JP5955773B2 - 改善された細菌膜タンパク質分泌 - Google Patents
改善された細菌膜タンパク質分泌 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5955773B2 JP5955773B2 JP2012539960A JP2012539960A JP5955773B2 JP 5955773 B2 JP5955773 B2 JP 5955773B2 JP 2012539960 A JP2012539960 A JP 2012539960A JP 2012539960 A JP2012539960 A JP 2012539960A JP 5955773 B2 JP5955773 B2 JP 5955773B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- phage
- protein
- bacterial
- vector
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 230000028327 secretion Effects 0.000 title claims description 55
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims description 53
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 title description 7
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 title description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 title description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 144
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 131
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 115
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 86
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 66
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 64
- 101100321993 Drosophila melanogaster pix gene Proteins 0.000 claims description 63
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 59
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 claims description 56
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 claims description 55
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 claims description 55
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 claims description 55
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 claims description 55
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 claims description 55
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 48
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 43
- 101100136076 Aspergillus oryzae (strain ATCC 42149 / RIB 40) pel1 gene Proteins 0.000 claims description 42
- 101150040383 pel2 gene Proteins 0.000 claims description 42
- 101150050446 pelB gene Proteins 0.000 claims description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 39
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 claims description 36
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 32
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 32
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 23
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 23
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 23
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 21
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 15
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 7
- 102000008102 Ankyrins Human genes 0.000 claims description 5
- 108010049777 Ankyrins Proteins 0.000 claims description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 5
- 108700010839 phage proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 4
- 230000005945 translocation Effects 0.000 claims description 4
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 claims description 3
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 claims description 3
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 claims description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 2
- 101710143509 Pre-histone-like nucleoprotein Proteins 0.000 claims 3
- 101710193132 Pre-hexon-linking protein VIII Proteins 0.000 claims 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 42
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 26
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 21
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 21
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 19
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 19
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 19
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 19
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 19
- 101100295756 Acinetobacter baumannii (strain ATCC 19606 / DSM 30007 / JCM 6841 / CCUG 19606 / CIP 70.34 / NBRC 109757 / NCIMB 12457 / NCTC 12156 / 81) omp38 gene Proteins 0.000 description 18
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 description 18
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 18
- 101150042295 arfA gene Proteins 0.000 description 18
- 101150087557 omcB gene Proteins 0.000 description 18
- 101150115693 ompA gene Proteins 0.000 description 18
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 17
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 13
- 102220005268 rs33912272 Human genes 0.000 description 13
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 12
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 12
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 11
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 10
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 9
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 9
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 9
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 7
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 7
- 101000998146 Homo sapiens Interleukin-17A Proteins 0.000 description 7
- 102100033461 Interleukin-17A Human genes 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 5
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 5
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 4
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 102200123673 rs104894481 Human genes 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710192393 Attachment protein G3P Proteins 0.000 description 3
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 102000025171 antigen binding proteins Human genes 0.000 description 3
- 108091000831 antigen binding proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 3
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 3
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102100033183 Epithelial membrane protein 1 Human genes 0.000 description 2
- -1 Fabs Proteins 0.000 description 2
- 108010021468 Fc gamma receptor IIA Proteins 0.000 description 2
- 108010021472 Fc gamma receptor IIB Proteins 0.000 description 2
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 2
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 2
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 2
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 2
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 2
- 102100029204 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Human genes 0.000 description 2
- 102100029205 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-b Human genes 0.000 description 2
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 108010008594 epithelial membrane protein-1 Proteins 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 2
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 108010087558 pectate lyase Proteins 0.000 description 2
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 2
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 2
- 230000007398 protein translocation Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 2
- QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N serotonin Chemical compound C1=C(O)C=C2C(CCN)=CNC2=C1 QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 2
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N (+/-)-DABA Natural products NCCC(N)C(O)=O OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HKZAAJSTFUZYTO-LURJTMIESA-N (2s)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-aminoacetyl)amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoic acid Chemical group NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O HKZAAJSTFUZYTO-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MUGYJXWDGQOBET-UFLZEWODSA-N 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoic acid;4-(2-aminoethyl)phenol Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C=C1.N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 MUGYJXWDGQOBET-UFLZEWODSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000008203 CTLA-4 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 1
- 101710167800 Capsid assembly scaffolding protein Proteins 0.000 description 1
- 101710169873 Capsid protein G8P Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 231100000023 Cell-mediated cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 206010057250 Cell-mediated cytotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 241001429175 Colitis phage Species 0.000 description 1
- 108010002947 Connectin Proteins 0.000 description 1
- 108010025905 Cystine-Knot Miniproteins Proteins 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 101710160937 DNA replication protein Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 102000056372 ErbB-3 Receptor Human genes 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 102100031939 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 108010075944 Erythropoietin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100036509 Erythropoietin receptor Human genes 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010020195 FLAG peptide Proteins 0.000 description 1
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 102000000802 Galectin 3 Human genes 0.000 description 1
- 108010001517 Galectin 3 Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102100026122 High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Human genes 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 101000851181 Homo sapiens Epidermal growth factor receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000913074 Homo sapiens High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Proteins 0.000 description 1
- 101000917826 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Proteins 0.000 description 1
- 101000917824 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-b Proteins 0.000 description 1
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 1
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 1
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 1
- 101710156564 Major tail protein Gp23 Proteins 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102400000058 Neuregulin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000556 Neuregulin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000004108 Neurotransmitter Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000590 Neurotransmitter Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000007399 Nuclear hormone receptor Human genes 0.000 description 1
- 108020005497 Nuclear hormone receptor Proteins 0.000 description 1
- 108010079246 OMPA outer membrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000000470 PDZ domains Human genes 0.000 description 1
- 108050008994 PDZ domains Proteins 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229920002230 Pectic acid Polymers 0.000 description 1
- 101800005149 Peptide B Proteins 0.000 description 1
- 229920002593 Polyethylene Glycol 800 Polymers 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 101710130420 Probable capsid assembly scaffolding protein Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 1
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 1
- 101710100968 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 101710100969 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Proteins 0.000 description 1
- 101710204410 Scaffold protein Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 102100026260 Titin Human genes 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 238000003314 affinity selection Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 230000003092 anti-cytokine Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013357 binding ELISA Methods 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000005890 cell-mediated cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010004073 cysteinylcysteine Proteins 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 102000034238 globular proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005896 globular proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 108091008042 inhibitory receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012917 library technology Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000002395 mineralocorticoid Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 108091005763 multidomain proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003551 muscarinic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229940005483 opioid analgesics Drugs 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- LCLHHZYHLXDRQG-ZNKJPWOQSA-N pectic acid Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)O[C@H](C(O)=O)[C@@H]1OC1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O2)C(O)=O)O)[C@@H](C(O)=O)O1 LCLHHZYHLXDRQG-ZNKJPWOQSA-N 0.000 description 1
- 108010091748 peptide A Proteins 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 229940037129 plain mineralocorticoids for systemic use Drugs 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000010318 polygalacturonic acid Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 210000004777 protein coat Anatomy 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 102220244541 rs376436045 Human genes 0.000 description 1
- 229940076279 serotonin Drugs 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
- C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
- C07K14/395—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts from Saccharomyces
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本出願は、2009年11月17日に出願された米国出願第61/261,768号に対する優先権を請求し、この出願は、参照により全体的に組み込まれる。
本発明は、提示のための繊維状ファージコートタンパク質、あるいは完全抗体及び抗体断片を含む単量体、二量体、又はヘテロ二量体若しくは多量体タンパク質、あるいは突然変異体pelB又は突然変異体ompA分泌シグナルをエキソタンパク質(exsoprotein)構築物にカップリングすることによる、他のジスルフィド結合多量体構築物であり得る、変異型のライブラリを含む外因性タンパク質の使用を含む、細菌膜を通じたタンパク質の分泌のための改善された方法に関する。
ADCC=抗体依存性細胞媒介型細胞傷害性、ADMC=抗体依存性単核細胞媒介型細胞傷害性、c1q=補体因子1q、EPO=組み換えエリスロポエチン、FcR=Fc受容体、Ig=免疫グロブリン、Hc=重鎖、Lc=軽鎖、IPTG=イソプロピルチオ−β−ガラクトシド、ompA=大腸菌外膜プロテインAをコードする遺伝子、pelB=軟腐病菌のペクチン酸リアーゼ遺伝子をコードする遺伝子。
本明細書で使用されるとき、別段の指示がない限り又は文脈から明白でない限り、抗体ドメイン、領域、及び断片は、当該技術分野において周知であるような標準的な定義に従う。本発明のタンパク質は、1つ以上の免疫グロブリンクラスの抗体に由来するか、又はその部分を組み込む。免疫グロブリンクラスには、IgG、IgM、IgA、IgD、及びIgEアイソタイプ、またIgG及びIgAの場合は、それらのサブタイプ、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4が含まれる。
ファージコートタンパク質に対する融合タンパク質を作製する際、エキソタンパク質分子は、特にpIX又はpVIIに関して、ファージコートタンパク質と比べて大きいか、又は多様な化学的特徴を有し、組み換えファージ粒子のアセンブリを干渉し得る。アセンブリ干渉を回避するために、ファージミド系がしばしば使用されており、それによってファージ粒子は、ヘルパーファージの存在下で組み立てられ、したがって発現野生型タンパク質及びエキソタンパク質コートタンパク質の両方の融合を含有する。ファージミド系は、余分な工程が要求され、またたとえあるとしても、十分な量をはるかに下回る、エキソタンパク質を提示するコートタンパク質の完全補体しかもたらさないため、より厄介である。後者の理由のために、ファージミドディスプレイ系は、典型的には一価と考えられている。一方で、多価の提示を達成するためのファージベクター系の使用は、しばしば低い力価のファージ増殖を引き起こす。
繊維状ファージ粒子上に提示された融合タンパク質において、外因性ポリペプチドと繊維状ファージコートタンパク質、及び特にpVII又はpIXコートタンパク質との間の「融合」は、アミド連鎖によって直接に連結されてもよく、又はリンカーポリペプチド(すなわち、「リンカー」)を含んでもよい。典型的に一続きの長さ約5〜50のアミノ酸である様々なリンカーのいずれを使用してもよい。特に好ましいリンカーは、そのリンカーの位置で融合タンパク質に対して大きな可動度を付与する。リピートの数が典型的には1〜12であるG4S(Gly−Gly−Gly−Gly−Ser)リピート又はG3S(Gly−Gly−Gly−Ser)を有するもののような、支配的にグリシン(G、Gly)残基からなるもののような、二次構造が欠けているリンカーを、この目的のために使用してもよい。
本発明の突然変異体分泌シグナル配列が、細菌宿主細胞、例えば、大腸菌中のタンパク質発現のためのベクターの構築において使用されるとき、ポリペプチドは、宿主細胞の周辺質中に分泌され、またそこから回収される。タンパク質回収は、典型的に、概して浸透性のショック、音波処理、又は溶解のような手段によって、微生物を妨害することを伴う。一旦、細胞が妨害されると、細胞残屑又は全細胞は、遠心分離又は濾過によって除去されてもよい。タンパク質は更に、例えば、親和性樹脂クロマトグラフィーによって精製されてもよい。あるいは、タンパク質は、培養培地中に輸送し、そこで単離することができる。細胞は、培養物から除去され、培養物上清は、産生されたタンパク質の更なる精製のために濾過及び濃縮され得る。発現ポリペプチドは更に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)及びウェスタンブロットアッセイのような一般的に知られる方法を用いて、単離及び特定され得る。
pVIIが、多コピーの異なるペプチド及びタンパク質を効率的かつ安定的に提示することができるかどうかを試験するために、ファージゲノム提示ベクターを設計及び構築した。pVIIベクターを、ファージゲノムM13KE、M13mp19の誘導体(一本鎖の雄型特異的繊維状DNAバクテリオファージM13、NCBI NC_003287の誘導体であるベクター、およそ7250bp長)を用いて構築した。pVII及びpIXコード配列は、ゲノム中で互いに隣接して位置する。このベクターにおいて、出発コドンを有するペプチド及びGSGGGリンカーを、pVIIのN末端中に挿入した(図1A)。pVIIコード領域の前のBsrG I制限エンドヌクレアーゼ部位及びpIXコード領域の末端部におけるBspHI部位を、クローニングに使用した。
ファージELISAデータを図2A−Eに示し、それによりすべての5つのペプチドが、種々の構造及び生物理学的特性を有するにもかかわらず、pVIIコートタンパク質に繋ぎ止められたファージ表面上に首尾よく提示されたことが実証される。
野生型pVIIは、それが宿主細胞中の内膜タンパク質であるという事実にもかかわらず、シグナルペプチドなしに天然に合成される。しかしながら、pVII及びpIXディスプレイ系の以前の研究において、シグナルペプチドが使用された(Gao,et al.1999,Proc Natl Acad Sci U S A 96:6025;Kwasnikowski et al.2005 Journal of Immunological Methods 307:135〜143)。細菌シグナル配列がpVII上でのファージディスプレイに必要であるかどうかを検査するために、Hペプチド、続いてGSGGGリンカー及びpVIIの前に、pelBを添加したか、又は添加しなかったいずれかの構築物を作製した。
ストレプトアビジンに結合する、PHPEP 97(RECHPQNWTSCSN)、ジスルフィド結合拘束13アミノ酸ペプチドは、pVIIファージディスプレイについて試験したペプチドのうちの1つであった(実施例1)。ファージELISAにおいて、PEP97(CL#7及びCL#8)の2つのクローンは、ストレプトアビジンへの高まった結合能力を示した(図2E)。これらのクローンの配列分析により、両方のクローンのpelB配列中の単一のアミノ酸突然変異Pro6からSer(図5A)が明らかとなった。
2つの異なるペプチドを同時に多価で提示するために、ファージベクターを、ファージゲノムM13KEに基づいて構築し、ここで突然変異体P6S細菌シグナルペプチドpelB(配列番号2、C16T)、ペプチドA、及び可動性のGSGGGリンカーをpVII遺伝子のN末端に挿入し、野生型細菌シグナルペプチドompA(配列番号4、G31)、ペプチドB、及び可動性のGSGGGリンカーをpIXのN末端中に挿入した(図1B)。pVIIコード領域の前のBsrG I制限エンドヌクレアーゼ部位及びpIXコード領域の末端部におけるBspH I部位を、クローニングに使用した。シグナル配列、ペプチド、GSリンカー、pVII、pIX遺伝子をコードするDNA断片、並びにBsrG I及びBspH I認識部位にまで延長する、5’及び3’末端部上の隣接DNA配列を、オーバーラップPCRによって生成した。ゲル生成したPCR産物を、BsrG I及びBspH I制限エンドヌクレアーゼで消化し、次いで同じ酵素で消化された二本鎖M13KEファージDNA中にライゲートした。ライゲート組み換えファージDNAを、XL1−ブルー大腸菌コンピテント細胞(Strata遺伝子)に形質転換し、形質転換細胞をXL1−ブルー宿主細胞の菌叢上にプレートして、前述のように単一のプラークを単離した。
A.ベクター設計。
完全IgG提示ファージミド(vDR47、図9)を、国際公開第2009/085462号に記載されるように、ファージミド構築物から出発して構築した(pCNTO Fab IX)。ヒトIgG1ヒンジ、CH2及びCH3ドメインをコードする配列、並びにP6S pelB変異型シグナル配列を付加し、ベクターは、lacI遺伝子を有さないが、発現は、lacプロモータによって制御することができた。
pIX上での完全IgGの提示を査定するために、試験構築物のパネルを作製した。6〜2及び16〜7と表記されるIL13に対する抗体、並びに抗サイトカイン抗体9〜4を、新たな完全IgG分子を構築するためのプロトタイプとして選択した。異なるコドン利用の効果を決定するために、2つの構築物を抗IL13抗体の各々に対して作製し、このうち1つはヒトコドン最適化を伴い、もう1つは大腸菌コドン最適化を伴った。表1は、5つの完全IgG試験構築物についてのベクター表記を列挙する。最適化された遺伝子を合成し、米国特許第6,670,127号及び同第6,521,427号に記載されるような二本鎖DNAに組み立てた。加えて、pIXと融合したEMP−1ペプチド−Fc融合構築物(US7393662のCNTO530、配列番号88)を、それがヒトIgGヒンジ、CH2及びCH3ドメインを含有するが、軽鎖を含有しないため、対照として含めた。
上記のB節に記載される完全IgGディスプレイ構築物を、標準的なプロトコルに従って2つの異なるF’大腸菌株、TG−1、及びXL−1ブルーに形質転換した。これらの2つの株を試験する理由は、仮説上、完全IgG pIX融合タンパク質のパッケージング及びディスプレイに影響を及ぼし得る、増殖率におけるそれらの差異である。個々の形質転換体を採取し、カルベニシリンを補充した(常に100μg/mLで使用される)2XYT培地中で一晩増殖させた。次いで一晩の培養物(500μL)を使用して、25mLの2XYT/カルベニシリンを接種し、培養物を37℃、250rpmで、OD(600nm)が0.5に到達するまで増殖させた。振盪を行わずに37℃で30分間インキュベーションする間に、細菌を10^11pfu/mLのVCSM13ヘルパーファージ(Stratagene,La Jolla,CA)に感染させ、続いて3,000rpmで15分間、遠心分離工程を行った。この工程において、標準的なプロトコルにより、2XYT/カルベニシリン/IPTG(1mM)での細菌培養が求められた。しかしながら、我々は、この体系の漏出性が、その後のファージパッケージングを伴う融合タンパク質を産生するために十分であろうとの仮説により、培養物を2つに分割し、1mM IPTGを一方に添加し、他方には添加しなかった。要約すると、各構築物について、4つの異なるファージ調製物を作成した:(i)IPTGを有するTG−1(ii)IPTGを有さないTG−1(iii)IPTGを有するXL−1ブルー(iv)IPTGを有さないXL−1ブルー。培養を30℃、250rpmで一晩増殖させ、翌日、3,000rpmで15分間遠沈させ、続いてPEG/NACl中でファージ上清の沈殿を行った。氷上で2時間後、沈殿したファージを10,000rpmで、15分間遠沈させ、ファージペレットを2mL PBS中に再懸濁させた。ファージ調製物を更に、10,000rpmで10分間スピンすることによって、あらゆる残存する細菌ペレットから清澄化し、2mL管中、4℃で保管した。
標準的なプロトコルに従ってファージ力価を決定した。簡潔に述べると、OD(600nm)が0.5に到達するまで、TG−1細胞を2XYT中で増殖させた。ファージ調製物を、96ウェルプレート中のPBS中に連続的に希釈し、TG−1細胞をファージに添加し、37℃でインキュベートして感染可能にした。30分後、1%グルコース及びカルベニシリンを含有するLB寒天プレートに、2μLの各ウェルを分与することによって、スポット滴定を行った。プレートを37℃で一晩インキュベートし、ファージ濃度を、mL当たりのコロニー形成単位(cfu)の観点から決定した。表3は、すべての構築物及び培養条件についてのファージ滴定からの結果を示す。すべてのクローンは、10^11〜10^13cfu/mLの間の高いファージ力価を産生し、それは予測範囲内であり、ファージが効率的に産生されることを示した。
ファージpIX上での完全IgG分子の提示を査定するために、一連のサンドイッチELISAを設定した。黒色マキシソーププレートを、1μg/mLの、TBS中に希釈した捕捉抗体;ヒツジ抗ヒトIgG(Fd、CH1)抗体(The Binding Site,Birmingham,UK)、マウス抗ヒトカッパ軽鎖(Southern Biotech,Birmingham,AL)、マウス抗ヒトIgG(CH2ドメイン)抗体(AbD Serotec,Raleigh,NC)、及びマウス抗ヒトIgG(CH3ドメイン)抗体(AbD Serotec)のうちの1つでコーティングした。プレートをケミブロッカー(Chemicon/Millipore,Billerica,MA)でブロックした後、プレートを洗浄し、ファージを2×10^11cfu/mLの濃度(10%ケミブロッカー/TBST中に希釈)で添加し、1時^11間インキュベートした。プレートを洗浄し、HRP共役したマウス抗M13抗体をプレートに添加した。30分のインキュベーション後、プレートを洗浄し、化学発光基質をウェルに添加し、プレートをEnvisionプレートリーダーにおいて読み取った。図10A〜Dは、それぞれCH1(図10A)、カッパ(図10B)、CH2(図10C)、及びCH3(図10D)サンドイッチELISAからの結果を示す。ELISAで使用した対照は、vDR10中のクローン6−2のFab−pIX融合物(ヒトコドン最適化、TG−1細胞中で作製、IPTG誘導を伴う)、非特異的な足場タンパク質−pIX融合物、又はCNTO530−pIX融合物を提示するファージであった。CH1及びカッパELISAにおいて、6−2 Fabは、陽性対照としての機能を果たす一方で、EMP−1構築物(CNTO530)分子は、陰性対照としての機能を果たす。CH2及びCH3 ELISAにおいて、6−2 Fabは、陰性対照としての機能を果たし、CNTO530分子は、陽性対照としての機能を果たす。足場タンパク質ファージは、それがいかなる抗体ドメインも担持しないため、すべてのELISAにおいて陰性対照としての機能を果たす。ファージの異なる捕捉抗体への結合を防止するために、可溶性競合物質として、5μg/mLの濃度での抗IL13完全IgG1抗体の添加によるELISAアッセイもまた行った。
IgG分子のすべてのドメインを、ELISAによってファージ粒子上で検出できることを実証した後、構築物が、それらのそれぞれの抗原に結合する能力も保持するかどうかを決定することが必要であった。IL13結合ELISAを、黒色マキシソーププレートを、1μg/mLの商業用の抗IL13抗体(マウス抗ヒトIL13、MAB213、R&D Systems)でコーティングすることによって設定した。MAB213は、IL13への結合をめぐって6−2又は16−7と競合せず、故に、サンドイッチELISA捕捉抗体として理想的である。洗浄及びブロッキング後、ビオチン化ヒトIL13R130Qヒト(Peprotech)を100nMで添加し、1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、pIX上で6−2及び16−7の完全IgGバージョンを提示するファージを2×1011cfu/mLで、単独で又は競合のための可溶性抗IL13抗体と一緒に添加した。結合ファージを、HRP共役したマウス抗M13抗体で検出し、化学発光をEnvision機器において読み取った。図11は、IL13ファージELISAの結果を示す。結合は、ほとんどの条件において検出され、このうち1mM IPTGを有するXL−1ブルー細胞中で産生されたファージが最も高いシグナルを示した。ペプチド−Fc−pIX及び代替的な足場分子−pIX融合物は、予測通り陰性であり、6−2 Fab pIX対照は、陽性であった。結合は、可溶性抗IL13抗体を添加することによって阻害され、相互作用が特異的であることを示した。IL13結合を更に検査するために、ELISAを設定し、そこで可溶性競合抗体を50μg/mL〜0.01μg/mLまで連続的に希釈した。対照抗体もまた含めた。図12A及びBは、それぞれ6〜2 IgG pIX及び6〜2Fab pIXのIL13結合に及ぼす可溶性抗体競合の効果を示す。結合の阻害は、およそ0.1μg/mLのIC50により、両方の構築物について見られた。しかしながら、完全IgG pIX構築物については、阻害は、非常に高い競合物質濃度においてさえ不完全であり、あるレベルの非特異的な相互作用が存在することを示唆する。
第2の確証的な実験を行った。これは、抗IL17A抗体の完全IgGバージョンをクローニングすることによって行った。構築物をXL−1ブルー細胞に形質転換し、ファージを、上述のように産生した。ELISAを行って、図13に示されるように、pIX上でのIL17 IgGの提示、並びにヒトIL17Amut6抗原へのその結合を確認した。各ELISA(FD捕捉、カッパ捕捉、CH2捕捉、CH3捕捉、IL13捕捉、及びIL17捕捉)について、ファージを単独で又は可溶性抗IL13 mAb若しくはA可溶性抗IL17A mAbと一緒にのいずれかで添加した。競合物質mAbの添加は、ELISAの特異性を示す。上記の図12A及びBにおいて明白なように、IL17 IgGは、IL13 IgGよりも低いレベルではあるが、pIX上に提示される。これは、これらの構築物の間のFab発現レベルにおける差異と一致する(データは図示されず)。ファージ上の抗IL13 IgGは、IL17に結合せず、ファージ上の抗IL17 IgGは、IL13に結合しないことから、抗原結合の特異性を見ることができる。加えて、ファージの2つのタイプの各々の結合は、それらの可溶性mAb対応物によって阻害され得る。
追加的に、pVIIファージミド系を用いて、Fc及びMIMETIBODY(商標)タンパク質がファージ表面上に提示され得ることを実証した。
本発明は、以下の態様を包含する。
[1]
細菌膜からタンパク質のトランスロケーションを導くために、菌分泌シグナルをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、pelBのP6S変異型(配列番号1)及びompAのA11P変異型(配列番号3)から選択される、単離されたポリヌクレオチド。
[2]
エキソタンパク質コード配列に操作可能に連結され、前記エキソタンパク質が、前記細菌膜から分泌されることになる、上記[1]に記載の単離されたポリヌクレオチド。
[3]
前記エキソタンパク質が更に、pIII、pVII、pVIII、及びpIXから選択されるファージコートタンパク質をコードする配列に操作可能に連結され、そのようにして形成された融合タンパク質が、細菌膜から分泌されることになる、上記[2]に記載の単離されたポリヌクレオチド。
[4]
前記エキソタンパク質が、ペプチドを含むポリペプチド、抗体重鎖定常ドメイン、抗体重鎖、哺乳類受容体鎖、受容体細胞外ドメイン、フィブロネクチン様ドメイン、及びアンキリンリピートドメインからなる群から選択される、上記[3]に記載の単離されたポリヌクレオチド。
[5]
外因性タンパク質に由来するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結された、細菌分泌シグナルをコードする核酸配列を含むベクターであって、前記コードされた分泌シグナルが、pelBのP6S変異型(配列番号1)及びompAのA11P変異型(配列番号3)から選択され、前記分泌シグナルが、野生型分泌シグナルと比較して、前記細菌膜からトランスロケーションすることが判明するエキソタンパク質の割合を増強する、ベクター。
[6]
前記コードされた外因性タンパク質コード配列が更に、pIII、pVII、pVIII、及びpIXから選択される繊維状ファージコートタンパク質をコードする配列に融合される、上記[5]に記載のベクター。
[7]
ファージミドベクターである、上記[6]に記載のベクター。
[8]
ファージベクターである、上記[6]に記載のベクター。
[9]
突然変異体分泌シグナルに連結されたエキソタンパク質コード配列が、pVIIに融合され、突然変異体分泌シグナルに連結されたエキソタンパク質配列が、pIXに融合され、それによって、前記ベクターが宿主細胞中で複製されるとき、前記両方のエキソタンパク質が多重コピーとして前記ファージ粒子の表面上に存在するようにする、上記[8]に記載のベクター。
[10]
前記コードされたエキソタンパク質が、ペプチド、抗体重鎖定常ドメイン、抗体重鎖、哺乳類受容体鎖、受容体細胞外ドメイン、フィブロネクチン様ドメイン、及びアンキリンリピートドメインからなる群から選択される、上記[6]に記載のベクター。
[11]
誘導可能なプロモータを更に含む、上記[5]に記載のファージベクター。
[12]
前記誘導可能なプロモータが、lacプロモータ又はlacの突然変異体である、上記[11]に記載のファージベクター。
[13]
上記[3]に記載のエキソタンパク質に操作可能に連結された、分泌シグナルをコードするポリヌクレオチドを封入した繊維状ファージ粒子であって、前記ファージの表面上に前記エキソタンパク質を有する、繊維状ファージ粒子。
[14]
前記エキソタンパク質が、繊維状ファージpVII又はpIXタンパク質のアミノ末端に融合され、その上で、前記タンパク質が、繊維状ファージタンパク質の表面で発現されるとき、1つのエキソタンパク質内のシステイン残基が、前記繊維状ファージ粒子の表面上で発現された第2のエキソタンパク質上のシステイン残基に酸化的に結合されるようになり、機能性タンパク質構造を形成する、上記[13]に記載の繊維状ファージ粒子。
[15]
前記機能性タンパク質構造が、抗体Fc領域を含む、上記[14]に記載の繊維状ファージ粒子。
[16]
前記タンパク質構造の機能的活性が、FcRn結合である、上記[15]に記載の繊維状ファージ粒子。
[17]
上記[13]に記載の繊維状ファージを含む、細菌宿主細胞。
[18]
上記[17]に記載の繊維状ファージベクターを含む、細菌宿主細胞のファージライブラリ。
[19]
前記各ポリヌクレオチドが、アミノ酸置換を有するFc形成配列をコードする、上記[14]に記載のファージライブラリ。
[20]
前記Fc形成配列が更にリガンド結合ドメインを含む、前記核酸鎖である、上記[15]に記載のファージライブラリ。
[21]
前記リガンド結合ドメインが、受容体結合リガンド、受容体細胞外ドメイン、可変ドメイン及び定常ドメインを含む抗体Fabドメイン、並びに単鎖Fv構築物からなる群から選択される、上記[16]に記載のファージライブラリ。
[22]
前記Fabドメインが、前記結合ドメイン内の特異的残基において互いに異なる配列を含む、上記[17]に記載のファージライブラリ。
[23]
pelBのP6S変異型のためのコード配列を含むポリヌクレオチドを用いて、細菌宿主細胞中でエキソタンパク質を発現させる方法であって、前記エキソタンパク質が、前記細菌宿主細胞の増殖を支持する培地から回収可能である、方法。
[24]
上記[1]に記載の細菌分泌シグナルの変異型を含むポリヌクレオチドを用いて、細菌宿主細胞中でエキソタンパク質を発現させる方法であって、前記タンパク質が、繊維状ファージコートタンパク質に融合され、前記ファージ粒子の表面上で前記タンパク質を提示するファージの力価が、野生型細菌分泌シグナルが使用されるとき又は細菌分泌シグナルが使用されないときよりも高い、方法。
[25]
上記[14]に記載のライブラリから選択される配列を有するタンパク質変異型を含む、医薬組成物。
Claims (20)
- 細菌膜からのタンパク質のトランスロケーションを導くための細菌分泌シグナルをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記細菌分泌シグナルが、pelBのP6S変異型(配列番号1)である、単離されたポリヌクレオチド。
- 外因性タンパク質コード配列に操作可能に連結され、前記外因性タンパク質が、前記細菌膜から分泌されることになる、請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 前記外因性タンパク質コード配列が更に、pIII、pVII、pVIII、及びpIXから選択されるファージコートタンパク質をコードする配列に操作可能に連結され、そのようにして形成された融合タンパク質が、細菌膜から分泌されることになる、請求項2に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 前記外因性タンパク質が、ペプチドを含むポリペプチド、抗体重鎖定常ドメイン、抗体重鎖、哺乳類受容体鎖、受容体細胞外ドメイン、フィブロネクチン様ドメイン、及びアンキリンリピートドメインからなる群から選択される、請求項3に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 外因性タンパク質に由来するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結された、細菌分泌シグナルをコードする核酸配列を含むベクターであって、前記コードされた細菌分泌シグナルが、pelBのP6S変異型(配列番号1)であり、前記細菌分泌シグナルが、野生型細菌分泌シグナルと比較して、細菌膜からトランスロケーションすることが判明する前記外因性タンパク質の割合を増強する、ベクター。
- 前記コードされた外因性タンパク質コード配列が更に、pIII、pVII、pVIII、及びpIXから選択される繊維状ファージコートタンパク質をコードする配列に融合される、請求項5に記載のベクター。
- ファージミドベクターである、請求項6に記載のベクター。
- ファージベクターである、請求項6に記載のベクター。
- 前記コードされた外因性タンパク質が、ペプチド、抗体重鎖定常ドメイン、抗体重鎖、哺乳類受容体鎖、受容体細胞外ドメイン、フィブロネクチン様ドメイン、及びアンキリンリピートドメインからなる群から選択される、請求項6に記載のベクター。
- 誘導可能なプロモータを更に含む、請求項8に記載のファージベクター。
- 前記誘導可能なプロモータが、lacプロモータ又はlacの突然変異体である、請求項10に記載のファージベクター。
- 外因性タンパク質に操作可能に連結された細菌分泌シグナルをコードする請求項3に記載のポリヌクレオチドを封入した繊維状ファージ粒子であって、前記ファージの表面上に前記外因性タンパク質を有する、繊維状ファージ粒子。
- 前記外因性タンパク質が、繊維状ファージpVII又はpIXタンパク質のアミノ末端に融合され、その上で、前記タンパク質が、繊維状ファージタンパク質の表面で発現されるとき、1つの外因性タンパク質内のシステイン残基が、前記繊維状ファージ粒子の表面上で発現された第2の外因性タンパク質上のシステイン残基に酸化的に結合されるようになり、機能性タンパク質構造を形成する、請求項12に記載の繊維状ファージ粒子。
- 前記機能性タンパク質構造が、抗体Fc領域を含む、請求項13に記載の繊維状ファージ粒子。
- 前記タンパク質構造の機能的活性が、FcRn結合である、請求項14に記載の繊維状ファージ粒子。
- 請求項12に記載の繊維状ファージ粒子を含む、細菌宿主細胞。
- 請求項16に記載の細菌宿主細胞のファージライブラリ。
- 前記各ポリヌクレオチドが、アミノ酸置換を有するFc形成配列をコードする、請求項17に記載のファージライブラリ。
- pelBのP6S変異型(配列番号1)のためのコード配列を含むポリヌクレオチドを用いて、細菌宿主細胞中で外因性タンパク質を発現させる方法であって、前記外因性タンパク質が、前記細菌宿主細胞の増殖を支持する培地から回収可能である、方法。
- 請求項1に記載の細菌分泌シグナルの変異型を含むポリヌクレオチドを用いて、細菌宿主細胞中で外因性タンパク質を発現させる方法であって、前記タンパク質が、繊維状ファージコートタンパク質に融合され、前記ファージ粒子の表面上で前記タンパク質を提示するファージの力価が、野生型細菌分泌シグナルが使用されるとき又は細菌分泌シグナルが使用されないときよりも高い、方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US26176809P | 2009-11-17 | 2009-11-17 | |
US61/261,768 | 2009-11-17 | ||
PCT/US2010/056680 WO2011062862A1 (en) | 2009-11-17 | 2010-11-15 | Improved bacterial membrane protein secrection |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2013510592A JP2013510592A (ja) | 2013-03-28 |
JP5955773B2 true JP5955773B2 (ja) | 2016-07-20 |
Family
ID=44059935
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012539960A Expired - Fee Related JP5955773B2 (ja) | 2009-11-17 | 2010-11-15 | 改善された細菌膜タンパク質分泌 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8450086B2 (ja) |
EP (1) | EP2501824A4 (ja) |
JP (1) | JP5955773B2 (ja) |
CN (2) | CN102770555B (ja) |
AU (1) | AU2010322205B2 (ja) |
CA (1) | CA2781099A1 (ja) |
IL (1) | IL219686A (ja) |
MY (1) | MY159680A (ja) |
WO (1) | WO2011062862A1 (ja) |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2865033C (en) | 2012-02-23 | 2021-11-02 | Stage Cell Therapeutics Gmbh | Chromatographic isolation of cells and other complex biological materials |
BR112015017560A2 (pt) | 2013-01-24 | 2018-05-15 | Scripps Korea Antibody Institute | biblioteca de fv à base de combinação de proteína e modo de preparação da mesma |
CN103254277B (zh) * | 2013-05-03 | 2017-02-08 | 南京工业大学 | 强分泌性信号肽增强小肽模序及其应用 |
JP6421456B2 (ja) * | 2013-05-28 | 2018-11-14 | 東ソー株式会社 | シグナルペプチドおよびそれを用いたタンパク質の製造方法 |
CN105018507B (zh) * | 2014-04-17 | 2018-05-15 | 东北师范大学 | 一种用于双表位展示的噬菌体载体及其构建方法 |
MA45489A (fr) | 2015-10-22 | 2018-08-29 | Juno Therapeutics Gmbh | Procédés de culture de cellules, kits et appareil associés |
JP7339160B2 (ja) | 2017-04-27 | 2023-09-05 | ジュノ セラピューティクス ゲーエムベーハー | オリゴマー粒子試薬およびその使用方法 |
US20230304025A1 (en) * | 2020-07-20 | 2023-09-28 | Massachusetts Institute Of Technology | M13 bacteriophage with a high cysteine content and genetically engineerable hydrogels |
CN113136372B (zh) * | 2021-05-28 | 2023-08-01 | 广西大学 | 一种重组噬菌体的构建方法 |
Family Cites Families (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
PT100379B (pt) | 1991-04-10 | 1999-01-29 | Scripps Research Inst | Bibliotecas de receptores heterodimericos usando fagomideos |
DK1015576T3 (da) | 1997-09-16 | 2005-08-29 | Egea Biosciences Llc | Fremgangsmåde til fuldstændig kemisk syntese og aggregering af gener og genomer |
US6670127B2 (en) | 1997-09-16 | 2003-12-30 | Egea Biosciences, Inc. | Method for assembly of a polynucleotide encoding a target polypeptide |
US6472147B1 (en) | 1999-05-25 | 2002-10-29 | The Scripps Research Institute | Methods for display of heterodimeric proteins on filamentous phage using pVII and pIX, compositions, vectors and combinatorial libraries |
AU781396B2 (en) | 1999-07-20 | 2005-05-19 | Morphosys Ag | Novel methods for displaying (poly)peptides/proteins on bacteriophage particles via disulfide bonds |
WO2001090192A2 (en) | 2000-05-24 | 2001-11-29 | Imclone Systems Incorporated | Bispecific immunoglobulin-like antigen binding proteins and method of production |
JP2004510410A (ja) * | 2000-06-05 | 2004-04-08 | コリクサ コーポレイション | 宿主細胞由来組換えタンパク質の分泌を促進するリーダーペプチド |
GB0027782D0 (en) * | 2000-11-14 | 2000-12-27 | Boehringer Ingelheim Int | Methods fro large scale protein productio in prokaryotes |
EP1425304B9 (en) | 2001-07-11 | 2010-09-08 | Maxygen, Inc. | G-csf conjugates |
KR20050033563A (ko) | 2002-06-28 | 2005-04-12 | 센토코 인코포레이티드 | 포유동물 epo 모방 ch1 결실된 모방체, 조성물, 방법및 용도 |
WO2004002417A2 (en) | 2002-06-28 | 2004-01-08 | Centocor, Inc. | Mammalian ch1 deleted mimetibodies, compositions, methods and uses |
UA89481C2 (uk) | 2003-09-30 | 2010-02-10 | Центокор, Инк. | Еритропоетинові міметичні шарнірно-серцевинні міметитіла людини, композиції, способи та застосування |
AU2004316266A1 (en) | 2003-09-30 | 2005-09-09 | Centocor, Inc. | Human hinge core mimetibodies, compositions, methods and uses |
US7417133B2 (en) | 2004-02-27 | 2008-08-26 | Institut Pasteur | Methods for obtaining thermostable enzymes, DNA polymerase I variants from Thermus aquaticus having new catalytic activities, methods for obtaining the same, and applications of the same |
US7393662B2 (en) | 2004-09-03 | 2008-07-01 | Centocor, Inc. | Human EPO mimetic hinge core mimetibodies, compositions, methods and uses |
JP2008138690A (ja) * | 2006-11-30 | 2008-06-19 | Tanashin Denki Co | 回転部品の取付機構 |
CA2710378A1 (en) | 2007-12-19 | 2009-07-09 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Engineered phage vectors for the design and the generation of a human non-antibody peptide or protein phage library via fusion to pix of m13 phage |
AU2008343589A1 (en) | 2007-12-19 | 2009-07-09 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Design and generation of human de novo pIX phage display libraries via fusion to pIX or pVII, vectors, antibodies and methods |
JP2011507520A (ja) | 2007-12-19 | 2011-03-10 | セントコア・オーソ・バイオテツク・インコーポレーテツド | M13ファージのpIXとの融合によってヒト非抗体ペプチド又はタンパク質ファージライブラリを設計及び生成するための、操作されたハイブリッドファージベクター |
-
2010
- 2010-11-15 US US13/509,287 patent/US8450086B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2010-11-15 WO PCT/US2010/056680 patent/WO2011062862A1/en active Application Filing
- 2010-11-15 CA CA2781099A patent/CA2781099A1/en not_active Abandoned
- 2010-11-15 JP JP2012539960A patent/JP5955773B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2010-11-15 CN CN201080052575.8A patent/CN102770555B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2010-11-15 AU AU2010322205A patent/AU2010322205B2/en not_active Ceased
- 2010-11-15 CN CN201410748438.8A patent/CN104531734A/zh active Pending
- 2010-11-15 MY MYPI2012002135A patent/MY159680A/en unknown
- 2010-11-15 EP EP10832035.9A patent/EP2501824A4/en not_active Withdrawn
-
2012
- 2012-05-09 IL IL219686A patent/IL219686A/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
IL219686A (en) | 2015-04-30 |
CN104531734A (zh) | 2015-04-22 |
US8450086B2 (en) | 2013-05-28 |
EP2501824A4 (en) | 2013-06-19 |
AU2010322205B2 (en) | 2015-01-22 |
CN102770555A (zh) | 2012-11-07 |
CN102770555B (zh) | 2015-01-28 |
AU2010322205A1 (en) | 2012-06-07 |
EP2501824A1 (en) | 2012-09-26 |
JP2013510592A (ja) | 2013-03-28 |
MY159680A (en) | 2017-01-13 |
IL219686A0 (en) | 2012-07-31 |
CA2781099A1 (en) | 2011-05-26 |
US20120225807A1 (en) | 2012-09-06 |
WO2011062862A1 (en) | 2011-05-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5955773B2 (ja) | 改善された細菌膜タンパク質分泌 | |
CN108473987B (zh) | 具有改变的多样性支架结构域的结合成员 | |
DK2044117T3 (en) | PROCEDURE FOR MANUFACTURING IMMUNGLOBULINES | |
Traxlmayr et al. | Construction of a stability landscape of the CH3 domain of human IgG1 by combining directed evolution with high throughput sequencing | |
KR20180077144A (ko) | 신규 항체 라이브러리 제조방법 및 이로부터 제조된 라이브러리 | |
KR101763345B1 (ko) | 단백질 조합 기반의 Fv 라이브러리 및 이의 제조 방법 | |
US11479879B2 (en) | Triple vector for expressing antibody molecules in full therapeutic format | |
JP5850846B2 (ja) | 繊維状ファージ上でのジスルフィド結合二量体タンパク質の提示 | |
CA2905529A1 (en) | An integrated system for library construction, affinity binder screening and expression thereof | |
US20200140573A1 (en) | Nucleic acid compositions, methods and kits for rapid pairing of affinity agents | |
CN113195537A (zh) | 抗体文库及方法 | |
US11085038B2 (en) | Polypeptide library | |
JP2013509200A (ja) | 抗体模倣足場 | |
JP2020534796A (ja) | エピトープ翻訳後修飾状態に特異的な抗体の開発方法及び開発のための組成物 | |
Jennings et al. | Production of calmodulin-tagged proteins in Drosophila Schneider S2 cells: a novel system for antigen production and phage antibody isolation | |
CN114245804A (zh) | 修饰的人可变域 | |
Omar | Development of a Naive Human Fab Antibody Library to Generate Monoclonal Antibodies Against BmSXP Recombinant Antigen |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20131031 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20141029 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20141118 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20150218 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20150318 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20150420 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150515 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150929 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20151228 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160329 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160330 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20160524 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20160615 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5955773 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |