JPH08253430A

JPH08253430A - Ｌｄｌレセプター媒介薬物輸送方法

Info

Publication number: JPH08253430A
Application number: JP7059574A
Authority: JP
Inventors: Hirofumi Yura; 洋文由良; Mitsuaki Goto; 光昭後藤; Toshihiro Akaike; 敏宏赤池
Original assignee: Kanagawa Academy of Science and Technology
Current assignee: Kanagawa Academy of Science and Technology
Priority date: 1995-03-17
Filing date: 1995-03-17
Publication date: 1996-10-01

Abstract

(57)【要約】【目的】ＬＤＬレセプターを介して選択的に細胞に取
り込まれ、安定かつ効率的に供給できる担体を用いた薬
物輸送方法を提供する。【構成】ＬＤＬレセプター選択的薬物輸送担体に薬物
を担持させて薬剤とし、この薬剤をＬＤＬレセプターを
有する細胞に適用し、ＬＤＬレセプターを介して選択的
に取り込ませることにより、薬物を輸送するＬＤＬレセ
プター媒介薬物輸送方法であって、その担体は、薬物を
化学結合、疎水性相互作用、または硫酸結合部位を介し
て担持させたＬＤＬ、あるいは末端グルコース構造を有
する側鎖を持つアミノ基含有高分子からなる。【効果】天然物または合成物からなり、容易に採取ま
たは合成できる担体を用いるので、安定かつ効率的に薬
物輸送できる。ＬＤＬレセプターを有する肝実質細胞、
増殖細胞、または癌細胞などに選択的に薬物輸送するこ
とができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ＬＤＬレセプターとの
特異的相互作用に基づき肝実質細胞や癌細胞等に選択的
に取り込まれるＬＤＬ及びそのモデル化合物を利用した
薬物輸送方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】生体内には、酵素反応、抗原−抗体反応
等の様々な特異的反応が存在し精致な生体系を構成して
いるが、今日それらの生体反応をモデルとするバイオミ
メティックなシステムの研究が種々の分野で盛んに行わ
れている。例えば、細胞や組織による特異的な分子認識
性を利用して、その細胞や組織に選択的に薬物を輸送す
るドラッグ・デリバリー・システム（ＤＤＳ）等がその
一例である。

【０００３】血漿中リポタンパク質の一つである低密度
リポタンパク質（ＬＤＬ）は、血中コレステロールの主
要運搬体として知られ、肝細胞や増殖細胞等の表面に存
在するＬＤＬレセプターに選択的に結合して細胞内に取
り込まれる。

【０００４】増殖できる哺乳類の細胞、例えば、白血
球、上皮細胞、内皮細胞等はＬＤＬレセプターを備えて
おり、このＬＤＬレセプターを介してコレステロールを
担持したＬＤＬが選択的に細胞内に取り込まれ、そのコ
レステロールを原料として細胞膜を合成して増殖する。
しかし、赤血球のような非増殖細胞には、活性なＬＤＬ
レセプターが存在しないことが知られている。また、肝
実質細胞のようにＬＤＬ等のリポタンパク質自身を代謝
する細胞、あるいは悪性の脱分化状態にある癌細胞等に
は概して高いＬＤＬレセプター活性が存在し、活発にＬ
ＤＬを取り込んでいる。

【０００５】従って、このようなＬＤＬに選択的に取り
込まれる物質に薬物を担持させることにより、その薬剤
をＬＤＬレセプターを介して細胞内に取り込ませ、増殖
細胞、肝実質細胞、あるいは癌細胞等の目的とする細胞
に選択的に作用させるＤＤＳを構成することが期待され
ていた。

【０００６】しかしながら従来は、ＬＤＬをヒトから採
取する場合が多く、健常なヒトではＬＤＬ濃度が低いた
め効率的にＬＤＬを採取することは困難であり、その効
率を上げるためには、高脂血症等の病人から採取しなけ
ればならず不適当であった。また、ネズミのような小動
物からでは採取量が限られており、やはり安定的にＬＤ
Ｌを入手することは困難であった。よって、薬物輸送担
体としてのＬＤＬを安定かつ高効率で供給する方策が求
められていた。

【０００７】本発明者らは、上記事情に鑑み、ＬＤＬレ
セプターに選択的に取り込まれる物質を、天然物質及び
合成物質の両面から鋭意検討した結果、例えば高脂血症
ウサギの血液からＬＤＬが効率よく得られること、並び
に末端マルトースの側鎖を有するアミノ基含有高分子が
ＬＤＬレセプターに選択的に取り込まれること、さらに
はＬＤＬとＬＤＬレセプターとの相互作用における電荷
の影響等の新たな知見を得て本発明をなすに至った。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】よって、本発明におけ
る課題は、入手が容易で安定かつ効率的に供給できる薬
物輸送担体を用いたＬＤＬレセプター媒介薬物輸送方法
を提供することにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】かかる課題は、ＬＤＬレ
セプター選択的薬物輸送担体に薬物を担持させて薬剤と
し、この薬剤をＬＤＬレセプターを有する細胞に適用
し、該薬剤を前記細胞のＬＤＬレセプターを介して選択
的に取り込ませることにより、前記薬物を該細胞に選択
的に輸送することを特徴とするＬＤＬレセプター媒介薬
物輸送方法であって、前記担体がＬＤＬであり、前記薬
剤が該ＬＤＬに薬物を化学結合を介して担持させてなる
か、前記薬剤が該ＬＤＬの疎水性コアに前記薬物を疎水
性相互作用を介して担持させてなるか、または前記薬剤
が該ＬＤＬの硫酸結合部位を介して前記薬物を担持させ
てなる薬物輸送方法、もしくは、前記担体が、末端グル
コース構造を有する側鎖を持つアミノ基含有高分子から
なる薬物輸送方法によって解決できる。以下に本発明の
薬物輸送方法について詳細に説明する。

【００１０】本発明の薬物輸送方法を実施するのに好適
な薬物輸送担体（以下、担体と略記する）の第１の態様
はＬＤＬからなる。このＬＤＬは、ウサギ、イヌ、ネ
コ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル等の哺乳類の血漿から採取
するのが好ましいが、中でも、飼育の容易さや取扱い易
さの点等からウサギを用いるのが好ましく、特に高脂血
症ウサギの血漿から採取したＬＤＬとするのが好まし
い。このＬＤＬは、例えば以下のようにして容易に得る
ことができる。

【００１１】ウサギを、１〜１０重量％、好ましくは５
重量％程度のコレステロールを含む食餌で１カ月以上、
好ましくは３カ月間程度飼育して血漿中のリポタンパク
質濃度を増加させ、好ましくは高脂血症とする。ここで
いう高脂血症とは、高脂質血症を意味し、例えばＷＨＯ
分類によるＩＩａ型やＩＩｂ型高脂質血症のようにＬＤ
Ｌのみが増加している症状の高脂血症でもよいが、それ
に限られるものではい。

【００１２】次いで、その高脂血症のウサギの末梢血液
から、高濃度のリポタンパク質を含む血漿を採取する。
採取した血漿から、従来の方法に従ってＬＤＬを分離、
精製すればよい。例えば、超遠心分離を用いるＨａｔｃ
ｈとＲｅｅｓの方法（Hatch,F.J. and Lees, R.S., Ad
v. Lipid. Res. 6, 1-68 (1968)）等が好適に用いられ
る。

【００１３】本発明の方法にあっては、上述のようにし
て得たＬＤＬからなる担体に、薬物を担持させる。薬物
を担持させる第１の方法においては、ＬＤＬに薬物を化
学結合を介して担持させる。この第１の方法によって担
持させる薬物は、活性な官能基、例えば、イソシアネー
ト基、イソチオシアネート基、オキシラン基、またはア
ルデヒド基等の少なくとも一種を有している薬剤とす
る。このような薬剤を、その活性な官能基とＬＤＬとを
化学結合、好ましくは共有結合させることにより担持さ
せる。

【００１４】例えば、蛍光物質であるフルオレセインイ
ソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を担持させる場合、上述
のＬＤＬ水溶液に、ＦＩＴＣを加えて約４℃で４時間程
度撹拌すればよい。そのような処理をすることにより、
ＬＤＬとＦＩＴＣとが反応して共有結合を形成しＦＩＴ
ＣがＬＤＬに担持される。

【００１５】本発明者らは、ＬＤＬにＦＩＴＣ等の薬物
を化学結合させて調整した薬剤が、ＬＤＬが元来有して
いる特有の沈降特性、及びＬＤＬレセプター選択性を維
持していることを明らかにした。

【００１６】このようにしてＬＤＬにＦＩＴＣを担持さ
せた薬剤は、ＬＤＬレセプターに選択的に結合するの
で、例えば、ＬＤＬレセプターを有する細胞の良好な蛍
光標識剤として作用する。また、ＬＤＬに化学結合を介
して担持させる薬物としては、上記のＦＩＴＣに限られ
るものではなく、ＬＤＬと結合可能な官能基を有する薬
物ならばいかなるものでもよい。

【００１７】本発明の方法において、ＬＤＬに薬物を担
持させる第２の方法は、疎水性相互作用を介して担持さ
せるものである。ＬＤＬ分子は、周囲を極性のシェルに
囲まれた疎水性の中性脂質コアを有するので、そのコア
の疎水性により、疎水性の薬物を包摂することができ
る。この第２の方法で担持される薬物としては、疎水性
のものならばいかなるのもでもよく、例えば、活性なＬ
ＤＬレセプターを有する肝実質細胞に選択的に薬物を輸
送することを意図して、アンスラサイクリン系抗腫瘍
薬、オリゴエン系肝疾患治療薬、ピリミジン系抗腫瘍
薬、β-ラクタム系抗生物質などの脂溶性肝疾患治療薬
を担持させるのも好適である。

【００１８】また、疎水性部分と親水性部分の両方を有
する薬物であっても、その親水性部分を疎水性部分で取
り囲んだミセル様構造を形成して、見かけ上は疎水性表
面を有している薬物も良好に担持される。

【００１９】本発明の方法において、ＬＤＬに薬物を担
持させる第３の方法は、硫酸結合部位を介して前記薬物
を担持させるものである。ＬＤＬは、硫酸基と結合可能
な硫酸結合部位を有することが知られている。従来は、
一般に、ＬＤＬとＬＤＬレセプターとの相互作用は、Ｌ
ＤＬが有する硫酸結合部位の正電荷とＬＤＬレセプター
に存在する負電荷との静電的相互作用が関与するとされ
ていた。しかしながら本発明者らは、ＬＤＬの正電荷を
デキストラン硫酸のようなポリアニオンによってブロッ
クしても、そのブロックしたＬＤＬは、正電荷をブロッ
クされていない天然のＬＤＬと同等にＬＤＬレセプター
に取り込まれることを新たに発見した。

【００２０】このことは、硫酸基を有する薬物をＬＤＬ
の硫酸結合部位に担持させて硫酸結合部位がブロックさ
れたとしても、その薬物を担持したＬＤＬは、目標とす
るＬＤＬレセプターを持つ細胞に選択的に結合し取り込
まれることを意味している。従って、この第３の方法で
ＬＤＬに担持される薬物としては、硫酸基を有する薬物
であれば如何なるものでもよい。また、通常の形態では
硫酸基を有しない薬物であっても、その薬効を維持する
ように硫酸基を導入すれば、そのような薬物も第３の方
法でＬＤＬに担持させることができる。

【００２１】さらに、上記のＬＤＬは、ポリアニオン化
合物を介して複合体を形成する。このＬＤＬ複合体は、
複数のＬＤＬが、それらの硫酸結合部位によってポリア
ニオン化合物を介して結合したものである。このポリア
ニオン化合物としては、負に荷電した官能基を複数個有
する化合物、例えば、硫酸化した多糖類などが好適に使
用されるが、特にデキストラン硫酸が好ましい。ＬＤＬ
とデキストラン硫酸とは、最も強固で安定な複合体を形
成する。このＬＤＬ複合体を調整するには、例えば、デ
キストラン硫酸水溶液にＬＤＬを添加して混合すればよ
い。

【００２２】本発明の方法にあっては、薬剤がこのＬＤ
Ｌ複合体であってもよい。即ち、薬剤が、薬物を担持し
た複数個のＬＤＬのポリアニオン化合物を介した複合体
からなるものである。本発明者らは、このような薬物を
担持したＬＤＬ複合体がＬＤＬレセプターに選択的に結
合して取り込まれることを初めて確認した。また、本発
明の薬剤として用いる場合のＬＤＬ複合体をなすポリア
ニオン化合物は、硫酸化糖類等が好適であるが、デキス
トラン硫酸が特に好ましい。このようなＬＤＬ複合体を
本発明の薬剤として用いると、一度に取り込まれるＬＤ
Ｌ即ち薬物の数が多く、効率的な薬物輸送が達成され
る。

【００２３】本発明の薬物輸送方法を実施するのに好適
な担体の第２の態様は合成担体、即ち、末端グルコース
構造を有する側鎖を持つアミノ基含有高分子からなる。
この担体を構成するアミノ基含有高分子としては、複数
のアミノ基を側鎖とする高分子であれば特に限られない
が、特に、キトサン、ポリアリルアミン等が好ましい。
ただし、このアミノ基含有高分子のアミノ基は、主鎖に
直接結合しているのが好ましく、例えば炭化水素鎖等を
介して結合している場合は、その炭化水素鎖の運動性が
抑制されたものであるのが好ましい。

【００２４】この合成担体は、上記のようなアミノ基含
有高分子のアミノ基の一部に、好ましくは炭化水素鎖を
介して末端にグルコース構造が結合されて構成されてい
る。アミノ基とグルコース構造とを結合する炭化水素鎖
としては、１，２-ジヒドロキシエチル基、ｔｅｒｔ-ブ
チル基のようなかさ高い置換基を有するものが好まし
い。これらの化合物の中でも、下記式（１）で表される
ような化合物が特に好ましい。

【００２５】

【化１】

【００２６】式（１）中のＲ₁及びＲ₂は、ビニル基等の
重合可能なモノマーを重合させたポリマー主鎖の繰り返
し単位である。即ち、アミノ基を側鎖とするモノマー
と、末端グルコース構造含有側鎖を有するモノマーとを
共重合させた構造をなしている。この式（１）の化合物
は、例えばキトサン等のアミノ基含有高分子に、マルト
ビオン酸とを付加することにより容易に合成することが
できる。

【００２７】本発明者らは、このような化合物からなる
合成担体が、ＬＤＬレセプターに選択的に結合すること
を初めて明らかにした。この合成担体は、他のレセプタ
ーとの相互作用が少ないグルコース構造を有することを
特徴とし、ＬＤＬレセプター選択的である。また、この
担体に、第３成分のとして他の官能基を有するモノマー
を共重合させ、さらなる機能を付加してもよい。例え
ば、ガラクトース構造を有するモノマーを共重合させれ
ば、アシアロ糖タンパク質レセプターとの結合性を付加
できるので、目的とする細胞のＬＤＬレセプター活性が
低下しても結合性を維持することが可能になる。

【００２８】本発明の方法では、上述した合成担体に薬
物を担持させる。その方法は、例えば、合成担体が有す
る活性なアミノ基に、蛍光分子やＤＮＡ等の薬物をイオ
ン性結合で固定化してもよいし、アミノ基と共有結合さ
せてもよい。従って、この合成担体に担持させる薬物と
しては、合成担体のアミノ基と結合可能な官能基を有す
る薬物が好ましい。

【００２９】以上述べたように、本発明の薬物輸送方法
では、ＬＤＬからなる第１の態様の担体、ＬＤＬ複合
体、または上記合成担体からなる第２の態様の担体のい
ずれを使用してもよい。これらの担体に担持される薬物
としては、上述のように種々のものが使用可能であり、
目的に応じて適宜選択が可能であるが、担持された薬剤
がＬＤＬレセプターに選択的に取り込まれることから、
活性なＬＤＬレセプターに供給したい薬剤とするのが好
ましい。例えば、ＬＤＬレセプターを有する癌細胞に取
り込まれることを目標として、抗癌剤を担持させた薬剤
としてもよい。

【００３０】本発明の薬物輸送方法では、上記の薬剤の
少なくともひとつを目標とするＬＤＬレセプターを有す
る細胞に適用する。適用方法は特に限られるものではな
く、例えば、培養した細胞に適用する場合には、上述の
薬剤の水溶液を細胞培養容器に添加すればよい。また、
動物の体内の細胞に適用する場合には、上述の薬剤の水
溶液を注射すればよい。さらに、適用する細胞の所在場
所によっては、経口、経腸などの方法を用いてもよい。

【００３１】そのようにして適用された薬剤は、ＬＤＬ
レセプター選択性を有する担体に薬物を担持させたもの
であるため、目標とする細胞のＬＤＬレセプターに選択
的に結合して取り込まれので、担持された薬物を目標と
する細胞に選択的に輸送するＤＤＳが構成される。

【００３２】（実施例１）通常のニホンシロウサギ（Ｃ
ＬＥＡ社より供給）を、５重量％のコレステロールを含
む半合成食餌で３カ月間飼育した。その後、そのウサギ
の末梢血液から、高濃度のリポタンパク質を含む血漿を
採取した。採取した血漿から、超遠心分離を用いるＨａ
ｔｃｈとＲｅｅｓの方法によりＬＤＬを分離、精製し
た。得られたＬＤＬを、ヘパリン-Ｃａ²⁺、デキストラ
ン硫酸−リンタングステン酸、及びＫ-アガーによる特
異的沈降反応により評価したところ、各々の測定値のば
らつきは６％以下であった。

【００３３】上記のＬＤＬを水溶液（２．１ｍｇ／ｍ
ｌ、ｐＨ８．５）とし、その水溶液６０ｍｌに、蛍光物
質であるＦＩＴＣ２５ｍｇを添加して４℃で４時間撹拌
した。ろ過後、２回の遠心分離（５．５×１０³ｒｐ
ｍ、３時間）により未反応のＦＩＴＣを取り除き、ＦＩ
ＴＣで蛍光標識したＬＤＬを得た。

【００３４】次に、このＦＩＴＣで蛍光標識したＬＤＬ
とデキストラン硫酸を混合してＬＤＬ複合体とし、それ
から得られる沈降物のコレステロールの酵素発色を、Ｆ
ＩＴＣ未標識のＬＤＬ沈降物のそれと比較したところ、
ＦＩＴＣ標識したＬＤＬ（５００〜２０００ｍｇ／ｄ
ｌ）の沈降率は未標識ＬＤＬの９７．２％であった。す
なわち、ＦＩＴＣの導入によっても、ヘパリン及びデキ
ストラン硫酸との沈降反応性には影響がないことが確認
された。

【００３５】ラット肝実質細胞、肝癌細胞であるＣｈａ
ｎｇＬｉｖｅｒ（ＣＬ）細胞及びＨｅｐＧ２（Ｈ
Ｇ）細胞、マクロファージ、及びヒト赤血球を用意し、
それらの細胞を公知の方法で精製した後、リン酸緩衝液
（ＰＢＳ）中に懸濁させた。

【００３６】ＦＩＴＣで蛍光標識したＬＤＬ（０．５〜
５．０ｍｇ／ｍｌ）を、１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブ
ミンとＮａＮ₃を含むＰＢＳ中に溶解させた。上記各細
胞の懸濁液（５．０×１０⁵細胞）を遠心して上澄みを
取り除いた後、ＦＩＴＣ標識ＬＤＬ溶液１００μｌを添
加し、アイス・バス中で、時折撹拌しながら４０分間イ
ンキュベーションした。その後、ＮａＮ₃を含むＰＢＳ
で２回洗浄し、５０−１００×１０⁴細胞／ｍｌに希釈
した。

【００３７】希釈した細胞懸濁液を、フローサイトメー
ター（ＦＡＣＳｃａｎ、ベクトン・ディッキンソン・イ
ムノサイトメトリー・システムズ社製）に導入して、各
細胞の蛍光強度を測定した。結果を図１に示す。図１に
おいて、（ａ）はラット肝実質細胞、（ｂ）はＣＬ細
胞、（ｃ）はＨＧ細胞、（ｄ）はマクロファージ、及び
（ｅ）はヒト赤血球で得られた結果を示す。

【００３８】ＬＤＬレセプターを有することが知られて
いる４種の細胞では、ＬＤＬ添加量に伴って蛍光強度が
増加しており、蛍光標識したＬＤＬが細胞表面に結合し
ていること、一方、ＬＤＬレセプターを持たない赤血球
では、ＬＤＬ添加量が増加しても蛍光強度は変化せず、
ＬＤＬが効率的に結合しないことが確認された。

【００３９】（実施例２）実施例１で得たＦＩＴＣで蛍
光標識したＬＤＬを、デキストラン硫酸（第一化学製）
で処理し、ＬＤＬ複合体を合成した。実施例１の蛍光標
識したＬＤＬ及びこのＬＤＬ複合体と、ラット肝実質細
胞との相互作用を以下のように検討した。

【００４０】まず、肝実質細胞を、非標識のＬＤＬ
（２．５ｍｇ／ｍｌ）、アシアロ糖タンパク質（ＡＳＧ
Ｐ）レセプターに対する天然リガンドであるアシアロフ
ェツイン（１００μｇ／ｍｌ）、またはＡＳＧＰレセプ
ターのリガンドのモデル化合物として本発明者らが合成
したガラクトースを側鎖に有するポリマーであるポリ
（Ｎ-ｐ-ビニルベンジル-［Ｏ-β-ガラクトピラノシル-
（１→４）-Ｄ-グルコンアミド］）（ＰＶＬＡと略記、
５０μｇ／ｍｌ）で前処理した。

【００４１】上記各細胞の懸濁液（５．０×１０⁵細
胞）を遠心して上澄みを取り除いた後、蛍光標識したＬ
ＤＬ（２．０ｍｇ／ｍｌ）、またはＬＤＬ複合体（１．
５ｍｇ／ｍｌ）を含み、１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブ
ミンとＮａＮ₃を含むＰＢＳを１００μｌ添加し、アイ
ス・バス中で、時折撹拌しながら４０分間インキュベー
ションした。その後、ＮａＮ₃を含むＰＢＳで２回洗浄
し、５０−１００×１０⁴細胞／ｍｌに希釈した。

【００４２】各細胞の蛍光強度を、実施例１と同様にフ
ローサイトメーターで測定した。比較のため、前処理し
ない肝実質細胞を用いて同様の処理を行った。結果を表
１に示すが、蛍光強度の数値は、前処理していない細胞
で得られた値を１としたときの相対値で表した。

【００４３】

【表１】

【００４４】次に、ＬＤＬレセプターを活性化する１７
α-エチニルエストラジオールを２日間腹腔に注入した
ＳＤラットの肝実質細胞、及び抗ヒトＬＤＬレセプター
モノクローナル抗体で処理したＨＧ細胞及びＣＬ細胞
と、実施例１の蛍光標識したＬＤＬ及び本実施例のＬＤ
Ｌ複合体との相互作用を、上記と同様にして測定した。
結果を表２に示す。

【００４５】

【表２】

【００４６】表１及び表２から明らかなように、本発明
のＬＤＬ及びＬＤＬ複合体と肝実質細胞との相互作用
は、ＡＳＧＰレセプターに選択的に結合するアシアロフ
ェツインやＰＶＬＡには影響されず、非標識のＬＤＬに
は阻害され、ＬＤＬレセプターを活性化するα-エチニ
ルエストラジオールによって促進された。また、肝癌細
胞との相互作用においても、ＬＤＬレセプターに結合す
るモノクローナル抗体によって阻害された。従って、本
発明のＬＤＬ及びデキストラン硫酸を含むＬＤＬ複合体
は、例えばアシアロ糖タンパク質レセプター等ではな
く、ＬＤＬレセプターに選択的に相互作用すること、ま
たその相互作用は、ＬＤＬとＬＤＬ複合体とでほぼ同等
であることが確認された。

【００４７】（実施例３）ＰＶＬＡ及びコラーゲンを被
覆したシャーレ上で、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）
を含むウィリアムＥ（ＷＥ）培地を用いて、ラット肝実
質細胞の一次培養を行った。ＰＶＬＡ上では、球状の細
胞集合体が形成され、コラーゲン上では、平面多角形状
の細胞が得られた。これらの培地に、実施例１及び２の
ＬＤＬ及びＬＤＬ複合体を添加して、各細胞によるアル
ブミン及び胆汁酸の分泌量を測定した。結果を表３に示
す。各分泌量は、ＬＤＬまたはＬＤＬ複合体を添加しな
い細胞の分泌量を１とする相対値で表した。

【００４８】

【表３】

【００４９】本発明のＬＤＬ及びＬＤＬ複合体は、同様
にＬＤＬレセプターを介して肝実質細胞に取り込まれ、
肝実質細胞の分化機能であるアルブミン及び胆汁酸の分
泌能に、類似の影響を与えていることがわかる。

【００５０】（実施例４）所定量のデキストラン硫酸を
含むＷＥ媒地を使用した以外は実施例３と同様にして肝
実質細胞の一次培養を２４時間行った。その後、培養し
た肝実質細胞のアルブミン及び胆汁酸の分泌量を測定し
た。ＰＶＬＡ被覆シャーレ上で培養した細胞の結果を図
２に、コラーゲン被覆シャーレ上で培養した細胞の結果
を図３に示す。但し、図中（ａ）は細胞１０×１０⁶個
当たりのアルブミン分泌量を、（ｂ）は細胞１０×１０
⁶個当たりの胆汁酸分泌量を示している。

【００５１】図２及び図３から、デキストラン硫酸の量
が１０μｇ／ｍｌ以下では影響が見られないが、１００
μｇ／ｍｌを越えるといずれの分泌量も著しく低下す
る。しかし、１００μｇ／ｍｌ以上の濃度は、培地を粘
調にするほどの濃度であり、浸透圧等の影響で低下した
ものと考えられる。一方、ＬＤＬ複合体には、その中に
培地を粘調にするほどのデキストラン硫酸は存在しない
ことは明白である。

【００５２】（実施例５）直径０．５μｍで、表面にア
ミノ基またはアルデキド基を導入した蛍光性ビーズ（Ｆ
ｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ^R、モレキュラー・プローブ社
製、ＦＩＴＣで標識）を用意した。表面にアルデヒド基
を導入した蛍光性ビーズは、水素化ホウ素ナトリウムで
処理した後、エチレンジアミン、またはトリエチレンテ
トラミンで処理して長さの異なるアミノ基を導入した。
それら３種のアミノ基を有する蛍光性ビーズを、ビーズ
１ｍｇ当たり３３ｎｇ／ｍｌまたは２００ｎｇ／ｍｌの
濃度でマルトビオン酸を仕込んだ溶液中に添加し、室温
で１６時間撹拌することにより、図４（ａ）、（ｂ）、
及び（ｃ）に示すような末端グルコース構造を導入した
アミノ基含有蛍光性ビーズを調整した。

【００５３】得られた各蛍光性ビーズに導入された末端
グルコース構造の量を見積もるため、各蛍光性ビーズ表
面に残存するアミノ基を塩化物イオンで交換したときの
交換量を測定した。その結果、アミノ基を有する蛍光性
ビーズ（図４（ａ））表面には、ビーズ１ｍｇ当たり８
８ナノグラム当量（ng eq）のアミノ基が導入されてお
り、処理するマルトビオン酸の量によらず、約５０％の
アミノ基にマルトビオン酸が結合した。一方、エチレン
ジアミンで処理した蛍光性ビーズ（図４（ｂ））表面に
は、７４（ng eq/mg）のアミノ基が導入され、トリエチ
レンテトラミンで処理した蛍光性ビーズ（図４（ｃ））
表面には、４８（ng eq/mg）のアミノ基が導入された。
これらはいずれも、３３ｎｇ／ｍｇのマルトビオン酸で
処理した場合は約４０％、２００ｎｇ／ｍｇのマルトビ
オン酸で処理した場合は約７５％のアミノ基にマルトビ
オン酸が結合した。

【００５４】別に調整したラット肝実質細胞の懸濁液
（５．０×１０⁵細胞）を遠心して上澄みを取り除いた
後、上記の末端グルコース構造を導入した蛍光性ビーズ
を各々１００μｇを含み、１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アル
ブミンとＮａＮ₃を含むＰＢＳを添加し、アイス・バス
中で、時折撹拌しながら４０分間インキュベーションし
た。その後、ＮａＮ₃を含むＰＢＳで２回洗浄し、５０
−１００×１０⁴細胞／ｍｌに希釈した。

【００５５】各細胞の蛍光強度を、実施例１と同様にフ
ローサイトメーターで測定した。その値を"Total"とす
る。次に、上記の細胞を、天然のウサギＬＤＬ（１ｍｇ
／ｍｌ）で３０分、４℃でインキュベーションした後、
同様にフローサイトメーターで蛍光強度を測定した。そ
の値を"LDL-resistant"とする。これらの測定結果を表
４にまとめて示す。表中、"LDL-releasable"とは、上記
"Total" から "LDL-resistant" を差し引いた値であ
り、ＬＤＬレセプターに選択的に結合する天然のＬＤＬ
と競合して脱離した蛍光性ビーズに基づく蛍光強度であ
り、これらはＬＤＬレセプターに結合していたことが確
認された。

【００５６】

【表４】

【００５７】表４より、表面に直接導入されたアミノ基
にマルトビオン酸を結合させた蛍光性ビーズ（ａ）は、
肝実質細胞への結合量が多く、その中の７０％以上がＬ
ＤＬレセプターに結合している。即ち、ＬＤＬレセプタ
ーを介して取り込まれる合成化合物（担体）となる。し
かしながら、エチレンジアミン及びトリエチレンテトラ
ミンを介してマルトビオン酸を導入した蛍光性ビーズ
（（ｂ）及び（ｃ））は、肝細胞への結合量が少なく、
結合部位もＬＤＬレセプターではないと考えられる。

【００５８】

【発明の効果】本発明の薬物輸送方法は、天然物または
合成物からなる担体を用い、その担体は容易に調整でき
るので、安定かつ効率的に供給できる。即ち、天然物で
あるＬＤＬは、例えばコレステロール添加食餌による高
脂血症ウサギの血漿から安定かつ大量に得ることができ
る。そのＬＤＬをポリアニオン化合物と処理するだけで
ＬＤＬ複合体が得られる。また、合成担体は、アミノ基
含有高分子とマルトビオン酸とから容易に合成すること
ができる。

【００５９】ＬＤＬからなる担体は、化学結合、疎水性
相互作用、及び／または硫酸結合部位を介して薬物を安
定に担持できる。ＬＤＬ複合体は、薬物を担持したＬＤ
Ｌ複数個をポリアニオン化合物を介して複合化できるの
で、薬物輸送の高効率化が図れる。薬物を担持したＬＤ
Ｌ及びＬＤＬ複合体は、ともに天然のＬＤＬと同様の特
性を維持している。また、合成担体は、アミノ基を介し
て薬物を担持でき、薬物を安定かつ強固に担持して輸送
することが可能になる。また、合成担体は、ＬＤＬまた
はＬＤＬ複合体より低分子量にできるので、脳に対する
ＤＤＳにも応用可能と考えられる。さらに、これら天然
及び合成担体には、複数の薬物を同時に担持させて輸送
することも可能である。

【００６０】本発明の薬物輸送方法は、ＬＤＬレセプタ
ーに選択的な担体を使用するので、例えばＬＤＬレセプ
ターを有する肝実質細胞、増殖細胞、または癌細胞など
に選択的に薬物を輸送することができる。従って、例え
ば本発明で使用する薬物輸送担体に抗癌剤を担持させ、
癌細胞に選択的に薬剤を輸送する新たなＤＤＳを構成す
ることもできる。

【図面の簡単な説明】

【図１】蛍光標識したウサギＬＤＬで処理した各種細
胞の蛍光強度を示すグラフである。

【図２】ＰＶＬＡ被覆シャーレで培養した肝実質細胞
のアルブミン及び胆汁酸分泌量と添加したデキストラン
硫酸濃度との関係を示すグラフである。

【図３】コラーゲン被覆シャーレで培養した肝実質細
胞のアルブミン及び胆汁酸分泌量と添加したデキストラ
ン硫酸濃度との関係を示すグラフである。

【図４】実施例５で調整した末端グルコース構造を導
入した蛍光性ビーズの模式図である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＬＤＬレセプター選択的薬物輸送担体に
薬物を担持させて薬剤とし、この薬剤をＬＤＬレセプタ
ーを有する細胞に適用し、該薬剤を前記細胞のＬＤＬレ
セプターを介して選択的に取り込ませることにより、前
記薬物を該細胞に選択的に輸送することを特徴とするＬ
ＤＬレセプター媒介薬物輸送方法であって、前記担体がＬＤＬであり、前記薬剤が該ＬＤＬに薬物を
化学結合を介して担持させてなることを特徴とする薬物
輸送方法。
【請求項２】前記担体がＬＤＬであり、前記薬剤が該
ＬＤＬの疎水性コアに前記薬物を疎水性相互作用を介し
て担持させてなることを特徴とする請求項１記載の薬物
輸送方法。
【請求項３】前記担体がＬＤＬであり、前記薬剤が該
ＬＤＬの硫酸結合部位を介して前記薬物を担持させてな
ることを特徴とする請求項１記載の薬物輸送方法。
【請求項４】前記担体が、高脂血症ウサギの血漿から
採取したＬＤＬであることを特徴とする請求項１から３
のいずれかに記載の薬物輸送方法。
【請求項５】前記薬剤が、前記薬物を担持した複数個
のＬＤＬのポリアニオン化合物を介した複合体からなる
ことを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の薬
物輸送方法。
【請求項６】前記ポリアニオン化合物が、デキストラ
ン硫酸であることを特徴とする請求項５記載の薬物輸送
担体。
【請求項７】前記薬物が、イソチアネート基を有する
蛍光性物質であることを特徴とする請求項１記載の薬物
輸送方法。
【請求項８】前記薬物が脂溶性肝疾患治療薬であるこ
とを特徴とする請求項２記載の薬物輸送方法。
【請求項９】前記薬物が硫酸化糖類であることを特徴
とする請求項３記載の薬物輸送方法。
【請求項１０】ＬＤＬレセプター選択的薬物輸送担体
に薬物を担持させて薬剤とし、この薬剤をＬＤＬレセプ
ターを有する細胞に適用し、該薬剤を前記細胞のＬＤＬ
レセプターを介して選択的に取り込ませることにより、
前記薬物を該細胞に選択的に輸送することを特徴とする
ＬＤＬレセプター媒介薬物輸送方法であって、前記担体が、末端グルコース構造を有する側鎖を持つア
ミノ基含有高分子からなることを特徴とする薬物輸送方
法。
【請求項１１】前記担体が、前記アミノ基含有高分子
に、マルトビオン酸を結合させてなることを特徴とする
請求項１０記載の薬物輸送方法。
【請求項１２】前記アミノ基含有高分子が、キトサン
またはポリアリルアミンであることを特徴とする請求項
１１記載の薬物輸送方法。