MXPA04000127A

MXPA04000127A - Acidos nucleicos que codifican a antigenos recombinantes de gametocitos de eimeria maxima de 56 y de 86 kda y sus usos.

Info

Publication number: MXPA04000127A
Application number: MXPA04000127A
Authority: MX
Inventors: Wallach Michael
Original assignee: Abic Biolog Lab Teva Ltd
Priority date: 2001-07-06
Filing date: 2002-07-03
Publication date: 2005-07-01
Also published as: ZA200400479B; BR0210853A; US7423137B2; EP1432722B1; IL159716A; DE60235021D1; RU2004103469A; IL159716A0; HUP0600028A2; CN1606565A; AU2002316558B2; CA2467006A1; JP2009077713A; US20090196888A1; ATE454392T1; US20050033042A1; WO2003004683A3; WO2003004683A2; ES2339227T3; TR200400049T2

Abstract

La presente invencion proporciona la clonacion recombinante y la formacion de secuencias de dos de los principales antigenos de gametocitos de Eimeria maxima que tienen pesos moleculares de 56 y de 82 kDa y la expresion de estos antigenos recombinantes en un sistema de expresion de E. Coli usando el plasmido pTrcIIis. El tema de la invencion tambien proporciona una vacuna contra coccidiosis que comprende el antigeno recombinante de 56 kDa y de 82 kDa. El tema de la invencion tambien proporciona dos proteinas de 30 kDa y tres proteinas de 14 kDa de gametocitos de Eimeria maxima que tienen en el extremo N- terminal la secuencia de aminoacidos descrita en la presente. El tema de la invencion tambien proporciona una vacuna contra coccidiosis que comprende el antigeno de 56 kDa o de 82 kDa recombinante y cualquiera de las proteinas antes mencionadas. Adicionalmente, el tema de la invencion tambien proporciona un metodo de inmunizar a un sujeto contra la infeccion por Eimeria tenella. Eimeria maxima, Eimeria acervulina, eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria mitis o Eimeria brunetti, o un microorganismo que expresa a un antigeno que interreacciona inmunologicamente, que comprende la etapa de administrar al sujeto cualquiera de las vacunas anteriormente mencionadas.

Description

ACIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN A ANTIGENOS RECOMBINANTES DE GAMETOCITOS DE EIMERIA MAXIMA DE 56 82 kDa Y SUS USOS CAMPO DE LA INVENCION En el transcurso de esta solicitud se hará referencia entre paréntesis a varias publicaciones. Las citas completas para estas publicaciones pueden encontrarse enlistadas en orden alfabético al final de la especificación inmediatamente antes de las reivindicaciones. Las descripciones integras de estas publicaciones se incorporan a la presente como referencia a fin de describir más completamente el estado del arte al cual pertenece esta invención.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los organismos que causan la enfermedad conocida como "coccidiosis" en pollos, pertenecen a la phylum Apicomplexa, clase Sporozoa, subclase Coccidia, orden Eucoccidia, suborden Eimeriorina, familia Eimerlidae, género Eimeria. En el género Eimeria hay muchas especies, varias de las cuales son patógenas en pollos. Las especies de importancia que conciernen a la industria del pollo son Eimeria tenella, -Eimeria máxima, Eimeria acerwlinar Eimeria necatrix y Eimeria brunetti.

Durante varias de las últimas décadas, la coccidiosis se ha vuelto un problema económico importante en la industria del pollo, principalmente debido al hacinamiento de los albergues para pollos y al desarrollo de la resistencia al fármaco en el parásito. La cría de pollos bajo condiciones de hacinamiento sobre un piso desechable proporciona condiciones óptimas para el crecimiento y la diseminación de parásitos Eimeria. Bajo dichas circunstancias, es imposible el control sanitario y los granjeros deben de confiar en la efectividad de los fármacos coccidiostáticos . No obstante, los fármacos deben de conservarse en el alimento en todo momento, deben de usarse programas de refuerzo para evitar la aparición de resistencia al fármaco en cepas de Eimeria, y ciertos fármacos tienen efectos colaterales costosos. Además, estos coccidiostáticos también tienen efectos antibacterianos y por consiguiente se consideran antibióticos para ingesta alimentaria. Recientemente la Unión Europea ha decidido anunciar el uso de todos los antibióticos para ingesta alimentaria en la industria del pollo incluyendo los fármacos anticoccidiales . Así, el único procedimiento viable para el control de coccidiosis en el futuro es por medio del desarrollo de vacunas. El parásito Eimeria sufre un ciclo de vida complejo en la mucosa del tracto intestinal. Este ciclo de vida es muy similar al de otros parásitos hemosporidianos (es decir, plasmodium, babesia, etc.) excepto por la falta de un vector artrópodo. Oocistos esporulados sobre el piso desechable que producen cuatro esporocistos, conteniendo cada uno dos esporozoitos (que pertenecen asi a la clase esporozoa) . Los oocistos son ingeridos por el pollo, y los esporocistos son liberados por la trituración mecánica de la molleja. Los esporozoitos son entonces liberados desde los esporocistos debido a la digestión de la pared del esporocisto por medio de enzimas proteoliticas en el intestino. Los esporozoitos móviles invaden entonces a los linfocitos e invaden las células epiteliales donde comienza el ciclo asexual. El parásito atraviesa 2-4 ciclos de replicación y de división (cada una de las especies tiene un número definido de divisiones) que conducen a la producción de gran número de merozoitos hijas. Después del ciclo final de producción del merozoito el ciclo sexual comienza con la producción del macrogametocito (hembra) y del microgametocito (macho) . El macrogametocito está caracterizado por la producción de cuerpos formadores de pared, mientras que los microgametocitos contienen los componentes involucrados en la formación de las microgametas, los cuales brotan desde la superficie del parásito intracelular . Las microgametas son flageladas y son responsables de la fertilización de la macrogameta. Se forma un zigoto, el cual madura en el oocisto por fusión de los cuerpos formadores de pared y por condensación de los núcleos. Los oocistos son secretados en las heces, completando asi el ciclo. Durante varios años anteriores, se usaron antigenos nativos de las etapas sexuales (gametocxtos) de Eimeria máxima para inmunizar gallinas ponedoras. Los pollos descendientes fueron consecuentemente vacunados vía inmunidad materna (anticuerpo materno protector) . Previamente se han identificado tres antigenos protectores principales en gametocxtos de E. Máxima que tienen pesos moleculares de 250, 82 y 56 kDa (Patente EP No. 0 256 536, Patente EüA No. 5,496,550, y Patente EUA No. 5,932,225) . La Patente EP No. 0 256 536, la Patente EUA No. 5,496,550, y la Patente EÜA No. 5,932,225 se incorporan a la presente solicitud como referencia a fin de describir más completamente el estado del arte al cual pertenece esta invención. Se mostró que estos antigenos son bien conservados entre especies de Eimeria (Wallach 1995) y puede proteger de manera cruzada contra las tres especies principales que causan coccidiosis en pollos de engorda, E. máxima, E. tenella y JE. acervulina. Más recientemente, se mostró que en ensayos en jaulas, pollos de gallinas vacunadas con estos antígenos de gametocxtos nativos estuvieron protegidos contra' Eimeria bajo condiciones de campo (Wallach 1996) . Esta protección actúa para abatir el pico en oocistos cayendo a un nivel en el cual no causa cualquier efecto dañino sobre los resultados de los pollos de engorda. Con base en los resultados anteriores se concluyó que estos antigenos son efectivos contra la coccidiosis en pollos y también tienen el potencial para uso contra coccidiosis en otros animales domésticos incluyendo pavos, gansos, ove as, vacas, cerdos y peces. Estos tres antigenos se caracterizaron también al nivel molecular. Se llevaron a cabo experimentos de traslación libres de células, para identificar las moléculas de RNA que los codifican (Mencher y colaboradores) . Moléculas de cDNA que codifican a estos antigenos se clonaron por inmunocribado de una biblioteca de cDNA hecha en el vector de expresión lambda zap (4, Patente EUA No. 5,932,225). Por medio de este procedimiento, el gen que codifica al antigeno de 250 kDa fue clonado y secuenciado. El clon pEM 250/14 fue parcialmente secuenciado en las Patentes Nos. 5,932,225 y 5,496,550. La figura 13a de la presente solicitud reproduce la Figura 11 de las Patentes EUA Nos. 5,932,225 y 5,496,550, las cuales representan la secuencia de DNA de los primeros 293 nucleótidos del clon pEM 250/14. La figura 13B de la presente solicitud reproduce la Figura 12 de las Patentes EUA Nos. 5,932,225 y 5,496,550, las cuales muestran la secuencia de DNA de los últimos 196 nucleótidos del clon pEM 250/14. También, en las Patentes EUA Nos. 5,932,225 y 5,496,550, los genes putativos que codifican a los antigenos de 56 y de 82 kDa fueron clonados y secuenciados . Subsecuentemente, Fried y colaboradores secuenciaron el clon pEM 250/14 completo y encontraron que el antigeno tuvo un peso molecular de 230 kDa en vez de 250 kDa como se habla pensado previamente. Fried y colaboradores encontraron que el gen de 230 kDa contenia motivos muy repetitivos y que estas repeticiones están contenidas en todo el gen completo (Fried y colaboradores) . Este clon fue expresado en bacterias usando el vector plásmido pATH y se mostró que es reconocido por suero de pollos convalecientes tomado 14 días post infección con E. Máxima. Finalmente, se mostró que este gen es expresado solamente en la etapa del macrogametocito y por inmunofluorescencia se encontró que está localizado en los cuerpos formadores de pared del macrogameto (Fried y colaboradores) . Se obtuvieron también clones de cDNA que codifican a los antigenos de 56 y de 82 kDa por cribado de la biblioteca con anticuerpos policlonales, asi como también un anticuerpo monoclonal contra el antígeno de 56 kDa. Se mostró previamente que este anticuerpo monoclonal proporciona inmunidad pasiva a pollos nativos (Wallach 1990). Se obtuvieron y analizaron unos cuantos clones. Se encontró que uno de los clones codifica a un antigeno pequeño de 10 kDa y por consiguiente no era el clon deseado. Se encontró otro clon que contenia solamente una pequeña parte del marco de lectura abierto (ORF) y por manchado Northern se mostró que hibridiza con dos itiR As de aproximadamente el tamaño esperado para los antigenos de 56 y de 82 kDa. Por consiguiente, se concluyó que este fue el clon deseado. Se cribaron entonces bibliotecas genómicas para obtener el clon de extensión total. No obstante, debido a los motivos GCA muy repetitivos en este clon, no fue posible aislar específicamente el clon de extensión total. Tampoco fueron exitosos los intentos para clonar la molécula de cDNA de extensión total debido a estas repeticiones. Finalmente, fallaron los intentos para expresar los clones de cDNA parcial en bacterias también probablemente debido a sus secuencias inusuales y no se obtuvo un nivel razonable de expresión genética. Se mostró previamente que los antígenos de 56 y de 82 kDa son glicosilados (Patente EUA No. 5,932,225). Esto está basado en su fuerte reactividad con lecitina de soya. Por consiguiente, puede requerirse la glicosilación a fin de obtener buena expresión de estos genes y para la conformación apropiada de los productos genéticos.

Además de los antigenos de 56, 82 y 230 kDa, se propuso un antigeno de 14 kDa obtenido de fracciones muy purificadas de paredes de oocistos como un posible candidato para vacunas contra coccidiosis (Eschenbacher y colaboradores) . No obstante, esta hipótesis no se ha explorado . Varios laboratorios han trabajado sobre una vacuna subunitaria contra la coccidiosis. La mayoría de estos investigadores han enfocado sus esfuerzos sobre las etapas asexuales extracelulares del ciclo de vida, en particular las etapas del esporozoito y del merozoito que se consideran como las más vulnerables al ataque inmune . En un estudio previo se encontró que extractos de esporozoito de E. tenella podrían inducir en pollos de engorda la protección contra la provocación de infecciones contra este parásito para hasta 7 semanas de edad (Karkhanis y colaboradores) . Los trabajo llevados a cabo usando anticuerpos monoclonales contra antígenos de esporozoitos de E. tenella condujeron a la identificación de un antígeno de peso molecular de 25,000, el cual fué clonado y secuenciado (Publicación de Patente Eur. No. 0 164 176, 11 de Diciembre de 1985) . Se identificaron varios genes diferentes de esporozoito y sus antígenos recombinantes o las mismas bacterias transformadas fueron probadas por inmunidad protectora (Denforth y colaboradores) .Los resultados indicaron que estos recombinantes fueron solamente capaces de proporcionar un nivel relativamente bajo de protección contra la provocación de infecciones con Eimeria y no evitó siempre la aparición de lesiones significativas. Se probó también, una vacuna usando antigenos de la etapa del merozoito (Publicación de Patente Europea No. 0 135 073) . Usando estos antígenos para inmunizar pollos de engorda jóvenes, se encontró una vez de nuevo que la protección resultante fue relativamente baja (Danforth y colaboradores) . En 1993, se encontró que hubo una correlación entre la inmunidad materna protectora con la aparición de anticuerpos maternos contra un antigeno de merozoito de 230 kDa (en oposición al gametocito) de Eimeria máxima (Smith y colaboradores) . Esta protección fue a menudo superior a 90 % y se encontró que tiene lugar aún cuando el nivel de anticuerpos maternos fue relativamente bajo (aunque la reactividad con la proteina de 230 kDa permaneció fuerte) . Se encontró también que una muy pequeña cantidad del antigeno del merozoito de 230 kDa nativo cortado de un gel de SDS-PAGE podría inducir un nivel significativo (60 %) de inmunidad materna protectora contra la infección contra E. máxima en los pollos descendientes. Además, el manchado Western mostró que esta proteina fue expresada en ambos, merozoitos y esporozoitos de E. máxima y se conserva también entre especies de Eimeria.

SUMARIO DE IA INVENCION La presente invención proporciona el ácido nucleico que codifica a dos de los principales antigenos de gametocitos de Eimeria máxima que tienen pesos moleculares de 56 y de 82 kDa. La presente invención también proporciona una proteina de 30 kDa de gametocitos de Eimeria máxima que tiene en el extremo N-terminal la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 35. La presente invención también proporciona una proteina de 30 kDa de gametocitos de Eimeria máxima que tiene en el extremo N-terminal la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 42. La presente invención también proporciona una proteina de 14 kDa de gametocitos de Eimeria máxima que tiene en el extremo N-terminal la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 37. La presente invención proporciona también una proteina de 14 kDa de gametocitos de Eimeria máxima que tiene en el extremo N-terminal la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 39.

La presente invención también proporciona una proteína de 14 kDa de- Eimeria máxima que tiene en el extremo N-terminal la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 41. La presente invención también proporciona una vacuna contra coccidiosis, que comprende el antígeno de 56 kDa recombinante solo o en combinación con cualquiera de las proteínas anteriormente mencionadas . La presente invención también proporciona una vacuna contra coccidiosis, que comprende el antígeno de 82 kDa recombinante solo o en combinación con cualquiera de las proteínas anteriormente mencionadas . La presente invención también proporciona un método de inmunizar a un sujeto contra la infección por Eimeria tenella, Eimeria maximar Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria mitis o Eimeria brunetti, o un microorganismo que expresa a un antígeno inter-reactivo inmunológicamente, que comprende la etapa de administrar al sujeto cualquiera de las vacunas mencionadas anteriormente.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1, expone antígenos de gametocito nativo purificados por afinidad con el gel de SDS PAGE teñido con Coomassie. Las flechas apuntan a los antígenos de 56 y de 82 kDa. Se indican las proteínas marcadoras del peso molecular. Figura 2, expone antigenos de gametocito nativo purificados por afinidad con el gel de SDS-PAGE en dos dimensiones (2D) después de inmunoitianchado y tinción con plata. Se indican las proteínas marcadoras del peso molecular . Figura 3, expone un filtro de PVDF teñido con Coomassie de un gel bi-dimensional de SDS-PAGE y la identificación de las manchas que se cortaron para análisis de secuencias. Las flechas apuntan a los antígenos nativos de 56 y de 82 kDa. Figura 4, expone la secuencia de DNA completa del antígeno del gametocito de 56 kDa. Se indica el amino terminus así como también los fragmentos de péptido tríptico interno. Además, se muestran el sitio de fragmentación de péptido de señal y la metionina iniciadora predicha. Se muestran la secuencia codificadora, su complemento y las secuencias de aminoácidos (SEC ID Nos: 1-3) . Figura 5, expone la secuencia de DNA completa del antígeno del gametocito de 82 kDa. Se indica el amino terminus así como también los fragmentos de péptido tríptico interno. Además, se muestran el sitio de fragmentación de péptido de señal y la metionina iniciadora predicha. Se muestran la secuencia codificadora, su complemento y las secuencias de aminoácidos (SEC ID NOS: 4-6) . Figura 6, expone un manchado Southern de un DNA de pollo control y de gametocxto sondeados con el clon de cDNA para el antigeno de 56 kDa. Se indican las enzimas de restricción usadas para digestión del DNA y los tamaños de la banda marcadora en kilosbase. Figura 7, expone un manchado Southern de DNA de pollo control y de gametocxto sondeado- con el clon de cDNA para el antigeno de 82 kDa. Se indican las enzimas de restricción usadas para digestión del DNA y los tamaños de las bandas marcadoras. Figura 8, expone un manchado Northern de RNA total de pollo control (C) y de gametocxto (G) sondeado con el clon de cDNA de 82 kDa. Se indican a la izquierda los tamaños de las bandas marcadoras en kilosbase. Figura 9, expone un inmunomanchado que muestra la reactividad del anticuerpo anti-polihistidina y anti-APGA de pollo con proteínas expresadas por bacterias no inducidas (control) e inducidas por IPTG que contienen el clon de cDNA de 56 kDa en pTrcHisB. Como un control negativo adicional, se probaron las bacterias que fueron transformadas con el plásmido pTrcHisB que no contiene inserto. Finalmente, se usó APGA nativa como un control positivo para el manchado con el antisuero anti APGA. Se indican los tamaños de las bandas marcadoras de proteínas . Las flechas muestran las posiciones de las proteínas nativas de 82 kDa y de 56 kDa y recombxnante de 41 kDa. Figura 10, expone un gel teñido con Coomassie e inmunomanchado de proteínas de bacterias que contienen plásmidos clonados de cDNA de 82 kDa en pTrcHisB. El inmunomanchado muestra la reactividad del anti-poli-histidina, anti-APGA de pollo así como también suero de pollo no infectado (control negativo) con la proteína recombinante de 82 kDa bajo condiciones no inducidas e inducidas por IPTG a varios tiempos después de inducción. Como un control negativo, el experimento se efectuó también usando bacterias transformadas con el mismo plásmido sin un inserto. Como un control positivo, se corrió también APGA nativa. La flecha muestra la posición de la proteína recombinante de 82 kDa. Se indican a la izquierda los tamaños de las bandas marcadoras de proteínas . Figura 11, expone un inmunomanchado de un lisado entero de oocistos de E. máxima sin esporular separado por SDS-PAGE bidimensional . El gel fue manchado sobre un filtro membrana y sondeado con un antisuero producido contra APGA. Se muestra con una flecha la mancha de 30 kDa que reacciona fuertemente. Esta fue la mancha que se cortó del gel y se usó para análisis de secuencia. Figura 12, expone la alineación de la secuencia de DNA del clon de E. máxima, cDNA de 230 kDa con una secuencia de DNA homologa de la patente WO 90/00403 que muestra 60 % de homología (SEC ID Nos: 26- 27). Figura 13a, expone la secuencia de DNA de los primeros 293 nucleótidos del clon pEM 250/14. Se muestran la secuencia codificadora y sus secuencias de aminoácidos (SEC ID Nos. 28-29) . La figura 13b, expone la secuencia de DNA de los últimos 196 nucleótidos del clon pEM 250/14. Se muestran la secuencia codificadora y sus secuencias de aminoácidos (SEC ID Nos. 30-31) . Figura 14 A y B Resultados de ELISA para ensayos de inmunogenicidad de pollos de la forma recombinante del antígeno de gametocito de 82 kDa y de 56 kDa. Todas las muestras de suero fueron probadas a la dilución de 1:1000. A) Antígeno de recubrimiento: APGA para suero de prueba contra APGA; r56 purificado para suero de prueba tomado de pollos inmunizados con PBS, FIA y las dos dosis de r56. B) Antígeno de recubrimiento: APGA para suero de prueba contra APGA; proteína purificada de r82 para suero de prueba tomado de pollos inmunizados con PBS, FIA y las dos dosis de r82. Figura 15, Secuencia de aminoácidos codificada y de DNA del fragmento de proteína expresado de la proteína de la etapa asexual de 250 kDa (SEC ID NOS: 32-33). Figura 16, ensayo de imnumogenicidad en ratón del fragmento recombinante de la protelna de etapa asexual de 250 kDa. Se muestra el promedio de cada grupo para los tres sangrados consecutivos con las barras de error estándar indicadas . Todas las muestras de suero fueron probadas en la dilución de 1:1000. El antigeno de recubrimiento fue 100 ng de APGA para suero del grupo de APGA control positivo, o 100 ng de la protelna recombinante para los grupos de PBS control negativo y de PBS/FIA y las dos dosis de protelna recombinante (r0.5 g y r5 µg) Figura 17, Ensayo de inmunogenicidad en pollos del fragmento recombinante de la protelna de etapa asexual de 250 kDa. Se muestra el promedio de cada grupo para los tres sangrados consecutivos, con las barras de error estándar indicadas . Todas las muestras de suero fueron probadas a la dilución de 1: 1000. El antigeno de recubrimiento fue 100 ng de APGA para suero del grupo de APGA control positivo, o 100 ng de la proteina recombinante para los grupos de PBS control negativo y de PBS/FIA y las dos dosis de proteína recombinante (1 g y rlO µg) . Figura 18, Reconocimiento de anti-r56 de gametocito y antígenos de pared en Eimeria máxima.

Figura 19, reconocimiento de anti-r82 de gametocito y antigenos de pared en Eimeria máxima. Figura 20, Alineación de la secuencia N-terminus de las proteínas de pared del oocisto en los antígenos de gametocito de 56 kDa y 82 kDa (SEC ID NOS: 34-42).

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido de 56 kDa de gametocitos de Eimeria máxima, o que codifica a un homólogo del polipéptido, o a un complemento del ácido nucleico. En una modalidad, el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 4 (SEC ID NO: 3) . En otra modalidad, el homólogo del polipéptido tiene al menos 50 % de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como la SEC ID NO: 3. En una modalidad adicional, el homólogo del polipéptido tiene al menos 60 % de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como la SEC ID NO: 3. En una modalidad adicional, el homólogo del polipéptido tiene al menos 70 % de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como la SEC ID NO : 3.

En una modalidad adicional, el homólogo del polipéptido tiene al menos 75 % de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como la SEC ID NO: 3. En aún otra modalidad, el homólogo del polipéptido tiene al menos 80 % de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como la SEC ID NO: 3. En una modalidad adicional, el homólogo del polipéptido tiene al menos 85 % de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como la SEC ID NO: 3. En una modalidad, el homólogo del polipéptido tiene al menos 90 % de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como la SEC ID NO: 3. En otra modalidad, el homólogo del polipéptido tiene al menos 93 % de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como la SEC ID NO: 3. En una modalidad adicional, el homólogo del polipéptido tiene al menos 95 % de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como la SEC ID NO: 3. En una modalidad adicional, el homólogo del polipéptido tiene al menos 97 % de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como la SEC ID NO: 3.

En aún otra modalidad, el homólogo del polipéptido tiene al menos 99 % de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como la SEC ID NO: 3. En una modalidad adicional, la secuencia de nucleótidos tiene al menos 50 % de identidad con la secuencia de nucleótidos que comienza en el nucleótido No. 103 y que finaliza en el nucleótido No. 1529 mostrada en la Figura 4 (SEC ID NO: 1) . En otra modalidad, la secuencia de nucleótidos tiene al menos 60 % de identidad son la secuencia de nucleótidos que comienza en el nucleótido No. 103 y que finaliza en el nucleótido No. 1529 mostrada como la SEC ID NO: 1. En una modalidad adicional, la secuencia de nucleótidos tiene al menos 70 % de identidad con la secuencia de nucleótidos que comienza en el nucleótido No. 103 y que finaliza en el nucleótido No. 1529 mostrada como la SEC ID NO: 1. En una modalidad, la secuencia de nucleótidos tiene al menos 75 % de identidad con la secuencia de nucleótidos que comienza en el nucleótido No. 103 y que finaliza en el nucleótido No. 1529 mostrada como la SEC ID NO: 1. En otra modalidad, la secuencia de nucleótidos tiene al menos 80 % de identidad con la secuencia de nucleótidos que comienza en el nucleótido No. 103 y que finaliza en el nucleótido No. 1529 mostrada como la SEC ID NO: 1.

En una modalidad adicional, la secuencia de nucleótidos tiene al menos 85 % de identidad con la secuencia de nucleótidos que comienza en el nucleotido No. 103 y que finaliza en el nucleotido No. 1529 mostrada como la SEC ID NO: 1. En una modalidad, la secuencia de nucleótidos tiene al menos 90 % de identidad con la secuencia de nucleótidos que comienza en el nucleotido No. 103 y que finaliza en el nucleotido No. 1529 mostrada como la SEC ID NO: 1. En una modalidad adicional, la secuencia de nucleótidos tiene al menos 93 % de identidad con la secuencia de nucleótidos que comienza en el nucleotido No . 103 y que finaliza en el nucleotido No. 1529, mostrada como la SEC ID NO: 1. En otra modalidad, la secuencia de nucleótidos tiene al menos 95 % de identidad con la secuencia de nucleótidos que comienza en el nucleotido No. 103 y que finaliza en el nucleotido No. 1529, mostrada como la SEC ID NO: 1. En una modalidad adicional, la secuencia de nucleótidos tiene al menos 97 % de identidad con la secuencia de nucleótidos que comienza en el nucleotido No . 103 y que finaliza en el nucleotido NO. 1529, mostrada como la SEC ID NO: 1. En una modalidad, la secuencia de nucleótidos tiene al menos 99 % de identidad con la secuencia de nucleótidos que comienza en el nucleótido No. 103 y que finaliza en el nucleótido NO. 1529, mostrada como la SEC ID NO: 1. En una modalidad adicional, el ácido nucleico es una molécula de DNA. En aún otra modalidad, la molécula de DNA es una molécula de cDNA. En una modalidad adicional, el ácido nucleico tiene la secuencia de nucleótidos que comienza en el nucleótido No. 103 y que finaliza en el nucleótido No. 1529, mostrada en la Figura 4 (SEC ID NO: 1) . En otra modalidad, el ácido nucleico es una molécula de RNA. En una modalidad, el ácido nucleico aislado está operativamente unido a un promotor de transcripción de RNA. La presente invención también incluye un vector que comprende un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido de 56 kDa de Gametocitos de Eimeria máxima, o que codifica a un homóloqo del polipéptido, o a un complemento de ácido nucleico . En una modalidad, el vector comprende el ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos que comienza en el nucleótido No. 103 y que finaliza en el nucleótido No. 1529, mostrada en la Figura 4 (SEC ID NO: 1) · En otra modalidad, el vector es un plásmido. En una modalidad adicional, el plásmido comprende el ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos que comienza en el nucleótido No. 103 y que finaliza en el nucleótido No. 1529, mostrada en la Figura 4 (SEC ID NO: 1) . En una modalidad adicional, el plásmido comprende un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido de 56 kDa de Gametocitos de Eimeria máxima, o que codifica a un homólogo del polipéptido, o a un complemento del ácido nucleico . En aún otra modalidad, el plásmido es el plásmido designado plásmido 56TRCHisbl (No. de Accceso del Australian Government Analytical Laboratories: NM01/22400) . La presente invención también abarca una célula huésped que comprende un vector que comprende un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido de 56 kDa de Gametocitos de Eimeria máxima, o que codifica a un homólogo del polipéptido, o a un complemento del ácido nucleico.

En una modalidad, la célula huésped comprende un vector que comprende un ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos que comienza en el nucleótido No . 103 y que finaliza en el nucleótido No. 1529 mostrada en la Figura 4 (SEC ID NO: 1). En otra modalidad, la célula huésped es seleccionada del grupo que consiste de una célula bacteriana; una célula vegetal; una célula de insecto; y una célula de mamifero . La presente invención expone adicionalmente una célula transformada que comprende un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido de 56 kDa de Gametocitos de Eimeria máxima, o que codifica a un homólogo del polipéptido, o a un complemento del ácido nucleico. En una modalidad, la célula transformada es la célula transformada designada clon 56TRCHisbl en bacteria (No. de Acceso de Australian Analytxcal Laboratories: NM01/22401) . Un plásmido que codifica al antigeno de 56 kDa se depositó con el Australian Government Analytical Laboratories, Pymble, Australia, el 26 de Junio de 2001, bajo el No. de Acceso: NM01/22400. La célula bacteriana transformada con el antigeno de 56 kDa se depositó con el Australian Governement Analytical Laboratories, Pymble, Australia, el 26 de Junio de 2001, bajo el No. de Acceso: NMOl/22401. Ambos depósitos fueron hechos de conformidad con el Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganism for the Purposes of Patent Procedure . En una modalidad adicional, la célula transformada comprende además un polipéptido de 56 kDa de Gantetocitos de Eimeria máxima, o un homólogo del polipéptido. La presente invención contiene adicionalmente un método de producir un polipéptido recoiabinante de 56 kDa de Gametocitos de Eimeria máxima que comprende cultivar una célula transformada que comprende un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido de 56 kDa de Gametocitos de Eimeria máxima, o que codifica a un homólogo del polipéptido, o a un complemento del ácido nucleico y aislar al polipéptido recombinante de 56 kDa de Gametocitos de Eimeria máxima. El polipéptido recoiabinante producido por este método está también abarcado por la presente invención. La presente invención también proporciona una vacuna contra Eimeria tenella r Eimeria maximar Eimeria acervulinar Eimeria necatrix o Eimeria brunettir Eimeria praecoxr Eimeria mitis o un microorganismo que expresa a un antigeno inter-reactivo inmunológicamente, que comprende el ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido de 56 kDa de Gametocitos de Eimeria máxima, o que codifica a un homólogo del polipéptido, o a un complemento del ácido nucleico . En una modalidad de la vacuna, el ácido nucleico aislado es un plásmido. Además, la presente invención expone una vacuna contra Eimeria tenellar Eimeria máximar Eimeria acervulina, Eimeria necatrix o Eimeria brunetti, Eimeria praecoxr Eimeria mitis o un microorganismo que expresa a un antigeno inter-reactivo inmunológicamente, que comprende un polipéptido recombinante de 56 kDa de Gametocitos de Eimeria máxima producido al cultivar una célula transformada que comprende un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido de 56 kDa de Gametocitos de Eimeria máxima, o que codifica a un homólogo del polipéptido, o a un complemento del ácido nucleico y al aislar el polipéptido recombinante de 56 kDa de Gametocitos de Eimeria máxima. En otra modalidad, la vacuna comprende una mezcla del ácido nucleico aislado de la presente invención y el polipéptido recombinante de la presente invención. En otra modalidad, la vacuna comprende una mezcla del ácido nucleico aislado de la presente invención, el polipéptido recombinante de la presente invención y un plásmido que comprende el ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido de 56 kDa de Gametocitos de Eimeria máxima. En una modalidad adicional, la vacuna comprende además un segundo antigeno. En una modalidad, el segundo antigeno es seleccionado del grupo que consiste de un ácido nucleico que codifica para un antígeno de Eimeria máxima, un plásmido que comprende un ácido nucleico tal, y un polipéptido codificado por un ácido nucleico tal . En otra modalidad, el segundo antigeno es seleccionado del grupo que consiste de una proteina de 30 kDa de gametocitos de Eimeria máxima que tienen en el extremo N-terminal la secuencia de aminoácidos mostrada como la SEC ID NO: 35, o la SEC ID NO: 42 o una proteina de 14 kDa de gametocitos de Eimeria máxima que tienen en el extremo N-terminal la secuencia de aminoácidos mostrada como la SEC ID NO: 37, SEC ID NO: 39 o la SEC ID NO: 41. En aún otra modalidad, el segundo antigeno es un ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada como la SEC ID NO: 4, un plásmido que comprende el ácido nucleico o un polipéptido codificado por el ácido nucleico . En una modalidad adicional, la vacuna comprende adicionalmente un tercer antígeno. La presente invención también proporciona una vacuna en la que el tercer antigeno es un antigeno de esporozoito/merozoito de 230 kDa de E. máxima. El antigeno de 230 kDa se aisló de esporozoitos de E. máxima purificados que están presentes en oocistos esporulados (ver el ciclo de vida anterior) . El procedimiento de aislamiento involucró la extracción de proteínas de los oocistos esporulados y la separación de las proteínas extraídas en una columna de intercambio aniónico de DEAE-Sep acel . Esto fue seguido por SDS-PAGE de las fracciones pico y manchado Western para identificar el antígeno de 230 kDa. Además, se usó el antisuero materno protector tanto de gallinas vacunadas como de los pollos descendientes para confirmar la identidad del antígeno purificado. Finalmente, se aisló la proteína de 230 kDa desde un filtro membrana de PVDF para llevar a cabo la secuenciación y la clonación de la proteína. Los productos de digestión del péptido tríptico y del amino terminal del antígeno de 230 kDa fueron secuenciados . Las secuencias del tríptico digerido se usaron para diseñar cebadores oligonucleótidos de PCR degenerados. Los cebadores se usaron en RACE (amplificación rápida de extremos de cDNA) PCR para amplificar productos genéticos parciales. Desde las secuencias de estos productos, se diseñaron cebadores específicos genéticos y se usaron en RACE PCR para definir los extremos 3' y 5' del mRNA. Un clon de cDNA de 7 kilosbase de .extensión total que codifica al antígeno se amplificó entonces por PCR usando cebadores específicos genéticos diseñados para los extremos 5' y 3' . Este clon fue secuenciado totalmente y mostró contener la secuencia de DNA correcta en su extremo 5' en comparación con la secuencia de aminoácidos del N-terminus de la proteína nativa. Así, esta secuencia de ácido nucleico codificó al antígeno de esporozoito/merozoito de 230 kDa protector y podría ahora ser usado para producir el antígeno recombinante para la vacunación de pollos contra la coccidiosis . Un plásmido que codifica al antígeno de 230 kDa fue depositado con el Australian Government Analytical Laboratories,. Pymble, Australia, el 26 de Junio de 2002, bajo el No. de Acceso: M01/22396. La célula bacteriana transformada con el antígeno de 230 kDa se depositó con el Australian Government Analytical Laboratories, Py ble, Australia, el 26 de Junio de 2001, bajo el No. de Acceso: NM01/22397. Ambos depósitos se hicieron de conformidad con el Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure.

Se pensó previamente que el antigeno de los esporozoitos/merozoitos de E. máxima fue un antigeno de 230 kDa. No obstante, nuestros estudios subsecuentes han revelado que el antigeno actualmente es un antigeno de 250 kDa de los esporozoitos/merozoitos de E. máxima. En una modalidad adicional, el tercer antigeno es un ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 12 (SEC ID NO: 26), un plásmido que comprende el ácido nucleico, o un polipéptido codificado por el ácido nucleico. En aún otra modalidad, la vacuna comprende adicionalmente un cuarto antigeno. En una modalidad, el cuarto antigeno es un polipéptido de Gametocitos de Elmeria máxima que tiene un peso molecular desde 230 kDa a 270 kDa, una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido, o a un plásmido que comprende la secuencia de nucleótidos. En una modalidad adicional, el antigeno comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 13a (SEC ID NO: 29) en su extremo 5' o la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 13b (SEC ID NO: 31) en su extremo 3' . La presente invención también proporciona un método de inmunizar a un sujeto contra la infección por Eimeria tenella, Eimeria maximar Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria mitis o Eimeria brunetti, o un microorganismo que expresa a un antigeno inter-reactivo inmunológicamente, que comprende la etapa de administrar al sujeto la vacuna de la presente invención. En una modalidad, el sujeto es una especie seleccionada del grupo que consiste de vacas, ovejas, cerdos y peces. En otra modalidad, el sujeto es una especie aviar. En una modalidad adicional, la especie aviar es seleccionada del grupo que consiste de pollos, pavos, gansos, patos, gallinas enanas, codornices y palomas. En una modalidad adicional, la especie aviar es pollos . En una modalidad, la etapa de administrar comprende atomizar la vacuna en las fosas nasales del sujeto. En una modalidad adicional, la administración comprende la inyección intravenosa, intramuscular o intraperitoneal . En otra modalidad, la administración se efectúa in ovo. En una modalidad adicional, la administración es en la bolsa de aire de un huevo, poniendo en contacto asi un embrión con la vacuna. La presente invención también contiene un huevo fertilizado de una especie aviar que tiene una bolsa de aire que es inoculada con la vacuna de la presente invención dicha vacuna es capaz de inducir antes o inmediatamente después de incubar una respuesta inmune en el embrión contra una forma virulenta de Elmeria tenella Ei eria máxima,. Elmeria acervulina Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria mitis o Eimeria hxunetti, o un microorganismo que expresa a un antígeno ínter-reactivo inmunológicamente . En una modalidad, la especie aviar es seleccionada del grupo que consiste de pollos, patos, pavos, gansos, gallinas enanas, codornices y palomas. En otra modalidad, la especie aviar es pollos . La presente invención proporciona adicionalmente un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido de 82 kDa de Gametocitos de Eimeria máxima, o que codifica a un homólogo del polipéptido, o a un complemento del ácido nucleico. En una modalidad, el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 5 (SEC ID NO: 6) . En otra modalidad, el homólogo del polipéptido tiene al menos 50 % de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como la SEC ID NO: 6. En una modalidad adicional, el homólogo del polipeptido tiene al menos 60 % de identidad con el polipeptido que tiene la secuencia mostrada como la SEC ID NO: 6. En una modalidad adicional, el homólogo del polipéptido tiene al menos 70 % de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como la SEC ID NO: 6. 1 En otra modalidad, el homólogo del polipéptido tiene al menos 75 % de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como SEC ID NO: 6. En aún otra modalidad, el homólogo del polipéptido tiene al menos 80 % de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como la SEC ID NO: 6. En una modalidad adicional, el homólogo del polipéptido tiene al menos 85 % de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como la SEC ID NO: 6. En una modalidad, el homólogo del polipéptido tiene al menos 90 % de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como la SEC ID NO: 6. En una modalidad adicional, el homólogo del polipéptido tiene al menos 93 % de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como la SEC ID NO: 6. En aún otra modalidad, el homólogo del polipéptido tiene al menos 95 % de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como la SEC ID NO: 6. En una modalidad, el homólogo del polipéptido tiene al menos 97 % de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como la SEC ID NO: 6. En una modalidad adicional, el homólogo del polipéptido tiene al menos 99 % de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como la SEC ID NO: 6. En una modalidad adicional, la secuencia de nucleótidos tiene más de 50 % de identidad con la secuencia de nucleótidos que inicia en el nucleótido No. 100 y que finaliza en el nucleótido No. 1886 mostrada en la Figura 5 (SEC ID NO: 4) . En otra modalidad, la secuencia de nucleótidos tiene más de 60 % de identidad con la secuencia de nucleótidos que inicia en el nucleótido No. 100 y que finaliza en el nucleótido No. 1886 mostrada como la SEC ID NO: 4. En una modalidad adicional, la secuencia de nucleótidos tiene más de 70 % de identidad con la secuencia de nucleótidos que inicia en el nucleótido No. 100 y que finaliza en el nucleótido No. 1886 mostrada como la SEC ID NO: 4. En una modalidad adicional, la secuencia de nucleótidos tiene más de 75 % de identidad con la secuencia de nucleótidos que inicia en el nucleótido No. 100 y que finaliza en el nucleótido No. 1886 mostrada como la SEC ID NO: 4. En otra modalidad, la secuencia de nucleótidos tiene más de 80 % de identidad con la secuencia de nucleótidos que inicia en el nucleótido No. 100 y que finaliza en el nucleótido No. 1886 mostrada como SEC ID NO: 4. En aún otra modalidad, la secuencia de nucleótidos tiene más de 85 % de identidad con la secuencia de nucleótidos que inicia en el nucleótido No. 100 y que finaliza en el nucleótido No. 1886 mostrada como la SEC ID NO: 4. En una modalidad, la secuencia de nucleótidos tiene más de 90 % de identidad con la secuencia de nucleótidos que inicia en el nucleótido No. 100 y que finaliza en el nucleótido No. 1886 mostrada como la SEC ID NO: 4. En una modalidad adicional, la secuencia de' nucleótidos tiene más de 93 % de identidad con la secuencia de nucleótidos que inicia en el nucleótido No. 100 y que finaliza en el nucleótido No. 1886 mostrada como la SEC ID NO: 4. En otra modalidad, la secuencia de nucleótidos tiene más de 95 % de identidad con la secuencia de nucleótidos que inicia en el nucleótido No. 100 y que finaliza en el nucleótido No. 1886 mostrada como la SEC ID NO: 4.

En una modalidad adicional, la secuencia de nucleótidos tiene más de 97 % de identidad con la secuencia de nucleótidos que inicia en el nucleótido No. 100 y que finaliza en el nucleótido No. 1886 mostrada como la SEC ID NO: 4. En una modalidad adicional, la secuencia de nucleótidos tiene más de 99 % de identidad con la secuencia de nucleótidos que inicia en el nucleótido No. 100 y que finaliza en el nucleótido No. 1886 mostrada como la SEC ID NO: 4. En una modalidad adicional, el ácido nucleico es una molécula de DNA. En aún otra modalidad, la molécula de DNA es una molécula de cDNA. En una modalidad adicional, el ácido nucleico tiene la secuencia de nucleótidos que comienza con el nucleótido No. 100 y que finaliza en el nucleótido No. 1886 mostrada como la SEC ID NO: 4. En otra modalidad, el ácido nucleico es una molécula de RNA. En una modalidad, el ácido nucleico aislado está operativamente unido a un promotor de transcripción de RNA. La presente invención también incluye un vector que comprende un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido de 82 JcDa de Gametocitos de Eimeria máxima, o que codifica a un homólogo del polipéptido, o a un complemento del ácido nucleico . En una modalidad, el vector comprende el ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos que comienza en el nucleótido No. 100 y que finaliza en el nucleótido No. 1886 mostrada en la Figura 5 (SEC ID NO: 4) . En otra modalidad, el vector es un plásmido. En una modalidad adicional, el plásmido comprende el ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos que comienza en el nucleótido No. 100 y que finaliza en el nucleótido No. 1886 mostrada en la Figura 5 (SEC ID NO: 4) . En una modalidad adicional, el plásmido comprende un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica al -polipéptido de 82 .kDa de Gametocitos de Eimeria máxima, o que codifica a un homólogo del polipéptido, o a un complemento del ácido nucleico . En aún otra modalidad, el plásmido es el plásmido designado plásmido 82TRCHisb8 (Australian Government Analytical Laboratories con No. de Acceso: NM01/22398) . La presente invención también abarca una célula huésped que comprende un vector que comprende un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido de 82 kDa de Gametocitos de Eimeria máxima, o que codifica a un homólogo del polipéptido, o a un complemento del ácido nucleico . En una modalidad, la célula huésped comprende un vector que comprende un ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos que comienza en el nucleótido No . 100 y que finaliza en el nucleótido No. 1886 mostrada en la Figura 5 (SEC ID NO: 4) . En otra modalidad, la célula huésped es seleccionada del grupo que consiste de una célula bacteriana; una célula vegetal; una célula de insecto; y una célula de mamífero. La presente invención adicionalmente presenta una célula transformada que comprende un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido de 82 kDa de Gametocitos de Eimeria máxima, o que codifica a un homólogo del polipéptido, o a un complemento del ácido nucleico. En una modalidad, la célula transformada es la célula transformada denominada clon 82TRCHisb8 en bacteria (Australian Government Analytical Laboratories No. NM01/22399) .

Un plásmido que codifica al antígeno de 82 kDa fue depositado con el Australian Government Analytical Laboratories, Pymble, Australia, el 26 de Junio de 2001, bajo el No. de Acceso: NM01/22398. La célula bacteriana transformada con el antigeno de 82 kDa fue depositada con el Australian Government Analytical Laboratories, Pymble, Australia, el 26 de Junio de 2001, bajo el No. de Acceso NM01/22399. Ambos depósitos fueron hechos de conformidad con el Budapest Treaty on the International Recognxtion of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure . En una modalidad adicional, la célula transformada comprende adicionalmente un polipéptido de 82 kDa de gametocitos de Eimeria máxima, o un homólogo del polipéptido. La presente invención contiene adicionalmente un método de producir un polipéptido recombinante de 82 kDa de Gametocitos de Eimeria máxima que comprende cultivar una célula transformada que comprende un ácido nucleico aislado 'que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido de 82 kDa de Gametocitos de Eimeria máxima, o que codifica a un homólogo del polipéptido, o a un complemento del ácido nucleico y aislar el polipéptido recombinante de 82 kDa de gametocitos de Eimeria máxima. El -polipéptido recombinante producido por este método es también abarcado por la presente invención. La presente invención también proporciona una vacuna contra Eimeria tenella, Eimeria máxima, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria mitis o Eimeria brunetti, o un microorganismo que expresa a un antigeno inter-reactivo inmunológicamente, que comprende el ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido de 82 kDa de Gametocitos de Eimeria máxima, o que codifica a un homólogo del polipéptido, o a un complemento del ácido nucleico . En una modalidad de la vacuna, el ácido nucleico aislado es un plásmido. Además, la presente invención expone una vacuna contra Eimeria tenella, Eimeria máxima, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria mitis o Eimeria brunetti, o un microorganismo que expresa a un antigeno inter-reactivo inmunológicamente, que ' comprende un polipéptido recombinante de 82 kDa de Gametocitos de Eimeria máxima producidos al cultivar una célula transformada que comprende un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido de 82 kDa de Gametocitos de Eimeria máxima, o que codifica a un homólogo del polipéptido, o a un complemento del ácido nucleico y aislar el polipéptido recombinante de 82 kDa de Gametocitos de Eimeria máxima. En otra modalidad, la vacuna comprende una mezcla del ácido nucleico aislado de la presente invención y el polipéptido recombinante de la presente invención. En otra modalidad, la vacuna comprende una mezcla del ácido nucleico aislado de la presente invención, el polipéptido recombinante de la presente invención y un plásmido que comprende el ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido de 82 kDa de Gametocitos de Eimeria máxima. En una modalidad adicional, la vacuna comprende adicionalmente un segundo antigeno. En una modalidad, el segundo antigeno es seleccionado del grupo que consiste de un ácido nucleico que codifica para un antigeno de Eimeria máxima, un plásmido que comprende , un ácido nucleico tal, y un polipéptido codificado por un ácido nucleico tal . En otra modalidad, el segundo antigeno es seleccionado del grupo que consiste de una proteina de 30 kDa de gametocitos de Eimeria máxima que tiene en el extremo N-terminal la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 35, o SEC ID NO: 42 o una proteina de 14 kDa de gametocitos de Eimeria máxima que tiene en el extremo N-terminal la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 37, SEC ID NO: 39 o SEC ID NO: 41. La presente invención también proporciona un método de inmunizar a un sujeto contra la infección por Eimeria tenella, Eimeria máximar Eimeria acervnlina, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria mitis o Eimeria brunetti, o un microorganismo que expresa a un antigeno inter-reactivo inmunológicamente, que comprende la etapa de administrar al sujeto la vacuna de la presente invención. En una modalidad, el sujeto es una especie seleccionada del grupo que consiste de vacas, ovejas, cerdos y peces. En otra modalidad, el sujeto es una especie aviar. En una modalidad adicional, la especie aviar es seleccionada del grupo que consiste de pollos, pavos, gansos, patos, gallinas enanas, codornices y palomas. En una modalidad adicional, la especie aviar es pollos . En una modalidad adicional, la administración comprende inyección intravenosa, intramuscular o intraperitoneal . En una modalidad, la etapa de administrar comprende rociar la vacuna en las fosas nasales del sujeto. En otra modalidad, la administración se efectúa in ovo. En una modalidad adicional, la administración es en la bolsa de aire de un huevo, poniendo asi en contacto a un embrión con la vacuna. La presente invención también contiene un huevo fertilizado de una especie aviar que tiene una bolsa de aire que es inoculada con la vacuna de la presente invención, dicha vacuna es capaz de inducir antes o inmediatamente después de incubación una respuesta inmune en el embrión contra una forma virulenta de Eimeria tenella, Eimeria máxima, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria itis o Eimeria brunetti, o un microorganismo que expresa a un antigeno inter-reactivo inmunológicamente . En una modalidad, la especie aviar es seleccionada del grupo que consiste de pollos, patos, pavos, gansos, gallinas enanas, codornices y palomas. En otra modalidad, la especie aviar es pollos . La presente invención también proporciona un polipéptido recombinante, en donde la secuencia de aminoácidos se muestra como la SEC ID NO: 3. La presente invención también proporciona un polipéptido recombinante, en donde la secuencia de aminoácidos se muestra como la SEC ID NO: 6. La presente invención también proporciona una proteína de 30 kDa de gametocitos de Eimeria máxima que tiene en el extremo N-terminal la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 35. La presente invención también proporciona una proteína de 30 kDa de gametocitos de Eimeria máxima que tiene en el extremo N-terminal la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 42. La presente invención también proporciona una proteína de 14 kDa de gametocitos de Eimeria máxima que tiene en el extremo N-terminal la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 37. La presente invención también proporciona una proteína de 14 kDa de gametocitos de Eimeria máxima que tiene en el extremo N-terminal la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 39. La presente invención también proporciona una proteína de 14 kDa de gametocitos de Eimeria máxima que tiene en el extremo N-terminal la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 41. Las proteínas mencionadas anteriormente y sus correspondientes secuencias de nucleótidos pueden usarse de la misma manera descrita anteriormente para las proteínas de 56 kDa y 82 kDa, que incluyen ser usadas para inmunizar a un sujeto, y para incorporar un plásmido que contenga una secuencia de nucleótidos que codifique a la protelna en una célula huésped. La presente invención también proporciona un método de conferir a un sujeto neonato de una especie aviar, inmunidad materna (anticuerpos) contra la infección por Ei eria tenella, Eimeria máxima. Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria mitis o Eimeria brunetti, o microorganismos que expresan a un antigeno que inter-reacciona inmunológicamente, que comprende la etapa de administrar a la madre del sujeto a un tiempo previo adecuado a la puesta de un huevo fertilizado, la vacuna de la presente invención a fin de conferir asi protección vía inmunidad materna contra la infección por Eimeria tenella, Eimeria máxima, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria mitis o Eimeria brunetti, o un microorganismo que expresa a un antigeno inter-reactivo inmunológicamente, en el sujeto neonato. En una modalidad adicional, la especie aviar es seleccionada del grupo que consiste de pollos, pavos, gansos, patos, gallinas enanas, codornices y palomas. En una modalidad adicional, la administración comprende la inyección intravenosa, intramuscular o intraperitoneal . La presente invención proporciona un método de reducir la salida de oocistos de Eimeria en heces de un sujeto neonato de una especie aviar, el cual comprende la etapa de administrar a la madre del sujeto a un tiempo previo adecuado a la puesta de un huevo fertilizado, la vacuna de la presente invención, a fin de inducir una respuesta inmune y transmitir anticuerpos maternos al neonato de modo que se reduzca la salida de oocistos desde el neonato.- En una modalidad adicional, la especie aviar es seleccionada del grupo que consiste de pollos, pavos, gansos, patos, gallinas enanas, codornices y palomas. En una modalidad adicional, la administración comprende la inyección intravenosa, intramuscular o intraperitoneal . La presente invención también proporciona un método de inmunizar a un sujeto contra la infección por Eimeria tenella, Eimeria máxima r Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria mitis o Eimeria brunetti, o un microorganismo que exprese a un antigeno inter-reactivo inmunológicamente, que comprende la etapa de administrar al sujeto una vacuna viva que comprenda un microorganismo viviente no virulento o un virus vivo que exprese a un polipéptido de 56 kDa o de 82 kDa de los gametocitos de Eimeria máxima. En una modalidad, el virus vivo es le virus pox. En una modalidad, el sujeto es una especie seleccionada del grupo que consiste de vacas, ovejas, cerdos y peces. En otra modalidad, el sujeto es una especie aviar. En una modalidad adicional, la especie aviar es seleccionada del grupo que consiste de pollos, pavos, gansos, patos, gallinas enanas, codornices y palomas. En una modalidad adicional, la administración comprende la inyección intravenosa, intramuscular o intraperitoneal . La presente invención también proporciona un método de inmunizar a un sujeto contra la infección por Eimeria tenella, Eimeria máxima, Eimexia acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria mitis o Eimeria brunetti, o un microorganismo que exprese a un antigeno inter-reactivo inmunológicamente, que comprende la etapa de alimentar al sujeto con un vegetal cuyas células expresen a un polipéptido de 56 kDa o de 82 kDa de los gametocitos de Eimeria máxima. En una modalidad el vegetal es trigo . En otra modalidad el vegetal es maíz. En una modalidad, el sujeto es una especie seleccionada del grupo que consiste de vacas, ovejas, cerdos y peces. En otra modalidad, el sujeto es una especie aviar. En una modalidad adicional, la especie aviar es seleccionada del grupo que consiste de pollos, pavos, gansos, patos, gallinas enanas, codornices y palomas. La presente invención también proporciona un método de inmunizar a un sujeto contra la infección por Eimeria tenella, Eimeria máxima, Eimeria acervnlina, Eimeria praecox, Eimeria mitis o Eimeria brunetti, o un microorganismo que exprese a un antigeno inter-reactivo inmunológicamente, que comprende la etapa de administrar al sujeto un plásmido que comprende un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido de 56 kDa o de 82 kDa desde los gametocitos de Eimeria máxima, o que codifica a un homólogo del polipéptido, o a un complemento del ácido nucleico . En una modalidad, el sujeto es una especie seleccionada del grupo que consiste de vacas, ovejas, cerdos y peces. En otra modalidad, el sujeto es una especie aviar. En una modalidad adicional, la especie aviar es seleccionada del grupo que consiste de pollos, pavos, gansos, patos, gallinas enanas, codornices y palomas. En una modalidad adicional, la administración comprende la inyección intravenosa, intramuscular o intraperitoneal . Un homólogo del ácido nucleico de la invención es un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene substancialmente la misma actividad biológica que el polipéptido codificado por el ácido nucleico. El término "homología", como se usa en la presente, se refiere a un grado de complementaridad. Puede ser homología parcial u homología completa (es decir, identidad) . Una secuencia complementaria parcialmente es una que al menos inhibe parcialmente una secuencia idéntica de hibridizar a un ácido nucleico objetivo. Esto , se refiere a usar el término funcional substancialmente homólogo"'. La inhibición de la hibridización de la secuencia completamente complementaria a la secuencia objetivo puede ser examinada usando un ensayo de hibridización (manchado Southern o Northern, hibridización en solución y los similares) bajo condiciones de baja severidad. Una secuencia substancialmente homologa o sonda rivalizará para e inhibirá el enlace (es decir, la hibridización) de una secuencia completamente homologa o sonda con la secuencia objetivo bajo condiciones de baja severidad. Esto no quiere decir que las condiciones de baja severidad son tales que no se permite el enlace no específico; las condiciones de baja severidad requieren que el enlace de dos secuencias entre sí sea una interacción específica (es decir, selectiva) . La ausencia de enlace no específico puede probarse por medio del uso de una segunda secuencia _ objetivo, la cual carece igualmente de un grado parcial de complementaridad (por ejemplo, menos de aproximadamente 30 % de identidad) ; en la ausencia de enlace no especifico, la sonda no ibridizará a la segunda secuencia objetivo no complementaria . Como se sabe en el arte, pueden emplearse numerosas condiciones equivalentes para comprender las condiciones de baja o de alta severidad o ambas. Se consideran factores tales como la extensión y la naturaleza (composición de bases, DNA, RNA) de la secuencia, naturaleza del objetivo (composición de bases, DNA, RNA, presencia en solución o inmovilización, etc.), y la concentración de las sales y otros componentes (por ejemplo, la presencia o ausencia de formamida, sulfato de dextrano y/o polietilen glicol) y la solución de ibridización puede variarse para generar condiciones ya sea de baja o de alta severidad diferentes de, pero equivalentes a, las condiciones enlistadas anteriormente.

Es un objeto de la presente invención proporcionar secuencias de nucleótidos que codifican a los antigenos de 56 y de 82 kDa de Gametocitos de Eimeria máxima y a la secuencia de aminoácidos deducida de éstos. Se ejemplifican específicamente las secuencias codificadoras dadas en las Figuras 4 y 5, junto con la secuencia de aminoácidos deducida. Todas las secuencias codificadoras sinónimas para las secuencias de aminoácidos ejemplificadas están en el alcance de esta invención. Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar secuencias de proteínas y equivalente codificadores funcionalmente, que incluyen secuencias equivalentes de especies diferentes a Eimeria. Antígenos de 56 y de 82 kDa equivalentes funcionalmente de secuencias codificadoras de Gametocitos de Eimeria máxima tienen deseablemente desde aproximadamente 50 % a aproximadamente 80 % de homología de secuencia de nucleótidos (identidad) con la secuencia codificadora identificada específicamente, desde aproximadamente 80 % hasta aproximadamente 95 %, y deseablemente desde aproximadamente 95 % hasta aproximadamente 100 % idénticas en la secuencia codificadora a la secuencia codificadora ejemplificada. Se proporcionaron las condiciones de severidad particulares de hibridización para la identificación de homólogos de la secuencia codificadora de otras especies y la identificación de secuencias variantes, donde las secuencias homologas y/o variantes tienen al menos (inclusivamente) 50 a 85 %, 85 a 100 % de identidad de secuencia de nucleótidos, 90 a 100 , o 95 a 100 % de identidad de secuencia de nucleótidos . Cada entero y cada subgrupo de cada intervalo especificado se pretende en el contexto de la presente invención.

La secuencia codificadora y los métodos de la presente invención incluyen secuencias codificadoras homologas en especies diferentes a Eimeria máxima. Pueden emplearse métodos para aislar las secuencias codificadoras correspondientes (por ejemplo, de cDNA) de otros organismos, incluyendo pero sin limitarse a otras especies tales como Eimeria tenella, Eimeria acervulina r Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria mitis y Eimeria brunetti útiles en los métodos de esta invención que usan las secuencias descritas en la presente y las técnicas experimentales conocidas en el arte. Se incluyen específicamente en esta invención las secuencias de especies diferentes a las ejemplificadas en la presente, dichas secuencias hibridizan a las secuencias descritas bajo condiciones de severidad. Las condiciones de severidad se refieren a las condiciones comprendidas en el arte para una extensión de sonda y composición de nucleótidos dados y capaz de hibridizar bajo condiciones de severidad significa fortalecer a una secuencia de nucleótidos objetivo, o a su hebra complementaria, bajo condiciones estándares (es decir, alta temperatura y/o bajo contenido de sales) las cuales tienden a desfavorecer el fortalecimiento de secuencias no relacionadas . "Condiciones de alta severidad" significa las condiciones de hibridización y de lavado de 65 ° - 68 ° C, 0.1 x SSC y 0.1 % de SDS (lo que indica aproximadamente 95 - 100 % de identidad/ similaridad de secuencia de nucleótidos) . Se describen adicionalmente ensayos y condiciones de hibridización en Sambrook y colaboradores (1989) Molecular Cloning, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Plain Vie , N.Y. Como se usa en la presente, las condiciones de severidad moderada (media) son aquellas con condiciones de hibridización y de lavado de 50 - 65 °C, 1 x SSC y 0.1 % de SDS (donde un resultado de hibridización positivo refleja aproximadamente 80 - 95 % de identidad de secuencia de nucleótidos) . Las condiciones de baja severidad son típicamente aquellas con condiciones de hibridización y de lavado de 40 - 50 °C, 6 x .SSC y 0.1 % de SDS (que refleja aproximadamente 50 - 80 % de identidad de secuencia de nucleótidos) . Un homólogo del polipéptido de la invención es un polipéptido que tiene substancialmente la misma secuencia de aminoácidos y actividad biológica que el polipéptido. Así, un homólogo puede diferir del polipéptido de la invención por la adición, eliminación, o substitución de uno o más residuos de aminoácidos no esenciales, a condición de que el polipéptido resultante retenga la actividad biológica del polipéptido. Los expertos en la materia pueden determinar fácilmente cuales residuos de aminoácidos pueden ser añadidos, eliminados, o substituidos (incluyendo con cuales aminoácidos pueden hacerse dichas substituciones) utilizando procedimientos establecidos y bien conocidos, que incluyen, por ejemplo, métodos convencionales para el diseño y la fabricación de secuencias de DNA que codifican para expresión bacteriana de homólogos del polipeptido del polipeptido objetivo, la modificación de secuencias genómicas y de cDNA por medio de técnicas de mutagénesis en sitio dirigido, la construcción de polipéptidos recombinantes y de vectores de expresión, la expresión bacteriana de los polipéptidos, y la medición de la actividad bioquímica de los polipéptidos por medio de ensayos bioquímicos convencionales . Ejemplos de homólogos son los homólogos de eliminación que contienen menos que todos los residuos especificados en el polipéptido objetivo, homólogos de substitución en donde uno o más residuos especificados son reemplazados por otros residuos, y homólogos de adición en donde uno o más residuos de aminoácidos son añadidos al polipéptido. Todos los homólogos comparten la actividad biológica del polipéptido de la invención. "Substancialmente el mismo polipéptido" se define en la presente como que abarca la eliminación, adición o substitución de menos de cuatro aminoácidos en el N- terminus de la secuencia de aminoácidos del polipéptido. Además, puede haber eliminaciones, adiciones o substituciones en la secuencia, lo cual no elimina la actividad biológica del polipéptido. Dichas modificaciones son conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, las substituciones pueden abarcar hasta 10 residuos de conformidad con los grupos homólogos o equivalentes descritos por ejemplo en Lehninger, Biochemistry, 2a. Edición Worth Pub., New York (1975); Creighton, Protein Structure, a Practical Aproach, IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, England (1989) ; y Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure 1972, National Biomedical Research Foundation, Maryland (1972) . El término ""activo biológicamente", como se usa en la presente, se refiere. a un polipéptido que tiene funciones estructurales, reguladoras, o bioquímicas de una molécula como se encuentra naturalmente. Similarmente ??activo inmunológica ente" se refiere a la capacidad del polipéptido natural, recombinante, o sintético, o a cualquier porción de oligopéptido del mismo, para inducir una respuesta inmune específica en un animal o células y para enlazar con anticuerpos específicos. "Substancialmente la misma actividad biológica" se refiere a la misma actividad biológica que la de la molécula como se encuentra de manera natural difiriendo posiblemente solo ligeramente en el grado o nivel que podría aún ser conocido por los expertos en la materia por ser la misma actividad biológica. El término "porción", como se usa en la presente, en conexión con un polipéptido (como en "una porción de un polipéptido dado") se refiere a fragmentos de ese polipéptido . Los fragmentos pueden variar de tamaño desde cuatro (4) residuos de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos entera menos un aminoácido. El término "porción", como se usa en la presente, en conexión con un ácido nucleico (como en "una porción de un ácido nucleico dado") se refiere a fragmentos de ese ácido nucleico. Los fragmentos pueden variar de tamaño desde doce (12) residuos de nucleótidos hasta la secuencia de nucleótidos entera menos un nucleótido. Una "eliminación", como se usa en la presente, se refiere a un cambio ya sea en la secuencia de aminoácidos o bien de nucleótidos en la cual uno o más residuos de aminoácidos o de nucleótidos, respectivamente, están ausentes. Una "inserción" o "adición", como se usa en la presente, se refiere a un cambio en una secuencia de aminoácidos o de nucleótidos que da como resultado la adición de uno o más residuos de aminoácidos o de nucleótidos, respectivamente, en comparación con la molécula como se encuentra de manera natural. Una "substitución" como se usa en la presente, se refiere al reemplazo de uno o más aminoácidos o nucleótidos por aminoácidos o nucleótidos diferentes, respectivamente. La presente invención proporciona la secuenciación y la clonación recombinante de dos de los principales antigenos de gametocitos de Eimeria máxima que tienen pesos moleculares de 56 y de 82 kDa. La presente invención también proporciona la expresión de estos antigenos recombinantes en un sistema de expresión de E. colx usando el plásmido pTrcHis . La presente invención también proporciona una vacuna contra coccidiosis que comprende el antigeno recombinante de 56 kDa. Además, la presente invención proporciona una vacuna contra coccidiosis que comprende ¦ el antigeno recombinante de 82 kDa. La presente invención proporciona la secuenciación y la clonación de dos de los principales antigenos de gametocitos de Eimeria máxima que tienen pesos moleculares de 56 y de 82 kDa. La producción de gametocitos fue aumentada a fin de aislar suficiente antigeno de gametocito para llevar a cabo la secuenciación de los aminoácidos (es decir, cantidades en miligramos de los antigenos específicos) en las glicoproteínas de 56 y de 82 kDa mismas. Esta producción en mayor escala fue en si misma una tarea muy difícil, y requirió infectar varios miles de pollos a fin de proporcionar suficiente material para llevar a cabo el análisis de la secuencia. Después de lograr este objetivo, fue posible producir suficiente antigeno de gametocito purificado por afinidad (APGA) para comenzar a aislar las dos glicoproteínas en gran escala. Las glicoproteínas antigénicas de gametocito purificadas se separaron por electroforesis sobre gel de poliacrilamida SDS, bidimensional . Después del análisis de los geles bidimensionales por tinción, la posición de los antxgenos de 56 y de 82 kDa se determinó por transferencia a un filtro membrana de PVDF e inmunodetección usando antisuero para APGA. Después de identificación y de remoción de los antxgenos de 56 y de 82 kDa del filtro, se efectuó la secuenciación de los aminoácidos tanto de su N-termini como también de las secuencias de la proteína interna obtenida de péptidos trípticos. Estas secuencias de péptidos se usaron para predecir las secuencias de DNA, se sintetizaron con base en las sondas de oligonucleótidos específicos, pequeños. Las sondas de oligonucleótidos específicos se usaron en RACE PCR (amplificación rápida de extremos de cDNA) para preparar moléculas de cDNA del KNA de gametocito que codifican a los antigenos de 56 y de 82 kDa. Este método permitió la producción de moléculas de cDNA de extensión total que son específicamente amplificadas de moléculas de mRNA que contienen en ellas secuencias de RNA que codifican a los péptidos deseados. Estos productos de cDNA fueron entonces secuenciados totalmente y se confirmó la presencia de varios de los péptidos secuenciados anteriormente. Sorprendentemente, se encontró que se obtuvieron clones de cDNA no relacionados con los descritos en Wallach y colaboradores, Patente EUA No. 5,932,225. Por consiguiente, parece que en Wallach y colaboradores, se encontraron partículas aberrantes al cribar la biblioteca de cDNA con anticuerpos y se pensó que los clones codificaban a los antígenos de 56 y de 82 kDa los cuales fueron aislados, de hecho no codifican a estos antígenos. Finalmente los dos clones de cDNA nuevos se usaron como una sonda en experimentos de manchado Southern y Northern para identificar a los genes y moléculas de mRNA específicas que codifican para los antígenos de 56 y de 82 kDa. Aunque previamente no estuvo claro que podían obtenerse patrones en banda sobre las manchas (Patente EUA ??. 5,932,225) se distinguieron claramente el número y el tamaño de los fragmentos de gen y de los transcriptos de mRNA que codifican .para los dos antígenos.

La presente invención proporciona adicionalmente un método para clonar los antigenos de 56 y de 82 kDa en un vector de expresión bacteriana, pTrcHis, que contenga un poli is tag (para ayudar en la purificación de los antigenos recombinantes) . Los dos genes se expresaron entonces en ?. coli al añadir una molécula inductora específica (isopropil-a-D-tiogalactosida) , seguido por la identificación de las proteínas antigénicas recombinantes de 56 y de 82 kDa por medio de manchado Western. Los resultados de estos manchados mostraron que los antígenos recombinantes de 56 y de 82 kDa tuvieron el tamaño correcto con base en las mediciones de espectrometría de masa, y se reconocieron por los anticuerpos en el his tag así como también el aumento del anticuerpo protector contra antígenos de gametocito de 56 y de 82 kDa nativos. Estos resultados confirmaron la identidad de los clones y mostraron que estos antígenos recombinantes pueden usarse para reemplazar a los antígenos nativos en las vacunas con base materna contra coccidiosis en pollos. La presente invención describe adicionalmente la relación entre el antígeno de gametocito de 56 kDa con una proteína de oocisto de 30 kDa. Esta proteína de oocisto se mostró, por inmunomanchado, para reaccionar fuertemente con antisuero contra los antígenos de gametocitos ' de 56 y de 82 kDa. Al ordenar las secuencias el amino terminus de la protelna de 30 kDa, se encontró que tuvo una pareja precisa con el amino terminus del antigeno de 56 kDa. Por consiguiente, se concluyó que el antigeno de 56 kDa se procesó durante el desarrollo de oocistos de gametocitos en la proteína de 30 kDa. Esta invención se ilustra adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos, los cuales no se construyen a modo que sean limitantes . Un experto en la materia apreciará fácilmente que los métodos y resultados específicos discutidos son meramente ilustrativos de la invención, que se describe más completamente en las reivindicaciones que siguen posteriormente. DETALLES EXPERIMENTALES EJEMPLO 1 Purificación en Gran Escala de Gametocitos de Eimerla máxima A fin de producir muy grandes cantidades de gametocitos, 4,000 pollos de reproducción abundante se infectaron con 10,000 oocistos de E. máxima esporulados, y fueron sacrificados en el día seis (aproximadamente 134 horas) post infección . Se removieron los intestinos de los pollos, se lavaron con PBS y se abrieron en corte longitudinalmente. Se cortaron entonces en piezas de 1 cm de largo y se colocaron en una solución regulada con SAC (170 mi de NaCl, 10 mM de Tris pH 7, 10 mM de glucosa, 5 mM de CaCl2, 1 % de leche en polvo) que contenia 0.5 mg/ml de hialuronidasa (Tipo III de Sigma, 700 unidades/mg) . Las piezas de intestino se incubaron a 37 °C por 20 minutos después de los cuales se colocaron en la parte superior de un filtro de gaza. Las piezas se enjuagaron con grandes cantidades de regulador SAC y se colectó el filtrado resultante. Este se filtró entonces a través de un filtro Polymon de 17 micrones (Swiss Silk Bolting Cloth Mfg. Co. Ltd., Zurich, Suiza) y el filtrado resultante se filtró entonces a través de un filtro de 10 micrones. Se colectaron los gametocitos de la parte superior del filtro de 10 micrones, se examinaron y contaron microscópicamente, y se colocaron en botellas de centrifuga, en donde se giraron a 800 (xg) por 10 minutos. Los gametocitos fueron entonces lavados con regulador SAC, y se congelaron a -70 °C. EJEMPLO 2 Purificación de los antígenos de gametocitos de 56, 82 y 230 kDa Se descongelaron a temperatura ambiente los gametocitos congelados y se extrajeron las proteínas como se describió previamente (Wallach 1995) . Se aislaron del extracto de proteína, los antígenos de gametocito de 56 y de 82 kDa, corriéndolo sobre una columna Sepharose 4B que contenía el anticuerpo monoclonal 1E11-11 producido contra el antlgeno de 56 kDa. Un complejo de loas antigenos de gametocito se dejaron enlazar al anticuerpo monoclonal fijado a la resina, el material no especifico se separó por lavado usando regulador, y los antigenos de gametocito purificados por afinidad (APGA) fueron eluidos de la columna. Se liofilizaron los APGA. Se analizó una pequeña muestra de APGA por SDS-PAGE en donde se visualizaron claramente los antigenos de 56 y de 82 kDa nativos (Figura 1) · EJEMPLO 3 Electroforesis sobre Gel Bidimensional de APGA. y Aislamiento de los Principales Antígenos de 56 y de 82 kDa. Se aislaron desde APGA los antigenos de gametocito de 56 y de 82 kDa. Se preparó APGA liofilizado como se describe en el Ejemplo 2, y se solubilizó en agua. Se separaron entonces las proteínas por SDS-PAGE bidimensional (Figura 2) , y se identificaron por inmunomanchado usando un anticuerpo anti-APGA pol'iclonal de pollo, el cual reconoce ambas proteínas de 56 y de 82 kDa. Una vez identificado y establecida su localización sobre geles de SDS-PAGE bidimensional, las proteínas se transfirieron entonces a un filtro de membrana de PVDF, y se tiñó con Azul de Coomassie (Figura 3) . Se llevó a cabo el inmunomanchado al mismo tiempo, y se compararon las dos manchas para identificar claramente las proteínas de 56 y de 82 kDa. Se cortaron de las membranas las manchas correspondientes a los antigenos de gametocitos de 56 y de 82 kDa, secuenciaron los amino-terminus de cada antigeno. EJEMPLO 4 Secuenciación de Aminoácidos del Amino-terminus así como también de Péptidos Trípticos Internos de los Antígenos de 56 y de 82 kDa Se secuenció el amino-termini de las proteínas de 56 y de 82 kDa: amino-terminus de la proteína de 56 kDa: VPSTTPVENQVHPY-EM (SEC ID NO: 7) amino-terminus de la proteína de 82 kDa: -PTVLDTTTG-QVEDT (SEC ID NO: 8) A fin de determinar la secuencia de la proteína de fragmentos del tríptico interno de las proteínas de 56 y de 82 kDa, la preparación de APGA se separó primero por SDS-PAGE monodimensional y se tiñó con Azul de Coomassie. Las proteínas se extirparon entonces de los geles y se digirieron con tripsina y se secuenciaron. Se obtuvieron varias secuencias de péptido tríptico desde ambas proteínas y los resultados se resumen en la Tabla 1.

Tabla 1 : Secuencias de Aminoácidos de Péptidos Trípticos Aislados desde los Antígenos de 56 y de 82 kDa. I Las secuencias de aminoácidos obtenidas no mostraron cualquier homología con cualquier proteína conocida. EJEMPLO 5 Clonación por RACE PCR y Secuenciación de los genes que codifican a los antígenos de 56 y de 82 kDa Los genes para las proteínas de 56 y de 82 kDa se amplificaron desde cDNA de gametocitos usando la tecnología de SMART RACE PCR (Clonentech) . Se aisló el RNA de gametocitos de E. máxima y se purificó el mR A usando perlas de Dynal (Dynal) . Se sintetizó el cDNA leido por SMART, siguiendo los protocolos de conformidad con las instrucciones del fabricante usando la transcriptasa inversa Powerscript (Clonentech) . Se llevaron a cabo las amplificaciones de ambos extremos 5' y 3f , usando los protocolos descritos en el manual de SMART RACE PCR, y la DNA polimerasa, Advantage Taq (Clonentech) , una mezcla enzimática de alta fidelidad. Se aislaron los gametocitos de los intestinos de los pollos, se filtraron un número de veces y se lavaron a fondo como se describió en el Ejemplo 1. Hubo un grupo en el que el material intestinal de pollo residual estuvo aún presente en esta preparación. Consecuentemente, se llevaron a cabo las PCRs usando cebadores degenerados designados en el amino-terminus de los genes de 56 y de 82 kDa y los cebadores degenerados designados en los fragmentos de péptido tríptico interno dieron origen a bandas en ambas muestras de cDNA preparadas desde gametocitos purificados y células de pollos no infectadas . En esta situación se purificaron, se clonaron en pGEMT-Easy (Promega) y se secuenciaron (servicio de secuenciación de SUPAMAC, Sydney, (Australia) , las bandas de PCR, que se mancharon intensamente con bromuro de etidio sobre gel de agarosa. En algunos casos cuando se observaron re-arreglos o el fragmento clonado fue difícil de secuenciar, se obtuvo la secuencia directamente del producto de PCR. Si los datos de la secuencia de DNA del producto de PCR trasladados a cualquiera de la secuencia de aminoácidos de los péptidos trípticos, el producto de PCR fue de origen parásito y se continuó la secuenciacion.

La secuencia de extensión total de las proteínas de 56 y de 82 kDa se muestran en las Figuras 4 y 5, respectivamente. La secuencia de extensión total de la proteína de 230 kDa se presenta en la Figura 12. La secuencia de aminoácidos de los péptidos trípticos y N-terminus del antígeno del gametocito de 56 empare ado con la secuencia de aminoácidos deducida dio origen al DNA clonado correspondiente. Se secuenciaron nueve péptidos trípticos para la proteína de 56 kDa (Tabla 1) . Todos los péptidos pero uno, sb56i, podría mapearse en el gen clonado correspondiente a la proteína de 56 kDa (Figura 4) . Este fragmento tríptico puede corresponder a una banda contaminante presente en la muestra. En detalle: - Los péptidos trípticos sb56a, sb56b, sb56c, sb56d, sb56f y sb56h emparejaron precisamente a la secuencia de aminoácidos deducida predicha por el DNA clonado. - El péptido tríptico sb56g no emparejó precisamente con la secuencia de aminoácidos deducida predicha por el DNA clonado. La secuencia del fragmento tríptico se reanalizó, y la nueva secuencia emparejó más estrechamente con la secuencia predicha derivada del DNA clonado. Secuencia original del fragmento tríptico sb56g: RQ-TAAWMDR-TA[L/IjEQEETT (SEC ID NO: 23) Secuencia de sb56g reanalizada: RGVQTAAWMDGVTA I EKEET (SEC ID NO: 24) Secuencia aa deducida de DNA: RGVQTAAWMNGVTA I EKEETT (SEC ID NO: 25) Aún permanece una discrepancia en este péptido en el aminoácido 10, en donde la secuencia de la proteína revela una D y la secuencia del DNA predicha una N. Este segmento de DNA fue secuenciado 4 veces, y cada vez predijo una N.

La secuencia de aminoácidos de los péptidos trípticos y N-terminus del antígeno del gametocito de 82 empare ó con la secuencia de aminoácidos predicha que se originó del DNA clonado correspondiente. Se secuenciaron siete péptidos trípticos para la proteína de 82 kDa (Tabla 1} . Todos los péptidos pero dos, sb82d y sb82e podrían ser mapeados en el gen clonado correspondiente a la proteína de 82 kDa. este fragmento tríptico puede corresponder a una banda contaminante presente en la muestra. En detalle: - Los péptidos trípticos sb82a, sb82b, sb82c, sb56d y sb82f emparejaron precisamente con la secuencia de aminoácidos deducida predicha por el DNA clonado. - Los péptidos trípticos* sbS2d y sb82e no emparejaron con la secuencia de aminoácidos deducida predicha por el DISTA clonado. Además de la información de la secuencia descrita anteriormente: 1) El tamaño predicho de la ORF que codifica a la forma madura de la proteina de 82 kDa es 64,275 Da, lo que corresponde al tamaño verdadero de la proteína nativa de 62,236 Da, como se determinó por espectrometría de masa. 2) El tamaño predicho de la ORF que codifica a la forma madura de la proteína de 56 kDa es 51,407 Da, lo cual correspondió al tamaño verdadero de la proteína nativa de 52,450 Da, como se determinó por espectrometría de masa. Finalmente, las dos proteínas y secuencias de DNA no mostraron homología con cualquier otro gen o proteína conocidos . EJEMPLO 6 Manchados Northern y Southern usando las Sondas Clonadas de cDNA de 56 y de 82 kDa. Se llevó a cabo el manchado Southern usando E. Máxima y DNA de pollo cortando primero el DNA con una variedad de enzimas de restricción y separando los fragmentos de DNA resultantes sobre un gel de agarosa. Esto es seguido por transferir el DNA a papel de nitrocelulosa, sondeando con una sonda de cDNA marcada con P32 para los antlgenos de 56 (Figura 6) o 82 (Figura 7) kDa y efectuando la autoradiografia . Los resultados mostraron que para ambos, los antigenos de 56 y de 82 kDa parecieron ser dos diferentes, genes copias únicas, que codificaron a las dos proteínas . Se llevó a cabo el manchado Northern usando E. máxima y RNA de pollo, separando las moléculas de RNA sobre un gel de agarosa, transfiriendo a un filtro de nitrocelulosa y sondeando con los clones de cDNA de 56 y de 82 marcados con P32. los resultados mostraron que el mRNA de 56 kDa tiene un peso molecular de aproximadamente 1.9 KB y el mRNA de 82 kDa tuvo un peso molecular de aproximadamente 2.4 KB (Figura 8). Estos tamaños son muy similares a los predichos desde las secuencias de DNA. EJEMPLO 7 Expresión de los Antígenos Recombinantes de 56 y de 82 kDa, usando el Vector pTrcHis en E. coli y su Análisis usando Suero contra APGA Nativo. El gen de extensión total que codifica a la proteina de 82 kDa, fue amplificado desde cDNA de gametocito de E. Máxima usando cebadores específicos del gen que lleva sitios de restricción terminal para facilitar la clonación direccional en el vector de expresión pTRCHisb (Invitrogen) . El gen de extensión total incluyó la región codificadora del amino-terminus de la proteina madura y la secuencia hasta, pero no incluyendo, el codón de detención (575 aa) . Un fragmento parcial del gen que codifica a la proteina de 56 kDa se amplificó desde cDNA de gametocitos de E. Máxima usando cebadores específicos del gen que lleva sitios de restricción N-terminales . Esto incluyó el amino-terminus de la proteína y unos 323 aminoácidos adicionales de la secuencia, 133 aminoácidos más cortos que la proteína madura de extensión total . Ambos genes fueron clonados en el vector pTrcHisb disponible comercialmente (Invitrogen) . 1) Expresión del gen de 56 kDa en pTxcHis B Se indujeron bacterias transformadas con lmM de IPTG, y los lasados bacterianos se analizaron por 1D-SDS PAGE y se inmunomancharon (Figura 9) .Un anticuerpo anti-His disponible comercialmente para la fusión de His con tag de la proteína recombinante reconoció una banda del tamaño predicho de 40 kDa (este clon carece de región codificadora para 133 aminoácidos) bajo condiciones de inducción. Bajo condiciones no inducidas hubo también un bajo nivel de reactividad con esta banda, indicando que hay algún grado de filtrabilidad del gen de expresión. El reconocimiento de .la proteína recombinante de 56 kDa, fue entonces evaluado por inmunomanchado con en anticuerpo anti-APGA policlonal de pollo. El inmunomanchado mostró que el anticuerpo anti-APGA reconoció a la forma nativa de la proteína por medio de un SDS PAGE monodimensional, así como también a la proteína recombinante, que demostró claramente que el producto genético clonado realmente codifica para la proteína de 56 kDa. 2) Expresión del gen de 82 kDa en pTrcHis B Se indujeron bacterias transformadas con 1 mM de IPTG, y se analizaron los lasados bacterianos por medio de SDS PAGE monodimensional e inmunomanchado (Figura 10) . Un anticuerpo anti-His disponible comercialmente para la fusión de His a tag de la proteína recombinante reconoció una banda del tamaño predicho de 82 kDa bajo condiciones de inducción y de no inducción. El reconocimiento de la proteína de 82 kDa fue entonces evaluado por medio de inmunomanchado con el anticuerpo anti-APGA policlonal de pollo. Este anticuerpo fue producido por pollos inmunizados con APGA nativo aislado desde gametocitos purificados. El inmunomanchado mostró que el anticuerpo anti-APGA reconoció a la forma nativa de la proteína por medio de ID SDS-PAGE, así como también de la proteína recombinante, lo que demostró claramente que el producto genético clonado realmente codifica para la proteína de 82 kDa. Con base en los resultados anteriores junto con el análisis de secuencio descrito en el Ejemplo 5, se concluye que los dos clones de cDNA descritos anteriormente son los genes auténticos que codifican para los antigenos de 82 kDa. Además, la fuerte reactividad con el antisuero cultivado contra los antigenos nativos mostró que estas proteínas recombinantes pueden ahora ser usadas para reemplazar a APGA para la inmunización de pollos contra coccidiosis. EJEMPLO 8 Homología del Antígeno de 56 kPa con un Antígeno de 30 kDa de oocistos de E. máxima Los anticuerpos para APGA fueron usados para detectar proteínas homologas sobre un manchado bidimensional de antígenos de oocisto. Se encontró que hubo muy fuerte reactividad con una proteína de 30 kDa (Figura 11) . Esta mancha se cortó del filtro membrana y se secuenció el N-terminus de la proteína. La secuencia de aminoácidos resultante correspondió precisamente a la secuencia N-terminal del antígeno de 56 kDa del gametocito. Con base en este descubrimiento se concluye que el antígeno de 56 kDa del gametocito es procesado en la proteína de 30 kDa de la etapa de desarrollo del oocisto. EJEMPLO 9 Expresión de gam 56, un Antígeno de Gametocito de 56 kDa de Eimer a máxima Proteína nativa: Mr 56,000 (tamaño determinado por calibración molecular (MS) : 52,450 Da) Fuente: Parásito: Eimeria máxima Etapa del ciclo de vida: macrogametocito Gen: 1,754 pares de base secuenciados presentados sobre 5 fragmentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , todos los cuales fueron clonados en pGEMT-Easy, excepto por al menos ~ 600 pared de bases del gen, los cuales incluyen ~ 400 pares de bases de la región codificadora. 5'UTR (1-102 pares de bases) ORF (103-1, 533 pares de bases) 3'UTR (1,534-1,731 pares de bases) cola de poliA (1,732-1,754 pares de bases) pl: 4.8 predichos desde la secuencia (por 2D SDS-PAGE, la proteína migra hacia el extremo ácido del gel) Construcciones de Expresión Vectores de expresión usados: pTRCHisb, pET25b Construcción de expresión: p56TRCHisbl dado El fragmento del Gen que fue clonado en el vector de expresión gam 56, fue amplificado desde cDNA usando los pares de cebadores siguientes: SB74/SB75 (172-1137 pb) por clonación direccional en el sitio BamHI/EcoRI de TRCHisb. La región amplificada contiene la secuencia que codifica al amino terminus de la proteína madura, que excluye la metionina iniciadora y la secuencia líder. Contiene una región rica en tirosina-serina y excluye una región rica en prolina-metionina . La composición de aminoácidos del fragmento de gam 56 clonado : 2 cisternas presentes en la composición del aminoácido del fragmento del gen clonado en pTRCHisb: S (12.7%) Y(11.5%) A(8.7%) T(8.4%) P(7.2%) R( 6.6%)E( 6.0%) M(5.5%) L(5.5%) V{4.6%) Q( 4.3 )N(4.3%) G(3.8%) D(3.5%) W(1.7%) F( 1.4%)K(1.4%) 1(1.4%) H(0.9%) C(0.6%) Tamaño predicho de la proteína: 41 kDa Rendimiento: 0.9 - 1.4 µg/ml (proteína purificada sobre agarosa níquel/ml de cultivo) Dificultad para ser ver la proteína predicha en lisado de bacterias crudo sobre un gel teñido con Azul de Coomassie. Condiciones de Expresión: El promotor es filtrable, por consiguiente puede expresarse en ausencia de IPTG. Se usaron matraces de desviación, 37 °C, inducción de 4 horas, con 1 mM de IPTG, 0.1 mg/ml de ampicilina en Mg2+SOB 0.01 M (SOB mejor que LB) . Normalmente, una banda predominante a ~ 42 kDa es obtenida después de purificación y detección con tinción de plata. A menudo algunas bandas de peso molecular más alto, la cual puede ser agregada, son obtenidas después de purificación asi como también la banda principal de ~ 42 kDa. La proteina parece ser agregada a - 20 °C y 4 °C; después de purificación se desaló y se añadió estabilizante (3 % de lactosa, 1 % de glutamato monosódico) . EJEMPLO 10 Inmunización y Prueba de Estimulación de los Antígenos de Gametocitos Recombinantes de 56 kDa (r56) y de 82 kDa (r82) , y el Antígeno de la Etapa Sexual de 250 kDa (r250) en Pollos INMUNIZACION Animales Pollos: - gallitos Australorp de 84 días de edad (~ 12 semanas) - conservados con alimento medicado (robenideno) - todos los pollos fueron marcados y registrados individualmente Antigenos Las proteínas recombinantes en el sistema de expresión pTRCHisb fueron desarrolladas a 37 °C en 0.1 mg/ml de ampicilina en Mg2+S0B 0.01 M e inducidas por 4 horas con 1 m de IPTG. Las proteínas fueron purificadas sobre una columna de Ni-agarosa, se concentraron, se desalaron, y se liofilizaron con estabilizador (lactosa al 3 %, glutamato monosódíco al 1 %} . Las concentraciones de las proteínas usadas fueron para todos los antígenos medidas usando el ensayo de Bradford. Se usaron las preparaciones del antígeno de Gametocito Purificado por Afinidad (APGA) proporcionadas por M. Wallach como un control positivo para la prueba Grupos y Dosis - Se usaron 9 pollos por grupo; 9 grupos en total; se usaron 81 pollos en total. Los pollos fueron inmunizados con 0.5 mi de antígeno/coctel de Antígeno Incompleto de Freunds (FIA) (0.25 mi de antígeno/0.25 de FIA por ave, intramuscularmente, solamente en un lado del pollo con los siguientes antígenos: Grupo 1, solamente PBS Grupo 2, Adyuvante de (FIA) /PBS Grupo 3, APGA (2.5 g) Grupo 4, proteína r250 (1.0 g) Grupo 5, proteína r250 (10.0 g) Grupo 6, proteína r56 (0.5 g) Grupo 7, proteína r56 (5.0 g) Grupo 8, proteína r82 (0.5 g) Grupo 9, proteína r82 (5.0 g) Programa de Inmunización Inmunización 1: semana 1 Inmunización 2: semana 3 Sangrado: semana 6 Sangrado: semana 8 Sangrado/Muerte: semana 9 Análisis - Se tomaron los sangrados (~ 1.5 - 2 mi/ave) , se separó el suero y se examinó por ELISA e xnmunomanchado Resultados Los resultados de los sangrados se muestran en la Figura 14. ESTIMULACION Animales y parásitos - se usaron 5 pollos (de 148 dias de edad; ~ 4.5 meses) de cada grupo que tuvo el titulo de anticuerpo más alto con base en los resultados de ELISA del sangrado 1; en el caso de los controles con PBS y FIA, se usaron los pollos con el titulo más bajo - E. máxima (cepa Houghton) ; - se retiró el robenideno de la alimentación y una semana antes de la estimulación Grupos Se tomaron los grupos y pollos siguientes del ensayo de inmunización descrito anteriormente, y se usaron en los experimentos de comparación Grupo 1 solamente PBS pollos números 2, 3, 4, 6, 8 Grupo 2 adyuvante de (FIA) /PBS) pollos números 12-16 Grupo 3 APGA (2.5 g) pollos números 20, 22, 23, 25, 27 Grupo 5 proteina r250 (10.0 g) pollos números 37, 39, 41, 44, 45 Grupo 7 proteína r56 (5.0 g) pollos números 57, 59, 60, 61 63 Grupo 9 proteína r82 (5.0 g) pollos números 74, 75, 76, 79, 80 Programa de Estimulación Se retiró el robenideno Se estimularon con 100 oocistos esporulados por ave día 6 Cosecha de oocistos y programa de conteo Día 0 post-infección Día 1 post-infección Día 2 post-infección Día 3 post-infección Día 4 post-infección Se verificó la salida de oocistos por contaminación de otras especies Se reemplazaron las hojas plásticas al comenzar las colecciones . Día 5 post-infección se colectaron las heces, y se contaron los oocistos Día 6 post-infección se colectaron las heces, y se contaron los oocistos Día 7 post-infección se colectaron las heces, y se contaron los oocistos Día 8 post-infección se colectaron las heces, y se contaron los oocistos Día 9 post-infección se colectaron las heces, y se contaron los oocistos Día 10 post-infección se colectaron las heces, y se contaron los oocistos Tabla 2. Ensayo de Inmunización y de Estimulación I Grupos/Día Conteo acumulado de i.p oocistos (x 106) 6 7 8 9 10 1. solamente 6.67 17.0 26.4 27.3 27.4 PBS 0 0 ' 3 3 2. solamente 3.2 14.4 17.3 17.5 17.5 FIA 0 0 0 0 3.APGA 2.77 9.35 13.4 13.5 13.6 (2.5 µg) 8 8 1 5.r250 0.83 8.35 13.7 14.7 14.7 (10 µg) 2 2 2 7.R56 0.33 4.53 7.20 8.16 8.53 (5 µ?) 9.r82 4.23 10.3 14.7 14.9 15.0 (5 g] 3 3 3 6 Tabla 2. Ensayo de Inmunización y de Estimulación I (Continuación) Grupos/Dia Salida i -p (%) 6 7 8 9 10 1. solamente 100 100 100 100 100 PBS 2. solamente 48 85 66 64 64 FIA (100) (100) (100) (100) (100) 3.APGA 42 55 51 50 50 (2.5 µg) (87) (65) (78) (78) (78) 5.r250 12 49 52 54 54 (10 µg) (26) (58) (79) (84) (84) 7.R56 5 27 27 30 31 (5 µg) (10) (32) (42) (47) (49) 9.r82 63 61 56 55 55 (5 µg) (132) (85) Tabla 2. Ensayo de Inmunización y de Estimulación I (Continuación) EJEMPLO 11 Expresión de un Fragmento Recombinante de la Proteína de la Etapa Sexual de 250 kDa La región de la proteina de 250 kDa que codifica a la región transmembrana predicha/cola citosólica y la región idrofilica, desde el extremo carboxi libre hacia el extremo amino libre de la cadena del polipéptido, fue seleccionada para estudios de expresión (Figura 15) . El área fue seleccionada por numerosas razones y son como sigue: 1) se identificaron regiones de la cola hidrofilica 3' similar en numerosas proteínas de apicomplexan micronema y parece única para esta familia de proteínas; 2) se han identificado dichas regiones en otras proteínas de micronema también reconocidas como inmunodominantes, primeramente la proteína 1 de micronema de Eimeria tenella (EtMICl) y el antígeno de superficie 5401 (EtMIC4) ; 3) una región similar fue expresada desde el antígeno 5401 de E. tenella (EtMIC4) y se encontró que dió como resultado protección significativa contra la estimulación con E. Tenella (Danforth y colaboradores, 1988); 4) otras regiones de la proteína consisten primeramente de las regiones similar a EGF y similar a TSP-1.Estos tipos de regiones se encuentran muy conservadas en eucariotas y por consiguiente debe de considerarse la posibilidad de inducir su autoinmunidad. Además a causa de la prevalescencia de dichos tipos de regiones parece improbable que fueran responsables de inducir una fuerte respuesta inmune. Se diseñaron los cebadores de PCR EP006 (5r~ TTGGATCCCGAATTGCACCCCA TTCC-3') y EP007 (5'- TTGAATTCTGAATGTCGCCGCTGTCG-3' ) para amplificar la región de DNA seleccionada desde un clon de cDNA que codifica a la proteina de 250 kDa. Los cebadores incorporaron .los sitios de restricción BamHI (EP006) y EcoRI (EP007) para facilitar la clonación en el vector de expresión seleccionado. El producto de PCR generado subsecuentemente usando los cebadores fue pruificado sobre gel y se confirmó su identidad por secuenciación. El vector de expresión bacteriana pTrcHisB (Invitrogen) fue seleccionado para estudios de expresión. El DNA del vector plásmido y el inserto de cDNA purificado sobre gel fueron digeridos con las enzimas de restricción BamHI y EcoRI, y los fragmentos de DNA se digirieron, se purificaron sobre gel y se ligaron. La mezcla de ligación se transformó en la cepa DH5-a de B. coli y después se plaqueó e incubó, las colonias resultantes fueron seleccionadas, cultivadas y usadas para la preparación del plásmido. Se confirmó la identidad de los recombinantes seleccionados por secuenciación del DNA. En la preparación para expresión, el DNA del plásmido que contenia la construcción de expresión se transformó en la cepa de expresión huésped de E. coli TOP10. Después del plaqueo e incubación se seleccionó una colonia bacteriana única y se usó para establecer un cultivo O/N en medio LB. Se estableció también un vector únicamente como cultivo control negativo . Se- transfirieron alícuotas de · cada cultivo a medio de LB recientemente preparado y se incubaron hasta que las células alcanzaron la fase media-logarítmica, en dicha etapa se indujo la expresión con la adición de 1 mM de IPTG. Se tomaron muestras del cultivo de expresión y del cultivo control negativo a 0, 1, 2, 5 y 24 horas post-inducción, y se centrifugaron para compactar las células bacterianas . Todos los compactados fueron subsecuentemente resuspendldos en regulador de TE, se sonicaron y se centrifugaron para separar la fracción acuosa soluble (sobrenadante) de la fracción insoluble (compactado) . Todas las fracciones fueron analizadas bajo condiciones reductoras sobre geles SDS-PAGE y subsecuentemente se tiñeron con Azul de Coomassie. Cuando se compararon con las muestras control negativo, se detectó una proteína sobre-expresada en las fracciones solubles, que migraron justo abajo del marcador de 45 kDa. El análisis Western de las fracciones solubles usando un anticuerpo reactivo con el marcador 6xHistidina de los productos de expresión pTrcHis, detectó una banda de proteína del mismo peso molecular aparente. El tamaño predicho de la proteína de expresión es aproximadamente 30 kDa, algo menos que el observado sobre los geles SDS-PAGE. La diferencia de tamaño debe de explicarse por la alta frecuencia de los residuos prolina · en la proteína expresada, conocida por causar que las proteínas migren con aparentemente alto peso molecular. En la preparación para ensayos de inmunogenicidad, se purificó la proteína expresada usando la resina cargada con Níquel Agarosa Ni-NTA (QIAGEN) , con modificaciones menores en el protocolo recomendado por el fabricante. Se expresaron las proteínas que contenían el marcador 6xHis enlazado a la resina y se desplazaron por medio de una concentración creciente de imidazol en el regulador de elución. Abreviando, los compactados celulares fueron resuspendidos en regulador de Lisis (50 mM de Na¾PC>4 , 300-mM de NaCl, 10 mM de imidazol, pH 8.0), que contenía 1 mg/ml de lisozima. La suspensión se sónico sobre hielo y se centrifugó para compactar el material insoluble. El sobrenadante que contenía la proteína soluble expresada se mezcló entonces con la resina Ni-NTA y se añadió a una columna de elución desechable. La suspensión se dejó sedimentar luego se lavó con el regulador de Lavado (50 mM de Na¾P04, 300 mM de NaCl, 20 mM de imidazol, pH 8.0), antes de elución con el regulador de elución (50 mM de Na¾P04, 300 mM de NaCl, 250 mM de imidazol, pH 8.0. Se analizó la pureza de las fracciones eluidas por medio de la reducción con SDS-PAGE y tinción con Azul de Coomassie.

Los detalles para los ensayos de inmunogenicidad son como para los ensayos de 56 kDa y de 82 kDa. Para el ensayo con ratones, se usaron dosis de 0.5 µg y de 5 g de la proteina recombinante por ratón (6 ratones por grupo) . Para el ensayo con pollos, se usaron dosis de 1 µg y de 10 µg por ave (9 pollos por grupo) . Los resultados de ELISA para las muestras de suero colectadas de los ensayos con ratones y con pollos se presentan en las Figuras 16 y 17 respectivamente. EJEMPLO 12 La Pared del Oocisto de Eimerla se Deriva de las Proteínas Precursoras Encontradas en la Etapa Sexual del Parásito (macrogametocito) , el cual se Sometió a Procesamiento y a la Reticulación di-tirosina para Formar la Barrera Protectora, Endurecida de la Forma Excretada del Parásito. Los genes que codifican a los antígenos de macrogametocito, etapa sexual de 56 kDa y de 82 kDa se clonaron y se secuenciaron. Ambos genes mostraron una composición de aminoácidos inusual, y en particular, ambos tuvieron regiones ricas en tirosina; la proteína de 56 kDa posee una región rica en tirosina y la proteína de 82 kDa posee dos regiones ricas en tirosina. Las proteínas ricas en tirosina han sido implicadas previamente en la formación de la pared del oocisto en E. acervnlina y E. tenella. (Eschenbacher y colaboradores) . Así, el papel de la región rica en tirosina en los antígenos de la etapa sexual de 56 kDa y de 82 kDa en la formación de la pared del oocisto se exploró en Eimeria máxima. Los anticuerpos para la forma recombinante de la proteína de 56 kDa (anti-r56) y los anticuerpos para la forma recombinante de la proteína de 82 kDa (anti-r82) reconocen a una proteína de ~ 30 kDa en oocistos esporulados y no esporulados, y a una proteína de ~ 30 kDa en fragmentos de pared purificados (ver las Figuras 18 y 19) . También reconoce su contraparte de la forma nativa en extractos de gametocitos. La proteína de ~ 30 kDa reconocida en fragmentos de pared de oocistos purificadas por el anticuerpo anti-r82 kDa no es la misma que la proteína de ~ 30 kDa reconocida por el anti-r56; es ligeramente más pequeña. La proteína de ~ 30 kDa reconocida por el anticuerpo anti-r56 fue purificada y el N-terminus fue secuenciado. El N-terminus de la proteína de ~ 30 kDa corresponde exactamente al N-terminus del antígeno de gametocito de 56 kDa (ver la Figura 20a) . Otros han mostrado por medio de SDS-PAGE y tinción con Azul de Coomassie que la pared del oocisto de Eimeria está compuesta de dos proteínas predominantes de 14 kDa y 30 kDa. Usando mejores técnicas de separación de SDS-PAGE, se resolvió que la proteina de 14 kDa en tres componentes de ~ 10-14 kDa, se les nombró 14.1, 14.2 y 14.3, en donde 14.1 representa la proteina que ha migrado más lentamente sobre los geles de SDS-PAGE, y 14.3 las más rápidas (ver la Figura 18c). Se secuenció el N-terminus de las cuatro proteínas y se presentan los resultados en la Figura 20. En resumen, la proteína de 30 kDa es una nueva proteína que no muestra cualquier similaridad a cualquier otra proteína caracterizada previamente como se determinó a través de una búsqueda de proteína BLAST (ver la Figura 20c). El N-terminus de la proteína 14.3 corresponde al comienzo de la región rica en tirosina en la región 1 de la proteína de 82 kDa (ver la Figura 20b) , el N-terminus de la proteína 14.2 corresponde al comienzo de la región rica en tirosina de la región 2 de la proteína de 82 kDa (ver la Figura 20b), y el N-terminus de la proteína 14.1 corresponde al comienzo de la región rica en tirosina en la proteína de 56 kDa (ver la Figura 20a) . Junto a estos resultados se mostró que la pared de oocisto de Eimeria se deriva de las proteínas precursoras encontradas en los cuerpos formadores de pared de la etapa sexual (macrogametocito) del parásito. A través de algunos mecanismos de' señalamiento, son proteolíticamente procesados en varias proteínas más cortas de ~ 30 kDa y de ~ 14 kDa. Contrario a descubrimientos previos, nuestros datos indican que la pared de oocisto está compuesta de más de dos proteínas. Nuestro descubrimiento sugiere que la pared de oocisto está compuesta de varias proteínas presentes en diferentes niveles en el parásito, algunas de los cuales están en la alta abundancia que se reconoce por medio de la tinción con Azul de Coomassie de los geles de SDS PAGE, y otras que están presentes en niveles bajos, solamente detectadas a través de la técnica más sensible de inmunomanchado . La proteína de ~ 30 kDa vista en los geles de SDS-PAGE teñidos con Azul de Coomassie no está relacionada con los antígenos de gametocito de 56 kDa y de 82 kDa, no obstante, los antígenos de gametocito de 56 kDa y de 82 kDa, no obstante, las proteínas de ~ 10 - 14 kDa son más pequeñas. Se descubrió más recientemente que está presente di-tirosina a niveles detectables del orden de 0.00338 mmoles/mol en oocistos, que indican que las proteínas ricas en tirosina pequeñas son probablemente retenidas en la pared a través de un mecanismo que involucra la reticulación de la di-tirosina. No obstante se cree que no todas las proteínas son retenidas en la pared de esta manera y esto es actualmente investigado.

Referencias Eschenbacher, K. H. , Eggli, P. , Wallach, M. y Braun, R. (1995) Characterization of a 14 kDa oocysts wall protein of Eimeria tenella y E. acervulina, Parasitol., 112:169-176. Fried, M. , Mencher, D., Sar-Shalom, O., y Wallach, M. (1992) Developmental gene expression of a 230 - kilodalton macrogamete-specific protein of the avian coccidial parasite, Eimeria máxima. Mol. & Biochem. Parasitol., 51: 251 - 262. Mencher, D. , Pugatsch, T. y Wallach, M. (1989) Antigenic proteins of Eimeria máxima gametocytes: cell-free translation and detection with recovered chicken serum. Exp. Parasitol. 68: 40 - 48. Wallach, M., Pillemer, G-, Yarus, S., Halabi, A., Pugatsch, T. y Mencher, D. (1990) Passive immunization of chickens against Eimeria máxima infection with a monoclonal antibody developed against a gametocyte antigen. Infection & Immunity 58: 557-562. Wallach, M., Smith, N. C, Petracca, M., Miller, C.

M. D., Eckert, J. Braun, R. (1995) Eimeria máxima gametocyte antigens: potential use in a subunit maternal vaccine against coccidiosis in chickens. Vaccine, 13: 347-354. Wallach, M. y Vermeulen, A., (1996) Progress Towards a Subunit Vaccine Against Coccidiosis. Misset' s World Poultry, Supplement Coccidiosis (2) , 22-24.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un ácido nucleico aislado caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido de 56 kDa de Gametocitos de Eimeria máxima, o que codifica a un homólogo del polipéptido o a un complemento del ácido nucleico.

2. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como la SEC ID NO: 3. 3. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el homólogo del polipéptido tiene al menos 50 % de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como la SEC ID NO:

3.

4. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos tiene al menos 50 % de identidad con la secuencia de nucleótidos que comienza en el nucleótido No. 103 y termina en el nucleótido No. 1529 mostrada como la SEC ID NO: 1.

5. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico es una molécula de DNA.

6. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la molécula de DNA es una molécula de cDNA.

7. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico tiene la secuencia de nucleótidos mostrada como la SEC ID NO: 1.

8. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico es una molécula de RNA.

9. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque está operablemente unido a un promotor de la transcripción de KNA.

10. Un vector caracterizado porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1.

11. Un vector caracterizado porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 7.

12. El vector de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el vector es un plásmido.

13. El vector de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el vector es un plásmido.

14. Un plásmido caracterizado porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1.

15. El plásmido de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque se denomina plásmido 56TRCHisbl depositado bajo el No. de Acceso NM01/22400 de Australian Government Analytical Laboratories .

16. Una célula huésped caracterizada porque comprende el vector de conformidad con la reivindicación 10.

17. Una célula huésped caracterizada porque comprende el vector de conformidad con la reivindicación 12.

18. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque la célula es seleccionada del grupo que consiste de una célula bacteriana; una célula vegetal; una célula de insecto; y una célula de mamífero.

19. üna célula transformada caracterizada porqué comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1.

20. la célula transformada de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque se denomina clon bacteriano de 56TRCHisbl depositado bajo el No. de acceso NM01/22401 del Australian Government Analytical Laboratories .

21. La célula transformada de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque comprende adicionalmente un polipéptido de 56 kDa de Gametocitos de Eimeria máxima, o un homólogo del polipéptido.

22. Un método de producir un polipéptido recombinante de 56 kDa de Gametocitos de Eimeria máxima, el método está caracterizado porque comprende cultivar la célula transformada de conformidad con la reivindicación 19 y aislar el polipéptido recombinante de 56 kDa de Gametocitos de Eimeria máxima.

23. Un polipéptido recombinante caracterizado porque es producido por medio del método de conformidad con la reivindicación 22.

24. Una proteina de 30 kDa de gametocitos de Eimeria máxima caracterizada porque tiene en el extremo N-terminal la secuencia de aminoácidos mostrada como la SEC ID NO: 35.

25. Una proteina de 30 kDa de gametocitos de Eimeria máxima caracterizada porque tiene en el extremo N-terminal la secuencia de aminoácidos mostrada como la SEC ID NO: 42.

26. Una proteina de 14 kDa de gametocitos de Eimeria máxima caracterizada porque tiene en el extremo N-terminal la secuencia de aminoácidos mostrada como la SEC ID NO: 37.

27. Una proteina de 14 kDa de gametocitos de Eimeria máxima caracterizada porque tiene en el extremo N-terminal la secuencia de aminoácidos mostrada como la SEC ID NO: 39.

28. Una proteina de 14 kDa de gametocitos de Elmeria máxima caracterizada porque tiene en el extremo N-terminal la secuencia de aminoácidos mostrada como la SEC ID NO: 41.

29. Una vacuna contra Eimerla tenella, Eimeria máxima, Eimeria acervnlina, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria mitis o Eimeria brunetti, o un microorganismo que expresa a un antigeno inter-reactivo inmunológicamente, caracterizado porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1 o el plásmido de conformidad con la reivindicación 14, o el polipéptido recombinante de conformidad con la reivindicación 23.

30. La vacuna de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque comprende adicionalmente un segundo antigeno.

31. La vacuna de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque el segundo antigeno es seleccionado del grupo que consiste de un ácido nucleico que codifica para un antigeno de Eimeria máxima, un plásmido que comprende un ácido nucleico tal, y un polipéptido codificado por un ácido nucleico tal.

32. La vacuna de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porgue el segundo antigeno es un ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada como la SEC ID NO: 4, un plásmido que comprende el ácido nucleico, o un polipéptido codificado por el ácido nucleico.

33. La vacuna de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque el segundo antigeno es seleccionado del grupo que consiste de una prote na de 30 kDa de gametocitos de Eimexia máxima que tiene en el extremo N-terminal la secuencia de aminoácidos mostrada como la SEC ID NO: 35, o la SEC ID NO: 42 o una proteina de 14 kDa de gametocitos de Eimeria máxima que tiene en el extremo N-terminal la secuencia de aminoácidos mostrada como la SEC ID NO: 37, la SEC ID NO: 39 o la SEC ID NO: 41.

34. La vacuna de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque comprende adicionalmente un tercer antigeno.

35. La vacuna de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque el tercer antigeno es un ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada como la SEC ID NO: 26, un plásmido que comprende el ácido nucleico, o un polipéptido codificado por el ácido nucleico .

36. La vacuna de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque comprende adicionalmente un cuarto an igeno.

37. La vacuna de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque el cuarto antigeno es un polipéptido de gametocitos de Eimeria máxima que tiene un peso molecular de 230 a 270 kDa, una secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido, o un plásmido que comprende la secuencia de nucleótidos.

38. La vacuna de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque el antigeno comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como la SEC ID NO: 29 en su extremo 5' o la secuencia de aminoácidos mostrada como la SEC ID NO: 31 en su extremo 3' .

39. Un método de inmunizar a un sujeto contra la infección por Eimeria t&nella, Eimeria máxima, Eimeria acervnlina, Eimeria necatrix, ¦ Eimeria praecox, Eimeria mitís o Eimeria Jbrunetti, o un microorganismo que expresa a un antigeno inter-reactivo inmunológicamente, caracterizado porque comprende la etapa de administrar al sujeto la vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 29-38.

40. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el sujeto es una especie seleccionada del grupo que consiste de vacas, ovejas, cerdos y peces.

41. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el sujeto es una especie aviar.

42. El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque la especie aviar es seleccionada del grupo que consiste de pollos, pavos, gansos, patos, gallinas enanas, codornices, y palomas.

43. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque la especie aviar es pollos.

44. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque la etapa de administrar comprende rociar la vacuna en las fosas nasales del sujeto.

45. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque la administración comprende la inyección intravenosa, intramuscular o intraperitoneal .

46. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque la administración se efectúa in ovo.

47. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque la administración es en la bolsa de aire de un huevo, poniendo en contacto asi a un embrión con la vacuna.

48. Un huevo de una especie aviar fertilizado que tiene una bolsa de aire, caracterizado porque la bolsa de aire es inoculada con la vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 29-38, en donde la vacuna es capaz de inducir antes de o inmediatamente después de incubar, una respuesta inmune en un embrión contra una forma virulenta de Eimeria tenella, Eimeria máxima, Eimeria acexvulina, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria mitis o Eimeria brunetti, o un microorganismo que expresa a un antigeno inter-reactivo inmunológicamente .

49. El huevo fertilizado de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque la especie aviar es seleccionada del grupo que consiste de pollos, patos, pavos, gansos, gallinas enanas, codornices y palomas.

50. El huevo fertilizado de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque la especie aviar es pollos.

51. Un ácido nucleico aislado caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido de 82 kDa de Gametocitos de Eimeria máxima, o que codifica a un homólogo del polipéptido, o a un complemente del ácido nucleico.

52. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como la SEC ID NO: 6.

53. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque el homólogo del polipéptido tiene al menos 50 % de identidad con el polipéptido que tiene la secuencia mostrada como la SEC ID NO: 6.

54. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos tiene al menos 50 % de identidad con la secuencia de nucleótidos que comienza en el nucleótido No. 100 y que termina en el nucleótido No. 1886 mostrada como la SEC ID NO: 4.

55. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque el ácido nucleico es una molécula de DNA.

56. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque la molécula de DNA es una molécula de cDNA.

57. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque el ácido nucleico tiene la secuencia de nucleótidos mostrada como la SEC ID NO: 4.

58. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque el ácido nucleico es una molécula de RNA,

59. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque está operativamente unido a un promotor de la transcripción de R A.

60. Un vector caracterizado porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 51.

61. ün vector caracterizado porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 57.

62. El vector de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque el vector es un plásmido.

63. El vector de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque el vector es un plásmido.

64. ün plásmido caracterizado porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 51.

65. El plásmido de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado porque se denomina plásmido 82TRCHisb8 depositado bajo el No. de Acceso NM01/22398 del Australian Government Analytical Laboratories.

66. Una célula huésped caracterizada porque comprende el vector de conformidad con la reivindicación 60.

67. Una célula huésped caracterizada porque comprende el vector de conformidad con la reivindicación 61.

68. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 66, caracterizada porque la célula es seleccionada del grupo que consiste de una célula bacteriana; una célula vegetal; una célula de insecto; y una célula de mamífero.

69. Una célula transformada caracterizada porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 51.

70. La célula transformada de conformidad con la reivindicación 69, caracterizada porque se denomina clon bacteriano de 82TRCHisb8 depositado bajo el No. de Acceso M01/22399 del Australian Government Analytical Laboratories .

71. La célula transformada de conformidad con la reivindicación 69, caracterizada porque comprende adicionalmente un polipéptido de 82 kDa de Gametocitos de Eimeria máxima, o un homólogo del polipéptido.

72. Un método de producir un polipéptido recombinante de 82 kDa de Gametocitos de Eimeria máxima, el método está caracterizado porque comprende cultivar la célula transformada de conformidad con la reivindicación 69 y aislar el polipéptido recombinante de 82 kDa de Gametocitos ' de Eimeria máxima.

73. Un polipéptido recombinante producido por el método de conformidad con la reivindicación 72.

74. Una vacuna contra Eimeria tenella, Eimeria máxima, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria mitis o Eimeria brunetti, o un microorganismo que expresa un antigeno inter-reactivo inmunológicamente, caracterizada porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 51 o el plásmido de conformidad con la reivindicación 64, o el polipéptido recombinante de conformidad con la reivindicación 73.

75. La vacuna de conformidad con la reivindicación 74, caracterizada porque comprende adicionalmente un segundo antigeno.

76. La vacuna de conformidad con la reivindicación 75, caracterizada porgue el segundo antigeno es seleccionado del grupo que consiste de un ácido nucleico que codifica para un antigeno de Eimerla máxima, un plásmido que comprende el ácido nucleico, y un polipéptido codificado por el ácido nucleico.

77. La vacuna de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado porque el segundo antigeno es seleccionado del grupo que consiste de una proteina de 30 kDa de gametocitos de Eimerla máxima que tiene en el extremo N-terminal la secuencia de aminoácidos mostrada como la SEC ID NO: 35, o la SEC ID NO: 42 o una proteina de 14 kDa de gametocitos de Eimeria máxima que tiene en el extremo N-terminal la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID NO: 37, SEC ID NO: 39 o SEC ID NO: 41.

78. Un método de inmunizar a un sujeto contra la infección por Eimeria tenellar Eimeria máxima Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria mitis o Eimeria brunetti, o un microorganismo que expresa a un antigeno inter-reactivo inmunológicamente, caracterizado porque comprende la etapa de administrar al sujeto la vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 74-77.

79. El método de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado porque el sujeto es una especie seleccionada del grupo que consiste de vacas, ovejas, cerdos y peces.

80. El método de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado porque el sujeto es una especie aviar.

81. El método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque la especie aviar es seleccionada del grupo que consiste de pollos, pavos, gansos, patos, gallinas enanas, codornices, y palomas.

82. El método de conformidad con la reivindicación 81, caracterizada porque la especie aviar es pollos.

83. El método de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado porque la etapa de administrar comprende rociar la vacuna en las fosas nasales del sujeto.

84. El método de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado porque la administración comprende la inyección intravenosa, intramuscular o intraperitoneal .

85. El método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque la administración se efectúa in ovo.

86. El método de conformidad con la reivindicación 85, caracterizado porque la administración es en la bolsa de aire de un huevo, poniendo asi en contacto un embrión con la vacuna.

87. Un huevo de una especie aviar fertilizado que tiene una bolsa de aire, caracterizado porque la bolsa de aire es inoculada con la vacuna de conformidad con la reivindicación 74, porque la vacuna es capaz de inducir antes o inmediatamente después de incubar, una respuesta inmune en un embrión contra una forma virulenta de Eimeria tenella, Eimeria máxima, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria praecoxr Eimeria mitis o Eimeria brunetti, o un microorganismo que expresa a un antigeno inter-reactivo inmunológicamente.

88. El huevo fertilizado de conformidad con la reivindicación 87, caracterizado porgue la especie aviar es seleccionada del grupo que consiste de pollos, patos, pavos, gansos, gallinas enanas, codornices y palomas.

89. El huevo fertilizado de conformidad con la reivindicación 88, caracterizado porque la especie aviar es pollos.

90. Un polipéptido recombinante, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos se muestra como la SEC ID NO: 3.

91. Un polipéptido recombinante, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos se muestra como la SEC ID NO: 6.

92. Un método de inmunizar a un sujeto contra la infección por Eimerla tenella, Eimeria máxima, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria praecoxr Eimeria mitis o Eimeria brunetti, o un microorganismo que expresa a un antigeno inter-reactivo inmunológicamente, caracterizado porque comprende la etapa de administrar al sujeto la proteina de una cualquiera de las reivindicaciones 24-28.

93. Un método de conferir en un sujeto neonato de una especie aviar, inmunidad materna contra la infección por Eimeria tenella, Eimeria máxima, Eimeria acervulina, Eimeria necatr x, Eimeria praecox, Eimeria mitis, o Eimeria brunetti, o un microorganismo que expresa a un antigeno inter-reactivo inmunológicamente, caracterizado porque comprende la etapa de administrar a la madre del sujeto en un tiempo adecuado previo a la puesta de un huevo fertilizado, la vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 29-38 o 74-77 a fin de conferir asi protección via inmunidad materna contra la infección por Eimeria tenella, Eimeria máxima, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria mitis o Eimeria brunetti, o un microorganismo que expresa a un antigeno inter-reactivo inmunológicamente, en el sujeto neonato.

94. El método de conformidad con la reivindicación 93, caracterizado porque la especie aviar es seleccionada del grupo que consiste de pollos, pavos, gansos, patos, gallinas enanas, codornices y palomas.

95. El método de conformidad con la reivindicación 93, caracterizado porque la administración comprende la inyección intravenosa, intramuscular o intraperitoneal .

96. Un método de reducir la salida de oocistos de Eimeria máxima en heces de un sujeto neonato de una especie aviar, caracterizado porque comprende la etapa de administrar a la madre del sujeto en un tiempo adecuado previo a la puesta de un huevo fertilizado la vacuna de conformidad con la reivindicación 29-38 o 74-77 a fin de inducir una respuesta inmune y transmitir anticuerpos maternos al neonato de modo que se reduzca la salida de oocistos del neonato.

97. El método de conformidad con la reivindicación 96, caracterizado porque la especie aviar es seleccionada del grupo que consiste de pollos, pavos, gansos, patos, gallinas enanas, codornices y palomas.

98. El método de conformidad con la reivindicación 96, caracterizado porque la administración comprende la inyección intravenosa, intramuscular o intraperitoneal.