ES2339227T3

ES2339227T3 - Acidos nucleicos que codifican antigenos recombinantes de 56 y 82 kda de gametocitos de eimeria maxima y sus usos.

Info

Publication number: ES2339227T3
Application number: ES02746870T
Authority: ES
Inventors: Sabina L. Belli; Nicolas C. Smith; Michael Wallach
Original assignee: Abic Biological Laboratories Ltd
Current assignee: Abic Biological Laboratories Ltd
Priority date: 2001-07-06
Filing date: 2002-07-03
Publication date: 2010-05-18
Anticipated expiration: 2022-07-03
Also published as: ATE454392T1; EP1432722A2; HUP0600028A3; WO2003004683A3; US20090196888A1; US20050033042A1; US7423137B2; CN1606565B; JP2009077713A; BR0210853A; MXPA04000127A; EP1432722B1; IL159716A; EP1432722A4; RU2004103469A; JP2005501533A; AU2002316558B2; HUP0600028A2; CA2467006A1; PL366540A1

Abstract

Ácido nucleico que comprende nucléotidos consecutivos que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de 56 kDa de gametocitos de Eimeria maxima, o que codifica un homólogo del polipéptido, o un complemento del ácido nucleico, donde (a) el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 3; (b) el homólogo del polipéptido tiene por lo menos un 50 % de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como SEC ID NO: 3; (c) la secuencia de nucleótidos tiene por lo menos un 50% de identidad con la secuencia de nucleótidos que empieza en el nucleótido No. 103 y acaba en el nucleótido No. 1529 mostrada como SEC ID NO: 1; (d) la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID NO: 1; (e) el ácido nucleico es un plásmido designado como plásmido 56TRCHisb1 depositado en los Laboratorios Analíticos del Gobierno de Australia con Número de acceso NM01/22400; o (f) el ácido nucleico se hibrida al ácido nucleico definido en (d) o (e) bajos condiciones de hibridación astringentes.

Description

Ácidos nucleicos que codifican antígenos recombinantes de 56 y 82 kDa de gametocitos de Eimeria maxima y sus usos.

Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos No. 60/303,699, solicitada el 6 de julio del 2001.

Antecedentes de la invención

Los organismos que causan la enfermedad conocida como "coccidiosis" en pollos pertenece a la phylum Apicomplexa, clase Sporozoa, subclase Coccidia, orden Eucoccidia, suborden Eimeriorina, familia Eimeriidae, género Eimeria. En el género Eimerian existen muchas especies, varias de ellas son patogénicas en los pollos. Las especies de mayor preocupación en la industria del pollo son Eimeria tenella, Eimeria maxima, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix y Eimeria brunetti.

La coccidiosis se ha convertido en un problema económico importante en la industria del pollo a lo largo de las últimas décadas, debido principalmente al abarrotamiento de las granjas de pollos y el desarrollo de la resistencia a los fármacos por el parásito. La crianza de pollos bajo condiciones de abarrotamiento en un suelo sucio proporciona las condiciones óptimas para el crecimiento y la propagación de los parásitos de Eimeria. Bajo estas circunstancias, el control sanitario es imposible y el granjero debe confiar en la eficacia de los fármacos coccidiostáticos. Sin embargo, los fármacos deben mantenerse en el pienso todo el tiempo, deben utilizarse programas de de vaivén ("shuttle") para evitar la aparición de cepas de Eimeria de resistencia a los fármacos, y varios fármacos presentan efectos secundarios costosos. Además, estos coccidiostáticos presentan también efectos antibacterianos y, por tanto, se consideran que son antibióticos mezclados con el pienso. Recientemente, la Unión Europea ha decidido prohibir el uso de todos los antibióticos mezclados en el pienso en la industria del pollo, incluyendo los fármacos anticcocidiales. De este modo, la única estrategia viable para el control de la coccidiosis en el futuro es mediante el desarrollo de vacunas.

El parásito de Eimeria tiene un ciclo vital complejo en la mucosa del tracto intestinal. Este ciclo vital es muy similar al de otros parásitos hemosporidianos (es decir, plasmodium, babesia, etc.) a excepción de la falta de vector artrópodo. Los ooquistes se esporulan en el suelo sucio produciendo cuatro esporoquistes, cada uno conteniendo dos esporozoítos (que pertenecen por tanto la clase sporozoa). Los ooquistes son ingeridos por el pollo y se liberan los esporocitos mediante la molienda mecánica de la molleja. Los esporozoítos se liberan entonces de los esporocitos debido a la digestión de la pared de los esporocitos mediante enzimas proteolíticas en el intestino. A continuación, los esperozoítos móviles invaden los linfocitos y continúan con la invasión de células epiteliales donde empieza el ciclo asexual. El parásito continúa a través de 2-4 ciclos de replicación y división (cada especie teniendo un número definido de divisiones) que conducen a la producción de grandes cantidades de merozoítos hija. Después del ciclo final de la producción de merozoítos, empieza el ciclo sexual con la producción del macrogametocito (hembra) y el microgametocito (macho). El macrogametocito se caracteriza por la producción de cuerpos formadores de paredes, mientras que los microgametocitos contienen los componentes implicados en la formación de microgametos, que se desprenden de la superficie del parásito intracelular. Los microgametos están flagelados y son responsables de la fecundación del macrogameto. Se forma un zigoto que madura en el ooquiste mediante la fusión de los cuerpos formadores de paredes y la condensación del núcleo. Los ooquistes se secretan en las heces, completando así
el ciclo.

Durante los últimos años, se han utilizado antígenos nativos de las etapas sexuales (gametocitos) de Eimeria maxima para inmunizar las gallinas ponedoras. Los pollitos vástagos se vacunaron consecuentemente a través de la inmunidad materna (anticuerpo materno protector). Se han identificado previamente tres antígenos protectores principales en los gametocitos de E. maxima que tiene los pesos moleculares de 250, 82 y 56 kDa (Patente EP No. 0 256 536, Patente de Estados Unidos No. 5,496,550, y la Patente de Estados Unidos No. 5,932,225). Se observó que estos antígenos están bien conservados entre las especies de Eimeria (Wallacj 1995) y pueden proteger contra las 3 principales especies que causan la coccidiosis en pollos tiernos: E. maxima, E. tenella y E. acervulina. Más recientemente, se observó que en pruebas en corrales, los pollitos de gallinas vacunadas con estos antígenos de gametocitos nativos se protegían contra Eimeria en condiciones campestres (Wallach 1996). Esta protección actúa para disminuir el máximo de eliminación de ooquistes hasta un nivel que no provoque ningún efecto dañino en la acción del pollo tierno. En base a los resultados anteriores, se concluyó que estos antígenos son eficaces con la coccidiosis en pollos y también tienen el potencial para utilizarse con la coccidiosis en otros animales domésticos incluyendo pavos, gansos, ovejas, ganado, cerdos y peces.

Estos tres antígenos también se caracterizaron a nivel molecular. Los experimentos de traducción libres de células se llevaron a acabo para identificar las moléculas de ARN que los codifican (Mencher et al.). Las moléculas de ADNc que codifican estos antígenos se clonaron mediante inmunocribado de una biblioteca de ADNc en el vector de expresión lambda zap (4, Patente de Estados Unidos No. 5,932,225). Mediante esta estrategia, se clonó y secuenció el gen que codifica el antígeno de 250 kDa. El clon pEM 250/14 se secuenció parcialmente en las patentes de Estados Unidos Nos 5,932,225 y 5,496,550. La figura 13a de la presente solicitud reproduce la figura 11 de las Patentes de Estados Unidos Nos. 5,932,225 y 5,496,550, que representa la secuencia de ADN de los primeros 293 nucleótidos del clon pEM 250/14. La figura 13b de presente solicitud reproduce la figura 12 de las Patentes de Estados Unidos Nos. 5,932,225 y 5,496,550, que muestra la secuencia de ADN de los últimos 196 nucleótidos del clon pEM 250/14. Además, en las Patentes de Estados Unidos Nos. 5,932,225 y 5,496,550, se clonaron y secuenciaron los genes putativos que codifican los antígenos de 56 y 82 kDa.

Posteriormente, Fried et al. secuenciaron el clon pEM 250/14 completo y observaron que el antígeno tenía un peso molécula de 230 kDa en lugar de 250 kDa según se había pensado anteriormente. Fried et al. observaron que el gen de 230 kDa contiene motivos altamente repetitivos y que estas repeticiones están contenidas a lo largo de todo el gen (Fried et al.) Este clon se expresó en bacterias utilizando el vector plásmido pATH y se observó que es reconocido por suero de pollo convalescente extraído 14 días después de la infección con E. maxima. Finalmente, se observó que este gen se expresa únicamente en la etapa de gametocito macroEP y mediante inmunofluorescencia se observó que se localizaba en los cuerpos formadores de paredes del macrogameto (Fried et al.).

También se obtuvieron los clones de ADNc que codificaban los antígenos de 56 y 82 kDa mediante el cribado de la biblioteca con anticuerpos policlonales, así como un anticuerpo monoclonal contra el antígeno de 56 kDa. Se observó previamente que este anticuerpo monoclonal proporcionó una inmunidad pasiva para los pollos intactos (Wallach 1990). Se obtuvieron y analizaron unos cuantos clones. Se observó que uno de los clones codificaba un pequeño antígeno de 10 kDa y, por tanto, no era el clon deseado. Se observó que otro clon contenía sólo una pequeña parte del marco de lectura abierto (ORF) y mediante transferencia Northern se observó que se hibridaba con dos ARNms del tamaño aproximadamente esperado para los antígenos de 56 y 82 kDa. Se concluyó, por tanto, que éste era el clon deseado. A continuación, se cribaron las bibliotecas genómicas para obtener el clon de longitud completa. Sin embargo, debido a los motivos GCA altamente repetititvos en este clon, no fue posible aislar específicamente el clon de longitud completa. Los intentos por clonar la molécula de ADNc de longitud completa tampoco fueron exitosos debido a estas repeticiones. Finalmente, los intentos por expresar los clones de ADNc parcial en bacterias tampoco fueron exitosos probablemente debido a sus secuencias inusuales y no se obtuvo un nivel razonable de la expresión génica. Se ha observado previamente que los antígenos de 56 y 82 kDa están glicosilados (Patente de Estados Unidos No. 5,932,225). Esto se basa en su fuerte reactividad con lectina de soja. Por lo tanto, se puede requerir la glicosilación con el fin de obtener una buena expresión de estos genes y para la conformación correcta de los productos
génicos.

Además de los antígenos de 56, 82 y 230 kDa, se ha propuesto un antígeno de 14 kDa obtenido de fracciones altamente purificadas de paredes de ooquistes como un posible candidato para vacunas contra la coccidiosis (Eschenbacher et al.). Sin embargo, no se ha explorado esta hipótesis.

Diversos laboratorios han estado trabajando en una vacuna subunitaria contra la coccidiosis. La mayoría de estos investigadores han centrado sus esfuerzos en las etapas asexuales extracelulares del ciclo vital, en particular las etapas de esporozoíto y merozoíto, que se considera que son las más vulnerables al ataque inmune. En un estudio previo, se observó que los extractos de esperozoítos de E. tenella podían inducir en pollos tiernos la protección contra infecciones por inoculación contra este parásito de hasta 7 semanas de vida (Karkhanis et al.). El trabajo llevado a cabo utilizando anticuerpos monoclonales contra antígenos de esperozoítos de E. tenella condujeron a la identificación de un antígeno de peso molecular de 25.000 que se clonó y se secuenció (Publicación de Patente Europea No. 0 164 176, 11 Dic. 1985). Se identificaron otros genes de esperozoítos y se analizó la inmunidad protectora de sus antígenos recombinantes o las propias bacterias transformadas (Danforth et al.). Los resultados indicaron que estos recombinantes sólo eran capaces de proporcionar un nivel relativamente bajo de protección contra infección por inoculación con Eimeria y no siempre prevenían la aparición de lesiones significativas.

También se ha analizado una vacuna utilizando antígenos de la etapa de merozoítos (Publicación de Patente Europea No. 0135 073). Utilizando estos antígenos para inmunizar pollos tiernos jóvenes, se observó una vez que la protección proporcionada era relativamente baja (Danforth et al.).

En 1993, se observó que había una correlación entre la inmunidad materna protectora con la aparición de anticuerpos maternos contra un antígeno de merozoíto de 230 kDa (en oposición a gametocitos) de Eimeria maxima (Smith et al.). Esta protección fue a menudo superior al 90% y se observó que aparecía cuando el nivel de anticuerpo materno era relativamente bajo (aunque la reactividad con la proteína de 230 kDa permanecía intensa). También se observó que una cantidad muy pequeña del antígeno de merozoíto de 230 kDa nativo cortado de un gel de SDS-PAGE podía inducir un nivel significativo (60%) de inmunidad materna protectora contra la infección con E. maxima en pollos vástagos. Además, la transferencia Western mostró que esta proteína se expresó tanto en merozoítos y esporozoítos de E. maxima y también se conserva entre especies de Eimeria.

Descripción resumida de la invención

La presente invención proporciona el ácido nucleico que codifica un antígeno de gametocito de Eimeria máxima principal que tiene un peso molecular de 56. La presente solicitud también describe el ácido nucleico que codifica un antígeno de gametocito de Eimeria máxima principal que tiene un peso molecular de 82 kDa. La presente solicitud también describe una proteína de 30 kDa de gametocitos de Eimeria máxima que tiene en el extremo N terminal la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEC ID No. 35.

La presente solicitud también describe una proteína de 30 kDa de gametocitos de Eimeria máxima que tiene en el extremo N terminal la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEC ID No. 42.

La presente solicitud también describe una proteína de 14 kDa de gametocitos de Eimeria máxima que tiene en el extremo N terminal la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEC ID No. 37.

La presente solicitud también describe una proteína de 14 kDa de gametocitos de Eimeria máxima que tiene en el extremo N terminal la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEC ID No. 39.

La presente solicitud también describe a una proteína de 14 kDa de gametocitos de Eimeria máxima que tiene en el extremo N terminal la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEC ID No. 41.

La presente invención también proporciona una vacuna contra la coccidiosis que comprende el antígeno recombinante de 56 kDa solo o en combinación con cualquiera de las proteínas mencionadas anteriormente.

La presente solicitud también describe una vacuna contra la coccidiosis que comprende el antígeno recombinante de 82 kDa solo o en combinación con cualquiera de las proteínas mencionadas anteriormente.

La presente solicitud también describe un uso de cualquiera de los ácidos nucleicos mencionados anteriormente y/o proteínas para la preparación de una vacuna para inmunizar un sujeto contra la infección por Eimeria tenella, Eimeria maxima, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria mitis o Eimeria brunetti.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 representa un gel de SDS PAGE teñido con Coomassie de antígenos de gametocitos nativos purificados por afinidad. Las flechas apuntan a los antígenos de 56 y 82 kDa. Se indican las proteínas marcadoras del peso molecular.

La figura 2 representa un gel SDS PAGE bidimensional (2D) de antígenos de gametocitos nativos purificados por afinidad después de inmunotransferencia y tinción con plata. Se indican las proteínas marcadoras del peso molecular.

La figura 3 representa un filtro de PVDF teñido con Coomassie de un gen SDS PAGE bidimensional y la identificación de las manchas que se cortaron para el análisis de la secuencia. Las flechas apuntan a los antígenos nativos de 56 y 82 kDa.

La figura 4 representa la secuencia de ADN completa del antígeno de gametocito de 56 kDa. Se designan el extremo amino terminal, así como los fragmentos peptídicos trípticos internos. Además, se muestran la metionina iniciadora prevista y el sitio de división por el péptido señal. Se muestran la secuencia codificante, su complemento y las secuencias de aminoácidos (SEC. ID. NOs. 1-3).

La figura 5 representa la secuencia de ADN completa del antígeno de gametocito de 82 kDa. Se designan el extremo amino terminal, así como los fragmentos peptídicos trípticos internos. Además, se muestran la metionina iniciadora prevista y el sitio de división por el péptido señal. Se muestran la secuencia codificante, su complemento y las secuencias de aminoácidos (SEC. ID. NOs. 4-6).

La figura 6 representa una transferencia Southern de ADN de gametocito y ADN de pollo de control sondado con el clon de ADNc para el antígeno de 56 kDa. Se indican las enzimas de restricción utilizadas para la digestión del ADN y los tamaños de las bandas marcadoras en kilobases.

La figura 7 representa una transferencia Southern de gametocito y ADN de pollo de control sondado con el clon de ADNc para el antígeno de 82 kDa. Se indican las enzimas de restricción utilizadas para la digestión del ADN y los tamaños de las bandas marcadoras.

La figura 8 representa una transferencia northern de ARN total de gametocito (G) y de pollo de control (C) sondado con el clon de ADNc de 82 kDa. Los tamaños de las bandas marcadoras en kilobases se indican en la izquierda.

La figura 9 representa una inmunotransferencia que muestra la reactividad del anticuerpo anti-polihistidina y del anti-APGA de pollo con proteínas expresadas por bacterias inducidas o no inducidas (control) por IPTG que contenían el clon de ADNc de 56 kDa en pTrcHisB. Como control negativo adicional, se analizaron las bacterias que se transformaron con el plásmido pTrcHisB que no contenían inserto. Finalmente, se utilizó APGA nativo como control positivo para la transferencia con el antisuero anti APGA. Se indican los tamaños de las bandas marcadoras de proteínas. Las flechas apuntan a las posiciones de las proteínas recombinantes de 41 kDa y nativas de 82 kDa.

La figura 10 representa un gel teñido con Coomassie y la inmunotransferencia de proteínas de bacterias que contienen plásmidos pTrcHisB clonados con ADNc de 82 kDa. La inmunotransferencia muestra la reactividad de la anti polihistidina, anti-APGA de pollo, así como suero de pollo no infectado (control negativo) con la proteína recombinante de 82 kDa en condiciones inducidas y no inducidas por IPTG en varios puntos de tiempo después de la inducción. Como control negativo, el experimento también se realizó utilizando bacterias transformadas con el mismo plásmido sin inserto. Como control positivo, también se desarrolla con APGA nativo. La flecha muestra la posición de la proteína recombinante de 82 kDa. Los tamaños de las bandas marcadoras de proteínas se indican en la izquierda.

La figura 11 representa una inmunotransferencia de un lisado completo de ooquistes de E. maxima no esporulados separados por SDS PAGE bidimensional. El gel se transfirió a un filtro de membrana y se sondó con un antisuero desarrollado contra APGA. La mancha de 30 kDa que reacciona de manera intensa se muestra con una flecha. Ésta era la mancha que se cortó del gel y se utilizó para el análisis de secuencias.

La figura 12 representa la alineación de secuencias de ADN del clon de ADNc de 230 kDa de E. maxima con una secuencia de Adn homóloga de la patente WO 90/00403 que muestra una homología del 60% (SEC. ID. NOs. 26-27).

La figura 13a representa la secuencia de ADN de los primeros 293 nucleótidos del clon pEM 250/14. Se muestran la secuencia codificante y sus secuencias de aminoácidos (SEC. ID. NOs. 28-29). La figura 13b representa la secuencia de ADN de los últimos 196 nucleótidos del clon pEM 250/14. Se muestran la secuencia codificante y sus secuencias de aminoácidos (SEC. ID. NOs. 30-31).

Figuras 14A y B Resultados de ELISA para las pruebas de inmunogenicidad de pollo de la forma recombinante del antígeno de gametocitos de 56 kDa y 82 kDa. Todas las muestras de suero se analizaron a una dilución de 1:1000. A) Antígeno de recubrimiento: APGA para analizar el suero contra APGA; r56 purificado para analizar el suero extraído de pollos inmunizados con PBS, FIA y las dos dosis de r56, B) Antígeno de recubrimiento: APGA para analizar el suero contra APGA; proteína r82 purificada para analizar el suero extraído de pollos inmunizados con PBS, FIA y las dos dosis de r82.

Figura 15. ADN y secuencia de aminoácidos codificada del fragmento de proteína expresada de proteína de la etapa asexual de 250 kDa (SEC. ID NOS. 32-33).

Figura 16. Prueba de inmunogenicidad de ratón del fragmento recombinante de la proteína de la etapa asexual de 250 kDa. Se muestra el promedio de cada grupo para las tres tomas de sangre consecutivas indicando las barras de error estándar. Se analizaron todas las muestras de suero a una dilución de 1:1000. El antígeno de recubrimiento fue de 100 ng de APGA para sueros del grupo APGA de control positivo, o 100 ng de la proteína recombinante para los grupos de PBS y PBS/FIA como control negativo, o 100 ng de la proteína recombinante para los grupos de PBS y PBS/FIA como control negativo y las dos dosis de proteínas recombinantes (r0,5 \mug y r5 \mug).

Figura 17. Prueba de inmunogenicidad de pollo del fragmento recombinante de la proteína de la etapa asexual de 250 kDa. Se muestra el promedio de cada grupo para las tres tomas de sangre consecutivas indicando las barras de error estándar. Se analizaron todas las muestras de suero a una dilución de 1:1000. El antígeno de recubrimiento fue de 100 ng de APGA para sueros del grupo APGA de control positivo, o 100 ng de la proteína recombinante para los grupos de PBS y PBS/FIA como control negativo, o 100 ng de la proteína recombinante para los grupos de PBS y PBS/FIA como control negativo y las dos dosis de proteínas recombinantes (r1 \mug y r10 \mug)

Figura 18. Reconocimiento anti-r56 de antígenos de gametocito y paredes en Eimeria maxima.

Figura 19 Reconocimiento anti-r82 de antígenos de gametocito y paredes en Eimeria maxima.

Figura 20. Alineación de la secuencia N-terminal de las proteínas de la pared del ooquiste con los antígenos de los gametocitos de 56 kDa y 82 kDa (SEC. ID NOS. 34-42).

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Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencias de nucleótidos que codifica un polipéptido de 56 kDa de Gametocitos de Eimeria maxima, o que codifica un homólogo del polipéptido, o un complemento del ácido nucleico.

En una realización, el polipéptido tiene la secuencias de aminoácidos mostrada en la figura 4 (SEC. ID. NO. 3).

En otra realización, el homólogo del péptido tiene por lo menos un 50% de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como SEC. ID. NO. 3.

En una realización adicional, el homólogo del péptido tiene por lo menos un 60% de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como SEC. ID. NO. 3.

En una realización adicional, el homólogo del péptido tiene por lo menos un 70% de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como SEC. ID. NO. 3.

En una realización adicional, el homólogo del péptido tiene por lo menos un 75% de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como SEC. ID. NO. 3.

En otra realización, el homólogo del péptido tiene por lo menos un 85% de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como SEC. ID. NO. 3.

En una realización adicional, el homólogo del péptido tiene por lo menos un 85% de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como SEC. ID. NO. 3.

En una realización, el homólogo del péptido tiene por lo menos un 90% de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como SEC. ID. NO. 3.

En otra realización, el homólogo del péptido tiene por lo menos un 93% de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como SEC. ID. NO. 3.

En una realización adicional, el homólogo del péptido tiene por lo menos un 95% de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como SEC. ID. NO. 3.

En una realización adicional, el homólogo del péptido tiene por lo menos un 97% de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como SEC. ID. NO. 3.

En otra realización, el homólogo del péptido tiene por lo menos un 99% de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como SEC. ID. NO. 3.

En una realización adicional, la secuencia de nucleótidos tiene por lo menos un 50% de identidad con la secuencia de nucleótidos que empieza en el nucleótido No. 103 y acaba en el nucleótido No. 1529 mostrada en la figura 4 (SEC. ID. NO. 1.)

En otra realización, la secuencia de nucleótidos tiene por lo menos un 60% de identidad con la secuencia de nucleótidos que empieza en el nucleótido No. 103 y acaba en el nucleótido No. 1529 mostrada como SEC. ID. NO. 1.

En una realización adicional, la secuencia de nucleótidos tiene por lo menos un 70% de identidad con la secuencia de nucleótidos que empieza en el nucleótido No. 103 y acaba en el nucleótido No. 1529 mostrada como SEC. ID.
NO. 1.

En una realización, la secuencia de nucleótidos tiene por lo menos un 75% de identidad con la secuencia de nucleótidos que empieza en el nucleótido No. 103 y acaba en el nucleótido No. 1529 mostrada como SEC. ID. NO. 1.

En otra realización, la secuencia de nucleótidos tiene por lo menos un 85% de identidad con la secuencia de nucleótidos que empieza en el nucleótido No. 103 y acaba en el nucleótido No. 1529 mostrada como SEC. ID.
NO. 1.

En una realización adicional, la secuencia de nucleótidos tiene por lo menos un 85% de identidad con la secuencia de nucleótidos que empieza en el nucleótido No. 103 y acaba en el nucleótido No. 1529 mostrada como SEC. ID.
NO. 1.

En una realización, la secuencia de nucleótidos tiene por lo menos un 90% de identidad con la secuencia de nucleótidos que empieza en el nucleótido No. 103 y acaba en el nucleótido No. 1529 mostrada como SEC. ID. NO. 1.

En una realización adicional, la secuencia de nucleótidos tiene por lo menos un 93% de identidad con la secuencia de nucleótidos que empieza en el nucleótido No. 103 y acaba en el nucleótido No. 1529 mostrada como SEC. ID.
NO. 1.

En otra realización, la secuencia de nucleótidos tiene por lo menos un 95% de identidad con la secuencia de nucleótidos que empieza en el nucleótido No. 103 y acaba en el nucleótido No. 1529 mostrada como SEC. ID. NO. 1.

En una realización adicional, la secuencia de nucleótidos tiene por lo menos un 97% de identidad con la secuencia de nucleótidos que empieza en el nucleótido No. 103 y acaba en el nucleótido No. 1529 mostrada como SEC. ID.
NO. 1.

En una realización, la secuencia de nucleótidos tiene por lo menos un 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos que empieza en el nucleótido No. 103 y acaba en el nucleótido No. 1529 mostrada como SEC. ID. NO. 1.

En una realización adicional, el ácido nucleico es una molécula de ADN.

En otra realización, la molécula de ADN es una molécula de ADNc.

En una realización adicional, el ácido nucleico tiene la secuencia de nucleótidos que empieza en el nucleótido No. 103 y acaba en el nucleótido No. 1529 mostrada en la figura 4 (SEC. ID. NO. 1).

En otra realización, el ácido nucleico es una molécula ARN.

En una realización, el ácido nucleico está unido operativamente a un promotor de la transcripción de ARN.

La presente invención también proporciona un vector que comprende un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de 56 kDa de Gametocitos de Eimeria maxima, o que codifica un homólogo del polipéptido, o un complemento del ácido nucleico.

En una realización, el vector comprende el ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos que empieza en el nucleótido No. 103 y acaba en el nucleótido No. 1529 mostrada en la figura 4 (SEC. ID. NO. 1).

En otra realización, el vector es un plásmido.

En una realización adicional, el plásmido comprende el ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos que empieza en el nucleótido No. 103 y acaba en el nucleótido No. 1529 mostrada en la figura 4 (SEC. ID. NO. 1).

En una realización adicional, el plásmido comprende un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de 56 kDa de Gametocitos de Eimeria maxima, o que codifica un homólogo del polipéptido, o un complemento del ácido nucleico.

En otra realización, el plásmido es el plásmido designado como plásmido 56TRCHisbl (Laboratorios Analíticos del Gobierno de Australia Número de acceso NM01/22400).

La presente invención también proporciona una célula huésped que comprende un vector que comprende un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de 56 kDa de Gametocitos de Eimeria maxima, o que codifica un homólogo del polipéptido, o un complemento del ácido nucleico.

En una realización, la célula huésped comprende un vector que comprende un ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos que empieza en el nucleótido No. 103 y acaba en el nucleótido No. 1529 mostrada en la figura 4 (SEC. ID. NO. 1).

En otra realización, la célula huésped se selecciona del grupo que consiste en una célula bacteriana; una célula vegetal; una célula de insecto; y una célula de mamífero.

La presente invención proporciona adicionalmente una célula transformada que comprende un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de 56 kDa de Gametocitos de Eimeria maxima, o que codifica un homólogo del polipéptido, o un complemento del ácido nucleico.

En una realización, la célula transformada es la célula transformada designada como clon 56TRCHisbl en bacterias (Laboratorios Analíticos del Gobierno de Australia Número de acceso NM01/22401).

Se depositó un plásmido que codifica el antígeno de 56 kDa con la Laboratorios Analíticos del Gobierno de Australia, Pymble, Australia, el 26 de junio de 2001, bajo el número de acceso. NM01/22400. La célula bacteriana transformada con el antígeno de 56 kDa se depositó con el Laboratorios Analíticos del Gobierno de Australia, Pymble, Australia, el 26 de junio del 2001, bajo el Número de acceso NM01/22401. Ambos depósitos se realizaron según el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los Fines del Procedimiento en Materia de Patentes.

En una realización adicional, la célula transformada comprende además un polipéptido de 56 kDa de Gametocitos de Eimeria maxima, o un homólogo del polipéptido.

La presente invención proporciona además un método de producción de un polipéptido recombinante de 56 kDa de Gametocitos de Eimeria maxima que comprende cultivar una célula transformada que comprende un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de 56 kDa de Gametocitos de Eimeria maxima, o que codifica un homólogo del polipéptido, o un complemento del ácido nucleico y aislar el polipéptido recombinante de 56 kDa de Gametocitos de Eimeria maxima. El polipéptido recombinante producido mediante este método también está comprendido por la presente invención.

La presente invención también proporciona una vacuna contra Eimeria tenella, Eimeria maxima, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix o Eimeria brunetti, Eimeria praecox, Eimeria mitis, que comprende el ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de 56 kDa de Gametocitos de Eimeria maxima, o que codifica un homólogo del polipéptido, o un complemento del ácido nucleico.

En una realización de la vacuna, el ácido nucleico es un plásmido.

Además, la presente solicitud describe una vacuna contra Eimeria tenella, Eimeria maxima, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix o Eimeria brunetti, Eimeria praecox, Eimeria mitis, que comprende un polipéptido recombinante de 56 kDa de Gametocitos de Eimeria maxima producido mediante el cultivo de una célula transformada que comprende un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de 56 kDa de Gametocitos de Eimeria maxima, o que codifica un homólogo del polipéptido, o un complemento del ácido nucleico y el aislamiento del polipéptido recombinante de 56 kDa de Gametocitos de Eimeria maxima.

En otra realización, la vacuna está comprendida de una mezcla del ácido nucleico aislado de la presente invención y el polipéptido recombinante de la presente invención.

En otra realización, la vacuna está comprendida de una mezcla del ácido nucleico aislado de la presente invención, el polipéptido recombinante de la presente invención y un plásmido que comprende el ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de 56 kDa de Gametocitos de Eimeria maxima.

En una realización adicional, la vacuna comprende además un segundo antígeno.

En una realización, el segundo antígeno se selecciona del grupo que consiste en un ácido nucleico que codifica para un antígeno de Eimeria maxima, un plásmido que comprende dicho ácido nucleico, y un polipéptido codificado por dicho ácido nucleico.

En otra realización, el segundo antígeno se selecciona del grupo que consiste en una proteína de 30 kDa de gametocitos de Eimeria maxima que tienen en el extremo N-terminal la secuencia de aminoácidos SEC. ID NO. 35, o SEC. ID NO. 42 o una proteína de 14 kDa de gametocitos de Eimeria maxima que tienen en el extremo N-terminal la secuencia de aminoácidos SEC. ID NO. 37, SEC. ID NO. 39 o SEC. ID NO. 41.

En otra realización, el segundo antígeno es un ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC. ID. No. 4, un plásmido que comprende el ácido nucleico o un polipéptido codificado por el ácido nucleico.

En una realización adicional, la vacuna comprende además un tercer antígeno.

La presente invención también proporciona una vacuna en la que el tercer antígeno es un antígeno de esporozoíto/merozoíto de 230 kDa de E. maxima.

El antígeno de 230 kDa se aisló de los esporozoítos purificados de E. maxima que están presentes en ooquistes esporulados (veer el ciclo vital anterior). El procedimiento de aislamiento implicaba la extracción de proteínas de los ooquistes esporulados y la separación de las proteínas extraídas en una columna de intercambio aniónico DEAE-sephacel. A continuación, las fracciones de los máximos se pasaron por SDS-PAGE y transferencia Western para identificar el antígeno de 230 kDa. Además, los antisueros maternos protectores tanto de gallinas vacunadas como de pollitos vástagos se utilizaron para confirmar la identidad del antígeno purificado. Finalmente, se aisló la proteína de 230 kDa del filtro de membrana de PVDF para llevar a cabo la secuenciación y clonación de la
proteína.

Se secuenciaron los productos del digesto del péptido amino terminal y tríptico del antígeno de 230 kDa. Las secuencias del digesto tríptico se utilizaron para diseñar cebadores de oligonucleótidos de PCR degenerados. Los cebadores se utilizaron en PCR RACE (amplificación rápida de los extremos del ADNc) para amplificar productos génicos parciales. A partir de las secuencias de estos productos, se diseñaron cebadores específicos de los genes y se utilizaron en PCR RACE para definir los extremos 3' y 5' del ARNm. A continuación, se amplificó mediante PCR utilizando cebadores específicos de los genes diseñados para los extremos 5' y 3' un clon de ADNc de longitud completa de 7 kilobases que codificaba el antígeno. Este clon se secuenció totalmente y se observó que contenía la secuencia de ADN correcta en su extremo 5' cuando se comparó con la secuencia de aminoácidos del extremo N-terminal de la proteína nativa. De este modo, esta secuencia de ácido nucleico codificaba el antígeno de esporozoíto/merozoíto protector de 230 kDa y se podría utilizar ahora para producir antígeno recombinante para la vacunación de pollos contra la coccidiosis.

Se depositó un plásmido que codificaba el antígeno de 230 kDa con los Laboratorios Analíticos del Gobierno de Australia, Pymble, Australia, el 26 de junio del 2001, bajo el Número de acceso NM01/22396. La célula bacteriana transformada con el antígeno de 230 kDa se depositó con los Laboratorios Analíticos del Gobierno de Australia, Pymble, Australia, el 26 de junio del 2001, bajo el Número de acceso NM01/22397. Ambos depósitos se realizaron según el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los Fines del Procedimiento en Materia de Patentes.

Previamente se pensaba que el antígeno de los esporozoítos/merozoítos de E. maxima era un antígeno de 230 kDa. Sin embargo, nuestros estudios posteriores han revelado que el antígeno en realidad es un antígeno de 250 kDa de los esporozoítos/merozoítos de E. maxima.

En una realización adicional, el tercer antígeno es un ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 12 (SEC. ID. NO. 26), un plásmido que comprende el ácido nucleico, o un polipéptido codificado por el ácido nucleico.

En otra realización, la vacuna comprende además un cuarto antígeno.

En una realización, el cuarto antígeno es un polipéptido de Gametocitos de Eimeria maxima que tiene un peso molecular de 230 kDa a 270 kDa, una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido, o un plásmido que comprende la secuencia de nucleótidos.

En una realización adicional, el antígeno comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 13a (SEC. ID. NO. 29) en su extremo 5' o la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 13b (SEC. ID. NO. 31) en su extremo 3'.

La presente invención también proporciona el uso de una vacuna de la presente solicitud para inmunizar un sujeto contra la infección por Eimeria tenella, Eimeria maxima, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria mitis o Eimeria brunetti.

En una realización, el sujeto es una especie seleccionada del grupo que consiste en ganado, ovejas, cerdos y peces.

En otra realización, el sujeto es una especie aviar.

En una realización adicional, la especie aviar se selecciona del grupo que consiste en pollos, pavos, gansos, patos, gallos bántam, codornices y palomas.

En una realización adicional, la especie aviar es un pollo.

En una realización, la etapa de administración comprende pulverizar la vacuna en las fosas nasales del sujeto.

En una realización adicional, la administración comprende inyección intravenosa, intramuscular o intraperitoneal.

En otra realización, la administración se realiza in ovo.

En una realización adicional, la administración es en la bolsa de aire de un huevo, poniendo en contacto de este modo un embrión con la vacuna.

La presente invención también proporciona un huevo fecundado de una especie aviar que tiene una bolsa de aire que es inoculada con la vacuna de la presente invención, cuya vacuna es capaz de inducir antes o inmediatamente después de la incubación una respuesta inmune en el embrión contra una forma virulenta de Eimeria tenella, Eimeria maxima, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria mitis o Eimeria brunetti.

En una realización, la especie aviar se selecciona del grupo que consiste en pollos, patos, pavos, gansos, gallos bantam, codornices y palomas.

En otra realización, la especie aviar es un pollo.

La presente solicitud describe adicionalmente un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de 82 kDa de Gametocitos de Eimeria maxima, o que codifica un homólogo del polipéptido, o un complemento del ácido nucleico.

En una realización, el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 5 (SEC. ID. NO. 6).

En otra realización, el homólogo del péptido tiene por lo menos un 50% de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como SEC. ID. NO. 6.

En una realización adicional, el homólogo del péptido tiene por lo menos un 60% de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como SEC. ID. NO. 6.

En una realización adicional, el homólogo del péptido tiene por lo menos un 70% de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como SEC. ID. NO. 6.

En otra realización, el homólogo del péptido tiene por lo menos un 75% de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como SEC. ID. NO. 6.

En otra realización, el homólogo del péptido tiene por lo menos un 85% de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como SEC. ID. NO. 6.

En una realización adicional, el homólogo del péptido tiene por lo menos un 85% de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como SEC. ID. NO. 6.

En una realización, el homólogo del péptido tiene por lo menos un 90% de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como SEC. ID. NO. 6.

En una realización adicional, el homólogo del péptido tiene por lo menos un 93% de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como SEC. ID. NO. 6.

En otra realización, el homólogo del péptido tiene por lo menos un 95% de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como SEC. ID. NO. 6.

En una realización, el homólogo del péptido tiene por lo menos un 97% de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como SEC. ID. NO. 6.

En una realización adicional, el homólogo del péptido tiene por lo menos un 99% de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como SEC. ID. NO. 6.

En una realización adicional, la secuencia de nucleótidos tiene más de un 50% de identidad con la secuencia de nucleótidos que empieza en el nucleótido No. 100 y acaba en el nucleótido No. 1886 mostrada en la figura 5 (SEC. ID. NO. 4).

En otra realización, la secuencia de nucleótidos tiene más de un 60% de identidad con la secuencia de nucleótidos que empieza en el nucleótido No. 100 y acaba en el nucleótido No. 1886 mostrada en la SEC. ID. NO. 4.

En una realización adicional, la secuencia de nucleótidos tiene por lo menos un 70% de identidad con la secuencia de nucleótidos que empieza en el nucleótido No. 100 y acaba en el nucleótido No. 1886 mostrada como SEC. ID.
NO. 4.

En una realización adicional, la secuencia de nucleótidos tiene por lo menos un 75% de identidad con la secuencia de nucleótidos que empieza en el nucleótido No. 100 y acaba en el nucleótido No. 1886 mostrada como SEC. ID.
NO. 4.

En otra realización, la secuencia de nucleótidos tiene por lo menos un 85% de identidad con la secuencia de nucleótidos que empieza en el nucleótido No. 100 y acaba en el nucleótido No. 1886 mostrada como SEC. ID.
NO. 4.

En una realización, la secuencia de nucleótidos tiene por lo menos un 90% de identidad con la secuencia de nucleótidos que empieza en el nucleótido No. 100 y acaba en el nucleótido No. 1886 mostrada como SEC. ID. NO. 4.

En una realización adicional, la secuencia de nucleótidos tiene por lo menos un 93% de identidad con la secuencia de nucleótidos que empieza en el nucleótido No. 100 y acaba en el nucleótido No. 1886 mostrada como SEC. ID.
NO. 4.

En otra realización, la secuencia de nucleótidos tiene por lo menos un 95% de identidad con la secuencia de nucleótidos que empieza en el nucleótido No. 100 y acaba en el nucleótido No. 1886 mostrada como SEC. ID. NO. 4.

En una realización adicional, la secuencia de nucleótidos tiene por lo menos un 97% de identidad con la secuencia de nucleótidos que empieza en el nucleótido No. 100 y acaba en el nucleótido No. 1886 mostrada como SEC. ID.
NO. 4.

En una realización, la secuencia de nucleótidos tiene por lo menos un 99% de identidad con la secuencia de nucleótidos que empieza en el nucleótido No. 100 y acaba en el nucleótido No. 1886 mostrada como SEC. ID. NO. 4.

En una realización adicional, el ácido nucleico es una molécula de ADN.

En otra realización, la molécula de ADN es una molécula de ADNc.

En una realización adicional, el ácido nucleico tiene la secuencia de nucleótidos que empieza en el nucleótido No. 100 y acaba en el nucleótido No. 1886 mostrada como SEC. ID. NO. 4.

En otra realización, el ácido nucleico es una molécula ARN.

La presente invención también incluye un vector que comprende un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de 82 kDa de Gametocitos de Eimeria maxima, o que codifica un homólogo del polipéptido, o un complemento del ácido nucleico.

En una realización, el vector comprende el ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos que empieza en el nucleótido No. 100 y acaba en el nucleótido No. 1886 mostrada en la figura 5 (SEC. ID. NO. 4).

En otra realización, el vector es un plásmido.

En una realización adicional, el plásmido comprende el ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos que empieza en el nucleótido No. 100 y acaba en el nucleótido No. 1886 mostrada en la figura 5 (SEC. ID. NO. 4).

En una realización adicional, el plásmido comprende un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de 82 kDa de Gametocitos de Eimeria maxima, o que codifica un homólogo del polipéptido, o un complemento del ácido nucleico.

En otra realización, el plásmido es el plásmido designado como plásmido 82TRCHisb8 (Laboratorios Analíticos del Gobierno de Australia Número de acceso NM01/22398).

La presente solicitud también describe una célula huésped que comprende un vector que comprende un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de 82 kDa de Gametocitos de Eimeria maxima, o que codifica un homólogo del polipéptido, o un complemento del ácido nucleico.

En una realización, la célula huésped comprende un vector que comprende un ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos que empieza en el nucleótido No. 100 y acaba en el nucleótido No. 1886 mostrada en la figura 5 (SEC. ID. NO. 4).

La presente solicitud describe adicionalmente una célula transformada que comprende un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de 82 kDa de Gametocitos de Eimeria maxima, o que codifica un homólogo del polipéptido, o un complemento del ácido nucleico.

En una realización, la célula transformada es la célula transformada designada como el clon 82TRCHisb8 en bacterias (Laboratorios Analíticos del Gobierno de Australia Número de acceso NM01/22399).

Se depositó un plásmido que codifica un antígeno de 82 kDa con los Laboratorios Analíticos del Gobierno de Australia, Pymble, Australia, el 26 de junio del 2001, bajo el Número de acceso NM01/22398. La célula bacteriana transformada con el antígeno de 82 kDa se depositó con los Laboratorios Analíticos del Gobierno de Australia, Pymble, Australia, el 26 de junio del 2001, bajo el Número de acceso NM01/22399. Ambos depósitos se realizaron según el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los Fines del Procedimiento en Materia de Patentes.

En una realización adicional, la célula transformada comprende además un polipéptido de 82 kDa de Gametocitos de Eimeria maxima, o un homólogo del polipéptido.

La presente invención contiene además un método de producción de un polipéptido recombinante de 82 kDa de Gametocitos de Eimeria maxima que comprende cultivar una célula transformada que comprende un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de 82 kDa de Gametocitos de Eimeria maxima, o que codifica un homólogo del polipéptido, o un complemento del ácido nucleico y aislar el polipéptido recombinante de 82 kDa de Gametocitos de Eimeria maxima. El polipéptido recombinante producido mediante este método también está comprendido por la presente invención.

La presente solicitud también describe una vacuna contra Eimeria tenella, Eimeria maxima, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria mitis o Eimeria brunetti, que comprende el ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de 82 kDa de Gametocitos de Eimeria maxima, o que codifica un homólogo del polipéptido, o un complemento del ácido nucleico.

En una realización de la vacuna, el ácido nucleico es un plásmido.

Además, la presente solicitud describe una vacuna contra Eimeria tenella, Eimeria maxima, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria mitis o Eimeria brunetti, que comprende un polipéptido recombinante de 82 kDa de Gametocitos de Eimeria maxima producido mediante el cultivo de una célula transformada que comprende un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de 82 kDa de Gametocitos de Eimeria maxima, o que codifica un homólogo del polipéptido, o un complemento del ácido nucleico y el aislamiento del polipéptido recombinante de 82 kDa de Gametocitos de Eimeria maxima.

En otra realización, la vacuna está comprendida de una mezcla del ácido nucleico aislado de la presente invención, el polipéptido recombinante de la presente invención y un plásmido que comprende el ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de 82 kDa de Gametocitos de Eimeria maxima.

En otra realización, el segundo antígeno se selecciona del grupo que consiste en una proteína de 30 kDa de gametocitos de Eimeria maxima que tiene en el extremo N-terminal la secuencia de aminoácidos SEC. ID NO. 35, o la SEC. ID NO. 42 o una proteína de 14 kDa de gametocitos de Eimeria maxima que tiene en el extremo N-terminal la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC. ID NO. 37, SEC. ID NO. 39 o SEC. ID NO. 41.

La presente solicitud también describe un método de inmunización de un sujeto contra una infección por Eimeria tenella, Eimeria maxima, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria mitis o Eimeria brunetti, que comprende la etapa de administrar al sujeto la vacuna de la presente invención.

En otra realización, el sujeto es una especie aviar.

En una realización adicional, la especie aviar es un pollo.

En otra realización, la administración se realiza in ovo.

La presente solicitud también describe un huevo fecundado de una especie aviar que tiene una bolsa de aire que es inoculada con la vacuna de la presente invención, cuya vacuna es capaz de inducir antes o inmediatamente después de la incubación una respuesta inmune en el embrión contra una forma virulenta de Eimeria tenella, Eimeria maxima, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria mitis o Eimeria brunetti.

En una realización, la especie aviar se selecciona del grupo que consiste en pollos, patos, pavos, gansos, gallos bántam, codornices y palomas.

En otra realización, la especie aviar es un pollo.

La presente solicitud también describe un polipéptido recombinante, donde la secuencia de aminoácidos se muestra como SEC. ID NO. 3.

La presente solicitud también describe un polipéptido recombinante, donde la secuencia de aminoácidos se muestra como SEC. ID NO. 6.

La presente solicitud también describe una proteína de 30 kDa de gametocitos de Eimeria maxima que tiene en el extremo N terminal la secuencia de aminoácidos SEC. ID NO. 35

La presente solicitud también describe una proteína de 30 kDa de gametocitos de Eimeria maxima que tiene en el extremo N terminal la secuencia de aminoácidos SEC. ID NO. 42.

La presente solicitud también describe una proteína de 14 kDa de gametocitos de Eimeria maxima que tiene en el extremo N terminal la secuencia de aminoácidos SEC. ID NO. 37.

La presente solicitud también describe una proteína de 14 kDa de gametocitos de Eimeria maxima que tiene en el extremo N terminal la secuencia de aminoácidos SEC. ID NO. 39.

La presente solicitud también describe una proteína de 14 kDa de gametocitos de Eimeria maxima que tiene en el extremo N terminal la secuencia de aminoácidos SEC. ID NO. 41.

Las proteínas mencionadas anteriormente y su correspondiente secuencia de nucleótidos se pueden utilizar de la misma manera descrita anteriormente para las proteínas de 56 kDa y 82 kDa, incluyendo la utilización para inmunizar un sujeto, e incorporar un plásmido que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína en una célula huésped.

La presente solicitud también describe un método para conferir a un sujeto recién nacido de una especie aviar inmunidad materna (anticuerpos) contra la infección por Eimeria tenella, Eimeria maxima, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria mitis o Eimeria brunetti, o un microorganismo que expresa un antígeno que reacciona inmunológicamente de forma cruzada, que comprende la etapa de administrar a la madre del sujeto en un tiempo adecuado anterior a la puesta de un huevo fecundado la vacuna de la presente invención con el fin de conferir así protección a través de la inmunidad materna contra la infección por Eimeria tenella, Eimeria maxima, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria mitis o Eimeria brunetti, en el sujeto recién nacido.

La presente solicitud también describe un método de reducción de la producción de ooquistes de Eimeria en heces de un sujeto recién nacido de una especie aviar que comprende la etapa de administrar a la madre del sujeto en un tiempo adecuado anterior a la puesta de un huevo fecundado la vacuna de la presente invención con el fin de inducir una respuesta inmune y transmitir anticuerpos maternas al recién nacido, de manera que se reduce el rendimiento de ooquistes del recién nacido.

La presente solicitud también describe un método de inmunización de un sujeto contra la infección por Eimeria tenella, Eimeria maxima, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria mitis o Eimeria brunetti, que comprende la etapa de administrar al sujeto una vacuna viva que comprende un microorganismo vivo no virulento o virus vivo que expresan un polipéptido de 56 kDa o 82 kDa de los gametocitos de Eimeria maxima.

En una realización, el virus vivo es el poxvirus.

En una realización, el sujeto es una especie seleccionada del grupo que consiste en ganado, ovejas, credos y peces.

En otra realización, el sujeto es una especie aviar.

La presente solicitud también describe un método de inmunización de un sujeto contra la infección por Eimeria tenella, Eimeria maxima, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria mitis o Eimeria brunetti, que comprende la etapa de alimentar al sujeto con una planta, cuyas células expresan un polipéptido de 56 kDa o 82 kDa de los gametocitos de Eimeria maxima.

En una realización, la planta es trigo.

En otra realización, la planta es maíz.

En otra realización, el sujeto es una especie aviar.

La presente solicitud también describe un método de inmunización de un sujeto contra la infección por Eimeria tenella, Eimeria maxima, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria mitis o Eimeria brunetti, que comprende la etapa de administrar al sujeto un plásmido que comprende un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de 56 kDa o 82 kDa de los gametocitos de Eimeria maxima, o que codifica un homólogo del polipéptido, o un complemento del ácido nucleico.

En otra realización, el sujeto es una especie aviar.

Un homólogo del ácido nucleico de la presente invención es un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene sustancialmente la misma actividad biológica que el polipéptido codificado por el ácido nucleico. El término "homología", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a un grado de complementariedad. Puede haber una homología (es decir, identidad) parcial u homología completa. Una secuencia parcialmente complementaria es aquella que inhibe por lo menos parcialmente la hibridación de una secuencia idéntica con un ácido nucleico diana; se refiere a la utilización del término funcional "sustancialmente homólogo". La inhibición de la hibridación de la secuencia completamente complementaria con la secuencia diana se puede examinar utilizando un ensayo de hibridación (transferencia Southern o Northern, hibridación en solución y similares) bajo condiciones de baja astringencia. Una secuencia o sonda sustancialmente homogénea competirán e inhibirán la unión (es decir, la hibridación) de una secuencia o sonda completamente homóloga a la secuencia diana bajo condiciones de baja astringencia. Eso no significa que las condiciones de baja astringencia son aquellas en las que se permite la unión no específica; las condiciones de baja astringencia requieren que la unión de dos secuencias a otra se una interacción específica (es decir, selectiva). La ausencia de unión no específica se puede analizar mediante el uso de una segunda secuencia diana que carece incluso de cierto grado de complementariedad (por ejemplo, menos de aproximadamente un 30% de identidad); en ausencia de unión no específica, la sonda no se hibridará a la segunda secuencia diana no comple-
mentaria.

Tal como se conoce en la técnica, se pueden utilizar numerosas condiciones equivalentes para comprender condiciones de baja o alta astringencia. Se consideran factores tales como la longitud y la naturaleza (Adn, ARN, composición de bases) de la secuencia, naturaleza de la diana (ADN, ARN, composición de bases, presencia en solución o inmovilización, etc.) y la concentración de las sales y otros componentes (por ejemplo, la presencia o ausencia de formamida, sulfato de dextrano y/o polietilenglicol) y la solución de hibridación puede variar para generar condiciones de baja o alta astrignencia diferentes, pero equivalentes, as las condiciones indicadas anteriormente.

Un objetivo de la presente invención es proporcionar la secuencia de nucleótidos que codifica el antígeno de 56 kDa de Gametocitos de Eimeria maxima y la secuencia de aminoácidos deducida para la misma. También es un objetivo de la presente solicitud dar a conocer la secuencia de nucleótidos que codifica el antígeno de 82 kDa de Gametocitos de Eimeria maxima y la secuencia de aminoácidos deducida para la misma. Las secuencias codificantes específicas como ejemplos se indican en las figuras 4 y 5, junto con la secuencia de aminoácidos deducida. Todas las secuencias codificantes sinónimas para las secuencias de aminoácidos de ejemplo se encuentra dentro del alcance de la presente invención.

Un objetivo adicional de la presente invención es proporciona secuencias codificantes y de proteínas funcionalmente equivalentes, incluyendo secuencias equivalentes de otras especies de Eimeria. Las secuencias codificantes funcionalmente equivalentes de antígenos de 56 y 82 kDa de Gametocitos de Eimeria maxima son deseablemente de desde aproximadamente un 50% a aproximadamente un 80% de homología (identidad) en la secuencia de nucleótidos con la secuencia codificante específicamente identificada, desde aproximadamente un 80% hasta aproximadamente un 95%, y deseablemente desde aproximadamente un 95% hasta aproximadamente un 100% idéntica en la secuencia codificante con la secuencia codificante específica de ejemplo.

Las condiciones de hibridación de astringencia concreta proporcionan la identificación de homólogos de la secuencia codificante de otras especies y la identificación de secuencias variantes, donde dichas secuencias homólogas y/o variantes tienen por lo menos (inclusive) de un 50 a un 95%, de un 85% a un 100% de identidad en la secuencia de nucleótidos, de un 90 a un 100%, o de un 95 a un 100% de identidad en la secuencia de nucleótidos. Cada valor y cada subgrupo de cada intervalo especificado pretenden estar en el contexto de la presente invención.

La secuencia codificante y métodos de la presente invención incluyen las secuencias codificantes homólogas en especies diferentes de Eimeria maxima. Se pueden utilizar métodos para aislar las correspondientes secuencias codificantes (por ejemplo, de ADNc) de otros organismos, incluyendo, pero sin limitación, otras especies, tales como Eimeria tenella, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria mitis y Eimeria brunetti útiles en los métodos de la presente invención utilizando las secuencias descritas aquí y técnicas experimentales conocidas en el sector.

Se incluyen específicamente en la presente invención secuencias de otras especies diferentes de las ejemplificadas aquí, las cuales se hibridan a las secuencias descritas bajo condiciones astringentes. Las condiciones astringentes se refieren a las condiciones entendidas en la técnica para una longitud de sonda y composición de nucleótidos concretas y capaces de hibridarse en condiciones astringentes significa la hibridación a una secuencia de nucleótidos objetivo, o su cadena complementaria, bajo condiciones estándar (es decir, temperatura elevada y/o contenido de sal bajo) que tienden a desfavorecer la hibridación de las secuencias no relacionadas.

"Condiciones de alta astringencia" significa condiciones de hibridación y lavado de 65º-68ºC, 0,1 x SSC y SDS al 0,1% (indicando aproximadamente un 95-100% de identidad/similitud en la secuencia de nucleótidos). Los ensayos y condiciones de hibridación se describen además en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, N.Y. Tal como se utiliza en la presente invención, las condiciones de moderada (media) astringencia son aquellas con unas condiciones de hibridación y lavado de 50-65ºC., 1 x SSC y SDS al 0,1% (donde un resultado de hibridación positiva refleja una identidad de aproximadamente el 80-95% de la secuencia de nucleótidos. Las condiciones de baja astringencia son habitualmente aquellas con unas condiciones de hibridación y lavado de 40-50ºC, 6 x.SSC y SDS al 0,1% (que reflejan una identidad de aproximadamente el 50-80% de secuencia de nucleótidos).

Un homólogo del polipéptido de la presente invención es un polipéptido que tiene sustancialmente la misma secuencias de aminoácidos y actividad biológica que el polipéptido. De este modo, un homólogo puede diferir del polipéptido de la presente invención por la adición, deleción o sustitución de uno o más residuos de aminoácidos no esenciales, siempre que el polipéptido resultante mantenga la actividad biológica del polipéptido. Las personas expertas en la materia pueden determinar fácilmente qué residuos de aminoácidos se pueden añadir, eliminar o sustituir (incluyendo con qué aminoácidos se pueden realizar dichas sustituciones) utilizando procedimientos establecidos y conocidos, incluyendo, por ejemplo, métodos convencionales para el diseño y fabricación de secuencias de ADN que codifican la expresión bacteriana de homólogos de polipéptidos del polipéptido objetivo, la modificación de las secuencias de ADNc y secuencias genómicas mediante técnicas de mutagénesis dirigida de sitio, la construcción de polipéptidos recombinantes y vectores de expresión, la expresión bacteriana de los polipéptidos, y la medición de la actividad bioquímica de los polipéptidos mediante ensayos bioquímicos convencionales.

Ejemplos de homólogos son homólogos por deleción que contienen menos de todos los residuos especificados en el polipéptido objetivo, homólogos por sustitución donde uno o más residuos especificados son sustituidos por otros residuos, y homólogos por adición, donde uno o más residuos de aminoácidos se añaden al polipéptido. Todos estos homólogos comparten la actividad biológica del polipéptido de la invención.

"Sustancialmente el mismo polipéptido" se define aquí como que comprende la deleción, adición o sustitución de menos de cuatro aminoácidos en los extremos N-terminales de la secuencia de aminoácidos del polipéptido. Además, pueden haber deleciones, adiciones o sustituciones en la secuencia que no eliminan la actividad biológica del polipéptido. Dichas modificaciones son conocidas por el experto en la materia. Por ejemplo, las sustituciones pueden comprende hasta 10 residuos de acuerdo con los grupos homólogos o equivalentes descritos por, por ejemplo, Lehninger, Biochemistry, 2nd ed. Worth Pub., New York. (1975); Creighton, Protein Structure, a Practical Approach, IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, England (1989); y Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure 1972, National Biomedical Research Foundation, Maryland (1972).

El término "biológicamente activo", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a un polipéptido que tiene funciones estructurales, reguladoras o bioquímicas de una molécula natural. Así mismo, "inmunológicamente activo" se refiere a la capacidad del polipéptido natural, recombinante o sintético, o cualquier parte oligopeptídica del mismo, de inducir una respuesta inmune específica en un animal o células y de unirse con anticuerpos específicos.

"Sustancialmente la misma actividad biológica" se refiere a la actividad biológica igual a la de la molécula natural que difiere posiblemente ligeramente en un grado o nivel que sería conocido por el experto en la materia por ser la misma actividad biológica.

El término "parte", tal como se utiliza en la presente invención, en relación con un polipéptido (como en "una parte de un polipéptido determinado") se refiere a fragmentos de ese polipéptido. Los fragmentos pueden variar de tamaño desde cuatro (4) residuos de aminoácidos hasta la secuencia de aminoácidos completa menos un aminoácido. El término "parte", tal como se utiliza en la presente invención, en relación con un ácido nucleico (como en "una parte de un ácido nucleico determinado") se refiere a fragmentos de ese ácido nucleico, Los fragmentos pueden variar de tamaño desde doce (12) residuos de nucleótidos hasta la secuencia de ácidos nucleicos completa menos un nucleótido.

Una "deleción", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a un cambio en cualquier secuencia de aminoácidos o de nucleótidos en la que uno o más residuos de aminoácidos o nucleótidos, respectivamente, están ausentes.

Una "inserción" o "adición", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a un cambio en la secuencia de aminoácidos o de nucleótidos que dan lugar a la adición de uno o más residuos de aminoácidos o nucleótidos, respectivamente, en comparación con la molécula natural.

Una "sustitución", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a la sustitución de uno o más aminoácidos o nucleótidos por diferentes aminoácidos o nucleótidos, respectivamente.

La presente solicitud describe la clonación recombinante y la secuenciación de dos de los antígenos de gametocitos de Eimeria maxima principales que tiene pesos moleculares de 56 y 82 kDa.

La presente solicitud también describe la expresión de estos antígenos recombinantes en un sistema de expresión de E. coli utilizando el plásmido pTrcHis.

La presente invención también proporciona una vacuna contra la coccidiosis que comprende el antígeno recombinante de 56 kDa. Además, la presente solicitud describe una vacuna contra la coccidiosis que comprende el antígeno recombinante de 82 kDa.

La presente solicitud describe la clonación y secuenciación de dos de los antígenos de gametocitos de Eimeria maxima principales que tienes los pesos moleculares de 56 y 82 kDa.

La producción de gametocitos se escaló con el fin de aislar suficiente antígeno de gametocitos para llevar a cabo la secuenciación de aminoácidos (es decir, cantidades de miligramos de los antígenos específicos) en las propias glicoproteínas de 56 y 82 kDa. Esta producción escalada fue en sí una tarea muy difícil y requirió la infección de varios miles de pollos con el fin de proporcionar suficiente material para llevar a cabo el análisis de las secuencias. Después de conseguir este objetivo, fue posible producir suficiente antígeno de gametocito purificado por afinidad (APGA) para iniciar el aislamiento de las dos glicoproteínas a gran escala.

Se separaron las glicoproteínas antigénicas de gametocitos purificados mediante una electroforesis en gel de SDS poliacrilamida bidimensional. Después del análisis de los geles bidimensionales mediante tinción, se determinó la posición de los antígenos de 56 y 82 kDa mediante la transferencia a un filtro de membrana de PVDF y la inmunodetección utilizando antisuero contra APGA. Después de la identificación y extracción de los antígenos de 56 y 82 kDa del filtro, se realizó la secuenciación de aminoácidos de ambos extremos N-terminales, así como de las secuencias internas de la proteína obtenidas de péptidos trípticos. Estas secuencias peptídicas se utilizaron para predecir las secuencias de ADN, en base a lo cual, se sintetizaron sondas de oligonucleótidos pequeñas especí-
ficas.

Se utilizaron sondas de oligonucleótidos específicas en PCR RACE (amplificación rápida de los extremos del ADNc) para preparar las moléculas de ADNc del ARN de los gametocitos que codifica los antígenos de 56 y 82 kDa. Este método permitió la producción de moléculas de ADNc de longitud completa que son amplificadas específicamente a partir de las moléculas de ARNm que contienen en ellas las secuencias de ARN que codifican los péptidos deseados. A continuación, este producto de ADNc se secuenció completamente y se confirmó la presencia de los diversos péptidos secuenciados anteriores. Sorprendentemente, se observó que los clones de ADNc obtenidos no estaban relacionados con los descritos en Wallach et al., Patente de Estados Unidos No. 5,932,225. Por lo tanto, parece ser que en Wallach et al., aparecieron entidades cuando se cribaba la biblioteca de ADNc con anticuerpos y los clones que se pensaba que codificaban los antígenos de 56 y 82 kDa que se aislaron de hecho no codificaban estos
antígenos.

Finalmente, se utilizaron los dos nuevos clones de ADNc como sonda en los experimentos de transferencia Southern y Northern para identificar el gen o genes específicos y la molécula o moléculas de ARNm que codifican los antígenos de 56 y 82 kDa. Mientras que previamente no se podían obtener patrones de las bandas claros en las transferencias (Patente de Estados Unidos No. 5, 932,225), el número y tamaño de los fragmentos génicos y los transcritos de ARNm que codificaban para los dos antígenos se discernieron claramente.

La presente solicitud describe además un método para clonar los antígenos de 56 y 82 kDa en un vector de expresión bacteriano, pTrcHis, que contiene una etiqueta poli his (para ayudar en la purificación de los antígenos recombinantes). A continuación, los dos genes se expresan en E. coli mediante la adición de una molécula inductora específica (isopropil-\alpha-D-tiogalactopiranósido), seguido de la identificación de las proteínas antigénicas de 56 y 82 kDa mediante la transferencia western. Los resultados de estas transferencias mostraron que los antígenos recombinantes de 56 y 82 kDa tenían el tamaño correcto en base a las mediciones mediante espectrometría de masas y fueron reconocidos por los anticuerpos para esta etiqueta de his, así como el antisuero protector desarrollado contra los antígenos de gametocitos nativos de 56 y 82 kDa. Estos resultados confirmaron la identidad de los clones y mostraron que estos antígenos recombinantes se pueden utilizar para sustituir los antígenos nativos en la vacuna de base materna contra la coccidiosis en pollos.

La presente solicitud describe además la relación entre el antígeno de gametocitos de 56 kDa y la proteína de ooquiste de 30 kDa. Se observó que esta proteína de ooquiste, mediante inmunotransferencia, reaccionaba de manera intensa con el antisuero contra los antígenos de gametocitos de 56 y 82 kDa. Mediante la secuenciación del extremo amino de la proteína de ooquiste de 30 kDa, se observó que existía un emparejamiento preciso con el extremo amino del antígeno de 56 kDa. Se concluyó, por tanto, que el antígeno de 56 kDa se procesa durante el desarrollo de ooquistes de gametocitos en la proteína de 30 kDa.

La presente invención se ilustra además mediante los siguientes ejemplos que en ningún caso deberían interpretarse como limitantes. Un experto en la materia entenderá fácilmente que los métodos específicos y resultados descritos son simplemente ilustrativos de la presente invención tal como se describe con más detalle en las reivindicaciones que se indican a continuación.

Detalles experimentales

Ejemplo 1

Purificación de gametocitos de Eimeria maxima a gran escala

Con el fin de producir cantidades muy grandes de gametocitos, se infectaron 4000 pollos desarrollados pesados con 10.000 ooquistes de E. maxima esporulados y, a continuación, se sacrificaron en el sexto día (aproximadamente 134 horas) después de la infección. Se extrajeron los intestinos de los pollos, se lavaron con PBS y se cortaron longitudinalmente. A continuación, se cortaron en piezas largas de 1 cm y se colocaron en una solución tamponada con SAC (NaCl 170 mM, Tris 10 mM pH 7, glucosa 10 mM, CaCl_{2} 5 mM, leche en polvo al 1%) que contenía hialuronidasa 0,5 mg/ml (tipo III de Sigma, 700 unidades/mg). Las piezas intestinales se incubaron a 37ºC durante 20 minutos, después de lo cual se colocaron en la parte superior de un filtro de malla. Las piezas se enjuagaron con grandes cantidades de tampón SAC y se recogió el filtrado resultante. A continuación, éste se filtró a través de un filtro de polimon de 17 micras (Swiss Silk Bolting Cloth Mfg. Co. Ltd., Zurich, Switzerland) y el filtrado resultante se filtró a continuación a través de un filtro de 10 micras. Los gametocitos se recogieron de la parte superior del filtro de 10 micras, se examinaron y se contaron microscópicamente y se colocaron en botellas para centrífuga, que se centrifugaron a 800 xg durante 10 minutos. A continuación, los gametocitos se lavaron dos veces con tampón SAC y se congelaron
a -70ºC.

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Ejemplo 2

Purificación de los antígenos de gametocitos de 56, 82 y 230 kDa

Los gametocitos congelados se descongelaron a temperatura ambiente y las proteínas se extrajeron tal como se ha descrito anteriormente (Wallach 1995). Los antígenos de gametocitos de 56 y 82 kDa se aislaron del extracto proteico mediante su separación sobre una columna de Sefarosa 4B que contenía el anticuerpo monoclonal 1E11-11 desarrollado contra el antígeno de 56 kDa. Se permitió que se uniera un complejo de antígenos de gametocitos al anticuerpo monoclonal unido a la resina, el material no específico se separó por lavado utilizando el tampón y se eluyeron de la columna los antígenos de gametocitos purificados por afinidad (APGA). Se liofilizó el APGA purificó. Se analizó una pequeña muestra de APGA mediante SDS-PAGE donde se visualizaron claramente los antígenos nativos de 56 y 82 kDa (figura 1).

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Ejemplo 3

Electroforesis en gel bidimensional de APGA y aislamiento de los antígenos de 56 y 82 kDa principales

Se aislaron los antígenos de gametocitos de 56 y 82 kDa de APGA. Se preparó APGA liofilizado tal como se describe en ele ejemplo 2 y se solubilizó en agua. A continuación, las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE bidimensional (figura 2) y se identificaron mediante inmunotransferencia utilizando un anticuerpo policlonal anti-APGA de pollo, que reconoce ambas proteínas de 56 y 82 kDa. Una vez localizadas y establecidas su localización en geles SDS-PAGE bidimensionales, las proteínas se transfirieron a continuación a un filtro de membrana de PVDF y se tiñeron con Azul de Coomassie (figura 3). A la vez se llevó a cabo la inmunotransferencia, y se compararon las dos transferencias para identificar claramente las proteínas de 56 y 82 kDa. Las manchas correspondientes a los antígenos de gametocitos de 56 y 82 kDa se cortaron de las membranas y se secuenciaron los extremos amino terminales de cada antígeno.

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Ejemplo 4

Secuenciación de aminoácidos del extremo amino, así como de los péptidos trípticos internos de los antígenos de 56 y 82 kDa

Se secuenciaron los extremos amino de las proteínas de 56 y 82 kDa:

Extremo amino de la proteína de 56 kDa:	VPSTTPVENQVHPY-EM	(SEC. ID. NO. 7)

Extremo amino de la proteína de 82 kDa:	-PTVLDTTTG-QVEDT	(SEC. ID. NO. 8)

Con el fin de determinar la secuencia de proteínas de los fragmentos trípticos internos de las proteínas de 56 y 82 kDa, la preparación de APGA se separó primero mediante un SDS-PAGE unidimensional y se tiñó con azul de coomassie. A continuación, las proteínas se escindieron de los geles y se digirieron con tripsina y se secuenciaron.

Se obtuvieron las secuencias de varios péptidos trípticos a partir de ambas proteínas y los resultados se resumen en la Tabla 1.

TABLA 1 Secuencias de aminoácidos de péptidos trípticos aislados de los antígenos de 56 y 82 kDa

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1

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Las secuencias de aminoácidos obtenidas no mostraron ninguna homología con cualquier otra proteína.

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Ejemplo 5

Clonación con PCR RACE y secuenciación de los genes que codifican los antígenos de 56 y 82 kDa

Los genes para las proteínas de 56 y 82 kDa se amplificaron a partir de ADNc de gametocitos utilizando la tecnología de PCR RACE SMART (Clonetech). Se aisló el ARN de los gametocitos de E. maxima y se purificó el ARNm utilizando partículas Dynal (Dynal). El ADNc preparado del SMART se sintetizó siguiendo los protocolos según las instrucciones del fabricante utilizando la transcriptasa inversa Powerscript (Clonetech). Las amplificaciones de ambos extremos 5' y 3' se llevaron a cabo utilizando los protocolos descritos en el manual de PCR RACE SMART y la ADN polimerasa Advantage Taq (Clonetech), una mezcla de enzimas de fidelidad elevada.

Los gametocitos se habían aislado de los intestinos de los pollos, se habían filtrado una cantidad de veces y lavado extensamente tal como se describe en el ejemplo 1. Existía la preocupación de que el material intestinal residual de los pollos aún estuviera presente en esta preparación. Consecuentemente, las PCRs llevadas a cabo utilizando cebadores degenerados diseñados para los extremos amino de los genes de 56 y 82 kDa y cebadores degenerados diseñados para los fragmentos de péptidos trípticos internos proporcionaron bandas en ambas muestras de ADNc preparadas a partir de gametocitos purificados y células de pollo no infectadas. En esta situación, las bandas de PCR, que se tiñeron intensamente con bromuro de etidio en geles de agarosa, se purificaron, clonaron en pGEMT-Easy (Promega) y se secuenciaron (servicio de secuenciación SUPAMAC, Sydney, Australia). En algunos casos, cuando se observaron reajustes o el fragmento clonado era difícil de secuenciar, se obtuvo la secuencia directamente del producto PCR. Si los datos de las secuencias de ADN del producto de PCR se traducían a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de los péptidos trípticos, el producto PCR era de origen parasitario y continuó la secuenciación.

La secuencia de longitud completa de las proteínas de 56 y 82 kDa se muestra en las figuras 4 y 5, respectivamente. La secuencia de longitud completa de la proteína de 230 kDa se presenta en la figura 12.

La secuencia de aminoácidos de los péptidos trípticos y el extremo N-terminal del antígeno de gametocito de 56 coincidían con la secuencia de aminoácidos deducida a partir del ADN clonado correspondiente.

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Se secuenciaron nueve péptidos trípticos para la proteína de 56 kDa (Tabla 1). Todos los péptidos excepto uno, sb56i, se pudieron localizar en el gen clonado correspondiente a la proteína de 56 kDa (Figura 4). El fragmento tríptico puede corresponde a una banda contaminante presente en la muestra. En detalle:

- Los péptidos trípticos sb56a, sb56b, sb56c, sb56d, sb56f y sb56h coincidían de manera exacta con la secuencia de aminoácidos deducida prevista por el ADN clonado.

- El péptido triptico sb56g no coincidía de manera exacta con la secuencia de aminoácidos deducida prevista por el ADN clonado.

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La secuencia del fragmento tríptico se reanalizó y la nueva secuencia coincidía de manera más exacta con la secuencia prevista derivada del ADN clonado.

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Secuencia original del fragmento tríptico sb56g:

RQ- -TAAWMDR-TA[h/I]EQEETT: (SEC. ID. NO. 23)

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Secuencia sb56g reanalizada:

RGVQTAAWMDGVTA I EKEETT: (SEC. ID. NO. 24)

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Secuencia de aminoácidos deducida a partir de ADN:

RGVQTAAWMNGVTA I EKEETT: (SEC. ID. NO. 25)

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En este péptido aún existe una discrepancia en el aminoácido 10, donde la secuencia de la proteína revela un D y la secuencia de ADN predice una N. este segmento de ADN se secuenció 4 veces y cada vez predecía una N.

La secuencia de aminoácidos de los péptidos trípticos y el extremo N-terminal del antígeno de gametocitos de 82 coinciden con la secuencia de aminoácidos deducida que surge del ADN clonado correspondiente.

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Se secuenciaron siete péptidos trípticos para la proteína de 82 kDa (tabla 1). Todos los péptidos, excepto dos, sb82d y sb82e, se podían localizar en el gen clonado correspondiente a la proteína de 82 kDa. Este fragmento tríptico puede corresponder a una banda contaminante presente en la muestra. En detalle:

- Los péptidos trípticos sb82a, sb82b, sb82c, sb56d y sb82f coincidían de manera exacta con la secuencia de aminoácidos deducida prevista por el ADN clonado.

- Los péptidos trípticos sb82d y sb82e no coincidían con la secuencia de aminoácidos deducida prevista por el ADN clonado.

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Además de la información de las secuencias descrita anteriormente:

1) El tamaño previsto del ORF que codifica la forma madura de la proteína de 82 kDa es 64.275 Da, que correspondía con el verdadero tamaño de la proteína nativa de 62.336 Da, determinado mediante espectrometría de masas.

2) El tamaño previsto del ORF que codifica la forma madura de la proteína de 56 kDa es 51.407 Da que correspondía con el verdadero tamaño de la proteína nativa de 52.450 Da, determinado mediante espectrometría de masas.

Finalmente, las secuencias de las dos proteínas y el ADN no mostraron ninguna homología con cualquier otro gen o proteína conocida.

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Ejemplo 6

Transferencia Southern y Northern utilizando las sondas clonadas de ADNc de 56 y 82 kDa

La transferencia Southern utilizando E. maxima y ADN de pollo se llevó a cabo cortando en primer lugar el ADN con un conjunto de enzimas de restricción y separando los fragmentos de ADN resultantes en un gel de agarosa. A continuación, se transfirió el ADN a papel de nitrocelulosa, se sondó con una sonda de ADNc marcada con P^{32} para los antígenos de 56 (figura 6) o 82 (figura 7) y se realizó una autorradiografía. Los resultados mostraron que para ambos antígenos de 56 y 82 kDa, parecía haber dos genes de copia única diferentes, que codifican las dos proteínas.

La transferencia Northern utilizando E. maxima y ADN de pollo se llevó a cabo separando las moléculas de ARN en un gel de agarosa, transfiriéndola a un filtro de nitrocelulosa y sondando con clones de ADNc de 56 y 82 kDa marcados con P^{32}. Los resultados mostraron que el ARNm de 86 kDa tenía un peso molecular de aproximadamente de 1,9 kB y el ARNm de 82 kDa tenía un peso molecular de aproximadamente 24 kB (figura 8). Estos tamaños son muy similares a los previstos a partir de las secuencias de ADN.

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Ejemplo 7

Expresión de los antígenos recombinantes de 56 y 82 kDa utilizando el vector pTrcHis en E. coli y sus análisis utilizando sueros contra APGA nativo

El gen de longitud completa que codifica la proteína de 82 kDa se amplificó a partir del ADNc de gametocitos de E. maxima utilizando cebadores específicos del gen que portan sitios de restricción terminales para facilitar la clonación direccional en el vector de expresión pTRCHisb (Invitrogen). El gen de longitud completa incluía la región codificante del extremo amino de la proteína madura y las secuencia hasta, pero sin incluir, el codón de parada (575 aa). Se amplificó un fragmento parcial del gen que codifica la proteína de 56 kDa a partir del ADNc de gametocitos de E. maxima utilizando cebadores específicos del gen que portan sitios de restricción terminal. Esto incluía el extremo amino de la proteína y 323 aminoácidos adicionales de la secuencia, 133 aminoácidos más corto que la proteína madura de longitud completa. Ambos genes se clonaron en el vector disponible comercialmente pTrcHisb (Invitrogen).

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1) Expresión del gen de 56 kDa en pTrcHis B

Las bacterias transformadas se indujeron con IPTG 1 mM, y se analizaron los lisados bacterianos mediante SDS-PAGE 1D e inmunotransferencia (figura 9). Con un anticuerpo anti-His disponible comercialmente para la etiqueta de fusión a His de la proteína recombinante se reconoció una banda del tamaño previsto de 40 kDa (este clon carece de la región codificante para 133 aminoácidos) bajo condiciones inductoras. Bajo condiciones no inducidas, también hubo un nivel bajo de reactividad con esta banda indicando que existe cierto grado de espacios de la expresión génica. El reconocimiento de la proteína recombinante de 56 kDa se evaluó a continuación mediante inmunotransferencia con el anticuerpo policlonal anti-APGA de pollo. La inmunotransferencia mostró que el anticuerpo anti-APGA reconocía la forma nativa de la proteína mediante SDS-PAGE unidimensional, así como la proteína recombinante, demostrando claramente que el producto génico clonado efectivamente codifica para la proteína de 56 kDa.

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2) Expresión del gen de 82 kDa en pTrcHis B

Las bacterias transformadas se indujeron con IPTG 1 mM y se analizaron los lisados bacterianos mediante SDS-PAGE unidimensional e inmunotransferencia (figura 10). Con un anticuerpo anti-His disponible comercialmente para la etiqueta de fusión a His de la proteína recombinante se reconoció una banda del tamaño previsto de 82 kDa bajo condiciones inductoras y no inductoras. El reconocimiento de la proteína recombinante de 82 kDa se evaluó a continuación mediante inmunotransferencia con el anticuerpo policlonal anti-APGA de pollo. Este anticuerpo se produjo mediante inmunización de los pollos con APGA nativo aislado de gametocitos purificados. La inmunotransferencia mostró que el anticuerpo anti-APGA reconocía la forma nativa de la proteína mediante SDS-PAGE unidimensional, así como la proteína recombinante, demostrando claramente que el producto génico clonado efectivamente codifica para la proteína de 82 kDa.

En base a los resultados anteriores junto con el análisis de secuencia del ejemplo 5, se concluyó que los dos clones de ADNc descritos anteriormente son los auténticos genes que codifican para los antígenos de 56 y 82 kDa. Además, la intensa reactividad con el antisuero desarrollado contra los antígenos nativos muestra que estas proteínas recombinantes se pueden utilizar ahora para sustituir el APGA para la inmunización de pollos contra la coccidiosis.

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Ejemplo 8

Homología del antígeno de 56 kDa con un antígeno de 30 kDa de ooquistes de E. maxima

Se utilizaron anticuerpos para APGA para detector proteínas homólogas en una transferencia bidimensional de antígenos de ooquistes. Se observó que había una reactividad intensa con una proteína de 30 kDa (figura 11). Esta mancha se cortó del filtro de membrana y se secuenció el extremo N terminal de la proteína. La secuencia de aminoácidos resultante correspondía de manera exacta con la secuencia N-terminal del antígeno de gametocitos de 56 kDa. En base a este hallazgo, se concluyó que el antígeno de gametocitos de 56 kDa se procesa en la proteína de 30 kDa de la fase de desarrollo del ooquiste.

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Ejemplo 9

Expresión de gam 56, un antígeno de gametocitos de 56 kDa de Eimeria maxima

Proteína nativa: Mr 56.000 (tamaño determinado por "molecular sizing" (MS): 52.450 Da)

Origen: Parasítico: Eimeria maxima

Fase del ciclo vital: macrogametocito

Gen: 1.754 pares de bases secuenciadas presentadas sobre 5 fragmentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), todos ellos se clonaron en pGEMT-Easy, a excepción de las últimas \sim600 pb del gen, que incluye \sim400 pb de la región codificante.

5'UTR (1-102 pb)

ORF (103-1.533 pb)

3'UTR (1.534-1.731 pb)

Cola poliA (1.732-1.754 pb)

pI: 4,8 previsto a partir de la secuencia (mediante SDS-PAGE 2D, la proteína migra hacia el extremo ácido del gel)

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Construcciones de expresión

Vectores de expresión utilizados: pTRCHisb, pET25b

Construcción de expresión: p56TRCHisbl determinado

El fragmento génico que se clonó en el vector de expresión: gam 56 se amplificó a partir del ADNc utilizando las siguientes parejas de cebadores: SB74/SB75 (172-1137 pb) para la clonación direccional en el sitio BamHI/EcorI de TRCHisb. La región amplificada contiene la secuencia que codifica el extremo amino de la proteína madura, excluyendo la metionina iniciadora y la secuencia líder. Contiene una región rica en tirosina-serina y excluye una región rica en prolina-metionina.

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Composición de aminoácidos del fragmento gam 56 clonado:

2 cisteínas presentes

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Composición de aminoácidos del fragmento génico clonado en pTRCHisb:

S(12,7%) Y(11,50) A (8,7%) T(8,4%) P(7,2%)

R(6,6%) E(6,0%) M(5,5%) L(5,5%) V(4,6%)

Q(4,3%) N(4,3%) G(3,8%) D(3,5%) W(1,7%)

F(1,4%) K(1,4%) I(1,4%) H(0,9%) C(0,6%)

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Tamaño de proteína previsto: 41 kDa

Rendimiento: 0,9 - 1,4 \mug/ml (proteína purificada en agarosa con níquel/ml cultivo). Difícil de ver la proteína inducida en lisado de bacterias crudas en un gel teñido con Azul de Commassie

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Condiciones de expresión

El promotor presenta espacios, por tanto se puede obtener una expresión en ausencia de IPTG.

Se utilizaron matraces de fondo "bafled", 37ºC, 4 h inducción, con IPTG 1 mM, ampicilina 0,1 mg/ml en Mg^{2+}SOB 0,01 M (SOB mejor que LB).

Normalmente, se obtiene una banda predominante a \sim42 kDa después de la purificación y detección con tinción con plata. A menudo, se obtienen algunas bandas de peso molecular más elevado, que pueden ser agregados, después de la purificación, así como la principal banda de \sim42 kDa. La proteína parece agregarse a -20ºC y 4ºC; después de la purificación, se desaló y se añadieron estabilizantes (lactosa al 3%, glutamato monosódico al 1%).

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Ejemplo 10

Prueba de inmunización e inoculación de los antígenos de gametocitos de 56 kDa (r56) y 82 kDa (r82), y el antígeno en la fase asexual de 250 kDa (r250) en pollos Immunización Animales

Pollos: - gallos jóvenes Autralorp de 84 días de vida (\sim12 semanas)

- mantenidos bajo alimentación medicada (robenideno)

- todos los pollos se marcaron individualmente y se registraron

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Antígenos

Se desarrollaron proteínas recombinantes en el sistema de expresión pTRCHisb a 37ºC en ampicilina 0,1 mg/ml en Mg^{2+} SOB 0,01M y se indujeron durante 4 horas con IPTG 1 mM. Las proteínas se purificaron en una columna de Ni-agarosa, se concentraron, se desalaron y se liofilizaron con estabilizantes (lactosa al 3%, glutamato monosódico al 1%). Las concentraciones de proteína utilizada para todos los antígenos se midieron utilizando el ensayo Bradford. Las preparaciones de Antígenos de Gametocitos Purificados por Afinidad (APGA) proporcionados por M. Wallach se utilizaron como control positivo para la prueba.

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Grupos y Dosis

- 9 pollos utilizados por grupo; 9 grupos en total; 81 pollos usados en total.

- Los pollos se inmunizaron con 0,5 ml antígeno/cóctel con Antígeno Incompleto de Freund (FIA) (0,25 ml antígeno/0,25 ml FIA) por ave, intramuscularmente, en una parte sólo del pollo, con los siguientes antígenos:

Grupo 1 PBS solo

Grupo 2 Adyuvante (FIA)/PBS

Grupo 3 APGA (2,5 g)

Grupo 4 proteína r250 (1,0 g)

Grupo 5 proteína r250 (10,0 g)

Grupo 6 proteína r56 (0,5 g)

Grupo 7 proteína r56 (5,0 g)

Grupo 8 proteína r82 (0,5 g)

Grupo 9 proteína r82 (5,0 g)

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Programa de inmunización

Inmunización 1: semana 1

Inmunización 2: semana 3

sangrado: semana 6

sangrado: semana 8

sangrado/sacrificio: semana 9

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Análisis

- Se tomaron muestras de sangre (\sim1,5-2 ml/ave), se separó el suero y se analizó mediante ELISA e inmunotransferencia

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Resultados

Los resultados de las muestras de sangre se muestran en la figura 14.

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Inoculación Animales y parásitos

- se utilizaron 5 pollos (148 días de visa; \sim4,5 meses) de cada grupo que tenían el título de anticuerpo más elevado en base a los resultados del ELISA del sangrado 1; en el caso de los controles con PBS y FIA, se utilizaron los pollos con los títulos de anticuerpos más bajos

- E. maxima (cepa Houghton);

- se extrajo el robenideno del pienso una semana antes de la inoculación

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Grupos

Los siguientes grupos y pollos se tomaron de la prueba de Inmunización descrita anteriormente, y se utilizaron en los experimentos de inoculación

Grupo 1 PBS solo: pollo números 2, 3, 4, 6, 8

Grupo 2 Adyuvante (FIA)/PBS: pollo números 12-16

Grupo 3 APGA (2,5 g): pollo números 20, 22, 23, 25, 27

Grupo 5 proteína r250 (10,0 g): pollo números 37, 39, 41, 44, 45

Grupo 7 proteína r56 (5,0 g): pollo números 57, 59, 60, 61, 63

Grupo 9 proteína r82 (5,0 g): pollo números 74, 75, 76, 79, 80

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Programación de la inoculación

Eliminación de Robenideno

Inoculación con 100 ooquistes esporulados por ave Día 6

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Programación de la recogida de ooquistes y recuento

Día 0 después de la infección

Día 1 después de la infección

Día 2 después de la infección

Día 3 después de la infección

Día 4 después de la infección

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Producción revisada de ooquistes por la contaminación de otra especie.

Lámina de plástico sustituida para iniciar la recogida.

Día 5 después de la infección: Recogida de heces y recuento de ooquistes

Día 6 después de la infección: Recogida de heces y recuento de ooquistes

Día 7 después de la infección: Recogida de heces y recuento de ooquistes

Día 8 después de la infección: Recogida de heces y recuento de ooquistes

Día 9 después de la infección: Recogida de heces y recuento de ooquistes

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Día 10 después de la infección: Recogida de heces y recuento de ooquistes

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2

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Ejemplo 11

Expresión de un fragmento recombinante de la proteína de la fase asexual de 250 kDa

Se seleccionó la región de la proteína de 250 kDa que codificaba el dominio transmembrana/cola citosólica prevista y el dominio hidrofílico más arriba ("upstream") para estudios de expresión (Figura 15). Se eligió el área por diversas razones que son las siguientes: 1) se han identificado regiones de cola hidrofílica 3' similar en diversas proteínas de micronema de apicomplexa y parecen únicos en esta familia de proteínas; 2) se han identificado tales regiones en otras proteínas de micronema también reconocidas como immunodominantes, principalmente la proteína 1 de micronema de Eimeria tenella (EtMIC1) y antígeno de superficie 5401 (EtMIC4); 3) se expresó una región similar del antígeno 5401 de E. tenella (EtMIC4) y se observó que proporcionaba una protección significativa contra la inoculación con E. tenella (Danforth et al, 1988); 4) otras regiones de la proteína consisten principalmente en dominios de tipo EGF y tipo TSP-1. Estos tipos de dominios se observan altamente conservados en eucariotas y, por tanto, debe considerarse la posibilidad de que induzcan auto-inmunidad. Además, a causa de la prevalencia de dichos tipos de dominios parece improbable que sean responsables de la inducción de una respuesta inmune fuerte.

Se diseñaron los cebadores de PCR EP006 (5'-TTGGATCCCGAATTGCACCCCA TTCC-3') y EP007 (5'-TT
GAATTCTGAATGTCGCCGCTGTCG-3') para amplificar la región seleccionada de ADN a partir de un clon de ADNc que codificaba la proteína de 250 kDa. Los cebadores incorporaron sitios de restricción BamHI (EP006) y EcoRI (EP007) para facilitar la clonación dentro del vector de expresión seleccionado. Se purificó en gel el producto de PCR generado posteriormente utilizando los cebadores y se confirmó su identidad mediante secuenciación.

Se seleccionó el vector de expresión bacteriana pTrcHisB (Invitrogen) para estudios de expresión. Se digirieron el vector de plásmido de ADN y el inserto de ADNc purificado por gel con las enzimas de restricción BamHI y EcoRI, y los fragmentos de ADN se purificaron en gel y se ligaron. Se transformó la mezcla de unión en la cepa DH5-a de E. coli y a continuación se puso en placas y se incubó, se seleccionaron las colonias resultantes, se cultivaron y se utilizaron para la preparación de plásmidos. Se confirmó la identidad de los recombinantes seleccionados mediante secuenciación de ADN.

En la preparación de la expresión, se transformó el ADN del plásmido que contiene la construcción de expresión en la cepa TOP10 de expresión de E. coli huésped. Después de poner en placas e incubar, se seleccionó una única colonia bacteriana y se utilizó para establecer un cultivo O/N en medios LB. También se estableció un único cultivo de control negativo del vector. A continuación se transfirieron alícuotas de cada cultivo a medios LB nuevos y se incubaron hasta que las células alcanzaran la fase semilogarítmica ("mid-log"), en cuya fase se indujo la expresión con la adición de IPTG 1 mM. Se tomaron muestras del cultivo de expresión y del cultivo de control negativo a las 0, 1, 2, 5 y 24 horas después de la inducción, y se centrifugaron para aglomerar las células bacterianas. Posteriormente, se resuspendieron todos los residuos celulares en tampón TE, se sonicaron y se centrifugaron para separar la fracción soluble acuosa (sobrenadante) de la fracción insoluble (residuo celular). Se analizaron todas las fracciones bajo condiciones reductoras en geles SDS-PAGE y posteriormente se tiñeron con azul Coomassie. Cuando se compararon con las muestras de control negativo, se detectó una proteína sobreexpresada en las fracciones solubles, migrando justo por debajo del marcador de 45 kDa. El análisis Western de las fracciones solubles utilizando un anticuerpo reactivo con la etiqueta de 6xHistidina de los productos de expresión de pTrcHis, detectó una banda de proteína del mismo peso molecular aparente. El tamaño previsto de la proteína expresada es aproximadamente 30 kDa, algo menos que lo observado en geles SDS-PAGE. La diferencia de tamaño puede explicarse por la alta frecuencia de residuos de prolina en la proteína expresada, conocida por hacer migrar a las proteínas con peso molecular aparentemente alto.

En la preparación de pruebas de inmunogenicidad, se purificó la proteína expresada utilizando resina de agarosa cargada de níquel Ni-NTA (QIAGEN), con modificaciones menores en el protocolo recomendado por el fabricante. Las proteínas expresadas que contenían la etiqueta 6xHis se unieron a la resina y se desplazaron por una concentración incrementada de imidazol en el tampón de elución. Resumidamente, se resuspendieron los residuos celulares en tampón Lysis (NaH_{2}PO_{4} 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM, pH 8,0), que contenía lisozima 1 mg/ml. Se sonicó la suspensión en hielo y se centrifugó para obtener el residuo del material insoluble. A continuación, se mezcló el sobrenadante que contenía la proteína soluble expresada con resina Ni-NTA y se añadió a una columna de elución desechable. La emulsión se dejo reposar, entonces se lavó con tampón de lavado (NaH_{2}PO_{4} 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, pH 8,0), antes de la elución con tampón de elución (NaH_{2}PO_{4} 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 250 mM, pH 8,0). Se analizó la pureza de las fracciones eluidas mediante SDS-PAGE reductor y tinción con azul Coomassie.

Los detalles para las pruebas de inmunogenicidad son tanto para las pruebas de 56 kDa como para las de 82 kDa. Para la prueba de ratón, se utilizaron dosis de 0,5 \mug y 5 \mug de la proteína recombinante por ratón (6 ratones/grupo). Para la prueba de pollo, se utilizaron dosis de 1 \mug y 10 \mug por ave (9 pollos/grupo). En las Figuras 16 y 17 se presentan respectivamente los resultados del ELISA para las muestras de suero recogido de las pruebas de ratón y pollo.

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Ejemplo 12

La pared de los ooquistes de Eimeria deriva de las proteínas precursoras halladas en la fase sexual del parásito (macrogametocito) que experimentan el procesado y la reticulación de di-tirosina para formar la barrera protectora endurecida de la forma excretada del parásito

Se clonaron y secuenciaron los genes que codifican los antígenos de macrogametocito de la fase sexual de 56 kDa y 82 kDa. Ambos genes muestran una composición de aminoácidos inusual, y en particular, ambas tienen regiones ricas en tirosina; la proteína de 56 kDa posee una región rica en tirosina y la proteína de 82 kDa posee dos regiones ricas en tirosina. Las proteínas ricas en tirosina se han implicado previamente en la formación de paredes de ooquistes en E. acervulina y E. tenella. (Eschenbacher et al.) De este modo, se exploró en Eimeria maxima el papel de la región rica en tirosina en los antígenos de la fase sexual de 56 kDa y 82 kDa en la formación de paredes de ooquistes.

Los anticuerpos para la forma recombinante de la proteína de 56 kDa (anti-r56) y anticuerpos para la forma recombinante de la proteína de 82 kDa (anti-r82) reconocen una proteína de \sim30 kDa en ooquistes no esporulados y esporulados y una proteína de \sim30 kDa en fragmentos de pared purificadas (véase las figuras 18 y 19). También reconocen sus homólogos en forma nativa en extractos de gametocitos. La proteína de \sim30 kDa reconocida en los fragmentos de paredes de ooquistes purificados por el anticuerpo anti-r82 kDa no es la misma que la proteína de \sim30 kDa reconocida por anti-r56; es ligeramente más pequeña. La proteína de \sim30 kDa reconocida por el anticuerpo anti-r56 se purificó y se secuenció el extremo N-terminal. El extremo N-terminal de la proteína de \sim30 kDa corresponde exactamente al extremo N-terminal del antígeno de gametocitos de 56 kDa (véase Fig. 20a).

Otros han demostrado mediante SDS-PAGE y tinción con azul de coomassie que la pared de ooquistes de Eimeria está compuesta de dos proteínas predominantes de 14 kDa y 30 kDa. Utilizando mejores técnicas de separación SDs-PAGE, se ha separado la proteína de 14 kDa en 3 componentes de \sim10-14 kDa, y se las ha denominado 14.1, 14.2 y 14.3, donde 14.1 representa la proteína que ha migrado de manera más lenta en geles de SDS-PAGE, y 14.3 la más rápida (véase la figura 18c). Se secuenció el extremo N-terminal de las cuatro proteínas y los resultados se presentan en la figura 20. En resumen, la proteína de 30 kDa es una proteína nueva que no muestra ninguna similitud con cualquier otra proteína caracterizada previamente determinada mediante una búsqueda de proteínas BLAST (véase la figura 20c). El extremo N-terminal de la proteína 14.3 corresponde al inicio de la región rica en tirosina en el dominio 1 de la proteína de 82 kDa (véase la figura 20b), el extremo N-terminal de la proteína 14.2 corresponde al inicio de la región rica en tirosina en el dominio 2 de la proteína de 82 kDa (véase la figura 20b), y el extremo N-terminal de la proteína 14.1 corresponde al inicio de la región rica en tirosina en la proteína de 56 kDa (véase la figura 20a).

Juntos estos resultados muestran que la pared de ooquistes de Eimeria deriva de las proteínas precursoras halladas en los cuerpos formadores de cuerpos de la fase sexual (macrogametocito) del parásito. A través de cierto mecanismo de señalización, se procesa proteolíticamente en varias proteínas más cortas de \sim30 kDa y \sim14 kDa. En contra de los hallazgos anteriores, nuestros datos indican que la pared de ooquistes está compuesta de más de dos proteínas. Nuestros hallazgos sugieren que la pared de ooquistes está compuesta de varias proteínas presentes a diferentes niveles en el parásito, algunas de las cuales están en gran abundancia y son reconocidas mediante tinción con azul de coomassie de geles SDS-PAGE, y otras que están presentes a niveles bajos, sólo detectables a través de la técnica más sensible de inmunotransferencia. La proteína de \sim30 kDa observada en geles de SDS-PAGE teñidas con azul de coomassie no está relacionada con los antígenos de gametocitos de 56 kDa y 82 kDa, aunque, las proteínas de \sim10-14 kDa más pequeñas lo están. Nuestro hallazgo más reciente de que la di-tirosina está presente a niveles detectables del orden de 0,00338 mmol/mol en ooquistes, indica que las proteínas pequeñas ricas en tirosina se mantienen probablemente en la pared a través de un mecanismo que implica reticulaciones de di-tirosina. Sin embargo, se cree que no todas las proteínas se mantienen en la pared de esta manera y actualmente se está investigando esto.

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Referencias

Eschenbacher, K.H., Eggli, P., Wallach, M. y Braun, R. (1995) Characterization of a 14kDa oocytst wall protein of Eimeria tenella and E. Acervulina, Parasitol., 112: 169-176.

Fried, M., Mencher, D., Sar-Shalom, O., y Wallach, M. (1992) Developmental gene expression of a 230-kilodalton macrogamete-specific protein of the avian coccidial parasite, Eimeria maxima. Mol. & Biochem. Parasitol., 51:251-262.

Mencher, D., Pugatsch, T. y Wallach, M. (1989) Antigenic proteins of Eimeria maxima gametocytes: cellfree translation and detection with recovered chicken serum. Exp. Parasitol. 68: 40-48.

Wallach, M., Pillemer, G., Yarus, S., Halabi, A., Pugatsch, T. y Mencher, D. (1990) Passive Inmunización of chickens against Eimeria maxima infection with a monoclonal antibody developed against a gametocyte antigen. Infection & Immunity 58: 557-562.

Wallach, M., Smith, N.C., Petracca, M., Miller, C.M.D., Eckert, J. y Braun, R. (1995) Eimeria maxima gametocyte antigens: potential use in a subunit maternal vaccine against coccidiosis in chickens. Vaccine, 13: 347-354.

Wallach, M. y Vermeulen, A., (1996) Progress Towards a Subunit Vaccine Against Coccidiosis. Misset's World Poultry, Supplement Coccidiosis (2), 22-24.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet US 30369901 P [0001]

\bullet EP 0256536 A [0005]

\bullet US 5496550 A [0005] [0006]

\bullet US 5932225 A [0005] [0006] [0008] [0213] [0214]

\bullet EP 0164176 A [0010]

\bullet EP 0135073 A [0011]

\bullet WO 9000403 A [0021]

Documentos no procedentes de patentes citados en la descripción

\bulletSambrook et al. Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory, 1989 [0197]

\bulletLehninger. Biochemistry. Worth Pub, 1975 [0200]

\bulletCreighton. Protein Structure, a Practical Approach. IRL Press at Oxford Univ. Press, 1989 [0200]

\bulletDayhoff. Atlas of Protein Sequence and Structure 197. National Biomedical Research Foundation, 1972 [0200]

\bulletEschenbacher, K.H.; Eggli, P.; Wallach, M.; Braun, R. Characterization of a 14kDa oocytst wall protein of Eimeria tenella and E. Acervulina. Parasitol., 1995, vol. 112, 169-176 [0270]

\bulletFried, M.; Mencher, D.; Sar-Shalom, O.; Wallach, M. Developmental gene expression of a 230-kilodalton macrogamete-specific protein of the avian coccidial parasite, Eimeria maxima. Mol. & Biochem. Parasitol., 1992, vol. 51, 251-262 [0271]

\bulletMencher, D.; Pugatsch, T.; Wallach, M. Antigenic proteins of Eimeria maxima gametocytes: cell-free translation and detection with recovered chicken serum. Exp. Parasitol., 1989, vol. 68, 40-48 [0272]

\bulletWallach, M.; Pillemer, G.; Yarus, S.; Halabi, A.; Pugatsch, T.; Mencher, D. Passive immunization of chickens against Eimeria maxima infection with a monoclonal antibody developed against a gametocyte antigen. Infection & Immunity, 1990, vol. 58, 557-562 [0273]

\bulletWallach, M.; Smith, N.C.; Petracca, M.; Miller, C.M.D.; Eckert, J.; Braun, R. Eimeria maxima gametocyte antigens: potential use in a subunit maternal vaccine against coccidiosis in chickens. Vaccine, 1995, vol. 13, 347-354 [0274]

\bulletWallach, M.; Vermeulen, A. Progress Towards a Subunit Vaccine Against Coccidiosis. Misset's World Poultry, 1996, 22-24 [0275]

Claims

1. Ácido nucleico que comprende nucléotidos consecutivos que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de 56 kDa de gametocitos de Eimeria maxima, o que codifica un homólogo del polipéptido, o un complemento del ácido nucleico, donde

(a): el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 3;

(b): el homólogo del polipéptido tiene por lo menos un 50 % de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como SEC ID NO: 3;

(c): la secuencia de nucleótidos tiene por lo menos un 50% de identidad con la secuencia de nucleótidos que empieza en el nucleótido No. 103 y acaba en el nucleótido No. 1529 mostrada como SEC ID NO: 1;

(d): la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID NO: 1;

(e): el ácido nucleico es un plásmido designado como plásmido 56TRCHisb1 depositado en los Laboratorios Analíticos del Gobierno de Australia con Número de acceso NM01/22400; o

(f): el ácido nucleico se hibrida al ácido nucleico definido en (d) o (e) bajos condiciones de hibridación astringentes.

2. Ácido nucleico según la reivindicación 1, donde el ácido nucleico es una molécula de ADN o una molécula de ARN.

3. Ácido nucleico según la reivindicación 2, donde la molécula de ADN es una molécula de ADNc.

4. Ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde los ácidos nucleicos consecutivos están unidos operativamente a un promotor de la transcripción de ARN.

5. Vector que comprende el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Vector según la reivindicación 5, donde el vector es un plásmido.

7. Plásmido que comprende el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

8. Plásmido según la reivindicación 7, designado como plásmido 56TRCHisb1 depositado en los Laboratorios Analíticos del Gobierno de Australia con Número de acceso NM01/22400.

9. Célula huésped que comprende el vector según la reivindicación 5 ó 6.

10. Célula huésped según la reivindicación 9, donde la célula se selecciona del grupo que consiste en una célula bacteriana; una célula vegetal; una célula de insecto, y una célula de mamífero.

11. Célula transformada aislada que comprende el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

12. Célula transformada según la reivindicación 11, designada como clon de la bacteria 56TRCHisbl depositada en los Laboratorios Analíticos del Gobierno de Australia con Número de acceso NM01/22401.

13. Célula transformada según la reivindicación 11 ó 12, que comprende un polipéptido de 56 kDa de gametocitos de Eimeria maxima, o un homólogo del polipéptido.

14. Método de producción de un polipéptido recombinante de 56 kDa de gametocitos de Eimeria maxima, comprendiendo el método cultivar la célula transformada según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 y aislar el polipéptido recombinante de 56 kDa de gametocitos de Eimeria maxima.

15. Vacuna contra Eimeria tenella, Eimeria maxima, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria mitis o Eimeria brunette que comprende el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o el plásmido según la reivindicación 6 ó 7.

16. Vacuna según la reivindicación 15, que comprende además un segundo ácido nucleico que codifica para un antígeno de Eimeria maxima, un plásmido que comprende dicho ácido nucleico, o un polipéptido codificado por dicho ácido nucleico.

17. Vacuna según la reivindicación 16, donde el segundo ácido nucleico tiene la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID NO: 4, el plásmido comprende el ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID NO: 4, o el polipéptido es codificado por el ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID NO: 4.

18. Vacuna según la reivindicación 16, que comprende un antígeno de 30 kDa de gametocitos de Eimeria maxima que tiene en el extremo N-terminal la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 35 ó 42.

19. Vacuna según la reivindicación 16, que comprende un antígeno de 14 kDa de gametocitos de Eimeria maxima que tiene en el extremo N-terminal la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 37, 39, ó 41.

20. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 16-19, que comprende además un tercer antígeno.

21. Vacuna según la reivindicación 20, donde el tercer antígeno es un ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID NO: 26, un plásmido que comprende el ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID NO: 26, o el polipéptido codificado por el ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada como SEC ID NO: 26.

22. Vacuna según la reivindicación 20 ó 21, que comprende además un cuarto antígeno.

23. Vacuna según la reivindicación 22, donde el cuarto antígeno es un polipéptido de gametocitos de Eimeria maxima que tiene un peso molecular de 230 kDa a 270 kDa, una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de gametocitos de Eimeria maxima que tiene un peso molecular de 230 kDa a 270 kDa, o un plásmido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de gametocitos de Eimeria maxima que tiene un peso molecular de 230 kDa a 270 kDa.

24. Vacuna según la reivindicación 22, donde el cuarto antígeno comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 29 en su extremo 5' o la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 31 en su extremo 3'.

25. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 24 para su uso en la inmunización de un sujeto contra la infección por Eimeria tenella, Eimeria maxima, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria mitis o Eimeria brunetti.

26. Uso de una proteína de 30 kDa de gametocitos de Eimeria maxima que tiene en el extremo N-terminal la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 35 ó 42 o una proteína de 14 kDa de gametocitos de Eimeria maxima que tiene en el extremo N-terminal la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 37, 39 ó 41 para la preparación de una vacuna para inmunizar un sujeto contra la infección por Eimeria tenella, Eimeria maxima, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria mitis o Eimeria brunetti.

27. Vacuna según la reivindicación 25, donde el sujeto se selecciona del grupo que consiste en ganado, ovejas, cerdos y peces.

28. Vacuna según la reivindicación 25, donde el sujeto es una especie aviar.

29. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 25, 27 ó 28, donde dicha vacuna se diseña para administrarse mediante la pulverización de dicha vacuna en las fosas nasales del sujeto.

30. Vacuna según la reivindicación 25 ó 28, donde la vacuna se diseña para administrarse in ovo.

31. Vacuna según la reivindicación 30, donde la vacuna se diseña para administrarse en la bolsa de aire de un huevo.

32. Uso según la reivindicación 26, donde el sujeto se selecciona del grupo que consiste en ganado, ovejas, cerdos y peces.

33. Uso según la reivindicación 26, donde el sujeto es una especie aviar.

34. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 26, 32 ó 33, donde dicha vacuna se diseña para administrarse mediante la pulverización de dicha vacuna en las fosas nasales del sujeto.

35. Uso según la reivindicación 26 ó 33, donde la vacuna se diseña para administrarse in ovo.

36. Uso según la reivindicación 35, donde la vacuna se diseña para administrarse en la bolsa de aire de un huevo.

37. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 25 ó 28 a 31 para su uso para conferir a un sujeto recién nacido de una especie aviar inmunidad materna contra la infección por Eimeria tenella, Eimeria maxima, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria mitis o Eimeria brunetti, o para reducir la producción de ooquistes de Eimeria en heces de un sujeto recién nacido de una especie aviar, donde dicha vacuna se diseña para administrarse a la madre del sujeto en un tiempo adecuado anterior a la puesta de un huevo fecundado.

38. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 25, 27, 28 ó 37, donde la vacuna se diseña para administrarse mediante inyección intravenosa, intramuscular o intraperitoneal.

39. Huevo fecundado de una especie aviar que tiene una bolsa de aire, donde la bolsa de aire comprende la vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 15-25, cuya vacuna es capaz de inducir antes o inmediatamente después de la incubación una respuesta inmune en un embrión contra una forma virulenta de Eimeria tenella, Eimeria maxima, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria mitis o Eimeria brunetti.

40. Huevo fecundado según la reivindicación 39, donde la especie aviar se selecciona del grupo que consiste en pollos, patos, pavos, gansos, pollos bántam, codornices y palomas.

41. Huevo fecundado según la reivindicación 40, donde la especie aviar es

un pollo.

42. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 31, ó 37, donde la especie aviar se selecciona del grupo que consiste en pollos, patos, pavos, gansos, pollos bántam, codornices y palomas.

43. Vacuna según la reivindicación 42, donde la especie aviar es un pollo.

44. Uso según la reivindicación 36, donde la especie aviar se selecciona del grupo que consiste en pollos, patos, pavos, gansos, pollos bántam, codornices y palomas.

45. Uso según la reivindicación 44, donde la especie aviar es un pollo.