ES2760004T3 - Vacuna contra Leishmania utilizando un inmunnógeno salival de mosca de la arena - Google Patents

Abstract

Vacuna de administración de sensibilización y una vacuna de administración de refuerzo para su uso en la protección de un sujeto de la leishmaniasis y/o la prevención de progresión de la enfermedad en un sujeto infectado, en la que el sujeto es un animal canino, en la que las vacunas se formulan para la administración en un régimen de administración de sensibilizaciónrefuerzo que comprende una administración de sensibilización con la vacuna de administración de sensibilización seguida de una administración de refuerzo con la vacuna de administración de refuerzo, en la que dicha vacuna de administración de sensibilización comprende, en un vehículo, diluyente o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable, un vector de expresión que contiene un polinucleótido para expresar, in vivo, un polipéptido salival de Lu. Longipalpis, y dicha vacuna de administración de refuerzo comprende, en un vehículo o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable, el mismo polipéptido salival de Lu. Longipalpis, en la que el polipéptido salival de Lu. Longipalpis es un polipéptido LJM17, en la que el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene la secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 5, 7, 15, o 17; o el polinucleótido tiene al menos 70% de identidad de secuencia con un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 5, 7, 15, o 17; o el polinucleótido tiene al menos 70% de identidad de secuencia con un polinucleótido que tiene la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 6, 8, 16, 18, 21, 90, o 91; y en la que el polipéptido de Lu. Longipalpis comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 5, 7, 15, o 17.

Description

DESCRIPCIÓN

Vacuna contra Leishmania utilizando un inmunnógeno salival de mosca de la arena

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de Estados Unidos No. de Serie 61/051.635 presentada el 8 de mayo de 2008, y la solicitud provisional de Estados Unidos No. de serie 61/101.345 presentada el 30 de septiembre de 2008, que hacen referencia a la Solicitud Internacional No. PCT/US2003/034453 titulada Polipéptidos de Lutzomyia longipalpis y procedimientos de uso presentada el 29 de octubre de 2003, que reivindica prioridad de la solicitud provisional No. 60/422.301, presentada el 29 de octubre del 2002.

Todos los documentos citados o mencionados en este documento ("documentos citados en el presente documento"), y todos los documentos citados o referenciados en documentos citados en el presente documento, junto con cualquiera de instrucciones de fabricante, descripciones, especificaciones de producto, y hojas de productos para cualquiera de los productos mencionados en este documento se pueden emplear en la práctica de la invención.

CAMPO

La presente invención se refiere a formulaciones para la lucha contra las infecciones por Leishmania en caninos. Específicamente, la presente descripción proporciona vectores que contienen y expresan in vivo o in vitro antígenos salivales de Lu. Longipalpis de la mosca de la arena que provocan una respuesta inmunitaria en animales o humanos contra Leishmania, incluyendo composiciones que comprenden dichos vectores, procedimientos de vacunación contra la Leishmania y kits para usar con tales procedimientos y composiciones.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La Leishmaniasis es una enfermedad parasitaria importante y grave que afecta a los seres humanos, caninos (perros, lobos, zorros, coyotes, chacales), y, en menor grado, felinos (leones, tigres, gatos domésticos, gatos salvajes, otros gatos grandes, y otros felinos incluyendo guepardos y lince).

Los subgéneros Leishmania y Viannia se agrupan en complejos de especies y subespecies basándose en similitudes moleculares, bioquímicas e inmunológicas. Hay varias formas de la enfermedad nombradas por su presentación clínica, incluyendo Leishmaniasis cutánea, mucocutánea o visceral. Cada una de estas formas de la enfermedad es causada por diferentes especies de moscas de la arena que se encuentran en diferentes regiones del mundo. La Leishmaniasis cutánea de los seres humanos se asocia con miembros de complejos de L. aethiopica, L. major y L. tropica en el Viejo Mundo y complejos de L. mexicana y L. braziliensis en el Nuevo Mundo. La Leishmaniasis visceral es causada por L. donovani y L. infautum en las regiones del Viejo Mundo, mientras que L chagasi es el principal responsable de la enfermedad visceral en el Nuevo Mundo. Debido a que L. infantum es el agente primario asociado con la leishmaniosis canina, las infecciones en perros a menudo son consideradas como viscerales, a pesar de que tienden a producir una enfermedad visceral y cutánea.

El agente de la Leishmaniasis visceral es un parásito protozoario y pertenece al complejo de Leishmania donovani. Este parásito se distribuye ampliamente en los países templados y subtropicales del sur de Europa, África, Asia, América del Sur y América Central (Desjeux P. et al.). Leishmania infantum donovani (L. infantum) es responsable de la enfermedad felina y canina en el sur de Europa, África y Asia. En América del Sur y América Central, el agente es Leishmania donovani chagasi (L. chagasi), que está estrechamente relacionado con L. infantum. En los seres humanos, el agente es Leishmania donovani donovani (L. donovani), que también está relacionado con L. infantum y L. chagasi.

Las moscas de la arena del género Phlebotomus (Viejo Mundo) y Lutzomyia (Nuevo Mundo) son los vectores principales responsables de la transmisión de la enfermedad. Actualmente estos son los únicos vectores conocidos capaces de propagación; pulgas, garrapatas y otros artrópodos no han demostrado ser vectores competentes. Sin embargo, se han contraído casos raros de Leishmaniasis a través del intercambio de sangre o fluidos corporales, el contacto directo y al menos un caso de transmisión congénita. La importancia de las moscas de arena nativas está todavía por determinar, pero podría estar relacionada con la dosis infecciosa del organismo. Sin embargo, en los últimos años, y en ausencia de vectores conocidos, se ha producido una incidencia abrumadora de Leishmaniasis en las perreras Foxhound través de los Estados Unidos. Todavía no se sabe cómo se produjo la transmisión de la enfermedad o cómo esta enfermedad se mantiene en estos perros porque las moscas de arena infectadas no han sido reportadas en los Estados Unidos. Sin embargo, ciertas especies de Lutzomyia (L. shannoni), que se encuentran a lo largo del este de los Estados Unidos y hasta el norte de Nueva Jersey, se consideran un vector potencialmente competentes para L. mexicana. Phlebotomus ariasi (P. ariasi) y Phlebotomus perniciosus (P. perniciosus), Phlebotomus neglectus (P. neglectus) son los portadores más comunes en el sur de Europa, África y Asia, mientras que Lutzomyia longipalpis (Lu. Longipalpis) es el portador más común en América del sur y Centroamérica.

La leishmaniosis es una enfermedad lentamente progresiva que puede tardar hasta 7 años en convertirse en clínicamente evidente (McConkey SE et al.; Slappendel RJ et al.). Incluso entonces, los signos son con frecuencia inespecíficos y raramente se considera un diagnóstico de Leishmania. Los perros se infectan con más frecuencia con L. infantum (complejo de L. donovani), que es responsable de la enfermedad viscerotrópica en personas. Sin embargo, hasta el 90% de los perros infectados se presentan con lesiones viscerales y cutáneas (Slappendel RJ et al.). Por otro lado, muchos perros aparecen resistentes de forma natural a este parásito y pueden permanecer asintomáticos a pesar de la infección conocida (Grosjean NL et al.). Se estima que sólo el 10% de los perros que residen en áreas endémicas en realidad a desarrollar la enfermedad clínica (Lindsay DS et al.). Esta menor incidencia de la enfermedad clínica se atribuye a una predisposición genética de ciertos perros para desarrollar una respuesta inmunitaria mediada por células más protectoras que una respuesta humoral (Lindsay DS et al., McConkey SE et al., Slappendel RJ, et al.). Además, se ha descrito que hasta el 20% de los perros infectados puede desarrollar una respuesta inmunitaria adecuada y espontáneamente se recuperan de la enfermedad clínica (McConkey SE et al.). En los animales que desarrollan una respuesta humoral, IgG1 parece que se correlaciona con la enfermedad clínica mientras que los perros asintomáticos tienen niveles de anticuerpos IgG2 más altos (Lindsay et al.).

Algunos de los signos clínicos descritos con más frecuencia de Leishmaniasis incluyen apatía, fatiga e intolerancia al ejercicio junto con la anorexia y la pérdida de peso que finalmente culminan como enfermedad de desgaste (McConkey SE et al.). Estos signos pueden estar acompañados o no de fiebre, linfadenopatía local o generalizada (90%) y/o hepatoesplenomegalia (Grosjean NL et al., Lindsay DS et al., McConkey SE et al., Martínez-Subiela S et al.). La afectación articular también es bastante común y puede presentarse como cojera con articulaciones hinchadas o simplemente como un modo de andar rígido. Los hallazgos menos comunes incluyen lesiones oculares (<5%), diarrea crónica (30%) y uñas largas quebradizas deformadas (20%) referidas como onicogrifosis (Lindsay DS et al., Slappendel RJ et al.). Las lesiones cutáneas están presentes en hasta el 89% de los perros infectados, con o sin signos evidentes de afectación visceral. Las lesiones por la Leishmaniasis cutánea pueden aparecer en cualquier parte del cuerpo, pero los sitios más comunes son los que están expuestas al medio ambiente y, por tanto, son más susceptibles a las picaduras de las moscas de la arena. La pápula inicial da lugar rápidamente a una úlcera. La Leishmaniasis Viseral es invariablemente fatal si no se trata rápidamente. La Leishmaniasis visceral afecta a los órganos internos del cuerpo, específicamente el bazo y el hígado.

Los perros son considerados el principal reservorio de Leishmaniasis. La enfermedad se caracteriza por la evolución crónica de signos víscero-cutáneos que aparecen en menos del 50% de los animales infectados (Lanotte G. et al.). Los perros asintomáticos y sintomáticos con anticuerpos detectables pueden ser infecciosos (Molina R. et al.; Courtenay O. et al.). Los gatos también pueden ser portadores de los parásitos de protozoos y por lo tanto se consideran reservorios potenciales secundarios.

Debido a una serie de factores, las opciones de tratamiento para la Leishmaniasis en perros y la respuesta a la terapia son limitadas a lo sumo. Por alguna razón no definida, la Leishmaniasis visceral es más difícil de tratar en perros que en los seres humanos. Ninguna opción de tratamiento es 100% eficaz en la limpieza de la infección parasitaria y la enfermedad clínica a menudo vuelve a aparecer con el cese de la terapia (Lindsay DS et al.). En áreas endémicas, el régimen de tratamiento más común ha sido una combinación de alopurinol con un compuesto de antimonio pentavalente, tal como antimonita de meglumina o estibogluconato de sodio (Lindsay DS et al., Slappendel RJ et al.). Sin embargo, en los últimos años este protocolo ha perdido el favor debido a la creciente resistencia del parásito al fármaco así como los efectos secundarios adversos asociados con estos compuestos (Lindsay DS et al.). Para limitar aún más las opciones de tratamiento, Pentostam® (estibogluconato de sodio) es el único compuesto de antimonio disponible en los Estados Unidos y su distribución está regulada por los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC) en Atlanta, GA (DS Lindsay et al.).

Se han intentado otros protocolos, pero no han demostrado ser más eficaces en la limpieza de la infección parasitaria o en la prevención de la recaída clínica. Además, cada protocolo está asociado con efectos adversos potenciales. La anfotericina B se une a esteroles y altera la permeabilidad de membrana celular pero es nefrotóxico (Lindsay DS et al.). Cuando se administra parenteralmente, la paramomicina actúa sinérgicamente con compuestos de antimonio que causan niveles más altos del compuesto de antimonio durante períodos más largos de tiempo, pero también es nefrotóxico y actualmente no se recomienda para el uso clínico (Lindsay DS et al.). El isetionato de pentamidina es eficaz contra la Leishmaniasis, pero requiere al menos 15 inyecciones intramusculares y es bastante doloroso (Lindsay DS et al.). Ketoconazol, miconazol, fluconazol e itraconazol son medicamentos orales que pueden ser útiles para contener la enfermedad, pero que son de coste prohibitivo y llevan el riesgo de resistencia a los medicamentos en el tratamiento de pacientes sintomáticamente. En resumen, los diversos regímenes de tratamiento para la Leishmaniasis en perros se han investigado, pero no son 100% eficaces; las recaídas son la regla más que la excepción. En última instancia, el médico veterinario se enfrenta al dilema de tratar los brotes sintomáticos de la Leishmaniasis en perros en riesgo de desarrollar cepas resistentes a los medicamentos de este parásito dentro de los Estados Unidos.

La detección masiva de perros seropositivos, seguido de sacrificio y/o tratamiento con fármacos, o la aplicación en masa de collares impregnados de deltametrina se desmostró que tenía un impacto en la reducción de la prevalencia de la leishmaniosis humana y canina en áreas endémicas del sur de Europa, África, y Asia (Maroli M. et al. Mazloumi Gavgani A.S. et al.), aunque se ha debatido la eficacia de la eliminación de los caninos seropositivos (Dietze R. et al.; Moreira Jr. ED et al.). Estas medidas de control se consideran inaceptables, caras o no eficaces (Gradoni L. et al.).

Los modelos matemáticos utilizados para comparar la eficacia de diversas herramientas para el control de Leishmaniasis sugieren que una vacuna canina puede ser el procedimiento más práctico y eficaz (Dye C). Por lo tanto, el desarrollo de vacunas capaces de proteger a los caninos de la Leishmaniasis y/o para prevenir la progresión de la enfermedad en los animales infectados es altamente deseable para la implementación de los programas de control de la Leishmaniasis, así como para la comunidad veterinaria (Gradoni L. et al.).

Las investigaciones anteriores han tratado de identificar procedimientos de diagnóstico y tratamiento de Leishmania a través de, por ejemplo, la administración de polipéptidos antigénicos (véase, por ejemplo, WO 2004/039958 y US 2006/051364). Sin embargo, hasta la fecha, no hay vacuna disponible para el tratamiento de la Leishmania. Los vectores y formulaciones de vacuna de la presente descripción cumplen esta necesidad en la técnica.

La cita o identificación de cualquier documento en esta solicitud no es una admisión de que tal documento está disponible como técnica anterior para la presente invención.

CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a una vacuna de administración de sensibilización y una vacuna de administración de refuerzo para usar en la protección de un sujeto de la Leishmaniasis y/o prevención de la progresión de la enfermedad en un sujeto infectado, en el que el sujeto es un canino,

en el que las vacunas se formulan para la administración en un régimen de administración de sensibilizaciónrefuerzo que comprende una administración de sensibilización con la vacuna de administración de sensibilización seguida de una administración de refuerzo con la vacuna de administración de refuerzo,

en el que dicha vacuna de administración de sensibilización comprende, en un vehículo, diluyente o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable, un vector de expresión que contiene un polinucleótido para expresar, in vivo, un polipéptido salival de Lu. Longipalpis, y

dicha vacuna de administración de refuerzo comprende, en un vehículo, diluyente o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable, el mismo polipéptido salival de Lu. Longipalpis,

en la que el polipéptido salival de Lu. Longipalpis es un polipéptido ^lJ^m 17,

en la que el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene la secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 5, 7, 15, o 17; o el polinucleótido tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 5, 7, 15, o 17; o el polinucleótido tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con un polinucleótido que tiene la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 6, 8, 16, 18, 21, 90, o 91; y en la que el polipéptido de Lu. Longipalpis comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 5, 7, 15, o 17.

Un objetivo de esta descripción puede ser uno cualquiera o todos de proporcionar vectores o virus recombinantes, así como procedimientos para la fabricación de dichos virus, y proporcionar composiciones y/o vacunas, así como procedimientos para el tratamiento y profilaxis de la infección por Leishmania.

En el presente documento se describe un vector recombinante, tal como un virus recombinante, por ejemplo, un poxvirus recombinante, que contiene y expresa al menos una molécula de ácido nucleico exógeno y, la al menos una molécula de ácido nucleico exógena puede comprender una molécula de ácido nucleico que codifica un inmunógeno o epítopo de interés de proteínas salivales de vectores de la mosca de la arena de Lu. Longipalpis.

En el presente documento se describe un vector recombinante, tal como un virus recombinante, por ejemplo, un poxvirus recombinante, que contiene y expresa al menos una molécula de ácido nucleico exógeno y, la al menos una molécula de ácido nucleico exógeno puede comprender polipéptidos salivales de Lu. Longipalpis y/o variantes o fragmentos de los mismos.

Estas vacunas pueden prevenir la difusión y/o la replicación del parásito en un huésped.

La descripción proporciona además composiciones inmunológicas (o inmunogénicas) o composiciones de vacuna que comprenden dicho vector de expresión o el producto o productos de expresión de dicho vector de expresión.

La descripción proporciona además procedimientos para inducir una respuesta inmunológica (o inmunogénica) o de protección contra Leishmania, así como procedimientos para prevenir o tratar Leishmania o un estado o estados patológicos causados por Leishmania, que comprende administrar el vector de expresión o un producto de expresión del vector de expresión, o una composición que comprende el vector de expresión, o una composición que comprende un producto de expresión del vector de expresión.

La descripción también se refiere a productos de expresión de virus, así como anticuerpos generados a partir de los productos de expresión o la expresión de los mismos in vivo y usos para dichos productos y anticuerpos, por ejemplo, en aplicaciones de diagnóstico.

Estas y otras realizaciones se describen o son evidentes a partir de y están abarcadas por la siguiente descripción detallada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La siguiente descripción detallada, proporcionada a modo de ejemplo, y que no pretende limitar la invención a realizaciones específicas descritas, puede entenderse conjuntamente con las figuras que se acompañan, incorporadas aquí por referencia, en las que:

La Figura 1 muestra la secuencia de ácido nucleico de una cadena del plásmido pVR2001 LJM17 (SEQ ID NO: 9), en el que los dos sitios de restricción BamHI están en negrita, la secuencia que codifica el péptido señal tPA está subrayada y la secuencia que codifica LJM17 está en negrita y mayúsculas.

La Figura 2 muestra la secuencia de ácido nucleico de una cadena del plásmido pVR2001 LJL143 (SEQ ID NO: 10), en el que los dos sitios de restricción BamHI están en negrita, la secuencia que codifica el péptido señal tPA está subrayada y la secuencia que codifica LJL143 está en negrita y mayúsculas.

La Figura 3 muestra un mapa del vector donante, pALVAC C3 H6p-LJM17, que tiene 5737 pares de bases.

La figura 4 ilustra el vector de expresión de la viruela de canario vCP2390, para cadena complementarias directa e inversa (SEQ ID NO: 93 y SEQ ID NO: 92). SEQ ID NO: 93 representa la cadena de vector vCP2390 que contiene el polinucleótido LJM17 optimizado en codones en la dirección que codifica el polipéptido LJM17 (SEQ ID NO: 5). La Figura 5 muestra un mapa del vector donante, pALVAC C3 H6p-LJL143, que tiene 5400 pares de bases.

La Figura 6 ilustra el vector de expresión de la viruela de canario vCP2389 con su inserto que codifica LJL143 y proporciona la secuencia de nucleótidos de una cadena del vector de expresión (SEq ID NO: 94).

La figura 7 ilustra anticuerpos anti-IgG para LJM17 y LJL143, la absorbancia medida a 405 nm, en perros vacunados y de control, desde un día antes de la administración V1 a dos semanas después de la administración V5.

La Figura 8 ilustra la secreción de interferón gamma (pg/ml) de PBMC de perros correspondiente a los 5 grupos, 2 semanas después de la 5' inmunización (administración V5). Las PBMC se estimularon mediante SGH (2 pares), LJL143 (4 mg), LJM17 (4 mg), ConA (4 mg) o no estimulado por medio (med).

La Figura 9 muestra un esquema de un ensayo de destrucción in vitro incluyendo los resultados, expresados en porcentaje de macrófagos infectados (NT: sin tratamiento, LPS: lipopolisacárido, ConA: concavalina A).

La Figura 10 muestra las biopsias de perros vacunados y de control, en los sitios de picadura de mosca de la arena, teñidas con hematoxilina/eosina (H & E), tinción de Luna, azul de toluidina y procedimientos inmunohistoquímicos para CD3 y los marcadores de macrófagos/monocitos (MAC).

La Figura 11 muestra la secuencia de ácido nucleico de una cadena del plásmido pNBO002 (SEQ ID NO: 19), en el que los dos sitios de restricción BamHI están en negrita, la secuencia que codifica el péptido señal tPA está subrayada y la secuencia que codifica LJM17 está en negrita y mayúsculas.

La Figura 12 muestra un mapa del plásmido vector pNBO002 con su inserto que codifica LJM17, que tiene 6247 pares de bases.

La Figura 13 muestra la secuencia de ácido nucleico de una cadena del plásmido pNBO003 (SEQ ID NO: 20), en el que los dos sitios de restricción BamHI están en negrita, la secuencia que codifica el péptido señal tPA está subrayada y la secuencia que codifica LJL143 está en negrita y mayúsculas.

La Figura 14 muestra un mapa del plásmido vector pNBO003 con su inserto que codifica LJL143, que tiene 5899 pares de bases.

La Figura 15 muestra las secuencias de proteínas de LJL143 y LJM17 de L. longipalpis.

La Figura 16 muestra las secuencias de ADN de LJL143 y LJM17 de L. longipalpis.

La Figura 17 muestra las tablas de identidad de secuencia.

La Figura 18 muestra la SEQ ID NO asignada a cada ADN y polipéptido.

La figura 19 es un conjunto de gráficos e imágenes que demuestran la inmunidad anti-saliva en perros expuestos a las picaduras de la mosca de la arena Lu. Longipalpis. La figura 19A es un conjunto de gráficos que muestran la cinética temprana de títulos de anticuerpos IgG, IgG2, e IgG1 anti-Lu. Longipalpis en perros expuestos. La figura 19B es un gráfico de una reacción de hipersensibilidad de tipo retardado en un perro representativo a lo largo de experimentos de exposición. La figura 19C es un conjunto de imágenes de un análisis histológico H/E realizado en biopsias por punción de la piel antes de la exposición (E0), 47 h después de la primera exposición (E1), 48 h después de la segunda exposición (E2) y 48 h después de la tercera exposición (E3) a picaduras de moscas de la arena. La figura 19D es un conjunto de imágenes que caracterizan la población inflamatoria a las 48 h después de la tercera exposición (E3) a las picaduras de moscas de arena con inmunohistoquímica para los linfocitos T CD3+ y macrófagos y tinción de Luna para eosinófilos.

La Figura 20 es un conjunto de gráficos e imágenes que demuestran un ensayo de cribado antígeno inverso de ADNc en los perros.

La Figura 21 es un conjunto de gráficos e imágenes que demuestran un ensayo de cribado de antígeno inverso de proteína en los perros.

La Figura 22 es un conjunto de dos gráficos que demuestran la producción de interferón g de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de perros vacunados después de la estimulación con la proteína salival recombinante. La Figura 23 es un conjunto de cuatro gráficos de barras que demuestra un ensayo de destrucción in vitro para Leishmania chagasi por PBMC de perros inmunizados (NT, ningún tratamiento; Ly, linfocitos).

DESCRIPCIÓN DETALLADA

A menos que se indique lo contrario, los términos técnicos se usan de acuerdo con el uso convencional. Las definiciones de términos comunes en biología molecular pueden encontrarse en Benjamin Lewin, Genes V. publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8). Los términos singulares "un", "una" y "el/la" incluyen los referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Del mismo modo, la palabra "o" pretende incluir "y" a menos que el contexto indique claramente lo contrario. La palabra "o" significa cualquier miembro de una lista en particular y también incluye cualquier combinación de los miembros de esa lista.

Se observa en esta descripción y en las reivindicaciones y/o párrafos adjuntas, el término "polipéptido de Lu. Longipalpis salival", "polipéptido de Lu. Longipalpis ", o "polipéptido salival" se utilizan indistintamente, el término "polinucleótido de Lu. Longipalpis salival ", “polinucleótido de Lu. Longipalpis“, o “polinucleótido salival” se usan de manera intercambiable.

Los términos "polipéptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en este documento para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos consecutivos.

El término "ácido nucleico", "nucleótido", y "polinucleótido" se refieren a ARN o ADN y sus derivados, tales como los que contienen cadenas principales modificadas. Se debe entender que la descripción proporciona polinucleótidos que comprenden secuencias complementarias a las descritas en el presente documento. Los polinucleótidos de acuerdo con la descripción pueden prepararse de diferentes maneras (por ejemplo, mediante síntesis química, mediante clonación de genes, etc.) y pueden adoptar diversas formas (por ejemplo, lineal o ramificado, de cadena simple o doble, o un híbrido de las mismas, cebadores, sondas, etc.).

El término "gen" se utiliza ampliamente para referirse a cualquier segmento de polinucleótido asociado con una función biológica. Por lo tanto, los genes o polinucleótidos incluyen intrones y exones como en la secuencia genómica, o sólo las secuencias de codificación como en ADNc, tal como un marco de lectura abierto (ORF), partiendo del codón de iniciación (codón de metionina) y terminando con una señal de terminación (codón de parada). Los genes y polinucleótidos también pueden incluir regiones que regulan su expresión, tal como el inicio de la transcripción, traducción y terminación de la transcripción. Por lo tanto, también se incluyen promotores y regiones de unión a ribosomas (en general, estos elementos reguladores se encuentran aproximadamente entre 60 y 250 nucleótidos en dirección 5' del codón de inicio de la secuencia codificante o gen; Doree SM et al.; Pandher K et al.; Chung JY et al), terminadores de la transcripción (en general el terminador se encuentra dentro de aproximadamente 50 nucleótidos en dirección 3' del codón de parada de la secuencia codificante o gen; Ward, CK et al). Un gen o polinucleótido también se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa ARNm o ARN funcional, o codifica una proteína específica, y que incluye secuencias reguladoras.

El término "polipéptido inmunogénico" o "fragmento inmunogénico", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido o un fragmento de un polipéptido que comprende un motivo específico de alelo, un epítopo u otra secuencia de forma que el polipéptido o el fragmento se unirán a una molécula de MHC e inducirán una respuesta de linfocito T citotóxico ("CTL") y/o una respuesta de células B (por ejemplo, producción de anticuerpos), y/o respuesta de linfocitos T auxiliares y/o una respuesta de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) contra el antígeno del que se deriva el polipéptido inmunogénico o el fragmento inmunogénico. Una respuesta DTH es una reacción inmunitaria en la que la activación de macrófagos dependiente de células T e inflamación causan lesión de tejido. Una reacción de DTH a la inyección subcutánea de antígeno se utiliza a menudo como un ensayo para la inmunidad mediada por células.

Por definición, un epítopo es un determinante antigénico que es inmunológicamente activo en el sentido de que una vez administrado al huésped, es capaz de evocar una respuesta inmunitaria del tipo humoral (células B) y/o tipo celular (células T). Estos son grupos químicos particulares o secuencias de péptidos en una molécula que son antigénicos. Un anticuerpo se une específicamente a un epítopo antigénico particular en un polipéptido. Ejemplos específicos, no limitativos, de un epítopo incluyen una secuencia de tetrapéptido a pentapéptido en un polipéptido, una secuencia de triglicósido a pentaglicósido en un polisacárido. En el animal la mayoría de los antígenos presentarán varios o incluso muchos determinantes antigénicos simultáneamente. Dicho polipéptido también puede ser calificado como un polipéptido inmunogénico y el epítopo puede identificarse tal como se describe adicionalmente.

Un componente biológico "aislado" (tal como un ácido nucleico o proteína u orgánulo) se refiere a un componente que se ha separado o purificado sustancialmente de otros componentes biológicos en la célula del organismo en el que se produce el componente de forma natural, por ejemplo, otros ADN y ARN cromosómicos y extracromosómicos, proteínas y orgánulos. Los ácidos nucleicos y proteínas que han sido "aislados" incluyen ácidos nucleicos y proteínas purificados mediante procedimientos de purificación estándar. El término también abarca ácidos nucleicos y proteínas preparados mediante tecnología recombinante, así como la síntesis química.

El término "purificado", tal como se usa en el presente documento no requiere pureza absoluta; más bien, se entiende como un término relativo. Así, por ejemplo, una preparación de polipéptido purificado es uno en el que el polipéptido está más enriquecido que el polipéptido está en su medio natural. Una preparación de polipéptido se purifica sustancialmente de tal manera que el polipéptido representa en varias formas de realización al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 98%, del contenido total de polipéptido de la preparación. Lo mismo se aplica a los polinucleótidos. Los polipéptidos descritos en este documento se pueden purificar mediante cualquiera de los medios conocidos en la técnica.

Un polinucleótido recombinante es uno que tiene una secuencia que no es de origen natural o tiene una secuencia que se fabrica mediante una combinación artificial de dos segmentos separados de otro modo de la secuencia. Esta combinación artificial a menudo se logra mediante síntesis química o, más comúnmente, mediante la manipulación artificial de segmentos aislados de ácidos nucleicos, por ejemplo, mediante técnicas de ingeniería genética. En una realización, un polinucleótido recombinante codifica una proteína de fusión.

En el presente documento se describen polipéptidos de especies de moscas de arena Lu. Longipalpis. En el presente documento se describe un polipéptido que tiene una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, o 87, y un variante o fragmento de las mismas.

Tal como se usa en el presente documento, el término "homólogos" incluye ortólogos, análogos y parálogos. El término "análogos" se refiere a dos polinucleótidos o polipéptidos que tienen la misma función o similar, pero que han evolucionado por separado en organismos no relacionados. El término "ortólogos" se refiere a dos polinucleótidos o polipéptidos de diferentes especies, pero que han evolucionado a partir de un gen ancestral común por especiación. Normalmente, los ortólogos codifican polipéptidos que tienen las mismas funciones o similares. El término "parálogos" se refiere a dos polinucleótidos o polipéptidos que están relacionados por duplicación dentro de un genoma. Los parálogos usualmente tienen diferentes funciones, pero estas funciones pueden estar relacionadas. Los análogos, ortólogos y parálogos de un polipéptido salival de tipo salvaje pueden diferir del polipéptido salival de tipo salvaje por modificaciones posteriores a la traducción, por diferencias en la secuencia de aminoácidos, o por ambas. En particular, un homólogo para su uso según la invención mostrará generalmente al menos el 80-85%, 85-90%, 90-95% o 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia, con toda o parte de las secuencias de polipéptidos o polinucleótidos salivales de tipo salvaje, y mostrará una función similar.

En el presente documento se describe un polipéptido que tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia como la expuesta en las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, o 87.

En el presente documento se describen fragmentos y variantes de polipéptidos de L. longipalpis identificados anteriormente (SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83 , 85, o 87), que fácilmente se pueden preparar por un experto en la técnica usando técnicas de biología molecular bien conocidas.

Las variantes son polipéptidos homólogos que tienen una secuencia de aminoácidos con al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos tal como se expone en la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, o 87.

Las variantes incluyen variantes alélicas. El término "variante alélica" se refiere a un polinucleótido o un polipéptido que contiene polimorfismos que conducen a cambios en las secuencias de aminoácidos de una proteína y que existen dentro de una población natural (por ejemplo, una especie o variedad de virus). Tales variaciones alélicas naturales pueden dar lugar típicamente al 1-5% de la variación en un polinucleótido o un polipéptido. Las variantes alélicas pueden identificarse por secuenciación de la secuencia de ácido nucleico de interés en un conjunto de diferentes especies, que puede llevarse a cabo fácilmente utilizando sondas de hibridación para identificar el mismo locus genético del gen en estas especies. Cualquiera y todas de dichas variaciones de ácido nucleico y los polimorfismos o variaciones de aminoácidos resultantes que son el resultado de la variación alélica natural y que no alteran la actividad funcional del gen de interés, se pretende que estén dentro del alcance de la descripción.

Una variante es cualquier polipéptido secretado de saliva de Lu. Longipalpis, capaz de inducir en animales, tales como perros, vacunados con este polipéptido, una respuesta inmunitaria basada en células específica caracterizada por la secreción de interferón gamma (IFN-gamma) tras la estimulación por compuestos de extracto de glándula salival de Lu. Longipalpis. Dicha secreción de IFN-gamma puede demostrarse utilizando metodología in vitro (es decir inmunoensayo Qnantikine® de R & D Systems Inc. (número de catálogo # CAIF00); Djoba Siawaya JF et al.).

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "derivado" o "variante" se refiere a un polipéptido, o un ácido nucleico que codifica un polipéptido, que tiene una o más variaciones conservativas de aminoácidos u otras modificaciones menores, tales que (1) el polipéptido correspondiente tiene una función sustancialmente equivalente en comparación con el polipéptido de tipo salvaje o (2) un anticuerpo generado contra el polipéptido es inmunorreactivo con el polipéptido de tipo salvaje. Estas variantes o derivados incluyen polipéptidos que tienen modificaciones menores de las secuencias de aminoácidos primarias del polipéptido de Lu. longipalpis que pueden dar lugar a péptidos que tienen una actividad sustancialmente equivalente en comparación con el polipéptido homólogo sin modificar. Tales modificaciones pueden ser deliberadas, como mediante mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser espontáneas. El término "variante" contempla además deleciones, adiciones y sustituciones en la secuencia, siempre que el polipéptido funcione para producir una respuesta inmunológica tal como se define en el presente documento.

El término "variación conservativa" indica el reemplazo de un residuo de aminoácido por otro residuo biológicamente similar, o la sustitución de un nucleótido en una secuencia de ácido nucleico de tal manera que el residuo de aminoácido codificado no cambia o es otro residuo biológicamente similar. A este respecto, las sustituciones particularmente preferidas serán generalmente de naturaleza conservativa, es decir, aquellas sustituciones que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos. Por ejemplo, los aminoácidos se dividen generalmente en cuatro familias: (1) ácidos - aspartato y glutamato; (2) básicos - lisina, arginina, histidina; (3) no polares - alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares sin carga - glicina, asparagina, glutamina, cistina, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, el triptófano y la tirosina se clasifican a veces como aminoácidos aromáticos. Los ejemplos de variaciones conservativas incluyen la sustitución de un resto hidrófobo, tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro residuo hidrófobo, o la sustitución de un residuo polar por otro residuo polar, tal como la sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por ácido aspártico, o glutamina por asparagina, y similares; o una sustitución conservativa similar de un aminoácido con un aminoácido estructuralmente relacionado que no tendrá un efecto importante sobre la actividad biológica. Las proteínas que tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la molécula de referencia, pero que poseen sustituciones de aminoácidos menores que no afectan sustancialmente a la inmunogenicidad de la proteína están, por lo tanto, dentro de la definición del polipéptido de referencia. Todos los polipéptidos producidos por estas modificaciones se incluyen en el presente documento. El término "variación conservativa" también incluye el uso de un aminoácido sustituido en lugar de un aminoácido parental no sustituido siempre que los anticuerpos producidos contra el polipéptido sustituido también inmunorreaccionen con el polipéptido no sustituido.

Un fragmento inmunogénico de un polipéptido de Lu. Longipalpis incluye al menos 8, 10, 15, o 20 aminoácidos consecutivos, al menos 21 aminoácidos, al menos 23 aminoácidos, al menos 25 aminoácidos, o al menos 30 aminoácidos de un polipéptido de L. longipalpis que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, o 87, o variantes de los mismos. En otra realización, un fragmento de un polipéptido de Lu. Longipalpis incluye un epítopo antigénico específico que se encuentra en un polipéptido de Lu. Longipalpis de longitud completa.

Los procedimientos para determinar los fragmentos de polipéptido y epítopo tal como, generando bibliotecas de péptidos solapantes (Henner B. et al.), Pepscan (Geysen RM et al, 1984; Geysen HM et al, 1985; Van der Zee R. et al.; Geysen HM) y algoritmos (de Groot A. et al.; Hoop T. et al.; Parker K. et al.), son conocidos en la técnica.

En general, los anticuerpos se unen específicamente a un epítopo antigénico particular. Ejemplos específicos, no limitativos, de los epítopos incluyen una secuencia de tetrapéptido a pentapéptido en un polipéptido, una secuencia de triglicósido a pentaglicósido en un polisacárido. En los animales, la mayoría de los antígenos presentarán varios o incluso muchos determinantes antigénicos simultáneamente. Preferentemente, cuando el epítopo es un fragmento de proteína de una molécula más grande, tendrá sustancialmente la misma actividad inmunológica que la proteína total.

Un polinucleótido para usar de acuerdo con la invención codifica un polipéptido de la mosca de la arena Lu. Longipalpis, tal como un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia, tal como se expone en SEQ ID NO: 5, 7, 15 o 17.

En aún otro aspecto, un polinucleótido para usar de acuerdo con la invención codifica un polipéptido que tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia, tal como se expone en SEQ ID NO: 5, 7, 15 o 17.

En otro aspecto, un polinucleótido para usar de acuerdo con la invención tiene una secuencia de nucleótidos, tal como se expone en SEQ ID NO: 6, 8, 16, 18, 21, 90, o 91.

En aún otro aspecto, un polinucleótido para usar de acuerdo con la invención tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 95 %, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con uno de un polinucleótido que tiene una secuencia, tal como se expone en SEQ ID NO: 6, 8, 16, 18, 21, 90, o 91.

Estos polinucleótidos pueden incluir secuencias de ADN, ADNc y ARN que codifican un polipéptido de Lu. Longipalpis. Se entiende que todos los polinucleótidos que codifican un polipéptido de Lu. Longipalpis también están incluidos en el presente documento, siempre que codifiquen un polipéptido con la actividad reconocida, tal como la unión a un anticuerpo que reconoce el polipéptido, la inducción de una respuesta inmunitaria al polipéptido o un efecto sobre la supervivencia de Leishmania cuando se administran a un sujeto expuesto al parásito o que experimenta una disminución de un signo o síntoma de infección por Leishmania.

Los polinucleótidos de la descripción incluyen secuencias que son degeneradas como resultado del código genético, por ejemplo, el uso de codones optimizados para un huésped específico. Tal como se usa en el presente documento, "optimizado" se refiere a un polinucleótido que se modifica mediante ingeniería genética para incrementar su expresión en una especie determinada. Para proporcionar polinucleótidos optimizados que codifican polipéptidos salivales, la secuencia de ADN del gen de la proteína salival se puede modificar para 1) comprender codones preferidos por genes altamente expresados en una especie particular; 2) comprender un contenido de A T o G C en la composición de bases de nucleótidos con el hallado sustancialmente en dicha especie; 3) formar una secuencia de iniciación de dicha especie; o 4) eliminar secuencias que causan la desestabilización, la poliadenilación inapropiada, la degradación y terminación de ARN, o que forman horquillas de estructura secundaria o sitios de corte y empalme de ARN. El aumento de la expresión de proteína salival en dicha especie se puede lograr mediante la utilización de la frecuencia de distribución del uso de codones en eucariotas y procariotas, o en una especie particular. El término "frecuencia de uso del codón preferido" se refiere a la preferencia exhibida por una célula huésped específica en el uso de codones de nucleótidos para especificar un aminoácido determinado. Hay 20 aminoácidos naturales, la mayoría de los cuales son especificados por más de un codón. Por lo tanto, todas las secuencias de nucleótidos degeneradas están incluidas en la descripción siempre que la secuencia de aminoácidos del polipéptido salival de Lu. Longipalpis codificada por la secuencia de nucleótidos no esté funcionalmente alterada.

La identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos puede establecerse por el “blast” por parejas de NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnológica) y la matriz BLOSUM62 utilizando los parámetros estándar (véase, por ejemplo, el algoritmo BLAST o BLASTX disponible en el servidor del "Centro Nacional de Información Biotecnológica" (NCBI, Bethesda, Md., EE.UU.), así como en Altschul et al.; y por lo tanto, este documento habla de utilizar el algoritmo o el BLAST o BLASTX y la matriz BLOSUM62 mediante el término “blasts”).

La identidad de secuencia entre dos secuencias de nucleótidos también se puede determinar utilizando el programa "Align" de Myers y Miller, ("Optimal Alignments in Linear Space”, CABIOS 4, 11-17, 1988) y disponible en NCBI, así como el mismo u otros programas disponibles a través de Internet en los sitios de la misma, tales como el sitio de NCBI.

Alternativa o adicionalmente, el término "identidad", por ejemplo, con respecto a una secuencia de nucleótidos o aminoácidos, puede indicar una medida cuantitativa de homología entre dos secuencias. El porcentaje de homología de secuencias puede calcularse como: (Ne - Ndr) * 100/Ne, en la que Nd<r es el número total de residuos no idénticos en las dos secuencias cuando se alinean y en la que N e es el número de residuos en una de las secuencias. Por lo tanto, la secuencia de ADN AGTCAGTC tendrá una identidad de secuencia del 75% con la secuencia AATCAATC (Nrer = 8; Nd<r = 2).

Alternativa o adicionalmente, la "identidad" con respecto a secuencias puede referirse al número de posiciones con nucleótidos o aminoácidos idénticos dividido por el número de nucleótidos o aminoácidos en la más corta de las dos secuencias, en la que la alineación de las dos secuencias puede determinarse de acuerdo con el algoritmo de Wilbur y Lipman (Wilbur y Lipman), por ejemplo, usando un tamaño de ventana de 20 nucleótidos, una longitud de palabra de 4 nucleótidos y una penalización por hueco de 4, y se pueden realizar convenientemente un análisis asistido por ordenador y la interpretación de la datos de la secuencia, incluyendo la alineación, utilizando programas disponibles comercialmente (por ejemplo, Intelligenetics™ Suite, Intelligenetics Inc. CA). Cuando las secuencias de ARN se dice que son similares o que tienen un grado de identidad u homología de secuencia con secuencias de ADN, la timidina (T) en la secuencia de ADN se considera igual a uracilo (U) en la secuencia de ARN. Por lo tanto, las secuencias de ARN están dentro del alcance de la invención y pueden derivarse de secuencias de ADN, considerándose la timidina (T) en la secuencia de ADN igual a uracilo (U) en las secuencias de ARN.

La identidad de secuencia o similitud de secuencia de dos secuencias de aminoácidos, o la identidad de secuencia entre dos secuencias de nucleótidos se pueden determinar utilizando el paquete de software Vector NTI (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA).

Ventajosamente, la identidad u homología de secuencia, tal como una identidad u homología de secuencia de aminoácidos, pueden determinarse usando el programa BlastP (Altschul et al.) disponible en NCBI, así como el mismo u otros programas disponibles a través de Internet en los sitios de la misma, tales como el sitio de NCBI.

Los siguientes documentos proporcionan algoritmos para comparar la identidad u homología relativa de secuencias, y adicional o alternativamente con respecto a lo anterior, las enseñanzas de estas referencias pueden utilizarse para determinar el porcentaje de homología o identidad: Needleman SB y Wunsch CD; Smith TF y Waterman MS; Smith TF, Waterman MS y Sadler JR; Feng DF y Dolittle RF; Higgins DG y Sharp PM; Thompson ^j D, Higgins DG y Gibson TJ; y, Devereux J, Haeberlie P y Smithies O. Y, sin demasiada experimentación, el experto puede consultar muchos otros programas o referencias para determinar el porcentaje de homología.

Los polinucleótidos de Lu. Longipalpis pueden incluir un ADN recombinante que se incorpora en un vector, en un plásmido o virus de replicación autónoma, o en el ADN genómico de un procariota o eucariota, o que existe como una molécula separada (por ejemplo, un ADNc) independiente de otras secuencias.

Los vectores recombinantes descritos en el presente documento pueden incluir un polinucleótido que codifica un polipéptido, una variante del mismo o un fragmento del mismo. Los vectores recombinantes pueden incluir plásmidos y vectores virales y se pueden usar para la expresión in vitro o in vivo. Los vectores recombinantes pueden incluir además un péptido señal. Los péptidos señal son de cadenas peptídicas cortas (3-60 aminoácidos de longitud) que dirigen el transporte posterior a la traducción de una proteína (que se sintetiza en el citosol) a ciertos orgánulos, tales como el núcleo, la matriz mitocondrial, retículo endoplásmico, cloroplasto, apoplasto y peroxisoma. Típicamente, los polipéptidos de Lu. Longipalpis salivales naturales, tales como las proteínas LJM17 y LJL143, pueden traducirse como precursores, que tienen una secuencia de péptido señal N-terminal y un dominio de proteína "madura". El péptido señal puede escindirse rápidamente tras la traducción. La secuencia señal puede ser la secuencia natural de la proteína salival o un péptido señal de una proteína secretada, por ejemplo, el péptido señal de la proteína de activador del plasminógeno tisular (tPA), en particular el tPA humano (S. Friezner Degen et al.; R. Rickles et al.; D. Berg. et al.), o el péptido señal del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF1), en particular el IGF1 equina (K. Otte et al.), el IGF1 canino (P. Delafontaine et al.), el IGF1 felino (WO03/022886), el IGF1 bovino (S. Lien et al.), el IGF1 porcino (M. Muller et al.), el IGF1 de pollo (Y. Kajimoto et al.), el IGF1 de pavo (GenBank número de acceso AF074980). El péptido señal de IGF1 puede ser natural u optimizado que puede conseguirse mediante la eliminación de los sitios de corte y empalme crípticos y/o mediante la adaptación del uso de codones. Tras la traducción, el polipéptido no procesado se puede escindir en un sitio de escisión para dar lugar al polipéptido maduro. El sitio de escisión puede predecirse utilizando el procedimiento de Von Heijne (1986).

Un plásmido que puede incluir una unidad de transcripción de ADN, por ejemplo una secuencia de ácido nucleico que le permite replicarse en una célula huésped, tal como un origen de replicación (procariota o eucariota). Un plásmido también puede incluir uno o más genes marcadores seleccionables y otros elementos genéticos conocidos en la técnica. Las formas circulares y lineales de plásmidos están abarcados en la presente descripción.

En un aspecto adicional, la vacuna para usar según la invención comprende un vector de expresión in vivo que comprende una secuencia de polinucleótidos, que contiene y expresa in vivo en un huésped los polipéptidos de Lu. Longipalpis salivales.

Un vector de expresión in vivo puede incluir cualquier unidad de transcripción que contiene un polinucleótido o un gen de interés y los elementos esenciales para su expresión in vivo. Estos vectores de expresión pueden ser plásmidos o vectores virales recombinantes. Para la expresión in vivo, el promotor puede ser de origen viral o celular. En una realización, el promotor puede ser el promotor temprano de citomegalovirus (CMV) (promotor CMV-IE), el promotor temprano o tardío del virus SV40 o el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous, un promotor de un gen del citoesqueleto, tal como el promotor de desmina (Kwissa M et al.) o el promotor de actina (Miyazaki J. et al.). Cuando varios genes están presentes en el mismo plásmido, se pueden proporcionar en la misma unidad de transcripción o en diferentes unidades.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "plásmido" puede incluir cualquier unidad de transcripción de ADN que comprende un polinucleótido de acuerdo con la invención y los elementos necesarios para su expresión in vivo en una célula o células del huésped o diana deseada; y, en este sentido, cabe indicar que un plásmido circular, superenrollado o no superenrollado, así como una forma lineal, pretenden estar dentro del alcance de la invención. Los plásmidos también pueden comprender otros elementos reguladores de la transcripción, tales como, por ejemplo, secuencias de estabilización de tipo intrón. En varias realizaciones, los plásmidos pueden incluir el primer intrón de CMV-IE (WO 89/01036), el intrón II del gen de beta-globina de conejo (van Ooyen et al.), la secuencia señal de la proteína codificada por el activador del plasminógeno tisular (tPA; Montgomery et al.), y/o una señal de poliadenilación (poliA), en particular la poliA del gen de la hormona de crecimiento bovino (bGH) (US 5.122.458) o la polyA del gen de beta-globina de conejo o del virus SV40.

En el presente documento se describe una composición de vacuna que comprende: a) un vector de expresión in vivo, en el que el vector comprende un polinucleótido que codifica uno o más polipéptidos seleccionados del grupo que consiste en un polipéptido salival de Lu. Longipalpis, una variante o fragmento del polipéptido salival de Lu. Longipalpis, y una mezcla de los mismos; y b) un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

En el presente documento se describe una composición de vacuna que comprende: a) un primer vector de expresión in vivo, en el que el vector comprende un polinucleótido que codifica uno o más polipéptidos seleccionados del grupo que consiste en un polipéptido salival de Lu. Longipalpis, una variante o fragmento del polipéptido salival de Lu. Longipalpis, y una mezcla de los mismos; b) un segundo vector de expresión in vivo, en el que el vector comprende un polinucleótido que codifica uno o más polipéptidos seleccionados del grupo que consiste en un polipéptido salival de Lu. Longipalpis, una variante o fragmento del polipéptido salival de Lu. Longipalpis, y una mezcla de los mismos; y c) un vehículo, diluyente o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable.

[0070] El término "composición de vacuna" o "vacuna" comprende cualquier composición, una vez que se ha inyectado a un huésped, incluyendo caninos, felinos y seres humanos, que protege al huésped de la Leishmaniasis cutánea y/o Leishmaniasis visceral, y/o que puede prevenir la implantación del parásito, y/o que puede prevenir la progresión de la enfermedad en sujetos infectados, y/o que puede limitar la difusión de parásitos fugitivos a los órganos internos, y/o que pueda evitar o captación límite parásito por una mosca de la arena durante una harina de sangre en un perro vacunado. Esto se puede lograr tras la vacunación según la presente invención a través de la inducción de la secreción de citoquinas, en particular la secreción de IFN-gamma (como ejemplo de un procedimiento de medición de la secreción de IFN-gamma, el inmunoensayo Quantikine de R & D Systems Inc. (número de catálogo # CAIF00) podría ser utilizado (Djoba Siawaya JF et al.)).

Los vehículos o excipientes de uso farmacéuticamente aceptables son convencionales. Remington's Pharmaceutical Sciences por EW Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15a Edición (1975), describe composiciones y formulaciones adecuadas para la administración farmacéutica de los polipéptidos, plásmidos, vectores virales descritos en el presente documento. En general, la naturaleza del vehículo o excipiente dependerá del modo de administración que se utiliza. Por ejemplo, las formulaciones parenterales normalmente comprenden fluidos inyectables que incluyen fluidos farmacéutica y fisiológicamente aceptables, tales como agua, solución salina fisiológica, soluciones salinas equilibradas, dextrosa acuosa, glicerol o similares como un vehículo. Para las composiciones sólidas (por ejemplo, formas de pastilla liofilizada, polvo, píldora, comprimido o cápsula), los vehículos o excipientes sólidos no tóxicos convencionales pueden incluir, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón o estearato de magnesio. Además de vehículos o excipientes biológicamente neutros, las composiciones inmunogénicas a administrar pueden contener también cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes y agentes de tamponamiento de pH y similares, por ejemplo acetato de sodio o monolaurato de sorbitán.

Las vacunas de acuerdo con la presente invención pueden incluir vectores que codifican cualquier polinucleótido de acuerdo con la presente invención, tal como se describe anteriormente.

Se pueden realizar múltiples inserciones en el mismo vector utilizando diferentes sitios de inserción o utilizando el mismo sitio de inserción. Cuando se utiliza el mismo sitio de inserción, cada inserto de polinucleótido, que puede ser cualquier polinucleótido de la presente invención mencionado anteriormente, se puede insertar bajo el control del mismo y/o diferentes promotores. La inserción se puede realizar cola a cola, cabeza a cabeza, cola a cabeza o cabeza a cola. Los elementos IRES (sitio interno de entrada al ribosoma, véase el documento EP 0.803.573) también se pueden utilizar para separar y para expresar múltiples insertos unidos operativamente al mismo y/o diferentes promotores.

En una realización, un vector de expresión para usar según la invención comprende un polinucleótido mencionado anteriormente. El vector de expresión puede ser un vector de expresión in vivo o un vector de expresión in vitro.

Los vectores de expresión in vivo para usar de acuerdo con la invención incluyen cualquier plásmido (EP-A2-1001025; Chaudhuri P) que contiene y expresa in vivo en un huésped, el polinucleótido o gen de polipéptido salival de Lu. Longipalpis, variante del mismo o fragmento del mismo y los elementos necesarios para su expresión in vivo.

En un ejemplo específico no limitativo, el plásmido pVR1020 o pVR1012 (VI CAL Inc.; Luke C. et al.; Hartikka J. et al.), pVR2001-TOPA (o pVR2001-TOPO) (Oliveira F. et al.) o pAB110 (US 6.852.705) se puede utilizar como un vector para la inserción de una secuencia de polinucleótidos. El plásmido pVR1020 se deriva de pVR1012 y contiene la secuencia señal de tPA humano. El pVR1020 es un esqueleto del plásmido disponible de Vical, Inc., (San Diego, CA) que se ha utilizado previamente, véase, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nos. 6.451.769 y 7.078.507. Tal como se describe en Oliveira et al., el plásmido pVR2001-TOPO (o pVR2001-TOPA) es pVR1020 modificado por la adición de topoisomerasas que flanquean el sitio de clonación y contienen la codificación y expresión de un péptido señal de secreción, por ejemplo, péptido señal de activador del plasminógeno tisular (tPA), que aumenta la probabilidad de producir una proteína secretada, (véase la Figura 1 en Oliveira F. et al.).

Cada plásmido puede comprender o contener o consistir esencialmente en, un polinucleótido antes mencionado, unido operativamente a un promotor o bajo el control de un promotor o dependiente de un promotor, en el que el promotor puede estar ventajosamente adyacente al polinucleótido para el que se desea la expresión. En general, es ventajoso emplear un promotor fuerte que es funcional en células eucariotas. Un ejemplo de un promotor útil puede ser el promotor de citomegalovirus temprano inmediato (CMV-IE) de origen humano o murino, o puede tener opcionalmente otro origen, tal como de rata o conejillo de indias. El promotor CMV-IE puede comprender la parte del promotor real, que puede o no estar asociado con la parte potenciadora. Se puede hacer referencia a los documentos EP 260 148, EP 323 597, US 5.168.062, 5.385.839, y 4.968.615, así como al documento WO 87/03905. El promotor CMV-IE puede ser ventajosamente un CMV-IE humano (Boshart M. et al.) o CMV-IE murino. En términos más generales, el promotor puede tener un origen viral o un origen celular. Un fuerte promotor viral distinto del CMV-IE que puede emplearse útilmente en la práctica de la invención es el promotor temprano/tardío del virus SV40 o el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous. Un fuerte promotor celular que puede emplearse útilmente en la práctica de la invención es el promotor de un gen del citoesqueleto, tal como el promotor de desmina (Kwissa M. et al.), o el promotor de actina (Miyazaki J. et al.). Los subfragmentos funcionales de estos promotores, es decir, porciones de estos promotores que mantienen actividad promotora adecuada, se incluyen dentro de la presente invención, por ejemplo los promotores de CMV-IE truncados según los documentos WO 98/00166 o US 6.156.567 y se pueden usar en la práctica de la invención. Un promotor útil en la práctica de la invención, por consiguiente, puede incluir derivados y/o subfragmentos de un promotor de longitud completa que mantienen una actividad promotora adecuada y por lo tanto, funcionan como promotor, y que pueden tener ventajosamente la actividad del promotor que es sustancialmente similar a la del promotor real o de longitud completa del que se deriva el derivado o subfragmento, por ejemplo, similar a la actividad de los promotores CMV-IE truncados de la patente US 6.156.567 en comparación con la actividad de promotores de CMV-IE de longitud completa. Por lo tanto, un promotor de CMV-IE en la práctica de la invención puede comprender o consistir esencialmente en o consistir en la porción de promotor del promotor de longitud completa y/o la porción potenciadora del promotor de longitud completa, así como derivados y/o subfragmentos de los mismos.

Ventajosamente, los plásmidos comprenden o consisten esencialmente en otros elementos de control de expresión. Es especialmente ventajoso incorporar una secuencia o secuencias de estabilización, por ejemplo, secuencia o secuencias de intrón, por ejemplo, el primer intrón del hCMV-IE (WO 89/01036), el intrón II del gen de pglobina de conejo (van Ooyen et al.). En cuanto a la señal de poliadenilación (poliA) para los plásmidos y vectores virales distintos de poxvirus, puede hacerse utilizarse la señal de poli (A) del gen de hormona de crecimiento bovina (bGH) (véase el documento US 5.122.458), o la señal de poli (A) del gen de p-globina de conejo o la señal de poli (A) del virus SV40.

En una realización de la presente invención, el vector plásmido para usar de acuerdo con la invención es pVR2001 que comprende el polinucleótido LJM17, tal como se describe en el ejemplo 1 en el presente documento.

En el presente documento se describe el plásmido vector es pR2001 que comprende el polinucleótido LJL143, tal como se describe en el ejemplo 2 en el presente documento.

En otra realización de la presente invención, el plásmido vector para usar de acuerdo con la invención es pNBO002, tal como se describe en el ejemplo 10 en este documento.

En el presente documento se describe el plásmido vector pNBO003, tal como se describe en el ejemplo 10 en este documento.

De manera más general, la presente descripción abarca vectores de expresión in vivo que incluyen cualquier vector viral recombinante que contiene un polinucleótido o gen que codifica uno o más inmunógenos salivales de Lu. Longipalpis y/o variantes o fragmentos de los mismos, incluyendo todos los elementos necesarios para su expresión in vivo.

Dichos vectores virales recombinantes podrían seleccionarse entre, por ejemplo, los poxvirus, especialmente virus de la viruela aviar, tales como virus de la viruela en aves de corral o virus de la viruela del canario. En una realización, el virus de la viruela en aves de corral es un TROVAC (véase el documento WO 96/40241). En otra realización, el vector de la viruela del canario es un ALVAC. El uso de estos vectores virales recombinantes y la inserción de polinucleótidos o genes de interés se describen completamente en el documento US 5.174.993; US 5.505.941 y US 5.766.599 para la viruela en aves de corral, y US 5.756.103 de la viruela del canario. Se podría utilizar más de un sitio de inserción dentro del genoma viral para la inserción de múltiples genes de interés.

En una realización, el vector viral es un adenovirus, tal como un adenovirus humano (HAV) o un adenovirus canino (CAV).

En otra realización, el vector viral es un adenovirus humano, específicamente un adenovirus de serotipo 5, hecho incompetente para la replicación mediante una deleción en la región E1 del genoma viral, en especial desde aproximadamente el nucleótido 459 hasta aproximadamente el nucleótido 3510 por referencia a la secuencia de hAd5 descrita en Genbank con el número de acceso M73260 y en la publicación de referencia Chroboczek et al, 1992. El adenovirus suprimido se propaga en células 293 que expresan EI (Graham et al., 1977) o células PER, especialmente PER.C6 (Falloux et al., 1998). El adenovirus humano puede adicional o alternativamente eliminarse en la región E3, especialmente desde aproximadamente el nucleótido 28592 hasta aproximadamente el nucleótido 30470. La deleción en la región de El se puede realizar en combinación con una deleción en la región E3 (véase, por ejemplo Shriver et al.; Graham et al.; Ilan et al.; las patentes de Estados Unidos n° 6.133.028 y 6.692.956; Tripathy et al.; Tapnell; Danthinne et al.; Berkner; Berkner et al.; Chavier et al). Los sitios de inserción pueden ser los locus (regiones) E1 y/o E3 eventualmente después de una supresión parcial o completa de las regiones E1 y/o E3. Ventajosamente, cuando el vector de expresión es un adenovirus, el polinucleótido que va a expresarse se introduce bajo el control de un promotor funcional en células eucariotas, tal como un promotor fuerte, de manera ventajosa un promotor del gen temprano inmediato de citomegalovirus (promotor de CMV-IE), especialmente la región potenciadora/promotora desde aproximadamente el nucleótido -734 hasta aproximadamente el nucleótido 7 en Boshart et al., o la región potenciadora/promotora del vector pCI de promotor Promega Corp. El promotor de CMV-IE es ventajosamente de origen murino o humano. El promotor del factor de elongación 1a también se puede utilizar. Un promotor específico de músculo también se puede utilizar (Li et al.). Promotores fuertes también se discuten en este documento en relación con vectores plasmídicos. En una realización, una secuencia de corte y empalme puede estar situada en dirección 3' de la región potenciadora/promotora. Por ejemplo, el intrón 1 aislado del gen de CMV-IE (Stenberg et al.), el intrón aislado del gen de p-globina de conejo o humano, especialmente el intrón 2 del gen de p-globina, el intrón aislado del gen de inmunoglobulina, una secuencia de corte y empalme del gen temprano de SV40 o la secuencia de intrón quimérica aislada a partir del vector pCI de Promege Corp. Se pueden insertar una secuencia de poli (A) y una secuencia de terminación en dirección 3' del polinucleótido a expresar, por ejemplo, un gen de la hormona de crecimiento bovina, especialmente desde aproximadamente el nucleótido 2339 hasta aproximadamente el nucleótido 2550 en el Genbank bajo el número de acceso BOVGHRH, un gen p-globina de conejo o una señal de poliadenilación de gen tardíos de SV40.

En otra realización, el vector viral es un adenovirus canino, especialmente un CAV-2 (véase, por ejemplo, Fischer et al.; patentes de Estados Unidos n° 5.529.780 y 5.688.920; w O 95/14102). Para CAV, los sitios de inserción pueden estar en la región E3 y/o en la región situada entre la región E4 y la región ITR derecha (véanse las Patentes de Estados Unidos Nos. 6.090.393 y 6.156.567). En una realización, el inserto está bajo el control de un promotor, tal como un promotor del gen temprano inmediato de citomegalovirus (promotor de CMV-IE) o un promotor ya descrito para un vector de adenovirus humano. Se pueden insertar una secuencia de poli (A) y una secuencia de terminación en dirección 3' del polinucleótido a expresar, por ejemplo, un gen de la hormona de crecimiento bovina o o una señal de poliadenilación del gen p-globina de conejo.

En otra realización, el vector viral es un virus del herpes, tal como un virus del herpes canino (CHV) o un virus del herpes felino (FHV). Para CHV, los sitios de inserción pueden estar en el gen de timidina quinasa, en el ORF3, o en el ORF de UL43 (véase el documento US 6.159.477). En una realización, el polinucleótido que va a expresarse se introduce bajo el control de un promotor funcional en células eucariotas, ventajosamente un promotor de CMV-IE (murino o humano). Se pueden insertar una secuencia de poli(A) y secuencia de terminador en dirección 3' del polinucleótido a expresar, por ejemplo, hormona de crecimiento bovina o una señal de poliadenilación del gen de pglobina de conejo.

Para los vectores recombinantes basados en un vector de poxvirus, se pueden utilizar un virus vaccinia o un virus vaccinia atenuado, (por ejemplo, MVA, una cepa Ankara modificada obtenida después de más de 570 pasajes de la cepa de la vacuna Ankara en fibroblastos de embriones de pollo; ver Stickl y Hochstein-Mintzel; Sutter et al.; disponible como ATCC VR-1508; o NYVAC, véase la patente de Estados Unidos No. US 5.494.807 y la Patente de Estados Unidos N° 5.494.807 que describen la construcción de NYVAC, así como las variaciones de NYVAC con ORF adicionales eliminados de la cepa Copenhagen del genoma del virus vaccinia, así como la inserción de moléculas de ácidos nucleicos codificantes heterólogas en los sitios de este recombinante, y también, el uso de promotores emparejados; véase también WO 96/40241), un virus de la viruela aviar o un virus de la viruela aviar atenuado (por ejemplo, viruela aviar del canario, viruela aviar, “dovepox”, viruela de la paloma, viruela de codorniz, ALVAC o TrOVAC; véase, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos n° 5.505.941, 5.494.807). El virus de la viruela de canario atenuado se describe en US 5.756.103 (ALVAC) y el documento WO 01/05934. También se hace referencia a US 5.766.599 que se refiere a la cepa de la viruela aviar atenuada TROVAC. Se hace referencia a la viruela del canario disponible en la ATCC bajo el número de acceso VR-111. Numerosas cepas de vacunación del virus de la viruela aviar también están disponibles, por ejemplo, la cepa DIFTOSEC TC comercializada por Merial y la vacuna NOBILIS VARIOLE comercializada por Intervet. Para obtener información sobre el procedimiento utilizado para generar recombinantes del mismo y cómo administrar recombinantes del mismo, el experto en la materia puede referirse documentos citados en la presente memoria y al documento WO 90/12882, por ejemplo, en cuanto al virus vaccinia, se hace mención de las Patentes de Estados Unidos Nos. 4.769.330, 4.722.848, 4.603.112, 5.110.587, 5.494.807 y 5.762.938, entre otras; en cuanto a la viruela aviar, se hace mención de las Patentes de Estados Unidos Nos. 5.174.993, 5.505.941 y 5.766.599, entre otras; en cuanto a la viruela del canario, se hace mención de la patente de Estados Unidos N° 5.756.103, entre otras. Cuando el vector de expresión es un virus vaccinia, el sitio o sitios de inserción para el polinucleótido o los polinucleótidos a expresar son ventajosamente en el gen o el sitio de inserción de la timidina quinasa (TK), el gen o sitio de inserción de la hemaglutinina (HA), la región que codifica el cuerpo de inclusión del tipo A (ATI); véanse también los documentos citados en este documento, especialmente los relacionados con virus vaccinia. En el caso de la viruela del canario, ventajosamente el sitio o sitios de inserción son ORF (s) C3, C5 y/o C6; véanse también los documentos citados aquí, especialmente aquellos relativos al virus de la viruela del canario. En el caso de la viruela aviar, ventajosamente el sitio o sitios de inserción son ORFs F7 y/o F8; véanse también los documentos citados aquí, especialmente aquellos relativos al virus de la viruela aviar. El sitio o sitios de inserción para el virus MVA son ventajosamente como en varias publicaciones, incluyendo Carroll MW et al.; Stittelaar KJ et al.; Sutter G. et al.; y, en este sentido también se indica que el genoma de MVA completo se describe en Antoine G., Virology, que permite que el experto en la técnica use otros sitios de inserción u otros promotores. Ventajosamente, el polinucleótido que se expresa se inserta bajo el control de un promotor de virus de la viruela específico, por ejemplo, el promotor de vaccinia de 7,5 kDa (Cochran et al), el promotor de vaccinia I3L (Riviere et al.), el promotor de vaccinia HA (Shida), el promotor de la viruela de vaca ATI (Funahashi et al.), el promotor de vaccinia H6 (Taylor J. et al.; Guo P. et al. J.; Perkus M. et al.), entre otros.

En una realización adicional, el vector viral recombinante para uso de acuerdo con la invención es el virus recombinante de viruela del canario ALVAC vCP2390-SEQ ID NO: 6, que expresa el polipéptido salival LJM17 de Lu. longipalpis, tal como se describe en el ejemplo 3.

En una realización adicional, el vector viral recombinante para uso de acuerdo con la invención es el virus MVA recombinante MVA-LJL17, que expresa el polipéptido salival LJM17 de Lu. Longipalpis, tal como se describe en el ejemplo 5.

En el presente documento se describe que el vector viral recombinante es el virus de la viruela del canario ALVAC recombinante vCP2389-SEQ ID NO: 2, que expresa el polipéptido salival LJL143 de Lu. Longipalpis, tal como se describe en el ejemplo 4.

En el presente documento se describe que el vector viral recombinante es el virus de la viruela del canario ALVAC recombinante vCP2389, que expresa el polipéptido salival LJL143 de Lu. Longipalpis, tal como se describe en el ejemplo 12.

En una realización adicional, el vector viral recombinante para uso de acuerdo con la invención es el virus de viruela del canario ALVAC recombinante vCP2390, que expresa el polipéptido salival LJM17 de Lu. Longipalpis, tal como se describe en el ejemplo 11.

En el presente documento se describe que el vector viral recombinante es el virus MVA recombinante MVA-LJL143, que expresa el polipéptido LJL143 salival de Lu. Longipalpis, tal como se describe en el ejemplo 6.

Cualquiera de los polinucleótidos descritos aquí puede expresarse in vitro por transferencia de ADN o vectores de expresión en una célula huésped adecuada. La célula huésped puede ser procariota o eucariota. El término "célula huésped" también incluye cualquier progenie de la célula huésped sujeto. Los procedimientos de transferencia estable, que significan que el polinucleótido foráneo se mantiene continuamente en la célula huésped, son conocidos en la técnica. Las células huésped pueden incluir bacterias (por ejemplo, Escherichia coli), levaduras, células de insectos y células de vertebrados. Los procedimientos para expresar secuencias de ADN en células eucariotas son bien conocidos en la técnica. Como procedimiento para la expresión in vitro, se pueden usar vectores de baculovirus recombinantes (por ejemplo, Autographa California Virus Polihedrosis Nuclear (AcNPV)) con los ácidos nucleicos descritos en este documento. Por ejemplo, los promotores de polihedrina se pueden utilizar con células de insectos (por ejemplo, células de Spodoptera frugiperda, como células Sf9 disponibles en la ATCC bajo el número de acceso CRL 1711, o células Sf21) (ver por ejemplo, Smith et al.; Pennock et al.; Vialard y et al.; Verne A.; O'Reilly et al.; Kidd I.M. y Emery V.C.; EP 0370573; EP 0265785, US 4745051). Para la expresión, se puede utilizar el paquete BaculoGold Starter (Cat # 21001K) de Pharmingen (Becton Dickinson). Como procedimiento para la expresión in vitro, se puede utilizar E. coli recombinante con un vector. Por ejemplo, cuando se clona en sistemas bacterianos, pueden usarse promotores inducibles, tales como el promotor de arabinosa, pL del bacteriófago lambda, plac, ptrp, ptac (promotor híbrido ptrp-lac) y similares. La transformación de una célula huésped con ADN recombinante puede llevarse a cabo mediante técnicas convencionales que son bien conocidas para los expertos en la técnica. Cuando el huésped es procariota, tal como E. coli, las células competentes que son capaces de la captación de ADN se pueden preparar a partir de células recogidas después de la fase de crecimiento exponencial y tratarse posteriormente mediante el procedimiento de CaCl2 usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Alternativamente, se pueden utilizar MgCl2 o RbCl. La transformación también puede llevarse a cabo mediante electroporación. Cuando el huésped es un eucariota, se pueden utilizar procedimientos de transducción de ADN, tales como coprecipitados con fosfato de calcio, procedimientos mecánicos convencionales, tales como microinyección, electroporación, inserción de un plásmido encerrado en liposomas, o vectores de virus. Las células eucariotas también pueden cotransformarse con secuencias de polinucleótidos de L. Iongipalpis, y una segunda molécula de ADN exógeno que codifica un fenotipo seleccionable, tal como el gen de la timidina quinasa del herpes simple. Otro procedimiento es usar un vector viral eucariota (ver anteriormente), tal como un virus herpes o adenovirus (por ejemplo, adenovirus canino 2), para transducir de forma transitoria células eucariotas y expresar la proteína (Gluzman ^eA). Además, se puede utilizar un agente de transfección, tal como dioleoil-fosfatidil-etanolamina (DOPE).

El aislamiento y purificación de polipéptido expresado recombinantemente pueden llevarse a cabo mediante medios convencionales que incluyen cromatografía preparativa (por ejemplo, exclusión por tamaño, intercambio iónico, afinidad), precipitación selectiva y ultra-filtración. Los ejemplos de técnicas del estado de la técnica que se pueden utilizar, pero sin limitación, se pueden encontrar en "Protein Purification Applications", segunda edición, editado por Simon Roe y disponible en Oxford University Press. Dicho polipéptido expresado de forma recombinante es parte de la presente descripción. Los procedimientos para la producción de cualquier polipéptido de acuerdo con la presente descripción, tal como se describe anteriormente, incluyen el uso de un vector de expresión recombinante que comprende un polinucleótido de acuerdo con la descripción y de una célula huésped.

Las vacunas que contienen vectores virales recombinantes para usar de acuerdo con la invención pueden liofilizarse, de manera ventajosa con un estabilizante. La liofilización puede realizarse de acuerdo con procedimientos de liofilización convencionales bien conocidos. Los estabilizadores farmacéutica o veterinariamente aceptables pueden ser carbohidratos (por ejemplo, sorbitol, manitol, lactosa, sacarosa, glucosa, dextrano, trehalosa), glutamato de sodio (Tsvetkov T et al.; Israeli E et al.), proteínas, tales como peptona, albúmina, lactoalbúmina o caseína, proteína que contiene agentes, tales como leche desnatada (Mills CK et al.; Wolff E et al.), y tampones (por ejemplo tampón fosfato, tampón fosfato de metal alcalino). Puede utilizarse un adyuvante para hacer solubles las preparaciones liofilizadas.

Cualquier composición de vacuna para usar de acuerdo con la invención también pueden contener ventajosamente uno o más adyuvantes.

Las vacunas basadas en plásmidos pueden formularse con lípidos catiónicos, ventajosamente con DMRIE (N-(2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3-bis(tetradeciloxi)-1-propanamonio; WO96/34109) y, ventajosamente, en asociación con un lípido neutro, por ejemplo DOPE (dioleoil-fosfatidil-etanolamina; Behr J.P.), con el fin de formar DMRIE-DOPE. En una realización, la mezcla se produce de manera extemporánea, y antes de su administración, es ventajoso esperar de aproximadamente 10 min a aproximadamente 60 min, por ejemplo, aproximadamente 30 min, para la complejación apropiada de la mezcla. Cuando se utiliza DOPE, la relación molar de DMRIE/DOPE puede ser de 95/5 a 5/95 y es ventajosamente 1/1. La relación en peso de plásmido/DMRIE o DMRIE-adyuvante DOPE es, por ejemplo, de 50/1 a 1/10, de 10/1 a 1/5 o de 1/1 a 1/2.

Opcionalmente se puede añadir una citoquina a la composición, especialmente GM-CSF o citoquinas que inducen Th1 (por ejemplo IL12). Estas citoquinas se pueden añadir a la composición como un plásmido que codifica la proteína de citoquinas. En una realización, las citoquinas son de origen canino, por ejemplo, GM-CSF canino cuya secuencia del gen ha sido depositada en la base de datos GenBank (número de acceso 849738). Esta secuencia se puede utilizar para crear dicho plásmido de una manera similar a lo que se hizo en el documento WO 00/77210. La vacuna basada en vector viral recombinante se puede combinar con fMLP (N-formil-metionil-leucil-fenilalanina; US 6.017.537) y/o adyuvante de carbómero (Phameuropa Vol 8, No. 2, junio de 1996.). Los expertos en la técnica también puede hacer referencia a US 2,909,462, que describe dichos polímeros acrílicos reticulados con un compuesto polihidroxilado que tiene al menos 3 grupos hidroxilo, ventajosamente no más de 8, estando los átomos de hidrógeno de al menos tres hidroxilos reemplazados por radicales alifáticos insaturados que tienen al menos 2 átomos de carbono. Por ejemplo, los radicales son los que contienen de 2 a 4 átomos de carbono, por ejemplo grupos vinilo, alilo y otros grupos etilénicamente insaturados. Los radicales insaturados pueden en sí mismos contener otros sustituyentes, tales como metilo. Los productos que se venden bajo el nombre Carbopol® (BF Goodrich, Ohio, Estados Unidos) son apropiados. Los productos son reticulados con una alil sacarosa o con alil pentaeritritol. Entre ellos, se pueden citar ventajosamente Carbopol® 974P, 934P y 971P.

R^í R²

-----------C --------(CH2) ^x -------C ----(CH2) y

COOH COOH

Entre los copolímeros de anhídrido maleico y derivado alquenilo, los copolímeros EMA® (Monsanto) que son copolímeros de anhídrido maleico y etileno, lineales o reticulados, por ejemplo, reticulados con divinil éter, son ventajosos. Se puede hacer referencia a J. Fields et al.

Los polímeros de ácido acrílico o metacrílico y los copolímeros EMA® están formados, por ejemplo, de unidades básicas de la fórmula siguiente en la que:

- R1 y R2, que son idénticos o diferentes, representan H o CH3

- x = 0 o 1, preferiblemente x = 1

- y = 1 o 2, con x y = 2

Para los copolímeros EMA®, x = 0 e y = 2. Para los carbómeros, x = y = 1.

La disolución de estos polímeros en agua conduce a una solución ácida, que se neutraliza, ventajosamente hasta pH fisiológico, a fin de proporcionar la solución adyuvante en la que se incorpora la vacuna en sí. Los grupos carboxilo del polímero están por tanto parcialmente en forma COO'. En una realización, se prepara una solución de adyuvante, especialmente de carbómero (Pharmeuropa, vol. 8, N° 2, junio de 1996), en agua destilada, de manera ventajosa en presencia de cloruro de sodio, estando la solución obtenida en un pH ácido. Esta solución madre se diluye mediante su adición a la cantidad deseada (para obtener la concentración final deseada), o una parte sustancial de la misma, de agua cargada con NaCl, ventajosamente solución salina fisiológica (NaCl 9 g/l) todas a la vez en varias porciones con una neutralización concomitante o subsiguiente (pH 7,3 a 7,4), ventajosamente con NaOH. Esta solución a pH fisiológico se utiliza para la mezcla con la vacuna, que puede almacenarse especialmente en forma liofilizada, líquida o congelada.

La concentración de polímero en la composición de vacuna final puede ser de 0,01% a 2% p/v, de 0,06 a 1% p/v, o de 0,1 a 0,6% p/v.

La vacuna de subunidades se puede combinar con adyuvantes, como emulsios de aceite-en-agua, agua-en-aceiteen agua a base de aceite mineral y/o aceite vegetal y tensioactivos no iónicos, tales como copolímeros de bloque, Tween® , Span®. Tales emulsiones se describen, en particular, en la página 147 de "Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach”, Pharmaceutical Biotechnology, 1995, o emulsiones de TS, en particular, la emulsión TS6, y emulsiones LF, en particular, emulsión LF2 (tanto para emulsiones TS como emulsiones LF, véase el documento WO 04/024027). Otros adyuvantes adecuados son, por ejemplo, vitamina E, saponinas y Carbopol® (Noveon; véase WO 99/51269; WO 99/44633), hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio (“Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach”, Pharmaceutical Biotechnology, vol . 6, 1995), adyuvantes biológicos (es decir, C4b, especialmente C4b murino (Ogata R T et al.) o C4b equino, GM-CSF, en particular, GM-CSF equino (US 6645740)), toxinas (es decir, toxinas del cólera CTA o CTB, toxinas termolábiles de Escherichia coli LTA o LTB (Olsen CW et al.; Fingerut E et al .; Zurbriggen R et al. Peppoloni S et al.), y CpG (es decir, CpG # 2395 (ver Jurk M et al.), CpG # 2142 (ver SEQ ID NO: 890 en el documento EP 1221955)).

La vacuna también puede contener o comprender uno o más antígenos de Leishmania, por ejemplo, proteína de membrana kinetoplástida 11 (KMP11).

Los antígenos de Leishmania KMP11 derivan de, por ejemplo, L. infantum o L. chagasi. KMP11 es una proteína de membrana de superficie altamente conservada presente en todos los miembros de la familia Kinetoplastidae, y se expresa diferencialmente en formas amastigote y promastigote de Leishmania (Jardim A. et al.; Jardim A. et al.; Berberich C. et al.). La secuencia de ácido nucleico del gen y la secuencia de aminoácidos de la proteína KMP11 de Leishmania están disponibles en bases de datos públicas, en particular como L. infantum en la base de datos GenBank bajo los números de acceso X95627y X95626. La secuencia de ácido nucleico de L. donovani también está disponible de la base de datos GenBank, en particular, bajo el número de acceso S77039.

El estado de la técnica con respecto a KMP11, vectores que expresan KMP11 y las vacunas se resumen mejor en la solicitud de patente WO 08/064181. Una vacuna basada en un plásmido que comprende pVR1020 KMP11 se describe en el ejemplo 1 y la vacuna basada en vectores de virus de viruela del canario que comprende vCP2350 se describe en el ejemplo 3. El documento WO 08/064181 también proporciona información sobre adyuvantes, formulación, dosis y vías de administración.

Los polipéptido KMP11 y variantes o fragmentos de los mismos pueden ser producidos, aislados y purificados de la misma forma establecida para la expresión in vitro de polipéptidos salivales de la mosca de arena.

En una realización, la vacuna para su uso según la presente invención comprende, además, vectores que comprenden me polinucleótido de KMP11 que codifica el polipéptido KMP11 y/o sus fragmentos o variantes de Leishmania. Dicha vacuna contiene un polipéptido salival de Lu. Longipalpis que incluye: un polipéptido que tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO: 5, 7, 15, o 17; o un polinucleótido que codifica un polipéptido salival de Lu. Longipalpis que tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO: 5, 7, 15, o 17; o un polinucleótido que tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con un polinucleótido que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO: 6, 8, 16, 18, 21, 90 o 91.

La vacuna para el uso de acuerdo con la invención puede comprender polipéptidos LJMI7 salivales de Lu. Longipalpis y/o variantes de los mismos, tal como se describen en el presente documento, y/o vectores que comprenden el polinucleótido que codifica el polipéptido LJM17 de Lu. Longipalpis y/o variantes del mismo, tal como se describen en el presente docuento, y/o vectores que comprenden el polinucleótido KMP11 que codifica el polipéptido KMP11 y/o fragmentos o variantes del mismo de Leishmania. Por ejemplo, los vectores para LJM17 pueden seleccionarse del grupo que consiste en pVR2001 LJM17, pNBO002, vCP2390, ^vCP2390-S^eQ ID N0: 6 y MVA-LJM17. Los vectores para KMP11 se pueden seleccionar del grupo que consiste en pVR1020 KMP11 y vCP2350. En una realización, la vacuna comprende plásmidos pVR2001 LJM17 y pVR1020 KMP11. En otra realización, la vacuna comprende vectores vCP2390 y vCP2350. En aún otra realización, la vacuna comprende plásmidos pNBO002 y pVR1020 KMP11. En aún otra realización, la vacuna comprende vCP2390-SEQ ID N0: 6 y vCP2350.

En el presente documento se describe la vacuna que comprende polipéptidos LJL143 salivales de Lu. Longipalpis y/o variantes o fragmentos de los mismos, y/o vectores que comprenden el polinucleótido que codifica el polipéptido LJL143 de Lu. longipalpis y/o variantes o fragmentos del mismo, y/o vectores que comprenden el polinucleótido que codifica los polipéptidos KMP11 de Leishmania y/o variantes o fragmentos de los mismos. Por ejemplo, los vectores para LJL143 pueden seleccionarse del grupo que consiste en pVR2001 LJL143, pNBO003, vCP2389, vCP2389-SEQ ID NO: 2 y MVA-LJL143. Los vectores para KMP11 pueden seleccionarse del grupo que consiste en pVR1020 KMP11 y vCP2350. En una realización, la vacuna comprende plásmidos pVR2001 Lj L143 y pVR1020 k Mp 11. En otra realización, la vacuna comprende vectores vCP2389 y vCP2350. En aún otra realización, la vacuna comprende plásmidos pNBO003 y pVR1020 KMP11. En aún otra realización, la vacuna comprende vectores vCP2389-SEQ ID NO: 2 y vCP2350.

En otra realización particular, la vacuna para su uso según la invención comprende al menos uno de polipéptidos LJM17 salivales de Lu. Longipalpis, variantes de los mismos, tal como se describen en el presente documento, o vectores que comprenden el polinucleótido que codifica el polipéptido LJM17 de Lu. Longipalpis y del mismo, tal como se describe en el presente documento, y puede comprender adicionalmente polipéptidos LJL143 salivales de Lu. Longipalpis y/o variantes o fragmentos de los mismos, y/o vectores que comprenden el polinucleótido LJLI43 que codifica el polipéptido LJL143 de Lu. longipalpis y/o variantes o fragmentos del mismo, y/o polipéptidos KMP11 de Leishmania y/o variantes o fragmentos de los mismos, y/o vectores que comprenden el polinucleótido o gen de KMP11. Por ejemplo, los vectores para LJL143 pueden seleccionarse del grupo que consiste en pVR2001 LJL143, pNBO003, vCP2389, vCP2389-SEQ ID N0: 2 y MVA-LJL143. Los vectores para L1MJ7 pueden seleccionarse del grupo que consiste en pVR2001 LJM17, pNBO002, vCP2390, vCP2390-SEQ ID NO: 6 y MVA-LJM17. Los vectores para KMP11 pueden seleccionarse del grupo que consiste en pVR1020 KMP11 y vCP2350. En una realización, la vacuna comprende plásmidos pVR2001 Lj L143, pVR2001 LJM17 y pVR1020 KMp11. En otra realización, la vacuna comprende vectores vCP2389, vCP2390 y vCP2350. En aún otra realización, la vacuna comprende plásmidos pNBO003, pNBO002 y pVR1020 KMP11. En otra realización, la vacuna comprende vCP2389-SEQ ID NO: 2, vCP2390-SEQ ID NO: 6 y vectores vCP2350.

La vacuna puede también estar asociada con al menos un antígeno de Leishmania, por ejemplo Leishmania inactivada.

En una realización particular, la cepa de Leishmania puede ser Leishmania infantum, y/o Leishmania braziliensis. En una realización preferida, la cepa de Leishmania puede ser Leishmania braziliensis.

Estas cepas de Leishmania se pueden inactivar por procedimientos químicos o físicos. Los procedimientos químicos son de manera destacada BPL, formaldehído. Los procedimientos físicos pueden ser de manera destacada sonicación. Un procedimiento para la inactivación de Leishmania para su uso en una vacuna se describe en R. Cordeiro Giunchetti et al., Vaccine, 2007. Los promastigotes se cultivan en medio NNN/LIT durante 6 a 14 días, pero más preferiblemente 10 días, hasta que se consigue la diferenciación entre la forma procíclica de promastigote y la forma metacíclica de promastigote en base de una observación microscópica. El cultivo a continuación se puede recoger por centrifugación (2000 xg, 20 minutos, 4 °C). Cuando sea aplicable, el sobrenadante se descarta y la biomasa se lava tres veces en tampón de solución salina. Tanto si el cultivo se aclara como si no, la suspensión de promastigotes (es decir, cultivo en bruto o promastigote resuspendido en tampón de solución salina después de la centrifugación) posteriormente se altera mediante tratamiento con ultrasonidos utilizando una potencia de 10 a 375W, pero más preferiblemente de 40 W, durante 1 minuto, a 0 °C. El volumen del lote para este tratamiento es de entre 5 y 150 ml, preferiblemente de 30 ml. Después del tratamiento, el lisado se puede almacenar a -80 °C.

La formulación de vacuna se puede preparar a partir del concentrado de proteína que se obtiene después de la lisis celular. La cantidad de proteína de lisado celular que puede usarse para la vacunación de un canino es de aproximadamente 50 mg a aproximadamente 2000 mg, preferiblemente de aproximadamente 50 mg a aproximadamente 600 mg. La concentración de proteína se determina de acuerdo con el procedimiento de Lowry.

La vacuna contra Leishmania inactivada se puede combinar con adyuvantes, como los descritos anteriormente para las vacunas de subunidades.

En una realización, la vacuna para usar según la invención comprende polipéptidos salivales de Lu. Longipalpis y/o variantes o fragmentos de los mismos, y/o vectores que comprenden el polinucleótido salival de Lu. Longipalpis y/o variantes o fragmentos de los mismos, y/o Leishmania inactivada. Dicha vacuna contiene el polipéptido salival de Lu. Longipalpis incluyendo un polipéptido que tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 5, 7, 15, o 17; o el polinucleótido que codifica un polipéptido salival de Lu. Longipalpis que tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 5, 7, 15, o 17; o el polinucleótido tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con un polinucleótido que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 6, 8, 16, 18, 21, 90, o 91.

En una realización particular, la vacuna para su uso según la invención comprende polipéptidos salival LJM17 de Lu. Longipalpis y/o variantes o fragmentos de los mismos, y/o vectores que comprenden el polinucleótido LJM17 y/o variantes o fragmentos de los mismos,y/o Leishmania inactivada. Por ejemplo, los vectores para LJM17 pueden seleccionarse entre el grupo que consiste en pVR2001 LJM17, pNBO002, vCP2390, vCP2390-SEQ ID NO: 6 y MVA-LJM17, y se pueden combinar con Leishmania inactivado seleccionado del grupo que consiste en Leishmania infantum y/o Leishmania braziliensis inactivados sonicados. Por ejemplo, en una realización, la vacuna comprende el vector vCP2390 y Leishmania braziliensis inactivado sonicado. En otra realización, la vacuna comprende el vector vCP2390-SEQ ID NO: 6 y Leishmania braziliensis inactivado sonicado.

En el presente documento se describe que la vacuna comprende polipéptidos salival LJL143 de Lu. Longipalpis y/o variantes o fragmentos de los mismos, y/o vectores que comprenden el polinucleótido LJL143 y/o variantes o fragmentos del mismo, y/o Leishmania inactivada. Por ejemplo, los vectores para LJL143 pueden ser seleccionados del grupo que consiste en pVR2001 LJL143, pNBO003, vCP2389, vCP2389-SEQ ID NO: 2 y MVA-LJL143. La Leishmania inactivada puede ser seleccionado del grupo que consiste en Leishmania infantum y/o Leishmania braziliensis inactivadas sonicadas. Por ejemplo, en una realización, la vacuna comprende el vector vCP2389 y Leishmania braziliensis inactivada sonicada. En otra realización, la vacuna comprende el vector vCP2389-SEQ ID NO: 2 y Leishmania braziliensis inactivada sonicada. En otra realización particular, la vacuna para su uso según la invención comprende al menos uno de polipéptidos salivales LJM17 de Lu. Longipalpis y/o variantes de los mismos como se describen en el presente documento y/o vectores que comprenden el polinucleótido LJM17 y/o variantes del mismo como se describe en el presente documento, y puede comprender adicionalmente polipéptidos salivales LJL143 de Lu. Longipalpis y/o variantes o fragmentos de los mismos, y/o vectores que comprenden el polinucleótido LJL143 y/o variantes o fragmentos del mismo, y/o Leishmania inactivada. Por ejemplo, los vectores podrían ser seleccionados para LJL143 del grupo que consiste en pVR2001 LJL143, pNBO003, vCP2389, vCP2389-8eQ ID NO: 2 y MVA-LJL143. Para LJM17, los vectores pueden ser seleccionados del grupo que consiste en pVR2001 LJM17, pNBO002, vCP2390, vCP2390-SEC 15 ID NO: 6 y MVA-LJM17. La Leishmania inactivada puede ser seleccionada del grupo que consiste en Leishmania infantum y/o Leishmania braziliensis inactivada sonicada. En una realización, la vacuna comprende los vectores de vCP2389 y vCP2390 y Leishmania braziliensis inactivada sonicada. En otra realización, la vacuna comprende los vectores vCP2389-SEQ ID NO: 2 y vCP2390-SEQ ID NO: 6 y Leishmania braziliensis inactivada sonicada.

La presente invención se refiere a composiciones de vacuna descritas en este documento para su uso en la vacunación de un animal canino contra Leishmania.

El huésped es un animal canino (por ejemplo, perros, perras, perritos, zorros, chacales y lobos).

Las vías de administración pueden ser, por ejemplo, intramuscular (IM) o intradérmica (ID) o transdérmica (TD) o subcutánea (SC). Los medios de administración pueden ser, por ejemplo, una jeringa con una aguja, o un aparato sin aguja, o una jeringa con una aguja acoplada a tratamiento con electrotransferencia (ET), o un aparato sin aguja acoplada a tratamiento con ET.

Otro aspecto de la descripción se refiere al uso de una vacuna basada en un plásmido de acuerdo con la presente descripción para la administración a Leishmania, un huésped, en el que esta administración está acoplada al tratamiento ET. La administración de una vacuna basada en plásmido es ventajosamente intramuscular. El medio de administración es, por ejemplo, una jeringa y una aguja. Una o varias inyecciones pueden administrarse sucesivamente. En el caso de varias inyecciones, se pueden llevar a cabo con de 2 a 6 semanas de diferencia, por ejemplo, alrededor de 3 semanas de diferencia. En una realización, se administra adicionalmente un refuerzo semianual o un refuerzo anual.

Para las vacunas basadas en plásmidos, las rutas ventajosas de administración pueden ser ID o IM. Esta administración puede ser a través del uso de una jeringa con una aguja o con un aparato sin aguja como Dermojet o Biojector (Bioject, Oregon, EE.UU.) o Vetjet™ (Merial) o Vitajet™ (Bioject Inc.), véase el documento US 2006/0034867. La dosificación puede ser de 50 mg hasta 500 mg por plásmido. Cuando se añade DMRIE-DOPE, se pueden utilizar 100 mg por plásmido. Cuando se utilizan GM-CSF caninos u otras citoquinas, el plásmido que codifica esta proteína puede estar presente en una dosis de aproximadamente 200 mg a aproximadamente 500 mg y puede ser ventajosamente de 200 mg. El volumen de dosis puede ser de entre 0,01 ml y 0,5 ml, por ejemplo, 0,25 ml. La administración puede estar provista de múltiples puntos de inyección.

Alternativamente, las vacunas basadas en plásmidos pueden administrarse por vía IM acopladas a tratamiento de electrotransferencia (ET). El tratamiento ET puede realizarse utilizando un aparato para electrotransferencia y las especificaciones del fabricante (es decir, generador G250 Sphergen (Sphergen sAr L, Evry Genopole, Francia); sistema de electroporación de ADN MedPulser® (Innovio Biomedical Corporation, San Diego, California, EE.UU.)). En una realización, el aparato para electrotransferencia tiene un campo unipolar. La intensidad de campo puede ser de aproximadamente 50 a aproximadamente 250 V/cm, de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 V/cm, o de aproximadamente 50 a aproximadamente 175 V/cm. La duración de pulso puede ser de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 ms, o de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 ms. La frecuencia puede ser de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 Hz, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 15 Hz. El intervalo entre pulsos puede ser de aproximadamente 1 a 1000 ms, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 200 ms. El número de pulsos puede ser de 1 a 20, o de 5 a 10. La intensidad intratisular puede ser ventajosamente de hasta aproximadamente 2 A. La distancia entre los electrodos puede ser de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 1 cm, o de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 0,5 cm.

Para las vacunas basadas en vectores virales recombinantes, las vías de administración pueden ser, ventajosamente, SC o IM o TD o ID. Esta administración puede hacerse mediante una jeringa con una aguja o con un aparato sin aguja como Dermojet o Biojector (Bioject, Oregon, EE.UU.) o Vetjet™ (Merial) o Vitajet™ (Bioject Inc.). La dosis puede ser de aproximadamente 103 ufp a aproximadamente 109 ufp por vector virus de la viruela recombinante. Cuando el vector es un virus de viruela del canario, la dosificación puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 105 ufp a aproximadamente 109 ufp, o de aproximadamente 106 ufp a aproximadamente 108 ufp. El volumen de dosis puede ser de aproximadamente 0,01 ml a 0,2 ml, y es ventajosamente de 0,1 ml. La administración puede comprender múltiples puntos de inyección.

Para la vía IM el volumen de la vacuna proporcionada puede ser de 0,2 a 2 ml, en particular de aproximadamente 0,5 a 1 ml. Las mismas dosis se utilizan para cualquiera de los vectores para usar según la presente invención.

Para las vacunas de subunidades, la vía de administración puede ser, ventajosamente, a través de SC o IM o TD o ID. Esta administración puede hacerse mediante una jeringa con una aguja o con un aparato sin aguja como Dermojet o Biojector (Bioject, Oregon, EE.UU.) o Veljet ™ (Merial) o Vitajet ™ (Bioject Inc.). La dosis puede ser de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 mg, en particular de aproximadamente 50 a aproximadamente 150 mg, y más particularmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 mg. El volumen de la vacuna de subunidades proporcionada es de 0,2 a 2 ml, en particular de aproximadamente 0,5 a 1 ml.

Se describe en el presente documento una estrategia de vacuna, que se basa en un régimen de administración de sensibilización-refuerzo, donde la administración de sensibilización y la administración o administraciones de refuerzo utilizan una composición que comprende un excipiente, diluyente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable, y un vector de expresión in vivo que comprende una secuencia de polinucleótidos, que contiene y expresa el polipéptido salival de Lu. Longipalpis y/o variantes o fragmentos del mismo.

En el presente documento se describe el uso de vectores de expresión in vivo en un régimen de administración de sensibilización-refuerzo, que comprende una administración de sensibilización de una vacuna que comprende un vehículo, diluyente o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable, un vector de expresión in vivo que contiene una secuencia de polinucleótidos para expresar, in vivo, polipéptidos salivales de Lu. Longipalpis y/o variantes o fragmentos de los mismos, seguido por una administración de refuerzo de una vacuna que comprende un vehículo o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable, un vector de expresión in vivo que contiene una secuencia de polinucleótido para expresar, in vivo, polipéptidos de Lu. Longipalpis de la mosca de la arenay/o variantes o fragmentos de los mismos, como se describió anteriormente, para proteger a un huésped de la leishmaniasis y/o para prevenir la progresión de la enfermedad en huéspedes infectados.

Un régimen de sensibilización-refuerzo comprende al menos una administración de sensibilización y al menos una administración de refuerzo usando al menos un polipéptido común y/o variantes o fragmentos del mismo. La vacuna utilizada en la administración de sensibilización puede ser de naturaleza diferente de las utilizadas una vacuna de refuerzo posterior. La administración de sensibilización puede comprender una o más administraciones. Del mismo modo, la administración de refuerzo puede comprender una o más administraciones.

Las vías de administración, las dosis y los volúmenes se describen como anteriormente en el presente documento.

Las administraciones de sensibilización-refuerzo pueden llevarse a cabo ventajosamente con de 2 a 6 semanas de diferencia, por ejemplo, alrededor de 3 semanas de diferencia. De acuerdo con una realización, también se prevé un refuerzo semianual o un refuerzo anual, de forma ventajosa usando la vacuna basada en vector viral. Los animales tienen ventajosamente al menos 6 a 8 semanas de vida en el momento de la primera administración.

En el presente documento se describe que el régimen de administración de sensibilización-refuerzo comprende al menos una administración de sensibilización de una vacuna basada en un plásmido de acuerdo con la presente descripción y al menos una administración de refuerzo de una vacuna basada en vector viral recombinante de acuerdo con la presente descripción.

En una realización particular, el régimen de administración de sensibilización-refuerzo comprende al menos una administración de sensibilización basada en un vector viral recombinante para su uso según la presente invención y al menos una administración de refuerzo de una vacuna de subunidades para el uso de acuerdo con la presente invención.

En el presente documento se describe que el régimen de administración de sensibilización-refuerzo comprende al menos una administración de sensibilización de una vacuna basada en vector viral recombinante de acuerdo con la presente descripción y al menos una administración de refuerzo de una vacuna basada en un plásmido de acuerdo con la presente descripción.

En el presente documento se describe que la presente descripción se refiere a un procedimiento de vacunación de un sujeto susceptible de Leishmania que comprende un régimen de administración de sensibilización-refuerzo en el que dicho regimiento comprende una administración de sensibilización de una vacuna que comprende, en un vehículo, diluyente o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable, un plásmido que contiene un polinucleótido para expresar, in vivo, un polipéptido salival de Lu. Longipalpis, una variante o fragmento del polipéptido salival de Lu. longipalpis, o una mezcla de los mismos, seguido por una administración de refuerzo de una vacuna que comprende, en un vehículo o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable, un vector recombinante viral que comprende un polinucleótido para expresar, in vivo, el mismo polipéptido o polipéptidos salivales de Lu. longipalpis, variante de los mismos, fragmento de los mismos, para proteger al sujeto de la Leishmaniasis y/o para prevenir la progresión de la enfermedad en sujetos infectados.

En el presente documento se describe que la presente descripción se refiere a un procedimiento de vacunación de un sujeto susceptible de Leishmania que comprende un régimen de administración de sensibilización-refuerzo en el que dicho regimiento comprende una administración de sensibilización de una vacuna que comprende, en un vehículo, diluyente o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable, un vector recombinante viral que comprende un polinucleótido para expresar, in vivo, un polipéptido salival de Lu. Longipalpis, una variante o fragmento del polipéptido salival de Lu. Longipalpis, o una mezcla de los mismos, seguido por una administración de refuerzo de una vacuna que comprende, en un vehículo o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable, un plásmido que contiene un polinucleótido para expresar, in vivo, el mismo polipéptido o polipéptidos salivales de Lu. longipalpis, variante de los mismos, fragmento de los mismos, para proteger al sujeto de la Leishmaniasis y/o para prevenir la progresión de la enfermedad en sujetos infectados.

En una realización, la presente invención se refiere a un procedimiento de vacunación de un animal canino susceptible a Leishmania que comprende un régimen de administración de sensibilización-refuerzo en el que dicho regimiento comprende una administración de sensibilización de una vacuna que comprende, en un vehículo, diluyente o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable, un vector recombinante viral que comprende un polinucleótido para expresar, in vivo, un polipéptido salival de Lu. Longipalpis, una variante del polipéptido salival de Lu. Longipalpis, o una mezcla de los mismos, seguido por una administración de refuerzo de una vacuna que comprende, en un vehículo o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable, el mismo polipéptido o polipéptidos salivales de Lu. Longipalpis, variante de los mismos, para proteger el canino de Leishmaniasis y/o para prevenir la progresión de la enfermedad en un canino infectado.

En otra realización, el régimen de administración de sensibilización-refuerzo para su uso según la invención puede comprender adicionalmente al menos una administración de refuerzo de una vacuna basada en vectores vCP2390 o vCP2390-SEQ ID NO: 6.

En otra realización, el régimen de administración de sensibilización-refuerzo para su uso según la invención puede comprender adicionalmente al menos una administración de refuerzo de una vacuna basada en vectores vCP2389 o vCP2389-SEQ ID NO: 2.

En otra realización, el régimen de administración de sensibilización-refuerzo para su uso según la invención comprende al menos una administración de sensibilización de una vacuna basada en un plásmido pVR2001 LJL143 y pVR2001 LJM17, y puede comprender adicionalmente al menos una administración de refuerzo de una vacuna basada en vectores vCP2389 o vCP2390.

En otra realización, el régimen de administración de sensibilización-refuerzo para su uso según la invención comprende al menos una administración de sensibilización de una vacuna basada en un plásmido pNBO003 y pNBO002, y puede comprender adicionalmente al menos una administración de refuerzo de vacuna basada en vectores vCP2389- SEQ ID NO: 2 y vCP2390-SEQ ID NO: 6.

En aún otra realización, el régimen de administración de sensibilización-refuerzo para su uso según la invención puede comprender adicionalmente al menos una administración de refuerzo de una vacuna basada en vectores MVA-LJM17.

En otra realización, el régimen de administración de sensibilización-refuerzo para su uso según la invención puede comprender adicionalmente al menos una administración de refuerzo de una vacuna basada en vector MVA-LJL143.

En otra realización, el régimen de administración de sensibilización-refuerzo para su uso según la invención comprende al menos un administración de una vacuna de sensibilización basada en un plásmido pVR2001 LJL143 y pVR2001 LJM17, y al menos una administración de refuerzo de una vacuna a base de vectores MVA-LJLI43 y MVA-LJM17.

En aún otra realización, el régimen de administración de sensibilización-refuerzo para su uso según la invención comprende al menos un administración de sensibilización de una vacuna basada en un plásmido pNBO003 y pNBO002, y puede comprender adicionalmente al menos una administración de refuerzo de una vacuna basada en los vectores MVA-LJL143 y MVA-LJM17.

En otra realización, el régimen de administración de sensibilización-refuerzo para su uso según la invención comprende al menos una administración de sensibilización de una vacuna basada en vectores vCP2390 o vCP2390-SEQ ID NO: 6 y al menos una administración de refuerzo de una vacuna de subunidades del polipéptido LJM17. En otra realización, el régimen de administración de sensibilización-refuerzo para su uso según la invención puede comprender adicionalmente al menos una administración de refuerzo de una vacuna de subunidades del polipéptido LJL143.

En otra realización, el régimen de administración de sensibilización-refuerzo para su uso según la invención comprende al menos una administración de sensibilización de vacuna basada en los vectores vCP2389 o vCP2389-SEQ ID NO: 2 y vCP2390 o vCP2390-SEQ ID NO: 6, y al menos una administración de refuerzo de una vacuna de subunidades del polipéptido LJLJ 43 y el polipéptido LJM17.

En aún otra realización, el régimen de administración de sensibilización-refuerzo para su uso según la invención comprende al menos una administración de sensibilización de una vacuna basada en el vector MVA-LJM17, y al menos una administración de refuerzo de una vacuna de subunidades del polipéptido LJM17.

En el presente documento se describe que el régimen de administración de sensibilización-refuerzo comprende al menos una administración de sensibilización de una vacuna basada en el vector MVA-LJL143, y al menos una administración de refuerzo de una vacuna de subunidades del polipéptido LJL143.

En otra realización, el régimen de administración de sensibilización-refuerzo para su uso según la invención comprende al menos una administración de sensibilización de una vacuna basada en los vectores MVA-LJLJ43 y MVA-LJM17, y al menos una administración de refuerzo de una vacuna de subunidades del polipéptido LJL143 y el polipéptido LJM17.

En otra realización, el régimen de administración de sensibilización-refuerzo para su uso según la invención puede comprender adicionalmente al menos una administración de refuerzo de una vacuna basada en un plásmido pVR2001 LJM17 o pNBO002.

En otra realización, el régimen de administración de sensibilización-refuerzo para uso según la invención puede comprender adicionalmente al menos una administración de refuerzo de una vacuna basadas en los plásmidos LJL143 pVR2001 o pNBO003.

En otra realización, el régimen de administración de sensibilización-refuerzo para su uso según la invención comprende al menos una administración de sensibilización de una vacuna basada en vectores vCP2389 y vCP2390, y puede comprender adicionalmente al menos una administración de refuerzo de una vacuna basada en los plásmidos pVR2001 LJLI43 y pVR2001 LJMI7.

En otra realización, el régimen de administración de sensibilización-refuerzo para su uso según la invención comprende al menos una administración de sensibilización de una vacuna basada en vectores vCP2389-SEQ ID NO: 2 y vCP2390-SEQ ID NO: 6 y puede además comprender al menos una administración de refuerzo de una vacuna basada en los plásmidos pNBO003 y pNBO002.

En el presente documento se describe que el régimen de administración de sensibilización-refuerzo comprende al menos una administración de sensibilización de una vacuna basada en el vector MVA-LJM17 y al menos una administración de refuerzo de una vacuna basada en los plásmidos pVR2001 LJM17 o pNBO002.

En el presente documento se describe que el régimen de administración de sensibilización-refuerzo comprende al menos una administración de sensibilización de una vacuna basada en el vector MVA-LJL143, y al menos una administración de refuerzo de una vacuna basada en los plásmidos pVR2001 LJL143 o pNBO003.

En otra realización, el régimen de administración de sensibilización-refuerzo para su uso según la invención comprende al menos una administración de sensibilización de una vacuna basada en vectores MVA-LJL143 y MVA-LJM17, y puede comprender adicionalmente al menos una administración de refuerzo de una vacuna basada en los plásmidos pNBO003 y pNBO002.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un kit para la vacunación de sensibilización-refuerzo de acuerdo con la presente descripción. El kit puede comprender al menos dos viales: un primer vial que contiene una vacuna para la vacunación de sensibilización de acuerdo con la presente descripción y un segundo vial que contiene una vacuna para la vacunación de refuerzo de acuerdo con la presente descripción. El kit puede contener ventajosamente primeros o segundos viales adicionales para vacunaciones de sensibilización adicionales o vacunaciones de refuerzo adicionales.

En una realización, el kit puede comprender dos viales, uno que contiene una vacuna basada en plásmido para la vacunación de sensibilización de acuerdo con la presente descripción, el otro vial que contiene una vacuna basada en vector viral recombinante para la vacunación de refuerzo de acuerdo con la presente descripción.

En el presente documento se describe que el kit puede comprender dos viales, uno que contiene una vacuna basada en vector viral recombinante para la vacunación de sensibilización de acuerdo con la presente descripción, el otro vial que contiene una vacuna de subunidades para la vacunación de refuerzo de acuerdo con la presente descripción.

En otra realización, el kit puede comprender dos viales, uno que contiene una vacuna basada en vector viral recombinante para la vacunación de sensibilización de acuerdo con la presente descripción, el otro vial que contiene una vacuna basada en plásmido para la vacunación de refuerzo de acuerdo con la presente descripción.

Se da a conocer en el presente documento que los individuos que experimentan una conversión de la respuesta DTH anti-Leishmania también tienen un aumento en los anticuerpos contra proteínas salivales de Lu. Longipalpis. Así, la presencia o ausencia de anticuerpos contra proteínas salivales de Lu. Longipalpis puede ser utilizado para determinar si un sujeto tiene una infección por Leishmania.

En el presente documento se da a conocer un procedimiento para el diagnóstico de la infección con Leishmania mediante la detección de la presencia de anticuerpos que se unen específicamente uno o más polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 11, 13 , 15, 17, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, o 87, o un polipéptido que tiene al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 99% de homología con uno de estos polipéptidos, una variante conservativa, un homólogo o un fragmento inmunogénico de uno de estos polipéptidos. El procedimiento puede utilizar un solo polipéptido de Lu. Longipalpis o una combinación de estos polipéptidos. En determinados ejemplos, el procedimiento de diagnóstico detecta anticuerpos que se unen específicamente a al menos 3, 6 ó 10 de estos polipéptidos, o fragmentos inmunogénicos de los mismos.

En el presente documento se describe que uno o más polipéptidos de Lu. Longipalpis pueden estar unidos a un sustrato sólido. Por ejemplo, el polipéptido de Lu. Longipalpis que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, o 87 se puede unir al sustrato. Uno o más de estos polipéptidos se pueden unir al sustrato, por ejemplo al menos 3, 6, o 10 de estos polipéptidos, o un fragmento inmunogénico de los mismos. En un ejemplo, uno o más polipéptidos que tienen una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 25, 33, 39, 47, o 77 se pueden unir al sustrato. En otro ejemplo, uno o más de polipéptidos de Lu. Longipalpis que tienen una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, o 57 pueden unirse al sustrato. En un ejemplo específico, no limitativo, por lo menos seis polipéptidos de Lu. Longipalpis se unen a un sustrato sólido, en el que cada uno de los polipéptidos comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 1 (o 3, o 11, o 13), SEQ ID NO: 5 (o 7, o 15, o 17), SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 73, o SEQ ID NO: 77, o un fragmento inmunogénico de los mismos. En otro ejemplo específico, no limitativo, al menos tres polipéptidos de Lu. Longipalpis se unen a un sustrato sólido, en el que cada uno de los polipéptidos comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 1 (o 3, o 11, o 13), SEQ ID NO: 5 (o 7, o 15 o 17), o SEQ ID NO: 57, o un fragmento inmunogénico de los mismos.

En el presente documento se describe que dos o más (por ejemplo al menos 3, 6, o 10) polipéptidos de Lu. Longipalpis (o fragmentos inmunogénicos de los mismos) se aplican a un sustrato sólido, por ejemplo como una serie de "puntos", tales como en un ensayo de "transferencia de puntos". En el presente documento se describe que dos o más polipéptidos de Lu. Longipalpis se aplican a un sustrato, tal como en un conjunto lineal. En el presente documento se describe que polipéptidos de Lu. Longipalpis se aplican a una membrana en una matriz de dos dimensiones. De esta manera, se evalúa la presencia de anticuerpos contra más de un polipéptido de Lu. Longipalpis. Cada polipéptido de Lu. Longipalpis puede ser aplicado directamente a la superficie de una membrana en un solo puntos o en una combinación de puntos.

El sustrato sólido puede ser una perla de poliestireno, una membrana, un chip o una placa. Puede utilizarse un sustrato de plástico o vidrio. En el presente documento se describe una membrana que se utiliza que se compone de materiales porosos, tales como nylon, nitrocelulosa, acetato de celulosa, fibras de vidrio, y otros polímeros porosos. La superficie de un soporte sólido puede ser activada por procesos químicos que causan la unión covalente del polipéptido al soporte. Sin embargo, puede utilizarse cualquier otro procedimiento adecuado para la inmovilización de un polipéptido a un soporte sólido, incluyendo, sin limitación, interacciones iónicas, interacciones hidrófobas, interacciones covalentes y similares. Una vez que el polipéptido se aplica al sustrato, el sustrato puede ponerse en contacto con una sustancia, tal como una solución que contiene proteína, que satura no específicamente los sitios de unión sobre la misma. Ejemplos específicos, no limitativos, de una solución que contiene proteína incluyen una solución producida a partir de leche en polvo o albúmina de suero, tal como albúmina de suero bovino.

A continuación, se añade una muestra (por ejemplo, suero, sangre, plasma, orina, semen, saliva, esputo, fluido lacrimal, fluido linfático) al sustrato, y la muestra y el sustrato combinados se incuban durante un tiempo suficiente para permitir la unión específica. La unión específica de anticuerpos a los polipéptidos de Lu. Longipalpis descritos en el presente documento, se detecta entonces usando cualquier medio conocido para un experto en la técnica. Se describe en el presente documento que se utiliza un anticuerpo secundario marcado para detectar los anticuerpos que se unen específicamente a los polipéptidos de Lu. Longipalpis. La etiqueta puede ser una etiqueta de radio (por ejemplo, 125I), un marcador enzimático (por ejemplo, fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante), o un marcador fluorescente (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína). Los sistemas de detección para estas etiquetas son conocidos para un experto en la técnica. La unión de la muestra, o un componente de la muestra, al polipéptidos de Lu. Longipalpis, como se indica por la presencia del marcador, indica infección con Leishmania.

En el presente documento se describe que la muestra se adsorbe sobre un sustrato sólido que contiene sitios de unión para los polipéptidos, tales como moléculas de anticuerpos. En el presente documento se describe que el sustrato sólido es una perla de poliestireno, un chip, una membrana o una placa. El sustrato se pone en contacto después con una sustancia, tal como una solución que contiene proteína que satura no específicamente los sitios de unión sobre la misma. El sustrato se lava a continuación con un tampón. Una solución de uno o más polipéptidos de Lu. Longipalpis se añade a continuación a las muestras unidas. En el presente documento se describe que el polipéptido de Lu. Longipalpis está marcado directamente. El marcaje del polipéptido de Lu. Longipalpis puede ser provocada por el uso de cualquier marcador, tal como mediante la incorporación de un isótopo o un grupo radiactivo, o mediante el acoplamiento de este componente a una enzima, un colorante, por ejemplo un resto cromóforo o un grupo fluorescente. Las enzimas de uso son aquellas que pueden determinarse colorimétricamente, espectrofotométricamente, o fluorimétricamente. Ejemplos de enzimas no limitantes para su uso en la presente descripción incluyen enzimas del grupo de las oxidorreductasas, tales como la catalasa, peroxidasa, glucosa oxidasa, beta-glucuronidasa, beta-D-glucosidasa, beta-D-galactosidasa, ureasa y galactosa oxidasa. Después de que el polipéptido de Lu longipalpis polipéptido marcado se incuba con el sustrato sólido, cualquier polipéptido de Lu. Longipalpis marcado no unido se elimina mediante lavado. El polipéptido de Lu. Longipalpis marcado unido se detecta mediante un ensayo apropiado. La unión del polipéptido de Lu longipalpis marcado a la muestra, o a un componente de la muestra, es indicativo de la infección con Leishmania.

En general, las etapas de incubación utilizadas en la realización de los procedimientos se pueden realizar de una manera conocida, tal como mediante la incubación a temperaturas entre aproximadamente 4 °C y aproximadamente 25 °C, durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 48 horas. Los lavados se pueden incluir con una solución acuosa tal como un tampón, donde el tampón es de aproximadamente pH 6 a aproximadamente pH 8, tal como usando una disolución salina isotónica de un pH de aproximadamente 7.

Los ensayos de unión competitiva son también de uso en la detección de la infección por Leishmania. Un experto en la técnica, dados los polipéptidos de Lu. Longipalpis descritos en el presente documento, será fácilmente capaz de diseñar ensayos adicionales, tales como ensayos de unión competitiva, de uso en la detección de infección por Leishmania.

En el presente documento se describe que los polipéptidos de Lu. Longipalpis descritos en este documento pueden ser incluidos en un kit de prueba de diagnóstico. Por ejemplo, un kit de prueba de diagnóstico para detectar una infección por Leishmania incluye un sustrato sólido que tiene aplicado sobre el mismo uno o más polipéptidos de Lu. Longipalpis descritos en el presente documento. En el presente documento se describe que el kit incluye instrucciones escritas y/o un recipiente que incluye una cantidad específica de anticuerpos marcados a las inmunoglobulinas, tales como IgG o IgM, o anticuerpos secundarios marcados que se unen a los anticuerpos de una especie de interés. Por ejemplo, los anticuerpos marcados pueden proporcionarse que específicamente detectan inmunoglobulinas de perro o humanas. Los anticuerpos marcados pueden ser marcados con fluorescencia, marcados enzimáticamente, o radiomarcados. Los anticuerpos marcados utilizados en los kits de prueba descritos anteriormente se pueden envasar en cualquier solución o forma liofilizada adecuada para la reconstitución.

En el presente documento se describe que el kit de ensayo incluye una cantidad específica de uno o más polipéptidos de Lu. Longipalpis descritos en el presente documento en un recipiente, e instrucciones escritas. En un ejemplo, el polipéptido de Lu. Longipalpis está marcado directamente. En otro ejemplo, el uno o más polipéptidos de Lu. Longipalpis no está marcado. Si el polipéptido de Lu. Longipalpis no está marcado, un recipiente también puede estar incluido con un reactivo de detección que se une específicamente al polipéptido de Lu. Longipalpis, tal como un anticuerpo monoclonal marcado. El kit también puede incluir opcionalmente un sustrato sólido para la unión de la muestra.

El proceso y el kit de prueba descritos anteriormente para la detección de anticuerpos para los polipéptidos de Lu. Longipalpis descritos en este documento pueden ser utilizados en muchas aplicaciones, incluyendo, pero no limitado a, la detección de infección por Leishmania en un sujeto usando los procedimientos descritos en este documento. Los ensayos y kits descritos en este documento se pueden usar para detectar la eficacia de un tratamiento terapéutico a un sujeto.

En el presente documento se describe que las pruebas y kits descritos en este documento también pueden ser utilizados para evaluar una infección primaria con Leishmania o para predecir la recuperación de la infección por Leishmania mediante la toma de un fluido corporal de un sujeto infectado, por ejemplo en diversos momentos después de la infección, y la aplicación de los procedimientos de detección descritos anteriormente.

La presente invención se describirá a continuación adicionalmente a modo de los siguientes ejemplos no limitativos.

EJEMPLOS

Sin más elaboración, se cree que un experto en la técnica puede, utilizando las descripciones anteriores, poner en práctica de la presente invención en su extensión más completa. Los siguientes ejemplos detallados deben interpretarse como meramente ilustrativos, y no son limitaciones de la descripción precedente en forma alguna. Los expertos en la técnica reconocerán rápidamente las variaciones apropiadas de los procedimientos tanto en cuanto a reactivos como a las condiciones y técnicas de reacción.

La construcción de insertos de ADN, plásmidos y vectores virales recombinantes se llevó a cabo utilizando las técnicas estándar de biología molecular descritas por J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989). Todos los fragmentos de restricción utilizados para la presente descripción se aislaron usando el kit "Geneclean" (BIO 101 Inc., La Jolla, Calif.).

EJEMPLO 1: Construcción del plásmido pVR2001 LJM17 que expresa el polipéptido salival LJM17 de Lu. Longipalpis

El polinucleótido que codifica polipéptido LJM17 de Lu. longipalpis se sintetiza y tiene la secuencia descrita en SEQ ID NO: 8 que contiene la cola de poli (A). El fragmento LJM17 se amplifica por PCR y se clona en el sitio de clonación TOPO del plásmido donante pVR2001-TOPA (también denominado pVR2001-TOPO). El plásmido resultante, pVR2001 LJM17, por lo tanto, contiene y expresa un nucleótido que codifica un promotor capaz de dirigir la expresión en una célula de mamífero, un péptido líder para facilitar la secreción/liberación de una secuencia de la proteína procariota de una célula de mamífero, LJM17, topoisomerasas que flanquean el ADN que codifica LJM17, así como una secuencia de terminación.

La secuencia de ácido nucleico de una cadena del plásmido pVR2001 LJM17 se describe en SEQ ID NO: 9 y en la Figura 1, en la que los sitios BamHI están en posiciones [4-9] y [5051-5056], la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido señal de tPA está en la posición [4976-5062] y la secuencia de nucleótidos que codifica LJM17 está en la posición [5063-6247].

EJEMPLO 2: Construcción del plásmido pVR2001 LJL143que expresa el polipéptido salival LJL143 de Lu. Longipalpis

El polinucleótido que codifica el polipéptido LJL143 de Lu. longipalpis se sintetiza y tiene la secuencia descrita en SEQ ID NO: 4 que contiene la cola de poli (A). El fragmento LJL143 se amplifica mediante PCR y se clona en el sitio de clonación TOPO del plásmido pVR2001-TOPA, tal como se describe en el ejemplo 1, para generar el plásmido pVR2001 LJL143.

La secuencia de ácido nucleico de una cadena del plásmido pVR2001 LJL143 se describe en SEQ ID NO: 10 y en la Figura 2, en la que sitios BamHI están en las posiciones [4-9] y [5051-5056], la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido señal de tPA está en la posición [4976-5062] y la secuencia de nucleótidos que codifica LJL143 está en la posición [5063-5899].

EJEMPLO 3: Construcción de un vector de virus de viruela del canario ALVAC que expresa el polipéptido salival LJM17 de Lu. Longipalpis

Para una discusión y los ejemplos del plásmido pALVAC, y el locus C3, véase, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N° 5.756.103.; 5.833.975; y 6.780.407. La secuencia del promotor H6 del virus vaccinia ha sido descrita previamente (véase, por ejemplo, Taylor et al.; Taylor et al.; Guo et al.).

El polinucleótido que codifica el polipéptido LJM17 de Lu. longipalpis se sintetiza y tiene la secuencia descrita en SEQ ID NO: 6. Este polinucleótido se liga a continuación al plásmido donante pALVAC C3 H6p que da lugar a pALVAC C3 H6p-LJM17 que contiene 5737 pares de bases (Figura 3).

Para generar vCP2390-SEQ ID NO: 6, el plásmido pALVAC C3 H6p-LJM17 se linealizó con la enzima de restricción NotI. Los fragmentos linealizados se transfectaron individualmente en células CEF primarias infectadas con ALVAC utilizando el procedimiento de precipitación con fosfato de calcio (véase, Panicali et al.; Piccini et al.). Después de 24 h, se recogieron las células transfectadas, se sonicaron y se usaron para el cribado de virus recombinante.

Las placas recombinantes se criban basándose en el procedimiento de hibridación por elevación de placas usando una sonda específica de LJM17 de Lu. longipalpis que está marcada con peroxidasa de rábano picante de acuerdo con el protocolo del fabricante (Amersham Cat # RPN-3001). Después de tres rondas secuenciales de purificación en placa, se generan los recombinantes mediante la confirmación de la hibridación como 100% positivo para el inserto de LJM17 de Lu. Longipalpis y 100% negativo para el ORF de C3.

Se selecciona una única placa de la tercera ronda de purificación en placa y se expande para obtener soluciones madre de P1 (60 mm), P2 (matraces T75) y P3 (botellas de rodillos) para amplificar vCP2390-SEQ ID NO: 6. El fluido de cultivo de células infectadas de las botellas de rodillos se recoge y se concentra para producir una solución madre de virus.

El constructo se secuencia para confirmar las secuencias del inserto LJM17 de Lutzomyia longipalpis y los brazos izquierdo y derecho de C3 alrededor del inserto de LM17 de Lutzomyia longipalpis en ^vCP2390-SE^q ID NO: 6.

EJEMPLO 4: Construcción de un vector de virus de viruela del canario ALVAC que expresa el polipéptido salival LJL143 de Lu. Longipalpis

El polinucleótido que codifica el polipéptido LJL143 de Lu. longipalpis se sintetiza y tiene la secuencia descrita en SEQ ID NO: 2. Esta secuencia a continuación se liga a un plásmido donante pALVAC C3 H6p. El plásmido resultante, pALVAC C3 H6p-LJL143 comprende 5400 pares de bases (Figura 5) y se secuencia para confirmar la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 2) del gen de LJL143.

Para generar vCP2389-SEQ ID NO: 2, el plásmido pALVAC C3 H6p-LJL143 se linealiza con la enzima de restricción NotI. Los fragmentos linealizados se transfectan individualmente en células CEF primarias infectadas con ALVAC utilizando el procedimiento de precipitación con fosfato de calcio (véase, Panicali et al.; Piccini et al.). Después de 24 h, se recogien las células transfectadas, se sonican y se usan para el cribado de virus recombinante.

Las placas recombinantes se criban basándose en el procedimiento de hibridación por elevación de placas usando una sonda específica de LJL143 de Lu. longipalpis que está marcada con peroxidasa de rábano picante de acuerdo con el protocolo del fabricante (Amersham Cat # RPN-3001). Después de tres rondas secuenciales de purificación en placa, se generan los recombinantes mediante la confirmación de hibridación como 100% positivo para el inserto LJL143 de Lu. Longipalpis y 100% negativo para el ORF de C3.

Se selecciona una única placa de la tercera ronda de purificación en placa y se expande para obtener soluciones madre de P1 (60 mm), P2 (matraces T75) y P3 (botellas de rodillos) para amplificar vCP2389-SEQ ID NO: 2. El fluido de cultivo de células infectadas de las botellas de rodillos se recoge y se concentra para producir una solución madre de virus.

El constructo se secuencia para confirmar las secuencias del inserto LJL143 de Lutzomyia longipalpis y los brazos izquierdo y derecho de C3 alrededor del inserto de LJL143 de Lutzomyia longipalpis en vCP2389-SEQ ID NO: 2.

EJEMPLO 5: Construcción de un vector MVA que expresa el polipéptido salival LJM17 de Lu. Longipalpis

MVA es una cepa Ankara modificada obtenida después de más de 570 pasajes de la cepa de la vacuna Ankara sobre fibroblastos de embrión de pollo (véase Stickl y Hochstein-Mintzel; Sutter et al.) disponible como ATCC VR-1508. Su adaptación a estas células causó la escisión de 6 regiones que no son esenciales para su desarrollo y su ciclo infeccioso sobre este tipo de células (desaparición de aproximadamente 15% del genoma viral; Meyer et al). El material genético exógeno se puede insertar en cualquiera de estas regiones de escisión. En el contexto de la presente descripción, se inserta material genético exógeno en escisiones II y III que se encuentran usando los fragmentos de restricción HindIII N y A respectivamente (Altenburger et al.).

La modificación del virus MVA recombinante que expresa LJM17 se realiza como se ha descrito previamente en Staib C. et al., con la excepción de que el fragmento de ADN de 723 pares de bases que contiene el ORF de gfp se sustituye por el fragmento de ADN de 1239 pares de bases que codifica el antígeno LJM17 (SEQ ID NO: 6), generando MVA-LJM17.

EJEMPLO 6: Construcción de un vector MVA que expresa el polipéptido salival LJL143 de Lu. Longipalpis

La construcción del virus MVA recombinante que expresa LJL143 se realiza como se ha descrito previamente en Staib C. et al., con la excepción de que el fragmento de ADN de 723 pares de bases que contiene el ORF de gfp se sustituye por el fragmento de ADN de 906 pares de bases que codifica el antígeno LJL143 (SEQ ID NO: 2), generando MVA-LJL143.

EJEMPLO 7: Expresión de proteína salival de Lu. Longipalpis in vitro

Los plásmidos de expresión que contienen antígenos salivales de Lu. Longipalpis etiquetados con His codificados por Ad Nc derivado de los plásmidos pVR2001 LJM17 (véase el ejemplo 1) y pVR2001 LJL143 (véase el Ejemplo 2) se construyen y se transfectan en células HEK-293F. Los sobrenadantes recogidos a las 72 h se analizan por cromatografía HPLC utilizando columna de níquel y fracciones de HPLC con gradiente de imidazol positivas para la proteína salival recombinante con un motivo 6x His en su C-terminal se prueban con sueros policlonales de ratones previamente inmunizados con los correspondientes plásmidos de ADNc originales. Las proteínas recombinantes son probadas mediante SDS-PAGE y transferencia de Western, se dividen en alícuotas en PBS y se almacenan a -70 °C.

La vacuna de subunidades que comprende LJM17 se denomina aquí como rLJM17. La vacuna se prepara combinando 100 mg de proteína recombinante purificada LJM17 con 300 mg del adyuvante CpG # 2142 en EMULSIGEN® al 20% (laboratorios MVP) (para CpG # 2142, véase SEQ ID NO: 890 en el documento EP-B1-1.221.955).

La vacuna de subunidades que comprende LJL143 se denomina aquí como rLJL143. La vacuna se prepara combinando 100 mg de proteína recombinante LJL143 purificada con 300 mg del adyuvante CpG # 2142 en EMULSIGEN® al 20%.

EJEMPLO 8: Vacunación de perros contra la leishmaniasis

25 perros (beagles hembras de 1-2 años de edad) se dividieron aleatoriamente en 5 grupos de 5 perros cada uno. Todos los perros de los grupos 1 a 4 son vacunados en D0 (V1) por vía intradérmica (ID) en el pabellón auditivo utilizando una jeringa y una aguja con 500 mg de plásmido pVR2001 LJM17 purificado (ejemplo 1) que expresa LJM17 (grupos 1 y 2) o plásmido pVR2001 LJL143 (ejemplo 2) que expresa LJL143 (grupos 3 y 4).

Los perros del grupo 1 y el grupo 3 se refuerzan en D14 (V2) y D28 (V3) con 500 mg de los mismos plásmidos utilizados para V1 por la vía transdérmica (TD) en la parte superior interna de ambas patas traseras utilizando el dispositivo de administración sin aguja VetJet ™ (Merial). Los perros del grupo 1 y el grupo 3 se reforzaron adicionalmente en D42 (V4) con 500 mg de los mismos plásmidos por la ruta intramuscular acoplada a electroporación (ET/IM) en el lado externo de ambos muslos utilizando el dispositivo y tecnología Sphergen (parámetros: 88V, T1 = 20, T2 = 80, 10).

Los perros de los grupos 2 y 4 se refuerzan en D14 (V2) y D28 (V3) con 500 mg de los mismos plásmidos utilizados para V1 por la vía IM acoplada a electroporación (ET/IM) como se describe anteriormente. Los perros de los grupos 2 y 4 se refuerzan adicionalmente en D42 (V4) por vía ID en el pabellón auditivo como se describió anteriormente con las vacunas de subunidades (véase el Ejemplo 7) rLJM17 (grupo 2) o rLJL143 (grupo 4), respectivamente. Todos los perros de los grupos 1 y 2 reciben un refuerzo de la vacuna final en D192 (V5) por vía IM en el cuadriceps izquierdo usando 108 ufp de un virus de la viruela del canario recombinante vCP2390 (Ejemplo 3) que expresa LJM17. Todos los perros de los grupos 3 y 4 reciben un refuerzo de la vacuna final en D192 (V5) por vía IM en el cuádriceps izquierdo usando 108 ufp de un virus de la viruela del canario recombinante vCP2389 (ejemplo 4) que expresa LJL143.

Los perros del grupo 5 se vacunan con 500 mg del plásmido parental purificado pVR2001 que no expresa el antígeno en D0 por ID, D14 por TD, D28 por TD y D42 por E^t/IM y reciben una dosis de refuerzo final en D192 por la ruta IM utilizando 108 ufp de un virus de la viruela del canario recombinante de control (Purevax™).

EJEMPLO 9: Construcción del plásmido pNBO002 que expresa el polipéptido salival LJM17 de Lu. Longipalpis

La secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido LJM17 de Lu. longipalpis se sintetizó y tiene la secuencia descrita en SEQ ID NO: 18 que contiene la cola de poli (A). El fragmento LJM17 se amplificó por PCR y se clonó en el sitio de clonación TOPO del plásmido donante pVR2001-TOPA como se describe en el ejemplo 1, para generar el plásmido pNBO002.

La secuencia de ácido nucleico de una cadena del plásmido pNBO002 se describe en SEQ ID NO: 19 y en la Figura 11, en el que sitios BamHI están en las posiciones [1819-1824] y [3019-3024], la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido señal de tPA está en la posición [1744-1830] y la secuencia de nucleótidos que codifica LJM17 está en la posición [1831-3015]. El mapa del plásmido pNBO002 se muestra en la Figura 12.

pNBO002 es análogo a pVR2001 LJM17. En este caso, este constructo y el constructo del ejemplo 1 son identificables por la secuencia de ácido nucleico de sus insertos, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 8, respectivamente. EJEMPLO 10: Construcción del plásmido pNBO003que expresa el polipéptido salival LJL143 de Lu. Longipalpis

La secuencia de ácido nucleico que codifica el LJL143 de Lu. Longipalpis se sintetizó y tiene la secuencia descrita en SEQ ID NO: 14, que contiene la cola de poli (A). El fragmento LJL143 se amplificó por PCR y se clonó en el sitio de clonación TOPO del plásmido pVR2001-TOPA, como se describe en el ejemplo 1, para generar el plásmido pNBO003.

La secuencia de ácido nucleico de una cadena del plásmido pNBO003 se describe en SEQ ID NO: 20 y en la Figura 13, en la que sitios BamHI están en las posiciones [1819-1824] y [2671-2676], la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido señal de tPA está en la posición [1744-1830] y la secuencia de nucleótidos que codifica LJL143 está en la posición [1831-2667]. El mapa del plásmido pNBO003 se muestra en la Figura 14.

pNBO003 es análogo a pVR2001 LJL143. En este caso, este constructo y el constructo del ejemplo 2 son identificables por la secuencia de ácido nucleico de sus insertos, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 4, respectivamente. EJEMPLO 11: Construcción de un vector de virus de viruela del canario ALVAC que expresa el polipéptido salival LJM17 de Lu. Longipalpis

Para la discusión y ejemplos del plásmido pALVAC y el locus C3, ver por ejemplo, patentes de Estados Unidos N° 5.756.103.; 5.833.975; y 6.780.407. La secuencia del promotor H6 del virus vaccinia ha sido descrita previamente (véase, por ejemplo, Taylor et al.; Taylor et al.; Guo et al.).

La secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido LJM17 de Lu. Longipalpis se sintetizó y tiene la secuencia descrita en SEQ ID NO: 6. Esta secuencia se optimizó en codones para la expresión en mamíferos por Geneart GmbH (Regensburg, Alemania), resultando en la secuencia descrita en SEQ ID NO: 91, que codifica el polipéptido LJM17 (SEQ ID NO: 5).

Esta secuencia de codones optimizados se ligó al plásmido donante pALVAC C3 H6p para generar pALVAC C3 H6p-LJM17 que contiene 5737 pares de bases (Figura 3). El plásmido resultante, pALVAC C3 H6p-LJM17, se secuenció y se confirmó que contenía la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 91) del gen de LJM17.

Para generar vCP2390, el plásmido pALVAC C3 H6p-LJM17 se linealizó con la enzima de restricción NotI. Los fragmentos linealizados se transfectaron individualmente en células CEF primarias infectadas con ALVAC utilizando el procedimiento de precipitación con fosfato de calcio descrito previamente (Panicali et al.; Piccini et al.). Después de 24 h, se recogieron las células transfectadas, se sonicaron y se usaron para el cribado de virus recombinante. Las placas recombinantes se cribaron basándose en el procedimiento de hibridación por elevación de placas usando una sonda específica de LJM17 sintética de Lu. Longipalpis que se marcó con peroxidasa de rábano picante de acuerdo con el protocolo del fabricante (Amersham Cat # RPN-3001). Después de tres rondas secuenciales de purificación en placa, los recombinantes se generaron y se confirmaron por hibridación como 100% positivos para el inserto LJM17 sintético y 100% negativo para el ORF de C3.

Se seleccionó una única placa de la tercera ronda de purificación de placas y se amplió para obtener soluciones madre P1 (60 mm), P2 (matraces T75), P3 (botellas de rodillos) para amplificar vCP2390. El fluido de cultivo de células infectadas de las botellas de rodillos se recogió y se concentró para producir la solución madre de virus. El constructo se secuenció para confirmar las secuencias del inserto LJM17 optimizado en codones y los brazos izquierdo y derecho de C3 alrededor del inserto LJM17 optimizados en codones en vCP2390.

El vector vCP2390 se ilustra en la Figura 4. Las secuencias de ácidos nucleicos para ambas cadenas de vCP2390 se describen en la Figura 4.

EJEMPLO 12: Construcción de un vector de virus de viruela del canario ALVAC que expresa el polipéptido salival LJL143 de Lu. Longipalpis

La secuencia de ácido nucleico que codifica el LJL143 de Lu. Longipalpis se sintetizó y tiene la secuencia descrita en SEQ ID NO: 2. Esta secuencia se optimizó en codones para la expresión en mamíferos por Geneart GmbH (Regensburg, Alemania), resultando en la secuencia descrita en SEQ ID NO: 22, que codifica la proteína LJL143 (SEQ ID NO: 1).

Esta secuencia de codones optimizados se ligó al plásmido donante pALVAC C3 H6p dando lugar a pALVAC C3 H6p-LJL143 que contiene 5400 pares de bases (Figura 5), que se secuenció y se confirmó que contenía la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 22) del gen de LJL143.

Para generar vCP2389, el plásmido pALVAC C3 H6p-LJL143 se linealizó con la enzima de restricción NotI. Los fragmentos linealizados se transfectaron individualmente en células CEF primarias infectadas con ALVAC utilizando el procedimiento de precipitación con fosfato de calcio (véase, Panicali et al.; Piccini et al.). Después de 24 h, se recogieron las células transfectadas, se sonicaron y se usaron para el cribado de virus recombinante.

Las placas recombinantes se cribaron basándose en el procedimiento de hibridación por elevación de placas usando una sonda específica de LJL143 sintética de Lu. Longipalpis que se marcó con peroxidasa de rábano picante de acuerdo con el protocolo del fabricante (Amersham Cat # RPN-3001). Después de tres rondas secuenciales de purificación en placa, los recombinantes se generaron y se confirmaron por hibridación como 100% positivos para el inserto LJL143 sintético y 100% negativo para el ORF de C3.

Se seleccionó una única placa de la tercera ronda de purificación de placas y se amplió para obtener soluciones madre P1 (60 mm), P2 (matraces T75), P3 (botellas de rodillos) para amplificar vCP2389. El fluido de cultivo de células infectadas de las botellas de rodillos se recogió y se concentró para producir la solución madre de virus.

Después de la secuenciación, los resultados mostraron que la secuencia del inserto LJL143 sintético y los brazos izquierdo y derecho de C3 alrededor del inserto LJL143 sintético en vCP2389 fueron correctos.

El vector vCP2389 se ilustra en la Figura 6.

Ejemplo 13: Expresión de proteína salival de Lu. Longipalpis in vitro

Los plásmidos de expresión que contienen antígenos salivales de Lu. Longipalpis etiquetados con His codificados por ADNc derivados de los plásmidos pNBO002 (véase el ejemplo 9) y pNBO003 (véase el Ejemplo 10) se construyeron y se transfectaron en células HEK-293F. Los sobrenadantes recogidos a las 72 h se analizaron por cromatografía HPLC utilizando columna de níquel y gradiente de imidazol. Las fracciones de HPLC positivas para la proteína salival recombinante con un motivo 6x His en su C-terminal se probaron con sueros policlonales de ratones previamente inmunizados con los correspondientes plásmidos de ADNc originales. Las proteínas recombinantes se probaron mediante SDS-PAGE y transferencia de Western, se dividieron en alícuotas en PBS y se almacenaron a -70 °C.

La vacuna subunidades que comprende LJM17 se denomina aquí como rLJM17. La vacuna se prepara combinando 100 mg de proteína LJM17recombinante purificada con 300 mg del adyuvante CpG # 2142 en EMULSIGEN® al 20% (laboratorios MVP) (para CpG # 2142, véase SEQ ID NO: 890 en el documento EP 1221955).

La vacuna de subunidades que comprende LJL143 se denomina aquí como rLJL143. La vacuna se prepara combinando 100 mg de proteína LJL143 recombinante purificada con 300 mg del adyuvante CpG # 2142 en EMULSIGEN® al 20%.

EJEMPLO 14: Vacunación de perros contra la leishmaniasis

25 perros (beagles hembras de 1-2 años de edad) se dividieron al azar en 5 grupos de 5 perros cada uno. Todos los perros de los grupos 1 a 4 fueron vacunados en D0 (V1) por vía intradérmica (ID) en el pabellón de la oreja utilizando una jeringa y una aguja con 500 mg de plásmido pNBO002 purificado (ejemplo 9) que expresa antígenos de LJM17 (grupos 1 y 2) o plásmido pNBO003 (ejemplo 10) que expresa antígenos de LJL143 (grupos 3 y 4), respectivamente.

Los perros del grupo 1 y el grupo 3 fueron reforzados en D14 (V2) y D28 (V3) con 500 mg de los mismos plásmidos utilizados para V1 por la vía transdérmica (TD) en la parte superior interna de ambas patas traseras utilizando el dispositivo de administración sin aguja VetJet™ (Merial). Los perros del grupo 1 y el grupo 3 fueron reforzados adicionalmente en D42 (V4) con 500 mg de los mismos plásmidos por la ruta intramuscular acoplada a electroporación (ET/IM) en el lado externo de ambos muslos utilizando el dispositivo y tecnología Sphergen (parámetros: 88V, T1 = 20, T2 = 80, 10).

Los perros de los grupos 2 y 4 fueron reforzados en D14 (V2) y D28 (V3) con 500 mg de los mismos plásmidos utilizados para V1 por la vía IM acoplada a electroporación (ET/iM), tal como se describe anteriormente. Los perros de los grupos 2 y 4 fueron reforzados adicionalmente en D42 (V4) por vía ID en el pabellón de la oreja, tal como se describió anteriormente, con vacunas de subunidades (véase el Ejemplo 13) rLJM17 (grupo 2) o rLJL143 (grupo 4), respectivamente.

Todos los perros de los grupos 1 y 2 recibieron una dosis de refuerzo de vacuna final a D192 (V5) por vía IM en el cuádriceps izquierdo usando 108 ufp de un virus de la viruela del canario recombinante vCP2390 (ejemplo 11, que tiene la SEQ ID NO: 21 como inserto) que expresa LJM17. Todos los perros de los grupos 3 y 4 recibieron una dosis de refuerzo final de vacuna en D192 (V5) por vía IM en el cuádriceps izquierdo usando 108 ufp de un virus de la viruela del canario recombinante vCP2389 (ejemplo 12, que tiene la SEQ ID NO: 22 como inserto) que expresa LJL143.

Los perros del grupo 5 se vacunaron con 500 mg del plásmido parental purificado VR2001 que no expresa el antígeno en D0 mediante ID, D14 mediante TD, D28 mediante TD y D42 mediante ET/IM y recibieron una dosis de refuerzo final en D192 por vía IM utilizando 108 ufp de un virus de la viruela del canario recombinante de control (Purevax™).

La inmunidad humoral específica y significativa a ambos LJM17 y LJL143 se evidenció mediante ELISA en los perros vacunados (ver Figura 7). Placas de 96 pocillos (Maxisorp™, Nunc) se recubrieron durante la noche a 4 ° C con la proteína rLJM17 (2 mg/ml) o rLJL143 (2 mg/ml). Se añadió sucesivamente suero de perro a las placas por triplicado a una dilución de 1/50 con IgG anti-perro de conejo AffiniPure conjugada con fosfatasa alcalina (Jackson ImmunoResearch) a 1/5000 y p-nitrofenilfosfato (Sigma). Se midió la absorbancia a 405 nm utilizando un Spectramax Plus (Molecular Devices).

Los títulos de anticuerpos significativos persistieron hasta 6 meses después de la administración V4. El refuerzo de vCP (V5) recordó las respuestas de anticuerpos específicos en los perros vacunados de manera eficiente. Las respuestas anamnésicas después de vCP establecieron la expresión de LJL143 y LJM17 de vCP2389 y vCP2390, respectivamente, y la capacidad de los vectores para reforzar las respuestas inmunitarias humorales in vivo.

Las PBMC de perros tomadas 2 semanas después de la administración V5 se estimularon por 2 pares de ^{homogeneizado de glándula salival (SGH), LJL143 (4} m^{g), y LJM17 (4} m^{g), o por ConA (4} m^{g). Las PBMC que eran} no estimuladas por medio (med) sirvieron como controles. La producción de IFN-gamma se evaluó mediante la medición de los niveles de secreción de IFN-gamma en el medio a las 72 horas (Quantikine ELISA; R & D Systems).

Los resultados se ilustran en la figura 8. La adición de proteínas LJM17 o LJL143 recombinantes purificadas causó que las PBMC de perros vacunados con LJM17 o LJL143 aumentaran la secreción de IFN-gamma. No se evidenció un aumento de la secreción de IFN-gamma cuando las PBMC estaban en presencia de medio de control (MED).

La adición de ConA o SGH a PBMC de perros vacunados con LJM17 o LJL143 también causó un aumento de la secreción de IFN-gamma. En particular, el antígeno LJM17 causó respuestas de INF-gamma muy fuertes en los animales del grupo 2 (1800 pg/ml), y también causó una fuerte respuesta en animales del grupo 1 (200 pg/ml). El antígeno LJL143 también causó respuestas de INF-gamma muy fuertes en los animales de los grupos 3 y 4, con más de 2.000 pg/ml, que fueron comparables a los resultados observados cuando las PBMCs se estimularon por ConA.

2 semanas después de la administración V5, se aislaron PBMC de dos perros que habían sido vacunados con ^{LJM17 y LJL143. Se estimularon linfocitos de células T autólogas (5.106 células) con 25} m^{g de LJM17 recombinante, 25} m^{g de LJL143 recombinante, o 4} m^{g de ConA. Las células fueron incubadas a continuación en presencia de} macrófagos infectados por amastigotes de Leishmania chagasi (infectados en una relación 5:1). Los lipopolisacáridos (LPS) y las células T no estimuladas (NT, sin tratamiento) sirvieron como controles. Las células se evaluaron para la eficiencia de destrucción que se midió mediante una reducción significativa en el porcentaje de macrófagos infectados (Figura 9).

Los linfocitos estimulados con LJM17 recombinante o LJL143 recombinante fueron citotóxicos a los macrófagos como a los linfocitos que habían sido estimulados por el mitógeno no específico ConA.

Los perros vacunados con LJL143 y LJM17 y de control perros fueron equipados con un dispositivo de collar Velcro. El dispositivo de collar Velcro se preparó mediante la disposición de veinte Lu. Longipalpis hembra de 6 días de vida no infectado en un dispositivo de plexiglás 10 mm de grosor que contenía un tornillo asegurado y una malla de nylon en uno de sus lados de modo que las moscas de arena fueron capaces de sondar a través de la malla. El dispositivo se mantuvo a 25 °C antes de la exposición para limitar la condensación y fue entonces fijado firmemente a un collar Velcro durante 10 minutos en el vientre rasurado de perros vacuandos con LJL143 y LJM17 y de control. Los perros estuvieron sin restricciones a lo largo del tiempo de exposición. Se tomaron biopsias con punezones de 4 mm o 6 mm de piel (Acuderm) del vientre de perros anestesiados 48 horas después de las picaduras de moscas de arena.

Las biopsias se almacenaron en formaldehído tamponado neutro (10% de formalina) y a continuación se procesaron de forma rutinaria para la tinción con hematoxilina/eosina (H & E), de Luna , azul de Toludina y procedimientos de inmunohistoquímica para CD3 y los marcadores de macrófagos/monocitos (Mac) . La Figura 10 proporciona los resultados inmunohistoquímicos de sitios de picadura de la mosca de arena. La infiltración celular inmune específica (manchas más oscuras en las imágenes) se observa en los perros vacunados, mientras que no se observó infiltración en los perros de control.

EJEMPLO 15: Vacunación de perros con proteínas salivales LJL143 y LJM17 producen una respuesta inmune protectora que mató amastigotes de Leishmania chagasi in vitro.

En este estudio, las proteínas salivales de Lu. Longipalpis fueron probadas para determinar si son inmunogénicas en perros. Además, las proteínas salivales de Lu. Longipalpis fueron identificadas que pueden producir una respuesta inmunitaria celular protectora y matan Leishmania infantum en un ensayo in vitro.

Para identificar estos componentes salivales, se desarrolló un ensayo de cribado de antígeno inverso in vivo de alto rendimiento basado en ADN. Este cribado identificó dos antígenos fuertes inductores de DTH de las 35 proteínas más abundantes en las glándulas salivales de Lu. Longipalpis. Estos datos fueron validados con proteínas recombinantes, lo que dio lugar a la confirmación del potencial inductor de DTH de las proteínas salivales LJM17 (SEQ ID NO: 5) y LJL143 (SEQ ID NO: 1) de Lu. Longipalpis. Además, las células mononucleares de sangre periférica de perros vacunados con LJL143 y LJM17 produjeron interferón (IFN)-^y tras la estimulación con las proteínas recombinantes salivales y, más en particular, la estimulación de estas células con las proteínas recombinantes dio como resultado la muerte de Leishmania infantum in vitro. Estas moléculas representan, por tanto, fuertes candidatos para ser utilizados como vacuna para controlar Leishmania infantum en perros.

Material y procedimientos

Perros: se colocaron perros beagles de 1-2 años de edad hembra (Marshall Farms) en las instalaciones de animales del NIH, Bethesda, EE.UU., siguiendo las directrices del Comité de Cuidado de Animales y del Usuario. Fueron animales bien alimentados en estudio constante de problemas de salud por un veterinario y todos habían recibido las vacunas de rutina. No se administraron tratamientos ectoparásitos durante los últimos cuatro meses antes de experimentos de exposición a la mosca de arena.

Moscas de la arena: se criaron Lutzomyia longipalpis, cepa Jacobina, usando como alimento larval una mezcla de heces de conejo fermentadas y comida de conejo. A las moscas de la arena adultos se les ofreció un hisopo de algodón que contenía 20% de sacarosa, pero murieron de inanición de azúcar de 24 horas antes de los experimentos de exposición. Algunas hembras se utilizaron para la disección de las glándulas salivales a los 4-7 días después de la aparición y se prepararon homogeneizados de las glándulas salivales (SGH) como se ha descrito anteriormente.

Exposición a las picaduras de moscas de arena: se colocaron Lu. Longipalpis hembra de seis días de vida en un dispositivo de plexiglás 10 mm de grosor. El dispositivo contenía un tornillo asegurado y una malla de nylon en uno de sus lados para que mosca de la arena sondee a través la misma. El dispositivo se mantuvo a 25 °C antes de la exposición para limitar la condensación y estaba firmemente unido con un collar de Velcro en el cuello afeitado de los perros durante 20 minutos. Los perros no tuvieron restricciones a lo largo del tiempo de exposición.

Cribado de antígeno inverso (RAS): Se anestesiaron perros preexpuestos a las picaduras de moscas de arena y se inyectaron por vía intradérmica con plásmidos de ADN o proteínas recombinantes. Los sitios de inyección estaban separados uno de otro por 15 mm. Para plásmidos de ADN, las moléculas se codificaron y se reagruparon de forma aleatoria para cada perro antes de la inyección en el vientre. El código fue roto sólo después de completar las mediciones de induración y eritema. Para el ADN-RAS, se inyectaron 38 muestras en un volumen total de 40 ml, incluyendo PBS, 1 par de SGH de Lu. Longipalpis diluido en PBS, y 20 mg de vector de control y los 35 plásmidos de ADN recombinante, diluidos en PBS, que codifican proteínas salivales individuales de Lu. Longipalpis. Para la proteína-RAS, se inyectaron 5 muestras por duplicado (40 ml), incluyendo PBS, 1 par de SGH de Lu. Longipalpis diluido en PBS, y 3 proteínas recombinantes salivales de Lu. Longipalpis (300 ng). La medición de los diámetros de induración y eritema se realizó 48 horas después de la inyección intradérmica de las muestras.

Histología y PCR en tiempo real en biopsias por punción de la piel: se tomaron biopsias por punción de la piel de 4 mm o 6 mm (Acuderm) del cuello o el vientre de perros anestesiados y se dividieron en dos mitades iguales. Una mitad se almacenó en formaldehído neutro tamponado (10% de formalina) y a continuación se procesaron rutinariamente para la tinción con hematoxilina/eosina, de una, azul de Toludina, y procedimientos inmunohistoquímicos para CD3 y los marcadores de macrófagos/monocitos. La otra mitad, almacenada en RNAlater (Sigma), se utilizó para la extracción de ARN (Agencourt® RNAdvance™ Tissue, Beckman Coulter). El ARN se transcribió de forma inversa (Transcriptor first strand ADNc synthesis, Roche) y se usó para PCR en tiempo real usando el LightCycler 480 (Roche), conjunto de cebadores (0,2 pM de concentración final) y sondas marcadas por duplicado FAM TAMRA hasta un total de 15 ml por reacción por triplicado. Los cebadores y sondas para IL4, IL12, TGF-p, IFN-y y GAPDH caninos ueron descritas anteriormente (Breathnach et al.). Las condiciones de amplificación, la adquisición, análisis de curva de fusión y la curva estándar se realizaron como se ha descrito previamente (Breathnach et al.). Los niveles de expresión del gen de interés se normalizaron a los niveles de GAPDH endógeno para controlar la cantidad de ARN.

ADNc recombinante: A partir de una biblioteca de ADNc (ver arriba), las 35 moléculas más abundantes de glándulas salivales de Lu. longipalpis se seleccionaron y su ADNc se clonó en el vector pVR2001-TOPO mediante técnicas de clonación estándar. Los plásmidos se prepararon usando GenElute™ Megaprep de plásmidos libre de endotoxinas (Sigma), se limpiaron con agua ultrapura utilizando Centricon® Plus-20 (Millipore) y se eluyeron en PBS. El control de calidad de los 35 plásmidos purificados incluyó mediciones de endotoxina, análisis de perfil de restricción y secuenciación. Los plásmidos de ADN salival purificados se filtraron de forma estéril y se almacenaron a -70 °C.

Proteínas recombinantes: los plásmidos de expresión que contenían antígenos salivalesde Lu. Longipalpis etiquetados con His que codifican ADNc derivado de los plásmidos de ADN salivales parentales se construyeron como se ha descrito (Oliveira et al.) y se transfectaron en células HEK-293F. Los sobrenadantes recogidos a las 72 h se sometieron a cromatografía HPLc usando una columna de níquel y gradiente de imidazol. Las fracciones de HPLC positivas para la proteína salival recombinante con un motivo 6x His en su C-terminal fueron probados con sueros policlonales de ratones previamente inmunizados con los correspondientes plásmidos de ADNc originales. Las proteínas recombinantes se analizaron mediante SDS-PAGE y transferencia de Western, se dividió en alícuotas en PBS y se almacenaron a -70 °C.

Virus de la viruela de canario recombinantes: Dos virus de la viruela del canario derivados de vectores de ALVAC que expresan respectivamente los antígenos LJL143 (vCP2389) o LJM17 (vCP2390) se generaron utilizando procedimientos estándar y validados mediante la secuenciación del ADN viral, RT-PCR sobre ARNm de las células infectadas y transferencia Western de los sobrenadantes de las células infectadas. Se utilizó la vacuna del moquillo de hurón Purevax™ (Merial) como control de las inyecciones de virus de viruela del canario.

Inmunización de perros con vacunas salivales: 25 perros se dividieron aleatoriamente en 5 grupos de 5 perros cada uno. Todos los perros de los grupos 1 a 4 fueron vacunados en D0 (V1) por vía intradérmica (ID) en el pabellón auditivo utilizando una jeringa y una aguja con 500 pg de plásmido purificado que expresa los antígenos LJM17 (grupos 1 y 2) o LJL143 (grupos 3 y 4), respectivamente. Los perros del grupo 1 y el grupo 3 fueron se reforzaron en D14 (V2) y D28 (V3) con 500 pg de los mismos plásmidos utilizados para V1 por ruta transdérmica (TD) en la parte superior interna de ambas patas traseras utilizando el dispositivo de administración sin aguja VetJet™ (Merial). Los perros del grupo 1 y el grupo 3 se reforzaron adicionalmente a D42 (V4) con 500 pg de los mismos plásmidos por vía intramuscular (IM) acoplada a la electroporación en la cara externa de ambos muslos utilizando el dispositivo y la tecnología Sphergen (parámetros: 88V, T1 = 20, T2 = 80, 10). Los perros de los grupos 2 y 4 se reforzaron en D14 (V2) y D28 (V3) con 500 pg de los mismos plásmidos utilizados para V1 por la vía IM acoplada a electroporación, tal ^{como se describe anteriormente. Los perros de los grupos 2 y 4 se reforzaron adicionalmente a D42 (V4) con 100} m^g de proteína recombinante purificada mencionada anteriormente LJM17 (rLJM17) (grupo 2) o LJL143 (rLJL143) ^{(grupo 4) en asociación con 300} m^{g de CpG ODN en EMULSIGEN® (laboratorios MVP) al 20% por vía ID en el} pabellón auditivo, tal como se describió anteriormente. Todos los perros de los grupos 1 a 4 recibieron una dosis de refuerzo de vacuna final a D192 (V5) por vía IM en el cuádriceps izquierdo usando 108 ufp de un virus de viruela de canario recombinante vCP2390 y vCP2389 que expresan respectivamente los antígenos LJM17 (grupos 1 y 2) o LJL143 (grupos 3 y 4). Los perros de grupo 5 fueron vacunados en D0, D14, D28 y D42 con 500 pg de plásmido parental VR2001 purificado que no expresa el antígeno y recibieron una dosis de refuerzo final en D192 por la vía IM usando 108 ufp de un virus de la viruela de canario recombinante de control (Purevax™).

ELISA: se recubrieron placas de 96 pocillos (Maxisorp™, Nunc) durante la noche a 4° C con SGH de Lu. Longipalpis (5 pares/ml), proteína rLJM17 (2 pg/ml) o rLJL143 (2 pg/ml). Se añadieron sucesivamente a las placas suero de perro por triplicado a una dilución de 1/50, IgG anti-perro de conejo AffiniPure conjugada con fosfatasa alcalina (Jackson ImmunoResearch) a 1/5000 y p-nitrofenilfosfato (Sigma). La absorbancia a 405 nm se midió utilizando un Spectramax Plus (Molecular Devices). La producción de IFN-^y en sobrenadantes de las células se midió después de ^{72 h (Quantikine ELISA; R & D Systems) después de la estimulación con SGH (1 o 2 pares), conA (4} m^{g), rLJM17 (2 o 10} m^{g) o rLJL143 (2 o 10} m^g).

Actividad anti-Leishmania: macrófagos derivados de monocitos caninos se prepararon utilizando procedimientos estándar. Se tomaron células T autólogas T (5x106 células) a partir del cultivo después de 1 semana, se estimularon ^{con SGH de Lu. Longipalpis (2 pares), conA (4} m^{g), rLJM17 (25} m^{g) o rLJL143 (25} m^{g), y se volvieron a poner en} presencia de macrófagos infectados por L. infantum infectados en una proporción de 5:1. La actividad anti-Leishmania se evaluó por los cambios en los porcentajes de células infectadas y el número de amastigotes por macrófago después de un examen microscópico de preparaciones teñidas con Giemsa.

Picaduras de moscas de la arena Lutzomyia longipalpis inducen una fuerte respuesta de hipersensibilidad de tipo retardado en los perros

En modelos de roedores, la inmunidad celular que se caracteriza por una respuesta de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) Th1 a proteínas salivales de la mosca de la arena, protegen los animales de la leishmaniasis cutánea y visceral. No hay información relacionada con la presencia y naturaleza de la inmunidad celular a la saliva de la mosca de arena en los perros, los principales reservorios de leishmaniasis visceral causada por Leishmania infantum (chagasi) en Europa y América Latina. Por lo tanto, la cinética inicial de la inmunidad anti-saliva en perros después de la exposición a las picaduras de Lutzomyia longipalpis, se investigó el vector de Leishmania infantum chagasi en América Latina. Siete de nueve beagles mostraron anticuerpos anti-saliva específicos una semana después de la tercera exposición a las picaduras (Fig. 19A). Aparte de un solo perro, estos animales mostraron una respuesta de anticuerpos IgG2 fuerte en ausencia de IgG1 (Fig. 19A). Un perro mostró una respuesta de anticuerpos IgG2/IgG1 mixta. Para investigar si los perros expuestos a las picaduras de moscas de arena desarrollan una respuesta DTH, se midió la induración de la piel en el lugar de la picadura hasta 96 horas después de cada exposición. Después de la segunda exposición a las picaduras de moscas de arena, se observó una pequeña induración en los 7 perros que produjeron niveles significativos de anticuerpos IgG de Lu. longipalpis (Fig. 19b ). Esta se caracterizó por un eritema localizado, hinchazón y, finalmente, engrosamiento de la piel. La intensidad y duración de la induración observada se incrementó significativamente después de la tercera exposición durando hasta 96 horas después de las picaduras de moscas de arena (Fig. 19B). Esta induración no se observó después de la primera exposición en animales sin tratar (Fig. 19B). Los análisis histológicos del sitio de induración muestran una mínima inflamación que se caracteriza por linfocitos perivasculares dispersos y neutrófilos raras dentro de la dermis superficial 48 horas después de la primera y segunda exposición (Fig. 19C). Se observó un aumento drástico en el infiltrado celular 48 horas después de la tercera exposición. Esto se caracterizó por un engrosamiento prominente de la epidermis y la presencia de infiltrados multifocales de células inflamatorias que consisten de linfocitos, macrófagos y eosinófilos (Fig. 19D). Basado en el tiempo de la reacción, así como la naturaleza del infiltrado, se concluyó que la saliva de la mosca de arena induce una reacción de hipersensibilidad de tipo retardado en la piel de los perros después de exposiciones repetidas.

Proteínas salivales de Lutzomyia longipalpis que inducen una DTH en perros

Se investigaron las moléculas salivales de Lu. longipalpis que son responsables de la generación de una respuesta DTH en los perros. Las transcripciones que codifican las 35 proteínas secretadas más abundantes a partir de las glándulas salivales de esta especie se identificaron anteriormente. La identificación de candidatos capaces de inducir una respuesta inmune celular de un gran número de antígenos en animales grandes, como los perros, es prohibitiva en términos de coste y espacio. Para superar este obstáculo, se desarrolló un procedimiento de cribado de antígeno inverso que consistía en la exposición de un número mínimo de los perros (cinco) a las picaduras de moscas de la arena y la inyección de cada animal con hasta 38 muestras (35 plásmidos de ADN que codifican las proteínas salivales y tres controles) (Fig. 20A). De los 35 plásmidos de ADN inyectados, sólo 4 (LJM17, LJM11, LJL143 y LJL138) indujeron un eritema significativo en más de 3 perros, 48 horas después de la estimulación (Fig. 20B) y sólo 2 plásmidos de ADN (LJL143 y LJM17) produjeron una fuerte induración en 3 perros, 48 horas después de la estimulación (Fig. 20B). La mayoría de los plásmidos inyectados no produjeron un eritema significativo o induración (Fig. 20B) y la inyección de PBS y control de vector vacío indujo un eritema mínimo en el sitio de inyección en comparación con LJM17 y LJL143 (Fig. 20C). La especificidad y la reactividad de los plásmidos de ADN inyectados se muestran en la figura. 20D. En base a estos resultados LJM17 y LJL143 se eligieron para análisis adicional. LJL143 y LJM17 indujeron la producción de citoquinas indicativas de un entorno de Th1 en el sitio de inyección, incluyendo IL-12 e IFN-y (Fig. 20E). Las secciones histológicas tomadas 48 horas después de la estimulación muestran que LJL143 y LJM17 reclutan linfocitos y macrófagos en el sitio de la inyección indicativo de una respuesta clásica de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) (Fig. 20F). Para validar la especificidad de este enfoque, se prepararon LJL143, LJM17 y LJM111 altamente purificadas solubles, entre varias otras proteínas recombinantes salivales (Fig. 21A). Las proteínas recombinantes LJL143 y LJM17 reprodujeron la respuesta DTH observada tras la inyección de sus respectivos plásmidos de ADN (Fig. 21B y 21C), incluyendo el reclutamiento de linfocitos y macrófagos al sitio de la inyección (Fig. 21D).

Perros inmunizados con LJL143 y LJM17 producen IFN-^y específica a las proteínas salivales recombinantes.

Los perros (5 por grupo) fueron inmunizados con plásmidos de ADN que codifican LJL143, LJM17 o plásmido de ADN de control, una sensibilización-refuerzo con las respectivas proteínas salivales recombinantes y una inmunización final con el virus de la viruela del canario que expresa las proteínas salivales respectivas (Tabla 1). Las PBMC de perros inmunizados se estimularon con hasta 4 ug de su respectiva proteína recombinante, ConA y 1 par de homogeneizado de glándulas salivales (SGH). Los perros vacunados con LJL143 produjeron niveles significativos de IFN-y cinco semanas después de la cuarta vacunación y antes de la inyección de la viruela de canario (Fig. 22A). Más importante aún, la proteína LJL143 nativa presente en 1 par de homogeneizado de glándula salival fue capaz de generar una respuesta similar en perros vacunados cm LJLL43 (Fig. 22A). Los perros vacunados con LJM17 produjeron un niveles considerablemente menores de IFN-y en comparación con perros vacunados con LJL143 (Fig. 22A). Un perfil similar se observó dos semanas después de la vacunación de viruela del canario, donde las PBMC de perros vacunados con LJL143 produjeron dos veces más IFN-^y en comparación con su estado pre-pox (Fig. 22B).

Tabla 1

Vacunación con LJL143 y LJM17 genera una respuesta inmune protectora que mata amastigotes de Leishmania chagasi in vitro.

Macrófagos infectados de PBMC de dos perros vacunados con LJM17 y LJL143 mataron de manera eficiente amastigotes de Leishmania chagasi después de la adición de linfocitos autólogos estimulados con proteínas recombinantes LJM17 y LJL143, respectivamente (Fig. 23). La eficiencia de destrucción se midió mediante una reducción significativa en el porcentaje de macrófagos infectados (Fig. 23A), así como en el número de amastigotes por macrófagos (Fig. 23B). Este efecto de destrucción fue comparable al observado tras la adición del mitógeno no específico ConA (Fig. 23).

EJEMPLO 16: Producción de una respuesta inmune en perros

Doce perros de aproximadamente tres años de edad con la inmunidad natural contra Leishmaniasis se inyectan a través de una vía intradérmica (ID) en la parte posterior después del afeitado, con 100 mg de cada plásmido individual suspendido en 100 ml de PBS. Cada plásmido se inyecta en un punto diferente. Los puntos están separados por al menos 3 cm para evitar la interferencia entre las respuestas de DTH. El control negativo (100 ml de tampón) también se inocula por vía ID.

La respuesta DTH se evalúa 72 horas después de la inyección mediante la medición del diámetro más grande de la zona de tumefacción de la piel. Los resultados se expresan como el valor promedio de la zona de tumefacción para todos los perros y como un porcentaje de perros que tienen una respuesta DTH positiva. Una DTH positiva es un diámetro del área de tumefacción mayor que o igual a 4 mm a las 72 horas después de la inyección.

En un segundo estudio, 10 perros sin tratar de 4 a 6 meses de edad se inmunizan mediante inyección ID en 10 puntos (100 ml por punto) en la oreja derecha con un conjunto de plásmidos que codifican un polipéptido de Lu. Longipalpis, 100 mg para cada uno suspendido en 1000 ml de PBS. En el día 21, los perros se inyectan en 10 puntos (100 ml por punto) en la oreja izquierda y en 10 puntos (100 ml por punto) en el vientre con un conjunto de plásmidos, 100 mg para cada uno suspendido en 2000 ml de PBS. Todos los perros se estimularon en el día 35 mediante la inoculación por vía ID en la parte posterior (después del afeitado), con 100 mg de cada plásmido individual suspendido en 100 ml de PBS. Cada plásmido se inyecta en un punto diferente. Los puntos están separados por al menos 3 cm para evitar interferencias. Como control negativo, 100 ml de tampón se inoculan por vía intradérmica. La respuesta DTH se evalúa 72 horas después del estímulo, midiendo el diámetro más grande del área de tumefacción de la piel. Los resultados se expresan como el valor promedio de la zona de tumefacción para todos los perros y como un porcentaje de perros que tienen una respuesta DTH positiva. Una DTH positiva es un diámetro del área tumefacción mayor o igual de 4 mm a las 72 horas después de la inyección.

Los resultados de este estudio muestran que los plásmidos pueden inducir una inmunidad celular en los perros después de la inyección, una inmunidad celular revelada por una respuesta DTH. La variación del nivel de respuesta DTH puede ser mediante la variación de la expresión del inserto.

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Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Vacuna de administración de sensibilización y una vacuna de administración de refuerzo para su uso en la protecciónde unsujetode laleishmaniasisy/olaprevención de progresiónde laenfermedad en unsujetoinfectado, 5 en laque elsujetoes un animal canino,

en la que las vacunas se formulan para la administración en un régimen de administración de sensibilizaciónrefuerzo que comprende una administración de sensibilización con lavacuna de administración de sensibilización seguidade una administraciónde refuerzocon lavacuna de administraciónde refuerzo,

en la que dicha vacuna de administración de sensibilización comprende, en un vehículo, diluyente o excipiente 10 farmacéutica oveterinariamenteaceptable, un vectorde expresión que contiene un polinucleótido para expresar, in vivo,un polipéptidosalivalde Lu. Longipalpis,y

dichavacuna de administraciónde refuerzocomprende, en unvehículooexcipientefarmacéuticaoveterinariamente aceptable, elmismo polipéptidosalivalde Lu. Longipalpis,

en laque elpolipéptidosalivalde Lu. Longipalpis es un polipéptidoLJM17,

15 en la que el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene lasecuencia como se expone en laSEQ ID NO: 5, 7, 15, o 17;o el polinucleótido tiene al menos 70% de identidaddesecuencia con un polinucleótidoque codificaun polipéptidoquetienelasecuenciacomo se expone en laSEQ IDNO: 5,7,15,o 17;oelpolinucleótidotienealmenos 70% de identidaddesecuenciacon un polinucleótidoquetienelasecuenciacomo seexpone en SEQ IDNO: 6,8,16, 18,21,90,o91;y

20 en laque elpolipéptidode Lu. Longipalpis comprende una secuencia de aminoácidos que tiene almenos 80% de identidaddesecuencia con un polipéptidoquetienelasecuenciacomo seexpone en SEQ IDNO: 5,7,15,o 17.

2. Vacuna de administración de sensibilización y vacuna de administración de refuerzo para usar según la reivindicación1,en laque elvectorde expresiónesunvectorviralrecombinanteoun plásmido.

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3. Vacuna de administración de sensibilización y vacuna de administración de refuerzo para usar según la reivindicación 1, en la que el vector de expresión se selecciona del grupo que consiste en pVR2001-TOPO, pVR2001-TOPA, pVR1020, pVR1012, pAB110, ALVAC, TROVAC, MVA, yelvectorde baculovirus.

30 4. Vacuna de administración de sensibilización y vacuna de administración de refuerzo para usar según la reivindicación 1,en laque elvectorse selecciona delgrupo que consiste en pVR2001 LJM17 mostrado como SEQ ID NO: 9, vCP2390 mostrado como SEQ ID NO: 93, MVA-LJM17, pNBO002 mostrado como SEQ ID NO: 19, vCP2390-SEQ IDNO: 6,ymezclasdelosmismos.

35 5. Vacuna de administración de sensibilización y vacuna de administración de refuerzo para usar, según la reivindicación1,en laque elvectorde expresiónesunvectorALVAC que comprende laSEQ IDNO: 21 o91.

6. Vacuna de administración de sensibilización y vacuna administración de refuerzo para usar según la reivindicación 1,en laque lasecuencia de polinucleótidoestáoptimizada en codones paraelhuésped de modo que 40 lasecuencia de aminoácidos del polipéptidode Lu. Longipalpis codificado porlasecuencia de polinucleótidos está funcionalmenteinalterada.

7.Vacuna de administración de sensibilizaciónyvacuna de administración de refuerzo para usarsegún cualquiera de lasreivindicacionesanteriores,en laque elanimalcaninoes un perro.

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