JP5429804B2 - 体内に存在する病因物質の低下剤 - Google Patents

Description

本発明は、体内に存在する病因物質を積極的に代謝又は排泄させるための薬剤に関する。

脂質、糖質、タンパク質、内分泌物質の代謝異常によって引き起こされる疾患は極めて多い。通常、正常人のこれら物質の体内濃度は一定に保たれており、過剰分は特異的な代謝経路によって能動的に体外へ排出される。しかし、何らかの原因でこの代謝経路に異常が生じると代謝されるべき物質が体内で循環し蓄積するため、その物質濃度は増加し、多くの疾患が誘発される。例えば、血清脂質の主としてコレステロール、トリグリセライド、リン脂質、遊離脂肪酸などが異常に増加した状態を示す高脂血症もその疾患の一つである。その基準は、空腹時の血清ＬＤＬコレステロール値が１４０ｍｇ／ｄｌ以上を高ＬＤＬコレステロール血症、トリグリセライド値が１５０ｍｇ／ｄｌ以上を高トリグリセライド血症という。特に高ＬＤＬコレステロール血症は冠動脈疾患や脳血管障害の主要な原因であると考えられており、血中ＬＤＬコレステロール濃度の是正によりこれらの疾患の罹患頻度が低下するいくつものエビデンスが得られている。

高脂血症の治療には、スタチン系薬剤、フィブラート系薬剤、ニコチン酸、陰イオン交換樹脂、コレステロール吸収阻害薬、プロブコール、デキストラン硫酸、イコサペント酸エチル等、種々の薬剤が用いられているが、プラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ピタバスタチン、ロスバスタチン等のスタチン系薬剤が最近の治療剤の中心をなしている。スタチン系薬剤の中でも、ピタバスタチン又はその塩類は強いＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害作用を有し、血中コレステロール低下剤として有用であることが知られている（特許文献１）。動脈硬化学会のガイドラインでは、患者の有する動脈硬化のリスクの数により、目標ＬＤＬコレステロール値が限定されている。高リスク群に対しては、これらのスタチンを用いても、目標を達成できるのは約２５％の患者のみである。ホモ型の家族性高コレステロール血症は、ＬＤＬ受容体遺伝子が欠損している遺伝病であり、その作用機序がＬＤＬ受容体の活性化を介しているスタチン類等の薬物による治療は無効であることが知られている。通常、肝実質細胞表面に存在するＬＤＬ受容体を介して血中ＬＤＬ（低比重リポタンパク質）が肝臓中に取り込まれ、過剰なＬＤＬは胆汁として排泄されるが、この患者はその機能が欠損している。また、血清コレステロール値は６００〜１０００ｍｇ／ｄｌの高値を示し、幼少期より進行する動脈硬化症により、若年齢で心筋梗塞が引き起こされる。

この疾患に対する治療法としては、欠損したＬＤＬ受容体を導入する遺伝子治療の臨床試験が行われているが、遺伝子治療に対する安全性は確立されておらず、実用化にはまだ多くの問題が残る。また、肝臓移植による治療も考えられるが、患者の肝機能そのものは正常であるため、倫理的な問題などもあり現実的ではない。このような重篤な高コレステロール血症患者の治療には、ＬＤＬアフェレーシスが用いられている。これはＬＤＬを特異的に吸着するカラム（デキストラン硫酸セルロースカラム）に血液を流すことにより、ＬＤＬのみを吸着除去するものであり、長期間安全に継続できる。しかし、これは体外循環を用いた血漿交換療法であり、患者が５〜６才になるまでは適用できない。そのため生下時より進行する動脈硬化には対応できない。さらに、治療費が高額で身体的にも負担が大きく、患者のＱＯＬの向上という面からも新たな治療方法の確立が望まれる。

透析患者では何らかの原因により、生体内で水、電解質の代謝異常と種々の窒素代謝産物の蓄積、腎臓が関与している種々のホルモンの異常がみられる。生体にとって有毒物質は通常、腎臓、肝臓、消化管などから排泄されるが、腎不全患者では、腎臓より有毒物質を排泄するのに長時間を要し、そのために腎機能障害の悪化、他臓器への悪影響をきたし、生命の危機に陥ったりする。

このような場合、持続的携帯式腹膜透析と血液透析が最も一般的な治療法として定着している。２００４年１２月末日の日本透析医学会統計によれば，慢性透析患者数は２４８，１６６人、２０年以上の生存者は１５，８９９人（６．７％）、最長透析歴患者は３７年３ヵ月となっている。

透析期間の長期化に伴い、近年、顕在化してきた合併症の一つに透析アミロイドーシスがある。腎不全患者は、腎機能の低下・障害により、ベータ２ミクログロブリンという中分子タンパク質の排泄が悪化し、血液中のベータ２ミクログロブリン濃度が高くなっている。ベータ２ミクログロブリンの物質の蓄積は、透析アミロイドーシスを発症し、アミロイド繊維が全身のいたるところに沈着し、痛み・痺れを伴う、骨・神経・関節障害が現れ、患者のＱＯＬは著しく低下する。

透析アミロイドーシス治療には、原因物質であるベータ２ミクログロブリンの除去が行われており、ベータ２ミクログロブリンの除去能の高い透析方法の導入、血液濾過透析（ＨＤＦ）の導入、ハイパフォーマンスメンブレンという透析膜の孔径の大きなダイアライザーの使用等が早期より開始されている。また、オンラインＨＤＦという、血液中の血漿成分を積極的に取り出し、それとほぼ当量の補液を血液に還流させる際に、透析液をクリーンに浄化する治療法も普及し始めているが、重篤な場合には外科的治療が実施されている。これらの治療法は、治療費が高額で身体的にも負担が大きく、患者のＱＯＬの向上という面からも新たな治療方法の確立が望まれる。

一方、体外循環医療カラムの治療効果を上げる補助用具も用いられており、ベータ２ミクログロブリンに選択的に結合するヘキサデシル基固定化セルロースビーズ（製品名：リクセル、登録商標）が用いられている（特許文献２）。ヘキサデシル基固定化セルロースビーズを用いた血液吸着療法により、透析アミロイドーシス患者の関節痛等が改善することも報告されている。しかし、これらの体外循環医療カラムの治療効果を上げる補助用具は、抗凝固剤併用もしくは、体外循環医療カラムに抗血栓性を付与することが必要である。抗凝固剤の使用は、患者に負担を強いるものであり、汎用されている抗凝固剤であるヘパリンに対して、ショック症状を呈する患者が存在するため、新たな治療方法の確立が望まれる。

また、重篤な高脂血症患者におけるＬＤＬの除去や透析アミロイドーシス患者におけるベータ２ミクログロブリンの除去のように、何らかの代謝異常や排泄機能不全、除去困難等により体内に過剰に存在する物質を除去する治療法において、一般的には人工透析や各種アフェレーシスが行われているものの、上述の通り患者のＱＯＬの問題や、高額な医療費が必要になるという問題も抱えており、人工透析や各種アフェレーシス療法に代わる新たな治療手段の確立が強く望まれている。

特発性拡張型心筋症（ＤＣＭ）は、心臓の内腔が著しく拡張して心筋の収縮不全を起こし、うっ血性心不全の臨床像を呈する予後不良の慢性進行性疾患である。１９９９年の旧厚生省の調査によれば患者数は全国推計で１７，７００人であるが、無症状の患者が多いため、実際の患者数はもっと多いものと考えられている。

ＤＣＭの根本治療法としては、今のところ脳死した心臓提供者からの心臓移植が代表的なものであるが、国内では脳死という概念が広く一般に浸透しているとはいえないため心臓移植手術がなかなか行われていない状況にあり、世界的にみても心臓提供者が心臓移植を必要とする患者に比べて少ないという問題がある。また、心臓移植は医療保険の対象外であるため、心臓提供者が見つかっても患者は大きな経済的負担を負うことになる。さらに、仮に心臓移植手術が成功しても、免疫抑制剤を一生服用し続けなければならず、免疫力低下により感染症に罹患し易くなることが大きな問題として残っている。このため、内科的療法としてアンジオテンシン変換酵素阻害薬とベータ遮断薬などが併用されて効果を挙げているが（非特許文献１）、体質・症状の進行状態により期待した効果が得られない場合もあり、また、進行を遅らせることしかできないため、内科的療法によってＤＣＭを根本的に治療する手段の確立が強く望まれている。
特開平１−２７９８６６号公報 特開平９−２６６９４８号公報 Ｍｅｄ．Ｊ．Ａｕｓｔ．，２００１，１７４，４５９−４６６

本発明は、体内に存在する病因物質の体内濃度を積極的に低下させるための薬剤を提供することを課題とする。

本発明者らは、かかる事情に鑑み鋭意検討の結果、体内に存在する病因物質を、本来の代謝経路とは異なる別の経路へと積極的に誘導する薬剤を提供することができれば、新規なメカニズム（メタボリックスイッチング機構と呼ぶ）に基づく該病因物質の体内レベル低下剤として有効に利用できるのではないかと着想した。そして、ＬＤＬの吸着剤であるデキストラン硫酸に肝細胞アシアロオロソムコイドレセプターリガンドであるガラクトースを修飾した化合物が、血中ＬＤＬを肝細胞へと誘導し、肝臓で分解させることで、血中ＬＤＬレベルを優位に低下させることを見出した。

また、ベータ２ミクログロブリンの吸着剤であるベータ２ミクログロブリン抗体を修飾させたデキストラン硫酸を、肝細胞特異的なリガンドの一つであるＬＤＬと同時に投与することによって生成するＬＤＬ−デキストラン硫酸−ベータ２ミクログロブリン抗体の複合体が、ベータ２ミクログロブリンを肝細胞へ積極的に取り込ませることを見出した。

さらに、抗体を特異的に認識するプロテインＡを導入したデキストラン硫酸を、肝細胞特異的なリガンドの一つであるＬＤＬと同時に投与することによって生成するＬＤＬ−デキストラン硫酸−プロテインＡの複合体が、過剰に体内に存在し、病因となっている抗体を肝細胞へ積極的に取り込ませることを見出した。
このことから、血中又はリンパ液中に存在する病因物質の吸着剤と、当該病因物質を代謝又は排泄する能力を有する臓器又は細胞に特異的なリガンドとをリンカーを介して又は介さずに結合させた化合物は、血中又はリンパ液中の病因物質レベルの低下剤として利用でき、その結果当該病因物質による疾患の治療が可能になることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、（Ａ）血中又はリンパ液中に存在する病因物質の吸着剤と、（Ｂ）当該病因物質を代謝又は排泄する能力を有する臓器又は細胞に特異的なリガンドとを、リンカーを介して又は介さずに結合させた化合物を提供するものである。
また本発明は、当該化合物を有効成分とする、血中又はリンパ液中に存在する病因物質の体内レベル低下剤を提供するものである。
また、本発明は、当該化合物を有効成分とする、血中又はリンパ液中に存在する病因物質に起因する疾患の予防及び／又は治療剤を提供するものである。
また本発明は、当該化合物及び薬学的に許容される担体を含有する、血中又はリンパ液中に存在する病因物質に起因する疾患の予防及び／又は治療用医薬組成物を提供するものである。
また、本発明は、血中又はリンパ液中に存在する病因物質に起因する疾患の予防及び／又は治療薬製造のための、当該化合物の使用を提供するものである。
また本発明は、血中又はリンパ液中に存在する病因物質低下剤製造のための、当該化合物の使用を提供するものである。
また、本発明は、当該化合物の有効量を投与することを特徴とする、血中又はリンパ液中に存在する病因物質の体内レベル低下方法を提供するものである。
さらに本発明は、当該化合物の有効量を投与することを特徴とする、血中又はリンパ液中に存在する病因物質に起因する疾患の予防及び／又は治療方法を提供するものである。

本発明によれば、人工透析や各種アフェレーシスによらず、薬剤の体内投与によって、血中又はリンパ液中に過剰に存在する病因物質レベルを低下させることができる。より具体的には、デキストラン硫酸にガラクトースを修飾した本発明化合物は、優れたＬＤＬ低下作用を示し、新たな高脂血症治療剤として利用できる。特に、これまでＬＤＬアフェレーシスにより血中ＬＤＬを除去しなければならなかったホモ型家族性高脂血症のような重篤な高脂血症患者であっても、効果的に血中ＬＤＬレベルを低下させることができる。

一方、ＬＤＬとデキストラン硫酸−ベータ２ミクログロブリン抗体を同時に投与することによって生成するＬＤＬ−デキストラン硫酸−ベータ２ミクログロブリン抗体の複合体は、優れたベータ２ミクログロブリン低下作用を示し、新たなアミロイドーシス治療剤として利用できる。特に、これまでベータ２ミクログロブリンの除去能を有するハイパフォーマンスタイプの人工腎臓やヘキサデシル基固定化セルロースビーズにより、血中ベータ２ミクログロブリンを除去しなければならなかった重篤な透析アミロイドーシス患者であっても、効果的に血中ベータ２ミクログロブリンレベルを低下させることができる。

さらに、ＬＤＬとデキストラン硫酸−プロテインＡを同時に投与することによって生成するＬＤＬ−デキストラン硫酸−プロテインＡの複合体は、過剰に体内に存在し、病因になっている抗体に対する優れた低下作用を示し、新しい治療薬、例えば特発性拡張型心筋症治療薬として利用できる。特に、これまで心臓移植などの外科的治療以外に有効な内科的療法がなかった患者の血中の抗体レベルを低下させることができる。

は、高脂血症モデルマウスに対するデキストラン硫酸−ガラクトース注射後のコレステロール量変化を示す図である。 は、合成したデキストラン硫酸−ベータ２ミクログロブリン抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより泳動した結果を示す図である。 は、ＬＤＬおよびデキストラン硫酸−ベータ２ミクログロブリン抗体によりＨｅｐＧ２細胞へベータ２ミクログロブリンが取り込まれた結果を示す図である。 は、合成したデキストラン硫酸−プロテインＡをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより泳動した結果を示す図である。 は、ＬＤＬおよびデキストラン硫酸−プロテインＡにより抗体が取り込まれた結果を示す図である。

血中又はリンパ液中に存在する病因物質とは、代謝異常、排泄機能不全、除去困難、又は異常増殖等の理由により、血中又はリンパ液中に過剰に存在することで生体機能に悪影響を及ぼす物質のことである。具体的には、高脂血症患者におけるＬＤＬや酸化ＬＤＬ、アミロイドーシス患者におけるベータ２ミクログロブリン、拡張型心筋症における抗心筋自己抗体、ガラクトース血症患者におけるガラクトース、糖原病患者におけるグリコーゲンと乳酸、乳糖不耐症患者における乳糖、果糖不耐症患者におけるショ糖や果糖、フェニールケトン尿症患者におけるフェニルアラニン、メープルシロップ尿症患者におけるα−ケト酸、ヒスチジン血症患者におけるヒスチジン、プロピオン酸血症患者におけるプロピオン酸、メチルマロン酸血症患者におけるメチルマロン酸、ポルフィリン症におけるポルフィリン、全身性エリテマトーデス、強皮症、多発性筋炎や慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患における自己抗体、ヘモシデローシス患者におけるヘモシデリン、Ｗｉｌｓｏｎ病における銅、高カリウム血症におけるカリウム、高カルシウム血症におけるカルシウム、高マグネシウム血症におけるマグネシウム、脂溶性ビタミン過剰症における脂溶性ビタミン等が挙げられる。

当該病因物質の吸着剤とは、血中やリンパ液中で上記病因物質を吸着する能力を有する物質であり、例えばＬＤＬ吸着剤としては、アスパラギン酸、グルタミン酸等を含むアニオン性ポリペプチド、デキストラン硫酸等のポリサッカライド等アニオン性基を有する高分子あるいは低分子化合物、カルボキシル基などのアニオン性基を含むポリマーなどが挙げられ、これらのうちデキストラン硫酸又はその塩が特に好ましい。デキストラン硫酸としては分子量３，０００〜２００，０００のものが挙げられるが、このうち分子量３，０００〜５０，０００のものが好ましく、分子量３６，０００〜５０，０００のものがさらに好ましい。また、デキストラン硫酸１分子あたりの硫黄原子の含有量が、３〜１０重量％のものが好ましい。さらにデキストラン硫酸の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩が挙げられ、このうちナトリウム塩が好ましい。また、ベータ２ミクログロブリン吸着剤としては、特異的に認識するペプチドや抗体、さらには、特異的な吸着作用のある水酸化リン酸カルシウム等が挙げられ、抗体の吸着剤としては、抗体と特異的結合するプロテインＡを挙げることができる。

前記病因物質を代謝又は排泄する能力を有する臓器又は細胞としては、肝臓、肝細胞、腎臓、腎細胞、脾臓、肺、尿細管が挙げられる。このうち、肝臓、肝細胞、腎臓、腎細胞等がより好ましく、特に肝臓、肝細胞が特に好ましい。

当該臓器又は細胞に特異的なリガンドとしては、前記臓器又は細胞に存在するレセプターに結合するリガンドが挙げられ、このうち、前記臓器又は細胞に存在するレセプターに結合し、取り込まれる能力を有するリガンドが好ましい。このように、リガンド自体が、前記臓器又は細胞に結合した後、取り込まれる能力があれば、そのリガンドに結合している病因物質も一緒に取り込まれるからである。

そのようなリガンドのうち、例えば肝臓又は肝細胞に特異的なリガンドとしては、アシアロオロソムコイドレセプターリガンド（ガラクトース、ラクトース、モノガラクトシルジアシルグリセロール、アガロース、カラギーナン等）、ＬＤＬ、Ｆａｓ、アルブミン、ＡｐｏＥ、ＡｐｏＢ等が挙げられる。これらのうち、アシアロオロソムコイドレセプターリガンドであるガラクトース、あるいはＬＤＬが好ましい。

前記吸着剤とリガンドとは、リンカーを介して結合させてもよいし、直接結合させてもよい。リンカーとしては、例えば、プロピレンジアミン、トリメチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、ポリエチレングリコール等のジアミン又はグリコールの両端にカルボニル基を介したもの等が挙げられる。具体的には、−ＣＯＮＨ−（ＣＨ_２）_ｌ−ＮＨＣＯ−、−ＣＯ−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｍ−ＯＣＯ−（ここでｌ、ｍは１〜１００の数を示す）が挙げられる。

前記吸着剤とリガンドとの結合（リンカーを介する場合も含む）は、例えばアミド結合の形成反応、ウレタン結合の形成反応、尿素結合の形成反応、エステル結合の形成反応、ジスルフィド結合の形成反応、エーテル結合の形成反応等の共有結合を形成する形成反応、抗体抗原反応による吸着、イオン性結合、疎水性相互作用などの非共有結合を形成する形成反応等、特にその構造を限定することなく行われる。例えばデキストラン硫酸とガラクトースの結合の場合には、リンカーを介し、ウレタン結合の形成反応によりリガンドと吸着剤を結合させることがより好ましい。
以下に、デキストラン硫酸にガラクトースを導入する場合の反応例を示す。

（式中、Ｒはスルホン酸残基又は水素原子を示し、Ａは脱離基を示し、ｎは１〜１００の整数を示す。）

工程１はデキストラン硫酸に活性化剤を作用させ、デキストラン硫酸の一部にアミノ基と反応する中間体を導入する反応である。
ここで、活性化剤とは水酸基を活性化させるために使用される試薬であれば制限はなく、例えばカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、Ｎ，Ｎ’−ジサクシイミジルカルボネート（ＤＳＣ）等が挙げられ、イミダゾールカルバメート基、およびサクシイミジルカルバメート基が導入される。反応溶媒は、ホルムアミド、ＤＭＳＯ等を使用することができる。反応温度は０〜４０℃で行うことができ、２５〜３７℃で行うことが好ましい。反応時間は０．５〜１２時間、特に１〜３時間が好ましい。

工程２は、工程１で得たカルボニル基を有するデキストラン硫酸にアルキレンジアミンを作用させ、アミド基を形成させる反応である。
ここで、アルキレンジアミンとしては、直鎖で炭素数１〜１００のものを使用することができ、好ましくは炭素数３〜５０のアルキレンジアミンを使用することが好ましい。反応溶媒は、ホルムアミド、ＤＭＳＯ等を使用することができる。反応温度は０〜４０℃で行うことができ、２５〜３７℃で行うことが好ましい。反応時間は０．５〜２４時間、特に５〜１６時間が好ましい。
また、工程１と工程２はワンポットで同時に行ってもよい。

工程ｉは、ガラクトースに活性化剤を作用させ、ガラクトースにアミノ基と反応する中間体を導入する反応である。
ここで、活性化剤は前記と同様である。反応溶媒は、ホルムアミド、ＤＭＳＯ等を使用することができる。反応温度は０〜４０℃で行うことができ、２５〜３７℃で行うことが好ましい。反応時間は０．５〜１２時間、特に１〜３時間が好ましい。

工程３は、工程２で得られた化合物のアミノ基と工程ｉで得られた化合物でウレタン結合を形成させ、目的のデキストラン硫酸にガラクトースを導入した化合物を得る反応である。
ここで、反応溶媒は、ホルムアミド、ＤＭＳＯ等を使用することができる。反応温度は０〜４０℃で行うことができ、２５〜３７℃で行うことが好ましい。反応時間は０．５〜２４時間、特に１５〜２１時間が好ましい。

デキストラン硫酸１モルに対して、ガラクトースを１５０〜２００モル反応させることが好ましい。デキストラン硫酸１モルに対して、ガラクトース１〜２０モルを修飾したものが好ましい。

工程４は、抗体に切断試薬を作用させ抗体のＦｃ領域を切断する反応である。ここで、切断試薬としてはＦｃ領域の一部もしくはすべてを切断できる化学薬品ならびに酵素等であれば制限はなく、特にペプシンが好ましい。反応溶媒はリン酸緩衝液やトリス緩衝液など反応を阻害することなく、抗体の活性を保持できる溶媒を使用することができる。反応温度は、０〜１００℃で行うことができ、２５〜４０℃で行うことが好ましい。反応時間は、０．５〜４８時間、特に２４〜４８時間が好ましい。

工程５は、工程４で得られたＦ（ａｂ’）_２抗体に対して、還元剤を作用させジスルフィド結合を切断する反応である。
ここで、還元剤は、抗体のジスルフィド結合を切断できる試薬を指し、特に２−メルカプトエチルアミンやジチオスレイトール等を使用することが好ましい。反応時間は、３０分から１２時間で行うことができ、６０分〜９０分で行うことが好ましい。また、反応温度は４〜４０℃、特に３０〜４０℃が好ましい。

工程６は、工程２で得られたアミノ基導入デキストラン硫酸に対して活性化剤を作用させ、工程５で得られた抗体と反応できる中間体を作製する反応である。
ここで、活性化剤としてはアミノ基を活性化させるために使用される試薬であれば制限はなく、例えばスルホサクシイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ）、Ｎ−サクシイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート等が挙げられる。反応溶媒は、水、ＤＭＳＯ等を使用することができる。反応温度は０〜５０℃で行うことができ、２５〜３７℃で行うことが好ましい。反応時間は０．５〜１２時間、特に１〜５時間が好ましい。

工程７は、工程６で得られた化合物と工程５で得られたチオール基でチオエーテル結合を形成させ、目的のデキストラン硫酸にＦ（ａｂ’）_２抗体を導入した化合物を得る反応である。
ここで、反応溶媒はＤＭＳＯ、緩衝液を使用することができる。反応温度は０〜５０℃で行うことができ、２５〜３７℃で行うことが好ましい。反応時間は０．５〜７２時間、特に１２〜４０時間が好ましい。Ｆ（ａｂ’）_２抗体１モルに対してデキストラン硫酸を１０００〜２０００モル反応させることが好ましい。

工程８は、工程２で得られたアミノ基導入デキストラン硫酸に対して活性化剤を作用させ、プロテインＡと反応できる中間体を作製する反応である。
ここで、活性化剤としてはアミノ基を活性化させるために使用される試薬であれば制限はなく、例えばジサクシイミジル タータレート（ＤＳＴ）、グリコビス（サクシイミジルサクシネート）（ＥＧＳ）等が挙げられる。反応溶媒は、水、ＤＭＳＯ等を使用することができる。反応温度は０〜５０℃で行うことができ、２５〜３７℃で行うことが好ましい。反応時間は０．５〜１２時間、特に１〜３時間が好ましい。

工程９は、工程８で得られた化合物とプロテインＡのアミノ基でアミド結合を形成させ、目的のデキストラン硫酸にプロテインＡを導入した化合物を得る反応である。
ここで、反応溶媒としてはＤＭＳＯ、緩衝液を使用することができる。反応温度は０〜５０℃で行うことができ、４〜３７℃で行うことが好ましい。反応時間は、０．５〜７２時間、特に１２〜４０時間が好ましい。プロテインＡに対して、デキストラン硫酸を０．５〜１００モル反応させることが好ましい。

本発明化合物を投与すると、血中又はリンパ液中において、前記吸着剤の作用により病因物質を吸着し、かつ前記リガンドの作用により前記臓器又は細胞に結合し、取り込まれる。その後、病因物質がその臓器又は細胞において代謝又は排泄される結果、血中又はリンパ液中から病因物質の体内レベルが低下する。従って、本発明化合物は、血中又はリンパ液中に存在する病因物質に起因する疾患の予防及び／又は治療剤として有用である。

本発明における好ましい実施形態としては、ＬＤＬ吸着剤とアシアロオロソムコイドレセプターリガンドとをリンカーを介して又は介さずに結合した化合物が挙げられる。特に、デキストラン硫酸とガラクトースとをリンカーを介して又は介さずに結合した化合物（以下、デキストラン硫酸−ガラクトース修飾体ともいう。）が好ましい。これによると、優れたＬＤＬ低下作用を示し、高脂血症の予防及び／又は治療剤とすることができる。すなわち、デキストラン硫酸−ガラクトース修飾体のデキストラン硫酸部に血中ＬＤＬが吸着し、これが肝臓に到達すると、今度はデキストラン硫酸−ガラクトース修飾体のガラクトース部が、肝細胞表面に広く存在するアシアロオロソムコイドレセプターに作用し、従来ＬＤＬが作用する部位ではない経路から薬剤が代謝経路をスイッチングするメカニズム（メタボリックスイッチング機構）に基づいて血中ＬＤＬが肝細胞内に取り込まれ、肝臓で分解される。この機構において高分子量体であるデキストラン硫酸−ガラクトース修飾体の側鎖には複数のガラクトース部が導入されているため、アシアロオロソムコイドレセプターに対する修飾体側鎖のガラクトースの結合は、ガラクトース単体での結合よりも促進される。このため、高分子化合物であるデキストラン硫酸−ガラクトース修飾体は肝臓を介してより効率的に血中ＬＤＬを低減することが可能になる。

また、別の好ましい実施形態としては、ベータ２ミクログロブリン吸着剤と肝細胞特異的なリガンドもしくはリガンドに吸着できる分子を併せ持つ化合物が挙げられる。特に、ベータ２ミクログロブリン抗体で修飾したデキストラン硫酸と肝細胞特異的なリガンドであるＬＤＬから構成される複合体が好ましい。これによると、優れたベータ２ミクログロブリン取り込み作用を示し、透析アミロイドーシスの予防及び／又は治療剤とすることができる。すなわち、ベータ２ミクログロブリン抗体で修飾したデキストラン硫酸のデキストラン硫酸部に別途投与された、あるいは体内に存在しているＬＤＬが吸着して上記複合体が生成し、このベータ２ミクログロブリン抗体部分がベータ２ミクログロブリンを吸着する。そして、これが肝細胞に到達すると、今度はこの複合体のＬＤＬ部が、肝細胞表面に広く存在するＬＤＬレセプターに作用し、ベータ２ミクログロブリンがメタボリックスイッチング機構に基づいて肝細胞内に取り込まれ、肝臓で分解される。また、予め、ベータ２ミクログロブリン抗体−デキストラン硫酸−ＬＤＬ複合体を作製しておき、これを投与してもよい。

さらにまた、別の好ましい実施形態としては、抗体吸着剤と肝細胞特異的なリガンドもしくはリガンドに吸着できる分子を併せ持つ化合物が挙げられる。特に、プロテインＡで修飾したデキストラン硫酸と肝細胞特異的なリガンドであるＬＤＬから構成される複合体が好ましい。これによると、優れた抗体取り込み作用を示し、例えば特発性拡張型心筋症の予防及び／又は治療剤とすることができる。すなわち、プロテインＡで修飾したデキストラン硫酸のデキストラン硫酸部に別途投与された、あるいは体内に存在しているＬＤＬが吸着して上記複合体が生成し、このプロテインＡ部分が抗体を吸着する。そして、これが肝細胞に到達すると、今度はこの複合体のＬＤＬ部が、肝細胞表面に広く存在するＬＤＬレセプターに作用し、抗体がメタボリックスイッチング機構に基づいて肝細胞内に取り込まれ、肝臓で分解される。また、予め、プロテインＡ−デキストラン硫酸−ＬＤＬ複合体を作製しておき、これを投与してもよい。

このようにメタボリックスイッチング機構では血中に蓄積した病因物質にとって直接関与する経路ではない代謝経路へと化合物が代謝誘導することによってその物質の代謝・排出を促進させることができる。

本発明の医薬は、本発明化合物を有効成分とするものであり、この投与形態は、特に限定されず治療目的に応じて適宜選択でき、例えば、経口用固形製剤、経口用液体製剤、注射剤、坐剤、外用剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、貼付剤とのいずれでもよく、これらの投与形態は、薬学的に許容される担体を配合し、当業者に公知慣用の製剤方法により製造できる。

経口用固形製剤を調製する場合は、本発明化合物に賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を加えた後、常法により錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等を製造することができる。そのような添加剤としては、当該分野で一般的に使用されているものでよく、例えば、賦形剤としては、乳糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、微結晶セルロース、珪酸等を、結合剤としては、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ゼラチン液、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン等を、崩壊剤としてはカンテン末、炭酸水素ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド等を、滑沢剤としては精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール等を、着色剤としては、β−カロチン、黄色三二酸化鉄、カルメラ等を、矯味剤としては白糖、橙皮等を例示できる。

経口用液体製剤を調製する場合は、本発明化合物に矯味剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤等を加えて常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等を製造することができる。そのような添加剤としては、当該分野で一般的に使用されているものでよく、例えば矯味剤としては白糖等が、緩衝剤としてはクエン酸ナトリウム等が、安定化剤としてはトラガント等が、保存剤としてはパラオキシ安息香酸エステル等が挙げられる。

注射剤を調製する場合は、本発明化合物にｐＨ調節剤、安定化剤、等張化剤等を添加し、常法により皮下、筋肉及び静脈内注射剤を製造することができる。そのような添加剤としては、当該分野で一般的に使用されているものでよく、例えばｐＨ調節剤としては、リン酸ナトリウム等が、安定化剤としてはピロ亜硫酸ナトリウム等が、等張化剤としては、塩化ナトリウム、等が例示できる。

坐薬を調製する場合は、本発明化合物に担体、界面活性剤を加えて常法により製造することができる。そのような添加剤としては、当該分野で一般的に使用されているものでよく、例えば、担体としてはポリエチレングリコール、ハードファット等を、界面活性剤としてはポリソルベート８０等を例示できる。

外用剤を調製する場合は、本発明化合物に基剤、水溶性高分子、溶媒、界面活性剤、保存剤等を加えて、常法により液剤、クリーム剤、ゲル剤、軟膏剤等を製造することができる。基剤としては、流動パラフィン、白色ワセリン、精製ラノリン等が、水溶性高分子としてはカルボキシビニルポリマー等が、溶媒としてはグリセリン、水等が、界面活性剤としてはポリオキシエチレン脂肪酸エステル等が、保存剤としては、パラオキシ安息香酸エステル等が挙げられる。

点眼剤を調製する場合は、本発明化合物にｐＨ調節剤、安定化剤、等張化剤、保存剤等を加えて常法により製造することができる。そのような添加剤としては、当該分野で一般的に使用されているものでよく、例えば、ｐＨ調節剤としては、リン酸ナトリウム等を、安定化剤としては、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ等を、等張化剤としては、塩化ナトリウム等を、保存剤としては、クロロブタノール等を例示できる。

点鼻剤を調製する場合は、本発明化合物にｐＨ調節剤、安定化剤、等張化剤、保存剤等を加えて常法により製造することができる。そのような添加剤としては、当該分野で一般的に使用されているものでよく、例えば、ｐＨ調節剤としてはリン酸ナトリウム等を、安定化剤としては、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ等を、等張化剤としては、塩化ナトリウム等を、保存剤としては、塩化ベンザルコニウム等を例示できる。

点耳剤を調製する場合は、本発明化合物にｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、保存剤等を加えて常法により製造することができる。そのような添加剤としては、当該分野で一般的に使用されているものでよく、例えば、ｐＨ調節剤及び緩衝剤としてはリン酸ナトリウム等を、安定化剤としてはピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ等を、等張化剤としては、塩化ナトリウム等を、保存剤としては、塩化ベンザルコニウム等を例示できる。

貼付剤を調製する場合は、本発明化合物に粘着剤、溶媒、架橋剤、界面活性剤等を加えて常法により含水型貼付剤、プラスター貼付剤等を製造することができる。そのような添加剤としては、当該分野で一般的に使用されているものでよく、例えば、粘着剤としてはポリアクリル酸部分中和物、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリアクリル酸２−エチルヘキシル、スチレン−イソプレン−スチレンブロック共重合体等を、溶媒としてはグリセリン、水等を、架橋剤としては、ジヒドロキシアルミニウムアミノアセテート、乾燥水酸化アルミニウムゲル等を、界面活性剤としては、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル等を例示できる。

本発明の医薬の投与量は年齢、体重、症状、投与形態及び投与回数などによって異なるが、通常は成人に対して本発明化合物として１日１〜１０００ｍｇを１回又は数回に分けて経口投与又は非経口投与するのが好ましい。

以下、実施例により本発明を詳細に説明する。本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１ デキストラン硫酸−ガラクトース結合体の合成
２５ｍＬの溶媒ホルムアミド中に、分子量３万６千〜５万の可溶性デキストラン硫酸（１２５ｍｇ、２．５〜３．４μｍｏｌ）、リンカー分子として１，６−ヘキサメチレンジアミンを６７．４（ｍｇ）（５８１μｍｏｌ）、及び活性化剤として、１，１’−カルボニルジイミダゾール（７８ｍｇ、４８４μｍｏｌ）を添加し、３７℃、１９時間反応し、デキストラン硫酸の側鎖の水酸基に対してリンカー１，６−ヘキサメチレンジアミンを導入した。
次いで、１０ｍＬのホルムアミド中にＤ−（＋）−ガラクトース（３４．７ｍｇ、１９３μｍｏｌ）を添加し、活性化剤として１，１’−カルボニルジイミダゾール（３７．５ｍｇ、２３２μｍｏｌ）を添加し、３７℃、２時間反応させた。その後、ヘキサメチレンジアミンを導入したデキストラン硫酸（５６ｍｇ、１．１〜１．５μｍｏｌ）添加して、３７℃、２１時間反応させ、定法により精製・単離し、標題の化合物（３３ｍｇ、０．６〜０．９μｍｏｌ、収率５５％）を得た。

^１Ｈ−ＮＭＲ：デキストラン硫酸、ガラクトースのプロトン（δ３．２−５．２ｐｐｍ）、リンカーのメチレンのプロトン（δ１．２−１．６ｐｐｍ）

実施例２ 血中ＬＤＬ低下作用
実施例１で合成した薬剤の毒性や有効性を調べるため、ＬＤＬ受容体・アポＥダブルノックアウトマウス（ｎ＝２）に対して２ｇ／Ｌのデキストラン硫酸−ガラクトース溶液（０．１ｍＬ）および、コントロールとして２ｇ／Ｌのデキストラン硫酸溶液（０．１ｍＬ）を１回頸動脈より注射し、血中コレステロール値をコレステロールオキシダーゼ・ＤＡＯＳ法によりモニターした。その結果を、図１に示す。
図１から、デキストラン硫酸−ガラクトース修飾体を投与した群においてのみ、２日にわたって、コントロール（非修飾デキストラン硫酸の投与群）に比較して、優位な血中コレステロール値の低下が認められた。

実施例３ デキストラン硫酸−ベータ２ミクログロブリン抗体の合成
ペプシン酵素固定化樹脂を２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）により洗浄し、１ｍＬの酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に懸濁させ、ベータ２ミクログロブリン抗体５０μｇを添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。その後、１５０００ｒｐｍで３分間遠心し、上澄み１ｍＬを回収し、１００ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を３０μＬ加えて中和させた。その後、プロテインＡ固定化カラムに未反応物を精製し、Ｆ（ａｂ’）_２抗体を得た。次いで、得られたＦ（ａｂ’）_２抗体１９０μｇに対して、２−メルカプトエチルアミンを１２ｍｇ加え、ＰＢＳで１ｍＬとした。３７℃で２時間インキュベートした後に、セファデックスＧ−２５カラムで精製し、限外濾過膜（３ｋＤａカット）を用いて濃縮してＦ（ａｂ’）_２還元型抗体溶液を５００μＬ得た。
次いで、実施例１で示した条件と同様の手順により作製したヘキサメチレンジアミンを導入したデキストラン硫酸（７２ｍｇ、１．０〜１．３μｍｏｌ）に対して、ｓｕｌｆｏＳＭＣＣ（１００ｍｇ，２２９μｍｏｌ）を添加し、１５ｍＬのリン酸緩衝液中で３７℃、５時間反応させ、限外濾過膜（３ｋＤａカット）により濃縮後、アミノ基を活性化したデキストラン硫酸５００μＬを得た。その後、Ｆ（ａｂ’）２還元型抗体溶液を５００μＬと混合し、３７℃で４０時間反応させた。その後５ｍＭのシステイン溶液を当量加えて、３７℃で５時間反応させた後に、限外濾過膜により反応物を濃縮し標題の化合物（７９μｇ（ＢＣＡ法によるタンパク定量より算出））を得た。図２に、合成したデキストラン硫酸−ベータ２ミクログロブリン抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより泳動した結果を示す。

実施例４ 血中ベータ２ミクログロブリン低下作用
ヒト肝細胞であるＨｅｐＧ２細胞を９６穴プレートに４．５×１０^３個／穴の密度で播種し、２４時間インキュベートした。その後、培地１ｍＬに低密度リポプロテイン（ＬＤＬ）（０．１μｇ、１．８ｐｍｏｌ）とフルオレセイン修飾ベータ２ミクログロブリン（Ｆ−βＩＩＭＧ）（３１μｇ、２．６ｎｍｏｌ）、合成したデキストラン硫酸−ベータ２ミクログロブリン抗体（ＤｅｘＳ−βＩＩＭＧ）（２．３μｇ、２６ｎｍｏｌ）を加えて、９６穴プレートに添加し、３７℃で３時間インキュベートした。その後、細胞を１００μＬのリン酸緩衝液で洗浄した後、細胞を溶解させてその溶液の蛍光強度を測定した。その結果を図３に示す。
図３より、コントロールとなるＬＤＬが添加されてない培地およびデキストラン硫酸−ベータ２ミクログロブリン抗体が添加されてない培地に比べて、ＬＤＬおよびデキストラン硫酸−ベータ２ミクログロブリン抗体が添加された培地の場合では、細胞内へベータ２ミクログロブリンが多く取り込まれることが認められた。つまり、ベータ２ミクログロブリンは、ＬＤＬ−デキストラン硫酸−ベータ２ミクログロブリン抗体複合体によりＨｅｐＧ２細胞へ特異的に取り込まれたことがわかる。

実施例５ デキストラン硫酸−プロテインＡの合成
実施例１で示した条件と同様の手順により作製したヘキサメチレンジアミンを導入したデキストラン硫酸（１．４ｍｇ、２３ｎｍｏｌ、アミノ化率６１．３％／ユニット）に対して、ＤＳＴ（４．４ｍｇ、１２．８８μｍｏｌ）を添加し、２００μＬの０．２Ｍ炭酸ナトリウム酸緩衝（ｐＨ９．４）中で室温、１時間反応させ、限外濾過膜（３０ｋＤａ）により精製・濃縮後、アミノ基を活性化したデキストラン硫酸２５０μＬを得た。その後、プロテインＡ溶液を１００μＬ（１ｍｇ、２３ｎｍｏｌ）と混合し、３７℃で４０時間反応させた。その後、限外濾過膜（５０ｋＤａ）により精製し反応物を濃縮し標題の化合物（１６９μｇ（ＢＣＡ法によるタンパク定量より算出））を得た。図４に、合成したデキストラン硫酸−プロテインＡをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより泳動した結果を示す。

実施例６ 血中抗体低下作用
ヒト肝細胞であるＨｅｐＧ２細胞を９６穴プレートに４．５×１０^３個／穴の密度で播種し、２４時間インキュベートした。その後、低密度リポプロテイン不含血清１０％を含む培地（ＬＤＬ不含培地）を１００μＬ加えて、３時間あるいは２４時間インキュベートした。その後、ＬＤＬ不含培地１ｍＬに低密度リポプロテイン（ＬＤＬ）（０．１μｇ、１．８ｐｍｏｌ）とフルオレセイン修飾ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（２７．３μｇ、１８２ｐｍｏｌ）、合成したデキストラン硫酸-プロテインＡ（２．０４μｇ、１８．２ｐｍｏｌ）を加えて、９６穴プレートに１００μＬ加えて３７℃で３時間インキュベートした。その後、細胞を１００μＬのリン酸緩衝液で洗浄し、細胞を溶解させてその溶液の蛍光強度を測定した。その結果を図５に示す。
図５より、デキストラン硫酸−プロテインＡが添加されていない培地、およびＬＤＬが添加されていない培地に比べて、ＬＤＬおよび合成したデキストラン硫酸−プロテインＡが添加された培地では、有意に蛍光修飾抗体の取り込みが増加していることがわかる。つまり、合成したデキストラン硫酸−プロテインＡは、ＬＤＬ−デキストラン硫酸−プロテインＡ複合体形成により、抗体をＨｅｐＧ２細胞へ特異的に取り込ませる能力があることがわかる。

Claims (10)

1. （Ａ）デキストラン硫酸又はその塩の水酸基と、（Ｂ）ガラクトース、ラクトース、モノガラクトシルジアシルグリセロール、アガロース及びカラギーナンから選ばれるアシアロオロソムコイドレセプターリガンドとを、ジアミン又はグリコールの両端にカルボニル基を有するリンカーを介して結合させてなる薬剤。
2. （Ｂ）アシアロオロソムコイドレセプターリガンドがガラクトースである請求項１記載の化合物。
3. （Ａ）デキストラン硫酸又はその塩の水酸基と抗ベータ２ミクログロブリン抗体とをジアミン又はグリコールの両端にカルボニル基を有するリンカーを介して修飾された抗ベータ２ミクログロブリン抗体と、（Ｂ）ＬＤＬとを、ジアミン又はグリコールの両端にカルボニル基を有するリンカーを介して又は介さずしてアミド結合、ウレタン結合、尿素結合、エステル結合、ジスルフィド結合若しくはエーテル結合の形成反応、イオン性結合又は疎水性相互作用により結合させてなる薬剤。
4. （Ａ）デキストラン硫酸又はその塩の水酸基とプロテインＡとをジアミン又はグリコールの両端にカルボキシル基を有するリンカーを介して修飾されたプロテインＡと、（Ｂ）ＬＤＬとを、ジアミン又はグリコールの両端にカルボニル基を有するリンカーを介して又は介さずしてアミド結合、ウレタン結合、尿素結合、エステル結合、ジスルフィド結合若しくはエーテル結合の形成反応、イオン性結合又は疎水性相互作用により結合させてなる薬剤。
5. 請求項１又は２に記載の薬剤を有効成分とする血中ＬＤＬ低下剤。
6. 請求項３に記載の薬剤を有効成分とする血中ベータ２ミクログロブリン低下剤。
7. 請求項４に記載の薬剤を有効成分とする血中抗体低下剤。
8. 請求項１又は２に記載の薬剤を有効成分とする高脂血症の予防及び／又は治療剤。
9. 請求項３に記載の薬剤を有効成分とする透析アミロイドーシスの予防及び／又は治療剤。
10. 請求項４に記載の薬剤を有効成分とする特発性拡張型心筋症の予防及び／又は治療剤。

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