TWI548646B - 免疫性多胜肽序列及包含該多胜肽序列之組成物於節肢動物傳播病之用途 - Google Patents
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Description
本發明係有關於胜肽序列、含該等胜肽序列之組成物，特別為含該等序列及組成物之可抗節肢動物產生之疾病的疫苗、及該等序列之用途。本發明尤其有關於可防止任一或多種蚊子產生之疾病，其包括一或多種瘧疾病變的疫苗。
對疾病之抵抗力為所有動物之幸存所不可或缺，且據此使用之防禦機制為該動物免疫系統。因此，瞭解該免疫系統為瞭解同樣同於人類及動物之新且更複雜的治療法之研發的關鍵。
該免疫系統之操作機制業經多年研究，該系統包括許多細胞類型及多種分子，因此極複雜。甚至在研究多年後，並不完全瞭解該等免疫系統組份之詳盡範圍。及其彼此間之交互作用。
多年前已知自特定疾病康復之人類在今後可獲得抗該疾病之保護力，但是並未能抗該人類尚未罹患之疾病。當時該免疫系統之基本原理方面係由斷定該免疫系統當暴露在已產生之特定病原中可獲得一種抗此等病原之“記憶”且該記憶對特定疾病具專一性加以詮釋。
逐漸地，開始知道對低有害性之病原變異體的暴露可
誘發抗更有害變異體之保護作用(例如對牛痘之暴露可保護人類免於天花，或對滅能炭疽暴露可保護人類免於活炭疽)。因此，形成接種法抗疾病之概念。
現在已知該免疫系統具有至少兩支：天生免疫力及適應性免疫力。在病原進入天生免疫系統前，該系統具完全機能性，而該病原進入適應性免疫系統後，該系統會開啟。其接著可對該病原發動專一性攻擊。該天生免疫系統包含許多組份，其包括吞噬細胞，諸如巨噬細胞，其(如該名稱表示)可“吃掉”或吞食異物，諸如病原。
典型上，但非專門地，本發明係有關於該適應性免疫系統且除非另有特別指定，本文中之“免疫系統”係指該適應性免疫系統。
為了更詳細瞭解該免疫系統之作用方式，必需仔細考慮其個別組份之角色。就該適應性免疫系統而言，已熟知抗病原之免疫力係由淋巴細胞之作用而提供，該等淋巴細胞構成免疫系統內之最常見細胞類型。有兩種淋巴細胞：B淋巴細胞及T淋巴細胞。其分別通稱為B細胞及T細胞。
B細胞可形成能製造抗體之漿細胞。抗體為動物免疫系統之很重要組份。其係回應侵入病原之某一標記部份(該病原之抗原-文中抗原之定義為可藉該免疫系統而辨識之任何外來物質)而產生且通常對該病原且專一性。然而，若兩病原很類似或至少含有相同抗原，則所產生之能抗其中一種病原之抗體仍然能有效抗另一種病原(其可“交錯反應”)。此可解釋經牛痘接種之方法可保護人類免於天花之
原因。重要竹是瞭解該等抗體僅可“辨識”該病原之抗原分子的一小部份而非整體上辨識該病原。這些部份稱為抗原決定位。
T細胞並不具有或產生抗體。反倒是，其可藉特定受體，亦即TCR(T細胞受體)而辨識與主要組織相容性複合體(MHC)(就人類而言，人類白血球抗原(HLA))複合之處來抗原的片段(亦即抗原決定位)。T細胞本身可分成可具有調節機能或效應機能之亞群。該等效應細胞涉及使外來物質之移除步驟“生效”。例如殺手T細胞(CTL)為可殺死經感染細胞以及其它非所欲種類，諸如腫瘤細胞之效應細胞。另一方面，調節性T細胞有助於使效應物T及B細胞變得更有效。由於該機能，所以這些調節性T細胞通稱為輔助(helper)T細胞。其它調節性T細胞，亦稱為抑制(suppressor)T細胞，被認為可抑制免疫反應，但是這一方面缺乏良好的瞭解。調節性T細胞亦可以與該等天生免疫系統之組份交互作用以加強其活性。
在正常健康之個體中，免疫系統內之淋巴細胞維持失活性“靜息”狀態，直到引發免疫反應為止。當需要免疫反應時，該等淋巴細胞變成活性，增生並開始進行其指定機能。例如就表現在其表面上之任何靜息T細胞而言，可活化能辨識與MHC分子複合之該侵入病原之抗原決定位的TCR，並增生(其被稱株系擴張)且所形成後代開始活躍地進行其與該等侵入微生物鬥爭所需之預定效應物機能。
當該免疫反應完成時(亦即該等病原及/或經感染細胞
業經消除)，該等淋巴細胞再回復靜息狀態。然而本靜息狀態並不等於該初失活性靜息狀態。可快速募集並誘發活化，但靜息之淋巴細胞以於後來回應藉相同或密切有關之病原的感染而增生。
在第二次遭遇侵入病原後，該等活化性靜息淋巴細胞傳遞更快速且更有力之反應的能力可有效地使該免疫系統具有“記憶”。該免疫系統之記憶的利用為所有長期免疫預防藥物(例如疫苗)之基礎且一直是很長期免疫免疫治療藥物研發的目標。
為了使細胞能在動物之複雜系統內執行其機能，該等細胞需要在其表面上具有“受體”。這些受體可“辨識”能控制各種必需過程，諸如活化、增生及黏著至其它細胞或其質之過程的特定物質。例如就該免疫系統而言，T及B細胞上之受體不僅使其可辨識抗原，而且可使其彼此交互作用，因此可調節其活性。若沒有這些受體，則該等細胞缺乏必需的傳遞方式，因此不能以一致地方或有效地作用，該一致性有效作用為多細胞生物體之免疫系統所不可或缺。
為了能夠專一性辨識並處理多種存在於環境中之病原，該免疫系統已在淋巴細胞上形成兩種高可變抗原受體：在B細胞中之抗體、及在T細胞中之T細胞受體或TCR。
體內有許多不同合適的抗原受體可以使免疫系統能辨識多種侵入病原。事實上，個體內有約1012個不同B細胞及T細胞受體。各個B細胞僅具有一種受體，因此為了處理一特定病原，必須選擇具有適於該病原之抗原的“最佳配合
性”受體之B細胞。本過程稱為“株系選擇”。理論上，僅單株可反應(單株回應)或根據藉該病原而顯示之抗原/抗原決定位數、及各種選擇之B細胞對這些抗原/抗原決定位的專一性而有幾個反應(寡株反應)或許多反應(多株反應)。
抗原類型間之主要差異可藉B細胞及T細胞而辨識。據所知，僅B淋巴細胞之表面上的受體(亦即抗體)可直接辨識抗原，諸如病毒及細菌上之蛋白質、或已溶解在體液內之外來分子。當抗體經活化並形成漿細胞時，該等抗體亦可藉B細胞而呈可溶形式產生。該等抗體亦稱為免疫球蛋白(其縮寫為Tg)。另一方面，T細胞受體僅可辨識體細胞表面上之短胜肽，亦稱為T細胞抗原決定位。這些T細胞抗原決定位係藉自我產生(亦即天然產生之身體蛋白質)或非自我產生(亦即衍生自可感染身體之外來生物體)之較大蛋白質之降解作用而產生。僅此等衍生自外來蛋白質之T細胞決定位，亦即抗原，可正常地在體內誘發免疫反應。一旦產生時，這些抗原決定位可結合至特定分子類子，亦即該MHC(主要組織相容性複合體)，且所形成複合體接著會呈現在細胞表面上以結合該T細胞受體。
應瞭解由於該免疫反應之破壞性質，該反應僅對外來病原有作用，而不能對身體自己的細胞或蛋白質作用。因此，該免疫系統必須可區別“自我”及“非自我”蛋白質。已認為雖然可產生能與自我蛋白質反應之淋巴細胞株系，但是在發生任何反應前，其可被刪除。本過程稱為“株系刪除”。亦已認為任何自我反應之淋巴細胞僅可以“關掉
(switched-off)”之狀態保留。本機制稱為“株系無力”。無論該過程如何進行，仍然不清楚使淋巴組織，諸如胸腺，可辨別能與自我蛋白質反應之個別T細胞株系及僅能與非自我蛋白質反應之T淋巴細胞群的精確基礎機制。
多年來已知該主要組織相容性複合體(MHC)在動物之免疫系統內扮演重要角色。如上文已論述，該MHC分子可以使T細胞能辨識抗原。有3種MHC分子之一般類型：I種類、II種類及III種類。I種類及II種類MHC分子為存在於細胞表面上之醣蛋白，而III種類通常為存在於細胞內之可溶性分子。有許多不同類型之MHC分子。例如在人體內(其中MHC稱為HLA，人類白血球抗原)，有許多可將MHC分子編碼之不同對偶基團，意指在人類群體中有許多不同類型之HLA。不同物種之MHC典型上係根據不同規定而命名，因此，小鼠之MHC稱為H-2，大鼠之MHC稱為RT1而兔子之MHC稱為RLA。個體內可將不同MHC分子編碼之不同基因區域通常經個別命名，諸如人類體內之HLA-A、HLA-C等。
該MHC分子為重要的免疫系統分子，因為該分子可以使該免疫系統得到該等抗原之抗原決定性。例如T細胞為了回應特定病原，該病原必須具有至少一抗原(諸如蛋白質)，該抗原具有至少一可組合至細胞表面上之MHC分子的抗原決定位(諸如該蛋白質之胜肽部份)，因此可以與能結合至該MHC-胜肽複合體之T細胞交互作用。因此，免疫反應係取決於該MHC對抗原決定位之結合能力。若該T細胞沒有可結合之抗原決定位或若T細胞並未可結合至該MHC-胜肽複
合體之T細胞，則不會發生免疫反應。
然而，就“自我”蛋白質而言，幾個抗原決定位中之一可能會與該MHC分子結合，因此可潛在性誘發免疫反應。在這些情況下，必須提供用於欲被刪除或“關掉”之自反應淋巴細胞株系的專一性“信號”。
儘管脊椎動物之運轉系統的知識日益增多，可抗許多疾病之疫苗仍然有限。某些病原容易快速突變(例如HIV及流行性感冒)。因此在已發生突變後，原本可以是某一菌株之有效疫苗對象的抗原決定位變得無效，因為該抗原決定位在新菌株內已變化。其它病原，諸如瘧原蟲屬(plasmodium)(造成瘧疾之病原)業經廣泛研究，但是可用於疫苗研發之該病原的對象已證明很難確認，或完全不能在活體內傳遞有效疫苗。
對於病情之演變有特殊需要之病原為此等藉節肢動物而傳播並可導致所謂“節肢動物傳播病”之病原。此等疾病為全世界死亡病例之主因，且尤其包括瘧疾及登革熱，其中有些為現代人口，特別為世界之較貧窮區域的人口之最大致命疾病。其實例包括，但不限於：下文表1中所列示。
先前，提供節肢動物傳播病疫苗之嘗試已涉及鑑定現有之病原菌株，然後產生對該病原具專一性之疫苗。一般而言，該等疫苗係以B細胞(抗體)反應(或偶爾，T細胞反應)為基礎，該抗體可以與業經形成之該專一性病原菌株之表面抗原進行反應。典型上，含該等抗原之表面蛋白質自一疾病菌株至下一疾病菌株可不同且不同病原可完全不同。其結果為習知疫苗通常僅可對抗一專一性病原或病原菌株(若該等疫苗完全有效)且不能對抗其它菌株或自突變形成之新菌株。因此，需要可對抗各疾病且通常可對抗相同疾病之不同及/或新菌株之不同疫苗。
有一段時間已知抗節肢動物唾液或抗表現在節肢動物之腸內的抗原的免疫作用可保護個體免於感染。這一方面之論述的文章包括下文摘述之文章。
R.G.Titus等人“The immunomodulatory factors of arthropod saliva and the potential for these factors to serve as vaccine targets to prevent pathogen transmission.”,Parasite Immunology,2006,28,131-141。該文章評論節肢動物唾液腺中之已知免疫調節劑。免疫調節因子可增強節肢動物之病原傳染。病媒唾液含有許多其活性包括抑制止血之能力、血管緊縮及炎症之形成與免疫反應的物質。蚊子自幾種T細胞抑制劑。若節肢動物唾液增強具有該等經節肢動物傳染之病原的感染，則可藉對宿主接種可強化該感染之唾液中之分子(群)而控制病原傳染，藉此阻斷唾液之增強作用，因此可防止該病原在宿主體內產生感染。可將沙蚊唾液中之強力血管擴張劑編碼之基因美沙迪蘭(maxadilan)或MAX經選殖且檢查該基因之蛋白質產物的活性。沙蚊MAX之作用可藉對吞噬細胞之主要作用而證實且其可導致對T細胞反應之下游免疫調節/抑制作用。對小鼠接種MAX，其係藉將MAX注射入完全弗洛德氏佐劑(Freund’s adjuvant)中，繼而將MAX注射入不完全弗洛德氏佐劑中，然後經可溶性MAX強化，直到循環介於1/10000與1/20000間之抗MAX抗體滴定濃度為止。該等經接種之小鼠顯著地未受感染。
G.A.T.Targett,“Parasites,arthropod vectors,and
immune responses.”,Parasite Immunology,2006,28,117-119。本文章表示蚊子吸血可對昆蟲之唾液誘發免疫反應。這些免疫反應兼包括過敏性反應及抗蚊抗體。就監測病媒菌群及應用此等反應以評估介入策略之有效性而言，這些抗體反應之測定法在流行病學上具重要性。若計劃夠野心，可削弱節肢動物病媒或體外寄生物之攝食、發育及/或存活的疫苗之製備為具吸引力之構想。一重要目標為控制該等體外寄生性節肢動物本身，而第二目標為使用該抗節肢動物疫苗作為損害節肢動物本身所傳播或當傳播至脊椎動物時所產生之寄生物的方式。
M.M.A.Whitten等人“Mosquito midguts and malaria：cell biology,compartmentalization and immunology.”,Parasite Immunology,2006,28,121-130。蚊子之中腸代表適於瘧原蟲屬之存活及發育之最高挑戰性的環境之一。在嘗試穿過往唾液腺之途中的中腸上皮時，可藉蚊辨識因素而快速偵測並標識能動性卵動子並藉可自中腸及自周圍體腔室內之其它組織募集殺滅因子之多種免疫反應而進行目標之毀滅。這些因子與該寄生物間之精確相互作用與該寄生物侵襲之時間及路線一樣具高物種及菌株專一性。該中腸可形成能分離並保護血腔組織免於消化酶及感染物破壞之物理屏障。其係由極化上皮細胞之單一層所組成，其中任一極係表示用於增加涉及分子改變之表面積的不同形態適應。各別微絨毛尖表面接觸管腔，且其主要角色為消化酶之分泌及營養物之吸收。藉吸血液而引發之結構改質包括
厚非細胞性甲殼素的圍食膜(PM)之形成，其係藉該中腸上皮而分泌並藉所攝取之血餐而聚合。該PM可包圍血團並形成用於嘗試滲入該中腸上皮之寄生物與細菌之屏障。
P.F.Billingsley等人“Immune interactions between mosquitoes and their hosts.”,Parasite Immunology,2006,28,143-153。可針對蚊中腸之抗體在蚊疫苗之研發上亦具重要性。在吸血時藉蚊子而分泌之唾液對宿主血管之成功定位及宿主止血及免疫反應之操控具重要性。免疫墨點技術業經用以描述藉唾液抗原之宿主抗蚊抗體而進行辨識之特性。當蚊子吸血時，其可攝取在該中腸內仍維持活性之可溶性及細胞性宿主免疫因子。與唾液抗原大不相同，該宿主通常並未接觸得自該蚊之內部器官的抗原，因此可得到使用這些“隱性”抗原作為疫苗標靶之構想。隱性抗原之最佳來源為該中腸，因為吸血後，其含有具有其組份免疫效應分子與細胞之血餐。埃及伊蚊(Ae.Aegypti)之中腸及全身性製劑可在小鼠體內誘發高抗體滴度且以其為食物之蚊子的增加死亡率係與結合至中腸微絨毛之抗體有關。在已注射甘比亞序列瘧蚊(An.Gambiae)之中腸cDNA基因庫之小鼠體內誘發IgG反應，並在經中腸蛋白質強化後獲得高抗體滴度。以這些小鼠為食物之蚊子顯示其殘存及繁殖能力重現性降低，但是有趣的是，細胞性反應而非體液性反應似乎成為該等滅蚊作用之主因。甚至在實驗中，變異性高且難以獲得作用之重現性。使用中腸蛋白質萃取物或中腸cDNA基因庫之複雜混合物所進行之免疫作用已意謂保護性標靶
抗原尚未經鑑定。
然而，儘管此知識，當未能研發出可利用此種作用機制以有效抗節肢動物傳播病之疫苗。現有抗節肢動物傳播病原(不論是依賴B細胞或T細胞反應)之疫苗的另一重要問題為各種疫苗僅能抗單一病原或至多單一現有病原菌株且不能對抗可能的未來菌株或多病原。因此迫切需要一種能抗多種節肢動物傳播病，其包括大規模致命疾病，諸如瘧疾及登革熱之疫苗。
本發者現在已能鑑定可抗所有節肢動物傳播病原之存在於節肢動物唾液蛋白質內之專一性產生免疫的胜肽序列且已使用該等經確認之序列研發該等疾病所產生之疫苗。因此，本發明者已研發可用於能引起免疫反應且特別為抗節肢動物傳播病之快速二次免疫反應之疫苗的胜肽。
因此，本發明之一目標為解決與如上文揭示之已知先前技藝有關之問題。本發明之另一目標為提供能在脊椎動物體內引起抗多種節肢動物傳播病，亦即藉多種病原或病原菌株而引起之疾病，之免疫反應(例如細胞性反應，其包括T細胞反應及/或B細胞反應)的多胜肽組成物。本發明之另一目標為提供使用本發明該等多胜肽組成物之節肢動物傳播病疫苗。
因此，本發明提供含一或多種多胜肽之多胜肽組成物，該等多胜肽在脊椎動物體內具致免疫性，因此其可以
使該脊椎動物產生能自動物唾液蛋白質成份辨識至少一抗原決定位的免疫系統細胞(或促進此等細胞之產生)，其中該節肢動物唾液蛋白質成份具有40kDA或較小之質量，且其中該等多胜肽係獨立選自：
(a)SEQ ID NO：1-44之多胜肽序列或得自這些序列之亞序列，該等亞序列具有7或多個胺基酸：
SEQ ID NO：1 HLTLFTVAVLLLAAAALLLLLPPAYSTTLTPP
SEQ ID NO：2 PLSYCHLFLTHTLARALSFSRSDCL
SEQ ID NO：3 KNVFFALLLVVLVCCLVSVQGNEI
SEQ ID NO：4 KLLVLLICLFFYHTHCTTAYLWLAMGV
SEQ ID NO：5 FLKGSFPRFQMCVMLIGFFSSAKCL
SEQ ID NO：6 NDYQALLGLCCPWIDLAAADLPMRRHAKA
SEQ ID NO：7 FYSVGKLVKVLLVMAVCCLLLCTAPTGADPL
SEQ ID NO：8 MKFAFAFVLIALFAVFAVSQALPQPEQAAA
SEQ ID NO：9 DGASAITKIVLELTPEQAAAV
SEQ ID NO：10 TLFIFLVCCQIPLFGIMSSDSADPFYWIRVILA
SEQ ID NO：11 GRVMCLLRLMSTLLVVLSIVGK
SEQ ID NO：12 LYSGYRLLVLLVMTVCCLLLFIAPTGADPLPGQTQRTL
SEQ ID NO：13 MYCVIKGKTGGYCNSEGLCTCRAEDLHFLLKPIINKD
SEQ ID NO：14 NAEDPRTELIGCGSVLFHLAANRLSLQLEEFAVCKR
SEQ ID NO：15 ALIGLLLCSVQSVTANDPVDALGACSGNLFGLLMTRL
SEQ ID NO：16 SKLFVLAFLCLALVVVVQSAPQYARGDVPT
SEQ ID NO：17 SMLVAFATLSVALVVVVAIPANFNYGGGGGYFINGTGQ
SEQ ID NO：18 IYEKLPAYLSEVSARVNVLQVSLQHDLPNLQ
SEQ ID NO：19 EMKLAKVALVTISLWFMAWTPYLVINFTGI
SEQ ID NO：20 LLPAKVIPDKTAAYVAYGGQETLVEHVEVLV
SEQ ID NO：21 FYTCFLGTSSLAGFKNAVDYDELLKAG
SEQ ID NO：22 VLEVLGFVEDNGELVFQELLGVLKMVDPDGD
SEQ ID NO：23 KLTPTVVVVLLCLTFVADALTIQELRAQIAQQRIQQRYGVTVATT
SEQ ID NO：24 SLSDYGLIELKEHCLECCQKDTEADSKLKVYPAAVLEV
SEQ ID NO：25 TYICFILHGVSEIIPQQQKKTMKFLLLVASVLCLVLI
SEQ ID NO：26 RYFVVIALICPLIIVETLAV
SEQ ID NO：27 LLLYLDAADLRRALHQYQLLAAQGDRHLPQQIVKFV
SEQ ID NO：28 VLLTPALQAYIMDEHNLNRSNIALGRIRPYPSAVKMP
SEQ ID NO：29 VLKGETHKALKLKDGGHYLVEFKSIYM
SEQ ID NO：30 VLHSMLVNASLAEMVKESYQTHGADGRMVVRMLKFVRLLP
SEQ ID NO：31 RVRALRALLETLLQHQGEQNNDVYLIRLAHET
SEQ ID NO：32 ELQQALSSLNAGSGSCAEVFNAYLPVHNKYIGVSRKI
SEQ ID NO：33 KFYRLISTLLVVVVIAPRHQCSPFFFQYNRPYL
SEQ ID NO：34 NYVPDVSALEQDIIEVDPETKEMLKHLDFNNIVVQL
SEQ ID NO：35 QYSMECLEAAEPKYLDGLKTLADETAQC
SEQ ID NO：36 EYAQVTKMLGNGRLEAMCFDGVKRLCHIRGKL
SEQ ID NO：37 KLFLTLLSTLSVAMVFALPAHHHSRG
SEQ ID NO：38 ELEEARLVAEELEERQQELDYLKRYLVGRLQAV
SEQ ID NO：39 SYFLTVCLLALVQSETVQD
SEQ ID NO：40 AMTNANLVGLTISLAYAIFFLLYTPPTGRSS
SEQ ID NO：41 SFAWLLYGIILRSNFLVVQNLMALALSAVQLSLFII
SEQ ID NO：42 AFPFISGFLSCFMWLKYGVLTEESTLILVNFIGSAL
SEQ ID NO：43 GLLCCCLAVLFFASPLTMLAHVIR
SEQ ID NO：44 LLLAMVLLPLLLLESVVPYAAAEKVW
(b)藉以下節肢動物唾液蛋白質之胺基酸殘基而定義之序列、或選自這些序列之亞序列，該等亞序列且有7或多個胺基酸：>gi|18389913|gb|AAL68793.1|AF457563_1假設的蛋白質16[甘比亞瘧蚊]之殘基2-33
>gi|18389909|gb|AAL68791.1|AF457561_1假設的蛋白質14[甘比亞瘧蚊]之殘基2-26
>gi|18389907|gb|AAL68790.1|AF457560_1假設的蛋白質13[甘比亞瘧蚊]之殘基2-25
>gi|18389903|gb|AAL68788.1|AF457558_1假設的蛋白質11[甘比亞瘧蚊]之殘基10-36
>gi|62546227|gb|AAX86005.1| hyp3.5前驅體[甘比亞瘧蚊]之殘基2-26
>gi|18389899|gb|AAL68786.1|AF457556_1似唾液腺7蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基14-42
>gi|18389911|gb|AAL68792.1|AF457562_1假設的蛋白質15[甘比亞瘧蚊]之殘基3-33
>gi|62546225|gb|AAX86004.1| hyp6.3前驅體[甘比亞瘧蚊]之殘基1-30
>gi|62546225|gb|AAX86004.1| hyp6.3前驅體[甘比亞瘧蚊]之殘基34-54
>gi|17026153|emb|CAD12038.1| Sec61蛋白質[甘比亞瘧蚊]
之殘基38-70
>gi|62546223|gb|AAX86003.1| hyp6.2前驅體[甘比亞瘧蚊]之殘基2-23
>gi|18389915|gb|AAL68794.1|AF457564_1假設的蛋白質17[甘比亞瘧蚊]之殘基17-54
>gi|87080391|gb|ABD18596.1|防衛素(defensin)[甘比亞瘧蚊]之殘基57-93
>gi|18389901|gb|AAL68787.1|AF457557_1假設的蛋白質10[甘比亞瘧蚊]之殘基22-57
>gi|18389905|gb|AAL68789.1|AF457559_1假設的蛋白質12[甘比亞瘧蚊]之殘基7-43
>gi|4127344|emb|CAA76832.1| cE5蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基3-32
>gi|4210617|emb|CAA10259.1| SG2蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基3-40
>gi|4127309|emb|CAA76820.1|假設的蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基91-121
>gi|4375824|emb|CAA76825.1|視蛋白(opsin)[甘比亞瘧蚊]之殘基65-94
>gi|62546233|gb|AAX86008.1|未知[甘比亞瘧蚊]之殘基41-71
>gi|3378531|emb|CAA03872.1| D7r2蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基117-143
>gi|3378529|emb|CAA03871.1| D7r3蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基63-93
>gi|18389893|gb|AAL68783.1|AF457553_1似黏蛋白(mucin-like)蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基23-67
>gi|18389881|gb|AAL68777.1|AF457547_1硒蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基43-80
>gi|18389879|gb|AAL68776.1|AF457546_1 30kDa蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基6-42
>gi|18378603|gb|AAL68639.1|AF458073_1 D7-相關性5蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基4-23
>gi|18389897|gb|AAL68785.1|AF457555_1似唾液腺1之4蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基20-55
>gi|18389883|gb|AAL68778.1|AF457548_1抗原5相關性1蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基59-95
>gi|83016748|dbj|BAE53441.1|DsRed[合成建構物]之殘基158-184
>gi|18389895|gb|AAL68784.1|AF457554_1似唾液腺1之3蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基37-76
>gi|18389895|gb|AAL68784.1|AF457554_1似唾液腺1之3蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基191-222
>gi|18389891|gb|AAL68782.1|AF457552_1 D7蛋白質長型[甘比亞瘧蚊]之殘基113-149
>emb|CAC35527.1|gSG9蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基1-37
>sp|Q9U9L1|RS17_ANOGA 40S核糖核蛋白體蛋白質S17之殘基81-120
>emb|CAC35523.1| gSG7蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基
111-142
>gb|AAD47075.1|AF164151_1轉譯起始因子4C(1A)[甘比亞瘧蚊]之殘基32-67
>emb|CAC35519.1|似gSG2之蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基1-29
>emb|CAC35451.1|假設的蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基106-142
>emb|CAC35524.1| D7r4蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基6-28
>ref|XP_001230998.1| ENSANGP00000014906[甘比亞瘧蚊str.PEST]之殘基70-104
>ref|XP_316361.2| ENSANGP00000012984[甘比亞瘧蚊str.PEST]之殘基174-213
>ref|XP_314140.3| ENSANGP00000015780[甘比亞瘧蚊str.PEST]之殘基41-80
>ref|XP_314140.3| ENSANGP00000015780[甘比亞瘧蚊str.PEST]之殘基126-153
>emb|CAC35522.1| gSG6蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基5-34
(c)及選自與(a)或(b)中之序列中之一或多種具有85%同源性且包含在以下資料庫中之一或多種內的多胜肽序列：GenBank、Protein Data Bank(PDB)、SwissProt、Protein Information Resource(PIR)、Protein Research Foundation(PRF)或彼等之CDS轉譯物。
CDS為“CoDing Sequence(密碼序列)”之縮寫，亦即相當於預測蛋白質中之胺基酸序列的核苷酸區域。該CDS包括起始及中止密碼子，因此密碼序列係以“ATG”開始並以
中止密碼子結束。由於移碼作用，所以未表現之未表現性序列，其包括5’-UTR、3’-UTR、插入序列或鹼基，並未包括在CDS內。特別注意該CDS並未與實際mRNA序列相符。因此，CDS轉譯物為若該等起始與中止密碼子間之所有密碼子經轉譯，則可形成之蛋白質。
PDB代表Protein Data Bank(蛋白質資料庫)。本基因庫(http：//www.rcsb.org/pdb/home/home.do)係由the Research Collaboratory for Structural Bioinformatics(RCSB)維持，該機構為致力於藉研究生物巨分子之3-D結構而改善生物系統機能之瞭解的非營利機構。
The Protein Information Resource(PIR)(http：//pir.georgetown.edu/)為由the National Biomedical Research Foundation(NBRF)於1984年制定之整合性公開生物訊息學資源以作為協助研究者鑑定並詮釋蛋白質序列訊息之資源(Wu CH,Yeh LS,Huang H,Arminski L,Castro-Alvear J,Chen Y,Hu Z,Kourtesis P,Ledley RS,Suzek BE,Garrett L,Vinayaka CR,Zhang J,Barker WC(2003).“The Protein Information Resource”.Nucleic Acids Res 31(1)：345-7.)。
PRF為藉the Protein Research Foundation(PRF)而維持之線上資料庫(http：//www.prf.or.jp/en/index.shtml)。該資料庫含有關於自科學期刊所收集之胺基酸、胜肽及蛋白質、胜肽及蛋白質序列資料、有關於合成化合物之資料、及蛋白質之分子方面。
GenBank為NIH基因序列資料庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)，其係為有註解之所有公開可得之DNA序列的收集。每兩個月有新的發佈。GenBank為the International Nucleotide Sequence Database Collaboration的一部份，該協會(Collaboration)由the DNA DataBank of Japan(DDBJ)、the European Molecular Biology Laboratory(EMBL)、及位於the National Center for Biotechnology Information之GenBank所組成。
Swissprot(亦稱為UniProtKB/Swiss-Prot)為藉the Swiss Institute of Bioinformatics(SIB)而維持之有組織的蛋白質序列資料庫。該資料庫努力提供高度詮釋(諸如蛋白質機能、其結構域結構、轉譯後之改質物、變體等之說明)、最低程序之贅詞及與其它資料庫之高度整合。
這些資料庫係每週或每月重新，且在本申請案提出的時候，該等序列涵蓋此等在該等資料庫內之序列。當在該等資料庫內發現具有所欲同源性之序列時，根據配合標準可使用任何方法。然而，較佳可使用BLASTP程式[BLAST及其衍生程式(例如BLASTP)為公用軟體]。
在另一實施例中，代替上文(c)中之該85%同源性或除該85%同源性外，上述資料庫中之多胜肽序列亦包括其胺基酸之至少85%與(a)或(b)之長為8或更多個胺基酸之序列的一部份相同(就胺基酸相同性及在該序列中之位置而言)且其長較佳為自8個胺基酸至高(a)或(b)中之該序列長度的三分之一。換言之，就(a)或(b)中之長為30個胺基酸之序列
而言，該資料庫中之序列亦包括其胺基酸之85%或更高與(a)或(b)中之長為8或更多個胺基酸、較佳自8至20個胺基酸之該序列的任一部份共享之序列。該等配合之胺基酸未必具連續性。例如就(a)或(b)中之20個胺基酸的序列而言，其包括對應資料庫序列在合適位置內共享17或更多個胺基酸，即使這些位置並非全部具連續性亦可。
典型上，該組成物內之多胜肽並非完全(非完整或非全部)節肢動物唾液蛋白質。“完全”(或完整或全部)係意指該等多胜肽並不含有存在於任何天然產生之節肢動物唾液蛋白質中之所有胺基酸殘基。
因此，該胜肽為可包含所有上述序列中之任一種(或可包含上述任一種序列之至少7或多個殘基部份的多胜肽。該多胜肽亦必須在脊椎動物體內可產生免疫性。典型上，該致免疫性可以使該等多胜肽在脊椎動物體內產生能自節肢動物唾液蛋白質成份辨識至少一抗原決定位的免疫系統細胞。因此，若多胜肽可引起T細胞或B細胞反應，則其在脊椎動物體內可產生免疫性。該多胜肽或可以是T輔助淋巴細胞(Th)抗原決定位或可以是B淋巴細胞抗原決定位。
一種用於測定多胜肽是否具有致免疫性之方法揭示在以下實驗2中。然而，本發明並不限於此等方法，且若必要，熟練者可選擇用於測定致免疫性之任何已知方法。
該多胜肽組成物之多胜肽更特佳獨立選自SEQ ID NO：1-6、20、28、30-32及35、或得自這些序列之亞序列(該等亞序列具有7或更多個胺基酸)或選自與這些序列中之一
具有85%或更高同源性且包含在以下資料庫中之一或多種內的多胜肽序列：GenBank、Protein Data Bank(PDB)、SwissProt、Protein Information Resource(PIR)、Protein Research Foundation(PRF)或彼等之CDS轉譯物。
典型上，但非單獨性，本發明該多胜肽組成物包含2或更多個多胜肽、較佳自2至10個多胜肽或更佳自2至6個多胜肽。然而，若必要，該組成物可包含單一多胜肽及另外的非多胜肽組份。
一般而言，在本發明該多胜肽組成物中，該節肢動物唾液蛋白質成份之質量為40kDa或更小、30kDa或更小或更佳20kDa或更小。該成份亦可具有自20至40kDa、自20至30kDa或自10-20kDa之質量。
在本發明另一實施例中，本發明該多胜肽組成物包含SEQ ID NO：131、或包含具有7或更多個胺基酸之SEQ ID NO：131之一或多種亞序列、或包含與這些序列中之一具有85%或更高同源性且包含在以下資料庫中之一或多種內的多胜肽序列：GenBank,Protein Data Bank(PDB)、SwissProt、Protein Information Resource(PIR)、Protein Research Foundation(PRF)或彼等之CDS轉譯物。
SEQ ID NO：131
在本發明另一實施例中，本發明該多胜肽組成物包含一或多種選自SEQ ID NO：1-4、6、9、10、13、14、17-19、21-25、27、29、33、34、36-40、43、及44之序列、或包含具有7或更多個胺基酸之這些序列的一或多種亞序列、或包含與這些序列中之一具有85%或更高同源性且包含在以下資料庫中之一或多種內的多胜肽序列：GenBank,Protein Data Bank(PDB)、SwissProt、Protein Information Resource(PIR)、Protein Research Foundation(PRF)或彼等之CDS轉譯物。
在另一實施例中，本發明該多胜肽組成物包含SEQ ID NO：132、或包含具有7或更多個胺基酸之SEQ ID NO：132之一或多種亞序列、或包含與這些序列中之一具有85%或更高同源性且包含在以下資料庫中之一或多種內的多胜肽序列：GenBank,Protein Data Bank(PDB)、SwissProt、Protein Information Resource(PIR)、Protein Research Foundation(PRF)或彼等之CDS轉譯物。
SEQ ID NO：132
在一實施例中，本發明該多胜肽組成物包含SEQ ID NO：133、或包含具有7或更多個胺基酸之SEQ ID NO：133之一或多種亞序列、或包含與這些序列中之一具有85%或更高同源性且包含在以下資料庫中之一或多種內的多胜肽序列：GenBank,Protein Data Bank(PDB)、SwissProt、Protein Information Resource(PIR)、Protein Research Foundation(PRF)或彼等之CDS轉譯物。
SEQ ID NO：133
在又另一實施例中，本發明該該多胜肽組成物包含SEQ ID NO：134、或包含具有7或更多個胺基酸之SEQ ID NO：134之一或多種亞序列、或包含與這些序列中之一具有85%或更高同源性且包含在以下資料庫中之一或多種內的多胜肽序列：GenBank,Protein Data Bank(PDB)、SwissProt、Protein Information Resource(PIR)、Protein Research Foundation(PRF)或彼等之CDS轉譯物。
SEQ ID NO：134
重要的是，在本發明所有實施例中，可使用所列示序列單獨或一起之任何組合。更特佳多胜肽為具有SEQ ID NO：1-6之序列的多胜肽、及/或具有SEQ ID NO：20、28、30-32及35之序列的多胜肽。尤佳含這些中之任一或多種，且更特佳含SEQ ID NO：1-6之全部、及或SEQ ID NO：20、28、30-32及35全部。
本發明者已發現上述序列包含可提供一群體中之多種脊椎動物抗節肢動物傳播病的抗原決定位或多個抗原決定位。節肢動物螫傷在宿主體內可誘發對由Th2表現性表現特徵之唾液組份的免疫反應(亦即IFN-γ產生之下調及IL-4產生之上調)(Mbow等人，1998)。一般而言，本免疫反應以及
許多這些唾液分子之抗上血作用業經發現可促進並增強寄生物傳染(Dhar and Kumar,2003)且尤其可促進利什曼原蟲感染(Kamhawi等人，2000)。反之，於感染部位(亦即螫傷部位)藉IFN-γ及IL-12(其皆為Th1型細胞素)之增加產生而表示特性之細胞性免疫反應的增加業經證明可誘發抗藉感染性沙蚊之螫傷所導致之碩大利什曼原蟲感染的保護作用(Kamhawi等人，2000)。
不想受限於理論，咸信可導致Th1型反應之唾液蛋白質的免疫作用可藉該免疫系統之細胞(諸如活化細胞毒殺性T細胞(CTL)及T輔助型1細胞)及IFN-γ之產生而快速辨識該螫傷部位之唾液抗原。本細胞素(1)可刺激T及NK細胞以產生更多IFN-γ，(2)可促進巨噬細胞之殺微生物活性，(3)誘使同型物轉換成IgG2a並藉B細胞增加IgG2a之產生，(4)多細胞素(例如TNF-α、介百素(IL)12及IL-18)之產生，其可合併地引發會導致細胞內寄生物死亡之連鎖免疫反應。詳述這些免疫反應之參考文獻揭示在下文。
Mbow ML, Bleyenberg JA, Hall LR & Titus RG. 1998. Phlebotomus papatasi sandfly salivary gland lysate down-regulates a Th1, but up-regulates a Th2, response in mice infected with Leishmania major. J. Immunol; 161: 5571-5577.
Dhar, R., Kumar, N., 2003. Role of mosquito salivary glands. Cur. Sci. 85, 1308-1313.
Kamhawi, S., Belkaid, Y., Modi, G., Rowton, E., Sacks, D., 2000. Protection against cutaneous leishmaniasis resulting from bites of uninfected sand flies. Science 290, 1351-1354
Malaguarnera L, Musumeci S. 2002. The immune response to Plasmodium falciparum malaria. Lancet Infect Dis. Aug;2(8):472-8
如上述，該等序列在分析其比亞瘧蚊體內之唾液序列後業經鑑定。熟練者可知本發明不僅涵蓋該等序列及其抗原決定位，而且包括含有這些序列之節肢動物唾液蛋白質中之較大序列、及與這些序列同源且因此具有致免疫活性之序列。因此，與該等一致序列具有部份同源性之序列亦屬於本發明範圍。此種同源性可取代，例如在8-mer抗原決定位(62.5%同源性)或9-mer、10-mer或11-mer抗原決定位中之至高3個胺基酸。較佳在相當於SEQ ID NO：1-44之完整序列(就30-mer而言，66.6%同源性)之本發明的序列中可鑑定不超過10個此等取代反應。此等取代反應較佳為根據已知取代方案之保留性取代。
本發明亦提供一種多胜肽，其包含一或多種藉以下序列SEQ ID NO：1-44而定義之序列、或節肢動物唾液蛋白質之以下胺基酸殘基、或包含一或多種得自這些序列之亞序列(該等亞序列具有7或更多個胺基酸)或包含與該等序列之一具有85%或更高同源性且包含在以下資料庫中之一或多種內的多胜肽序列：GenBank,Protein Data Bank(PDB)、SwissProt、Protein Information Resource(PIR)、Protein Research Foundation(PRF)或彼等之CDS轉譯物。
SEQ ID NO：1 HLTLFTVAVLLLAAAALLLLLPPAYSTTLTPP
SEQ ID NO：2 PLSYCHLFLTHTLARALSFSRSDCL
SEQ ID NO：3 KNVFFALLLVVLVCCLVSVQGNEI
SEQ ID NO：4 KLLVLLICLFFYHTHCTTAYLWLAMGV
SEQ ID NO：5 FLKGSFPRFQMCVMLIGFFSSAKCL
SEQ ID NO：6 NDYQALLGLCCPWIDLAAADLPMRRHAKA
SEQ ID NO：7 FYSVGKLVKVLLVMAVCCLLLCTAPTGADPL
SEQ ID NO：8 MKFAFAFVLIALFAVFAVSQALPQPEQAAA
SEQ ID NO：9 DGASAITKIVLELTPEQAAAV
SEQ ID NO：10 TLFIFLVCCQIPLFGIMSSDSADPFYWIRVILA
SEQ ID NO：11 GRVMCLLRLMSTLLVVLSIVGK
SEQ ID NO：12 LYSGYRLLVLLVMTVCCLLLFIAPTGADPLPGQTQRTL
SEQ ID NO：13 MYCVIKGKTGGYCNSEGLCTCRAEDLHFLLKPIINKD
SEQ ID NO：14 NAEDPRTELIGCGSVLFHLAANRLSLQLEEFAVCKR
SEQ ID NO：15 ALIGLLLCSVQSVTANDPVDALGACSGNLFGLLMTRL
SEQ ID NO：16 SKLFVLAFLCLALVVVVQSAPQYARGDVPT
SEQ ID NO：17 SMLVAFATLSVALVVVVAIPANFNYGGGGGYFINGTGQ
SEQ ID NO：18 IYEKLPAYLSEVSARVNVLQVSLQHDLPNLQ
SEQ ID NO：19 EMKLAKVALVTISLWFMAWTPYLVINFTGI
SEQ ID NO：20 LLPAKVIPDKTAAYVAYGGQETLVEHVEVLV
SEQ ID NO：21 FYTCFLGTSSLAGFKNAVDYDELLKAG
SEQ ID NO：22 VLEVLGFVEDNGELVFQELLGVLKMVDPDGD
SEQ ID NO：23 KLTPTVVVVLLCLTFVADALTIQELRAQIAQQRIQQRYGVTVATT
SEQ ID NO：24 SLSDYGLIELKEHCLECCQKDTEADSKLKVYPAAVLEV
SEQ ID NO：25 TYICFILHGVSEIIPQQQKKTMKFLLLVASVLCLVLI
SEQ ID NO：26 RYFVVIALICPLIIVETLAV
SEQ ID NO：27 LLLYLDAADLRRALHQYQLLAAQGDRHLPQQIVKFV
SEQ ID NO：28 VLLTPALQAYIMDEHNLNRSNIALGRIRPYPSAVKMP
SEQ ID NO：29 VLKGETHKALKLKDGGHYLVEFKSIYM
SEQ ID NO：30 VLHSMLVNASLAEMVKESYQTHGADGRMVVRMLKFVRLLP
SEQ ID NO：31 RVRALRALLETLLQHQGEQNNDVYLIRLAHET
SEQ ID NO：32 ELQQALSSLNAGSGSCAEVFNAYLPVHNKYIGVSRKI
SEQ ID NO：33 KFYRLISTLLVVVVIAPRHQCSPFFFQYNRPYL
SEQ ID NO：34 NYVPDVSALEQDIIEVDPETKEMLKHLDFNNIVVQL
SEQ ID NO：35 QYSMECLEAAEPKYLDGLKTLADETAQC
SEQ ID NO：36 EYAQVTKMLGNGRLEAMCFDGVKRLCHIRGKL
SEQ ID NO：37 KLFLTLLSTLSVAMVFALPAHHHSRG
SEQ ID NO：38 ELEEARLVAEELEERQQELDYLKRYLVGRLQAV
SEQ ID NO：39 SYFLTVCLLALVQSETVQD
SEQ ID NO：40 AMTNANLVGLTISLAYAIFFLLYTPPTGRSS
SEQ ID NO：41 SFAWLLYGIILRSNFLVVQNLMALALSAVQLSLFII
SEQ ID NO：42 AFPFISGFLSCFMWLKYGVLTEESTLILVNFIGSAL
SEQ ID NO：43 GLLCCCLAVLFFASPLTMLAHVIR
SEQ ID NO：44 LLLAMVLLPLLLLESVVPYAAAEKVW
>gi|18389913|gb|AAL68793.1|AF457563_1假設的蛋白質16[甘比亞瘧蚊]之殘基2-33
>gi|18389909|gb|AAL68791.1|AF457561_1假設的蛋白質14[甘比亞瘧蚊]之殘基2-26
>gi|18389907|gb|AAL68790.1|AF457560_1假設的蛋白質
13[甘比亞瘧蚊]之殘基2-25
>gi|18389903|gb|AAL68788.1|AF457558_1假設的蛋白質11[甘比亞瘧蚊]之殘基10-36
>gi|62546227|gb|AAX86005.1| hyp3.5前驅體[甘比亞瘧蚊]之殘基2-26
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>gi|62546225|gb|AAX86004.1| hyp6.3前驅體[甘比亞瘧蚊]之殘基1-30
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>gi|17026153|emb|CAD12038.1| Sec61蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基38-70
>gi|62546223|gb|AAX86003.1| hyp6.2前驅體[甘比亞瘧蚊]之殘基2-23
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>gi|87080391|gb|ABD18596.1|防衛素[甘比亞瘧蚊]之殘基57-93
>gi|18389901|gb|AAL68787.1|AF457557_1假設的蛋白質10[甘比亞瘧蚊]之殘基22-57
>gi|18389905|gb|AAL68789.1|AF457559_1假設的蛋白質
12[甘比亞瘧蚊]之殘基7-43
>gi|4127344|emb|CAA76832.1| cE5蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基3-32
>gi|4210617|emb|CAA10259.1| SG2蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基3-40
>gi|4127309|emb|CAA76820.1|假設的蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基91-121
>gi|4375824|emb|CAA76825.1|視蛋白[甘比亞瘧蚊]之殘基65-94
>gi|62546233|gb|AAX86008.1|未知[甘比亞瘧蚊]之殘基41-71
>gi|3378531|emb|CAA03872.1| D7r2蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基117-143
>gi|3378529|emb|CAA03871.1| D7r3蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基63-93
>gi|18389893|gb|AAL68783.1|AF457553_1似黏液素之蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基23-67
>gi|18389881|gb|AAL68777.1|AF457547_1硒蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基43-80
>gi|18389879|gb|AAL68776.1|AF457546_1 30kDa蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基6-42
>gi|18378603|gb|AAL68639.1|AF458073_1 D7相關性5蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基4-23
>gi|18389897|gb|AAL68785.1|AF457555_1似唾液腺1之4蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基20-55
>gi|18389883|gb|AAL68778.1|AF457548_1抗原5相關性1蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基59-95
>gi|83016748|dbj|BAE53441.1|DsRed[合成建構物]之殘基158-184
>gi|18389895|gb|AAL68784.1|AF457554_1似唾液腺1之3蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基37-76
>gi|18389895|gb|AAL68784.1|AF457554_1似唾液腺1之3蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基191-222
>gi|18389891|gb|AAL68782.1|AF457552_1 D7蛋白質長形式[甘比亞瘧蚊]之殘基113-149
>gi|13537676|emb|CA35527.1| gSG9蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基3-35
>sp|Q9U9L1|RS17_ANOGA 40S核糖核蛋白體蛋白質S17及gb|AAD47077.1|AF164153_1核糖核蛋白體蛋白質S17[甘比亞瘧蚊]之殘基83-118
>emb|CAC35523.1| gSG7蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基113-140
>gb|AAD47075.1|AF164151_1轉譯抑制因子4C(1A)[甘比亞瘧蚊]之殘基34-65
>emb|CAC35519.1|似gSG2之蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基2-27
>emb|CAC35451.1|假設的蛋白質[甘比亞瘧蚊]及>gb|EAU75730.1| ENSANGP00000031975[甘比亞瘧蚊str.PEST]
>emb|CAC35524.1| D7r4蛋白質[甘比亞瘧蚊]及
>gb|AAK84945.1| D7相關性4蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基8-26
>ref|XP_001230998.1| ENSANGP00000014906[甘比亞瘧蚊str.PEST]及gb|EAU76798.1| ENSANGP00000014906[甘比亞瘧蚊str.PEST]之殘基72-102
>ref|XP_316361.2| ENSANGP00000012984[甘比亞瘧蚊str.PEST]及>gb|EAA10852.2| ENSANGP00000012984[甘比亞瘧蚊str.PEST]之殘基176-211
>ref|XP_314140.3| ENSANGP00000015780[甘比亞瘧蚊str.PEST]及gb|EAA09398.3| ENSANGP00000015780[甘比亞瘧蚊str.PEST]之殘基43-78
>ref|XP_314140.3| ENSANGP00000015780[甘比亞瘧蚊str.PEST]及gb|EAA09398.3| ENSANGP00000015780[甘比亞瘧蚊str.PEST]之殘基128-151
>emb|CAC35522.1| gSG6蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基7-32
該多胜肽較佳並非完全節肢動物唾液蛋白質。
適用於本發明之序列編號係根據已充份確定之原則而定義。因此，該編號係自己確定之轉譯起始密碼子(ATG)以1開始。就可將相關蛋白質編碼之基因組的片段而言，其相當於甲硫胺酸(M)。換言之，如藉其中該等序列業經揭示之資料庫(亦即GenBank,SwissProt等)所使用並定義，就以相關蛋白質序列中之第一胺基酸表示之甲硫胺酸而言，其係以1開始。
參考以下附圖，僅以實例說明更詳細地描述本發明，其中：第1圖表示根據以下實例所揭示之方法所製成之甘比亞瘧蚊唾液腺的IEF膠片(考馬斯藍染色(Comassie Blue stain))；第2圖表示第1圖之IEF膠片的SDS-PAGE(銀染色法)-紅色長方形表示該等標靶蛋白質(<30kDa)之一的位置；第3A-3I圖表示該疫苗對蚊子之繁殖能力的影響之資料，該等資料如下：
3A：飼養百分比3B：生蛋平均數
3C：產卵平均數3D：孵化百分比
3E：幼蟲平均數3F：蛹平均數
3G：蛹化百分比3H：出現百分比
3I：成蟲平均數
第4圖表示餵食免疫化小鼠後，有關於蚊子之存活百分比的資料；第5圖表示在經實驗3之抗原活體外刺激96小時後，IFN-γ產生；第6圖表示在血清中對根據實驗3之抗原的總Ig反應；第7圖表示根據實據4，於第21天在血清中對AGS-混合物之總Ig反應；第8圖表示與對照NRP-混合物免疫化群組比較，實驗4之該AGS-混合物免疫化群組顯示存活率增加；第9圖表示如根據以下實例所揭示之方法所製成之甘
比亞瘧蚊唾液腺的一般SDS膠片。
上述多胜肽典型上包含一或多個(較佳2或多個)抗原決定位。這些抗原決定位較佳為T細胞抗原決定位，諸如細胞毒殺性T淋巴細胞(CTL)抗原決定位，但是亦可含有B細胞抗原決定位。一般而言，該多胜肽對節肢動物唾液蛋白質且較佳對多種此等蛋白質可產生免疫性。就本文而言，對節肢動物唾液蛋白質可產生免疫性之多胜肽係意指本身為節肢動物唾液蛋白質之一部份且可引起免疫系統反應之多胜肽。一種用於測定多胜肽是否具有此種致免疫性之方法係揭示在下文實驗2中。然而，本發明不限於此等方法且若必要，熟練者可選擇適於測定致免疫性之任何已知方法。
在本發明中，該多胜肽組成物含一或多種如上述之序列。典型上，若必要，2、3、4、5或更多種此等序列可存在於該多胜肽內。此等抗原決定位存在愈多，在具有不同HLA及MHC之人類及/或動物群體內所能提供之保護效果愈大。若所包含之該等抗原決定位係得自多種不同節肢動物之唾液或由不同節肢動物物種之唾液蛋白質共享且因此可提供抗藉多種不同節肢動物而傳播之疾病的保護作用，則上述特別屬實。典型上，該多胜肽組成物包含10或較少個多胜肽、較佳6或較少個多胜肽且典型上自2-10個多胜肽、且更佳自2-6個多胜肽。
若必要，根據本發明之該多胜肽組成物亦可包含一或
多種非抗原決定位之另外序列。典型上，這等另外序列係得自一或多種節肢動物唾液蛋白質、較佳選自SEQ ID NO：45-85之序列或彼等之亞序列。這些序列可位於2或多種上述序列(該等抗原決定位)之間、或可位於該多胜肽之一或兩末端。此等另外序列之存在應該不會影響多胜肽之機能，但其限制條件為整體上，該多胜肽不能太大，其會干擾該等抗原決定位在脊椎動物之免疫系統的表現。
在最佳實施例中，該等得自上述蛋白質之序列為以下序列式其範圍內之序列：SEQ ID NO：45->gi|18389913|gb|AAL68793.1|AF457563_1假設的蛋白質161[甘比亞瘧蚊]MHLTLFTVAVLLLAAAALLLLLPPAYSTTLTPPAPPRLSHLGITIGRI
SEQ ID NO：46->gi|18389909|gb|AAL68791.1|AF457561_1假設的蛋白質14[甘比亞瘧蚊]MPLSYCHLFLTHTLARALSFSRSDCLKFSEKRLLFSGSKTFPTTLL
SEQ ID NO：47->gi|18389907|gb|AAL68790.1|AF457560_1假設的蛋白質13[甘比亞瘧蚊]MKNVFFALLLVVLVCCLVSVQGNEIIQNVVKRSIPLRQLILQHNALDDSNSDSGSQ
SEQ ID NO：48->gi|18389903|gb|AAL68788.1|AF457558_1假設的蛋白質11[甘比亞瘧蚊]MCIFFQAGIKLLVLLICLFFYHTHCTTAYLWLAMGVEAKSIKARGTAHSKSRTSTN
SEQ ID NO：49->gi|62546227|gb|AAX86005.1| hyp3.5前驅體[甘比亞瘧蚊]MFLKGSFPRFQMCVMLIGFFSSAKCLMCFADWEGMLLMTMEVFDFQLIVFTPVLKRS
SEQ ID NO：50->gi|18389899|gb|AAL68786.1|AF457556_1似唾液腺7之蛋白質[甘比亞瘧蚊]
SEQ ID NO：51->gi|18389911|gb|AAL68792.1|AF457562_1假設的蛋白質15[甘比亞瘧蚊]
SEQ ID NO：52->gi|62546225|gb|AAX86004.1| hyp6.3前驅體[甘比亞瘧蚊]
SEQ ID NO：53->gi|17026153|emb|CAD12038.1| Sec61蛋白質[甘比亞瘧蚊]
SEQ ID NO：54->gi|62546223|gb|AAX86003.1| hyp6.2前驅體[甘比亞瘧蚊]
SEQ ID NO：55->gi|18389915|gb|AAL68794.1|AF457564_I假設的蛋白質17[甘比亞瘧蚊]
SEQ ID NO：56->gi|87080391|gb|ABD18596.1|防衛素[甘比亞
瘧蚊]
SEQ ID NO：57->gi|18389901|gb|AAL68787.1|AF457557_1假設的蛋白質10[甘比亞瘧蚊]
SEQ ID NO：58->gi|18389905|gb|AAL68789.1|AF457559_1假設的蛋白質12[甘比亞瘧蚊]
SEQ ID NO：59->gi|4127344|emb|CAA76832.1| cE5蛋白質[甘比亞瘧蚊]
SEQ ID NO：60->gi|4210617|emb|CAA10259.1| SG2蛋白質
[甘比亞瘧蚊]
SEQ ID NO：61->gi|4127309|emb|CAA76820.1|假設的蛋白質[甘比亞瘧蚊]
SEQ ID NO：62->gi|4375824|emb|CAA76825.1|視蛋白[甘比亞瘧蚊]
SEQ ID NO：63->gi|62546233|gb|AAX86008.1|未知[甘比亞瘧蚊]
SEQ ID NO：64->gi|3378531|emb|CAA03872.1| D7r2蛋白質[甘比亞瘧蚊]
SEQ ID NO：65->gi|3378529|emb|CAA03871.1| D7r3蛋白質[甘比亞瘧蚊]
SEQ ID NO：66->gi|18389893|gb|AAL68783.1|AF457553_1似黏液素蛋白質[甘比亞瘧蚊]
SEQ ID NO：67->gi|18389881|gb|AAL68777.1|AF457547_1硒蛋白質[甘比亞瘧蚊]
SEQ ID NO：68->gi|18389879|gb|AAL68776.1|AF457546_1 30kDa蛋白質[甘比亞瘧蚊]
SEQ ID NO：69->gi|18378603|gb|AAL68639.1|AF458073_1 D7相關性5蛋白質[甘比亞瘧蚊]
SEQ ID NO：70->gi|18389897|gb|AAL68785.1|AF457555_1似唾液腺1之4蛋白質[甘比亞瘧蚊]
SEQ ID NO：71->gi|18389883|gb|AAL68778.1|AF457548_1抗原5相關性1蛋白質[甘比亞瘧蚊]
SEQ ID NO：72->gi|83016748|dbj|BAE53441.1| DsRed[合成建構物]
SEQ ID NO：73->gi|18389895|gb|AAL68784.1|AF457554_1似唾液腺1之3蛋白質[甘比亞瘧蚊]
蛋白質長形式[甘比亞瘧蚊]
SEQ ID NO：75->emb|CAC35527.1| gSG9蛋白質[甘比亞瘧蚊]
SEQ ID NO：76->sp|Q9U9L1|RS17_ANOGA 40S核糖核蛋白體蛋白質
SEQ ID NO：77->emb|CAC35523.1| gSG7蛋白質[甘比亞瘧蚊]
SEQ ID NO：78->gb|AAD47075.1|AF164151_1轉譯抑制因子4C(1A)[甘比亞瘧蚊]
SEQ ID NO：79->emb|CAC35519.1|似gSG2之蛋白質[甘比亞瘧蚊]
SEQ ID NO：80->emb|CAC35451.1|假設的蛋白質[甘比亞瘧蚊]
SEQ ID NO：81>emb|CAC35524.1| D7r4蛋白質[甘比亞瘧蚊]
SEQ ID NO：82->ref|XP_001230998.1| ENSANGP00000014906[甘比亞瘧蚊str.PEST]
SEQ ID NO：83->ref|XP_316361.2| ENSANGP00000012984[甘比亞瘧蚊str.PEST]
SEQ ID NO：84->ref|XP_314140.3| ENSANGP00000015780[甘比亞瘧蚊str.PEST]
SEQ ID NO：85->emb|CAC35522.1| gSG6蛋白質[甘比亞瘧蚊]
本發明該等胜肽，諸如SEQ ID NO：1-44之胜肽及上述SEQ ID NO：131-134範圍內之胜肽，較佳於其一或兩末端包含一或多種另外胺基酸以幫助其加工成為疫苗。典型上，這些另外胺基酸為如上述SEQ ID NO：45-85之較大蛋白質(這些較大蛋白質含有SEQ ID NO：1-44之序列)內所示之SEQ ID NO：1-44的各末端彼此鄰接之胺基酸。於各末端之另外胺基酸數較佳為自1-5個、更佳自1-3個且最佳2個。在各這些實例中，若於SEQ ID NO：1-44之序列的末端的另外胺基酸數少於2個，則該等另外胺基酸包括於末端之所有其餘胺基酸(群)。相當於SEQ ID NO：1-44之本類型的更特佳序列如下：SEQ ID NO：86 MHLTLFTVAVLLLAAAALLLLLPPAYSTTLTPPAP
SEQ ID NO：87 MPLSYCHLFLTHTLARALSFSRSDCLKF
SEQ ID NO：88 MKNVFFALLLVVLVCCLVSVQGNEIIQ
SEQ ID NO：89 GIKLLVLLICLFFYHTHCTTAYLWLAMGVEA
SEQ ID NO：90 MFLKGSFPRFQMCVMLIGFFSSAKCLMC
SEQ ID NO：91 KQNDYQALLGLCCPWIDLAAADLPMRRHAKARE
SEQ ID NO：92 MKFYSVGKLVKVLLVMAVCCLLLCTAPTGADPLPG
SEQ ID NO：93 MKFAFAFVLIALFAVFAVSQALPQPEQAAASS
SEQ ID NO：94 SNDGASAITKIVLELTPEQAAAVQK
SEQ ID NO：95 AITLFIFLVCCQIPLFGIMSSDSADPFYWIRVILASN
SEQ ID NO：96 MGRVMCLLRLMSTLLVVLSIVGKKT
SEQ ID NO：97 MKLYSGYRLLVLLVMTVCCLLLFIAPTGADPLPGQTQRTLGY
SEQ ID NO：98 CKMYCVIKGKTGGYCNSEGLCTCRAEDLHFLLKPIINKD
SEQ ID NO：99 TVNAEDPRTELIGCGSVLFHLAANRLSLQLEEFAVCKRSN
SEQ ID NO：100 CVALIGLLLCSVQSVTANDPVDALGACSGNLFGLLMTRLQQ
SEQ ID NO：101 MASKLFVLAFLCLALVVVVQSAPQYARGDVPTYD
SEQ ID NO：102 MKSMLVAFATLSVALVVVVAIPANFNYGGGGGYFINGTGQSF
SEQ ID NO：103 NAIYEKLPAYLSEVSARVNVLQVSLQHDLPNLQE
SEQ ID NO：104 STEMKLAKVALVTISLWFMAWTPYLVINFTGIFK
SEQ ID NO：105
GDLLPAKVIPDKTAAYVAYGGQETLVEHVEVLVHK
SEQ ID NO：106 NTFYTCFLGTSSLAGFKNAVDYDELLKAGKM
SEQ ID NO：107 QCVLEVLGFVEDNGELVFQELLGVLKMVDPDGDHA
SEQ ID NO：108 RRKLTPTVVVVLLCLTFVADALTIQELRAQIAQQRIQQRYGVTVATTSA
SEQ ID NO：109 CSSLSDYGLIELKEHCLECCQKDTEADSKLKVYPAAVLEVCT
SEQ ID NO：110 AITYICFILHGVSEIIPQQQKKTMKFLLLVASVLCLVLIVS
SEQ ID NO：111 EWRYFVVIALICPLIIVETLAVSD
SEQ ID NO：112 QLLLLYLDAADLRRALHQYQLLAAQGDRHLPQQIVKFVYA
SEQ ID NO：113 RKVLLTPALQAYIMDEHNLNRSNIALGRIRPYPSAVKMPTL
SEQ ID NO：114 DGVLKGETHKALKLKDGGHYLVEFKSIYMAK
SEQ ID NO：115 ALVLHSMLVNASLAEMVKESYQTHGADGRMVVRMLKFVRLLPGA
SEQ ID NO：116 VQRVRALRALLETLLQHQGEQNNDVYLIRLAHETGR
SEQ ID NO：117 VNELQQALSSLNAGSGSCAEVFNAYLPVHNKYIGVSRKIYH
SEQ ID NO：118 MCKFYRLISTLLVVVVIAPRHQCSPFFFQYNRPYLSQ
SEQ ID NO：119 RDNYVPDVSALEQDIIEVDPETKEMLKHLDFNNIVVQLTN
SEQ ID NO：120 HDQYSMECLEAAEPKYLDGLKTLADETAQCMR
SEQ ID NO：121 EQEYAQVTKMLGNGRLEAMCFDGVKRLCHIRGKLRK
SEQ ID NO：122 MKLFLTLLSTLSVAMVFALPAHHHSRGGD
SEQ ID NO：123 SDELEEARLVAEELEERQQELDYLKRYLVGRLQAVAI
SEQ ID NO：124 IISYFLTVCLLALVQSETVQDCE
SEQ ID NO：125 DSAMTNANLVGLTISLAYAIFFLLYTPPTGRSSYW
SEQ ID NO：126 VVSFAWLLYGIILRSNFLVVQNLMALALSAVQLSLFIIFP
SEQ ID NO：127 TSAFPFISGFLSCFMWLKYGVLTEESTLILVNFIGSALFF
SEQ ID NO：128 VIGLLCCCLAVLFFASPLTMLAHVIRTQ
SEQ ID NO：129 VELLLAMVLLPLLLLESVVPYAAAEKVWVD
更特佳之此等胜肽亦包括以下：>gi|18389913|gb|AAL68793.1|AF457563_1假設的蛋白質16[甘比亞瘧蚊]之殘基1-35
>gi|18389909|gb|AAL68791.1|AF457561_1假設的蛋白質14[甘比亞瘧蚊]之殘基1-28
>gi|18389907|gb|AAL68790.1|AF457560_1假設的蛋白質13[甘比亞瘧蚊]之殘基1-27
>gi|18389903|gb|AAL68788.1|AF457558_1假設的蛋白質11[甘比亞瘧蚊]之殘基8-38
>gi|62546227|gb|AAX86005.1| hyp3.5前驅體[甘比亞瘧蚊]
之殘基1-28
>gi|18389899|gb|AAL68786.1|AF457556_1似唾液腺7蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基12-14
>gi|18389911|gb|AAL68792.1|AF457562_1假設的蛋白質15[甘比亞瘧蚊]之殘基1-35
>gi|62546225|gb|AAX86004.1| hyp6.3前驅體[甘比亞瘧蚊]之殘基1-32
>gi|62546225|gb|AAX86004.1| hyp6.3前驅體[甘比亞瘧蚊]之殘基32-56
>gi|17026153|emb|CAD12038.1| Sec61蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基36-72
>gi|62546223|gb|AAX86003.1| hyp6.2前驅體[甘比亞瘧蚊]之殘基1-25
>gi|18389915|gb|AAL68794.1|AF457564_1假設的蛋白質17[甘比亞瘧蚊]之殘基15-56
>gi|87080391|gb|ABD18596.1|防衛素[甘比亞瘧蚊]之殘基55-93
>gi|18389901|gb|AAL68787.1|AF457557_1假設的蛋白質10[甘比亞瘧蚊]之殘基20-59
>gi|18389905|gb|AAL68789.1|AF457559_1假設的蛋白質12[甘比亞瘧蚊]之殘基5-45
>gi|4127344|emb|CAA76832.1| cE5蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基1-34
>gi|4210617|emb|CAA10259.1| SG2蛋白質[甘比亞瘧蚊]之
殘基1-42
>gi|4127309|emb|CAA76820.1|假設的蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基89-122
>gi|4375824|emb|CAA76825.1|視白質[甘比亞瘧蚊]之殘基63-96
>gi|62546233|gb|AAX86008.1|未知[甘比亞瘧蚊]之殘基39-73
>gi|3378531|emb|CAA03872.1| D7r2蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基115-145
>gi|3378529|emb|CAA03871.1| D7r3蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基61-95
>gi|18389893|gb|AAL68783.1|AF457553_1似黏液素蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基21-69
>gi|18389881|gb|AAL68777.1|AF457547_1硒蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基41-82
>gi|18389879|gb|AAL68776.1|AF457546_1 30kDa蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基4-44
>gi|18378603|gb|AAL68639.1|AF458073_1 D7-相關性5蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基2-25
>gi|18389897|gb|AAL68785.1|AF457555_1似唾液腺1之4蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基18-57
>gi|18389883|gb|AAL68778.1|AF457548_1抗原5相關性1蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基57-97
>gi|83016748|dbj|BAE53441.1| DsRed[合成建構物]之殘基
156-186
>gi|18389895|gb|AAL68784.1|AF457554_1似唾液腺1之3蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基35-78
>gi|18389895|gb|AAL68784.1|AF457554_1似唾液腺1之3蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基189-224
>gi|18389891|gb|AAL68782.1|AF457552_1 D7蛋白質長形式[甘比亞瘧蚊]之殘基111-151
>emb|CAC35527.1| gSG9蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基1-37
>sp|Q9U9L1|RS17_ANOGA 40S核糖核蛋白體蛋白質S17之殘基81-120
>emb|CAC35523.1| gSG7蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基111-142
>gb|AAD47075.1|AF164151_1轉譯抑制因子4C(1A)[甘比亞瘧蚊]之殘基32-67
>emb|CAC35519.1|似gSG2蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基1-29
>emb|CAC35451.1|假設的蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基106-142
>emb|CAC35524.1| D7r4蛋白質[甘比亞瘧蚊]之殘基6-28
>ref|XP_001230998.1| ENSANGP00000014906[甘比亞瘧蚊str.PEST]之殘基70-104
>ref|XP_316361.2| ENSANGP00000012984[甘比亞瘧蚊str.PEST]之殘基174-213
>ref|XP_314140.3| ENSANGP00000015780[甘比亞瘧蚊str.PEST]之殘基41-80
>ref|XP_314140.3| ENSANGP00000015780[甘比亞瘧蚊str.PEST]之殘基126-153
>emb|CAC35522.1| gSG6 protein[甘比亞瘧蚊]之殘基5-34
在本發明之替代實施例中，本發明係有關於含與上述多胜肽同源之多胜肽，特別為與SEQ ID NO：1-134之任一胜肽同源之胜肽的組成物。上文有關於這些序列之同源性較佳為60%、75%、80%、85%、90%、95%或實質上100%。
就本發明而言，第一多胜肽序列對第一多胜肽序列之同源性百分比之定義為與第一序列之胺基酸之位置及同一性相配的第二序列中之胺基酸殘留數除以該第二多胜肽中之胺基酸殘基總數(第一及第二多胜肽必須具有相同胺基酸殘基數)並乘以100。在本發明中，該多胜肽與特定序列之同源性較佳為75%或更高、80%或更高、85%或更高、90%或更高、95%或更高或100%(或實質上100%)。
在本發明中，該節肢動物傳播病並未特別受限，且該等多胜肽對任何已知節肢動物傳播病可產生免疫性及/或可自其衍生免疫性。本發明所涵蓋之疾病、病原及病媒之實例揭示在上文表1內。然而，重大疾病為如藉瘧原蟲屬之菌株中的任一種而導致之瘧疾(其包括任何瘧疾菌株)。
與上述SEQ ID NO：1-134中之任一種同源的專一性序列較佳為可以在公開的NCBI蛋白質資料庫內找到之已知節肢動物蛋白質中的合適位置之序列，該資料庫之線上URL位址為http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query/static/help/helpdoc.ht ml#Protein。該列表典型上呈以下格式1版本號碼(gi號碼)|資料庫鑑定(例如gb代表GenBank)|NCBI存取號碼|視需要選用之另外訊息(例如可衍化蛋白質序列之該核苷酸序列)。該蛋白質序列資料庫含有得自GenBank、EMBL、及DDBJ中之DNA序列之已轉譯密碼區的序列資料、以及已提交Protein Information Resource(PIR)、SWISS-PROT,Protein Research Foundation(PRF)、及Protein Data Bank(PDB)之蛋白質序列(得自已溶解結構之序列)。
上文定義之該等序列內之抗原決定位並未特別受限，但其限制條件為該等抗原決定位含有7或更多個胺基酸殘基。該等抗原決定位之長度較佳至少適於較小致免疫性抗原決定位，諸如在特定脊椎動物物種(諸如人類)體內之CTL、T輔助及B細胞抗原決定位。典型上該等抗原定位含有8、9、10或11個胺基酸殘基，但是若必要，可含有更多個胺基酸。
雖然其可包含多個胺基酸，典型上，該多胜肽包含100或更少個、較佳介於7與100個間之胺基酸、且更佳自8-75個胺基酸。該大小不應該如此大以致有用的抗原決定位受到免疫系統內之非保護性抗原決定位競爭的不利影響(據此，並不包括完整蛋白質)，該大小亦不應該如此小以致僅提供很窄範圍之保護作用。更佳範圍為自15-75個胺基酸、20-55個胺基酸、及23-50個胺基酸。該多胜肽更特佳由一選自由上文定義之序列的序列所組成(或實質上由其組成)。
除上述多胜肽外，本發明亦提供包含2或多種本發明之
多胜肽作為多分支鏈多胜肽或鏈狀相接的序列之多抗原決定位致免疫性多胜肽。這些多抗原決定位多胜肽之大小並未受限且可包含，例如至高1400或至高900或至高550個胺基酸。因此，其不僅涵蓋上述之多胜肽，而且亦包括較大的多胜肽，但其限制條件為這些較大的多胜肽包含2或更多個單元，各單元由本發明之多胜肽所組成。因此，本發明涵蓋具有100個重覆蓋單元之本發明之7-mer的多胜肽，實際上，多胜肽具有52個單元之8-mer抗原決定位、及23個單元之第二10-mer抗原決定位。此種類型之多胜肽不會發生與僅包含一或兩個抗原決定位之類似長度之多胜肽有關的競爭性問題。為了避免疫疑惑，該多抗原決定位可包含相同抗原決定位之多種製物、或多種不同抗原決定位之單一複製物、或2或更多個抗原決定位之多複製物。多抗原決定位多胜肽更特佳包含在上述SEQ ID NO：1-44(且尤佳為SEQ ID 1-6、7、8、11、12、15、16、20、26、28、30-32、35、41、及42中之序列)或SEQ ID NO：86-134中之一或多種序列。
如業經描述，本發明提供含一或多種、較佳2或多種如上文定義之不同多胜肽的多胜肽組成物。因此，該多胜肽組成物可在相同序列、混合物或配方中包含任何數量之本發明多胜肽。多種多胜肽一起之存在很有用，因為其各自可引起免疫反應，增加該組成物之保護作用。該組成物更特佳含有SEQ ID NO：1-44之2或多種(或所有)序列(且尤佳在SEQ ID NO：1-6、7、8、11、12、15、16、20、26、28、
30-32、35、41、及42中之序列)、及/或SEQ ID NO：86-134內之2或多個抗原決定位。在該組成物內，各序列及/或抗原決定位可以呈各別胜肽或呈許多含幾個鏈狀相接的抗原決定位及/或序列之較大胜肽(例如在一較大胜肽內鏈狀相接的3種序列及在另一較大胜肽內鏈狀相接的另外4種序列)存在。
本發明亦提供多胜肽建構物，該建構物包含如上文定義之多胜肽、及載體。可藉合併一或多種抗原決定位及/或如上文定義之多胜肽與該載體而形成該建構物。該載體可以是分子，諸如佐劑及/或賦形劑。在本文中，合併係意指一起混合或一起連接(例如經由共價鍵結)。
本發明進一步提供用於醫學之如上文定義之多胜肽。亦提供可抗節肢動物傳播病之藥物或疫苗組成物，其包含如上文定義之多胜肽、及一或多種合適賦形劑及/或佐劑、或如上文定義之多胜肽建構物及視需要選用之一或多種合適賦形劑及/或佐劑(若該建構物之載體部份本身為賦形劑或佐劑，則可需要另外賦形劑或佐劑)。該賦形劑或佐劑並未特別受限，且可使用適用於藥物及疫苗之任何賦形劑及佐劑。可根據適於本發明之任何已知方法，諸如藉混合本發明之多胜肽及合適賦形劑而製備該藥物或疫苗組成物。
本發明亦提供一種製備如上文定義之多胜肽的方法。該方法並未特別受限，且典型上包括結合2或多種抗原決定位以形成該多胜肽。然而，可藉直接化學合成法(例如一次併入一個胺基酸，直到形成該完整多胜肽為止)或重組方法
而合成該多胜肽。此等通用方法為熟練者所熟知且若必要可經調整以適於本發明。在某些情況下，本發明該多胜肽可以於其一或兩末端包含另外胺基酸序列以幫助該多胜肽之合成。這些另外序列之長度較佳為自1-5個胺基酸。典型上包括2個胺基酸。此等序列之實例係以如上述之SEQ ID NO：86-129提供。
本發明又進一步提供如上文定義之多胜肽或組成物在製備能有效治療或預防節肢動物傳播病之藥物或疫苗的用途。亦提供一種治療或預防節肢動物傳播病之方法，該方法包括對脊椎動物投與如上文定義之多胜肽、組成物、藥物或疫苗。該投藥方法並未特別受限，且可包括皮下、肌內、靜脈、皮內或鼻內投藥，或可口服(例如呈丸劑或液體製劑形式)，或若要，可以呈栓劑形式。此等投藥製劑並未特別受限，且可使用為熟練者已知之合適修飾法修飾之已知形式。劑量並未特別受限且根據所涉及個體之大小、體重及物種，每個體之劑量範圍可自1微克(pg)至100克、較佳1毫微克(ng)至100克多胜肽。
本發明可適用於任何脊椎動物，因為脊椎動物之免疫系統係以相關方式運作。典型上，本文所謂之脊椎動物為哺乳動物、鳥、爬蟲類或魚。該脊椎動物物為人類、馴養動物(諸如狗或貓)、農場動物(諸如豬或馬)、牛類動物(諸如牛)或家禽(諸如馴養的禽、農場禽或狩獵的禽)。當該脊椎動物為禽時，其較佳為雞、火雞、鴨或鵝。
可以與本發明中之特定T細胞抗原決定位有關之人類
MHC(HLA)實例包括以下：
A*010101、A*010102、A*010103、A*0102、A*0103、A*0104N、A*0106、A*0107、A*0108、A*0109、A*0110、A*02010101、A*02010102L、A*020102、A*020103、A*020104、A*020105、A*020106、A*020107、A*020108、A*020109、A*020110、A*020111、A*0202、A*020301、A*020302、A*0204、A*0205、A*020601、A*020602、A*020603、A*0207、A*0208、A*0209、A*0210、A*0211、A*0212、A*0213、A*0214、A*0215N、A*0216、A*021701、A*021702、A*0218、A*0219、A*022001、A*022002、A*0221、A*0222、A*0224、A*0225、A*0226、A*0227、A*0228、A*0229、A*0230、A*0231、A*0232N、A*0233、A*0234、A*023501、A*023502、A*0236、A*0237、A*0238、A*0239、A*0240、A*0241、A*0242、A*0243N、A*0244、A*0245、A*0246、A*0247、A*0248、A*0249、A*0250、A*0251、A*0252、A*0253N、A*0254、A*0255、A*0256、A*0257、A*0258、A*0259、A*0260、A*0261、A*0262、A*0263、A*0264、A*0265、A*0266、A*0267、A*0268、A*0269、A*0270、A*0271、A*0272、A*0273、A*03010101、A*03010102N、A*03010103、A*030102、A*030103、A*0302、A*0303N、A*0304、A*0305、A*0306、A*0307、A*0308、A*0309、A*0310、A*0311N、A*0312、A*0313、A*0314、A*110101、A*110102、A*1102、A*1103、A*1104、
A*1105、A*1106、A*1107、A*1108、A*1109、A*1110、A*1111、A*1112、A*1113、A*1114、A*1115、A*1116、A*1117、A*1118、A*1119、A*2301、A*2302、A*2303、A*2304、A*2305、A*2306、A*2307N、A*2308N>、A*2309、A*2310、A*2311N、A*2312、A*24020101、A*24020102L、A*240202、A*240203、A*240204、A*240205、A*240206、A*240301、A*240302、A*2404、A*2405、A*2406、A*2407、A*2408、A*2409N、A*2410、A*2411N、A*2413、A*2414、A*2415、A*2417、A*2418、A*2419、A*2420、A*2421、A*2422、A*2423、A*2424、A*2425、A*2426、A*2427、A*2428、A*2429、A*2430、A*2431、A*2432、A*2433、A*2434、A*2435、A*2436N、A*2437、A*2438、A*2439、A*2440N、A*2441、A*2442、A*2443、A*2444、A*2445N、A*2446、A*250101、A*250102、A*2502、A*2503、A*2504、A*2601、A*2602、A*2603、A*2604、A*2605、A*2606、A*260701、A*260702、A*2608、A*2609、A*2610、A*2611N、A*2612、A*2613、A*2614、A*2615、A*2616、A*2617、A*2618、A*2619、A*2620、A*2621、A*2622、A*2623、A*29010101、A*29010102N、A*290201、A*290202、A*290203、A*2903、A*2904、A*2905、A*2906、A*2907、A*2908N、A*2909、A*2910、A*2911、A*300101、A*300102、A*300201、A*300202、A*3003、A*3004、A*3006、A*3007、A*3008、A*3009、A*3010、A*3011、A*3012、A*310102、A*3102、A*3103、A*3104、A*3105、
A*3106、A*3107、A*3108、A*3109、A*3110、A*3201、A*3202、A*3203、A*3204、A*3205、A*3206、A*3207、A*3208、A*3301、A*330301、A*330302、A*3304、A*3305、A*3306、A*3307、A*3401、A*3402、A*3403、A*3404、A*3405、A*3406、A*3601、A*3602、A*3603、A*3604、A*4301、A*6601、A*6602、A*6603、A*6604、A*680101、A*680102、A*680103、A*6802、A*680301、A*680302、A*6804、A*6805、A*6806、A*6807、A*6808、A*6809、A*6810、A*6811N、A*6812、A*6813、A*6814、A*6815、A*6816、A*6817、A*6818N、A*6819、A*6820、A*6821、A*6822、A*6823、A*6824、A*6825、A*6826、A*6827、A*6901、A*7401、A*7402、A*7403、A*7404、A*7405、A*7406、A*7407、A*7408、A*7409、A*7410、A*8001.
B*070201、B*070202、B*070203、B*070204、B*0703、B*0704、B*0705、B*0706、B*0707、B*0708、B*0709、B*0710、B*0711、B*0712、B*0713、B*0714、B*0715、B*0716、B*0717、B*0718、B*0719、B*0720、B*0721、B*0722、B*0723、B*0724、B*0725、B*0726、B*0727、B*0728、B*0729、B*0730、B*0731、B*0732、B*0733、B*0734、B*0735、B*0736、B*0737、B*0738、B*0801、B*0802、B*0803、B*0804、B*0805、B*0806、B*0807、B*0808N、B*0809、B*0810、B*0811、B*0812、B*0813、
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DRB1*1430、DRB1*1431、DRB1*1432、DRB1*1433、DRB1*1434、DRB1*1435、DRB1*1436、DRB1*1437、DRB1*1438、DRB1*1439、DRB1*1440、DRB1*1441、DRB1*1442、DRB1*1443、DRB1*1444、DRB1*1445、DRB1*1446、DRB1*1447、DRB1*1448、DRB1*150101、DRB1*150102、DRB1*150103、DRB1*150104、DRB1*150105、DRB1*150201、DRB1*150202、DRB1*150203、DRB1*1503、DRB1*1504、DRB1*1505、DRB1*1506、DRB1*1507、DRB1*1508、DRB1*1509、DRB1*1510、DRB1*1511、DRB1*1512、DRB1*1513、DRB1*1514、DRB1*1515、DRB1*1516、DRB1*160101、DRB1*160102、DRB1*160201、DRB1*160202、DRB1*1603、DRB1*1604、DRB1*160501、DRB1*160502、DRB1*1607、DRB1*1608.
DRB2*0101、DRB3*010101、DRB3*01010201、DRB3*01010202、DRB3*010103、DRB3*010104、DRB3*0102、DRB3*0103、DRB3*0104、DRB3*0105、DRB3*0106、DRB3*0107、DRB3*0108、DRB3*0109、DRB3*0110、DRB3*0111、DRB3*0201、DRB3*020201、DRB3*020202、DRB3*020203、DRB3*020204、DRB3*0203、DRB3*0204、DRB3*0205、DRB3*0206、DRB3*0207、DRB3*0208、DRB3*0209、DRB3*0210、
DRB3*0211、DRB3*0212、DRB3*0213、DRB3*0214、DRB3*0215、DRB3*0216、DRB3*0217、DRB3*0218、DRB3*0219、DRB3*030101、DRB3*030102、DRB3*0302、DRB3*0303、DRB4*01010101、DRB4*0102、DRB4*01030101、DRB4*01030102N、DRB4*010302、DRB4*010303、DRB4*010304、DRB4*0104、DRB4*0105、DRB4*0106、DRB4*0107、DRB4*0201N、DRB4*0301N、DRB5*010101、DRB5*010102、DRB5*0102、DRB5*0103、DRB5*0104、DRB5*0105、DRB5*0106、DRB5*0107、DRB5*0108N、DRB5*0109、DRB5*0110N、DRB5*0111、DRB5*0112、DRB5*0113、DRB5*0202、DRB5*0203、DRB5*0204、DRB5*0205、DRB6*0101、DRB6*0201、DRB6*0202、DRB7*010101、DRB7*010102、DRB8*0101、DRB9*0101.
DQA1*010101、DQA1*010102、DQA1*010201、DQA1*010202、DQA1*0103、DQA1*010401、DQA1*010402、DQA1*0105、DQA1*0106、DQA1*0107、DQA1*0201、DQA1*030101、DQA1*0302、DQA1*0303、DQA1*040101、DQA1*040102、DQA1*0402、DQA1*0403N、DQA1*0404、DQA1*050101、DQA1*050102、DQA1*0502、DQA1*0503、DQA1*0504、DQA1*0505、DQA1*060101、DQA1*060102、DQA1*0602.
DQB1*020101、DQB1*020102、DQB1*0202、DQB1*0203、DQB1*030101、DQB1*030102、DQB1*030201、DQB1*030202、DQB1*030302、DQB1*030303、DQB1*0304、DQB1*030501、DQB1*030502、DQB1*030503、DQB1*0306、DQB1*0307、DQB1*0308、DQB1*0309、DQB1*0310、DQB1*0311、DQB1*0312、DQB1*0313、DQB1*0401、DQB1*0402、DQB1*050101、DQB1*050102、DQB1*050201、DQB1*050202、DQB1*050301、DQB1*050302、DQB1*0504、DQB1*060101、DQB1*060102、DQB1*060103、DQB1*0602、DQB1*0603、DQB1*060401、DQB1*060402、DQB1*060501、DQB1*060502、DQB1*0606、DQB1*0607、DQB1*0608、DQB1*0609、DQB1*0610、DQB1*061101、DQB1*061102、DQB1*0612、DQB1*0613、DQB1*0614、DQB1*0615、DQB1*0616、DQB1*0617、DQB1*0618、DQB1*0619、DQB1*0620、DQB1*0621、DQB1*0622、DQB1*0623.
DPA1*010301、DPA1*010302、DPA1*010303、DPA1*0104、DPA1*0105、DPA1*0106、DPA1*0107、DPA1*0108、DPA1*020101、DPA1*020102、DPA1*020103、
DPA1*020104、DPA1*020105、DPA1*020106、DPA1*020201、DPA1*020202、DPA1*020203、DPA1*0203、DPA1*0301、DPA1*0302、DPA1*0303、DPA1*0401.
DPB1*010101、DPB1*010102、DPB1*010103、DPB1*0102、DPB1*020102、DPB1*020103、DPB1*020104、DPB1*020105、DPB1*020106、DPB1*0202、DPB1*0203、DPB1*030101、DPB1*030102、DPB1*0302、DPB1*040101、DPB1*040102、DPB1*0402、DPB1*0501、DPB1*0601、DPB1*0801、DPB1*0901、DPB1*1001、DPB1*110101、DPB1*110102、DPB1*1301、DPB1*1401、DPB1*1501、DPB1*1601、DPB1*1701、DPB1*1801、DPB1*1901、DPB1*200101、DPB1*200102、DPB1*2101、DPB1*2201、DPB1*2301、DPB1*2401、DPB1*2501、DPB1*260101、DPB1*260102、DPB1*2701、DPB1*2801、DPB1*2901、DPB1*3001、DPB1*3101、DPB1*3201、DPB1*3301、DPB1*3401、DPB1*3501、DPB1*3601、DPB1*3701、DPB1*3801、DPB1*3901、DPB1*4001、DPB1*4101、DPB1*4401、DPB1*4501、DPB1*4601、DPB1*4701、DPB1*4801、DPB1*4901、DPB1*5001、DPB1*5101、DPB1*5201、DPB1*5301、DPB1*5401、DPB1*5501、DPB1*5601、DPB1*5701、DPB1*5801、DPB1*5901、DPB1*6001、DPB1*6101N、DPB1*6201、DPB1*6301、
DPB1*6401N、DPB1*6501、DPB1*6601、DPB1*6701、DPB1*6801、DPB1*6901、DPB1*7001、DPB1*7101、DPB1*7201、DPB1*7301、DPB1*7401、DPB1*7501、DPB1*7601、DPB1*7701、DPB1*7801、DPB1*7901、DPB1*8001、DPB1*8101、DPB1*8201、DPB1*8301、DPB1*8401、DPB1*8501、DPB1*8601、DPB1*8701、DPB1*8801、DPB1*8901、DPB1*9001、DPB1*9101、DPB1*9201、DPB1*9301、DPB1*9401、DPB1*9501、DPB1*9601、DPB1*9701、DPB1*9801、DPB1*9901.
DMA*0101、DMA*0102、DMA*0103、DMA*0104.
DMB*0101、DMB*0102、DMB*0103、DMB*0104、DMB*0105、DMB*0106.
DOA*010101、DOA*01010201、DOA*01010202、DOA*01010203、DOA*010103、DOA*01010401、DOA*01010402、DOA*010105.
DOB*01010101、DOB*01010102、DOB*010102、DOB*010201、DOB*010202、DOB*0103、DOB*01040101、
DOB*01040102.
H-2Db、H-2Dd、H-2Dk、H-2Dq、H-2Kb、H-2Kd、H-2Kk、H-2Ld、H-2M3、H-2Ad、H-2Ag7、H-2Ak、H2-Ab、H-2Ed、H-2Ek、H-2Bxk、H-2F、H-2I、H-2P、H-2R、H-2S、H-2Sxd、H-2T4、H-2U.
I-Ab、I-Ad、I-Ag7、I-Ak、I-Ap、I-Aq、I-Ar、I-As、I-Au、I-Av、I-Ea、I-Eb、I-Ed、I-Ek、I-Es、I-Eu、H-2Q、H-2Qa-2、H-2Qa-2a、Qa-1a、Qa-1b.
本發明並不受限於此等MHC及HLA分子，且若必要可僅藉確認物質，諸如具有該等分子之胜肽的反應性而使本發明適於新發現之此等分子。使用本領域之普遍已知的技術可輕易達成上述步驟。適用於本發明之更特佳HLA對偶基團包括以下：
根據本發明之最佳對偶基因如下：HLA-A*0201、HLA-A*0206、HLA-A*0301、HLA-A*1101、HLA-A*2402、HLA-A*3401、HLA-B*0702、HLA-B*0801、HLA-B*1301、HLA-B*27、HLA-B*4002、HLA-B*5101、HLA-Cw*03、HLA-cW*07
HLA-DRB1*0301、HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0701、HLA-DRB1*1501、HLA-DRB1*1104、HLA-DRB1*1101、HLA-DRB4*0101
HLA-DQA1*01、HLA-DQA1*02、HLA-DQA1*05
HLA-DQB1*03、HLA-DQB1*04、HLA-DQB1*05、HLA-DQB1*06
HLA-DPA1*01、HLA-DPA1*02
HLA-DPB1*02、HLA-DPB1*04
本發明現在可參考以下特定實施例僅以實例說明。
為了測定本發明之專一性序列的作用，可測試其對抗節肢動物唾液蛋白質成份之致免疫性。可致使脊椎動物產生能辨識專一性唾液蛋白質成份中之至少一抗原決定位的免疫系統細胞之此等序列可用於本發明之疫苗。
可使用熟練者已熟知之標準實驗室技術輕易地離析該等唾液蛋白質成份。可使用任何節肢動物唾液蛋白質成份，因為本發明者已確定該蛋白質成份之質量具重要性。特別有用為質量40kDa或較低、30kDa或較低、較佳自20-40kDa且更佳20kDa或較低之成份。
提供以下實驗程序以例證該蛋白質成份之可測試的候選序列。其可利用得自甘比亞瘧蚊之唾液，但是亦可使用任何節肢動物唾液。
自雌蚊菌株解剖甘比亞瘧蚊唾液腺對(SGP)。在20微升PBS內收集15對SGP並藉添加5微升含0.25% 2-β-ME之5x SDS-PAG試樣緩衝劑而溶解。渦旋並沸騰5分鐘後，將該蛋白質混合物裝載在Novex 4-20%梯度Tris-Glycine凝膠
(INVITROGEN)上。然後對該凝膠進行銀染色並拍照(見第9圖)。
該等虛線箭號表示用於選擇可用於免疫作用及研究之SGP成份(亦即<20kDa、20-40kDa、40-80kDa及>80kDa)之截止點的位置。該實心箭號表示用於選擇<30kDa且>30kDa之SGP成份之截止點的位置。
使用與上述代表性實驗程式類似之方法，製備適用於研究之幾種唾液蛋白質試樣。
自雌甘比亞瘧蚊解剖唾液腺(SG)並於-70℃下貯存在PBS內，直到使用為止。
為了進行凝膠分析，藉凍結-解凍而溶解SG添加劑Novex® IEF試樣緩衝劑(pH 3-10)(Invitrogen)並在Novex®凝膠(Invitrogen)內分析所形成物質。然後以12% TCA固定該凝膠。在水中清洗3次並經考馬斯藍染色。所形成凝膠示於第1圖內。
染色並脫染後，在20%乙醇內培育該IEF凝膠，費時10分鐘並將含具有該SG蛋白質之道的凝膠條狀物切除。在含20%乙醇之2x SDS-PAGE試樣緩衝劑內使該凝膠條狀物平衡5分鐘，在SDS-PAGE試樣緩衝劑內沖洗兩次並裝載在Novex® 4-20% Tris-Glycine凝膠(Invitrogen)之單井內。所形成凝膠示於第2圖內。
最後根據製造商之指示，使用Proteosilve染色套組(Sigma)對該含號己分離之SG蛋白質的凝膠進行染色。
自該凝膠鑑定用於分析之4種蛋白質群組(命名為化合
物1、2、3及4)。
化合物1 小於20kDa之唾液腺蛋白質成份
化合物2 20kDa<X<40kDa之唾液腺蛋白質成份
化合物3 40kDa<X<80kDa之唾液腺蛋白質成份
化合物4 大於80kDa之唾液腺蛋白質成份
(A)確定候選化合物在保護動物免疫於經感染蚊子(亦即經尼日約氏瘧原蟲屬(Plasmodium yoelii nigeriensis)感染之甘比亞瘧蚊)之螫咬的制抗。
(B)確定藉候選化合物對不同種類之蚊子(例如甘比亞瘧蚊及斯特芬西瘧蚊(Anopheles stephensi))所誘發之抗蚊反應的交叉反應性程度。
(C)確定候選化合物在預防螫咬免疫性及經感染小鼠後之藉尼日約氏瘧原蟲屬所致之蚊(甘比亞瘧蚊及斯特芬西瘧蚊)的感染之效力。
所選擇之化合物為上文所鑑定之化合物：化合物1 小於20kDa之唾液腺蛋白質成份
化合物2 20kDa<X<40kDa之唾液腺蛋白質成份
化合物3 40kDa<X<80kDa之唾液腺蛋白質成份
化合物4 大於80kDa之唾液腺蛋白質成份
使用CD1小鼠。有5個實驗群組(1、2、3、4及5)，其中
第1組為負對照組成物而第2-5組為試驗組，各組具有9隻動物。
第1天：以皮下注射劑量之候選疫苗化合物(第2組注射化合物1。第3組注射化合物2，以下類推)使各含9隻CD1小鼠之4個群組免疫化(第2、3、4及5組)(N=4×9=36)。
第14天：以相同劑量之候選疫苗候選疫苗化合物(第2組注射化合物1，第3組注射化合物2，以下類推)增強所有動物之免疫力。
第21天：測試所有流血之動物。冷凍(-20℃)貯存試樣，直到採集為止。將各組再分成亞組：A-5隻動物，B-4隻動物。
第1A組-5隻動物 第1B組-4隻動物
第2A組-5隻動物 第2B組-4隻動物
第3A組-5隻動物 第3B組-4隻動物
第4A組-5隻動物 第4B組-4隻動物
第5A組-5隻動物 第5B組-4隻動物
第28天：藉5-9隻經感染蚊子(亦即經尼日約氏瘧原蟲屬感染之甘比亞瘧蚊)螫咬腹部而制抗亞組A內之所有動物。維持所有動物物，直到首先確定寄生物血症或經感染蚊制抗後最多6週為止。藉放血而殺死所有動物並冷凍(-20℃)貯存血清試樣，直到採集為止。
第28天：使用亞組B中之所有動物以餵養(以腹部)以下許多
新(未經感染)蚊子：5-10集甘比亞瘧蚊及5-10隻斯特芬西瘧蚊
測試這些蚊子之以下項目：
1.在8天時間內之存活率。
2.產卵數。
3.生蛋數。
4.得自該等產卵之成蟲數(F1)。
第32天：藉直接IV接種寄生物而使亞組B中之所有動物感染尼日約氏瘧原蟲屬。
第32天：一旦已在B組中之所有(或至少75%)動物鑑定活性瘧疾感染，則使用所有經感染動物以餵養(以腹部)大數量(每一群小鼠大於10隻)之新甘比亞瘧蚊及新斯特芬西瘧蚊。
測試所有這些蚊子之以下項目：
1.在8天時期內之殘活率。
2.在所需培育期(17天)能存活之在其唾液腺內具有瘧疾寄物之蚊子數。
3.產卵數。
4.生蛋數。
5.得自該等產卵之成蟲數(F1)。
蚊子吸血後，藉放血而殺死所有動物並冷凍(-20℃)貯存血清試樣，直到採集為止。
於該試驗結束時任何殘留之該實驗化合物經冷凍(-20℃)貯存，直到採集為止。
該等實驗之結果的圖示係示於第3A-3I及第4圖。該等附圖之第一組顯示就各該第1-5組而言，該疫苗對蚊子之繁殖能力的影響之資料，該等資料如下：
3A：飼養百分比 3B：生蛋平均數
3C：產卵平均數 3D：孵化百分比
3E：幼蟲平均數 3F：蛹平均數
3G：蛹化百分比 3H：出現百分比
3I：成蟲平均數
可證實這些圖示A-I中之各圖的數據(就第3A圖而言，柱A，以下類推)係分別描述在下表2內：
表3A-3I內所揭示之數據表示使用Mann-Whitney非參數統計分析法分析上述數據所獲得之p值。
第4圖表示在8天之時期內，在各該5個群組內之蚊子的存活百分比。於第零天之各組內之蚊子數如下：第1組(對照組)：100
第2組：89
第3組：100
第4組：99
第5組：98
與第4圖之圖示有關之數據揭示在下表4內：
下表5(i)-5(viii)內所揭示之數據表示使用Mann-Whitney非參數統計分析法分析上述數據所獲得之p值。
自實驗1進一步研究最有效之成份以鑑定可用於疫苗之多胜肽。使用以下實驗程序以測定本發明該等胜肽之效用。
藉Fmoc化學方法而合成研究中之所有多胜肽(抗原製劑)。
對每一隻小鼠皮下注射20微升劑量之該抗原製劑以使該等6至10週大之C57BL/6小鼠免疫化。在該試驗組中，該抗原製劑之各劑量含有根據製造商指示在佐劑(Sigma)內所製成之該等胜肽的等莫耳混合物(各10毫微莫耳)。在該對照組內，該抗原製劑之各劑量含有根據製造商指示(NRP製法)在IFA(Sigma)內所製成之等劑量的非相關性多胜肽。
在第15天免疫化作用後，使用如原先之相同劑量及投藥方式使所有動物接受加強免疫化作用。
最後，在第20天時殺死所有動物對採集彼等之脾臟及血清。
將屬於相同實驗群組之小鼠脾臟集中，溫和地壓擠使其通過細胞濾器並藉經紅細胞溶解緩衝劑(9份0.16M之
NH4Cl及一份0.17M Tris,pH 7.2)處理而移除紅血球細胞，以4×106個細胞/井之密度4次將得自各實驗群組之脾細胞懸浮液接種在含經0.02mM β-巰基乙醇(Sigma)、50IU/50毫克/毫升之青黴素/鏈黴素(Sigma)及10% FCS(Sigma)補充且含有在研究中之各該多胜肽抗原(2μM)之IMDM培養基(Invitrogen)內之96井平皿中。於37℃下培育3天後，收集上澄清液並藉根據製造商之實驗程序列(Pharmingen)之夾層的細胞素ELISA而分析IFN-γ及IL-4。就IL-4而言，該檢測法之偵測下限為9.77微微克/毫升，而就IFN-γ而言為39.06微微克/毫升。
將2μM各實驗多胜肽在PBS中之溶液塗覆在ELISA 96井微量滴定盤(Becton-Dickinson)上。於4℃下培育一夜後，在PBST(含0.05% Tween 20之PBS)內清洗該平皿共兩次且經1% BSA Fraction V在PBST內之溶液阻斷各井。一小時培育後，在PBST內清洗平皿且添加一系列試驗及對照血清之稀釋液至各該井內。2小時培育後，在PBST內清洗平皿共6次，且添加一級抗小鼠Ig2a血清至所有井內。一小時培育後，在PBST內清洗平皿共6次，且添加抗一級抗小鼠Ig2a血清至所有井內。一小時培育後，在PBST內清洗平皿共7次添加TMB基質至所有井內。20-30分鐘培育後，以HCl中止該反應並讀取於450奈米之吸光度。
藉該等試樣之非參數Mann-Whitney分析而確認該等試
驗組與對照組之對不同抗原之IFN-γ反應的統計學上顯著差異。若該p值在0.05以下，則差異被視為具統計學顯著性。
研究以下多胜肽：SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：35。將這些胜肽一起混合以形成用於測試之候選疫苗(稱為AGS胜肽混合物)。
根據下示實驗程序評估藉這些胜肽接種而誘發之免疫反應之類型及程度：
第1天：使用以下皮下注射劑量之候選疫苗產物將各含4隻CD1小鼠之兩組免疫化：
‧非相關性胜肽(NRP)混合物(各10毫微莫耳)+ISA-51
‧AGS胜肽混合物(各10毫微莫耳)-ISA-51
第15天：以相同劑量之候選疫苗產物增強所有動物之免疫力。
第21天：致命性將所有動物放血。個別採集脾臟並測試其對以下之IFN-γ反應性：
‧個別AGS胜肽(各2μM)
‧AGS混合物(各0.5μM及2μM)
‧Con A(7.5微克/毫升)
‧空白試驗
第21天後：測試所有血清對抗AGS胜肽之反應性。
活體外經該等抗原刺激96小時後之IFN-γ產生係示於第5圖之圖解中。
對SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30及SEQ ID NO：35以及對該AGS-混合物製劑之IFN-γ反應性具統計學顯著性(p<0.05)。
SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：31及SEQ ID NO：32在該等經AGS-混合物免疫化之動物體內誘發高反應性，但是其似乎亦對經NRP-混合物免疫化小鼠之脾細胞以非專一形式產生刺激性。
在血清內對該等抗原之總Ig反應性係示於第6圖之解圖內。對SEQ ID NO：20及SEQ ID NO：30之總Ig反應性具統計學顯著性(p<0.05)。
為了測試該AGS-混合物製劑抗天然瘧疾感染之保護性的能力。根據以下實驗程序使CD1小鼠經免疫化並經制抗：第0天：進行所有動物之放血試驗。保留試樣以進一步用於分析。
第1天：使用以下皮下注射劑量之候選疫苗產物使各含8隻CD1小鼠之兩群組免疫化：
‧非相關性胜肽(NPR)混合物(各10毫微莫耳)+ISA-51
‧AGS胜肽混合物(各10毫微莫耳)+ISA-51
第7天：進行所有動物之放血試驗。保留試樣也進一步用於分析。
第14天：以相同劑量之候選疫苗產物增強動物之免疫力。
第21天：進行所有動物之放血試驗。保留試樣以進一步用於分析。
第28天：藉8隻經感染蚊子(亦即經尼日約氏瘧原蟲屬感染之甘比亞瘧蚊)螫咬腹部而制抗所有動物。維持所有動物，直到首先確定寄生物血症或經已感染蚊子制抗後最長6週為止。
第70天(最久)：致命性將所有動物放血。
於第21天時，在血清內對該AGS混合物之總Ig反應性示於第7圖之圖解中。
該組AGS混合物免疫之群組中的一隻動物顯示總Ig反應性顯著低於在該群組內之其餘動物(在該AGS混合物組內之平均總Ig反應小於50%)。
在制抗當天，由於缺乏感染性蚊子，所以該經NRP、混合物免疫之群組內之一隻動物及在該經AGS-混合物免疫之群組內的兩隻動物可未經制抗。
就經制抗之該等動物而言，該經AGS-混合物免疫之群組內之動物顯示存活率高於該經對照NRP-混合物免疫之群組內之動物(見第8圖)。在該經AGS-混合物免疫之群組內死亡之該隻動物為對該AGS製劑未能形成強抗體反應之相同動物。
第1圖表示根據實例所揭示之方法所製成之甘比亞瘧蚊唾液腺的IEF膠片(考馬斯藍染色(Comassie Blue stain))；第2圖表示第1圖之IEF膠片的SDS-PAGE(銀染色法)-紅色長方形表示該等標靶蛋白質(<30kDa)之一的位置；
第3A-3I圖表示該疫苗對蚊子之繁殖能力的影響之資料，該等資料如下：
3A：飼養百分比 3B：生蛋平均數
3C：產卵平均數 3D：孵化百分比
3E：幼蟲平均數 3F：蛹平均數
3G：蛹化百分比 3H：出現百分比
3I：成蟲平均數
第4圖表示餵食免疫化小鼠後，有關於蚊子之存活百分比的資料；第5圖表示在經實驗3之抗原活體外刺激96小時後，IFN-γ產生；第6圖表示在血清中對根據實驗3之抗原的總Ig反應；第7圖表示根據實據4，於第21天在血清中對AGS-混合物之總Ig反應；第8圖表示與對照NRP-混合物免疫化群組比較，實驗4之該AGS-混合物免疫化群組顯示存活率增加；第9圖表示根據實例所揭示之方法所製成之甘比亞瘧蚊唾液腺的一般SDS膠片。
<110> 皮特錫爾有限公司
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<400> 134
Claims (26)
- 一種多胜肽組成物，其包含一或多個多胜肽以及一載劑、一賦形劑、一佐劑、一緩衝劑或一安定劑，其中該一或多個多胜肽包含一由SEQ ID NO：35所構成之多胜肽；以及其中該由SEQ ID NO：35所構成之多胜肽係在脊椎動物中產生免疫系統細胞，該免疫系統細胞辨識至少一種來自一節肢動物唾液蛋白部分之抗原決定位。
- 如申請專利範圍第1項之多胜肽組成物，其中該一或多個多胜肽進一步包括一由SEQ ID NO：1-34或36-44所構成之多胜肽；其中該組成物係於脊椎動物中引發對抗二種或更多種會造成節肢動物傳播病的病原或病原種類之免疫反應。
- 如申請專利範圍第1項之多胜肽組成物，該組成物包含2至12個多胜肽。
- 如申請專利範圍第1項之多胜肽組成物，該組成物包含2至6個多胜肽。
- 如申請專利範圍第1項之多胜肽組成物，其中該一或多個多胜肽包含細胞毒殺性T淋巴細胞(CTL)抗原決定位、T輔助淋巴細胞(Th)抗原決定位、及/或B淋巴細胞抗原決定位。
- 如申請專利範圍第1項之多胜肽組成物，其包含2、3、4、5、6或更多個抗原決定位。
- 如申請專利範圍第1項之多胜肽組成物，其具抗多種節 肢動物唾液蛋白質之致免疫性，該多種節肢動物唾液蛋白質包含SEQ ID NO：35或其亞序列，該亞序列具有7或更多個胺基酸。
- 如申請專利範圍第1項之多胜肽組成物，其進一步包含一或多種得自節肢動物唾液蛋白質之另外序列，該一或多種另外序列係SEQ ID NO：45-85或其亞序列。
- 如申請專利範圍第2項之多胜肽組成物，其中該一或多個多胜肽係由序列SEQ ID NO：20、28、30、31或32所構成。
- 如申請專利範圍第1項之多胜肽組成物，其中具有SEQ ID 20、28、30-32及35之胜肽全部存在。
- 如申請專利範圍第1-10項中任一項之多胜肽組成物，其中該節肢動物傳播病係瘧疾、絲蟲病、錐蟲病、利什曼病、蟠尾絲蟲病、登革熱、萊姆病(lyme disease)、土拉倫斯病(tularaemia)、回歸熱、斑疹傷寒、鼠疫、黃熱病、里夫谷熱(rift valley fever)或腦炎。
- 如申請專利範圍第1-10項中任一項之多胜肽組成物，其中該腦炎係聖路易斯(St.Louis)腦炎、西尼羅河熱(west Nile fever)、東部馬型腦脊髓炎、拉克羅斯(La Crosse)腦炎及西部馬型腦脊髓炎。
- 如申請專利範圍第1-10項中任一項之多胜肽組成物，其中該節肢動物係噬血性節肢動物。
- 如申請專利範圍第13項中任一項之多胜肽組成物，其中該噬血性節肢動物係選自蚊子、壁蝨、沙蚊、恙蟲及跳 蚤。
- 如申請專利範圍第1-10項中任一項之多胜肽組成物，其中該節肢動物係選自斑翅蚊屬、黑斑蚊屬、庫列蚊屬、曼森蚊屬、斑虻屬、蚋屬、錐鼻蟲屬、紅獵蝽屬、錐鼻臭蟲屬、鱷蠅屬、牛虻屬、白蛉屬、羅蛉屬、蝨屬、鳥壁蝨屬、壁蝨屬、蚤屬、斯佩嘎紮尼趨血蚊屬、黃蚊亞屬及苛蚊屬。
- 一種如申請專利範圍第1-15項中任一項之多胜肽組成物用於製備供治療或預防一脊椎動物之瘧疾的藥物之用途。
- 一種如申請專利範圍第1-15項中任一項之多胜肽組成物用於製備供治療或預防一脊椎動物之瘧疾的獸醫用藥物之用途。
- 一種製備多胜肽組成物的方法，該方法包括混合或組合一或多個如申請專利範圍第1項所界定之多胜肽及一或多個如申請專利範圍第2-15項中任一項所界定之多胜肽、及一或多個另外組份，該一或多個另外組份包含載劑、賦形劑、佐劑、緩衝劑或安定劑。
- 一種抗節肢動物傳播病之藥物或疫苗組成物，其包含如申請專利範圍第1-15項中任一項之多胜肽組成物，及一合適賦形劑及/或佐劑。
- 一種製備一藥物或疫苗組成物之方法，該方法包括連接、組合或混合如申請專利範圍第1-15項中任一項之多胜肽組成物與一合適賦形劑及/或佐劑。
- 一種具有SEQ ID NO：35之多胜肽，其中該具有SEQ ID NO：35之多胜肽係在脊椎動物中產生免疫系統細胞，該免疫系統細胞辨識至少一種來自一節肢動物唾液蛋白部分之抗原決定位。
- 一種具有SEQ ID NO：20之多胜肽，其中該具有SEQ ID NO：20之多胜肽係在脊椎動物中產生免疫系統細胞，該免疫系統細胞辨識至少一種來自一節肢動物唾液蛋白部分之抗原決定位。
- 一種具有SEQ ID NO：28之多胜肽，其中該具有SEQ ID NO：28之多胜肽係在脊椎動物中產生免疫系統細胞，該免疫系統細胞辨識至少一種來自一節肢動物唾液蛋白部分之抗原決定位。
- 一種具有SEQ ID NO：30之多胜肽，其中該具有SEQ ID NO：30之多胜肽係在脊椎動物中產生免疫系統細胞，該免疫系統細胞辨識至少一種來自一節肢動物唾液蛋白部分之抗原決定位。
- 一種具有SEQ ID NO：31之多胜肽，其中該具有SEQ ID NO：31之多胜肽係在脊椎動物中產生免疫系統細胞，該免疫系統細胞辨識至少一種來自一節肢動物唾液蛋白部分之抗原決定位。
- 一種具有SEQ ID NO：32之多胜肽，其中該具有SEQ ID NO：32之多胜肽係在脊椎動物中產生免疫系統細胞，該免疫系統細胞辨識至少一種來自一節肢動物唾液蛋白部分之抗原決定位。
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