los sistemas inmunes de los vertebrados funcionan de una manera relacionada. Típicamente, el vertebrado al que se hace referencia en el presente contexto es un mamífero, pájaro, reptil o pez. Se prefiere especialmente que el vertebrado sea un humano, un animal doméstico (como un perro o un gato), un animal de granja (como un cerdo o un caballo), un animal bovino (como el ganado) o aves de corral (tales como ave doméstica, ave de granja o ave de caza). Cuando el vertebrado es un pájaro, es preferible un pollo, un pavo, un pato o un ganso.
[0091] Ejemplos de MHCs humanos (HLA) que pueden estar asociados con un epítopo particular de células T en la presente invención incluyen los siguientes:
HLA-A
[0092] A*010101, A*010102, A*010103, A*0102, A*0103, A*0104N, A*0106, A*0107, A*0108, A*0109, A*0110, A*02010101, A*02010102L, A*020102, A*020103, A*020104, A*020105, A*020106, A*020107, A*020108, A*020109, A*020110, A*020111, A*0202, A*020301, A*020302, A*0204, A*0205, A*020601, A*020602, A*020603, A*0207, A*0208, A*0209, A*0 010, A*0211, A*0212, A*0213, A*0214, A*0215N, A*0216, A*021701, A*021702, A*0218, A*0219, A*022001, A*022002, A*0221, A*0222, A*0224, A*0225, A*0226, A*0227, A*0228, A*0229, A*0230, A*0231, A*0232N, A*0233, A*0234, A*023501, A*023502, A*0236, A*0237, A*0238, A*0239, A*0240, A*0241, A*0242, A*0243N, A*0244, A*0245, A*0246, A*0247, A*0248, A*0249, A*0250, A*0251, A*0252, A*0253N, A*0254, A*0255, A*0256, A*0257, A*0258, A*0259, A*0260, A*0261, A*0262, A*0263, A*0264, A*0265, A*0266, A*0267, A*0268, A*0269, A*0701, A*0271, A*0272, A*0273, A*03010101, A*03010102N, A*03010103, A*030102, A*030103, A*0302, A*0303N, A*0304, A*0305, A*0306, A*0307, A*0308, A*0309, A*0310, A*0311N, A*0312, A*1103, A*0314, A* 110101, A*110102, A*1102, A*1103, A*1104, A*1105, A*1106, A*1107, A*1108, A*1109, A*1110, A*1111, A*1112, A* 1113, A*1114, A* 1115, A*1116, A*1117, A*1118, A*1119, A*2301, A*2302, A*2303, A*2304, A*2305, A*2306, A*2307N, A*2308N, A*2309, A*2310, A*2311N, A*2312, A*24020101, A*24020102L, A*240202, A*240203, A*240204, A*240205, A*240206, A*240301, A*240302, A*2404, A*2405, A*2406, A*2407, A*2408, A*2409N, A*2410, A*2411N, A*2413, A*2414, A*2415, A*2417, A*2418, A*2419, A*2420, A*2421, A*2422, A*2423, A*2424, A*2425, A*2426, A*2427, A*2428, A*2429, A*2430, A*2431, A*2432, A*2433, A*2434, A*2435, A*2436N, A*2437, A*2438, A*2439, A*2440N, A*2441, A*2442, A*2443, A*2444, A*2445N, A*2446, A*250101, A*250102, A*2502, A*2503, A*2504, A*2601, A*2602, A*2603, A*2604, A*2605, A*2606, A*260701, A*260702, A*2608, A*2609, A*2610, A*2611N, A*2612, A*2613, A*2614, A*2615, A*2616, A*2617, A*2618, A*2619, A*2620, A*2621, A*2622, A*2623, A*29010101, A*29010102N, A*290201, A*290202, A*290203, A*2903, A*2904, A*2905, A*2906, A*2907, A*2908N, A*2909, A*2910, A*2911, A*300101, A*300102, A*300201, A*300202, A*3003, A*3004, A*3006, A*3007, A*3008, A*3009, A*3010, A*3011, A*3012, A*310102, A*3102, A*3103, A*3104, A*3105, A*3106, A*3107, A*3108, A*3109, A*3110, A*3201, A*3202, A*3203, A*3204, A*3205, A*3206, A*3207, A*3208, A*3301, A*330301, A*330302, A*3304, A*3305, A*3306, A*3307, A*3401, A*3402, A*3403, A*3404, A*3405, A*3406, A*3601, A*3602, A*3603, A*3604, A*4301, A*6601, A*6602, A*6603, A*6604, A*680101, A*680102, A*680103, A*6802, A*680301, A*680302, A*6804, A*6805, A*6806, A*6807, A*6808, A*6809, A*6810, A*6811N, A*6812, A*6813, A*6814, A*6815, A*6816, A*6817, A*6818N, A*6819, A*6820, A*6821, A*6822, A*6823, A*6824, A*6825, A*6826, A*6827, A*6901, A*7401, A*7402, A*7403, A*7404, A*7405, A*7406, A*7407, A*7408, A*7409, A*7410, A*8001.
HLA-B
[0093] B*070201, B*070202, B*070203, B*070204, B*0703, B*0704, B*0705, B*0706, B*0707, B*0708, B*0709, B*0710 , B*0711, B*0712, B*0713, B*0714, B*0715, B*0716, B*0717, B*0718, B*0719, B*0720, B*0721, B*0722, B*0723, B*0724, B*0725, B*0726, B*0727, B*0728, B*0729, B*0730, B*0731, B*0732, B*0733, B*0734, B*0735 ,
B*0736, B*0737, B*0738, B*0801, B*0802, B*0803, B*0804, B*0805, B*0806, B*0807, B*0808N, B*0809, B*0810,
B*0811, B*0812, B*0813, B*0814, B*0815, B*0816, B*0817, B*0818, B*0819N, B*0820, B*0821, B*0822 , B*1301,
B*1302, B*1303, B*1304, B*1306, B*1307N, B*1308, B*1309, B*1310, B*1311, B*1312, B*1313, B*1401, B*1402,
B*1403, B*1404, B*1405, B*140601, B*140602, B*15010101, B*15010102N, B*150102, B*150103, B*150104, B*150105 , B*1502, B*1503, B*1504, B*1505, B*1506, B*1507, B*1508, B*1509, B*1510, B*151101, B*151102, B*1512, B*1513, B*1514, B*1515, B*1516, B*15170101, B*15170102, B*1518, B*1519, B*1520, B*1521, B*1523,
B*1524, B*1525 , B*1526N, B*1527, B*1528, B*1529, B*1530, B*1531, B*15 32, B*1533, B*1534, B*1535, B*1536,
B*1537, B*1538, B*1539, B*1540, B*1542, B*1543, B*1544, B*1545, B*1546, B*1547, B*1548, B*1549, B*1550,
B*1551, B*1552, B*1553, B*1554, B*1555, B*1556, B*1557, B*1558, B*1560, B*1561, B*1562, B*1563, B*1564,
B*1565, B*1566, B*1567, B*1568, B*1569, B*1570, B*1571, B*1572, B*1573, B*1574, B*1575, B*1576, B*1577,
B*1578, B*1579N, B*1580, B*1581, B*1582, B*1583, B*1584, B*1585, B*1586, B*1587, B*1588, B*1589, B*1590, B*1591, B*1592, B*1593, B*1594N, B*180101, B*180102, B*1802, B*1803, B*1804, B*1805, B*1806, B*1807, B*1808, B*1809, B*1810, B*1811, B*1812, B*1813, B*1814, B*1815, B*1817N, B*1818, B*1819, B*1820, B*2701, B*2702, B*2703, B*2704, B*270502, B*270503, B*270504, B*270505, B*270506, B*270507, B*2706, B*2707, B*2708, B*2709, B*2710, B*2711, B*2712, B*2713, B*2714, B*2715, B*2716, B*2717, B*2718, B*2719, B*2720, B*2721, B*2723, B*2724, B*2725, B*2726, B*350101, B*350102, B*3502, B*3503, B*3504, B*3505, B*3506, B*3507, B*3508, B*350901, B*350902, B*3510, B*3511, B*3512, B*3513, B*351401, B*351402, B*3515, B*3516, B*3517, B*3518, B*3519, B*3520, B*3521 , B*3522, B*3523, B*3524, B*3525, B*3526, B*3527, B*3528, B*3529, B*3530,
B*3531, B*3532, B*3533, B*3534, B*3535, B*3536, B*3537, B*3538, B*3539, B*3540N, B*3541, B*3542, B*3543,
B*3544, B*3545, B*3546 , B*3547, B*3548, B*3549, B*3550, B*3551, B*3552, B*3553N, B*3701, B*3702, B*3703N,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
B*3704, B*3705, B*3706, B*3707, B*3801, B*380201, B*380202, B*3803, B*3804, B*3805, B*3806, B*3807, B*3808, B*3809, B*3810 , B*390101, B*390103, B*390104, B*390201, B*390202, B*3903, B*3904, B*3905, B*390601, B*390602, B*3907, B*3908, B*3909, B*3910, B*3911, B*3912, B*3913, B*3914, B*3915, B*3916, B*3917, B*3918, B*3919, B*3920, B*3922 , B*3923, B*3924, B*3925N, B*3926, B*3927, B*3928, B*3929, B*3930, B*3931, B*3932, B*400101, B*400102, B*400103, B*400104, B*400105, B*400201, B*400202, B*4003, B*4004, B*4005, B*40060101, B*40060102, B*4007, B*4008, B*4009 , B*4010, B*4011, B*4012, B*4013, B*401401, B*40140 2, B*401403, B*4015, B*4016, B*4018, B*4019, B*4020, B*4021, B*4022N, B*4023, B*4024, B*4025, B*4026, B*4027, B*4028, B*4029, B*4030, B*4031, B*4032, B*4033, B*4034, B*4035, B*4036, B*4037, B*4038, B*4039, B*4040, B*4042, B*4043,
B*4044, B*4045, B*4046, B*4047, B*4048, B*4049, B*4050, B*4051, B*4052, B*4053, B*4054, B*4055, B*4056,
B*4057, B*4101, B*4102, B*4103, B*4104, B*4105, B*4106, B*4201, B*4202, B*4204, B*420501, B*420502, B*4206, B*44020101, B*44020102S, B*440202, B*440203, B*440301, B*440302, B*4404, B*4405, B*4406, B*4407, B*4408, B*4409, B*4410, B*4411, B*4412, B*4413, B*4414, B*4415, B*4416, B*4417, B*4418, B*4419N, B*4420, B*4421, B*4422, B*4423N, B*4424, B*4425, B*4426, B*4427, B*4428, B*4429, B*4430, B*4431, B*4432, B*4433, B*4434, B*4435, B*4436, B*4437, B*4438, B*4439, B*4440, B*4501, B*4502, B*4503, B*4504, B*4505, B*4506, B*4507,
B*4601, B*4602, B*4603, B*4604, B*47010101, B*47010102, B*4702, B*4703, B*4704, B*4705, B*4801, B*4802,
B*4803, B*4804, B*4805, B*4806, B*4807, B*4808, B*4809, B*4810, B*4901, B*4902, B*4903, B*5001, B*5002,
B*5004, B*510101, B*510102, B*510103, B*5 10104, B*510105, B*510201, B*510202, B*5103, B*5104, B*5105, B*5106, B*5107, B*5108, B*5109, B*5110, B*5111N, B*5112, B*511301, B*511302, B*5114, B*5115, B*5116, B*5117, B*5118, B*5119, B*5120, B*5121, B*5122, B*5123, B*5124, B*5126, B*5127N, B*5128, B*5129, B*5130,
B*5131, B*5132, B*5133, B*5134, B*5135, B*5136, B*520101, B*520102, B*520103, B*520104, B*5202, B*5203,
B*5204, B*5205, B*5206, B*530101, B*530102, B*5302, B*5303, B*5304, B*5305, B*5306, B*5307, B*5308, B*5309, B*5401, B*5402, B*5501, B*5502, B*5503, B*5504, B*5505, B*5507, B*5508, B*5509, B*5510, B*5511, B*5512, B*5513, B*5514, B*5515, B*5516, B*5601, B*5602, B*5603, B*5604, B*560501, B*560502, B*5606, B*5607, B*5608, B*5609, B*5610, B*5611, B*5612, B*5613, B*5614, B*570101, B*570102, B*5702, B*570301, B*570302, B*5704,
B*5705, B*5706, B*5707, B*5708, B*5709, B*5801, B*5802, B*5804, B*5805, B*5806, B*5807, B*5808, B*5809,
B*5810N, B*5901, B*670101, B*670102, B*6702, B*7301, B*7801, B*780201, B*780202, B*7803, B*7804, B*78 05, B*8101, B*8102, B*8201, B*8202, B*8301.
HLA-C
[0094] Cw*010201, Cw*010202, Cw*0103, Cw*0104, Cw*0105, Cw*0106, Cw*0107, Cw*0108, Cw*0109, Cw*0110, Cw*020201, Cw*020202 , Cw*020203, Cw*020204, Cw*020205, Cw*0203, Cw*0204, Cw*0205, Cw*0206, Cw*0207, Cw*0208, Cw*0209, Cw*030201, Cw*030202, Cw*030301, Cw*030302, Cw*030303, Cw*030304, Cw*030401, Cw*030402, Cw*030403, Cw*0305, Cw*0306, Cw*0307, Cw*0308, Cw*0309, Cw*0310 , Cw*0311, Cw*0312, Cw*0313, Cw*0314, Cw*0315, Cw*0316, Cw*0317, Cw*0318, Cw*04010101, Cw*04010102, Cw*040102, Cw*0403, Cw*040401, Cw*040402, Cw*0405, Cw*0406, Cw*0407, Cw*0408, Cw*0409N, Cw*0410, Cw*0411, Cw*0412, Cw*0413, Cw*0414, Cw*0415 , Cw*050101, Cw*050102, Cw*0502, Cw*0503, Cw*0504, Cw*0505, Cw*0506, Cw*0507N, Cw*0508, Cw*0509, Cw*0510, Cw*0602, Cw*0603, Cw*0604, Cw*0605, Cw*0606, Cw*0607, Cw*0608, Cw*0609, Cw*0610, Cw*0611, Cw*070101, Cw*070102, Cw*070103, Cw*07020101 , Cw*07020102, Cw*07020103, Cw*0703, Cw*070401, Cw*070402, Cw*0705, Cw*0706, Cw*0707, Cw*0708, Cw*0709, Cw*0710, Cw*0711, Cw*0712, Cw*0713, Cw*0714, C w * 0715, Cw*0716, Cw*0717, Cw*0718, Cw*0719, Cw*0720, Cw*0721, Cw*0722, Cw*0723, Cw*0724, Cw*0725, Cw*0726, Cw*0727, Cw*0728, Cw*0729, Cw*080101, Cw*080102, Cw*0802, Cw*0803, Cw*0804, Cw*0805, Cw*0806, Cw*0807, Cw*0808, Cw*0809, Cw*0810, Cw*0811, Cw*0812, Cw*120201, Cw*120202, Cw*120203, Cw*120301, Cw*120302, Cw*120303, Cw*120401, Cw*120402, Cw*1205, Cw*1206, Cw*1207, Cw*1208, Cw*1209, Cw*1210, Cw*1211, Cw*1212, Cw*1213, Cw*1214, Cw*1215, Cw*140201, Cw*140202, Cw*140203, Cw*1403, Cw*1404, Cw*1405, Cw*150201, Cw*150202, Cw*1503, Cw*1504, Cw*150501, Cw*150502, Cw*150503, Cw*150504, Cw*1506, Cw*1507, Cw*1508, Cw*1509, Cw*1510, Cw*1511, Cw*1512, Cw*1601, Cw*1602, Cw*160401, Cw*1606, Cw*1701, Cw*1702, Cw*1703, Cw*1801, Cw*1802.
HLA-E
[0095] E*0101, E*010301, E*010302, E*010303, E*0104.
HLA-F
[0096] F*010101, F*010102.
HLA-G
[0097] G*010101, G*010102, G*010103, G*010104, G*010105, G*010106, G*010107, G*010108, G*0102, G*0103, G*010401, G*010402 , G*010403, G*0105N, G*0106.
HLA-DRA
[0098] DRA*0101, DRA*010201, DRA*010202.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
[0099] DRB1*010101, DRB1*010102, DRB1*010103, DRB1*010201, DRB1*010202, DRB1*010203, DRB1*010204 DRB1*0103, DRB1*0104, DRB1*0105, DRB1*0106, DRB1*0107 , DRB1*0108, DRB1*0109, DRB1*0110
DRB1*0111, DRB1*030101, DRB1*030102, DRB1*030201, DRB1*030202, DRB1*0303, DRB1*0304
DRB1*030501, DRB1*030502, DRB1*0306, DRB1*0307, DRB1*0308, DRB1*0309, DRB1*0310, DRB1*0311
DRB1*0312, DRB1*0313, DRB1*0314, DRB1*0315, DRB1*0316, DRB1*0317, DRB1*0318 , DRB1*0319
DRB1*0320, DRB1*0321, DRB1*0322, DRB1*0323, DRB1*0324, DRB1*0325, DRB1*0326, DRB1*0327
DRB1*0328, DRB1*040101, DRB1*040102, DRB1*0402, DRB1*040301, DRB1*040302, DRB1*0404
DRB1*040501, DRB1*040502, DRB1*040503, DRB1*040504, DRB1*0406, DRB1*040701, DRB1*040702
DRB1*040703, DRB1*0408 , DRB1*0409, DRB1*0410, DRB1*0411, DRB1*0412, DRB1*0413, DRB1*0414
DRB1*0415, DRB1*0416, DRB1*0417, DRB1*0418, DRB1*0419, DRB1*0420, DRB1*0421, DRB1*0422
DRB1*0423, DRB1*0424, DRB1*0425, DRB1*0426, DRB1*0427, DRB1*0428, DRB1*0429, DRB1*0430
DRB1*0431, DRB1*0432, DRB1*0433, DRB1*0434, DRB1*0435, DRB1*0436, DRB1*0437, DRB1*0438
DRB1*0439, DRB1*0440, DRB1*0441, DRB1*0442, DRB1*0443, DRB1*0444, DRB1*0445, DRB1*0446
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DRB1*090102, DRB1*090103, DRB1*0902, DRB1*0903, DRB1*100101, DRB1*100102, DRB1*110101
DRB1*110102, DRB1*110103, DRB1*110104, DRB1*110105, DRB1*1102, DRB1*1103, DRB1*110401 DRB1*110402, DRB1*1105, DRB1*110601, DRB1*110602, DRB1*1107, DRB1*110801, DRB1*110802
DRB1*1109, DRB1*1110, DRB1*1111, DRB1*11120 1, DRB1*111202, DRB1*1113, DRB1*1114, DRB1*1115 DRB1*1116, DRB1*1117, DRB1*1118, DRB1*1119, DRB1*1120, DRB1*1121, DRB1*1122, DRB1*1123
DRB1*1124, DRB1*1125, DRB1*1126, DRB1*112701, DRB1*112702, DRB1*1128, DRB1*1129, DRB1*1130
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DRB1*1321, DRB1*1322, DRB1*1323, DRB1*1324, DRB1*1325, DR B1 * 1326, DRB1*1327, DRB1*1328
DRB1*1329, DRB1*1330, DRB1*1331, DRB1*1332, DRB1*1333, DRB1*1334, DRB1*1335, DRB1*1336
DRB1*1337, DRB1*1338, DRB1*1339, DRB1*1340, DRB1*1341, DRB1*1342, DRB1*1343, DRB1*1344
DRB1*1345, DRB1*1346, DRB1*1347, DRB1*1348, DRB1*1349, DRB1*1350, DRB1*1351, DRB1*1352
DRB1*1353, DRB1*1354, DRB1*1355, DRB1*1356, DRB1*1357, DRB1*1358, DRB1*1359, DRB1*1360
DRB1*1361, DRB1*1362, DRB1*1363, DRB1*1364, DRB1*1365, DRB1*140101, DRB1*140102, DRB1*1402
DRB1*140301, DRB1*140302, DRB1*1404, DRB1*140501, DRB1*140502, DRB1*1406, DRB1*140701
DRB1*140702, DRB1*1408, DRB1*1409, DRB1*1410, DRB1*1411, DRB1*1412, DRB1*1413, DRB1*1414 DRB1*1415, DRB1*1416, DRB1*1417, DRB1*1418, DRB1*1419, DRB1*1420, DRB1*1421, DRB1*1422
DRB1*1423, DRB1*1424, DRB1*1425, DRB1*1426, DRB1*1427, DRB1*1428, DRB1*1429, DRB1*1430
DRB1*1431, DRB1*1432, DRB1*1433, DRB1*1434, DRB1*1435, DRB1*1436, DRB1*1437, DRB1*1438
DRB1*1439, DRB1*1440, DRB1*1441, DRB1*1442, DRB1*1443, DRB1*1444, DRB1*1445, DRB1*14 46
DRB1*1447, DRB1*1448, DRB1*150101, DRB1*150102, DRB1*150103, DRB1*150104, DRB1*150105
DRB1*150201, DRB1*150202, DRB1*150203, DRB1*1503, DRB1*1504, DRB1*1505, DRB1*1506, DRB1*1507 DRB1*1508, DRB1*1509, DRB1*1510, DRB1*1511, DRB1*1512, DRB1*1513, DRB1*1514, DRB1*1515
DRB1*1516, DRB1*160101, DRB1*160102, DRB1*160201, DRB1*160202, DRB1*1603, DRB1*1604
DRB1*160501, DRB1*160502, DRB1*1607, DRB1*1608.
HLA-DRB2-9
[0100] DRB2*0101, DRB3*010101, DRB3*01010201, DRB3*01010202, DRB3*010103, DRB3*010104, DRB3*0102, DRB3*0103, DRB3*0104, DRB3*0105, DRB3*0106, DRB3*0107 , DRB3*0108, DRB3*0109, DRB3*0110, DRB3*0111, DRB3*0201, DRB3*020201, DRB3*020202, DRB3*020203, DRB3*020204, DRB3*0203, DRB3*0204, DRB3*0205, DRB3*0206, DRB3*0207, DRB3*0208, DRB3*0209, DRB3*0210, DRB3*0211, DRB3*0212, DRB3*0213, DRB3*0214, DRB3*0215, DRB3*0216, DRB3*0217, DRB3*0218 , DRB3*0219, DRB3*030101, DRB3*030102, DRB3*0302, DRB3*0303, DRB4*01010101, DRB4*0102, DRB4*01030101, DRB4*01030102N, DRB4*010302, DRB4*010303, DRB4*010304, DRB4*0104, DRB4*0105, DRB4*0106, DRB4*0107, DRB4*0201N, DRB4*0301N, DRB5*010101, DRB5*010102, DRB5*0102, DRB5*0103, DRB5*0104, DRB5*0105, DRB5*0106, DRB5*0107, DRB5*0108N, DRB5*0109, DRB5*0110N, DRB5*0111, DRB5*0112, DRB5*0113, DRB5*0202, DRB5*0203, DRB5*0204, DRB5*0205, DRB6*0101, DRB6*0201, DRB6*0202, DRB7*010101, DRB7*010102, DRB8*0101, DRB9*0101.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
[0101] DQA1*010101, DQA1*010102, DQA1*010201, DQA1*010202, DQA1*0103, DQA1*010401, DQA1*010402, DQA1*0105, DQA1*0106, DQA1*0107, DQA1*0201, DQA1*030101 , DQA1*0302, DQA1*0303, DQA1*040101, DQA1*040102, DQA1*0402, DQA1*0403N, DQA1*0404, DQA1*050101, DQA1*050102, DQA1*0502, DQA1*0503, DQA1*0504, DQA1*0505, DQA1*060101, DQA1*060102, DQA1*0602.
HLA-DQB1
[0102] DQB1*020101, DQB1*020102, DQB1*0202, DQB1*0203, DQB1*030101, DQB1*030102, DQB1*030201,
DQB1*030202, DQB1*030302, DQB1*030303, DQB1*0304, DQB1*030501 , DQB1*030502, DQB1*030503, DQB1*0306, DQB1*0307, DQB1*0308, DQB1*0309, DQB1*0310, DQB1*0311, DQB1*0312, DQB1*0313,
DQB1*0401, DQB1*0402, DQB1*050101, DQB1*050102, DQB1*050201, DQB1*050202, DQB1*050301,
DQB1*050302, DQB1*0504, DQB1*060101, DQB1*060102, DQB1*060103, DQB1*0602, DQB1*0603,
DQB1*060401 , DQB1*060402, DQB1*060501, DQB1*060502, DQB1*0606, DQB1*0607, DQB1*0608, DQB1*0609, DQB1*0610, DQB1*061101, DQB1*061102, DQB1*0612, DQB1*0613, DQB1*0614, DQB1*0615, DQB1*0616, DQB1*0617, DQB1*0618, DQB1*0619, DQB1*0620, DQB1*0621, DQB1*0622, DQB1*0623.
HLA-DPA1
[0103] DPA1*010301, DPA1*010302, DPA1*010303, DPA1*0104, DPA1*0105, DPA1*0106, DPA1*0107,
DPA1*0108, DPA1*020101, DPA1*020102, DPA1*020103, DPA1*020104 , DPA1*020105, DPA1*020106, DPA1*020201, DPA1*020202, DPA1*020203, DPA1*0203, DPA1*0301, DPA1*0302, DPA1*0303, DPA1*0401.
HLA-DPB1
[0104] DPB1*010101, DPB1*010102, DPB1*010103, DPB1*0102, DPB1*020102, DPB1*020103, DPB1*020104, DPB1*020105, DPB1*020106, DPB1*0202, DPB1*0203, DPB1*030101 , DPB1*030102, DPB1*0302, DPB1*040101, DPB1*040102, DPB1*0402, DPB1*0501, DPB1*0601, DPB1*0801, DPB1*0901, DPB1*1001, DPB1*110101, DPB1*110102, DPB1*1301, DPB1*1401, DPB1*1501, DPB1*1601, DPB1*1701, DPB1*1801, DPB1*1901, DPB1*200101, DPB1*200102, DPB1*2101, DPB1*2201, DPB1*2301, DPB1*2401 , DPB1*2501, DPB1*260101, DPB1*260102, DPB1*2701, DPB1*2801, DPB1*2901, DPB1*3001, DPB1*3101, DPB1*3201, DPB1*3301, DPB1*3401, DPB1*3501, DPB1*3601, DPB1*3701, DPB1*3801, DPB1*3901, DPB1*4001, DPB1*4101, DPB1*4401, DPB1*4501, DPB1*4601, DPB1*4701, DPB1*4801, DPB1*4901, DPB1*5001 , DPB1*5101, DPB1*5201,
DPB1*5301, DPB1*5401, DPB1*5501, DPB1*5601, DPB1*5701, DPB1*5801, DPB1*5901, DPB1*6001,
DPB1*6101N, DPB1*6201, DPB1*6301, DPB1*6401N, DPB1*6501, DPB1*6601, DPB1*6701, DPB1*6801, DPB1*6901, DPB1*7001, DPB1*7101, DPB1*7201, DPB1*7301, DPB1*7401, DPB1*7501 , DPB1*7601,
DPB1*7701, DPB1*7801, DPB1*7901, DPB1*8001, DPB1*8101, DPB1*8201, DPB1*8301, DPB1*8401, DPB1*8501, DPB1*8601, DPB1*8701, DPB1*8801, DPB1*8901, DPB1*9001, DPB1*9101, DPB1*9201, DPB1*9301, DPB1*9401, DPB1*9501, DPB1*9601, DPB1*9701, DPB1*9801, DPB1*9901.
HLA-DMA
[0105] DMA*0101, DMA*0102, DMA*0103, DMA*0104. HLA-DMB
[0106] DMB*0101, DMB*0102, DMB*0103, DMB*0104, DMB*0105, DMB*0106. HLA-DOA
[0107] DOA*010101, DOA*01010201, DOA*01010202, DOA*01010203, DOA*010103, DOA*01010401,
DOA*01010402, DOA*010105.
HLA-DOB
[0108] DOB*01010101, DOB*01010102, DOB*010102, DOB*010201, DOB*010202, DOB*0103, DOB*01040101, DOB*01040102.
MHC Clase I
[0109] H-2Db, H-2Dd, H-2Dk, H-2Dq, H-2Kb, H-2Kd, H-2Kk, H-2Ld, H-2M3, H-2Ad, H-2Ag7, H-2Ak, H2-Ab, H-2Ed, H-2Ek, H-2Bxk, H-2F, H-2I, H-2P, H-2R, H-2S, H-2Sxd, H-2T4, H-2U.
MHC Clase II
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
[0110] I-Ab, I-Ad, I-Ag7, I-Ak, I-Ap, I-Aq, I-Ar, I-As, I-Au, I-Av, I-Ea, I-Eb , I-Ed, I-Ek, I-Es, I-Eu, H-2Q, H-2Qa-2, H- 2Qa-2a, Qa-1a, Qa-1b.
[0111] La invención no se limita a tales moléculas de MHC y HLA, y se puede adaptar a tales moléculas recién descubiertas, si se desea, simplemente mediante el establecimiento de la reactividad de las sustancias tales como péptidos con las moléculas. Esto se puede lograr fácilmente utilizando técnicas conocidas que son estándar en el campo. Los alelos de HLA particularmente preferidos para usar con la presente invención incluyen los siguientes:
HLA Clase I
HLA A HLA B HLA Cw
A*6802
B*5801 Cw*1701
A*6801
B*5701 Cw*1601
A*66Q1
B*5501 Cw*15Q2
A*3303
B*5201 Cw*1402
A*3301
B*5101 Cw*1203
A*3201
B*5001 Cw*0802
A*310102
B*4901 Cw*0801
A*3002
B*4501 Cw*0704
A*3001
B*4403 Cw*0703
A*2902
B*4402 Cw*0702
A*2608
B*4101 Cw*0701
A*26Q1
B*4002 Cw*06Q2
A*2501
B*4001 Cw*0501
A*2402
B*3901 Cw*0401
A*2301
B*3801 Cw*03Q4
A*1101
B*3701 Cw*0303
A*0302
B*3503 Cw*0202
A*Q3Q1
B*3501 Cw*0102
A*0205
B*2705
A*0201
B*1801
A*Q1Q1
B*1501
B*1402
B*1401
B*1302
B*0801
B*0705
B*0702
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
HLADPB HLADQA HLA DQB HLADRB DPB1*1701 DQA1*05Q5 DQBT0604 DRB1*1601
DPB1*1301
DQA1*0501
DPB1*1001
DQA1*0401
DPB1*0601
DQA1*0303
DPB1*0501
DQA1*0302
DPB1*0402
DQA1*0301
DPB1*0401
DQA1*0201
DPB1*0301
DQA1*0104
DPB1*0201
DQA1*0103
DPB1‘0101
DQA1*0102 DQA1*0101
DQB1*0603
DRB1*1501
DQB 1*0602
DRB1*1401
DQB1*0503
DRB1*1302
DQB1*0502
DRB1*1301
DQB 1*0501
DRB1*1201
DQB 1*0402
DRB1*1104
DQB1*0303
DRB1*1101
DQB 1*0302
DRB1*0801
DQB 1*0301
DRB1*0701
DQB1*0202
DRB1*0404
DQB1*0201
DRB1*0401
DRB1*0301
DRB1*0103
DRB1*0102
DRB1*0101
[0112] Los alelos más preferidos según la invención son los siguientes:
HLA-A*0201, HLA-A*0206, HLA-A*0301, HLA-A*1101, HLA-A*2402, HLA-A*3401 , HLA-B*0702, HLA-B*0801, HLA-B*1301, HLA-B*27, HLA-B*4002, HLA-B*5101, HLA-Cw*03, HLA-Cw*07
HLA-DRB1*0301, HLA-DRB1*0401, HLA-DRB1*0701, HLA-DRB1*1501, HLA-DRB1*1104, HLA-DRB1*1101, HLA-DRB4*0101
HLA-DQA1*01, HLA-DQA1*02, HLA-DQA1*05 HLA-DQB1*03, HLA-DQB1*04, HLA-DQB1*05, HLA-DQB1*06 HLA-DPA1*01, HLA-DPA1*02 HLA-DPB1*02, HLA-DPB1*04
[0113] Las realizaciones de la invención incluyen:
1. Una composición polipeptídica que comprende uno o más polipéptidos, polipéptidos que son inmunogénicos en un vertebrado de manera que causan que el vertebrado produzca células del sistema inmunitario capaces de reconocer al menos un epítopo de una proteína de saliva artrópoda fracción, en la que la fracción de proteína de saliva de artrópodo tiene una masa de <20 kDa, y en la que el polipéptido se selecciona independientemente de:
(a) las secuencias polipeptídicas de las SEQ ID 1-28, 33-39, 44 o sub-secuencias de estas secuencias, las subsecuencias que tienen 7 aminoácidos o más:
SEQ ID 1 SEQ ID 2 SEQ ID 3 SEQ ID 4 SEQ ID 5 SEQ ID 6 SEQ ID 7 SEQ ID 8 SEQ ID 9 SEQ ID 10 SEQ ID 11 SEQ ID 12
HLTLFTVAVLLLAAAALLLLLPPAYSTTLTPP
PLSYCHLFLTHTLARALSFSRSDCL
KNVFFALLLVVLVCCLVSVQGNEI
KLLVLLICLFFYHTHCTTAYLWLAMGV
FLKGSFPRFQMCVMLIGFFSSAKCL
NDYQALLGLCCPWIDLAAADLPMRRHAKA
FYSVGKLVKVLLVMAVCCLLLCTAPTGADPL
MKFAFAFVLIALFAVFAVSQALPQPEQAAA
DGASAITKIVLELTPEQAAAV
TLFIFLVCCQIPLFGIMSSDSADPFYWIRVILA
GRVMCLLRLMSTLLWLSIVGK
LYSGYRLLVLLVMTVCCLLLFIAPTGADPLPGQTQRTL
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
SEQ ID 13 SEQ ID 14 SEQ ID 15 SEQ ID 16 SEQ ID 17 SEQ ID 18 SEQ ID 19 SEQ ID 20 SEQ ID 21 SEQ ID 22 SEQ ID 23 SEQ ID 24 SEQ ID 25 SEQ ID 26 SEQ ID 27 SEQ ID 28 SEQ ID 29 SEQ ID 30 SEQ ID 31 SEQ ID 32 SEQ ID 33 SEQ ID 34 SEQ ID 35 SEQ ID 36 SEQ ID 37 SEQ ID 38 SEQ ID 39 SEQ ID 40 SEQ ID 41 SEQ ID 42 SEQ ID 43 SEQ ID 44
MYCVIKGKTGGYCNSEGLCTCRAEDLHFLLKPIINKD
AEDPRTELIGCGSVLFHLAANRLSLQLEEFAVCKR
ALIGLLLCSVQSVTAN D PVDALGACSGNLFG LLMTRL
SKLFVLAFLCLALWWQSAPQYARGDVPT
SMLVAFATLSVALWWAIPANFNYGGGGGYFINGTGQ
IYEKLPAYLSEVSARVNVLQVSLQHDLPNLQ
EMKLAKV ALVTISLWFMA WTP YLVINFTGI
LLPAKVIPDKTAAYVAYGGQETLVEHVEVLV
FYTCFLGTSSLAGFKNAVDYDELLKAG
VLEVLGFVEDNGELVFQELLGVLKMVDPDGD
KLTPTVVVVLLCLTFVADALTIQELRAQIAQQRIQQRYGVTVATT
SLSDYGLIELKEHCLECCQKDTEADSKLKVYPAAVLEV
TYICFILHGVSEIIPQQQKKTMKFLLLVASVLCLVLI
RYFVVIALICPLIIVETLAV
LLLYLDAADLRRALHQYQLLAAQGDRHLPQQIVKFV
VLLTPALQAYIM DE H NLN RSNIALGP J RPYPS AVKMP
VLKGETHKALKLKDGGHYLVEFKSIYM
VLHSMLVNASLAEMVKESYQTHGADGRMWRMLKFVRLLP
RVRALRALLETLLQHQGEQNNDVYLÍRLAHET
ELQQALSSLNAGSGSCAEVFNAYLPVHNKYIGVSRKI
KFYRLISTLLVVVVIAPRHQCSPFFFQYNRPYL
NYVPDVSALEQDIIEVDPETKEMLKHLDFNNIVVQL
QYSMECLEAAEPKYLDGLKTLADETAQC
EYAQVTKMLGNGRLEAMCFDGVKRLCHIRGKL
KL FLTLLSTLSVAM VFALPAH H HS RG
ELEEARLVAEELEERQQELDYLKRYLVGRLQAV
SYFLTVCLLALVQSETVQD
AMTNANLVG LTISLAYAIFFLLYTP PTGRSS
SFAWLLYGIILRSNFLWQNLMALALSAVQLSLFII
AFPFISGFLSCFMWLKYGVLTEESTLILVNFIGSAL
GLLCCCLAVLFFASPLTMLAHVIR
LLLAMVLLPLLLLESVVPYAAAEKVW
(b) las secuencias definidas por los siguientes residuos de aminoácidos de una proteína de saliva de artrópodo, o sub-secuencias de estas secuencias, las sub-secuencias que tienen 7 aminoácidos o más:
residuos 2-33 de >gi|18389913|gb|AAL68793.1|AF457563_1 proteína hipotética 16 [Anopheles gambiae]
residuos 2-26 de >gi|18389909|gb|AAL68791.1 |AF457561_1 proteína hipotética 14 [Anopheles gambiae]
residuos 2 -25 de >gi|18389907|gb|AAL68790.1|AF457560_1 proteína hipotética 13 [Anopheles gambiae]
residuos 10-36 de >gi|18389903|gb|AAL68788.1|AF457558_1 proteína hipotética 11 [Anopheles gambiae]
residuos 2-26 de >gi|62546227|gb|AAX86005.1|precursor de hyp3.5 [Anopheles gambiae]
residuos 14-42 de gi|18389899|gb|AAL68786.1 |Af457556_1 glándula salival proteína tipo 7 [Anopheles gambiae]
residuos 3-33 de >gi|18389911|gb|AAL68792.1|AF457562_1 proteína hipotética 15 [Anopheles gambiae]
residuos 1-30 de >gi|62546225|gb|AAX86004.1|precursor de hyp6.3 [Anopheles gambiae]
residuos 34-54 de >gi|62546225|gb|AAX86004.1|precursor de hyp6.3 [Anopheles gambiae]
residuos 38-70 de >gi|17026153|emb|CAD12038.1|proteína Sec61 [Anopheles gambiae]
residuos 2-23 de >gi|62546223|gb|AAX86003.11 precursor de hyp6.2 [Anopheles gambiae]
residuos 17-54 de >gi|18389915|gb|AAL68794.1 |Af457564_1 proteína hipotética 17 [Anopheles gambiae]
residuos 57-93 de >gi|87080391 |gb|ABD18596.1 defensina [Anopheles gambiae]
residuos 22-57 de >gil 18389901|gb|AAL68787.1|AF457557_1 proteína hipotética 10 [Anopheles gambiae]
residuos 7-43 de >gi|18389905|gb|AAL68789.1|AF457559_1 proteína hipotética 12 [Anopheles gambiae]
residuos 3-32 de >gi|4127344|emb|CAA76832.1|proteína cE5 [Anopheles gambiae]
residuos 3-40 de >gi|4210617|emb|CAA10259.1|proteína SG2 [Anopheles gambiae]
residuos 91-121 de >gi|4127309|emb|CAA76820.1|proteína hipotética [Anopheles gambiae]
residuos 65-94 de >gi|4375824|emb|CAA76825.1|opsina [Anopheles gambiae]
residuos 41-71 de >gi|62546233|gb|AAX86008.1|desconocido [Anopheles gambiae]
residuos 117-143 de >gi|3378531|emb|CAA03872.1|proteína D7r2 [Anopheles gambiae]
residuos 63-93 de >gij3378529|emb|CAA03871.1|proteína D7r3 [Anopheles gambiae]
residuos 23-67 de >gi|18389893|gb|AAL68783.1 |Af457553_1 proteína de mucina [Anopheles gambiae]
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residuos 43-80 de >gi|18389881|gb|AAL68777.1|AF457547_1 selenoproteína [Anopheles gambiae] residuos 6-42 de >gi|18389879|gb|AAL68776.1|AF457546_1 proteína de 30 kDa [Anopheles gambiae] residuos 4-23 de >gi|18378603|gb|AAL68639.1|AF458073_1 proteína relacionada con D7 5 [Anopheles gambiae] residuos 20-55 de >gi|18389897|gb|AAL68785.1|AF457555_1 glándula salival tipo 1 4 proteína [Anopheles gambiae]
residuos 59-95 de >gi|18389883|gb|AAL68778.1|AF457548 1 antígeno relacionado 5 proteína 1 [Anopheles gambiae]
residuos 1-37 de >emb|CAC35527.1|proteína gSG9 [Anopheles gambiae] residuos 81-120 de> sp|Q9U9L1|RSl 7_AN0GA 40S proteína ribosomal S17 residuos 111 a 142 de >emb|CAC35523.11 proteína gSG7 [Anopheles gambiae]
residuos 32-67 de> gb|AAD47075.1|AF164151_1 factor de iniciación de traducción 4C (1A) [Anopheles gambiae]
residuos 1-29 de >emb|CAC35519.1|proteína tipo gSG2 [Anopheles gambiae]
residuos 106-142 de >emb|CAC35451.1|proteína hipotética [Anopheles gambiae]
residuos 6-28 de >emb|CAC35524.1|proteína D7r4 [Anopheles gambiae]
residuos 5-34 de >emb|CAC35522.11 proteína gSG6 [Anopheles gambiae]
(c) o de secuencias polipeptídicas que tienen 85% de homología o más con una o más de las secuencias en (a) o (b) y que están contenidas en una o más de las siguientes bases de datos: GenBank, Protein Data Bank (PDB), SwissProt, Protein Information Resource (PIR), Protein Research Foundation (PRF), o las traducciones de CDS de estos.
2. Una composición polipeptídica según la realización 1, cuya composición comprende además una o más secuencias seleccionadas independientemente de:
(a) secuencias polipeptídicas de SEQ ID 29-32 o 40-43 o sub-secuencias de estas secuencias, teniendo las subsecuencias 7 aminoácidos o más:
SEQ ID 29 SEQ ID 30 SEQ ID 31 SEQ ID 32 SEQ ID 40 SEQ ID 41 SEQ ID 42 SEQ ID 43
VLKGETHKALKLKDGGHYLVEFKSIYM
VLHSMLVNASLAEMVKESYQTHGADGRMWRMLKFVRLLP
RVRALRALLETLLQHQGEQNNDVYLIRLAHET
ELQQALSSLNAGSGSCAEVFNAYLPVHNKYIGVSRKI
AMTNANLVGLTISLAYAIFFLLYTPPTGRSS
S FAWLLYG11LRSNFLWQN LMALALSAVQLSLFII
AFPFISGFLSCFMWLKYGVLTEESTLILVNFIGSAL
GLLCCCLAVLFFASPLTMLAHVIR
(b) las secuencias definidas por los siguientes residuos de aminoácidos de una proteína de saliva de artrópodo, o sub-secuencias de estas secuencias, teniendo las sub-secuencias 7 aminoácidos o más:
residuos 158-184 de >gi:83016748:dbj:BAE53441.1: residuos DsRed [constructo sintético]
residuos 37-76 de >gi:18389895:gb:AAL68784.1:AF457554_1 glandula salival tipo 1 proteina 3 [Anopheles gambiae]
residuos 191-222 de >gi:18389895:gb:AAL68784.1:AF457554_1 glándula salival tipo 1 proteína 3 [Anopheles gambiae]
residuos 113-149 de >gi:18389891:gb:AAL68782.1¡A454552_1 proteína D7 de forma larga [Anopheles gambiae] residuos 70-104 de >ref¡XP_001230998.1¡ ENSANGP00000014906 [Anopheles gambiae str. PEST] residuos 174-213 de >ref¡XP_316361.2¡ ENSANGP00000012984 [Anopheles gambiae str. PEST] residuos 41-80 de >ref¡XP_314140.3¡ ENSANGP00000015780 [Anopheles gambiae str. PEST] residuos 126-153 de >ref¡XP_314140.3¡ ENSANGP00000015780 [Anopheles gambiae str. PEST]
(c) y de secuencias polipeptídicas que tienen 85% de homología o más con una o más de las secuencias en (a) o (b) y que están contenidas en una o más de las siguientes bases de datos: GenBank, Protein Data Bank (PDB), SwissProt, Protein Information Resource (PIR), Protein Research Foundation (PRF), o las traducciones de CDS de estos.
3. Una composición polipeptídica según la realización 1 o la realización 2, cuya composición comprende de 2 a 12 polipéptidos, o más preferiblemente de 2-6 polipéptidos, y/o en el que uno o más polipéptidos son epítopos de linfocitos T citotóxicos (CTL), y/o el uno o más polipéptidos son epítopos de linfocitos T cooperadores (Th), y/o uno o más polipéptidos son epítopes de linfocitos B,
y/o en el que uno o más polipéptidos son inmunogénicos frente a una pluralidad de proteínas salivales de artrópodo.
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y/o en el que la composición comprende 2, 3, 4, 5, 6 o más epítopos,
y/o en la que la fracción de proteína de saliva de artrópodo es una fracción de proteína de saliva de mosquito de cualquier especie de mosquito, preferiblemente de Anopheles gambiae,
y/o en el que la composición comprende además una o más secuencias adicionales de una proteína salivar de artrópodo, y/o en la que la subsecuencia comprende 8, 9, 10 u 11 aminoácidos o más,
y/o en la que cada polipéptido no comprende más de 100 aminoácidos, preferiblemente de 15-75 residuos de aminoácidos, y más preferiblemente de 17-55 residuos de aminoácidos,
y/o en el que la composición consiste sustancialmente en dos o más polipéptidos que tienen una secuencia de las secuencias SEQ ID 1-44,
y/o en la que están todos los polipéptidos que tienen secuencias de SEQ ID 1-6, y/o en los que los polipéptidos tienen las secuencias de SEQ ID 20, 28, 30-32 y 35 están todas presentes.
4. Una composición polipeptídica, como se define en cualquiera de las formas de realización 1 a 3 para uso en medicina, y/o para uso veterinario.
5. Un método para producir una composición polipeptídica como se define en cualquiera de las realizaciones 1-4, cuyo método comprende mezclar o combinar uno o más polipéptidos como se define en cualquiera de las realizaciones 1-4 con uno o más polipéptidos adicionales como se define en cualquiera de las realizaciones 1-4, y/o con uno o más componentes adicionales, tales como un vehículo, un excipiente, un adyuvante, un tampón o un estabilizador.
6. Una construcción polipeptídica, construcción que comprende una composición polipeptídica como se define en cualquiera de las realizaciones 1-4 y un vehículo.
7. Un método para producir una construcción polipeptídica como se define en la realización 6, cuyo método comprende unir, combinar o mezclar una composición polipeptídica como se define en cualquiera de las realizaciones 1-4 con el vehículo.
8. Una construcción polipeptídica o un método de acuerdo con la realización 6 o la realización 7, en donde el vehículo comprende un adyuvante y/o un excipiente.
9. Una construcción de ácido nucleico que comprende uno o más ácidos nucleicos que comprende la secuencia codificante de uno o más polipéptidos en la composición polipeptídica como se define en cualquiera de las realizaciones 1-4, preferiblemente en la que la construcción de ácido nucleico es una construcción de ADN o ARN.
10. Una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la realización 9, que comprende un plásmido o un virus recombinante.
11. Una composición de medicamento o vacuna contra una enfermedad transmitida por artrópodos, que comprende una composición polipeptídica, una construcción polipeptídica o una construcción de ácido nucleico como se define en cualquiera de las realizaciones 1-4, 6 y 8-10 y opcionalmente un excipiente y/o adyuvante apropiado.
12. Un método para producir un medicamento o composición de vacuna como se define en la realización 11, cuyo método comprende unir, combinar o mezclar una composición polipeptídica, una construcción polipeptídica y/o una construcción de ácido nucleico, como se define en cualquiera de las realizaciones 1-4, 6 y 8-10 con un excipiente y/o adyuvante apropiado.
13. Uso de una composición polipeptídica, una construcción polipeptídica, una construcción de ácido nucleico o una composición de medicamento o vacuna como se define en cualquiera de las realizaciones 1-4, 6 y 8-10 en la fabricación de un medicamento o vacuna, efectiva en el tratamiento o prevención de una enfermedad transmitida por artrópodos; preferiblemente en donde la enfermedad transmitida por artrópodos es una enfermedad en un vertebrado, preferiblemente, en donde el vertebrado se selecciona de un mamífero, un pájaro, un reptil y un pez, y preferiblemente de un ser humano, un animal doméstico o un animal de granja, un bovino animal o aves de corral.
14. Una composición polipeptídica, construcción polipeptídica, construcción de ácido nucleico, método, medicamento, vacuna o uso de acuerdo con cualquier realización anterior, en donde el artrópodo es un artrópodo hematófago, preferiblemente, en donde el artrópodo hematófago se selecciona de mosquitos, garrapatas, moscas de arena, ácaros, y pulgas, más preferiblemente en donde el artrópodo se selecciona de Anopheles sp., Aedes sp., Culex sp., Mansonia sp., Chrysops sp., Simulium sp., Triatoma sp., Rhodnius sp., Panstrongylus sp., Glossina sp., Tabanus sp., Phlebotomus sp., Lutzomyia sp., Pediculus sp., Ornitodoros sp., Ixodes sp., Pediculus sp., Pulex sp., Hemagogous spegazzani., Ochlerotatus sp., Y Coquillettidia sp.
15. Un medicamento, composición de vacuna, método o uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 12-14, en donde la enfermedad transmitida por artrópodos es una enfermedad seleccionada de malaria, filariasis, tripanosomiasis, leishmaniasis, oncocercosis, dengue, enfermedad de Lyme, tularemia, fiebre recurrente, tifus, peste, fiebre amarilla, fiebre del valle del rift y encefalitis, como la encefalitis de San Luis, la fiebre del Nilo occidental, la encefalitis equina del este, la encefalitis de La Crosse y la encefalitis equina del este.
[0114] La invención se describirá ahora a modo de ejemplo solamente, con referencia a las siguientes realizaciones específicas.
EJEMPLOS
Preparación de fracciones de proteínas de saliva de artrópodos
[0115] Para determinar el efecto de las secuencias específicas de la invención, su inmunogenicidad se puede ensayar frente a diversas fracciones de proteína de saliva de artrópodo. Aquellas secuencias que hacen que un vertebrado produzca células del sistema inmunitario que reconocen al menos un epítopo en fracciones proteicas de
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saliva específicas son útiles en las vacunas de la presente invención.
[0116] Las fracciones de proteína de saliva pueden aislarse fácilmente usando técnicas de laboratorio estándar, que son bien conocidas por la persona experta. Se puede usar cualquier fracción de proteína de saliva de artrópodo, ya que los inventores han determinado que es la masa de la fracción de proteína lo que es importante. Las fracciones de masa 40 kDa o menos, 30 kDa o menos, preferiblemente de 20 a 40 kDa, y más preferiblemente 20 kDa o menos, son particularmente útiles.
[0117] Se proporciona el siguiente protocolo para ejemplificar la fracción de proteína contra la que secuencias candidatas se pueden ensayar. Utiliza la saliva de los mosquitos Anopheles gambiae, aunque se puede emplear cualquier saliva artrópoda.
[0118] Pares de glándulas salivales Anopheles gambiae (PEC) se diseccionaron a partir de colonias de mosquitos hembra. Se recogieron quince SGP en 20 pl de PBS y se lisaron añadiendo 5 pl de tampón de muestra SDS-PAGE 5x que contenía 0,25% de 2-p-ME. Después de agitar en vórtice y ebullición durante 5 minutos, la mezcla de proteínas se cargó en un gel Novex 4-20% en gradiente de Tris-Glicina (INVITRO-GEN). El gel se tiñó con plata y se fotografió (véase Figura 9).
[0119] Las flechas discontinuas indican la posición de los puntos de corte para la selección de las fracciones del PPD que pueden ser utilizadas para la inmunización y el estudio (es decir, <20 kDa, 20-40 kDa, 40-80 kDa y> 80 kDa). La flecha sólida indica la posición del punto de corte para la selección de fracciones SGP de <30 kDa y> 30 kDa.
Identificar muestras de proteínas candidatas de la saliva de mosquito
[0120] Tomando un enfoque similar al protocolo ejemplar descrito anteriormente, se prepararon varias muestras de proteína de saliva para el estudio.
[0121] Las glándulas salivales (SG) fueron disecadas de mosquitos hembra Anopheles gambiae y se almacenaron en PBS a -70°C hasta su uso.
[0122] Para el análisis en gel, los GS se lisaron mediante congelación-descongelación, se añadió el tampón de muestra Novex® IEF pH 3-10 (Invitrogen) y el material resultante se analizó en un gel Novex® IEF (Invitrogen). El gel se fijó luego con TCA al 12%, se lavó tres veces en agua y se tiñó con Comassie Blue. El gel resultante se muestra en la Figura 1.
[0123] Después de teñir y decolorar, el gel de IEF se incubó en etanol al 20% durante 10 minutos y se cortó la tira de gel que contenía el carril con las proteínas SG. Esta tira de gel se equilibró durante 5 min en tampón de muestra SDS-PAGE 2x que contenía etanol al 20%, se enjuagó dos veces en tampón de muestra SDS-PAGE y se cargó en el único pocillo de un gel Novex® 4-20% Tris-Glicina (Invitrogen). El gel resultante se muestra en la Figura 2.
[0124] El gel que contiene las proteínas SG separadas fue finalmente teñido usando el kit de mancha Proteosilver (Sigma) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
[0125] A partir del gel, se identificaron cuatro grupos de proteínas (compuestos designados 1, 2, 3 y 4) para el análisis:
Compuesto 1 Fracción de proteína de glándula salival <20 kDa Compuesto 2 Fracción de proteína de glándula salival 20 kDa <X <40 kDa Compuesto 3 Fracción de proteína de glándula salival 40 kDa <X< 80 kDa Compuesto 4 Fracción de proteína de la glándula salival> 80 kDa
EXPERIMENTO 1
[0126] Objetivos:
(A) Establecer la eficacia de los candidatos para proteger a los animales frente a la picadura de mosquitos infectados (es decir, Anopheles gambiae infectado por Plasmodium yoelii nigeriensis)
(B) Establecer un nivel de reactividad cruzada de la respuesta antimosquitos inducida por candidatos en diferentes especies de mosquitos (por ejemplo, Anopheles gambiae y Anopheles stephensi).
(C) Establecer la eficacia de los candidatos en la prevención de la infección de mosquitos (Anopheles gambiae y Anopheles stephensi) por Plasmodium yoelii nigeriensis después de morder ratones inmunizados e infectados.
Compuestos candidatos
[0127] Los compuestos seleccionados fueron los identificados anteriormente:
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Compuesto 1 Fracción de proteína de glándula salival <20 kDa Compuesto 2 Fracción de proteína de glándula salival 20 kDa < X <40 kDa Compuesto 3 Fracción de proteína de glándula salival 40 kDa <X <80 kDa Compuesto 4 Fracción de proteína de la glándula salival > 80 kDa
Cepa y número de animales involucrados:
[0128] Se usan ratones CD1. Hubo cinco grupos experimentales (1, 2, 3, 4 y 5) siendo el grupo 1 el grupo de control negativo y los grupos de 2-5 los grupos de prueba, teniendo cada grupo nueve (9) animales.
Protocolo experimental
[0129] Día 1:4 grupos se inmunizaron (grupos 2, 3, 4 y 5) de 9 ratones CD1 cada uno (N = 4 x 9 = 36) con dosis subcutáneas de compuestos vacunales candidatos (Grupo 2 con compuesto 1, Grupo 3 con el compuesto 2, y así sucesivamente).
[0130] Día 14: Todos los animales se reforzaron con las mismas dosis de compuestos vacunales candidatos a candidatos vacunales (Grupo 2 con compuesto 1, Grupo 3 con compuesto 2, etc.).
[0131] Día 21: Se sangraron todos los animales de prueba. Las muestras se almacenaron congeladas (-20°C) hasta la recolección. Cada grupo se dividió en otros subgrupos: A - 5 animales, B - 4 animales.
Grupo 1A - 5 animales Grupo 2A - 5 animales Grupo 3A - 5 animales Grupo 4A - 5 animales Grupo 5A - 5 animales
Grupo 1B - 4 animales Grupo 2B - 4 animales Grupo 3B - 4 animales Grupo 4B - 4 animales Grupo 5B - 4 animales
Subgrupos A
[0132] Día 28: Todos los animales en los subgrupos A fueron desafiados a través de la picadura de 5-9 mosquitos infectados (es decir, Anopheles gambiae infectado con Plasmodium yoelii nigeriensis ) en el área del vientre. Todos los animales se mantuvieron hasta que se estableció por primera vez la parasitemia o durante un máximo de 6 semanas después de la exposición a los mosquitos infectados. Todos los animales se sacrificaron por exsanguinación y las muestras de suero se almacenaron congeladas (-20°C) hasta la recolección.
Subgrupos B
[0133] Día 28: Todos los animales en los subgrupos B se utilizaron para alimentar (en el área del vientre) la siguiente cantidad de mosquitos frescos (no infectados):
5-10 Anopheles gambiae Y 5-10 Anopheles stephensi
[0134] Todos estos mosquitos fueron ensayados para:
1. Supervivencia durante un período de 8 días.
2. Número de huevos puestos.
3. Número de huevos producidos.
4. Número de adultos (F1) producidos a partir de los huevos puestos.
[0135] Día 32: Todos los animales en los subgrupos B se infectaron con Plasmodium yoelii nigeriensis por inoculación IV directa de parásitos.
[0136] Día 32: Una vez que se identificó la infección activa de malaria en todos (o al menos el 75%) animales en el Grupo B, todos los animales infectados se utilizaron para alimentar (en el área abdominal) números grandes (> 10 por ratón) de tanto Anopheles gambiae fresco COMO Anopheles stephensi fresco.
[0137] Todos estos mosquitos se ensayaron para:
1. Supervivencia durante un período de 8 días.
2. Número de mosquitos con parásitos palúdicos en sus glándulas salivales entre los que sobrevivieron el período de incubación requerido (17 días).
3. Número de huevos puestos.
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4. Número de huevos producidos.
5. Número de adultos (F1) producidos a partir de los huevos puestos.
[0138] Después de la alimentación de mosquitos, todos los animales se sacrificaron por exanguinación y las muestras de suero se almacenaron congeladas (-20°C) hasta la recolección.
[0139] Cualquier volumen del compuesto experimental que quedaba al final del estudio se almacenó congelado (- 20°C) hasta la recolección.
Resultados
[0140] Las representaciones gráficas de los resultados de los experimentos se muestran en las figuras 3A-3I y 4. El primer conjunto de Figuras (Figuras 3x) muestran datos sobre el efecto de la vacuna sobre la fecundidad de los mosquitos, para cada uno de los Grupos 1 -5, de la siguiente manera:
3A: Por ciento que se alimentó 3B: Promedio que no pusieron huevos
3C: Promedio que no se pusieron huevos 3D: Porcentaje de eclosión
3E: Promedio sin larvas 3F: Promedio sin pupas
3G: Porcentaje de pupación 3H: Porcentaje de aparición
3I: Promedio sin adultos
[0141] Los datos numéricos que sustentan cada una de estas representaciones gráficas A-I se establecen respectivamente (columna A para la Figura 3A, etc.) en la Tabla 2 a continuación:
Tabla 2 - Datos para Figuras 3A-3I
Promedio ± Error Est.
A B C D E
Grupo 1
82,7±4 29,6±5 37,5±4,6 20,1±3,9 54,6±4,7
Grupo 2
66,7±6,5 17,1±3,8 12±3 9,7±2,4 51,9±7,4
Grupo 3
81,2±3,4 19,1±4,6 16±3,7 12,9±4 44,3±8,7
Grupo 4
73,7±4,9 24,1±3,9 26,4±3,9 15±2,8 56,6±6,6
Grupo 5
75,7±4,5 30,1±4,1 32,4±5 16,9±2,5 55±4,6
Promedio ± Error Est.
F G H I
Grupo 1
15,6±3 82,9±3 14±2,8 92,4±2,6
Grupo 2
7,8±1,8 86,1±5,7 6,9±1,8 80±7,8
Grupo 3
12,6±3,7 77,7±7,3 12,5±3,6 92±1,8
Grupo 4
12,3±2,1 88,5±3,3 10,8±1,9 88,8±2,4
Grupo 5
14,4±2,2 88,4±2,7 12,1±1,8 84,8±3,7
[0142] Los datos que figuran en las Tablas 3A-3I a continuación muestran los valores p obtenidos usando un análisis estadístico no paramétrico de Mann-Whitney de los datos anteriores.
Tabla 3A - Valores de P para el porcentaje que se alimentó
Compuesto 1 Compuesto 2 Compuesto 3 Compuesto 4
Grupo 1
Grupo 2
0,10504
Grupo 3
0,41727 0,14813
Grupo 4
0,14813 0,26543 0,10504
Grupo 5
0,23235 0,23235 0,26543 0,5
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Compuesto 1 Compuesto 2 Compuesto 3 Compuesto 4
Grupo 1
Grupo 2
4,6E-05
Grupo 3
0,00042 0,1612
Grupo 4
0,04038 0,0032 0,01602
Grupo 5
0,17836 0,0018 0,00551 0,22172
Tabla 3C - Valores de P para la media sin huevos puestos
Compuesto 1 Compuesto 2 Compuesto 3 Compuesto 4
Grupo 1
Grupo 2
0,09451
Grupo 3
0,07626 0,49308
Grupo 4
0,27329 0,09416 0,10891
Grupo 5
0,30616 0,01171 0,00879 0,15145
Tabla 3D - Valores de P para la tasa de sombreado porcentual
Compuesto 1 Compuesto 2 Compuesto 3 Compuesto 4
Grupo 1
Grupo 2
0,46767
Grupo 3
0,19155 0,29445
Grupo 4
0,36699 0,33803 0,14632
Grupo 5
0,40058 0,47907 0,15041 0,40187
Tabla 3E - Valores de P para el promedio sin larvas
Compuesto 1 Compuesto 2 Compuesto 3 Compuesto 4
Grupo 1
Grupo 2
0,04897
Grupo 3
0,07371 0,45038
Grupo 4
0,29801 0,06197 0,11695
Grupo 5
0,4499 0,0164 0,06524 0,23691
Tabla 3F - Valores de P para la media sin pupas
Compuesto 1 Compuesto 2 Compuesto 3 Compuesto 4
Grupo 1
Grupo 2
0,06224
Grupo 3
0,28662 0,22088
Grupo 4
0,44057 0,04081 0,35186
Grupo 5
0,40546 0,01118 0,17373 0,25066
Tabla 3G - Valores de P para el porcentaje de pupación
Compuesto 1 Compuesto 2 Compuesto 3 Compuesto 4
Grupo 1
Grupo 2
0,11277
Grupo 3
0,3664 0,13511
Grupo 4
0,11848 0,50798 0,07764
Grupo 5
0,10627 0,41971 0,08354 0,37388
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Compuesto 1 Compuesto 2 Compuesto 3 Compuesto 4
Grupo 1
Grupo 2
0,06876
Grupo 3
0,12815 0,25697
Grupo 4
0,059 0,33712 0,2767
Grupo 5
0,02006 0,4853 0,18532 0,2943
Tabla 31 - Valores de P para la media sin adultos
Compuesto 1 Compuesto 2 Compuesto 3 Compuesto 4
Grupo 1
Grupo 2
0,04391
Grupo 3
0,47127 0,06735
Grupo 4
0,3981 0,03908 0,47468
Grupo 5
0,46488 0,0123 0,31328 0,24603
[0143] La Figura 4 muestra el porcentaje de supervivencia de los mosquitos en cada uno de los cinco grupos, durante un período de 8 días. La cantidad de mosquitos en cada grupo en el día cero fue la siguiente:
Grupo 1 (control):
100
Grupo 2:
89
Grupo 3:
100
Grupo 4:
99
Grupo 5:
98
[0144] Los datos relevantes para la representación gráfica de la Figura 4 se establecen en la Tabla 4 a continuación:
Promedio ± Error Est.
Día 0 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4
Grupo 1
100±0 86±4,2 77±5 73±5,2 61±4,6
Grupo 2
100±0 53,4±5,5 40,4±5,3 36,4±4,9 28±5,2
Grupo 3
100±0 67±4,5 51±4,7 44±4,9 36±4,4
Grupo 4
100±0 78±5,1 62±5,7 60±5,6 51±4,9
Grupo 5
100±0 73±5,6 53,4±6,7 48,4±6,3 41,4±5,6
Promedio ± Error Est.
Día 5 Día 6 Día 7 Día 8
Grupo 1
58±4,8 56±4,4 53±4,5 53±4,5
Grupo 2
23,7±5 21,4±4,8 20±4,8 20±4,8
Grupo 3
30±4,1 28±3,7 28±3,7 28±3,7
Grupo 4
46±5 46±5 43±5,2 43±5,2
Grupo 5
36,7±5 33,7±5,3 29,4±5 29,4±5
[0145] Los datos expuestos en la Tabla 5(i)-5(viii) a continuación muestran los valores p obtenidos usando un análisis estadístico Mann-Whitney no paramétrico de los datos anteriores.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Día 1
Compuesto 1 Compuesto 2 Compuesto 3 Compuesto 4
Grupo 1
Grupo 2
2,6E-05
Grupo 3
0,00217 0,0326
Grupo 4
0,13228 0,0007 0,0387
Grupo 5
0,0526 0,0071 0,1588 0,2738
Tabla 5 (ii) - Valores de P para el día 2
Dia 2
Compuesto 1 Compuesto 2 Compuesto 3 Compuesto 4
Grupo 1
Grupo 2
1, 1E-05
Grupo 3
0,0003 0,0676
Grupo 4
0,0274 0,00453 0,06759
Grupo 5
0,0049 0,07833 0,44598 0,166
Tabla 5 (iii) - Valores de P para el día 3
Día 3
Compuesto 1 Compuesto 2 Compuesto 3 Compuesto 4
Grupo 1
Grupo 2
1, 1E-05
Grupo 3
0,0002 0,20756
Grupo 4
0,04955 0,00253 0,0213
Grupo 5
0,00311 0,07692 0,26734 0,10538
Tabla 5 (iv) - Valores de P para el día 4
Día 4
Compuesto 1 Compuesto 2 Compuesto 3 Compuesto 4
Grupo 1
Grupo 2
3,8E-05
Grupo 3
0,00032 0,12615
Grupo 4
0,09515 0,00175 0,01525
Grupo 5
0,0065 0,04759 0,24854 0,09848
Tabla 5 (v) - Valores de P para el día 5
Dia 5
Compuesto 1 Compuesto 2 Compuesto 3 Compuesto 4
Grupo 1
Grupo 2
2,6E-05
Grupo 3
6,9E-05 0,14515
Grupo 4
0,07976 0,00198 0,00944
Grupo 5
0,00393 0,03955 0,14962 0,09848
Tabla 5 (vi) - Valores de P para el día 6
Día 6
Compuesto 1 Compuesto 2 Compuesto 3 Compuesto 4
Grupo 1
Grupo 2
1E-05
Grupo 3
2,3E-05 0,12817
Grupo 4
0,12022 0,00081 0,00393
Grupo 5
0,0034 0,05802 0,22172 0,0558
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Día 7
Compuesto 1 Compuesto 2 Compuesto 3 Compuesto 4
Grupo 1
Grupo 2
2,3E-05
Grupo 3
8,4E-05 0,07147
Grupo 4
0,13648 0,00175 0,01315
Grupo 5
0,00132 0,09032 0,40795 0,03713
Tabla 5 (viii) - Valores de P para el día 8
Día 8
Compuesto 1 Compuesto 2 Compuesto 3 Compuesto 4
Grupo 1
Grupo 2
2,3E-05
Grupo 3
8,4E-05 0,07147
Grupo 4
0,13648 0,00175 0,01315
Grupo 5
0,00132 0,09032 0,40795 0,03713
EXPERIMENTO 2: Inducción de producción de citocina por inmunización con antígenos polipeptídicos Péptidos y proteínas recombinantes
[0146] A partir del experimento 1, la fracción más efectiva se estudió adicionalmente, para identificar polipéptidos para los que se pueden emplear en vacunas. La utilidad de los péptidos de la presente invención se determinó usando el siguiente protocolo.
Vacunas
[0147] Todos los polipéptidos en estudio (preparaciones de antígeno) se sintetizan mediante la química de Fmoc.
[0148] Ratones de seis a diez semanas de edad C57BL/6 se inmunizaron por vía subcutánea con una dosis de 200 |jl de la preparación antigénica por ratón. En el grupo de prueba, cada dosis de la preparación de antígeno contiene una mezcla equimolar de los péptidos (10 nmol cada uno) preparados en adyuvante (Sigma) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En el grupo de control, cada dosis de la preparación de antígeno contiene una dosis equivalente de un polipéptido no relevante preparado en IFA (Sigma) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (preparación de nRp).
[0149] El día 15 después de la inmunización, todos los animales reciben una vacuna de refuerzo usando las mismas dosis y la misma vía de administración que originalmente.
[0150] Finalmente, el día 20 todos los animales son sacrificados y se recogen sus bazos y sueros.
ELISA de atocinas
[0151] Se reúnen bazos de ratón que pertenecen al mismo grupo experimental, se presionan suavemente a través de tamices celulares y células rojas de la sangre eliminadas por tratamiento con tampón de lisis de glóbulos rojos (nueve partes de 0,l6 M NH4Cl y una parte de 0,17 M Tris, pH 7,2). Las suspensiones de esplenocitos de cada grupo experimental se colocan en placas de 96 pocillos por cuadruplicado a una densidad de 4 x 106 células/pocillo en medio IMDM (Invitrogen) suplementado con p-mercaptoetanol 0,02 mM (Sigma), 50 IU/50 mg/ml de penicilina/estreptomicina (Sigma) y 10% FCS (Sigma) y que contiene cada uno de los antígenos polipeptídicos en estudio (2 mM). Después de 3 días de incubación a 37°C, el sobrenadante se recoge y se analiza para detectar IFN- Y e IL-4 mediante un ELISA de citoquina sándwich de acuerdo con el protocolo del fabricante (Pharmingen). Los límites de detección más bajos para el ensayo son 9,77 pg/ml para IL-4 y 39,06 pg/ml para IFN-y.
ELISA específico de IgG2a
[0152] Se recubren placas de 96 pocillos ELISA de microtitulación (Becton-Dickinson) con 2 mM de cada polipéptido experimental en PBS. Después de una noche en la incubación a 4°C, las placas se lavan dos veces en PBST (PBS que contiene 0,05% de Tween 20) y los pocillos se bloquean con BSA al 1% Fracción V en PBST. Después de 1 h de incubación, las placas se lavan tres veces en PBST y se agregan a los pocillos un rango de diluciones de suero de prueba y control en PBST. Después de 2 h de incubación, las placas se lavan seis veces en PBST, y se añaden los sueros primarios de anti-Ig2a de ratón a todos los pocillos. Después de 1 h de incubación, las placas se lavan
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
seis veces en PBST, y se añaden sueros anti-ratón anti-Ig2a de ratón a todos los pocilios. Después de 1 hora de incubación, las placas se lavan siete veces con sustrato PBST y TMB en todos los pocillos. Después de 20-30 minutos de incubación, la reacción se detiene con HCl y se lee la absorbancia a 450 nm.
Análisis estadístico
[0153] Se establecen diferencias estadísticamente significativas en la respuesta de IFN-y a diferentes antígenos entre los grupos de prueba y control a través del análisis no paramétrico de Mann-Whitney de las muestras. Las diferencias se consideran estadísticamente significativas si el valor p está por debajo de 0,05.
EXPERIMENTO 3 - Evaluación de la respuesta inmune a varios polipéptidos:
[0154] Se investigaron los siguientes polipéptidos: SEQ ID 20, SEQ ID 28, SEQ ID 30, SEQ ID 31, SEQ ID 32 y SEQ ID 35. Estos péptidos se mezclaron juntos para formar una vacuna candidata para la prueba (llamada la mezcla de péptido AGS).
[0155] El tipo y nivel de la respuesta inmune inducida por la vacunación con estos péptidos se evaluó de acuerdo con el protocolo que se muestra a continuación:
Día 1: Inmunizar 2 grupos de 4 ratones CD1 cada uno con las siguientes dosis subcutáneas de productos candidatos para vacunas:
• Mezcla de péptido no relevante (NRP) (10 nmol cada uno) + ISA-51
• Mezcla de péptidos AGS (10 nmol cada uno) + ISA-51
Día 15: Impulsar a todos los animales con las mismas dosis de productos vacunales candidatos.
Día 21: Sangrar definitivamente a todos los animales. Cosechar los bazos individualmente y evaluar la reactividad de IFN-gamma a:
• Péptidos AGS individuales (2 pM cada uno)
• Mezcla AGS (0,5 pM y 2 pM cada uno)
• Con A (7,5 pg/ml)
• Blanco
Post-día 21: Ensayar todos los sueros para determinar la reactividad contra los péptidos AGS.
Resultados
[0156] La producción de IFN-gamma después de una estimulación de 96 horas in vitro con los antígenos se indica en el gráfico de la Figura 5.
[0157] Las respuestas de IFN-gamma a SEQ ID 28, SEQ ID 30 y SEQ ID 35 así como a la preparación de la mezcla AGS son estadísticamente significativas (p <0,05).
[0158] La SEQ ID 20, la SEQ ID 31 y la SEQ ID 32 inducen una respuesta más alta en los animales inmunizados con mezcla AGS, pero también parecen ser estimulantes, de una manera no específica, a los esplenocitos de ratones inmunizados con mezcla de NRP.
[0159] La respuesta total de Ig en el suero a los antígenos indicados en el gráfico de la Figura 6. Respuestas totales de Ig con la SEQ ID 20 y SEQ ID 30 son estadísticamente significativas (p <0,05).
EXPERIMENTO 4 - Estudio de desafío después de la inmunización con mezcla de péptidos AGS:
[0160] Para ensayar la capacidad de la preparación de la mezcla AGS para conferir protección contra la infección natural por malaria, los ratones CD1 se inmunizaron y desafiaron de acuerdo con el siguiente protocolo:
Día 0: Sangrado de prueba a todos los animales. Retenga las muestras para un análisis posterior.
Día 1: Inmunizar 2 (dos) grupos de 8 ratones CD1 cada uno con las siguientes dosis subcutáneas de productos candidatos para vacunas:
• Mezcla de péptido no relevante (NRP) (10 nmol cada uno) + ISA-51
• Mezcla de péptidos AGS (10 nmol cada uno) + ISA-51
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Día 7: Sangrado de prueba a todos los animales. Retenga las muestras para un análisis posterior.
Día 14: Impulsar a los animales con las mismas dosis de productos candidatos para vacunas.
Día 21: Sangrado de prueba a todos los animales. Retenga las muestras para un análisis posterior.
Día 28: Todos los animales son desafiados a través de la picadura de 8 mosquitos infectados (es decir, Anopheles gambiae infectado por Plasmodium yoelii nigeriensis) en el área del vientre. Todos los animales se mantienen hasta que se establece la parasitemia o durante un máximo de 6 semanas después de la exposición con mosquitos infectados.
Día 70 (max): Sangrado terminal a todos los animales.
Resultados
[0161] La respuesta total de Ig en los sueros a la mezcla AGS en el día 21 se indica en el gráfico de la Figura 7.
[0162] Un animal en el grupo inmunizado de la mezcla AGS mostró una respuesta de Ig total significativamente menor que los restantes animales en el grupo (<50% de respuesta de Ig total promedio en el grupo de la mezcla AGS).
[0163] El día del desafío, un animal en el grupo inmunizado con mezcla de NRP y dos animales en el grupo inmunizado con mezcla AGS no pudo ser desafiado debido a una escasez de mosquitos infecciosos.
[0164] De los animales que fueron desafiados, aquellos en el grupo inmunizado con la mezcla AGS mostraron una tasa de supervivencia incrementada que aquellos en el grupo inmunizado de control con la mezcla NRP (véase Figura 8). El único animal que murió en el grupo inmunizado de mezcla AGS fue el mismo que no había logrado desarrollar una fuerte respuesta de anticuerpos a la preparación de AGS.
LISTADO DE SECUENCIAS
[0165]
<110> PepTcell Limited
<120> Secuencias y composiciones de péptidos
<130> P40013EPD3
<140> PCT/EP 08/061824 <141> 2008-09-05
<150> GB 0717864.3 <151> 2007-09-13
<160> 134
<170> PatentIn versión 3.1
<210> 1 <211> 32 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> polipéptido inmunogénico <400> 1
His Leu Thr Leu Phe Thr Val Ala Val Leu Leu Leu Ala Ala Ala Ala
15 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Pro Pro Ala Tyr Ser Thr Thr Leu Thr Pro Pro
20 25 30
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 2 <211> 25 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> polipéptido inmunogénico <400> 2
Pro Leu Ser Tyr Cys His Leu Phe Leu Thr His Thr Leu Ala Arg Ala
15 10 15
Leu Ser Phe Ser Arg Ser Asp Cys
20
Leu
25
<210> 3 <211> 24 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> polipéptido inmunogénico <400> 3
Lys Asn Val Phe Phe Ala Leu Leu Leu Val Val Leu Val Cys Cys Leu
15 10 15
Val Ser Val Gln Gly Asn Glu lie
20
<210> 4 <211> 27 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> polipéptido inmunogénico <400> 4
Lys Leu Leu Val Leu Leu lie Cys Leu Phe Phe Tyr His Thr His Cys 1 5 10 15
Thr Thr Ala Tyr Leu Trp Leu Ala Met Gly Val
20 25
<210> 5 <211> 25 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> polipéptido inmunogénico <400> 5
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Phe Leu Lys Gly Ser Phe Pro Arg Phe Gln Met Cys Val Met Leu lie 1 5 10 15
Gly Phe Phe Ser Ser Ala Lys Cys Leu 20 25
<210> 6 <211> 29 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> polipéptido inmunogénico <400> 6
Asn Asp Tyr Gln Ala Leu Leu Gly Leu Cys Cys Pro Trp lie Asp Leu 1 5 10 15
Ala Ala Ala Asp Leu Pro Met Arg Arg His Ala Lys Ala 20 25
<210> 7 <211> 31 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> polipéptido inmunogénico <400> 7
Phe Tyr Ser Val Gly Lys Leu Val Lys Val Leu Leu Val Met Ala Val 1 5 10 15
Cys Cys Leu Leu Leu Cys Thr Ala Pro Thr Gly Ala Asp Pro Leu 20 25 30
<210> 8 <211> 30 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> polipéptido inmunogénico <400> 8
Met Lys Phe Ala Phe Ala Phe Val Leu lie Ala Leu Phe Ala Val Phe 15 10 15
Ala Val Ser Gln Ala Leu Pro Gln Pro Glu Gln Ala Ala Ala 20 25 30
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<211> 21 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> polipéptido inmunogénico <400>9
Asp Gly Ala Ser Ala lie Thr Lys lie Val Leu Glu Leu Thr Pro Glu 1 5 10 15
Gln Ala Ala Ala Val
20
<210> 10 <211> 33 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> polipéptido inmunogénico <400> 10
Thr Leu Phe lie Phe Leu Val Cys Cys Gln lie Pro Leu Phe Gly lie
15 10 15
Met Ser Ser Asp Ser Ala Asp Pro Phe Tyr Trp lie Arg Val lie Leu 20 25 30
Ala
<210> 11 <211> 22 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> polipéptido inmunogénico <400> 11
Gly Arg Val Met Cys Leu Leu Arg Leu Met Ser Thr Leu Leu Val Val 15 10 15
Leu Ser lie Val Gly Lys 20
<210> 12 <211> 38 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> polipéptido inmunogénico
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 12
Leu Tyr Ser Gly Tyr Arg Leu Leu Val Leu Leu Val Met Thr Val Cys 1 5 10 15
Cys Leu Leu Leu Phe lie Ala Pro Thr Gly Ala Asp Pro Leu Pro Gly 20 25 30
Gln Thr Gln Arg Thr Leu
35
<210> 13 <211> 37 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> polipéptido inmunogénico <400> 13
Met Tyr Cys Val lie Lys Gly Lys Thr Gly Gly Tyr Cys Asn Ser Glu 1 5 10 15
Gly Leu Cys Thr Cys Arg Ala Glu Asp Leu His Phe Leu Leu Lys Pro 20 25 30
lie lie Asn Lys Asp
35
<210> 14 <211> 36 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> polipéptido inmunogénico <400> 14
Asn Ala Glu Asp Pro Arg Thr Glu Leu lie Gly Cys Gly Ser Val Leu 15 10 15
Phe His Leu Ala Ala Asn Arg Leu Ser Leu Gln Leu Glu Glu Phe Ala 20 25 30
Val Cys Lys Arg
35
<210> 15 <211> 37 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<223> polipéptido inmunogénico <400> 15
Ala leu lie Gly Leu Leu Leu Cys Ser Val Sin Ser Val Thr Ala Asn 15 10 15
Asp Pro Val Asp Ala Leu Gly Ala Cys Ser Gly Asn Leu Phe Gly Leu 20 25 30
Leu Met Thr Arg Leu
35
<210> 16 <211> 30 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> polipéptido inmunogénico <400> 16
Ser Lys Leu Phe Val Leu Ala Phe Leu Cys Leu Ala Leu Val Val Val 1 5 10 15
Val Gln Ser Ala Pro Gln Tyr Ala Arg Gly Asp Val Pro Thr 20 25 30
<210> 17 <211> 38 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> polipéptido inmunogénico <400> 17
Ser Met Leu Val Ala Phe Ala Thr Leu Ser Val Ala Leu Val Val Val 1 5 10 15
Val Ala lie Pro Ala Asn Phe Asn Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Phe 20 25 30
lie Asn Gly Thr Gly Gln 35
<210> 18 <211> 31 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> polipéptido inmunogénico <400> 18
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
lie Tyr Glu Lys Leu Pro Ala Tyr Leu Ser Glu Val Ser Ala Arg Val 15 10 15
Asn Val Leu Gln Val Ser Leu Gln His Asp Leu Pro Asn Leu Gln 20 25 30
<210> 19 <211> 30 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Polipéptido inmunogénico <400> 19
Glu Met Lys Leu Ala Lys Val Ala Leu Val Thr lie Ser Leu Trp Phe
15 10 15
Met Ala Trp Thr Pro Tyr Leu Val lie Asn Phe Thr Gly lie 20 25 30
<210> 20 <211> 31 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> polipéptido inmunogénico <400> 20
Leu Leu Pro Ala Lys Val lie Pro Asp Lys Thr Ala Ala Tyr Val Ala 1 5 10 15
Tyr Gly Gly Gln Glu Thr Leu Val Glu His Val Glu Val Leu Val
20 25 30
<210> 21 <211> 27 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> polipéptido inmunogénico <400> 21
Phe Tyr Thr Cys Phe Leu Gly Thr Ser Ser Leu Ala Gly Phe Lys Asn 15 10 15
Ala Val Asp Tyr Asp Glu Leu Leu Lys Ala Gly 20 25
<210> 22
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<211> 31 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> polipéptido inmunogénico <400> 22
Val Leu Glu Val Leu Gly Phe Val Glu Asp Asn Gly Glu Leu Val Phe 15 10 15
Gln Glu Leu Leu Gly Val Leu Lys Met Val Asp Pro Asp Gly Asp 20 25 30
<210> 23 <211> 45 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> polipéptido inmunogénico <400> 23

Lys Leu Thr Pro Thr Val Val Val Val Leu Leu Cys Leu Thr Phe Val 1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Thr lie Gln Glu Leu Arg Ala Gln lie Ala Gln Gln

20 25 30
Arg lie

Gln Gln Arg Tyr Gly Val Thr Val Ala Thr Thr 35 40 45
<210> 24 <211> 38 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> polipéptido inmunogénico <400> 24
Ser Leu Ser Asp Tyr Gly Leu lie Glu Leu Lys Glu His Cys Leu Glu 1 5 10 15
Cys Cys Gln Lys Asp Thr Glu Ala Asp Ser Lys Leu Lys Val Tyr Pro 20 25 30
Ala Ala Val Leu Glu Val
35
<210> 25 <211> 37 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<220>
<223> polipéptido inmunogénico <400> 25
Thr Tyr lie Cys Phe lie leu His Gly Val Ser Glu lie lie Pro Gln 1 5 10 15
Gln Gln Lys Lys Thr Met Lys Phe Leu Leu Leu Val Ala Ser Val Leu 20 25 30
Cys Leu Val Leu lie
35
<210> 26 <211> 20 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> polipéptido inmunogénico <400> 26
Arg Tyr Phe Val Val lie Ala Leu lie Cys Pro Leu lie lie Val Glu 15 10 15
Thr Leu Ala Val 20
<210> 27 <211> 36 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> polipéptido inmunogénico <400> 27
Leu Leu Leu Tyr Leu Asp Ala Ala Asp Leu Arg Arg Ala Leu His Gln 1 5 10 15
Tyr Gln Leu Leu Ala Ala Gln Gly Asp Arg His Leu Pro Gln Gln lie 20 25 30
Val Lys Phe Val
35
<210> 28 <211> 37 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> polipéptido inmunogénico
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 28
Val Leu Leu Thr Pro Ala Leu Gln Ala Tyr lie Met Asp Glu His Asn
15 10 15
Leu Asn Arg Ser Asn lie Ala Leu Gly Arg lie Arg Pro Tyr Pro Ser
20 25 30
Ala Val Lys Met Pro 35
<210> 29 <211> 27 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> polipéptido inmunogénico <400> 29
Val Leu Lys Gly Glu Thr His Lys Ala Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly 15 10 15
His Tyr Leu Val Glu Phe Lys Ser lie Tyr Met
20 25
<210> 30 <211> 40 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> polipéptido inmunogénico <400> 30
Val Leu His Ser Met Leu Val Asn Ala Ser Leu Ala Glu Met Val Lys

15 10 15
Glu Ser Tyr Gln Thr His Gly Ala Asp Gly Arg Met Val Val Arg Met

20 25 30

Leu Lys Phe Val Arg Leu Leu Pro 35 40
<210> 31 <211> 32 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> polipéptido inmunogénico
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Arg Val Arg Ala Leu Arg Ala Leu Leu Glu Thr Leu Leu Gln His Gln
15 10 15
Gly Glu Gln Asn Asn Asp Val Tyr Leu lie Arg Leu Ala His Glu Thr 20 25 30
<210> 32 <211> 37 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> polipéptido inmunogénico <400> 32
Glu Leu Gln Gln Ala Leu Ser Ser Leu Asn Ala Gly Ser Gly Ser Cys 1 5 10 15
Ala Glu Val Phe Asn Ala Tyr Leu Pro Val His Asn Lys Tyr lie Gly 20 25 30
Val Ser Arg Lys lie
35
<210> 33 <211> 33 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> polipéptido inmunogénico <400> 33
Lys Phe Tyr Arg Leu lie Ser Thr Leu Leu Val Val Val Val lie Ala 1 5 10 15
Pro Arg His Gln Cys Ser Pro Phe Phe Phe Gln Tyr Asn Arg Pro Tyr 20 25 30
Leu
<210> 34 <211> 36 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> polipéptido inmunogénico <400> 34
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Asn Tyr Val Pro Asp Val Ser Ala Leu Glu Gln Asp lie lie Glu Val 15 10 15
Asp Pro Glu Thr Lys Glu Met Leu Lys His Leu Asp Phe Asn Asn lie 20 25 30
Val Val Gln Leu 35
<210> 35 <211> 28 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> polipéptido inmunogénico <400> 35
Gln Tyr Ser Met Glu Cys Leu Glu Ala Ala Glu Pro Lys Tyr Leu Asp 15 10 15
Gly Leu Lys Thr Leu Ala Asp Glu Thr Ala Gln Cys 20 25
<210> 36 <211> 32 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> polipéptido inmunogénico <400> 36
Glu Tyr Ala Gln Val Thr Lys Met Leu Gly Asn Gly Arg Leu Glu Ala
15 10 15
Met Cys Phe Asp Gly Val Lys Arg Leu Cys His lie Arg Gly Lys Leu 20 25 30
<210> 37 <211> 26 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> polipéptido inmunogénico <400> 37
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Lys Leu Phe Leu Thr Leu Leu Ser Thr Leu Ser Val Ala Met Val Phe 1 5 10 15
Ala Leu Pro Ala His His His Ser Arg Gly
20 25
<210> 38 <211> 33 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> polipéptido inmunogénico <400> 38
Glu Leu Glu Glu Ala Arg Leu Val Ala Glu Glu Leu Glu Glu Arg Gln 1 5 10 15
Gln Glu Leu Asp Tyr Leu Lys Arg Tyr Leu Val Gly Arg Leu Gln Ala 20 25 30
Val
<210> 39 <211> 19 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> polipéptido inmunogénico <400> 39
Ser Tyr Phe Leu Thr Val Cys Leu Leu Ala Leu Val Gln Ser Glu Thr 1 5 10 15
Val Gln Asp
<210> 40 <211> 31 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> polipéptido inmunogénico <400> 40
Ala Met Thr Asn Ala Asn Leu Val Gly Leu Thr lie Ser Leu Ala Tyr
15 10 15
Ala lie Phe Phe Leu Leu Tyr Thr Pro Pro Thr Gly Arg Ser Ser 20 25 30
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 41 <211> 36 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> polipéptido inmunogénico <400> 41
Ser Phe ala Trp Leu Leu Tyr Gly lie lie Leu Arg Ser Asn Phe Leu 15 10 15
Val Val Gln Asn Leu Met Ala Leu Ala Leu Ser Ala Val Gln Leu Ser 20 25 30
imagen1
<210> 42 <211> 36 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> polipéptido inmunogénico <400> 42
Ala Phe Pro Phe lie Ser Gly Phe Leu Ser Cys Phe Met Trp Leu Lys 15 10 15
Tyr Gly Val Leu Thr Glu Glu Ser Thr Leu lie Leu Val Asn Phe lie 20 25 30
Gly Ser Ala Leu
35
<210> 43 <211> 24 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> polipéptido inmunogénico <400> 43
Gly Leu Leu Cys Cys Cys Leu Ala Val Leu Phe Phe Ala Ser Pro Leu 1 5 10 15
Thr Met Leu Ala His Val lie Arg
20
<210> 44 <211> 26
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
<212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> polipéptido inmunogénico <400> 44
Leu Leu Leu Ala Met Val Leu Leu Pro Leu Leu Leu Leu Glu Ser Val 1 5 10 15
Val Pro Tyr Ala Ala Ala Glu Lys Val Trp 20 25
<210> 45 <211> 48 <212> PRT
<213> Anopheles gambiae <400> 45

Met His Leu Thr Leu Phe Thr Val Ala Val Leu Leu Leu Ala Ala Ala 1 5 10 15
Ala Leu Leu Leu Leu Leu Pro Pro Ala Tyr Ser Thr Thr Leu Thr Pro

20 25 30

Pro Ala Pro Pro Arg Leu Ser His Leu Gly lie Thr lie Gly Arg lie 35 40 45
<210> 46 <211> 46 <212> PRT
<213> Anopheles gambiae <400> 46

Met Pro Leu Ser Tyr Cys His Leu Phe Leu Thr His Thr Leu Ala Arg 1 5 10 15

Ala Leu Ser Phe Ser Arg Ser Asp Cys Leu Lys Phe Ser Glu Lys Arg 20 25 30

Leu Leu Phe Ser Gly Ser Lys Thr Phe Pro Thr Thr Leu Leu 35 40 45
<210> 47 <211> 56 <212> PRT
<213> Anopheles gambiae <400> 47
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
imagen2
<210> 48 <211> 56 <212> PRT
<213> Anopheles gambiae <400> 48
imagen3
<210> 49 <211> 57 <212> PRT
<213> Anopheles gambiae <400> 49

Met Phe Leu Lys Gly Ser Phe Pro Arg Phe Gln Met Cys Val Met Leu 1 5 10 15

lie Gly Phe Phe Ser Ser Ala Lys Cys Leu Met Cys Phe Ala Asp Trp 20 25 30

Glu Gly Met Leu Leu Met Thr Met Glu Val Phe Asp Phe Gln Leu lie 35 40 45

Val Phe Thr Pro Val Leu Lys Arg Ser 50 55
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 50 <211> 65 <212> PRT
<213> Anopheles gambiae <400> 50
Met Ala Gly Glu Ser Gln Lys Asn Ala Arg Ser Lys Gln Asn Asp Tyr

15 10 15

Gln Ala Leu Leu Gly Leu Cys Cys Pro Trp lie Asp Leu Ala Ala Ala 20 25 30

Asp Leu Pro Met Arg Arg His Ala Lys Ala Arg Glu Ala lie Asn Phe 35 40 45

Leu Leu Gln Ala His Glu Ala Gly Pro Asn Glu Glu Pro Ser Leu Pro 50 55 60
Ala
65
<210> 51 <211> 78 <212> PRT
<213> Anopheles gambiae <400> 51
Met Lys Phe Tyr Ser Val Gly Lys Leu Val Lys Val Leu Leu Val Met

15 10 15

Ala Val Cys Cys Leu Leu Leu Cys Thr Ala Pro Thr Gly Ala Asp Pro 20 25 30
Leu Pro Gly Arg Asp Arg Asn Thr lie Ala Asn Lys Ser Lys Asp Lys

35 40 45

Lys Ala Ser Ala Pro Lys His Ser Leu Gly Thr Gly Ala Arg Met Ala 50 55 60

Leu Thr Gly Gly Gly Val Leu Gly Gly Val Leu Thr Asn Met 65 70 75
<210> 52 <211> 83 <212> PRT
<213> Anopheles gambiae <400> 52
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Met Lys Phe Ala Phe A 1.3. Ph© Val Leu ILe Ale Leu Ph© Ale Vel Ph©

15 10 15
Ale Val Ser Glu Ale Leu Pro Glu Pro Glu Glu Ale Ale Ale Ser Ser

20 25 30

Asn Asp Gly Ala Ser Ala lie Thr Lys lie Val Leu Glu Leu Thr Pro 35 40 45
Glu Glu Ale Ale Ale Val Glu Lys Met Gly Gly Arg Gly Phe Trp Pro

50 55 60

lie Met Met Lys Ser Val Lys Lys lie Met Ala lie Gly Cys Asp Leu 65 70 75 80
lie Asp Cys
<210> 53 <211> 77 <212> PRT
<213> Anopheles gambiae <400> 53
Met Gly lie Lys Phe Leu Glu lie lie Lys Pro Phe Cys Gly lie Leu

15 10 15

Pro Glu lie Ala Lys Pro Glu Arg Lys lie Glu Phe Arg Glu Lys Val 20 25 30

Leu Trp Thr Ala lie Thr Leu Phe lie Phe Leu Val Cys Cys Glu lie 35 40 45

Pro Leu Phe Gly lie Met Ser Ser Asp Ser Ala Asp Pro Phe Tyr Trp 50 55 60

lie Arg Val lie Leu Ala Ser Asn Arg Gly Thr Leu Met 65 70 75
<210> 54 <211> 85 <212> PRT
<213> Anopheles gambiae <400> 54
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Val Leu Ser lie Val Gly Lys Lys Thr Asn Ala Ala Pro 20 25
Glu Ala Pro Gly Asn Val Gly Ser Thr Tyr Ser Pro Met 35 40 45
Gly Arg Leu Ala Thr Gly Ala Thr Lys Leu Phe Gly Gln 50 55 60
Thr Gly Thr Arg Phe Gly Thr Glu Leu Ser Arg Arg Thr
65 70 75
Leu Arg Val Lys Lys
85
Leu Leu Val
15
Gln Val Thr
30
Ala Asp lie
Phe Trp Asn
Phe Asp Phe 80
<210> 55 <211> 91 <212> PRT
<213> Anopheles gambiae
<400> 55
Met Ala Gly Asp lie Gln Leu Phe Ser Thr Arg Glu Thr Thr Met Lys 1 5 10 15
Leu Tyr Ser Gly Tyr Arg Leu Leu Val Leu Leu Val Met Thr val Cys 20 25 30
Cys Leu Leu Leu Phe lie Ala Pro Thr Gly Ala Asp Pro Leu Pro Gly 35 40 45
Gln Thr Gln Arg Thr Leu Gly Tyr Arg Gly Asn Asp Lys Arg Ala Thr
5(1
*%■/ V \r
Pro Pro Met His Ser Leu Gly Ser Gly Ala Arg Met Ala Met Thr Gly 65 70 75 80
Gly Gly xle Leu Gly Gly He Phe Ser Ala Leu
85 90
<210> 56 <211> 93 <212> PRT
<213> Anopheles gambiae <400> 56
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Met Asp Gln Cys Ser Val Pro Arg Leu Cys lie lie lie Met Lys Ser

15 10 15

Phe lie Ala Ala Ala Val lie Ala Leu lie Cys Ala lie Ala Val Ser 20 25 30
Gly Thr Thr Val Thr Leu Gln Ser Thr Cys Lys Leu Phe Thr Ala Asp

35 40 45

Val Val Ser Ser lie Thr Cys Lys Met Tyr Cys Val lie Lys Gly Lys 50 55 60

Thr Gly Gly Tyr Cys Asn Ser Glu Gly Leu Cys Thr Cys Arg Ala Glu 65 70 75 80

Asp Leu His Phe Leu Leu Lys Pro lie lie Asn Lys Asp 85 90
<210> 57 <211> 90 <212> PRT
<213> Anopheles gambiae <400> 57

Met Arg Phe Leu Ser Val Leu Thr Val Gly Leu Leu Val Trp Val Gly 1 5 10 15

Val Phe Ala Thr Val Asn Ala Glu Asp Pro Arg Thr Glu Leu lie Gly 20 25 30

Cys Gly Ser Val Leu Phe His Leu Ala Ala Asn Arg Leu Ser Leu Gln 35 40 45

Leu Glu Glu Phe Ala Val Cys Lys Arg Ser Asn Pro Gly Tyr Asp Cys 50 55 60

Ser Asp Ser lie His Arg Ala lie Ser Asp Leu Gln Gln Gly Leu Phe 65 70 75 80
Asp Leu Asn His Cys Thr Lys Asp lie Arg

85 90
<210> 58 <211> 92 <212> PRT
<213> Anopheles gambiae <400> 58
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Gln Ser Val Thr Ala Asn Asp Pro Val Asp Ala Leu Gly Ala Cys Ser

20 25 30

Gly Asn Leu Phe Gly Leu Leu Met Thr Arg Leu Gln Gln Met Val Glu 35 40 45

Asp Phe Thr Ala Cys Arg Gln Glu Ala Thr Ala Asn Asp Pro Gln His 50 55 60

Asp Arg Ser Asp Ser lie Gln Arg Ala Lys Val Asp Leu Gln Gln Gln 65 70 75 80
Leu Val Asn Tyr Ser Tyr Cys Thr Lys Asn lie Gln

85 90
<210> 59 <211> 101 <212> PRT
<213> Anopheles gambiae <400> 59

Met Ala Ser Lys Leu Phe Val Leu Ala Phe Leu Cys Leu Ala Leu Val 1 5 10 15

Val Val Val Gln Ser Ala Pro Gln Tyr Ala Arg Gly Asp Val Pro Thr 20 25 30

Tyr Asp Glu Glu Asp Phe Asp Glu Glu Ser Leu Lys Pro His Ser Ser 35 40 45

Ser Pro Ser Asp Asp Gly Glu Glu Glu Phe Asp Pro Ser Leu Leu Glu 50 55 60

Glu His Ala Asp Ala Pro Thr Ala Arg Asp Pro Gly Arg Asn Pro Glu 65 70 75 80

Phe Leu Arg Asn Ser Asn Thr Asp Glu Gln Ala Ser Ala Pro Ala Ala 85 90 95
Ser Ser Ser Asp Ser
100
<210> 60 <211> 114 <212> PRT
<213> Anopheles gambiae
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65

Met Lys Ser Met Leu Val Ala Phe Ala Thr Leu Ser Val Ala Leu Val 15 10 15
Val Val Val Ala lie Pro Ala Asn Phe Asn Tyr Gly Gly Gly Gly Gly

20 25 30

Tyr Phe lie Asn Gly Thr Gly Gln Ser Phe Asn Phe Ser Gly Glu Ser 35 40 45

Asn Gly Thr Ser lie Pro Gly Leu Pro Asp Phe Gly Ser Phe Leu Pro 50 55 60

Asn Leu Gly Asn Leu Thr Gln Gln Phe Gly Gly Ser Ser Gly Ala Phe 65 70 75 80

Pro Gln Phe Ser He Pro Ser Trp Thr Asn Phe Thr Asp Ala Phe Thr 85 80 95
Ser lie Leu Pro Phe Phe Gly Asn Gly Gln Gly Gly Gly Phe Pro Phe
imagen4
<210> 61 <211> 122 <212> PRT
<213> Anopheles gambiae <220>
<221> misc_feature <222> (39) .. (39)
<223> Cualquier aminoácido
<400> 61
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65

lie Val Bis Ser Arg Gly Leu Pro Glu Ser Ser Asp Lys Leu Glu Ala 20 25 30

Cys Gly Gln Bis Tyr Gly Xaa Leu Leu Lys Ala Ser Thr Thr Trp Asn 35 40 45
Glu Lys Glu Cys Asn Gly Ser Thr Lys Leu Ala Ala Cys Val Val Ser

50 55 60
Glu His Glu Gln Ala Tyr Arg Glu Leu Lys Gln Arg Cys Gln Glu Ala

65 70 75 80
His Asp Glu Arg Thr Ala Lys Val Asn Ala lie Tyr Glu Lys Leu Pro

85 90 95

Ala Tyr Leu Ser C31u ^^al Ser j^la ^^rg 'Val A.sn 'Val Leu Gln ^^al Ser 100 105 110

Leu Gln His Asp Leu Pro Asn Leu Gln Glu 115 120
<210> 62 <211> 124 <212> PRT
<213> Anopheles gambiae <400> 62
Pro Asp Val Ala Glu Pro Leu Val His His His Leu Arg His Leu Arg
15 10 15
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65

Vetl Leu Ale Ale Ala Ala Asp His His Leu Leu val His Leu Mis Piro 20 25 30

Glu Gly Cys Val Arg Ser Arg Glu Glu His Ala Arg Ala Gly Gln Glu 35 40 45

Gly Asn Val Ala Ser Leu Arg Thr Gln Glu Ala Gln Asn Thr Ser Thr 50 55 60

Glu Met Lys Leu Ala Lys Val Ala Leu Val Thr lie Ser Leu Trp Phe 65 70 75 80

Met Ala Trp Thr Pro Tyr Leu Val lie Asn Phe Thr Gly lie Phe Lys 85 90 95
Ala Ala Pro lie Ser Pro Leu Ala Thr lie Arg Gly Ser Leu Phe Ala

100 105 110

Lys Ala Asn Ala Val Tyr Asn Pro lie Val Tyr Gly 115 120
<210> 63 <211> 144 <212> PRT
<213> Anopheles gambiae <400> 63
Met Ala Thr Thr Trp lie Pro Thr Ser Val His Gly Pro Tyr Pro Pro

15 10 15

His Met Val Pro Gly Gly Val Asp Ser Asp Gly Ala Gln lie Phe Val 20 25 30

Gly Arg Ala His His Ala Gly Asp Leu Leu Pro Ala Lys Val lie Pro 35 40 45
Asp Lys Thr Ala Ala Tyr Val Ala Tyr Gly Gly Gln Glu Thr Leu Val

50 55 60

Glu His Val Glu Val Leu Val His Lys Gln Leu lie Trp Asp Thr Ala 65 70 75 80
Ser Ala Gly Gln Val Pro Leu Gly Ala Val Val Gly Gly His Thr Ser

85 90 95

Asp Gly Glu lie Leu Tyr Val Gly Arg Ala Tyr His Glu Gly Ser Gln 100 105 110
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
imagen5
<210> 64 <211> 150 <212> PRT
<213> Anopheles gambiae <400> 64

Met Phe Lys Lys Leu Leu Leu Ser Val Gly Leu Val Trp Cys Leu lie 1 5 10 15

Ser Leu Gly Gln Ala Arg Lys Glu Ser Thr Val Glu Glu Cys Glu Lys 20 25 30

Asn lie Gly Asp Ser Leu Lys Asp Arg Val Cys Glu Leu Arg Glu Tyr 35 40 45

Thr Pro Val Ser Ser Asp Asp Met Asp Lys His Met Gln Cys Val Leu 50 55 60

Glu Val Val Gly Phe Val Asp Gly Asn Gly Glu Val Lys Glu Ser Val 65 70 75 80

Leu Leu Glu Leu Leu Gln Arg Val Asp Ser Gly Val Asn His Ala Ala 85 90 95
Asn Met Lys Lys Cys Val Thr Glu Ala Ser Thr Ser Gly Ser Asp Lys

100 105 110
Lys Ala Asn Thr Phe Tyr Thr Cys Phe Leu Gly Thr Ser Ser Leu Ala

115 120 125

Gly Phe Lys Asn Ala Val Asp Tyr Asp Glu Leu Leu Lys Ala Gly Lys 130 135 140

Met Gln Thr Ser Asp Pro 145 150
<210> 65 <211> 156 <212> PRT
<213> Anopheles gambiae <220>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<221> misc_feature <222> (138) .. (138)
<223> Cualquier aminoácido
<220>
<221> misc_feature <222> (140) .. (140)
<223> Cualquier aminoácido
<400> 65

Met Phe Gly Lys Leu Leu Pro Cys Ala lie Leu Leu Trp Cys Leu Phe 15 10 15

Ser Leu Gly Gln Ala Arg Gln Glu Glu Thr Val Glu Glu Cys Glu Arg 20 25 30

Asn lie Pro Ala Ser Leu Lys Glu Arg Val Cys Glu Leu Arg Gln Tyr 35 40 45

Thr Pro Val Gln Gly Lys Asp Met Asp Ser His Met Gln Cys Val Leu 50 55 60

Glu Val Leu Gly Phe Val Glu Asp Asn Gly Glu Leu Val Phe Gln Glu 65 70 75 80

Leu Leu Gly Val Leu Lys Met Val Asp Pro Asp Gly Asp His Ala Gly 85 90 95

Ser Met Lys Lys Cys Asn Gly Glu Ala Glu Lys Val Asp Thr Ser Ser 100 105 110

Lys Ala Asn Thr Phe Tyr Thr Cys Phe Leu Gly Thr Ser Ser Ala Gln 115 120 125

Ala Phe Lys Tyr Ala Val Asp Tyr Val Xaa Ala Xaa Arg Ala Gly Lys 130 135 140

Leu Asp Met Gly Thr Thr Phe Asn Ala Gly Gln Val 145 150 155
<210> 66 <211> 178 <212> PRT
<213> Anopheles gambiae <400> 66
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Ala Gly Gly Phe Ser Leu Phe Glu Ala Leu Lys Gln Thr Thr Thr Arg

15 10 15
Gly Glu Met Phe Arg Arg Lys Leu Thr Pro Thr Val Val Val Val Leu

20 25 30

Leu Cys Leu Thr Phe Val Ala Asp Ala Leu Thr Xle Glu Glu Leu Arg 35 40 45
Ala Gln lie Ala Gln Gln Arg lie Gln Gln Arg Tyr Gly Val Thr Val

50 55 60

Ala Thr Thr Ser Ala Ala Thr Thr Thr Ala Ala Thr Thr Ser Ala Ala 65 70 75 80
Thr Thr Ser Glu Ala Thr Thr Thr Ala Ala Ala Ser Thr Thr Gln Ala

85 90 95

Ser Asp Ser Asp Asn Thr Thr Thr Thr Ala Glu Ala Thr Thr Thr Thr 100 105 110

Glu Ala Gln Thr Thr Ser Ser Ser Asp Asn Ser Thr Thr Thr Glu Ala 115 120 125

Ala Ala Thr Thr Thr Ala Ala Ser Glu Thr Thr Ala Asp Ser Ser Ser 130 135 140
Thr Gly Thr Thr Ser Val Glu Ala Gly Leu Arg Ala Gln Tyr Arg Asp

145 150 155 160
Gln Val Arg Gln Gln Ala lie Glu Arg Ala Leu Ala Arg Ala Ala Ala

165 170 175
Phe Gly
<210> 67 <211> 163 <212> PRT
<213> Anopheles gambiae <400> 67
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65

lie Gly Ala Glu Phe Ser Ala Glu Asp Cys Arg Glu Leu Gly Leu lie 20 25 30

Lys Ser Gln Leu Phe Cys Ser Ala Cys Ser Ser Leu Ser Asp fyr Gly 35 40 45
Leu lie Glu Leu Lys Glu His Cys Leu Glu Cys Cys Gln Lys Asp Thr

50 55 60

Glu Ala Asp Ser Lys Leu Lys Val Tyr Pro Ala Ala Val Leu Glu Val 65 70 75 80
Cys Thr Cys Lys Phe Gly Ala Tyr Pro Gln lie Gln Ala Phe lie Lys

85 90 95

Ser Asp Arg Pro Ala Lys Phe Pro Asn Leu Thr lie Lys Tyr Val Arg 100 105 110

Gly Leu Asp Pro lie Val Lys Leu Met Asp Glu Gln Gly Thr Val Lys 115 120 125

Glu Thr Leu Ser lie Asn Lys Trp Asn Thr Asp Thr Val Gln Glu Phe 130 135 140

Phe Glu Thr Arg Leu Ala Lys Val Glu Asp Asp Asp Tyr lie Lys Thr 145 150 155 160
Asn Arg Val
<210> 68 <211> 182 <212> PRT
<213> Anopheles gambiae <400> 68
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65

Glu lie lie Pro Gln Gln Gln Lys Lys Thr Met Lys Phe Leu Leu Leu 20 25 30

Val Ala Ser Val Leu Cys Leu Val Leu lie Val Ser Ala Arg Pro Ala 35 40 45

Asp Asp Thr Ser Asp Gln Glu Ser Ser Thr Glu Leu Ser Asp Asp Ala 50 55 60

Gly Ala Glu Glu Gly Ala Glu Asp Ala Gly Ser Asp Ala Glu Ala Asp 65 70 75 80

Ala Gly Ala Ala Asp Gly Glu Glu Gly Ala Thr Asp Thr Glu Ser Gly 85 90 95
Ala Glu Gly Asp Asp Ser Glu Met Asp Ser Ala Met Lys Glu Gly Glu
imagen6
<210> 69 <211> 166 <212> PRT
<213> Anopheles gambiae <400> 69
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65

Met Glu Trp Arg Tyr Phe Val Val IX© Ala Leu IX© Cys Pro Leu IX© 15 10 15

IX© Val Glu Thr Leu Ala Val Ser Asp Cys Val Arg lis Val Ser Glu 20 25 30

Ser Ala Arg Asn Thr Val Cys Asp Val Arg Gln Tyr Arg Val Thr Lys 35 40 45

Gly Val Glu Ala Asp Arg Tyr Val Gln Cys Phe Met Thr Ala Leu Gly 50 55 60

Phe Ala Asp Glu Ser Gly Ser lie Gln Arg Ser Asn Val Leu Thr Ala 65 70 75 80
Leu Asp Ala Val Glu Thr His Asp Gly Val Tyr Thr Asp Ala Val Asp

85 90 95

Val Cys Leu Ser Lys Ala Lys Lys Leu Pro Gly Thr Glu Arg Ser Gly 100 105 110
Tyr Phe Phe Ser Cys Met Leu Arg Thr Glu Ser Ala Leu Asn Phe Arg

115 120 125
Asp Ala Val Glu Leu Gln Glu Leu Arg Val Ala Ser Lys Trp Pro Glu

130 135 140

Gly Glu Arg Phe Asp Arg Ser Lys Val Gln Gln Met Met Arg Glu Leu 145 150 155 160
Asn Ser Gln Leu Arg Cys 165
<210> 70 <211> 161 <212> PRT
<213> Anopheles gambiae <400> 70
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Gly Arg Glu Ala lie Glu Thr Met Arg Thr Glu Gln Arg Asn His Arg

15 10 15
Gln Gln Leu Leu Leu Leu Tyr Leu Asp Ala Ala Asp Leu Arg Arg Ala

20 25 30
Leu His Gln Tyr Gln Leu Leu Ala Ala Gln Gly Asp Arg His Leu Pro

35 40 45

Gln Gln lie Val Lys Phe Val Tyr Ala Ala Pro Arg His Glu Asn Arg 50 55 60

Arg Leu Glu Asn Leu Leu Asp Leu Val Arg Gln Leu Pro Ala Arg Gln 65 70 75 80

Asp Gln Arg Thr Leu Tyr Gln Leu Leu Gln Pro Glu 1 le Met Lys Arg 85 90 95

Pro Ala Gln Asn Gln Ser Thr Leu Ala Met Leu Thr Ala Leu Glu Met 100 105 110

Gly Gln Val Val Glu Gly Asn Gly Glu Leu Lys Lys Gln Gln Asp Ala 115 120 125

Met Tyr Gln Leu Val Leu Lys Arg Trp Met Phe Leu Cys Leu Ala Gly 130 135 140

Gln Tyr Arg Glu ile Val Gln Phe Ala Thr Lys His Pro Arg Leu Phe 145 150 155 160
Glu
<210> 71 <211> 178 <212> PRT
<213> Anopheles gambiae
<400> 71
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Met
Ala lie Trp lie Val Cys Ala Thr Leu Leu Leu Ala Val Leu Ser
1
5 10 15
val
val
Ser Val Gly Gly Gln Tyr Cys Ser Ser ASp Leu Cys Pro Arg
20 25 30
Gly
Gly
Pro His Val Gly Cys Asn Pro Pro Ser Ser Ser Gly Gly Pro
35 40 45
Thr
Cys Gln Gly Lys Gln Lys Ala Arg Lys Val Leu Leu Thr Pro Ala
50 55 60
Leu
Gln Ala Tyr lie Met Asp Glu His Asn Leu Asn Arg Ser Asn lie
65
70 75 80
Ala
Leu Gly Arg lie Arg Pro Tyr Pro Ser Ala Val Lys Met Pro Thr
85 90 95
Leu
Thr Trp Asp Pro Glu Leu Ala Ser Leu Ala Asp Ala Asn Ala Arg
100 105 110
Ser
Cys Asn Tyr Gly His Asp Arg Cys Arg Ala Thr Lys Lys Phe Pro
115 120 125
Tyr
Ala Gly Gln Asn lie Ala lie Thr Gln Phe Phe dy Tyr Arg Phe
130 135 140
Thr
Glu Lys Asp Leu lie His Lys Fhe Val Ser Ser Trp Trp Ser Glu
145
150 155 160
Tyr
Leu Asp Ala Arg Pro Glu His Val Arg Lys Tyr Pro Ser S©IT
Tyr
165 170 175
Ser Gly
<210> 72 <211> 238 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Construcción sintética <400> 72

Claims (17)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    Reivindicaciones
    1. Un polipéptido que consiste en entre 20 y 55 aminoácidos, cuyo polipéptido comprende SEQ ID NO: 35, una secuencia de polipéptido que tiene al menos 90% de homología con sEq ID NO: 35, o una subsecuencia de SEQ ID NO: 35, el sub-secuencias que tienen 20 aminoácidos o más, donde el polipéptido no es una proteína de saliva de artrópodo completa, en donde el polipéptido es inmunogénico en un vertebrado y en el que el vertebrado produce células del sistema inmunitario capaces de reconocer al menos un epítopo de una fracción proteica de saliva de artrópodo.
  2. 2. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polipéptido comprende la SEQ ID NO: 120 o una secuencia polipeptídica que tiene al menos un 90% de homología con la SEQ ID NO: 120.
  3. 3. Una composición polipeptídica que comprende uno o más polipéptidos como se define en la reivindicación 1 o la reivindicación 2.
  4. 4. La composición polipeptídica según la reivindicación 3, composición que comprende además uno o más polipéptidos adicionales seleccionados independientemente de un polipéptido que tiene entre 20 y 55 aminoácidos y que comprende la SEQ ID NO: 1-34 o 36-44, una secuencia polipeptídica que tiene 90 % de homología con SEQ ID NO: 1-34 o 36-44, o una subsecuencia de SEQ ID NO: 1-34 o 36-44, teniendo las sub-secuencias 20 aminoácidos o más, en donde el uno o más polipéptidos adicionales son capaces de provocar una respuesta inmune en vertebrados frente a uno o más patógenos o cepas de patógenos responsables de una enfermedad transmitida por artrópodos.
  5. 5. La composición polipeptídica, como se define en la reivindicación 3 o 4, cuya composición comprende un polipéptido de la SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, o SEQ ID NO: 32, a polipéptido que tiene una secuencia polipeptídica que tiene un 90% de homología con la SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, o SEQ ID No: 32, o un polipéptido que tiene una subsecuencia de SEQ ID N° 20, SEQ ID N° 28, SEQ ID N° 30, SEQ ID N° 31 o SEQ ID N° 32, las sub-secuencias que tienen 20 aminoácidos o más.
  6. 6. La composición polipeptídica, como se define en la reivindicación 3 o 4, cuya composición comprende un polipéptido de SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, o SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117 o SEQ ID NO: 120 o un polipéptido que tiene una secuencia de polipéptido que tiene 90% de homología con SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, o SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117 o SEQ ID NO: 120.
  7. 7. La composición polipeptídica, como se define en la reivindicación 3 o 4, cuya composición comprende un polipéptido de SEQ ID No: 91, SEQ ID NO: 115, SEQ ID N° 116 o SEQ ID N° 120 o un polipéptido que tiene una secuencia polipeptídica que tiene 90 % de homología con SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 115, SEQ ID nO: 116 o SEQ ID NO: 120.
  8. 8. La composición polipeptídica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3-7, cuya composición comprende de 2 a 10 polipéptidos, o más preferiblemente de 2-6 polipéptidos,
    o en donde uno o más polipéptidos son epítopos de linfocitos T citotóxicos (CTL), o uno o más polipéptidos son epítopos de linfocitos T auxiliares (Th), o uno o más polipéptidos son epítopos de linfocitos B, o en donde uno o más polipéptidos son inmunogénicos frente a una pluralidad de proteínas salivales de artrópodo. o en donde la composición comprende 2, 3, 4, 5, 6 o más epítopos,
    o en donde la fracción proteica de saliva de artrópodo es una fracción proteica de saliva de mosquito de cualquier especie de mosquito, preferiblemente de Anopheles gambiae,
    o en donde la composición comprende además uno o más secuencias adicionales de una proteína salival artrópoda, o en donde la subsecuencia comprende 8, 9, 10 u 11 aminoácidos o más,
    o en donde la composición comprende polipéptidos que tienen secuencias de SEQ ID NO: 1-6 todos presentes, y/o en donde la composición comprende polipéptidos que tienen secuencias de SEQ ID NOs: 20, 28, 30-32 y 35 presentes.
  9. 9. Un polipéptido como se define en la reivindicación 1 o la reivindicación 2 o una composición polipeptídica como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 3-8, para uso en medicina.
  10. 10. Un método para producir una composición polipeptídica como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 3-9, cuyo método comprende mezclar o combinar uno o más polipéptidos como se define en la reivindicación 1 o la reivindicación 2 con uno o más componentes adicionales, tales como un vehículo, un excipiente, un adyuvante, un tampón o un estabilizador.
  11. 11. Una construcción de ácido nucleico que comprende uno o más ácidos nucleicos que comprende la secuencia codificante de un polipéptido como se define en la reivindicación 1 o la reivindicación 2.
  12. 12. Una composición de medicamento o vacuna contra una enfermedad transmitida por artrópodos, que comprende
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    un polipéptido como se define en la reivindicación 1 o la reivindicación 2 o una composición polipeptídica como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 3-9 y un excipiente y/o adyuvante apropiado.
  13. 13. Un método para producir un medicamento o composición de vacuna como se define en la reivindicación 12, cuyo método comprende unir, combinar o mezclar un polipéptido como se define en la reivindicación 1 o la reivindicación 2 y/o una composición polipeptídica como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 3-9 y/o una construcción de ácido nucleico como se define en la reivindicación 11 con un excipiente y/o adyuvante apropiado.
  14. 14. Un polipéptido como se define en la reivindicación 1 o reivindicación 2, una composición polipeptídica como se define en cualquiera de las reivindicaciones 3-9, una construcción de ácido nucleico como se define en la reivindicación 11, o una composición de medicamento o vacuna como se define en la reivindicación 12 para uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad transmitida por artrópodos; preferiblemente en donde la enfermedad transmitida por artrópodos es una enfermedad en un vertebrado, preferiblemente, en donde el vertebrado se selecciona de un mamífero, un pájaro, un reptil y un pez, y preferiblemente de un ser humano, un animal doméstico o un animal de granja, un bovino animal o aves de corral.
  15. 15. Un polipéptido como se define en la reivindicación 1 o reivindicación 2, una composición polipeptídica como se define en cualquiera de las reivindicaciones 3-9, una construcción de ácido nucleico como se define en la reivindicación 11, un medicamento o composición de vacuna como se define en la reivindicación 12, o un polipéptido, composición, construcción de ácido nucleico, medicamento o composición de vacuna para uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad transmitida por artrópodos como se define en la reivindicación 14,
    en donde el artrópodo es un artrópodo hematófago, o
    en donde el artrópodo es un artrópodo hematófago seleccionado entre mosquitos, garrapatas, moscas de arena, ácaros y pulgas, o en donde el artrópodo es Anopheles sp., Aedes sp., Culex sp., Mansonia sp. Chrysops sp., Simulium sp., Triatoma sp., Rhodnius sp., Panstrongylus sp., Glossina sp., Tabanus sp., Phlebotomus sp., Lutzomyia sp., Pediculus sp., Ornithodoros sp., Ixodes sp., Pediculus sp. , Pulex sp., Hemagogous spegazzani., Ochlerotatus sp., O Coquillettidia sp.
  16. 16. Un polipéptido como se define en la reivindicación 1 o reivindicación 2, una composición polipeptídica como se define en cualquiera de las reivindicaciones 3-9, una construcción de ácido nucleico como se define en la reivindicación 11, un medicamento o composición de vacuna como se define en la reivindicación 12, o un polipéptido, composición, construcción de ácido nucleico, medicamento o composición de vacuna para uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad transmitida por artrópodos como se define en la reivindicación 14, donde la enfermedad transmitida por artrópodos es una enfermedad seleccionada de malaria, filariasis, tripanosomiasis, leishmaniasis, oncocercosis, dengue, enfermedad de Lyme, tularemia, fiebre recurrente, tifus, peste, fiebre amarilla, fiebre del valle del rift y encefalitis, como encefalitis de St. Louis, fiebre del Nilo occidental, encefalitis de La Crosse y encefalitis equina del este.
    FIG. 1
    Gel de IEF de glándulas salivares de Anopheles gambiae (mancha azul Comassie)
    imagen1
    MW Muestra MW
    FIG. 2
    SDS-PAGE de gel IEF de glándulas salivares Anopheles gambiae (mancha plateada) Rectángulo rojo indica ubicación de proteínas diana (<30 kDa)
    imagen2
    imagen3
    F G. 3
    C1I2D3D+
    □ 1 ■ 2 □ 3 □ 4
    P'omodio sir huevos producios
    % que so aumentó
    □ 1 ■? Q3 C4 □ 5
    J1 |2n3D4 BS
    Promedio sir huevos puestos
    % tasa do o: os ór
    □ 1 |2 D3 R4 ■&
    □ 1 ■ 2 D3 Q4 H 5
    P'cmcdio sir puaas
    Promedio sir oivas
    11 12 D3 G4
    100
    100
    % emergencia
    % pLpÜCl&íl
    □ 1 ■ 2 □ 3 □ 4
    Promedio sin adultos
    O.D. 450 nm * de supervivencia
    FIG. 4
    % Supervivencia de mosquitos días iras a¡irer:acián
    imagen4
    -m-2 -6-3 -^4 -*-5 j
    imagen5
    FIG. 5
    A blanco
    imagen6
  17. 7.5ug/m) (2uM) (2uM) (2uMJ (2uM) (2uM) (2uM) 2 1.2uM
    (C4uM (0,2uM
    cada uno) cada urc}
    □ Mezcla NRn £] Mozclü AG S
    tyli de supervivencia 0,D, 450 riTi
    FIG. 7
    R&ssuesta total Ig
    imagen7
    FIG. 8
    Supervivencia de ratones nocaiados
    imagen8
    -«-Mezcla NRP-*-Mezcla AGS
    imagen9
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