ES2744709T3 - Expresión de una proteína quimérica KSAC y procedimiento de producción de proteínas solubles a alta presión - Google Patents

Expresión de una proteína quimérica KSAC y procedimiento de producción de proteínas solubles a alta presión Download PDF

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Abstract

Procedimiento para producir una proteína soluble expresada en procariotas o eucariotas que comprende las etapas de: (i) preparar cuerpos de inclusión en un tampón que no comprende o comprende una baja concentración de urea para formar una suspensión de cuerpos de inclusión, en el que la concentración de urea es de 0 M a 3 M; (ii) someter la suspensión de cuerpos de inclusión a un incremento escalonado de la presión durante un período de tiempo; y (iii) mantener una presión elevada aplicada a los cuerpos de inclusión durante un período de tiempo, preferiblemente en el que la alta presión está en el intervalo de aproximadamente 2000 bar a aproximadamente 5000 bar.

Description

DESCRIPCIÓN
Expresión de una proteína quimérica KSAC y procedimiento de producción de proteínas solubles a alta presión
REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS
[0001] Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de Estados Unidos n° de serie 61/694.968, presentada el 30 de agosto de 2012 y la solicitud provisional de Estados Unidos n° de serie 61/830.425, presentada el 3 de junio de 2013.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0002] La presente invención se refiere a formulaciones para combatir las infecciones por Leishmania en animales o seres humanos. Específicamente, la presente descripción proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un antígeno de Leishmania quimérico y un procedimiento de vacunación contra la Leishmania. La presente invención también se refiere a procedimientos para producir proteínas solubles o desagregadas utilizando alta presión.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0003] La leishmaniasis es una enfermedad parasitaria importante y grave que afecta a los humanos, caninos, y en menor grado, los felinos.
[0004] Los subgéneros Leishmania y Viannia se agrupan en complejos de especies y subespecies en base a similitudes moleculares, bioquímicas e inmunológicas. Hay varias formas de la enfermedad denominadas por su presentación clínica, incluyendo leishmaniasis cutánea, mucocutánea o visceral. Cada una de estas formas de la enfermedad es causada por diferentes especies de moscas de la arena que se encuentran en diferentes regiones del mundo. La leishmaniasis cutánea de los seres humanos se asocia con miembros de los complejos de L. aethiopica, L. major y L. tropica en el Viejo Mundo y los complejos de L. mexicana y L. braziliensis en el Nuevo Mundo. La leishmaniasis visceral es causada por L. donovani y L. infantum en las regiones del Viejo Mundo, mientras que L. chagasi es el principal responsable de la enfermedad visceral en el Nuevo Mundo. Debido a que L. infantum es el agente primario asociado con la leishmaniosis canina, las infecciones en perros a menudo son consideradas como viscerales, a pesar de que tienden a producir una enfermedad visceral y cutánea.
[0005] El agente de la leishmaniasis visceral es un parásito protozoario y pertenece al complejo Leishmania donovani. Este parásito se distribuye ampliamente en los países de clima temperado y subtropical del sur de Europa, África, Asia, América del Sur y América Central (Desjeux P. et al, 1984, Nucl Acids Res., 12: 387-395). La Leishmania donovani infantum (L. infantum) es responsable de la enfermedad felina y canina en el sur de Europa, África y Asia. En América del Sur y América Central, el agente es Leishmania donovani chagasi (L. chagasi), que está estrechamente relacionado con L. infantum. En los seres humanos, el agente es Leishmania donovani donovani (L. donovani), que también está relacionado con L. infantum y L. chagasi.
[0006] La leishmaniosis es una enfermedad lentamente progresiva que puede tomar hasta 7 años en resultar clínicamente evidente (McConkey SE et al, 2002, Vet Canine J. 43: 607-609). Incluso entonces, los signos son inespecíficos y con frecuencia un diagnóstico de Leishmania raramente se considera. Los perros se infectan con más frecuencia con L. infantum (complejo de L. donovani), que es responsable de la enfermedad viscerotrópica en personas. Sin embargo, hasta el 90% de los perros infectados presentes con lesiones viscerales y cutáneas (Slappendel RJ et al, 1998, en Greene CE: Infectious Diseases of the Dog and Cat, págs. 450-458). Por otro lado, muchos perros parecen resistentes a este parásito de forma natural y pueden permanecer asintomáticos a pesar de la infección conocida (Grosjean NL et al, 2002, Vet Rec. 150: 241-244). Se estima que sólo el 10% de los perros que residen en áreas endémicas en realidad desarrollan la enfermedad clínica (Lindsay DS et al, 2002, Compend Cont Educ Pract Vet. 24: 304-312). Esta menor incidencia de la enfermedad clínica se atribuye a una predisposición genética de ciertos perros de generar una respuesta inmunitaria mediada por células más protectora que una respuesta humoral (Lindsay DS et al., McConkey SE et al., Slappendel RJ, et al.). Además, se ha descrito que hasta el 20% de los perros infectados pueden generar una respuesta inmunitaria adecuada y recuperarse espontáneamente de la enfermedad clínica (McConkey SE et al.). En los animales que desarrollan una respuesta humoral, IgG1 parece correlacionarse con la enfermedad clínica, mientras que los perros asintomáticos tienen niveles de anticuerpos IgG2 más altos (Lindsay et al.).
[0007] Algunos de los signos clínicos descritos más frecuencia de la leishmaniasis incluyen apatía, fatiga e intolerancia al ejercicio junto con la anorexia y la pérdida de peso que finalmente culminan como enfermedad de desgaste (McConkey SE et al.). Estos signos pueden estar acompañados o no de fiebre, linfadenopatía local o generalizada (90%) y/o hepatoesplenomegalia (Grosjean NL et al, 2003, J Am Vet Med Assoc 222: 603-606; Lindsay DS et al, McConkey SE et al.; Martínez-Subiela S et al, 2002, Vet Rec 150: 241-244). La afectación articular también es bastante común y puede presentarse como cojera con articulaciones hinchadas o simplemente como un modo de andar rígido. Hallazgos menos comunes incluyen lesiones oculares (<5%), diarrea crónica (30%) y uñas quebradizas deformadas largas (20%) que se refieren como onicogrifosis (Lindsay DS et al., Slappendel RJ et al.). Las lesiones cutáneas están presentes en hasta el 89% de los perros infectados, con o sin signos evidentes de afectación visceral. Las lesiones de la leishmaniasis cutánea pueden aparecer en cualquier parte del cuerpo, pero los sitios más comunes son los que están expuestos al medio ambiente y, por tanto, son más susceptibles a las picaduras de las moscas de la arena. La pápula inicial da lugar rápidamente a una úlcera. La leishmaniasis visceral es invariablemente fatal si no se trata rápidamente. La leishmaniasis visceral afecta a los órganos internos del cuerpo, específicamente el bazo y el hígado.
[0008] Los perros son considerados el principal reservorio de Leishmaniasis. La enfermedad se caracteriza por la evolución crónica de signos víscero-cutáneos que aparecen en menos del 50% de los animales infectados (Lanotte G. et al, 1979, Ann Parasitol Hum Comp. 54: 277-95). Tanto los perros asintomáticos como los sintomáticos con anticuerpos detectables pueden ser infecciosos (Molina R. et al, 1994, Trans R. Soc Med Hyg 88: 491-3; Courtenay O. et al, 2002, J. Infect. Dis., 186: 1314-1320). Los gatos también pueden ser portadores de los parásitos protozoos y por lo tanto se consideran reservorios secundarios potenciales.
[0009] Debido a una serie de factores, las opciones de tratamiento para la leishmaniasis en perros y respuesta a la terapia son, como mucho, limitadas. Por alguna razón no definida, la leishmaniasis visceral es más difícil de tratar en perros que en los seres humanos. Ninguna opción de tratamiento es 100% eficaz en la limpieza de la infección parasitaria y la enfermedad clínica a menudo vuelve a aparecer con el cese de la terapia (Lindsay DS et al.). En áreas endémicas, el régimen de tratamiento más común ha sido una combinación de alopurinol con un antimonial pentavalente, tal como antimoniato meglumina o estibogluconato de sodio (Lindsay DS et al., Slappendel RJ et al.). Sin embargo, en los últimos años este protocolo ha peridod popularidad debido a la creciente resistencia del parásito al fármaco, así como los efectos secundarios adversos asociados con estos compuestos (Lindsay DS et al.). Para limitar más las opciones de tratamiento, el PENTOSTAM® (estibogluconato de sodio) es el único antimonial disponible en los Estados Unidos y su distribución está regulada por los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC) en Atlanta, GA (DS Lindsay et al.). Otras investigaciones han buscado procedimientos de identidad de la prevención y el tratamiento de la leishmaniasis a través de, por ejemplo, la administración de polipéptidos de fusión antigénicos (véase el documento US 2009/0291099).
[0010] Se han intentado protocolos diferentes, pero no han demostrado ser más eficaces en la limpieza de la infección parasitaria o en la prevención de la recaída clínica. Además, cada protocolo se asocia con efectos adversos potenciales. La anfotericina B se une a esteroles y altera la permeabilidad de la membrana celular, pero es nefrotóxica (Lindsay DS et al.). Cuando se administra parenteralmente, la paramomicina actúa sinérgicamente con los antimoniales causando niveles más altos de antimonial durante períodos más largos de tiempo, pero también es nefrotóxica y actualmente no se recomienda para el uso clínico (Lindsay DS et al.). El isetionato de pentamidina es eficaz contra la leishmaniasis, pero requiere al menos 15 inyecciones intramusculares y es bastante doloroso (Lindsay DS et al.). Ketoconazol, miconazol, fluconazol e itraconazol son medicamentos orales que pueden ser útiles en contener la enfermedad, pero que tienen un coste prohibitivo y llevan el riesgo de resistencia a los medicamentos cuando se tratan pacientes sintomáticamente. En resumen, los diversos regímenes de tratamiento para la leishmaniasis en perros han sido investigados, pero no son 100% eficaces; las recaídas son la regla más que la excepción. En última instancia, el médico veterinario se enfrenta al dilema de tratar los brotes sintomáticos de la leishmaniasis en perros en riesgo de desarrollar cepas resistentes a los medicamentos de este parásito dentro de los Estados Unidos.
[0011] La detección masiva de perros seropositivos, seguido de sacrificio y/o tratamiento con fármacos, o la aplicación de masa de collares impregnados con deltametrina, demostró que tenía un impacto en la reducción de la prevalencia de leishmaniosis humana y canina en áreas endémicas del sur de Europa, África, y Asia (Maroli M. et al, 2001, Med Vet Entomol 15: 358-63; Mazloumi Gavgani AS et al, 2002, Lancet 360: 374-9), aunque se ha debatido la eficacia de la eliminación de caninos seropositivos (Dietze R. et al, 1997, Clin Infect Dis 25: 1240-2; Moreira Jr. ED et al, 2004, Vet Parasitol 122: 245-52). Estas medidas de control se consideran inaceptables, caras o no eficaces (Gradoni L. et al, 2005, Vaccine, 23: 5245-51).
[0012] Los modelos matemáticos utilizados para comparar la eficacia de diversas herramientas para el control de la Leishmaniasis sugieren que una vacuna canina puede ser el procedimiento más práctico y eficaz (Dye C., 1996, Am J. Trop Med Hyg 55: 125- 30). Por lo tanto, el desarrollo de vacunas capaces de proteger a los caninos de la leishmaniasis y/o para prevenir la progresión de la enfermedad en animales infectados es muy deseable para la implementación de programas de control de la leishmaniasis, así como para la comunidad veterinaria (Gradoni L. et al.).
[0013] Haynes et al. (Biotechnol. Prog., 2010, Vol. 26, No. 3, 743-749) describen el uso de alta presión hidrostática para lograr una alta solubilidad y altos rendimientos de replegamiento de la hormona del crecimiento (GH) producida en los cuerpos de inclusión de E. coli. Los documentos US 6,489,450, US7,064,192, US7,767,795 y u S7,615,617 describen revertir la agregación y aumentar el replegamiento de proteínas desnaturalizadas mediante aplicación de alta presión.
[0014] Sigue existiendo la necesidad de procedimientos eficaces y eficientes para producir vacunas de subunidades (proteína) para el tratamiento de Leishmania. La formulación de vacunas y el procedimiento de producir tal vacuna de la presente descripción satisfacen esta necesidad en el estado de la técnica.
CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN
[0015] La presente invención demostró por primera vez que una proteína KSAC quimérica expresada en cuerpos de inclusión de E. coli se solubilizó sustancialmente y se replegó después del tratamiento a alta presión.
[0016] La presente invención mostró el resultado sorprendente de que la aplicación de un incremento escalonado de la presión acoplado con el tratamiento prolongado de cuerpos de inclusión bajo alta presión produjo un alto rendimiento de proteínas solubles, disgregadas, replegadas y activas.
[0017] Se proporcionan composiciones y vacunas que comprenden la proteína KSAC quimérica. Tales vacunas o composiciones se pueden utilizar para vacunar un animal y proporcionar protección contra la leishmaniasis. La proteína KSAC puede expresarse en cuerpos de inclusión de E. coli y posteriormente se solubiliza mediante tratamiento a alta presión. La proteína KSAC posee propiedades inmunogénicas y protectoras.
[0018] Los procedimientos de la invención incluyen procedimientos para la fabricación y la producción de proteínas solubles expresadas en procariotas o eucariotas que comprenden las etapas de
(i) preparar cuerpos de inclusión en un tampón que no comprende o comprende una baja concentración de urea para formar una suspensión de cuerpos de inclusión, en el que la concentración de urea es de 0 M a 3 M;
(ii) someter la suspensión de cuerpos de inclusión a un incremento escalonado de la presión durante un período de tiempo; y
(iii) mantener una presión elevada aplicada a los cuerpos de inclusión durante un período de tiempo, preferiblemente en el que la alta presión está en el intervalo de aproximadamente 2000 bar a aproximadamente 5000 bar.
Los procedimientos descritos en el presente documento también incluyen los procedimientos de uso que incluyen administrar a un animal una cantidad eficaz de la proteína KSAC antigénica del mismo para provocar una respuesta inmunogénica protectora.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0019] La siguiente descripción detallada, proporcionada a modo de ejemplo, y que no pretende limitar la invención a realizaciones específicas descritas, puede entenderse conjuntamente con las figuras adjuntas, en las que:
La Figura 1 es una tabla que muestra la SEQ ID NO asignada a cada secuencia de ADN y proteína.
Las figuras 2A-2C muestran las secuencias de ADN y proteínas.
La Figura 3 es una representación gráfica de la presión y el tiempo de tratamiento de cuerpos de inclusión de KSAC.
La Figura 4 es una representación esquemática de la comparación entre el replegamiento con un tratamiento a alta presión y con cromatografía clásica.
La Figura 5 es la representación gráfica del procedimiento de replegamiento de KSAC.
La Figura 6 representa la SDS-PAGE de KSAC replegada mediante cromatografía de exclusión.
La Figura 7 representa el diagrama de HPLC de KSAC replegada mediante cromatografía de exclusión.
Las figuras 8A y 8B representan la dispersión de luz dinámica (DLS) de la proteína KSAC replegada usando cromatografía de exclusión.
La Figura 9 representa la transferencia Qdot de muestras de KSAC tratadas con 3000 bar.
La Figura 10 representa la SDS-PAGE de muestras de KSAC tratadas con 3000 bar.
La Figura 11 representa la HPLC de muestras de control y KSAC solubilizada después de un tratamiento con 3000 bar.
La Figura 12 representa el cromatograma de HPLC superpuesto del sobrenadante de las muestras de KSAC tratadas con 3000 bar de presión y la proteína KSAC obtenida con el procedimiento de replegamiento clásico.
La Figura 13 representa la superposición de los datos de DLS obtenidos con la proteína presurizada a 3000 bar en el tampón sin urea y la proteína obtenida con el procedimiento de replegamiento clásico.
La Figura 14 muestra el efecto de la presión y tampón en los tamaños de las proteínas.
La Figura 15 representa el cromatograma de HPLC de muestras tratadas con 4000 bar.
La Figura 16 muestra la distribución de tamaño por DLS en número de las muestras tratadas con 5000 bar sin urea. La Figura 17 muestra la comparación del contenido de proteína soluble KSAC determinado mediante HPLC y transferencia Qdot.
Figuras 18A y 18B muestran el análisis SDS-PAGE de muestras de KSAC después de los tratamientos a alta presión.
Las figuras 19A-19D muestran el análisis de transferencia Q-Dot de muestras de KSAC después de los tratamientos a alta presión.
La Figura 20 representa el análisis HPLC de muestras de KSAC después del tratamiento con el procedimiento A. La Figura 21 representa el análisis HPLC de muestras de KSAC después del tratamiento con el procedimiento B. La Figura 22 representa el análisis HPLC de muestras KSAC después del tratamiento con el procedimiento A, procedimiento B y procedimiento clásico.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
[0020] Se observa que en esta descripción y particularmente en las reivindicaciones, términos, tales como "comprende", "comprendido", "que comprende" y similares pueden tener el significado que se le atribuye en la ley de Patentes de Estados Unidos; por ejemplo, pueden significar "incluye", "incluido", "que incluye", y similares; y que términos, tales como "que consiste esencialmente en" y "consiste esencialmente en" tienen el significado que se les atribuye en la ley de patentes de Estados Unidos, por ejemplo, permiten elementos no citados de manera explícita, pero excluyen elementos que se encuentran en la técnica anterior o que afectan una característica básica o novedosa de la invención.
[0021] A menos que se indique lo contrario, los términos técnicos se usan de acuerdo con el uso convencional. Las definiciones de términos comunes en biología molecular pueden encontrarse en Benjamin Lewin, Genes V. publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8). Los términos singulares "un", "una" y "el/la" incluyen los referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Del mismo modo, la palabra "o" pretende incluir "y" a menos que el contexto indique claramente lo contrario. La palabra "o" significa cualquier miembro de una lista en particular y también incluye cualquier combinación de los miembros de esa lista.
[0022] El término "animal" se utiliza en el presente documento para incluir todos los mamíferos, aves y peces. El animal tal como se usa en el presente documento se puede seleccionar del grupo que consiste en equino (por ejemplo, caballo), canino (por ejemplo, perros, lobos, zorros, coyotes, chacales), felino (por ejemplo, leones, tigres, gatos domésticos, gatos salvajes, otra gatos grandes, y otros felinos incluyendo guepardos y lince), bovino (por ejemplo, ganado), porcino (por ejemplo, cerdo), ovino (por ejemplo, ovejas, cabras, llamas, bisontes), aviar (por ejemplo, pollo, pato, ganso, pavo, codorniz, faisán, loro, pinzones, halcón, cuervo, avestruz, emu y casuario), primate (por ejemplo, prosimio, tarsio, mono, gibón, simio), seres humanos, y peces. El término "animal" también incluye un animal individual en todas las etapas del desarrollo, incluyendo etapas embrionarias y fetales.
[0023] Los términos "polipéptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en este documento para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos consecutivos.
[0024] Los términos "ácido nucleico", "nucleótido", y "polinucleótido" se usan indistintamente y se refieren a ARN, ADN, ADNc o ARNc y derivados de los mismos, tales como los que contienen cadenas principales modificadas. Se debe entender que la descripción proporciona polinucleótidos que comprenden secuencias complementarias a las descritas en el presente documento. El "polinucleótido" contemplado en la presente descripción incluye tanto la cadena directa (5' a 3 ') como la cadena complementaria inversa (3' a 5'). Los polinucleótidos según la descripción se pueden preparar de diferentes maneras (por ejemplo, mediante síntesis química, por clonación de genes, etc.) y pueden adoptar diversas formas (por ejemplo, lineal o ramificado, de cadena simple o doble, o un híbrido de las mismss, cebadores, sondas, etc.).
[0025] El término "ADN genómico" o "genoma" se usa de manera intercambiable y se refiere a la información genética heredable de un organismo huésped. El ADN genómico comprende el ADN del núcleo (también denominado ADN cromosómico), pero también el ADN de los plástidos (por ejemplo, cloroplastos) y otros orgánulos celulares (por ejemplo, las mitocondrias). El ADN genómico o genoma contemplado en la presente descripción también se refiere al ARN de un virus. El ARN puede ser un ARN de cadena positiva o de cadena negativa. El término "ADN genómico" contemplado en la presente descripción incluye el ADN genómico que contiene secuencias complementarias a las descritas en el presente documento. El término "ADN genómico" también se refiere a ARN mensajero (ARNm), ADN complementario (ADNc) y ARN complementario (ARNc).
[0026] El término "gen" se utiliza ampliamente para referirse a cualquier segmento de polinucleótido asociado con una función biológica. Por lo tanto, los genes o polinucleótidos incluyen intrones y exones como en la secuencia genómica, o sólo las secuencias de codificación como en los ADNc, tal como un marco de lectura abierto (ORF), empezando a partir del codón de iniciación (codón de metionina) y terminando con una señal de terminación (codón de parada). Los genes y polinucleótidos también pueden incluir regiones que regulan su expresión, tales como el inicio de la transcripción, traducción y terminación de la transcripción. Por lo tanto, también se incluyen promotores y regiones de unión a ribosomas (en general, estos elementos reguladores se encuentran aproximadamente entre 60 y 250 nucleótidos en dirección 5' del codón de inicio de la secuencia codificante o gen; Doree SM et al.; Pandher K et al.; Chung J Y et al), terminadores de la transcripción (en general el terminador se encuentra dentro de aproximadamente 50 nucleótidos en dirección 3' del codón de parada de la secuencia codificante o gen; Ward, C K et al). Un gen o polinucleótido también se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa ARNm o ARN funcional, o codifica una proteína específica, y que incluye secuencias reguladoras.
[0027] El término "ADN heterólogo" tal como se utiliza en el presente docuemnto se refiere al ADN derivado de un organismo diferente, tal como un tipo de célula diferente o de una especie diferente al receptor. El término también se refiere a un ADN o fragmento del mismo en el mismo genoma del ADN huésped en el que se inserta el ADN heterólogo en una región del genoma que es diferente de su ubicación original.
[0028] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "antígeno" o "inmunógeno" significa una sustancia que induce una respuesta inmune específica en un animal huésped. El antígeno puede comprender un organismo completo, muerto, atenuado o vivo; una subunidad o parte de un organismo; un vector recombinante que contiene un inserto con propiedades inmunogénicas; una pieza o fragmento de ADN capaz de inducir una respuesta inmune tras la presentación a un animal huésped; un polipéptido, un epítopo, un hapteno o cualquier combinación de los mismos. Alternativamente, el inmunógeno o antígeno puede comprender una toxina o antitoxina.
[0029] El término "proteína o péptido inmunogénico", tal como se usa en el presente documento incluye polipéptidos que son inmunológicamente activos en el sentido de que una vez administrados al huésped, son capaces de evocar una respuesta inmune de tipo humoral y/o celular dirigida contra la proteína. Preferiblemente, el fragmento de proteína es tal que tiene sustancialmente la misma actividad inmunológica que la proteína total. Por lo tanto, un fragmento de proteína según la descripción comprende o consiste esencialmente en o consiste en al menos un epítopo o determinante antigénico. Una proteína o polipéptido "inmunogénico", como se usa en el presente documento, incluye la secuencia de longitud completa de la proteína, análogos de la misma o fragmentos inmunogénicos de la misma. Por "fragmento inmunogénico" se entiende un fragmento de una proteína que incluye uno o más epítopos y de este modo provoca la respuesta inmunológica descrita anteriormente. Tales fragmentos pueden ser identificados usando cualquier número de técnicas de mapeo de epítopos bien conocidas en la técnica.
[0030] El término "proteína o péptido inmunogénico" contempla además deleciones, adiciones y sustituciones a la secuencia, siempre que el polipéptido funcione para producir una respuesta inmunológica tal como se define en el presente documento. El término "variación conservativa" se refiere a la sustitución de un residuo de aminoácido por otro residuo biológicamente similar, o la sustitución de un nucleótido en una secuencia de ácido nucleico de tal manera que el residuo de aminoácido codificado no cambia o es otro residuo biológicamente similar. A este respecto, las sustituciones particularmente preferidas serán generalmente de naturaleza conservativa, es decir, aquellas sustituciones que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos. Por ejemplo, los aminoácidos se dividen generalmente en cuatro familias: (1) ácidos - aspartato y glutamato; (2) básicos - lisina, arginina, histidina; (3) no polares - alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares sin carga -glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, el triptófano y la tirosina se clasifican a veces como aminoácidos aromáticos. Los ejemplos de variaciones conservativas incluyen la sustitución de un resto hidrófobo tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro residuo hidrófobo, o la sustitución de un residuo polar por otro residuo polar, tal como la sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por ácido aspártico ácido, o glutamina por asparagina, y similares; o una sustitución conservativa similar de un aminoácido por un aminoácido estructuralmente relacionado que no tendrá un efecto importante sobre la actividad biológica. Las proteínas que tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la molécula de referencia, pero que poseen sustituciones de aminoácidos menores que no afectan sustancialmente a la inmunogenicidad de la proteína están, por lo tanto, dentro de la definición del polipéptido de referencia. Todos los polipéptidos producidos mediante estas modificaciones se incluyen en el presente documento. El término "variación conservativa" también incluye el uso de un aminoácido sustituido en lugar de un aminoácido parental no sustituido siempre que los anticuerpos producidos contra el polipéptido sustituido también inmunorreaccionen con el polipéptido no sustituido.
[0031] El término "epítopo" se refiere al sitio en un antígeno o hapteno al cual responden células B y/o células T específicas. El término también se usa indistintamente con "determinante antigénico" o "sitio determinante antigénico". Los anticuerpos que reconocen el mismo epítopo pueden identificarse en un inmunoensayo simple que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno diana.
[0032] Una "respuesta inmunológica" a una composición o vacuna es el desarrollo en el huésped de una respuesta inmune celular y/o mediada por anticuerpos a una composición o vacuna de interés. Por lo general, una "respuesta inmunológica" incluye, pero no se limita a, uno o más de los siguientes efectos: la producción de anticuerpos, células B, células T auxiliares, y/o células T citotóxicas, dirigidas específicamente a un antígeno o antígenos incluidos en la composición o vacuna de interés. Preferentemente, el huésped mostrará una respuesta inmunológica terapéutica o protectora tal que la resistencia a una nueva infección se verá reforzada y/o la gravedad clínica de la enfermedad se verá reducida. Dicha protección se demostrará por una reducción o falta de los síntomas normalmente mostrados por un huésped infectado, un tiempo de recuperación más rápido y/o un título viral disminuido en el huésped infectado.
[0033] Los términos "recombinante" y "genéticamente modificado" se utilizan indistintamente y se refieren a cualquier modificación, alteración o diseño de un polinucleótido o proteína en su forma o estructura nativa, o cualquier modificación, alteración o diseño de un polinucleótido o proteína en su entorno nativo o circundante. La modificación, alteración o diseño de un polinucleótido o proteína pueden incluir, pero no se limitan a, la deleción de uno o más nucleótidos o aminoácidos, la deleción de un gen completo, la optimización de codones de un gen, la sustitución conservativa de aminoácidos, la inserción de uno o más polinucleótidos heterólogos.
[0034] El término "cuerpos de inclusión", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a agregados inactivos de proteínas heterólogas expresadas en procariotas o eucariotas. Los términos "sustancialmente soluble", "sustancialmente solubilizada”, "sustancialmente disgregada" o "sustancialmente replegada" se usan indistintamente en este documento para referirse a proteínas agregadas en cuerpos de inclusión que son al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 98% solubles en solución acuosa, o se disgregan, o se repliegan a una forma activa después de los tratamientos. El replegamiento significa que una proteína total o parcialmente desnaturalizada adopta una estructura secundaria, terciaria y cuaternaria como la de la molécula nativa.
[0035] En el presente documento se decribe una composición o vacuna que comprende una proteína producida a partir de E. coli. La proteína puede ser una proteína de fusión que comprende dos o más partes inmunogénicas de la proteína de Leishmania seleccionadas entre proteína de membrana de kinetoplástidos 11 (KMP11), esterol metiltransferasa (SMT), A2 y cisteína proteinasa (CP). La proteína puede ser una proteína de fusión que comprende KMP11, SMT, A2 y CP de Leishmania designada como proteína quimérica KSAC. La proteína KSAC puede solubilizarse a partir de los cuerpos de inclusión de E. coli mediante una alta presión. La proteína KSAC puede ser sustancialmente soluble en una solución acuosa o replegarse sustancialmente.
[0036] Además, en el presente documento se describen homólogos de proteínas o polinucleótidos mencionados anteriormente. Tal como se usa en el presente documento, el término "homólogos" incluye ortólogos, análogos y parálogos. El término "análogos" se refiere a dos polinucleótidos o polipéptidos que tienen la misma función o similar, pero que han evolucionado por separado en organismos no relacionados. El término "ortólogos" se refiere a dos polinucleótidos o polipéptidos de diferentes especies, pero que han evolucionado a partir de un gen ancestral común mediante especiación. Normalmente, los ortólogos codifican polipéptidos que tienen las mismas funciones o similares. El término "parálogos" se refiere a dos polinucleótidos o polipéptidos que están relacionados por duplicación dentro de un genoma. Los parálogos usualmente tienen diferentes funciones, pero estas funciones pueden estar relacionadas. Los análogos, ortólogos y parálogos de un polipéptido de tipo salvaje pueden diferir del polipéptido de tipo salvaje por modificaciones posteriores a la traducción, por diferencias en la secuencia de aminoácidos, o por ambos. En particular, los homólogos mostrarán generalmente al menos el 80-85%, 85-90%, 90-95%, o 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia, con toda o parte de las secuencias de polinucleótido o polipéptido descritas anteriormente, y mostrarán una función similar.
[0037] La proteína KSAC quimérico puede tener al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene la secuencia tal como se expone en la SEQ ID NO: 2. El polinucleótido que codifica la proteína KSAC quimérica puede tener al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene la secuencia tal como se expone en la SEQ ID NO: 2. El polinucleótido que codifica KSAC puede tener al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polinucleótido que tiene la secuencia tal como se expone en la la SEQ ID NO: 1.
[0038] El término "identidad" con respecto a secuencias puede referirse a, por ejemplo, el número de posiciones con nucleótidos o aminoácidos idénticos dividido por el número de nucleótidos o aminoácidos en la más corta de las dos secuencias, en el que la alineación de las dos secuencias se puede determinar de acuerdo con el algoritmo de Wilbur y Lipman (Wilbur y Lipman). La identidad de secuencia o similitud de secuencia de dos secuencias de aminoácidos, o la identidad de secuencia entre dos secuencias de nucleótidos se pueden determinar utilizando el paquete de software Vector NTI (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA). Cuando las secuencias de ARN se dice que son similares o tienen un grado de identidad u homología de secuencia con secuencias de ADN, la timidina (T) en la secuencia de ADN se considera igual a uracilo (U) en la secuencia de ARN. Por lo tanto, las secuencias de ARN están dentro del alcance de la descripción y pueden derivarse de secuencias de ADN, considerando la timidina (T) en la secuencia de ADN igual a uracilo (U) en las secuencias de ARN.
[0039] Los polinucleótidos de la descripción incluyen secuencias que son degeneradas como resultado del código genético, por ejemplo, el uso de codones optimizados para un huésped específico. Tal como se usa en el presente documento, "optimizado" se refiere a un polinucleótido que se modifica mediante ingeniería genética para incrementar su expresión en una especie determinada. Para proporcionar polinucleótidos optimizados que codifican polipéptidos KSAC, la secuencia de ADN del gen de la proteína KSAC se puede modificar para 1) comprender codones preferidos por genes altamente expresados en una especie particular; 2) comprender un contenido de A T o G C en la composición de bases de nucleótidos que sustancialmente se encuentra en dicha especie; 3) formar una secuencia de iniciación de dicha especie; o 4) eliminar secuencias que causan la desestabilización, poliadenilación inapropiada, degradación y terminación de ARN, o que forman horquillas de estructura secundaria o sitios de empalme de ARN. El aumento de expresión de la proteína KSAC en dicha especie se puede lograr mediante la utilización de la frecuencia de distribución de uso de codones en las células eucariotas y procariotas, o en una especie particular. El término "frecuencia de uso de codones preferidos" se refiere a la preferencia exhibida por una célula huésped específica en el uso de codones de nucleótidos para especificar un aminoácido determinado. Hay 20 aminoácidos naturales, la mayoría de los cuales son especificados por más de un codón. Por lo tanto, todas las secuencias de nucleótidos degeneradas están incluidas en la descripción, siempre que la secuencia de aminoácidos del polipéptido KSAC codificada por la secuencia de nucleótidos esté funcionalmente inalterada.
[0040] La presente descripción proporciona un procedimiento para producir una proteína soluble, disgregada, replegado o activo expresada en procariotas o eucariotas que comprende las etapas de (i) preparar los cuerpos de inclusión en un tampón que no contiene o contiene una baja concentración de urea para formar una suspensión de cuerpos de inclusión; y (ii) someter la suspensión de cuerpos de inclusión a una alta presión durante un período de tiempo.
[0041] En aún otra realización, la presente invención proporciona un procedimiento para producir una proteína soluble expresada en procariotas o eucariotas que comprende las etapas de (i) preparar cuerpos de inclusión en un tampón que no contiene o contiene una baja concentración de urea para formar una suspensión de cuerpos de inclusión, en el que la concentración de urea es de 0 M a 3M; (ii) someter la suspensión de cuerpos de inclusión a un incremento escalonado de presión durante un período de tiempo; y (iii) mantener una alta presión aplicada a los cuerpos de inclusión durante un período de tiempo.
[0042] En un aspecto de la realización, el tampón puede contener ditio treitol (DTT). En otro aspecto, la concentración de DTT puede variar de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 90 mM, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 70 mM, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 60 mM, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM, o aproximadamente 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM, 75 mM, 80 mM, 85 mM, 90 mM, 95 mM, 100 mM.
[0043] En un aspecto, la urea puede no estar presente en el tampón. En otro aspecto, la urea puede estar presente en el tampón a la concentración de aproximadamente 1 M, aproximadamente 2 M y aproximadamente 3M.
[0044] En otro aspecto de la realización, la alta presión puede estar en el intervalo de aproximadamente 1000 bar a aproximadamente 5000 bar, de aproximadamente 2000 bar a aproximadamente 4000 bar. La alta presión puede ser cualquier presión en el intervalo de aproximadamente 2000 bar hasta aproximadamente 4000 bar, por ejemplo, pero sin limitación, 2000 bar, 2100 bar, 2200 bar, 2300 bar, 2400 bar, 2500 bar, 2600 bar, 2700 bar, 2800 bar, 2900 bar, 3000 bar, 3100 bar, 3200 bar, 3300 bar, 3400 bar, 3500 bar, 3600 bar, 3700 bar, 3800 bar, 3900 bar y 4000 bar.
[0045] Puede aplicarse un aumento gradual de la presión a la suspensión de cuerpos de inclusión mediante el aumento continuo de la presión a una velocidad constante durante un período de tiempo para alcanzar la presión elevada final deseada. Por ejemplo, la presión puede aumentarse a una velocidad de aproximadamente 200 bar/min a aproximadamente 1000 bar/min de forma continua durante de aproximadamente 2 min a aproximadamente 10 minutos para llegar a 2000 bar, a una velocidad de aproximadamente 200 bar/min a aproximadamente 1000 bar/min de forma continua durante de aproximadamente 3 min a aproximadamente 15 minutos para llegar a 3000 bar, a una velocidad de aproximadamente 200 bar/min a aproximadamente 1000 bar/min de forma continua durante de aproximadamente 4 min a aproximadamente 20 minutos para llegar a 4000 bar, a una velocidad de aproximadamente 200 bar/min a aproximadamente 1000 bar/min de forma continua durante de aproximadamente 5 min a aproximadamente 25 minutos para llegar a 5000 bar. En otro aspecto, el aumento gradual de la presión se aplica de forma escalonada. Por ejemplo, la presión se aumenta a aproximadamente 1.000 bar/min durante aproximadamente un minuto para llegar a 1.000 bar, entonces se mantiene la presión de 1000 bar durante aproximadamente una hora para relajar la proteína, después del período de relajación, la presión se aumenta de nuevo a aproximadamente 1000 bar/min durante aproximadamente un minuto para llegar a la presión elevada final deseada de 2000 bar. La presión también se puede incrementar a aproximadamente 1.000 bar/min durante aproximadamente treinta segundos para llegar a 500 bar, la presión de 500 bar se mantiene durante aproximadamente una hora para relajar la proteína, a continuación, la presión se aumenta de nuevo a aproximadamente 1000 bar/min durante aproximadamente treinta segundos para llegar a 1.000 bar, la presión de 1000 bar se mantiene durante aproximadamente una hora para relajar la proteína, la presión se aumenta de nuevo a aproximadamente 1000 bar/min durante aproximadamente treinta segundos para llegar a 1.500 bar, la presión de 1500 bar se mantiene durante aproximadamente una hora para relajar la proteína, a continuación, la presión se aumenta de nuevo a aproximadamente 1000 bar/min para llegar a la presión final deseada de 2000 bar. Para llegar a la presión alta final deseada de 3000 bar, 4000 bar y 5000 bar, puede emplearse el mismo aumento escalonado de la presión a aproximadamente 1000 bar/min durante aproximadamente un minuto o aproximadamente 30 segundos con una relajación intermedia de proteína durante aproximadamente una hora. Por ejemplo, para llegar a la presión objetivo de 3.000 bar, la presión se aumenta a aproximadamente 1.000 bar/min durante aproximadamente un minuto para llegar a 1.000 bar, a continuación la presión de 1000 bar se mantiene durante aproximadamente una hora para relajar la proteína, la presión se aumenta de nuevo a aproximadamente 1000 bar/min durante aproximadamente un minuto para llegar a la presión de 2000 bar, a continuación la presión de 2000 bar se mantiene durante aproximadamente una hora para relajar la proteína por segunda vez, la presión se aumenta de nuevo a aproximadamente 1000 bar/min durante aproximadamente un minuto para llegar a la presión final deseada de 3000 bar. Para llegar a la presión objetivo de 3000 bar, la presión también se puede aumentar a aproximadamente 1.000 bar/min durante aproximadamente treinta segundos, con una zona invariable de 1 hora de duración cada 500 bar, y la presión objetivo de 3000 bar puede alcanzarse después de 5 horas. Para llegar a la presión final deseada de 4.000 bar, la presión se aumenta a aproximadamente 1.000 bar/min durante aproximadamente un minuto para llegar a 1.000 bar, a continuación la presión de 1000 bar se mantiene durante aproximadamente una hora para relajar la proteína, la presión se aumenta de nuevo a aproximadamente 1000 bar/min durante aproximadamente un minuto para llegar a la presión de 2000 bar, a continuación la presión de 2000 bar se mantiene durante aproximadamente una hora para relajar la proteína una segunda vez, la presión se aumenta de nuevo a aproximadamente 1000 bar/min durante aproximadamente un minuto para llegar a la presión final deseada de 3000 bar, a continuación la presión de 3000 bar se mantiene durante aproximadamente una hora para relajar la proteína por tercera vez, la presión se aumenta de nuevo a 1000 bar/min durante aproximadamente un minuto para llegar a la presión final deseada de 4000 bar. Para llegar a la presión objetivo de 4000 bar, la presión también se puede aumentar a aproximadamente 1.000 bar/min durante aproximadamente treinta segundos, con una zona invariable de 1 hora de duración cada 500 bar, y la presión objetivo de 4000 bar puede alcanzarse después de 7 horas.
[0046] La suspensión de cuerpos de inclusión se puede tratar bajo la alta presión durante de aproximadamente 10 horas a aproximadamente 100 horas, de aproximadamente 20 horas a aproximadamente 100 horas. El tratamiento a alta presión es, preferentemente, durante más de 24 horas, por ejemplo, durante de aproximadamente 25 horas a aproximadamente 100 horas, de aproximadamente 25 horas a aproximadamente 80 horas, de aproximadamente 25 horas a aproximadamente 60 horas, de aproximadamente 25 horas a aproximadamente 50 horas, de aproximadamente 25 horas, de aproximadamente 26 horas, de aproximadamente 27 horas, de aproximadamente 28 horas, de aproximadamente 29 horas, de aproximadamente 30 horas, aproximadamente 31 horas, de aproximadamente 32 horas, de aproximadamente 33 horas, de aproximadamente 34 horas, de aproximadamente 35 horas, aproximadamente 36 horas, de aproximadamente 37 horas, de aproximadamente 38 horas, aproximadamente 39 horas, aproximadamente 40 horas, de aproximadamente 41 horas, de aproximadamente 42 horas, aproximadamente 43 horas, aproximadamente 44 horas, de aproximadamente 45 horas, de aproximadamente 46 horas, de aproximadamente 47 horas, de aproximadamente 48 horas, de aproximadamente 49 horas, de aproximadamente 50 horas.
[0047] En otra realización, la presente invención proporciona un procedimiento para producir una proteína soluble expresada en procariotas o eucariotas que comprende las etapas de (i) preparar cuerpos de inclusión en un tampón que no contiene o contiene una baja concentración de urea para formar una suspensión de cuerpos de inclusión en el que la concentración de urea es de 0 M a 3M; (ii) someter la suspensión de cuerpos de inclusión a un incremento escalonado de la presión durante un período de tiempo; (iii) mantener una presión elevada aplicada a los cuerpos de inclusión durante un período de tiempo; y (iv) recuperar la proteína mediante despresurización.
[0048] La despresurización se puede realizar a la velocidad de aproximadamente 83 bar/hr - 200 bar/hr.
[0049] Los procariotas contemplados en la presente invención pueden incluir Avibacterium, Brucella, Escherichia coli, Haemophilus (por ejemplo, Haemophilus suis), Salmonella (por ejemplo, Salmonella Enteridis, Salmonella typhimurium, Salmonella infantis), Shigella, Pasteurella, y Rimeirella.
[0050] En los sistemas procariotas, pueden seleccionarse un conjunto de vectores de expresión. Tales vectores incluyen, pero no se limitan a, los vectores de de clonación y expresión de E. coli multifuncionales, tales como PBLUESCRIPT (Stratagene); vectores pIN (Van Heeke & Schuster, J. Biol Chern 264: 5503-5509 (1989)); y similares; vectores PGEX (Promega, Madison, Wis.); en los sistemas eucariotas, las líneas celulares pueden ser de levadura (tal como Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris), células de baculovirus, células de mamífero, células de plantas. Los vectores de expresión de los sistemas eucariotas incluyen, pero no se limitan a, vectores pVR1020 o pVT1012 (Vical Inc., San Diego, CA), vector PichiaPink (Invitrogen, CA, e E.UU.), vector pFasBac TOPO (Invitrogen).
[0051] El procedimiento para producir una proteína soluble expresada en procariotas o eucariotas proporcionada en la presente invención puede usarse para solubilizar cualquier proteína. Las proteínas pueden incluir anticuerpos y la insulina.
[0052] La presente descripción proporciona una composición o vacuna que comprende la proteína quimérica KSAC mencionada anteriormente y un portador, excipiente, vehículo o adyuvante farmacéutica o veterinariamente aceptable.
[0053] Los portadores o adyuvante o vehículos o excipientes aceptables farmacéutica o veterinariamente son bien conocidos por los expertos en la técnica. El portador o adyuvante o vehículo o excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables que pueden ser utilizados para los procedimientos de esta descripción incluyen, pero no se limitan a, solución al 0,9% de NaCl (por ejemplo, solución salina) o un tampón de fosfato, poli-(L-glutamato) o polivinilpirrolidona. El portador o vehículo o excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables pueden ser cualquier compuesto o combinación de compuestos que facilitan la administración del vector (o proteína expresada a partir de un vector de la invención in vitro), o facilitan la transfección o infección y/o mejoran la conservación del vector (o proteína). Las dosis y volúmenes de dosis en el presente documento descritas en la descripción general también pueden ser determinadas por el experto en la materia a partir de esta descripción en relación con el conocimiento en la técnica, sin gran experimentación.
[0054] Opcionalmente pueden añadirse otros compuestos como portadores o adyuvantes o vehículos o excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables, incluyendo, pero no limitados a, alumbre; Oligonucleótidos CpG (ODN), en particular ODN 2006, 2007, 2059, o 2135 (Pontarollo RA et al, Vet Immunol Immunopath, 2002, 84: 43-59; Wernette CM et al, Vet Immunol Immunopath, 2002, 84: 223-236; Mutwiri G. et al, Vet Immunol Immunopath, 2003, 91: 89-103); poliA-poliU, bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDA) ("Vaccine Design, The subunit and Adjuvant Approach”, editado por Michael F. Powell y Mark J. Newman, Pharmaceutical Biotechnology, 6: p. 03, p. 157); N, N-dioctadecil-N',N'-bis(2-hidroxietil)propandiamina (tal como AVRIDINE®) (Ibid, p 148.); carbómero, quitosano (véase la Patente de Estados Unidos N° 5.980.912, por ejemplo).
[0055] Las composiciones farmacéuticas y vacunas según la descripción pueden comprender o consistir esencialmente en uno o más adyuvantes. Los adyuvantes adecuados son (1) polímeros de ácido acrílico o metacrílico, anhídrido maleico y polímeros de derivados de alquenilo, (2) secuencias inmunoestimulantes (ISS), tales como secuencias de oligodesoxirribonucleótidos que tienen una o más unidades de CpG no metiladas (Klinman et al., 1996; WO98/16247), (3) una emulsión de aceite en agua, tal como la emulsión SPT descrita en la pág 147 de "Vaccine Design, The subunit and Adjuvant Approach", publicado por M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, y la emulsión MF59 descrita en la pág. 183 del mismo trabajo, (4) lípidos catiónicos que contienen una sal de amonio cuaternario, por ejemplo, DDA (5) citocinas, (6) hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio, (7) saponina u (8) otros adyuvantes descritos en cualquier documento citado en la presente solicitud, o (9) cualquier combinación o mezclas de los mismos.
[0056] Se puede preparar una solución de adyuvante, especialmente de carbómero (Pharmeuropa, vol. 8, N° 2, junio de 1996) en agua destilada, de manera ventajosa en presencia de cloruro de sodio, teniendo la solución obtenida un pH ácido. Esta solución madre se diluye mediante su adición a la cantidad deseada (para obtener la concentración final deseada), o una parte sustancial de la misma, de agua cargada con NaCl, ventajosamente solución salina fisiológica (NaCl 9 g/l) a la vez en varias porciones con neutralización concomitante o subsiguiente (pH 7,3 a 7,4), ventajosamente con NaOH. Esta solución a pH fisiológico se utiliza para la mezcla con la vacuna, que puede almacenarse especialmente en forma liofilizada, líquida o congelada. La concentración de polímero en la composición de vacuna final puede ser de 0,01% al 2% p/v, de 0,06 al 1% p/v, o de 0,1 al 0,6% p/v.
[0057] La vacuna de subunidades (proteína) se puede combinar con adyuvantes, como emulsiones de aceite-en­ agua, agua-en-aceite-en-agua a base de aceite mineral y/o aceite vegetal y tensioactivos no iónicos, tales como copolímeros de bloque, TWEEN®, SPAN®. Dichas emulsiones son en particular las descritas en la página 147 de "Vaccine Design - The subunit and Adjuvant Approach", Pharmaceutical Biotechnology, 1995, o emulsiones TS, en particular la emulsión TS6, y emulsiones LF, especialmente emulsión LF2 (para emulsiones TS y LF, véase el documento WO 04/024027). Otros adyuvantes adecuados son, por ejemplo vitamina E, saponinas, y CARBOPOL® (Noveon; véanse los documentos WO 99/51269; WO 99/44633), hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio ("Vaccine Design, The Subunit and adjuvant approach", Pharmaceutical Biotechnology, vol. 6, 1995), adyuvantes biológicos (es decir, C4b, especialmente C4b murino (Ogata R T et al.) o C4b equino, GM-CSF, en particular GM-CSF equino (US 6645740)), toxinas (es decir, toxinas del cólera CTA o CTB, toxinas termolábiles de Escherichia coli LTA o Lt B (Olsen CW et al.; Fingerut E et al.; Zurbriggen R et al. Peppoloni S et al.), y CpG (es decir CpG # 2395 (ver Jurk M et al.), CpG # 2142 (ver SEQ ID NO: 890 en el documento EP 1221955)).
[0058] Otro aspecto de la descripción se refiere a un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica en un animal frente a uno o más antígenos o una respuesta protectora en un animal frente a uno o más patógenos, procedimiento que comprende inocular al animal al menos una vez con la vacuna o la composición farmacéutica de la presente descripción. Sin embargo, otro aspecto de la descripción se refiere a un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica en un animal para uno o más antígenos o una respuesta protectora en un animal frente a uno o más patógenos de Leishmania en un régimen de administración de sensibilización-refuerzo, que se compone de al menos una administración primaria y al menos una administración de refuerzo usando al menos un polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno común. La composición inmunológica o vacuna utilizada en la administración primaria puede ser la misma, pueden ser de naturaleza diferente de las utilizadas como refuerzo. La administración de sensibilización puede comprender una o más administraciones. Del mismo modo, la administración de refuerzo puede comprender una o más administraciones. Las administraciones de sensibilización-refuerzo pueden llevarse a cabo con 2 a 6 semanas de diferencia, por ejemplo, con aproximadamente 3 semanas de diferencia. También se contempla un refuerzo semianual o un refuerzo anual de forma ventajosa utilizando la vacuna de subunidades (proteína).
[0059] La administración de sensibilización-refuerzo puede incluir la vacuna o composición de subunidades que comprende la proteína quimérica KSAC mencionada anteriormente. La administración de sensibilización-refuerzo también puede incluir vectores virales y vectores plasmídicos recombinantes que expresan antígenos de Leishmania (ver, por ejemplo, US2009/0324649). En un aspecto del régimen de sensibilización-refuerzo, la composición o vacuna que comprende la proteína KSAC se administra seguido por la administración de la vacuna o la composición que comprende un vector viral recombinante que contiene y expresa cualquier antígeno de Leishmania, o una vacuna o composición de ADN plasmídico que contiene y expresa cualquier antígeno de Leishmania, o una vacuna viral o composición inactivada que comprende los antígenos de Leishmania.
[0060] Por lo general, una administración de la vacuna se lleva a cabo a las 10 a 15 semanas de edad por vía subcutánea o intramuscular. Una segunda o tercera administración puede realizarse dentro de las 2-6 semanas de la primera administración. Los animales tienen preferiblemente al menos 4 semanas de edad en el momento de la primera administración.
[0061] Se puede utilizar una variedad de rutas de administración, además de por vía subcutánea o por vía intramuscular, tal como por vía intradérmica o transdérmica.
[0062] La composición o vacuna de acuerdo con la descripción comprenden o consisten esencialmente en o consisten en una cantidad eficaz para provocar una respuesta terapéutica de uno o más polipéptidos, tal como se describe en el presente documento; y puede determinarse una cantidad eficaz a partir de esta descripción y el conocimiento en la técnica, sin gran experimentación.
[0063] Para la composición o vacuna que comprende la proteína KSAC expresada de la presente descripción, una dosis puede incluir, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 2000 mg, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 1000 mg, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 100 mg, de aproximadamente 20 mg a aproximadamente 1000 mg, de aproximadamente 30 mg a aproximadamente 500 mg, o de aproximadamente 50 mg a aproximadamente 500 mg. Los volúmenes de dosis pueden estar entre aproximadamente 0,1 ml y aproximadamente 10 ml, o entre aproximadamente 0,2 ml y aproximadamente 5 ml.
[0064] La invención se describirá ahora adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitativos.
EJEMPLOS
[0065] La construcción de insertos de ADN, plásmidos y vectores virales o vegetales recombinantes se llevó a cabo utilizando las técnicas estándar de biología molecular descritas por J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989).
Ejemplo 1 Solubilización de la proteína KSAC expresada en cuerpos de inclusión de E. coli
[0066] Los cuerpos de inclusión con KSAC producidos a partir de E. coli se prepararon en los siguientes tres tampones: 1) Tris 20 mM, ditio treitol (DTT) 50 mM, pH 8; 2) Tris 20 mM, diitio treitol (DTT) 50 mM, pH 8, urea 1 M; 3) Tris 20 mM, ditio treitol (DTT) 50 mM, pH 8, urea 2 M. Los cuerpos de inclusión con KSAC preparados en los mismos tampones a temperatura ambiente sin presión durante toda la duración del tratamiento se utilizaron como controles.
[0067] La Figura 3 muestra las etapas de los niveles de presión para la relajación de proteínas durante el aumento de la presión (incremento escalonado de la presión). La presurización a una presión objetivo se aplicó durante 48 horas, a continuación, se despresurizaron las muestras durante 24 horas.
[0068] La Figura 4 muestra la comparación esquemática entre la solubilización a alta presión y el plegamiento de proteínas recombinantes a partir de cuerpos de inclusión y la solubilización clásica y el plegamiento de proteínas recombinantes a partir de cuerpos de inclusión.
[0069] La Figura 5 muestra la gráfica esquemática del replegamiento de KSAC. La Figura 6 muestra el patrón de SDS-PAGE típico de la proteína KSAC después de solubilizar la proteína KSAC en urea 7 M, DTT 20 mM y replegarse mediante cromatografía de exclusión. La Figura 7 muestra la representación de HPLC típica de la proteína KSAC. El cromatograma de HPLC identifica el trímero de la proteína KSAC por su masa. Se estimaron la concentración de proteínas y la pureza relativa frente al contenido total de proteína. La Figura 8 muestra la dispersión dinámica de luz (DLS) de proteína KSAC replegada usando cromatografía de exclusión. La figura 8A muestra la distribución en número que indica que la mayoría de la población tiene un tamaño de 12 a 18 nm. La figura 8B muestra el intervalo exhaustivo de tamaños detectado que no está vinculado a la población relativa. Se detectaron objetos entre 10 y 800 nm.
[0070] El análisis por transferencia Qdot (Figura 9) y SDS-PAGE (Figura 10) de los cuerpos de inclusión presurizados a 3000 bares y las muestras de control mostraron que todas las proteínas están en la fase de sobrenadante de la muestra tratada en los tres tampones, lo que indica que las proteínas están solubilizadas.
[0071] La superposición de los cromatogramas de HPLC del sobrenadante de los controles (Figura 11 panel superior) y todas las muestras tratadas con 3000 bar (Figura 11 panel inferior) mostró que ninguna proteína se detecta en los controles, mientras que la proteína KSAC y todas las otras proteínas presentes en los cuerpos de inclusión se detectan después de tratamiento a presión, lo que significa que todas las proteínas se solubilizan después del tratamiento a presión.
[0072] La Figura 12 es el cromatograma de HPLC superpuesto del sobrenadante de las muestras de KSAC tratadas con 3000 bar de presión y la proteína KSAC obtenida con el procedimiento de replegamiento clásico. Los resultados muestran que los picos son similares, de manera que la proteína soluble obtenida mediante tratamiento a alta presión se organiza en trímero.
[0073] La Tabla 1 a continuación muestra la cuantificación de proteína KSAC después de un tratamiento con 3000 bar mediante transferencia Qdot y HPLC.
Tabla 1
Figure imgf000012_0001
[0074] La cantidad de proteína solubilizada fue de aproximadamente 800 mg/ml. Esto estaba muy cerca de la cantidad estimada de proteína KSAC inicial como cuerpos de inclusión (1000 mg/ml). El rendimiento de solubilización es muy alto (75-100%).
[0075] La Figura 13 muestra la superposición de los datos de DLS obtenidos con la proteína presurizado a 3000 bar (línea más clara) en el tampón sin urea y la proteína obtenida con el procedimiento de replegamiento clásico (línea más oscura). El intervalo exhaustivo de tamaños (panel superior) muestra que se detectan menos objetos de mayor tamaño en muestras presurizadas. La distribución en número (panel inferior) muestra que la mayoría de la población replegada por presión tiene un tamaño similar con respecto a la población replegada por el procedimiento clásico y el plegado parece muy similar.
[0076] La Figura 14 muestra que los tamaños de proteína obtenidos a 3000 bar son idénticos a los tamaños de proteínas obtenidos a partir de replegamiento con cromatografía clásica para los tres tampones utilizados (en el círculo). Cuando se trataron a 2000 bar, los tamaños de proteína son idénticos a los tamaños de proteínas de replegamiento por cromatografía clásica cuando se utiliza urea en el tampón. A una presión más alta que 3000 bar, aparecen agregados a alta presión cuando no se utiliza urea. Con urea presente en el tampón, la proteína parece deshacerse (10 nm de tamaño), lo que indica que se ha producido la desnaturalización.
[0077] La Figura 15 muestra el cromatograma de HPLC de muestras tratadas con 4000 bar. Los resultados muestran que las proteínas con tamaños más grandes que la proteína KSAC aparecieron cuando la urea no estaba presente en el tampón, o solamente se añadió urea 1 M en el tampón. El tamaño de proteína fue como se esperaba cuando se añadó 2 M en el tampón.
[0078] La Figura 16 muestra la distribución de tamaño de DLS en número de las muestras tratadas con 5.000 bar sin urea. Los resultados indican que se detectaron tres poblaciones de proteínas con grandes tamaños de hasta 90 nm. La población cuyo tamaño es similar a KSAC replegada por cromatografía es una minoría.
[0079] La Figura 17 muestra la comparación del contenido de proteína soluble KSAC determinado mediante HPLC y transferencia Qdot. Los resultados indican que las concentraciones máximas de proteínas solubilizadas se obtienen con muestras tratadas con 3000 bar con una buena consistencia entre las tecnologías de HPLC y transferencia Qdot. Para las muestras tratadas con 2000 bar, la presencia de urea ayuda a aumentar el rendimiento de solubilización. Para las muestras tratadas con 4000 bar, HPLC proporciona un rendimiento más alto que transferencia Qdot, lo que indica una pérdida de reconocimiento de los antígenos.
Ejemplo 2 Vacunación de perros utilizando la vacuna de KSAC
[0080] En este estudio, cuarenta y nueve perros Beagle de 15 semanas de edad fueron vacunados de acuerdo con el siguiente protocolo.
Tabla 2
Figure imgf000012_0002
Figure imgf000013_0001
[0081] Después de la vacunación (en D77), los perros fueron trasladados al sur de Italia, en una zona altamente endémica de leishmaniasis canina para pruebas de hasta 15 meses (M15). El estudio después de la vacuna incluyó la evaluación de la temperatura rectal, la condición general (véase la Tabla 3), dolor a la palpación (presencia/ausencia), calor cutáneo (presencia/ausencia), picazón (presencia/ausencia) e hinchazón. Las hinchazones se calificaron de la siguiente manera; 0 = sin hinchazón, 1 = hinchazón leve (sólo detectable), 2 = hinchazón, pero < 2 cm, 3 = hinchazón > 2 cm.
[0082] El estudio después de la vacuna mostró que no se detectó un signo importante (dolor persistente, picazón importante) durante el período de observación.
Tabla 3 Los signos clínicos evaluados durante el estudio de la Leishmaniasis canina y el cálculo de la puntuación líni n r l
Figure imgf000013_0002
[0083] Para cada categoría, sólo se consideró la puntuación más alta en el cálculo de la puntuación clínica general (OCS). Las puntuaciones de las siete categorías se suman para determinar el OCS.
[0084] Los datos de OCS indicaron que no se detectó ninguna anormalidad importante de la OCS antes de M15.
[0085] Los patrones de infección se clasificaron en 4 categorías (Oliva et al 2006, J Clin Microbiol de 44: 1318-1322) y se reagruparon en infecciones no establecidas (alias no activas) y las infecciones activas en función de si el análisis basado en el cultivo era positivo o negativo.
Tabla 4 Terminología usada para la clasificación de los perros de acuerdo a sus signos parasitológicos, serológicos y clínicos
Figure imgf000014_0001
[0086] Se realizaron los ensayos parasitológicos y serológicos para evaluar el estado de los perros, tal como se define por Oliva et al (2006). Se realizaron PCR anidada en médula ósea, cultivo en nódulos linfáticos aspirados según Gradoni et al (2005, Vaccine, 23: 5.245-5.251). Se realizó la prueba de títulos en suero IFAT (prueba de anticuerpos inmunofluorescentes) de acuerdo con una técnica derivada de OIE (2004, Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals, quinta edición OIE, París). Se realizaron PCR cuantitativa y LDA (ensayo de dilución limitante) en aspirado de bazo utilizando procedimientos derivados de Bretagne et al (2001, Clin Diagn Lab Immunol 8: 828-831) y Hill et al. (1983, Infect Immun 39: 1087-1094), respectivamente.
Tabla 5 Resultados del cultivo en aspirados de nódulos linfáticos y LDA realizados en muestras recogidas en M8,
M12 y M15 que indican infecciones activas
Figure imgf000014_0002
Tabla 6 Resultados de ensayos serológicos (IFAT) y parasitológicos (nPCR es aspirados de médula ósea y PCR cuantitativa en aspirados de bazos) realizados en muestras recogidas en M8, M12 y M15
Figure imgf000014_0003
[0087] Además de las pruebas realizadas en la Tabla 6, los títulos de IFAT también se midieron en las muestras recogidas en M0 (tiempo correspondiente al pico de la respuesta de anticuerpos inducida por la vacuna) en perros vacunados y de control, y todas las muestras dieron negativo.
Tabla 7 Repartición de los perros de acuerdo con las clases definidas en la Tabla 4
Figure imgf000015_0001
[0088] Los resultados indicaron una alta proporción de perros con infecciones activas entre los perros de control (a M15, 40%, 10/25) y una menor proporción de perros con infecciones activas entre los perros vacunados (a M15, 12,5%, 3/24).
[0089] El estudio muestra que después de 15 meses en el área endémica, se observó una reducción de la proporción de perros con infección activa de Leishmania en perros vacunados frente a los perros de control (es decir, eficacia de la vacuna). La eficacia de la vacuna se evaluó en un 69%. Estos resultados son consistentes con un control significativo de la infección por parásitos en perros vacunados.
[0090] El resultado también demostró que la vacunación con la vacuna de subunidades de KSAC no interfiere con la prueba de serología IFAT. Esto apoya la posibilidad de vacunar en las zonas endémicas sin interferir con los estudios de epidemiología en curso y la evaluación clínica de los perros.
Ejemplo 3 Comparación de diferentes procedimientos de solubilización de la proteína KSAC
[0091] El objetivo del estudio es comparar la eficacia de la solubilización de la proteína a partir de los cuerpos de inclusiones mediante diferentes procedimientos.
[0092] Los cuerpos de inclusión de KSAC producidos a partir de E. coli se prepararon en los siguientes tampones para formar una suspensión de cuerpos: a) tampón Tris 20 mM, ditiotreitol (DTT) 50 mM, pH = 8,0; b) tampón Tris de 20 mM, pH = 8,0.
[0093] Las suspensiones de cuerpos de inclusión se almacenaron en tubos Quick Seal para los tratamientos a alta presión, tal como se describe a continuación.
[0094] En el procedimiento A, se aplicó una presurización escalonada a las suspensiones de cuerpos de inclusión aumentando la presión de 0 bar a 3.000 bar a 1.000 bar/min, con una zona invariable de 1 hora de duración cada 500 bar (presión objetivo de 3000 bar alcanzada después de 5 h). La presión de 3000 bar se mantuvo durante 48 horas. Las muestras se despresurizaron a continuación desde 3000 bar a 0 bar a una velocidad constante de 125 bar/h durante 24 horas.
[0095] En el procedimiento B, las suspensiones de cuerpos inclusiones fueron tratadas de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento US 6.489.450. Las muestras se sometieron a presurización a una velocidad constante de hasta 2500 bar en 1 hora. La presión de 2500 bar se mantuvo durante 6 horas. La despresurización se realizó a una velocidad constante durante 1 h reduciendo la presión de 2500 bar a 0 bar.
[0096] Las muestras se prepararon tal como se muestra en la Tabla 8 a continuación.
Tabla 8 Tratamiento de suspensiones de cuerpos de inclusión
Figure imgf000015_0002
Control*: sin tratamiento a alta presión, almacenada a temperatura ambiente
Análisis mediante SDS-PAGE
[0097] Después de los tratamientos a alta presión, las muestras se centrifugaron para separar el sobrenadante y los residuos, y se procesaron para el análisis de proteínas en SDS-PAGE. El análisis de SDS-PAGE se muestra en las Figuras 18A y 18B. Cada pocillo se cargó con 5 ml de muestra (crudo), 5 ml de sobrenadante, 5 ml de sedimento resuspendidos en tampón Tris.
[0098] Las cantidades de proteínas KSAC calculadas a partir de la intensidad de la banda en la SDS-PAGE se presentan en la Tabla 9 a continuación.
Tabla 9 Integración comparativa de las intensidades de las bandas medidas en geles de SDS
Figure imgf000016_0001
[0099] Los resultados muestran que no existe una cantidad significativa de KSAC detectada en el sobrenadante de los controles o las muestras tratadas con los procedimientos A y B cuando se usó tampón que no contenía DTT. Se encontró proteína KSAC soluble en el sobrenadante de las muestras tratadas con alta presión (ambos procedimientos A y B) cuando se usó con tampón que contenía TDT. Sorprendentemente, los resultados de la cuantificación de proteínas a partir de SAS-PAGE también indican que el procedimiento A proporcionó una mejor solubilización en comparación con el procedimiento B. Este sorprendente resultado se confirmó además por el cálculo más preciso del rendimiento de solubilización para cada procedimiento a alta presión usando transferencia Q-Dot y HPLC.
Transferencia Q-Dot
[0100] Los sobrenadantes de las muestras se analizaron mediante transferencia Q-Dot para estimar la cantidad de proteína KSAC solubilizada mediante los tratamientos. Los resultados se muestran en las Figuras 19A-19D y en la Tabla 10.
Tabla 10 Concentraciones de KSAC solubilizada hallada en los sobrenadantes para los controles y las muestras procesadas a alta presión
Figure imgf000016_0002
[0101] No se observó ninguna diferencia significativa entre las muestras de control (sin tratamiento de alta presión) con y sin DTT. No se halló KSAC soluble en el sobrenadante. El resultado de la transferencia Q-Dot confirmó el resultado de SDS-PAGE.
[0102] El tratamiento realizado usando el procedimiento A con DTT permitió la solubilización y el replegamiento de la proteína KSAC (detectada mediante transferencia Q-Dot). Se encontró que la concentración de proteína KSAC soluble fue de 632 mg/ml usando el procedimiento A, mientras que la concentración de proteína KSAC obtenida utilizando el procedimiento B fue de aproximadamente 369 g/ml. Los rendimientos de solubilización obtenidos son del 63% para el procedimiento A y del 37% para el procedimiento B. Los resultados de la transferencia Q-Dot demuestran además que el procedimiento A es más eficiente en la producción de proteínas solubles y replegadas.
Análisis mediante HPLC
[0103] La Figura 20 muestra la superposición de los cromatogramas de HPLC del sobrenadante del control y la muestra tratada con el procedimiento A. El tiempo de retención, el volumen de retención y la pureza estimada obtenida para la muestra tratada con el procedimiento A se muestran en la Tabla 11 a continuación.
Tabla 11 Tiempo de retención, volumen de retención y pureza estimada obtenida para la muestra tratada mediante el procedimiento A
Figure imgf000017_0001
[0104] La Figura 21 muestra la superposición de los cromatogramas de HPLC del sobrenadante de la muestra tratada con el procedimiento A y la muestra tratada con el procedimiento B. El tiempo de retención, volumen de retención y la pureza estimada obtenidas para la muestra tratada con el procedimiento A se muestran en la Tabla 12 a continuación.
Tabla 12 Tiempo de retención, volumen de retención y pureza estimada obtenida para las muestras tratadas mediante el procedimiento A y el procedimiento B
Figure imgf000017_0002
[0105] La Figura 22 muestra la superposición de los cromatogramas de HPLC del sobrenadante de la muestra tratada con el procedimiento A, la muestra tratada con el procedimiento B y la muestra tratada con el procedimiento clásico (desnaturalización y replegamiento obtenidos mediante tratamiento con urea y DTT). El tiempo de retención, el volumen de retención y la pureza estimada obtenidos para la muestra tratada con el procedimiento A se muestran en la Tabla 13 a continuación.
Tabla 13 Tiempo de retención, volumen de retención y pureza estimada obtenida para las muestras tratadas mediante el procedimiento A, el procedimiento B y el procedimiento clásico
Figure imgf000017_0003
[0106] Los resultados de HPLC confirmaron adicionalmente que el procedimiento A proporcionó una mejor solubilización de la proteína KSAC que el procedimiento B a juzgar por las áreas de los picos (25251 mAU para el procedimiento A vs 10506 mAU para el procedimiento B). Tanto el procedimiento A como el B permiten la obtención de un replegamiento de la proteína KSAC muy cerca de la obtenida mediante el procedimiento clásico (solubilización utilizando tratamiento con urea DTT y replegamiento mediante cromatografía SEC).
[0107] Los ensayos realizados con los procedimientos A y B no produjeron una proteína KSAC soluble significativa en ausencia de DTT. Los resultados confirmaron que se necesita un agente reductor durante el tratamiento a alta presión para romper los enlaces disulfuro. Sin embargo, el sorprendente descubrimiento inesperado es que no hay necesidad de eliminación de DTT con el fin de obtener un replegamiento correcto de la proteína. Contrariamente al

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento para producir una proteína soluble expresada en procariotas o eucariotas que comprende las etapas de:
(i) preparar cuerpos de inclusión en un tampón que no comprende o comprende una baja concentración de urea para formar una suspensión de cuerpos de inclusión, en el que la concentración de urea es de 0 M a 3 M;
(ii) someter la suspensión de cuerpos de inclusión a un incremento escalonado de la presión durante un período de tiempo; y
(iii) mantener una presión elevada aplicada a los cuerpos de inclusión durante un período de tiempo, preferiblemente en el que la alta presión está en el intervalo de aproximadamente 2000 bar a aproximadamente 5000 bar.
2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que el tampón comprende, además, DTT, preferiblemente en el que la concentración de DTT es de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM.
3. Procedimiento, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que en la etapa (ii) se aumenta la presión a aproximadamente 1000 bar/min durante aproximadamente 30 segundos con la relajación intermedia de la proteína durante aproximadamente una hora cada 500 bar.
4. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que en la etapa (iii) la alta presión es de aproximadamente 3000 bar.
5. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que en la etapa (iii) el período de tiempo es de aproximadamente 20 horas a aproximadamente 100 horas.
6. Procedimiento, según la reivindicación 5, en el que el período de tiempo es de aproximadamente 48 horas.
7. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el procedimiento comprende además la etapa de despresurización, preferiblemente en el que la despresurización es a la velocidad de aproximadamente 83 bar/h - 125 bar/h.
8. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la proteína soluble es una proteína de fusión que consiste en antígenos de Leishmania proteína de membrana de kinetoplástidos 11 (KMP11), esterol metiltransferasa (SMT), A2 y cisteína proteinasa (CP).
ES13760212T 2012-08-30 2013-08-30 Expresión de una proteína quimérica KSAC y procedimiento de producción de proteínas solubles a alta presión Active ES2744709T3 (es)

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