WO2023229029A1 - ヘテロダイマータンパク質の製造方法、ダイマータンパク質、モノマータンパク質、および標的反応性のヘテロダイマータンパク質のスクリーニング方法 - Google Patents

ヘテロダイマータンパク質の製造方法、ダイマータンパク質、モノマータンパク質、および標的反応性のヘテロダイマータンパク質のスクリーニング方法 Download PDF

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intein
tag
dimer
binding
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幸樹 真壁
猛 中西
竜太郎 浅野
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国立大学法人山形大学
公立大学法人大阪
国立大学法人東京農工大学
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a heterodimeric protein, a dimeric protein, a monomeric protein, and a method for screening target-reactive heterodimeric proteins.
  • one antibody molecule has antigen-binding domains that exhibit binding properties to different antigens, and by changing the target antigen, it can be used for various medical applications such as anticancer drugs and hemophilia treatment drugs. Development is underway.
  • bispecific antibodies have problems in that their production efficiency is extremely low and their production is difficult.
  • a bispecific antibody is composed of two types of heavy chains (H chains) and two types of light chains (L chains).
  • H chains heavy chains
  • L chains light chains
  • nine types of unnecessary antibodies are produced (Patent Document 1).
  • knob-into-holes have been developed in which mutations are introduced into the amino acid sequence of the Fc region of the antibody so that two different heavy chains specifically associate with each other.
  • the present invention aims to provide a method for producing a heterodimeric protein such as a bispecific antibody, which can also produce a heterodimeric protein composed only of domains composed of natural amino acid sequences. do.
  • the production method of the present invention is a method for producing a heterodimeric protein, comprising: A manufacturing step of producing a heterodimeric protein by reacting a dimeric protein containing a reaction tag with a modified protein that modifies the dimeric protein,
  • the dimeric protein containing the reactive tag includes a first monomeric protein and a second monomeric protein, the first monomeric protein comprises, in order, a first reactive tag and a first dimer-forming domain capable of forming a dimer;
  • the first reaction tag includes a binding tag and a first C intein;
  • the second monomeric protein comprises, in this order, a second reactive tag and a second dimer-forming domain capable of forming a dimer with the first dimer-forming domain;
  • the second reactive tag comprises a binding partner capable of binding to the binding tag and a second C intein;
  • the modified protein includes a first modified protein and a second modified protein,
  • the first modified protein includes a first N intein capable
  • the protein of the present invention includes a dimeric protein containing a reactive tag
  • the dimeric protein containing the reactive tag includes a first monomeric protein and a second monomeric protein
  • the first monomeric protein includes a first reactive tag and a first dimer-forming domain capable of forming a dimer
  • the first reactive tag includes a binding tag and a first C intein capable of reacting with a first N intein
  • the second monomeric protein comprises, in this order, a second reactive tag and a second dimer-forming domain capable of forming a dimer with the first dimer-forming domain
  • the second reactive tag comprises a binding partner capable of binding to the binding tag and a second C intein capable of reacting with a second N intein
  • the first monomer protein and the second monomer protein form a dimer.
  • the protein of the present invention includes a first monomer protein, the first monomeric protein comprises, in order, a first reactive tag and a first dimer-forming domain capable of forming a dimer;
  • the first reactive tag includes a binding tag capable of binding a binding partner and a first C intein capable of reacting with a first N intein;
  • the first monomer protein is capable of forming a dimer with a second monomer protein,
  • the second monomeric protein includes a second reactive tag and a second dimer-forming domain capable of forming a dimer with the first dimer-forming domain,
  • the second reactive tag includes a binding partner capable of binding the binding tag and a second C intein capable of reacting with a second N intein.
  • the protein of the present invention includes a second monomer protein, the second monomeric protein comprises, in this order, a second reactive tag and a second dimer-forming domain capable of forming a dimer; the second reactive tag comprises a binding partner capable of binding the binding tag and a second C intein capable of reacting with a second N intein;
  • the second monomer protein is capable of forming a dimer with the first monomer protein, the first monomeric protein comprises, in this order, a first reactive tag and a first dimer-forming domain capable of forming a dimer with the second dimer-forming domain;
  • the first reactive tag includes a binding tag capable of binding the binding partner and a first C intein capable of reacting with the first N intein.
  • the nucleic acid of the present invention encodes the dimeric protein of the present invention, the first monomer protein of the present invention, and/or the second monomer protein of the present invention.
  • the expression vector of the present invention contains the nucleic acid of the present invention.
  • the method for screening target-reactive heterodimeric proteins of the present invention involves reacting a dimeric protein containing a reaction tag with a modified protein that modifies the dimeric protein to obtain a target-reactive heterodimeric protein.
  • a manufacturing process for manufacturing a detection step of contacting the candidate heterodimeric protein with a target and detecting a reaction between the candidate heterodimeric protein and the target; a selection step of selecting the candidate heterodimeric protein for which the reaction has been detected as a candidate substance that reacts with the target;
  • the manufacturing process is carried out by the manufacturing method of the present invention.
  • heterodimeric proteins such as bispecific antibodies that are composed only of domains composed of natural amino acid sequences can also be produced.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of the components of a dimeric protein used in the production method of the present invention and each step of producing a heterodimeric protein.
  • FIG. 2 is a photograph showing each antibody fragment and the protein before and after PTS reaction in Example 1.
  • FIG. 3 is a photograph showing the protein after PTS reaction and column purification in Example 1.
  • FIG. 4 is a graph showing the protein elution pattern by gel filtration chromatography in Example 1.
  • FIG. 5 is a graph showing the binding of bispecific antibodies to CD3-positive cells by flow cytometry in Example 1.
  • FIG. 6 is a graph showing the binding of bispecific antibodies to HER2-positive cells by flow cytometry in Example 1.
  • FIG. 7 is a graph showing the maintenance of binding of the bispecific antibody to HER2 by surface plasmon resonance method in Example 1.
  • protein refers to a polymer of peptides composed of unmodified amino acids (natural amino acids), modified amino acids, and/or artificial amino acids. Examples of the shape of the polymer include linear, branched, and cyclic. Said protein can also be referred to as a peptide or a polypeptide.
  • monomeric protein refers to a protein that is not bound to or associated with other proteins.
  • dimeric protein refers to a protein complex in which two proteins or protein subunits are bound or associated. When the two proteins are the same protein or subunit, the dimeric protein can also be called a homodimeric protein. Furthermore, when the two proteins are different proteins or subunits, the dimeric protein can also be called a heterodimeric protein.
  • fusion protein refers to a protein in which part or all of two or more different proteins or heterologous proteins are bound (linked) via a peptide bond.
  • the fusion protein may be a natural fusion protein or an artificial fusion protein. Examples of the artificial fusion proteins include proteins designed by genetic engineering techniques.
  • binding tag refers to a polypeptide or substance that has specific binding properties with other molecules.
  • binding partner refers to a polypeptide or substance that has specific binding properties with the binding tag.
  • domain refers to a three-dimensionally or functionally organized region in a “protein,” “polypeptide,” and/or “peptide.”
  • antibody refers to a protein comprising one or more polypeptides that is substantially or partially encoded by an immunoglobulin gene or a fragment of an immunoglobulin gene.
  • Immunoglobulin genes include, for example, genes encoding constant regions such as ⁇ , ⁇ , ⁇ (including ⁇ 1 and ⁇ 2), ⁇ (including ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ 3, and ⁇ 4), ⁇ , ⁇ , and ⁇ , and the V region. , D region, J region, and other genes that can encode numerous immunoglobulin variable regions.
  • the antibody includes, for example, a heavy chain and a light chain.
  • the light chains include ⁇ and ⁇ , which constitute ⁇ and ⁇ chains, respectively.
  • the heavy chains include ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ , or ⁇ , and constitute the immunoglobulin classes IgG, IgM, IgA, IgD, and IgE, respectively.
  • the antibody may be a typical immunoglobulin (antibody) structural unit composed of a tetramer.
  • the antibody is composed of two identical pairs of polypeptide chains, each pair consisting of one light chain (approximately 25 kDa) and one heavy chain (approximately 50-70 kDa).
  • the N-terminus of each chain also defines a variable region comprised of about 100-110 or more amino acids primarily involved in antigen recognition.
  • antigen-binding fragment refers to a part or portion of a polypeptide that includes an antigen-binding site of an antibody.
  • the antigen-binding fragment can be obtained by chemically or enzymatically treating the antibody. Said antigen-binding fragments can also be obtained by recombinant means. Examples of the antigen-binding fragments include Fab, Fab', F(ab') 2 , Fc, and/or Fv fragments, and derivatives thereof.
  • heavy chain antibody means an antibody composed of only two heavy chains.
  • the heavy chain antibody can also be referred to as an antibody that does not contain a light chain.
  • multispecific antibody means an antibody or antibody derivative having specificity for two or more antigens and/or two or more epitopes.
  • intein refers to an autocatalytic enzyme that has both protein protease activity and protein ligase activity.
  • the intein is, for example, a protein that excises its own amino acid sequence from the protein by protein splicing and connects the remaining amino acid sequence (extein) with a peptide bond.
  • the "intein” can also be referred to as a protein intron, for example.
  • split-type intein is an intein composed of two complementary half-inteins, C-intein and N-intein, and the C-intein and the N-intein are activated by closely binding. It means intein that forms intein and exhibits enzymatic activity.
  • the split-type intein is also referred to as a separated intein.
  • integrated intein is one intein containing C intein and N intein, and the C intein and the N intein form an active intein by closely binding and exhibit enzyme activity. means the intein indicated.
  • complementary intein means a combination (pair) of an intein or a split-type intein with a C intein and an N intein.
  • C intein refers to an intein polypeptide having homology to the C-terminal portion of intein.
  • the C intein combines with a complementary N intein to form an active intein.
  • N-intein refers to an intein polypeptide having homology to the N-terminal portion of intein.
  • the N-intein combines with a complementary C-intein to form an active intein.
  • salt means an electrolyte that can be ionized in an aqueous solvent.
  • aqueous solvent means a solvent containing water.
  • a "solubilization domain” means that when fused to a peptide, polypeptide, or protein, a transformant is It means a polypeptide that increases (eg, increases or promotes) the expression level of a peptide, polypeptide, or protein expressed in.
  • purification refers to identifying, separating, recovering from components in their natural state, identified and separated, and/or recovered from components in their natural state. means.
  • the “purification” can be carried out, for example, by performing at least one purification step.
  • the purification can also be referred to as isolation.
  • separation means separating a target object from an object containing the target object and/or a separated state. Said separation can also be referred to as release.
  • nucleic acid refers to a polymer of deoxyribonucleotides (DNA), ribonucleotides (RNA), and/or modified nucleotides.
  • DNA deoxyribonucleotides
  • RNA ribonucleotides
  • nucleic acid refers to a polymer of nucleotides that encodes the amino acid sequence of the protein.
  • examples of the nucleic acids include genomic DNA, cDNA, mRNA, and the like.
  • the nucleic acid may be, for example, single-stranded or double-stranded.
  • the nucleic acid can be read interchangeably as a "polynucleotide” or a "nucleic acid molecule.”
  • host refers to a cell and/or individual into which a foreign nucleic acid is introduced.
  • the host can also be called a host cell.
  • vector and “expression vector” refer to a recombinant plasmid or virus containing a nucleic acid that is delivered to a host or host cell in vitro or in vivo .
  • the "vector” and “expression vector” include viral vectors and non-viral vectors.
  • transformant means a host into which a foreign nucleic acid has been introduced.
  • each protein, polypeptide, or peptide is not particularly limited and may be any animal.
  • the animal is, for example, a human or a non-human animal.
  • the non-human animals include mammals such as mice, rats, rabbits, dogs, cats, cows, horses, pigs, monkeys, dolphins, and sea lions.
  • the present invention provides a method for producing a heterodimeric protein such as a bispecific antibody, which can also produce a heterodimeric protein composed only of domains composed of natural amino acid sequences, or Provided is a method capable of producing heterodimeric proteins modified with different adducts.
  • the manufacturing method of the present invention is a method for manufacturing a heterodimeric protein, and includes a manufacturing step of manufacturing a heterodimeric protein by reacting a dimeric protein containing a reaction tag with a modified protein that modifies the dimeric protein,
  • a dimeric protein comprising a reactive tag comprises a first monomeric protein and a second monomeric protein, the first monomeric protein comprising a first reactive tag and a first dimer-forming domain capable of forming a dimer.
  • the first reactive tag comprises a binding tag and a first C-intein
  • the second monomeric protein forms a dimer with the second reactive tag and the first dimer-forming domain.
  • said second reactive tag comprising a binding partner capable of binding to said binding tag and a second C-intein
  • said modified protein comprises a first modified dimerization domain.
  • the first modified protein comprising a first N intein capable of reacting with the first C intein and a first addition added to the first monomer protein.
  • the second modified protein comprises a second N-intein capable of reacting with the second C-intein and a second adduct added to the second monomer protein;
  • the adduct and the second adduct are different adducts, the first monomer protein and the second monomer protein form a dimer, and in the manufacturing process, the first monomer protein
  • the first N intein of the modified protein reacts with the first C intein of the first monomer protein, such that a first adduct of the first modified protein is linked to the first monomer protein.
  • the second N-intein of the second modified protein reacts with the second C-intein of the second monomer protein such that a second adduct of the second modified protein 2 monomeric proteins.
  • the first monomer protein and the second monomer protein are proteins that form a homodimer
  • the first monomer protein linked to the first adduct and the second monomer protein linked to the second adduct are prepared in advance.
  • two monomer proteins are prepared and combined, various combinations of dimers are generated.
  • the first monomer protein is reacted with the first N-intein and the first C-intein while the dimeric protein is being formed. , connecting said first appendage.
  • the second monomer protein is reacted with the second N-intein and the second C-intein while the dimeric protein is being formed. , connecting said second appendage.
  • the production method of the present invention even if the first monomer protein and the second monomer protein are proteins that form a homodimer, the first monomer protein to which the first adduct is linked A heterodimer protein of a protein derived from a monomer protein and a protein derived from a second monomer protein to which the second adduct is linked can be efficiently produced.
  • the present inventors produced a monomer to which different adducts were linked by causing a specific binding reaction for each monomer protein in the dimerized state of two monomer proteins and linking different adducts.
  • the present inventors discovered two types of monomer proteins to which binding tags or binding partners and different inteins were added, and an intein capable of reacting with the different inteins and an adduct to the monomer protein.
  • the inventors have discovered that the above idea can be implemented by using two types of modified proteins linked together, and have established the present invention. Specifically, it is estimated that the production method of the present invention, as shown in FIG. 1, can produce a heterodimeric protein composed of monomer proteins to which different adducts are linked, by the mechanism described below. Note that the present invention is not limited to the mechanism described below.
  • a first monomer protein 1, a second monomer protein 2, a first modified protein 3, and a second modified protein 4 are used.
  • Dimeric proteins can be produced.
  • the first monomer protein 1 includes a first reaction tag 11 and a first dimer-forming domain 12 in this order from the N-terminal side.
  • the first reaction tag 11 includes a binding tag 13 and a first C intein 14 in this order from the N-terminal side.
  • the second monomer protein 2 includes a second reaction tag 21 and a second dimer-forming domain 22 in this order from the N-terminal side.
  • the second reaction tag 21 includes a binding partner 23 and a second C intein 24 in this order from the N-terminal side.
  • the first modified protein 3 includes a first N-intein 31 and a first adduct 32 in this order from the N-terminal side.
  • the second modified protein 4 includes a second N-intein 41 and a second adduct 42 in this order from the N-terminal side.
  • the first monomer protein 1 and the second monomer protein 2 formed a dimer, as shown in FIG. 1(B).
  • dimeric protein 10 is brought into contact with the first modified protein 3 and the second modified protein 4, as shown in FIG. 1(C)
  • the first N intein 31 of the first modified protein 3 is , reacts with the first C intein 14 of the first monomeric protein 1 to form an active intein (arrow X).
  • the second N intein 41 of the second modified protein 4 reacts with the second C intein 24 of the second monomer protein 2 to form an active intein (arrow Y).
  • a heterodimeric protein 30 is produced in which the first dimer-forming domain 12 and the second dimer-forming domain 22 that form a dimer are modified with different adducts 32 and 42. can. Therefore, according to the production method of the present invention, it is presumed that a heterodimeric protein modified with any adduct can be produced.
  • the heterodimeric protein can be produced as a fusion protein in which the monomer proteins constituting the obtained heterodimeric protein are linked via peptide bonds from the N-terminus to the C-terminus, similar to recombinant proteins. Therefore, in the production method of the present invention, the first dimer-forming domain 12, the second dimer-forming domain 22, the first adduct 32, and the second adduct 42 are replaced with the natural amino acid sequence, that is, with amino acid mutations.
  • the first adduct 32 and the second adduct 42 are Fabs that bind different antigens
  • the first dimer-forming domain 12 and the second dimer-forming domain 22 are Fabs that bind to different antigens
  • the first dimer-forming domain 12 and the second dimer-forming domain 22 are A bispecific monoclonal antibody composed of a natural amino acid sequence can be suitably produced by using a protein composed of the CH2 region and the CH3 region of the Fc region.
  • the heterodimeric protein when producing a heterodimeric protein using two types of monomer proteins that have the same amino acid sequence in the dimer-forming domain and different amino acid sequences in other parts, also, the heterodimeric protein can be specifically produced without introducing mutations in the amino acid sequences that would cause specific binding or association between the monomer proteins of interest.
  • the first adduct 32 and the second adduct 42 are modified on the N-terminal side of the first dimer-forming domain 12 and the second dimer-forming domain 22.
  • Adduct 42 may also be modified.
  • the first monomer protein 1 includes a first reaction tag 11 and a first dimer-forming domain 12 in this order from the C-terminal side
  • the first reaction tag 11 includes a binding tag 13 and a first dimer-forming domain 12. 1 N intein 31 in this order from the C-terminal side.
  • the second monomer protein 2 includes a second reaction tag 21 and a second dimer-forming domain 22 in this order from the C-terminal side, and the second reaction tag 21 contains a binding partner 23 and a second N dimer-forming domain 22 .
  • Intein 41 is included in this order from the C-terminal side.
  • the first modified protein 3 includes the first C intein 14 and the first adduct 32 in this order from the C-terminal side.
  • the second modified protein 4 includes a second C intein 24 and a second adduct 42 in this order from the C-terminal side.
  • the production method of the present invention modifies the first adduct 32 and the second adduct 42 on the C-terminal sides of the first dimer-forming domain 12 and the second dimer-forming domain 22.
  • each domain can be read and used as described above.
  • a dimeric protein containing a reaction tag is formed by dimerization of the first monomer protein and the second monomer protein.
  • the first monomer protein and the second monomer protein can be prepared, for example, by genetic engineering techniques, as described in the method for producing a monomer protein of the present invention, which will be described later. Therefore, the production method of the present invention may optionally include, prior to the production step, a formation step of reacting the first monomer protein with the second monomer protein to form a dimer. Further, the production method of the present invention optionally includes, prior to the production step, a preparation step of preparing the first monomer protein and/or the second monomer protein, and the first monomer protein and the second monomer protein.
  • the preparation method in the preparation step may also include a formation step of reacting with a monomer protein to form a dimer.
  • a formation step of reacting with a monomer protein to form a dimer for the preparation method in the preparation step, the description of the method for producing the first monomer protein, second monomer protein, nucleic acid, expression vector, transformant, and monomer protein of the present invention described below can be referred to.
  • the first monomer protein and the second monomer protein are reacted.
  • the first monomer protein and the second monomer protein form a dimer, and a dimeric protein containing the reaction tag can be prepared or prepared.
  • the first monomer protein and the second monomer protein can form a heterodimer via the binding tag and the binding partner. Therefore, the formation step may be performed in parallel with the manufacturing step described below.
  • the reaction in the formation step is preferably carried out in the presence of an aqueous solvent such as a buffer, physiological saline, or water.
  • the first monomer protein and the second monomer protein may be solid or liquid, but liquid is preferable.
  • the first monomer protein and the second monomer protein are mixed in an aqueous solvent such as a buffer, physiological saline, or water.
  • it is dispersed in advance.
  • the first monomer protein and the second monomer protein are liquids
  • the first monomer protein and the second monomer protein can be mixed with an aqueous solvent such as a buffer solution, physiological saline, or water. It may be diluted in advance.
  • it can be carried out by mixing a liquid containing the first monomer protein and a liquid containing the second monomer protein.
  • the monomer protein may be a purified or crudely purified protein, a transformant expressing the first monomer protein and/or the second monomer protein, or a processed product of the transformant.
  • the processed products include lysates, extracts, crushed products, protein preparations, and crude or purified products thereof.
  • the treated product may be, for example, a product that has been subjected to at least one purification treatment.
  • the first monomer protein includes, for example, the first reaction tag and a first dimer-forming domain capable of forming a dimer in this order from the N-terminal side.
  • the first reaction tag includes, for example, the binding tag and the first C intein in this order from the N-terminal side.
  • the second monomer protein includes, for example, a second dimer-forming domain capable of forming a dimer with the second reaction tag and the first dimer-forming domain in this order from the N-terminal side.
  • the second reactive tag includes the binding partner and the second C intein.
  • the first reaction tag is placed on the N-terminal side of the first dimer-forming domain, thereby causing a reaction between the first C intein and the first N intein.
  • the first adduct can be introduced to the N-terminal side of the first dimer-forming domain.
  • the second monomer protein can react with the second C intein and the second N intein by arranging the second reaction tag on the N-terminal side of the second dimer-forming domain. When this occurs, the second adduct can be introduced to the N-terminal side of the second dimer-forming domain.
  • the dimerization of the first monomer protein and the second monomer protein may include, for example, (1) binding of the first reaction tag and the second reaction tag, for example, the dimerization of the first monomer protein and the second monomer protein. (2) by binding of the first dimer-forming domain and the second dimer-forming domain.
  • the reaction tag may be, for example, a domain that contributes to binding with the monomer protein and the modified protein and addition reaction of an adduct to the monomer protein in the first monomer protein and the second monomer protein. can. Further, the reaction tag can also be referred to as a domain that disappears from the monomer protein after the addition reaction, for example.
  • the dimer may be formed by direct binding between the first monomer protein and the second monomer protein, or by indirect binding between the first monomer protein and the second monomer protein. (association), or may be formed by both direct and indirect binding between the first monomer protein and the second monomer protein.
  • the direct bond is a covalent bond, and specific examples thereof include an amide bond (peptide bond) between amino acids, a disulfide bond between cysteines, and the like.
  • the indirect bond is a non-covalent bond, and specific examples thereof include a hydrogen bond, a hydrophobic bond, and the like.
  • the first dimer-forming domain and the second dimer-forming domain can adopt amino acid sequences that can form a dimer condition-dependently or condition-independently when proteins containing each domain coexist.
  • the first dimer-forming domain and the second dimer-forming domain can utilize, for example, the amino acid sequence of each subunit in a protein dimer or a motif sequence that forms a dimer thereof.
  • the first dimer-forming domain and the second dimer-forming domain may utilize the amino acid sequence of each subunit in a protein multimer or a motif sequence that forms a dimer thereof.
  • the protein dimer may be a homodimer or a heterodimer.
  • the protein dimer includes, for example, immunoglobulins (antibodies) such as IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM; myc family proteins such as AP-1 (c-fos and c-jun), myc, max, and mdx1; leucine zipper-containing proteins; G protein-coupled receptors; kinesins; ErbB receptor family such as epidermal growth factor receptor (EGFR), platelet-derived growth factor receptor (PDGFR), neurotrophin receptors , receptor-type tyrosine kinases such as insulin receptor, insulin-like growth factor receptor, vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR), and stem cell factor receptor; Toll-like receptors such as TLR1-11; etc. can be given.
  • immunoglobulins immunoglobulins
  • myc family proteins such as AP-1 (c-fos and c-jun), my
  • the first dimer-forming domain and the second dimer-forming domain are, for example,
  • the amino acid sequence includes the CH2 region and CH3 region of the Fc region of an antibody, or the CH2 region and CH3 region of the Fc region of the antibody and the hinge region.
  • the first dimer-forming domain and the second dimer-forming domain include the Fc region of the antibody
  • the first dimer-forming domain and the second dimer-forming domain include all or all of the Fc region of the antibody. Contains some amino acid sequences.
  • the first dimer-forming domain and the second dimer-forming domain include the CH2 region and CH3 region of the Fc region of the antibody and a hinge region
  • the first dimer-forming domain and the second dimer-forming domain contains the amino acid sequence of all or part of the CH2 region and CH3 region of the Fc region of the antibody, and the amino acid sequence of all or part of the hinge region of the antibody, preferably CH2 region of the Fc region of the antibody. and the entire amino acid sequence of the CH3 region, and the amino acid sequence of all or part of the hinge region of the antibody.
  • the first dimer-forming domain and the second dimer-forming domain include the CH2 region and CH3 region of the Fc region of the antibody and a hinge region
  • the first dimer-forming domain and the second dimer-forming domain includes, for example, a continuous amino acid sequence in the amino acid sequence of the CH2 region and CH3 region of the Fc region of the antibody and the hinge region.
  • the amino acid sequence of the Fc region, or the CH2 region and CH3 region of the Fc region and the hinge region may be a natural amino acid sequence, that is, an amino acid sequence that does not contain mutations, or a non-natural amino acid sequence, that is, a mutation or
  • the amino acid sequence may include an artificial amino acid sequence.
  • the antibody is, for example, IgA, IgD, IgE, IgG, or IgM, and preferably IgG.
  • the IgG is, for example, IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3, or IgG4.
  • the antibody is, for example, an antibody derived from an animal, and specific examples thereof include a human antibody, a mouse antibody, a bird antibody, a rat antibody, a rabbit antibody, and the like.
  • the first dimer-forming domain and the second dimer-forming domain are preferably human-derived antibodies, more preferably human-derived IgG.
  • amino acid sequences of human IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 reference can be made to, for example, the amino acid sequences registered with UniProt accession numbers P01857, P01859, P01860, and P01861, respectively.
  • the antibody may be an antibody with a modified Fc region.
  • the first dimer-forming domain and the second dimer-forming domain include the Fc region of the Fc region variant, or an amino acid sequence comprising the Fc region and hinge region of the Fc region variant. But that's fine.
  • the modified Fc region is, for example, an Fcab (Fc antigen binding, References 1 and 5) in which the amino acid sequence of the Fc region has been modified and is given the ability to bind to a target molecule, or the amino acid sequence of the Fc region of an IgG antibody.
  • IgG hexamer (References 2 to 4), DAF (Dual Action Fab, Reference 5), Charge pair (Amgen, Reference 5), SEEDbody (IgG Hexamer, References 2 to 4), Charge pair (Amgen, Reference 5), Reference 5), Knobs-in-holes (Reference 5), DVI-IgG (Reference 5), etc.
  • Reference 1 G.
  • Reference 3 de Jong RN et al., “A Novel Platform for the Potentiation of Therapeutic Antibodies Based on Antigen-Dependent Formation of IgG Hexamers at the Cell Surface.”, PLoS. Biol. (2016) 14(1): e1002344 .
  • Reference 4 Christoph A. Diebolder et al., “Complement Is Activated by IgG Hexamers Assembled at the Cell Surface”, Science, 343 (6176), pages 1260-1263
  • Reference 5 Christoph Spiess et al., “Alternative molecular formats and therapeutic applications for bispecific antibodies”, Molecular Immunology, Volume 67, Issue 2, Part A, 2015, Pages 95-106
  • the antibody may be a multispecific antibody.
  • the first dimer-forming domain and the second dimer-forming domain are, for example, the Fc region of the multispecific antibody, or the CH2 region and CH3 region and hinge region of the Fc region, and the Fc region. and a domain added to the C-terminus of the amino acid sequence.
  • the multispecific antibodies include, for example, IgG-scFv (Reference 5), IgG(L, H)-scFv (Reference 5), IgG(H)-V (Reference 5), and KIH IgG-scFab (Reference 5).
  • Reference 5 IgG-2scFv (Reference 5), Intrabody (Reference 5), and Tetravalent HHCAb (Reference 5).
  • the binding tag and the binding partner are such that when the protein containing the binding tag and the protein containing the binding partner coexist, the binding tag and the binding partner occur in a condition-dependent or condition-independent manner. It is a molecule.
  • the binding between the binding tag and the binding partner may be a direct binding or an indirect binding.
  • the binding tag and the binding partner may be, for example, a peptide tag and a peptide capable of spontaneously forming a covalent bond, or a modification of another molecule.
  • Peptide tags and peptides whose activity allows the formation of covalent bonds are available.
  • the binding tag and the binding partner are, for example, Streptococcus pyogenes surface protein (SpyCatcher, SEQ ID NO: 1) and a peptide capable of binding to the SpyCatcher.
  • SpyCatcher Streptococcus pyogenes surface protein
  • Examples include a tag (SpyTag, SEQ ID NO: 2) or a variant thereof.
  • Examples of the SpyCatcher and SpyTag variants include SpyCatcher2 and SpyTag2 (Reference 6), SpyCatcher3 and SpyTag3 (Reference 7), SnoopCatcher and SnoopTag (Reference 8), and the like.
  • Reference 6 Anthony H.
  • Keeble et al. “Evolving Accelerated Amidation by SpyTag/SpyCatcher to Analyze Membrane Dynamics”, Angew. Chem. Int. Ed., 2017, 56, pages 16521 - 16525 Reference 7: Anthony H. Keeble et al., “Approaching infinite affinity through engineering of Peptide-protein interaction”, PNAS, 2019, vol. 116, No. 52, pages 26523-26533 Reference 8: Veggiani G, Nakamura T, Brenner MD, Gayet RV, Yan J, Robinson CV, Howarth M. Programmable polyproteams built using twin peptide superglues. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Feb 2;113(5):1202 -7. doi: 10.1073/pnas.1519214113.
  • SpyCatcher Amino acid sequence of Streptococcus pyogenes surface protein (SpyCatcher) (SEQ ID NO: 1) DSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVN Amino acid sequence of SpyTag (SEQ ID NO: 2) AHIVMVDAYKPTK
  • examples of the binding tag and binding partner include K tag and Q tag.
  • the K tag and the Q tag can form a covalent bond by crosslinking the N-terminal lysine residue of the K tag and the N-terminal glutamic acid of the Q tag using, for example, bacterial transglutaminase. .
  • the binding tag and the binding partner can be, for example, an affinity tag and a molecule that binds to the affinity tag.
  • the binding tag and the binding partner are, for example, peptides, polypeptides, or proteins.
  • the binding tags include, for example, His-tag (His ⁇ 6), His-Strep-tag, strep-tag, avidin tag, flag(TM)-tag, HA (hemagglutinin)-tag, T7-tag, V5-peptide- tag, GST (glutathione-S-transferase)-tag, CBP (calmodulin-binding peptide)-tag, MBP (maltose-binding protein)-tag, Myc-tag, and the like.
  • the binding partner is a molecule that exhibits specific binding to a target molecule, such as an antibody or an antigen-binding fragment thereof, or a derivative thereof
  • the binding tag is any molecule that can bind to the molecule that exhibits specific binding. It may also be a peptide consisting of an amino acid sequence.
  • the binding partner can be set as appropriate depending on the type of the binding tag.
  • the binding partner may be an antibody or an antigen-binding fragment thereof that recognizes the binding tag, or a derivative thereof; a nucleic acid molecule such as an aptamer; a sugar chain such as glutathione, calmodulin, or mannose; Examples include metals or ions thereof.
  • the combination of the binding tag and the binding partner may be any combination that allows the binding tag and the binding partner to bind.
  • the binding tag comprises a His-tag
  • the binding partner is, for example, nickel.
  • the binding tag comprises a strep-tag or an avidin tag
  • the binding partner comprises, for example, biotin.
  • the binding tags include epitope tags such as flagTM-tags, HA-tags, T7-tags, V5-peptide-tags, and/or Myc-tags
  • the binding partners may e.g. Examples include antibodies, antigen-binding fragments thereof, and derivatives thereof.
  • the binding tag comprises a GST-tag
  • the binding partner can be, for example, glutathione.
  • the binding tag includes a CBP-tag
  • the binding partner can be, for example, calmodulin.
  • the binding tag comprises an MBP-tag
  • the binding partner can be, for example, mannose.
  • the binding tag and the binding partner may be functional equivalents to the extent that the binding ability between the binding tag and the binding partner is maintained.
  • the binding tag or the binding partner is a peptide, polypeptide, or protein
  • the functional equivalent is, for example, 70% or more, 75% of the reference amino acid sequence of the binding tag or the binding partner. consisting of an amino acid sequence having an identity of 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more, and a corresponding binding tag or bond
  • Examples include polypeptides that have the ability to bind to a partner.
  • the functional equivalent for example, consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted, and/or added to the reference amino acid sequence of the binding tag and the binding partner, and the corresponding binding Includes polypeptides that have the ability to bind tags or binding partners.
  • the one or several pieces are, for example, 1 to 44 pieces, 1 to 33 pieces, 1 to 22 pieces, 1 to 11 pieces, 1 to 8 pieces, 1 to 6 pieces, 1 to 4 pieces, 1 to 3 pieces, 1 Or two or one.
  • the substitution is preferably a conservative substitution, for example.
  • the number of binding tags may be one or more. In the latter case, the number of the binding tags may be one type or multiple types.
  • the binding tag when modifying (adding) a first adduct to the N-terminus of the first monomer protein, the binding tag is placed on the N-terminal side of the first dimer-forming domain. It is preferable that
  • the number of binding partners may be one or more. In the latter case, the number of binding partners may be one or more than one.
  • the binding partner when modifying (adding) a second adduct to the N-terminus of the second monomer protein, the binding partner is located on the N-terminal side of the second dimer-forming domain. It is preferable that The binding partner and the number of binding partners may be the same or different, but are preferably the same.
  • the binding tag and the binding partner are interchangeable, and the combinations in the above description may be used interchangeably.
  • the first C-intein and the first N-intein are condition-dependent when the first monomer protein containing the first C-intein and the first modified protein containing the first N-intein coexist.
  • the second C intein and the second N intein when the second monomer protein containing the second C intein and the second modified protein containing the second N intein coexist, A molecule in which binding of the binding tag and the binding partner occurs in a condition-dependent or condition-independent manner.
  • Inteins that can be used as the first C intein, the first N intein, the second C intein, and the second N intein will be described below.
  • the C-intein and N-intein that constitute the intein may be designed, for example, from an integrated intein, or a split-type intein may be used.
  • Examples of the integrated intein include gp41-1, gp41-8, NrdJ-1, SspGyrB, and Cfa.
  • the split-type intein is, for example, DnaE (catalytic subunit ⁇ , dnaE-n, and dnaE-c of DNA polymerase III derived from cyanobacteria), MCM2 (SEQ ID NO: 3, Hut MCM-2 intein derived from Archaea Halorhabdus utahensis DSM 12940, Uniprot : partial sequence of C7NUH7).
  • MCM2 Amino acid sequence of MCM2 (SEQ ID NO: 3) [CVTGDTLVQAGDGRRRIRELAGETAEAGSIEELPNGRTIRDVDIDVWTMTDDETLTRRPVTAIHEYDAPETLYEVTLSTGEEVTVTPDHPFFIEQASGRVETPAEDLQPGDLVFVPEGSAMATDG][GIAQIDTSSDRLGPAESGL][GDIGLRTIENVESVPDHDYDSVYDLTVEGTHNFLANGMVVHN
  • examples of the MCM2-derived C intein and N intein include the C intein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and the N intein consisting of the amino acid sequence SEQ ID NO: 5 below.
  • gp41-1 derived N intein (SEQ ID NO: 7) SGYCLDLKTQVQTPQGMKEISNIQVGDLVLSNTGYNEVLNVFPKSKKKSYKITLEDGKEIICSEEHLFPTQTGEMNISGGLKEGMCLYVKE
  • the intein may be an intein in which a binding reaction occurs condition-dependently (condition-dependent intein).
  • condition-dependent intein can also be referred to as, for example, an intein in which a binding reaction between the intein and/or the C intein and the N intein occurs under certain conditions.
  • the condition-dependent inteins include, for example, salt concentration-dependent inteins such as MCM2, a combination of HsaPolII and HsaCDC21 derived from Halobacterium salinarum NRC-1 (ATCC 700922) (see Reference 9); temperature-dependent inteins (see Reference 10). etc. can be mentioned.
  • the salt concentration-dependent intein is, for example, an intein in which a binding reaction between the intein and/or the C intein and the N intein occurs when the salt concentration becomes relatively high, that is, the probability that the binding reaction occurs increases.
  • the salt concentration-dependent intein may be an intein that causes a binding reaction when the salt concentration reaches a certain concentration. It is presumed that the binding reaction of the salt concentration-dependent intein occurs in a manner dependent on the ionic strength of the salt. Therefore, the salt used to generate the salt concentration-dependent intein binding reaction is not particularly limited, and any salt can be used.
  • the salts include, for example, chlorides such as sodium chloride, calcium chloride, potassium chloride, and magnesium chloride; sulfates such as sodium sulfate, calcium sulfate, potassium sulfate, and magnesium sulfate; and sodium nitrate, calcium nitrate, potassium nitrate, magnesium nitrate, and the like. Examples include nitrates; carbonates such as sodium carbonate, calcium carbonate, potassium carbonate, and magnesium carbonate; phosphates such as sodium phosphate, calcium phosphate, potassium phosphate, and magnesium phosphate; and the like.
  • the salt concentration-dependent intein is MCM2
  • the salt is preferably sodium chloride.
  • Reference 10 Zeidler, M. et al. “Temperature-sensitive control of protein activity by conditionally splicing inteins.” Nat Biotechnol 22, 871-876 (2004). https://doi.org/10.1038/nbt979
  • the intein may be a functional equivalent to the extent that its protease activity and ligase activity are maintained.
  • the functional equivalent is, for example, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more with respect to the reference amino acid sequence of intein. , 98% or more, or 99% or more of identity, and has protease activity and ligase activity.
  • the functional equivalent is, for example, a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted, and/or added to the standard amino acid sequence of intein, and has protease activity and ligase activity. can be given.
  • the one or several pieces are, for example, 1 to 44 pieces, 1 to 33 pieces, 1 to 22 pieces, 1 to 11 pieces, 1 to 8 pieces, 1 to 6 pieces, 1 to 4 pieces, 1 to 3 pieces, 1 Or two or one.
  • the substitution is preferably a conservative substitution, for example.
  • the number of C inteins in the first monomer protein and the second monomer protein may be one or more, but the first monomer protein and the second monomer protein can be efficiently modified. , preferably one.
  • the first C-intein is preferably placed on the N-terminal side of the first dimer-forming domain.
  • the binding partner is located on the N-terminal side of the second dimer-forming domain. It is preferable that
  • the first C intein and the second C intein are configured to be able to react with the first N intein and the second N intein, respectively, for example.
  • the first modified protein can be configured to be able to modify (modify) the first monomer protein
  • the second modified protein can be configured to be able to modify (modify) the second monomer protein.
  • the first C intein and the second C intein are preferably C inteins derived from different inteins.
  • the first C intein and the second C intein contain different C inteins.
  • the first C intein and the first N intein are derived from the same intein, for example.
  • the second C intein and the second N intein are derived from the same intein, for example.
  • the order of the first reaction tag and the first dimer-forming domain can be set, for example, depending on the position of addition of the first adduct in the first modified protein.
  • the first reaction tag and the first dimer-forming domain are added to the N-terminal side of the first dimer-forming domain. They are arranged in this order.
  • the first dimer-forming domain and the first reaction tag are N They are arranged in this order starting from the end.
  • the order of the binding tag and the first C-intein can be set, for example, depending on the position of the first adduct in the first modified protein.
  • the binding tag and the first C-intein are arranged in this order from the N-terminal side.
  • the order of the binding partner and the second C intein can be set, for example, depending on the position of attachment of the second adduct in the second modified protein.
  • the binding partner and the second C-intein are arranged in this order from the N-terminal side.
  • the order of the binding tag, the first C-intein, and the first dimer-forming domain may depend, for example, on the attachment position of the first adduct in the first modified protein. Can be set. When the first adduct is added to the N-terminal side of the first dimer-forming domain, the binding tag, the first C intein, and the first dimer-forming domain are added in this order from the N-terminal side. It will be placed in Further, in the second monomer protein, the order of the binding partner, the second C intein, and the second dimer-forming domain may be, for example, at the attachment position of the second adduct in the second modified protein. You can set it accordingly. When the second adduct is added to the N-terminal side of the second dimer-forming domain, the binding partner, the second C intein, and the second dimer-forming domain are arranged in this order from the N-terminal side. It will be placed in
  • the binding tag, the first C intein, and the first dimer-forming domain are each directly or indirectly bound (linked).
  • the first C intein and the first dimer-forming domain are directly linked. It is preferable that
  • the binding partner, the second C intein, and the second dimer-forming domain are each directly or indirectly bound (linked).
  • the second C intein and the second dimer-forming domain are directly linked. It is preferable that
  • the direct bond means that the N-terminal or C-terminal amino acid of one polypeptide or domain is bonded to the C-terminal or N-terminal amino acid of another polypeptide or domain by forming a peptide bond.
  • the indirect bond is a bond between the N-terminal or C-terminal amino acid of one polypeptide or domain and the C-terminal or N-terminal amino acid of another polypeptide or domain via a linker peptide (peptide linker).
  • the N-terminal or C-terminal amino acid of a polypeptide or domain is linked to the C-terminal or N-terminal amino acid of said linker peptide by forming a peptide bond, and said linker peptide It means that the amino acid at the other end is bonded to the amino acid at the N-terminus or C-terminus of another polypeptide or domain.
  • the length of the linker peptide is, for example, 5 to 15 amino acids.
  • a known linker peptide can be used as the linker peptide, and specific examples include a GS linker (GS, GGS, or GGGGS (SEQ ID NO: 10)), a linker peptide in which a GS linker is repeated ([GS] l , [GGS] m , or [GGGGS] n (l, m, and n are each an integer of 2 or more)), GGGSGG (SEQ ID NO: 11), and the like.
  • GS linker GS, GGS, or GGGGS (SEQ ID NO: 10)
  • a linker peptide in which a GS linker is repeated [GS] l , [GGS] m , or [GGGGS] n (l, m, and n are each an integer of 2 or more)
  • GGGSGG SEQ ID NO: 11
  • the dimeric protein when the heterodimeric protein is a multispecific antibody, is, for example, a CH2 region and a CH3 region of the Fc region of the immunoglobulin (antibody), or a portion of the hinge region of the immunoglobulin. and the CH2 region and CH3 region of the Fc region of the immunoglobulin.
  • the first dimer-forming domain of the first monomer protein and the second dimer-forming domain of the second monomer protein are, for example, the CH2 region and CH3 region of the Fc region of the immunoglobulin (antibody),
  • the amino acid sequence includes part or all of the hinge region of the immunoglobulin and the CH2 region and CH3 region of the Fc region of the immunoglobulin.
  • the immunoglobulin is, for example, a human antibody, preferably human IgG.
  • the first monomer protein may include other polypeptides such as a solubilization domain and a signal peptide, for example, on the N-terminal side of the first reaction tag.
  • the second monomer protein may include other polypeptides such as a solubilization domain and a signal peptide, for example, on the N-terminal side of the second reaction tag.
  • the solubilization domain When the solubilization domain is fused with the polypeptide or protein, the first monomer protein or The expression level of the second monomer protein is at least 10% or more, 15% or more, 20% or more, 25% or more, 30% or more, 35% or more, 40% or more, 45% or more, 50% or more, 55% or more , 60% or more, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, or 100% or more.
  • the solubilization domain include a protein or a partial polypeptide thereof. Specific examples of the solubilization domain include GST, MBP, thioredoxin, antibodies, antibody variants such as single chain antibodies, and the like.
  • the number of solubilization domains in the first monomer protein may be one or more. In the latter case, there may be one type of solubilization domain or multiple types of solubilization domains.
  • the number of solubilization domains in the second monomer protein may be one or more. In the latter case, there may be one type of solubilization domain or multiple types of solubilization domains.
  • the first monomer protein and the second monomer protein may include, for example, a purification tag used to purify the first monomer protein, the second monomer protein, or the heterodimer protein.
  • a purification tag used to purify the first monomer protein, the second monomer protein, or the heterodimer protein.
  • the purification tag for example, the affinity tag described above can be used.
  • the purification tag can be added, for example, to at least one of the N-terminus (side) and C-terminus (side) of the first dimer-forming domain and the second dimer-forming domain.
  • the reaction conditions in the formation step may be any conditions as long as the first monomer protein and the second monomer protein can form a dimer, and the reaction conditions (binding conditions) for the binding tag and the binding partner, and/or Alternatively, it can be appropriately set in consideration of the reaction conditions (binding conditions) of the first dimer-forming domain and the second dimer-forming domain.
  • the reaction temperature in the formation step is, for example, 4 to 50°C or 10 to 45°C.
  • the reaction time in the formation step is, for example, 0.1 to 24 hours or 0.5 to 12 hours.
  • the reaction pH in the formation step is, for example, pH 4 to 10 or pH 5 to 9.
  • the reaction conditions of the formation step can be set to a reaction condition that allows sufficient formation of the bond between the binding tag and the binding partner.
  • the binding tag and the binding partner are the SpyTag and the SpyCatcher
  • the forming step can be performed, for example, at pH 5-8, 4-37° C., and in the presence of a buffer.
  • the reaction conditions for the formation step can be set, for example, based on the activity conditions of the enzyme used in the enzymatic reaction.
  • the reaction conditions of the forming step are such that the bond between the first dimer-forming domain and the second dimer-forming domain is
  • the reaction conditions can be set to ensure sufficient formation.
  • the formation step can be set to, for example, reaction conditions such that the disulfide bond is not reduced.
  • the reaction conditions in the formation step are, for example, such that the first monomer protein and the second monomer protein form a disulfide between the hinge regions of the immunoglobulin.
  • the condition may be such that it can be formed.
  • the manufacturing step can also be said to be a step of adding, for example, a polypeptide or protein derived from the modified protein to the dimeric protein to produce the heterodimeric protein.
  • the first N intein of the first modified protein reacts with the first C intein of the first monomer protein
  • the first N intein of the first modified protein reacts with the first C intein of the first monomer protein.
  • first linking step is linked to the N-terminal side of the first dimer-forming domain of the first monomer protein, more specifically, the first dimer-forming domain of the first monomer protein (hereinafter referred to as "first linking step") ).
  • second N intein of the second modified protein reacts with the second C intein of the second monomer protein, resulting in a second addition of the second modified protein. is linked to the N-terminal side of the first dimer-forming domain of the second monomer protein, more specifically, the first monomer protein (hereinafter also referred to as "second linking step”).
  • the dimeric protein is combined with a protein containing the first adduct and the first dimer-forming domain in this order, and a protein containing the second adduct and the second dimer-forming domain. In this order, it can be converted into a heterodimer protein composed of the containing protein.
  • the reaction in the manufacturing process is preferably carried out in the presence of an aqueous solvent such as a buffer, physiological saline, or water.
  • the dimeric protein, the first modified protein, and the second modified protein may be solid or liquid, but liquid is preferable.
  • the dimeric protein, the first modified protein, and the second modified protein are solids such as powders
  • the dimeric protein, the first modified protein, and the second modified protein are Preferably, it is previously dispersed in an aqueous solvent such as saline or water.
  • the dimeric protein, the first modified protein, and the second modified protein are liquids
  • the dimeric protein, the first modified protein, and the second modified protein can be mixed with a buffer solution, physiological saline, etc.
  • reaction it may be diluted in advance with water or an aqueous solvent such as water.
  • aqueous solvent such as water.
  • it can be carried out by mixing a liquid containing the dimeric protein, a liquid containing the first modified protein, and/or a liquid containing the second modified protein.
  • the first connecting step and the second connecting step may be performed partially or completely simultaneously, or may be performed separately.
  • the order of the first connection step and the second connection step is not particularly limited, and the order of the first connection step and the second connection step is not particularly limited.
  • the second connection step may be performed later, or the first connection step may be performed after the second connection step is performed.
  • the first modified protein includes a first adduct added to the first monomer protein and a first N intein capable of reacting with the first C intein.
  • the first modified protein includes, for example, the first adduct and the first N-intein in this order from the N-terminal side.
  • the second modified protein includes a second adduct added to the second monomer protein and a second N intein capable of reacting with the second C intein.
  • the second modified protein includes, for example, the second adduct and the second N-intein in this order from the N-terminal side.
  • the first modified protein is configured to link the first adduct to the first N-intein so that when a reaction occurs between the first N-intein and the first C-intein, the first modified protein The first adduct can be introduced to the N-terminal side of the first dimer-forming domain.
  • a fusion protein containing the first dimer-forming domain and the first adduct can be produced.
  • the second modified protein is configured to link the second adduct to the second N-intein, so that when a reaction between the second N-intein and the second C-intein occurs, , the second adduct can be introduced to the N-terminal side of the second dimer-forming domain.
  • a fusion protein containing the second dimer-forming domain and the second adduct can be produced.
  • the first N-intein and the second N-intein are configured to be able to react with the first C-intein and the second C-intein, respectively, for example.
  • the first modified protein can be configured to be able to modify (modify) the first monomer protein
  • the second modified protein can be configured to be able to modify (modify) the second monomer protein.
  • the first N-intein and the second N-intein are preferably N-inteins derived from different inteins.
  • the first N-intein and the second N-intein contain different N-inteins.
  • the first C intein and the first N intein are derived from the same intein, for example.
  • the second C intein and the second N intein are derived from the same intein, for example.
  • the first adduct and the second adduct mean something added to the dimeric protein.
  • the adduct can also be referred to as a modification, for example.
  • the first adduct and the second adduct include one or more desired peptides, polypeptides, or proteins, and the desired peptide, polypeptide, or protein may be modified. good.
  • the first adduct and the second adduct are different adducts.
  • the first adduct and the second adduct are different adducts, so that one dimer-forming domain and the other dimer-forming domain constituting the dimeric protein, Different adducts can be added, thereby producing heterodimeric proteins.
  • adducts that can be used as the first adduct and the second adduct will be described together.
  • adduct examples include antibody variants, heavy chain antibodies (VHH), receptors, cytokines, chemokines, toxins, enzymes, fluorescent proteins, and proteins such as collagen binding domains; peptides such as insulin; and the like.
  • the antibody variant is a protein containing an antigen-binding fragment of the antibody, or a polypeptide in which the antigen-binding fragments are linked with a linker peptide.
  • the antibody variants include Fab, Fab', F(ab') 2 , single chain antibody (scFv), tandem scFv, BiTE, Diabody, DART, TandAb, scDiabody, heavy chain antibody (VHH), and variable of the VHH. Examples include domains.
  • the antibody variant may be a protein in which an antigen-binding fragment of another antibody is linked to an antigen-binding fragment of the antibody, or a protein containing a polypeptide in which the antigen-binding fragment is linked with a linker peptide.
  • the antibody variant is, for example, DVD-IgG (Reference 5), scFv-(H)IgG (Reference 5), IgG(L)-scFv (Reference 5), scFv-(L)IgG (Reference 5), V(H)-IgG (Reference 5), IgG(L)-V (Reference 5), V(L)-IgG (Reference 5), 2scFv-IgG (Reference 5) , scFv4-Ig (Reference 5), Zybody (Reference 5), scDiabody-CH3 (Reference 5), Diabody-CH3 (Reference 5), scDiabody-Fc (Reference 5), Diabody-Fc (Reference 5) etc., it can be configured as a protein containing a part or all of the domain on the N-terminal side of the Fc region.
  • the target antigen in the antibody variant or the heavy chain antibody is not particularly limited, and can be any antigen.
  • the target antigen include tumor antigens, viral antigens, bacterial antigens, parasite antigens, antigens related to autoimmune diseases, sugar chain antigens, and surface antigens of immune cells such as lymphocytes.
  • the surface antigen examples include CD (cluster of differentiation) antigen.
  • the surface antigen may be an antigen that activates immune cells expressing the surface antigen when an antibody variant or a heavy chain antibody binds to the surface antigen, or an antigen whose activation is suppressed.
  • the immune cells include T cells, NK cells, NKT cells, B cells, and macrophages.
  • the antigen that activates the T cells include CD2, CD3, CD4, CD5, CD8 ⁇ , CD8 ⁇ , CD27, CD28, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD154, GITR, ICOS, etc. , preferably CD3.
  • Examples of the CD3 include CD3 ⁇ , CD3 ⁇ , CD3 ⁇ , CD3 ⁇ , etc., and preferably CD3 ⁇ .
  • Examples of the antigen whose activation of T cells is suppressed include CTLA4, PD-1, LAG3, B7-H3, TIM3, and TIGIT.
  • Examples of the antigens that activate the NK cells include CD94/NKG2C, CD94/NKG2E, and NKG2D/NKG2D.
  • Examples of the antigen whose activation of NK cells is suppressed include KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR2DL4, KIR2DL5, KIR3DL3, and the like.
  • Examples of the antigen that activates the NKT cells include the antigen that activates the T cell and the antigen that activates the NK cell.
  • Examples of the antigen whose activation of NKT cells is suppressed include antigens whose activation of T cells is suppressed and antigens whose activation of NK cells is suppressed.
  • receptors examples include cytokine receptors such as TNF ⁇ receptor; chemokine receptors; hormone receptors such as insulin receptor; growth factors or growth factor receptors such as EGF receptor; and the like.
  • the cytokines and chemokines include, for example, TNF (Tumor Necrosis Factor) such as TNF- ⁇ and TNF- ⁇ ; lymphotoxin; IL-1 to IL-38 (for example, IL-1 ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12, IL-17, IL-18, IL-23, IL- 33, IL-36, etc.); chemokines; hematopoietic factors; cell growth factors; adipokines; growth factors such as VEGF;
  • TNF Tumor Necrosis Factor
  • IL-1 to IL-38 for example, IL-1 ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12, IL-17, IL-18, IL-23,
  • Examples of the toxin include staphylococcal enterotoxin.
  • Examples of the enzyme include luciferase, phosphatase, and the like.
  • fluorescent protein examples include GFP (Green Fluorescent Protein), dsRED, and the like.
  • the first adduct and the first N-intein are directly or indirectly bound (linked).
  • the first adduct and the first N-intein are directly linked.
  • the first adduct and the first N-intein are directly linked.
  • the second adduct and the second N-intein are directly or indirectly bound (linked).
  • the second adduct and the second N-intein are directly linked.
  • the second adduct and the second N-intein are directly linked.
  • first adduct and the second adduct the above description can be referred to for the direct or indirect bond.
  • the first adduct and the second adduct are, for example, a polypeptide comprising the antibody variant or the heavy chain antibody.
  • the first adduct comprises the Fab region of the first antibody, or the Fab region and all or part of the hinge region of the antibody.
  • the second adduct is a polypeptide comprising the Fab region of the second antibody, or an amino acid sequence comprising the Fab region and all or part of the hinge region of the antibody.
  • the first antibody and the second antibody are antibodies that bind to different antigens or different epitopes.
  • the hinge region included in the first adduct and the second adduct is the same as that of the first adduct, respectively. It is set to constitute the entire hinge region of the antibody when linked to the dimer-forming domain and the second dimer-forming domain.
  • the antibody variant is, for example, a human antibody variant, preferably a human IgG antibody variant.
  • the first modified protein may include other polypeptides such as the solubilization domain and the signal peptide, for example, on the N-terminal side.
  • the second modified protein may include other polypeptides such as the solubilization domain and the signal peptide, for example, on the N-terminal side.
  • the number of solubilization domains in the first modified protein may be one or more. In the latter case, there may be one type of solubilization domain or multiple types of solubilization domains.
  • the number of solubilization domains in the second modified protein may be one or more. In the latter case, there may be one type of solubilization domain or multiple types of solubilization domains.
  • the first modified protein and the second modified protein may include, for example, a purification tag used to purify the first modified protein, the second modified protein, or the heterodimeric protein.
  • a purification tag used to purify the first modified protein, the second modified protein, or the heterodimeric protein.
  • the purification tag for example, the affinity tag described above can be used.
  • the purification tag can be added to at least one of the N-terminus (side) and C-terminus (side) of the first adduct and the second adduct, for example.
  • reaction conditions of the first connection step and the second connection step may be the same or different.
  • the reaction conditions of the first linking step can be set, for example, depending on the types of the first C intein and the first N intein, and more specifically, the reaction conditions of the first C intein and the first It can be set according to the conditions of the enzymatic activity of the active intein formed by binding of the N-inteins.
  • the reaction conditions of the second linking step can be set depending on the types of the second C intein and the second N intein, and more specifically, the reaction conditions of the second C intein and the second N intein can be set according to the types of the second C intein and the second N intein.
  • the reaction temperature in the manufacturing process is, for example, 0 to 40°C, 4 to 37°C, or 4 to 30°C.
  • the reaction time of the production process is, for example, 1 minute to 48 hours, 30 minutes to 48 hours, or 1 to 48 hours.
  • the reaction pH in the production process is, for example, pH 5 to 10, pH 6 to 9, or pH 6.5 to 9.
  • the production method of the present invention may include a purification step of purifying the heterodimeric protein after the production step.
  • a purification method in the purification step for example, a general protein purification method such as chromatography can be used.
  • the production method of the present invention can produce a heterodimeric protein from a dimeric protein.
  • the present invention provides a dimeric protein that can be suitably used for producing a heterodimeric protein.
  • the protein (dimeric protein) of the present invention includes a dimeric protein including a reaction tag, and the dimeric protein including the reaction tag includes a first monomer protein and a second monomer protein, and the first monomer protein includes a first monomer protein and a second monomer protein.
  • the second monomeric protein includes, in order, a second reactive tag and a second dimer-forming domain capable of forming a dimer with the first dimer-forming domain, and the second reactive tag is capable of forming a dimer with the first dimer-forming domain.
  • a binding partner capable of binding a tag and a second C intein capable of reacting with a second N intein, the first monomeric protein and the second monomeric protein forming a dimer.
  • a heterodimeric protein can be suitably produced by combining the first modified protein and the second modified protein.
  • the present invention provides a monomer protein that can be suitably used for producing the dimeric protein.
  • the protein of the invention comprises a first monomeric protein, said first monomeric protein comprising, in this order, a first reactive tag and a first dimer-forming domain capable of forming a dimer;
  • the reactive tag includes a binding tag capable of binding a binding partner and a first C intein capable of reacting with a first N intein, and the first monomeric protein is capable of forming a dimer with a second monomeric protein.
  • the second monomeric protein includes a second reactive tag and a second dimer-forming domain capable of forming a dimer with the first dimer-forming domain, and the second reactive tag binds to the binding tag.
  • the protein of the present invention also includes a second monomer protein, the second monomer protein comprising a second reaction tag and a second dimer-forming domain capable of forming a dimer in this order; a second reactive tag comprising a binding partner capable of binding the binding tag and a second C intein capable of reacting with a second N intein, said second monomeric protein capable of forming a dimer with the first monomeric protein; and the first monomeric protein includes, in this order, a first reactive tag and a first dimer-forming domain capable of forming a dimer with the second dimer-forming domain, and the first reactive tag is , a binding tag capable of binding the binding partner and a first C intein capable of reacting with the first N intein.
  • the invention provides nucleic acids that can be used to synthesize dimeric proteins, first monomeric proteins, and/or second monomeric proteins.
  • the nucleic acid of the present invention encodes the dimeric protein of the present invention, the first monomeric protein of the present invention, and/or the second monomeric protein of the present invention.
  • the nucleic acid of the present invention can be obtained by substituting a corresponding codon based on the amino acid sequence of the dimeric protein of the present invention, the first monomer protein of the present invention, and/or the second monomer protein of the present invention. It is possible to design.
  • the base sequence of the nucleic acid of the present invention may be codon-optimized, for example.
  • the nucleic acid of the present invention may further encode the first modified protein and/or the second modified protein.
  • the invention provides expression vectors that can be used to synthesize dimeric proteins, first monomeric proteins, and/or second monomeric proteins.
  • the expression vector of the present invention contains the nucleic acid of the present invention.
  • the dimeric protein of the present invention, the first monomer protein of the present invention, and/or the second monomer protein of the present invention (hereinafter referred to as "the present monomer protein") can be produced by genetic engineering techniques. protein of the invention) can be suitably produced.
  • the nucleic acid of the present invention is inserted into the expression vector.
  • the expression vector refers to a nucleic acid molecule capable of transporting an inserted gene into a target such as a cell.
  • the expression vector is capable of expressing the protein of the present invention encoded by the polynucleotide of the nucleic acid of the present invention, for example, the dimeric protein of the present invention, the first monomer protein of the present invention, and/or
  • the structure is not particularly limited as long as it contains a polynucleotide encoding the second monomer protein of the present invention.
  • the dimeric protein of the present invention, the first monomer protein of the present invention, and/or the second monomer protein of the present invention may be partially or entirely inserted into the same expression vector, for example. , may be inserted into separate expression vectors.
  • the expression vector of the present invention comprises the An expression vector comprising a nucleic acid encoding the dimeric protein of the present invention, an expression vector comprising a nucleic acid encoding the first monomer protein of the present invention, and/or a nucleic acid encoding the second monomer protein of the present invention. It can be configured as an expression vector set including the expression vector containing the expression vector.
  • the expression vector may further include a nucleic acid encoding the first modified protein and/or the second modified protein.
  • the nucleic acid encoding the first modified protein and/or the second modified protein is the dimeric protein of the present invention, the first monomer protein of the present invention, and/or the nucleic acid encoding the first modified protein of the present invention. It may be inserted into an expression vector containing the nucleic acid encoding the second monomer protein, or into another expression vector.
  • the expression vector can be produced, for example, by inserting a polynucleotide encoding the protein of the present invention, that is, the nucleic acid of the present invention, into a backbone vector (hereinafter also referred to as "basic vector").
  • the type of the expression vector is not particularly limited, and can be determined as appropriate depending on, for example, the type of the host.
  • Examples of the host include non-human hosts such as microorganisms, animal cells, insect cells, or cultured cells thereof, isolated human cells or cultured cells thereof, mammalian cells, and the like.
  • Examples of the prokaryotes include bacteria of the genus Escherichia, such as Escherichia coli , and bacteria of the genus Pseudomonas, such as Pseudomonas putida .
  • Examples of the eukaryotic organisms include yeasts such as Saccharomyces cerevisiae .
  • Examples of the animal cells include HEK293 cells, Expi293F cells, COS cells, and CHO cells, and examples of the insect cells include Sf9 and Sf21.
  • the expression vectors include viral vectors and non-viral vectors.
  • examples of the expression vector include a binary vector.
  • examples of the expression vector include pETDuet-1, pQE-80L, pUCP26Km, and the like.
  • examples of the expression vector include pETDuet-1 vector (Novagen), pQE-80L (QIAGEN), pBR322, pB325, pAT153, pUC8, and the like.
  • examples of the expression vector include pYepSec1, pMFa, pYES2, and the like.
  • examples of the expression vector When the insect cells are transformed, examples of the expression vector include pAc and pVL. When transforming the mammalian cells, examples of the expression vector include pcDNA3.1, pcDNA3.4, pCAG, pCAGEN, pCDM8, pMT2PC, and the like.
  • the expression vector preferably has a regulatory sequence that regulates, for example, the expression of the polynucleotide encoding the protein of the present invention and the expression of the protein of the present invention encoded by the polynucleotide of the protein of the present invention.
  • the regulatory sequences include promoters, terminators, enhancers, polyadenylation signal sequences, origin of replication sequences (ori), and the like.
  • the arrangement of the regulatory sequence is not particularly limited.
  • the regulatory sequence may be arranged so as to be able to functionally regulate the expression of the polynucleotide encoding the protein of the present invention and the protein of the present invention encoded thereby. , can be arranged based on known methods.
  • a sequence provided in the basic vector may be used, the regulatory sequence may be further inserted into the basic vector, or the regulatory sequence provided in the basic vector may be combined with another sequence. may be replaced by the regulatory sequence.
  • the expression vector may, for example, further include a coding sequence for a selection marker.
  • a selection marker include drug resistance markers, fluorescent protein markers, enzyme markers, cell surface receptor markers, and the like.
  • Insertion of DNA, the regulatory sequence, and/or the selection marker coding sequence into the expression vector may be carried out, for example, by a method using restriction enzymes and ligase, or by using a commercially available kit. etc. may also be used.
  • transformant capable of producing the protein of the present invention and a method for producing the same are provided.
  • the transformant of the present invention contains a nucleic acid encoding the protein of the present invention. According to the transformant of the present invention, the protein of the present invention can be suitably produced.
  • the method for producing a transformant of the present invention includes the step of introducing the nucleic acid of the present invention into a host. According to the method for producing a transformant of the present invention, the transformant can be produced.
  • nucleic acid encoding the protein of the present invention in the transformant of the present invention, the description of the nucleic acid encoding the protein of the present invention can be referred to for the nucleic acid encoding the protein of the present invention.
  • the expression vector of the present invention described above may be used as the nucleic acid of the present invention described above.
  • the nucleic acid of the present invention exists as an exogenous molecule. Therefore, the transformant of the present invention can be produced, for example, by introducing the nucleic acid of the present invention into the host.
  • the method for introducing the nucleic acid is not particularly limited, and any known method can be used.
  • the nucleic acid may be introduced, for example, by the expression vector.
  • the introduction method can be appropriately set, for example, depending on the type of the host.
  • the introduction method includes, for example, an introduction method using a gene gun such as a particle gun, a calcium phosphate method, a polyethylene glycol method, a lipofection method using liposomes, an electroporation method, an ultrasonic nucleic acid introduction method, a DEAE-dextran method, a micro glass tube, etc. Examples include a direct injection method using a hydrodynamic method, a cationic liposome method, a method using an introduction aid, and a method using Agrobacterium.
  • liposome examples include lipofectamine and cationic liposome
  • introduction aid examples include atelocollagen, nanoparticles, and polymers.
  • the host is a microorganism, for example, E. coli or Ps. Preferred is the method via P. putida et al.
  • the polynucleotide encoding the protein of the present invention may be introduced into the host using, for example, the expression vector of the present invention.
  • the present invention provides a method for producing a dimeric protein that can be suitably used for producing a heterodimeric protein, or a monomeric protein that can be suitably used for producing the dimeric protein.
  • the method for producing a protein of the present invention includes an expression step of expressing the nucleic acid of the present invention, the expression vector of the present invention, and/or the expression vector set of the present invention. According to the method for producing a protein of the present invention, the dimeric protein, the first monomer protein, and/or the second monomer protein of the present invention can be produced.
  • the protein of the present invention may be expressed using, for example, the expression vector of the present invention described above.
  • the method for expressing the protein of the present invention is not particularly limited, and any known method may be employed, for example, a host may be used or a cell-free protein synthesis system may be used.
  • the host into which the protein of the present invention or a nucleic acid encoding the same has been introduced it is preferable to use the host into which the protein of the present invention or a nucleic acid encoding the same has been introduced, and to culture the host to express the protein of the present invention in the host.
  • a nucleic acid encoding the protein of the present invention into a host, a transformant that synthesizes the protein of the present invention can be produced, and by culturing the transformant, the protein of the present invention can be produced. can be synthesized.
  • the method for culturing the host is not particularly limited and can be appropriately set depending on the type of the host.
  • the medium used for culture is not particularly limited and can be appropriately determined depending on the type of the host.
  • the polynucleotide of the protein of the present invention in a cell-free protein synthesis system.
  • an expression vector may be used to express the polynucleotide of the protein of the present invention.
  • the cell-free protein synthesis system can be carried out by a known method using, for example, a cell extract, a buffer containing various components, and an expression vector into which a polynucleotide encoding the protein of the present invention has been introduced.
  • commercially available reagent kits can be used.
  • the method for producing the protein of the present invention may include, for example, a recovery step of recovering the protein of the present invention.
  • the protein of the present invention obtained in the recovery step may be, for example, a crudely purified product or a purified protein.
  • insoluble matter is removed by, for example, filtering or centrifuging the culture supernatant.
  • the culture supernatant after removing the insoluble matter is subjected to concentration using an ultrafiltration membrane; salting out such as ammonium sulfate precipitation; dialysis; using various columns such as an ion exchange column and a gel filtration column.
  • the protein of the present invention can be obtained by performing separation and purification using an appropriate combination of chromatography.
  • the transformant is crushed by, for example, pressure treatment, ultrasonic treatment, or the like. Then, the protein of the present invention can be obtained by removing insoluble matter, separating and purifying the resulting crushed solution as described above.
  • the protein of the present invention obtained by the production method of the present invention may be used, for example, as a crudely purified protein as it is, as a partially purified protein, or as a single purified protein. It may also be used as a purified protein.
  • the obtained protein of the present invention may be powdered by, for example, freeze drying, vacuum drying, spray drying, or the like.
  • the production method of the present invention includes, for example, adding the protein of the present invention to an acetate buffer, a phosphate buffer, a triethanolamine buffer, a Tris-HCl buffer, a GOOD's buffer (e.g., HEPES, PIPES, MES, MOPS). etc.) may be dissolved in a buffer solution such as
  • the invention provides a method of screening for heterodimeric proteins responsive to a desired target.
  • the method for screening a target-reactive heterodimeric protein of the present invention comprises a manufacturing step of producing a candidate heterodimeric protein by reacting a dimeric protein containing a reaction tag with a modified protein that modifies the dimeric protein; a detection step of bringing a dimeric protein into contact with a target and detecting a reaction between the candidate heterodimeric protein and the target; and a selection step of selecting the candidate heterodimeric protein for which the reaction has been detected as a candidate substance that reacts with the target.
  • the manufacturing process is carried out by the manufacturing method of the present invention. According to the screening method of the present invention, heterodimeric proteins that react with a desired target can be screened.
  • the candidate heterodimeric protein can be produced in the same manner as the manufacturing method of the present invention.
  • Said candidate heterodimeric protein is preferably an antibody, such as a multispecific antibody or a bispecific antibody.
  • the antigen-binding domain of the antibody may be used, for example, as a candidate antigen-binding domain for evaluating binding to a target described below.
  • the candidate heterodimeric protein may include a label.
  • the label include fluorescent substances such as fluorescent proteins and fluorescent dyes; enzymes such as luciferase and phosphatase; and the like.
  • the candidate heterodimeric protein is brought into contact with the target, and a reaction between the candidate heterodimeric protein and the target is detected.
  • the contact is performed, for example, in the presence of the aqueous solvent.
  • the contact conditions are not particularly limited, and can be set depending on the type of target, for example.
  • the temperature in the detection step is, for example, 4 to 37°C or 18 to 25°C.
  • the time of the detection step is, for example, 0 to 120 minutes, 30 to 60 minutes.
  • the target can be a desired target for screening the reactivity of the heterodimeric protein.
  • the target can be exemplified by, for example, the target antigen.
  • the target may be fixed to a carrier or may be free, for example.
  • the carrier include substrates, beads, containers, and the like.
  • the container include a microplate, a tube, and the like.
  • a reaction between the candidate heterodimeric protein and the target is detected.
  • the reaction can be determined depending on the type of the candidate heterodimeric protein and the target.
  • the candidate heterodimeric protein comprises an antibody, such as a multispecific antibody, or an antigen-binding fragment thereof
  • the reaction is, for example, binding.
  • the candidate heterodimeric protein contains an enzyme
  • the reaction is, for example, a catalytic reaction. If the candidate heterodimeric protein includes a receptor, the reaction is, for example, binding.
  • the detection step for example, the presence or absence of reactivity of the candidate heterodimer protein with the target is detected or analyzed (qualitative analysis) by detecting the presence or absence of a reaction between the candidate heterodimer protein and the target. can. Furthermore, in the detection step, by detecting the degree of reaction between the candidate heterodimer protein and the target, for example, the strength of the reaction of the candidate heterodimer protein to the target can be detected or analyzed (quantitative analysis). .
  • the candidate heterodimer protein does not react with the target, and if the reaction is detected, the candidate heterodimer protein can be evaluated as not reacting with the target. Proteins can be evaluated to react with said target.
  • the method for analyzing the reaction between the candidate heterodimeric protein and the target is not particularly limited, and can be determined depending on the type of the reaction.
  • the reaction between the candidate heterodimeric protein and the target is, for example, about a complex formed by binding of the candidate heterodimeric protein and the target. , can be carried out by detecting the label.
  • the candidate heterodimeric protein whose reaction has been detected is selected as a candidate substance that reacts with the target.
  • candidate heterodimeric proteins that are estimated to have reactivity with the target can be screened.
  • Example 1 It was confirmed that different adducts could be introduced into the dimeric protein by the production method of the present invention.
  • Example 1 a protein containing part of the hinge region and the CH2 and CH3 regions of the Fc region of a human IgG antibody was used as a model of a dimeric protein, and the Fab of the HER2 antibody and the Fab of the OKT3 antibody were They were used as a first adduct model and a second adduct model, respectively.
  • a first monomer protein, a second monomer protein, a first modified protein, and a second modified protein containing these as parts are prepared, and by the production method of the present invention, the protein containing the Fc region has HER2 It was confirmed that a bispecific antibody capable of binding to HER2 and CD3 could be produced by introducing an antibody (Herceptin) Fab and an OKT3 antibody Fab.
  • Modified protein 2 (Her2-Fab): A protein containing the VL and CL regions of Herceptin antibody (Her2-Fab-L), A complex of a protein (Her2-Fab-C) containing the VH and CH1 regions of Herceptin antibody and the N-terminal region of the hinge region of human IgG1 and cfa N-intein (second N-intein)
  • a plasmid vector capable of expressing CD3-Fab-H was constructed using the following procedure. First, it encodes the signal peptide, the VH-CH1 domain of OKT3 (SEQ ID NO: 12), the N-terminal partial sequence of the hinge region of human IgG1, the gp41-1 N intein (SEQ ID NO: 7), the G1 linker, and the His tag. The full length of a synthetic gene (Eurofin Genomics) containing the base sequence was amplified by PCR. The obtained full-length synthetic gene was ligated to an animal cell expression vector (pCAGEN) to construct a recombinant protein expression vector.
  • pCAGEN animal cell expression vector
  • the expression vector contains the signal peptide, the VH-CH1 domain of OKT3, and the N-terminal portion of the hinge region, as shown in parentheses, from the N-terminus to the C-terminus as the CD3-Fab-H region (SEQ ID NO: 13).
  • the sequence, gp41-1 N intein, G1 linker, and His tag are linked in this order.
  • CD3-Fab-H region (SEQ ID NO: 13) [MEFGLSWLFLVAILKGVQC][QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGKGLEWIGYINPSRGYTNYNQKVKDRFTISRDNSKNTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARYYDDHYSLDYWGQGTPVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC][DKT][SGYCLDLKTQVQTPQGMKEISNIQVGDLVLSNTGYNEVLNVFPKSKKKSYKITLEDGKEIICSEEHLFPTQTGEMNISGGLKEGMCLYVKE][GGSGG][HHHHHH]
  • a plasmid vector capable of expressing CD3-Fab-L was constructed using the following procedure.
  • a full-length synthetic gene (Eurofin Genomics) containing a base sequence encoding the signal peptide and the VL-CL domain of OKT3 (SEQ ID NO: 14) was amplified by PCR.
  • the obtained full-length synthetic gene was ligated to an animal cell expression vector (pCAGEN) to construct a recombinant protein expression vector.
  • the signal peptide and the VL-CL domain of OKT3 are linked in this order from the N-terminus to the C-terminus as the CD3-Fab-L region (SEQ ID NO: 15), as shown in parentheses.
  • CD3-Fab-L region (SEQ ID NO: 15) [MDFQVQIFSFLLISASVIISRG][DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQTPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLQITRTVA][APSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC]
  • a plasmid vector capable of expressing Her2-Fab-H was constructed using the following procedure. First, the base sequence encoding the signal peptide, the VH-CH1 domain of Herceptin (SEQ ID NO: 16), the N-terminal partial sequence of the hinge region of human IgG1, the Cfa N intein (SEQ ID NO: 9), the G1 linker, and the His tag. The full-length synthetic gene (Eurofin Genomics) containing the following was amplified by PCR. The obtained full-length synthetic gene was ligated to an animal cell expression vector (pCAGEN) to construct a recombinant protein expression vector.
  • pCAGEN animal cell expression vector
  • the expression vector contains the signal peptide, the VH-CH1 domain of Herceptin, and the N-terminal portion of the hinge region, as shown in parentheses, from the N-terminus to the C-terminus as the Her2-Fab-H region (SEQ ID NO: 17).
  • the sequence, CfaN intein, G1 linker, and His tag are linked in this order.
  • Her2-Fab-H region (SEQ ID NO: 17) [MEFGLSWLFLVAILKGVQC][EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAVDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC][DKT][CLSYDTEILTVEYGFLPIGKIVEERIECTVYTVDKNGFVYTQPIAQWHNRGEQEVFEYCLEDGSIIRATKDHKFMTTDGQMLPIDEIFERGLDLKQVDGLP][GGSGG][HHHHHH]
  • a plasmid vector capable of expressing Her2-Fab-L was constructed using the following procedure.
  • a full-length synthetic gene (Eurofin Genomics) containing a base sequence encoding the signal peptide and the VL-CL domain of Herceptin (SEQ ID NO: 18) was amplified by PCR.
  • the obtained full-length synthetic gene was ligated to an animal cell expression vector (pCAGEN) to construct a recombinant protein expression vector.
  • the signal peptide and the VL-CL domain of Herceptin are linked in this order from the N-terminus to the C-terminus as the Her2-Fab-L region (SEQ ID NO: 19), as shown in parentheses.
  • Her2-Fab-L region (SEQ ID NO: 19) [METPAQLLFLLLLWLPESTG][DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEI][KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC]
  • a plasmid vector capable of expressing SpyCatcher-VHH was constructed using the following procedure. First, signal peptide, Ia1 (single chain antibody (solubilization domain), SEQ ID NO: 20), G1 linker, SpyCatcher (SEQ ID NO: 1), G1 linker, Cfa C intein (SEQ ID NO: 8), hinge region of human IgG1.
  • a full-length synthetic gene (Eurofin Genomics) containing a C-terminal partial sequence and a nucleotide sequence encoding the CH2 and CH3 regions (SEQ ID NO: 21) of the human IgG Fc region was amplified by PCR.
  • the obtained full-length synthetic gene was ligated to an animal cell expression vector (pCDNA3.4) to construct a recombinant protein expression vector.
  • the expression vector contains a signal peptide, Ia1, G1 linker, SpyCatcher, G1 linker, Cfa C intein, and human IgG1 hinge region as shown in parentheses from the N-terminus to the C-terminus as the SpyCatcher VHH region (SEQ ID NO: 22).
  • the partial sequence on the C-terminal side of , and the CH2 region and CH3 region of the Fc region of human IgG are linked in this order.
  • Fc region (SEQ ID NO: 21) APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSPGK
  • Ia1 (SEQ ID NO: 20) QVQLQESGGGLVQAGGSLLLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAAINWSGGSTSYADSVKGRFTISRDNTKNTVYLQMNSLKPEDTAAFYCAATYNPYSRDHYFPRMTTEYDYWGQGTQVTVSS
  • SpyCatcher-VHH region (SEQ ID NO: 22) [MEFGLSWLFLVAILKGVQC][QVQLQESGGGLVQAGGSLLLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAAINWSGGSTSYADSVKGRFTISRDNTKNTVYLQMNSLKPEDTAAFYCAATYNPYSRDHYFPRMTTEYDYWGQGTQVTVSS][GGSGG][DSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDF YLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNG][GGSGG][VKIISRKSLGTQNVYDIGVEKDHNFLLKNGLVASNC][FNASYTCPPCP][APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKE
  • a plasmid vector capable of expressing SpyTag-VHH was constructed using the following procedure. First, signal peptide, cAb GFP4 (single chain antibody (solubilization domain), SEQ ID NO: 23), G1 linker, SpyTag (SEQ ID NO: 2), gp41-1 C intein (SEQ ID NO: 6), C of the hinge region of human IgG1.
  • the full length of a synthetic gene (Eurofin Genomics) containing a terminal partial sequence and base sequences encoding the CH2 and CH3 regions of the Fc region of human IgG was amplified by PCR. The obtained full-length synthetic gene was ligated to an animal cell expression vector (pCDNA3.4) to construct a recombinant protein expression vector.
  • pCDNA3.4 animal cell expression vector
  • the expression vector contains a signal peptide, cAb GFP4, G1 linker, SpyTag, gp41-1 C intein, human IgG1 hinge, as shown in parentheses, from the N-terminus to the C-terminus as the SpyTag-VHH region (SEQ ID NO: 24).
  • the C-terminal partial sequence of the region and the CH2 region and CH3 region of the human IgG Fc region are linked in this order.
  • cAb GFP4 (SEQ ID NO: 23) QVQLVESGGALVQPGGSLRLSCAASGFPVNRYSMRWYRQAPGKEREWVAGMSSAGDRSSYEDSVKGRFTISRDDARNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNVNVGFEYWGQGTQVTVSS
  • SpyTag-VHH region (SEQ ID NO: 24) [MEFGLSWLFLVAILKGVQC][QVQLVESGGALVQPGGSLRLSCAASGFPVNRYSMRWYRQAPGKEREWVAGMSSAGDRSSYEDSVKGRFTISRDDARNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNVNVGFEYWGQGTQVTVSS][GGSGG][AHIVMVDAYKPTK][GGSGG][MMLKKILKIEELDERELIDIEVSGNHLFYANDIL THNSAG][ASYTCPPCP][APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY
  • each plasmid expression vector for the recombinant protein was transfected into Expi293F cells.
  • a combination of the CD3-Fab-H expression vector and the CD3-Fab-L expression vector, a combination of the Her2-Fab-H expression vector and the Her2-Fab-L expression vector, or the A combination of the SpyCatcher-VHH expression vector and the SpyTag-VHH expression vector was introduced into the cells.
  • the obtained transformants were cultured in HE400 medium at 37°C in a CO 2 incubator for 7 days, and recombinant proteins (SpyTag-VHH + SpyCatcher-VHH (Fc dimer), CD3-Fab-L + CD3 -Fab-H (CD3-Fab), Her2-Fab-L + Her2-Fab-H (Her2-Fab)).
  • Each of the obtained protein samples was diluted with ultrapure water, and the absorbance at 280 nm and 330 nm was measured using an ultraviolet-visible spectrophotometer (UV-1800, manufactured by SHIMADZU). Then, the molar concentration of protein in each protein sample was calculated from the following formula (1).
  • C (A280-A320) ⁇ (l ⁇ ) ⁇ (dilution ratio)...(1)
  • A320 absorbance at 320 nm l: cell length
  • ⁇ molar extinction coefficient of protein
  • Herceptin-OKT3 bispecific antibody was prepared using SpyTag-VHH + SpyCatcher-VHH (Fc dimer), CD3-Fab, and Her2-Fab obtained in Example 1 (1) above. was created. Specifically, SpyTag-VHH+SpyCatcher-VHH, CD3-Fab, and Her2-Fab were reacted by PTS reaction to obtain a Herceptin-Okt3 bispecific antibody. 2 ⁇ l of the protein containing each antibody fragment obtained in Example 1 (1) and (2) (dissolved in 150 mmol/l NaCl, 50 mmol/l HEPES (pH 7.6), and 1 mmol/l TCEP) was placed in a microtube. was added to prepare a pre-PTS reaction sample. After the preparation, the pre-PTS reaction sample was allowed to stand in an incubator at 37° C. for 24 hours to perform the PTS reaction. After the PTS reaction, a post-PTS reaction sample was obtained.
  • Herceptin-OKT3 bispecific antibody was produced by SDS-PAGE for the sample obtained in Example 1 (4) after the PTS reaction.
  • Fc region complex of SpyTag-VHH and SpyCatcher-VHH
  • Herceptin-Fab Fab composed of Her2-Fab-L and Her2-Fab-H, Herceptin
  • CD3-Fab Fab composed of CD3-Fab-L and CD3-Fab-H, hOKT3
  • pre-PTS reaction sample was added with 10 ⁇ l of 5 ⁇ SDS buffer and suspended. After the suspension, heating treatment was performed at 95° C. for 5 minutes.
  • FIG. 2 is a photograph showing each antibody fragment and the protein before and after PTS reaction.
  • the upper part of the photograph shows the type of sample, and the right side of the photograph shows the molecular weight (kDa).
  • each lane shows, from the left, an Fc region, Herceptin, hOKT3, a pre-PTS reaction sample (reaction 0 hours), a post-PTS reaction sample (reaction 24 hours), and a marker.
  • bands representing four proteins constituting each antibody were detected in the sample after the PTS reaction. From these results, it was found that the Herceptin-OKT3 bispecific antibody was produced by the PTS reaction in the post-PTS reaction sample.
  • the post-PTS reaction sample obtained in Example 1 (4) was purified. Specifically, the protein was purified using a column for purifying proteins having an Fc region, and then purified using a column for purifying proteins having an Fab region.
  • a protein having an Fc region was purified using a KanCapA column. After equilibrating a KanCapA column (manufactured by KANEKA, column volume 500 ⁇ l) with TBS buffer (150 mmol/l NaCl, and 50 mmol/l Tris-HCl (pH 7.5)), the PTS reaction obtained in Example 1 (4) was performed. The subsequent sample was loaded onto the column, and the flow-through fraction was collected.
  • the collected eluted fractions were placed in a transparent membrane (semi-permeable membrane) and dialyzed using the dialysis buffer (1 ⁇ PBS). After the dialysis, concentration was performed using a concentration tube. A purified sample was obtained by the concentration.
  • Example 1 (6) contained the Herceptin-Okt3 bispecific antibody was examined using SDS-PAGE. Specifically, 10 ⁇ l of 5 ⁇ SDS buffer was added and suspended. After the suspension, heat treatment was performed at 95° C. for 5 minutes. After the heat treatment, it was applied to a well of 12.5% or 10% polyacrylamide gel, and electrophoresis was performed at 150 to 200V. A marker, a post-PTS reaction sample, a flow-through fraction, a wash fraction, and an elution fraction were applied to the 12.5% polyacrylamide gel. Further, in the 10% acrylamide gel, the purified sample was applied. After the electrophoresis, the polyacrylamide gel was stained with a CBB (Coomassie Brilliant Blue) staining solution for 5 minutes, and decolorized with a destaining solution.
  • CBB Common Blue
  • FIG. 3 is a photograph showing the protein after PTS reaction and column purification.
  • (A) shows photographs of the protein before and after purification with a KanCapA column
  • FIG. 3(B) shows a photograph of the protein of the purified sample purified with a KanCapL column.
  • the upper part of the photograph shows the type of sample
  • the left side of the photograph shows the molecular weight (kDa).
  • the upper part of the photograph shows the type of sample
  • the left side of the photograph shows the molecular weight (kDa).
  • FIG. 3(B) shows the upper part of the photograph shows the type of sample, and the left side of the photograph shows the molecular weight (kDa).
  • FIG. 3(A) shows photographs of the protein before and after purification with a KanCapA column
  • FIG. 3(B) shows a photograph of the protein of the purified sample purified with a KanCapL column.
  • the upper part of the photograph shows the type of sample
  • the left side of the photograph shows the mole
  • each lane shows, from the left, a marker, a sample after PTS reaction (24 hours of reaction), a flow-through fraction (pass-through), a wash fraction (wash), and an eluted fraction (elution).
  • a marker As shown in FIG. 3(A), in the elution fraction, bands of each antibody fragment of interest were detected, but bands of contaminant proteins were also detected.
  • FIG. 3(B) in the purified sample purified using the KanCapL column, bands of each antibody fragment of interest were detected, and no bands of contaminant proteins were detected.
  • Example 1 (6) Examination of the unity of the purified bispecific antibody Regarding the Herceptin-Okt3 bispecific antibody purified in Example 1 (6), whether the Herceptin-Okt3 bispecific antibody is single? , investigated using gel filtration chromatography. Specifically, the protein purified in Example 1 (6) was passed through a column for gel filtration chromatography (Superdex 200 increase 30/100 GL, manufactured by GE Healthcare) at a rate of 0.5 mL/min, and the mixture was heated to room temperature (approx. Absorbance at 212 nm was measured under conditions (25°C). In the measurement, 1 ⁇ PBS was used as a buffer. This result is shown in Figure 4.
  • FIG. 4 is a graph showing the protein elution pattern by gel filtration chromatography.
  • the horizontal axis shows excluded volume (ml), and the vertical axis shows absorbance.
  • the purified protein obtained by the method of the present disclosure showed a single peak at 15 ml at an absorption wavelength of 212 nm.
  • Example 1 (6) After the centrifugation, the supernatant was removed using an aspirator, and the Herceptin-Okt3 bispecific antibody purified in Example 1 (6) was added to one microtube (b) with 1 ⁇ PBS. The heavy specific antibody was added at a final concentration of 0.05 ⁇ mol/l and mixed by inversion. After mixing by inversion, the mixture was allowed to stand for 20 minutes. After the above-mentioned standing, it was centrifuged under the conditions of 2000 rpm, 25° C., and 7 minutes.
  • FIG. 5 is a graph showing the binding of bispecific antibodies to CD3-positive cells by flow cytometry.
  • the horizontal axis indicates fluorescence intensity
  • the vertical axis indicates cell number.
  • the Herceptin-Okt3 bispecific antibody obtained by the method of the present disclosure was added to CD3-positive cells, the fluorescence intensity increased compared to when it was not added to CD3-positive cells. I found out that it shows.
  • the flask was tapped lightly. After the tapping, DMEM medium was added to make the total volume 10 ml, and the cells were separated from the flask by suspension to obtain a cell suspension. Next, the cell suspension was transferred to a 15 ml Falcon tube and centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes. After the centrifugation, the supernatant was removed by suction using an aspirator, and a required amount of 1 ⁇ PBS was added and suspended to obtain a cell suspension. Thereafter, 1 ml of the suspension containing 1 ⁇ 10 6 cells was aliquoted into three microtubes (d) to (f), and diluted with 1 ⁇ PBS.
  • the two microtubes (d) and (e) were centrifuged at 2000 rpm, 25° C., and 7 minutes. After the centrifugation, the supernatant was removed by suction using an aspirator, and 1 ml of 1 ⁇ PBS was added. After the addition, the two microtubes (d) and (e) were centrifuged again at 2000 rpm, 25° C., and 7 minutes. After the centrifugation, the supernatant was removed by suction using an aspirator.
  • the two microtubes (d) and (e) were centrifuged under the conditions of 2000 rpm, 25° C., and 7 minutes. After the centrifugation, the supernatant was removed by suction using an aspirator, and 1 ml of 1 ⁇ PBS was added. After the addition, the two microtubes (d) and (e) were centrifuged again at 2000 rpm, 25° C., and 7 minutes.
  • the supernatant was removed by suction using an aspirator, and 1 ⁇ l of anti-Fc-FITC (manufactured by AbCam) and 1 ml of 1 ⁇ PBS were added to the two microtubes (d) and (e), and the tubes were mixed by inversion. . After mixing by inversion, the mixture was allowed to stand for 20 minutes. After the above-mentioned standing, the two microtubes were centrifuged under the conditions of 2000 rpm, 25° C., and 7 minutes. After the centrifugation, the supernatant was removed by suction using an aspirator, and 1 ml of 1 ⁇ PBS was added.
  • the two microtubes (d) and (e) were centrifuged again at 2000 rpm, 25° C., and 7 minutes. After the centrifugation, the supernatant was removed by suction using an aspirator, and 1 ml of 1 ⁇ PBS was added and suspended. After the suspension, sterilization was performed using a mesh filter. After setting the measurement conditions, measurements were performed using Cell Analyzer RF-500 (manufactured by Sysmex Corporation) in the order of negative control (f), positive control (d), and sample (e). After measurement, the measurement results were graphed using FCSalyzer. These results are shown in FIG.
  • FIG. 6 is a graph showing the binding of bispecific antibodies to HER2-positive cells by flow cytometry.
  • the horizontal axis indicates fluorescence intensity and the vertical axis indicates cell number.
  • the Herceptin-Okt3 bispecific antibody obtained by the production method of the present invention was added to HER2-positive cells, the fluorescence intensity increased compared to when it was not added to HER2-positive cells. It was found that These results revealed that the Herceptin-Okt3 bispecific antibody obtained by the method of the present disclosure binds to Her2-positive breast cancer cells.
  • Example 1 (11) Evaluation of maintenance of activity on HER2-positive cells using surface plasmon resonance method
  • Surface plasmon resonance method was used to determine whether the Herceptin-Okt3 bispecific antibody obtained in Example 1 (6) could maintain binding to Her2.
  • a Herceptin-Okt3 bispecific antibody was flowed at a predetermined flow rate onto HER2 immobilized on a sensor chip, and measurement was performed using an intermolecular interaction analyzer.
  • the Herceptin-Okt3 bispecific antibody purified in Example 1 (6) was adjusted to 1 nmol/l, 2 nmol/l, 4 nmol/l, 8 nmol/l, and 16 nmol/l using 1 ⁇ PBS-Tween20. Diluted.
  • the diluted solution containing the Herceptin-Okt3 bispecific antibody was immobilized on a CM5 sensor chip (manufactured by GE Healthcare) using a surface plasmon resonance measurement device (Biacore T200, manufactured by Cytiva). The binding strength was measured by flowing it through HER2-hFc. The results are shown in FIG.
  • FIG. 7 is a graph showing the maintenance of binding of bispecific antibodies to HER2 by surface plasmon resonance.
  • the horizontal axis indicates time (minutes), and the vertical axis indicates response units (RU).
  • the dissociation equilibrium constant Kd value was 2.25 ⁇ 10 ⁇ 9 (M).
  • a method for producing a heterodimeric protein comprising: A manufacturing step of producing a heterodimeric protein by reacting a dimeric protein containing a reaction tag with a modified protein that modifies the dimeric protein,
  • the dimeric protein containing the reactive tag includes a first monomeric protein and a second monomeric protein, the first monomeric protein comprises, in order, a first reactive tag and a first dimer-forming domain capable of forming a dimer;
  • the first reaction tag includes a binding tag and a first C intein;
  • the second monomeric protein comprises, in this order, a second reactive tag and a second dimer-forming domain capable of forming a dimer with the first dimer-forming domain;
  • the second reactive tag comprises a binding partner capable of binding to the binding tag and a second C intein;
  • the binding tag and the binding partner are, respectively, a Streptococcus pyogenes surface protein (SpyCatcher) and a peptide tag capable of binding to the SpyCatcher (SpyTag), or the binding tag and the binding partner are, respectively, the SpyTag and the The manufacturing method according to any one of Supplementary Notes 1 to 4, which is SpyCatcher.
  • Appendix 6 6.
  • Appendix 7) The manufacturing method according to appendix 6, wherein the immunoglobulin is IgG, IgA, IgE, IgD, or IgM.
  • the first C intein and the first N intein are the C intein and N intein of an integral intein or a split intein, respectively, and/or the second C intein and the second N intein are , C intein and N intein of integral type intein or split type intein, respectively, the manufacturing method according to any one of appendices 1 to 9.
  • Appendix 11 11. The manufacturing method according to any one of Supplementary Notes 1 to 10, wherein the first adduct and/or the second adduct are proteins.
  • Appendix 12 12.
  • Appendix 13 13.
  • the dimeric protein includes part or all of the Fc region of an immunoglobulin, the first adduct and the second adduct include an antibody variant and/or a heavy chain antibody (VHH); 14.
  • ⁇ Dimeric protein> contains a dimeric protein containing a reactive tag
  • the dimeric protein containing the reactive tag includes a first monomeric protein and a second monomeric protein
  • the first monomeric protein includes a first reactive tag and a first dimer-forming domain capable of forming a dimer
  • the first reactive tag includes a binding tag and a first C intein capable of reacting with a first N intein
  • the second monomeric protein comprises, in this order, a second reactive tag and a second dimer-forming domain capable of forming a dimer with the first dimer-forming domain
  • the second reactive tag comprises a binding partner capable of binding to the binding tag and a second C intein capable of reacting with a second N intein
  • the first monomer protein and the second monomer protein form a dimer; protein.
  • the protein according to appendix 16, wherein the binding tag and the binding partner are peptide tags and peptides capable of spontaneously forming a covalent bond.
  • the protein according to appendix 16 or 17, wherein the binding between the binding tag and the binding partner is a covalent bond.
  • the binding tag and the binding partner are, respectively, a Streptococcus pyogenes surface protein (SpyCatcher) and a peptide tag capable of binding to the SpyCatcher (SpyTag), or the binding tag and the binding partner are, respectively, the SpyTag and the 19.
  • the dimeric protein includes part or all of the Fc region of an immunoglobulin, and the protein according to any one of Supplementary Notes 16 to 19.
  • the protein according to appendix 20, wherein the immunoglobulin is IgG, IgA, IgE, IgD, or IgM.
  • the protein according to appendix 21, wherein the IgG is IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3, or IgG4.
  • the first C intein and the first N intein are the C intein and N intein of an integral intein or a split intein, respectively, and/or the second C intein and the second N intein are , C intein and N intein of integral intein or split intein, respectively, according to any one of appendices 16 to 23.
  • ⁇ Monomer protein> (Additional note 25) comprising a first monomeric protein; the first monomeric protein comprises, in order, a first reactive tag and a first dimer-forming domain capable of forming a dimer;
  • the first reactive tag includes a binding tag capable of binding a binding partner and a first C intein capable of reacting with a first N intein;
  • the first monomer protein is capable of forming a dimer with a second monomer protein,
  • the second monomeric protein includes a second reactive tag and a second dimer-forming domain capable of forming a dimer with the first dimer-forming domain,
  • the second reactive tag comprises a binding partner capable of binding the binding tag and a second C intein capable of reacting with a second N intein.
  • the second monomeric protein comprises, in this order, a second reactive tag and a second dimer-forming domain capable of forming a dimer;
  • the second reactive tag comprises a binding partner capable of binding the binding tag and a second C intein capable of reacting with a second N intein;
  • the second monomer protein is capable of forming a dimer with the first monomer protein,
  • the first monomeric protein comprises, in this order, a first reactive tag and a first dimer-forming domain capable of forming a dimer with the second dimer-forming domain;
  • the first reactive tag comprises a binding tag capable of binding the binding partner and a first C intein capable of reacting with the first N intein.
  • (Additional note 27) 27 The protein according to appendix 25 or 26, wherein the binding tag and the binding partner are peptide tags and peptides capable of spontaneously forming a covalent bond.
  • (Additional note 28) 28 The protein according to any of appendices 25 to 27, wherein the binding between the binding tag and the binding partner is a covalent bond.
  • the binding tag and the binding partner are, respectively, a Streptococcus pyogenes surface protein (SpyCatcher) and a peptide tag capable of binding to the SpyCatcher (SpyTag), or the binding tag and the binding partner are, respectively, the SpyTag and the 29.
  • SpyCatcher Streptococcus pyogenes surface protein
  • SpyTag a peptide tag capable of binding to the SpyCatcher
  • the binding tag and the binding partner are, respectively, the SpyTag and the 29.
  • the dimeric protein includes part or all of the Fc region of an immunoglobulin, and the protein according to any one of appendices 25 to 29.
  • the protein according to appendix 30, wherein the immunoglobulin is IgG, IgA, IgE, IgD, or IgM.
  • (Appendix 32) The protein according to appendix 31, wherein the IgG is IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3, or IgG4.
  • Appendix 33 33.
  • the first C intein and the first N intein are the C intein and N intein of an integral intein or a split intein, respectively, and/or the second C intein and the second N intein are , C intein and N intein of integral intein or split intein, respectively, according to any one of appendices 25 to 33.
  • ⁇ Nucleic acid> (Appendix 35) A nucleic acid encoding the protein according to any one of appendices 25 and 27 to 34.
  • (Appendix 38) comprising a nucleic acid encoding a first modified protein and/or a nucleic acid encoding a second modified protein
  • the first modified protein includes a first N intein capable of reacting with the first C intein and a first adduct added to the first monomer protein
  • the second modified protein includes a second N intein capable of reacting with the second C intein and a second adduct added to the second monomer protein,
  • the first adduct and the second adduct are different adducts
  • the expression vector according to attachment 38, wherein the first adduct and/or the second adduct are proteins.
  • the first modified protein includes a first N intein capable of reacting with the first C intein and a first adduct added to the first monomer protein
  • the second modified protein includes a second N intein capable of reacting with the second C intein and a second adduct added to the second monomer protein,
  • the first adduct and the second adduct are different adducts, Expression vector set according to appendix 42. (Appendix 44) 44.
  • a transformant comprising the nucleic acid according to appendix 35, the nucleic acid according to appendix 36, the expression vector according to any one of appendices 37 to 41, and/or the expression vector set according to any one of appendices 42 to 45.
  • a method for producing a protein including.
  • the expression step includes: A culturing step of culturing the transformant according to appendix 47; an isolation step of isolating the first monomeric protein and/or the second monomeric protein;
  • the manufacturing method according to appendix 48 comprising: ⁇ Screening method> (Additional note 50)
  • a production step of producing a candidate heterodimeric protein by reacting a dimeric protein containing a reaction tag with a modified protein that modifies the dimeric protein a detection step of contacting the candidate heterodimeric protein with a target and detecting a reaction between the candidate heterodimeric protein and the target; a selection step of selecting the candidate heterodimeric protein for which the reaction has been detected as a candidate substance that reacts with the target;
  • a method for screening a target-reactive heterodimeric protein wherein the manufacturing step is carried out by the manufacturing method according to any one of Supplementary Notes 1 to 15.
  • (Appendix 51) 51 The screening method according to appendix 50, wherein the reaction is binding.
  • (Appendix 52) 52 The screening method according to appendix 50 or 51, wherein the target is selected from the group consisting of a tumor antigen and a cluster of differentiation (CD) antigen.
  • the candidate heteroprotein includes a label, 53. The screening method according to any one of appendices 50 to 52, wherein in the detection step, the label is detected.
  • heterodimeric proteins such as bispecific antibodies that are composed only of domains composed of natural amino acid sequences can also be produced.
  • a desired modified peptide can be loaded onto a dimeric protein. Therefore, the present invention is extremely useful, for example, in the pharmaceutical field, the pharmaceutical manufacturing field, and the like.

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Abstract

二重特異性抗体等のヘテロダイマータンパク質について、天然のアミノ酸配列から構成されるドメインのみから構成されるヘテロダイマータンパク質も製造可能なヘテロダイマータンパク質の製造方法を提供する。　本発明の製造方法は、ヘテロダイマータンパク質の製造方法であって、 反応タグを含むダイマータンパク質を、前記ダイマータンパク質を修飾する修飾タンパク質と反応させて、ヘテロダイマータンパク質を製造する製造工程を含み、　前記反応タグを含むダイマータンパク質は、第１のモノマータンパク質と、第２のモノマータンパク質とを含み、　前記第１のモノマータンパク質は、第１の反応タグおよびダイマーを形成可能な第１のダイマー形成ドメインを、この順序で含み、　前記第１の反応タグは、結合タグおよび第１のＣインテインを含み、　前記第２のモノマータンパク質は、第２の反応タグおよび前記第１のダイマー形成ドメインとダイマーを形成可能な第２のダイマー形成ドメインを、この順序で含み、　前記第２の反応タグは、前記結合タグに結合可能な結合パートナーおよび第２のＣインテインを含み、　前記修飾タンパク質は、第１の修飾タンパク質と、第２の修飾タンパク質とを含み、　前記第１の修飾タンパク質は、前記第１のＣインテインと反応可能な第１のＮインテインおよび前記第１のモノマータンパク質に付加される第１の付加物を含み、　前記第２の修飾タンパク質は、前記第２のＣインテインと反応可能な第２のＮインテインおよび前記第２のモノマータンパク質に付加される第２の付加物を含み、　前記第１の付加物と、前記第２の付加物とは、異なる付加物であり、　前記第１のモノマータンパク質および前記第２のモノマータンパク質は、ダイマーを形成しており、 前記製造工程において、　前記第１の修飾タンパク質の前記第１のＮインテインが、前記第１のモノマータンパク質の第１のＣインテインと反応して、前記第１の修飾タンパク質の第１の付加物が、前記第１のモノマータンパク質に連結され、　前記第２の修飾タンパク質の前記第２のＮインテインが、前記第２のモノマータンパク質の第２のＣインテインと反応して、前記第２の修飾タンパク質の第２の付加物が、前記第２のモノマータンパク質に連結される。

Description

ヘテロダイマータンパク質の製造方法、ダイマータンパク質、モノマータンパク質、および標的反応性のヘテロダイマータンパク質のスクリーニング方法
　本発明は、ヘテロダイマータンパク質の製造方法、ダイマータンパク質、モノマータンパク質、および標的反応性のヘテロダイマータンパク質のスクリーニング方法に関する。
　多重特異性抗体では、１つの抗体分子が、異なる抗原に対して結合性を示す抗原結合ドメインを有し、対象の抗原を変更することにより、抗癌剤、血友病治療薬等の様々な医薬用途での開発が進められている。
　しかしながら、多重特異性抗体は、その製造効率が極めて低く、またその製造が困難であるという問題がある。例えば、二重特異性抗体は、２種類の重鎖（Ｈ鎖）および２種類の軽鎖（Ｌ鎖）から構成される。また、２種類のＨ鎖および２種類のＬ鎖を発現させ、前記二重特異性抗体を製造する場合、発現する抗体における２つのＨ鎖および２つのＬ鎖の組合せは１０通りとなり、目的とする二重特異性抗体以外に９種類もの不要な抗体が製造されることとなる（特許文献１）。
国際公開第２０１３／０６５７０８号公報
　そこで、二重特異性抗体では、前記抗体のＦｃ領域のアミノ酸配列に変異を導入し、異なる２つの重鎖が特異的に会合する技術（knob-into-holes）等が開発されている。
　しかしながら、これらの技術では、非天然のアミノ酸配列が抗体のＦｃ領域に存在するため、これらの領域に対する抗体が生成される可能性がある。
　そこで、本発明は、二重特異性抗体等のヘテロダイマータンパク質について、天然のアミノ酸配列から構成されるドメインのみから構成されるヘテロダイマータンパク質も製造可能なヘテロダイマータンパク質の製造方法の提供を目的とする。
　前記目的を達成するために、本発明の製造方法（以下、「製造方法」ともいう）は、ヘテロダイマータンパク質の製造方法であって、
反応タグを含むダイマータンパク質を、前記ダイマータンパク質を修飾する修飾タンパク質と反応させて、ヘテロダイマータンパク質を製造する製造工程を含み、
　前記反応タグを含むダイマータンパク質は、第１のモノマータンパク質と、第２のモノマータンパク質とを含み、
　　前記第１のモノマータンパク質は、第１の反応タグおよびダイマーを形成可能な第１のダイマー形成ドメインを、この順序で含み、
　　前記第１の反応タグは、結合タグおよび第１のＣインテインを含み、
　　前記第２のモノマータンパク質は、第２の反応タグおよび前記第１のダイマー形成ドメインとダイマーを形成可能な第２のダイマー形成ドメインを、この順序で含み、
　　前記第２の反応タグは、前記結合タグに結合可能な結合パートナーおよび第２のＣインテインを含み、
　前記修飾タンパク質は、第１の修飾タンパク質と、第２の修飾タンパク質とを含み、
　　前記第１の修飾タンパク質は、前記第１のＣインテインと反応可能な第１のＮインテインおよび前記第１のモノマータンパク質に付加される第１の付加物を含み、
　　前記第２の修飾タンパク質は、前記第２のＣインテインと反応可能な第２のＮインテインおよび前記第２のモノマータンパク質に付加される第２の付加物を含み、
　前記第１の付加物と、前記第２の付加物とは、異なる付加物であり、
　前記第１のモノマータンパク質および前記第２のモノマータンパク質は、ダイマーを形成しており、
前記製造工程において、
　前記第１の修飾タンパク質の前記第１のＮインテインが、前記第１のモノマータンパク質の第１のＣインテインと反応して、前記第１の修飾タンパク質の第１の付加物が、前記第１のモノマータンパク質に連結され、
　前記第２の修飾タンパク質の前記第２のＮインテインが、前記第２のモノマータンパク質の第２のＣインテインと反応して、前記第２の修飾タンパク質の第２の付加物が、前記第２のモノマータンパク質に連結される。
　本発明のタンパク質（以下、「ダイマータンパク質」ともいう）は、反応タグを含むダイマータンパク質を含み、
　前記反応タグを含むダイマータンパク質は、第１のモノマータンパク質と、第２のモノマータンパク質とを含み、
　　前記第１のモノマータンパク質は、第１の反応タグおよびダイマーを形成可能な第１のダイマー形成ドメインを含み、
　　前記第１の反応タグは、結合タグおよび第１のＮインテインと反応可能な第１のＣインテインを含み、
　　前記第２のモノマータンパク質は、第２の反応タグおよび前記第１のダイマー形成ドメインとダイマーを形成可能な第２のダイマー形成ドメインを、この順序で含み、
　　前記第２の反応タグは、前記結合タグに結合可能な結合パートナーおよび第２のＮインテインと反応可能な第２のＣインテインを含み、
　前記第１のモノマータンパク質および前記第２のモノマータンパク質は、ダイマーを形成している。
　本発明のタンパク質（以下、「第１のモノマータンパク質」ともいう）は、第１のモノマータンパク質を含み、
前記第１のモノマータンパク質は、第１の反応タグおよびダイマーを形成可能な第１のダイマー形成ドメインを、この順序で含み、
前記第１の反応タグは、結合パートナーと結合可能な結合タグおよび第１のＮインテインと反応可能な第１のＣインテインを含み、
前記第１のモノマータンパク質は、第２のモノマータンパク質とダイマーを形成可能であり、
前記第２のモノマータンパク質は、第２の反応タグおよび前記第１のダイマー形成ドメインとダイマーを形成可能な第２のダイマー形成ドメインを含み、
前記第２の反応タグは、前記結合タグと結合可能な結合パートナーおよび第２のＮインテインと反応可能な第２のＣインテインを含む。
　本発明のタンパク質（以下、「第２のモノマータンパク質」ともいう）は、第２のモノマータンパク質を含み、
前記第２のモノマータンパク質は、第２の反応タグおよびダイマーを形成可能な第２のダイマー形成ドメインを、この順序で含み、
前記第２の反応タグは、結合タグと結合可能な結合パートナーおよび第２のＮインテインと反応可能な第２のＣインテインを含み、
前記第２のモノマータンパク質は、第１のモノマータンパク質とダイマーを形成可能であり、
前記第１のモノマータンパク質は、第１の反応タグおよび前記第２のダイマー形成ドメインとダイマーを形成可能な第１のダイマー形成ドメインを、この順序で含み、
前記第１の反応タグは、前記結合パートナーと結合可能な結合タグおよび第１のＮインテインと反応可能な第１のＣインテインを含む。
　本発明の核酸は、前記本発明のダイマータンパク質、前記本発明の第１のモノマータンパク質、および／または、前記本発明の第２のモノマータンパク質をコードする。
　本発明の発現ベクターは、前記本発明の核酸を含む。
　本発明の標的反応性のヘテロダイマータンパク質のスクリーニング方法（以下、「スクリーニング方法」ともいう）は、反応タグを含むダイマータンパク質を、前記ダイマータンパク質を修飾する修飾タンパク質と反応させて、候補ヘテロダイマータンパク質を製造する製造工程と、
前記候補ヘテロダイマータンパク質を標的と接触させ、前記候補ヘテロダイマータンパク質と前記標的との反応を検出する検出工程と、
前記反応が検出された前記候補ヘテロダイマータンパク質を前記標的と反応する候補物質として選抜する選抜工程を含み、
前記製造工程は、前記本発明の製造方法により実施される。
　本発明によれば、二重特異性抗体等のヘテロダイマータンパク質について、天然のアミノ酸配列から構成されるドメインのみから構成されるヘテロダイマータンパク質も製造できる。
図１は、本発明の製造方法に用いるダイマータンパク質の構成要素及びヘテロダイマータンパク質の製造の各工程の一例を示す模式図である。 図２は、実施例１における各抗体断片およびＰＴＳ反応前後におけるタンパク質を示す写真である。 図３は、実施例１におけるＰＴＳ反応後およびカラム精製におけるタンパク質を示す写真である。 図４は、実施例１におけるゲル濾過クロマトグラフィーによるタンパク質の溶出パターンを示すグラフである。 図５は、実施例１におけるフローサイトメトリーによる二重特異性抗体のＣＤ３陽性細胞への結合を示すグラフである。 図６は、実施例１におけるフローサイトメトリーによる二重特異性抗体のＨＥＲ２陽性細胞への結合を示すグラフである。 図７は、実施例１における表面プラズモン共鳴法による二重特異性抗体のＨＥＲ２への結合維持を示すグラフである。
＜定義＞
　本明細書において、「タンパク質」は、未修飾アミノ酸（天然のアミノ酸）、修飾アミノ酸、および／または人工アミノ酸から構成されるペプチドのポリマーを意味する。前記ポリマーの形状は、例えば、直鎖、分岐、および環状等があげられる。前記タンパク質は、ペプチドまたはポリペプチドということもできる。
　本明細書において、「モノマータンパク質」は、他のタンパク質と結合していない状態、または他のタンパク質と会合していない状態のタンパク質を意味する。
　本明細書において、「ダイマータンパク質」は、２つのタンパク質またはタンパク質のサブユニットが、結合している状態または会合している状態のタンパク質の複合体を意味する。前記２つのタンパク質が同じタンパク質またはサブユニットである場合、前記ダイマータンパク質は、ホモダイマータンパク質ということもできる。また、前記２つのタンパク質が異なるタンパク質またはサブユニットである場合、前記ダイマータンパク質は、ヘテロダイマータンパク質ということもできる。
　本明細書において、「融合タンパク質」は、２つ以上の異なるタンパク質または異種のタンパク質の一部または全部がペプチド結合を介して結合（連結）したタンパク質を意味する。前記融合タンパク質は、天然の融合タンパク質でもよいし、人工の融合タンパク質でもよい。前記人工の融合タンパク質は、例えば、遺伝子工学的手法により設計されたタンパク質があげられる。
　本明細書において、「結合タグ」は、他の分子と特異的な結合性を有するポリペプチドまたは物質を意味する。
　本明細書において、「結合パートナー」は、前記結合タグと、特異的な結合性を有するポリペプチドまたは物質を意味する。
　本明細書において、「ドメイン」は、「タンパク質」、「ポリペプチド」、および／または、「ペプチド」において、立体構造または機能的にまとまった領域を意味する。
　本明細書において、「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片により実質的または部分的にコードされる、１または複数のポリペプチドを含むタンパク質を意味する。免疫グロブリン遺伝子は、例えば、κ、λ、α（α１、α２を含む）、γ（γ１、γ２、γ３、γ４を含む）、δ、εおよびμ等の定常領域をコードする遺伝子と、Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域等の無数の免疫グロブリン可変領域をコードしうる遺伝子とを含む。前記抗体は、例えば、重鎖および軽鎖を含む。前記軽鎖は、κおよびλを含み、それぞれ、κ鎖およびλ鎖を構成する。前記重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεを含み、それぞれ、免疫グロブリンのクラスであるＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを構成する。前記抗体は、四量体から構成される典型的な免疫グロブリン（抗体）の構造単位であってもよい。この場合、前記抗体は、２つの同一のポリペプチド鎖の対から構成され、各対は、１つの軽鎖（約２５ｋＤａ）と１つの重鎖（約５０～７０ｋＤａ）とから構成される。また、各鎖のＮ末端は、主に抗原認識に関与する約１００～１１０個またはそれ以上のアミノ酸から構成される可変領域を規定する。
　本明細書において、「抗原結合断片」は、抗体の抗原結合部位を含む一部または部分のポリペプチドを意味する。前記抗原結合断片は、抗体を化学的または酵素的処理によって取得できる。前記抗原結合断片は、組換え手段によって得ることもできる。前記抗原結合断片は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、および／または、Ｆｖ断片、ならびに、これらの誘導体があげられる。
　本明細書において、「重鎖抗体」は、２本の重鎖のみから構成される抗体を意味する。前記重鎖抗体は、軽鎖を含まない抗体ということもできる。
　本明細書において、「多重特異性抗体」は、２以上の抗原および／または２以上のエピトープに対して特異性を有する抗体または抗体誘導体を意味する。
　本明細書において、「インテイン」は、タンパク質のプロテアーゼ活性およびタンパク質のリガーゼ活性の両者を有する自己触媒酵素を意味する。前記インテインは、例えば、あるタンパク質において、タンパク質スプライシングによって、自身のアミノ酸配列を前記タンパク質から切り出し、残部のアミノ酸配列（エクステイン）をペプチド結合で連結するタンパク質である。前記「インテイン」は、例えば、タンパク質イントロンということもできる。
　本明細書において、「スプリット型インテイン」は、ＣインテインおよびＮインテインの２つの相補的なハーフインテインから構成されるインテインであり、前記Ｃインテインと前記Ｎインテインとは、密接に結合することで活性インテインを形成し、酵素活性を示すインテインを意味する。前記スプリット型インテインは、分離インテインともいう。
　本明細書において、「一体型インテイン」は、ＣインテインおよびＮインテインを含む１つのインテインであり、前記Ｃインテインと前記Ｎインテインとは、密接に結合することで活性インテインを形成し、酵素活性を示すインテインを意味する。
　本明細書において、「相補的なインテイン」は、インテインまたはスプリット型インテインのＣインテインおよびＮインテインとの組合せ（ペア）を意味する。
　本明細書において、「Ｃインテイン」は、インテインのＣ末端部分と相同性を有するインテインポリペプチドを意味する。前記Ｃインテインは、相補的なＮインテインと結合して、活性インテインを形成する。
　本明細書において、「Ｎインテイン」は、インテインのＮ末端部分と相同性を有するインテインポリペプチドを意味する。前記Ｎインテインは、相補的なＣインテインと結合して、活性インテインを形成する。
　本明細書において、「塩」は、水性溶媒において、電離可能な電解質を意味する。前記水性溶媒は、水を含む溶媒を意味する。
　本明細書において、「可溶化ドメイン」は、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質と融合すると、可溶化ドメインを有さないペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質として発現させた場合と比較して、形質転換体において発現されるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の発現量が増加（例えば、増大または促進）するポリペプチドを意味する。
　本明細書において、「精製」は、同定し、分離すること、自然状態での成分から回収すること、同定され、かつ分離された状態、および／または自然状態での成分から回収された状態を意味する。前記「精製」は、例えば、少なくとも１つの精製工程を得ることにより実施できる。前記精製は、単離ということもできる。
　本明細書において、「分離」は、目的物を、前記目的物を含む物から分けること、および／または分けた状態を意味する。前記分離は、遊離ということもできる。
　本明細書において、「核酸」は、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）、および／または、改変ヌクレオチドのポリマーを意味する。本明細書において、「核酸」が特定のタンパク質と組合わせて用いられる場合、前記「核酸」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチドのポリマーを意味する。前記核酸は、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ等があげられる。前記核酸は、例えば、一本鎖または二本鎖等であってもよい。前記核酸は、「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」と互いに読み替え可能である。
　本明細書において、「宿主」は、外来の核酸を導入される細胞、および／または、個体を意味する。前記宿主が細胞の場合、前記宿主は、宿主細胞ということもできる。
　本明細書において、「ベクター」および「発現ベクター」は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏにおいて、宿主または宿主細胞に送達される核酸を含む組換えプラスミドまたはウイルスを意味する。前記「ベクター」および「発現ベクター」は、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターがあげられる。
　本明細書において、「形質転換体」は、外来の核酸が導入された宿主を意味する。
　本明細書において、各タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの由来は、特に制限されず、任意の動物である。前記動物は、例えば、ヒトまたは非ヒト動物である。前記非ヒト動物は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サル、イルカ、アシカ等の哺乳類動物があげられる。
　以下、本発明について例をあげて説明するが、本発明は以下の例等に限定されるものではなく、任意に変更して実施できる。また、本発明における各説明は、特に言及がない限り、互いに援用可能である。なお、本明細書において、「～」という表現を用いた場合、その前後の数値または物理値を含む意味で用いる。また、本明細書において、「Ａおよび／またはＢ」という表現には、「Ａのみ」、「Ｂのみ」、「ＡおよびＢの双方」が含まれる。
＜ヘテロダイマータンパク質の製造方法＞
　ある態様において、本発明は、二重特異性抗体等のヘテロダイマータンパク質について、天然のアミノ酸配列から構成されるドメインのみから構成されるヘテロダイマータンパク質も製造可能なヘテロダイマータンパク質の製造方法、または、異なる付加物により修飾されたヘテロダイマータンパク質を製造可能な方法を提供する。本発明の製造方法は、ヘテロダイマータンパク質の製造方法であって、反応タグを含むダイマータンパク質を、前記ダイマータンパク質を修飾する修飾タンパク質と反応させて、ヘテロダイマータンパク質を製造する製造工程を含み、前記反応タグを含むダイマータンパク質は、第１のモノマータンパク質と、第２のモノマータンパク質とを含み、前記第１のモノマータンパク質は、第１の反応タグおよびダイマーを形成可能な第１のダイマー形成ドメインを、この順序で含み、前記第１の反応タグは、結合タグおよび第１のＣインテインを含み、前記第２のモノマータンパク質は、第２の反応タグおよび前記第１のダイマー形成ドメインとダイマーを形成可能な第２のダイマー形成ドメインを、この順序で含み、前記第２の反応タグは、前記結合タグに結合可能な結合パートナーおよび第２のＣインテインを含み、前記修飾タンパク質は、第１の修飾タンパク質と、第２の修飾タンパク質とを含み、前記第１の修飾タンパク質は、前記第１のＣインテインと反応可能な第１のＮインテインおよび前記第１のモノマータンパク質に付加される第１の付加物を含み、前記第２の修飾タンパク質は、前記第２のＣインテインと反応可能な第２のＮインテインおよび前記第２のモノマータンパク質に付加される第２の付加物を含み、前記第１の付加物と、前記第２の付加物とは、異なる付加物であり、前記第１のモノマータンパク質および前記第２のモノマータンパク質は、ダイマーを形成しており、前記製造工程において、前記第１の修飾タンパク質の前記第１のＮインテインが、前記第１のモノマータンパク質の第１のＣインテインと反応して、前記第１の修飾タンパク質の第１の付加物が、前記第１のモノマータンパク質に連結され、前記第２の修飾タンパク質の前記第２のＮインテインが、前記第２のモノマータンパク質の第２のＣインテインと反応して、前記第２の修飾タンパク質の第２の付加物が、前記第２のモノマータンパク質に連結される。
　前記第１のモノマータンパク質および前記第２のモノマータンパク質が、ホモダイマーを形成するタンパク質の場合、予め、前記第１の付加物と連結した第１のモノマータンパク質および前記第２の付加物と連結した第２のモノマータンパク質とを準備し、これらを結合させた場合、様々な組合せのダイマーが生じる。他方、本発明の製造方法では、前記ダイマータンパク質を形成している状態で、前記第１のモノマータンパク質に対して、前記第１のＮインテインおよび前記第１のＣインテインとの反応を利用して、前記第１の付加物を連結させる。また、本発明の製造方法では、前記ダイマータンパク質を形成している状態で、前記第２のモノマータンパク質に対して、前記第２のＮインテインおよび前記第２のＣインテインとの反応を利用して、前記第２の付加物を連結させる。このため、本発明の製造方法によれば、前記第１のモノマータンパク質および前記第２のモノマータンパク質が、ホモダイマーを形成するタンパク質であっても、前記第１の付加物が連結された第１のモノマータンパク質由来のタンパク質と、前記第２の付加物が連結された第２のモノマータンパク質由来のタンパク質とのヘテロダイマータンパク質を効率よく製造できる。
　本発明者らは、２つのモノマータンパク質についてダイマー化した状態で、それぞれのモノマータンパク質に対して特異的な結合反応を生じさせ、異なる付加物を連結することにより、異なる付加物が連結されたモノマータンパク質から構成されるヘテロダイマータンパク質を製造できるのではないかとの着想を得た。そして、本発明者らは、鋭意研究の結果、結合タグまたは結合パートナーと異なるインテインとが付加された２種類のモノマータンパク質、および前記異なるインテインと反応可能なインテインと前記モノマータンパク質への付加物とが連結された２種類の修飾タンパク質とを用いることで、上記着想を実施できることを見出し、本発明を確立するに至った。具体的には、本発明の製造方法は、図１に示すように、以下に説明するメカニズムによって、異なる付加物が連結されたモノマータンパク質から構成されるヘテロダイマータンパク質を製造できると推定される。なお、本発明は、以下に説明するメカニズムには何ら制限されない。
　図１（Ａ）に示すように、本発明の製造方法では、第１のモノマータンパク質１、第２のモノマータンパク質２、第１の修飾タンパク質３、および第２の修飾タンパク質４を用いて、ヘテロダイマータンパク質を製造できる。第１のモノマータンパク質１は、第１の反応タグ１１と第１のダイマー形成ドメイン１２とを、Ｎ末端側からこの順番で含む。また、第１の反応タグ１１は、結合タグ１３と、第１のＣインテイン１４とを、Ｎ末端側からこの順番で含む。第２のモノマータンパク質２は、第２の反応タグ２１と第２のダイマー形成ドメイン２２とを、Ｎ末端側からこの順番で含む。また、第２の反応タグ２１は、結合パートナー２３と、第２のＣインテイン２４とを、Ｎ末端側からこの順番で含む。また、第１の修飾タンパク質３は、第１のＮインテイン３１と第１の付加物３２とを、Ｎ末端側からこの順番で含む。第２の修飾タンパク質４は、第２のＮインテイン４１と第２の付加物４２とを、Ｎ末端側からこの順番で含む。
　まず、第１のモノマータンパク質１および第２のモノマータンパク質２を接触させることにより、図１（Ｂ）に示すように、第１のモノマータンパク質１と第２のモノマータンパク質２とがダイマーを形成したダイマータンパク質１０を準備する。つぎに、ダイマータンパク質１０を、第１の修飾タンパク質３および第２の修飾タンパク質４と接触させると、図１（Ｃ）に示すように、第１の修飾タンパク質３の第１のＮインテイン３１は、第１のモノマータンパク質１の第１のＣインテイン１４と活性インテインを形成して反応する（矢印Ｘ）。また、第２の修飾タンパク質４の第２のＮインテイン４１は、第２のモノマータンパク質２の第２のＣインテイン２４と活性インテインを形成して反応する（矢印Ｙ）。そして、第１のＣインテイン１４および第１のダイマー形成ドメイン１２間と、第１の付加物３２および第１のＮインテイン３１間との間で、ペプチド結合の組換えが生じ、第１の付加物３２のＣ末端側に第１のダイマー形成ドメイン１２が連結される。また、第２のＣインテイン２４および第２のダイマー形成ドメイン２２間と、第２の付加物４２および第２のＮインテイン４１間との間で、ペプチド結合の組換えが生じ、第２の付加物４２のＣ末端側に第２のダイマー形成ドメイン２２が連結される。この結果、図１（Ｄ）に示すように、ダイマーを形成する第１のダイマー形成ドメイン１２および第２のダイマー形成ドメイン２２が、異なる付加物３２、４２で修飾されたヘテロダイマータンパク質３０を製造できる。したがって、本発明の製造方法によれば、任意の付加物で修飾したヘテロダイマータンパク質を製造できると推定される。
　また、本発明の製造方法では、インテインを用いて、第１の付加物３２および第２の付加物４２を付加する。このため、得られたヘテロダイマータンパク質を構成するモノマータンパク質は、組換えタンパク質と同様に、Ｎ末端からＣ末端までペプチド結合を介して連結した融合タンパク質として、ヘテロダイマータンパク質を製造することができる。そこで、本発明の製造方法では、第１のダイマー形成ドメイン１２、第２のダイマー形成ドメイン２２、第１の付加物３２、および第２の付加物４２を、天然のアミノ酸配列、すなわち、アミノ酸変異または人工アミノ酸配列を含まないアミノ酸配列とすることにより、天然のアミノ酸配列のみから構成される複数ドメインが連結されたヘテロダイマータンパク質も製造できる。したがって、一例として、第１の付加物３２および第２の付加物４２を、それぞれ、異なる抗原に結合するＦａｂとし、第１のダイマー形成ドメイン１２および第２のダイマー形成ドメイン２２を、抗体のヒンジ領域とＦｃ領域のＣＨ２領域およびＣＨ３領域から構成されるタンパク質とすることにより、天然のアミノ酸配列から構成される二重特異性モノクローナル抗体を好適に製造できる。このように、本発明の製造方法によれば、例えば、前記ダイマー形成ドメインのアミノ酸配列が共通し、その他の部分のアミノ酸配列が異なる２種類のモノマータンパク質を用いてヘテロダイマータンパク質を製造する場合においても、目的とするモノマータンパク質間で特異的な結合または会合が生じるようなアミノ酸配列の変異を導入せずに、前記ヘテロダイマータンパク質を特異的に製造できる。
　なお、図１（Ａ）～（Ｄ）では、第１のダイマー形成ドメイン１２および第２のダイマー形成ドメイン２２のＮ末端側に、第１の付加物３２および第２の付加物４２を修飾する場合を例にあげて説明したが、本発明はこれに限定されず、第１のダイマー形成ドメイン１２および第２のダイマー形成ドメイン２２のＣ末端側に、第１の付加物３２および第２の付加物４２を修飾してもよい。この場合、第１のモノマータンパク質１は、第１の反応タグ１１と第１のダイマー形成ドメイン１２とを、Ｃ末端側からこの順番で含み、第１の反応タグ１１は、結合タグ１３および第１のＮインテイン３１を、Ｃ末端側からこの順番で含む。第２のモノマータンパク質２は、第２の反応タグ２１と第２のダイマー形成ドメイン２２とを、Ｃ末端側からこの順番で含み、第２の反応タグ２１は、結合パートナー２３および第２のＮインテイン４１を、Ｃ末端側からこの順番で含む。また、第１の修飾タンパク質３は、第１のＣインテイン１４と第１の付加物３２とを、Ｃ末端側からこの順番で含む。第２の修飾タンパク質４は、第２のＣインテイン２４と第２の付加物４２とを、Ｃ末端側からこの順番で含む。これらの点を除き、本発明の製造方法は、第１のダイマー形成ドメイン１２および第２のダイマー形成ドメイン２２のＣ末端側に、第１の付加物３２および第２の付加物４２を修飾することができ、以下の説明において、上記のように、各ドメインを読み替えてその説明を援用できる。
　本発明の製造方法において、反応タグを含むダイマータンパク質は、前記第１のモノマータンパク質および前記第２のモノマータンパク質がダイマー化することにより構成される。また、前記第１のモノマータンパク質および前記第２のモノマータンパク質は、例えば、後述の本発明のモノマータンパク質の製造方法で説明するように、遺伝子工学的手法により調製できる。このため、本発明の製造方法は、任意に、前記製造工程に先立ち、前記第１のモノマータンパク質と前記第２のモノマータンパク質と反応させて、ダイマーを形成する形成工程を含んでもよい。また、本発明の製造方法は、任意に、前記製造工程に先立ち、前記第１のモノマータンパク質および／または前記第２のモノマータンパク質を調製する調製工程と、前記第１のモノマータンパク質と前記第２のモノマータンパク質と反応させて、ダイマーを形成する形成工程とを含んでもよい。前記調製工程における調製方法は、後述の前記本発明の第１のモノマータンパク質、第２のモノマータンパク質、核酸、発現ベクター、形質転換体、およびモノマータンパク質の製造方法の説明を援用できる。
　前記形成工程では、前記第１のモノマータンパク質と前記第２のモノマータンパク質とを反応させる。これにより、図１（Ｂ）に示すように、前記形成工程では、前記第１のモノマータンパク質と前記第２のモノマータンパク質とがダイマーを形成し、前記反応タグを含むダイマータンパク質を調製または準備できる。前記第１のモノマータンパク質および前記第２のモノマータンパク質とは、前記結合タグおよび前記結合パートナーを介してヘテロダイマーを形成可能である。このため、前記形成工程は、後述の製造工程と並行して実施してもよい。
　前記形成工程における反応は、例えば、緩衝液、生理的食塩水、水等の水性溶媒の存在下で実施することが好ましい。前記第１のモノマータンパク質および前記第２のモノマータンパク質は、固体でもよいし、液体でもよいが、液体が好ましい。前記第１のモノマータンパク質および前記第２のモノマータンパク質が粉末等の固体である場合、前記第１のモノマータンパク質および前記第２のモノマータンパク質は、緩衝液、生理的食塩水、水等の水性溶媒に予め分散されていることが好ましい。また、前記第１のモノマータンパク質および前記第２のモノマータンパク質が液体である場合、前記第１のモノマータンパク質および前記第２のモノマータンパク質は、緩衝液、生理的食塩水、水等の水性溶媒を用いて予め希釈されてもよい。前記反応の具体例として、前記第１のモノマータンパク質を含む液体と、前記第２のモノマータンパク質を含む液体とを混合することにより実施できる。
　前記第１のモノマータンパク質および前記第２のモノマータンパク質として、前記調製工程で得られた前記第１のモノマータンパク質および前記第２のモノマータンパク質を用いる場合、前記第１のモノマータンパク質および前記第２のモノマータンパク質は、精製または粗精製のタンパク質でもよいし、前記第１のモノマータンパク質および／または前記第２のモノマータンパク質を発現する形質転換体または前記形質転換体の処理物でもよい。前記処理物は、例えば、ライセート、抽出物、破砕物、タンパク質調製物、またはこれらの粗精製物もしくは精製物等があげられる。前記処理物は、例えば、少なくとも１回の精製処理を行なった物でもよい。
　前記第１のモノマータンパク質は、例えば、前記第１の反応タグおよびダイマーを形成可能な第１のダイマー形成ドメインを、Ｎ末端側からこの順序で含む。前記第１の反応タグは、例えば、前記結合タグおよび前記第１のＣインテインを、Ｎ末端側からこの順序で含む。また、前記第２のモノマータンパク質は、例えば、前記第２の反応タグおよび前記第１のダイマー形成ドメインとダイマーを形成可能な第２のダイマー形成ドメインを、Ｎ末端側からこの順序で含む。前記第２の反応タグは、前記結合パートナーおよび前記第２のＣインテインを含む。前記第１のモノマータンパク質は、前記第１の反応タグを前記第１のダイマー形成ドメインのＮ末端側に配置することにより、前記第１のＣインテインと前記第１のＮインテインとの反応が生じた際に、前記第１のダイマー形成ドメインのＮ末端側に、前記第１の付加物を導入できる。また、前記第２のモノマータンパク質は、前記第２の反応タグを前記第２のダイマー形成ドメインのＮ末端側に配置することにより、前記第２のＣインテインと前記第２のＮインテインとの反応が生じた際に、前記第２のダイマー形成ドメインのＮ末端側に、前記第２の付加物を導入できる。
　前記形成工程では、前記第１のモノマータンパク質と前記第２のモノマータンパク質とのダイマー化は、例えば、（１）前記第１の反応タグと前記第２の反応タグとの結合、例えば、前記第１の反応タグの結合タグと、前記第２の反応タグの結合パートナーとの結合により生じてもよいし、（２）前記第１のダイマー形成ドメインと前記第２のダイマー形成ドメインとの結合により生じてもよいし、前記（１）および（２）の両者の結合により生じてもよいが、ダイマー形成能を向上できることから、前記（１）および（２）の両者の結合により生じることが好ましい。前記反応タグは、例えば、前記第１のモノマータンパク質および前記第２のモノマータンパク質において、前記モノマータンパク質および前記修飾タンパク質との結合および前記モノマータンパク質への付加物の付加反応に寄与するドメインということもできる。また、前記反応タグは、例えば、前記付加反応後に、前記モノマータンパク質から消失するドメインということもできる。
　前記ダイマーは、前記第１のモノマータンパク質と前記第２のモノマータンパク質との直接的な結合により形成されてもよいし、前記第１のモノマータンパク質と前記第２のモノマータンパク質との間接的な結合（会合）により形成されてもよいし、前記第１のモノマータンパク質と前記第２のモノマータンパク質との直接的な結合および間接的な結合の両者により形成されてもよい。前記直接的な結合は、共有結合であり、具体例として、アミノ酸間のアミド結合（ペプチド結合）、システイン間のジスルフィド結合等があげられる。前記間接的な結合は、非共有結合であり、具体例として、水素結合、疎水結合等があげられる。
　前記第１のダイマー形成ドメインおよび前記第２のダイマー形成ドメインは、各ドメインを含むタンパク質が共存した際に、条件依存的または条件非依存的に、ダイマーを形成可能なアミノ酸配列を採用できる。具体例として、前記第１のダイマー形成ドメインおよび前記第２のダイマー形成ドメインは、例えば、タンパク質二量体における各サブユニットまたはそのダイマーを形成するモチーフ配列のアミノ酸配列を利用できる。前記第１のダイマー形成ドメインおよび前記第２のダイマー形成ドメインは、タンパク質マルチマーにおける各サブユニットまたはそのダイマーを形成するモチーフ配列のアミノ酸配列を利用してもよい。前記タンパク質二量体は、ホモ二量体でもよいし、ヘテロ二量体でもよい。前記タンパク質二量体は、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ等の免疫グロブリン（抗体）；ＡＰ－１（ｃ－ｆｏｓおよびｃ－ｊｕｎ）、ｍｙｃ、ｍａｘ、ｍｄｘ１等のｍｙｃファミリータンパク質等のロイシンジッパーを含むタンパク質；Ｇタンパク質共役受容体；キネシン；上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）等のＥｒｂＢ受容体ファミリー、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、ニューロトロフィン（神経栄養因子）受容体、インスリン受容体、インスリン様増殖因子受容体、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、幹細胞因子（Stem cell factor）受容体等の受容体型チロシンキナーゼ；ＴＬＲ１～１１等のＴｏｌｌ様受容体；等があげられる。
　前記第１のダイマー形成ドメインおよび前記第２のダイマー形成ドメインとして、前記抗体のダイマー形成のモチーフ配列を利用する場合、前記第１のダイマー形成ドメインおよび前記第２のダイマー形成ドメインは、例えば、前記抗体のＦｃ領域のＣＨ２領域およびＣＨ３領域、または、前記抗体のＦｃ領域のＣＨ２領域およびＣＨ３領域ならびにヒンジ領域を含むアミノ酸配列を含む。前記第１のダイマー形成ドメインおよび前記第２のダイマー形成ドメインが前記抗体のＦｃ領域を含む場合、前記第１のダイマー形成ドメインおよび前記第２のダイマー形成ドメインは、前記抗体のＦｃ領域の全てまたは一部のアミノ酸配列を含む。前記第１のダイマー形成ドメインおよび前記第２のダイマー形成ドメインが前記抗体のＦｃ領域のＣＨ２領域およびＣＨ３領域とヒンジ領域とを含む場合、前記第１のダイマー形成ドメインおよび前記第２のダイマー形成ドメインは、前記抗体のＦｃ領域のＣＨ２領域およびＣＨ３領域の全てまたは一部のアミノ酸配列と、前記抗体のヒンジ領域の全てまたは一部のアミノ酸配列とを含み、好ましくは、前記抗体のＦｃ領域のＣＨ２領域およびＣＨ３領域の全てのアミノ酸配列と、前記抗体のヒンジ領域の全てまたは一部のアミノ酸配列とを含む。前記第１のダイマー形成ドメインおよび前記第２のダイマー形成ドメインが前記抗体のＦｃ領域のＣＨ２領域およびＣＨ３領域とヒンジ領域とを含む場合、前記第１のダイマー形成ドメインおよび前記第２のダイマー形成ドメインは、例えば、前記抗体のＦｃ領域のＣＨ２領域およびＣＨ３領域とヒンジ領域とのアミノ酸配列において、連続するアミノ酸配列を含む。前記Ｆｃ領域、または前記Ｆｃ領域のＣＨ２領域およびＣＨ３領域とヒンジ領域とのアミノ酸配列は、天然のアミノ酸配列、すなわち、変異を含まないアミノ酸配列でもよいし、非天然のアミノ酸配列、すなわち、変異または人口のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列でもよい。
　前記抗体は、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭであり、好ましくは、ＩｇＧである。前記ＩｇＧは、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。前記抗体は、例えば、動物由来の抗体であり、具体例として、ヒト抗体、マウス抗体、トリ抗体、ラット抗体、ウサギ抗体等があげられる。前記第１のダイマー形成ドメインおよび前記第２のダイマー形成ドメインは、好ましくは、ヒト由来抗体であり、より好ましくは、ヒト由来ＩｇＧである。
　前記ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４のアミノ酸配列としては、例えば、それぞれ、UniProtのアクセッション番号P01857、P01859、P01860、P01861で登録されているアミノ酸配列を参照できる。
　前記第１のダイマー形成ドメインおよび前記第２のダイマー形成ドメインとして、前記抗体のダイマー形成のモチーフ配列を利用する場合、前記抗体は、Ｆｃ領域が改変された抗体でもよい。この場合、前記第１のダイマー形成ドメインおよび前記第２のダイマー形成ドメインは、前記Ｆｃ領域の改変体のＦｃ領域、または、前記Ｆｃ領域の改変体のＦｃ領域およびヒンジ領域を含むアミノ酸配列を含んでもよい。前記Ｆｃ領域の改変体は、例えば、Ｆｃ領域のアミノ酸配列が改変され、標的分子への結合能が付与されたＦｃａｂ（Fc antigen binding、参考文献１および５）、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域のアミノ酸配列が改変され、六量体形成能が付与されたＩｇＧヘキサマー（IgG Hexamer、参考文献２～４）、ＤＡＦ（Dual Action Fab、参考文献５）、Charge pair（Amgen社、参考文献５）、SEEDbody（参考文献５）、Knobs-in-holes（参考文献５）、DVI-IgG（参考文献５）等があげられる。
参考文献１：G. Wozniak-Knopp et al., “Introducing antigen-binding sites in structural loops of immunoglobulin constant domains: Fc fragments with engineered HER2/neu-binding sites and antibody properties”, Protein Engineering, Design and Selection, Volume 23, Issue 4, April 2010, Pages 289-297
参考文献２：Sopp, J.M. et al., “On-target IgG hexamerisation driven by a C-terminal IgM tail-piece fusion variant confers augmented complement activation.”, Commun. Biol., 4, 1031 (2021).
参考文献３：de Jong RN et al., “A Novel Platform for the Potentiation of Therapeutic Antibodies Based on Antigen-Dependent Formation of IgG Hexamers at the Cell Surface.”, PLoS. Biol. (2016) 14(1): e1002344.
参考文献４： Christoph A. Diebolder et al., “Complement Is Activated by IgG Hexamers Assembled at the Cell Surface”, Science, 343 (6176), pages 1260-1263
参考文献５：Christoph Spiess et al., “Alternative molecular formats and therapeutic applications for bispecific antibodies”, Molecular Immunology, Volume 67, Issue 2, Part A, 2015, Pages 95-106
　前記第１のダイマー形成ドメインおよび前記第２のダイマー形成ドメインとして、前記抗体のダイマー形成のモチーフ配列を利用する場合、前記抗体は、多重特異性抗体でもよい。この場合、前記第１のダイマー形成ドメインおよび前記第２のダイマー形成ドメインは、例えば、前記多重特異性抗体のＦｃ領域、または、前記Ｆｃ領域のＣＨ２領域およびＣＨ３領域ならびにヒンジ領域と、前記Ｆｃ領域のＣ末端に付加されたドメインとを含むアミノ酸配列を含んでもよい。前記多重特異性抗体は、例えば、IgG-scFv（参考文献５）、IgG(L, H)-scFv（参考文献５）、IgG(H)-V（参考文献５）、KIH IgG-scFab（参考文献５）、IgG-2scFv（参考文献５）、Intrabody（参考文献５）、Tetravalent HCAb（参考文献５）等があげられる。
　前記結合タグおよび前記結合パートナーは、前記結合タグを含むタンパク質および前記結合パートナーを含むタンパク質が共存した際に、条件依存的または条件非依存的に、前記結合タグと前記結合パートナーとの結合が生じる分子である。前記結合タグと前記結合パートナーとの結合は、直接的な結合でもよいし、間接的な結合でもよい。
　前記結合タグと前記結合パートナーとの結合とが直接的な結合の場合、前記結合タグおよび前記結合パートナーは、例えば、自発的に共有結合を形成可能なペプチドタグおよびペプチド、または他の分子の修飾活性により共有結合を形成可能なペプチドタグおよびペプチドを利用できる。
　前記自発的に共有結合を形成可能なペプチドタグおよびペプチドを利用する場合、前記結合タグおよび前記結合パートナーは、例えば、化膿レンサ球菌表面タンパク質（ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ、配列番号１）および前記ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒと結合可能なペプチドタグ（ＳｐｙＴａｇ、配列番号２）またはこれらの改変体等があげられる。前記ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒおよび前記ＳｐｙＴａｇの改変体は、例えば、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ２およびＳｐｙＴａｇ２（参考文献６）、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ３およびＳｐｙＴａｇ３（参考文献７）、SnoopCatcherおよびSnoopTag（参考文献８）等があげられる。
参考文献６： Anthony H. Keeble et al., “Evolving Accelerated Amidation by SpyTag/SpyCatcher to Analyze Membrane Dynamics”, Angew. Chem. Int. Ed., 2017, 56, pages 16521 - 16525
参考文献７：Anthony H. Keeble et al., “Approaching infinite affinity through engineering of Peptide-protein interaction”, PNAS, 2019, vol. 116, No. 52, pages 26523-26533
参考文献８：Veggiani G, Nakamura T, Brenner MD, Gayet RV, Yan J, Robinson CV, Howarth M. Programmable polyproteams built using twin peptide superglues. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Feb 2;113(5):1202-7. doi: 10.1073/pnas.1519214113. 
化膿レンサ球菌表面タンパク質（SpyCatcher）のアミノ酸配列（配列番号１）
DSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVN
SpyTagのアミノ酸配列（配列番号２）
AHIVMVDAYKPTK
　前記他の分子の修飾活性により共有結合を形成可能なペプチドタグおよびペプチドを利用する場合、前記結合タグおよび前記結合パートナーは、例えば、ＫタグおよびＱタグ等があげられる。前記Ｋタグおよび前記Ｑタグは、例えば、細菌由来のトランスグルタミナーゼを用いて、前記ＫタグのＮ末端リジン残基と、前記ＱタグのＮ末端のグルタミン酸が架橋することにより、共有結合を形成できる。
　前記結合タグと前記結合パートナーとの結合とが間接的な結合の場合、前記結合タグおよび前記結合パートナーは、例えば、アフィニティータグおよび前記アフィニティータグに結合する分子を利用できる。前記結合タグおよび前記結合パートナーは、例えば、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である。前記結合タグは、例えば、Ｈｉｓ－タグ（Ｈｉｓ×６）、Ｈｉｓ－Ｓｔｒｅｐ－タグ、ｓｔｒｅｐ－タグ、アビジンタグ、ｆｌａｇ（商標）－タグ、ＨＡ（ヘマグルチニン）－タグ、Ｔ７－タグ、Ｖ５－ペプチド－タグ、ＧＳＴ（グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ）－タグ、ＣＢＰ（カルモジュリン結合ペプチド）－タグ、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）－タグ、Ｍｙｃ－タグ等があげられる。前記結合パートナーが、抗体もしくはその抗原結合断片、またはこれらの誘導体等の標的分子に特異的な結合を示す分子の場合、前記結合タグは、前記特異的な結合を示す分子が結合可能な任意のアミノ酸配列からなるペプチドとしてもよい。
　前記結合パートナーは、前記結合タグの種類に応じて適宜設定できる。具体例として、前記結合パートナーは、前記結合タグを認識する抗体もしくはその抗原結合断片、またはこれらの誘導体；アプタマー等の核酸分子；グルタチオン、カルモジュリン；マンノース等の糖鎖；ニッケル、コバルト、亜鉛等の金属またはそのイオン；等があげられる。
　前記結合タグと前記結合パートナーとの組合せは、前記結合タグと前記結合パートナーとが結合可能な組合せであればよい。具体例として、前記結合タグがＨｉｓ－タグを含む場合、前記結合パートナーは、例えば、ニッケルである。また、前記結合タグがｓｔｒｅｐ－タグまたはアビジンタグを含む場合、前記結合パートナーは、例えば、ビオチンを含む。前記結合タグがｆｌａｇ（商標）－タグ、ＨＡ－タグ、Ｔ７－タグ、Ｖ５－ペプチド－タグ、および／またはＭｙｃ－タグ等のエピトープタグを含む場合、前記結合パートナーは、例えば、各エピトープタグに対する抗体もしくはその抗原結合断片、またはこれらの誘導体等があげられる。前記結合タグがＧＳＴ－タグを含む場合、前記結合パートナーは、例えば、グルタチオンがあげられる。前記結合タグＣＢＰ－タグを含む場合、前記結合パートナーは、例えば、カルモジュリンがあげられる。前記結合タグがＭＢＰ－タグを含む場合、前記結合パートナーは、例えば、マンノースがあげられる。
　前記結合タグおよび前記結合パートナーは、前記結合タグおよび前記結合パートナー間の結合能を維持する範囲での機能等価物でもよい。前記結合タグまたは前記結合パートナーがペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である場合、前記機能等価物は、例えば、前記結合タグまたは前記結合パートナーの基準となるアミノ酸配列に対して、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、対応する結合タグまたは結合パートナーとの結合能を有するポリペプチドがあげられる。前記機能等価物は、例えば、前記結合タグおよび前記結合パートナーの基準となるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、対応する結合タグまたは結合パートナーとの結合能を有するポリペプチドがあげられる。前記１もしくは数個は、例えば、１～４４個、１～３３個、１～２２個、１～１１個、１～８個、１～６個、１～４個、１～３個、１または２個、１個である。前記置換は、例えば、保存的置換であることが好ましい。
　前記第１のモノマータンパク質において、前記結合タグは、１つでもよいし、複数でもよい。後者の場合、前記結合タグは、１種類でもよいし、複数種類でもよい。前記第１のモノマータンパク質において、前記第１のモノマータンパク質のＮ末端に第１の付加物を修飾（付加）する場合、前記結合タグは、前記第１のダイマー形成ドメインのＮ末端側に配置されることが好ましい。
　前記第２のモノマータンパク質において、前記結合パートナーは、１つでもよいし、複数でもよい。後者の場合、前記結合パートナーは、１種類でもよいし、複数種類でもよい。前記第２のモノマータンパク質において、前記第２のモノマータンパク質のＮ末端に第２の付加物を修飾（付加）する場合、前記結合パートナーは、前記第２のダイマー形成ドメインのＮ末端側に配置されることが好ましい。前記結合パートナーおよび前記結合パートナーの数は、同じでも異なってもよいが、同じことが好ましい。
　前記第１のモノマータンパク質および前記第２のモノマータンパク質において、前記結合タグと前記結合パートナーとは、交換可能であり、上述の説明における組合せを交換して使用してもよい。
　前記第１のＣインテインおよび前記第１のＮインテインは、前記第１のＣインテインを含む第１のモノマータンパク質および前記第１のＮインテインを含む第１の修飾タンパク質が共存した際に、条件依存的または条件非依存的に、前記結合タグと前記結合パートナーとの結合が生じる分子である。また、前記第２のＣインテインおよび前記第２のＮインテインは、前記第２のＣインテインを含む第２のモノマータンパク質および前記第２のＮインテインを含む第２の修飾タンパク質が共存した際に、条件依存的または条件非依存的に、前記結合タグと前記結合パートナーとの結合が生じる分子である。以下、前記第１のＣインテイン、前記第１のＮインテイン、前記第２のＣインテイン、および前記第２のＮインテインに使用可能なインテインについて併せて説明する。
　本発明において、前記インテインを構成するＣインテインおよびＮインテインは、例えば、一体型インテインから設計してもよいし、スプリット型インテインを用いてもよい。
　前記一体型インテインは、例えば、gp41-1、gp41-8、NrdJ-1、SspGyrB、Cfa等があげられる。前記スプリット型インテインは、例えば、ＤｎａＥ（シアノバクテリア由来ＤＮＡポリメラーゼIIIの触媒サブユニットα、dnaE-nおよびdnaE-c）、ＭＣＭ２（配列番号３、アーキアHalorhabdus utahensis DSM 12940由来Hut MCM-2インテイン、Uniprot: C7NUH7の部分配列）等があげられる。下記配列番号３のアミノ酸配列において、括弧で囲った領域が、Ｎ末端側から、Ｎインテイン、削除領域、およびＣインテインに対応する（参考文献９）。
参考文献９：Ciragan A. et al., “Salt-inducible Protein Splicing in cis and trans by Inteins from Extremely Halophilic Archaea as a Novel Protein-Engineering Tool.” J Mol Biol. 2016 Nov 20;428(23):4573-4588. doi: 10.1016/j.jmb.2016.10.006. Epub 2016 Oct 6. PMID: 27720988.
ＭＣＭ２のアミノ酸配列（配列番号３）
[CVTGDTLVQAGDGRRRIRELAGETAEAGSIEELPNGRTIRDVDIDVWTMTDDETLTRRPVTAIHEYDAPETLYEVTLSTGEEVTVTPDHPFFIEQASGRVETPAEDLQPGDLVFVPEGSAMATDG][GIAQIDTSSDRLGPAESGL][GDIGLRTIENVESVPDHDYDSVYDLTVEGTHNFLANGMVVHN
　前記インテインがＭＣＭ２の場合、前記ＭＣＭ２由来のＣインテインおよびＮインテインとしては、下記配列番号４のアミノ酸配列からなるＣインテインおよび配列番号５のアミノ酸配列からなるＮインテインがあげられる。
ＭＣＭ２由来Ｃインテインのアミノ酸配列（配列番号４）
GIAQIDTSSDRLGPAESGL/GDIGLRTIENVESVPDHDYDSVYDLTVEGTHNFLANGMVVHN
ＭＣＭ２由来Ｎインテインのアミノ酸配列（配列番号５）
CVTGDTLVQAGDGRRRIRELAGETAEAGSIEELPNGRTIRDVDIDVWTMTDDETLTRRPVTAIHEYDAPETLYEVTLSTGEEVTVTPDHPFFIEQASGRVETPAEDLQPGDLVFVPEGSAMATD
gp41-1由来Ｃインテイン（配列番号６）
MMLKKILKIEELDERELIDIEVSGNHLFYANDILTHNSAG
gp41-1由来Ｎインテイン（配列番号７）
SGYCLDLKTQVQTPQGMKEISNIQVGDLVLSNTGYNEVLNVFPKSKKKSYKITLEDGKEIICSEEHLFPTQTGEMNISGGLKEGMCLYVKE
Cfa由来Ｃインテイン（配列番号８）
VKIISRKSLGTQNVYDIGVEKDHNFLLKNGLVASNC
Cfa由来Ｎインテイン（配列番号９）
CLSYDTEILTVEYGFLPIGKIVEERIECTVYTVDKNGFVYTQPIAQWHNRGEQEVFEYCLEDGSIIRATKDHKFMTTDGQMLPIDEIFERGLDLKQVDGLP
　前記インテインは、条件依存的に結合反応が生じるインテイン（条件依存的インテイン）であってもよい。前記条件依存的インテインは、例えば、一定条件下において、前記インテイン、および／または、前記ＣインテインおよびＮインテインの結合反応が生じるインテインということもできる。前記条件依存的インテインは、例えば、ＭＣＭ２、Halobacterium salinarum NRC-1 (ATCC 700922)由来 HsaPolIIおよびHsaCDC21の組合せ（参考文献９参照）等の塩濃度依存的インテイン；温度依存的インテイン（参考文献１０参照）等があげられる。前記塩濃度依存的インテインは、例えば、塩濃度が相対的に高くなると、前記インテイン、および／または、前記ＣインテインおよびＮインテインの結合反応が生じる、すなわち、結合反応が生じる確率が上昇するインテインである。前記塩濃度依存的インテインは、塩濃度が一定濃度になると結合反応が生じるインテインであってもよい。前記塩濃度依存的インテインは、塩のイオン強度依存的に結合反応が生じると推定される。このため、前記塩濃度依存的インテインの結合反応の発生に用いる塩は、特に制限されず、任意の塩を用いることができる。前記塩は、例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム等の塩化物；硫酸ナトリウム、硫酸カルシウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム等の硫酸塩；硝酸ナトリウム、硝酸カルシウム、硝酸カリウム、硝酸マグネシウム等の硝酸塩；炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、炭酸カリウム、炭酸マグネシウム等の炭酸塩；リン酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸カリウム、リン酸マグネシウム等のリン酸塩；等があげられる。前記塩濃度依存的インテインがＭＣＭ２の場合、前記塩は、塩化ナトリウムが好ましい。
参考文献１０：Zeidler, M. et al. “Temperature-sensitive control of protein activity by conditionally splicing inteins.” Nat Biotechnol 22, 871-876 (2004). https://doi.org/10.1038/nbt979
　前記インテインは、そのプロテアーゼ活性およびリガーゼ活性を維持する範囲での機能等価物でもよい。前記機能等価物は、例えば、インテインの基準となるアミノ酸配列に対して、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、プロテアーゼ活性およびリガーゼ活性を有するポリペプチドがあげられる。前記機能等価物は、例えば、インテインの基準となるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、プロテアーゼ活性およびリガーゼ活性を有するポリペプチドがあげられる。前記１もしくは数個は、例えば、１～４４個、１～３３個、１～２２個、１～１１個、１～８個、１～６個、１～４個、１～３個、１または２個、１個である。前記置換は、例えば、保存的置換であることが好ましい。
　前記第１のモノマータンパク質および前記第２のモノマータンパク質におけるＣインテインの数は、１つでもよいし、複数でもよいが、効率よく、前記第１のモノマータンパク質および前記第２のモノマータンパク質を修飾できることから、好ましくは、１つである。
　前記第１のモノマータンパク質のＮ末端に第１の付加物を修飾（付加）する場合、前記第１のＣインテインは、前記第１のダイマー形成ドメインのＮ末端側に配置されることが好ましい。前記第２のモノマータンパク質において、前記第２のモノマータンパク質のＮ末端に第２の付加物を修飾（付加）する場合、前記結合パートナーは、前記第２のダイマー形成ドメインのＮ末端側に配置されることが好ましい。
　前記第１のＣインテインおよび前記第２のＣインテインは、例えば、それぞれ、前記第１のＮインテインおよび前記第２のＮインテインと反応可能に構成されている。これにより、前記第１の修飾タンパク質は、前記第１のモノマータンパク質を修飾（改変）可能に構成でき、かつ前記第２の修飾タンパク質は、前記第２のモノマータンパク質を修飾（改変）可能に構成できる。このため、前記第１のＣインテインおよび前記第２のＣインテインは、異なるインテインに由来するＣインテインであることが好ましい。この場合、前記第１のＣインテインと、前記第２のＣインテインとは、異なるＣインテインを含む。また、前記第１のＣインテインと前記第１のＮインテインとは、例えば、同じインテインに由来する。前記第２のＣインテインと前記第２のＮインテインとは、例えば、同じインテインに由来する。
　前記第１のモノマータンパク質において、前記第１の反応タグおよび前記第１のダイマー形成ドメインの順序は、例えば、前記第１の修飾タンパク質における第１付加物の付加位置に応じて設定できる。前記第１の付加物を前記第１のダイマー形成ドメインのＮ末端側に付加する場合、前記第１のモノマータンパク質において、前記第１の反応タグおよび前記第１のダイマー形成ドメインは、Ｎ末端側からこの順序で配置される。また、前記第１の付加物を前記第１のダイマー形成ドメインのＣ末端側に付加する場合、前記第１のモノマータンパク質において、前記第１のダイマー形成ドメインおよび前記第１の反応タグは、Ｎ末端側からこの順序で配置される。
　前記第１の反応タグにおいて、前記結合タグおよび前記第１のＣインテインの順序は、例えば、前記第１の修飾タンパク質における第１付加物の付加位置に応じて設定できる。前記第１の付加物を前記第１のダイマー形成ドメインのＮ末端側に付加する場合、前記結合タグおよび前記第１のＣインテインは、Ｎ末端側からこの順序で配置される。前記第２の反応タグにおいて、前記結合パートナーおよび前記第２のＣインテインの順序は、例えば、前記第２の修飾タンパク質における第２付加物の付加位置に応じて設定できる。前記第２の付加物を前記第２のダイマー形成ドメインのＮ末端側に付加する場合、前記結合パートナーおよび前記第２のＣインテインは、Ｎ末端側からこの順序で配置される。
　前記第１のモノマータンパク質において、前記結合タグ、前記第１のＣインテイン、および前記第１のダイマー形成ドメインの順序は、例えば、前記第１の修飾タンパク質における第１付加物の付加位置に応じて設定できる。前記第１の付加物を前記第１のダイマー形成ドメインのＮ末端側に付加する場合、前記結合タグ、前記第１のＣインテイン、および前記第１のダイマー形成ドメインは、Ｎ末端側からこの順序で配置される。また、前記第２のモノマータンパク質において、前記結合パートナー、前記第２のＣインテイン、および前記第２のダイマー形成ドメインの順序は、例えば、前記第２の修飾タンパク質における第２付加物の付加位置に応じて設定できる。前記第２の付加物を前記第２のダイマー形成ドメインのＮ末端側に付加する場合、前記結合パートナー、前記第２のＣインテイン、および前記第２のダイマー形成ドメインは、Ｎ末端側からこの順序で配置される。
　前記第１のモノマータンパク質において、前記結合タグ、前記第１のＣインテイン、および前記第１のダイマー形成ドメインは、それぞれが直接的または間接的に結合（連結）している。前記ヘテロダイマータンパク質として、天然のアミノ酸配列のみから構成される複数ドメインが連結されたヘテロダイマータンパク質を製造する場合、前記第１のＣインテインおよび前記第１のダイマー形成ドメインは、直接的に連結していることが好ましい。
　前記第２のモノマータンパク質において、前記結合パートナー、前記第２のＣインテイン、および前記第２のダイマー形成ドメインは、それぞれが直接的または間接的に結合（連結）している。前記ヘテロダイマータンパク質として、天然のアミノ酸配列のみから構成される複数ドメインが連結されたヘテロダイマータンパク質を製造する場合、前記第２のＣインテインおよび前記第２のダイマー形成ドメインは、直接的に連結していることが好ましい。
　前記直接的な結合は、あるポリペプチドまたはドメインのＮ末端またはＣ末端のアミノ酸が、他のポリペプチドまたはドメインのＣ末端またはＮ末端のアミノ酸とペプチド結合を形成して結合していることを意味する。他方、前記間接的な結合は、あるポリペプチドまたはドメインのＮ末端またはＣ末端のアミノ酸が、リンカーペプチド（ペプチドリンカー）を介して、他のポリペプチドまたはドメインのＣ末端またはＮ末端のアミノ酸と結合していることを意味する、すなわち、あるポリペプチドまたはドメインのＮ末端またはＣ末端のアミノ酸が、前記リンカーペプチドのＣ末端またはＮ末端のアミノ酸とペプチド結合を形成して結合し、かつ前記リンカーペプチドの他端のアミノ酸と他のポリペプチドまたはドメインのＮ末端またはＣ末端のアミノ酸と結合していることを意味する。前記リンカーペプチドの長さは、例えば、５～１５アミノ酸である。前記リンカーペプチドは、公知のリンカーペプチドを使用でき、具体例として、ＧＳリンカー（ＧＳ、ＧＧＳ、またはＧＧＧＧＳ（配列番号１０））、ＧＳリンカーが繰り返したリンカーペプチド（［ＧＳ］ｌ、［ＧＧＳ］ｍ、または［ＧＧＧＧＳ］ｎ（ｌ、ｍ、およびｎは、それぞれ、２以上の整数））、ＧＧＧＳＧＧ（配列番号１１）等があげられる。
　本発明において、前記ヘテロダイマータンパク質が多重特異性抗体である場合、前記ダイマータンパク質は、例えば、前記免疫グロブリン（抗体）のＦｃ領域のＣＨ２領域およびＣＨ３領域、または、前記免疫グロブリンのヒンジ領域の一部または全部と前記免疫グロブリンのＦｃ領域のＣＨ２領域およびＣＨ３領域とを含む。この場合、前記第１のモノマータンパク質の第１のダイマー形成ドメインおよび前記第２のモノマータンパク質の第２のダイマー形成ドメインは、例えば、前記免疫グロブリン（抗体）のＦｃ領域のＣＨ２領域およびＣＨ３領域、または、前記免疫グロブリンのヒンジ領域の一部または全部と前記免疫グロブリンのＦｃ領域のＣＨ２領域およびＣＨ３領域のアミノ酸配列を含む。前記免疫グロブリンは、例えば、ヒト抗体であり、好ましくは、ヒトＩｇＧである。
　前記第１のモノマータンパク質は、例えば、前記第１の反応タグのＮ末端側に、可溶化ドメイン、シグナルペプチド等の他のポリペプチドを含んでもよい。また、前記第２のモノマータンパク質は、例えば、前記第２の反応タグのＮ末端側に、可溶化ドメイン、シグナルペプチド等の他のポリペプチドを含んでもよい。前記可溶化ドメインは、前記ポリペプチドまたはタンパク質と融合すると、前記可溶化ドメインを含有しないポリペプチドまたはタンパク質として発現した場合と比較して、後述の形質転換体において発現される第１のモノマータンパク質または第２のモノマータンパク質の発現量が、少なくとも１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または１００％以上増大させるポリペプチドであることが好ましい。前記可溶化ドメインは、例えば、タンパク質またはその部分ポリペプチドがあげられる。具体例として、前記可溶化ドメインは、例えば、ＧＳＴ、ＭＢＰ、チオレドキシン、抗体、一本鎖抗体等の抗体改変体等があげられる。
　前記第１のモノマータンパク質が前記可溶化ドメインを含む場合、前記第１のモノマータンパク質における可溶化ドメインの数は、１つでもよいし、複数でもよい。後者の場合、前記可溶化ドメインは、１種類でもよいし、複数種類でもよい。
　前記第２のモノマータンパク質が前記可溶化ドメインを含む場合、前記第２のモノマータンパク質における可溶化ドメインの数は、１つでもよいし、複数でもよい。後者の場合、前記可溶化ドメインは、１種類でもよいし、複数種類でもよい。
　前記第１のモノマータンパク質および前記第２のモノマータンパク質は、例えば、前記第１のモノマータンパク質、前記第２のモノマータンパク質、またはヘテロダイマータンパク質の精製に用いる精製タグを含んでもよい。前記精製タグは、例えば、前述のアフィニティータグを使用できる。前記精製タグは、例えば、前記第１のダイマー形成ドメインならびに前記第２のダイマー形成ドメインのＮ末端（側）およびＣ末端（側）の少なくとも一方に付加できる。
　前記形成工程における反応条件は、前記第１のモノマータンパク質および前記第２のモノマータンパク質がダイマーを形成可能な条件であればよく、前記結合タグおよび前記結合パートナーの反応条件（結合条件）、および／または、前記第１のダイマー形成ドメインおよび前記第２のダイマー形成ドメインの反応条件（結合条件）を考慮して、適宜設定できる。具体例として、前記形成工程における反応温度は、例えば、４～５０℃または１０～４５℃である。前記形成工程における反応時間は、例えば、０．１～２４時間または０．５～１２時間である。前記形成工程の反応ｐＨは、例えば、ｐＨ４～１０またはｐＨ５～９である。
　前記結合タグおよび前記結合パートナーが直接的に結合する場合、前記形成工程の反応条件は、前記結合タグおよび前記結合パートナー間の結合が十分に形成される反応条件に設定できる。具体例として、前記結合タグおよび前記結合パートナーが前記ＳｐｙＴａｇおよび前記ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒである場合、前記形成工程は、例えば、ｐＨ５～８、４～３７℃、緩衝液存在下で実施できる。前記結合タグおよび前記結合パートナー間の結合が酵素反応により生成される場合、前記形成工程の反応条件は、例えば、前記酵素反応に用いる酵素の活性条件に基づき設定できる。
　前記第１のダイマー形成ドメインおよび前記第２のダイマー形成ドメインが直接的に結合する場合、前記形成工程の反応条件は、前記第１のダイマー形成ドメインおよび前記第２のダイマー形成ドメイン間の結合が十分に形成される反応条件に設定できる。具体例として、前記第１のダイマー形成ドメインおよび前記第２のダイマー形成ドメインとが、ジスルフィド結合により結合する場合、前記形成工程では、例えば、前記ジスルフィド結合が還元されない反応条件に設定できる。
　前記ヘテロダイマータンパク質が多重特異性抗体である場合、前記形成工程における反応条件は、例えば、さらに、前記第１のモノマータンパク質および前記第２のモノマータンパク質が、前記免疫グロブリンのヒンジ領域間でジスルフィドを形成可能な条件としてもよい。
　つぎに、前記製造工程では、図１（Ｃ）～（Ｄ）に示すように、前記ダイマータンパク質を、前記ダイマータンパク質を修飾する修飾タンパク質と反応させて、ヘテロダイマータンパク質を製造（生成）する。このため、前記製造工程は、例えば、前記ダイマータンパク質に、前記修飾タンパク質に由来するポリペプチドまたはタンパク質を付加し、前記ヘテロダイマータンパク質を生成する工程ともいえる。具体的には、前記製造工程では、前記第１の修飾タンパク質の前記第１のＮインテインが、前記第１のモノマータンパク質の第１のＣインテインと反応して、前記第１の修飾タンパク質の第１の付加物が、前記第１のモノマータンパク質、より具体的には、前記第１のモノマータンパク質の第１のダイマー形成ドメインのＮ末端側に連結される（以下、「第１の連結工程」ともいう）。また、前記製造工程では、前記第２の修飾タンパク質の前記第２のＮインテインが、前記第２のモノマータンパク質の第２のＣインテインと反応して、前記第２の修飾タンパク質の第２の付加物が、前記第２のモノマータンパク質、より具体的には、前記第１のモノマータンパク質の第１のダイマー形成ドメインのＮ末端側に連結される（以下、「第２の連結工程」ともいう）。これにより、前記製造工程では、前記ダイマータンパク質を、前記第１の付加物および前記第１のダイマー形成ドメインをこの順番で含むタンパク質と、前記第２の付加物および前記第２のダイマー形成ドメインをこの順場で含むタンパク質とから構成されるヘテロダイマータンパク質に変換できる。
　前記製造工程における反応は、例えば、緩衝液、生理的食塩水、水等の水性溶媒の存在下で実施することが好ましい。前記ダイマータンパク質、前記第１の修飾タンパク質および前記第２の修飾タンパク質は、固体でもよいし、液体でもよいが、液体が好ましい。前記ダイマータンパク質、前記第１の修飾タンパク質および前記第２の修飾タンパク質が粉末等の固体である場合、前記ダイマータンパク質、前記第１の修飾タンパク質および前記第２の修飾タンパク質は、緩衝液、生理的食塩水、水等の水性溶媒に予め分散されていることが好ましい。また、前記ダイマータンパク質、前記第１の修飾タンパク質および前記第２の修飾タンパク質が液体である場合、前記ダイマータンパク質、前記第１の修飾タンパク質および前記第２の修飾タンパク質は、緩衝液、生理的食塩水、水等の水性溶媒を用いて予め希釈されてもよい。前記反応の具体例として、前記ダイマータンパク質を含む液体と、前記第１の修飾タンパク質を含む液体、および／または、前記第２の修飾タンパク質を含む液体とを混合することにより実施できる。
　前記製造工程において、前記第１の連結工程と前記第２の連結工程は、一部または全部を同時に実施してもよいし、別々に実施してもよい。前記第１の連結工程および前記第２の連結工程を別々に実施する場合、前記第１の連結工程および前記第２の連結工程の順序は、特に制限されず、前記第１の連結工程の実施後に前記第２の連結工程を実施してもよいし、前記第２の連結工程の実施後に、前記第１の連結工程を実施してもよい。
　前記第１の修飾タンパク質は、前記第１のモノマータンパク質に付加される第１の付加物と、前記第１のＣインテインと反応可能な第１のＮインテインとを含む。前記第１の修飾タンパク質は、例えば、前記第１の付加物および前記第１のＮインテインを、Ｎ末端側からこの順序で含む。また、前記第２の修飾タンパク質は、前記第２のモノマータンパク質に付加される第２の付加物および前記第２のＣインテインと反応可能な第２のＮインテインを含む。前記第２の修飾タンパク質は、例えば、前記第２の付加物および前記第２のＮインテインを、Ｎ末端側からこの順序で含む。前記第１の修飾タンパク質は、前記第１の付加物を前記第１のＮインテインと連結させることにより、前記第１のＮインテインと前記第１のＣインテインとの反応が生じた際に、前記第１のダイマー形成ドメインのＮ末端側に前記第１の付加物を導入できる。この結果、前記第１の連結工程では、前記第１のダイマー形成ドメインおよび前記第１の付加物を含む融合タンパク質を生成できる。また、前記第２の修飾タンパク質は、前記第２の付加物を前記第２のＮインテインと連結させることにより、前記第２のＮインテインと前記第２のＣインテインとの反応が生じた際に、前記第２のダイマー形成ドメインのＮ末端側に前記第２の付加物を導入できる。この結果、前記第２の連結工程では、前記第２のダイマー形成ドメインおよび前記第２の付加物を含む融合タンパク質を生成できる。
　前記第１の修飾タンパク質における第１のＮインテインおよび前記第２の修飾タンパク質における第２のＮインテインの説明は、前述の説明を援用できる。前記第１のＮインテインおよび前記第２のＮインテインは、例えば、それぞれ、前記第１のＣインテインおよび前記第２のＣインテインと反応可能に構成されている。これにより、前記第１の修飾タンパク質は、前記第１のモノマータンパク質を修飾（改変）可能に構成でき、かつ前記第２の修飾タンパク質は、前記第２のモノマータンパク質を修飾（改変）可能に構成できる。このため、前記第１のＮインテインおよび前記第２のＮインテインは、異なるインテインに由来するＮインテインであることが好ましい。この場合、前記第１のＮインテインと、前記第２のＮインテインとは、異なるＮインテインを含む。また、前記第１のＣインテインと前記第１のＮインテインとは、例えば、同じインテインに由来する。前記第２のＣインテインと前記第２のＮインテインとは、例えば、同じインテインに由来する。
　前記第１の付加物および前記第２の付加物は、前記ダイマータンパク質に付加されるものを意味する。前記付加物は、例えば、修飾物ということもできる。前記第１の付加物および前記第２の付加物は、１または複数の所望のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を含み、さらに、前記所望のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質が、修飾されたものでもよい。前記第１の付加物および前記第２の付加物は、異なる付加物である。本発明の製造方法では、前記第１の付加物および前記第２の付加物を異なる付加物とすることにより、前記ダイマータンパク質を構成する一方のダイマー形成ドメインと、他方のダイマー形成ドメインとに、異なる付加物を付加でき、これによりヘテロダイマータンパク質を製造できる。以下、前記第１の付加物および前記第２の付加物に使用可能な付加物について併せて説明する。
　前記付加物は、例えば、抗体改変体、重鎖抗体（ＶＨＨ）、受容体、サイトカイン、ケモカイン、毒素、酵素、蛍光タンパク質、およびコラーゲン結合ドメイン等のタンパク質；インスリン等のペプチド；等があげられる。
　前記抗体改変体は、前記抗体の抗原結合断片、または前記抗原結合断片をリンカーペプチドで連結したポリペプチドを含むタンパク質である。前記抗体改変体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、タンデムｓｃＦｖ、ＢｉＴＥ、Ｄｉａｂｏｄｙ、ＤＡＲＴ、ＴａｎｄＡｂ、ｓｃＤｉａｂｏｄｙ、重鎖抗体（ＶＨＨ）および前記ＶＨＨの可変ドメイン等があげられる。前記抗体改変体は、前記抗体の抗原結合断片、または前記抗原結合断片をリンカーペプチドで連結したポリペプチドを含むタンパク質に対して、さらに他の抗体の抗原結合断片等が連結されたタンパク質でもよい。この場合、前記抗体改変体は、例えば、ＤＶＤ－ＩｇＧ（参考文献５）、ｓｃＦｖ－（Ｈ）ＩｇＧ（参考文献５）、ＩｇＧ（Ｌ）－ｓｃＦｖ（参考文献５）、ｓｃＦｖ－（Ｌ）ＩｇＧ（参考文献５）、Ｖ（Ｈ）－ＩｇＧ（参考文献５）、ＩｇＧ（Ｌ）－Ｖ（参考文献５）、Ｖ（Ｌ）－ＩｇＧ（参考文献５）、２ｓｃＦｖ－ＩｇＧ（参考文献５）、ｓｃＦｖ４－Ｉｇ（参考文献５）、Ｚｙｂｏｄｙ（参考文献５）、ｓｃＤｉａｂｏｄｙ－ＣＨ３（参考文献５）、Ｄｉａｂｏｄｙ－ＣＨ３（参考文献５）、ｓｃＤｉａｂｏｄｙ－Ｆｃ（参考文献５）、Ｄｉａｂｏｄｙ－Ｆｃ（参考文献５）等におけるＦｃ領域以外のドメイン、より具体的には、Ｆｃ領域よりＮ末端側のドメインの一部または全部を含むタンパク質として構成できる。
　前記抗体改変体または前記重鎖抗体における標的抗原は、特に制限されず、任意の抗原とできる。前記標的抗原は、例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、自己免疫疾患に関連する抗原、糖鎖抗原、リンパ球等の免疫細胞の表面抗原等があげられる。
　前記表面抗原は、例えば、ＣＤ（cluster of differentiation）抗原があげられる。前記表面抗原は、前記表面抗原に抗体改変体または重鎖抗体が結合した際に、前記表面抗原を発現する免疫細胞が活性化する抗原、または活性化が抑制される抗原であってもよい。前記免疫細胞は、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ等があげられる。前記Ｔ細胞が活性化する抗原としては、例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１５４、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ等があげられ、好ましくは、ＣＤ３である。前記ＣＤ３は、例えば、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ３η等があげられ、好ましくは、ＣＤ３εである。前記Ｔ細胞の活性化が抑制される抗原は、例えば、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、Ｂ７－Ｈ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ等があげられる。前記ＮＫ細胞が活性化する抗原は、例えば、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｄ／ＮＫＧ２Ｄ等があげられる。前記ＮＫ細胞の活性化が抑制される抗原は、例えば、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５、ＫＩＲ３ＤＬ３等があげられる。前記ＮＫＴ細胞が活性化する抗原は、例えば、前記Ｔ細胞が活性化する抗原および前記ＮＫ細胞が活性化する抗原があげられる。前記ＮＫＴ細胞の活性化が抑制される抗原は、例えば、前記Ｔ細胞の活性化が抑制される抗原および前記ＮＫ細胞の活性化が抑制される抗原があげられる。
　前記受容体は、例えば、ＴＮＦα受容体等のサイトカイン受容体；ケモカイン受容体；インスリン受容体等のホルモン受容体；ＥＧＦ受容体等の成長因子または増殖因子の受容体；等があげられる。
　前記サイトカインおよびケモカインは、例えば、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β等のＴＮＦ（Tumor Necrosis Factor）；リンフォトキシン；ＩＬ－１～ＩＬ－３８（例えば、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３、ＩＬ－３３、ＩＬ－３６等）のインターロイキン；ケモカイン；造血因子；細胞増殖因子；アディポカイン；ＶＥＧＦ等の成長因子；等があげられる。
　前記毒素は、例えば、ブドウ球菌エンテロトキシン等があげられる。
　前記酵素は、例えば、ルシフェラーゼ、フォスファターゼ、等があげられる。
　前記蛍光タンパク質は、例えば、ＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）、dsRED等があげられる。
　前記第１の修飾タンパク質において、前記第１の付加物および前記第１のＮインテインは、直接的または間接的に結合（連結）している。前記ヘテロダイマータンパク質として、天然のアミノ酸配列のみから構成される複数ドメインが連結されたヘテロダイマータンパク質を製造する場合、前記第１の付加物および前記第１のＮインテインは、直接的に連結していることが好ましい。
　前記第２の修飾タンパク質において、前記第２の付加物および前記第２のＮインテインは、直接的または間接的に結合（連結）している。前記ヘテロダイマータンパク質として、天然のアミノ酸配列のみから構成される複数ドメインが連結されたヘテロダイマータンパク質を製造する場合、前記第２の付加物および前記第２のＮインテインは、直接的に連結していることが好ましい。
　前記第１の付加物および前記第２の付加物において、前記直接的または間接的な結合は、前述の説明を援用できる。
　本発明において、前記ヘテロダイマータンパク質が多重特異性抗体である場合、前記第１の付加物および前記第２の付加物は、例えば、前記抗体改変体または前記重鎖抗体を含むポリペプチドである。具体例として、前記ヘテロダイマータンパク質が二重特異性抗体である場合、前記第１の付加物は、第１の抗体のＦａｂ領域、または、前記Ｆａｂ領域と、抗体のヒンジ領域の全部または一部を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また、前記第２の付加物は、第２の抗体のＦａｂ領域、または、前記Ｆａｂ領域と、抗体のヒンジ領域の全部または一部を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドである。前記第１の抗体および前記第２の抗体は、異なる抗原または異なるエピトープと結合する抗体である。前記第１の付加物および前記第２の付加物が抗体のヒンジ領域の一部を含む場合、前記第１の付加物および前記第２の付加物が含むヒンジ領域は、それぞれ、前記第１のダイマー形成ドメインおよび前記第２のダイマー形成ドメインと連結された際に、抗体のヒンジ領域全体を構成するように設定される。前記抗体改変体は、例えば、ヒト抗体の抗体改変体、好ましくは、ヒトＩｇＧの抗体改変体である。
　前記第１の修飾タンパク質は、例えば、Ｎ末端側に、前記可溶化ドメイン、前記シグナルペプチド等の他のポリペプチドを含んでもよい。また、前記第２の修飾タンパク質は、例えば、Ｎ末端側に、前記可溶化ドメイン、前記シグナルペプチド等の他のポリペプチドを含んでもよい。
　前記第１の修飾タンパク質が前記可溶化ドメインを含む場合、前記第１の修飾タンパク質における可溶化ドメインの数は、１つでもよいし、複数でもよい。後者の場合、前記可溶化ドメインは、１種類でもよいし、複数種類でもよい。
　前記第２の修飾タンパク質が前記可溶化ドメインを含む場合、前記第２の修飾タンパク質における可溶化ドメインの数は、１つでもよいし、複数でもよい。後者の場合、前記可溶化ドメインは、１種類でもよいし、複数種類でもよい。
　前記第１の修飾タンパク質および前記第２の修飾タンパク質は、例えば、前記第１の修飾タンパク質、前記第２の修飾タンパク質、またはヘテロダイマータンパク質の精製に用いる精製タグを含んでもよい。前記精製タグは、例えば、前述のアフィニティータグを使用できる。前記精製タグは、例えば、前記第１の付加物ならびに前記第２の付加物のＮ末端（側）およびＣ末端（側）の少なくとも一方に付加できる。
　前記製造工程において、前記第１の連結工程と前記第２の連結工程の反応条件は、同じでもよいし、異なってもよい。前記第１の連結工程の反応条件は、例えば、前記第１のＣインテインおよび前記第１のＮインテインの種類に応じて設定でき、より具体的には、前記第１のＣインテインおよび前記第１のＮインテインが結合して形成された活性インテインの酵素活性の条件に応じて設定できる。また、前記第２の連結工程の反応条件は、例えば、前記第２のＣインテインおよび前記第２のＮインテインの種類に応じて設定でき、より具体的には、前記第２のＣインテインおよび前記第２のＮインテインが結合して形成された活性インテインの酵素活性の条件に応じて設定できる。具体例として、前記製造工程の反応温度は、例えば、０～４０℃、４～３７℃、または４～３０℃である。前記製造工程の反応時間は、例えば、１分～４８時間、３０分～４８時間、または１～４８時間である。前記製造工程の反応ｐＨは、例えば、ｐＨ５～１０、ｐＨ６～９、またはｐＨ６．５～９である。
　本発明の製造方法は、前記製造工程後に、前記ヘテロダイマータンパク質を精製する精製工程を含んでもよい。前記精製工程における精製方法は、例えば、クロマトグラフィー等の一般的なタンパク質の精製方法を利用できる。
　このようにして、本発明の製造方法は、ダイマータンパク質からヘテロダイマータンパク質を製造できる。
＜ダイマータンパク質＞
　別の態様において、本発明は、ヘテロダイマータンパク質の製造に好適に使用できるダイマータンパク質を提供する。本発明のタンパク質（ダイマータンパク質）は、反応タグを含むダイマータンパク質を含み、前記反応タグを含むダイマータンパク質は、第１のモノマータンパク質と、第２のモノマータンパク質とを含み、前記第１のモノマータンパク質は、第１の反応タグおよびダイマーを形成可能な第１のダイマー形成ドメインを含み、前記第１の反応タグは、結合タグおよび第１のＮインテインと反応可能な第１のＣインテインを含み、前記第２のモノマータンパク質は、第２の反応タグおよび前記第１のダイマー形成ドメインとダイマーを形成可能な第２のダイマー形成ドメインを、この順序で含み、前記第２の反応タグは、前記結合タグに結合可能な結合パートナーおよび第２のＮインテインと反応可能な第２のＣインテインを含み、前記第１のモノマータンパク質および前記第２のモノマータンパク質は、ダイマーを形成している。本発明のダイマータンパク質によれば、前記第１の修飾タンパク質および前記第２の修飾タンパク質と組合わせることにより、ヘテロダイマータンパク質を好適に製造できる。
＜モノマータンパク質＞
　別の態様において、本発明は、前記ダイマータンパク質の製造に好適に使用できるモノマータンパク質を提供する。本発明のタンパク質は、第１のモノマータンパク質を含み、前記第１のモノマータンパク質は、第１の反応タグおよびダイマーを形成可能な第１のダイマー形成ドメインを、この順序で含み、前記第１の反応タグは、結合パートナーと結合可能な結合タグおよび第１のＮインテインと反応可能な第１のＣインテインを含み、前記第１のモノマータンパク質は、第２のモノマータンパク質とダイマーを形成可能であり、前記第２のモノマータンパク質は、第２の反応タグおよび前記第１のダイマー形成ドメインとダイマーを形成可能な第２のダイマー形成ドメインを含み、前記第２の反応タグは、前記結合タグと結合可能な結合パートナーおよび第２のＮインテインと反応可能な第２のＣインテインを含む。また、本発明のタンパク質は、第２のモノマータンパク質を含み、前記第２のモノマータンパク質は、第２の反応タグおよびダイマーを形成可能な第２のダイマー形成ドメインを、この順序で含み、前記第２の反応タグは、結合タグと結合可能な結合パートナーおよび第２のＮインテインと反応可能な第２のＣインテインを含み、前記第２のモノマータンパク質は、第１のモノマータンパク質とダイマーを形成可能であり、前記第１のモノマータンパク質は、第１の反応タグおよび前記第２のダイマー形成ドメインとダイマーを形成可能な第１のダイマー形成ドメインを、この順序で含み、前記第１の反応タグは、前記結合パートナーと結合可能な結合タグおよび第１のＮインテインと反応可能な第１のＣインテインを含む。
＜核酸＞
　別の態様において、本発明は、ダイマータンパク質、第１のモノマータンパク質、および／または、第２のモノマータンパク質の合成に使用可能な核酸を提供する。本発明の核酸は、前記本発明のダイマータンパク質、前記本発明の第１のモノマータンパク質、および／または、前記本発明の第２のモノマータンパク質をコードする。
　本発明の核酸は、前記本発明のダイマータンパク質、前記本発明の第１のモノマータンパク質、および／または、前記本発明の第２のモノマータンパク質のアミノ酸配列に基づいて、対応するコドンに置き換えることで設計可能である。前記本発明の核酸の塩基配列は、例えば、コドン最適化されていてもよい。
　本発明の核酸は、さらに、前記第１の修飾タンパク質および／または前記第２の修飾タンパク質をコードしてもよい。
＜発現ベクター＞
　別の態様において、本発明は、ダイマータンパク質、第１のモノマータンパク質、および／または、第２のモノマータンパク質の合成に使用可能な発現ベクターを提供する。本発明の発現ベクターは、前記本発明の核酸を含む。本発明の発現ベクターによれば、遺伝子工学的手法により、前記本発明のダイマータンパク質、前記本発明の第１のモノマータンパク質、および／または、前記本発明の第２のモノマータンパク質（以下、「本発明のタンパク質」ともいう）を好適に製造できる。
　前記本発明の発現ベクターは、例えば、前記本発明の核酸が、発現ベクターに挿入されている。前記発現ベクターは、例えば、挿入された遺伝子を細胞等の標的内に輸送できる核酸分子を意味する。
　前記発現ベクターは、例えば、前記本発明の核酸のポリヌクレオチドがコードする本発明のタンパク質を発現可能なように、前記本発明のダイマータンパク質、前記本発明の第１のモノマータンパク質、および／または、前記本発明の第２のモノマータンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでいればよく、その構成は、特に制限されない。前記本発明のダイマータンパク質、前記本発明の第１のモノマータンパク質、および／または、前記本発明の第２のモノマータンパク質は、例えば、その一部または全部が同じ発現ベクターに挿入されてもよいし、別々の発現ベクターに挿入されてもよい。前記本発明のダイマータンパク質、前記本発明の第１のモノマータンパク質、および／または、前記本発明の第２のモノマータンパク質が別々の発現ベクターに挿入されている場合、本発明の発現ベクターは、前記本発明のダイマータンパク質をコードする核酸を含む発現ベクター、前記本発明の第１のモノマータンパク質をコードする核酸を含む発現ベクター、および／または、前記本発明の第２のモノマータンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを含む、発現ベクターセットとして構成できる。
　前記発現ベクターは、さらに、前記第１の修飾タンパク質、および／または前記第２の修飾タンパク質をコードする核酸を含んでもよい。この場合、前記第１の修飾タンパク質、および／または前記第２の修飾タンパク質をコードする核酸は、前記本発明のダイマータンパク質、前記本発明の第１のモノマータンパク質、および／または、前記本発明の第２のモノマータンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターに挿入されてもよいし、他の発現ベクターに挿入されてもよい。
　前記発現ベクターは、例えば、骨格となるベクター（以下、「基本ベクター」ともいう）に、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、すなわち、前記本発明の核酸を挿入することで作製できる。前記発現ベクターの種類は、特に制限されず、例えば、前記宿主の種類に応じて、適宜決定できる。
　前記宿主は、例えば、微生物、動物細胞、昆虫細胞、または、これらの培養細胞等の非ヒト宿主、単離したヒト細胞またはその培養細胞、哺乳類細胞等があげられる。前記原核生物は、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属等の細菌があげられる。前記真核生物は、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の酵母等があげられる。前記動物細胞は、例えば、HEK293細胞、Expi293F細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等があげられ、前記昆虫細胞は、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１等があげられる。
　前記発現ベクター（基本ベクター）は、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターがあげられる。前記導入方法としてヒートショック法により宿主の形質転換を行う場合、前記発現ベクターは、例えば、バイナリーベクター等があげられる。前記発現ベクターは、例えば、pETDuet-1、pQE-80L、pUCP26Km等があげられる。大腸菌等の細菌に形質転換を行う場合、前記発現ベクターは、例えば、ｐＥＴＤｕｅｔ－１ベクター（ノバジェン社）、pQE-80L（QIAGEN社）、pBR322、pB325、pAT153、pUC8等があげられる。前記酵母に形質転換を行なう場合、前記発現ベクターは、例えば、pYepSec1、pMFa、pYES2等があげられる。前記昆虫細胞に形質転換を行なう場合、前記発現ベクターは、例えば、pAc、pVL等があげられる。前記哺乳類細胞に形質転換を行なう場合、前記発現ベクターは、例えば、pcDNA3.1、pcDNA3.4、pCAG、pCAGEN、pCDM8、pMT2PC等があげられる。
　前記発現ベクターは、例えば、前記本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現および前記本発明のタンパク質のポリヌクレオチドがコードする前記本発明のタンパク質の発現を調節する、調節配列を有することが好ましい。前記調節配列は、例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル配列、複製起点配列（ｏｒｉ）等があげられる。前記発現ベクターにおいて、前記調節配列の配置は特に制限されない。前記発現ベクターにおいて、前記調節配列は、例えば、前記本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現およびこれがコードする本発明のタンパク質質の発現を、機能的に調節できるように配置されていればよく、公知の方法に基づいて配置できる。前記調節配列は、例えば、前記基本ベクターが予め備える配列を利用してもよいし、前記基本ベクターに、さらに、前記調節配列を挿入してもよいし、前記基本ベクターが備える調節配列を、他の調節配列に置き換えてもよい。
　前記発現ベクターは、例えば、さらに、選択マーカーのコード配列を有してもよい。前記選択マーカーは、例えば、薬剤耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、酵素マーカー、細胞表面レセプターマーカー等があげられる。
　前記発現ベクターへの、ＤＮＡの挿入、前記調節配列の挿入、および／または前記選択マーカーのコード配列の挿入は、例えば、制限酵素およびリガーゼを用いた方法で実施してもよいし、市販のキット等を用いてもよい。
＜形質転換体および形質転換体の製造方法＞
　別の態様において、本発明のタンパク質を製造可能な形質転換体およびその製造方法を提供する。本発明の形質転換体は、本発明のタンパク質をコードする核酸を含む。本発明の形質転換体によれば、前記本発明のタンパク質を好適に製造できる。
　また、本発明の形質転換体の製造方法は、宿主に、前記本発明の核酸を導入する工程を含む。本発明の形質転換体の製造方法によれば、前記形質転換体を製造できる。
　本発明の形質転換体において、前記本発明のタンパク質をコードする核酸は、前記本発明のタンパク質をコードする核酸の説明を援用できる。本発明の核酸としては、前記本発明の発現ベクターを用いてもよい。
　本発明の形質転換体では、本発明の核酸が外来性の分子として存在する。このため、本発明の形質転換体は、例えば、前記宿主に、前記本発明の核酸を導入することにより製造できる。
　前記核酸の導入方法は、特に制限されず、公知の方法により行うことができる。前記核酸は、例えば、前記発現ベクターにより導入されてもよい。前記導入方法は、例えば、前記宿主の種類に応じて、適宜設定できる。前記導入方法は、例えば、パーティクルガン等の遺伝子銃による導入法、リン酸カルシウム法、ポリエチレングリコール法、リポソームを用いるリポフェクション法、エレクトロポレーション法、超音波核酸導入法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、微小ガラス管等を用いた直接注入法、ハイドロダイナミック法、カチオニックリポソーム法、導入補助剤を用いる方法、アグロバクテリウムを介する方法等があげられる。前記リポソームは、例えば、リポフェクタミンおよびカチオニックリポソーム等があげられ、前記導入補助剤は、例えば、アテロコラーゲン、ナノ粒子およびポリマー等があげられる。前記宿主が、微生物の場合、例えば、中でも、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＰｓ．ｐｕｔｉｄａ等を介する方法が好ましい。前記本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば、前記本発明の発現ベクターにより前記宿主に導入してもよい。
＜タンパク質の製造方法＞
　別の態様において、本発明は、ヘテロダイマータンパク質の製造に好適に使用できるダイマータンパク質、または前記ダイマータンパク質の製造に好適に使用できるモノマータンパク質の製造方法を提供する。本発明のタンパク質の製造方法は、前記本発明の核酸、前記本発明の発現ベクター、および／または、前記本発明の発現ベクターセットを発現させる発現工程を含む。本発明のタンパク質の製造方法によれば、前記本発明のダイマータンパク質、第１のモノマータンパク質、および／または、第２のモノマータンパク質を製造できる。
　本発明のタンパク質の発現は、例えば、前記本発明の発現ベクターを使用して行ってもよい。本発明のタンパク質を発現させる方法は、特に制限されず、公知の方法が採用でき、例えば、宿主を使用してもよいし、無細胞タンパク質合成系を使用してもよい。
　前者の場合、例えば、本発明のタンパク質またはそれをコードする核酸が導入された前記宿主を使用し、前記宿主の培養により、前記宿主において本発明のタンパク質を発現させることが好ましい。このように、例えば、本発明のタンパク質をコードする核酸を宿主に導入することで、本発明のタンパク質を合成する形質転換体を製造でき、また、前記形質転換体の培養により、本発明のタンパク質を合成できる。
　前記宿主の培養の方法は、特に制限されず、前記宿主の種類に応じて適宜設定できる。培養に使用する培地は、特に制限されず、前記宿主の種類に応じて適宜決定できる。
　後者の場合、無細胞タンパク質合成系において、本発明のタンパク質のポリヌクレオチドを発現させることが好ましい。この場合、本発明のタンパク質のポリヌクレオチドの発現には、発現ベクターを使用してもよい。前記無細胞タンパク質合成系は、例えば、細胞抽出液と、各種成分を含むバッファーと、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入された発現ベクターとを用いて、公知の方法により行うことができ、例えば、市販の試薬キットが使用できる。
　本発明のタンパク質の製造方法は、例えば、本発明のタンパク質を回収する回収工程を含んでもよい。前記回収工程で得られた本発明のタンパク質は、例えば、粗精製物でもよいし、精製タンパク質でもよい。
　前記培養液から回収する場合、前記回収工程では、例えば、培養上清をろ過、遠心処理等することによって不溶物を除去する。そして、前記回収工程では、例えば、前記不溶物除去後の培養上清について、限外ろ過膜による濃縮；硫安沈殿等の塩析；透析；イオン交換カラム、ゲル濾過カラム等の各種カラムを用いたクロマトグラフィーを適宜組み合わせて、分離、精製を行うことにより、本発明のタンパク質を得ることができる。
　前記形質転換体から回収する場合には、前記回収工程では、例えば、前記形質転換体を加圧処理、超音波処理などによって破砕する。そして、得られた破砕液について、前述のように、不溶物を除去し、分離、精製を行うことにより本発明のタンパク質を得ることができる。
　本発明の製造方法により得られた本発明のタンパク質は、例えば、そのまま粗精製タンパク質として使用してもよいし、部分的に精製した部分精製タンパク質として使用してもよいし、単一に精製した精製タンパク質として使用してもよい。
　また、本発明の製造方法は、得られた本発明のタンパク質を、例えば、凍結乾燥や真空乾燥またはスプレードライなどにより粉末化してもよい。この場合、本発明の製造方法は、例えば、本発明のタンパク質を予め酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液、トリス塩酸緩衝液、GOOD’sバッファー（例えば、HEPES、PIPES、MES、MOPS等）等の緩衝液に溶解させておいてもよい。
＜ヘテロダイマータンパク質のスクリーニング方法＞
　別の態様において、本発明は、所望の標的に反応するヘテロダイマータンパク質のスクリーニング方法を提供する。本発明の標的反応性のヘテロダイマータンパク質のスクリーニング方法は、反応タグを含むダイマータンパク質を、前記ダイマータンパク質を修飾する修飾タンパク質と反応させて、候補ヘテロダイマータンパク質を製造する製造工程と、前記候補ヘテロダイマータンパク質を標的と接触させ、前記候補ヘテロダイマータンパク質と前記標的との反応を検出する検出工程と、前記反応が検出された前記候補ヘテロダイマータンパク質を前記標的と反応する候補物質として選抜する選抜工程を含み、前記製造工程は、前記本発明の製造方法により実施される。本発明のスクリーニング方法によれば、所望の標的に反応するヘテロダイマータンパク質をスクリーニングできる。
　前記製造工程において、前記候補ヘテロダイマータンパク質は、前記本発明の製造方法と同様にして実施できる。前記候補ヘテロダイマータンパク質は、好ましくは、多重特異性抗体または二重特異性抗体等の抗体である。前記候補ヘテロダイマータンパク質が抗体の場合、前記抗体の抗原結合ドメインは、例えば、後述の標的に対する結合性を評価する候補抗原結合ドメインとしてもよい。
　前記候補ヘテロダイマータンパク質は、標識を含んでもよい。前記標識は、例えば、蛍光タンパク質、蛍光色素等の蛍光物質；ルシフェラーゼ、フォスファターゼ等の酵素；等があげられる。
　つぎに、前記検出工程では、前記候補ヘテロダイマータンパク質を標的と接触させ、前記候補ヘテロダイマータンパク質と前記標的との反応を検出する。前記検出工程において、前記接触は、例えば、前記水性溶媒の存在下実施する。前記接触の条件は、特に制限されず、例えば、標的の種類に応じて、設定できる。前記検出工程の温度は、例えば、４～３７℃、または１８～２５℃である。前記検出工程の時間は、例えば、０～１２０分、３０～６０分である。
　前記標的は、前記ヘテロダイマータンパク質の反応性をスクリーニングする所望の標的とできる。前記標的は、例えば、前記標的抗原の例示を援用できる。前記接触において、前記標的は、例えば、担体に固定されていてもよいし、遊離していてもよい。前記担体は、例えば、基板、ビーズ、容器等があげられる。前記容器は、例えば、マイクロプレート、チューブ等があげられる。前記標的が細胞に発現可能な分子の場合、前記標的は、前記標的を発現する細胞でもよい。
　つぎに、前記検出工程では、前記候補ヘテロダイマータンパク質と前記標的との反応を検出する。前記反応は、前記候補ヘテロダイマータンパク質および前記標的の種類に応じて決定できる。具体例として、前記候補ヘテロダイマータンパク質が多重特異性抗体等の抗体またはその抗原結合断片を含む場合、前記反応は、例えば、結合である。また、前記候補ヘテロダイマータンパク質が酵素を含む場合、前記反応は、例えば、触媒反応である。前記候補ヘテロダイマータンパク質が受容体を含む場合、前記反応は、例えば、結合である。
　そして、前記検出工程では、前記候補ヘテロダイマータンパク質と前記標的との反応の有無を検出することによって、例えば、前記候補ヘテロダイマータンパク質の前記標的への反応性の有無を検出または分析（定性分析）できる。また、前記検出工程では、前記候補ヘテロダイマータンパク質と前記標的との反応の程度を検出することによって、例えば、前記候補ヘテロダイマータンパク質の前記標的への反応の強弱を検出または分析（定量分析）できる。
　そして、前記候補ヘテロダイマータンパク質と前記標的との反応が検出できなかった場合は、前記候補ヘテロダイマータンパク質は、前記標的と反応しないと評価でき、前記反応が検出された場合は、前記候補ヘテロダイマータンパク質は、前記標的と反応すると評価できる。
　前記候補ヘテロダイマータンパク質と前記標的との反応の分析方法は、特に制限されず、前記反応の種類に応じて決定できる。前記候補ヘテロダイマータンパク質が標識を含み、前記反応が結合である場合、前記候補ヘテロダイマータンパク質と前記標的との反応は、例えば、前記候補ヘテロダイマータンパク質と前記標的との結合により生じた複合体について、前記標識を検出することにより実施できる。
　そして、前記選抜工程では、前記反応が検出された前記候補ヘテロダイマータンパク質を前記標的と反応する候補物質として選抜する。これにより、本発明のスクリーニング方法によれば、前記標的との反応性を有すると推定される候補ヘテロダイマータンパク質をスクリーニングできる。
　以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明は実施例に記載された態様に限定されるものではない。
［実施例１］
　本発明の製造方法により、前記ダイマータンパク質に対して異なる付加物を導入できることを確認した。
　具体的には、実施例１では、ヒトＩｇＧ抗体のヒンジ領域の一部およびＦｃ領域のＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含むタンパク質を、ダイマータンパク質のモデルとし、ＨＥＲ２抗体のＦａｂおよびＯＫＴ３抗体のＦａｂを、それぞれ、第１の付加物モデルおよび第２の付加物のモデルとした。そして、これらをパーツとして含む第１のモノマータンパク質、第２のモノマータンパク質、第１の修飾タンパク質、および第２の修飾タンパク質を調製し、本発明の製造方法により、Ｆｃ領域を含むタンパク質に、ＨＥＲ２抗体（Herceptin）のＦａｂおよびＯＫＴ３抗体のＦａｂを導入して、ＨＥＲ２およびＣＤ３に結合可能な二重特異性抗体を作製できることを確認した。
（１）Herceptin-OKT3二重特異性抗体の各抗体断片のタンパク質の調製
　Herceptin-OKT3二重特異性抗体を調製するために、以下のモノマータンパク質および修飾タンパク質を調製した。
・第１のモノマータンパク質：SpyTag（結合タグ）と、gp41-1 Ｃインテイン（第１のＣインテイン）と、ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域のＣ末端側領域およびＦｃ領域とを含むタンパク質（SpyTag-VHH）
・第２のモノマータンパク質：SpyCatcher（結合パートナー）と、cfa Ｃインテイン（第２のＣインテイン）と、ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域のＣ末端側領域およびＦｃ領域とを含むタンパク質（SpyCatcher-VHH）
・第１修飾タンパク質：（CD3-Fab）
　hOKT3抗体のＶＬおよびＣＬ領域を含むタンパク質（CD3-Fab-L）と、
　hOKT3抗体のＶＨ、ＣＨ１領域、およびヒトＩｇＧ１のヒンジ領域のＮ末端側領域と、go41-1 Ｎインテイン（第１のＮインテイン）とを含むタンパク質（CD3-Fab-H）との複合体
・第２の修飾タンパク質（Her2-Fab）：
　Herceptin抗体のＶＬおよびＣＬ領域を含むタンパク質（Her2-Fab-L）と、
　Herceptin抗体のＶＨ、ＣＨ１領域、およびヒトＩｇＧ１のヒンジ領域のＮ末端側領域と、cfa Ｎインテイン（第２のＮインテイン）とを含むタンパク質（Her2-Fab-C）との複合体
　CD3-Fab-Hを発現可能なプラスミドベクターは、以下の手順で構築した。まず、シグナルペプチド、OKT3のＶＨ－ＣＨ１ドメイン（配列番号１２）、ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域のＮ末端側の部分配列、gp41-1　Ｎインテイン（配列番号７）、Ｇ１リンカー、およびＨｉｓタグをコードする塩基配列を含む合成遺伝子（ユーロフィンジェノミクス社）について、全長をＰＣＲにより増幅した。得られた全長の合成遺伝子を動物細胞の発現ベクター（pCAGEN）に連結させ、組換えタンパク質の発現ベクターを構築した。前記発現ベクターは、CD3-Fab-H領域（配列番号１３）としてＮ末端からＣ末端に向かって、括弧で示すように、シグナルペプチド、OKT3のＶＨ－ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域のＮ末端側の部分配列、gp41-1　Ｎインテイン、Ｇ１リンカー、およびＨｉｓタグがこの順序で連結されている。
CD3-Fab-H領域（配列番号１３）
[MEFGLSWLFLVAILKGVQC][QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGKGLEWIGYINPSRGYTNYNQKVKDRFTISRDNSKNTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARYYDDHYSLDYWGQGTPVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC][DKT][SGYCLDLKTQVQTPQGMKEISNIQVGDLVLSNTGYNEVLNVFPKSKKKSYKITLEDGKEIICSEEHLFPTQTGEMNISGGLKEGMCLYVKE][GGSGG][HHHHHH]
　つぎに、CD3-Fab-Lを発現可能なプラスミドベクターは、以下の手順で構築した。まず、シグナルペプチドおよびOKT3のＶＬ－ＣＬドメイン（配列番号１４）をコードする塩基配列を含む合成遺伝子（ユーロフィンジェノミクス社）について、全長をＰＣＲにより増幅した。得られた全長の合成遺伝子を動物細胞の発現ベクター（pCAGEN）に連結させ、組換えタンパク質の発現ベクターを構築した。前記発現ベクターは、CD3-Fab-L領域（配列番号１５）としてＮ末端からＣ末端に向かって、括弧で示すように、シグナルペプチドおよびOKT3のＶＬ－ＣＬドメインがこの順序で連結されている。
CD3-Fab-L領域（配列番号１５）
[MDFQVQIFSFLLISASVIISRG][DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQTPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLQITRTVA][APSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC]
　Her2-Fab-Hを発現可能なプラスミドベクターは、以下の手順で構築した。まず、シグナルペプチド、HerceptinのＶＨ－ＣＨ１ドメイン（配列番号１６）、ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域のＮ末端側の部分配列、Ｃｆａ　Ｎインテイン（配列番号９）、Ｇ１リンカー、およびＨｉｓタグをコードする塩基配列を含む合成遺伝子（ユーロフィンジェノミクス社）について、全長をＰＣＲにより増幅した。得られた全長の合成遺伝子を動物細胞の発現ベクター（pCAGEN）に連結させ、組換えタンパク質の発現ベクターを構築した。前記発現ベクターは、Her2-Fab-H領域（配列番号１７）としてＮ末端からＣ末端に向かって、括弧で示すように、シグナルペプチド、HerceptinのＶＨ－ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域のＮ末端側の部分配列、ＣｆａＮインテイン、Ｇ１リンカー、およびＨｉｓタグがこの順序で連結されている。
Her2-Fab-H領域（配列番号１７）
[MEFGLSWLFLVAILKGVQC][EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAVDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC][DKT][CLSYDTEILTVEYGFLPIGKIVEERIECTVYTVDKNGFVYTQPIAQWHNRGEQEVFEYCLEDGSIIRATKDHKFMTTDGQMLPIDEIFERGLDLKQVDGLP][GGSGG][HHHHHH]
　つぎに、Her2-Fab-Lを発現可能なプラスミドベクターは、以下の手順で構築した。まず、シグナルペプチドおよびHerceptinのＶＬ－ＣＬドメイン（配列番号１８）をコードする塩基配列を含む合成遺伝子（ユーロフィンジェノミクス社）について、全長をＰＣＲにより増幅した。得られた全長の合成遺伝子を動物細胞の発現ベクター（pCAGEN）に連結させ、組換えタンパク質の発現ベクターを構築した。前記発現ベクターは、Her2-Fab-L領域（配列番号１９）としてＮ末端からＣ末端に向かって、括弧で示すように、シグナルペプチドおよびHerceptinのＶＬ－ＣＬドメインがこの順序で連結されている。
Her2-Fab-L領域（配列番号１９）
[METPAQLLFLLLLWLPESTG][DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEI][KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC]
　SpyCatcher-VHHを発現可能なプラスミドベクターは、以下の手順で構築した。まず、シグナルペプチド、Ｉａ１（一本鎖抗体（可溶化ドメイン）、配列番号２０）、Ｇ１リンカー、SpyCatcher（配列番号１）、Ｇ１リンカー、Ｃｆａ　Ｃインテイン（配列番号８）、ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域のＣ末端側の部分配列、およびヒトＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２領域およびＣＨ３領域（配列番号２１）をコードする塩基配列を含む合成遺伝子（ユーロフィンジェノミクス社）について、全長をＰＣＲにより増幅した。得られた全長の合成遺伝子を動物細胞の発現ベクター（pCDNA3.4）に連結させ、組換えタンパク質の発現ベクターを構築した。前記発現ベクターは、SpyCatcherVHH領域（配列番号２２）としてＮ末端からＣ末端に向かって、括弧で示すように、シグナルペプチド、Ｉａ１、Ｇ１リンカー、SpyCatcher、Ｇ１リンカー、Ｃｆａ　Ｃインテイン、ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域のＣ末端側の部分配列、およびヒトＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２領域およびＣＨ３領域がこの順序で連結されている。
Ｆｃ領域（配列番号２１）
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Ｉａ１（配列番号２０）
QVQLQESGGGLVQAGGSLLLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAAINWSGGSTSYADSVKGRFTISRDNTKNTVYLQMNSLKPEDTAAFYCAATYNPYSRDHYFPRMTTEYDYWGQGTQVTVSS
SpyCatcher-VHH領域（配列番号２２）
[MEFGLSWLFLVAILKGVQC][QVQLQESGGGLVQAGGSLLLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAAINWSGGSTSYADSVKGRFTISRDNTKNTVYLQMNSLKPEDTAAFYCAATYNPYSRDHYFPRMTTEYDYWGQGTQVTVSS][GGSGG][DSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNG][GGSGG][VKIISRKSLGTQNVYDIGVEKDHNFLLKNGLVASNC][FNASYTCPPCP][APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK]
　SpyTag-VHHを発現可能なプラスミドベクターは、以下の手順で構築した。まず、シグナルペプチド、ｃＡｂＧＦＰ４（一本鎖抗体（可溶化ドメイン）、配列番号２３）、Ｇ１リンカー、SpyTag（配列番号２）、gp41-1　Ｃインテイン（配列番号６）、ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域のＣ末端側の部分配列、およびヒトＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２領域およびＣＨ３領域をコードする塩基配列を含む合成遺伝子（ユーロフィンジェノミクス社）について、全長をＰＣＲにより増幅した。得られた全長の合成遺伝子を動物細胞の発現ベクター（pCDNA3.4）に連結させ、組換えタンパク質の発現ベクターを構築した。前記発現ベクターは、SpyTag-VHH領域（配列番号２４）としてＮ末端からＣ末端に向かって、括弧で示すように、シグナルペプチド、ｃＡｂＧＦＰ４、Ｇ１リンカー、ＳｐｙＴａｇ、ｇｐ４１－１　Ｃインテイン、ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域のＣ末端側の部分配列、およびヒトＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２領域およびＣＨ３領域がこの順序で連結されている。
ｃＡｂＧＦＰ４（配列番号２３）
QVQLVESGGALVQPGGSLRLSCAASGFPVNRYSMRWYRQAPGKEREWVAGMSSAGDRSSYEDSVKGRFTISRDDARNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNVNVGFEYWGQGTQVTVSS
SpyTag-VHH領域（配列番号２４）
[MEFGLSWLFLVAILKGVQC][QVQLVESGGALVQPGGSLRLSCAASGFPVNRYSMRWYRQAPGKEREWVAGMSSAGDRSSYEDSVKGRFTISRDDARNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNVNVGFEYWGQGTQVTVSS][GGSGG][AHIVMVDAYKPTK][GGSGG][MMLKKILKIEELDERELIDIEVSGNHLFYANDILTHNSAG][ASYTCPPCP][APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK]
　つぎに、前記組換えタンパク質の各プラスミド発現ベクターを、それぞれ、Expi293F細胞にトランスフェクションした。前記トランスフェクションでは、前記CD3-Fab-Hの発現ベクターおよび前記CD3-Fab-Lの発現ベクターの組合せ、前記Her2-Fab-Hの発現ベクターおよびHer2-Fab-Lの発現ベクターの組合せ、または前記SpyCatcher-VHHの発現ベクターおよび前記SpyTag-VHHの発現ベクターの組合せを前記細胞に導入した。得られた形質転換体について、HE400培地を用いて、CO2インキュベータにて３７℃で７日間培養し、培地上清へ組換えタンパク質（SpyTag-VHH＋SpyCatcher-VHH（Fcダイマー）、CD3-Fab-L＋CD3-Fab-H（CD3-Fab）、Her2-Fab-L＋Her2-Fab-H（Her2-Fab））を発現させた。
　つぎに、前記培養後の組換えタンパク質を含む培養上清を回収した。
（２）CD3-FabとHer2-Fabの精製
　培養上清を１５００ｒｐｍ、５分間の条件下で、遠心した。遠心分離後の上清に終濃度500 mmol/l NaCl、終濃度10 mmol/lイミダゾールとなるように試薬溶液を加えた後、Wash Buffer（500 mmol/l NaCl、50 mmol/l Tris-HCl、10 mmol/l イミダゾール）に平衡化したカラム体積3 mlのNi-NTAカラム（FUJIFILM社製）に流し、Wash Buffer 30 mlで洗浄後に、Elute Buffer（500 mmol/l NaCl、50 mmol/l Tris-HCl、500 mmol/l イミダゾール） 15 mlで溶出した。回収した溶出画分を透析バッファー（150 mmol/l NaCl、50 mmol/l HEPES）で透析した。
（３）Fcダイマーの精製
培養上清を１５００ｒｐｍ、５分間の条件下で、遠心した。Wash Buffer（50 mmol/lリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.5）に平衡化したカラム体積1 mlのプロテインAカラム（SUPrA社製）に流し、Wash Buffer 10 mlで洗浄後に、Elute Buffer（20 mmol/lクエン酸ナトリウム、100 mmol/l NaCl、pH3.0） 5 mlで溶出した。Elute Bufferを流す際、中和するために100 mmol/l リン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）を5 mlに溶出溶液を流した。回収した溶出画分を透析バッファー（150 mmol/l NaCl、50 mmol/l HEPES）で透析した。
　得られた各タンパク質サンプルについて、超純水で希釈し、紫外可視分光光度計（UV-1800、SHIMADZU社製）により、２８０ｎｍおよび３３０ｎｍの吸光度を測定した。そして、各タンパク質サンプルにおけるタンパク質のモル濃度は、下記式（１）から算出した。
 
　Ｃ＝（Ａ２８０－Ａ３２０）÷（ｌ×ε）×（希釈倍率）　・・・（１）
　　Ｃ：タンパク質のモル濃度
　　Ａ２８０：２８０ｎｍの吸光度
　　Ａ３２０：３２０ｎｍの吸光度
　　ｌ：セル長
　　ε：タンパク質のモル吸光係数
（４）二重特異性抗体の作製
　前記実施例１（１）で得た、SpyTag-VHH＋SpyCatcher-VHH（Fcダイマー）、CD3-Fab、Her2-Fabを用いて、Herceptin-OKT3二重特異性抗体を作製した。具体的には、ＰＴＳ反応によってSpyTag-VHH+SpyCatcher-VHH、CD3-Fab、Her2-Fab を反応させてHerceptin-Okt3二重特異性抗体を得た。前記実施例１（１）および（２）で得た２μｌの各抗体断片を含むタンパク質（１５０ｍｍｏｌ／ｌ　ＮａＣｌ、５０ｍｍｏｌ／ｌ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）、および１ｍｍｏｌ／ｌ　ＴＣＥＰに溶存）を、マイクロチューブに添加し、ＰＴＳ反応前サンプルを調製した。前記調製後、前記ＰＴＳ反応前サンプルを、３７℃で２４時間の条件で、インキュベータ内で静置し、ＰＴＳ反応を実施した。前記ＰＴＳ反応後、ＰＴＳ反応後サンプルを得た。
（５）各抗体断片の結合による二重特異性抗体結合の検討
　前記実施例１（４）で得た前記ＰＴＳ反応後サンプルについて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより、Herceptin-OKT3二重特異性抗体が製造されているかを検討した。具体的には、４０μｌの前記ＰＴＳ反応後サンプル、Ｆｃ領域（SpyTag-VHHおよびSpyCatcher-VHHの複合体）、Herceptin－Ｆａｂ（Her2-Fab-LおよびHer2-Fab-Hから構成されるＦａｂ、Herceptin）、ＣＤ３－Ｆａｂ（CD3-Fab-LおよびCD3-Fab-Hから構成されるＦａｂ、hOKT3）、またはＰＴＳ反応前サンプルに、１０μｌの５×ＳＤＳバッファーを添加し、懸濁した。前記懸濁後、９５℃で５分の条件で、加熱処置を行った。前記加熱処理後、１２．５％のポリアクリルアミドゲルのウェルにアプライし、１５０～２００Ｖの条件で電気泳動を行った。前記１２．５％のポリアクリルアミドゲルでには、Ｆｃ領域、Herceptin、hOKT3、ＰＴＳ反応前サンプル、ＰＴＳ反応後サンプル、およびマーカーをアプライした。前記電気泳動後、前記ポリアクリルアミドゲルをＣＢＢ（Coomassie Brilliant Blue）染色液で５分間染色を行い、脱染液で脱色を行った。これらの結果を図２に示す。
　図２は、各抗体断片およびＰＴＳ反応前後におけるタンパク質を示す写真である。図２において、写真の上部は、サンプルの種類を示し、写真の右側は、分子量（ｋＤａ）を示す。図２において、各レーンは、左から、Ｆｃ領域、Herceptin、hOKT3、ＰＴＳ反応前サンプル（反応０時間）、ＰＴＳ反応後サンプル（反応２４時間）、およびマーカーを示す。図２に示すように、ＰＴＳ反応後サンプルでは、各抗体を構成する４つのタンパク質を示すバンドが検出された。これらの結果から、ＰＴＳ反応後サンプルは、ＰＴＳ反応によってHerceptin-OKT3二重特異性抗体が製造されていることがわかった。
（６）二重特異性抗体の精製
　つぎに、前記実施例１（４）で得たＰＴＳ反応後サンプルについて、精製した。具体的には、Ｆｃ領域を有するタンパク質を精製するカラムを用いて精製後、Ｆａｂ領域を有するタンパク質を精製するカラムを用いて精製した。まず、Ｆｃ領域を有するタンパク質を、ＫａｎＣａｐＡカラムを用いて精製した。ＫａｎＣａｐＡカラム（ＫＡＮＥＫＡ社製、カラム体積５００μｌ）をＴＢＳバッファー（１５０ｍｍｏｌ／ｌ　ＮａＣｌ、および５０ｍｍｏｌ／ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５））で平衡化後、前記実施例１（４）で得たＰＴＳ反応後サンプルを前記カラムに負荷し、素通り画分を回収した。前記回収後、ＴＢＳバッファー　２０ｍｌを負荷後、洗浄画分を回収した。さらに、Ｅｌｕｔｅバッファー（１００ｍｍｏｌ／ｌ　Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌ（ｐＨ２．８））　２．８ｍｌを負荷し、溶出画分を回収した。前記溶出画分の回収では、前記溶出画分を中和するために、予め回収チューブに１ｍｏｌ／ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）　１．２ｍｌを入れた状態で回収した。そして、回収した溶出画分を透明膜（半透膜）に入れ、透析バッファー（１×ＰＢＳ）を用いて透析した。つぎに、前記透析後のタンパク質サンプルについて、Ｆａｂ領域を有するタンパク質を精製した。ＫａｎＣａｐＬカラム（ＫＡＮＥＫＡ社製、カラム体積５００μｌ）を１×ＰＢＳで平衡化後、前記透析後のタンパク質サンプルを負荷し、素通り画分を回収した。前記回収後、１×ＰＢＳ　１０ｍｌを流し、洗浄画分を回収した。つぎに、Ｅｌｕｔｅバッファー（１００ｍｍｏｌ／ｌ　Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌ（ｐＨ２．８））　７ｍｌを負荷し、溶出画分を回収した。前記溶出画分の回収では、前記溶出画分を中和するために、予め回収チューブに、１ｍｏｌ／ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）　３ｍｌを入れた状態で回収した。その後、回収した溶出画分を透明膜（半透膜）に入れ、前記透析バッファー（１×ＰＢＳ）を用いて透析した。前記透析後、濃縮チューブを用いて濃縮を行った。前記濃縮によって、精製後サンプルを得た。
（７）精製後の二重特異性抗体の検討
　前記実施例１（６）で得た前記精製後サンプルが、Herceptin-Okt3二重特異性抗体を含むか、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて検討した。具体的には、前記ＰＴＳ反応後サンプル、ＫａｎＣａｐＡカラムで精製した溶出画分、素通り画分、または洗浄画分（各４０μｌ）と、ＫａｎＣａｐＬカラムで精製した前記精製後サンプルとに、１０μｌの５×ＳＤＳバッファーを添加し、懸濁した。前記懸濁後、９５℃で５分の条件で、加熱処理した。前記加熱処理後、１２．５％または１０％のポリアクリルアミドゲルのウェルにアプライし、１５０～２００Ｖの条件で電気泳動を行った。前記１２．５％のポリアクリルアミドゲルには、マーカー、ＰＴＳ反応後サンプル、素通り画分、洗浄画分、および溶出画分をアプライした。また、前記１０％のアクリルアミドゲルでは、前記精製後サンプルをアプライした。前記電気泳動後、前記ポリアクリルアミドゲルをＣＢＢ（Coomassie Brilliant Blue）染色液で５分間染色を行い、脱染液で脱色を行った。これらの結果を図３に示す。
　図３は、ＰＴＳ反応後およびカラム精製におけるタンパク質を示す写真である。図３において、（Ａ）は、ＫａｎＣａｐＡカラムでの精製前後のタンパク質の写真を示し、図３（Ｂ）は、ＫａｎＣａｐＬカラムで精製した前記精製後サンプルのタンパク質を示す写真である。図３（Ａ）において、写真の上部は、サンプルの種類を示し、写真の左側は、分子量（ｋＤａ）を示す。図３（Ｂ）において、写真の上部は、サンプルの種類を示し、写真の左側は、分子量（ｋＤａ）を示す。図３（Ａ）において、各レーンは、左から、マーカー、ＰＴＳ反応後サンプル（反応２４時間）、素通り画分（素通り）、洗浄画分（洗浄）、および溶出画分（溶出）を示す。図３（Ａ）に示すように、溶出画分では、目的の各抗体断片のバンドが検出されたが、夾雑タンパク質のバンドも検出された。他方、図３（Ｂ）に示すように、ＫａｎＣａｐＬカラムで精製した前記精製後サンプルでは、目的の各抗体断片のバンドが検出され、夾雑タンパク質のバンドは検出されなかった。これらの結果から、２段階のカラムを用いた精製を行うことによって、目的のHerceptin-Okt3二重特異性抗体のみを精製できることがわかった。
（８）精製した二重特異性抗体の単一性の検討
　前記実施例１（６）で精製したHerceptin-Okt3二重特異性抗体について、Herceptin-Okt3二重特異性抗体が単一であるか、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて検討した。具体的には、ゲル濾過クロマトグラフィー用カラム（Superdex 200 increase 30/100 GL、GE Healthcare社製）に、前記実施例１（６）で精製したタンパク質を０．５ｍＬ／ｍｉｎで流し、室温（約２５℃）の条件下で２１２ｎｍの吸光度を測定した。前記測定では、１×ＰＢＳをバッファーとして用いた。この結果を図４に示す
　図４は、ゲル濾過クロマトグラフィーによるタンパク質の溶出パターンを示すグラフである。図４において、横軸は、排除体積（ｍｌ）を示し、縦軸は、吸光度を示す。図４に示すように、本開示の方法で得た精製後のタンパク質は、２１２ｎｍの吸収波長において、１５ｍｌで単一のピークを示すことがわかった。これらの結果から、本開示の方法で得た精製後のHerceptin-Okt3二重特異性抗体は、単一性を有することがわかった。
（９）ＣＤ３陽性細胞への活性評価
　前記実施例１（６）で得られたHerceptin-Okt3二重特異性抗体が、Ｈｅｒ２またはＣＤ３を発現する細胞に結合するかフローサイトメトリーによって検討した。具体的には、細胞膜表面上にＣＤ３が過剰発現したＨＰＢ－ＡＬＬ株を使用し、フローサイトメーターを用いて測定を行った。Ｔ７５フラスコで培養したＨＰＢ－ＡＬＬを２本の１５ｍｌファルコンチューブに当量移し、１５００ｒｐｍ、５分の条件下で、遠心した。前記遠心後、上清をアスピレーターによって吸引除去し、１×ＰＢＳを必要量加え懸濁し、１×１０６細胞／ｍｌの細胞懸濁液を得た。その後、３つのマイクロチューブ（ａ）～（ｃ）に、それぞれ１ｍｌの前記懸濁液を分注し、１×ＰＢＳで希釈した。前記希釈後、２０００ｒｐｍ、２５℃、７分の条件下で、２つのマイクロチューブ（ａ）および（ｂ）を遠心した。前記遠心後、上清をアスピレーターによって吸引除去し、１ｍｌの１×ＰＢＳを添加した。前記添加後、２０００ｒｐｍ、２５℃、７分の条件下で、２つのマイクロチューブ（ａ）および（ｂ）を再度遠心した。前記遠心後、上清をアスピレーターによって吸引除去し、１つのマイクロチューブ（ｂ）に１×ＰＢＳ、および前記実施例１（６）で精製したHerceptin-Okt3二重特異性抗体を前記Herceptin-Okt3二重特異性抗体の終濃度が０．０５μｍｏｌ／ｌとなるように添加し、転倒混和した。前記転倒混和後、２０分間静置した。前記静置後、２０００ｒｐｍ、２５℃、７分の条件下で、遠心した。その後、マイクロチューブ（ａ）に１μｌのＯＫＴ３－ＦＩＴＣ（コスモ・バイオ社製）、および１ｍｌの１×ＰＢＳを添加し、マイクロチューブ（ｂ）に１μｌのａｎｔｉ－Ｆｃ－ＦＩＴＣ（AbCam社製）、および１ｍｌの１×ＰＢＳを添加し、それぞれ転倒混和した。前記転倒混和後、２０分間静置した。前記静置後、２０００ｒｐｍ、２５℃、７分の条件下で、遠心した。前記遠心後、上清をアスピレーターによって吸引除去し、１ｍｌの１×ＰＢＳを添加した。前記添加後、２０００ｒｐｍ、２５℃、７分の条件下で、再度遠心した。前記遠心後、上清をアスピレーターによって吸引除去し、１ｍｌの１×ＰＢＳを添加し、懸濁した。前記懸濁後、メッシュフィルターを用いて滅菌を行った。測定条件を設定後、ネガティブコントロール（ｃ）、ポジティブコントロール（ａ）、サンプル（ｂ）の順に、セルアナライザＲＦ－５００（シスメックス社製）を用いて測定を行った。測定後はFCSalyzerで測定結果をグラフ化した。これらの結果を図５に示す。
　図５は、フローサイトメトリーによる二重特異性抗体のＣＤ３陽性細胞への結合を示すグラフである。図５において、横軸は、蛍光強度を示し、縦軸は、細胞数を示す。図５に示すように、本開示の方法で得たHerceptin-Okt3二重特異性抗体をＣＤ３陽性細胞に添加した場合、ＣＤ３陽性細胞に添加しなかった場合と比較して、蛍光強度の増加を示すことがわかった。これらの結果から、本発明の製造方法で得たHerceptin-Okt3二重特異性抗体は、ＣＤ３陽性細胞と結合することがわかった。
（１０）ＨＥＲ２陽性細胞への活性評価
　前記実施例１（６）で得られたHerceptin-Okt3二重特異性抗体が、乳がん細胞に結合するかフローサイトメトリーによって検討した。具体的には、細胞膜表面上にＨＥＲ２が過剰発現したＳＫ－ＢＲ－３株を使用し、フローサイトメーターを用いて測定を行った。Ｔ７５フラスコで培養したＳＫ－ＢＲ－３の上清をアスピレーターによって吸引除去し、５ｍｌの１×ＰＢＳ／５ｍｍｏｌ／ｌ　ＥＤＴＡで洗浄した。前記洗浄後、上清をアスピレーターによって吸引除去し、５ｍｌのトリプシンを添加した。その後、３７℃で５分の条件下で、インキュベータ内で静置した。前記静置後、フラスコを軽くタッピングした。前記タッピング後、全量１０ｍｌとなるようにＤＭＥＭ培地を添加し、懸濁によって細胞をフラスコから乖離させ、細胞懸濁液を得た。つぎに、１５ｍｌファルコンチューブに移し、１５００ｒｐｍ、５分の条件下で、前記細胞懸濁液を遠心した。前記遠心後、上清をアスピレーターによって吸引除去し、１×ＰＢＳを必要量加え懸濁し、細胞懸濁液を得た。その後、３つのマイクロチューブ（ｄ）～（ｆ）に、１×１０６細胞の前記懸濁液をそれぞれ１ｍｌ分取し、１×ＰＢＳで希釈した。前記希釈後、２０００ｒｐｍ、２５℃、７分の条件下で、２つのマイクロチューブ（ｄ）および（ｅ）を遠心した。前記遠心後、上清をアスピレーターによって吸引除去し、１ｍｌの１×ＰＢＳを添加した。前記添加後、２０００ｒｐｍ、２５℃、７分の条件下で、２つのマイクロチューブ（ｄ）および（ｅ）を再度遠心した。前記遠心後、上清をアスピレーターによって吸引除去した。前記吸引除去後、１つのマイクロチューブ（ｄ）に１μｌの５ｍｇ／ｍｌ　ハーセプチン（中外製薬社製）および１ｍｌの１×ＰＢＳを添加し、転倒混和した。並行して、１つのマイクロチューブ（ｅ）に１ｍｌの１×ＰＢＳ、および前記実施例１（６）で精製したHerceptin-Okt3二重特異性抗体を前記Herceptin-Okt3二重特異性抗体の終濃度が０．１μｍｏｌ／ｌとなるように添加し、転倒混和した。前記転倒混和後、２つのマイクロチューブ（ｄ）および（ｅ）を２０分間静置した。前記静置後、２０００ｒｐｍ、２５℃、７分の条件下で、２つのマイクロチューブ（ｄ）および（ｅ）を遠心した。前記遠心後、上清をアスピレーターによって吸引除去し、１ｍｌの１×ＰＢＳを添加した。前記添加後、２０００ｒｐｍ、２５℃、７分の条件下で、２つのマイクロチューブ（ｄ）および（ｅ）を再度遠心した。前記遠心後、上清をアスピレーターによって吸引除去し、２つのマイクロチューブ（ｄ）および（ｅ）に、１μｌのａｎｔｉ－Ｆｃ－ＦＩＴＣ（AbCam社製）および１ｍｌの１×ＰＢＳを加え、転倒混和した。前記転倒混和後、２０分間静置した。前記静置後、２０００ｒｐｍ、２５℃、７分の条件下で、２つのマイクロチューブを遠心した。前記遠心後、上清をアスピレーターによって吸引除去し、１ｍｌの１×ＰＢＳを添加した。前記添加後、２０００ｒｐｍ、２５℃、７分の条件下で、２つのマイクロチューブ（ｄ）および（ｅ）を再度遠心した。前記遠心後、上清をアスピレーターによって吸引除去し、１ｍｌの１×ＰＢＳを添加し、懸濁した。前記懸濁後、メッシュフィルターを用いて滅菌を行った。測定条件を設定後、ネガティブコントロール（ｆ）、ポジティブコントロール（ｄ）、サンプル（ｅ）の順に、セルアナライザＲＦ－５００（シスメックス社製）を用いて測定を行った。測定後はFCSalyzerで測定結果をグラフ化した。これらの結果を図６に示す。
　図６は、フローサイトメトリーによる二重特異性抗体のＨＥＲ２陽性細胞への結合を示すグラフである。図６において、横軸は、蛍光強度を示し、縦軸は、細胞数を示す。図６に示すように、本発明の製造方法で得たHerceptin-Okt3二重特異性抗体をＨＥＲ２陽性細胞に添加した場合、ＨＥＲ２陽性細胞に添加しなかった場合と比較して、蛍光強度の増加を示すことがわかった。これらの結果から、本開示の方法で得たHerceptin-Okt3二重特異性抗体は、Ｈｅｒ２陽性乳がん細胞と結合することがわかった。
（１１）表面プラズモン共鳴法によるＨＥＲ２陽性細胞への活性維持評価
　前記実施例１（６）で得られたHerceptin-Okt3二重特異性抗体が、Ｈｅｒ２への結合を維持できるか表面プラズモン共鳴法を用いて検討した。具体的には、センサーチップに固定化したＨＥＲ２にHerceptin-Okt3二重特異性抗体を所定の流速で流し、分子間相互作用解析装置を用いて測定を行った。前記実施例１（６）で精製したHerceptin-Okt3二重特異性抗体を、１×ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０を用いて、１ｎｍｏｌ／ｌ、２ｎｍｏｌ／ｌ、４ｎｍｏｌ／ｌ、８ｎｍｏｌ／ｌ、および１６ｎｍｏｌ／ｌに希釈した。前記希釈後、表面プラズモン共鳴法測定装置（Ｂｉａｃｏｒｅ　Ｔ２００、Cytiva社製）を用いて、前記Herceptin-Okt3二重特異性抗体を含む希釈液を、ＣＭ５センサーチップ（GE Healthcare社製）上に固定化されたＨＥＲ２－ｈＦｃに流すことにより、結合強度の測定を行なった。この結果を図７に示す。
　図７は、表面プラズモン共鳴法による二重特異性抗体のＨＥＲ２への結合維持を示すグラフである。図７において、横軸は、時間（分）を示し、縦軸は、レスポンスユニット（ＲＵ）を示す。図７に示すように、本開示の方法で得たHerceptin-Okt3二重特異性抗体をＨＥＲ２に添加した場合、解離平衡定数Ｋｄ値は、２．２５×１０－９（Ｍ）であった。これらの結果から、本発明の製造方法で得たHerceptin-Okt3二重特異性抗体は、ＨＥＲ２への結合が維持されていることがわかった。
　以上、実施形態を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。
　本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用される。
＜付記＞
　上記の実施形態および実施例の一部または全部は、以下の付記のように記載されうるが、以下には限られない。
＜ヘテロダイマータンパク質の製造方法＞
（付記１）
ヘテロダイマータンパク質の製造方法であって、
反応タグを含むダイマータンパク質を、前記ダイマータンパク質を修飾する修飾タンパク質と反応させて、ヘテロダイマータンパク質を製造する製造工程を含み、
　前記反応タグを含むダイマータンパク質は、第１のモノマータンパク質と、第２のモノマータンパク質とを含み、
　　前記第１のモノマータンパク質は、第１の反応タグおよびダイマーを形成可能な第１のダイマー形成ドメインを、この順序で含み、
　　前記第１の反応タグは、結合タグおよび第１のＣインテインを含み、
　　前記第２のモノマータンパク質は、第２の反応タグおよび前記第１のダイマー形成ドメインとダイマーを形成可能な第２のダイマー形成ドメインを、この順序で含み、
　　前記第２の反応タグは、前記結合タグに結合可能な結合パートナーおよび第２のＣインテインを含み、
　前記修飾タンパク質は、第１の修飾タンパク質と、第２の修飾タンパク質とを含み、
　　前記第１の修飾タンパク質は、前記第１のＣインテインと反応可能な第１のＮインテインおよび前記第１のモノマータンパク質に付加される第１の付加物を含み、
　　前記第２の修飾タンパク質は、前記第２のＣインテインと反応可能な第２のＮインテインおよび前記第２のモノマータンパク質に付加される第２の付加物を含み、
　前記第１の付加物と、前記第２の付加物とは、異なる付加物であり、
　前記第１のモノマータンパク質および前記第２のモノマータンパク質は、ダイマーを形成しており、
前記製造工程において、
　前記第１の修飾タンパク質の前記第１のＮインテインが、前記第１のモノマータンパク質の第１のＣインテインと反応して、前記第１の修飾タンパク質の第１の付加物が、前記第１のモノマータンパク質に連結され、
　前記第２の修飾タンパク質の前記第２のＮインテインが、前記第２のモノマータンパク質の第２のＣインテインと反応して、前記第２の修飾タンパク質の第２の付加物が、前記第２のモノマータンパク質に連結される、
製造方法。
（付記２）
前記第１のモノマータンパク質と、前記第２のモノマータンパク質とを反応させて、ダイマーを形成する形成工程を含む、付記１に記載の製造方法。
（付記３）
前記結合タグおよび前記結合パートナーは、自発的に共有結合を形成可能なペプチドタグおよびペプチドである、付記１または２に記載の製造方法。
（付記４）
前記結合タグおよび前記結合パートナーとの結合は、共有結合である、付記１から３のいずれかに記載の製造方法。
（付記５）
前記結合タグおよび前記結合パートナーは、それぞれ、化膿レンサ球菌表面タンパク質（ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ）および前記ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒと結合可能なペプチドタグ（ＳｐｙＴａｇ）である、または
前記結合タグおよび前記結合パートナーは、それぞれ、前記ＳｐｙＴａｇおよび前記ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒである、付記１から４のいずれかに記載の製造方法。
（付記６）
前記ダイマータンパク質は、免疫グロブリンのＦｃ領域の一部または全部を含む、付記１から５のいずれかに記載の製造方法。
（付記７）
前記免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭである、付記６に記載の製造方法。
（付記８）
前記ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である、付記７に記載の製造方法。
（付記９）
前記免疫グロブリンのＦｃ領域は、変異を含まない、付記６から８のいずれかに記載の製造方法。
（付記１０）
前記第１のＣインテインおよび前記第１のＮインテインは、それぞれ、一体型インテインまたはスプリット型インテインのＣインテインおよびＮインテインである、および／または
前記第２のＣインテインおよび前記第２のＮインテインは、それぞれ、一体型インテインまたはスプリット型インテインのＣインテインおよびＮインテインである、付記１から９のいずれかに記載の製造方法。
（付記１１）
前記第１の付加物および／または前記第２の付加物は、タンパク質である、付記１から１０のいずれかに記載の製造方法。
（付記１２）
前記タンパク質は、抗体改変体、重鎖抗体（ＶＨＨ）、受容体、サイトカイン、ケモカイン、毒素、酵素、蛍光タンパク質、およびコラーゲン結合ドメインからなる群から選択される、付記１１に記載の製造方法。
（付記１３）
前記抗体改変体は、Ｆａｂ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、タンデムｓｃＦｖ、重鎖抗体（ＶＨＨ）および前記ＶＨＨの可変ドメインからなる群から選択される、付記１２に記載の製造方法。
（付記１４）
前記ダイマータンパク質は、免疫グロブリンのＦｃ領域の一部または全部を含み、
前記第１の付加物および前記第２の付加物は、抗体改変体および／または重鎖抗体（ＶＨＨ）を含み、
前記ヘテロダイマータンパク質は、多重特異性抗体である、付記１から１３のいずれかに記載の製造方法。
（付記１５）
前記ダイマータンパク質では、前記第１のモノマータンパク質と前記第２のモノマータンパク質とが、ジスルフィド結合により連結されている、付記１から１４のいずれかに記載の製造方法。
＜ダイマータンパク質＞
（付記１６）
反応タグを含むダイマータンパク質を含み、
　前記反応タグを含むダイマータンパク質は、第１のモノマータンパク質と、第２のモノマータンパク質とを含み、
　　前記第１のモノマータンパク質は、第１の反応タグおよびダイマーを形成可能な第１のダイマー形成ドメインを含み、
　　前記第１の反応タグは、結合タグおよび第１のＮインテインと反応可能な第１のＣインテインを含み、
　　前記第２のモノマータンパク質は、第２の反応タグおよび前記第１のダイマー形成ドメインとダイマーを形成可能な第２のダイマー形成ドメインを、この順序で含み、
　　前記第２の反応タグは、前記結合タグに結合可能な結合パートナーおよび第２のＮインテインと反応可能な第２のＣインテインを含み、
　前記第１のモノマータンパク質および前記第２のモノマータンパク質は、ダイマーを形成している、
タンパク質。
（付記１７）
前記結合タグおよび前記結合パートナーは、自発的に共有結合を形成可能なペプチドタグおよびペプチドである、付記１６に記載のタンパク質。
（付記１８）
前記結合タグおよび前記結合パートナーとの結合は、共有結合である、付記１６または１７に記載のタンパク質。
（付記１９）
前記結合タグおよび前記結合パートナーは、それぞれ、化膿レンサ球菌表面タンパク質（ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ）および前記ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒと結合可能なペプチドタグ（ＳｐｙＴａｇ）である、または
前記結合タグおよび前記結合パートナーは、それぞれ、前記ＳｐｙＴａｇおよび前記ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒである、付記１６から１８のいずれかに記載のタンパク質。
（付記２０）
前記ダイマータンパク質は、免疫グロブリンのＦｃ領域の一部または全部を含み、付記１６から１９のいずれかに記載のタンパク質。
（付記２１）
前記免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭである、付記２０に記載のタンパク質。
（付記２２）
前記ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である、付記２１に記載のタンパク質。
（付記２３）
前記免疫グロブリンのＦｃ領域は、変異を含まない、付記２０から２２のいずれかに記載のタンパク質。
（付記２４）
前記第１のＣインテインおよび前記第１のＮインテインは、それぞれ、一体型インテインまたはスプリット型インテインのＣインテインおよびＮインテインである、および／または
前記第２のＣインテインおよび前記第２のＮインテインは、それぞれ、一体型インテインまたはスプリット型インテインのＣインテインおよびＮインテインである、付記１６から２３のいずれかに記載のタンパク質。
＜モノマータンパク質＞
（付記２５）
第１のモノマータンパク質を含み、
前記第１のモノマータンパク質は、第１の反応タグおよびダイマーを形成可能な第１のダイマー形成ドメインを、この順序で含み、
前記第１の反応タグは、結合パートナーと結合可能な結合タグおよび第１のＮインテインと反応可能な第１のＣインテインを含み、
前記第１のモノマータンパク質は、第２のモノマータンパク質とダイマーを形成可能であり、
前記第２のモノマータンパク質は、第２の反応タグおよび前記第１のダイマー形成ドメインとダイマーを形成可能な第２のダイマー形成ドメインを含み、
前記第２の反応タグは、前記結合タグと結合可能な結合パートナーおよび第２のＮインテインと反応可能な第２のＣインテインを含む、タンパク質。
（付記２６）
第２のモノマータンパク質を含み、
前記第２のモノマータンパク質は、第２の反応タグおよびダイマーを形成可能な第２のダイマー形成ドメインを、この順序で含み、
前記第２の反応タグは、結合タグと結合可能な結合パートナーおよび第２のＮインテインと反応可能な第２のＣインテインを含み、
前記第２のモノマータンパク質は、第１のモノマータンパク質とダイマーを形成可能であり、
前記第１のモノマータンパク質は、第１の反応タグおよび前記第２のダイマー形成ドメインとダイマーを形成可能な第１のダイマー形成ドメインを、この順序で含み、
前記第１の反応タグは、前記結合パートナーと結合可能な結合タグおよび第１のＮインテインと反応可能な第１のＣインテインを含む、タンパク質。
（付記２７）
前記結合タグおよび前記結合パートナーは、自発的に共有結合を形成可能なペプチドタグおよびペプチドである、付記２５または２６に記載のタンパク質。
（付記２８）
前記結合タグおよび前記結合パートナーとの結合は、共有結合である、付記２５から２７のいずれかに記載のタンパク質。
（付記２９）
前記結合タグおよび前記結合パートナーは、それぞれ、化膿レンサ球菌表面タンパク質（ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ）および前記ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒと結合可能なペプチドタグ（ＳｐｙＴａｇ）である、または
前記結合タグおよび前記結合パートナーは、それぞれ、前記ＳｐｙＴａｇおよび前記ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒである、付記２５から２８のいずれかに記載のタンパク質。
（付記３０）
前記ダイマータンパク質は、免疫グロブリンのＦｃ領域の一部または全部を含み、付記２５から２９のいずれかに記載のタンパク質。
（付記３１）
前記免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭである、付記３０に記載のタンパク質。
（付記３２）
前記ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である、付記３１に記載のタンパク質。
（付記３３）
前記免疫グロブリンのＦｃ領域の一部または全部は、変異を含まない、付記３０から３２のいずれかに記載のタンパク質。
（付記３４）
前記第１のＣインテインおよび前記第１のＮインテインは、それぞれ、一体型インテインまたはスプリット型インテインのＣインテインおよびＮインテインである、および／または
前記第２のＣインテインおよび前記第２のＮインテインは、それぞれ、一体型インテインまたはスプリット型インテインのＣインテインおよびＮインテインである、付記２５から３３のいずれかに記載のタンパク質。
＜核酸＞
（付記３５）
付記２５および２７から３４のいずれかに記載のタンパク質をコードする、核酸。
（付記３６）
付記２６から３４のいずれかに記載のタンパク質をコードする、核酸。
＜発現ベクター＞
（付記３７）
付記３５に記載の核酸、および／または、付記３６に記載の核酸を含む、発現ベクター。
（付記３８）
第１の修飾タンパク質をコードする核酸、および／または、第２の修飾タンパク質をコードする核酸を含み、
　　前記第１の修飾タンパク質は、前記第１のＣインテインと反応可能な第１のＮインテインおよび前記第１のモノマータンパク質に付加される第１の付加物を含み、
　　前記第２の修飾タンパク質は、前記第２のＣインテインと反応可能な第２のＮインテインおよび前記第２のモノマータンパク質に付加される第２の付加物を含み、
　前記第１の付加物と、前記第２の付加物とは、異なる付加物である、
付記３７に記載の発現ベクター。
（付記３９）
前記第１の付加物および／または前記第２の付加物は、タンパク質である、付記３８に記載の発現ベクター。
（付記４０）
前記タンパク質は、抗体改変体、重鎖抗体（ＶＨＨ）、受容体、サイトカイン、ケモカイン、毒素、蛍光タンパク質、およびコラーゲン結合ドメインからなる群から選択される、付記３９に記載の発現ベクター。
（付記４１）
前記抗体改変体は、Ｆａｂ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、タンデムｓｃＦｖ、重鎖抗体（ＶＨＨ）、および前記ＶＨＨの可変ドメインからなる群から選択される、付記４０に記載の発現ベクター。
（付記４２）
付記３５に記載の核酸を含む発現ベクターと、付記３６に記載の核酸を含む発現ベクターとを含む、発現ベクターセット。
（付記４３）
第１の修飾タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクター、および／または、第２の修飾タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを含み、
　　前記第１の修飾タンパク質は、前記第１のＣインテインと反応可能な第１のＮインテインおよび前記第１のモノマータンパク質に付加される第１の付加物を含み、
　　前記第２の修飾タンパク質は、前記第２のＣインテインと反応可能な第２のＮインテインおよび前記第２のモノマータンパク質に付加される第２の付加物を含み、
　前記第１の付加物と、前記第２の付加物とは、異なる付加物である、
付記４２に記載の発現ベクターセット。
（付記４４）
前記第１の付加物および／または前記第２の付加物は、タンパク質である、付記４３に記載の発現ベクターセット。
（付記４５）
前記タンパク質は、抗体改変体、重鎖抗体（ＶＨＨ）、受容体、サイトカイン、ケモカイン、毒素、蛍光タンパク質、およびコラーゲン結合ドメインからなる群から選択される、付記４４に記載の発現ベクターセット。
（付記４６）
前記抗体改変体は、Ｆａｂ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、タンデムｓｃＦｖ、重鎖抗体（ＶＨＨ）、および前記ＶＨＨの可変ドメインからなる群から選択される、付記４５に記載の発現ベクターセット。
＜形質転換体＞
（付記４７）
付記３５に記載の核酸、付記３６に記載の核酸、付記３７から４１のいずれかに記載の発現ベクター、および／または、付記４２から４５のいずれかに記載の発現ベクターセットを含む、形質転換体。
＜タンパク質の製造方法＞
（付記４８）
付記３５に記載の核酸、付記３６に記載の核酸、付記３７から４１のいずれかに記載の発現ベクター、および／または、付記４２から４５のいずれかに記載の発現ベクターセットを発現させる発現工程を含む、タンパク質の製造方法。
（付記４９）
前記発現工程は、
　付記４７に記載の形質転換体を培養する培養工程と、
　第１のモノマータンパク質、および／または第２のモノマータンパク質を単離する単離工程と、
を含む、付記４８に記載の製造方法。
＜スクリーニング方法＞
（付記５０）
反応タグを含むダイマータンパク質を、前記ダイマータンパク質を修飾する修飾タンパク質と反応させて、候補ヘテロダイマータンパク質を製造する製造工程と、
前記候補ヘテロダイマータンパク質を標的と接触させ、前記候補ヘテロダイマータンパク質と前記標的との反応を検出する検出工程と、
前記反応が検出された前記候補ヘテロダイマータンパク質を前記標的と反応する候補物質として選抜する選抜工程を含み、
前記製造工程は、付記１から１５のいずれかに記載の製造方法により実施される、標的反応性のヘテロダイマータンパク質のスクリーニング方法。
（付記５１）
前記反応は、結合である、付記５０に記載のスクリーニング方法。
（付記５２）
前記標的は、腫瘍抗原、およびＣＤ（cluster of differentiation）抗原からなる群から選択される、付記５０または５１に記載のスクリーニング方法。
（付記５３）
前記候補へテロタンパク質は、標識を含み、
前記検出工程では、前記標識を検出する、付記５０から５２のいずれかに記載のスクリーニング方法。
　以上のように、本発明によれば、二重特異性抗体等のヘテロダイマータンパク質について、天然のアミノ酸配列から構成されるドメインのみから構成されるヘテロダイマータンパク質も製造できる。また、本発明によれば、ダイマータンパク質に対して、所望の修飾ペプチドを負荷できる。このため、本発明は、例えば、医薬分野、医薬の製造分野等において極めて有用である。

Claims (28)

  1. ヘテロダイマータンパク質の製造方法であって、
    反応タグを含むダイマータンパク質を、前記ダイマータンパク質を修飾する修飾タンパク質と反応させて、ヘテロダイマータンパク質を製造する製造工程を含み、
    　前記反応タグを含むダイマータンパク質は、第１のモノマータンパク質と、第２のモノマータンパク質とを含み、
    　　前記第１のモノマータンパク質は、第１の反応タグおよびダイマーを形成可能な第１のダイマー形成ドメインを、この順序で含み、
    　　前記第１の反応タグは、結合タグおよび第１のＣインテインを含み、
    　　前記第２のモノマータンパク質は、第２の反応タグおよび前記第１のダイマー形成ドメインとダイマーを形成可能な第２のダイマー形成ドメインを、この順序で含み、
    　　前記第２の反応タグは、前記結合タグに結合可能な結合パートナーおよび第２のＣインテインを含み、
    　前記修飾タンパク質は、第１の修飾タンパク質と、第２の修飾タンパク質とを含み、
    　　前記第１の修飾タンパク質は、前記第１のＣインテインと反応可能な第１のＮインテインおよび前記第１のモノマータンパク質に付加される第１の付加物を含み、
    　　前記第２の修飾タンパク質は、前記第２のＣインテインと反応可能な第２のＮインテインおよび前記第２のモノマータンパク質に付加される第２の付加物を含み、
    　前記第１の付加物と、前記第２の付加物とは、異なる付加物であり、
    　前記第１のモノマータンパク質および前記第２のモノマータンパク質は、ダイマーを形成しており、
    前記製造工程において、
    　前記第１の修飾タンパク質の前記第１のＮインテインが、前記第１のモノマータンパク質の第１のＣインテインと反応して、前記第１の修飾タンパク質の第１の付加物が、前記第１のモノマータンパク質に連結され、
    　前記第２の修飾タンパク質の前記第２のＮインテインが、前記第２のモノマータンパク質の第２のＣインテインと反応して、前記第２の修飾タンパク質の第２の付加物が、前記第２のモノマータンパク質に連結される、
    製造方法。
  2. 前記第１のモノマータンパク質と、前記第２のモノマータンパク質とを反応させて、ダイマーを形成する形成工程を含む、請求項１に記載の製造方法。
  3. 前記結合タグおよび前記結合パートナーは、自発的に共有結合を形成可能なペプチドタグおよびペプチドである、請求項１または２に記載の製造方法。
  4. 前記結合タグおよび前記結合パートナーとの結合は、共有結合である、請求項１または２に記載の製造方法。
  5. 前記結合タグおよび前記結合パートナーは、それぞれ、化膿レンサ球菌表面タンパク質（ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ）および前記ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒと結合可能なペプチドタグ（ＳｐｙＴａｇ）である、または
    前記結合タグおよび前記結合パートナーは、それぞれ、前記ＳｐｙＴａｇおよび前記ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒである、請求項１または２に記載の製造方法。
  6. 前記ダイマータンパク質は、免疫グロブリンのＦｃ領域の一部または全部を含む、請求項１または２に記載の製造方法。
  7. 前記免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭである、請求項６に記載の製造方法。
  8. 前記ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である、請求項７に記載の製造方法。
  9. 前記免疫グロブリンのＦｃ領域は、変異を含まない、請求項６または７に記載の製造方法。
  10. 前記第１のＣインテインおよび前記第１のＮインテインは、それぞれ、一体型インテインまたはスプリット型インテインのＣインテインおよびＮインテインである、および／または
    前記第２のＣインテインおよび前記第２のＮインテインは、それぞれ、一体型インテインまたはスプリット型インテインのＣインテインおよびＮインテインである、請求項１または２に記載の製造方法。
  11. 前記第１の付加物および／または前記第２の付加物は、タンパク質である、請求項１または２に記載の製造方法。
  12. 前記タンパク質は、抗体改変体、重鎖抗体（ＶＨＨ）、受容体、サイトカイン、ケモカイン、毒素、酵素、蛍光タンパク質、およびコラーゲン結合ドメインからなる群から選択される、請求項１１に記載の製造方法。
  13. 前記抗体改変体は、Ｆａｂ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、タンデムｓｃＦｖ、重鎖抗体（ＶＨＨ）および前記ＶＨＨの可変ドメインからなる群から選択される、請求項１２に記載の製造方法。
  14. 前記ダイマータンパク質は、免疫グロブリンのＦｃ領域の一部または全部を含み、
    前記第１の付加物および前記第２の付加物は、抗体改変体および／または重鎖抗体（ＶＨＨ）を含み、
    前記ヘテロダイマータンパク質は、多重特異性抗体である、請求項１または２に記載の製造方法。
  15. 前記ダイマータンパク質では、前記第１のモノマータンパク質と前記第２のモノマータンパク質とが、ジスルフィド結合により連結されている、請求項１または２に記載の製造方法。
  16. 反応タグを含むダイマータンパク質を含み、
    　前記反応タグを含むダイマータンパク質は、第１のモノマータンパク質と、第２のモノマータンパク質とを含み、
    　　前記第１のモノマータンパク質は、第１の反応タグおよびダイマーを形成可能な第１のダイマー形成ドメインを含み、
    　　前記第１の反応タグは、結合タグおよび第１のＮインテインと反応可能な第１のＣインテインを含み、
    　　前記第２のモノマータンパク質は、第２の反応タグおよび前記第１のダイマー形成ドメインとダイマーを形成可能な第２のダイマー形成ドメインを、この順序で含み、
    　　前記第２の反応タグは、前記結合タグに結合可能な結合パートナーおよび第２のＮインテインと反応可能な第２のＣインテインを含み、
    　前記第１のモノマータンパク質および前記第２のモノマータンパク質は、ダイマーを形成している、
    タンパク質。
  17. 第１のモノマータンパク質を含み、
    前記第１のモノマータンパク質は、第１の反応タグおよびダイマーを形成可能な第１のダイマー形成ドメインを、この順序で含み、
    前記第１の反応タグは、結合パートナーと結合可能な結合タグおよび第１のＮインテインと反応可能な第１のＣインテインを含み、
    前記第１のモノマータンパク質は、第２のモノマータンパク質とダイマーを形成可能であり、
    前記第２のモノマータンパク質は、第２の反応タグおよび前記第１のダイマー形成ドメインとダイマーを形成可能な第２のダイマー形成ドメインを含み、
    前記第２の反応タグは、前記結合タグと結合可能な結合パートナーおよび第２のＮインテインと反応可能な第２のＣインテインを含む、タンパク質。
  18. 第２のモノマータンパク質を含み、
    前記第２のモノマータンパク質は、第２の反応タグおよびダイマーを形成可能な第２のダイマー形成ドメインを、この順序で含み、
    前記第２の反応タグは、結合タグと結合可能な結合パートナーおよび第２のＮインテインと反応可能な第２のＣインテインを含み、
    前記第２のモノマータンパク質は、第１のモノマータンパク質とダイマーを形成可能であり、
    前記第１のモノマータンパク質は、第１の反応タグおよび前記第２のダイマー形成ドメインとダイマーを形成可能な第１のダイマー形成ドメインを、この順序で含み、
    前記第１の反応タグは、前記結合パートナーと結合可能な結合タグおよび第１のＮインテインと反応可能な第１のＣインテインを含む、タンパク質。
  19. 請求項１６に記載のタンパク質をコードする、核酸。
  20. 請求項１７に記載のタンパク質をコードする、核酸。
  21. 請求項１８に記載のタンパク質をコードする、核酸。
  22. 請求項１９に記載の核酸の核酸を含む、発現ベクター。
  23. 請求項２０に記載の核酸と、請求項２１に記載の核酸とを含む発現ベクターを含む、発現ベクターセット。
  24. 請求項１９から２１のいずれか一項に記載の核酸、請求項２２に記載の発現ベクター、および／または、請求項２０に記載の核酸と、請求項２１に記載の核酸とを含む発現ベクターを含む、発現ベクターセットを発現させる発現工程を含む、タンパク質の製造方法。
  25. 反応タグを含むダイマータンパク質を、前記ダイマータンパク質を修飾する修飾タンパク質と反応させて、候補ヘテロダイマータンパク質を製造する製造工程と、
    前記候補ヘテロダイマータンパク質を標的と接触させ、前記候補ヘテロダイマータンパク質と前記標的との反応を検出する検出工程と、
    前記反応が検出された前記候補ヘテロダイマータンパク質を前記標的と反応する候補物質として選抜する選抜工程を含み、
    前記製造工程は、請求項１または２に記載の製造方法により実施される、標的反応性のヘテロダイマータンパク質のスクリーニング方法。
  26. 前記反応は、結合である、請求項２５に記載のスクリーニング方法。
  27. 前記標的は、腫瘍抗原、およびＣＤ（cluster of differentiation）抗原からなる群から選択される、請求項２５または２６に記載のスクリーニング方法。
  28. 前記候補へテロタンパク質は、標識を含み、
    前記検出工程では、前記標識を検出する、請求項２５または２７に記載のスクリーニング方法。

     
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