ES2525106B1 - Péptido sintético derivado de Fasciola hepatica y su uso como vacuna - Google Patents

Abstract

Péptido sintético derivado de Fasciola hepática y su uso como vacuna.#La presente invención se refiere a polipéptidos o secuencias nucleotídicas que los codifican y composiciones que los contienen los cuales resultan útiles para la prevención y o el tratamiento de infecciones producidas por organismos del género Fasciola y más concretamente por Fasciola hepática. Estos elementos también resultan útiles para la producción de anticuerpos frente a dichos péptidos. Los polipéptidos, secuencias nucleotídicas, composiciones, sueros y anticuerpos también resultan útiles para la elaboración de vacunas.

Description

Péptido sintético derivado de Fasciola hepatica y su uso como vacuna DESCRIPCIÓN

La presente invención se refiere a un polipéptido o una combinación de polipéptidos 5 sintéticos derivados de secuencias de proteínas de Fasciola hepatica, los cuales resultan útiles como vacuna frente a la infección producida por este organismo. La invención también se refiere a las secuencias nucleotídicas que codifican para los polipéptidos, y a composiciones que comprendan los polipéptidos. Además la presente invención también incluye los anticuerpos que reconocen los polipéptidos de la 10 invención. Por tanto, la presente invención se podría encuadrar en el campo de la biotecnología y más concretamente dentro del campo de la biomedicina.

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ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

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El organismo Fasciola hepatica es un trematodo digénido que produce la enfermedad denominada fasciolosis o fascioliasis, la cual es transmitida principalmente por la ingestión de metacercarias adheridas a plantas acuáticas. Su distribución geográfica es cosmopolita y se han reportado casos de fasciolosis en los cinco continentes (Mas-Coma et al., 2009. Adv Parasitol. 69: 41-146; Hotez et al., 2012. PLoS Negl Trop Dis. 20 6: e1475).

Este organismo en su ciclo de vida necesita dos hospedadores, uno intermediario el cual es un caracol de agua dulce. En Europa el hospedador intermediario es el caracol Galba truncatula (sinónimo Lymnaea truncatula). El segundo hospedador o 25 hospedador definitivo son principalmente mamíferos herbívoros como ovejas y vacas, pero también el ser humano (López-Abán et al., 2012. Manual de enfermedades importadas p.10).

A nivel veterinario, la fasciolosis causa grandes pérdidas económicas debidas 30 principalmente a la muerte de los animales, disminución en la producción de carne y leche, así como el decomiso de los mismos por las autoridades sanitarias en los mataderos para evitar que puedan llegar al consumo alimentario humano (Rojo-Vázquez et al.,2012. Vet Parasitol. 1: 15-38).

Por otro lado, en humanos esta enfermedad está considerada como un problema de salud pública. La Organización Mundial de la Salud (OMS) ha descrito casos de fasciolosis humana en 51 países, con más de 17 millones de personas afectadas, existiendo mayores problemas de salud en áreas endémicas de países andinos, el 5 área del Caribe, Norte de África, Europa del Este y cuenca del mar Caspio. En la actualidad se considera que existe un aumento en los casos registrados de fasciolosis humana ya que los avances surgidos en el diagnóstico de la enfermedad permiten detectar un mayor número de casos, considerándola una enfermedad emergente a nivel mundial (World Health Organization 2008. Facts sheet on fasciolasis. In action 10 Against worms: 1-8).

Tras la ingestión de las metacercarias, los vermes juveniles liberados atraviesan la pared intestinal para migrar a través del parénquima hepático y llegar a su localización definitiva en los conductos biliares. El daño durante su proceso migratorio se debe a 15 factores mecánicos como la abrasión que causan sus espículas o la succión originada por sus ventosas. Durante este proceso el parénquima hepático sufre una extensa destrucción con intensas lesiones y hemorragias causadas tanto por los vermes inmaduros como por la reacción inflamatoria e inmunológica desencadenada. Además se pueden producir infecciones bacterianas secundarias que pueden originar 20 peritonitis. Los vermes adultos se localizan principalmente en los conductos biliares, pero pueden encontrarse en el conducto cístico, la vesícula biliar, la ampolla de Vater o el colédoco. Los conductos biliares interlobulares se observan dilatados y esclerosados, presentan hiperplasia y obstrucción del flujo biliar.

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Las infecciones por este organismo se tratan fundamentalmente con triclabenzadol, un antihelmíntico seguro el cual actúa frente a las fasciolas tanto inmaduras como adultas y elimina hasta el 99% de las mismas. Sin embargo, no resulta útil en todos los casos y por tanto aun resulta necesaria la búsqueda de nuevos tratamientos. Además, debido al amplio uso de este fármaco en animales se han ido seleccionando 30 organismos resistentes al mismo, por lo que su eficacia se ha ido viendo reducida paulatinamente (World Health Organization, 2006. Report of the WHO Informal Meeting on use of triclabendazole in fascioliasis control; Fairweather, 2009. J. Helminthol. 83: 139-150).

El control de la fasciolosis se basa principalmente en evitar la ingestión de plantas acuáticas (berros, marujas, lechugas, etc.) recogidas en zonas endémicas de fasciolosis y en efectuar tratamientos eficaces en ganado infectado con el parásito. Por último, se siguen realizando grandes esfuerzos para lograr una vacuna efectiva contra 5 esta enfermedad. De esta manera se han descrito diferentes moléculas candidatas a vacunas (catepsinas, GST (Glutatión S-transferasa o “Glutathione S-transferase”), FABP (proteínas de unión a ácidos grasos o “fatty-acid-binding proteins”), etc.). (Hillyer, 2005. J. Helminthol. 79: 241-247; McManus et al., 2006. Parasitology. 133 Suppl: S43-61). Sin embargo en la actualidad no se dispone de una vacuna comercial 10 eficaz.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a polipéptidos formados por al menos 3 repeticiones 15 de una secuencia de aminoácidos. La presente invención también se refiere a combinaciones de los polipéptidos, así como a composiciones que comprenden dichos polipéptidos, solos o en combinación con otros elementos. También se refiere a anticuerpos producidos por la inmunización de un animal con cualquiera de estos elementos. La presente invención también se refiere al uso de estos polipéptidos, 20 composiciones y/o anticuerpos para la elaboración de medicamentos, preferiblemente vacunas para la prevención de enfermedades producidas por organismos del género Fasciola y más concretamente por Fasciola hepatica.

En la presente invención, los inventores demuestran como el uso de uno de los 25 polipéptidos denominados T14 (SEQ ID NO: 1), T15 (SEQ ID NO: 2) y T16 (SEQ ID NO: 3) o combinaciones de estos polipéptidos derivados de proteínas de Fasciola hepatica, provocan la generación de una respuesta inmune en el individuo. Además demuestran como mediante esta inmunización se disminuye la mortalidad de los individuos infectados con Fasciola hepatica, y se consigue una reducción en el daño 30 hepático y del número de vermes presentes en el individuo. Estos polipéptidos son moléculas que presentan 3 copias de una secuencia de 15 aminoácidos. T14 se refiere a un péptido que presenta 3 copias del péptido de secuencia SEQ ID NO: 17 y que tiene la secuencia SEQ ID NO: 1. T15 se refiere a un péptido que presenta 3

copias del péptido de secuencia SEQ ID NO: 18 y que tiene la secuencia SEQ ID NO: 2. T16 se refiere a un péptido que presenta 3 copias del péptido de secuencia SEQ ID NO: 19 y que tiene la secuencia SEQ ID NO: 3. Por todo ello, un primer aspecto de la invención se refiere a un polipéptido aislado o sintético que comprende SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 19, donde dicha secuencia SEQ ID NO: 17, SEQ ID 5 NO: 18 o SEQ ID NO: 19 se repite al menos 3 veces. En una realización preferida el polipéptido comprende SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 19 donde dicha secuencia SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 19 se repite 3 veces. En una realización más preferida el polipéptido que comprende SEQ ID NO: 17 donde dicha secuencia SEQ ID NO: 17 se repite 3 veces es SEQ ID NO: 1. En otra realización más 10 preferida el polipéptido que comprende SEQ ID NO: 18 donde dicha secuencia SEQ ID NO: 18 se repite 3 veces es SEQ ID NO: 2. En otra realización más preferida el polipéptido que comprende SEQ ID NO: 19 donde dicha secuencia SEQ ID NO: 19 se repite 3 veces es SEQ ID NO: 3. En una realización aun más preferida el polipéptido es el polipéptido de secuencia SEQ ID NO: 2. En otra realización preferida el 15 polipéptido consiste en 3 copias del péptido de secuencia SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 19.

Estos polipéptidos que comprenden SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 19, donde dicha secuencia SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 19 se repite al 20 menos 3 veces, presentan una mayor utilidad que las secuencias SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 19 en sí ya que inducen una respuesta inmunológica mayor y provocan una mayor protección.

En la presente invención los polipéptidos que presentan al menos 3 copias de un 25 péptido pueden consistir únicamente en las secuencias de los péptidos repetidas en tándem de forma que no incluyen ningún aminoácido adicional, o bien pueden incluir aminoácidos adicionales entre las repeticiones separándolas y/o en los extremos, debido por ejemplo al método de obtención del péptido para permitir la fusión de monómeros mediante oxidación. Estos aminoácidos adicionales que separan las 30 repeticiones como son por ejemplo la presencia de glicina y cisteína en ambos extremos de cada monómero no modifican la capacidad inmunogénica de los polipéptidos con respecto a los polipéptidos que no presentan estos aminoácidos entre los monómeros. Además todos los polipéptidos descritos en la presente invención, se

pueden encontrar fusionados o conjugados con otros elementos de forma que se aumente su inmunogenicidad. Estos elementos pueden ser por ejemplo, aunque sin limitarse, hemocianina de lapa (KLH o keyhole limpet hemocyanin), haptenos, GST, GPI (glicosil fosfatidil inositol o glycosyl phosphatidylinositol). Por tanto en otra realización preferida de este primer aspecto de la invención los polipéptidos se 5 encuentran fusionados o conjugados con elementos que aumentan su inmunogenicidad.

Los péptidos o polipéptidos de la presente invención pueden ser sintetizados, por ejemplo, aunque sin limitarnos, siguiendo la metodología de síntesis de péptidos en 10 fase sólida y fusión de varias copias mediante reacciones de oxidación tal y como se indica en los ejemplos, o mediante aproximaciones de ADN recombinante que den lugar a la misma secuencia. Los polipéptidos de la invención pueden producirse recombinantemente, no sólo directamente sino como un polipéptido de fusión junto con un polipéptido heterólogo, el cual puede contener, por ejemplo aunque sin 15 limitarnos, otro péptido o polipéptido que facilite su aislamiento y purificación. Este péptido o polipéptido fusionado al polipéptido de la invención puede comprender además un sitio de corte para una proteasa, por ejemplo, aunque sin limitarnos, en el extremo N-terminal del polipéptido o proteína madura. La producción recombinante puede comprender por ejemplo, aunque sin limitarse, la amplificación de una 20 secuencia nucleotídica que codifique para el polipéptido de interés, la clonación de la secuencia nucleotídica amplificada en un vector de expresión, la transformación o transfección de una célula competente con dicho vector, el cultivo de dicha célula en condiciones que promuevan la expresión del polipéptido de la invención y el aislamiento y purificación del polipéptido de la invención producido por la célula. 25

Debido a la degeneración del código genético, en el cual diversos tripletes de nucleótidos dan lugar a un mismo aminoácido, existen diferentes secuencias de nucleótidos que dan lugar a una misma secuencia de aminoácidos y por tanto múltiples secuencias de nucleótidos que pueden dar lugar a los polipéptidos de la 30 invención. La obtención de estas secuencias de nucleótidos que dan lugar a los polipéptidos de la invención, son fáciles de obtener mediante herramientas informáticas. Por ello, otro aspecto de la invención se refiere a una secuencia nucleotídica aislada, de ahora en adelante “secuencia nucleotídica de la invención”,

que codifica para cualquiera de los polipéptidos de la invención. Los términos “secuencia nucleotídica”, “secuencia de nucleótidos”, “ácido nucleico”, “oligonucleótido” y “polinucleótido” se usan aquí de manera intercambiable y se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud que pueden estar o no, química o bioquímicamente modificados. Se refieren, por tanto, a cualquier 5 polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, tanto de cadena sencilla como de doble hebra.

La secuencia nucleotídica de la invención puede obtenerse de manera artificial mediante métodos de clonación y selección convencional, o mediante secuenciación. 10 La secuencia nucleotídica, adicionalmente a la secuencia codificante, puede llevar otros elementos, como por ejemplo aunque sin limitarse, intrones, secuencias no codificantes en los extremos 5’ o 3’, sitios de unión a ribosomas, o secuencias estabilizadoras. Las secuencias nucleotídicas adicionalmente también pueden incluir secuencias codificantes para aminoácidos adicionales que puedan ser útiles, por 15 ejemplo, aunque sin limitarse, para aumentar la estabilidad del péptido generado a partir de ellos o permitir una mejor purificación del mismo.

Otro aspecto de la invención se refiere a una construcción genética, de ahora en adelante “construcción genética de la invención”, que comprende la secuencia 20 nucleotídica de la invención. El término “construcción genética” se refiere a una molécula de ADN o ARN en la que se puede integrar otro fragmento de ADN, sin que pierda la capacidad de autorreplicación. En una realización preferida, la construcción genética de la invención es un vector de expresión. El término “vector de expresión”, tal y como se utiliza en la presente invención, se refiere a una molécula de ADN linear 25 o circular que comprende la secuencia nucleotídica de la invención operativamente unido a nucleótidos adicionales necesarios para su expresión, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, secuencias control tales como reguladores, terminadores y/o promotores. Ejemplos de vectores de expresión son, sin ningún tipo de limitación, plásmidos, fagos, cósmidos, fagémidos, cromosomas artificiales de levaduras (YAC), 30 cromosomas artificiales de bacterias (BAC), cromosomas humanos artificiales (HAC), vectores virales, tales como adenovirus, retrovirus o cualquier otro tipo de molécula de ADN con capacidad para replicarse en el interior de una célula, procariota o eucariota.

La expresión “unidos operativamente” se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes así descritos tienen una relación que les permite funcionar en la manera intencionada. Una secuencia de control “unida de forma operativa” a una secuencia nucleotídica, está ligada de tal manera que la expresión de la secuencia codificante se consigue en condiciones compatibles con las secuencias de control. 5

El término “promotor” hace referencia a una región del ADN, generalmente “aguas arriba” o upstream del punto de inicio de la transcripción, que es capaz de iniciar la transcripción en una célula. Este término incluye, por ejemplo, pero sin limitarse, promotores constitutivos, promotores específicos de tipo celular o de tejido o 10 promotores inducibles o reprimibles. Las secuencias de control dependen del origen de la célula en la que se quiere expresar el ácido nucleico. Ejemplos de promotores procariotas incluyen, por ejemplo, pero sin limitarnos, los promotores de los genes trp, recA, lacZ, lacI, tet, gal, trc, o tac de Escherichia coli, o el promotor del gen α-amilasa de Bacillus subtilis. Para la expresión de un ácido nucleico en una célula procariota 15 también es necesaria la presencia de un sitio de unión ribosomal situado upstream de la secuencia codificante. Secuencias de control apropiadas para la expresión de una secuencia nucleotídica en células eucariotas son conocidas en el estado de la técnica. Dicha construcción genética de la invención puede ser introducida en una célula hospedadora de manera que se mantenga como una construcción genética integrada 20 en el cromosoma o como un vector extracromosómico autoreplicante. Por ello, otro aspecto de la invención se refiere a una célula, de ahora en adelante “célula de la invención”, que comprende la construcción genética de la invención.

La célula de la invención puede ser cualquier tipo celular susceptible de 25 transformación o transfección con la construcción genética de la invención para la expresión del péptido de la invención. Así, dicha célula puede ser eucariota o procariota, preferiblemente procariota y más preferiblemente E. coli.

Todos los polipéptidos o secuencias nucleotídicas descritas pueden usarse bien de 30 forma independiente o bien incluidos en una composición que comprenda otros elementos útiles para el mismo o diferente fin que los polipéptidos o secuencias nucleotídicas de la invención. Por tanto otro aspecto de la invención se refiere a una composición “de ahora en adelante composición de la invención” que comprende un

polipéptido aislado o sintético que comprende SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 19, donde dicha secuencia SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 19 se repite al menos 3 veces. En una realización preferida el número de repeticiones de SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 19 en el polipéptido es de 3. En una realización más preferida el polipéptido consiste en 3 repeticiones de SEQ ID NO: 17, 5 SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 19. En una realización aun más preferida el polipéptido consiste en 3 repeticiones de SEQ ID NO: 18. En otra realización más preferida el polipéptido comprende solo 3 copias del péptido de secuencia SEQ ID NO: 18. En una realización aun más preferida el polipéptido es el polipéptido de secuencia SEQ ID NO: 2. 10

Los polipéptidos también se pueden usar en composiciones que comprenden uno o varios de estos polipéptidos tal y como se demuestra en la presente invención. De esta forma la composición de la invención puede incluir combinaciones de polipéptidos aislados o sintéticos que comprenden SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 15 19, donde dicha secuencia SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 19 se repite al menos 3 veces. De esta forma la composición induce una mayor respuesta inmunitaria en un individuo en caso de ser administrada que si comprende uno solo de los péptidos. Por ello en una realización preferida de este aspecto de la invención, la composición comprende: 20

a) un polipéptido aislado o sintético que comprende SEQ ID NO: 17 donde dicha secuencia SEQ ID NO: 17 se repite al menos 3 veces, y preferiblemente solo 3 veces, y

b) un polipéptido aislado o sintético que comprende SEQ ID NO: 18 donde dicha secuencia SEQ ID NO: 18 se repite al menos 3 veces, y preferiblemente solo 3 veces. 25

En otra realización preferida la composición comprende:

a) un polipéptido aislado o sintético que comprende SEQ ID NO: 17 donde dicha secuencia SEQ ID NO: 17 se repite al menos 3 veces, y preferiblemente solo 3 veces, y 30

b) un polipéptido aislado o sintético que comprende SEQ ID NO: 19 donde dicha secuencia SEQ ID NO: 19 se repite al menos 3 veces, y preferiblemente solo 3 veces.

En otra realización preferida la composición comprende:

a) un polipéptido aislado o sintético que comprende SEQ ID NO: 18 donde dicha secuencia SEQ ID NO: 18 se repite al menos 3 veces, y preferiblemente solo 3 veces, y

b) un polipéptido aislado o sintético que comprende SEQ ID NO: 19 donde dicha secuencia SEQ ID NO: 19 se repite al menos 3 veces, y preferiblemente solo 3 veces. 5

En una realización más preferida la composición comprende:

a) un polipéptido aislado o sintético que comprende SEQ ID NO: 17 donde dicha secuencia SEQ ID NO: 17 se repite al menos 3 veces, y preferiblemente solo 3 veces,

b) un polipéptido aislado o sintético que comprende SEQ ID NO: 18 donde dicha 10 secuencia SEQ ID NO: 18 se repite al menos 3 veces, y preferiblemente solo 3 veces, y

c) un polipéptido aislado o sintético que comprende SEQ ID NO: 19 donde dicha secuencia SEQ ID NO: 19 se repite al menos 3 veces, y preferiblemente solo 3 veces.

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Cabe destacar que tal y como se muestra en los ejemplos de la presente invención la combinación de los péptidos T14 (SEQ ID NO: 1), T15 (SEQ ID NO: 2) y T16 (SEQ ID NO: 3) es la que mejor efecto tienen en cuanto a la supervivencia y protección frente a Fasciola hepatica. Por ello en una realización aun más preferida la composición comprende los polipéptidos de secuencia SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y/o SEQ ID 20 NO: 3.

En otra realización preferida la composición comprende el péptido que consiste 3 repeticiones de SEQ ID NO: 17, el péptido que consiste 3 repeticiones de SEQ ID NO: 18 y/o el péptido que consiste 3 repeticiones de SEQ ID NO: 19. 25

Estas composiciones además de uno o varios de los péptidos o polipéptidos de la invención previamente descritos pueden incluir además otros elementos como son por ejemplo, aunque sin limitarse, otros péptidos derivados de organismos del género Fasciola y más preferiblemente de Fasciola hepatica, adyuvantes, sistemas de 30 liberación, y/o inmunomoduladores de forma que se potencie aun en mayor medida el efecto inmunológico de los polipéptidos.

Se entiende por “péptidos derivados de organismos del género Fasciola” en la

presente invención cualquier péptido obtenible de un organismo del género Fasciola y que produzca una respuesta inmunitaria en el individuo o potencie la respuesta producido por los péptidos de la invención. Estos péptidos pueden potenciar tanto la respuesta por células T como por células B.

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En la presente invención se entiende por “individuo” un sujeto que es un mamífero, y que puede ser tanto humano como no humano.

Se entiende por “adyuvante” en la presente invención aquella sustancia que administrada con un antígeno provoca un aumento en la respuesta inmune y por tanto 10 una mejora en la inmunogenicidad del antígeno así como su eficacia. Además los adyuvantes pueden provocar que la respuesta inmunológica se extienda durante más tiempo. Resultan de interés como adyuvantes por ejemplo, aunque sin limitarse, sales minerales, y más concretamente sales de aluminio, adyuvantes tensoactivos, adyuvantes derivados de bacterias, emulsiones, liposomas, microesferas poliméricas, 15 citocinas, carbohidratos, o mezclas de los mismos. En la presente invención resultan de especial relevancia como adyuvantes las saponinas y más concretamente las saponinas de Quillaja saponaria (Qs). Estas saponinas se pueden encontrar individualizadas o incluidas dentro de extractos obtenidos de dicho organismo y que incluyan varias de estas saponinas. En la presente invención resulta de especial 20 importancia el adyuvante QS21, el cual es un adyuvante que comprende diversas saponinas de Quillaja saponaria. Por todo lo descrito, en una realización preferida la composición de la invención además comprende un adyuvante. En una realización más preferida el adyuvante comprende al menos una saponina de Quillaja saponaria. En una realización más preferida el adyuvante es QS21. 25

Se entiende por “sistemas de liberación” en la presente invención aquellos sistemas que permiten la encapsulación de los péptidos de forma que estos se vayan liberando de forma lenta y prolongada en el tiempo permitiendo de esta forma mantener el efecto durante más tiempo. Existen diferentes sistemas de liberación conocidos en el estado 30 de la técnica como por ejemplo aquellos basados en la encapsulación mediante sistemas lipídicos (liposomas) o mediante sistemas poliméricos (microesferas o nanoesferas). Dentro de los sistemas poliméricos se encuentran por ejemplo los sistemas naturales como alginato, dextrano, goma arábiga o quitosano, los

semisintéticos como derivados de celulosa (etilcelulosa, acetobutirato de celulosa o acetoftalato de celulosa) o los sintéticos como son los derivados acrílicos o los poliésteres (policaprolactona, ácido poliláctico o copolímeros del ácido láctico y del ácido glicólico). Dentro de los sistemas lipídicos en la presente invención se pueden encontrar por ejemplo, aunque sin limitarse, aceites tanto minerales como no 5 minerales. Entre estos grupos resulta más interesante el uso de los aceites no minerales ya que permiten la formación de micelas dentro de las cuales se encapsulan los polipéptidos y permiten su liberación lenta y por tanto mantienen su efecto durante mayor tiempo. Ejemplos de aceites no minerales que presentan utilidad son por ejemplo, aunque sin limitarse, Montanide ISA 720 ó Montanide ISA 763A. Por todo 10 ello, en una realización preferida la composición de la invención comprende además un sistema de liberación. En una realización más preferida el sistema de liberación es un aceite no mineral. En una realización aun más preferida el aceite no mineral es Montanide ISA 763A.

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Se entiende por “inmunomodulador” en la presente invención aquellos compuestos o elementos que permiten modular la respuesta inmune en función de los requerimientos de cada caso. De esta forma existen compuestos que pueden activar esta respuesta inmune mientras que otros la reducen o la suprimen. Estos inmunomoduladores pueden actuar a diferentes niveles dentro del sistema inmune de forma que se pueden 20 inhibir o intensificar poblaciones o subpoblaciones de células, modular la respuesta inmune o dirigirla a un tipo celular concreto, o provocar la modulación de la producción de mediadores solubles. Los inmunomoduladores pueden ser de acción inespecífica los cuales estimulan o suprimen la respuesta inmune, sin que la actividad de las células estimuladas vaya dirigida hacia un antígeno determinado, o específicos los 25 cuales ejercen su acción sobre células del sistema inmune en presencia de un antígeno o inmunógeno lo que provoca una especificidad selectiva en la acción de las células para producir una respuesta inmune. La inmunomodulación es selectiva cuando hay estimulación y su resultado significa una inmunorreacción hacia un antígeno o varios. Los inmunomoduladores pueden ser por ejemplo, aunque sin 30 limitarse, bacilo de Calmette-Guering, levamisol, dipéptido murámico, glucanos (hongos), polisacáridos de algas, hormonas tímicas, proteínas del complemento (globulinas), citocinas como por ejemplo Interleucina 1(IL-1), Interferón gamma (IFN-γ), Interleucina 2 (IL-2), Interleucina 5 (IL-5), Factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α),

Interleucina 18 (IL-18), Factor de transferencia y factor de crecimiento y diferenciación granulocito–macrófago (GM-CSF), Interleucina 12 (IL-12), lectinas, concanavalina A, fitohemaglutininas (PHA), lipopolisacáridos bacterianos (LPS), ciclosporina, metotrexato, ciclofosfamida, azatriopina, o corticosteroides. En la presente invención resultan de especial relevancia los inmunomoduladores tanto de síntesis química 5 derivados de diaminas o aminoalcoholes como son por ejemplo aunque sin limitarse los immunomoduladores, OA0004, AA0029 y AA2829, como el inmunomodulador natural PAL el cual es un extracto acuoso del helecho Polypodium leucotomos (PAL). Por todo ello, en otra realización preferida la composición de la invención comprende un inmunomodulador. En una realización más preferida el inmunomodulador es 10 OA0004, AA0029, AA2829 o PAL. En una realización aun más preferida el inmunomodulador es AA0029.

La composición de la invención puede comprender además de los polipéptidos descritos previamente, otros péptidos o polipéptidos derivados de organismos del 15 género Fasciola y preferiblemente de la especie Fasciola hepatica. Tal y como se demuestra en los ejemplos de la invención las composiciones pueden comprender otros polipéptidos que comprendan al menos 3 copias, y preferiblemente solo 3 copias de péptidos derivados de proteínas de Fasciola hepatica. Por tanto en otra realización preferida de este aspecto de la invención, la composición de la invención puede 20 comprender además al menos otro péptido derivado de proteínas de Fasciola hepatica. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la composición de la invención puede comprender además al menos otro polipéptido que comprende al menos 3 copias de un péptido derivado de proteínas de Fasciola hepatica. Dentro de los péptidos derivados de proteínas de Fasciola hepatica, resultan de especial 25 interés los incluidos y utilizados en los ejemplos de la presente invención. Por ello, en una realización más preferida de este aspecto de la invención, la composición de la invención comprende además al menos otro polipéptido que comprende al menos 3 copias y preferiblemente solo 3 copias del péptido derivado de proteínas de Fasciola hepatica el cual se selecciona de la lista que comprende SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 30 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 27. En una realización aun

más preferida la composición comprende al menos un polipéptido seleccionado de la lista que comprende SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, 5 SEQ ID NO: 47 y SEQ ID NO: 48.

Los polipéptidos o composiciones de la invención tal y como se demuestra en los ejemplos, al ser inoculados en un organismo dan lugar a una respuesta inmunológica en el mismo, mediante la cual se producen anticuerpos que reconocen los 10 polipéptidos. Debido a la composición de los polipéptidos que incluyen varias copias de un único péptido, algunos de los anticuerpos producidos son capaces de reconocer no sólo el polipéptido sino también el péptido repetido en el polipéptido. Por tanto otro aspecto de la invención se refiere a los anticuerpos producidos por la inmunización de un animal con cualquiera de los polipéptidos o composiciones de la invención. En una 15 realización preferida de este aspecto de la invención, el animal inmunizado es un mamífero.

El término “anticuerpo” se refiere a moléculas de inmunoglobulinas o a porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulinas, es decir, moléculas 20 que contienen un sitio de fijación de antígeno que se une específicamente (inmunorreacciona) con los péptidos o polipéptidos de la invención. Ejemplos de porciones de moléculas de inmunoglobulinas inmunológicamente activas incluyen fragmentos F(ab) y F(ab’)2, los cuales pueden ser generados, por ejemplo, aunque sin limitarnos, tratando el anticuerpo con una enzima tal como pepsina o mediante 25 técnicas de ingeniería genética conocidas en el estado de la técnica.

El anticuerpo de la invención puede ser policlonal (incluye típicamente anticuerpos distintos dirigidos contra determinantes o epítopos distintos) o monoclonal (dirigido contra un único determinante en el antígeno). La expresión “anticuerpo monoclonal” 30 alude a una población de moléculas de anticuerpos que contienen solamente una especie de un sitio de fijación de antígeno capaz de inmunorreaccionar con un epítopo particular del antígeno. El anticuerpo monoclonal puede ser alterado bioquímicamente, mediante manipulación genética, o puede ser sintético, careciendo, posiblemente, el

anticuerpo en su totalidad o en partes, de porciones que no son necesarias para el reconocimiento del péptido de la invención, y estando sustituidas por otras que producen en el anticuerpo propiedades ventajosas adicionales.

El anticuerpo de la invención también puede ser recombinante, quimérico, sintético o 5 una combinación de cualquiera de los anteriores. Un “anticuerpo recombinante” (rAC) es un anticuerpo que ha sido producido en una célula hospedadora transformada o transfectada con la secuencia nucleotídica de la invención, con un ácido nucleico codificante para el anticuerpo de la invención, o que produce el anticuerpo de la invención o el péptido de la invención como resultado de la recombinación homóloga. 10 Dicha célula hospedadora incluye una célula en un cultivo celular “in vitro” así como una célula en un animal hospedador.

El anticuerpo de la invención también puede ser quimérico. Así, una región de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes 15 en anticuerpos procedentes de una especie determinada o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpos determinados, mientras que la(s) cadena(s) restante(s) es(son) idéntica(s), u homóloga(s), a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como a fragmentos de dichos anticuerpos, de manera que exhiban la actividad 20 biológica deseada.

La expresión “anticuerpo frente al péptido de la invención” se refiere a que el anticuerpo de la invención reconoce el polipéptido de la invención.

25

Uno de los métodos mediante el que se pueden obtener los anticuerpos de la invención consiste, por ejemplo, aunque sin limitarnos, en la inmunización de animales con un polipéptido o composición de la invención y la posterior purificación de los anticuerpos específicos para los péptidos o polipéptidos presentes en su suero.

30

Por ello, otro aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de anticuerpos específicos frente a los péptidos o polipéptidos de la invención, de ahora en adelante “primer método de la invención”, que comprende:

a. Obtener el suero previamente extraído de un animal inmunizado con un polipéptido o composición de la invención, y

b. Purificar los anticuerpos frente al polipéptido usado para inmunizar en el paso (a) presentes en el suero obtenido en la etapa (a).

5

De forma preferible, el animal al que se refiere la etapa (a) del primer método de la invención puede ser, un mamífero, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, conejo, roedores como el ratón o rata, cerdo, caballo, oveja o cabra.

El protocolo de inmunización se puede realizar por métodos convencionales, es decir, 10 administrando al animal a inmunizar una única dosis o varias dosis. Otro protocolo de inmunización puede ser el descrito en los ejemplos de la presente invención. Las inmunizaciones se pueden llevar a cabo con cualquiera de los polipéptidos o composiciones de la invención.

15

Las inmunizaciones se pueden llevar a cabo por vía oral o parenteral. Ejemplos de vía parenteral son, aunque sin limitarnos, intravenosa, intradérmica, subcutánea, intramuscular o intraperitoneal. Preferiblemente, el protocolo de inmunización es el que se describe en los ejemplos de la presente invención y puede ser llevado a cabo por un técnico sin formación médica específica. 20

Una vez producida la inmunización, se extrae el suero del animal inmunizado con el polipéptido o composición de la invención. Se entiende por “suero”, “suero sanguíneo” o “suero hemático” el componente de la sangre resultante tras permitir la coagulación de ésta y eliminar el coágulo de fibrina y otros componentes, que contiene numerosos 25 efectores biológicos, como el factor de crecimiento derivado de plaquetas, segregados por los elementos formes al suceder dicha coagulación. Es de un color amarillo, un poco más intenso que el plasma.

Posteriormente, se purifican los anticuerpos específicos frente al polipéptido de interés 30 presentes en el suero obtenido en la etapa (a) del método de la invención. Son conocidos en el estado de la técnica diversos métodos de purificación de anticuerpos que podrían llevarse a cabo en la etapa (b) del primer método de la invención, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, métodos electroforéticos o cromatográficos.

La “electroforesis” es una técnica analítica de separación basada en el movimiento o la migración de macro-moléculas disueltas en un medio (buffer de electroforesis), mediante una matriz o un sólido apoyo como resultado de la acción de un campo eléctrico. El comportamiento de la molécula depende de su movilidad electroforética y 5 esta movilidad depende de la carga, tamaño y forma. Existen numerosas variaciones de esta técnica basadas en el equipamiento usado, soportes y condiciones para llevar a cabo la separación de las moléculas. La electroforesis se selecciona de la lista que consiste en, pero sin limitarse, electroforesis capilar, electroforesis en papel, electroforesis en gel de agarosa, electroforesis en gel de poliacrilamida, 10 isoelectroenfoque o electroforesis bidimensional.

Los “métodos cromatográficos” permiten la separación de las moléculas por, aunque sin limitarse, su carga, tamaño, masa molecular, mediante su polaridad o mediante su potencial redox. La técnica de cromatografía se selecciona de entre, pero sin limitarse, 15 cromatografía de partición, filtración, cromatografía de adsorción, cromatografía de exclusión molecular, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrofóbica o cromatografía de afinidad, y pueden realizarse tanto en columna, como en papel o en placa.

20

Otro aspecto de la invención se refiere al suero que comprende anticuerpos específicos frente a cualquiera de los péptidos o polipéptidos de la presente invención. Este suero también se denominará “suero de la invención”. Dicho suero comprende uno o más anticuerpos frente al polipéptido de la invención.

25

Como se demuestra en la invención los péptidos o composiciones de la invención presentan utilidad al ser inoculados en un organismo para producir una respuesta inmune específica en el organismo, de forma que se protege al organismo de las infecciones por Fasciola y más concretamente por Fasciola hepatica al reducir el daño producido por este parásito. Además se evita la muerte de los organismos infectados 30 ya que se reduce la cantidad de vermes presentes. Esta respuesta inmune es la encargada de producir una protección frente a parásitos del género Fasciola y especialmente de la especie Fasciola hepatica. Como se observa en los ejemplos resulta de especial relevancia la combinación de los polipéptidos de secuencia SEQ ID

NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3 en combinación ya que son los que provocan en el individuo posteriormente infectado por Fasciola hepatica una mayor supervivencia, un bajo daño hepático y una mayor reducción de vermes. Por todo esto, tanto otro aspecto de la invención se refiere al uso de los polipéptidos, secuencias nucleotídicas, construcciones genéticas, vectores de expresión, células, composiciones, sueros o 5 anticuerpos de la invención para la elaboración de un medicamento o alternativamente a los polipéptidos, secuencias nucleotídicas, construcciones genéticas, vectores de expresión, células, composiciones, sueros o anticuerpos de la invención para su uso como medicamento. Una realización preferida se refiere al uso de los polipéptidos, secuencias nucleotídicas, construcciones genéticas, vectores de expresión, células, 10 composiciones, sueros o anticuerpos de la invención para la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento de infecciones producidos por organismos del género Fasciola, preferiblemente de la especie Fasciola hepatica o alternativamente a los polipéptidos, secuencias nucleotídicas, construcciones genéticas, vectores de expresión, células, composiciones, sueros o anticuerpos de la 15 invención para su uso como medicamento para la prevención o el tratamiento de infecciones producidos por organismos del género Fasciola, preferiblemente de la especie Fasciola hepatica.

Otra realización preferida se refiere al uso de los polipéptidos, secuencias 20 nucleotídicas, construcciones genéticas, vectores de expresión, células, composiciones, sueros o anticuerpos de la invención para la elaboración de un medicamento donde el medicamento es una vacuna o alternativamente a los polipéptidos, secuencias nucleotídicas, construcciones genéticas, vectores de expresión, células, composiciones, sueros o anticuerpos de la invención para su uso 25 como medicamento donde el medicamento es una vacuna.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método para tratar a pacientes infectados por el parásito del género Fasciola, preferiblemente de Fasciola hepatica, el cual comprende la administración de los polipéptidos, secuencias nucleotídicas, 30 construcciones genéticas, vectores de expresión, células, composiciones o anticuerpos de la invención.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y 5 no se pretende que sean limitantes de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Fig. 1 representa los niveles de anticuerpos IgG totales, determinados mediante 10 ELISA, específicos para cada uno de los péptidos utilizados.

Fig. 2 representa los niveles de IFN- en ratones inmunizados con cada uno de los péptidos sintéticos medido mediante citometría de flujo. A: Ratones inmunizados con los péptidos que contienen epítopos B; B: Ratones inmunizados con los péptidos que 15 contienen epítopos T.

Fig. 3 representa los niveles de IL-4 en ratones inmunizados con cada uno de los péptidos sintéticos medido mediante citometría de flujo. A: Ratones inmunizados con los péptidos que contienen epítopos B; B: Ratones inmunizados con los péptidos que 20 contienen epítopos T.

Fig. 4 representa los niveles de IL-10 en ratones inmunizados con cada uno de los péptidos sintéticos medido mediante citometría de flujo. A: Ratones inmunizados con los péptidos que contienen epítopos B; B: Ratones inmunizados con los péptidos que 25 contienen epítopos T.

Fig. 5 representa los niveles de IL-17 en ratones inmunizados con cada uno de los péptidos sintéticos medido mediante citometría de flujo. A: Ratones inmunizados con los péptidos que contienen epítopos B; B: Ratones inmunizados con los péptidos que 30 contienen epítopos T.

Fig. 6 representa el porcentaje de CD62L en ratones inmunizados con cada uno de los péptidos sintéticos medido mediante citometría de flujo. A: Ratones inmunizados con

los péptidos que contienen epítopos B; B: Ratones inmunizados con los péptidos que contienen epítopos T.

Fig. 7. Análisis macroscópico del hígado de ratones inmunizados e infectados con metacercarias de Fasciola hepatica. A: Hígado de un ratón del grupo control sano; B: 5 Hígado de un ratón del grupo de control de la infección; C: Hígado de un ratón inmunizado con la mezcla de péptidos T14 (SEQ ID NO: 1) + T15 (SEQ ID NO: 2) + T16 (SEQ ID NO: 3) e infectado con metacercarias de Fasciola hepatica.

Fig. 8 representa los niveles de anticuerpos IgG totales, determinados mediante 10 ELISA, con cada una de las mezclas complejas de antígenos.

EJEMPLOS

Diseño de péptidos: 15

Debido a que en la actualidad no se encuentra disponible el genoma completo de F. hepatica, solamente se encuentra información parcial de secuencias de genes y proteínas en las bases de datos. Todas las secuencias de proteínas disponibles de F. hepatica fueron recogidas de la base de datos NCBI. Para seleccionar aquellas proteínas que posiblemente son secretadas, cada secuencia obtenida fue 20 individualmente analizada para detectar la presencia de péptido señal (SP) y la ausencia de dominios de unión transmembrana (TM). El dominio de péptido señal fue identificado mediante el servidor SignalP 3.0 (Bendsten et al., 2004, J. Mol Biol., 4: 783-95) y la predicción del dominio transmembranal mediante el servidor TMHMM2.0. Solamente aquellas proteínas que presentaron péptido señal y ningún dominio de 25 unión transmembranal fueron finalmente seleccionadas y agrupadas en familias comunes.

- Péptidos que contienen epítopos B: Para la predicción de epitopos B lineales se utilizaron las herramientas BepiPred (Larsen et al. 2006, Immunome Res, 30 2:2), y Antheprot (Deléage et al. 2001, Comput Biol Med, 31:258-267). En el método empleado por BepiPred, a partir de una secuencia de aminoácidos de una proteína en formato FASTA como entrada, cada aminoácido recibe un puntaje basado en algoritmos de Modelos Ocultos de Markov (HMM) y de

Redes Neuronales (NN) e incorpora métodos basado en la hidrofilicidad y predicción de estructura secundaria.

Los valores obtenidos por este método fueron comparados con aquellos dados por el programa ANTHEPROT 3D el cual se basa en propiedades físicas y 5 químicas de los aminoácidos, tales como antigenicidad, hidrofobicidad, flexibilidad y acceso al solvente. Las secuencias de aminoácidos con los mayores puntajes fueron agrupadas en secuencias de 20 aminoácidos y solamente aquellas regiones que mostraron los mayores puntajes de probabilidad (≥ 0,5 de acuerdo al resultado HMM) fueron seleccionadas como 10 epitopos B lineales (Kolaskar A.S. et al. 1990, FEBS letters, 276:172-174; Larsen et al. 2006, Immunome Res, 2:2).

- Péptidos que comprenden epítopos T: Las herramientas de predicción SYFPEITHI (Rammensee et al. 1999, Immunogenetics, 50:213-219) e IEDB 15 (Immune Epitope Database) fueron usadas para predecir el anclaje de péptidos derivados de las proteínas seleccionadas al complejo mayor de histocompatibilidad de clase II. La predicción de epítopos T fue realizada empleando como referencia las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad de clase II de ratón (H2-IAd y H2-IEd). Los péptidos 20 diseñados siguiendo esta metodología corresponden a secuencias de 15 aminoácidos de longitud. Las secuencias de aminoácidos seleccionadas corresponden a aquellas secuencias que presentan los mayores valores “scores”, diseñándose dos péptidos por cada secuencia de proteína.

25

Síntesis de péptidos:

Se utilizó la metodología de síntesis de péptidos en fase sólida desarrollada por Merrifield (Merrifield 1969, Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol, 32;221-296) y modificada por Houghten (Houhgten 1985, Proc Nat Acad Sci USA, 82;5131-5135) con algunas modificaciones. En este procedimiento se distinguen cuatro pasos 30 fundamentales:

i. Acople del primer aminoácido protegido (t-Boc) por el extremo carboxilo terminal a una resina sólida, inerte y estable que va a soportar los polipéptidos sintetizados mediante un enlace covalente tipo éter.

ii. Desprotección (clivaje del grupo t-Boc) del aminoácido acoplado en el paso anterior, exponiendo así el grupo funcional amino del extremo N-terminal. 5

iii. Activación del grupo carboxílico del aminoácido t-Boc que va a ser acoplado.

iv. Acople del aminoácido t-Boc activado en el paso anterior al aminoácido que está unido covalentemente a la resina (formación del enlace amida peptídico).

Estos pasos son repetidos simultáneamente dependiendo del número de aminoácidos 10 que se deseen acoplar a la cadena peptídica. Al final del último acople y desprotección se sigue un procedimiento de clivaje para retirar el polipéptido de la resina, así como para eliminar grupos protectores adicionales que eventualmente pudieran tener algunos aminoácidos que contengan en su estructura grupos funcionales reactivos, por ejemplo, aminoácidos con grupos –OH, - COOH y -SH libres. 15

Cada vez que se realiza el acople de un aminoácido y la desprotección del mismo, se debe hacer una prueba analítica cualitativa para verificar que estos pasos han sido correctamente desarrollados. La prueba cualitativa empleada se denomina el test de Kaiser (Kaiser et al. 1970, Anal Biochem, 34;595-598) que detecta la presencia de 20 grupos amino libres en aminas primarias y secundarias. Cuando el test de Kaiser resulta positivo se produce una coloración azul de la resina y es debido a que la unión de un aminoácido a otro ha sido incompleto y se detecta la presencia de grupos amino libres, o bien la desprotección ha sido completa y los grupos amino del último aminoácido acoplado están libres para formar el enlace peptídico con el siguiente 25 aminoácido t-Boc. En caso contrario no se produce dicha coloración azul.

Inicialmente se parte de una resina de MBHA (Hidrocloruro de Metilbenzildrilamina) con una sustitución de 0,50 meq/gramo, la cual se neutraliza con DIEA (N,N – Diisopropiletilamina) al 5% en DCM (Diclorometano), los aminoácidos t-Boc son 30 acoplados utilizando como activadores del grupo alfa carboxílico DCC (diciclohexilcarbodiimida) y HOBt (1-hidroxi-benzotriazol) en DMF (Dimetil-formamida). Para confirmar la unión del aminoácido se realiza el test de Kaiser. Una vez acoplado el aminoácido, el grupo protector t-Boc se remueve con TFA (Ácido trifluoroacético) al

55% en DCM por 25 minutos. Antes del siguiente acople, el péptido-resina se neutraliza con DIEA al 5% en DCM. Al finalizar la síntesis del péptido el clivaje de los grupos protectores de las cadenas laterales de los aminoácidos y el desanclaje del péptido de la resina se hace con las técnicas de clivaje bajo (25% HF) y clivaje alto (100% HF). Finalmente, se añadieron un residuo de glicina y uno de cisteína en los 5 extremos amino y carboxilo-terminal de cada péptido para permitir su polimerización por oxidación (Lioy et al. 2001, Angew Chem Int Ed Engl, 40;2631-2635), dando como resultado la generación de polipéptidos formados mayoritariamente por trímeros de cada monómero.

10

Mediante la síntesis de péptidos en fase sólida se sintetizaron los monómeros indicados en la tabla 1 a los que se añadió una glicina y una cisteína en cada uno de los extremos amino y carboxilo terminal. Posteriormente mediante reacción de oxidación se fusionaron 3 monómeros de cada péptido mediante la cisteínas de los extremos para dar los polipéptidos de la tabla 2. 15

Tabla 1: péptidos sintetizados

Familia

Péptido Secuencia de aminoácidos del monómero Peso molecular (KDa) Posición

Amebaporo 1

B1 kgagssqdacikfiqyevdg (SEQ ID NO: 4) 2437,1 63-82

Amebaporo 1

B2 kgagssqdatikfiqyevdg (SEQ ID NO: 5) 2435 63-82

Amebaporo 2

B3 fasfdvpskqptididlcdi (SEQ ID NO: 6) 2545,3 14-33

Amebaporo 2

B4 fasfdvpskqptididltdi (SEQ ID NO: 7) 2543,2 14-33

Catepsina B1

B5 iseirdqsstsstwavssas (SEQ ID NO: 8) 2419,9 79-98

Catepsina B2

B6 gvengvkywlianswnegwg (SEQ ID NO: 9) 2600,3 293-312

Catepsina L1

B7 qtcsplrvnhavlavgygtq (SEQ ID NO: 10) 2435 260-279

Catepsina L1

B8 qttsplrvnhavlavgygtq (SEQ ID NO: 11) 2432,9 260-279

Cistatina 1

B9 yteprsvtpeersvfqpmil (SEQ ID NO: 12) 2700,2 27-46

Cistatina 2

B10 fvplyssksatsvgtptrvs 2405,1 95-114

(SEQ ID NO: 13)

Legumaína 2

B11 vttngppngkhndkhtyvec (SEQ ID NO: 14) 2532,2 350-369

Legumaína 2

B12 vttngppngkhndkhtyvet (SEQ ID NO: 15) 2530,1 350-369

Amebaporo

T13 tvnlvkrllqnsvve (SEQ ID NO: 16) 2032,5 37-51

Amebaporo

T14 dyiidhvdqhnatei (SEQ ID NO: 17) 2103,6 80-94

Catepsina B

T15 drntqrqtvrysvse (SEQ ID NO: 18) 2159,3 46-60

Catepsina B

T16 fymfedflvyksgiy (SEQ ID NO: 19) 2243,1 260-274

Catepsina L

T17 kyltemsrasdilsh (SEQ ID NO: 20) 2071,9 83-97

Catepsina L

T18 isfseqqlvdtsgpw (SEQ ID NO: 21) 2014,3 153-167

Catepsina L

T19 enayeylkhnglete (SEQ ID NO: 22) 2130,7 178-192

Citocromo oxidasa

T20 ldpyfnlvspevyny (SEQ ID NO: 23) 2153,7 27-41

Citocromo oxidasa

T21 dlnlprlnalsawll (SEQ ID NO: 24) 2029,9 76-90

Vitelina

T22 faghgkaylhgsfdk (SEQ ID NO: 25) 1955,9 56-70

Vitelina

T23 yekyeddyaretpyd (SEQ ID NO: 26) 2276,7 254-268

NADH

T24 lgigflvevrrgyvr (SEQ ID NO: 27) 2054,9 101-115

Tabla 2: Secuencias de los polipéptidos

Polipéptido

Secuencia

B1

cg kgagssqdacikfiqyevdg gccg kgagssqdacikfiqyevdg gccg kgagssqdacikfiqyevdg gc (SEQ ID NO: 28)

B2

cg kgagssqdatikfiqyevdg gccg kgagssqdatikfiqyevdg gccg kgagssqdatikfiqyevdg gc (SEQ ID NO: 29)

B3

cg fasfdvpskqptididlcdi gccg fasfdvpskqptididlcdi gccg fasfdvpskqptididlcdi gc (SEQ ID NO: 30)

B4

cg fasfdvpskqptididltdi gccg fasfdvpskqptididltdi gccg fasfdvpskqptididltdi gc (SEQ ID NO: 31)

B5

cg iseirdqsstsstwavssas gccg iseirdqsstsstwavssas gccg iseirdqsstsstwavssas gc (SEQ ID NO: 32)

B6

cg gvengvkywlianswnegwg gccg gvengvkywlianswnegwg gccg gvengvkywlianswnegwg gc (SEQ ID NO: 33)

B7

cg qtcsplrvnhavlavgygtq gccg qtcsplrvnhavlavgygtq gccg qtcsplrvnhavlavgygtq gc (SEQ ID NO: 34)

B8

cg qttsplrvnhavlavgygtq gccg qttsplrvnhavlavgygtq gccg qttsplrvnhavlavgygtq gc (SEQ ID NO: 35)

B9

cg yteprsvtpeersvfqpmil gccg yteprsvtpeersvfqpmil gccg yteprsvtpeersvfqpmil gc (SEQ ID NO: 36)

B10

cg fvplyssksatsvgtptrvs gccg fvplyssksatsvgtptrvs gccg fvplyssksatsvgtptrvs gc (SEQ ID NO: 37)

B11

cg vttngppngkhndkhtyvec gccg vttngppngkhndkhtyvec gccg vttngppngkhndkhtyvec gc (SEQ ID NO: 38)

B12

cg vttngppngkhndkhtyvet gccg vttngppngkhndkhtyvet gccg vttngppngkhndkhtyvet gc (SEQ ID NO: 39)

T13

cg tvnlvkrllqnsvve gccg tvnlvkrllqnsvve gccg tvnlvkrllqnsvve gc (SEQ ID NO: 40)

T14

cg dyiidhvdqhnatei gccg dyiidhvdqhnatei gccg dyiidhvdqhnatei gc (SEQ ID NO: 1)

T15

cg drntqrqtvrysvse gccg drntqrqtvrysvse gccg drntqrqtvrysvse gc (SEQ ID NO: 2)

T16

cg fymfedflvyksgiy gccg fymfedflvyksgiy gccg fymfedflvyksgiy gc (SEQ ID NO: 3)

T17

cg kyltemsrasdilsh gccg kyltemsrasdilsh gccg kyltemsrasdilsh gc (SEQ ID NO: 41)

T18

cg isfseqqlvdtsgpw gccg isfseqqlvdtsgpw gccg isfseqqlvdtsgpw gc (SEQ ID NO: 42)

T19

cg enayeylkhnglete gccg enayeylkhnglete gccg enayeylkhnglete gc (SEQ ID NO: 43)

T20

cg ldpyfnlvspevyny gccg ldpyfnlvspevyny gccg ldpyfnlvspevyny gc (SEQ ID NO: 44)

T21

cg dlnlprlnalsawll gccg dlnlprlnalsawll gccg dlnlprlnalsawll gc (SEQ ID NO: 45)

T22

cg faghgkaylhgsfdk gccg faghgkaylhgsfdk gccg faghgkaylhgsfdk gc (SEQ ID NO: 46)

T23

cg yekyeddyaretpyd gccg yekyeddyaretpyd gccg yekyeddyaretpyd gc (SEQ ID NO: 47)

T24

cg lgigflvevrrgyvr gccg lgigflvevrrgyvr gccg lgigflvevrrgyvr gc (SEQ ID NO: 48)

Evaluación in vitro de la citotoxicidad de los péptidos sintéticos en macrófagos peritoneales de ratón:

Los péptidos sintetizados se analizaron para determinar su toxicidad con la finalidad de poder descartar aquellos que pudieran generar reacciones no adecuadas en un 5 organismo. Para ello se estableció un cultivo continuo in vitro de la línea celular J774.2 derivada de macrófagos peritoneales de ratón. Brevemente, el vial que contenía los macrófagos fue descongelado rápidamente en un baño a 37ºC y puesto en un frasco de cultivo de 75 cm2 de área superficial junto con 10 mL de medio completo de cultivo (DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino, 2mM de L-glutamina y 10 penicilina-estreptomicina) que se incuba en cámara de 37ºC con 5% CO2 durante 48-72 h. Pasado este tiempo, el sobrenadante de cultivo fue retirado del frasco de cultivo y los macrófagos adheridos a la superficie fueron retirados añadiendo 5 mL de Versene (Gibco) e incubados durante 10 minutos a 37ºC / 5% CO2. Los macrófagos fueron recuperados por centrifugación a 1.200 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante 15 fue descartado y los macrófagos fueron resuspendidos en 10 mL de medio completo de cultivo con el fin de ser cuantificados en cámara de Neubauer. Un millón de macrófagos por cada pocillo fueron puestos en placas de cultivo e incubados durante 2 h a 37ºC / 5% CO2. Posteriormente, todos los péptidos sintéticos fueron añadidos por duplicado en un rango de concentraciones entre 5 y 100 µg/mL por un periodo de 24 h 20 a 37ºC y 5% CO2. Después de este tiempo, el sobrenadante de cultivo fue recuperado y almacenado a -20º C para la posterior cuantificación de la producción de óxido nítrico. Los macrófagos adheridos a la superficie de la placa fueron tratados con el colorante MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-bromuro de difeniltetrazolio) para evaluar la viabilidad celular (Ferrari et al. 1990, J Immunol Methods, 131; 165-172). 25

Sistema ADAD de vacunación

Para la inmunización de los ratones con los péptidos sintéticos se utilizó el sistema ADAD de vacunación para potenciar el efecto de los péptidos, el cual presenta la siguiente composición:

- Extracto no-tóxico de Quillaja saponaria como adyuvante. 5

- Inmunodulador de síntesis química AA0029.

- Aceite no-mineral Montanide ISA 763A que forma una emulsión (aceite/agua) (70/30) y permite una liberación lenta del antígeno.

El adyuvante utilizado (Quillaja saponaria) está compuesto por 4 fracciones purificadas 10 de un extracto, denominadas: Qs21, Qs18, Qs17y Qs7, las cuales no mostraban actividad hemolítica.

Como inmunomodulador sintético, se empleo la diamina alifática AA0029 de fórmula:

15

en una dosis de 100 μg / ratón. Este compuesto fue sintetizado siguiendo la metodología descrita por del Olmo (del Olmo et al. 2006, Bioorg Med Chem Lett, 16;6091-6095). AA0029 inhibe la proliferación de linfocitos en cultivo de esplenocitos en un rango de concentraciones entre 1 y 10 µg / mL, no presenta citotoxidad (≈ 4%) y aumenta la producción de óxido nítrico (≈ 25%) en macrófagos alveolares de rata pre-20 estimulados con LPS, por lo cual se sugiere su uso como inmunomodulador.

El protocolo de vacunación con el sistema ADAD consta de dos inyecciones para cada administración: la primera está compuesta por el adyuvante, el inmunomodulador y el aceite no-mineral Montanide ISA 763A formando una emulsión aceite/agua (70/30), 25 administrada por vía subcutánea como un primer paso de adaptación del sistema inmune. Cinco días después de la inyección de adaptación se realiza la primera dosis de inmunización que incluye además de los componentes anteriormente mencionados el antígeno vacunal.

30

Inmunización de ratones BALB/c con los péptidos sintéticos

Se emplearon para este estudio 84 ratones hembras de la cepa BALB/c de seis semanas de edad procedentes de Charles River Laboratorios España (Griffa, S.A.). Todos los animales fueron tratados de acuerdo a las disposiciones de la Unión Europea, recogidas en el Real Decreto 1201/2005 del 10 de Octubre del Ministerio de 5 Agricultura, Pesca y Ganadería “Protección de los animales utilizados para experimentación y otros fines específicos”.

Para los estudios de valoración de la respuesta inmunológica, se inmunizaron grupos de tres ratones cada uno con los diferentes péptidos, empleando el sistema de 10 vacunación ADAD usando el inmunommodulador de síntesis química AA0029.

Se realizaron dos experimentos de inmunización, en los cuales se utilizaron 42 ratones por cada experimento. La distribución de los ratones en los diferentes grupos se muestra en la tabla 3. 15

Tabla 3. Distribución de los ratones en grupos de inmunización con epítopos de péptidos B y T. Cada grupo consta de tres ratones hembra de la cepa BALB/c.

Experimento 1

Experimento 2

Grupo

Antígeno Inmunomodulador Grupo Antígeno Inmunomodulador

1

Sano 1 Sano

2

Adyuvante AA0029 2 Adyuvante AA0029

3

B1 (SEQ ID NO: 28) AA0029 3 T13 (SEQ ID NO: 40) AA0029

4

B2 (SEQ ID NO: 29) AA0029 4 T14 (SEQ ID NO: 1) AA0029

5

B3 (SEQ ID NO: 30) AA0029 5 T15 (SEQ ID NO: 2) AA0029

6

B4 (SEQ ID NO: AA0029 6 T16 (SEQ ID NO: 3) AA0029

31)

7

B5 (SEQ ID NO: 32) AA0029 7 T17 (SEQ ID NO: 41) AA0029

8

B6 (SEQ ID NO: 33) AA0029 8 T18 (SEQ ID NO: 42) AA0029

9

B7 (SEQ ID NO: 34) AA0029 9 T19 (SEQ ID NO: 43) AA0029

10

B8 (SEQ ID NO: 35) AA0029 10 T20 (SEQ ID NO: 44) AA0029

11

B9 (SEQ ID NO: 36) AA0029 11 T21 (SEQ ID NO: 45) AA0029

12

B10 (SEQ ID NO: 37) AA0029 12 T22 (SEQ ID NO: 46) AA0029

13

B11 SEQ ID NO: 38) AA0029 13 T23 (SEQ ID NO: 47) AA0029

14

B12 (SEQ ID NO: 39) AA0029 14 T24 (SEQ ID NO: 48) AA0029

Los ratones fueron inmunizados por vía subcutánea con 10 μg de cada péptido sintético formulado en el sistema ADAD de vacunación en el día 0. Dos dosis de refuerzo fueron aplicadas con la misma cantidad de antígeno en los días 14 y 28, respectivamente. Se incluyó en este experimento un grupo de ratones como control 5 sano que no fueron inmunizados durante el experimento y un grupo de ratones que solo recibieron los componentes del sistema ADAD. Dos semanas después de la última dosis de inmunización todos los ratones fueron necropsiados a fin de caracterizar la respuesta inmunológica inducida.

Detección de anticuerpos específicos en suero de ratones inmunizados con cada péptido por la técnica de ELISA.

Se emplearon placas de 96 pocillos y cada pocillo fue cargado con 1 μg de cada péptido sintético en un volumen final de 100 µL en tampón carbonato pH 9,6 e 5 incubado durante 1 h a 37ºC, 12 h a 37ºC y finalmente 1 h más a 37ºC. Las placas fueron lavadas tres veces con PBS-0,05% Tween (PBS-T) y bloqueadas con 200 μL por pocillo de una solución de leche descremada al 5% en PBS-T durante 1 h a 37ºC. Las placas fueron lavadas nuevamente tres veces con PBS-T. Las muestras de suero obtenidas de cada ratón de cada uno de los dos experimentos de inmunización fueron 10 incubadas en una dilución 1:100 en leche descremada al 5% en PBS-T durante 1 h a 37ºC. Posteriormente las placas fueron lavadas como en los pasos anteriores y los anticuerpos secundarios de ratón acoplados a peroxidasa anti-IgG, IgE, IgM, así como de los subtipos IgG1 e IgG2a fueron incubados durante 1 hora a 37ºC en una dilución 1:1000 en leche descremada al 5% en PBS-T. Las placas fueron lavadas y reveladas 15 empleando el substrato de la peroxidasa OPD (o-fenilendiamina dihidrocloruro) en buffer citrato pH 5,0, la cual da como resultado una coloración amarillo-naranja que se mide a una longitud de onda de 492 nm en un espectrofotómetro Anthos 2010.

Los péptidos que presentaron los mayores títulos de anticuerpos (p<0,05) 20 corresponden a los denominados B1 (SEQ ID NO: 28), B3 (SEQ ID NO: 30), B4 (SEQ ID NO: 31), B5 (SEQ ID NO: 32), B6 (SEQ ID NO: 33), T13 (SEQ ID NO: 40), T15 (SEQ ID NO: 2), T18 (SEQ ID NO: 42), T20 (SEQ ID NO: 44) y T21 (SEQ ID NO: 45) (Figura 1).

25

Determinación de citocinas en sobrenadantes de cultivo de esplenocitos de ratones inmunizados con los péptidos sintéticos por citometría de flujo.

Todos los ratones utilizados en los experimentos de inmunización fueron necropsiados dos semanas después de la tercera inmunización y los esplenocitos fueron obtenidos siguiendo la metodología descrita por López-Aban (López-Aban et al. 2007, J 30 Parasitol, 93;428-432) con algunas modificaciones. Brevemente, los bazos de los ratones fueron extraídos y puestos en una caja de Petri que contenía 10 mL de PBS 1X estéril. Los extremos de cada bazo fueron cortados y perfundidos con 10 mL de PBS 1X estéril. Los esplenocitos fueron recuperados por centrifugación a 1.200 rpm

durante 5 min a temperatura ambiente y posteriormente los glóbulos rojos fueron lisados añadiendo 1 mL de solución de lisis que contenía cloruro de amonio (154 mM), bicarbonato de potasio (10 mM) y EDTA (0,082 mM) durante 5 min a 4º C. El sobrenadante que contiene los glóbulos rojos lisados fue descartado y los esplenocitos fueron recuperados por centrifugación a 1.200 rpm durante 5 min y lavados con 5 mL 5 de PBS 1X – 2% SFB para eliminar restos de la solución de lisis. Finalmente, los esplenocitos fueron resuspendidos en 1 mL de PBS 1X – 2% Suero Fetal Bovino (SFB) y cuantificados en cámara de Neubauer.

Un millón de esplenocitos fueron incubados en placas de cultivo de 6 pocillos en un 10 volumen final de 1 mL de medio completo de cultivo y dejados en cámara de 37ºC /5% CO2 / 6 h. Pasado este tiempo los esplenocitos de cada ratón fueron reestimulados con 10 µg / mL del péptido con el que fueron inmunizados. El sobrenadante de cultivo fue recuperado a las 72 horas y las citocinas del perfil Th1 (IFN-γ, TNF-α, IL-2), Th2 (IL-4, IL-5, IL-6), Treg (IL-10), Th 17 (IL17), IL-1α y el factor estimulante de colonias 15 granulocitos / macrófagos (GM-CSF) fueron cuantificadas empleando el kit FlowCytomix Mouse Th1/Th2 10plex, por citometría de flujo de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. Brevemente, se dispone de unas esferas que están cargadas con anticuerpos específicos que reaccionan con cada citocina que va a ser detectada en este sistema. Las esferas son diferenciadas en citómetro de flujo al tener 20 dos tamaños diferentes (4 µm y 5 µm) y emitir diferentes intensidades de fluorescencia. De esta forma, se pueden distinguir 10 subpoblaciones de esferas diferentes, cada una correspondiente con la citocina que se desea cuantificar. Posteriormente, una mezcla de todas las esferas cargadas con cada anticuerpo para las diferentes citocinas que se van a cuantificar son incubadas con la muestra a 25 analizar, dando como resultado la unión de las citocinas a su anticuerpo correspondiente. Posteriormente se añade una mezcla de anticuerpos secundarios conjugados con biotina, los cuales se unen a las citocinas que previamente se habían unido a las esferas marcadas con anticuerpo primario. Finalmente, el conjugado Streptavidin – Phycoerithrin es adicionado y se une al anticuerpo secundario 30 conjugado con biotina, emitiendo señales fluorescentes que son detectadas en el citómetro de flujo y posteriormente analizadas con el software FlowCytomix Pro de Bender MedSystems. Las muestras fueron analizadas en un citómetro de flujo Becton Dickinson FACScalibur de cuatro colores del Servicio de Citometría de Flujo del Centro

de Investigación del Cáncer – CIC - de la Universidad de Salamanca. La concentración de cada citocina fue determinada a partir de curvas de calibración usando citocinas recombinantes de ratón de concentración conocida.

Las citocinas más representativas pertenecientes a los perfiles inmunológicos Th1 5 (IFN-), Th2 (IL-4), Treg (IL-10) y Th17 (IL-17) fueron determinadas en cada grupo de ratones inmunizados con los péptidos sintéticos y a continuación se describen aquellos péptidos que al inmunizarlos en los ratones produjeron aumentos estadísticamente significativos (p<0,05) comparado con el grupo control.

10

Los péptidos B5 (SEQ ID NO: 32), B6 (SEQ ID NO: 33), T14 (SEQ ID NO: 1) y T15 (SEQ ID NO: 2) produjeron un aumento en los niveles de IL-4 (Figuras 2A y 2B). Como se ilustra en las figuras 3A y 3B, los péptidos B1 (SEQ ID NO: 28), B5 (SEQ ID NO: 32), T15 (SEQ ID NO: 2) y T16 (SEQ ID NO: 3) aumentaron los niveles de IFN- y los péptidos B2 (SEQ ID NO: 4), T13 (SEQ ID NO: 40), T14 (SEQ ID NO: 1), T15 (SEQ ID 15 NO: 2) y T16 (SEQ ID NO: 3) presentaron altos niveles de IL-10 (Figuras 4A y 4B). Por último, los péptidos B5 (SEQ ID NO: 32) y T16 (SEQ ID NO: 3) mostraron altos niveles de IL-17 (Figuras 5A y 5B).

Determinación de subpoblaciones linfocitarias en esplenocitos tras la 20 inmunización con los péptidos sintéticos por citometría de flujo.

Se emplearon para este estudio los esplenocitos de cada ratón obtenidos en el apartado anterior. A 100 µL de la suspensión de esplenocitos se añadió anticuerpo de bloqueo CD16/CD32 en un volumen final de 25 µL por pocillo y en una dilución de 0.1 µL anticuerpo / muestra en solución de lavado PBS – 2% SFB. Se homogenizó muy 25 bien y se dejó 5 min sobre hielo.

Se hizo la preparación de un MasterMix (mezcla de anticuerpos específicos para cada una de las subpoblaciones linfocitarias a estudiar) añadiendo 0.5 µL de anticuerpo en 25 µL de solución de lavado (PBS 1X - 2% SFB). A cada pocillo de cada serie a 30 determinar se añadieron 25 µL de MasterMix y se dejó incubar durante 30 min a 4º C. Posteriormente, las placas fueron lavadas con 100 µL de solución de lavado, homogenizados, centrifugados a 1.500 rpm y el sobrenadante descartado. Finalmente se añadieron 100 µL por cada pocillo de solución fijadora (2% p-formaldehido en PBS

1X) y los tubos se dejaron en la oscuridad a 4º C hasta la adquisición de datos en el citómetro de flujo. El análisis de los resultados se hizo empleando el software GatelogicTM Flow Cytometry Analysis Software (Inivai Technologies Pty Ltd). En la tabla 4 se muestran las subpoblaciones linfocitarias estudiadas.

5

Tabla 4: Subpoblaciones linfocitarias cuantificadas en esplenocitos de ratones inmunizados.

SERIE

ANTICUERPO FLUOROCROMO

Linfoide

CD45 CD4 CD8 CD45R/B220 PerCP-Cy5.5 FITC PE APC

Mieloide

CD45 CD27 PerCP-Cy5.5 APC

Memoria

CD45 CD197 (CCR7) CD62L PerCP-Cy5.5 PE APC

Respecto a las subpoblaciones linfocitarias, un aumento en los niveles de CD62L se observó en el grupo de ratones inmunizados con los péptidos B5 (SEQ ID NO: 32), B6 10 (SEQ ID NO: 33), B7 (SEQ ID NO: 34), B8 (SEQ ID NO: 35), B9 (SEQ ID NO: 36), B10 (SEQ ID NO: 37), B11 (SEQ ID NO: 38), T16 (SEQ ID NO: 3), T17 (SEQ ID NO: 41), T18 (SEQ ID NO: 42), T19 (SEQ ID NO: 43), T22 (SEQ ID NO: 46) y T23 (SEQ ID NO: 47) (Figura 6).

15

Selección de péptidos para ser utilizados en ensayos de protección frente a la infección por metacercarias de Fasciola hepatica.

De los péptidos se seleccionaron varios en función de los siguientes criterios:

1) El perfil de respuesta Th1. Se seleccionaron péptidos que aumentaban los niveles de IFN-γ, niveles de IL-2 y/o IL-1α. 20

2) Péptidos que estimulen citocinas del perfil Th2 (IL-4,), Treg (IL-10) y Th17 (IL-17).

3) Péptidos que presenten un aumento en los marcadores de células memoria (CD62L, CD197, CD27).

De acuerdo al perfil inmunológico producido tras la inmunización de ratones con los 25 péptidos sintéticos, los péptidos denominados B1 (SEQ ID NO: 28), B2 (SEQ ID NO: 28), B5 (SEQ ID NO: 32), B6 (SEQ ID NO: 33), T14 (SEQ ID NO: 1), T15 (SEQ ID NO:

2) y T16 (SEQ ID NO: 3) fueron seleccionados para realizar los posteriores ensayos de protección in vivo en modelo murino frente a la infección experimental con metacercarias de Fasciola hepatica.

Estudios de protección en ratones CD1 inmunizados con los péptidos 5 seleccionados e infectados con metacercarias de Fasciola hepatica

Animales

Se utilizaron en este estudio 98 ratones hembra de la cepa CD1 (Laboratorios Charles River, Barcelona, España) de seis semanas de edad y con un peso comprendido entre 10 20 y 35 g. Los animales fueron mantenidos en jaulas plásticas con comida y agua ad libitum, periodos controlados de 12 h de luz / oscuridad y una temperatura de 20º C en las instalaciones del Servicio de Experimentación Animal de la Universidad de Salamanca.

15

Parásitos

Se utilizaron metacercarias de Fasciola hepatica provenientes de Ridgeway Research Ltd (Gloucestershire, United Kingdom) y fueron mantenidas a 4º C en una solución acuosa que contiene 0.4% de carboximetilcelulosa hasta el momento de su uso. La viabilidad de las metacercarias fue confirmada bajo observación microscópica antes de 20 la infección.

Antígenos

Se emplearon en este estudio siete péptidos derivados de proteínas de F. hepatica que contienen epítopos B y epítopos T y que fueron seleccionados de acuerdo a la 25 respuesta inmunológica.

Inmunización

Un total de 98 ratones hembras de la cepa CD1 fueron divididos en 14 grupos para ser inmunizados con los diferentes antígenos como se indica en la tabla 5. Siete ratones 30 fueron asignados a cada grupo.

Tabla 5. Distribución de los ratones en grupos de inmunización.

Grupo

Antígeno *Dosis/ Antígeno Grupo Antígeno *Dosis/ Antígeno

1

Sin tratamiento 8 B1 (SEQ ID NO: 28), B5 (SEQ ID NO: 32), B6 (SEQ ID NO: 33) 3,3 µg

2

Control infección 9 B6 (SEQ ID NO: 33), T14 (SEQ ID NO: 1) 5 µg

3

Control adyuvante 10 T14 (SEQ ID NO: 1) 10 µg

4

B1 (SEQ ID NO: 28) 10 µg 11 T15 (SEQ ID NO: 2) 10 µg

5

B2 (SEQ ID NO: 29) 10 µg 12 T16 (SEQ ID NO: 3) 10 µg

6

B5 (SEQ ID NO: 32) 10 µg 13 T14 (SEQ ID NO: 1), T15 (SEQ ID NO: 2), T16 (SEQ ID NO: 3) 3,3 µg

7

B6 (SEQ ID NO: 33) 10 µg 14 B1 (SEQ ID NO: 28), B2 (SEQ ID NO: 29), B5 (SEQ ID NO: 32), B6 (SEQ ID NO: 33), T14 (SEQ ID NO: 1), T15 (SEQ ID NO: 2), T16 (SEQ ID NO: 3) 1,4 µg

* Dosis individual de cada antígeno.

Las dosis de los demás componentes del sistema ADAD de vacunación fueron las siguientes: 100 µg del inmunomodulador de síntesis química AA0029 y 20 µg de Qs 5 21. Los ratones fueron inmunizados en el día 0 y dos dosis adicionales fueron administradas en los días 14 y 28, respectivamente. Se tomaron muestras de sangre antes de cada inmunización, en el momento de la infección y 21 días después de la infección experimental.

10

Infección y evaluación de la protección

Dos semanas después de la última inmunización, todos los ratones incluidos en este estudio, (excepto el grupo de control sano), fueron infectados por vía oral con siete metacercarias de F. hepatica. Todos los ratones del grupo de infección murieron entre los días 24 y 34 después de la infección. Los ratones supervivientes fueron 15 necropsiados para realizar la recuperación de los vermes y la valoración de lesiones hepáticas en el día 42 después de la infección.

En el hígado de cada ratón se evaluaron cambios de color, tamaño, consistencia, cicatrices y conductos biliares. La intensidad de los cambios o de las lesiones se cuantificaron de acuerdo a los siguientes criterios: 0 puntos si no había lesiones, 1 punto si una porción de un lóbulo hepático presentaba lesiones, 2 puntos si un lóbulo entero presentaba lesiones y 3 puntos si más de un lóbulo estaba afectado. Cuando la 5 suma fue de 0 puntos, se asignó “Sin lesiones”, entre 1-5 puntos “daño leve” (+), entre 6-10 puntos “daño moderado” (++) y entre 11-14 puntos “daño grave” (+++).

La protección de los ratones frente a la infección causada por F. hepatica fue evaluada de acuerdo al porcentaje de supervivencia de los ratones en cada grupo de 10 inmunización, calculado como la relación entre el número de ratones supervivientes después del día 34 y el número de ratones pertenecientes a cada grupo. La puntuación total de las lesiones hepáticas y el porcentaje de reducción de vermes también se consideraron como indicadores de protección.

15

Determinación de anticuerpos.

Los niveles de IgG totales, IgG1 e IgG2a fueron detectados por la técnica de ELISA en suero de ratones inmunizados con los péptidos sintéticos y en suero de ratones infectados con metacercarias de F. hepatica. Brevemente, placas de 96 pocillos fueron sensibilizados con 1 µg de cada péptido o la mezcla de ellos en buffer carbonato pH 20 9,6 e incubados durante 12h a 4ºC. Las placas fueron lavadas con PBS-T y posteriormente bloqueadas con 200 µL por pozo de una solución de leche descremada al 5% p/V en PBS 1X durante 1h a 37ºC. Después de lavar las placas nuevamente se adicionó el suero de los ratones incluidos en este estudio en una dilución 1:100 en solución de bloqueo y se incubó durante 1h a 37ºC. Posteriormente, 25 se lavaron las placas como en el paso anterior y se añadieron 100 L/pozo de anticuerpo secundario IgG anti-ratón generado en cabra y acoplado a peroxidasa en una dilución 1:1000 y se dejó incubar durante 1h a 37ºC. Después de lavar las placas, se adicionaron 100 L de solución de revelado (2,59 mM orto-fenilendiamina + 17,05 mM H2O2 en buffer de citrato pH 5,0) a cada pozo y se deja en la oscuridad por un 30 periodo de 10 minutos. Finalmente se adicionan 50 L de ácido sulfúrico 3N para detener la reacción colorimétrica y se lee la absorbancia de la placa a 492 nm en el lector de ELISA EAR400FT (STL Lab Instruments, Groding, Austria).

Resultados

La inmunización de los ratones con los péptidos sintéticos produjo un aumento en la supervivencia de estos, así como una reducción tanto en el daño hepático como en el número de vermes recuperado. Estos datos se muestran en la tabla 6.

5

Tabla 6. Valoración de la protección frente a la infección experimental con metacercarias de Fasciola hepatica en ratones inmunizados con péptidos sintéticos.

Antígeno

Supervivencia (%) Puntuación daño hepático Reducción de vermes (%)

Control sano

100 0,0

Control infección

0 12,0

Control adyuvante

33 8,0 50,0

Péptido B1 (SEQ ID NO: 28

50 9,3 50,0

Péptido B2 (SEQ ID NO: 29)

67 6,0 58,3

Péptido B5 (SEQ ID NO: 32)

60 7,8 60,0

Péptido B6 (SEQ ID NO: 33)

60 6,4 50,0

Péptidos B6 (SEQ ID NO: 33)+T14 (SEQ ID NO: 1)

50 10,0 58,3

Péptidos B1 (SEQ ID NO: 28)+B5 (SEQ ID NO: 32)+B6 (SEQ ID NO: 33)

50 8,7 41,7

Péptido T14 (SEQ ID NO: 1)

40 6,8 50,0

Péptido T15 (SEQ ID NO: 2)

67 8,8 58,3

Péptido T16 (SEQ ID NO: 3)

43 10,7 57,1

Péptidos T14 (SEQ

80 6,2 60,0

ID NO: 1)+T15 (SEQ ID NO: 2)+T16 (SEQ ID NO: 3)

Péptidos B [B1 (SEQ ID NO: 28), B2 (SEQ ID NO: 29), B5 (SEQ ID NO: 32), B6 (SEQ ID NO: 33)] +T [T14 (SEQ ID NO: 1), T15 (SEQ ID NO: 2), T16 (SEQ ID NO: 3)]

57 6,3 57,1

Los resultados demuestran el enorme potencial de la mezcla de péptidos T14 (SEQ ID NO: 1)+T15 (SEQ ID NO: 2)+T16 (SEQ ID NO: 3) como candidatos a vacuna contra la infección causada por F. hepatica, ya que el grupo de ratones inmunizados con esta mezcla de péptidos presentaron el mayor porcentaje de supervivencia, así como los 5 menores daños hepáticos y recuperación de vermes comparado con el grupo de infección.

Se evidencia el efecto sinérgico que posee esta mezcla de péptidos, ya que aumenta la protección de los grupos de ratones inmunizados con los péptidos individuales. El 10 análisis macroscópico del hígado de los ratones inmunizados con esta mezcla de péptidos (T14 (SEQ ID NO: 1)+T15 (SEQ ID NO: 2)+T16 (SEQ ID NO: 3)) evidenció que las lesiones hepáticas son mínimas comparado con el grupo de infección (Figura 7). Este efecto sinérgico además no se produce cuando se utilizan otras mezclas de antígenos diferentes como se evidencia en la tabla 6 con la mezcla de los péptidos B 15 [B1 (SEQ ID NO: 28), B5 (SEQ ID NO: 32), B6 (SEQ ID NO: 33)],o péptidos B [(B1 (SEQ ID NO: 28), B2 (SEQ ID NO: 29), B5 (SEQ ID NO: 32), B6 (SEQ ID NO: 33)] +T [T14 (SEQ ID NO: 1), T15 (SEQ ID NO: 2), T16 (SEQ ID NO: 3)]. Además este efecto se produce a pesar de que el número de anticuerpos IgG totales producidos por la inmunización con esta mezcla es inferior a la producción de anticuerpos IgG producida 20 por otras mezclas de antígenos (Figura 8).

Claims (25)

1. REIVINDICACIONES

   1. Polipéptido aislado o sintético que comprende SEQ ID NO: 18, donde dicha secuencia se repite al menos 3 veces.

   5
2. 2. Polipéptido según la reivindicación 1 donde el número de repeticiones de SEQ ID NO: 18 es 3.
3. 3. Polipéptido según la reivindicación 2 que consiste en la secuencia SEQ ID NO: 2.

   10
4. 4. Secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. 5. Construcción genética que comprende la secuencia nucleotídica según la reivindicación 4. 15
6. 6. Construcción genética según la reivindicación 5 que es un vector de expresión.
7. 7. Célula que comprende una secuencia nucleotídica según la reivindicación 4 o una construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6. 20
8. 8. Composición que comprende un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
9. 9. Composición según la reivindicación 8 que además comprende un polipéptido que 25 comprende SEQ ID NO: 17 donde SEQ ID NO: 17 se repite al menos 3 veces o un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 19 donde SEQ ID NO: 19 se repite al menos 3 veces.
10. 10. Composición según la reivindicación 9 que comprende un polipéptido que 30 comprende SEQ ID NO: 17 donde SEQ ID NO: 17 se repite al menos 3 veces y un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 19 donde SEQ ID NO: 19 se repite al menos 3 veces.
11. 11. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10 donde el número de repeticiones de SEQ ID NO: 17 en el polipéptido que comprende SEQ ID NO: 17 es 3, y/o el número de repeticiones de SEQ ID NO: 19 en el polipéptido que comprende SEQ ID NO: 19 es 3.

    5
12. 12. Composición según la reivindicación 11 donde el polipéptido que comprende SEQ ID NO: 17 es el polipéptido SEQ ID NO: 2 y/o donde el polipéptido que comprende SEQ ID NO: 19 es el polipéptido SEQ ID NO: 3.
13. 13. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12 que además 10 comprende un inmunomodulador, un aceite no-mineral y/o un adyuvante.
14. 14. Composición según la reivindicación 14 donde el inmunomodulador es AA0029.
15. 15. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 14 donde el adyuvante 15 es al menos una saponina de Quillaja saponaria.
16. 16. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 14 donde el adyuvante es Qs21.

    20
17. 17. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16 donde el aceite no-mineral es Montanide ISA 763A.
18. 18. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 17 que además comprende otro péptido derivado de Fasciola hepatica. 25
19. 19. Composición según la reivindicación 18 donde el péptido derivado de Fasciola hepatica es un polipéptido que comprende al menos tres copias de uno de los péptidos de secuencia SEQ ID NO: 4-16 o SEQ ID NO: 20-27.

    30
20. 20. Composición según la reivindicación 19 donde el polipéptido es uno de los polipéptidos de secuencia SEQ ID NO: 28-48
21. 21. Anticuerpos aislados producidos tras la inmunización de un mamífero con un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una composición según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 20.
22. 22. Uso de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, una 5 secuencia nucleotídica según la reivindicación 4, una construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, una célula según la reivindicación 7, una composición según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 20 o un anticuerpo según la reivindicación 21 para la elaboración de un medicamento.

    10
23. 23. Uso de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, una secuencia nucleotídica según la reivindicación 4, una construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, una célula según la reivindicación 7, una composición según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 20 o un anticuerpo según la reivindicación 21 para la prevención y/o el tratamiento de infecciones 15 producidas por organismos del género Fasciola.
24. 24. Uso según la reivindicación 23 donde el organismo del género Fasciola es de la especie Fasciola hepatica.

    20
25. 25. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24 donde el medicamento es una vacuna.