CN117384936A - 一种酵母展示载体及酵母展示双特异Fab的方法 - Google Patents

一种酵母展示载体及酵母展示双特异Fab的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN117384936A
CN117384936A CN202210808296.4A CN202210808296A CN117384936A CN 117384936 A CN117384936 A CN 117384936A CN 202210808296 A CN202210808296 A CN 202210808296A CN 117384936 A CN117384936 A CN 117384936A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tag
yeast
antigen
tigit
yeast display
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210808296.4A
Other languages
English (en)
Inventor
梁世忠
俞金泉
李胜峰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bio Thera Solutions Ltd
Original Assignee
Bio Thera Solutions Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bio Thera Solutions Ltd filed Critical Bio Thera Solutions Ltd
Priority to CN202210808296.4A priority Critical patent/CN117384936A/zh
Publication of CN117384936A publication Critical patent/CN117384936A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/035—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal for targeting to the external surface of a cell, e.g. to the outer membrane of Gram negative bacteria, GPI- anchored eukaryote proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/102—Plasmid DNA for yeast

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种酵母展示共用轻链的双特异Fab片段的载体和方法，便于抗体或抗原结合片段的改造及建库。

Description

一种酵母展示载体及酵母展示双特异Fab的方法
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种展示共用轻链的双特异Fab的酵母展示载体及方法。
背景技术
酵母表面展示技术是继噬菌体展示技术发明之后发展起来的蛋白表面展示技术，可用于构建和筛选抗体文库。传统的噬菌体展示技术的主要原理是把目的蛋白质与噬菌体外壳蛋白质融合表达，然后通过固相或液相方法进行抗原筛选，但是其有以下缺点，一是其利用的是原核表达系统，不利于复杂蛋白的表达；二是其筛选抗体的过程近似于黑箱操作。Wittrup于1997首次发表了酵母展示的文章，酵母展示技术是利用真核表达系统，具有与哺乳动物细胞类似的蛋白质修饰和折叠机制，且通过与流式细胞分选技术结合，研究人员可实时监控筛选过程，特别是针对抗体的亲和力或者阻断活性等性质进行精细的筛选。
通常来说，具有抗体功能活性结构的抗体，除了完整的全抗之外，还包括scFv，scFab，Fab片段等。scFv是具有抗体活性的最小功能单位，其结构简单，便于改造和建库。单链Fab(scFab)的抗体重链VH-CH1和VL-CL通过一个柔性氨基酸多肽连接子连接并实现scFab的重链VH-CH1和轻链匹配，Fab是由重链VH-CH1结构域与轻链通过二硫键匹配组成的抗原结合片段。与scFv相比，scFab和Fab的结构和亲和力都更接近于IgG型式的全抗。而Fab的结构则更加复杂，这导致Fab表达系统的改造和建库都相对复杂和麻烦，其中涉及重链和轻链之间的匹配和二硫键形成。目前利用Aga1-Aga2酵母细胞表面展示系统产生Fab片段的方法，主要为在一个表达质粒上利用两个完整的启动子和读码框分别表达Fab的重链区和轻链，再将质粒转化到酵母细胞中诱导表达，将完整的Fab展示到酵母表面。由于酵母本身对于蛋白质二硫键形成和修饰等能力较弱，因此经常产生稳定性差或低活性的Fab或其片段。
目前双特异抗体的开发被受关注，而共用轻链的双特异抗体是其中的一个有潜力的发展方向。它的优势之一是，借助于共用轻链，其能在结构上尽量维持IgG型式的结构，方便下游的工艺开发。
发明内容
本发明涉及一个可以用于酵母展示共用轻链的双特异抗体的质粒，其能方便这类双特异抗体的改造优化。共用轻链型式的双特异抗体Fab是一种常用的双特异抗体型式，相比于scFv等型式，其结构更类似于天然的IgG抗体。由于两个Fab是共用一个VL，所以在针对VL的做任何优化或突变时，会导致两个Fab的性质都发生改变。酵母展示质粒能够使得共用轻链的两种Fab展示在同一个酵母上，因此基于VL突变而导致的两种Fab的变化能够在同一个酵母上被检测出来。比如，该质粒可用于基于VL突变的亲和力成熟，筛选能同步提高两种Fab亲和力的VL突变。
在一个方面，本发明提供了一种用于酵母表面展示共用轻链的双特异Fab的重组质粒，其特征在于：包含编码共用轻链VL-CL的第一多核苷酸，编码靶向第一抗原的VH1-CH1a的第二多核苷酸和编码靶向第二抗原的VH2-CH1b的第三多核苷酸，所述第一多核苷酸的3’末端连接有酵母锚定蛋白基因。在一些实施方案中，所述酵母锚定蛋白为Aga2p。
在一些实施方案中，所述酵母展示载体包含pYD1质粒骨架、编码共用轻链VL-CL的第一多核苷酸，编码靶向第一抗原的VH1-CH1a的第二多核苷酸和编码靶向第二抗原VH2-CH1b基因的第三多核苷酸，所述第一多核苷酸的3’末端连接有酵母锚定蛋白基因。在一些实施方案中，所述酵母锚定蛋白为Aga2p。在一些实施方案中，所述酵母锚定蛋白为α-凝集素、Flolp蛋白、Cwp1p蛋白、Cwp2p蛋白、或Tip1p等。
在一些实施方案中，所述第一多核苷酸、第二多核苷酸或第三多核苷酸之间包含启动子或自剪切多肽基因。在一些实施方案中，所述第二多核苷酸和第三多核苷酸之间、第三多核苷酸和第一多核苷酸之间包含自剪切多肽基因。在一些实施方案中，所述自剪切多肽为P2A。
在一些实施方案中，所述第一多核苷酸，第二多核苷酸和/或第三多核苷酸的3’末端连接有蛋白检测标签基因。在一些实施方案中，所述蛋白检测标签选自His标签、Myc标签、HA标签、V5标签、Arg标签、Avi标签、Flag标签、3xFlag标签、Strep标签、Nano标签、SBP标签、S标签、钙调蛋白结合肽、纤维素结合结构域、几丁质结合结构域、GST标签和MBP标签。在一些实施方案中，所述蛋白检测标签选自Myc标签，V5标签和HA标签。
在一些实施方案中，所述酵母展示载体包含编码任选的信号肽-VH1-CH1a-任选的连接子和/或标签-P2A-任选的信号肽-VH2-CH1b-任选的连接子和/或标签-P2A-任选的信号肽-VL-CL-3GS-酵母锚定蛋白-任选的标签的多核苷酸。
在一些实施方案中，所述酵母展示载体包含编码SP1-VH1-CH1a-GS-Myc-P2A-SP2-VH2-CH1b-GS-HA-P2A-SP3-VL-CL-3GS-Aga2p-V5的多核苷酸。
在一些实施方案中，所述酵母展示载体为PYD-Fab-BICL(载体图谱如图1所示)。
在另一方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含上述酵母展示载体。在一些实施方案中，所述宿主细胞为酵母。在一些实施方案中，所述酵母细胞选自：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(Pichia Pastoris)、巴氏酵母(SaccharomycesPastorianus)、贝酵母(Saccharomyces Bayanus)、乳酸克鲁维酵母(KluyveromycesLactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces Marxianus)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces Pombe)、白色假丝酵母(Candida Albicans)、树干毕赤酵母(Pichia Stipitis)、解脂耶氏酵母(Yarrowia Lipolytica)、多形汉逊酵母(HansenulaPolymorpha)、红法夫酵母(Phaffia Rhodozyma)、产朊假丝酵母(Candida Utilis)、耐盐酵母(Arxula Adeninivorans)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces Hansenii)、多形德巴利酵母(Debaryomyces Polymorphus)、、西方许旺酵母(Schwanniomyces Occidentalis)或其衍生物。在一些实施方案中，所述酵母为酿酒酵母。在一些实施方案中，所述酵母为表达a-凝集素的aga1p亚基的酿酒酵母。在一些实施方案中，所述酵母为酿酒酵母EBY100。
在另一方面，本发明提供一种酵母展示双特异Fab的方法，包括将上述酵母展示载体转入酵母细胞，获得含有酵母展示载体的酵母，然后进行培养和诱导。在一些实施方案中，所述酵母为表达a-凝集素的aga1p亚基的酿酒酵母。在一些实施方案中，所述酵母为酿酒酵母EBY100。
在一些实施方案中，所述第一抗原和第二抗原可以为不同的靶点或同一靶点的不同表位；例如，所述第一抗原和/或第二抗原独立选自TIGIT、4-1BB、OX40、PD-1、PD-L1、ANGPT2、APLP2、BAFF、BCMA、CCR2、CD123、CD16、CD19、CD20、CD22、CD28、CD3、CD30、CD40、CD47、CD73、CDH17、cMET、CSF1R、CTLA-4、Claudin18.2、DLL4、EGFR、FGFR1、GITR、HER2、HGF、IL-13、IL-17、IL-17A、IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-4Ra、IL-5、IL-6、IL-6R、KLB、LAG-3、MSLN、PSMA、TfR、TGFβ、TIM-3、TRAILR2、VEGF、VISTA、ICOS，病毒抗原如新冠病毒抗原。
在一些实施方案中，所述第一抗原和第二抗原独立选自于：细胞因子包括IL-1α(白介素IL-1α)、IL-1β(白介素IL-1β)、IL-13(白介素IL-13)、TNF-α(肿瘤坏死因子α)、TNF-β(肿瘤坏死因子β)、TIM-3(T cell immunoglobin domain and mucin domain-3)、LAG3(淋巴细胞活化基因-3分子)、CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关抗原)、TIGIT(T cell Ig andITIM domain)、CD27(分化簇27)、OX40(肿瘤坏死因子受体超家族成员4)、ICOS(induciblecostimulator)、BTLA(B和T淋巴细胞弱化因子)、PD-1(程序性死亡受体1)和CD137(分化簇137)、PD-L1(程序性死亡配体1)、半乳糖凝集素9、CD48(分化簇48)、CD40(分化簇40)、CD70(分化簇70)、B7H3(CD276，分化簇276)、HVEM(Herpesvirus Entry Mediator)、和CC趋化因子亚组中的CCL1、CCL3、CCL5、CCL7、CCL8等。
在一些实施方案中，所述第一抗原和第二抗原选自于：TIGIT和CTLA-4，OX40和CTLA-4，TIGIT和PD-1，PD-L1和CD47，TIGIT和OX40，VEGF和cMET，VEGF和DLL4，VEGF和HGF，VEGF和ANGPT2，TfR和CD20，PD-L1和4-1BB，PSMA和CD28，PD-1和PD-L1，HER2和4-1BB，PD-1和TIM-3，PD-1和CD47，GITR和CTLA-4，CD40和4-1BB，OX40和4-1BB，LAG-3和TIM-3，EGFR和CTLA-4，CD19和CD22，CD16和CD30，CD3和CD123，BCMA和CD47，MSLN和CD47，EGFR和cMET，CD73和TGFβ，EGFR和TGFβ，CCR2和CSF1R，CD20和CD3，CD19和CD47，CDH17和TRAILR2，APLP2和HER2，IL-1α和IL-1β，IL-17和IL-13，IL-4和IL-13，BAFF和IL-17A，CD3和PD-1，IL-4Ra和IL-5，VEGF和IL-6，FGFR1和KLB。
在一些实施方案中，所述靶向的第一抗原为PD-L1，第二抗原为TIGIT。在一些实施方案中，所述共用轻链VL-CL氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述靶向的第一抗原的VH1-CH1a的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述靶向第二抗原的VH2-CH1b的氨基酸序列如SEQID NO:2所示。
在一些实施方案中，所述第一多核苷酸、第二多核苷酸和第三多核苷酸任选的包含信号肽基因。在一个实施方案中，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
在一些实施方案中，所述酵母展示载体的骨架质粒为其他适于在酵母中表达抗体或抗原结合片段的载体，例如pESC-LEU、pESC-leu2d、p4X3、p4X4、p4X5、p4X6，pCTCON2，pYD1。在一些实施方案中，所述酵母展示载体的骨架质粒为pYD1。
可以使用本领域已知的任何方法构建本发明的酵母展示载体。例如，合成编码目的蛋白(如
SP1-VH1-CH1a-Myc-P2A1-SP2-VH2-CH1B-HA-P2A2-SP3-VL-CL-3GS-Aga2p-V5)的多核苷酸并在两端设计合适的酶切位点，通过酶切连接将合成的目的核酸片段连接到载体如pYD1载体。在一些实施方案中，可通过在VL两端设计酶切位点BamHI和BsiWI，和/或在VH1两端设计酶切位点NcoI和AfeI，和/或在VH1两端设计酶切位点SacI和SalI在PYD-Fab-BICL上插入任意抗体的VL或VH。
不限定所述第一多核苷酸、第二多核苷酸和第三多核苷酸在酵母展示载体中的相对位置，只要所述第一多核苷酸、第二多核苷酸和第三多核苷酸在导入酵母细胞后均能表达即可。可使用本领域已知的任何方法将酵母展示载体转化到酵母细胞中。
在一些实施方案中，所述酵母展示载体为PYD-Fab-BICL(载体图谱如图1所示)。
在一些实施方案中，在构建共用轻链的双特异抗体库时，通过使设计的双特异抗体库的多核苷酸文库或基因文库具有合适的限制性酶切位点，以将双特异抗体库的多核苷酸文库或基因文库与本发明的酵母展示载体连接。在一些实施方案中，用编码目的共用轻链的双特异抗体的第一多核苷酸、第二多核苷酸和/或第三多核苷酸替换本文所述酵母展示载体中的对应的第一多核苷酸、第二多核苷酸和/或第三多核苷酸以构成表达目的抗体的酵母展示载体。在一些实施方案中，用编码目的共用轻链的双特异抗体可变区的第一多核苷酸、第二多核苷酸和/或第三多核苷酸替换本文所述酵母展示载体中的对应的编码双特异抗体可变区的第一多核苷酸、第二多核苷酸和/或第三多核苷酸以构成表达目的抗体的酵母展示载体。这种用于展示共用轻链的双特异Fab的酵母展示载体可应用于基于VL突变的亲和力成熟，筛选能同时提高两种Fab亲和力的VL突变。
除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用的方式完整地并入作为参考。此外，本文中所述的材料、方法和例子仅是说明性的并且非意在是限制性的。
附图说明
图1表示用于酵母展示Fab片段的重组PYD-Fab-BICL质粒的图谱；
图2表示酵母表面展示共用轻链双特异Fab片段的模式图；
图3和图4表示实施例2中酵母展示共用轻链的双特异Fab及其与抗原结合情况的流式细胞分析结果。
具体实施方式
术语
除非另作说明，否则下列的每一个术语应当具有下文所述的含义。
定义
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本文所用的术语“包含”或“包括”意味着组合物和方法等包括所列举的元素，例如组份或步骤，但不排除其它。“基本上由……组成”意味着组合物和方法排除对组合的特征有根本影响的其它元素，但不排除对组合物或方法无本质上影响的元素。“由……组成”意味着排除未特别列举的元素。
“表达框”、“读码框”或“表达盒”是指包含必要的表达元件，比如调控元件如启动子和终止子和目的基因片段的核酸构建体。“启动子”通常是指一段DNA序列，其可以调节与启动子其操作性连接的所述DNA序列的表达，从而影响细胞中所述DNA序列的表达。所述启动子可以来自于酵母启动子数据库SCPD。
“表达载体”代表包含至少一个编码多肽的氨基酸序列的核酸分子序列、启动子序列、终止子序列、选择标记和复制起点、以及任选的分泌信号序列的天然或人造DNA序列。在一些实施方案中，所述酵母展示载体的骨架质粒为适于在酵母中表达抗体或抗原结合片段的载体，例如pESC-LEU、pESC-leu2d、p4X3、p4X4、p4X5、p4X6，pCTCON2或例如描述于Yeast1993Dec；9(12):1309-18中的那些。“Fab”是指包含轻链片段以及重链的可变重链结构域(VH)和第一恒定结构域(CH1)的抗体片段，所述轻链片段包含可变轻链结构域(VL)和轻链的恒定结构域(CL)。“单链Fab”或“scFab”是由VH、CH1、VL、CL和连接子组成的多肽，其中所述抗体结构域和所述连接子在N-末端至C-末端方向上具有以下顺序中的一种：a)VH-CH1-连接子-VL-CL，b)VL-CL-连接子-VH-CH1，c)VH-CL-连接子-VL-CH1，或d)VL-CH1-连接子-VH-CL；并且其中所述连接子可以是30个氨基酸或更多。所述单链Fab片段经由CL结构域与CH1结构域之间的天然二硫键而稳定化。此外，这些单链Fab片段可以通过经由插入半胱氨酸残基(例如根据Kabat编号的可变重链中的44位和可变轻链中的100位)产生链间二硫键，而进一步稳定化。
“连接子”或“接头”是指由氨基酸组成的连接肽，例如单独或组合使用的甘氨酸和/或丝氨酸残基，以连接融合蛋白的各个结构域。
“标签”、“tag”或“蛋白检测标签”指具有特定结合特性的通过肽键相互连接的氨基酸残基序列。氨基酸序列标签可以有亲和或纯化标签。氨基酸序列标签可选自His标签、Myc标签、HA标签、V5标签、Arg标签、Avi标签、His-Avi标签、Flag标签、3xFlag标签、Strep标签、Nano标签、SBP标签、S标签、钙调蛋白结合肽、纤维素结合结构域、几丁质结合结构域、GST标签和MBP标签等(参见，例如Amau,J.等人，Current strategies for the use ofaffinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins，Protein Expr.Purif.，2006，48(1)：1-13)。
“展示”通常是表达蛋白的行为，有时还指其表达的蛋白可以被检测。例如，重组宿主细胞可以展示修饰多肽，所述修饰多肽中融合有能将目的多肽定位到酵母细胞表面的蛋白序列、方便检测的标签序列和/或接头序列等，可以理解为所述细胞中存在所述修饰多肽的表达，且所述表达的修饰多肽可以被检测到，例如使用细胞免疫沉淀法或免疫杂交方法检测细胞中或表面上有所述修饰多肽的存在。
“编码”指被称为“编码”多肽的多聚核苷酸或基因，在其天然状态或当通过本领域技术人员公知的方法操作时，经转录和/或翻译可以产生该多肽和/或其片段。编码多肽的基因可以通过常规方法根据多肽氨基酸序列设计和合成。
具体实施例
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1构建酵母展示质粒PYD-Fab-BICL
酵母展示质粒PYD-Fab-BICL只含有一个GAL1启动子和一个读码框，借助2个P2A肽，分别表达包含VH1-CH1a、VH2-CH1b以及VL-CL的三个多肽，并借助酵母锚定蛋白Aga2p亚基、共用轻链VL-CL和抗体组装将共用轻链的双特异Fab展示在酵母表面。其质粒图谱见图1，酵母表面展示共用轻链的双特异Fab的示意图见图2。以表达含氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的靶向PD-L1的VH1-CH1a，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的靶向Tigit的VH2-CH1b，和氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的共用轻链VL-CL的双特异Fab为例，插入如表2所示的核酸序列(编码抗体片段的序列标记为大写字母)。其中，重链恒定区结构域1CH1a和CH1b的氨基酸序列相同。自剪切多肽P2A(基因序列为SEQ ID NO:4和5中的加粗部分)的氨基酸序列为GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO:6)。信号肽基因SP1、SP2和SP3编码的信号肽的氨基酸序列均为MQLLRCFSIFSVIASVLAAG(SEQ ID NO:7)。连接子GS氨基酸序列为GGGGS(SEQID NO:8)，连接子3GS氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:9)。GAL1是酵母翻译启动子，在SD培养基(含2％葡萄糖的YNB-CAA培养基)中被抑制，在SG培养基(含2％半乳糖的YNB-CAA培养基)中被启动。CYC1是酵母翻译的终止子。Aga2为酵母锚定蛋白Aga2p编码基因(SEQ IN NO:3下划线部分)。
>靶向PD-L1的VH1-CH1a的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVGDISAYGGSTLVRGSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
>靶向Tigit的VH2-CH1b的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLELVATINSNGGSTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCARLGTGTLGFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
>靶向PD-L1和Tigit的共用轻链VL-CL的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCKASQDVKTAVSWYQQKPGQAPRLLIYWASTRATGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQHYSTPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
表1 PYD-Fab-BICL质粒插入核酸序列的组成描述
>BtgZI-SP1-VH1-CH1a-GS-Myc-P2A1-SP2-VH2-SalI(SEQ ID NO:4)
>SalI-CH1b-GS-HA-P2A2-SP3-VL-CL-3GS-Aga2-V5-PmeI(SEQ ID NO:5)
具体质粒构造和验证步骤如下：
(1)Fab-BICL(PD-L1 x Tigit)片段的设计和合成。SEQ ID NO:4和5所示的核酸序列由广州金唯智生物技术有限公司合成。
(2)重组PYD-Fab-BICL(PD-L1 x Tigit)质粒的构建。将合成的SEQ ID NO:4核酸片段用BtgZI和SalI双酶切，合成的SEQ ID NO:5核酸片段用PmeI和SalI双酶切，pYD1质粒(Invitrogen，货号：V83501)用BtgZI和PmeI双酶切，并回收对应的片段。然后用T4酶连接上述三个片段，并转化E.coli感受态细胞中培养过夜，提取质粒进行测序验证，最后得到PYD-Fab-BICL(PD-L1 x Tigit)质粒，其质粒图谱如图1所示。
实施例2验证酵母展示质粒PYD-Fab-BICL
(1)PYD-Fab-BICL(PD-L1 x Tigit)转化酵母菌落的培养筛选。重组质粒转化酵母菌落的筛选及培养。复苏和培养酿酒酵母EBY100，采用电转化的方法将步骤1)构建的重组质粒转入酵母细胞中，然后将电转化后的酵母菌液涂布在色氨酸营养缺陷型固体培养平板上，在30℃培养箱中静置培养3天，挑选单菌落进行测序鉴定。挑选测序鉴定正确的单克隆酵母株在SD培养基(含2％葡萄糖的YNB-CAA培养基)中30℃和250rpm摇床中培养过夜，后换成SG诱导培养基(含2％半乳糖的YNB-CAA培养基)在20℃和250rpm摇床中培养36小时。
(2)流式细胞分析抗体酵母表面展示能力和与抗原结合能力。取适量上述诱导后的酵母，并用PBS洗涤和重悬，等量分成4管。1号管是空白细胞对照；2号管孵育anti-Myc PE25min(购自Abcam，货号ab72468，1:500)；3号管先孵育10nM的Tigit-his(购自ACRO公司，TIT-H52H5)1小时，洗涤后再孵育anti-his FITC(购自Invitrogen公司，MA1-81891，1:500)25分钟；4号管先孵育10nM的PD-L1-FC(购自ACRO公司，货号PD1-H5258)1小时，洗涤后再孵育anti-FC PE(购自Invitrogen公司，货号12-4998-82，1:500)25分钟；5号管先孵育10nM的Tigit-his和10nM的PD-L1-FC 1小时，洗涤后再孵育anti-his FITC、anti-FC PE和anti-V5Alexa Fluor 647(购自Invitrogen公司，货号451098，1:500)荧光二抗25分钟。然后用PBS洗涤样品3次，并用PBS重悬。最后用BD C6流式仪检测上述样品的对应荧光信号。
流式细胞分析结果如图3和图4所示。1-4号管的流式分析结果如图3所示，可得出，PYD-Fab-BICL(PD-L1 x Tigit)质粒系统可以使得靶向Tigit和PD-L1的共用轻链的双特异Fab正确地展示在酵母表面，并特异地结合对应抗原Tigit和PD-L1，抗原标记的酵母细胞比例分别约为63％和62.8％。
5号管的流式分析结果如图4所示。根据不同荧光标记，对酵母群进行不同的画门分析。其中，A图表明能够对单个酵母同时进行Tigit抗原结合的标记以及Fab展示的标记，双阳率为45％。B图表明能够对单个酵母同时进行PD-L1抗原结合的标记以及Fab展示的标记，双阳率为58.6％。C图表明同一个酵母能同时被抗原Tigit和PD-L1标记上，也间接表明共用轻链的Fab(PD-L1 x Tigit)展示在同一个酵母表面，双阳率为49.7％。对PD-L1和V5双阳性的酵母群进行Tigit标记和V5标记的分析，结果如D图所示，其表明在PD-L1阳性的酵母集群中，能分析出Tigit阳性的酵母集群，百分比达到84.8％。这种同步检测分析可应用于基于VL突变的亲和力成熟，筛选能同时提高两种Fab亲和力的VL突变。

Claims (10)

1.一种展示共用轻链的双特异Fab片段的酵母展示载体，其特征在于，所述酵母展示载体包含编码共用轻链VL-CL的第一多核苷酸，编码靶向第一抗原的VH1-CH1a的第二多核苷酸和编码靶向第二抗原的VH2-CH1b的第三多核苷酸，所述第一多核苷酸的3’末端连接有酵母锚定蛋白基因；任选的，所述酵母锚定蛋白为Aga2p、α-凝集素、Flolp蛋白、Cwp1p蛋白、Cwp2p蛋白、或Tip1p。
2.一种展示共用轻链的双特异Fab片段的酵母展示载体，其特征在于，所述酵母展示载体包含pYD1质粒骨架、编码共用轻链VL-CL的第一多核苷酸，编码靶向第一抗原的VH1-CH1a的第二多核苷酸和编码靶向第二抗原的VH2-CH1b基因的第三多核苷酸，所述第一多核苷酸的3’末端连接有酵母锚定蛋白基因。
3.根据权利要求1或2所述的酵母展示载体，其特征在于，所述第一多核苷酸、第二多核苷酸和/或第三多核苷酸之间包含启动子和/或自剪切多肽基因。
4.根据权利要求1-3任一项所述的酵母展示载体，其特征在于，所述第一多核苷酸，第二多核苷酸和/或第三多核苷酸的3’末端连接有蛋白检测标签基因；
任选的，所述蛋白检测标签选自His标签、Myc标签、HA标签、V5标签、Arg标签、Avi标签、Flag标签、3xFlag标签、Strep标签、Nano标签、SBP标签、S标签、钙调蛋白结合肽、纤维素结合结构域、几丁质结合结构域、GST标签和MBP标签。
5.根据权利要求1-4任一项所述的酵母展示载体，其特征在于，所述第一抗原和第二抗原为不同靶点或同一靶点的不同表位；或者，所述抗原选自TIGIT、4-1BB、OX40、PD-1、PD-L1、ANGPT2、APLP2、BAFF、BCMA、CCR2、CD123、CD16、CD19、CD20、CD22、CD28、CD3、CD30、CD40、CD47、CD73、CDH17、cMET、CSF1R、CTLA-4、Claudin18.2、DLL4、EGFR、FGFR1、GITR、HER2、HGF、IL-13、IL-17、IL-17A、IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-4Ra、IL-5、IL-6、IL-6R、KLB、LAG-3、MSLN、PSMA、TfR、TGFβ、TIM-3、TRAILR2、VEGF、VISTA、ICOS，病毒抗原如新冠病毒抗原、IL-1α、IL-1β、IL-13、TNF-α、TNF-β、TIM-3、LAG3、CD27、BTLA、CD137、半乳糖凝集素9、CD48、CCD70、HVEM、和CC趋化因子亚组中的CCL1、CCL3、CCL5、CCL7、CCL8；或者，所述第一抗原和第二抗原选自于：TIGIT和PD-L1，TIGIT和CTLA-4，OX40和CTLA-4，TIGIT和PD-1，PD-L1和CD47，TIGIT和OX40，VEGF和cMET，VEGF和DLL4，VEGF和HGF，VEGF和ANGPT2，TfR和CD20，PD-L1和4-1BB，PSMA和CD28，PD-1和PD-L1，HER2和4-1BB，PD-1和TIM-3，PD-1和CD47，GITR和CTLA-4，CD40和4-1BB，OX40和4-1BB，LAG-3和TIM-3，EGFR和CTLA-4，CD19和CD22，CD16和CD30，CD3和CD123，BCMA和CD47，MSLN和CD47，EGFR和cMET，CD73和TGFβ，EGFR和TGFβ，CCR2和CSF1R，CD20和CD3，CD19和CD47，CDH17和TRAILR2，APLP2和HER2，IL-1α和IL-1β，IL-17和IL-13，IL-4和IL-13，BAFF和IL-17A，CD3和PD-1，IL-4Ra和IL-5，VEGF和IL-6，FGFR1和KLB；或者，所述第一抗原为PD-L1，所述第二抗原为TIGIT。
6.根据权利要求1-5任一项所述的酵母展示载体，其特征在于，所述第一多核苷酸、第二多核苷酸和第三多核苷酸任选的包含信号肽基因；任选的，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
7.一种宿主细胞，其包含权利要求1-6任一项所述的酵母展示载体。
8.根据权利要求7所述的宿主细胞，所述宿主细胞为酵母；或者，所述宿主细胞为酿酒酵母、毕赤酵母。
9.根据权利要求7所述的宿主细胞，所述宿主细胞为表达a-凝集素的aga1p亚基的酿酒酵母；或者，所述宿主细胞为酿酒酵母EBY100。
10.一种展示双特异Fab的方法，其特征在于，将权利要求7所述的宿主细胞进行培养和诱导。
CN202210808296.4A 2022-07-11 2022-07-11 一种酵母展示载体及酵母展示双特异Fab的方法 Pending CN117384936A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210808296.4A CN117384936A (zh) 2022-07-11 2022-07-11 一种酵母展示载体及酵母展示双特异Fab的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210808296.4A CN117384936A (zh) 2022-07-11 2022-07-11 一种酵母展示载体及酵母展示双特异Fab的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117384936A true CN117384936A (zh) 2024-01-12

Family

ID=89470868

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210808296.4A Pending CN117384936A (zh) 2022-07-11 2022-07-11 一种酵母展示载体及酵母展示双特异Fab的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117384936A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220098294A1 (en) Activatable Binding Polypeptides and Methods of Identification and Use Thereof
CA2145278C (en) Target binding polypeptide
CN113234142B (zh) 超稳定免疫球蛋白可变结构域的筛选和改造方法及其应用
JP5955773B2 (ja) 改善された細菌膜タンパク質分泌
WO2018069416A1 (en) Triple vector for expressing antibody molecules in full therapeutic format
CN111247429A (zh) 用于新颖抗原结合模块的特异性测试的通用报告细胞测定法
AU2018203095A1 (en) Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof
CN113544275A (zh) 展示与分泌目的多肽的酵母展示系统及其用途
AU2013202755B2 (en) Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof
JP5850846B2 (ja) 繊維状ファージ上でのジスルフィド結合二量体タンパク質の提示
JP2011525103A (ja) ディスプレイベクター並びにその方法及び用途
CN117384936A (zh) 一种酵母展示载体及酵母展示双特异Fab的方法
US20220186209A1 (en) Methods of antibody panning against target proteins
EP4314042A2 (en) Multivalent proteins and screening methods
CN117384937A (zh) 一种高效酵母展示载体及酵母展示方法
WO2009109572A2 (en) Monovalent phage display of single variable domains
WO2024199476A1 (zh) 一种单链抗体及其体外合成体系和应用
CN113999306B (zh) 一种获得识别空间构象表位抗体的方法
US20190144541A1 (en) Anti-pd-1 monoclonal antibody and obtaining method therefor

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication