CN117384937A - 一种高效酵母展示载体及酵母展示方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酵母展示载体及酵母展示方法。本发明的酵母展示载体能够高效率展示，便于抗体或抗原结合片段的改造及建库。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种酵母展示载体及高效酵母展示方法。
背景技术
酵母表面展示技术是继噬菌体展示技术发明之后发展起来的蛋白表面展示技术，可用于构建和筛选抗体文库。传统的噬菌体展示技术的主要原理是把目的蛋白质与噬菌体外壳蛋白质融合表达，然后通过固相或液相方法进行抗原筛选，但是其有以下缺点，一是其利用的是原核表达系统，不利于复杂蛋白的表达；二是其筛选抗体的过程近似于黑箱操作。Wittrup于1997首次发表了酵母展示的文章，酵母展示技术是利用真核表达系统，具有与哺乳动物细胞类似的蛋白质修饰和折叠机制，且通过与流式细胞分选技术结合，研究人员可实时监控筛选过程，特别是针对抗体的亲和力或者阻断活性等性质进行精细的筛选。
通常来说，具有抗体功能活性结构的抗体，除了完整的全抗之外，还包括scFv、scFab、Fab片段等。scFv是具有抗体活性的最小功能单位，其结构简单，便于改造和建库。单链Fab(scFab)的抗体重链VH-CH1和VL-CL通过一个柔性氨基酸多肽连接子连接并实现scFab的重链VH-CH1和轻链匹配，Fab是由重链VH-CH1结构域与轻链通过二硫键匹配组成的抗原结合片段。与scFv相比，scFab和Fab的结构和亲和力都更接近于IgG型式的全抗。而Fab的结构则更加复杂，这导致Fab表达系统的改造和建库都相对复杂和麻烦，其中涉及重链和轻链之间的匹配和二硫键形成。目前利用Aga1-Aga2酵母细胞表面展示系统产生Fab片段的方法，主要为在一个表达质粒上利用两个完整的启动子和读码框分别表达Fab的重链区和轻链，再将质粒转化到酵母细胞中诱导表达，将完整的Fab展示到酵母表面。由于酵母本身对于蛋白质二硫键形成和修饰等能力较弱，因此经常产生稳定性差或低活性的Fab或其片段。
鉴于现有技术的不足，酵母细胞表面展示抗体或其片段的效率较低以及其重链的VH-CH1结构域和轻链的有效组装和折叠能力较弱。因此，本领域仍需开发可以提高酵母表面展示抗体或其片段的重组载体，利用该载体可以加快抗体发现和抗体工程改造的进程。
发明内容
本发明发现在酵母表达载体中添加分子伴侣基因和亮氨酸拉链(leucinezipper，LZ)基因，可以提高酵母表面展示Fab或scFab的效率，特别是针对一些在酵母中低表达或难以正确折叠的Fab片段。
在一方面，本发明提供了一种酵母展示载体，其特征在于，所述酵母展示载体包含分子伴侣基因和分别带有正、负电荷的亮氨酸拉链基因。
在一些实施方案中，其中一个亮氨酸拉链基因的3’末端连接有酵母锚定蛋白基因。
在一些实施方案中，所述的酵母展示载体还包含一个或多个多肽编码区编码被展示的多肽。
在一些实施方案中，所述多肽编码区包含编码抗体或抗原结合片段的多核苷酸。
在一些实施方案中，所述多肽编码区包含编码抗体或抗原结合片段的第一多肽的第一多核苷酸和编码抗体或抗原结合片段的第二多肽的第二多核苷酸。在一些实施方案中，所述第一多肽包含抗体或抗原结合片段的重链可变区，所述第二多肽包含抗体或抗原结合片段的轻链可变区。在一些实施方案中，所述第一多肽包含抗体或抗原结合片段的轻链可变区，所述第二多肽包含抗体或抗原结合片段的重链可变区。
在一些实施方案中，所述酵母展示载体包含分子伴侣基因、编码抗体或抗原结合片段的包含重链可变区的第一多肽的第一多核苷酸和编码抗体或抗原结合片段的包含轻链可变区的第二多肽的第二多核苷酸；其中，所述第一多核苷酸和第二多核苷酸的3’末端分别连接有带正、负电荷的亮氨酸拉链基因，其中一个亮氨酸拉链基因的3’末端连接有酵母锚定蛋白基因。
在一些实施方案中，所述酵母展示载体包含pYD1质粒骨架、分子伴侣基因、编码抗体或抗原结合片段的包含重链可变区的第一多肽的第一多核苷酸和编码抗体或抗原结合片段的包含轻链可变区的第二多肽的第二多核苷酸；所述第一多核苷酸和第二多核苷酸的3’末端分别连接有带正、负电荷的亮氨酸拉链基因，其中一个亮氨酸拉链基因的3’末端连接有酵母锚定蛋白基因。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段为Fab。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段为scFab。
在一些实施方案中，所述抗原结合片段为Fab，且所述第一多核苷酸和第二多核苷酸之间包含自剪切多肽P2A基因。
在一些实施方案中，所述抗原结合片段为scFab，且所述第一多核苷酸和第二多核苷酸之间包含连接子。在一些实施方案中，所述连接子为包含甘氨酸和丝氨酸的多肽。在一些实施方案中，所述连接子的序列为(GmS)n，其中每个m独立为2、3、4或5，n独立为1、2、3、4或5。在一些实施方案中，所述连接子的序列为(GGGGS)n，所述n独立为1、2、3、4或5。在一些实施方案中，所述连接子为60aa Linker(SEQ ID NO:12：GGSSGSGSGSTGTSSSGTGTSAGTTGTSASTSGSGSGGGGGSGGGGSAGGTATAGAS SGS)。
在一些实施方案中，所述亮氨酸拉链基因的3’末端通过连接子与酵母锚定蛋白基因连接。在一些实施方案中，所述连接子包含甘氨酸和丝氨酸残基。在一些实施方案中，所述连接子为包含甘氨酸和丝氨酸的多肽。在一些实施方案中，所述连接子的序列为(GmS)n，其中每个m独立为2、3、4或5，n独立为1、2、3、4或5。在一些实施方案中，所述连接子的序列为(GGGGS)n，所述n独立为1、2、3、4或5。在一些实施方案中，所述连接子的氨基酸序列如SEQID NO:19所示。
在一些实施方案中，所述酵母锚定蛋白为Aga2p亚基。在一些实施方案中，所述酵母锚定蛋白为α-凝集素、Flolp蛋白、Cwp1p蛋白、Cwp2p蛋白、或Tip1p等。
在一些实施方案中，所述分子伴侣基因为PDI(Protein disulfide isomerase，蛋白质二硫键异构酶)基因。在一些实施方案中，所述PDI基因表达的蛋白的氨基酸序列如SEQID NO:13所示。在一些实施方案中，所述分子伴侣为Bip、或Kar2等。
在一些实施方案中，所述带正电荷的亮氨酸拉链的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，所述带负电荷的亮氨酸拉链的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。在一些实施方案中，所述亮氨酸拉链为O'Shea et al.,1993,Current Biology,3:658-667s所述亮氨酸拉链或其衍生物。在一些实施方案中，所述亮氨酸拉链为Fos/Jun亮氨酸拉链或其衍生物。
在一些实施方案中，所述第一多核苷酸和第二多核苷酸还包含信号肽基因。在一些实施方案中，所述信号肽基因编码的信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示。
在一些实施方案中，所述酵母锚定蛋白基因的3’末端和/或所述第二多核苷酸的3’末端连接的亮氨酸拉链基因的3’末端连接有蛋白检测标签基因。在一些实施方案中，所述蛋白检测标签选自His标签、Myc标签、HA标签、V5标签、Arg标签、Avi标签、Flag标签、3xFlag标签、Strep标签、Nano标签、SBP标签、S标签、钙调蛋白结合肽、纤维素结合结构域、几丁质结合结构域、GST标签和MBP标签。在一些实施方案中，所述蛋白检测标签选自Myc标签，V5标签和HA标签。
在一些实施方案中，所述酵母展示载体的骨架质粒为其他适于在酵母中表达抗体或抗原结合片段的载体，例如pESC-LEU、pESC-leu2d、p4X3、p4X4、p4X5、p4X6，pCTCON2，pYD1。在一个实施方案中，所述酵母展示载体的骨架质粒为pYD1。
在一些实施方案中，所述酵母展示载体包含编码分子伴侣的多核苷酸和包含编码抗体或抗原结合片段的第二多肽-带负/正电荷的亮氨酸拉链-任选的蛋白检测标签-自剪切多肽-抗体或抗原结合片段的第一多肽-带正/负电荷的亮氨酸拉链-连接子-酵母锚定蛋白-任选的标签的多核苷酸。
在一些实施方案中，所述酵母展示载体包含编码PDI的多核苷酸和编码SP2-VL-CL-(A-LZ)-V5-P2A-SP1-VH-CH1-(B-LZ)-3GS-Aga2p-Myc的多核苷酸。在一些实施方案中，可通过在VL两端设计酶切位点BamHI和BsiWI，和/或在VH两端设计酶切位点NcoI和AfeI在PYD-PDI-Fab-LZ载体上插入任意抗体的VL或VH。在一些实施方案中，所述酵母展示载体为PYD-PDI-Fab-LZ(载体图谱如图6所示)。
所述抗体或抗原结合片段可以靶向任何抗原，例如，所述抗原为TIGIT、4-1BB、OX40、PD-1、PD-L1、ANGPT2、APLP2、BAFF、BCMA、CCR2、CD123、CD16、CD19、CD20、CD22、CD28、CD3、CD30、CD40、CD47、CD73、CDH17、cMET、CSF1R、CTLA-4、Claudin18.2、DLL4、EGFR、FGFR1、GITR、HER2、HGF、IL-13、IL-17、IL-17A、IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-4Ra、IL-5、IL-6、IL-6R、KLB、LAG-3、MSLN、PSMA、TfR、TGFβ、TIM-3、TRAILR2、VEGF、VISTA、ICOS，病毒相关抗原如新冠病毒抗原、IL-1α(白介素IL-1α)、IL-1β(白介素IL-1β)、IL-13(白介素IL-13)、TNF-α(肿瘤坏死因子α)、TNF-β(肿瘤坏死因子β)、TIM-3(T cell immunoglobin domain and mucindomain-3)、LAG3(淋巴细胞活化基因-3分子)、CD27(分化簇27)、BTLA(B和T淋巴细胞弱化因子)、CD137(分化簇137)、半乳糖凝集素9、CD48(分化簇48)、CCD70(分化簇70)、HVEM(Herpesvirus Entry Mediator)、和CC趋化因子亚组中的CCL1、CCL3、CCL5、CCL7、CCL8等。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段靶向OX40。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段为11D4抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含的重链片段VH-CH1的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述抗体或抗原结合片段包含的轻链包含的VL-CL的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段靶向PD-L1。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段包含的重链片段VH-CH1的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，所述抗体或抗原结合片段包含的轻链包含的VL-CL的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
在另一方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含上述酵母展示载体。在一些实施方案中，所述宿主细胞为酵母。在一些实施方案中，所述酵母细胞选自：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(Pichia Pastoris)、巴氏酵母(SaccharomycesPastorianus)、贝酵母(Saccharomyces Bayanus)、乳酸克鲁维酵母(KluyveromycesLactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces Marxianus)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces Pombe)、白色假丝酵母(Candida Albicans)、树干毕赤酵母(Pichia Stipitis)、解脂耶氏酵母(Yarrowia Lipolytica)、多形汉逊酵母(HansenulaPolymorpha)、红法夫酵母(Phaffia Rhodozyma)、产朊假丝酵母(Candida Utilis)、耐盐酵母(Arxula Adeninivorans)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces Hansenii)、多形德巴利酵母(Debaryomyces Polymorphus)、、西方许旺酵母(Schwanniomyces Occidentalis)或其衍生物。在一些实施方案中，所述酵母为酿酒酵母。在一些实施方案中，所述酵母为表达a-凝集素的aga1p亚基的酿酒酵母。在一些实施方案中，所述酵母为酿酒酵母EBY100。
在另一方面，本发明提供一种酵母展示方法，包括将上述酵母展示载体转入酵母细胞，获得含有酵母展示载体的酵母，然后进行培养和诱导。在一些实施方案中，所述酵母为表达a-凝集素的aga1p亚基的酿酒酵母。在一些实施方案中，所述酵母为酿酒酵母EBY100。
可以使用本领域已知的任何方法构建本发明的酵母展示载体。例如，合成编码目的蛋白(如本文所述分子伴侣、亮氨酸拉链、第一多肽和/或第二多肽)的核酸并在两端设计合适的酶切位点，将上述目的核酸片段通过酶切连接到载体如pYD1载体中。在一些实施方案中，可通过在VL两端设计酶切位点BamHI和BsiWI，和/或在VH两端设计酶切位点NcoI和AfeI在PYD-PDI-Fab-LZ载体上插入任意抗体的VL或VH。在一些实施方案中，所述酵母展示载体为PYD-PDI-Fab-LZ(载体图谱如图6所示)。
不限定所述分子伴侣基因、第一多核苷酸和第二多核苷酸在酵母展示载体中的相对位置，只要所述分子伴侣基因、第一多核苷酸和第二多核苷酸在导入酵母细胞后均能表达即可。可使用本领域已知的任何方法将酵母展示载体转化到酵母细胞中。
本发明的酵母展示载体能够解决一些在酵母中低表达或难以正确折叠的抗体的展示问题。在一些实施方案中，用编码目的抗体的第一多核苷酸和/或第二多核苷酸替换本文所述酵母展示载体中的对应的第一多核苷酸和/或第二多核苷酸以构成表达目的抗体的酵母展示载体。在一些实施方案中，在构建抗体库时，通过使设计的抗体库的多核苷酸文库或基因文库具有合适的限制性酶切位点，以将抗体库的多核苷酸文库或基因文库与本发明的酵母展示载体连接，使酵母表达展示更多折叠正确的抗体蛋白，以尽可能地避免某些克隆的丢失，保持原始库的多样性。
除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用的方式完整地并入作为参考。此外，本文中所述的材料、方法和例子仅是说明性的并且非意在是限制性的。
附图说明
图1a表示用于酵母展示scFab片段的重组PYD-scFab质粒的图谱；图1b表示酵母表面展示scFab片段的模式图；
图2表示实施例1中酵母展示scFab片段(11D4)及其与抗原结合情况的流式细胞分析结果；
图3a表示用于酵母展示Fab片段的重组PYD-2GAL-Fab质粒的图谱；图3b：酵母表面展示Fab片段的模式图；
图4表示实施例2中酵母展示Fab片段(11D4)及其与抗原结合情况的流式细胞分析结果；
图5a表示用于酵母展示Fab片段的重组PYD-P2A-Fab质粒的图谱；图5b：实施例3中酵母展示Fab(11D4)抗体及其与抗原结合情况的流式细胞分析结果；
图6表示用于酵母展示Fab片段的重组PYD-PDI-Fab-LZ质粒的图谱；
图7表示实施例4中酵母展示Fab抗体(11D4)及其与抗原结合情况的流式细胞分析结果；
图8表示实施例5中酵母展示Fab抗体(11D4)及其与抗原结合情况的流式细胞分析结果；
图9表示实施例5中酵母展示Fab抗体(PD-L1)及其与抗原结合情况的流式细胞分析结果。
具体实施方式
术语
除非另作说明，否则下列的每一个术语应当具有下文所述的含义。
定义
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本文所用的术语“包含”或“包括”意味着组合物和方法等包括所列举的元素，例如组份或步骤，但不排除其它。“基本上由……组成”意味着组合物和方法排除对组合的特征有根本影响的其它元素，但不排除对组合物或方法无本质上影响的元素。“由……组成”意味着排除未特别列举的元素。
“表达框”、“读码框”或“表达盒”是指包含必要的表达元件，比如调控元件如启动子和终止子和目的基因片段的核酸构建体。“启动子”通常是指一段DNA序列，其可以调节与启动子其操作性连接的所述DNA序列的表达，从而影响细胞中所述DNA序列的表达。所述启动子可以来自于酵母启动子数据库SCPD。
“表达载体”代表包含至少一个编码多肽的氨基酸序列的核酸分子序列、启动子序列、终止子序列、选择标记和复制起点、以及任选的分泌信号序列的天然或人造DNA序列。在一些实施方案中，所述酵母展示载体的骨架质粒为适于在酵母中表达抗体或抗原结合片段的载体，例如pESC-LEU、pESC-leu2d、p4X3、p4X4、p4X5、p4X6，pCTCON2或例如描述于Yeast1993Dec；9(12):1309-18中的那些。
“Fab”是指包含轻链片段以及重链的可变结构域(VH)和第一恒定结构域(CH1)的抗体片段，所述轻链片段包含轻链可变结构域(VL)和轻链的恒定结构域(CL)。“单链Fab”或“scFab”是VH、CH1、VL、CL和连接子组成的多肽，其中所述抗体结构域和所述连接基在N-末端至C-末端方向上具有以下顺序中的一种：a)VH-CH1-连接子-VL-CL，b)VL-CL-连接子-VH-CH1，c)VH-CL-连接子-VL-CH1，或d)VL-CH1-连接子-VH-CL；并且其中所述连接子至少是30个氨基酸。所述单链Fab片段经由CL结构域与CH1结构域之间的天然二硫键而稳定化。此外，这些单链Fab片段可以通过经由插入半胱氨酸残基(例如根据Kabat编号的可变重链中的44位和可变轻链中的100位)产生链间二硫键，而进一步稳定化。
“连接子”或“接头”是指由氨基酸组成的连接肽，例如单独或组合使用的甘氨酸和/或丝氨酸残基，以连接融合蛋白的各个结构域。
“标签”、“tag”或“蛋白检测标签”指具有特定结合特性的通过肽键相互连接的氨基酸残基序列。氨基酸序列标签可以有亲和或纯化标签。氨基酸序列标签可选自His标签、Myc标签、HA标签、V5标签、Arg标签、Avi标签、His-Avi标签、Flag标签、3xFlag标签、Strep标签、Nano标签、SBP标签、S标签、钙调蛋白结合肽、纤维素结合结构域、几丁质结合结构域、GST标签和MBP标签等(参见，例如Amau,J.等人，Current strategies for the use ofaffinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins，Protein Expr.Purif.，2006，48(1)：1-13)。
“展示”通常是表达目的蛋白的行为，有时还指其表达的目的蛋白可以被检测。例如，重组宿主细胞可以展示修饰多肽，所述修饰多肽中融合有能将目的多肽定位到酵母细胞表面的蛋白序列、方便检测的标签序列和接头序列等，可以理解为所述细胞中存在所述修饰多肽的表达，且所述表达的修饰多肽可以被检测到，例如使用细胞免疫沉淀法或免疫杂交方法检测细胞中或细胞表面上有所述修饰多肽的存在。
“编码”指被称为“编码”多肽的多聚核苷酸或基因，在其天然状态或当通过本领域技术人员公知的方法操作时，经转录和/或翻译可以产生该多肽和/或其片段。编码多肽的基因可以通过常规方法根据多肽氨基酸序列设计和合成。
具体实施例
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1构建和验证质粒PYD-scFab(11D4)和PYD-2GAL-Fab(11D4)
用酵母展示质粒pYD1(Invitrogen，货号：V83501)构建质粒PYD-scFab(11D4)和PYD-2GAL-Fab(11D4)，分别通过表达抗OX40的抗体11D4的scFab(11D4)和Fab(11D4)来验证转化了重组质粒的酵母展示抗体或抗原结合片段的效率及其与抗原结合的能力。根据pYD1质粒上的多克隆位点和在插入片段的5’和3’端引入适当的酶切位点，便于构建重组载体。scFab(11D4)的结构为VH-CH1-60aa Linker-VL-CL，其氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，60aa Linker的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。Fab(11D4)的重链片段VH-CH1的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，Fab(11D4)的轻链VL-CL的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。其中信号肽基因SP1、SP2编码的信号肽的氨基酸序列均为MQLLRCFSIFSVIASVLAAG(SEQ ID NO:17)。连接子GS氨基酸序列为GGGGS(SEQ ID NO:18)，连接子3GS氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:19)。GAL1是酵母翻译启动子，在SD培养基(含2％葡萄糖的YNB-CAA培养基)中被抑制，在SG培养基(含2％半乳糖的YNB-CAA培养基)中被启动。CYC1是酵母翻译的终止子。Aga2是酵母锚定蛋白编码基因(SEQ ID NO:2下划线部分)。
>Fab(11D4)的重链片段VH-CH1(SEQ ID NO:7)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIDYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCARESGWYLFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
>Fab(11D4)的重链片段VL-CL(SEQ ID NO:8)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>scFab(11D4)(SEQ ID NO:11)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIDYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCARESGWYLFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGGSSGSGSGSTGTSSSGTGTSAGTTGTSASTSGSGSGGGGGSGGGGSAGGTATAGASSGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
表1.质粒PYD-scFab(11D4)和PYD-2GAL-Fab(11D4)的组成
插入核酸序列如下(5’-3’)：
>HindIII-VH-CH1-60aa Linker-VL-CL-BstBI(SEQ ID NO:1)
aagcttctgcaggctagtggtggtggtggttctggtggtggtggttctggtggtggtggttctgctagcggggccatggccGAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGACTGGTGCAGCCAGGAGGAAGCCTGAGACTGTCCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCTCCAGCTACTCCATGAACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGAGCTACATCTCCAGCTCCTCCAGCACCATCGATTACGCCGATAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCAGGGATAACGCCAAGAATAGCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGGGATGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGAGAGCGGCTGGTACTTGTTTGATTACTGGGGCCAGGGTACCCTGGTTACCGTTAGCAGCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAACCTAAGTCTTGTggaggatcttccggttcgggctcagggtctaccggcacatcaagctcgggaactggaacgagtgctggtactacggggactagtgcatctacgtccggatcaggtagtggcggaggtggtggctctggaggcggtggaagtgctggagggacagctactgcaggtgcctctagcggatccGATATCCAGATGACCCAGAGCCCTTCCTCCCTGTCCGCCTCCGTGGGCGATAGAGTGACCATCACCTGTAGGGCCAGCCAGGGCATCAGCTCCTGGCTGGCCTGGTATCAACAGAAGCCTGAGAAGGCCCCCAAGAGCCTGATCTACGCCGCCAGCTCCCTGCAGAGCGGCGTGCCTAGCAGATTCTCCGGCTCCGGCTCCGGAACCGATTTCACCCTGACCATCTCCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTTGCCACCTACTACTGTCAGCAGTACAACTCCTACCCTCCTACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCTAGCGTGTTTATCTTCCCTCCCAGCGACGAGCAGCTGAAAAGCGGAACAGCCAGCGTCGTCTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCAGGGAGGCCAAGGTCCAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTGCAGAGCGGAAACTCTCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGATAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTGAGCAGCACACTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCTTGCGAAGTGACCCACCAGGGACTGAGCAGCCCAGTGACCAAGAGCTTCAACCGCGGCGAGTGCgcggccgcaggcgggcccttcgaa
>BtgZI-SP1-VH-CH1-GS-Myc-3GS-Aga2-CYC1-HindIII(SEQ ID NO:2)
gcgatgatttttgatctattaacagatatataaatgcaaaaactgcataaccactttaactaatactttcaacattttcggtttgtattacttcttattcaaatgtaataaaagtatcaacaaaaaattgttaatatacctctatactttaacgtcaaggagaaaaaaccccggatcggactactagcagctgtaatacgactcactatagggaatattaagctaattctacttcatacattttcacttaagatgcagttacttcgctgtttttcaatattttctgttattgctagcgttttagcagccggtgccatggcaGAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGACTGGTGCAGCCAGGAGGAAGCCTGAGACTGTCCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCTCCAGCTACTCCATGAACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGAGCTACATCTCCAGCTCCTCCAGCACCATCGATTACGCCGATAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCAGGGATAACGCCAAGAATAGCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGGGATGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGAGAGCGGCTGGTACTTGTTTGATTACTGGGGCCAGGGTACCCTGGTTACCGTTAGCAGCGCTTCTACAAAAGGTCCATCTGTTTTTCCATTGGCTCCATCTTCTAAATCTACATCTGGTGGTACTGCTGCTTTGGGTTGTTTGGTTAAGGATTATTTTCCAGAACCAGTCACCGTTTCTTGGAATTCTGGTGCTTTGACTTCTGGTGTTCATACTTTTCCAGCCGTATTGCAATCTTCTGGCTTGTATTCTTTGTCCTCTGTTGTTACTGTTCCCTCTTCTTCTTTGGGTACTCAAACTTACATCTGCAACGTTAACCATAAGCCATCTAACACCAAGGTTGATAAGAAAGTTGAACCATAAGCCATCTAACACCAAGGTTGATAAGAAAGTTGAACCTAAGTCTTGTGATAAGgtggaggtggttctgaacagaagttgatttctgaagaggatctcgagggaggtggtggatcaggcggtggtggcagtggaggtggaggctcacaggaactga caactatatgcgagcaaatcccctcaccaactttagaatcgacgccgtactctttgtcaacgactactattttggc caacgggaaggcaatgcaaggagtttttgaatattacaaatcagtaacgtttgtcagtaattgcggttctcacccc tcaacaactagcaaaggcagccccataaacacacagtatgttttttgataagcgcgccccgctgatcctagagggccgcatcatgtaattagttatgtcacgcttacattcacgccctccccccacatccgctctaaccgaaaaggaaggagttagacaacctgaagtctaggtccctatttatttttttatagttatgttagtattaagaacgttatttatatttcaaatttttcttttttttctgtacagacgcgtgtacgcatgtaacattatactgaaaaccttgcttgagaaggttttgggacgctcgaaggctttaatttgcaagctgcggccctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactaagctt
>HindIII-GAL1-间隔序列-SP2-VL-CL-GS-V5-PmeI(SEQ ID NO:3)
aagcttacggattagaagccgccgagcgggtgacagccctccgaaggaagactctcctccgtgcgtcctcgtcttcaccggtcgcgttcctgaaacgcagatgtgcctcgcgccgcactgctccgaacaataaagattctacaatactagcttttatggttatgaagaggaaaaattggcagtaacctggccccacaaaccttcaaatgaacgaatcaaattaacaaccataggatgataatgcgattagttttttagccttatttctggggtaattaatcagcgaagcgatgatttttgatctattaacagatatataaatgcaaaaactgcataaccactttaactaatactttcaacattttcggtttgtattacttcttattcaaatgtaataaaagtatcaacaaaaaattgttaatatacctctatactttaacgtcaaggagaaaaaaccccggatcggactactagcatctgtaatacgactcactatagggaatattaagctaattctactcactagtaacggccgccagtatgcaacttttgagatgcttctccattttctccgttatcgcgtctgtcttggctgctggatccGATATCCAGATGACCCAGAGCCCTTCCTCCCTGTCCGCCTCCGTGGGCGATAGAGTGACCATCACCTGTAGGGCCAGCCAGGGCATCAGCTCCTGGCTGGCCTGGTATCAACAGAAGCCTGAGAAGGCCCCCAAGAGCCTGATCTACGCCGCCAGCTCCCTGCAGAGCGGCGTGCCTAGCAGATTCTCCGGCTCCGGCTCCGGAACCGATTTCACCCTGACCATCTCCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTTGCCACCTACTACTGTCAGCAGTACAACTCCTACCCTCCTACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTTGCTGCTCCATCAGTTTTCATTTTTCCACCATCTGACGAACAGTTGAAATCTGGTACAGCTTCTGTTGTTTGCCTGTTGAACAATTTCTATCCAAGAGAAGCTAAGGTCCAATGGAAGGTTGACAATGCTTTACAATCTGGTAACTCCCAAGAATCCGTTACTGAACAAGATTCTAAGGACTCTACCTACTCTTTGTCATCTACTTTGACTTTGTCCAAGGCCGATTACGAAAAACATAAGGTTTACGCTTGTGAAGTTACCCATCAAGGTTTATCTTCTCCAGTTACCAAGTCTTTCAACAGAGGTGAATGTggcggtggaggttctttcgaaggtaagcctatccctaaccctctcctcggtctcgattctacgcgtaccggtcatcatcaccatcaccattgagtttaaac
实验步骤如下：
1)重组载体的构建。SEQ ID NO:1、2和3所示的核酸序列由广州金唯智生物技术有限公司合成。将SEQ ID NO:1所示的核酸序列与pYD1质粒分别用HindIII和BstBI双酶切后，用T4连接酶连接得到PYD-scFab(11D4)质粒并转化至DH5α大肠杆菌感受态细胞中，培养后提取质粒进行测序验证，最终得到质粒PYD-scFab(11D4)，其质粒图谱如图1a所示。图1b为酵母展示scFab的示意图。
将SEQ ID NO:2所示的核酸序列用HindIII和BtgZI双酶切，SEQ ID NO:3所示的核酸序列用HindIII和PmeI双酶切，pYD1质粒用PmeI和BtgZI双酶切后，将三个酶切后的片段回收，用T4连接酶连接，并转化至DH5α感受态细胞中，培养后提取质粒进行测序验证，最终得到质粒PYD-2GAL-Fab(11D4)，其质粒图谱如图3a所示。图3b为酵母展示Fab的示意图。
2)重组质粒转化酵母菌落的筛选及培养。复苏和培养酿酒酵母EBY100(购自Invitrogen公司)，采用电转化的方法将步骤1)构建的重组质粒PYD-scFab(11D4)和PYD-2GAL-Fab(11D4)分别转入酵母细胞中，然后将电转化后的酵母菌液涂布在色氨酸营养缺陷型固体平板上筛选，在30℃培养箱中静置培养3天，挑选单菌落进行测序鉴定。挑选测序鉴定正确的转化入重组质粒PYD-scFab(11D4)和PYD-2GAL-Fab(11D4)的单克隆酵母株分别在SD培养基(含2％葡萄糖的YNB-CAA培养基)中30℃和250rpm摇床中培养过夜，后换成SG诱导培养基(含2％半乳糖的YNB-CAA培养基)在20℃和250rpm摇床中培养36小时。
3)流式细胞分析酵母表面展示抗体的能力及展示的抗体与抗原结合能力。取上一步诱导的转化入质粒PYD-scFab(11D4)和质粒PYD-2GAL-Fab(11D4)的酵母，用PBS洗涤和重悬，分别等量分成四管。其中转化入PYD-scFab(11D4)质粒的酵母的流式细胞染色方案如下：1号管是空白对照，2号管先孵育10nM的OX40-FC(购自ACRO公司，货号OX0-H5255)1小时，用PBS洗涤重悬后，再孵育anti-FC PE荧光二抗(购自Invitrogen公司，货号12-4998-82，1:500稀释)25分钟；3号管孵育anti-V5Alexa Fluor 647荧光二抗(购自Invitrogen公司，货号451098，1:500稀释)25分钟；4号管先孵育10nM的OX40-FC 1小时，洗涤后再孵育anti-FCPE(1:500稀释)和anti-V5Alexa Fluor 647(1:500稀释)荧光二抗25分钟。
转化入PYD-2GAL-Fab(11D4)质粒的酵母的流式细胞染色方案如下：1号管是空白细胞对照；2号管孵育anti-Myc PE(购自Abcam公司，货号ab72468，1:500稀释)25分钟；3号管孵育anti-V5 Alexa Fluor 647(购自Invitrogen公司，货号451098，1:500稀释)和anti-FC PE(购自Invitrogen公司，货号12-4998-82，1:500稀释)荧光二抗25分钟；4号管先孵育10nM的OX40-FC(购自ACRO公司，货号OX0-H5255)1小时，洗涤后再孵育anti-FC PE(1:500稀释)和anti-V5 Alexa Fluor 647(1:500稀释)荧光二抗25分钟。然后用PBS洗涤样品3次，并用PBS重悬，然后用BD C6流式仪检测上述样品的对应荧光信号。
4)流式分析结果。如图2和图4所示，使用PYD-scFab(11D4)质粒表达的scFab片段(11D4)和使用PYD-2GAL-Fab(11D4)质粒表达的Fab片段(11D4)均能在酵母表面正确展示，特异性结合OX40-FC抗原，质粒系统均可以同时对单个酵母进行抗原结合和抗体片段展示的标记。图2和图4的实验是同时操作的，通过比较两者的数据，发现与PYD-scFab(11D4)质粒系统相比，PYD-2GAL-Fab(11D4)质粒系统与OX40-FC结合的荧光强度明显更强。考虑到两个质粒系统的抗体展示的酵母比例和荧光强度相差不大，甚至前者还要略好于后者，表明酵母表面展示的Fab的抗原结合能力比scFab更强。
实施例2构建酵母展示质粒PYD-P2A-Fab(11D4)和PYD-PDI-Fab-LZ(11D4)
酵母展示质粒PYD-P2A-Fab(11D4)在一个读码框中引入一个启动子GAL1和自剪切多肽P2A(porcine teschovirus-1 2A)，利用其在蛋白转译时，P2A肽会诱使核糖体在合成多肽在P2A肽处产生断裂，从而转录出两个蛋白的特点，在一个读码框中同时表达Fab的VH-CH1和VL-CL。与PYD-2GAL-Fab(11D4)质粒相比，PYD-P2A-Fab(11D4)质粒只需要一个启动子和读码框，其质粒大小明显减小，这有利于质粒转化进入酵母中。PYD-P2A-Fab(11D4)的质粒图谱见图5a。
与PYD-P2A-Fab(11D4)质粒相比，PYD-PDI-Fab-LZ(11D4)质粒添加了PDI表达元件以及在Fab的两条链的恒定区末端分别添加了亮氨酸拉链，扩大酵母展示质粒的适用性，特别是针对一些在酵母中低表达或难以正确折叠的Fab蛋白。PYD-PDI-Fab-LZ(11D4)质粒图谱见图6。A-LZ为带负电荷的亮氨酸拉链，氨基酸序列为AQLEKELQALEKENAQLEWELQALEKELAQ(SEQ ID NO:14)；B-LZ为带正电荷的亮氨酸拉链，氨基酸序列为AQLKKKLQALKKKNAQLKWKLQALKKKLAQ(SEQ ID NO:15)。自剪切多肽P2A的氨基酸序列为GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO:16)，蛋白二硫键异构酶PDI的氨基酸序列为MQFNWNIKTVASILSALTLAQASDQEAIAPEDSHVVKLTEATFESFITSNPHVLAEFFAPWCGHCKKLGPELVSAAEILKDNEQVKIAQIDCTEEKELCQGYEIKGYPTLKVFHGEVEVPSDYQGQRQSQSIVSYMLKQSLPPVSEINATKDLDDTIAEAKEPVIVQVLPEDASNLESNTTFYGVAGTLREKFTFVSTKSTDYAKKYTSDSTPAYLLVRPGEEPSVYSGEELDETHLVHWIDIESKPLFGDIDGSTFKSYAEANIPLAYYFYENEEQRAAAADIIKPFAKEQRGKINFVGLDAVKFGKHAKNLNMDEEKLPLFVIHDLVSNKKFGVPQDQELTNKDVTELIEKFIAGEAEPIVKSEPIPEIQEEKVFKLVGKAHDEVVFDESKDVLVKYYAPWCGHCKRMAPAYEELATLYANDEDASSKVVIAKLDHTLNDVDNVDIQGYPTLILYPAGDKSNPQLYDGSRDLESLAEFVKERGTHKVDALALRPVEEEKEAEEEAESEADAHDEL(SEQ ID NO:13)。
表2.质粒PYD-P2A-Fab(11D4)和PYD-PDI-Fab-LZ(11D4)的组成
插入核酸序列如下(5’-3’)：
>EcoRI-3GS-Aga2-GS-Myc-P2A-SP2-BamHI(SEQ ID NO:4)
gaattctggtgctttgacttctggtgttcatacttttccagccgtattgcaatcttctggcttgtattctttgtcctctgttgttactgttccctcttcttctttgggtactcaaacttacatctgcaacgttaaccataagccatctaacaccaaggttgataagaaagttggaggaggtggtggatcaggcggtggtggcagtggaggtggaggctcacaggaactgacaactatatgcgagcaaatcccctcaccaactttagaatcgacgccgtactctttgtcaacgacta ctattttggccaacgggaaggcaatgcaaggagtttttgaatattacaaatcagtaacgtttgtcagtaattgcgg ttctcacccctcaacaactagcaaaggcagccccataaacacacagtatgttttttgaggcggtggaggttctgaacagaagttgatttctgaagaggatctcgagggtggttctggttcaggtgctactaattttagtttgttgaagcaagccggtgacgttgaagaaaatccaggtccaatgcaacttttgagatgcttctccattttctccgttatcgcgtctgtcttggctgctggatcc
>AfIII-PDI-BssHII(SEQ ID NO:5)
cttaagccgccaccatgcagttcaattggaatattaagaccgtcgcctctatcttgtctgctcttaccttggcccaagcttctgaccaagaagccattgccccagaagactctcatgtcgtcaagttgaccgaggctaccttcgagtctttcatcacctctaatcctcatgttttggctgagtttttcgccccttggtgcggacactgcaagaagcttggaccagaattggtctctgctgccgagatcttgaaggacaacgagcaagttaagatcgcccagatcgactgcaccgaggagaaggaattgtgccaaggttacgagatcaaaggatacccaaccttgaaagtcttccacggtgaggtcgaagtccctagtgactaccaaggtcagaggcagagtcagtctatcgtcagttacatgttgaaacagagtttgccaccagtcagtgagattaacgccaccaaggaccttgacgataccatcgcagaggctaaagagccagtcatcgtccaagttttgccagaagacgccagtaacttggagtctaataccaccttctatggagtcgccggaactttgagggagaaattcacttttgtctctactaaatctactgattatgccaagaagtataccagtgactctaccccagcctaccttcttgtcagacccggtgaggagccatctgtctactctggagaggagcttgacgaaacccacttggtccactggatcgacatcgaatctaagcctcttttcggtgacatcgacggaagtaccttcaagtcttacgccgaggccaacatccctcttgcctactacttctacgagaacgaggagcagagggctgctgccgccgacatcatcaaacctttcgccaaggagcagagaggaaagatcaacttcgtcggattggacgccgttaagttcggaaagcacgctaagaatttgaacatggacgaagagaaattgccattgttcgttattcatgatcttgtcagtaacaagaaattcggtgttcctcaagatcaagaacttaccaacaaagatgtcactgagcttatcgagaagtttatcgctggagaggccgagcctatcgttaagtctgagccaatcccagaaatccaagaagaaaaggttttcaagcttgtcggtaaagcccacgacgaggtcgtcttcgacgaatctaaagatgtccttgtcaaatattatgccccttggtgtggacattgcaagaggatggctccagcctacgaggaattggctaccttgtacgccaacgacgaggatgcctcttctaaggtcgtcatcgccaagcttgaccatacccttaatgatgttgataatgttgacatccaaggttatccaaccttgatcctttacccagctggtgacaagagtaaccctcagctttacgatggttctagagaccttgagagtttggccgagttcgtcaaagaaaggggtactcacaaggttgatgcccttgctttgaggccagtcgaagaagagaaggaggctgaagaggaagccgaaagtgaagccgacgctcacgatgaactttgataagcgcgc
>BsiWI-CL-(A-LZ)-V5-P2A-SP1-VH-CH1-(B-LZ)-3GS-Aga2-Myc–PmeI(SEQ IDNO:6)
CGTACGGTGGCCGCCCCTAGCGTGTTTATCTTCCCTCCCAGCGACGAGCAGCTGAAAAGCGGAACAGCCAGCGTCGTCTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCAGGGAGGCCAAGGTCCAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTGCAGAGCGGAAACTCTCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGATAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTGAGCAGCACACTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCTTGCGAAGTGACCCACCAGGGACTGAGCAGCCCAGTGACCAAGAGCTTCAACCGCGGCGAGTGCggttctggcggtggtggcagtgctcagcttgaaaaagaattgcaagctttggagaaggagaacgcccaattggagtgggaattgcaagctttggagaaagagttggctcagggcggtggaggttctttcgaaggtaagcctatccctaaccctctcctcggtctcgattctacgcgtggtggttctggttcaggtgctactaattttagtttgttgaagcaagccggtgacgttgaagaaaatccaggtccaatgcagttacttcgctgtttttcaatattttctgttattgctagcgttttagcagccggtGAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGACTGGTGCAGCCAGGAGGAAGCCTGAGACTGTCCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCTCCAGCTACTCCATGAACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGAGCTACATCTCCAGCTCCTCCAGCACCATCGATTACGCCGATAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCAGGGATAACGCCAAGAATAGCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGGGATGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGAGAGCGGCTGGTACTTGTTTGATTACTGGGGCCAGGGTACCCTGGTTACCGTTAGCAGCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAACCTAAGTCTTGTggaggtggtggatcagctcagttgaaaaagaagttgcaagctttgaagaaaaagaacgcccagttgaaatggaagcttcaagctttgaaaaaaaaattggctcaaggaggtggtggatcaggcggtggtggcagtggaggtggaggctcacaggaactgacaactatatgcgagcaaatcccctcaccaactttagaatcgacgccgtactctttg tcaacgactactattttggccaacgggaaggcaatgcaaggagtttttgaatattacaaatcagtaacgtttgtca gtaattgcggttctcacccctcaacaactagcaaaggcagccccataaacacacagtatgttttttgagaacagaagttgatttctgaagaggatctcgaggtttaaac
具体质粒构造和验证步骤如下：
1)重组载体的构建。SEQ ID NO:4、5和6所示的核酸序列由广州金唯智生物技术有限公司合成。将SEQ ID NO:4所示的核酸序列与PYD-2GAL-Fab(11D4)质粒分别用EcoRI和BamHI酶切后，回收相应的片段用T4连接酶连接，并转化至DH5α感受态细胞中，培养后提取质粒进行测序验证，最终得到质粒PYD-P2A-Fab(11D4)；
将如SEQ ID NO:5所示的核酸序列和PYD-2GAL-Fab(11D4)质粒分别用AfIII和BssHII酶切后，回收相应的片段用T4连接酶连接，将正确连接的质粒与如SEQ ID NO:6所示的核酸序列分别用BsiWI和PmeI双酶切后再回收相应的片段用T4连接酶连接，并转化至感受态细胞中，培养后提取质粒进行测序验证，最终得到质粒PYD-PDI-Fab-LZ(11D4)。
2)重组质粒转化酵母菌落的筛选及培养。复苏和培养酿酒酵母EBY100，采用电转化的方法将步骤1)构建的重组质粒PYD-P2A-Fab(11D4)和PYD-PDI-Fab-LZ(11D4)分别转入酵母细胞中，然后将电转化后的酵母菌液涂布在色氨酸营养缺陷型固体培养平板上，在30℃培养箱中静置培养3天，挑选单菌落进行测序鉴定。挑选测序鉴定正确的转化入重组质粒PYD-P2A-Fab(11D4)和PYD-PDI-Fab-LZ(11D4)的单克隆酵母株分别在SD培养基(含2％葡萄糖的YNB-CAA培养基)中30℃和250rpm摇床中培养过夜，后换成SG诱导培养基(含2％半乳糖的YNB-CAA培养基)在20℃和250rpm摇床中培养36小时。
3)流式细胞分析酵母表面展示能力和与抗原结合能力。取上一步诱导的转化入重组质粒PYD-P2A-Fab(11D4)和转化入重组质粒PYD-PDI-Fab-LZ(11D4)的酵母，用PBS洗涤和重悬，分别等量分成四管。其中转化PYD-P2A-Fab(11D4)质粒的酵母的流式染色方案如下：1号管是空白细胞对照；2号管孵育anti-Myc PE(购自Abcam公司，货号ab72468，1:500稀释)25分钟；3号管孵育anti-V5 Alexa Fluor 647(购自Invitrogen公司，货号451098，1:500稀释)和anti-FC PE(购自Invitrogen公司，货号451098，1:500稀释)荧光二抗25分钟；4号管先孵育10nM的OX40-FC(购自ACRO公司，货号OX0-H5255)1小时，洗涤后再孵育anti-FC PE(1:500稀释)和anti-V5 Alexa Fluor647(1:500稀释)荧光二抗25分钟。
PYD-P2A-Fab(11D4)质粒酵母展示Fab的结果如图5b所示。其表明，PYD-P2A-Fab(11D4)质粒系统可以使Fab片段(11D4)正确地展示在酵母表面，并特异地结合对应抗原OX40-FC。而且PYD-P2A-Fab(11D4)质粒能够对单个酵母同时进行抗原结合的标记以及Fab展示的标记。
图5b、图4和图2的实验是同时操作，通过比较三者的数据，可以发现，相比于实施例1中的PYD-scFab(11D4)质粒系统，PYD-P2A-Fab(11D4)质粒系统的抗原结合的荧光强度明显更强。考虑到两个质粒系统展示抗体的酵母比例和荧光强度相差不大，表明Fab比scFab更能维持IgG抗体的亲和力。而PYD-2GAL-Fab(11D4)质粒系统和PYD-P2A-Fab(11D4)质粒系统中展示抗体的酵母比例分别为48％和61％，这表明PYD-P2A-Fab(11D4)质粒系统能使得更多的抗体Fab片段(11D4)展示在酵母表面。
实施例3比较酵母展示质粒PYD-PDI-Fab-LZ和PYD-P2A-Fab
(1)以11D4抗体的Fab为例进行比较。
在用流式细胞分析验证实施例2的PYD-PDI-Fab-LZ(11D4)质粒展示Fab效果的同时，按实施例2中的步骤，扩增和诱导含PYD-P2A-Fab(11D4)质粒的酵母。取适量上述诱导后的酵母，并用PBS洗涤重悬，等量分成3管。1号管是空白细胞对照；2号管孵育anti-his FITC(购自Invitrogen公司，MA1-81891，1:500稀释)和anti-V5APC(购自Abcam，货号ab72560，1:500稀释)25分钟；3号管先孵育5nM的OX40-his(购自ACRO公司，货号OX0-H5224)1小时，洗涤后再孵育anti-his FITC(1:500稀释)和anti-V5 APC(1:500稀释)荧光二抗25分钟。然后用PBS洗涤样品3次，并用PBS重悬。最后用BD C6流式仪检测上述样品的对应荧光信号。
其中转化PYD-PDI-Fab-LZ(11D4)质粒的酵母的流式染色方案如下：1号管是空白细胞对照；2号管孵育anti-Myc FITC(购自Abcam公司，货号ab117599，1:500稀释)25分钟；3号管孵育anti-V5 APC(购自Abcam，货号ab72560，1:500稀释)和anti-his FITC(购自Invitrogen公司，MA1-81891，1:500稀释)荧光二抗25分钟；4号管先孵育5nM的人OX40-his(购自Acro公司，货号OX0-H5224)1小时，洗涤后再孵育anti-his FITC(1:500稀释)和anti-V5 APC(1:500稀释)荧光二抗25分钟。最后用PBS洗涤样品3次，并用适量PBS重悬，使用BDC6流式仪检测上述样品的对应荧光信号。
细胞流式结果如图8所示。含PYD-P2A-Fab(11D4)质粒的酵母的V5标签的阳性率为31％，表明酵母成功诱导表达Fab片段(11D4)，但是5nM的单价抗原OX40-his标记的酵母比例却为0，表明酵母表面展示的Fab片段(11D4)不能有效结合OX40-his，这表明PYD-P2A-Fab(11D4)质粒系统的酵母表面展示的Fab大多不能正常折叠。而相对的，根据图7的结果，PYD-PDI-Fab-LZ(11D4)系统的表面展示抗体的酵母比例为46％，同时5nM的单价抗原OX40-his标记的酵母比例高达28.5％。所以，相比于PYD-P2A-Fab(11D4)质粒系统，PYD-PDI-Fab-LZ(11D4)质粒系统使得更多的Fab片段(11D4)正常折叠并展示在酵母表面。
(2)以anti PD-L1的Fab为例进行比较。
利用NcoI和AfeI酶切位点把编码anti-PD-L1 Fab的VH(SEQ ID NO:9)的核酸序列插入PYD-P2A-Fab(11D4)质粒，得到重组质粒，再利用BamHI和BsiWI酶切位点把编码anti-PD-L1 Fab的VL(SEQ ID NO:10)的核酸序列插入上述重组质粒。经过转化和测序验证，得到用于酵母展示anti-PD-L1 Fab的PYD-P2A-Fab(PD-L1)质粒。同理，分别利用NcoI和AfeI酶切位点以及BamHI和BsiWI酶切位点把anti-PD-L1Fab的VH和VL的核酸序列插入到PYD-PDI-Fab-LZ(11D4)质粒。经过转化和测序验证，得到用于酵母展示anti-PD-L1 Fab的PYD-PDI-Fab-LZ(PD-L1)质粒。
>anti-PD-L1 Fab的VH的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVGDISAYGGSTLVRGSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS
>anti-PD-L1 Fab的VL的氨基酸序列(SEQ ID NO:10)
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCKASQDVKTAVSWYQQKPGQAPRLLIYWASTRATGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQHYSTPWTFGQGTKVEIK
按实施例1中的步骤，通过电转化酵母后，得到分别含PYD-P2A-Fab(PD-L1)和PYD-PDI-Fab-LZ(PD-L1)质粒的两种酵母，然后分别进行扩增和诱导。取适量上述诱导后的2种酵母，分别分为3管，其中1号管是空白细胞对照；2号管分别孵育anti-FC PE(购自Invitrogen公司，货号12-4998-82，1:500稀释)和anti-V5 APC(Abcam，货号ab72560，1:500稀释)25分钟；3号管分别先孵育10nM的PD-L1-FC(购自ACRO公司，货号PD1-H5258)1小时，洗涤后再孵育anti-FC PE(1:500稀释)和anti-V5 APC(1:500稀释)荧光二抗25分钟。然后用PBS洗涤样品3次，并用PBS重悬。最后用BD C6流式仪检测上述样品的对应荧光信号。
细胞流式结果如图9所示。结果表明，含PYD-P2A-Fab(PD-L1)质粒的酵母的V5标签阳性率(用于检测表面展示Fab的酵母量)为44.9％，而含PYD-PDI-Fab-LZ(PD-L1)质粒的酵母的V5标签阳性率只有22.2％，这可能是由于V5小肽在空间上和Aga2蛋白并列并导致了空间位阻，可以通过检测Myc标签或者Fab的恒定区以衡量酵母展示Fab的能力。但是含PYD-PDI-Fab-LZ(PD-L1)质粒的酵母的PD-L1-FC结合的阳性率约为48％，显著高于含PYD-P2A-Fab(PD-L1)质粒的酵母的25.5％，而且前者的荧光信号也显著地强于后者。
(3)综合上述两个例子的比较，可以发现，相比于PYD-P2A-Fab(11D4)和PYD-P2A-Fab(PD-L1)展示质粒，PYD-PDI-Fab-LZ(11D4)和PYD-PDI-Fab-LZ(PD-L1)展示质粒能够解决一些在酵母中低表达或难以正确折叠的抗体或抗原结合片段的展示问题。此外，在构建抗体库时，通过使得酵母表达展示更多折叠正确的抗体或抗原结合片段蛋白，可以尽可能地避免某些克隆的丢失，保持原始库的多样性。
Claims (12)
1.一种酵母展示载体，其特征在于，所述酵母展示载体包含分子伴侣基因、编码抗体或抗原结合片段的包含重链可变区的第一多肽的第一多核苷酸和编码抗体或抗原结合片段的包含轻链可变区的第二多肽的第二多核苷酸；所述第一多核苷酸和第二多核苷酸的3’末端分别连接有带正、负电荷的亮氨酸拉链基因，其中一个亮氨酸拉链基因的3’末端连接有酵母锚定蛋白基因。
2.一种酵母展示载体，其特征在于，所述酵母展示载体包含pYD1质粒骨架、分子伴侣基因、编码抗体或抗原结合片段的包含重链可变区的第一多肽的第一多核苷酸和编码抗体或抗原结合片段的包含轻链可变区的第二多肽的第二多核苷酸；所述第一多核苷酸和第二多核苷酸的3’末端分别连接有带正、负电荷的亮氨酸拉链基因，其中一个亮氨酸拉链基因的3’末端连接有酵母锚定蛋白基因。
3.根据权利要求1或2所述的酵母展示载体，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段为Fab或scFab；或者，所述抗体或抗原结合片段结合的靶点选自TIGIT、4-1BB、OX40、PD-1、PD-L1、ANGPT2、APLP2、BAFF、BCMA、CCR2、CD123、CD16、CD19、CD20、CD22、CD28、CD3、CD30、CD40、CD47、CD73、CDH17、cMET、CSF1R、CTLA-4、Claudin18.2、DLL4、EGFR、FGFR1、GITR、HER2、HGF、IL-13、IL-17、IL-17A、IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-4Ra、IL-5、IL-6、IL-6R、KLB、LAG-3、MSLN、PSMA、TfR、TGFβ、TIM-3、TRAILR2、VEGF、VISTA、ICOS，病毒相关抗原如新冠病毒抗原、IL-1α、IL-1β、IL-13、、TNF-α、TNF-β、TIM-3、LAG3、CD27、BTLA、CD137、半乳糖凝集素9、CD48、CCD70、HVEM、和CC趋化因子亚组中的CCL1、CCL3、CCL5、CCL7、CCL8。
4.根据权利要求1-3任一项所述的酵母展示载体，其特征在于，所述抗原结合片段为Fab，所述第一多核苷酸和第二多核苷酸之间包含自剪切多肽P2A基因。
5.根据权利要求1-4任一项所述的酵母展示载体，其特征在于，所述亮氨酸拉链基因的3’末端通过连接子基因与酵母锚定蛋白基因连接；如，所述连接子为包含甘氨酸和丝氨酸的多肽；或者，所述连接子的序列为(GmS)n，其中每个m独立为2、3、4或5，n独立为1、2、3、4或5；或者，所述连接子的序列为(GGGGS)n，所述n独立为1、2、3、4或5；或者，所述连接子氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示。
6.根据权利要求1-5任一项所述的酵母展示载体，其特征在于，所述分子伴侣基因为PDI基因。
7.根据权利要求1-6任一项所述的酵母展示载体，其特征在于，所述第一多核苷酸和第二多核苷酸还包含信号肽基因；如，所述信号肽如SEQ ID NO:17所示。
8.根据权利要求1-7任一项所述的酵母展示载体，其特征在于，所述第一多核苷酸的3’末端连接的亮氨酸拉链基因的3’末端连接有酵母锚定蛋白基因；如，所述酵母锚定蛋白为Aga2p亚基，α-凝集素、Flolp蛋白、Cwp1p蛋白、Cwp2p蛋白、或Tip1p等。
9.根据权利要求1-8任一项所述的酵母展示载体，其特征在于，所述带正电荷的亮氨酸拉链的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；和/或
所述带负电荷的亮氨酸拉链的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。
10.根据权利要求1-9任一项所述的酵母展示载体，其特征在于，所述酵母锚定蛋白基因的3’末端和/或所述第二多核苷酸的3’末端连接的亮氨酸拉链基因的3’末端连接有蛋白检测标签基因；可选的，所述蛋白检测标签选自His标签、Myc标签、HA标签、V5标签、Arg标签、Avi标签、Flag标签、3xFlag标签、Strep标签、Nano标签、SBP标签、S标签、钙调蛋白结合肽、纤维素结合结构域、几丁质结合结构域、GST标签和MBP标签。
11.一种宿主细胞，其包含权利要求1-10任一项所述的酵母展示载体；如，所述宿主细胞为酵母；或所述宿主细胞为酿酒酵母、毕赤酵母等；或所述宿主细胞为表达a-凝集素的aga1p亚基的酿酒酵母；或所述宿主细胞为酿酒酵母EBY100。
12.一种提高酵母展示效率的方法，其特征在于，将权利要求11所述的宿主细胞进行培养和诱导。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication |