JP2020152644A - Vnarのリフォールディング方法およびvnarの製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
前記製造工程は、前記本発明のVNARのリフォールディング方法により実施される。
本発明のVNARのリフォールディング方法は、前述のように、サメ由来一本鎖抗体(VNAR)を含む封入体について、液体存在下で加圧することにより、VNARをリフォールディングさせるリフォールディング工程を含む。本発明のリフォールディング方法は、VNARを含む封入体について、液体存在下で加圧することにより、VNARをリフォールディングさせることが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。
本発明のリフォールディングされたVNARの製造方法は、前述のように、サメ由来一本鎖抗体(VNAR)を含む封入体からリフォールディングされたVNARを製造する製造工程を含み、前記製造工程は、前記本発明のVNARのリフォールディング方法により実施される。本発明の製造方法は、前記製造工程が、前記本発明のVNARのリフォールディング方法により実施されることが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の製造方法によれば、収率よくVNARを製造できる。本発明の製造方法は、前記本発明のリフォールディング方法の説明を援用できる。
本発明のサメ由来一本鎖抗体(VNAR)は、前記本発明のリフォールディングされたVNARの製造方法により得られる。本発明のVNARは、前記本発明のリフォールディングされたVNARの製造方法により得られることが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明のVNARは、例えば、抗体と同様に使用できる。本発明のVNARは、前記本発明のリフォールディング方法および製造方法の説明を援用できる。
本発明のリフォールディング方法により、サメ由来一本鎖抗体(VNAR)をリフォールディングできることを確認した。
サメ(エイラクブカ)に、蛍光タンパク質(Venus)を免疫後、サメの血液を回収し、RT-PCRによりIgNAR可変領域のcDNAを得た。増幅した可変領域をファージミドベクターと連結し、VNAR提示ファージライブラリーを構築した。Venusをコートした試験管を用いて4ラウンドのバイオパンニングを実施後、複数のコロニーをシークエンス解析により解読し、配列の異なる3種類の抗Venus VNAR(clone 11、clone 25、clone 39)を獲得した。VNAR clone 11および clone 39をコードする塩基配列を、検出用のタグ配列(-GS linker-AGIA-His)とともにpET−30a(+)ベクターにクローニングした。下記配列番号1〜4において、タグ配列およびそれをコードする塩基配列は下線で示している。そして、前記ベクターを、ヒートショック法により、大腸菌(BL21(DE3))に導入し、各VNARを発現する形質転換体を得た。
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MAAHVDQTPRMATKETGESLTINCVLRDTSCGLYATSWFRKNPGSTDWERITIGGRYVESVNKGSNSFSLQIKDLTVEDSVTFYCKARDARTPGSVGCSYRDRGYHDGAGTVLTVNSGLTPPVISLFSETDELRANGFTSAGSGSGSGSGSGSEEAAGIARPLHHHHHH
5'-ATGGCTGCACATGTCGATCAAACACCACGAATGGCAACTAAAGAAACAGGCGAATCTCTGACAATCAACTGCGTCCTAAGGGATACTAGCTGTGGCTTGTACGCAACAAGCTGGTTTCGGAAAAATCCTGGTTCAACAGATTGGGAACGCATCACCATTGGCGGCCGATATGTTGAATCAGTCAACAAGGGAAGCAACTCGTTTTCTCTGCAAATCAAGGACCTAACAGTTGAAGACAGTGTCACATTTTACTGCAAAGCTCGAGATGCCCGTACCCCGGGCAGTGTGGGATGCAGCTACAGGGATCGGGGCTACCATGATGGGGCTGGCACCGTGCTGACTGTGAATTCTGGACTGACTCCCCCAGTCATCAGTCTCTTCTCTGAAACTGATGAGTTGAGAGCAAACGGGTTCACTAGTGCAGGGTCCGGTTCTGGGTCTGGATCTGGCTCGGGCTCTGAAGAAGCAGCTGGTATTGCTCGCCCATTGCATCACCATCACCATCACTAG-3'
前記形質転換体は、まず、LB培地において、37℃で5時間、OD600=約0.6(菌濃度≒8×108cells/mL)となるまで培養した。つぎに、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド(IPTG)を終濃度0.5mmol/Lとなるように添加し、さらに、25℃で16時間培養した。得られた培養液を、4,000rpm、10分間、4℃で遠心分離し、集菌した。
前記培養菌体1Lに対し、75mLのLysis buffer(20mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 300 mmol/L NaCl, protease inhibitor cocktail)を添加し、ソニケーションにより破砕した。破砕した菌体液を、40,000g、30分間、4℃で遠心分離し、沈殿した不溶性画分(封入体)を回収した。
回収した前記封入体を、前記封入体1gあたり10mLのWash buffer A(20 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 50 mmol/L NaCl, 0.5 mM EDTA, 125 mmol/L NDSB-201, 5% glycerol)で懸濁し、10,000g、30分間、4℃で遠心分離し、沈殿した封入体を回収した。回収した前記封入体を、前記封入体1gあたり10mLのWash buffer B(20 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 50 mmol/L NaCl, 0.5 mmol/L EDTA, 5% glycerol)で懸濁し、10,000g、30分間、4℃で遠心分離し、沈殿した封入体を回収した。そして、回収した前記封入体を、前記封入体1gあたり10mLのMilliQ水に懸濁し、10,000g、30分間、4℃で遠心分離し、沈殿した封入体を回収し、洗浄封入体を得た。前記洗浄した封入体の一部をMilliQ水に懸濁し、BSAを標準タンパク質として、BCAアッセイ(Thermo Fisher Scientific社製)にて、タンパク質の濃度を測定した。その後、前記タンパク質濃度が、5mg/mLとなるようにMilliQ水で希釈し、封入体のサンプルを得た。
前記封入体のサンプルは、0.5mmol/Lのアルギニン添加群(+Arg)およびアルギニン非添加群(−Arg)に分けた。そして、前記封入体のサンプルを、前記タンパク質の終濃度が0.5mg/mLとなるように、pHを6、7、8、または9とした緩衝液にに懸濁した。pH6.0の緩衝液としては、50mmol/L MES、pH7.0の緩衝液としては、50mmol/L HEPES、pH8.0の緩衝液としては、50mmol/L Tris−HCl、pH9.0の緩衝液としては、50mmol/L CHESを用いた。各条件の封入体溶液を、密閉容器(Quick-Seal Centrifuge Tubes、BECKMAN COULTER社製)に封入後、加圧し、さらに、室温(約25℃、以下、同様。)、200MPa、16時間で維持した。そして、5分ごとに25MPaを減圧する段階的な減圧により、常圧(大気圧)まで減圧した。処理後の各溶液を、40,000g、30分間、4℃で遠心分離し、上清を回収した。以下、VNAR clone 11(tag)を含む封入体由来のサンプルをclone 11(tag)、VNAR clone 39(tag)を含む封入体由来のサンプルをclone 39(tag)という。各条件のclone 11(tag)およびclone 39(tag)を、SDS−PAGEに供し、バンドパターンを確認した。これらの結果を図1に示す。
リフォールディングしたVNARの結合性を確認した。
参考文献1:Yano, T., Takeda, H., Uematsu, A., Yamanaka, S., Nomura, S., Nemoto, K., et al. (2016). AGIA Tag System Based on a High Affinity Rabbit Monoclonal Antibody against Human Dopamine Receptor D1 for Protein Analysis. PLoS ONE, 11(6), e0156716.
本発明のリフォールディング方法により、リフォールディングの効率が改善し、VNARの収率が改善されることを確認し、またリフォールディング後の抗Venus VNARがVenusと結合することを確認した。
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タグを含むVNAR clone 11を含む封入体およびVNAR clone 39を含む封入体に代えて、タグを含まないVNAR clone 11を含む封入体、VNAR clone 25を含む封入体、VNAR clone 39を含む封入体を用いた以外は、前記実施例1(5)と同様にして、加圧処理後、上清を回収したサンプルであるclone 11、clone 25およびclone 39を得た。得られたclone 11、clone 25およびclone 39のタンパク質濃度を、前記実施例1(4)と同様にして測定し、大腸菌培養液1Lあたりの収量を算出した。その結果、大腸菌培養液1Lあたりの収量は、clone 11が116mg、clone 25が108mg、clone 39が210mgであった。一般的に、変性剤を用いてリフォールディングした場合の大腸菌培養液1Lあたりの収量は、最大で100mg程度である。このため、本発明のリフォールディング方法によれば、より高い収率でVNARを回収できることがわかった。
clone 11、clone 25およびclone 39を発現する大腸菌について、ソニケーション直後の可溶性画分(S)と、遠心後の不溶性画分(沈殿物、P)と、加圧処理および遠心後の可溶性画分(R)をSDS−PAGEに供し、バンドパターンを確認した。これらの結果を図3に示す。
各サンプルの可溶性画分(R)に対し、同モル量のVenusを添加し、Venus−VNAR複合体を形成した。前記各複合体を、下記条件のゲルろ過クロマトグラフィーに供し、ピーク画分(図4左側のグラフにおける、破線で示した部分)を回収した。
サンプル:Venus−VNAR複合体(20 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0)
使用機器:M150システム(Barofold社製)
カラム:Superdex 75 HR(24 mL, GE Healthcare)
移動相:20mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 150 mmol/L NaCl
流速:0.5 mL/min
送液条件:1.2 CV
検出器:AKTA purifier(検出波長:280nm)
280nmの吸光における各ピーク画分(第14〜23画分)について、SDS−PAGEを行った。結果を図4に示す。
異なる液体を用いた場合においても、本発明のリフォールディング方法により、VNARをリフォールディングできることを確認した。
使用機器:AKTA purifier(GE Healthcare社製)
カラム: Resource Q(6 mL, GE Healthcare)
移動相:
移動相A:20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)
移動相B:20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0), 1 mol/L NaCl
流速:6 mL/min
検出器:AKTA purifier(検出波長:280nmおよび260nm)
送液条件:
送液開始後、4カラム体積(CV)まで、移動相A 100%とし、その後、20CVの間に、移動相Aを100%から0%へ、移動相Bを0%から100%へ連続的に変化させた。その後、2CVの間、移動相B 100%とし、さらに、1CVの間、移動相A 100%とした。
上記の実施形態および実施例の一部または全部は、以下の付記のように記載されうるが、以下には限られない。
(付記1)
サメ由来一本鎖抗体(VNAR)を含む封入体について、液体存在下で加圧することにより、VNARをリフォールディングさせるリフォールディング工程を含む、VNARのリフォールディング方法。
(付記2)
前記リフォールディング工程では、前記加圧後、圧力を維持し、
前記圧力の維持時間は、0分〜50時間である、付記1記載のリフォールディング方法。
(付記3)
前記リフォールディング工程では、前記加圧、圧力の維持、および減圧を実施し、
前記減圧において、連続的に減圧する、付記1または2記載のリフォールディング方法。
(付記4)
前記リフォールディング工程の時間は、10分〜52時間である、付記1から3のいずれかに記載のリフォールディング方法。
(付記5)
前記加圧後の圧力は、10〜500MPaである、付記1から4のいずれかに記載のリフォールディング方法。
(付記6)
大腸菌にVNARを発現させる発現工程と、
VNAR発現大腸菌からVNARを含む封入体を回収する回収工程とを含む、付記1から5のいずれかに記載のリフォールディング方法。
(付記7)
前記回収工程は、
前記VNAR発現大腸菌を破砕し、破砕液を調製する破砕工程と、
前記破砕液を遠心し、前記封入体を含む沈殿物を回収する沈殿物回収工程とを含む、付記6記載のリフォールディング方法。
(付記8)
前記沈殿物に、液体を積層し、封入体調製液を調製する調製工程を含み、
前記リフォールディング工程では、前記封入体調製液について、加圧することにより、VNARをリフォールディングさせる、付記7記載のリフォールディング方法。
(付記9)
前記沈殿物を洗浄する洗浄工程を含む、付記7または8記載のリフォールディング方法。
(付記10)
前記液体は、水である、付記1から9のいずれか一項に記載のリフォールディング方法。
(付記11)
前記リフォールディング工程を、圧力容器内で実施する、付記1から10のいずれかに記載のリフォールディング方法。
(付記12)
前記圧力容器の容積は、5L未満である、付記11記載のリフォールディング方法。
(付記13)
サメ由来一本鎖抗体(VNAR)を含む封入体からリフォールディングされたVNARを製造する製造工程を含み、
前記製造工程は、付記1から12のいずれかに記載のVNARのリフォールディング方法により実施される、VNARの製造方法。
(付記14)
付記13に記載のサメ由来一本鎖抗体(VNAR)の製造方法で得られる、VNAR。
Claims (13)
- サメ由来一本鎖抗体(VNAR)を含む封入体について、液体存在下で加圧することにより、VNARをリフォールディングさせるリフォールディング工程を含む、VNARのリフォールディング方法。
- 前記リフォールディング工程では、前記加圧後、圧力を維持し、
前記圧力の維持時間は、0分〜50時間である、請求項1記載のリフォールディング方法。 - 前記リフォールディング工程では、前記加圧、圧力の維持、および減圧を実施し、
前記減圧において、連続的に減圧する、請求項1または2記載のリフォールディング方法。 - 前記リフォールディング工程の時間は、10分〜52時間である、請求項1から3のいずれか一項に記載のリフォールディング方法。
- 前記加圧後の圧力は、10〜500MPaである、請求項1から4のいずれか一項に記載のリフォールディング方法。
- 大腸菌にVNARを発現させる発現工程と、
VNAR発現大腸菌からVNARを含む封入体を回収する回収工程とを含む、請求項1から5のいずれか一項に記載のリフォールディング方法。 - 前記回収工程は、
前記VNAR発現大腸菌を破砕し、破砕液を調製する破砕工程と、
前記破砕液を遠心し、前記封入体を含む沈殿物を回収する沈殿物回収工程とを含む、請求項6記載のリフォールディング方法。 - 前記沈殿物に、液体を積層し、封入体調製液を調製する調製工程を含み、
前記リフォールディング工程では、前記封入体調製液について、加圧することにより、VNARをリフォールディングさせる、請求項7記載のリフォールディング方法。 - 前記沈殿物を洗浄する洗浄工程を含む、請求項7または8記載のリフォールディング方法。
- 前記液体は、水である、請求項1から9のいずれか一項に記載のリフォールディング方法。
- 前記リフォールディング工程を、圧力容器内で実施する、請求項1から10のいずれか一項に記載のリフォールディング方法。
- 前記圧力容器の容積は、5L未満である、請求項11記載のリフォールディング方法。
- サメ由来一本鎖抗体(VNAR)を含む封入体からリフォールディングされたVNARを製造する製造工程を含み、
前記製造工程は、請求項1から12のいずれか一項に記載のVNARのリフォールディング方法により実施される、VNARの製造方法。
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